JP2003079381A - 新規タンパク質およびそのｄｎａ - Google Patents

新規タンパク質およびそのｄｎａ

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JP2003079381A JP2001396686A JP2001396686A JP2003079381A JP 2003079381 A JP2003079381 A JP 2003079381A JP 2001396686 A JP2001396686 A JP 2001396686A JP 2001396686 A JP2001396686 A JP 2001396686A JP 2003079381 A JP2003079381 A JP 2003079381A
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Nozomi Katayama
望 片山
Mihoko Kawamura
美穂子 河村
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 Ｎａ+／グルコーストランスポーター活性を
有する新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮ
Ａ、該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物の
スクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる
化合物などの提供。 【解決手段】ヒト由来の特定なアミノ酸配列と同一もし
くは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質は
糖尿病等の診断マーカー等として有用であり、該タンパ
ク質を用いるスクリーニング法により得られる該タンパ
ク質の活性を促進または阻害する化合物は、例えば、糖
尿病、高脂血症などの疾病の予防・治療剤として使用す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎａ+／グルコー
ストランスポーター活性を有するタンパク質（SGLTホモ
ログ）、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの
一塩基多型（ＳＮＰｓ）体、該タンパク質の活性を促進
または阻害する化合物のスクリーニング方法、該スクリ
ーニング方法で得られる化合物などを提供する。
【０００２】
【従来の技術】グルコースが細胞内外を移行するには、
細胞膜上に糖輸送担体と呼ばれる膜タンパクが必要であ
る。グルコースの輸送担体は、受動輸送担体である促通
拡散型グルコーストランスポーター (GLUT)とNa+イオン
輸送と共役することでグルコースを濃度勾配に逆らって
輸送する能動輸送担体であるNa+/グルコーストランスポ
ーター (SGLT)に大別される。GLUT は、8種類のアイソ
フォームが存在し、分子量約5万の細胞膜を12回貫通す
る共通構造を有している。SGLT は、分子量7.5万の細胞
膜を14回貫通する共通構造を有している。日本臨床 5
5, 1997、増刊号、糖尿病I、59-64にはSGLT1および2の
機能や発現部位が概説されている。ヒトSGLT1 は、小
腸、腎臓に特異的に発現しグルコースに対して高親和性
で輸送能は小さく、ヒトSGLT2 は、腎臓特異的に発現し
グルコースに対して低親和性で輸送能は大きい事が知ら
れている。SGLTは、グルコースの小腸からの吸収と、腎
臓から一旦尿中に排出されたグルコースを再吸収する役
割を担っている。糖尿病モデルラットにおいて、SGLTを
阻害することで、腎臓におけるグルコースの再吸収を抑
制し、尿中にグルコースを排出することで血糖を降下す
る作用が示されている。(Diabetes 48:1794-1800,1999)
これまで、膵β細胞、肝細胞では、受動輸送担体である
GLUT2 が主に発現していると考えられてきた。GLUT2 は
グルコースに対する低い親和性と高い最大輸送能を特徴
とする。膵β細胞では、血糖値に応じてグルコースを取
り込み、グルコキナーゼと共にグルコース濃度依存性の
インスリン分泌作用を示すためのグルコースセンサーと
して機能していると考えられている。肝細胞では、細胞
内外のグルコース濃度勾配に従って、食後高血糖時には
血中グルコースを細胞内に取り込み、空腹時にはグリコ
ーゲン分解、あるいは糖新生によって細胞内で作られた
グルコースを血中に放出する糖輸送担体として機能して
いる。ヒトSGLT1 は、小腸細胞において消化管ホルモン
であるGLP-2の作用で細胞内から膜表面に移行し、糖取
り込み活性が3倍に増加するという報告(Am.J.Physiol.2
73 R1965-R1971, 1997)がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】現在使用されているイ
ンスリン分泌促進薬（SU剤）は、膵β細胞のKATPチャネ
ルを閉鎖することにより、血糖値に関わらず強制的にイ
ンスリンを分泌させる。従って、血糖コントロールが難
しく低血糖を起こしたり、過剰なインスリン分泌により
肥満を誘発したりする副作用があると考えられている。
また、平均して10年で薬が効かなくなるSU剤の二次無効
と呼ばれる現象が起きるが、膵β細胞に疲弊を起こすの
が原因とも考えられている。SGLTホモログ機能を賦活化
することにより、膵β細胞への糖取り込みを促進し、血
糖値依存性のインスリン分泌を亢進することが期待でき
る。また、SGLT機能の賦活化薬には、現在使用されてい
るインスリン分泌促進薬（SU剤）の前記副作用は起きな
いものと期待される。肝細胞においては、GLUT2が空腹
時は肝臓から血中へグルコースを放出するのに対して、
SGLTホモログは細胞内外のグルコース濃度勾配に関わ
らず血中から肝臓への糖取り込みを促進するものと考え
られ、肝臓から血中への糖放出を抑制することが期待で
き、糖尿病患者に認められる空腹時高血糖を低血糖など
の副作用を起こさずに抑制することが期待できる。さら
に、SGLT阻害薬は、腎臓からの糖の再吸収を抑制するこ
とで血糖を下げることができ、肝臓への糖取り込みを抑
制することで脂肪合成を抑制することが期待できる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規Na+／
グルコーストランスポータータンパク質（ヒトSGLTホモ
ログ、マウスSGLTホモログおよびラットSGLTホモログ）
を見出した。該ヒトSGLTホモログ はアミノ酸レベル
で、ヒトSGLT1 と52%、ヒト SGLT2 と52% 、マウスSGLT
1と53％、マウスSGLT2 と51% 、ラットSGLT1と52％およ
びラット SGLT2 と51% の高い相同性を示し、該マウスS
GLTホモログ はアミノ酸レベルで、ヒトSGLT1 と52%、
ヒト SGLT2と52% 、マウスSGLT1と53％、マウス SGLT2
と50% 、ラットSGLT1と52％およびラット SGLT2 と50%
の高い相同性を示し、該ラットSGLTホモログ はアミノ
酸レベルで、ヒトSGLT1 と52%、ヒト SGLT2 と52% 、マ
ウスSGLT1と53％、マウス SGLT2 と49% 、ラットSGLT1
と52％およびラット SGLT2 と48% の高い相同性を示
す。該ヒト、マウスおよびラットSGLTホモログは、何れ
も14回膜貫通型の構造を有しており、グルコースの能動
輸送担体として機能し得るものである。該ヒトSGLTホモ
ログの発現分布はヒトSGLT1, 2 と異なり、膵臓、肝臓
でもっとも発現が高く、該ラットSGLTホモログは腎臓で
発現が高く、ラットSGLTホモログは平滑筋および腎臓で
発現が高い。SGLTホモログを賦活化する方法としては、
例えばSGLTホモログのプロモーターを活性化したり、mR
NAを安定化することで発現レベルを亢進することが考え
られる。また、SGLTホモログを細胞内から膜表面に移行
し、細胞膜上で機能するSGLTホモログの数を増やすこと
も考えられる。本発明者らは、これらの知見に基づい
て、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至っ
た。
【０００５】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有す
る前記（１）項記載のタンパク質またはその塩、（３）
配列番号：１５または配列番号：２６で表わされるアミ
ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するタンパク質またはその塩、（４）配列番号：１
５または配列番号：２６で表わされるアミノ酸配列を含
有する前記（３）項記載のタンパク質またはその塩、
（５）前記（１）項記載のタンパク質の部分ペプチドま
たはその塩、（６）前記（３）項記載のタンパク質の部
分ペプチドまたはその塩、（７）前記（１）項記載のタ
ンパク質または前記（５）項記載の部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（８）前記（３）項記
載のタンパク質または前記（６）項記載の部分ペプチド
をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（９）配列番
号：２で表わされる塩基配列を有する前記（７）項記載
のＤＮＡ、（１０）配列番号：７で表わされる塩基配列
を有する前記（７）項記載のＤＮＡ、（１１）配列番
号：１６または配列番号：２７で表わされる塩基配列を
有する前記（８）項記載のＤＮＡ、（１２）前記（７）
項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、（１３）前
記（８）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（１４）前記（１２）項記載の組換えベクターで形質転
換された形質転換体、（１５）前記（１３）項記載の組
換えベクターで形質転換された形質転換体、（１６）前
記（１４）項記載の形質転換体を培養し、前記（１）項
記載のタンパク質または前記（５）項記載の部分ペプチ
ドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
る前記（１）項記載のタンパク質もしくは前記（５）項
記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、（１７）前
記（１５）項記載の形質転換体を培養し、前記（３）項
記載のタンパク質または前記（６）項記載の部分ペプチ
ドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
る前記（３）項記載のタンパク質もしくは前記（６）項
記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、（１８）前
記（１）項記載のタンパク質もしくは前記（５）項記載
の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、（１
９）前記（３）項記載のタンパク質もしくは前記（６）
項記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医
薬、（２０）前記（７）項記載のＤＮＡを含有してなる
医薬、（２１）前記（８）項記載のＤＮＡを含有してな
る医薬、（２２）前記（１）項または前記（３）項記載
のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する
ポリヌクレオチドもしくは前記（５）項または前記
（６）項記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを含有するポリヌクレオチドを含有することを特徴
とする診断剤、（２３）前記（１）項記載のタンパク質
もしくは前記（５）項記載の部分ペプチドまたはその塩
に対する抗体、（２４）前記（３）項記載のタンパク質
もしくは前記（６）項記載の部分ペプチドまたはその塩
に対する抗体、（２５）前記（２３）項または前記（２
４）項記載の抗体を含有することを特徴とする診断剤、
（２６）前記（１）項記載のタンパク質もしくは前記
（５）項記載の部分ペプチドまたはその塩を用いること
を特徴とする、前記（１）項記載のタンパク質もしくは
前記（５）項記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を
促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法、（２７）前記（３）項記載のタンパク質もしく
は前記（６）項記載の部分ペプチドまたはその塩を用い
ることを特徴とする、前記（３）項記載のタンパク質も
しくは前記（６）項記載の部分ペプチドまたはその塩の
活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ
ーニング方法、（２８）前記（７）項または前記（８）
項記載のＤＮＡのプロモーター下流にレポーター遺伝子
を挿入したＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換
させた形質転換体を用いることを特徴とする、前記
（１）項もしくは前記（３）項記載のタンパク質または
前記（５）項もしくは前記（６）項記載の部分ペプチド
の発現を促進または抑制する化合物またはその塩のスク
リーニング方法、（２９）前記（１）項記載のタンパク
質もしくは前記（５）項記載の部分ペプチドまたはその
塩を含有してなる、前記（１）項記載のタンパク質もし
くは前記（５）項記載の部分ペプチドまたはその塩の活
性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー
ニング用キット、（３０）前記（３）項記載のタンパク
質もしくは前記（６）項記載の部分ペプチドまたはその
塩を含有してなる、前記（３）項記載のタンパク質もし
くは前記（６）項記載の部分ペプチドまたはその塩の活
性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー
ニング用キット、（３１）前記（２６）項記載のスクリ
ーニング方法または前記（２９）項記載のスクリーニン
グ用キットを用いて得られる、前記（１）項記載のタン
パク質もしくは前記（５）項記載の部分ペプチドまたは
その塩の活性を促進する化合物またはその塩、（３２）
前記（２７）項記載のスクリーニング方法または前記
（３０）項記載のスクリーニング用キットを用いて得ら
れる、前記（３）項記載のタンパク質もしくは前記
（６）項記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進
する化合物またはその塩、（３３）前記（２６）項記載
のスクリーニング方法または前記（２９）項記載のスク
リーニング用キットを用いて得られる、前記（１）項記
載のタンパク質もしくは前記（５）項記載の部分ペプチ
ドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、
（３４）前記（２７）項記載のスクリーニング方法また
は前記（３０）項記載のスクリーニング用キットを用い
て得られる、前記（３）項記載のタンパク質もしくは前
記（６）項記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を阻
害する化合物またはその塩、（３５）前記（２６）項記
載のスクリーニング方法または前記（２９）項記載のス
クリーニング用キットを用いて得られる前記（１）項記
載のタンパク質もしくは前記（５）項記載の部分ペプチ
ドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を
含有してなる医薬、（３６）前記（２７）項記載のスク
リーニング方法または前記（３０）項記載のスクリーニ
ング用キットを用いて得られる前記（３）項記載のタン
パク質もしくは前記（６）項記載の部分ペプチドまたは
その塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有して
なる医薬、（３７）前記（２６）項記載のスクリーニン
グ方法または前記（２９）項記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られる前記（１）項記載のタンパク質も
しくは前記（５）項記載の部分ペプチドまたはその塩の
活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医
薬、（３８）前記（２７）項記載のスクリーニング方法
または前記（３０）項記載のスクリーニング用キットを
用いて得られる前記（３）項記載のタンパク質もしくは
前記（６）項記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を
阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、（３
９）糖尿病の予防・治療剤である前記（１８）項または
前記（２０）項記載の医薬、（４０）糖尿病の予防・治
療剤である前記（１９）項または前記（２１）項記載の
医薬、（４１）糖尿病の予防・治療剤である前記（３
５）項記載の医薬、（４２）糖尿病の予防・治療剤であ
る前記（３６）項記載の医薬、（４３）高脂血症の予防
・治療剤である前記（３７）項記載の医薬、（４４）高
脂血症の予防・治療剤である前記（３８）項記載の医
薬、（４５）糖尿病・高脂血症の診断剤である前記（２
２）項または前記（２５）項記載の診断剤、（４６）前
記（１）項もしくは前記（３）項記載のタンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド
または前記（５）項もしくは前記（６）項記載の部分ペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌ
クレオチドを用いることを特徴とする糖尿病・高脂血症
の診断方法、（４７）前記（２３）項または前記（２
４）項記載の抗体を用いることを特徴とする糖尿病・高
脂血症の診断方法、（４８）哺乳動物に対して、前記
（３１）項または前記（３２）項記載の化合物またはそ
の塩の有効量を投与することを特徴とする糖尿病の予防
・治療方法、（４９）哺乳動物に対して、前記（３３）
項または前記（３４）項記載の化合物またはその塩の有
効量を投与することを特徴とする高脂血症の予防・治療
方法、（５０）糖尿病の予防・治療剤を製造するための
前記（３１）項または前記（３２）記載の化合物または
その塩の使用、（５１）高脂血症の予防・治療剤を製造
するための前記（３３）項または前記（３４）項記載の
化合物またはその塩の使用、（５２）配列番号：２、配
列番号：１６または配列番号：２７で表される塩基配列
を含有するＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰｓ）体、（５
３）配列番号：４０、配列番号：４２または配列番号：
４５の何れかで表される塩基配列を含有する前記（５
２）項記載の一塩基多型（ＳＮＰｓ）体、（５４）前記
（５２）項記載の一塩基多型（ＳＮＰｓ）体にコードさ
れるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（５５）配列番号：４１、配列番号：４３または配列番
号：４６の何れかで表されるアミノ酸配列を含有する前
記（５４）項記載のタンパク質またはその塩、（５６）
配列番号：５１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、
（５７）配列番号：５１で表される塩基配列を含有する
ＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰｓ）体、（５８）配列番
号：５４、配列番号：５５または配列番号：５６の何れ
かで表される塩基配列を含有する前記（５７）記載の一
塩基多型（ＳＮＰｓ）体、（５９）前記（５２）項記載
の一塩基多型（ＳＮＰｓ）体を含有する組換えベクタ
ー、（６０）前記（５６）項記載のＤＮＡまたは前記
（５７）項記載の一塩基多型（ＳＮＰｓ）体を含有する
組換えベクター、（６１）前記（５９）項記載の組換え
ベクターで形質転換された形質転換体、（６２）前記
（６０）項記載の組換えベクターで形質転換された形質
転換体、（６３）前記（６１）項記載の形質転換体を培
養し、前記（５４）項記載のタンパク質を生成、蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする前記（５４）項
記載のタンパク質またはその塩の製造法、（６４）前記
（５２）項記載の一塩基多型（ＳＮＰｓ）体を含有して
なる医薬、（６５）前記（５４）記載のタンパク質また
はその塩を含有してなる医薬、（６６）糖尿病または高
脂血症の予防・治療剤である前記（６４）項または前記
（６５）項記載の医薬、（６７）前記（５２）項または
前記（５７）項記載の一塩基多型（ＳＮＰｓ）体を含有
してなる診断剤、（６８）さらに、配列番号：２、配列
番号：１６、配列番号：２７または配列番号：５１で表
される塩基配列を含有するＤＮＡまたはその一部を含有
する前記（６７）項記載の診断剤、（６９）糖尿病また
は高脂血症の診断剤である前記（６７）項記載の診断
剤、（７０）前記（５２）項または前記（５７）項記載
の一塩基多型（ＳＮＰｓ）体を解析することを特徴とす
る糖尿病または高脂血症の診断方法などを提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明で用いられる配列番号：
１、配列番号：１５および配列番号：２６で表されるア
ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質また
は本発明で用いられるタンパク質と称することもある）
は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マ
ウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルな
ど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリ
ア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ラ
ンゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮
細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂
肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細
胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基
球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨
細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは
間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしく
はガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあら
ゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃
核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延
髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生
殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、
消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、
顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、
骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であっても
よく、合成タンパク質であってもよい。
【０００７】配列番号：１、配列番号：１５および配列
番号：２６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列としては、配列番号：１、配列番号：１５お
よび配列番号：２６で表わされるアミノ酸配列と約６０
％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８
０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましく
は約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙
げられる。配列番号：１、配列番号：１５および配列番
号：２６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記
の配列番号：１、配列番号：１５および配列番号：２６
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有し、配列番号：１、配列番号：１５および配列番
号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好まし
い。実質的に同質の活性としては、例えば、グルコース
の能動輸送活性などが挙げられる。実質的に同質とは、
それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理
学的に）同質であることを示す。したがって、グルコー
スの能動輸送活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、
好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜
２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、
タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ
い。グルコースの能動輸送活性などの活性の測定は、公
知の方法に準じて行うことが出来るが、例えば、Clonin
g and functional expression of an SGLT-1-likeprote
in from the Xenopus laevis intestine (Am. J. Phisi
ol. 276: G1251-G1259, 1999)に記載の方法またはそれ
に準じる方法に従って測定することができる。
【０００８】また、本発明で用いられるタンパク質とし
ては、例えば、配列番号：１、配列番号：１５または
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列中の１または２
個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜
１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミ
ノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１、配列番
号：１５または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列
に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好
ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜
５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番
号：１、配列番号：１５または配列番号：２６で表され
るアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜
３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好まし
くは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸
配列、配列番号：１、配列番号：１５または配列番
号：２６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個
程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれ
らを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質な
どのいわゆるムテインも含まれる。前記のようにアミノ
酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿
入、欠失または置換の位置は、とくに限定されない。
【０００９】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１、
配列番号：１５または配列番号：２６で表わされるアミ
ノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明
で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基
（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ-）、アミ
ド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何
れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとして
は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロ
ピル、ｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シ
クロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアル
キル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12
アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェ
ニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルな
どのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラ
ルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられ
る。本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカル
ボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場
合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されて
いるものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。
この場合のエステルとしては、例えば前記したＣ末端の
エステルなどが用いられる。さらに、本発明で用いられ
るタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオ
ニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、
アセチル基などのＣ 1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル
基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生
成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化し
たもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−
ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール
基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホル
ミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などの
Ｃ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは
糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパ
ク質なども含まれる。本発明で用いられるタンパク質の
具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列を含有するヒト膵臓由来のタンパク質、配列番
号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するマウス腎臓
由来のタンパク質および配列番号：２６で表されるアミ
ノ酸配列を含有するラット腎臓由来のタンパク質などが
あげられる。
【００１０】本発明で用いられるタンパク質の部分ペプ
チドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質
の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明
で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであ
ればいずれのものでもよい。例えば、本発明で用いられ
るタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０
個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０
個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは
２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用
いられる。また、本発明で用いられる部分ペプチドは、
そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、
１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）の
アミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１また
は２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好まし
くは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）
個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に
１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より
好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜
５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸
配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程
度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程
度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよ
い。本発明の部分ペプチドとしては、配列番号：１で表
されるアミノ酸配列において例えば第176番目〜201番
目、第471番目〜491番目のアミノ酸配列を含有するペプ
チドが好ましい。配列番号：15で表されるアミノ酸配列
において例えば第172番目〜197番目、第467番目〜487番
目のアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましい。配列
番号：26で表されるアミノ酸配列において例えば第175
番目〜200番目、第470番目〜490番目のアミノ酸配列を
含有するペプチドが好ましい。
【００１１】また、本発明で用いられる部分ペプチドは
Ｃ末端が、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシ
レート（−ＣＯＯ-）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエ
ステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。さらに、
本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明
で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボ
キシル基（またはカルボキシレート）を有しているも
の、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のア
ミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内
で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸
化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当
な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合し
たいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれ
る。本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のため
の抗原としても用いることができる。たとえば、後述す
る本発明の抗体を調製する目的には、例えば配列番号：
１で表されるアミノ酸配列において第261〜275番目, 第
399〜417番目, 第500〜649番目のアミノ酸配列を含有す
るペプチドなどがあげられる。配列番号：15で表される
アミノ酸配列において第257〜271番目, 第395〜413番
目, 第496〜645番目のアミノ酸配列を含有するペプチド
などがあげられる。配列番号：26で表されるアミノ酸配
列において第260〜274番目, 第398〜416番目, 第499〜6
48番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげら
れる。
【００１２】本発明で用いられるタンパク質または部分
ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、
無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）などとの
塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩
が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例
えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、ある
いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマ
ル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リン
ゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンス
ルホン酸）との塩などが用いられる。本発明で用いられ
るタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩
は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知
のタンパク質の精製方法によって製造することもできる
し、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換
体を培養することによっても製造することができる。ま
た、後述のペプチド合成法に準じて製造することもでき
る。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場
合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズし
た後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロ
マトグラフィーを組み合わせることにより精製単離する
ことができる。
【００１３】本発明で用いられるタンパク質もしくは部
分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成に
は、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることがで
きる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル
樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセト
アミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocア
ミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の
配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合
させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペ
プチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに
高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施
し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれ
らのアミド体を取得する。前記した保護アミノ酸の縮合
に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試
薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類が
よい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプ
ロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミ
ノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これら
による活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt,
HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかま
たは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBt
エステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行な
った後に樹脂に添加することができる。
【００１４】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより
十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても
十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセ
チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化
することによって、後の反応に影響を与えないようにす
ることができる。
【００１５】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボ
ルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシ
カルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニ
ル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２
−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノ
チオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキシル基は、
例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、
シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２
−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アル
キルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベ
ンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メ
トキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステ
ル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル
化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブト
キシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化な
どによって保護することができる。セリンの水酸基は、
例えば、エステル化またはエーテル化によって保護する
ことができる。このエステル化に適する基としては、例
えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル
基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカ
ルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導
される基などが用いられる。また、エーテル化に適する
基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニ
ル基、t-ブチル基などである。チロシンのフェノール性
水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、２−
ニトロベンジル、Br-Z、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニ
ル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmoc
などが用いられる。
【００１６】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対
応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ-炭
素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、
また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオ
ロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれら
の混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルア
ミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなど
による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによ
る還元なども用いられる。前記酸処理による脱離反応
は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、
酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、
チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジ
メチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタン
ジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効で
ある。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用
いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理
により除去され、トリプトファンのインドール保護基と
して用いられるホルミル基は前記の1,2-エタンジチオー
ル、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１７】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質または部分ペプチドの
アミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カル
ボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化し
て保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖
を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端の
α−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部
分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除
去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これ
らのタンパク質またはペプチドを前記したような混合溶
媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については前記と同
様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペ
プチドを精製した後、前記方法によりすべての保護基を
除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ること
ができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各
種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥する
ことで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得
ることができる。タンパク質またはペプチドのエステル
体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−
カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸
エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド
体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエ
ステル体を得ることができる。
【００１８】本発明で用いられる部分ペプチドまたはそ
れらの塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるい
は本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼ
で切断することによって製造することができる。ペプチ
ドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法
のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられ
る部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミ
ノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する
場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製
造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離と
しては、例えば、以下の〜に記載された方法が挙げ
られる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合
成、広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペ
プチドを精製単離することができる。前記方法で得られ
る部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法ある
いはそれに準じる方法によって適当な塩に変換すること
ができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法ある
いはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変
換することができる。
【００１９】本発明で用いられるタンパク質をコードす
るＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられるタンパ
ク質をコードする塩基配列を含有するものであればいか
なるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮ
Ａ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、
合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用する
ベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミ
ド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前
記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分
を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Po
lymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称
する）によって増幅することもできる。本発明で用いら
れるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
配列番号：２、配列番号：７、配列番号：１６または配
列番号：２７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、ま
たは配列番号：２、配列番号：７、配列番号：１６また
は配列番号：２７で表される塩基配列とハイストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、
本発明で用いられるタンパク質と実質的に同質の性質を
有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのも
のでもよい。
【００２０】配列番号：２で表される塩基配列とハイス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列と
約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好まし
くは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に
好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上
の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用い
られる。配列番号：７で表される塩基配列とハイストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとし
ては、例えば、配列番号：７で表される塩基配列と約５
０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは
約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ま
しくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相
同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：１６で表される塩基配列とハイストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：１６で表される塩基配列と約５
０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは
約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ま
しくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相
同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：２７で表される塩基配列とハイストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：２７で表される塩基配列と約５
０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは
約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ま
しくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相
同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ
る。ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそ
れに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,Cold
Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など
に従って行なうことができる。また、市販のライブラリ
ーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従
って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリ
ンジェントな条件に従って行なうことができる。ハイス
トリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が
