JP2001299363A - 新規タンパク質およびそのｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規タンパク質、そのＤＮＡおよびその製造法
の提供。 【解決手段】本発明のタンパク質およびそれをコードす
るＤＮＡは、例えば、骨・軟骨・関節疾患、癌（悪性腫
瘍）、前記以外の病的血管新生、臓器不全、消化管障
害、外分泌障害などの疾病の治療・予防剤として使用す
ることができる。また、本発明のタンパク質は、本発明
のタンパク質の活性を促進もしくは阻害する化合物また
はその塩のスクリーニングのための試薬として有用であ
る。さらに、本発明のタンパク質に対する抗体は、本発
明のタンパク質を特異的に認識することができるので、
被検液中の本発明のタンパク質の定量などに使用するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規な細胞制御因子
タンパク質に関する。

【０００２】

【従来技術】生体は、細胞間または組織間で、互いに情
報伝達をすることにより、発生、分化、増殖、恒常性の
維持などの統合の取れた調節を行っている。多くの場
合、タンパク性因子がそれらの仲立ちをしている。例え
ば、免疫系、造血系に関与する分泌性因子（液性因子）
が数多く見いだされていて、それらはサイトカインと呼
ばれている。リンホカイン、モノカイン、インターフェ
ロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子などがこれらに
含まれる。また、液性因子には、その前駆体タンパク質
に典型的分泌シグナル配列が存在しなくても、膜タンパ
ク質として合成された後に、プロテアーゼによる限定分
解を受けて成熟型として切り出されるものもある。その
代表的な例として、コンドロモジュリン−Ｉ（Ｃｈｏｎ
ｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ−Ｉ；以下、ＣｈＭ−Ｉと略す）
が挙げられる。ＣｈＭ−Ｉは、１９９１年に軟骨細胞の
増殖・分化をモジュレートする因子としてウシ胎仔軟骨
から精製された約２５ｋＤａの糖タンパク質である。そ
の前駆体ｃＤＮＡは３３５個のアミノ酸からなるタンパ
ク質をコードしており、そのＮ末端付近には膜貫通領域
が存在し、まずＣｈＭ−Ｉ前駆体が糖鎖の結合した膜タ
ンパク質として合成された後に、プロセシング・シグナ
ル（Arg-Glu-Arg-Arg）で切断され、Ｃ末端部にコード
される１２１個の成熟ＣｈＭ−Ｉが産生されると推定さ
れている〔Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 17
5, p.971-977(1991)〕。また、ＣｈＭ−Ｉはウシ以外の
各種哺乳動物からも相同遺伝子がクローニングされてお
り、ヒトＣｈＭ−Ｉもクローニングされている〔Eur.
J. Biochem., Vol. 260, p.869-878 (1999)〕。ＣｈＭ
−Ｉは、元々、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）
の軟骨細胞に対する相乗的なＤＮＡ合成促進活性を指標
にウシ胎仔軟骨から精製された軟骨における機能性マト
リクスタンパク質の一つであるが、後に軟骨における血
管内皮細胞の増殖と管腔形成を阻害する血管新生抑制因
子であることが明らかになった〔ザ・ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー (The Journal of Bio
logical Chemistry)２７２巻、３２４１９−３２４２６
頁 (１９９７)〕。さらに、最近になって軟骨肉腫組織
でのＣｈＭ−Ｉ ｍＲＮＡの発現レベルが正常軟骨組織
より著しく低下していることが判明し、軟骨肉腫におけ
る血管侵入抵抗性の消失に深く関与していることが示唆
された他、ヒト軟骨肉腫細胞株や大腸癌細胞株のヌード
マウスへの移植モデルで、ヒト組換えＣｈＭ−Ｉの局所
投与が腫瘍血管新生、腫瘍造成を顕著に阻害することが
わかり、ＣｈＭ−Ｉの抗腫瘍因子としての可能性も論じ
られている〔フェブス・レターズ（FEBS Letters）４５
８巻、４３６−４４０頁 (１９９９)〕。ＣｈＭ−Ｉ
は、上述のようにこれまで種間を越えてその遺伝子が発
見されてきているが、他のサイトカイン、例えば腫瘍壊
死因子（Tumor Necrosis Factor, TNF）ファミリーに見
られるような、いわゆる構造面からのファミリーを形成
するような他の遺伝子の存在は知られていなかった。し
かし、軟骨細胞特異的に発現し、その増殖・分化の制御
を司るＣｈＭ−Ｉのような局所性因子が、生体内に他に
存在する可能性は否定されている訳では決してなく、む
しろそうしたユニークな基本構造を有する未知の因子が
さらに重要な生理機能を担い、ひいては発生、分化、増
殖、恒常性の維持などの統合の取れた調節を行っている
と考えられる。また、医薬研究開発の側面からもそのよ
うな内因性因子はこれまで知られている作用機序とは異
なる全く新しい医薬そのもの、あるいはその標的因子を
提供する可能性が大きいことから、こうした範疇に含ま
れる新規細胞制御因子タンパク質が望まれていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、生物学、医
学、獣医学などに利用可能な新規タンパク質、その部分
ペプチド、またはそれらの塩、組換えベクター、形質転
換体、該タンパク質の製造法、該タンパク質または部分
ペプチドを含有する医薬、および該タンパク質などに対
する抗体を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト胎児な
