KR20180047188A - Cry1의 당뇨병 치료제 및 이를 표적으로 하는 당뇨병 치료제 스크리닝 용도 - Google Patents

Cry1의 당뇨병 치료제 및 이를 표적으로 하는 당뇨병 치료제 스크리닝 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 CRY1의 당뇨병 치료제로서의 용도를 개시한다. 아울러 본원은 SREBP1c-CRY1-FOXO1 포도당 생합성 조절 경로를 기반으로 하는 새로운 분자기전을 이용한 혈당조절제 또는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법을 개시한다. 본원에 따른 치료제는 지방생합성을 증가시키지 않으면서 동시에 포도당 생합성을 억제시킬 수 있다.

Description

CRY1의 당뇨병 치료제 및 이를 표적으로 하는 당뇨병 치료제 스크리닝 용도 {Use of CRY1 for treatment and screening target of therapeutic agents of diabetes mellitus}
본원은 당뇨병 치료 및 치료 약물 개발과 관련된 기술이다.
당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종으로, 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 고혈당으로 인하여 여러 증상 및 징후를 일으키고 소변에서 포도당을 배출하게 된다. 당뇨병은 제1형과 제2형으로 구분되는데, 제1형 당뇨병은 인슐린을 전혀 생산하지 못하는 것이 원인이 되어 발생하며, 인슐린이 상대적으로 부족한 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성(insulin resistance; 혈당을 낮추는 인슐린 기능이 떨어져 세포가 포도당을 효과적으로 연소하지 못하는 것)을 특징으로 한다. 제2형 당뇨는 식생활의 서구화에 따른 고열량, 고지방, 고단백의 식단, 운동 부족, 스트레스 등 환경적인 요인이 크게 작용하는 것으로 보이지만, 이 외에 특정 유전자의 결함, 췌장 수술, 감염, 약제 등에 의해서도 생길 수 있다.
인슐린은 섭취시에 분비되는 주요 동화작용 호르몬으로, 체내 에너지 대사를 관장한다. 인슐린은 간에서 포도당 생합성을 억제하고 지방생합성을 증가시켜 잉여에너지는 저장하게 한다. 인슐린저항성으로 대표되는 당뇨병에서는 흥미로운 현상이 발생하는데, 인슐린 신호전달경로가 기능을 하지 못해 포도당 생합성의 억제가 사라져 간에서 지속적으로 포도당을 만들어 혈액으로 내보내고 있으나, 동시에 인슐린이 과도하게 기능을 해 지방생합성이 증가되어 혈중 지질 농도가 높아지고 지방간이 발생하는 선택적 인슐린 저항성이 나타나게 된다.
당뇨병 환자의 90% 이상이 제2형 당뇨 환자이다. 현행 제2형 당뇨병의 경우 약물치료법을 살펴보면, 메트포르민(metformin)과 티아졸리딘디온(thiazolidinedione, TZD)계열의 약물이 상당한 유용성을 보이고 있으나, 인슐린 저항성 발생 등 당뇨병의 근본적 원인 치료에는 이르지 못하고 있으며, 여러 부작용 또한 보고되고 있어 인슐린 저항성을 근본적으로 해결할 수 있는 보다 효능이 우수하고 안전한 약물의 개발이 필요하다.
CRY1(Cryptochrome Circadian Clock 1)은 블루라이트에 민감한 플라보단백질(flavoprotein)의 일종으로, 동식물의 생체시계 리듬에 관여한다.
대한민국 공개특허번호 제2013-0027059호는 방광암 검출용 소변표지에 관한 것으로, 방광암 표지자로서의 CRY1이 개시되어 있다.
대한민국 공개특허번호 제2015-0106492호는 FPR2를 활성화하는 물질을 포함하는 인슐린 저항성 관련 질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 인슐린 신호전달에 중요한 Akt의 인산화를 유지하고, PKC-theta의 인산화를 억제하여 인슐린 저항성을 개선하는 것이 개시되어 있다.
본원은 새로운 분자 기전에 근거한 제2형 당뇨병의 치료제, 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 제 1 형 또는 제 2 당뇨병을 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
특히 일 구현예에서 본원에 따른 조성물이 사용될 수 있는 당뇨병은 제 2 형 당뇨병이다.
다른 구현예에서 본원에 따른 조성물이 사용될 수 있는 제 2 형 당뇨병 환자는 선택적 인슐린 저항성이 수반되는 것으로 선택적 인슐린 저항성은 지방대사는 여전히 증가되는데, 포도당 생합성은 억제되지 않는 현상을 말하며, 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, SREBP1c가 증가되어 있는 반면 CRY1은 감소로 인한 것이다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 제 1 형 또는 제 2 당뇨병을 포함하는 혈당조절용, 특히 혈당강하제, 특히 포도당 생합성 억제를 통한 혈당강하용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 SREBP1c-CRY1-FOXO1 신호전달 경로를 표적으로 하는 포도당 생합성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
일 구현예에서 상기 방법은 CRY1의 발현 또는 활성이 감소 또는 결여된 세포 또는 동물모델을 제공하는 제 1 단계; 상기 세포를 CRY1의 발현 또는 활성을 증가시킬 것으로 기대되는 시험물질로 처리하는 제 2 단계; 상기 시험물질로 처리된 세포에서 FOXO1 단백질 농도를 측정하는 제 3 단계; 및; 상기 측정결과 상기 FOXO1 단백질 양이 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군에서 FOXO1 단백질 양과 비교하여 감소한 경우 이를 제 2 형 당뇨병 치료제 후보물질로 선별하는 제 4 단계를 포함한다.
다른 구현예에서는 제 3 단계 대신에 또는 이에 부가하여 상기 FOXO1에 의해 발현이 촉진되는 포도당 생합성에 관여하는 효소인 PEPCK 및/또는 G6Pase의 발현을 측정하는 단계를 포함하며, 그리고 이 경우 상기 제 4 단계에서 상기 후보물질은 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여 상기 PEPCK 또는 G6Pase의 발현이 감소한 것이다.
본원에 따른 방법에서 상기 CRY1의 발현이 감소된 세포 또는 동물은 CRY1의 감소에 부가하여 상위 단계의 단백질인 SREBP1c의 발현은 증가된 것일 수 있다.
상기 본원에 따른 스크리닝 방법으로 선별된 화합물은 포도당 생합성을 억제할 수 있어, 혈당조절, 혈당 강하, 당뇨병 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서 본원은 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 또는 상기 유전자를 포함하는 인비트로에서 간세포 또는 동물에서 SREBP1c-CRY1-FOXO1 신호전달 경로 조절용 키트를 제공한다.
CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 또는 상기 유전자를 포함하는 인비트로에서 간세포 또는 동물에서 포도당생합성 억제용 키트를 제공한다.
또한 다른 양태에서 본원은 인비트로에서 간세포 또는 동물에 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 처리하는 단계를 포함하는, SREBP1c-CRY1-FOXO1 경로 조절 방법 또는 상기 경로 조절을 통한 포도당 생합성 억제방법을 제공하며, 상기 방법에서, 특히 상기 간세포 및 동물은 SREBP1c 발현은 증가되고 CRY1 단백질의 발현 또는 활성은 감소된 것이다.
본원에서는 SREBP1c가 SREBP1c-CRY1-FOXO1 경로를 통해 포도당 생합성을 억제하고, 또한 당뇨병 동물모델에서 CRY1의 과발현에 의해 포도당 생합성을 억제할 수 있음을 발견하였다. 따라서 CRY1은 지방생합성을 증가시키지 않으면서 동시에 포도당 생합성을 억제시킬 수 있는 새로운 당뇨병 치료제로서 그리고 치료제 개발의 표적으로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 CRY1이 섭취(feeding) 및 인슐린에의 노출에 의해 자극받는다는 것을 나타낸 것이다. (a,b) C57BL/6 마우스를 24시간 동안 금식시키고 그 후 12시간 동안 재섭취시켰다. 섭취시킨 마우스 및 재섭취시킨 마우스 둘 다 ZT 3 희생시켰다. TBP mRNA 레벨에 정규화시킨 qRT-PCT 및 웨스턴 블랏을 이용하여 간에서의 CRY1 mRNA(a) 및 CRY1 단백질(b)을 각각 측정하였다. pSREBP1, precursor SREBP1; nSREBP1, nuclear SREBP1. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test). (C) 12시간 인슐린 노출 후 qRT-PCR을 이용하여 CRY1 유전자 발현을 측정하였다. qRT-PCR 정규화를 하기 위하여 TBP mRNA 레벨을 사용하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.001 (Student’s t-test).
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 CRY1 유전자 발현이 SREBP1c에 의해 직접적으로 활성화된다는 것을 나타낸 것이다. (a,b) Ad-MOCK 또는 Ad-SREBP1c으로 마우스 1차 간세포를 아데노바이러스로 감염시켰다. CRY1 mRNA (a) 및 CRY1 단백질 (b) 레벨은 각각 TBP mRNA 레벨에 정규화시킨 qRT-PCT 및 웨스턴 블랏을 사용하여 측정하였다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test). (C) HEK293T 세포에서 SREBP1c 또는 MOCK를 인코딩하는 발현 플라스미드로 동시-트랜스펙션한 후 WT CRY1 프로모터 및 3XSRE 돌연변이 프로모터의 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 루시퍼라아제 활성은 β-gal 활성으로 정규화시켰다. TSS, Transcription Start Site; SRE, Sterol Regulatory Elements. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5. **P<0.01 (Student’s t-test). (d) H4IIE 세포에서 SREBP1c가 점유한 CRY1 프로모터를 나타내는 ChIP 분석법을 나타낸 것이다. (e) 마우스 1차 간세포를 SREBP1c-/- 및 SREBP1c+/+ 마우스에서 분리하였다. 인슐린(10 nM) 존재시의 SREBP1c 및 CRY1 단백질 레벨을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. (f) SREBP1c-/- 및 SREBP1c+/+ 마우스를 24시간 동안 금식시킨 후 12시간 동안 재섭취시켰다. 섭취시킨 마우스 및 재섭취시킨 마우스 둘 다 ZT 3 희생시켰다. SREBP1c 및 CRY1 mRNA 레벨을 qRT-PCR로 측정하여 TBP mRNA 레벨로 정규화시켰다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3-4. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test).