約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温
度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件
を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約
６５℃の場合が最も好ましい。より具体的には、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を
コードするＤＮＡとしては、配列番号：２または配列番
号：７で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用い
られ、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有す
るタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：
１６で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いら
れ、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有する
タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２
７で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ
る。
【００２１】本発明で用いられる部分ペプチドをコード
するＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられる部分
ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであれば
いかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲ
ノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃ
ＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリ
ー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。本発明で用いられる
部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配
列番号：２、配列番号：７、配列番号：１６または配列
番号：２７で表される塩基配列を有するＤＮＡの一部分
を有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：７、
配列番号：１６または配列番号：２７で表される塩基配
列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
る塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同
質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部
分を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２、
配列番号：７、配列番号：１６または配列番号：２７で
表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前
記と同意義を示す。ハイブリダイゼーションの方法およ
びハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用
いられる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの一
塩基多型（ＳＮＰｓ）体としては、例えば、配列番号：
２、配列番号：１６または配列番号：２７で表される塩
基配列を含有するＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰｓ）体な
どが用いられ、具体的には、配列番号：４０、配列番
号：４２または配列番号：４５で表される塩基配列を含
有する一塩基多型（ＳＮＰｓ）体などが用いられる。本
発明の一塩基多型（ＳＮＰｓ）体にコードされるタンパ
ク質としては、具体的には、配列番号：４１、配列番
号：４３または配列番号：４６で表されるアミノ酸配列
を含有するタンパク質などが用いられる。本発明のタン
パク質をコードするＤＮＡに対するプロモーターとして
は、例えば、配列番号：５１で表される塩基配列を含有
するＤＮＡなどが用いられる。本発明の配列番号：５１
で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一塩基多型（Ｓ
ＮＰｓ）体としては、例えば、配列番号：５４、配列番
号：５５または配列番号：５６で表される塩基配列を含
有する一塩基多型（ＳＮＰｓ）体などが用いられる。
【００２２】本発明で用いられるタンパク質、部分ペプ
チド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニング
および発現の説明においては、これらを単に本発明のタ
ンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤ
ＮＡ（一塩基多型（ＳＮＰｓ）体も含む）のクローニン
グの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩
基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて
ＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに
組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは
全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用
いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって
選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法
は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Har
bor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行な
うことができる。また、市販のライブラリーを使用する
場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこ
とができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知
のキット、例えば、MutanTM-superExpress Km（宝酒造
（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA
-LAPCR法やGapped duplex法やKunkel法等の公知の方法
あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができ
る。クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは
目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化
したり、リンカーを付加したりして使用することができ
る。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとして
のＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンと
してのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよ
い。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当
な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもでき
る。本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、
（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的
とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適
当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結するこ
とにより製造することができる。
【００２３】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ
（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、
ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主が
バチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、Ｓ
ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主
が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプ
ロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター
などが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘ
ドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好まし
い。
【００２４】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイ
ニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含
まない培地によっても選択できる。また、必要に応じ
て、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質
のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である
場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列な
どが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラー
ゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列など
が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、
ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場
合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフ
ェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などが
それぞれ利用できる。このようにして構築された本発明
のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを
用いて、形質転換体を製造することができる。
【００２５】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１
２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０
巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・
アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９
巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecul
ar Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ
１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネテ
ィックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕な
どが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチ
ルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４
〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１
〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of
Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用
いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccha
romyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３
６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１
などが用いられる。
【００２６】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In V
ivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換する
には、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９
巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１
０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことが
できる。
【００２７】バチルス属菌を形質転換するには、例え
ば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，
１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうこと
ができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７
８）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆
虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ
／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）
などに記載の方法に従って行なうことができる。動物細
胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細
胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）
（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，
４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことがで
きる。このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡ
を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を
得ることができる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス
属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される
培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質
転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が
含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコー
ス、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源と
しては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーン
スチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大
豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無
機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素
ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。ま
た、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加
してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２８】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０
５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培
地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。
培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は
通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要
に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆
虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grac
e's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Natur
e）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の
添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨ
は約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通
常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や
撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養
する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛
血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２
２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジ
ー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・
メディカル・アソシエーション（The Journal of the A
merican Medical Association）１９９巻，５１９(１９
６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding ofthe Society for the Biological Medi
cine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃
〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気
や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞
内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せ
しめることができる。
【００２９】前記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ
る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク
質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が
含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌され
る場合には、培養終了後、それ公知の方法で菌体あるい
は細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにし
て得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタン
パク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わ
せて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法
としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方
法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子
量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー
などの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマ
トグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用す
る方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する
方法などが用いられる。
【００３０】かくして得られるタンパク質が遊離体で得
られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法
によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場
合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊
離体または他の塩に変換することができる。なお、組換
え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適
当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に
修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去すること
もできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプ
シン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダー
ゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いら
れる。かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、
特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタ
ンブロッティングなどにより測定することができる。
【００３１】本発明で用いられるタンパク質もしくは部
分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用い
られるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を
認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体の何れであってもよい。本発明で用いられ
るタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以
下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタン
パク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明
のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血
清の製造法に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免
疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種ま
たは異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することが
できる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標
識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結
合した標識剤の活性を測定することにより行なうことが
できる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミ
ルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1
975)〕に従い実施することができる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが
用いられる。
【００３２】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、
ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）
が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベート
することにより効率よく細胞融合を実施できる。モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を
直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する
方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着
させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性
物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げら
れる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれ
に準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加
した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および
育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるもの
ならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２
０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧ
ＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドー
マ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、前記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３３】（ｂ）モノクローナル抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例え
ば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコ
ール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体
（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過
法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテ
インＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合
を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なう
ことができる。
【００３４】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ公知あるいはそれに準じる方
法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原
（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータ
ンパク質との複合体をつくり、前記のモノクローナル抗
体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動
物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取し
て、抗体の分離精製を行なうことにより製造することが
できる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原
とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアー
タンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合
比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対し
て抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比
率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン
やウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハ
プテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５
の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテ
ンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用い
ることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミ
ド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリ
ジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮
合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位
にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。
投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイント
アジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与し
てもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約
３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、前
記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ま
しくは血液から採取することができる。抗血清中のポリ
クローナル抗体価の測定は、前記の抗血清中の抗体価の
測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分
離精製は、前記のモノクローナル抗体の分離精製と同様
の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことがで
きる。
【００３５】本発明で用いられるタンパク質または部分
ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、アンチセンスヌク
レオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明の
ＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、
または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンス
ヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列に相
補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該Ｄ
ＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、い
ずれのアンチセンスヌクレオチドであってもよいが、ア
ンチセンスＤＮＡが好ましい。本発明のＤＮＡに実質的
に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相
補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）
の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好
ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、
最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列
などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全
塩基配列うち、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコー
ドする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基
配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０
％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは
約９５％以上の相同性を有するアンチセンスヌクレオチ
ドが好適である。具体的には、配列番号：２、配列番
号：７、配列番号：１６または配列番号：２７で表わさ
れる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、も
しくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を
有するアンチセンスヌクレオチド、好ましくは例えば、
配列番号：２、配列番号：７、配列番号：１６または配
列番号：２７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩
基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するア
ンチセンスヌクレオチドなどが挙げられる。アンチセン
スヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは
１５〜３０個程度の塩基から構成される。ヌクレアーゼ
などの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセ
ンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホ
スフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチル
ホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾り
ん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセン
スヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて
製造することができる。
【００３６】以下に、本発明のタンパク質もしくは部分
ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略
記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペ
プチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略
記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分
ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗
体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのア
ンチセンスヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンス
ヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明す
る。
【００３７】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質（以下、ヒトSGLTホモログタンパクと表記すること
がある）はヒトの膵臓、肝臓において組織特異的に高発
現するので、例えば糖尿病などの疾患マーカーとして利
用することが出来る。すなわち、糖尿病における早期診
断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のためのマー
カーとして有用である。ヒトSGLTホモログタンパクの活
性を促進する化合物もしくはその塩を含有する医薬は、
例えば膵β細胞への糖取り込みを促進し、血糖値依存性
のインスリン分泌を亢進でき、さらに肝細胞において細
胞内外のグルコース濃度勾配に関わらず血中から肝臓へ
の糖取り込みを促進し肝臓から血中への糖放出を抑制す
ることができるので例えば、糖尿病などの治療・予防剤
として使用することができる。一方、ヒトSGLTホモログ
タンパクの活性を阻害する化合物もしくはその塩を含有
する医薬は、腎臓からの糖の再吸収を抑制することで血
糖を下げることができ、(糖尿病)肝臓への糖取り込みを
抑制することで脂肪合成を抑制することができるので、
例えば、高脂血症などの治療・予防剤として使用するこ
とができる。
【００３８】配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質（以下、マウスSGLTホモログタンパクと表記する
ことがある）はマウスの腎臓において組織特異的に高発
現するので、例えば高脂血症などの疾患マーカーとして
利用することが出来る。すなわち、高脂血症における早
期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のための
マーカーとして有用である。マウスSGLTホモログタンパ
クの活性を阻害する化合物もしくはその塩を含有する医
薬は、腎臓からの糖の再吸収を抑制することで血糖を下
げることができ、(糖尿病)肝臓への糖取り込みを抑制す
ることで脂肪合成を抑制することができるので、例えば
高脂血症などの治療・予防剤として使用することができ
る。
【００３９】配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質（以下、ラットSGLTホモログタンパクと表記する
ことがある）はラットの腎臓において組織特異的に高発
現するので、例えば高脂血症などの疾患マーカーとして
利用することが出来る。すなわち、高脂血症における早
期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のための
マーカーとして有用である。ラットSGLTホモログタンパ
クの活性を阻害する化合物もしくはその塩を含有する医
薬は、腎臓からの糖の再吸収を抑制することで血糖を下
げることができ、(糖尿病)肝臓への糖取り込みを抑制す
ることで脂肪合成を抑制することができるので、例え
ば、高脂血症などの治療・予防剤として使用することが
できる。
【００４０】〔１〕本発明のタンパク質が関与する各種
疾病の治療・予防剤 本発明のタンパク質は、Na+／グルコーストランスポー
ターとしてグルコースの能動輸送活性を有し、膵β細胞
への糖取り込み、血糖値依存性のインスリン分泌に寄与
している。また、肝細胞においては、細胞内外のグルコ
ース濃度勾配に関わらず血中から肝臓への糖取り込みに
寄与している。したがって、本発明のタンパク質をコー
ドするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合ある
いは本発明のタンパク質の発現量が減少している場合に
は、例えば、糖尿病などの種々の疾患が発症する。した
がって、本発明のタンパク質および本発明のＤＮＡは、
例えば、糖尿病などの疾患の治療・予防剤などの医薬と
して使用することができる。例えば、生体内において本
発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているために、
グルコースの膵β細胞への糖取り込み、肝細胞への糖取
り込みが十分に、あるいは正常に発揮されない患者がい
る場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生
体内で本発明のタンパク質を発現させることによって、
（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパ
ク質を発現させた後に、該細胞を患者に移植することに
よって、または（ハ）本発明のタンパク質を該患者に投
与することなどによって、該患者における本発明のタン
パク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させること
ができる。本発明のＤＮＡを前記の治療・予防剤として
使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイル
スベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス
アソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクタ
ーに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動
物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのま
まで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的
に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイド
ロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき
る。本発明のタンパク質を前記の治療・予防剤として使
用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以
上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９
％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００４１】本発明のタンパク質等は、例えば、必要に
応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、
マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水も
しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶
液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用
できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認
められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安
定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に
要求される単位用量形態で混和することによって製造す
ることができる。これら製剤における有効成分量は指示
された範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加
剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラ
ガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロー
スのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギ
ン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような
甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのよ
うな香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセル
である場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のよう
な液状担体を含有することができる。注射のための無菌
組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻
油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解また
は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ
とができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアル
コール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポ
リソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用し
てもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油な
どが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベ
ンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤
（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液な
ど）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当
なアンプルに充填される。本発明のＤＮＡが挿入された
ベクターも前記と同様に製剤化され、通常、非経口的に
使用される。
【００４２】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラ
ット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーな
ど）に対して投与することができる。とりわけ、ヒトに
対して投与するのが好ましい。本発明のタンパク質等の
投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより
差異はあるが、例えば、糖尿病の治療目的で本発明のタ
ンパク質等を経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋ
ｇとして）においては、一日につき該タンパク質等を約
０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経
口的に投与する場合は、該タンパク質等の１回投与量は
投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、
糖尿病の治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形
で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日に
つき該タンパク質等を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ま
しくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．
１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与する
のが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たり
に換算した量を投与することができる。
【００４３】〔２〕疾病に対する医薬候補化合物のスク
リーニング 本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を促
進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング
のための試薬として有用である。すなわち、本発明は、
（１）本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本
発明のタンパク質の活性（例えば、グルコースの能動輸
送活性など）を促進または阻害する化合物またはその塩
（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合があ
る）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、
例えば、（２）（ｉ）本発明のタンパク質を産生する能
力を有する細胞の糖取り込み活性と（ii）本発明のタン
パク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合
物の糖取り込み活性の比較を行なうことを特徴とする促
進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。具
体的には、前記スクリーニング方法においては、例え
ば、（ｉ）と（ii）の場合において、糖取り込み活性を
3H標識したグルコースまたは2-deoxy-glucoseなどのグ
ルコース類縁体の細胞内への蓄積を放射活性で測定し、
グルコースの能動輸送活性の指標として比較することを
特徴とするものである。
【００４４】本発明のスクリーニングにおいては、タン
パク質を産生する能力を有する細胞に、グルコースの能
動輸送活性阻害剤（例、フロリジン）などをポジティブ
コントロールとして使用してもよい。すなわち、本発明
は(i)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞
に、3H標識したグルコースまたはグルコース類縁体を取
り込ませると同時もしくは取り込ませる前に、グルコー
スの能動輸送活性阻害剤を添加した場合と、(ii) 本発
明のタンパク質を産生する能力を有する細胞に、3H標識
したグルコースまたはグルコース類縁体を取り込ませる
と同時もしくは取り込ませる前に、グルコースの能動輸
送活性賦活化剤または阻害剤、および試験化合物を添加
した場合とを比較し、その取り込み量の変化を測定する
ことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング
方法を提供する。試験化合物としては、例えば、ペプチ
ド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵
生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液など
が挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよ
いし、公知の化合物であってもよい。前記のスクリーニ
ング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生す
る能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファ
ーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１
０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、
ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質のＮａ+
イオンチャネル活性を阻害しないバッファーであればい
ずれでもよい。本発明のタンパク質を産生する能力を有
する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク
質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換さ
れた宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、
例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられ
る。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養
することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発
現させた形質転換体が好ましく用いられる。
【００４５】本発明のタンパク質のグルコースの能動輸
送活性は、公知の方法、例えば、Cloning and function
al expression of an SGLT-1-like protein from the X
enopus laevis intestine (Am. J. Phisiol. 276: G125
1-G1259, 1999)に記載の方法あるいはそれに準じる方法
に従って測定することができる。例えば、前記（ii）の
場合におけるグルコースの能動輸送活性を、前記（ｉ）
の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以
上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を
本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその
塩として選択することができる。また、例えば、前記
（ii）の場合におけるグルコースの能動輸送活性を、前
記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３
０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害（または抑
制）する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害
する化合物またはその塩として選択することができる。
また、本発明のタンパク質SGLTホモログ遺伝子のプロモ
ーター下流に分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェ
ラーゼなどの遺伝子を挿入し、前記の各種細胞に発現さ
せ、該細胞に前記試験化合物を接触させた場合における
酵素活性を賦活化または阻害する化合物またはその塩を
探索することによって本発明のタンパク質（SGLTホモロ
グ）の発現を促進または抑制（すなわち、本発明のタン
パク質の活性を促進または阻害）する化合物またはその
塩をスクリーニングすることができる。
【００４６】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたは
その塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは
部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するも
のである。
【００４７】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、前記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから
選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク
質の活性（例、グルコースの能動輸送活性など）を促進
または阻害する化合物またはその塩である。該化合物の
塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様の
ものが用いられる。本発明のタンパク質の活性を促進す
る化合物またはその塩は、例えば、ヒトに対して糖尿病
に対する治療・予防剤などの医薬として有用である。ま
た、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物または
その塩は、例えば、高脂血症に対する治療・予防剤など
の医薬として有用である。
【００４８】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に
従って製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセ
ル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶
液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして
得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒト
または温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チ
ンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投
与することができる。該化合物またはその塩の投与量
は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどに
より差異はあるが、例えば、糖尿病治療の目的で本発明
のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩を経
口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）
においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.