どで多く発現している新規な塩基配列を有するｃＤＮＡ
を発見することに成功し、それにコードされるタンパク
質が、新しい細胞制御因子タンパク質であることを見出
し、かかるタンパク質をヒトＮＣＨＭ（New Chondromod
ulin-I）と命名した。本発明者らは、これらの知見に基
づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに
至った。すなわち、本発明は、 （１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質
またはその塩、 （２）上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドまた
はその塩、 （３）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する
上記（２）記載の部分ペプチドまたはその塩、 （４）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有する
上記（２）記載の部分ペプチドまたはその塩、 （５）上記（１）記載のタンパク質または上記（２）記
載の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮ
Ａ、 （６）配列番号：４で表される塩基配列を含有する上記
（５）記載のＤＮＡ、 （７）配列番号：５で表される塩基配列を含有する上記
（５）記載のＤＮＡ、 （８）配列番号：６で表される塩基配列を含有する上記
（５）記載のＤＮＡ、 （９）上記（１）記載のタンパク質または上記（２）記
載の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え
ベクターで形質転換された形質転換体、 （１０）上記（１）記載のタンパク質または上記（２）
記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換
えベクターで形質転換された形質転換体を培養し、該タ
ンパク質または該部分ペプチドを生成せしめることを特
徴とする、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記
（２）記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、 （１１）上記（１）記載のタンパク質もしくは上記
（２）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 （１２）上記（１）記載のタンパク質もしくは上記
（２）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを
特徴とする、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記
（２）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方
法、 （１３）上記（１）記載のタンパク質もしくは上記
（２）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してな
る、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（２）記
載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害
する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、 （１４）上記（１２）記載のスクリーニング方法または
上記（１３）記載のスクリーニング用キットを用いて得
られうる、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記
（２）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩、 （１５）上記（１２）記載のスクリーニング方法または
上記（１３）記載のスクリーニング用キットを用いて得
られうる、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記
（２）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、 （１６）上記（１１）記載の抗体を含有してなる診断
剤、 （１７）上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩ま
たは上記（２）記載の部分ペプチドもしくはその塩を含
有してなる医薬、（１８）骨・軟骨・関節疾患、癌、病
的血管新生、胎児発育不全、臓器不全、消化管障害また
は外分泌障害の治療・予防剤である上記（１７）記載の
医薬、 （１９）上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩ま
たは上記（２）記載の部分ペプチドもしくはその塩を投
与することを特徴とする骨・軟骨・関節疾患、癌、病的
血管新生、胎児発育不全、臓器不全、消化管障害または
外分泌障害の治療・予防方法、 （２０）上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩ま
たは上記（２）記載の部分ペプチドもしくはその塩を含
有してなる骨・軟骨・関節疾患、癌、病的血管新生、胎
児発育不全、臓器不全、消化管障害または外分泌障害の
治療・予防剤を製造するための上記（１）記載のタンパ
ク質もしくはその塩または上記（２）記載の部分ペプチ
ドもしくはその塩の使用などを提供する。