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 SREBP1c-CRY1 시그널링 경로가 간 포도당 생성을 조절한다는 것을 나타낸 것이다. (a) 마우스 1차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-SREBP1c로 감염시켰다. 포도당 옥시다아제(GO)를 사용하여 상대적 포도당 생산을 측정하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. **P<0.05 (Student’s t-test). (b) Ad-G6Pase-luc 및 Ad-MOCK 또는 Ad-SREBP1c 중 하나로 C57BL/6 마우스를 감염시켰다. 광학 인 비보 이미지 및 광자 밀도로 G6Pase 프로모터 활성을 측정하였다. (c,d) Ad-MOCK 또는 Ad-SREBP1c로 C57BL/6 마우스를 감염시켜 PTT(pyruvate tolerance test)를 수행하였다(c). 모든 마우스를 ZT3 희생시켜 ZT3에서 PTT를 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다(d). 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test). (e,f) SREBP1-/- 및 SREBP1c+/+ 마우스에서 PTT(e)를 수행하였다. 모든 마우스를 ZT3 희생시켜 ZT3에서 PTT를 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다(f). 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test). (g) H4IIE 세포를 siCON 또는 siCRY1로 감염시켰다. qRT-PCR로 상대적 mRNA 레벨을 측정하여 싸이클로필린(cyclophilin) mRNA 레벨로 정규화시켰다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.001 (Student’s t-test). (h) Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1로 마우스 초기 간세포를 감염시켰다. qRT-PCR로 상대적 mRNA 레벨을 측정하여 TBP mRNA 레벨로 정규화시켰다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05 (Student’s t-test). (i,j) CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스(i)에서 PTT를 수행하였다. 모든 마우스를 ZT10 희생시켜 ZT3에서 PTT를 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다(j). 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 7. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test). (k) CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스에서 분리한 마우스 1차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-SREBP1c로 감염시켰다. 상대적 포도당 생산을 GO(glucose oxidase) 키트를 사용하여 측정하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 8. ***P<0.001 versus Ad-MOCK, ###P<0.001 versus CRY1+/+(Student’s t-test). (l,m) Ad-MOCK를 주입한 SREBP1c+/+ 마우스 및 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1를 주입한 SREBP1c-/- 마우스에서의 PTT(l). 결과를 AUC로 전환시켰다(m). 모든 마우스를 ZT10 희생시켜 ZT3에서 PTT를 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다(j). 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 7-10. **P<0.01, ***P<0.001 versus SREBP1c+/+, Ad-MOCK, #P<0.05, ###P<0.001 versus SREBP1c-/-, Ad-MOCK (Student’s t-test).
도 4는 CRY1이 FOXO1 단백질 레벨을 조절한다는 것을 나타낸 것이다. (a,b) 마우스 1차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1로 아데노바이러스 감염시켰다. FOXO1의 발현 프로파일을 웨스턴 블랏을 사용한 단백질 레벨(a) 및 qRT-PCR을 사용한 mRNA 레벨로 분석하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 4. *P<0.05 (Student’s t-test). (c,d) H4IIE 세포를 siCON 또는 siCRY1로 감염시켰다. 내인성 FOXO1의 면역세포화학 분석. DAPI, 4’, 6-diamidino-2-phenylindole. 스케일 바, 10 ㎛. 내인성 FOXO1 및 CRY1 단백질 레벨을 웨스턴 블랏을 사용하여 분석하였다(d). (e,f) CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스의 간에서의 FOXO1 단백질의 발현 패턴을 웨스턴 블랏 및 qRT-PCT(f)로 분석하였다. 상대적 mRNA 레벨을 qRT-PCR을 사용하여 측정하여 TBP mRNA 레벨로 노말라이즈하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 4. *P<0.05 (Student’s t-test). (g) SREBP1c+/+ 및 SREBP1c-/- 마우스 간에서의 CRY1 및 FOXO1 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (h) siCRY1 및/또는 siFOXO1로 H4IIE 세포를 공동-트랜스펙션시켰다. qRT-PCR을 사용하여 상대적 mRNA 레벨을 측정하여 싸이클로필린 mRNA 레벨로 노말라이즈하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. #P<0.05, ##P<0.01 versus siCRY1, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 versus siCON (Student’s t-test).
도 5는 장기간 인슐린 치료가 CRY1 발현을 자극하고 간 포도당 신생과정을 저해한다는 것을 나타낸 것이다. (a,b) 마우스 일차 간세포에 서로 다른 기간동안 10 nM 인슐린을 처리하였다. 단백질 레벨(a)을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. mRNA 레벨(b)을 qRT-PCR로 분석하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, ***P<0.001 versus siCON (Student’s t-test). (c-e) CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스에서 분리한 마우스 일차 간세포에 서로 다른 기간동안 10nm 인슐린을 처리하였다. 단백질 레벨(c)을 웨스턴 블랏으로 분석하였고, 상대적 mRNA 레벨(d)을 qRT-PCR로 측정하여 TBP mRNA 레벨로 정규화하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 versus CRY1+/+ 대조군(Student’s t-test). 상대적 포도당 생산(e)을 GO(glucose oxidase) 키트를 사용하여 측정하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5. *P<0.05, **P<0.01 versus CRY1+/+ 대조군(Student’s t-test). (f) 마우스 일차 간세포를 Ad-MOCK 및 Ad-CRY1로 감염시킨 후, 인슐린(10 nM) 또는 인슐린(10 nM) 및 AKTVIII (5 ㎛)로 12시간 동안 처리하였다. 단백질 레벨을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. (g-i) C57BL/6 마우스를 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1으로 감염시켜 AKT 저해제 MK2206 존재 또는 부존재하에 PTT를 수행하였다. PTT 수행전에 MK2206 (30mg kg-1)를 경구로 10분간 투여하였다. 모든 마우스를 ZT10 희생시켜 ZT3에서 PTT를 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다(h). 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5-7. ##P<0.01, ###P<0.001 versus Ad-MOCK + 비히클 대조군, *P<0.05, **P<0.01, versus Ad-MOCK + MK2206 대조군(Student’s t-test).
도 6은 CRY1이 유비퀴틴-매개 FOXO1 분해를 촉진시킨다는 것을 나타낸 것이다. (a) 마우스 일차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1로 아데노바이러스 감염시켰다. 상기 세포에 20㎛ MG132 또는 비히클을 4시간 동안 처리하였다. 총 세포 용해물을 지시된 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (b) HEK293T 세포를 GFP-CRY1 및/또는 FOXO1-MYC 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다. 지시된 항체 존재하에서 항-MYC 항체와의 공동-면역침강 및 웨스턴 블랏을 수행하였다. IP, immunoprecipitation. (c) FOXO1-MYC, GFP-CRY1, 및 Ubiquitin-HA를 인코딩하는 플라스미드로 COS-1 세포를 공동-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후, 상기 세포에 MG132(20㎛)를 6시간 동안 처리한 후 상기 세포 용해물을 항-MYC 항체와 같이 면역침강하고나서 지시된 항체존재하에 웨스턴 블랏을 수행하였다. (d) 마우스 일차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1로 감염시켰다. 감염 후, 상기 세포를 MG132(20㎛)로 4시간 동안 처리하였다. 핵 및 세포질 분획을 분리하여 지시된 항체 존재하에 웨스턴 블랏을 수행하였다. (e) COS-1 세포를 nFOXO1-MYC, GFP-CRY1, 및 Ubiquitin-HA를 인코딩하는 플라스미드와 같이 공동-트랜스팩션시켰다. 트랜스펙션 후, 상기 세포를 MG132(20㎛)로 6시간 동안 챌린지시켰다. 상기 세포 용해물을 항-MYC 항체 존재하에 면역침강시켰다. IP, immunoprecipitation.
도 7은 CRY1이 MDM2-매개 FOXO1 유비퀴틴화에 포함된다는 것을 나타낸 것이다. (a) 마우스 일차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1 및/또는 siCON 또는 siMDM2로 감염시켰다. 총 세포 용해물을 지시된 항체 존재하에 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (b) HEK293T 세포를 FLAG-MDM2, nFOXO1-MYC, 및 GFP-CRY1 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다. 총 세포 용해물을 항-MYC 항체 존재하에 공동-면역침강한 후 지시된 항체 존재하에 웨스턴 블랏을 수행하였다. IP, immunoprecipitation. (c) nFOXO1-MYC, FLAG-MDM2, FLAG-CRY1,및 Ubiquitin-HA 인코딩 플라스미드로 COS-1 세포를 공동-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션후, 상기 세포를 MG132(20㎛)로 6시간 동안 챌린지시켰다. 세포 용해물을 항-MYC 항체로 면역침강시켰다. IP, immunoprecipitation. (d) nFOXO1-MYC, FLAG-MDM2, Ubiquitin-HA, 및 siCRY1 인코딩 플라스미드로 COS-1 세포를 공동-트랜스펙션시켰다. 상기 세포를 MG132(20㎛)로 6시간 동안 챌린지시켰다. 세포 용해물을 항-MYC 항체로 면역침강시켰다. IP, immunoprecipitation.
도 8은 당뇨 마우스 모델에서 CRY1이 당신생과정을 완화시킨다는 것을 나타낸 것이다. (a-c) 8-주령 수컷 마우스에게 STZ (150mg kg- 1)를 주입한 후 1주 후에 ZT 3일때 희생시켰다. ZT 3에 임의(ad libitum)로 혈당 레벨(a)을 측정하였다. 모든 마우스를 ZT 3일때 희생시킨 후, 간 단백질 레벨(b)을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. mRNA 레벨(c)을 qRT-PCR 분석으로 측정하여 TBP mRNA 레벨로 정규화하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (Student’s t-test). (d-f) STZ-주입 마우스를 MOCK 또는 CRY1 인코딩 아데노바이러스로 감염시켰다(adenoviral dose of 2109 viral particles per mouse). 혈당 레벨(d)을 ZT3에 임의로 측정하였다. 모든 마우스를 ZT 3에 희생시킨 후, mRNA 레벨(e)을 qRT-PCR 분석으로 측정하여 TBP mRNA 레벨로 노말라이즈하였다. 간 단백질 레벨(f)을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 4. *P<0.05, **P<0.01, (Student’s t-test). (g,h) 10-주령 수컷 db/+ 및 db/db 마우스를 임의로 ZT3일때 희생시켰다. 다양한 간 유전자의 상대적 mRNA 레벨(g)을 qRT-PCR 분석으로 측정하여 TBP mRNA 레벨로 노말라이즈하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 4. *P<0.05 (Student’s t-test). 단백질 레벨(h)을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. (i-l) 10-주령 수컷 db/db 마우스를 MOCK 또는 CRY1 인코딩 아데노바이러스로 꼬리 정맥을 통해 감염시켜(adenoviral dose of 21010 viral particles per mouse) PTT(i)를 수행하였다. 모든 마우스를 ZT 10 희생시켜 ZT 3에 PTT 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다. 혈당 레벨(j)을 ZT 3에 임의로 측정하였다. 모든 마우스를 ZT 3에 희생시킨 후, 간 단백질 레벨(k)을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. mRNA 레벨(l)은 qRT-PCR로 분석한 후 TBP mRNA 레벨로 노말라이즈하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (Student’s t-test).