１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より
好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投
与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投
与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、糖
尿病治療の目的で本発明のタンパク質の活性を促進する
化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０
ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物また
はその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約
０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０
ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。
他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。
【００４９】〔３〕本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはその塩の定量 本発明のタンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体
と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質を特異
的に認識することができるので、被検液中の本発明のタ
ンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定
量などに使用することができる。すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発
明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合し
た標識化された本発明のタンパク質の割合を測定するこ
とを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量
法、および（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の
抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時ある
いは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の
活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタ
ンパク質の定量法を提供する。前記（ii）の定量法にお
いては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認
識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端
部に反応する抗体であることが望ましい。
【００５０】また、本発明のタンパク質に対するモノク
ローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称
する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を
行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともで
きる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いても
よく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2 、Ｆａｂ'、あるい
はＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本
発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきもの
ではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質
量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の
量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知
量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算
出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよ
い。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリッ
ク法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感
度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるの
が特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる
標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素とし
ては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14
Ｃ〕などが用いられる。前記酵素としては、安定で比活
性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダ
ーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用い
られる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられ
る。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノー
ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−アビジン系を用いることもできる。
【００５１】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵
素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用
いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキス
トラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ある
いはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては
不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応
させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化
担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の
本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反
応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定
法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明
のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合す
る部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわ
ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例え
ば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質
のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体
は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗
体が用いられる。
【００５２】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、お
よび、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるい
は、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリ
ック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の
標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離
するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００５３】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一
般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる。例えば、入江 寛編「ラジオイム
ノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編
「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochem
ical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochem
ical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochem
ical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明の抗体を用い
ることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量す
ることができる。さらには、本発明の抗体を用いて本発
明のタンパク質の濃度を定量することによって、（１）
本発明のタンパク質の濃度の減少が検出された場合、例
えば、糖尿病などの疾病である、または将来罹患する可
能性が高いと診断することができる。また、本発明の抗
体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタ
ンパク質を検出するために使用することができる。ま
た、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体
カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質
の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動
の分析などのために使用することができる。
【００５４】〔４〕遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡまたは一塩基多型（ＳＮＰｓ）体は、例
えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは
温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサ
ギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サ
ル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質ま
たはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮ
Ａの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、
例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異ある
いは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるい
は発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発
明のＤＮＡを用いる前記の遺伝子診断は、例えば、公知
のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ
法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７
９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ユーエスエー（Proceedings of theNational Academy o
f Sciences of the United States of America），第８
６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などによ
り実施することができる。例えば、ノーザンハイブリダ
イゼーションにより発現低下が検出された場合やＰＣＲ
−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合
は、例えば、糖尿病などの疾病である可能性が高いと診
断することができる。特に近年、疾患関連遺伝子を探索
する上で非常に重要なツールとしてＳＮＰｓ（single n
ucleotide polymorphisms、一塩基多型）体と呼ばれる
多型マーカーが登場し、疾患のなり易さ（なり難さ）を
規定し、薬剤に対する応答性の違い・副作用の違いにも
影響するものとしてにわかに注目を集めている。ＳＮＰ
ｓのタイピング法としては、その具体的な目的に応じ
て、直接塩基配列決定法、Invader法、Sniper法、MALDI
-TOF/MS法、オリゴＳＮＰチップ法などが挙げられる
（実験医学１８巻１２号、２０００年）。こうした手法
により見出された本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａ（プロモーター領域、エキソン、イントロンを含む）
に存在するＳＮＰｓは、それ自体単独で、あるいは他の
遺伝子上のＳＮＰｓや本発明のＤＮＡと併せて解析する
ことにより、糖尿病、高脂血症に対する罹りやすさの判
定や発症時期の予測、あるいは糖尿病、高脂血症の診断
に有用である。
【００５５】〔５〕アンチセンスヌクレオチドを含有す
る医薬 本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができる本発明のアンチセンスヌクレオチド
は低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質ま
たは本発明のＤＮＡの機能（例、Ｎａ+イオンチャネル
活性、グルコースの能動輸送活性）を抑制することがで
きるので、例えば、高脂血症などの治療・予防剤として
使用することができる。前記アンチセンスヌクレオチド
を前記の治療・予防剤として使用する場合、公知の方法
に従って製剤化し、投与することができる。例えば、該
アンチセンスヌクレオチドを用いる場合、該アンチセン
スヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクタ
ー、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエ
ーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入
した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、
ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サ
ルなど）に対して経口的または非経口的に投与すること
ができる。該アンチセンスヌクレオチドは、そのまま
で、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に
認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロ
ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき
る。該アンチセンスヌクレオチドの投与量は、対象疾
患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例
えば、高脂血症の治療の目的で本発明のアンチセンスヌ
クレオチドを肝臓に局所投与する場合、一般的に成人
（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセン
スヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。さら
に、該アンチセンスヌクレオチドは、組織や細胞におけ
る本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための
診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用すること
もできる。
【００５６】〔６〕ＤＮＡ導入動物 本発明は、外来性の本発明のタンパク質等をコードする
ＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）また
はその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記す
る場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。す
なわち、本発明は、（１）本発明の外来性ＤＮＡまたは
その変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（２）非ヒト
哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、 （３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）
記載の動物、および（４）本発明の外来性ＤＮＡまたは
その変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる
組換えベクターを提供するものである。本発明の外来性
ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物
（以下、本発明のＤＮＡ導入動物と略記する）は、未受
精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞
などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生にお
ける胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受
精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸
カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝
集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン
法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤ
ＮＡを導入することによって作出することができる。ま
た、該ＤＮＡ導入方法により、体細胞、生体の臓器、組
織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを導入
し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さ
らに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法
により融合させることにより本発明のＤＮＡ導入動物を
作出することもできる。
【００５７】非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。な
かでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生およ
び生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ
歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７
ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６
Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡ
ＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例え
ば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。哺乳動
物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動
物」としては、前記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが
挙げられる。本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動
物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん
哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩
基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、
具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換など
が生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含
まれる。該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパ
ク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発
明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ
るＤＮＡなどが用いられる。本発明の外来性ＤＮＡは、
対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物
由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物
に導入させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現
させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンスト
ラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本
発明のヒトＤＮＡを導入させる場合、これと相同性が高
い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサ
ギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マ
ウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモータ
ーの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコン
ストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精
卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクション
することによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ導
入哺乳動物を作出することができる。
【００５８】本発明のタンパク質の発現ベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリ
オファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィ
ルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなど
の動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由
来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由
来のプラスミドなどが好ましく用いられる。前記のＤＮ
Ａ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、
ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイル
ス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイ
ルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモ
ーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、
モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の
プロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、
ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、
エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸
性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、
血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ
１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭ
Ｐ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロ
フィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房
ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナー
ゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウム
アデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓ
ｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩ
およびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビタ
ー、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レ
ニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダ
ーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−
１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシ
ン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロ
ブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（Ｖ
ＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビ
ン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケ
ファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用
いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサ
イトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖
延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよ
びニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
【００５９】前記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物にお
いて目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する
配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有しているこ
とが好ましく、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動
物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましく
は、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用
いられる。その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高
発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、
エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部など
をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻
訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結すること
も目的により可能である。正常な本発明のタンパク質の
翻訳領域は、各種哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イ
ヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスな
ど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来Ｄ
ＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲ
ノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎
臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法
により調製された相補ＤＮＡを原料として取得すること
が出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、前記の細胞ま
たは組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点
突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製すること
ができる。該翻訳領域は導入動物において発現しうるＤ
ＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流
および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常
のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。受精
卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対
象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在する
ように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞
において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作
出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のす
べてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味す
る。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の
子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外
来性ＤＮＡを有する。
【００６０】本発明の外来性正常ＤＮＡを導入させた非
ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持
することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。受精卵細胞段階に
おける本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の
胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確
保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において
本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動
物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発
明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発
明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はそ
の胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡ
を過剰に有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つ
ホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配す
ることによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するよ
うに繁殖継代することができる。本発明の正常ＤＮＡを
有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現
させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進する
ことにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を
発症することがあり、その病態モデル動物として利用す
ることができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ導入動物
を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明
のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこ
れらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能であ
る。また、本発明の外来性正常ＤＮＡを導入させた哺乳
動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有す
ることから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対す
る治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
【００６１】一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する
非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保
持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とす
る外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科とし
て用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンス
トラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製する
ことができる。受精卵細胞段階における本発明の異常Ｄ
ＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の
全てに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出
動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在する
ことは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細
胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味す
る。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の