【０００５】さらには、本発明は、 （２１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列と約５０％以上（好ましくは約６０％以
上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約
８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好まし
くは約９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列であ
る上記（１）記載のタンパク質またはその塩、 （２２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１
〜３０個程度）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１または２個
以上（好ましくは、１〜３０個程度）のアミノ酸が付加
したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個
程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸
配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配列であ
る上記（１）記載のタンパク質またはその塩、 （２３）上記（１）記載のタンパク質または上記（２）
記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換
えベクター、 （２４）組織または臓器再生補助剤である上記（１７）
記載の医薬などを提供する。さらに本発明は、分子量マ
ーカー、組織マーカー、染色体マッピング、遺伝病の同
定、プライマー、プローブの設計などの基礎研究に利用
できるのみならず、がん転移阻害、がん転移の検出、細
胞の分化増殖の調節、サイトカインの誘導、造血調節、
血液凝固調節、感染症、代謝調節、創傷火傷治癒、抗炎
症、胎児発育不全、遺伝子治療などの分野で、各種疾病
の治療または予防目的で利用できる可能性がある。さら
には、消化管障害（例、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候
群、クローン病）、外分泌障害（例、シェーグレン症候
群、膵嚢胞繊維症）などの疾病に対する治療または予防
目的で利用できる可能性がある。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質と
称する場合もある）は、胎児を含むヒト、温血動物（例
えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサ
ギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、
肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、
骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表
皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、
筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ
細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑
膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺
細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細
胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細
胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位
（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下
部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵
臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血
管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾
丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋などに
由来するタンパク質であってもよく、組換えタンパク質
であってもよく、合成タンパク質であってもよい。 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一
のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、
さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０
％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは
約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げ
られる。

【０００７】本発明の配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク
質としては、例えば、前記の配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク
質と実質的に同質の性質を有するタンパク質などが好ま
しい。実質的に同質の性質としては、例えば、血管新生
抑制作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それら
の性質が定性的に同質であることを示す。したがって、
血管新生抑制作用などの性質が同等（例、約０．１〜１
００倍、好ましくは約０．５〜１０倍、より好ましくは
０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの性質
の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なって
いてもよい。また、本発明のタンパク質としては、例え
ば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましく
は１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）
のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましく
は、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さら
に好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したア
ミノ酸配列、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列
に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好
ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜
５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以
上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０
個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸
が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそ
れらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質
などのいわゆるムテインも含まれる。上記のようにアミ
ノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その
挿入、欠失または置換の位置としては、特に限定されな
い。本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣
例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端
（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、
本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基
（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ^-）で
あるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステ
ル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。

【０００８】ここでエステルにおけるＲとしては、例え
ば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもし
くはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、例えば、シク
ロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキ
ル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_6-12ア
リール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニ
ル−Ｃ_1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなど
のα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキル基などのＣ_7-14アラル
キル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロ
イルオキシメチル基などが用いられる。本発明のタンパ
ク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシ
レート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化
またはエステル化されているものも本発明のタンパク質
に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記
したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発
明のタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチ
オニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル
基、アセチル基などのＣ_1-6アルカノイルなどのＣ_1-6ア
シル基など）で保護されているもの、生体内で切断され
て生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸
化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例え
ば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インド
ール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、
ホルミル基、アセチル基などのＣ_1-6アルカノイル基な
どのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、ある
いは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タ
ンパク質なども含まれる。本発明のタンパク質の具体例
としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列を有するヒト由来のタンパク質などが挙げられる。

【０００９】本発明のタンパク質の部分ペプチド（以
下、本発明の部分ペプチドと称することもある）として
は、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであっ
て、好ましくは、前記した本発明のタンパク質と同様の
性質を有するものであればいずれのものでもよい。例え
ば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少な
くとも５個以上、好ましくは２０個以上、さらに好まし
くは３０個以上、より好ましくは５０個以上、最も好ま
しくは８０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなど
が用いられる。これらペプチドの中でも、例えば、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列の４９番目〜３１７
番目のアミノ酸配列（配列番号：２）と同一もしくは実
質的に同一のアミノ酸配列を有し、本発明のタンパク質
と実質的に同質の性質を有するペプチドなどが好まし
い。さらに好ましくは、配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列の２１５番目〜３１７番目のアミノ酸配列（配
列番号：３）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列を有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の性質を
有するペプチドなどがあげられる。また、例えば、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列の１番目〜２８９
番目、６２５番目〜９５１番目、１番目〜６４０番
目、１番目〜７２１番目、１番目〜７４４番目、ま
たは１番目〜７６５番目のアミノ酸配列と同一もしく
は実質的に同一のアミノ酸配列を有し、本発明のタンパ
ク質と実質的に同質の性質を有するペプチドなどもあげ
られる。ここで、「実質的に同質の性質」とは、前記と
同意義を示す。また、本発明の部分ペプチドは、そのア
ミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１
０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ
酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個
以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１
〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のア
ミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または
２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましく
は１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）
のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の
１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より
好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のア
ミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。