도 9는 SREBP1c-CRY1 축이 FOXO1 분해를 촉진시킴으로써 간 포도당 신생과정을 억제시킨다는 것을 나타낸 것이다. 장기간 인슐린 작용을 한 후, SREBP1c-CRY1 축은 핵내 FOXO1 분해를 통해 간 포도당 신생과정을 억제시킨다. 동화작용 상태동안, 증가된 CRY1이 MDM2-매개 FOXO1 분해를 촉진시키고 그럼으로써 인슐린이 지속적으로 간 포도당 생성을 억제한다.
본원은 인슐린에 의해 활성화되어 지방생합성 촉진 및 포도당 생합성 억제에 관여하는 전사인자인 SREBP1c가 CRY1 유전자 발현을 조절하고, CRY1이 FOXO1 단백질 레벨을 조절함으로써 포도당생합성을 억제한다는 SREBP1c-CRY1-FOXO1 경로를 규명하고, 당뇨 마우스 모델에서 과발현된 CRY1이 과혈당증을 완화시키므로 CRY1을 이용하면 지방생합성을 증가시키지 않으면서도 동시에 포도당생합성을 억제시킬 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
이에 한 양태에서 본원은 CRY1(Cryptochrome Circadian Clock 1) 유전자 또는 그 단백질 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체, 또는 그 발현을 활성화 시키는 물질을 포함하는 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병 치료용 조성물에 관한 것이다.
본원에 따른 조성물에 포함되는 CRY1(Cryptochrome Circadian Clock 1)은 식물에서는 블루라이트에 민감한 플라보단백질(flavoprotein)의 일종이지만, 동물에서는 크게 역할이 알려져 있지 않고, 단지 생체시계 리듬에 관여함이 알려져 있다. 본원에 따른 조성물에 포함되는 CRY1의 유전자 또는 단백질 서열은 본원에 따른 효과를 달성하는 한 다양한 형태 및 유래의 것이 사용될 수 있다. 일 구현예에서는 포유류, 특히 인간 유래의 CRY1 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체가 사용되며, 그 유전자 및 단백질 서열은 공지되어 있다 (Gene ID: 12952, NCBI Reference Sequence: NP_031797.1).
본원에 따른 유전자는 게놈 DNA, cDNA 및 화학합성 DNA를 포함한다. 게놈 DNA 및 cDNA는 당업계의 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 게놈 DNA는 예를 들어, 해당 유전자를 가지는 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고 게놈 라이브러리(벡터는 예를 들면 플라스미드, 파지, 코스미드, BAC, PAC 등이 이용될 수 있다)를 제작하고 상기 라이브러리를 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 기초로 제작한 프로브를 이용하여 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA에 특이적인 프라이머를 작성하고, 이를 이용한 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 행함으로써 제조할 수도 있다. cDNA는 예를 들어, CRY1 유전자를 가지는 세포에서 추출한 mRNA를 기초로 cDNA를 합성하고, 상기 합성된 cDNA를 λZAP 등의 벡터로 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 상기 cDNA 라이브러리를 전개하여, 상기와 동일하게 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나 또는 PCR을 수행하여 제조할 수 있다.
본원에서 용어 “기능적으로 동등한 변이체”란 특정 종 유래의 야생형 단백질 또는 이의 유전자 서열과 비교하여 변이가 있지만 본원에서 규명한 효능을 갖는 것을 말한다. 따라서, 예를 들면 본원발명의 CRY1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 사람 유래의 서열로서, 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체 (homologues)를 포함한다. 나아가, 예를 들어, 염기서열의 변이가 단백질 중의 아미노산의 변이를 수반하지 않는 경우(축중변이)도 있고, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 유전자에 포함된다.
CRY1 단백질 및 이와 기능적으로 동등한 단백질을 암호화하는 유전자는 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 PCR 방법(Saiki et al., Science, 230: 1350-1354, 1985; Saiki et al., Science, 239: 487-491, 1988)을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 당업자라면 공지된 CRY1 유전자의 염기서열로부터 이에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프라이머를 고안하여 CRY1 유전자와 높은 상동성을 가지는 다양한 포유류 유래의 유전자를 분리할 수 있을 것이다.
상기와 같이 분리된 유전자는 아미노산 수준에 있어서, 인간 유래 CRY1 단백질의 아미노산 서열과 높은 상동성을 가진다. 높은 상동성이란 아미노산 서열 전체에서, 적어도 50% 이상, 더 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 90%이상(예를 들어, 95% 이상)의 서열의 동일성을 가리킨다. 아미노산 서열이나 염기서열의 상동성은 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993)에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX라 불리는 프로그램(Altschul et al, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990)을 사용하여 분석될수 있으며 구체적인 방법은 다음의 웹사이트에 공지되어 있다(http://www,ncbi.nlm.nih.gov.).
본원에 따른 조성물에 포함되는 CRY1 단백질 또는 유전자는 전장 또는 잘린 형태의 것이 모두 포함된다. 또한 동일한 숙주, 예를 들면 인간에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 한 구현예에서는 인간 유래의 것으로 이에 관하여는 앞서 언급한 바와 같다.
본원에 따른 조성물이 CRY1 유전자 또는 이와 동등한 변이체를 포함하는 경우, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 재조합 DNA 기술 등 공지된 방법에 따라, 표적세포 예를 들면 포유류 유래의 당뇨 비만세포에서 CRY1 유전자를 발현할 수 있는 한 이로 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 선형 DNA, 플라스미드 벡터 또는 그 외 DNA 전달용 벡터로 도입되어 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 바람직하게는 비바이러스성이며, 진핵세포에서 CRY1 유전자를 발현할 수 있는 한, 특별히 제한되는 것은 아니며, 본원 실시예에 기재된 것을 참고할 수 있다.
또한 본 발명의 CRY1 유전자는 유전자치료 시스템 등에 사용되는 발현벡터 예를 들면 바이러스벡터에 도입되어 공지된 방법에 따라 전달체로서 바이러스입자에 포함되어 사용될 수 있다. 상기의 바이러스 벡터는 본 발명의 단백질을 목적하는 세포 또는 조직내로 도입할 수 있는 것이면 제한되지 않으며 바람직하게는 아데노바이러스 벡터이며, 상기 바이러스성 벡터는 진핵세포에서 이에 포함된 유전자를 발현할 수 있는 한, 특별히 제한되는 것은 아니다.
본원에 따른 조성물이 단백질 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 경우, 예를 들면 상기 벡터를 공지된 방법에 따라 세포배양 시스템에서 적절한 세포에 트렌스펙션하여 발현시킨 후 단백질을 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 본 발명의 단백질은 예를 들면 정제된 단백질, 수용성 단백질, 또는 표적 세포로의 전달 또는 투여를 위해 담체에 결합된 형태의 단백질 또는 아미노산 잔기와 융합된 형태의 것을 포함하는 것이다.
본원에 따른 조성물이 사용되는 당뇨병은 혈중 포도당 농도가 높은 증상으로, 제 1 형 및 제 2 형 당뇨병을 포함한다. 제 1 형 당뇨병은 인슐린을 분비하는 췌장 베타 세포의 문제가 발생하여 혈중에 인슐린 분비가 되지 않는 질환이고, 제 2 형 당뇨병은 췌장 베타세포에서는 인슐린이 분비되나, 간, 지방세포 및 근육에서 인슐린 수용체 하위 신호가 문제가 발생하여 인슐린이 있음에도 인슐린 신호가 전달되지 않는 질환이나, 이와 같은 상황에서는 결국 췌장 베타세포에 과부하가 걸려 베타 세포도 망가져서 인슐린도 분비되지 않는 상황이 발생할 수 있다. 즉 제 2 형 당뇨병은 췌장에서 인슐린 분비기능은 일부 남아있지만 여러 가지 원인에 의해 상대적으로 인슐린 저항성이 커지면서 인슐린의 작용이 원활하지 않아 고혈당과 상대적인 인슐린 분비 장애가 생기는 것이 특징이다. 본원에서는 제 1 형 및 제 2 형의 대표적 당뇨병 모델 마우스를 이용하여 실험한 결과 인슐린 분비의 문제 뿐 아니라 인슐린 신호전달 경로의 문제 모두에서 CRY1의 과발현을 통해 포도당 생합성을 억제할 수 있는 현상을 관찰하였기에 본원은 제 1 형 당뇨병 뿐 아니라 제 2 형 당뇨병 혈당 조절제, 혈당 강하제로 사용될 수 있다.
본원에 따른 조성물은 특히 지방생합성을 증가시키지 않으면서 포도당생합성을 억제시킴으로써 인슐린 저항성이 나타나는 제 2 형 당뇨병에 사용될 수 있다. 구체적으로 인슐린에 의해 발현이 증가되는 SREBP1c가 CRY1 유전자 발현을 조절하고, CRY1은 FOXO1 단백질 레벨을 조절함으로써 포도당생합성을 억제한다.
일 구현예에서 본원에 따른 조성물이 사용되는 제 2 형 당뇨병은 특히 고인슐린 혈증, 특히 본원에서 규명된 SREBP1c가 증가되어 있는 반면 CRY1은 감소로 인한 당뇨병, 일종의 선택적 인슐린 저항성에 사용될 수 있다.
선택적 인슐린 저항성은 과도한 인슐린으로 인해 지방생합성이 증가되어 혈중 지질 농도가 높아지고 지방간이 발생하지만, 고혈당이 발생하는 증상이다. 본원의 이전에는 그 이유가 규명되지 않았고, 본원에 따른 CRY1 단백질 또는 유전자는 이러한 선택적저항성 인슐린 증상의 고혈당을 완화시킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료" 란 당뇨병으로 인한 불규칙한 혈당을 조절하는, 특히 고혈당을 완화시키거나 또는 정상범위의 혈당으로 돌려놓거나 유지시키는 것을 의미한다.