子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異
常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持
つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配
することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように
繁殖継代することができる。本発明の異常ＤＮＡを有す
る非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させ
られており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害すること
により最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応
症となることがあり、その病態モデル動物として利用す
ることができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ導入動物
を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の
病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行な
うことが可能である。また、具体的な利用可能性として
は、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパ
ク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパ
ク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negat
ive作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外
来異常ＤＮＡを導入させた哺乳動物は、遊離した本発明
のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタ
ンパク質の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリー
ニング試験にも利用可能である。
【００６２】また、前記２種類の本発明のＤＮＡ導入動
物のその他の利用可能性として、例えば、 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のＤＮＡ導入動物の組織中のＤＮＡもしくはＲ
ＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現された
タンパク質組織を分析することによる、本発明のタンパ
ク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質
との関連性についての解析、 ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織から
の細胞の機能の研究、 前記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作
製などが考えられる。 さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタ
ンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタ
ンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることがで
き、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの
各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新し
い治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患
の研究および治療に貢献することができる。また、本発
明のＤＮＡ導入動物から各臓器を取り出し、細切後、ト
リプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤ
ＮＡ導入細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系
統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタン
パク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは
増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機
構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発
明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究
材料となる。さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用い
て、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、
本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行
なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、
有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供す
ることが可能となる。また、本発明のＤＮＡ導入動物ま
たは本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発
明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、
開発することが可能である。
【００６３】〔７〕ノックアウト動物 本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、（１）本発明の
ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不
活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、（３）ネオマ
イシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、（４）非
ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹
細胞、（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載
の胚幹細胞、（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（７）該ＤＮＡがレポ
ーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポー
ター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制
御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記
載の非ヒト哺乳動物、（９）ゲッ歯動物がマウスである
第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および（１０）第
（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポータ
ー遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤ
ＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化
合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００６４】本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明
のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの
発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしてい
る本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させること
により、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能
を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称す
ることがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ
細胞と略記する）をいう。非ヒト哺乳動物としては、前
記と同様のものが用いられる。本発明のＤＮＡに人為的
に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手
法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡ
を挿入または置換させることによって行なうことができ
る。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠
をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を
破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製
すればよい。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細
胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の
具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が
有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネ
オマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を
代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレ
ポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能
を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に
遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ
付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲ
ＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子
を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖
（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例
えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得ら
れたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近
傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ
ーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤ
ＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本
発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマー
としたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥ
Ｓ細胞を選別することにより得ることができる。
【００６５】また、相同組換え法等により本発明のＤＮ
Ａを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述
のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知
EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでも
よい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的
には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的
背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免
疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなど
の目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／
６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善し
たＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ
１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤ
Ｆ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であると
いう利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つ
ので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウ
スを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロ
スすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに
代えることが可能である点で有利に用い得る。また、Ｅ
Ｓ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚
盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤
胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚
を取得することができる。また、雌雄いずれのＥＳ細胞
を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キ
メラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手
間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行な
うことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法として
は、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の
遺伝子を増幅、検出する方法が、その一例として挙げる
ことができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析
をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対し
て、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むの
で、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを
雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の
選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削
減できる。
【００６６】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により
行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常
数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の
関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウト
した後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ
＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ま
しい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その
増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養
器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５
％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養
するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプ
シン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシ
ン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％ト
リプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、
新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などが
とられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なう
が、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が
見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望ま
れる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るま
で単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊
培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々
のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J.
Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292
巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第7
8巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschmanら、ジャーナ
ル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメン
タル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発
明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現
不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の
細胞生物学的検討において有用である。本発明のＤＮＡ
発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知
方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較するこ
とにより、正常動物と区別することが可能である。該非
ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられ
る。
【００６７】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティン
グベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入
し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤ
ＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えに
より、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の
本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることに
より、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができ
る。本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発
明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブと
したサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッ
ティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティング
ベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の
近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法に
よる解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明
のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変
異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成さ
れるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部
が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキ
メラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体
群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤ
ＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コート
カラーの判定等により選別することにより得られる。こ
のようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク
質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質の
ヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本
発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができ
る。卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマ
イクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入すること
によりターゲッティングベクターを染色体内に導入した
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、
これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、
遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のある
ものを選択することにより得られる。
【００６８】このようにして本発明のＤＮＡがノックア
ウトされている個体は、交配により得られた動物個体も
該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常
の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。さらに、
生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよ
い。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を
交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両
方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホ
モザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，
ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することに
より効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物
の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有する
ホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代
する。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物
胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を
作出する上で、非常に有用である。また、本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質によ
り誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明
のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病の
モデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治
療法の検討に有用である。
【００６９】〔７ａ〕本発明のＤＮＡの欠損や損傷など
に起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物
のスクリーニング方法 本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤ
ＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病（例、動脈硬化
症、高脂血症、肥満症、糖尿病など）に対して治療・予
防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることが
できる。すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全
非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を
観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠
損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を
有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供
する。該スクリーニング方法において用いられる本発明
のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様
のものが挙げられる。試験化合物としては、例えば、ペ
プチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽
出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合
物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。具
体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、
試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動
物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として
試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例え
ば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症
状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択すること
ができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試
験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができ
る。例えば、動脈硬化症に対して治療・予防効果を有す
る化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発
現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処
置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血糖
値および体重変化などを経時的に測定する。該スクリー
ニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した
場合、該試験動物の血糖値が約１０％以上、好ましくは
約３０％以上、より好ましくは約５０％以上低下した場
合、該試験化合物を動脈硬化症に対して治療・予防効果
を有する化合物として選択することができる。
【００７０】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物は、前記した試験化合物から選ばれた化合物
であり、本発明のタンパク質等の欠損や損傷などによっ
て引き起こされる疾患（例、糖尿病、高脂血症など）に
対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安
全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用するこ
とができる。さらに、前記スクリーニングで得られた化
合物から誘導される化合物も同様に用いることができ
る。該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成
していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許
容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカ
リ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許
容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例
えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫
酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プ
ロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石
酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられ
る。該スクリーニング方法で得られた化合物またはその
塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含
有する医薬と同様にして製造することができる。このよ
うにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例
えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モル
モット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）に対して投与することができる。該化合
物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与
ルートなどにより差異はあるが、例えば、糖尿病の治療
目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体
重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を
約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経
口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対
象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、糖尿病
の治療目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋ
ｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍ
ｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈
注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合
も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができ
る。
【００７１】〔７ｂ〕本発明のＤＮＡに対するプロモー
ターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニン
グ方法 本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、
試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出す
ることを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ーの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。前記スクリーニング方法
において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物とし
ては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入す
ることにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発
明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる
ものが用いられる。試験化合物としては、前記と同様の
ものが挙げられる。遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプ
ロモーターとしては、例えば、配列番号：５１、配列番
号：５２、配列番号：５３または配列番号：５４で表さ
れる塩基配列を含有するプロモーターなどが用いられ
る。レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用
いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可
溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラ
ーゼ遺伝子などが好適である。本発明のＤＮＡをレポー
ター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト
哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対
するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター
遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることによ
り、プロモーターの活性を検出することができる。
【００７２】例えば、本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明
のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の
代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例
えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラク
トシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することによ
り、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発
現状態を観察することができる。具体的には、本発明の
タンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルア
ルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または
３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組
織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄すること
によって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色
を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコー
ドするｍＲＮＡを検出してもよい。
【００７３】前記スクリーニング方法を用いて得られる
化合物またはその塩は、前記した試験化合物から選ばれ
た化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター
活性を促進または阻害する化合物である。該スクリーニ
ング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、
無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）などとの
塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩
が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例
えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、ある
いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマ
ル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リン
ゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンス
ルホン酸）との塩などが用いられる。本発明のＤＮＡに
対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩
は、本発明のタンパク質の発現を促進し、該タンパク質
の機能を促進することができるので、例えば、糖尿病な
どの疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医
薬として有用である。本発明のＤＮＡに対するプロモー
ター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタ
ンパク質の発現を阻害し、該タンパク質の機能を阻害す
ることができるので、例えば、高脂血症などの疾病に対
する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用
である。
【００７４】該スクリーニング方法で得られた化合物ま
たはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパ
ク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造する
ことができる。このようにして得られる製剤は、安全で
低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、
ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、
ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与する
ことができる。該化合物またはその塩の投与量は、対象
疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、
例えば、糖尿病の治療目的で本発明のＤＮＡに対するプ
ロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、
一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日
につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回
投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、
例えば、糖尿病の治療目的で本発明のＤＮＡに対するプ
ロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成
人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化
合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１
〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程
度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動
物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与するこ
とができる。このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒ
ト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの
活性を促進する化合物またはその塩をスクリーニングす
る上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起
因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に
大きく貢献することができる。また、本発明のタンパク
質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その
下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、こ
れを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニッ
ク動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にその
タンパクを合成させ、その生体での作用を検討すること
も可能となる。さらに前記プロモーター部分に適当なレ
ポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞
株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体内
での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持
つ低分子化合物の探索系として使用できる。また該プロ
モーター部分を解析することにより新たなシスエレメン
トやそれに結合する転写因子を見つけることも可能であ
る。
【００７５】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
【００７６】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Cl2-Bzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００７７】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕ヒトSGLTホモログタンパク質のアミノ
酸配列を示す。 〔配列番号：２〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列
を有するヒトSGLTホモログタンパク質をコードするＤＮ
Ａの塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕実施例１で用いられたプライマー１の
塩基配列を示す。 〔配列番号：４〕実施例１で用いられたプライマー２の
塩基配列を示す。 〔配列番号：５〕実施例１で用いられたプライマー３の
塩基配列を示す。 〔配列番号：６〕実施例１で用いられたプライマー４の
塩基配列を示す。 〔配列番号：７〕3’非翻訳領域(2026-3140)を含むヒト
SGLTホモログタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列
を示す。 〔配列番号：８〕実施例２で用いられたプライマー５の
塩基配列を示す。 〔配列番号：９〕実施例２で用いられたプライマー６の
塩基配列を示す。 〔配列番号：１０〕実施例３で用いられたプライマー７
の塩基配列を示す。 〔配列番号：１１〕実施例３で用いられたプライマー８
の塩基配列を示す。 〔配列番号：１２〕実施例３で用いられたプローブの塩
基配列を示す。 〔配列番号：１３〕実施例３で用いられたプライマー９
の塩基配列を示す。 〔配列番号：１４〕実施例３で用いられたプライマー１
０の塩基配列を示す。 〔配列番号：１５〕マウスSGLTホモログタンパク質のア
ミノ酸配列を示す。
【００７８】〔配列番号：１６〕配列番号：１５で表さ
れるアミノ酸配列を有するマウスSGLTホモログタンパク
質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７〕実施例６で用いられたプライマー１
１の塩基配列を示す。 〔配列番号：１８〕実施例６で用いられたプライマー１
２の塩基配列を示す。 〔配列番号：１９〕実施例６で用いられたプライマー１
３の塩基配列を示す。 〔配列番号：２０〕実施例６で用いられたプライマー１
４の塩基配列を示す。 〔配列番号：２１〕実施例７で用いられたプライマー１
５の塩基配列を示す。 〔配列番号：２２〕実施例７で用いられたプライマー１
６の塩基配列を示す。 〔配列番号：２３〕実施例７で用いられたプローブの塩
基配列を示す。 〔配列番号：２４〕実施例７で用いられたプライマー１
７の塩基配列を示す。 〔配列番号：２５〕実施例７で用いられたプライマー１
８の塩基配列を示す。 〔配列番号：２６〕ラットSGLTホモログタンパク質のア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２７〕配列番号：２６で表されるアミノ酸
配列を有するラットSGLTホモログタンパク質をコードす
るＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：２８〕実施例１０で用いられたプライマー
１９の塩基配列を示す。 〔配列番号：２９〕実施例１０で用いられたプライマー
２０の塩基配列を示す。 〔配列番号：３０〕実施例１０で用いられたプライマー
２１の塩基配列を示す。
【００７９】〔配列番号：３１〕実施例１０で用いられ
たプライマー２２の塩基配列を示す。 〔配列番号：３２〕実施例１１で用いられたプライマー
２３の塩基配列を示す。 〔配列番号：３３〕実施例１１で用いられたプライマー
２４の塩基配列を示す。 〔配列番号：３４〕実施例１１で用いられたプローブの
塩基配列を示す。 〔配列番号：３５〕実施例１１で用いられたプライマー
２５の塩基配列を示す。 〔配列番号：３６〕実施例１１で用いられたプライマー
２６の塩基配列を示す。 〔配列番号：３７〕実施例１４で用いられた免疫原ペプ
チドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３８〕実施例１７で用いられたＣ１変異導
入用プライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：３９〕実施例１７で用いられたＣ２変異導
入用プライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４０〕実施例１７で得られたＣ１の塩基置
換の入ったＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：４１〕実施例１７で得られたＣ１の塩基置
換の入ったペプチドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４２〕実施例１７で得られたＣ２の塩基置
換の入ったＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：４３〕実施例１７で得られたＣ２の塩基置
換の入ったペプチドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４４〕実施例１７で用いられたＣ３変異導
入用プライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４５〕実施例１７で得られたＣ３の塩基置
換の入ったＤＮＡの塩基配列を示す。
【００８０】〔配列番号：４６〕実施例１７で得られた
Ｃ３の塩基置換の入ったペプチドのアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：４７〕実施例２０で用いられたプライマー
２７の塩基配列を示す。 〔配列番号：４８〕実施例２０で用いられたプライマー
２８の塩基配列を示す。 〔配列番号：４９〕実施例２０で用いられたプライマー
K1の塩基配列を示す。 〔配列番号：５０〕実施例２０で用いられたプライマー
X1の塩基配列を示す。 〔配列番号：５１〕実施例２０で得られたヒトSGLTホモ
ログ遺伝子翻訳開始点の2261bp上流から8bp上流領域のD
NAの塩基配列を示す。 〔配列番号：５２〕実施例２１で用いられたＰ１変異導
入用プライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５３〕実施例２１で用いられたＰ２変異導
入用プライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５４〕実施例２１で得られたＰ２の塩基置
換の入ったＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５５〕実施例２１で得られたＰ１の塩基置
換の入ったＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５６〕実施例２１で得られたＰ１およびＰ
２の両方の塩基置換の入ったＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５７〕実施例２２で用いられたプライマー
K2の塩基配列を示す。 〔配列番号：５８〕実施例２２で用いられたプライマー
K3の塩基配列を示す。 〔配列番号：５９〕実施例２２で用いられたプライマー
X2の塩基配列を示す。 〔配列番号：６０〕実施例２４で用いられたプライマー
２９の塩基配列を示す。
【００８１】〔配列番号：６１〕実施例２４で用いられ
たプライマー３０の塩基配列を示す。 〔配列番号：６２〕実施例２４で用いられたプライマー
３１の塩基配列を示す。 〔配列番号：６３〕実施例２４で用いられたプライマー
３２の塩基配列を示す。 〔配列番号：６４〕実施例２４で用いられたプライマー
３３の塩基配列を示す。 〔配列番号：６５〕実施例２４で用いられたプライマー
３４の塩基配列を示す。 〔配列番号：６６〕実施例２４で用いられたプライマー
３５の塩基配列を示す。 〔配列番号：６７〕実施例２４で用いられたプライマー
３６の塩基配列を示す。 〔配列番号：６８〕実施例２４で用いられたプライマー
３７の塩基配列を示す。 〔配列番号：６９〕実施例２４で用いられたプライマー
３８の塩基配列を示す。 〔配列番号：７０〕実施例２４で用いられたプライマー
３９の塩基配列を示す。 〔配列番号：７１〕実施例２４で用いられたプライマー
４０の塩基配列を示す。
【００８２】実施例１で得られた形質転換体エシェリヒ
ア コリ（Escherichia coli）DH5α/pTB2193は、２０
００年（平成１２年）１２月２２日から日本国茨城県つ
くば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−
８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生
物寄託センター（旧 通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所：ＮＩＢＨ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
７４１０として、２０００年（平成１２年）１２月１４
日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵
便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １６５１６として寄託されて
いる。実施例２で得られた形質転換体エシェリヒア コ
リ（Escherichia coli）DH5α/TKD-1は、２００１年
（平成１３年）６月１４日から日本国茨城県つくば市東
１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６
６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託
センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６２９として、
２００１年（平成１３年）６月５日から大阪府大阪市淀
川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８
６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦ
Ｏ １６６４８として寄託されている。実施例６で得ら
れた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia col
i）DH5α/pTB2238は、２００１年（平成１３年）１０月
１５日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術
総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−７７７６として、２００１年（平成１３年）９
月２７日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８
５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究
所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １６７０８として寄託
されている。実施例１０で得られた形質転換体エシェリ
ヒア コリ（Escherichia coli）DH5α/pTB2239は、２
００１年（平成１３年）１０月１５日から茨城県つくば
市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５
６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄
託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７７７７とし
て、２００１年（平成１３年）９月２７日から大阪府大
阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−
８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番
号ＩＦＯ １６７０９として寄託されている。
【００８３】実施例１７で得られた形質転換体エシェリ
ヒア コリ（Escherichia coli）XL1-Blue/pTB2251は、
２００１年（平成１３年）１２月６日から茨城県つくば
市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５
６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄
託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８１５とし
て、２００１年（平成１３年）１１月１３日から大阪府
大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２
−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託
番号ＩＦＯ １６７２６として寄託されている。実施例
１７で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escher
ichia coli）XL1-Blue/pTB2252は、２００１年（平成１
３年）１２月６日から茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法
人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８１６として、２００１年（平成
１３年）１１月１３日から大阪府大阪市淀川区十三本町
２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法
人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １６７２
７として寄託されている。実施例１７で得られた形質転
換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli）DH5α/pT
B2253は、２００１年（平成１３年）１２月６日から茨
城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３
０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８
１７として、２００１年（平成１３年）１１月１３日か
ら大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番
号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に受託番号ＩＦＯ １６７２８として寄託されてい
る。実施例２０で得られた形質転換体エシェリヒア コ
リ（Escherichia coli）XL1-Blue/pTB2254は、２００１
年（平成１３年）１２月６日から茨城県つくば市東１丁
目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ
ーに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８１８として、２００
１年（平成１３年）１１月２０日から大阪府大阪市淀川
区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８
６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦ
Ｏ １６７２９として寄託されている。
【００８４】実施例２１で得られた形質転換体エシェリ
ヒア コリ（Escherichia coli）XL1-Blue/pTB2255は、
２００１年（平成１３年）１２月６日から茨城県つくば
市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５
６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄
託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８１９とし
て、２００１年（平成１３年）１１月２０日から大阪府
大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２
−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託
番号ＩＦＯ １６７３０として寄託されている。実施例
２１で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escher
ichia coli）XL1-Blue/pTB2256は、２００１年（平成１
３年）１２月６日から茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法
人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８２０として、２００１年（平成
１３年）１１月２０日から大阪府大阪市淀川区十三本町
２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法
人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １６７３
１として寄託されている。実施例２１で得られた形質転
換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli）DH5α/pT
B2257は、２００１年（平成１３年）１２月１９日から
茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号
３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７
８３２として、２００１年（平成１３年）１１月２０日
から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便
番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に受託番号ＩＦＯ １６７３２として寄託されてい
る。
【００８５】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いた遺伝子操作法は、モレキュラ
ー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）に記載されている方法に従った。 実施例１ ヒト膵臓由来Na+/グルコーストランスポータ
ータンパク質をコードするcDNAのクローニングと塩基配
列の決定 ヒト膵臓cDNA（CLONTECH社）を鋳型とし、2個のプライ
マー、プライマー1（配列番号：3）およびプライマー2
（配列番号：4）を用いてPCR反応を行った。該反応にお
ける反応液の組成は前記cDNA 1μlを鋳型として使用
し、Pfu Turbo DNA Polymerase（STRATAGENE社）1μl
量、プライマー1（配列番号：3）およびプライマー2
（配列番号：4）を各0.5μM、dNTPsを200μM、および酵
素に添付のバッファーを5μl加え、50μlの液量とし
た。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・20秒、60℃・30
秒、72℃・2分のサイクルを35回繰り返し、最後に72℃
・7分の伸長反応を行った。さらに、該PCR反応産物を鋳
型とし、2個のプライマー、プライマー3（配列番号：
5）およびプライマー4（配列番号：6）を用いてPCR反応
を行った。該反応における反応液の組成は前記PCR反応
産物 1μlを鋳型として使用し、Pfu Turbo DNA Polymer
ase（STRATAGENE社）1μl量、プライマー3（配列番号：
5）およびプライマー4（配列番号：6）を各0.5μM、dNT
Psを200μM、および酵素に添付のバッファーを5μl加
え、50μlの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、9
6℃・20秒、60℃・30秒、72℃・2分のサイクルを35回繰
り返し最後に72℃・7分の伸長反応を行った。該PCR反応
産物およびプラスミドベクターpME18Sを制限酵素EcoRI,
SpeIで37℃、一夜切断処理した。1% アガロースゲル電
気泳動し、2Kbp DNA断片(SGLTホモログ), 3Kbp DNA断片
(pME18S)を切り出し、ゲルエクストラクションキット
（Qiagen社）を用いてDNAを抽出し、ライゲーションキ
ット（宝酒造社）の処方に従い、SGLTホモログをpME18S
へサブクローニングした。これを大腸菌DH5αに導入
し、cDNAを持つクローンをアンピシリンを含むLB寒天培
地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結
果、新規Na+/グルコーストランスポータータンパク質を
コードするcDNA配列（配列番号：2）を得た。これらの
アミノ酸配列（配列番号：1）を含有する新規Na+/グル
コーストランスポータータンパク質をヒトSGLTホモログ
とした。また形質転換体を大腸菌（Escherichia coli）
DH5α/pTB2193と命名した。ヒトSGLTホモログの疎水性
プロット図を図１に示す。
【００８６】実施例２ ヒト肝臓由来Na+/グルコースト
ランスポータータンパク質をコードするcDNAのクローニ
ングと塩基配列の決定 ClonCapture cDNA Selection Kit(CLONTECH 社)の処方
に従い、ヒト肝臓cDNAライブラリー(CLONTECH 社)から
クローニングした。ビオチン化プローブは、ヒトSGLT
ホモログcDNAを鋳型として、プライマー5 (5’-ggtctgc
gggggctgatgattg-3’)（配列番号：８）, プライマー6
(5’-aggctggcgctgggtatgagaac-3’)（配列番号：９）
を用いてPCR反応で増幅した403 bp 断片を使用した。SG
LT ホモログcDNA の入った大腸菌の選択は、プライマ−
1, 2 を用いてコロニーPCR で行った。得られたクロー
ンの塩基配列を解析した結果、3’ 非翻訳領域 (2026-3
140)を含むSGLT ホモログタンパク質をコードするcDNA
配列（配列番号：７）を得た。また形質転換体を大腸菌
（Escherichia coli）DH5α/TKD-1と命名した。
【００８７】実施例３ Taqman PCR によるヒトSGLTホ
モログの発現分布の解析 Taqman PCR に用いるプライマーおよびプローブは、Pri
mer Express ver. 1.0 (PE バイオシステムジャパン)を
用いて検索し、 プライマー7 (5’-cccgatgctttccacattcttc -3’)
（配列番号：10）, プライマー8 (5’-acaatgacctggtctgtgcacc -3’)
（配列番号：11）, プローブ (5’-acatcccttggccaggtctcattttcgg -3’)
（配列番号：12） を選択した。プローブのリポーター色素として、FAM (6
-carboxyfluorescein)を付加した。スタンダードDNA と
して、ヒトSGLTホモログのPCR断片を使用した。PCR反応
における反応液の組成はpTB2193 DNA 1μlを鋳型として
使用し、Pfu Turbo DNA Polymerase（STRATAGENE社）1
μl量、プライマー9 (5’-gggggccagaggatccaggtgta-
3’)(配列番号：13)およびプライマー10 (5’-gcaatcat
cagcccccgcagac -3’)（配列番号：14）を各0.5μM、dN
TPsを200μM、および酵素に添付のバッファーを5μl加
え、50μlの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、9
6℃・20秒、60℃・30秒、72℃・1分のサイクルを35回繰
り返し、最後に72℃・7分の伸長反応を行った。該PCR反
応産物を1% アガロースゲル電気泳動し、0.7 Kbp DNA断
片を切り出し、ゲルエクストラクションキット（Qiagen
社）を用いてDNAを抽出した。該 PCR断片を100 - 106
コピー/μl に調製してスタンダードDNA として使用し
た。各組織のcDNA ソースとして、Human Mulitiple Tis
sue cDNA Panel I および II(CLONTECH Laboratories,
Inc.) を使用した。プライマー7 200nM, プライマー8 1
00nM, プローブ50nM, 鋳型DNA に、Taqman Universal P
CR Master Mix (PEバイオシステムズジャパン)を添付書
類記載の規定量加え、ABI PRISM 7700 Sequence Detect
ion System (PE バイオシステムズジャパン)でPCR反応
および解析を行った。結果を図2に示した。主に膵臓、
肝臓でヒトSGLTホモログの発現が見られた。
【００８８】実施例４ SGLT発現細胞の作成 Human SGLT1 (NCBI Accession NM_000343)およびSGLT2
(NCBI Accession NM_003041)のcDNAを、Clontech MTC p
anel kidney cDNA libraryからPCR法によって増幅し、
動物細胞発現ベクター pME18S のEcoRI, SpeI siteにク
ローニングすることによりｐME18S-hSGLT1およびｐME18
S-hSGLT2を作成した。プラスミド pME18S , pME18S-SGL
T ホモログ, pME18S-hSGLT1, pME18S-hSGLT2 各5μgと
動物細胞発現ベクター pRSVneo 0.5μgを LipofectAMIN
E PLUS 法 (GIBCOBRL)でCHO細胞( 1x106 cells) に共導
入した。G418 (500μg/ml)、10% FBS添加 DMEM 培地で2
週間培養し、薬剤耐性細胞 を選択した。G418耐性CHO細
胞から、RNAeasy mini キット(Quiagen)を用いて、トー
タルRNAを抽出した。TaqMan Gold RT-PCR キット (PE b
iosystems) を用い、TaqMan PCR 法でSGLT ホモログ、h
SGLT1, hSGLT2の発現量を測定し、各遺伝子を発現して
いるCHO細胞を選択した。
【００８９】実施例５ 糖取りこみ量の測定 SGLT ホモログ、hSGLT1, hSGLT2発現CHO細胞 および pM
E18S 導入CHO 細胞のα-Methyl Glucose の取り込み実
験は、Am. J. Physiol. 270 : G833-G843, 1996および
J. Clin. Invest 93 : 397-404, 1994 の方法に従っ
た。細胞を96wellプレートに1×105 細胞 / well 、100
μl 10% FBS 添加DMEM 培地で播種し、37℃、一夜培養
した。細胞をバッファー (125 mM KCl, 1.2mM KH2PO4,
2.5mM CaCl 2, 1.2mM MgSO4, 4mM Glutamine, 10mM HEPE
S (pH 7.2) , 0.1mg/ml BSA) 150μlで3回洗浄後同バッ
ファーで１時間培養し、残存するグルコースを除去し
た。バッファーを除去し、同バッファーおよびKClをNaC
l あるいは NaCl + 10μM あるいは100μM Phlorizin
(Sigma 社) に置き換えたバッファー 90μl を添加し
た。1mM α-Methyl Glucose を各well に10μl ( [14C]
α-Methyl Glucose (アマシャム ファルマシア バイ
オテク社) 0.02μCi を含む) 添加し１時間後、冷PBS
バッファー 200ulで3回洗浄した。各well に液体シンチ
レータ100μl を添加し、細胞に取り込まれた14Cのカウ
ントを測定した。結果を図3に示した。SGLT ホモログ
は、hSGLT1, hSGLT2 と同様に、Na濃度に依存してSGLT
によって選択的に細胞内に取りこまれるグルコースアナ
ログであるα-Methyl Glucose を取り込み、この活性は
Phlorizin によって阻害されたことから、SGLT の機能
を持つことが証明された。
【００９０】実施例６ マウス腎臓由来Na+/グルコース
トランスポーター蛋白質をコードするcDNAのクローニン
グと塩基配列決定 マウス腎臓cDNA(CLONTECH社)を鋳型とし、2個のプライ
マー、プライマー11（配列番号：17）およびプライマー
12（配列番号：18）を用いてPCR反応を行った。該反応
における反応液の組成は上記cDNA 1μlを鋳型として使
用し、Pfu TurboDNA Polymerase (STRATAGENE社)1μl
量、プライマー11（配列番号：17）およびプライマー12
（配列番号：18）を各0.5μM、dNTPsを200μM、および
酵素に添付のバッファーを5μl加え、50μlの液量とし
た。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・20秒、62℃・30
秒、72℃・2分30秒のサイクルを40回繰り返し、最後に7
2℃・7分の伸長反応を行った。さらに該PCR反応産物を
鋳型とし、2個のプライマー、プライマー13（配列番
号：19）およびプライマー14（配列番号：20）を用いて
PCR反応を行った。該反応における反応液の組成は上記P
CR反応産物1μlを鋳型として使用し、Pfu Turbo DNA po
lymerase(STRATAGENE社) 1μl量、プライマー13(配列番
号：19)およびプライマー14(配列番号：20)を各0.5μ
M、dNTPsを200μM、および酵素に添付のバッファーを5
μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の
後、96℃・20秒、62℃・30秒、72℃・2分30秒のサイク
ルを40回繰り返し、最後に72℃・7分の伸長反応を行っ
た。該PCR反応産物およびプラスミドベクターpME18Sを
制限酵素EcoRI、SpeIで37℃、一夜切断処理した。1％ア
ガロースゲル電気泳動し、2Kbp DNA断片（マウスSGLTホ
モログ）、3Kbp DNA断片（pME18S）を切り出し、ゲルエ
クストラクションキット(Qiagen社)を用いてDNAを抽出
し、ライゲーションキット(宝酒造社)の処方に従い、SG
LTホモログをpME18Sへサブクローニングした。これを大
腸菌DH5αに導入し、cDNAを持つクローンをアンピシリ
ンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配
列を解析した結果、新規Na+/グルコーストランスポータ
ー蛋白質をコードするcDNA配列（配列番号：16）を得
た。これらのアミノ酸配列（配列番号：15）を含有する