【００１０】また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通
常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレー
ト（−ＣＯＯ^-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮ
Ｈ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
また、本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシ
ル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カ
ルボキシル基がアミド化またはエステル化されているも
のも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエス
テルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが
用いられる。さらに、本発明の部分ペプチドには、Ｎ末
端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が
保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断さ
れ生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したも
の、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基
で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆ
る糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。本発
明の部分ペプチドは抗体作成のための抗原として用いる
ことができるので、必ずしも本発明のタンパク質が有す
る活性を有する必要はない。本発明のタンパク質または
部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸
（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）
などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される
酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無
機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との
塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン
酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン
酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。

【００１１】本発明のタンパク質、部分ペプチドまたは
それらの塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組
織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造す
ることもできるし、後述するタンパク質をコードするＤ
ＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製
造することができる。また、後述のペプチド合成法に準
じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の組織また
は細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または
細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該
抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせるこ
とにより精製単離することができる。本発明のタンパク
質、部分ペプチドまたはそれらのアミド体、またはそれ
らの塩の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を
用いることができる。そのような樹脂としては、例え
ば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズ
ヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジル
オキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒド
リルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメ
チルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルア
ミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒ
ドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−
ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキ
シ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用
い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ
酸を、目的とするタンパク質またはペプチドのアミノ酸
配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で
縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出
すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で
分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタン
パク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を
取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タ
ンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いること
ができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジ
イミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル
カルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルア
ミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これ
らによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯ
Ｂｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に
添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステ
ルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護ア
ミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することがで
きる。

【００１２】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより
十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても
十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセ
チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化
することによって、後の反応に影響を与えないようにす
ることができる。原料のアミノ基の保護基としては、例
えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イ
ソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオ
キシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオ
キシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、
ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニ
ルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。カ
ルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例え
ば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、
シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シ
クロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状
もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステ
ル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジル
エステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロ
ベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェ
ナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジ
ド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチル
ヒドラジド化などによって保護することができる。セリ
ンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化に
よって保護することができる。このエステル化に適する
基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ_1-6）
アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベン
ジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの
炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテ
ル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラ
ヒドロピラニル基、t-ブチル基などである。チロシンの
フェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚ
ｌ、Ｃｌ₂−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、
ｔ−ブチルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾー
ルの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−
２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、
ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍ
ｏｃなどが用いられる。原料のカルボキシル基の活性化
されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジ
ド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロ
フェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，
４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パ
ラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエ
ステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化さ
れたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用
いられる。

【００１３】保護基の除去（脱離）方法としては、例え
ば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下で
の水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、
メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ト
リフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処
理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミ
ン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また
液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられ
る。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜
４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例え
ば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタク
レゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，
４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなど
のようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒ
スチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４
−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去
され、トリプトファンのインドール保護基として用いら
れるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、
１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。原料の
反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、
およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性
化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しう
る。タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、例
えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシ
ル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド
（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプ
チド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタ
ンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去
したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記し
たような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細につ
いては上記と同様である。縮合により得られた保護タン
パク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を
除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この
粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、
主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミ
ド体を得ることができる。タンパク質のエステル体を得
るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボ
キシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステ
ルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望
のタンパク質のエステル体を得ることができる。

【００１４】本発明の部分ペプチドまたはその塩は、自
体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の
タンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによっ
て製造することができる。ペプチドの合成法としては、
例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良
い。すなわち、本発明の部分ペプチドを構成し得る部分
ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生
成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することによ
り目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合
方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の〜に
記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合
成、広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸
留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィ
ー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれ
に準じる方法によって適当な塩に変換することができる
し、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれ
に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換するこ
とができる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基
配列を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。また、ゲノムＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃ
ＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに
使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミ
ド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよ
い。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたは
ｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Tran
scriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-Ｐ
ＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。