이런 측면에서 본원은 또한 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 당뇨병 환자의 혈당조절용 약학 조성물에 관한 것이다.
혈당조절은 고혈당을 정상범위의 혈당으로 낮추거나 유지하는 것을 의미하는 것이다.
본원의 조성물은 CRY1 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본원의 약학 조성물은 신장암의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 씨딩 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화 할 수 있다.
본원의 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양할 수 있다. CRY1 유전자 또는 폴리펩타이드를 포함한 단백질 제제의 경우 비경구 투여가 선호될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01mg 내지 100mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본원에서는 마우스 일차 간세포에서 SREBP1c 과발현에 의해 포도당 생성이 감소되며, 상기 SREBP1c이 CRY1의 발현을 통해 포도당 생성을 조절하며, 상기 CRY1은 FOXO1과 FOXO1을 분해시킬 수 있는 MDM2라는 단백질의 결합을 강화시켜 FOXO1의 분해를 촉진시킨다는, SREBP1c-CRY1-FOXO1 신호전달 경로를 발견하였다. FOXO1은 포도당 생합성의 주요 효소인 PEPCK(Phosphoenolpyruvate carboxykinase) 및 G6Pase(Glucose-6-phosphatase)의 발현 조절을 억제하는데, CRY1에 의해 FOXO1 단백질 레벨이 저하되면 PEPCK 및 G6Pase의 발현도 저하되어 포도당 생합성이 저해된다.
따라서 다른 양태에서 본원은 SREBP1c(Sterol Regulatory Element Binding Transcription Factor 1c)-CRY1-FOXO1 신호전달 경로를 표적으로 하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서 상기 방법은 CRY1의 발현 또는 활성이 감소된 간 세포 또는 동물을 제공하는 제 1 단계; 상기 세포를 CRY1의 발현 또는 활성을 증가시킬 것으로 기대되는 시험물질로 처리하는 제 2 단계; 상기 시험물질로 처리된 세포에서 FOXO1 단백질 농도를 측정하는 제 3 단계; 및; 상기 측정결과 상기 FOXO1 단백질 양이 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군에서 FOXO1 단백질 양과 비교하여 감소한 경우 이를 포도당 생합성 억제제, 또는 당뇨병 치료제 후보물질을 선별하는 제 4 단계를 포함한다.
본원에 따른 방법이 적용되는 세포 또는 동물은 당뇨병의 특징 또는 증상을 나타내는 것이 사용될 수 있으며, 특히 SREBP1c 및/또는 CRY1이 발현 또는 활성이 감소된 세포 및/또는 동물이 사용된다.
SREBP1c 및/또는 CRY1 발현은 유전자 및 단백질 수준에서의 발현으로, 발현이 감소된 세포는 정상 세포 특히 정상 간세포와 비교하여 감소된 것으로 당업자면 본원의 개시사항 및 당업계의 수준을 근거로 감소된 수준을 판단할 수 있다. SREBP1c 및/또는 CRY1 의 활성은 단백질은 발현되나, 돌연변이 등의 이유로 인해, 목적하는 활성을 나타내지 못하거나 감소한 것을 의미하며, 당업자면 본원의 개시사항 및 당업계의 수준을 근거로 감소된 수준을 판단할 수 있다.
본원에 따른 방법에 사용되는 동물모델은 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병 모델 마우스가 사용될 수 있으며, 이러한 모델은 당업계에 공지된 것으로 예를 들면 스트렙토조토신 유도된 1형 당뇨병 마우스 또는 자연발생 2형 당뇨병 모델인 db/db 마우스 (C57BLKsJ-db/db 마우스)을 포함한다.
본원에 따른 방법에 사용되는 세포로는 상술한 조건을 갖는 포도당 합성이 가능한 세포로 이러한 세포는 상술한 동물모델로부터 유래된 세포 특히 포도당을 합성할 수 있는 세포, 특히 일차 간세포, 또는 세포주 예를 들면 H4IIE, HepG2를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 따른 다른 구현예에서, 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 세포 또는 동물은 CRY1의 윗단계인 SREBP1c의 발현은 증가되었으나 CRY1의 발현 또는 활성이 감소된 동물 또는 세포가 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 분자 표적은 CRY1으로서, 이의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질은 당뇨병 치료제 또는 포도당 생합성 억제 스크리닝의 시험물질로 사용될 수 있다. CRY1의 발현을 증가시키는 물질은 유전자 및/또는 단백질 수준에서의 증가를 의미하는 것이다.
본원의 방법에 사용되는 시험물질은 상술한 표적 유전자 또는 단백질의 발현 및/또는 활성을 조절할 것으로 기대되는 물질로, 예를 들면 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에 따른 방법은 시험물질 처리 후 시험물질이 목적하는 효과를 나타내는지는 FOXO1 단백질의 발현량 변화로 측정될 수 있다.
FOXO1(Forkhead box protein O1)은 본원에서 규명한 SREBP1c-CRY1-FOXO1 경로의 단백질로 인슐린 신호전달과정에서 혈당조절과 관련된 전사인자이며, 인간의 핵산 및 단백질 서열은 각각 NM_002015 및 NP_002006.2로 공지되어 있다. 본원에서는 CRY1이 MDM2를 통해 FOXO1의 분해를 촉진하여 결국 포도당합성을 억제하는 것을 발견하여, SREBP1c-CRY1-FOXO1 기전에 기반한 제2형 당뇨병 치료제는 결국 FOXO1의 단백질 농도를 낮추게 되는 것이다.
다른 구현예에서는 상기 제 3 단계에 부가하여, 또는 제 3 단계의 FOXO1 대신에, FOXO1에 의해 발현이 촉진되는 포도당 생합성에 관여하는 효소인 PEPCK 또는 G6Pase의 발현의 측정하여 시험물질의 선별이 가능하다. 이 경우 본원 방법 제 4 단계에서 후보물질은 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여 상기 PEPCK 또는 G6Pase의 발현이 감소한 것이다.
PEPCK (Phosphoenolpyruvate carboxykinase)의 핵산 및 단백질 서열을 각각 (Gene ID: 18534, NP_035174.1)로 공지되어 있고, G6Pase (Glucose 6-phosphatase)의 핵산 및 단백질 서열을 각각 (Gene ID: 14377, NP_032087.2)로 공지되어 있다.
본원에서 FOXO1 단백질 양 또는 PEPCK 또는 G6Pase의 발현 양 측정은 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본원의 일 구현예에 따르면 검출시약은 항체를 포함하며, 본원의 FOXO1 단백질 양 또는 PEPCK 또는 G6Pase의 발현 양 측정은 이에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 이용하여 실시된다.
본원에 이용될 수 있는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불멸 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.
단백질의 양, 존재여부 발현패턴의 분석을 위한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테를로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등을 들 수 있다. 단백질 또는 핵산 수준검출을 위한 시약은 공지된 것으로서, 예를 들면 전자는 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분광분석기를 이용할 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)과 함께 사용될 수 있다.
본원의 다른 구현예에 따르면 발현 양 분석은 가능한 경우 mRNA 수준에서 실시될 수 있다. mRNA 검출은 통상 노던블랏이나 역전사 PCR(중합효소연쇄반응)을 통해 수행된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H.; Bearss, D. J.; Browne, L. W.; Calaluce, R.; Nagle, R. B.; Von Hoff, D. D., Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray. Cancer Res 2002, 62, (10), 2890-6)에 기재되어 있다.
후보물질은 상기 시험물질과 접촉된 세포와 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포에서 상기 FOXO1의 단백질 양을 비교하여, 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 FOXO1의 단백질 양이 상기 대조군의 FOXO1의 단백질 양과 비교하여 감소한 경우 이를 제2형 당뇨병 치료제 후보물질로 선별할 수 있다.
본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재 하에서 상기 단백질 발현 또는 활성의 감소를 가져오는 물질을 후보 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이상 감소, 약 95% 이상 감소, 약 90% 이상 감소, 약 85% 이상 감소, 약 80% 이상 감소, 약 75% 이상 감소, 약 70% 이상 감소, 약 65% 이상 감소, 약 60% 이상 감소, 약 55% 이상 감소, 약 50% 이상 감소, 약 45% 이상 감소, 약 40% 이상 감소, 약 30% 이상 감소, 약 20% 이상 감소, 약 10% 이상 감소를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 또는 상기 유전자를 포함하는 인비트로 세포 또는 동물에서 SREBP1c-CRY1-FOXO1 신호전달 경로 조절용 키트 또는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서 본원은 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 또는 상기 유전자를 포함하는 인비트로 세포 또는 동물에서 포도당생합성 조절용 키트 또는 방법에 관한 것이다.
상기 키트 및 방법에 사용되는 물질 및 이를 이용한 조절 기전에 대한 설명은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다. 본원에 따른 방법 및 키트는 당뇨병의 혈당조절제, 혈당강하제, 기존의 약물 테스트, 신약 개발, 연구툴로서 유용하게 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
동물실험
C57BL/6 수컷 마우스를 SAMTACO 에서 구입하였다. db/+와 db/db 마우스를 중앙실험동물에서 구입하였다. SREBP1c 결핍 마우스는 University of texas Southwestern Medical Center의 J. Horton 박사에게서 받았다. 모든 동물은 12시간 light, 12시간 dark로 이뤄진 병원균이 없는 동물실에서 유지하였다. 마우스의 조직은 -80도에 보관한 뒤 분석하였다. 모든 마우스 실험은 SNU IACUC와 Institutional Animal Care and Use Committee at the University of North Carolina 의 허락을 받고 수행되었다.