新規Na+/グルコーストランスポーター蛋白質をマウスSG
LTホモログとした。また、形質転換体を大腸菌（Escher
ichia coli）DH5α/pTB2238と命名した。マウスSGLTホ
モログの疎水性プロット図を図４に示す。
【００９１】実施例７ TaqMan PCRによるマウスSGLTホ
モログの発現分布の解析 TaqMan PCRに用いるプライマーおよびプローブは、Prim
er Express ver.1.0(PEバイオシステムズジャパン)を用
いて検索し、 プライマー15（5’-tgcacagaccaggtgattgtg-3’）（配
列番号：21） プライマー16（5’-gcacggagcctcccttg-3’）（配列番
号：22） プローブ （5’-ctcgcagccaacaatctttcacatg-3’）
（配列番号：23） を選択した。プローブのリポーター色素として、FAM(6-
carboxyfluorescein)を付加した。スタンダードDNAとし
てマウスSGLTホモログのPCR断片を使用した。PCR反応に
おける反応液の組成はpTB2238 DNA 1μlを鋳型として使
用し、Pfu Turbo DNA polymerase(STRATAGENE社)1μl
量、プライマー17（5’-atctctaatgtccagcaatgtg-3’)
(配列番号：24)およびプライマー18（5’-accagcttgggg
taggcaat-3’）(配列番号：25)を各0.5μM、dNTPsを200
μM、および酵素に添付のバッファーを5μl加え、50μl
の液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・20
秒、62℃・30秒，72℃・30秒のサイクルを40回繰り返
し、最後に72℃・7分の伸長反応を行った。該PCR反応産
物を2％アガロースゲル電気泳動し、0.9kbp DNA断片を
切り出し、ゲルエクストラクションキット（Qiagen社）
を用いてDNAを抽出した。該PCR断片を100-106コピー/μ
lに調整してスタンダードDNAとして使用した。各組織の
cDNAソースとして、6週齢のC57BL/6マウス（チャールズ
リバー社）より肝臓、腎臓、膵臓、骨格筋、白色脂肪組
織、褐色脂肪組織を摘出、ここからtotal RNAを抽出し
た。total RNAの抽出はISOGEN(ニッポンジーン社)の方
法に従った。得られたRNA0.1μgを鋳型としてTaqMan Re
verse Transcription Reagents(Roche社)の方法に従
い、cDNAを合成した。このcDNA1μlを鋳型とし、プライ
マー15（配列番号：21）200nM、プライマー16（配列番
号：22）200nM、プローブ（配列番号：23）50nM、にTaq
Man universal PCR Master mix(PE バイオシステムズジ
ャパン)を添付書類記載の規定量加え、ABI PRISM 7700
sequence Detection system(PE バイオシステムズジャ
パン)でPCR反応および解析を行った。各組織のmRNA量は
GAPDH値で補正した。GAPDHはTaqMan Rodent GAPDH Cont
rol Reagents VIC Probe(アプライドバイオシステムズ
ジャパン)を使用し、上記と同様に添付書類記載の規定
量加え、ABI PRISM 7700 sequence Detection systemで
PCR反応および解析を行った。結果を図５に示した。マ
ウスSGLTホモログは腎臓で高い発現が認められた。
【００９２】実施例８ マウスSGLTホモログ発現細胞の
作成 Human SGLT1(NCBI Accession NM-000343)のcDNAをClont
ech MTC panel kidneycDNA library からPCR法によって
増幅し、動物細胞発現ベクターpME18SのEcoRI、SpeI si
teにサブクローニングすることによりpME18S-hSGLT1を
作成した。プラスミドpME18S、pME18S-hSGLT1、およびp
ME18S-マウスSGLTホモログ各1μgをFuGENE6法（Roche
社）でCOS7細胞（5×105細胞）に導入した。
【００９３】実施例９ 糖取り込み量の測定 pME18S、hSGLT1およびマウスSGLTホモログ導入COS7細胞
のα-Methyl Glucoseの取り込み実験は、Am. J. Physio
l. 270:G833-G843, 1996およびJ. Clin. Invest. 93:39
7-404, 1994の方法に従った。細胞を96穴プレートに3×
104細胞／well、100μl 10%FBS添加DMEM培地で播種し、
37℃で一夜培養した。細胞をバッファー（125mM KCl,
1.2mM KH2PO4, 2.5mM CaCl2, 1.2mM MgSO4, 4mM Glutam
ine, 10mM HEPES(pH7.2), 0.1mg/ml BSA）150μlで3回
洗浄後、同バッファーで1時間培養し、残存するグルコ
ースを除去した。バッファーを除去し、同バッファーお
よびKClをNaCl、あるいはNaCl+100μM phlorizin(Sigma
社)、あるいはNaCl+1mM phlorizinに置き換えたバッフ
ァー90μlを添加した。1mM α-Methyl Glucoseを各well
に10μl（［14C］α-Methyl Glucose（アマシャム フ
ァルマシア バイオテク社）0.02μCiを含む）を添加
し、1時間後、冷PBSバッファー200μlで3回洗浄した。
各wellに液体シンチレータ100μlを添加し、細胞に取り
込まれた14Cのカウントを測定した。結果を図６に示し
た。マウスSGLTホモログは、hSGLT1と同様に、Na+依存
性にSGLTによって選択的に細胞内に取り込まれるグルコ
ースアナログであるα-MethylGlucoseを取り込み、この
活性はphlorizinによって阻害されたことから、SGLTの
機能を持つことが証明された。
【００９４】実施例１０ ラット腎臓由来Na+/グルコー
ストランスポーター蛋白質をコードするcDNAのクローニ
ングと塩基配列決定 ラット腎臓cDNA(CLONTECH社)を鋳型とし、2個のプライ
マー、プライマー19（配列番号：28）およびプライマー
20（配列番号：29）を用いてPCR反応を行った。該反応
における反応液の組成は上記cDNA 1μlを鋳型として使
用し、Pfu TurboDNA Polymerase (STRATAGENE社)1μl
量、プライマー19（配列番号：28）およびプライマー20
（配列番号：29）を各0.5μM、dNTPsを200μM、および
酵素に添付のバッファーを5μl加え、50μlの液量とし
た。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・20秒、62℃・30
秒、72℃・2分30秒のサイクルを40回繰り返し、最後に7
2℃・7分の伸長反応を行った。さらに該PCR反応産物を
鋳型とし、2個のプライマー、プライマー21（配列番
号：30）およびプライマー22（配列番号：31）を用いて
PCR反応を行った。該反応における反応液の組成は上記P
CR反応産物1μlを鋳型として使用し、Pfu Turbo DNA po
lymerase(STRATAGENE社) 1μl量、プライマー21(配列番
号：30)およびプライマー22(配列番号：31)を各0.5μ
M、dNTPsを200μM、および酵素に添付のバッファーを5
μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の
後、96℃・20秒、62℃・30秒、72℃・2分30秒のサイク
ルを40回繰り返し、最後に72℃・7分の伸長反応を行っ
た。該PCR反応産物およびプラスミドベクターpME18Sを
制限酵素EcoRI、SpeIで37℃、一夜切断処理した。1％ア
ガロースゲル電気泳動し、2Kbp DNA断片（ラットSGLTホ
モログ）、3Kbp DNA断片（pME18S）を切り出し、ゲルエ
クストラクションキット(Qiagen社)を用いてDNAを抽出
し、ライゲーションキット(宝酒造社)の処方に従い、SG
LTホモログをpME18Sへサブクローニングした。これを大
腸菌DH5αに導入し、cDNAを持つクローンをアンピシリ
ンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配
列を解析した結果、新規Na+/グルコーストランスポータ
ー蛋白質をコードするcDNA配列（配列番号：27）を得
た。これらのアミノ酸配列（配列番号：26）を含有する
新規Na+/グルコーストランスポーター蛋白質をラットSG
LTホモログとした。また、形質転換体を大腸菌（Escher
ichia coli）DH5α/pTB2239と命名した。ラットSGLTホ
モログの疎水性プロット図を図７に示す。
【００９５】実施例１１ TaqMan PCRによるラットSGLT
ホモログの発現分布の解析 TaqMan PCRに用いるプライマーおよびプローブは、Prim
er Express ver.1.0(PEバイオシステムズジャパン)を用
いて検索し、 プライマー23（5’-ctcacagtcttggccacctg-3’）（配列
番号：32） プライマー24（5’-agaaccggctctctctggag-3’）（配列
番号：33） プローブ （5’-tgcacggaccaggtgattgtgc-3’）（配列
番号：34） を選択した。プローブのリポーター色素として、FAM(6-
carboxyfluorescein)を付加した。スタンダードDNAとし
てラットSGLTホモログのPCR断片を使用した。PCR反応に
おける反応液の組成はpTB2239 DNA 1μlを鋳型として使
用し、Pfu Turbo DNA polymerase(STRATAGENE社)1μl
量、プライマー25（5’-tctggagtcagcctgcacacct-3’)
(配列番号：35)およびプライマー26（5’-cagccttctcag
ctgggctcag-3’）(配列番号：36)を各0.5μM、dNTPsを2
00μM、および酵素に添付のバッファーを5μl加え、50
μlの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・2
0秒、62℃・30秒，72℃・30秒のサイクルを40回繰り返
し、最後に72℃・7分の伸長反応を行った。該PCR反応産
物を2％アガロースゲル電気泳動し、0.9kbp DNA断片を
切り出し、ゲルエクストラクションキット（Qiagen社）
を用いてDNAを抽出した。該PCR断片を100-106コピー/μ
lに調整してスタンダードDNAとして使用した。各組織の
cDNAソースとして、Sprague-Dawley Rat Poly A+ RNA(C
LONTECH社)（Brain, Heart, Kidney, Liver, Lung, Pan
creas, Retina, Skeltal Muscle, Smooth muscle, Sple
en, Testis）を使用した。このRNA0.1μgを鋳型としてT
aqManReverse Transcription Reagents(Roche社)の方法
に従い、cDNAを合成した。このcDNA1μlを鋳型とし、プ
ライマー23（配列番号：32）200nM、プライマー24（配
列番号：33）200nM、プローブ（配列番号：34）50nM、
にTaqMan universal PCR Master mix(PE バイオシステ
ムズジャパン)を添付書類記載の規定量加え、ABIPRISM
7700 sequence Detection system(PE バイオシステムズ
ジャパン)でPCR反応および解析を行った。各組織のmRNA
量はGAPDH値で補正した。GAPDHはTaqManRodent GAPDH C
ontrol Reagents VIC Probe(アプライドバイオシステム
ズジャパン)を使用し、上記と同様に添付書類記載の規
定量加え、ABI PRISM 7700 sequence Detection system
でPCR反応および解析を行った。結果を図８に示した。
ラットSGLTホモログは腎臓と平滑筋において高い発現が
認められた。
【００９６】実施例１２ ラットSGLTホモログ発現細胞
の作成 Human SGLT1(NCBI Accession NM-000343)のcDNAをClont
ech MTC panel kidneycDNA library からPCR法によって
増幅し、動物細胞発現ベクターpME18SのEcoRI、SpeI si
teにサブクローニングすることによりpME18S-hSGLT1を
作成した。プラスミドpME18S、pME18S-hSGLT1、およびp
ME18S-ラットSGLTホモログ各1μgをFuGENE6法（Roche
社）でCOS7細胞（5×105細胞）に導入した。
【００９７】実施例１３ 糖取り込み量の測定 pME18S、hSGLT1およびラットSGLTホモログ導入COS7細胞
のα-Methyl Glucoseの取り込み実験は、Am. J. Physio
l. 270:G833-G843, 1996およびJ. Clin. Invest. 93:39
7-404, 1994の方法に従った。細胞を96穴プレートに3×
104細胞／well、100μl 10%FBS添加DMEM培地で播種し、
37℃で一夜培養した。細胞をバッファー（１２５mM KC
l, 1.2mM KH2PO4, 2.5mM CaCl2, 1.2mM MgSO4, 4mM Glu
tamine,10mM HEPES(pH7.2), 0.1mg/ml BSA）150μlで3
回洗浄後、同バッファーで1時間培養し、残存するグル
コースを除去した。バッファーを除去し、同バッファー
およびKClをNaCl、あるいはNaCl+100μM phlorizin(Sig
ma社)、あるいはNaCl+1mMphlorizinに置き換えたバッフ
ァー90μlを添加した。1mM α-Methyl Glucoseを各well
に10μl（［14C］α-Methyl Glucose（アマシャム フ
ァルマシア バイオテク社）0.02μCiを含む）を添加
し、1時間後、冷PBSバッファー200μlで3回洗浄した。
各wellに液体シンチレータ100μlを添加し、細胞に取り
込まれた14Cのカウントを測定した。結果を図９に示し
た。ラットSGLTホモログは、hSGLT1と同様に、Na+依存
性にSGLTによって選択的に細胞内に取り込まれるグルコ
ースアナログであるα-MethylGlucoseを取り込み、この
活性はphlorizinによって阻害されたことから、SGLTの
機能を持つことが証明された。
【００９８】実施例１４ 抗ヒトSGLTホモログペプチド
抗体の作製 ヒトSGLTホモログの261-275の275番目のアミノ酸残基に
システインをつけたもの（クラボウ社）を免疫原ペプチ
ドとして使用した（配列番号：37）。N-(γ-マレイミド
ブチリロキシ)サクシニミド(GMBS) とKeyhole Limpet H
emocyanin (KLH) を混合し、室温で40分反応した。セフ
ァデックスG-25カラムで分画し、マレイミド基の導入さ
れたKLHを得た。免疫原ペプチド5mgとマレイミド基の導
入されたKLHを等量混合し4℃で1日間反応した。PBS buf
fer で2日間透析し、PBS bufferに1mg/mlの濃度で懸濁
した。完全フロイントアジュバントと抗原を等量で混合
し（トータル0.6 ml）、３ヶ月齢のNew Zealand white
rabbit に皮下免疫した。以後、２〜３週間おきに同量
の免疫源を不完全フロイントアジュバントとともに3回
追加免疫した。5mg の合成ペプチドとSulfo-Link gel 5
ml を、システインを介して結合させ、PBS bufferで平
衡化した。5mlの抗血清を、ペプチドを結合したゲルに
通し、PBS buffer (5 ml) で3回洗浄した。ペプチドに
結合した抗体を0.1N グリシン-HCl buffer (pH 2.5) 8
ml で溶出した。2.4 ml のTris buffer で中和し、抗ヒ
トSGLTホモログペプチド抗体とした。
【００９９】実施例１５ 抗ヒトSGLTホモログペプチド
抗体によるウェスタンブロッティング ヒトSGLTホモログ、hSGLT1、hSGLT2発現CHO細胞およびp
ME18Sベクター導入CHO細胞に対し、抗ヒトSGLTホモログ
ペプチド抗体を用いてウェスタンブロッティングを行っ
た。各細胞を6wellプレートに1×105細胞/2ml 10% FBS
添加MEMα培地/wellで播種し、37℃、一夜培養した。細
胞をバッファー（62.5ｍM Tris(pH6.8),2% SDS）に懸濁
し、超音波破砕機で細胞を破砕した。５％容 2-メルカ
プトエタノール、10％容 グリセロールを加え、5分煮沸
した後、氷冷した。各サンプル50μg相当量をとり、7.5
％アクリルアミドゲルでSDS-PAGEを行った。泳動したゲ
ルをセミドライトランスファー法でニトロセルロースメ
ンブレン（BIO-RAD社）に転写した。転写したニトロセ
ルロースメンブレンを5％ スキムミルクを溶解したTBST
バッファー（10ｍM Tris(pH7.5), 150mM NaCl, 0.05% T
ween20）溶液中で、4℃で一晩反応させた。1次抗体溶液
として抗ヒトSGLTホモログペプチド抗体をTBSTバッファ
ーで50倍に希釈したものを用い、メンブレンを抗体溶液
中で室温で4時間反応させた。メンブレンをTBSTバッフ
ァーで5回洗浄した後、二次抗体として抗ラビット-HRP
抗体（アマシャムファルマシア社）をTBSTバッファーで
10000倍希釈したものを加えた。室温で1時間反応させ、
その後TBSTバッファーで5回洗浄した。ルネッサンスTM
ルミノール ウェスタンブロット化学発光検出試薬プラ
ス (NEN life science社)溶液中で1分反応させ、X線フ
ィルムで現像した。結果を図 10 に示した。抗ヒトSGL
Tホモログペプチド抗体が矢印で示したヒトSGLTホモロ
グを特異的に認識することが証明された。
【０１００】実施例１６ 抗ヒトSGLTホモログペプチド
抗体によるヒト膵臓、肝臓切片の免疫染色 PCR解析の結果からSGLTホモログ遺伝子はヒトでは膵
臓、肝臓及び腎臓に多く発現していることがわかった。
そこでSGLTホモログ遺伝子の糖尿病治療薬開発上での標
的臓器を同定し、その遺伝子機能を明らかにするため、
抗ヒトSGLTホモログポリクローナル抗体（クラボウ）を
用いて正常ヒト膵臓及び肝臓でのSGLTホモログ遺伝子の
発現を免疫染色法によって調べた。正常ヒト膵臓及び肝
臓の組織サンプルはBiochain社から購入した、倫理上問
題のないとされる市販スライドグラスを用いた。切片の
一部は脱パラフィン後、定法に従ってヘマトキシリンエ
オジン染色を行い封入し、形態学的観察を行った（組織
学研究法、佐野豊、南山堂、1985年）。さらに同じロッ
トのほぼ連続と考えられる切片について、抗ヒトSGLTホ
モログポリクローナル抗体を用いて免疫染色を行った。
組織のマウントされたスライドガラスを脱パラフィン
後、免疫染色を行った。免疫染色はベクタステイン ABC
キット（ペルオキシダーゼ法、ベクター社）を用いて行
った。発色基質にはDABを用いた。具体的な実験手順は
キット添付のマニュアルに従って行った。SGLTホモログ
遺伝子の発現は膵臓では腺房細胞に強く見られ、肝臓で
は肝実質細胞全体に渡って発現が見られた。また肝実質
細胞内での発現に極性は見られなかった。
【０１０１】実施例１７ SNPを有するヒトSGLTホモロ
グ発現ベクターの作製 Celela社 SNPデータベースを検索するとヒトSGLTホモ
ログ構造遺伝子には、3ヶ所SNPが認められた（図11）。
G433A の塩基置換は、Val145Metのアミノ酸置換を起こ
し、これをSNP C1 と命名した。G786T の塩基置換は、M
et262Ileのアミノ酸置換を起こし、これをSNP C2 と命
名した。G1756T の塩基置換は、Glu586Stopのアミノ酸
置換を起こし、これをSNP C3 と命名した。SNP C1, C2
の塩基置換は、pME18S-ヒトSGLTホモログ(pTB2193) D
NA にQuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit
（STRATAGENE社）を用いて導入した。 PTB2193 10ng 、
反応buffer 5μl、C1 変異導入用プライマー（配列番
号：38）あるいはC2 変異導入用プライマー（配列番
号：39）125ng、dNTP mix 1μl、QuickSolution 3μlに
蒸留水を添加して50μlとし、Pfu Turbo DNA Polymeras
e(2.5U/μl)を1μl添加した。PCR反応は、95℃・1分の
後、95℃・50秒、60℃・50秒、68℃・12分のサイクルを
18回繰り返し、最後に68℃・7分の伸長反応を行った。
該PCR反応産物に制限酵素DpnI(10U)を添加し、37℃で1
時間反応し、メチル化された親鎖DNAを切断した。これ
を大腸菌XL1- Blueに導入し、cDNAを持つクローンを、
アンピシリンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のク
ローンの配列を解析し、C1 の塩基置換の入ったcDNA 配
列（配列番号：40）、アミノ酸配列（配列番号：41）を
得た。また形質転換体を大腸菌（Escherichia coli）XL
1- Blue /pTB2251と命名した。次にC2 の塩基置換の入
ったcDNA 配列（配列番号：42）、アミノ酸配列（配列
番号：43）を得た。また形質転換体を大腸菌（Escheric
hia coli）XL1-Blue /pTB2252と命名した。SNP C3の塩
基置換は、pME18S-ヒトSGLTホモログ(pTB2193) DNA を
鋳型とし、2個のプライマー、プライマー3（配列番号：
5）およびC3変異導入用プライマー（配列番号：44）を
用いてPCR反応を行った。該反応における反応液の組成
は上記DNA 10ngを鋳型として使用し、Pfu Turbo DNA Po
lymerase (STRATAGENE社)1μl量、プライマー3（配列番
号：5）およびC3変異導入用プライマー（配列番号：4
4）を各0.5μM、dNTPsを200μM、および酵素に添付のバ
ッファーを5μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、
94℃・1分の後、96℃・20秒、62℃・30秒、72℃・2分30
秒のサイクルを40回繰り返し、最後に72℃・7分の伸長
反応を行った。該PCR反応産物およびプラスミドベクタ
ーpME18Sを制限酵素EcoRI(10U), SpeI(10U)で37℃、一
夜切断処理した。1% アガロースゲル電気泳動し、1.8 K
bp DNA断片(SGLTホモログ), 3Kbp DNA断片(pME18S)を切
り出し、ゲルエクストラクションキット（Qiagen社）を
用いてDNAを抽出し、ライゲーションキット（宝酒造
社）の処方に従い、C3変異の導入されたSGLTホモログを
pME18Sへサブクローニングした。これを大腸菌DH5αに
導入し、cDNAを持つクローンを、アンピシリンを含むLB
寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析し
た結果、C3変異の導入されたcDNA配列（配列番号：4
5）、アミノ酸配列（配列番号：46）を得た。また形質
転換体を大腸菌（Escherichia coli）DH5α/pTB2253と
命名した。
【０１０２】実施例１８ SNPを有するヒトSGLTホモロ
グ発現細胞の作製 動物細胞発現ベクターpME18S、pME18S-hSGLT2 および p
ME18S-ヒトSGLTホモログ(pTB2193)、pME18S-ヒトSGLTホ
モログ SNP-C1 (pTB2251)、pME18S-ヒトSGLTホモログ S
NP-C2 (pTB2252)、pME18S-ヒトSGLTホモログ SNP-C3 (p
TB2253)各1μgとFuGENE 6（Roche社）3μlをOpti-MEM
(Gibco-BRL社)100μlに添加し、15分間室温で放置した
後、COS7細胞（1×106細胞/1ml 10% FBS添加DMEM培地 /
6 well plate）に添加し遺伝子導入した。
【０１０３】実施例１９ SNPを有するヒトSGLTホモロ
グ発現細胞の糖取り込み活性の測定 pME18S、pME18S-hSGLT2 および pME18S-ヒトSGLTホモロ
グ(pTB2193)、pME18S-ヒトSGLTホモログ SNP-C1 (pTB22
51)、pME18S-ヒトSGLTホモログ SNP-C2 (pTB2252)、pME
18S-ヒトSGLTホモログ SNP-C3 (pTB2253)導入COS7細胞
のα-Methyl Glucoseの取り込み実験は、Am. J. Physio
l. 270:G833-G843, 1996およびJ. Clin.Invest. 93:397
-404, 1994の方法に従った。遺伝子導入処理した細胞
は、一日培養後96穴プレートに3×104細胞／well、100
μl 10%FBS添加DMEM培地で播種し、37℃で一夜培養し
た。細胞をバッファー（125mM KCl, 1.2mM KH2PO4, 2.5
mM CaCl 2, 1.2mM MgSO4, 4mM Glutamine, 10mM HEPES(p
H7.2), 0.1mg/ml BSA）150μlで3回洗浄後、同バッファ
ーで1時間培養し、残存するグルコースを除去した。バ
ッファーを除去し、同バッファーおよびKClをNaCl、あ
るいはNaCl+100μM phlorizin(Sigma社)、あるいはNaCl
+1mM phlorizinに置き換えたバッファー90μlを添加し
た。1mM α-Methyl Glucoseを各wellに10μl（［14C］
α-Methyl Glucose（アマシャム ファルマシア バイ
オテク社）0.02μCiを含む）を添加し、1時間後、冷PBS
バッファー200μlで3回洗浄した。各wellに液体シンチ
レータ100μlを添加し、細胞に取り込まれた14Cのカウ
ントを測定した。pME18S vector 導入COS-7細胞 (KCl)
の糖取り込み量を1として、結果を図12に示した。ヒトS
GLT ホモログは、hSGLT2 と同様に、NaCl で糖取り込み
が上昇し、SGLT の特異的阻害剤フロリジンによって抑
制された。SNP C1 は、NaCl による糖取り込み活性の上
昇が低下していた。SNP C2 は、糖取り込み活性に有意
な差は認められなかった。SNP C3は、NaClによる糖取り
込み活性の上昇が消失していた。
【０１０４】実施例２０ ヒトSGLTホモログ遺伝子上流
領域のクローニングと塩基配列の決定 ヒトゲノム遺伝子（CLONTECH社）を鋳型とし、２個のプ
ライマー２７（配列番号：４７）およびプライマー２８
（配列番号：４８）を用いてPCR反応を行った。該反応
における反応液の組成は前記ゲノムDNA 1μlを鋳型とし
て使用し、PfuTurbo DNA Polymerase（STRATAGENE社）1
μl量、プライマー２７（配列番号：４７）を0.5μM、
プライマー２８（配列番号：４８）を0.5μM、dNTPsを2
00μM、および酵素に添付のバッファーを5μl加え、50
μlの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・2
0秒、65℃・30秒、72℃・4分のサイクルを40回繰り返
し、最後に72℃・7分の伸長反応を行った。さらに、該P
CR反応産物を鋳型とし、2個のプライマー、プライマーK
1（配列番号：４９）およびプライマーX1（配列番号：
５０）を用いてPCR反応を行った。該反応における反応
液の組成は前記PCR反応産物 1μlを鋳型として使用し、
Pfu Turbo DNA Polymerase（STRATAGENE社）1μl量、プ
ライマーK1（配列番号：４９）およびプライマーX1（配
列番号：５０）を各0.5μM、dNTPsを200μM、および酵
素に添付のバッファーを5μl加え、50μlの液量とし
た。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・20秒、65℃・30
秒、72℃・3分のサイクルを40回繰り返し、最後に72℃
・7分の伸長反応を行った。該PCR反応産物およびホタル
・ルシフェラーゼ発現プラスミドベクターpGV-B2（ニッ
ポンジーン社）を制限酵素KpnI(10U)、 XhoI(10U)で37
℃、一夜切断処理した。1% アガロースゲル電気泳動
し、2.3 Kbp DNA断片(ヒトSGLTホモログ遺伝子上流領
域)、4.8Kbp DNA断片(pGV-B2)を切り出し、ゲルエクス
トラクションキット（Qiagen社）を用いてDNAを抽出
し、ライゲーションキット（宝酒造社）の処方に従い、
ヒトSGLTホモログ遺伝子上流領域をpGV-B2へサブクロー
ニングした。これを大腸菌DH5αに導入し、cDNAを持つ
クローンをアンピシリンを含むLB寒天培地中で選択し
た。個々のクローンの配列を解析した結果、ヒトSGLTホ
モログ遺伝子翻訳開始点の2261bp上流から8bp上流領域
のDNA配列（配列番号：５１）を得た。また形質転換体
を大腸菌（Escherichia coli）XL1-Blue/pTB2254と命名
した。ヒトSGLTホモログ遺伝子上流領域DNA配列には、I
sl1, HNF5, PPAR, HNF4 などの転写因子の認識結合配
列、RNA ポリメラーゼが結合するTATA box が存在した
（図13）。
【０１０５】実施例２１ SNPを有するヒトSGLTホモロ
グ遺伝子上流領域の作製 Celela社 SNPデータベースを検索すると、ヒトSGLTホ
モログ遺伝子上流領域に２ヶ所のSNPが見つかった（図1
3）。C翻訳開始点1564bp上流TをSNP-P1、A翻訳開始点14
38bp上流TをSNP-P2と命名した。SNP P1, P2の塩基置換
は、pGV-B2-ヒトSGLTホモログ遺伝子上流領域(pTB2254)
DNA にQuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit
（STRATAGENE社）を用いて導入した。 pTB2254 10ng、
反応buffer 5μl、P1 変異導入用プライマー（配列番
号：52）あるいはP2 変異導入用プライマー（配列番
号：53）125ng、dNTPmix 1μl、QuickSolution 3μlに
蒸留水を添加して50μlとし、Pfu Turbo DNAPolymerase
(2.5U/μl)を1μl添加した。PCR反応は、95℃・1分の
後、95℃・50秒、60℃・50秒、68℃・12分のサイクルを
18回繰り返し、最後に68℃・7分の伸長反応を行った。
該PCR反応産物に制限酵素DpnI(10U)を添加し、37℃で1
時間反応し、メチル化された親鎖DNAを切断した。これ
を大腸菌XL-1 Blueに導入し、プラスミドを持つクロー
ンを、アンピシリンを含むLB寒天培地中で選択した。個
々のクローンの配列を解析し、P2 の塩基置換の入ったD
NA 配列（配列番号：54）を得た。また形質転換体を大
腸菌（Escherichia coli）XL1-Blue /pTB2255と命名し
た。P1 の塩基置換の入ったDNA 配列（配列番号：55）
を得た。また形質転換体を大腸菌（Escherichia coli）
XL1-Blue /pTB2256と命名した。P1 ,P2両方の塩基置換
の入ったDNA 配列（配列番号：56）を得た。また形質転
換体を大腸菌（Escherichia coli）DH5α/pTB2257と命
名した。
【０１０６】実施例２２ ヒトSGLTホモログ遺伝子上流
領域の欠失変異体の作製 ヒトSGLTホモログ遺伝子上流領域 (pTB2254) DNAを鋳型
とし、2個のプライマーセット、プライマーK2（配列番
号：５７）およびプライマーX1（配列番号：５０）、プ
ライマーK3（配列番号：５８）およびプライマーX1（配
列番号：５０）、プライマーK1（配列番号：４９）およ
びプライマーX2（配列番号：５９）, プライマーK2（配
列番号：５７）およびプライマーX2（配列番号：５９）
を用いてPCR反応を行った。該反応における反応液の組
成は前記pTB2254 DNA 10ngを鋳型として使用し、Pfu Tu
rbo DNA Polymerase（STRATAGENE社）1μl量、各プライ
マーセットを各0.5μM、dNTPsを200μM、および酵素に
添付のバッファーを5μl加え、50μlの液量とした。PCR
反応は、94℃・1分の後、96℃・20秒、65℃・30秒、72
℃・3分のサイクルを40回繰り返し、最後に72℃・7分の
伸長反応を行った。該PCR反応産物およびホタル・ルシ
フェラーゼ発現プラスミドベクターpGV-B2（ニッポンジ
ーン社）を制限酵素KpnI(10U)、 XhoI(10U)で37℃、一
夜切断処理した。1% アガロースゲル電気泳動し、1.3 K
bp DNA断片(K2X1)、450 bp DNA断片(K3X1)、1.8 Kbp DN
A断片(K1X2)、0.8 Kbp DNA断片(K2X2)、4.8 Kbp DNA断
片(pGV-B2)を切り出し、ゲルエクストラクションキット
（Qiagen社）を用いてDNAを抽出し、ライゲーションキ
ット（宝酒造社）の処方に従い、ヒトSGLTホモログ遺伝
子上流領域をpGV-B2へサブクローニングした。これを大
腸菌DH5αに導入し、DNAを持つクローンを、アンピシリ
ンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配
列を解析した結果、ヒトSGLTホモログ遺伝子上流領域DN
A配列 K2X1, K3X1,K1X2, K2X2を得た(図14)。
【０１０７】実施例２３ ヒトSGLTホモログ遺伝子上流
領域+レポータープラスミド導入細胞の作製 プロモーターを含まないホタル・ルシフェラーゼ発現プ
ラスミドベクターpGV-B2（ニッポンジーン社）、SV40ウ
ィルス初期エンハンサー／プロモーター＋ホタル・ルシ
フェラーゼ発現プラスミドベクターpGV-C2（ニッポンジ
ーン社）、ヒトSGLTホモログ遺伝子上流領域+レポータ
ープラスミド K1X1(CA), K1X1(CT), K1X1(TA), K1X1(T
T), K2X1, K3X1, K1X2, K2X2 各0.5μgと内部標準化す
るためのコントロールとしてpRL-TK(単純ヘルペスウィ
ルスのチミジンキナーゼプロモーター下流にシーパンジ
ー・ルシフェラーゼを発現する、ニッポンジーン社)0.5
μgと FuGENE 6（Roche社）3μlをOpti-MEM (Gibco-BRL
社)50μlに添加し15分間室温で放置した後、ヒト肝癌細
胞株HepG2細胞（1×105細胞/0.2ml 10%FBS添加DMEM培地
/48 well plate）に各サンプル4wellずつ10μl/well添
加することにより導入処理し、２日間培養した。プロモ
ーター活性は、ピッカジーンデュアル・シーパンジー
（ニッポンジーン社）を用いて測定した。HepG2 細胞を
PBS(200μl)で2回洗浄し、添付の細胞溶解剤を各ウェル
に30μlずつ添加し、室温で15分間振とうした。細胞溶
解液を各ウェル10μlずつ96ウェルフルオロブラックプ
レート（大日本製薬）に移した。ルシフェラーゼによる
発光量の測定は、Luminoskan RS （Labsystems 社）を
用いた。ホタル・ルシフェラーゼ活性はピッカジーン発
光試薬IIを各ウェル50μlずつ添加し、測定遅延時間1秒
後、５秒間発光量を測定した。その後シーパンジー・ル
シフェラーゼ活性は、シーパンジー発光試薬を各ウェル
50μlずつ添加し、測定遅延時間1秒後、５秒間発光量を
測定した。プロモーター活性は、各ウェルのホタル・ル
シフェラーゼ活性のシーパンジー・ルシフェラーゼ活性
に対する比率で示した（図15）。X1K3領域が、ヒトSGLT
ホモログのプロモーター活性に必須であること、K1K3領
域があればさらにプロモーター活性が高まることがわか
った。SNP は、CA, CT, TA型の間ではプロモーター活性
に差はないが、TT型は活性が低下することがわかった。
【０１０８】実施例２４ ヒトSGLTホモログのSNP解析 ヒトSGLTホモログプロモーター内のSNPをそれぞれSNP-P
1、SNP-P2とし、構造遺伝子内のSNPをSNP-C1、SNP-C2、
SNP-C3とし、それぞれについてPCRフラグメント直接シ
ークエンス法で配列を確認した。該反応における反応液
の組成は、ヒトゲノムDNA（BCP社）200ngを鋳型として
使用し、Pfu Turbo DNA polymerase(STRATAGENE社)1μl
量、dNTPsを200μM、および酵素に添付のバッファーを5
μl 加えた。SNP-P1、P2についてはプライマー２９（配
列番号：６０）、およびプライマー３０（配列番号：６
１）を各0.5μM加え、50μlの液量とした。同様にSNP-C
1についてはプライマー３２(配列番号：６３)、および
プライマー３３(配列番号：６４)を、SNP-C2については
プライマー３５(配列番号：６６)、およびプライマー３
６（配列番号：６７）を、SNP-C3についてはプライマー
３８(配列番号：６９)、およびプライマー３９（配列番
号：７０）をそれぞれ使用した。PCR反応はいずれも94
℃・1分の後、96℃・20秒、57℃・30秒、72℃・30秒の
サイクルを40回繰り返し、最後に72℃・7分の伸長反応
を行った。該PCR反応産物を2％アガロースゲルで電気泳
動し、500bpのDNA断片を切り出し、ゲルエクストラクシ
ョンキット（Qiagen社）を用いてDNAを30μl量抽出し
た。抽出したDNA 5μlに対し、5×sequencing buffer
（PEバイオシステムズジャパン社） 4μl、BigDye Term
inator RR Mix (PEバイオシステムズジャパン社)4μlを
加えた。SNP-P1、P2についてはプライマー３１（配列番
号：６２）を3.2pmolを加え、20μlの液量とした。同様
にSNP-C1についてはプライマー３４(配列番号：６５)
を、SNP-C2についてはプライマー３７ (配列番号：６
８)を、SNP-C3についてはプライマー４０(配列番号：７
１)をそれぞれ使用した。シークエンス反応は94℃・1分
の後、96℃・10秒、50℃・5秒、60℃・4分のサイクルを
25回繰り返し、72℃・7分の伸長反応を行った。該反応
産物をSephadex-G50 superfine(アマシャムファルマシ