【００１５】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列を
含有するＤＮＡ、または配列番号：４で表わされる塩基
配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する塩基配列を有し、本発明のタンパク質と実質的に同
質の性質（例、血管新生抑制作用など）を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：４で表わされる塩基配列とハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、
例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列と約６０％
以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８
０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡな
どが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知
の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラ
ー・クローニング（Molecular Cloning）２ｎｄ（J. Sa
mbrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 198
9）に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好
ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なう
ことができる。ハイストリンジェントな条件とは、例え
ば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約
１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは
約６０〜６５℃の条件を示す。より具体的には、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質を
コードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる
塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。本発明の部
分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発
明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するもの
であればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤ
ＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ
のいずれでもよい。

【００１６】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：５で表わされる塩基配
列を有するＤＮＡ、または配列番号：５で表わされる塩
基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする塩基配列を有し、本発明のタンパク質と実質的に
同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部
分塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：６で表わされ
る塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：６で表わ
される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタンパク質と
実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。 配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列
とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示
す。ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリン
ジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。具体
的には、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有す
る部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番
号：５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが、配
列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプ
チドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わ
される塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。本発
明のタンパク質または部分ペプチド（以下、これらをコ
ードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明におい
ては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合
がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手
段としては、本発明のタンパク質の部分塩基配列を有す
る合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅
するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本
発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤ
ＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとの
ハイブリダイゼーションによって選別することができ
る。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning）2nd（J. S
ambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 198
9）に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡ
の塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、
Ｍｕｔａｎ^TM−Ｍｕｔａｎ^TM−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓ（宝酒造（株））、Ｍｕｔａｎ^TM−Ｋ（宝酒造
（株））などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａ
ｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの自体
公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なう
ことができる。

【００１７】クローン化されたタンパク質をコードする
ＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵
素で消化したり、リンカーを付加したりして使用するこ
とができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コド
ンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止
コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有してい
てもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドン
は、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加すること
もできる。本発明のタンパク質の発現ベクターは、例え
ば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから
目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片
を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結す
ることにより製造することができる。ベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢ
Ｒ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプ
ラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９
４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１
５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウ
イルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの
動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲ
ｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏな
どが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとし
ては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロ
モーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物
細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、
ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、
ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが
挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイ
ルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いる
のが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、
ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプ
ロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモータ
ー、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌であ
る場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモータ
ー、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。

【００１８】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏ^rと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイ
ニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含
まない培地によっても選択できる。また、必要に応じ
て、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質
のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である
場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル
配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−ア
ミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列
などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配
列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞であ
る場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インタ
ーフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列な
どがそれぞれ利用できる。このようにして構築された本
発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクタ
ーを用いて、形質転換体を製造することができる。宿主
としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、
酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エ
シェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕，
ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nu
cleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，
ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Journal of MolecularBiology）〕，１２０
巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１
９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetic
s），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス
（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，
２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），
９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。酵母とし
ては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８
７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカ
ロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）Ｎ
ＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリ
ス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。

【００１９】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌ
ｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏ
ｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細
胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞
またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞など
が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来
株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用
いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞
（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Vaughn, J.L.
ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)〕な
どが用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫
などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３
１５巻，５９２(１９８５)〕。動物細胞としては、例え
ば、サル細胞ＣＯＳ−７（ＣＯＳ７）、Ｖｅｒｏ、チャ
イニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略
記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞
ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞と略記）、マ
ウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細
胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。エ
シェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシー
ジングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)や
ジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載
の方法に従って行なうことができる。バチルス属菌を形
質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェ
ネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Gen
etics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方
法に従って行なうことができる。酵母を形質転換するに
は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth
ods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１
９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエ
スエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９
２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうこと
ができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例
えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47
-55(1988)）などに記載の方法に従って行なうことがで
きる。

【００２０】動物細胞を形質転換するには、例えば、細
胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−
２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Vi
rology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従
って行なうことができる。このようにして、タンパク質
をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換
された形質転換体を得ることができる。宿主がエシェリ
ヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する
際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であ
り、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒
素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源として
は、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、
ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カ
ゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無
機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カル
シウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムな
どが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長
促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８
が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５
(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地
〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８
１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐ
Ｈは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２
０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて
通気や撹拌を加える。