시약 및 플라스미드
MG132는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. MK2206는 Selleckchem (S1078)에서 구입하였다. AKTVIII는 Santa Cruz Biotechnology (sc-202048)에서 구입하였다. 사용된 하기 항체 및 구입처는 다음과 같다 : MYC (Cell Signalling, 2276, 1:1,000 dilution), HA (Cell Signalling, 3724, 1:1,000 dilution), FOXO1 (Cell Signalling, 2880, 1:1,000 dilution), phosphor-FOXO1-Ser256 (Cell Signalling, 9461, 1:1,000 dilution), AKT (Cell Signalling, 9272, 1:1,000 dilution), 및 phosphor-AKT-Ser473 (Cell Signalling, 9271, 1:1,000 dilution), FLAG (Sigma-Aldrich, F3165, 1:1,000 dilution), ACTIN (Sigma-Aldrich, A5316, 1:2,000 dilution), G6Pase (Santa Cruz Biotechnology, sc-33839, 1:500 dilution), POLII (Santa Cruz Biotechnology, sc-899, 1:1,000 dilution), GFP (Santa Cruz Biotechnology, sc-9996, 1:1,000 dilution), GAPDH (LabFrontier, Co., LF-PA0018, 1:1,000 dilution), SREBP1 (BD Bioscience, 557036, 1:1,000 dilution), MDM2(Abcam, ab16895, 1:1,000 dilution) 및 CRY1 (lab made antibody from Dr Aziz Sancar31, 1:200 dilution). GFP-CRY1는 pEGFP-N1 벡터로 클론되었고 FLAG-MDM2는 pCMV-3 FLAG로 클론되었다. 마우스 CRY1 프로모터는 pGL3-basic 벡터로 클론되었다.
In vivo imaging system
10주령 된 C57BL/6 수컷 마우스에 GFP, SREBP1c가 들어있는 adenovirus를 G6Pase luciferase가 나오는 adenovirus와 함께 감염시켰다. 5일 이후 마우스의 복강에 100mg/kg의 firefly D-luciferin을 찌른 뒤 5분후 마취시키고, IVIS100 기계를 이용하여 이미지를 확보하였다.
피루브산염 저항성 실험
피루브산염 저항성 실험을 위해 마우스를 16시간 굶긴 뒤 복강에 피루브산염을 2g/kg 의 농도로 주입하였다. 혈당은 꼬리의 혈관을 통해서 각 시간마다 Free-Style blood glucose metre를 이용하여 측정하였다.
세포-기초의 유비퀴틴화 분석법
COS-1 세포에 FOXO1 WT-MYC, nFOXO1(ADA)-MYC, GFP-CRY1 (또는 FLAG-CRY1), FLAG-MDM2, 그리고 Ubiquitin-HA를 넣어준 뒤 MG132를 20uM의 농도로 4시간 처리하였다. 이후 세포를 TGN Buffer를 이용해서 깬 뒤 myc 안티바디를 이용해 침전시켰다. TGN buffer로 침전물을 3번 씻은 뒤 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리시켰다. 이후 western blotting을 할 때에 HA 항체를 이용하였다.
ChIP assay
4% formaldehyde를 이용하여 H4IIE cell의 핵에 있는 chromatin과 protein을 고정시켰다. 고정시킨 이후에 세포를 분해하고, sonication을 이용하여 DNA를 잘게 분쇄하였다. 이후 SREBP1c 안티바디와 대조군 IgG 안티바디를 이용하여 2시간 동안 침전시켰다. 침전 된 DNA 조각들은 PCR 방법을 이용하여 증폭시켰다. ChIP 분석 프라이머 서열은 하기와 같다 : sense, 50-GTCCGAGCCAGCGTAGTAAA-30 , antisense, 50-GGATAGCGCGGGCTAGAG-30 ; negative control primer sense, 50-CCAGCCACTTTGCTGAAGTT-30 and antisense, 50-CTAGACAAGGCTGCCCACTC-30.
아데노바이러스 제조
SREBP1c와 CRY1의 cDNA 를 adTrack-CMV 셔틀 벡터에 클로닝을 한 뒤 ad-easy adenoviral 벡터 시스템에 재조합 시켰다. 완성된 벡터는 HEK293A 세포에 발현 시킨뒤 만들어지는 adenovirus를 응축시켰다. In vivo 실험을 하기 위해서는 5 x 109 p.f.u(plaqueformationunit)의 Adenovirus를 이용하였다.
마우스 일차 간세포 배양
마우스의 일차 간세포는 10주령 된 C57BL/6 male mice에서 분리하였다. 마우스를 마취시킨 이후 간의 혈관을 이용하여 collagenase를 주입하였다. 이를 통해 간조직이 간세포로 분리되었다. 6시간이 지나면 분리된 간세포는 dish에 붙었다. 이후에 adenovirus나 siRNA을 이용한 실험을 진행하였다. Adenovirus는 4시간 동안 10 PFU의 농도로 처리한 뒤 미디어를 갈아주었다.
세포 분해 및 침전
세포를 차가운 PBS를 이용해 씻은 다음 TGN Buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% Tween-20 and 0.3% NP-40) 또는 SDS lysis buffer (200mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% glycerol and 4% SDS)에 0.1% proteases inhibitor를 넣어 준 buffer로 세포를 분해하였다. 분해된 세포의 부산물은 12,000r.p.m. 4℃에서 15분 동안 원심분리 한 뒤 1~1.5mg의 단백질을 면역침전에 사용하였다. 면역침전은 1차 안티바디를 이용하여 2시간 동안 4℃에서 배양한 뒤 50% slurry of protein A sepharose를 첨가한 뒤 1시간 더 배양하였다. 이후 세번의 워시 과정을 거친 뒤 SDS-PAGE를 이용하여 Western blot을 진행하였다.
일시적 형질 도입 및 luciferase assay
HEK293T 세포에 다양한 DNA를 일시적 형질 도입방법으로 넣었다. 이 때 사용되는 방법은 calcium-phosphate 방법이다. 36시간 동안 배양한 이후에 lysis buffer(25mM Tris-phosphate pH 7.8, 10% glycerol, 2mM EDTA, 2mM DTT and 1% Triton X-100) 를 이용하여 세포를 깬 뒤 luciferase 활성 및 beta-galatosidase 활성을 측정하였다(Promega, Madison, WI, USA).
RNA 준비와 정량적 실시간 PCR
전체 RNA를 iso-RNA 용해 시약으로 추출하였으며, RevertAid M-MuLV 역전사 효소로 cDNA를 합성하였다. 상대적인 mRNA 양은 CFX96TM 리얼 타임 시스템을 이용하여 측정하였으며, TBP 또는 cyclophilin mRNA 양으로 보정한 뒤 계산하였다.
siRNA 일시적 형질 도입
CRY1, FOXO1, MDM2의 siRNA Duplex를 Bioneer, Inc. (Daejeon, South Korea)에서 구입하였다. 일차간세포에는 Lipofectamine RNAi MAX를 이용하여 일시적 형질 도입을 하였다.
포도당 생합성 ASSAY
일차간세포에서 포도당 생합성을 Glucose oxidase assay kit을 사용하였다 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). 세포를 Krebs-Ringer buffer (115mM NaCl, 5.9mM KCl, 1.2mM MgCl2, 1.2mM NaH2PO4, 2.5mM CaCl2, 25mM NaHCO3, 10mM lactate and 2mM pyruvate, pH 7.4)에 37℃ and 5% CO2의 조건에서 6시간 동안 배양한 뒤 측정하였다.
통계분석
샘플의 크기는 서행실험에 근거해서 통계적인 의미성을 가지는 수준에서 선택하였다. 통계분석은 Student’s t-test를 이용하였고, mean±s.d.로 표기하였다. 각각의 실험은 3번 이상 독립적으로 수행하였다. P<0.05의 의미는 통계적으로 의미가 있다. 기술적인 실패가 발생한 샘플은 최종 분석에서 제외하였다. 각각의 실험들은 임의적으로 수행되지 않았다. 또한 실험자들은 실험샘플의 정체를 알고 수행하였다.
실시예 1. 섭취 및 인슐린에 의한 CRY1의 상향조절
간에서, 말초 생체시계(peripheral circadian clock) 유전자는 다양한 영양 및 호르몬 변화에 의해 조절된다. 생체시계 유전자가 에너지 항상성과 밀접하게 연관되어 있다면, 생체시계 유전자가 섭취-의존성 간 지질 및 당 대사에 영향을 미칠 수 있다고 본 발명자는 생각하였다. 대부분 생체시계 유전자의 발현이 시간 의존적 방식으로 변동하므로, 섭취 및/또는 재섭취 실험의 종점을 ZT3으로 고정하였다. 재 섭취시에, SREBP1c, FASN 및 ACC를 포함하는 지질생성 유전자의 발현이 간에서 상향조절되었다. 종래 연구와 일치하게도, PEPCK 및 G6Pase와 같은 당 신생과정의 유전자의 발현은 식사 후 상태에서는 하향조절되었다 (도 1의 a). 흥미롭게도, 간 CRY1 mRNA의 레벨이 재섭취된 마우스에서 증가하였다(도 1a도 1의 a). 또한, ZT 3일 때 CRY1 단백질의 발현이 재섭취된 마우스 간에서 현저히 증가하였다(도 1의 b). CRY1이 생체시계 핵심 유전자의 하나이므로, 본 발명자는 각각 CRY1 발현의 피크 및 트로프(trough) 타임인 ZT 22 및 ZT 10일 때 CRY1 유전자 발현을 조사하였다. 재섭취시에, CRY1, BMAL1, CLOCK, PER1, PER2 및 Reverbs를 포함하는 많은 생체시간 유전자의 발현이 ZT22일 때 상당히 변화하였지만, ZT 10일때는 대부분 그렇지 않았다. CRY1 발현의 기저 레벨이 ZT 22 및 ZT 10일때 서로 다르게 조절되었던 반면, 재섭취는 ZT 22일때 CRY1 mRNA 및 단백질 레벨이 ZT 10일때와 비교하여 증가하였다. 이러한 결과는, CRY1 발현이 특정 ZT 시점에서 영양적 자극에 의해 조절된다는 것을 의미한다. 이러한 발견으로 인해 본 발명자는 인슐린이 간 CRY1 유전자 발현을 증가시킬 수 있는지를 시험하였다. 일차 간세포에서, CRY1 mRNA 레벨은 SREBP1c mRNA와 유사하게 인슐린에 의해 증가하였다(도 1의 c). 종합하여 보면, 이러한 데이터는 간 CRY1 발현이 섭취 및 인슐린에 의해 상향조절되는 것을 나타낸다.