ア社)で精製した後、100℃・3分処理し、氷冷した。ABI
3700 AutosequencerでSNP部位の塩基配列を決定した。
結果を図16に示す。SNP-C2を除いては健常人58例中にお
いてもSNPの発現が確認された。
【０１０９】
【発明の効果】配列番号：１、配列番号：１５または配
列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実
質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質は糖尿病
等の診断マーカー等として有用であり、該タンパク質を
用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の
活性を促進または阻害する化合物は、例えば、糖尿病、
高脂血症などの疾病の予防・治療剤として使用すること
ができる。
【０１１０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel Protein and Its DNA <130> B01455 <150> JP 2000-403078 <151> 2000-12-28 <150> JP 2001-195467 <151> 2001-06-27 <160> 71 <210> 1 <211> 674 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Gly Pro Gly Ala Ser Gly Asp Gly Val Arg Thr Glu Thr Ala Pro 5 10 15 His Ile Ala Leu Asp Ser Arg Val Gly Leu His Ala Tyr Asp Ile Ser 20 25 30 Val Val Val Ile Tyr Phe Val Phe Val Ile Ala Val Gly Ile Trp Ser 35 40 45 Ser Ile Arg Ala Ser Arg Gly Thr Ile Gly Gly Tyr Phe Leu Ala Gly 50 55 60 Arg Ser Met Ser Trp Trp Pro Ile Gly Ala Ser Leu Met Ser Ser Asn 65 70 75 80 Val Gly Ser Gly Leu Phe Ile Gly Leu Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly 85 90 95 Gly Leu Ala Val Gly Gly Phe Glu Trp Asn Ala Thr Trp Leu Leu Leu 100 105 110 Ala Leu Gly Trp Val Phe Val Pro Val Tyr Ile Ala Ala Gly Val Val 115 120 125 Thr Met Pro Gln Tyr Leu Lys Lys Arg Phe Gly Gly Gln Arg Ile Gln 130 135 140 Val Tyr Met Ser Val Leu Ser Leu Ile Leu Tyr Ile Phe Thr Lys Ile 145 150 155 160 Ser Thr Asp Ile Phe Ser Gly Ala Leu Phe Ile Gln Met Ala Leu Gly 165 170 175 Trp Asn Leu Tyr Leu Ser Thr Gly Ile Leu Leu Val Val Thr Ala Val 180 185 190 Tyr Thr Ile Ala Gly Gly Leu Met Ala Val Ile Tyr Thr Asp Ala Leu 195 200 205 Gln Thr Val Ile Met Val Gly Gly Ala Leu Val Leu Met Phe Leu Gly 210 215 220 Phe Gln Asp Val Gly Trp Tyr Pro Gly Leu Glu Gln Arg Tyr Arg Gln 225 230 235 240 Ala Ile Pro Asn Val Thr Val Pro Asn Thr Thr Cys His Leu Pro Arg 245 250 255 Pro Asp Ala Phe His Met Leu Arg Asp Pro Val Ser Gly Asp Ile Pro 260 265 270 Trp Pro Gly Leu Ile Phe Gly Leu Thr Val Leu Ala Thr Trp Cys Trp 275 280 285 Cys Thr Asp Gln Val Ile Val Gln Arg Ser Leu Ser Ala Lys Ser Leu 290 295 300 Ser His Ala Lys Gly Gly Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Lys Ile Leu 305 310 315 320 Pro Met Phe Phe Ile Val Met Pro Gly Met Ile Ser Arg Ala Leu Phe 325 330 335 Pro Asp Glu Val Gly Cys Val Asp Pro Asp Val Cys Gln Arg Ile Cys 340 345 350 Gly Ala Arg Val Gly Cys Ser Asn Ile Ala Tyr Pro Lys Leu Val Met 355 360 365 Ala Leu Met Pro Val Gly Leu Arg Gly Leu Met Ile Ala Val Ile Met 370 375 380 Ala Ala Leu Met Ser Ser Leu Thr Ser Ile Phe Asn Ser Ser Ser Thr 385 390 395 400 Leu Phe Thr Ile Asp Val Trp Gln Arg Phe Arg Arg Lys Ser Thr Glu 405 410 415 Gln Glu Leu Met Val Val Gly Arg Val Phe Val Val Phe Leu Val Val 420 425 430 Ile Ser Ile Leu Trp Ile Pro Ile Ile Gln Ser Ser Asn Ser Gly Gln 435 440 445 Leu Phe Asp Tyr Ile Gln Ala Val Thr Ser Tyr Leu Ala Pro Pro Ile 450 455 460 Thr Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ile Phe Cys Lys Arg Val Thr Glu Pro 465 470 475 480 Gly Ala Phe Trp Gly Leu Val Phe Gly Leu Gly Val Gly Leu Leu Arg 485 490 495 Met Ile Leu Glu Phe Ser Tyr Pro Ala Pro Ala Cys Gly Glu Val Asp 500 505 510 Arg Arg Pro Ala Val Leu Lys Asp Phe His Tyr Leu Tyr Phe Ala Ile 515 520 525 Leu Leu Cys Gly Leu Thr Ala Ile Val Ile Val Ile Val Ser Leu Cys 530 535 540 Thr Thr Pro Ile Pro Glu Glu Gln Leu Thr Arg Leu Thr Trp Trp Thr 545 550 555 560 Arg Asn Cys Pro Leu Ser Glu Leu Glu Lys Glu Ala His Glu Ser Thr 565 570 575 Pro Glu Ile Ser Glu Arg Pro Ala Gly Glu Cys Pro Ala Gly Gly Gly 580 585 590 Ala Ala Glu Asn Ser Ser Leu Gly Gln Glu Gln Pro Glu Ala Pro Ser 595 600 605 Arg Ser Trp Gly Lys Leu Leu Trp Ser Trp Phe Cys Gly Leu Ser Gly 610 615 620 Thr Pro Glu Gln Ala Leu Ser Pro Ala Glu Lys Ala Ala Leu Glu Gln 625 630 635 640 Lys Leu Thr Ser Ile Glu Glu Glu Pro Leu Trp Arg His Val Cys Asn 645 650 655 Ile Asn Ala Val Leu Leu Leu Ala Ile Asn Ile Phe Leu Trp Gly Tyr 660 665 670 Phe Ala 674 <210> 2 <211> 2022 <212> DNA <213> Human <400> 2 atggggcctg gagcttcagg ggacggggtc aggactgaga cagctccaca catagcactg 60 gactccagag ttggtctgca cgcctacgac atcagcgtgg tggtcatcta ctttgtcttc 120 gtcattgctg tggggatctg gtcgtccatc cgtgcaagtc gagggaccat tggcggctat 180 ttcctggccg ggaggtccat gagctggtgg ccaattggag catctctgat gtccagcaat 240 gtgggcagtg gcttgttcat cggcctggct gggacagggg ctgccggagg ccttgccgta 300 ggtggcttcg agtggaacgc aacctggctg ctcctggccc ttggctgggt cttcgtccct 360 gtgtacatcg cagcaggtgt ggtcacaatg ccgcagtatc tgaagaagcg atttgggggc 420 cagaggatcc aggtgtacat gtctgtcctg tctctcatcc tctacatctt caccaagatc 480 tcgactgaca tcttctctgg agccctcttc atccagatgg cattgggctg gaacctgtac 540 ctctccacag ggatcctgct ggtggtgact gccgtctaca ccattgcagg tggcctcatg 600 gccgtgatct acacagatgc tctgcagacg gtgatcatgg tagggggagc cctggtcctc 660 atgtttctgg gctttcagga cgtgggctgg tacccaggcc tggagcagcg gtacaggcag 720 gccatcccta atgtcacagt ccccaacacc acctgtcacc tcccacggcc cgatgctttc 780 cacatgcttc gggaccctgt gagcggggac atcccttggc caggtctcat tttcgggctc 840 acagtgctgg ccacctggtg ttggtgcaca gaccaggtca ttgtgcagcg gtctctctcg 900 gccaagagtc tgtctcatgc caagggaggc tccgtgctgg ggggctacct gaagatcctc 960 cccatgttct tcatcgtcat gcctggcatg atcagccggg ccctgttccc agacgaggtg 1020 ggctgcgtgg accctgatgt ctgccaaaga atctgtgggg cccgagtggg atgttccaac 1080 attgcctacc ctaagttggt catggccctc atgcctgttg gtctgcgggg gctgatgatt 1140 gccgtgatca tggccgctct catgagctca ctcacctcca tcttcaacag cagcagcacc 1200 ctgttcacca ttgatgtgtg gcagcgcttc cgcaggaagt caacagagca ggagctgatg 1260 gtggtgggca gagtgtttgt ggtgttcctg gttgtcatca gcatcctctg gatccccatc 1320 atccaaagct ccaacagtgg gcagctcttc gactacatcc aggctgtcac cagttacctg 1380 gccccaccca tcaccgctct cttcctgctg gccatcttct gcaagagggt cacagagccc 1440 ggagctttct ggggcctcgt gtttggcctg ggagtggggc ttctgcgtat gatcctggag 1500 ttctcatacc cagcgccagc ctgtggggag gtggaccgga ggccagcagt gctgaaggac 1560 ttccactacc tgtactttgc aatcctcctc tgcgggctca ctgccatcgt cattgtcatt 1620 gtcagcctct gtacaactcc catccctgag gaacagctca cacgcctcac atggtggact 1680 cggaactgcc ccctctctga gctggagaag gaggcccacg agagcacacc ggagatatcc 1740 gagaggccag ccggggagtg ccctgcagga ggtggagcgg cagagaactc gagcctgggc 1800 caggagcagc ctgaagcccc aagcaggtcc tggggaaagt tgctctggag ctggttctgt 1860 gggctctctg gaacaccgga gcaggccctg agcccagcag agaaggctgc gctagaacag 1920 aagctgacaa gcattgagga ggagccactc tggagacatg tctgcaacat caatgctgtc 1980 cttttgctgg ccatcaacat cttcctctgg ggctattttg cg 2022 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ctaacagaga gcaaggagct ggc 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 aggtctgtgg aatcacgcaa 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 tggaattcat ggggcctgga gctt 24 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tctactagtt cacgcaaaat agccccaga 29 <210> 7 <211> 3140 <212> DNA <213> Human <400> 7 atggggcctg gagcttcagg ggacggggtc aggactgaga cagctccaca catagcactg 60 gactccagag ttggtctgca cgcctacgac atcagcgtgg tggtcatcta ctttgtcttc 120 gtcattgctg tggggatctg gtcgtccatc cgtgcaagtc gagggaccat tggcggctat 180 ttcctggccg ggaggtccat gagctggtgg ccaattggag catctctgat gtccagcaat 240 gtgggcagtg gcttgttcat cggcctggct gggacagggg ctgccggagg ccttgccgta 300 ggtggcttcg agtggaacgc aacctggctg ctcctggccc ttggctgggt cttcgtccct 360 gtgtacatcg cagcaggtgt ggtcacaatg ccgcagtatc tgaagaagcg atttgggggc 420 cagaggatcc aggtgtacat gtctgtcctg tctctcatcc tctacatctt caccaagatc 480 tcgactgaca tcttctctgg agccctcttc atccagatgg cattgggctg gaacctgtac 540 ctctccacag ggatcctgct ggtggtgact gccgtctaca ccattgcagg tggcctcatg 600 gccgtgatct acacagatgc tctgcagacg gtgatcatgg tagggggagc cctggtcctc 660 atgtttctgg gctttcagga cgtgggctgg tacccaggcc tggagcagcg gtacaggcag 720 gccatcccta atgtcacagt ccccaacacc acctgtcacc tcccacggcc cgatgctttc 780 cacatgcttc gggaccctgt gagcggggac atcccttggc caggtctcat tttcgggctc 840 acagtgctgg ccacctggtg ttggtgcaca gaccaggtca ttgtgcagcg gtctctctcg 900 gccaagagtc tgtctcatgc caagggaggc tccgtgctgg ggggctacct gaagatcctc 960 cccatgttct tcatcgtcat gcctggcatg atcagccggg ccctgttccc agacgaggtg 1020 ggctgcgtgg accctgatgt ctgccaaaga atctgtgggg cccgagtggg atgttccaac 1080 attgcctacc ctaagttggt catggccctc atgcctgttg gtctgcgggg gctgatgatt 1140 gccgtgatca tggccgctct catgagctca ctcacctcca tcttcaacag cagcagcacc 1200 ctgttcacca ttgatgtgtg gcagcgcttc cgcaggaagt caacagagca ggagctgatg 1260 gtggtgggca gagtgtttgt ggtgttcctg gttgtcatca gcatcctctg gatccccatc 1320 atccaaagct ccaacagtgg gcagctcttc gactacatcc aggctgtcac cagttacctg 1380 gccccaccca tcaccgctct cttcctgctg gccatcttct gcaagagggt cacagagccc 1440 ggagctttct ggggcctcgt gtttggcctg ggagtggggc ttctgcgtat gatcctggag 1500 ttctcatacc cagcgccagc ctgtggggag gtggaccgga ggccagcagt gctgaaggac 1560 ttccactacc tgtactttgc aatcctcctc tgcgggctca ctgccatcgt cattgtcatt 1620 gtcagcctct gtacaactcc catccctgag gaacagctca cacgcctcac atggtggact 1680 cggaactgcc ccctctctga gctggagaag gaggcccacg agagcacacc ggagatatcc 1740 gagaggccag ccggggagtg ccctgcagga ggtggagcgg cagagaactc gagcctgggc 1800 caggagcagc ctgaagcccc aagcaggtcc tggggaaagt tgctctggag ctggttctgt 1860 gggctctctg gaacaccgga gcaggccctg agcccagcag agaaggctgc gctagaacag 1920 aagctgacaa gcattgagga ggagccactc tggagacatg tctgcaacat caatgctgtc 1980 cttttgctgg ccatcaacat cttcctctgg ggctattttg cgtgattcca cagacctggc 2040 ttcagtgtag acagattaaa caaagcccaa gcctgtcagc cacagaaaca ggctctcctc 2100 ttactttgct gtctaaactg gagatcacag aagtcaagac tgcaagctcc cctgaagaga 2160 atccaactca acctgcacac ttgacaagtg gagaaacaga agctcagaga gagcactggg 2220 tttgttcagg accacccaga aggtgtcaca cggggtttcc ccactctttc tgatatattg 2280 ccttacagac ctacctcaaa cacactgttt ccaccctctt cttgaatgta ttcagtagcc 2340 tttactgaat gtgtgtcttg agagtagaaa aatggaggat acaagaaaag gagcaggaag 2400 aaatttgcaa aaatccaaga gcacctttgc tcccccttat cctccttcct cttccccttt 2460 ctagttcccc tacctctcta tctttctatt ctcaccaata atctctttgt tgcatgaatt 2520 tacccaggag agtcctatat ttccattggt ggctccacag tggtggctgt cagacccgaa 2580 ggggtgggga gccaagggtg gactttaagc atggtgacag atggtatttt gggcagaaag 2640 ctcttagaca atggactatc caaagcacta tttaaattct gcctcttcct actctctaac 2700 ccaaatatgc acaaactctc tatggccttg agaagcagtt ggagagacat gacttgttaa 2760 aacctcaagg aatcaagaca tgttactctg tatttaaggg taagccccac agcgggcagc 2820 acaaacagcc tgggagccac tgtgcctgtg cttctctgtc cttctccctt tgcttgccat 2880 gaatccgcat accttggaat acactgtgac cccagttaag tgtcccttcg ccaggaagct 2940 gccgcaacgt ccagacctgg gtcaagttcc cactcctgct cccatagcct tgacctgctt 3000 ctgtcacagc actgatcaca ctgagatgga agactccagg gggcaaggac caagggccat 3060 atcccaagtg actttgtacc cagaaaataa cagctgttca ataaatgtgt attgagttaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3140 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggtctgcggg ggctgatgat tg 22 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 aggctggcgc tgggtatgag aac 23 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 cccgatgctt tccacattct tc 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 acaatgacct ggtctgtgca cc 22 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 acatcccttg gccaggtctc attttcgg 28 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 gggggccaga ggatccaggt gta 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gcaatcatca gcccccgcag ac 22 <210> 15 <211> 678 <212> PRT <213> Mouse <400> 15 Met Glu Pro Gly Val Ser Arg Asn Gly Val Arg Thr Glu Thr Thr Thr 5 10 15 Asn Pro Ser Leu Gly Leu His Thr Tyr Asp Ile Val Val Val Val Ile 20 25 30 Tyr Phe Val Phe Val Leu Ala Val Gly Ile Trp Ser Ser Ile Arg Ala 35 40 45 Ser Arg Gly Thr Val Gly Gly Tyr Phe Leu Ala Gly Arg Ser Met Thr 50 55 60 Trp Trp Pro Ile Gly Ala Ser Leu Met Ser Ser Asn Val Gly Ser Gly 65 70 75 80 Leu Phe Ile Gly Leu Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Leu Ala Val 85 90 95 Gly Gly Phe Glu Trp Asn Ala Thr Phe Leu Leu Leu Ala Leu Gly Trp 100 105 110 Ile Phe Val Pro Val Tyr Ile Ala Ala Gly Val Val Thr Met Pro Gln 115 120 125 Tyr Leu Lys Lys Arg Phe Gly Gly Gln Arg Ile Gln Val Tyr Met Ser 130 135 140 Val Leu Ser Leu Ile Leu Tyr Ile Phe Thr Lys Ile Ser Thr Asp Ile 145 150 155 160 Phe Ser Gly Ala Leu Phe Ile Gln Met Ala Leu Gly Trp Asn Leu Tyr 165 170 175 Leu Ser Thr Val Ile Leu Leu Val Val Thr Ala Val Tyr Thr Ile Ala 180 185 190 Gly Gly Leu Thr Ala Val Ile Tyr Thr Asp Ala Leu Gln Thr Val Ile 195 200 205 Met Val Gly Gly Ala Leu Val Leu Met Phe Leu Gly Phe Gln Glu Val 210 215 220 Gly Trp Tyr Pro Gly Leu Gln Gln Leu Tyr Arg Gln Ala Ile Pro Asn 225 230 235 240 Thr Thr Val Pro Asn Thr Thr Cys His Leu Pro Arg Pro Asp Ala Phe 245 250 255 His Met Leu Arg Asp Pro Val Asn Gly Asp Ile Pro Trp Pro Gly Leu 260 265 270 Ile Phe Gly Leu Thr Val Leu Ala Thr Trp Cys Trp Cys Thr Asp Gln 275 280 285 Val Ile Val Gln Arg Ser Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser His Ala Lys 290 295 300 Gly Gly Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Lys Ile Leu Pro Met Phe Phe 305 310 315 320 Ile Val Met Pro Gly Met Ile Ser Arg Ala Leu Tyr Pro Asp Glu Val 325 330 335 Ala Cys Val Asp Pro Asp Ile Cys Gln Arg Val Cys Gly Ala Arg Val 340 345 350 Gly Cys Ser Asn Ile Ala Tyr Pro Lys Leu Val Met Ala Leu Met Pro 355 360 365 Val Gly Leu Arg Gly Leu Met Ile Ala Val Ile Met Ala Ala Leu Met 370 375 380 Ser Ser Leu Thr Ser Ile Phe Asn Ser Ser Ser Thr Leu Phe Ala Ile 385 390 395 400 Asp Val Trp Gln Arg Phe Arg Arg Gln Ala Ser Glu Gln Glu Leu Met 405 410 415 Val Val Gly Arg Leu Phe Val Val Phe Leu Val Val Ile Ser Ile Leu 420 425 430 Trp Ile Pro Ile Ile Gln Ser Ser Asn Ser Gly Gln Leu Phe Asp Tyr 435 440 445 Ile Gln Ser Ile Thr Ser Tyr Leu Ala Pro Pro Ile Thr Ala Leu Phe 450 455 460 Leu Leu Ala Ile Phe Cys Lys Arg Val Asn Glu Pro Gly Ala Phe Trp 465 470 475 480 Gly Leu Met Phe Gly Leu Val Val Gly Ile Leu Arg Met Ile Leu Glu 485 490 495 Phe Ser Tyr Ser Ala Pro Ala Cys Gly Glu Met Asp Arg Arg Pro Ala 500 505 510 Val Leu Lys Asp Phe His Tyr Leu Tyr Phe Ala Leu Leu Leu Cys Gly 515 520 525 Leu Thr Ala Ile Ile Ile Val Val Ile Ser Phe Phe Thr Glu Pro Ile 530 535 540 Pro Asp Asp Lys Leu Ala Arg Leu Thr Trp Trp Thr Arg Asn Cys Ala 545 550 555 560 Val Ser Asp Leu Gln Lys Lys Thr Ser Val Ser Val Asn Asn Thr Glu 565 570 575 Asp Asp Asn Ser Pro Gly Leu Ala Gly Arg Pro Val Val Glu Gly Pro 580 585 590 Ala Gly Asp Glu Glu Glu Ala Asn Thr Thr Gln Gly Pro Glu Gln Pro 595 600 605 Gly Ala Leu His Arg Ser Trp Gly Lys Trp Leu Trp Asn Trp Phe Cys 610 615 620 Gly Leu Ser Gly Ala Pro Gln Gln Ala Leu Ser Pro Ala Glu Lys Ala 625 630 635 640 Val Leu Glu Gln Lys Leu Thr Ser Ile Glu Glu Glu Pro Leu Trp Arg 645 650 655 Arg Val Cys Asn Ile Asn Ala Ile Ile Leu Leu Ala Ile Asn Ile Phe 660 665 670 Leu Trp Gly Tyr Phe Ala 675 678 <210> 16 <211> 2034 <212> DNA <213> Mouse <400> 16 atggaaccag gagtgtcaag gaatggagtc agaactgaga caacaacgaa cccaagcctg 60 gggctacata cctatgacat cgtggtggtg gtcatctatt ttgtctttgt tcttgctgtg 120 ggaatttggt catccatccg tgcaagtcga gggaccgttg gtggctattt cctggctggg 180 agatccatga cctggtggcc aattggagca tctctaatgt ccagcaatgt gggcagtggc 240 ttatttatcg gcctggctgg aacaggggct gctggaggac ttgctgttgg tggctttgag 300 tggaacgcaa ccttcctgct tctagccctg ggctggatct ttgtccctgt gtacatagca 360 gctggtgtgg tcaccatgcc acagtacctg aagaaacgat ttgggggaca gaggatccag 420 gtgtacatgt cagttctttc tctcatcctc tacatcttca ccaagatatc gactgatatc 480 ttctctggag ccctcttcat ccagatggcc ttgggctgga atctctatct ctccacagtc 540 atcttgctgg tggtgacagc tgtctacacc attgcagggg gcctcacagc tgtgatctac 600 acagatgctc tacagactgt gatcatggtt gggggagctc tggtcctcat gtttctgggc 660 tttcaggagg ttggctggta cccaggcctg cagcagctct atagacaggc catccccaat 720 accacagttc ccaataccac ctgtcacctc ccacggcctg atgccttcca catgcttcga 780 gatcctgtga atggagacat cccctggcca ggtctcattt ttggcctcac agtcttggcc 840 acctggtgtt ggtgcacaga ccaggtgatt gtgcagaggt ctctcgcagc caagaatctt 900 tcacatgcca agggaggctc cgtgctaggg ggctacctaa agatcctccc aatgttcttc 960 attgtcatgc ctggcatgat cagcagggcc ctgtacccag atgaagttgc ctgtgtggac 1020 cctgacatct gtcaaagagt gtgtggggcc agagttggat gctccaatat tgcctacccc 1080 aagctggtta tggctctcat gcctgtgggg ctgcgaggcc tgatgattgc tgtgatcatg 1140 gctgccctca tgagctcact cacctctatc ttcaacagca gtagcaccct gtttgccata 1200 gatgtgtggc agcgcttccg caggcaggca tcggagcaag agctgatggt ggtaggcagg 1260 ttgttcgtag tcttcctggt agtcatcagc atcctctgga tccccatcat ccagagctcc 1320 aatagtgggc agctctttga ctacatccaa tctatcacca gctacttagc cccacccatc 1380 acagccctct tcctgctggc tatcttctgc aagagggtca acgagcctgg tgccttctgg 1440 ggcctcatgt ttggcctggt cgtcggaata ctgcgtatga ttctggagtt ctcatactcg 1500 gccccagcct gtggggagat ggacaggcgg ccagctgttc tgaaggactt ccactacctg 1560 tactttgccc ttctcctctg tggactgacc gcgatcatca ttgtcgtaat cagcttcttc 1620 acggagccca tccccgatga caagcttgct cgcctgacct ggtggacaag gaactgtgcc 1680 gtatctgacc tgcagaagaa aacctctgtg agtgtgaaca acacagagga tgacaactct 1740 ccaggactgg cagggaggcc agtggtagag ggccctgcag gagatgagga agaagcaaac 1800 accactcagg ggcctgaaca accaggagcc ctacacaggt cctggggaaa atggctgtgg 1860 aactggttct gcggactctc aggagcccca cagcaagccc tgagcccagc tgagaaggct 1920 gtgttggagc agaagctgac cagcatcgag gaggagccgc tctggagacg tgtctgcaac 1980 atcaacgcca tcatcctgct agccatcaac atctttctct ggggctattt tgcg 2034 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 atggaaccag gagtgtcaag gaa 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 ggagtcgcaa aatagcccca gag 23 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 cggaattcat ggaaccagga gtgtcaag 28 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 tctactagtt cacgcaaaat agccccaga 29 