CRY1이 당코르티코이드 수용체 시그널링 및 글루카곤 시그널링 경로를 방해함으로써 간에서 당의 신생과정을 억제하는 것처럼 보인다고 보고되어 있다. CRY1는, 당 신생과정의 조절에 참여하는 당코르티코이드 수용체 및 글루카곤 수용체의 α-서브유닛과 상호작용한다. 그럼에도 불구하고, 인슐린에 노출된 후 영양이 풍부한 상태동안의 CRY1의 특이적 역할은 분명하게 설명되어 있지 않았다. CRY1가 글루카곤 시그널링 및/또는 당코르티코이드 수용체 의존성 경로를 저해함으로써 당신생과정을 억제할 수 있는지를 시험하기 위하여, 글루카곤 또는 당코르티코이드 자극에 대한 상태를 흉내내기 위하여 CRY1-과발현 일차 간세포를 포르스콜린(forskolin), db-cAMP 또는 덱사메타손으로 처리하였다. 일차 간세포에서, CRY1는 포르스콜린(forskolin), db-cAMP 또는 덱사메타손의 존재시에 당신생과정 유전자를 부분적으로 억제하는데, 이는 글루카곤 및 당코르티코이드 시그널링 경로에 추가하여, 간 포도당 생산을 억제하는, CRY1에 의해 조절되는 또다른 시그널링 캐스캐이드가 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 CRY1는 다양한 호르몬에 반응하여 간 당 신생과정을 조절하는 다양한 조절 경로에 포함된 것으로 보인다.
실시예 2. SREBP1c에 의한 CRY1 유전자 발현 조절
이어 인슐린-의존성 CRY1 유전자 발현을 조절하는 단백질을 조사하기 위하여, 원숭이, 소, 양, 인간, 랫트 및 마우스를 포함하는 다양한 종에서 CRY1 프로모터를 분석하였다. 프록시말 CRY1 프로모터에 E-BOX (CANNTG) 뿐만 아니라 몇몇 SRE(sterol regulatory element)가 있는데, 이는 또한 핵심 생체시계 단백질인 BMAL1 및 CLOCK에 대한 타겟 모티프이다. SRE 및 E-BOX 모티프 둘다 이중 DNA 결합 특이성을 가지는 SREBP1c의 잘 알려진 결합 타겟이다. SREBP1c가 CRY1 유전자 발현을 조절할 수 있는지를 알아보기 위하여, SREBP1c를 마우스 일차 간세포에 과발현시켰다. 도 2의 a, b에 나타난 바와 같이, 간 CRY1 mRNA 및 CRY1 단백질 레벨은 SREBP1c 과발현에 의해 증가하였는데(도 2의 a, b), 이는 SREBP1c가 식사 후 상태에서 간 CRY1 유전자 발현을 상향조절하는 주요 전사인자일 수 있다는 것을 암시한다. 다음으로, CRY1 프로모터 활성에 대한 SREBP1c의 이소성 발현의 효과를 조사하였다. 야생형 CRY1 프로모터 유래 루시퍼라아제의 발현을 HEK293T 세포에서 돌연변이 SRE 모티프(3XSRE)가 있는 프로모터로부터의 발현과 비교하였다. 본원에서는 3XSRE 서열 손실과 함께 프로모터 활성이 실질적으로 손실되지만 E-BOX 모티프 서열은 그렇지 않다는 것을 발견하였다(도 2의 c). 또한, CRY1 프로모터에 결합하는 SREBP1c를 ChIP 분석법으로 확인하였다(도 2의 d). 그 결과 간 SREBP1c는 G6Pase 및 PEPCK 발현을 감소시켰다(도 2a).
SREBP1c가 인슐린이 있을 때 CRY1 유전자 발현을 촉진시키는지를 조사하기 위하여, SREBP1c+/+ 및 SREBP1c-/- 마우스에서 분리한 일차 간세포 를 인슐린으로 챌린지하였다. SREBP1c+/+ 일차 간세포에서의 CRY1 단백질 레벨이 인슐린에 의해 현저히 높아진 반면 SREBP1c-/- 일차 간세포의 CRY1 단백질 레벨은 인슐린에 의해 더 낮은 정도로 증가하였다(도 2의 e). 또한 SREBP1c+/+ 마우스와는 반대로, SREBP1c-/- 마우스에서는 재섭취를 하더라도 간 CRY1 유전자 발현을 증가시키지 못하였다(도 2의f). 이러한 데이터는 SREBP1c이 식사 후 상태에서 간 CRY1 유전자 발현을 상향조절시키는 주요 인자라는 것을 의미한다.
실시예 3. SREBP1c - CRY1 경로에 의한 간의 당 신생과정 저해 규명
마우스 일차 간세포에서 SREBP1c 과발현은 포도당 생성을 감소시키는 것으로 나타났다(도 3의 a). 또한 광학 인 비보 이미지 분석에서, 간 SREBP1c 과발현은 인 비보 G6Pase 유전자의 프로모터 활성을 현저하게 억제하였다(도 3b). 따라서, G6Pase 및 PEPCK 유전자의 발현은 SREBP1c 과발현 마우스의 간에서 억제되었다. 이러한 발견으로 인해 인비보 혈당 레벨에 대한 SREBP1c의 효과에 대해 연구하게 되었다. PTT 시험에서 피루브산염 주입 후 SREBP1c의 아데노바이러스 과발현은 혈당 레벨을 상당히 감소시켰다(도 3의 c, d). 또한 SREBP1c-/- 마우스에서 SREBP1c+/+ 마우스보다 혈당이 더 높게 나타났다(도 3e,f). 이에 이러한 결과는, 간 SREBP1c가 당신생과정 유전자 발현을 강력하게 조절함으로써 당신생과정을 억제할 수 있다는 것을 의미한다.
이어 SRENBP1c의 신규타겟 유전자인 CRY1이 간 당 신생과정 유전자 발현을 조절하는지 조사하기 위하여, 랫트 간세포암 H4IIE 세포에서 siRNA(small interfering RNA)를 통해 CRY1 발현을 억제시켰다. CRY1이 하향조절되면, 간 당신생과정에 중요한 유전자인 G6Pase 및 PEPCK 유전자 발현이 증가하였다(도 3g). 반대로, 간 CRY1 과발현은 마우스 일차 간세포에서 G6Pase 및 PEPCK 유전자 발현을 감소시켰다(도 3h). 이러한 관찰을 확인하기 위하여, CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스에서 피루브산-유도의 혈당 레벨을 측정하였다. 도 3i,j에 나타난 바와 같이, CRY1+/+ 마우스보다 CRY1-/- 마우스에서 혈당 레벨이 더 높게 나타났다. CRY1가 SREBP1c에 의한 간 당 신생과정을 저해하는 주요 매개자인지를 알아보기 위하여, CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스 유래의 일차 간세포에서 포도당 생산 분석법을 수행하였다. 도 3k에 나타나 있는 바와 같이, SREBP1c 과발현에 의하여 CRY1+/+ 일차 간세포에서 포도당 생성이 약화된 반면 SREBP1c는 CRY1-/- 일차 간세포에서 포도당 생성을 억제하지 못하였다. SREBP1c-CRY 시그널링 경로가 실제 인비보 간 당 생성과정을 억제하는지를 알아보기 위하여, SREBP1-/- 마우스의 간에서 CRY1을 아데노바이러스성으로 과발현시켰다. PTT에서 SREBP1c+/+ 마우스보다 SREBP1c-/- 마우스에서 혈당 레벨이 더 높게 나타난 반면, CRY1 과발현된 SREBP1c-/- 마우스에서는 혈당 레벨이 감소되었다(도 3의 l,m). 이러한 데이터는 SREBP1c-CRY1 시그널링 경로가 인 비보에서 간 당 신생과정을 저해할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 4. CRY1에 의한 FOXO1 단백질 레벨 조절 규명
인슐린-유도 CRY1이 간 당신생과정을 억제하는 기저 매카니즘을 규명하기 위하여, 인슐린 시그널링 및 당 신생과정에 대한 FOXO1의 조절 효과가 잘 확립되어 있으므로 본 발명자는 FOXO1에 초점을 두었다. 마우스 일차 간세포에서 FOXO1 단백질의 레벨은 CRY1 과발현에 의해 감소된 반면(도 4의 a) FOXO1 mRNA 레벨은 변경되지 않았다(도 4b). 이러한 데이터는, FOXO1 mRNA와는 독립적으로, CRY1가 상기 단백질 레벨을 조절할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, FOXO1 단백질 레벨은 CRY1가 억제된 간세포에서 증가하였다(도 4의 c,d). 이러한 인 비트로 데이터와 일치하게도, FOXO1 단백질 레벨은 CRY1+/+ 마우스 간에서보다 CRY1-/- 마우스 간에서 더 높은 반면, FOXO1 mRNA 레벨은 CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스 사이에 다른 점이 없었다(도 4의 e, f). SREBP1c+/+ 마우스와 비교하여, FOXO1 단백질 및 G6Pase 및 PEPCK mRNA의 레벨이 SREBP1c-/- 마우스의 간에서는 증가된 반면 CRY1 단백질의 레벨은 감소되었다(도 4의 g). CRY1이 FOXO1을 통해 간 당 신생과정을 저해하는지를 입증하기 위하여 당 신생과정 유전자 발현에 대한 CRY1 및/또는 FOXO1 억제 효과를 조사하였다. FOXO1 유전자가 siRNA에 의해 하향조절될때 CRY1 억제에 의한 G6Pase 및 PEPCK 유전자의 발현 증가가 없어졌는데, 이는 FOXO1이 포도당신생과정을 조절하는 CRY1의 다운스트림 인자일 수 있다는 것을 암시하는 것이다. 이러한 인비보 및 인비트로 데이터는 CRY1이 FOXO1을 통해 간 포도당 신생과정을 억제 또는 완화시킬 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 5. 인슐린-활성화된 CRY1에 의한 FOXO1 단백질 감소 확인
FOXO1-매개 당 신생과정의 활성화는 인슐린에 의해 저해된다. AKT는 인슐린-활성화된 시그널링의 주요 다운스트림 분자로서, 그 후 14-3-3 단백질과의 연관을 통해 핵에서 세포질로 이동(translocation)한다 (Zhao, X. et al. Multiple elements regulate nuclear/cytoplasmic shuttling of FOXO1: characterization of phosphorylation- and 14-3-3-dependent and -independent mechanisms. Biochem. J. 378, 839849 (2004)). 일차 간세포에서, FOXO1 인산화는 인슐린에 의해 재빨리 증가한다. 그러나, 인슐린 작용 후기 단계에서 FOXO1 인산화의 감소에도 불구하고 간 당신생과정 프로그래밍은 지속적으로 그리고 효율적으로 억제된다. 흥미롭게도 간 CRY1 발현은 인슐린 작용의 상대적 후기 기간 동안 증가하였다(도 5a).
상기와 같은 AKT에 의한 핵에서 세포질로의 FOXO1의 이동(translocation)은 인슐린이 간 포도당 생성을 급성으로 저해하는 잘 알려진 기전이다. 인슐린이 CRY1을 상향조절하고 순차적으로 FOXO1 단백질을 하향조절하므로(도 1c 및 4a), 인슐린-처리된 일차 간세포에서 FOXO1 및 CRY1 단백질의 발현 프로파일을 조사하여 이들 사건을 시간 순서대로 연구하였다. 도 5의 a에 나타난 바와 같이, 비교적 짧은 기간(0-4h)동안 인슐린으로 처리된 세포에서 AKT 및 FOXO1의 인산화가 확실히 유도되었다. 종래 결과와 일치하게도, 단기간 인슐린 처리에 의해 FOXO1 단백질의 레벨이 감소되었으며, 이는 세포기질에서 FOXO1 유비퀴틴화 및 분해에 의해 매개되었다. 또한, AKT 및 FOXO1의 인산화 레벨은 장기간(8-12h) 인슐린 유도에 의하여 점차적으로 그리고 실질적으로 감소하였다. 장기긴 인슐린 처리(8-12h) 이후 보다는 단기간(0-4h) 인슐린에의 노출 후에, AKT에 의한 핵에서 세포질로의 FOXO1 이동이 일어나는 것으로 나타났다. 흥미로운 것은, 장기간(8-12h)동안 인슐린으로 처리된 간세포에서는, CRY1 단백질의 레벨이 현저하게 증가한 반면, 총 FOXO1 단백질의 레벨은 계속하여 감소하였는데, 이는 CRY1 단백질의 양은 FOXO1 단백질의 총 양과 역으로 연관되어 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 장기간(8-12h) 또는 단기간(0-4h) 인슐린 처리 후에 PEPCK 및 G6Pase 유전자의 발현이 하향조절되었다(도 5b). 이러한 데이터는, FOXO1 단백질의 지속적 감소가 장기간 인슐린 작용동안 간 포도당신생과정의 억제에 관여할 수 있다는 것을 의미한다.
다음으로, CRY1이 실지로 인슐린-처리된 간세포에서 FOXO1 단백질을 조절하는지를 조사하였다. 이점을 다루기 위하여, CRY1+/+ 및 CRY1-/- 일차 간세포를 시험하였다. 도 5의 c에 나타난 바와 같이, 인슐린-처리된 CRY1+/+ 일차 간세포에서 FOXO1 단백질의 레벨이 감소한 반면, 인슐린-처리된 CRY1-/- 일차 간세포에서 FOXO1 단백질의 레벨은 지속적으로 억제되지는 않았다. 인슐린 작용 후기에는, CRY1-/- 일차 간세포에서 PEPCK 및 G6Pase mRNA의 레벨 감소가 조금 그러나 실질적으로 증가하였다(도 5의 d). 또한, 장기간(8-12h) 인슐린-처리된 CRY1-/- 일차 간세포에서, 인슐린이 포도당 생성을 억제하지 못하였다(도 5e). 종합하여 보면, 이러한 데이터는 장기간 인슐린 작용할 동안(8-12h) FOXO1 단백질이 감소되어 있고 간 당신생과정 유전자의 발현을 CRY1이 억제할 수 있다는 것을 의미한다.
증가된 CRY1이 단기간 인슐린 작용(0-4h)이 없을 때에도 간 당신생과정을 억제할 수 있는지 알아보기 위하여, AKT 저해제를 이용하여 시험하였다. 일차 간세포에서, 인슐린이 AKT 및 FOXO1 둘 다의 인산화 레벨을 증가시켰지만, 반면 AKT 저해제인 AKTVIII와 같이 공동-처리하면 기대한 바와 같이 인산화가 저해되었다(도 5f). 그러나, CRY1-과발현된 간세포에서, 인슐린 처리 세포 및/또는 AKT 저해제 처리 세포에서 총 FOXO1 레벨이 감소되었는데, 이는 CRY1이 FOXO1 인산화와는 상관없이 독립적으로 FOXO1 단백질을 하향조절할 수 있다는 것을 의미한다(도 5의 f). 인 비보에서 이러한 발견을 확인하기 위하여, 또다른 AKT 저해제인 MK2206으로 마우스에서 시험하였다. 도 5의 g,h에 나타난 바와 같이, MK2206을 투여하면 피루브산 챌린지에 대한 혈당 레벨이 상당히 증가하였다. 그러나, 마우스에서 MK2206이 존재하더라도 아데노바이러스성 CRY1 과발현에 의해 혈당 레벨이 상당히 약화되었다. FOXO1 단백질의 레벨이 MK2206에 의해 상당히 증가된 반면 CRY1 증가에 의해 인 비보에서 FOXO1 단백질 발현은 억제되었다(도 5i). 이를 종합하여 보면, 이러한 데이터는 분명히 CRY1-1의존적 FOXO1 감소가 AKT 활성화와 상관없이 간 당신생과정을 억제하는데 기여한다는 것을 분명히 보여주는 것이다.
종합하여 보면, 본원의 인비보 및 인비보 데이터는, CRY1-의존성 FOXO1 분해가 장기간 인슐린 작용동안 간 당신생과정을 약화시키는 주요한 매카니즘의 하나 일수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 관찰결과는 초기 인슐린 반응에서는 AKT-매개 FOXO1 인산화로 인해 급성 포도당 합성 반응이 일어난 반면, SREBP1c-매개 CRY1 조절은 동화작용 전반에 걸쳐 간에서, 필요하지 않은 (futile) 당의 신생과정을 억제하게 하는 보다 지속적인 반응에 관여하는 것을 나타낸다(도 9).
실시예 6. CRY1에 의한 FOXO1의 프로테아좀 분해 자극 규명
CRY1 과발현이 FOXO1 단백질 레벨을 감소시키지만 FOXO1 mRNA 레벨은 감소시키지 않으므로, FOXO1 하향조절이 프로테아좀 분해를 통해 이루어질 수도 있는지를 조사하였다. 도 6의 a에 나타난 바와 같이, CRY1 과발현에 의한 FOXO1 단백질 감소가 MG132에 의해 완화될 수 있는데, 이는 CRY1에 의한 FOXO1 단백질의 조절이, 최소 일 부분은, 프로테아좀 분해에 의해 좌우된다는 것을 의미한다. FOXOa 및 CRY1 단백질 사이의 물리적 상호작용을 시험해 보았을 때, 공동-면역침전 분석법에서 CRY1이 FOXO1 단백질과 상호작용할 수 있다는 것이 나타났다(도 6의 b). 그 후, CRY1이 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통해 FOXO1 분해를 유도할 수 있는지를 조사하였다. 도 6c에 나타난 바와 같이, CRY1 과발현은 FOXO1 폴리-유비퀴틴화를 극적으로 촉진시켰는데, 이는 CRY1이 아마도 단백질-단백질 상호작용을 통해 FOXO1 분해를 강화시킬 수 있다는 것을 의미한다.
CRY1에 의해 유도된 FOXO1 분해시의 세포내(subcellular) 위치를 탐구하기 위하여, 핵 및 세포기질 FOXO1 단백질의 레벨을 조사하였다. 도 6의 d에 나타난 바와 같이, CRY1 과발현에 의하여 FOXO1 단백질의 핵 분획은 감소한 반면 MG132와 배양으로 이러한 감소는 방지되었다. 동시에, 세포기질 FOXO1의 레벨은, MG132의 존재와 상관없이, CRY1 과발현에 의해 변경되지 않았다. 이러한 결과와 일치하게도 FOXO1 돌연변이 단백질의 핵 형태의 폴리유비퀴틴화(nFOXO1-MYC)는 CRY1에 의하여 상당히 증가되었다(도 6의 e). 따라서, 이는 폴리-유비퀴틴화를 통한 FOXO1 단백질의 분해가 핵에서 CRY1에 의해 자극받는다는 것을 나타낸다.
실시예 7. CRY1의 MDM2 -매개 FOXO1 분해 관여 규명
FOXO1 단백질의 여러 유비퀴틴 E3 리가아제 중에서, MDM2 유비퀴틴 E3 리가아제가 CRY1-매개 FOXO1 분해에 관여하는 것으로 나타났다. 도 7의 a에 나타난 바와 같이, CRY1-과발현 세포에서 MDM2 억제에 의해 FOXO1 단백질의 레벨이 현저하게 회복되었는데, 이는 MDM2가 CRY1-의존성 FOXO1 감소에 참여할 수 있다는 것을 암시한다. MDM2-매개 FOXO1 분해에서의 CRY1의 역학을 조사하기 위하여, CRY1이 MDM2의 준세포(subcellular) 위치를 조절할 수 있는지를 알아보았다. 야생형 CRY1 및 세포기질 CRY1 (DNLS-CRY1)은 핵 MDM2의 준세포 위치를 변경시키지 않았다. 그 대신, CRY1이 FOXO1 및 MDM2 사이의 관련을 강화시킨다는 것을 밝혔다(도 7의 b).
다른 실험에서, CRY1이 MDM2-매개 FOXO1 분해를 조절할 수 있는지를 조사하였다. 도 7의 c,d에 나타난 바와 같이, CRY1 과발현에 의하여 FOXO1 단백질의 핵 형태의 MDM2-매개 폴리-유비퀴틴화가 촉진된 반면(도 7의 c), CRY1 억제에 의해 MDM2에 의한 FOXO1 폴리유비퀴틴화가 약화되었다(도 7의 d). 이러한 데이터는 CRY1이 MDM2-유도 FOXO1 분해에 의해 FOXO1-매개 간 포도당 생산을 억제할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 8. 제 1 형 및 제 2 형 당뇨 마우스 모델에서 CRY1에 의한 고혈당의 완화 확인
STZ 마우스는 1형 당뇨병의 대표 모델로서 인슐린을 분비하는 췌장의 베타 세포에 문제가 발생하여 인슐린이 분비되지 않는 마우스이다. db/db 마우스는 2형 당뇨병의 대표모델로 췌장의 베타 세포에서는 인슐린이 분비되나, 간, 지방세포 및 근육에서 인슐린 수용체 하위 신호가 문제가 발생하여 인슐린이 있음에도 인슐린 신호가 전달되지 않는 현상을 동반한다. 이와 같은 상황에서는 결국 베타세포에 과부하가 걸려 베타세포도 망가져서 인슐린도 분비되지 않는 상황이 발생한다.