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 tgcacagacc aggtgattgt g 21 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 gcacggagcc tcccttg 17 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 ctcgcagcca acaatctttc acatg 25 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 atctctaatg tccagcaatg tg 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 accagcttgg ggtaggcaat 20 <210> 26 <211> 681 <212> PRT <213> Rat <400> 26 Met Glu Pro Gly Ala Ser Arg Asp Gly Leu Arg Ala Glu Thr Thr His 5 10 15 Gln Ala Leu Gly Ser Gly Val Ser Leu His Thr Tyr Asp Ile Val Val 20 25 30 Val Val Ile Tyr Phe Val Phe Val Leu Ala Val Gly Ile Trp Ser Ser 35 40 45 Ile Arg Ala Ser Arg Gly Thr Ile Gly Gly Tyr Phe Leu Ala Gly Arg 50 55 60 Ser Met Thr Trp Trp Pro Ile Gly Ala Ser Leu 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tctctcggcc 900 aagagtcttt cacatgccaa gggaggatca gtgttagggg gctacctaaa gatcctccca 960 atgttcttca ttgtcatgcc cggcatgatc agcagggccc tgtacccaga tgaagtcgcc 1020 tgtgtggacc ctgacatctg tcagagagtg tgtggggcca gagttggatg ctccaatatt 1080 gcctacccca aacttgttat ggctctcatg cctgtgggtc tgcgaggcct gatgattgcc 1140 gtgatcatgg ctgccctcat gagctcactc acctccatct tcaacagcag tagcaccctg 1200 tttgccatag atgtgtggca gcgagtccgc aggcaggcat cggagcaaga gctgatggtg 1260 gtaggcaggt tgtttgtagt cttcctggta ctcatcagca tcctctggat ccccatcatc 1320 cagagctcca atagtgggca gctctttgac tacatccaat ccatcaccag ctacctagcc 1380 ccgcccatca cagccctctt cctgctggcc atcttctgca agagggtcac tgagcctggt 1440 gccttctggg gcctcatgtt tggcctggta gtgggaatac tgcgtatgat tctggagttc 1500 tcatactcag ccccagcctg tggggagaag gacaggcggc cagctgttct taaggacttc 1560 cactacctgt actttgccct cctcctctgt ggacttaccg ccatcatcat tgtcataatc 1620 agcttcttca cggagcccat ccccgacgaa aagcttgctc gcctgacctg gtggacaagg 1680 agctgtccca tatctgaact acagaagaaa gtctctgtga gtgtgaacaa 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ccagagccct cactatggtg 540 tgctcagagg cctaagctca gaccactcct tccctgctcc ctgattaaca cccagagatc 600 tgccagcctc attccccact gtccctgtat ccagctcacc cccagggacc actgggcacc 660 tggtccatca cattttcctg atgtttctaa tgctgcctct cctgcatccc tgttcgtctg 720 ataaacttgc ctttaaacgt gtatatgaag gactcttcct ctggtatcta atcctaacag 780 gtgctagatc ccacagagcc ctgtccagct ggggactatg ctgacctctc tcccagatca 840 atatccctct cctcggggct cagcctggcc agtgcctgat gttctgggat aggagaactg 900 gggagagaag gcctaggacc ctgcctctca cttttctttc caccaaaagg ggaaaaaaga 960 ggatctggtc ctcacaccca gccttgggat acttataaga tgctggggat agggtgtggg 1020 acagggccag tgagagctgg ggatggggtg tgggacaggg ccagtgagat ctgttttcct 1080 gctgctccag tctgggccct acagcagatg catgcagagt aatatttgta agactgaaat 1140 attccaaatg cagctacttt ggaaggacca tgtgagcaga tatctaagtg cgtggcatct 1200 gggccccttg gctagatggt ggtcgatgtt ggtttctttg tgttaacccc aagaacattc 1260 agtagctcag ggtttgcaga ggttctcagg agcacatctt agcctcattg gtggtgtgag 1320 gcaggcaggg cacaggtcac actgatgagg acacccgggc ccagagacat ttagcaacct 1380 gcccaagggc atctgtagtt cagtgagagg tggagctggg actgaaatct aggctgcctg 1440 agtcccagag atggtcttcc ctggacccag ggagcactgt atctttttca gggaaggcct 1500 cctgaccaca accatttcat ctgtcacagt acagaatagg aagtatgggt caggcatcag 1560 aagatgtgaa ttctggctct gccttttcag agatggccct gcctagttcc ttggaataaa 1620 tgatgatgtc ttccccagcc tcagtttcct acactatata aaaagagaaa gcaacatcta 1680 ggtaggttgg aatgggagta catgaggtgg tggccacttt gctagggtca cagtagactc 1740 ctcacctcct tccccttgtc ttcctctcac taggtaaaag acaattgtat tgaactctta 1800 agaaaattgg actccagtcc cggctccacc tttacttccc tgggccttgg ttttcccacc 1860 acacaggagt ttgaacactt tgatttctga agtccttccc acctctgggg ttccaatatt 1920 ctgctccttt tctcctcttc ctcctccccc tcctttctcc tcctgctcat ctggggttag 1980 ggagattgcg tgtatgtgtg tgcctgtgtg tacacatgca tgtatgtgtg tgcacgtagt 2040 ggcagcaagg aagaggaagg aaggagtcct gcaggggttg gtggtggcag ttgggagaaa 2100 aggaggcagg actgtatgtg ccagcagggc tcagagtttt ctcaccaact aatggtgctt 2160 ggggcagttt aatcattaaa ggaaaggaat gaagccagga gcgcctcaaa gtccagcctg 2220 ctgttgacca acactaacag atgagcaagg agct 2254 <210> 56 <211> 2254 <212> DNA <213> Human <400> 56 tgggaagaca gagcatgcag gcagcagaac actgtcctag tccatcccta ctgctacagc 60 aaaacaccta agaccaggta atttataaag tacaggaatt tatttctcac aattctggag 120 gctggaagtc caagatcaaa gccccagcag gtttggtgtc tggtgagggc ccagtctatg 180 cctccaagac ggcaccttgt ggctgtgtcc tcacatggca gaaggtaaaa aggcaaaagg 240 gcctggctag ttcccttagc ccttttataa ggtactgatc ccacccatga gggagaagcc 300 ctcacgggct aatcactcct aaaggcccta cctcttagta ctgttgcatt ggggattcag 360 tttcaacatg aattttggaa gcaacacaag catccaaact atagcaaacc ccaagggctg 420 ggtgaggggg ctccttgtgg ggagcataga aagaagtaca agactcagct gtcttctccc 480 tgcacattcc ttttcccatc tctggaagag tcatccggat ccagagccct cactatggtg 540 tgctcagagg cctaagctca gaccactcct tccctgctcc ctgattaaca cccagagatc 600 tgccagcctc attccccact gtccctgtat ccagctcacc cccagggacc actgggcacc 660 tggtccatca cattttcctg atgtttctaa tgctgcctct cctgcatccc tgttcgtctg 720 ataaacttgc ctttaaacgt gtatatgaag gactcttcct ctggtatcta atcctaacag 780 gtgctagatc ccacagagcc ctgtccagct ggggactatg ctgtcctctc tcccagatca 840 atatccctct cctcggggct cagcctggcc agtgcctgat gttctgggat aggagaactg 900 gggagagaag gcctaggacc ctgcctctca cttttctttc caccaaaagg ggaaaaaaga 960 ggatctggtc ctcacaccca gccttgggat acttataaga tgctggggat agggtgtggg 1020 acagggccag tgagagctgg ggatggggtg tgggacaggg ccagtgagat ctgttttcct 1080 gctgctccag tctgggccct acagcagatg catgcagagt aatatttgta agactgaaat 1140 attccaaatg cagctacttt ggaaggacca tgtgagcaga tatctaagtg cgtggcatct 1200 gggccccttg gctagatggt ggtcgatgtt ggtttctttg tgttaacccc aagaacattc 1260 agtagctcag ggtttgcaga ggttctcagg agcacatctt agcctcattg gtggtgtgag 1320 gcaggcaggg cacaggtcac actgatgagg acacccgggc ccagagacat ttagcaacct 1380 gcccaagggc atctgtagtt cagtgagagg tggagctggg actgaaatct aggctgcctg 1440 agtcccagag atggtcttcc ctggacccag ggagcactgt atctttttca gggaaggcct 1500 cctgaccaca accatttcat ctgtcacagt acagaatagg aagtatgggt caggcatcag 1560 aagatgtgaa ttctggctct gccttttcag agatggccct gcctagttcc ttggaataaa 1620 tgatgatgtc ttccccagcc tcagtttcct acactatata aaaagagaaa gcaacatcta 1680 ggtaggttgg aatgggagta catgaggtgg tggccacttt gctagggtca cagtagactc 1740 ctcacctcct tccccttgtc ttcctctcac taggtaaaag acaattgtat tgaactctta 1800 agaaaattgg actccagtcc cggctccacc tttacttccc tgggccttgg ttttcccacc 1860 acacaggagt ttgaacactt tgatttctga agtccttccc acctctgggg ttccaatatt 1920 ctgctccttt tctcctcttc ctcctccccc tcctttctcc tcctgctcat ctggggttag 1980 ggagattgcg tgtatgtgtg tgcctgtgtg tacacatgca tgtatgtgtg tgcacgtagt 2040 ggcagcaagg aagaggaagg aaggagtcct gcaggggttg gtggtggcag ttgggagaaa 2100 aggaggcagg actgtatgtg ccagcagggc tcagagtttt ctcaccaact aatggtgctt 2160 ggggcagttt aatcattaaa ggaaaggaat gaagccagga gcgcctcaaa gtccagcctg 2220 ctgttgacca acactaacag atgagcaagg agct 2254 <210> 57 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 agaggtaccg gtcctcacac ccagccttg 29 <210> 58 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 attggtaccc agtcccggct gcaccttta 29 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 59 ggactcgagg agtctactgt gac 23 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 60 ttgtggggag catagaaaga agt 23 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 61 caaggctggg tgtgaggac 19 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 62 aggcctaagc tcagaccact cc 22 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 63 gatccatcca aggtcacacg 20 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 64 cttcccctca gcaacacgca cat 23 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 65 ggcctcccac agcacagcac t 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 66 ggctgggctt gctgagtgac a 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 67 gcagcgcagg tagaggagag g 21 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 68 gacaggctca gtggggtttc ag 22 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 69 tagcacaagc ctggggtaga g 21 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 70 cgtgggaaag gagttagggt gata 24 <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 71 tgttctttgt actctttgct tttg 24
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトSGLTホモログの疎水性プロット図を示す。
【図２】ヒトSGLTホモログの各種組織における発現分布
の解析結果を示す。MTCパネルは発現量を標準化したcDN
A（clontech 社製）を示す。
【図３】ヒトSGLTホモログ、hSGLT1およびhSGLT2のα-M
ethyl Glucoseの取り込み活性の測定結果を示す。
【図４】マウスSGLTホモログの疎水性プロット図を示
す。
【図５】マウスSGLTホモログの各種組織における発現分
布の解析結果を示す（左図は雄、右図は雌を示す）。MT
Cパネルは発現量を標準化したcDNA（clontech 社製）を
示す。
【図６】マウスSGLTホモログ、hSGLT1およびhSGLT2のα
-Methyl Glucoseの取り込み活性の測定結果を示す。
【図７】ラットSGLTホモログの疎水性プロット図を示
す。
【図８】ラットSGLTホモログの各種組織における発現分
布の解析結果を示す。MTCパネルは発現量を標準化したc
DNA（clontech 社製）を示す。
【図９】ラットSGLTホモログ、hSGLT1およびhSGLT2のα
-Methyl Glucoseの取り込み活性の測定結果を示す。
【図１０】抗ヒトSGLTホモログペプチド抗体によるウェ
スタンブロッティングの結果を示す。
【図１１】ヒトSGLTホモログ構造遺伝子に存在するSNP
を示す。
【図１２】pME18S vector 導入COS-7細胞 (KCl)の糖取
り込み量を1としたときのSNPを有するヒトSGLTホモログ
発現細胞の糖取り込み活性の値のグラフを示す。
【図１３】ヒトSGLTホモログ遺伝子上流領域に存在する
SNPを示す。
【図１４】ヒトSGLTホモログ遺伝子上流領域の欠失変異
体を示す。
【図１５】シーパンジー・ルシフェラーゼ活性を１とし
たときのヒトSGLTホモログ遺伝子上流領域におけるプロ
モーター活性の値のグラフを示す。
【図１６】健常人におけるヒトSGLTホモログのSNP発現
頻度を表すグラフを示す（平均年齢42.3歳、ｎ＝58）。
SNP-P1についてはCをmajor、Tをminorとする。SNP-P2に
ついてはAをmajor、Tをminorとする。SNP-C1については
Gをmajor、Aをminorとする。SNP-C2についてはGをmajo
r、Tをminorとする。SNP-C3についてはGをmajor、Tをmi
norとする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ｃ０７Ｋ 16/18 ４Ｃ０８４ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８６ 16/18 1/19 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 48/00 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 河村 美穂子 茨城県つくば市松代３丁目12番地１ 武田 松代レジデンス612号 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA34 AA35 DA13 DA36 FB01 FB02 FB03 FB07 FB08 FB12 GC15 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ20 QQ42 QR55 QR59 QR62 QR77 QR80 QS24 QS25 QS28 QS34 4B064 AG01 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA91X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA22 BA23 NA14 ZC33 ZC35 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 NA14 ZC33 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 EA27 EA50 FA74

Claims (70)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
    同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタ
    ンパク質またはその塩。
  2. 【請求項２】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を
    含有する請求項１記載のタンパク質またはその塩。
  3. 【請求項３】配列番号：１５または配列番号：２６で表
    わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
  4. 【請求項４】配列番号：１５または配列番号：２６で表
    わされるアミノ酸配列を含有する請求項３記載のタンパ
    ク質またはその塩。
  5. 【請求項５】請求項１記載のタンパク質の部分ペプチド
    またはその塩。
  6. 【請求項６】請求項３記載のタンパク質の部分ペプチド
    またはその塩。
  7. 【請求項７】請求項１記載のタンパク質または請求項５
    記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮ
    Ａ。
  8. 【請求項８】請求項３記載のタンパク質または請求項６
    記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮ
    Ａ。
  9. 【請求項９】配列番号：２で表わされる塩基配列を有す
    る請求項７記載のＤＮＡ。
  10. 【請求項１０】配列番号：７で表わされる塩基配列を有
    する請求項７記載のＤＮＡ。
  11. 【請求項１１】配列番号：１６または配列番号：２７で
    表わされる塩基配列を有する請求項８記載のＤＮＡ。
  12. 【請求項１２】請求項７記載のＤＮＡを含有する組換え
    ベクター。
  13. 【請求項１３】請求項８記載のＤＮＡを含有する組換え
    ベクター。
  14. 【請求項１４】請求項１２記載の組換えベクターで形質
    転換された形質転換体。
  15. 【請求項１５】請求項１３記載の組換えベクターで形質
    転換された形質転換体。
  16. 【請求項１６】請求項１４記載の形質転換体を培養し、
    請求項１記載のタンパク質または請求項５記載の部分ペ
    プチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴
    とする請求項１記載のタンパク質もしくは請求項５記載
    の部分ペプチドまたはその塩の製造法。
  17. 【請求項１７】請求項１５記載の形質転換体を培養し、
    請求項３記載のタンパク質または請求項６記載の部分ペ
    プチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴
    とする請求項３記載のタンパク質もしくは請求項６記載
    の部分ペプチドまたはその塩の製造法。
  18. 【請求項１８】請求項１記載のタンパク質もしくは請求
    項５記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医
    薬。
  19. 【請求項１９】請求項３記載のタンパク質もしくは請求
    項６記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医
    薬。
  20. 【請求項２０】請求項７記載のＤＮＡを含有してなる医
    薬。
  21. 【請求項２１】請求項８記載のＤＮＡを含有してなる医
    薬。
  22. 【請求項２２】請求項１または請求項３記載のタンパク
    質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレ
    オチドもしくは請求項５または請求項６記載の部分ペプ
    チドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌク
    レオチドを含有することを特徴とする診断剤。
  23. 【請求項２３】請求項１記載のタンパク質もしくは請求
    項５記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
  24. 【請求項２４】請求項３記載のタンパク質もしくは請求
    項６記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
  25. 【請求項２５】請求項２３または請求項２４記載の抗体
    を含有することを特徴とする診断剤。
  26. 【請求項２６】請求項１記載のタンパク質もしくは請求
    項５記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特
    徴とする、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項５
    記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻
    害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  27. 【請求項２７】請求項３記載のタンパク質もしくは請求
    項６記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特
    徴とする、請求項３記載のタンパク質もしくは請求項６
    記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻
    害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  28. 【請求項２８】請求項７または請求項８記載のＤＮＡの
    プロモーター下流にレポーター遺伝子を挿入したＤＮＡ
    を含有する組換えベクターで形質転換させた形質転換体
    を用いることを特徴とする、請求項１もしくは請求項３
    記載のタンパク質または請求項５もしくは請求項６記載
    の部分ペプチドの発現を促進または抑制する化合物また
    はその塩のスクリーニング方法。
  29. 【請求項２９】請求項１記載のタンパク質もしくは請求
    項５記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、
    請求項１記載のタンパク質もしくは請求項５記載の部分
    ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合
    物またはその塩のスクリーニング用キット。
  30. 【請求項３０】請求項３記載のタンパク質もしくは請求
    項６記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、
    請求項３記載のタンパク質もしくは請求項６記載の部分
    ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合
    物またはその塩のスクリーニング用キット。
  31. 【請求項３１】請求項２６記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項２９記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項５
    記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合
    物またはその塩。
  32. 【請求項３２】請求項２７記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項３０記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる、請求項３記載のタンパク質もしくは請求項６
    記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合
    物またはその塩。
  33. 【請求項３３】請求項２６記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項２９記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項５
    記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合
    物またはその塩。
  34. 【請求項３４】請求項２７記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項３０記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる、請求項３記載のタンパク質もしくは請求項６
    記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合
    物またはその塩。
  35. 【請求項３５】請求項２６記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項２９記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる請求項１記載のタンパク質もしくは請求項５記
    載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物
    またはその塩を含有してなる医薬。
  36. 【請求項３６】請求項２７記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項３０記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる請求項３記載のタンパク質もしくは請求項６記
    載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物
    またはその塩を含有してなる医薬。
  37. 【請求項３７】請求項２６記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項２９記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる請求項１記載のタンパク質もしくは請求項５記
    載の部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物
    またはその塩を含有してなる医薬。
  38. 【請求項３８】請求項２７記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項３０記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる請求項３記載のタンパク質もしくは請求項６記
    載の部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物
    またはその塩を含有してなる医薬。
  39. 【請求項３９】糖尿病の予防・治療剤である請求項１８
    または請求項２０記載の医薬。
  40. 【請求項４０】糖尿病の予防・治療剤である請求項１９
    または請求項２１記載の医薬。
  41. 【請求項４１】糖尿病の予防・治療剤である請求項３５
    記載の医薬。
  42. 【請求項４２】糖尿病の予防・治療剤である請求項３６
    記載の医薬。
  43. 【請求項４３】高脂血症の予防・治療剤である請求項３
    ７記載の医薬。
  44. 【請求項４４】高脂血症の予防・治療剤である請求項３
    ８記載の医薬。
  45. 【請求項４５】糖尿病・高脂血症の診断剤である請求項
    ２２または請求項２５記載の診断剤。
  46. 【請求項４６】請求項１もしくは請求項３記載のタンパ
    ク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌク
    レオチドまたは請求項５もしくは請求項６記載の部分ペ
    プチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌ
    クレオチドを用いることを特徴とする糖尿病・高脂血症
    の診断方法。
  47. 【請求項４７】請求項２３または請求項２４記載の抗体
    を用いることを特徴とする糖尿病・高脂血症の診断方
    法。
  48. 【請求項４８】哺乳動物に対して、請求項３１または請
    求項３２記載の化合物またはその塩の有効量を投与する
    ことを特徴とする糖尿病の予防・治療方法。
  49. 【請求項４９】哺乳動物に対して、請求項３３または請
    求項３４記載の化合物またはその塩の有効量を投与する
    ことを特徴とする高脂血症の予防・治療方法。
  50. 【請求項５０】糖尿病の予防・治療剤を製造するための
    請求項３１または請求項３２記載の化合物またはその塩
    の使用。
  51. 【請求項５１】高脂血症の予防・治療剤を製造するため
    の請求項３３または請求項３４記載の化合物またはその
    塩の使用。
  52. 【請求項５２】配列番号：２、配列番号：１６または配
    列番号：２７で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一
    塩基多型（ＳＮＰｓ）体。
  53. 【請求項５３】配列番号：４０、配列番号：４２または
    配列番号：４５の何れかで表される塩基配列を含有する
    請求項５２記載の一塩基多型（ＳＮＰｓ）体。
  54. 【請求項５４】請求項５２記載の一塩基多型（ＳＮＰ
    ｓ）体にコードされるアミノ酸配列を含有するタンパク
    質またはその塩。
  55. 【請求項５５】配列番号：４１、配列番号：４３または
    配列番号：４６の何れかで表されるアミノ酸配列を含有
    する請求項５４記載のタンパク質またはその塩。
  56. 【請求項５６】配列番号：５１で表される塩基配列を含
    有するＤＮＡ。
  57. 【請求項５７】配列番号：５１で表される塩基配列を含
    有するＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰｓ）体。
  58. 【請求項５８】配列番号：５４、配列番号：５５または
    配列番号：５６の何れかで表される塩基配列を含有する
    請求項５７記載の一塩基多型（ＳＮＰｓ）体。
  59. 【請求項５９】請求項５２記載の一塩基多型（ＳＮＰ
    ｓ）体を含有する組換えベクター。
  60. 【請求項６０】請求項５６記載のＤＮＡまたは請求項５
    ７記載の一塩基多型（ＳＮＰｓ）体を含有する組換えベ
    クター。
  61. 【請求項６１】請求項５９記載の組換えベクターで形質
    転換された形質転換体。
  62. 【請求項６２】請求項６０記載の組換えベクターで形質
    転換された形質転換体。
  63. 【請求項６３】請求項６１記載の形質転換体を培養し、
    請求項５４記載のタンパク質を生成、蓄積せしめ、これ
    を採取することを特徴とする請求項５４記載のタンパク
    質またはその塩の製造法。
  64. 【請求項６４】請求項５２記載の一塩基多型（ＳＮＰ
    ｓ）体を含有してなる医薬。
  65. 【請求項６５】請求項５４記載のタンパク質またはその
    塩を含有してなる医薬。
  66. 【請求項６６】糖尿病または高脂血症の予防・治療剤で
    ある請求項６４または請求項６５記載の医薬。
  67. 【請求項６７】請求項５２または請求項５７記載の一塩
    基多型（ＳＮＰｓ）体を含有してなる診断剤。
  68. 【請求項６８】さらに、配列番号：２、配列番号：１
    ６、配列番号：２７または配列番号：５１で表される塩
    基配列を含有するＤＮＡまたはその一部を含有する請求
    項６７記載の診断剤。
  69. 【請求項６９】糖尿病または高脂血症の診断剤である請
    求項６７記載の診断剤。
  70. 【請求項７０】請求項５２または請求項５７記載の一塩
    基多型（ＳＮＰｓ）体を解析することを特徴とする糖尿
    病または高脂血症の診断方法。
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