각각의 마우스를 이용한 실험결과에서 인슐린 분비의 문제 뿐 아니라 인슐린 신호전달 경로의 문제 모두에서 CRY1의 과발현을 통해 포도당 생합성을 억제할 수 있는 현상을 관찰하였고, 이는 본원에 따른 CRY1의 제 1 형 당뇨병 뿐 아니라 제 2형 당뇨병의 치료적 표적이 될 수 있음을 나타내는 것이다.
스트렙토조토신(STZ)-처리 인슐린-결핍 마우스는 FOXO1 단백질 레벨을 포함하는 당 신생과정 프로그램 뿐만 아니라 고혈당 증상을 가지며, 이때 PEPCK 및 G6Pase 유전자 발현 증가가 동시에 일어났다(도 8의 a-c). SREBP1c-CRY1 축이 인슐린에 의해 상향조절되기 때문에 STZ-처리 인슐린-결핍 마우스의 간에 CRY1을 과발현시켰다. 도 8의 d에 나타난 바와 같이, CRY1 과발현은 STZ-처리 마우스에서 혈당 레벨을 감소시켰다. 또한, CRY1는 PEPCK 및 G6Pase 유전자 발현 뿐만 아니라 FOXO1 단백질 레벨도 감소시켰다(도 8의 e,f). 이러한 데이터는 CRY1이 인슐린 작용시 간 포도당 생산을 억제하는 주요한 인자 중 하나라는 것을 의미한다.
흥미롭게도, db/db 및 식이-유도 비만 마우스와 같은 비만 동물의 간에서, 간 당 신생과정이 억제되지 않는 동안에도 SREBP1c 레벨이 높아졌다. 간 당신생과정의 조절에서 어느 과정이 탈조절되는지를 조사하기 위하여, 당뇨 동물에서 SREBP1c-CRY1 축 및 당신생과정 유전자에 대한 mRNA 및 단백질 레벨을 조사하였다. 종래 연구와 유사하게도, SREBP1c 및 당신생과정 유전자의 mRNA 레벨이 db/db 마우스에서는 높았다(도 8의 g). 그러나 db/db 마우스에서 간 CRY1 단백질은 실질적으로 감소하였고 MDM2 단백질의 레벨은 유의하게 변하지는 않았다(도 8의 h). 유사하게도, 식이-유도 비만 마우스에서는 SREBP1c 및 당 신생과정 유전자 발현이 높게 나타난 반면 CRY1은 활성화되지 않았다. 당뇨 동물에서 탈조절된 CRY1 단백질이 FOXO1 단백질이 증가되어 있는 과혈당증을 매개할 수 있다는 것을 착안하여 이를 시험하고자, db/db 마우스의 간에 CRY1을 아데노바이러스로 과발현시켰다. 도 8의 i에 나타난 바와 같이, 피루브산염-유도 혈당 레벨은 CRY1-과발현 db/db 마우스에서 감소되었다. 또한 섭취(feeding) 혈당 레벨은 CRY1 과발현에 의하여 감소되었다(도 8의 j). 추가로, 이소성 CRY1 발현은 db/db 마우스에서 당신생과정 유전자 발현 뿐만 아니라 FOXO1 단백질 레벨을 감소시켰다(도 8의 k,l). 이러한 결과는 CRY1이 db/db 마우스에서 FOXO1 단백질의 레벨을 억제함으로써 고혈당을 완화시킬 수 있다는 것을 의미하며 선택적인슐린 저항성의 치료에 사용될 수 있음을 나타낸다.
하루주기 리듬(circadian rhythmic) 조절의 주요 인자 중 하나로서, CRY1 발현은 다양한 전사 인자 및 후생적(epigenetic) 조절에 의해 영향을 받는다. 비록 본 발명의 인비보 및 인비트로 데이터에서 CRY1 발현은 인슐린 및 SREBP1c에 의해 촉진되었지만, CRY1 변화주기 중 트루프(trhough) 지점인 ZT 10일때 재섭취에 의하여 CRY1 mRNA 발현이 높아지지 않았다. 이러한 데이터는 증가된 SREBP1c가 ZT 10일 때 CRY1를 활성화시키기엔 충분하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 역으로, 상기 주기 중 피크 지점인 ZT 22일때 재섭취에 의하여 CRY1 mRNA 및 단백질의 레벨이 세게 증가하였는데, 이는 아마도 다른 생체주기 조절 인자와 함께, SREBP1c가 CRY1 발현을 증가시킨다는 것을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 다른 생체시계 유전자 뿐만 아니라 CRY1도 ZT 22일때 간 당신생과정을 조절하는데 기여하는지가 설명되어야 한다.
다른 한편으로, SREBP1c 결핍이 간 생체시계 유전자 주기(oscillation)을 변경시킬 수 있는지에 대해 알아보았다. SREBP1c+/+ 및 SREBP1c-/- 마우스에서 간 생체시계 유전자 주기가 서로 많이 다르지는 않았다. 물론, CRY1-/-CRY2-/- 이중-돌연변이 마우스와 비교하여 CRY1-/- 마우스가 생체시계 진동에서 더 적은 변화를 나타내기 때문에, SREBP1c-/- 마우스에서 간 생체시계 진동에 대해 SREBP1c-유도된 CRY1이 작은 역할을 할 수도 있다는 가능성을 배제할 수 없었다. 나아가, SREBP1c-/- 마우스에 남아있는 SREBP1a 및/또는 SREBP2 활성이 온전한 생체시계 유전자 진동을 유지시킬 가능성이 역시 있으며 이러한 항상성 조절을 장래 더 연구가 필요하다. 그럼에도 불구하고, 간 CRY1 유전자 발현은 분명히 섭취/인슐린-매개 SREBP1c에 의해 상향조절된다.
종래 논문과 일치하게도, 야행성 동물에서 섭취 행동이 우세하게 일어날 때인 밤시간(ZT 12-24)에 간 CRY1이 증가하였다. 비록 SREBP1c-/- 마우스에서 생체시계 주기가 서로 많이 다르게 나타나지 않았지만, SREBP1c 발현은 또한 밤시간(ZT 12-24)에 증가하였다. SREBP1c 및 CRY1의 발현 프로파일과는 달리, FOXO1 단백질의 레벨이 밤시간에는 감소되는 것으로 나타났는데, 이는 SREBP1c 및 CRY1의 생체시계 주기가 FOXO1의 조절에 의한 주행성 포도당 생산을 억제하는데 기여할 수 있다는 것을 암시하는 것이다.
SREBP1c가 당 신생과정 및 지질생성과정 둘 다를 동시에 조절할 수 있으므로, 서로 다른 타겟 유전자 존재시의 인슐린 시그널링에 대해 지방산 대사를 상향조절하고 당 대사를 하향조절함으로써 간 SREBP1c가 동화작용 경로를 효율적으로 조정할 수 있다고 추측하는 것이 가능하다. 본 발명은, 동화작용 상태에서 간 당대사의 조절에 필수적인, CRY1 활성화에서의 SREBP1c의 역할을 최초로 밝혔다. SREBP1c-/- 마우스에서의 생체시계 진동 유전자 발현 프로파일을 기초로, SREBP1c가 간 생체시계를 능동적으로 지배하지는 못하는 것으로 보인다. 오히려, 식후 상태동안 간 CRY1의 증가된 발현은, 시계-의존적 방식(clock-gated manner)에서, 인슐린-활성화된 SREBP1c에 의하여 우선적으로 조절되고, 궁극적으로는 FOXO1 분해를 통해 포도당 생산의 억제로 이끈다(도 9). 본 발명은 생리적 병리적 상태에서 간 SREBP1c 및 포도당 항상성을 연결하는 분자 매카니즘을 이해하는데 중요한 실마리를 제공한다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (9)

  1. CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병을 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 당뇨병은 제 2 형 당뇨병이며, 상기 제 2 형 당뇨병 환자는 선택적 인슐린 저항성이 수반된 것인, 당뇨병 치료용 약학적 조성물.
  3. SREBP1c-CRY1-FOXO1 신호전달 경로를 표적으로 하는 당뇨병 치료제 또는 포도당생합성 억제제 스크리닝 방법으로, 상기 방법은
    CRY1의 발현 또는 활성이 감소된 세포 또는 동물을 제공하는 제 1 단계;
    상기 세포를 CRY1의 발현 또는 활성을 증가시킬 것으로 기대되는 시험물질로 처리하는 제 2 단계;
    상기 시험물질로 처리된 세포에서 FOXO1 단백질 농도를 측정하는 제 3 단계; 및;
    상기 측정결과 상기 FOXO1 단백질 양이 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군에서 FOXO1 단백질 양과 비교하여 감소한 경우 이를 당뇨병 치료제 또는 포도당 생합성 억제 후보물질로 선별하는 제 4 단계를 포함하는, 당뇨병 치료제 또는 포도당 생합성 억제제 스크리닝 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 제 1 단계의 CRY1의 발현 또는 활성이 감소된 세포 또는 동물은 SREBP1c의 발현이 증가된 것인, 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 제 1 단계의 동물은 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병 모델 마우스이고, 상기 제 1 단계의 세포는 상기 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병 마우스 유래의 일차 간세포, 또는 H4IIE 또는 HepG2 세포주를 포함하는 포도당 생합성능을 갖는 세포인, 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 제 3 단계 대신에 또는 이에 부가하여 상기 FOXO1에 의해 발현이 촉진되는 포도당 생합성에 관여하는 효소인 PEPCK 및/또는 G6Pase의 발현을 측정하는 단계를 포함하며, 그리고
    이 경우 상기 제 4 단계에서 상기 후보물질은 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여 상기 PEPCK 또는 G6Pase의 발현이 감소한 것인, 방법.
  7. CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 인비트로의 세포 또는 동물에서 SREBP1c-CRY1-FOXO1 신호전달 경로 조절용 키트.
  8. CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 인비트로의 간세포 또는 동물에서 포도당 생합성 억제용 키트.
  9. 인비트로의 간세포 또는 동물에 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 처리하는 단계를 포함하는, 포도당 생합성 억제방법으로, 상기 간세포 및 동물은 SREBP1c 발현은 증가되고 CRY1 단백질의 발현 또는 활성은 감소된 것인, 방법.
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Eric E. Zhang, et al. Nat Med. 2010 Oct; 16(10): 1152-1156. (2010.09.19)* *

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