【００２１】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Journal of the American Medica
l Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９
９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜ま
たは細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることが
できる。上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製
するには、例えば、下記の方法により行なうことができ
る。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽
出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは
細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リ
ゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体ある
いは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパ
ク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝
液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤
や、トリトンＸ−１００^TMなどの界面活性剤が含まれて
いてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合に
は、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細
胞と上清とを分離し、上清を集める。

【００２２】このようにして得られた培養上清、あるい
は抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の
分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができ
る。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒
沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過
法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方
法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利
用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられ
る。かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場
合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によ
って塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合に
は自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊
離体または他の塩に変換することができる。なお、組換
え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適
当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に
修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去すること
もできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプ
シン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダー
ゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いら
れる。かくして生成する本発明のタンパク質またはその
塩の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセ
イやWestern blottingなどにより測定することができ
る。本発明のタンパク質、部分ペプチドまたはその塩に
対する抗体は、本発明のタンパク質、部分ペプチドまた
はその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明
のタンパク質、部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体
の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と
略記する）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原
として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従
って製造することができる。

【００２３】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免
疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種ま
たは異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することが
できる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標
識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結
合した標識剤の活性を測定することにより行なうことが
できる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミ
ルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1
975)〕に従い実施することができる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが
用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、
ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）
が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベート
することにより効率よく細胞融合を実施できる。モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を
直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する
方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着
させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性
物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げら
れる。

【００２４】モノクローナル抗体の選別は、自体公知あ
るいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。
通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。
選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育
できるものならばどのような培地を用いても良い。例え
ば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清
を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血
清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハ
イブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水
製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、
通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時
間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間で
ある。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。 （ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。

【００２５】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗
原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー
タンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル
抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫
動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取
して、抗体の分離精製を行なうことにより製造すること
ができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗
原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリア
ータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混
合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対
して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な
比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミ
ンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比で
ハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜
５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプ
テンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用
いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイ
ミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビ
リジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部
位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与され
る。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイ
ントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投
与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、
計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体
は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水な
ど、好ましくは血液から採取することができる。

【００２６】抗血清中のポリクローナル抗体価の測定
は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定で
きる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノク
ローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離
精製法に従って行なうことができる。本発明のタンパク
質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、アン
チセンスＤＮＡの説明においては、これらのＤＮＡを本
発明のＤＮＡと略記する）に相補的な、または実質的に
相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとして
は、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的
な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を
有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであ
ってもよい。本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配
列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列
（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あ
るいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０
％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは
約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられ
る。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、
本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩
基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相
補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好
ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の
相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これ
らのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置など
を用いて製造することができる。以下に、本発明のタン
パク質、部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタ
ンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質
または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明
のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク
質、部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本
発明の抗体と略記する場合がある）、およびアンチセン
スＤＮＡの用途を説明する。

【００２７】（１）本発明のタンパク質は、組織特異的
に発現しているため、組織マーカーとして使用すること
ができる。すなわち組織の分化、病態、癌の転移などの
検出のためのマーカーとして有用である。また、対応す
るレセプター、結合タンパク質などの分取にも利用でき
る。さらに、自体公知のハイスループットスクリーニン
グのためのパネルにして、生物活性を調べるのに利用で
きる。また、染色体マッピングを行い、遺伝病の研究に
も利用できる。 （２）本発明のタンパク質が関与する各種疾病の治療・
予防剤 本発明のタンパク質などは、生体内で細胞制御因子とし
て存在するため、本発明のタンパク質などまたは本発明
のＤＮＡなどに異常があったり、欠損している場合ある
いは発現量が異常に減少または高進している場合、例え
ば、骨・軟骨・関節疾患、癌（悪性腫瘍）、前記以外の
病的血管新生、胎児発育不全、臓器不全、消化管障害
（例、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、クローン病）、
外分泌障害（例、シェーグレン症候群、膵嚢胞繊維症）
などの種々の疾病が発症する。したがって、本発明のタ
ンパク質および本発明のＤＮＡは、例えば、骨・軟骨・
関節疾患、癌（悪性腫瘍）、前記以外の病的血管新生、
胎児発育不全、臓器不全、消化管障害（例、潰瘍性大腸
炎、過敏性腸症候群、クローン病）、外分泌障害（例、
シェーグレン症候群、膵嚢胞繊維症）などの種々の疾病
の治療・予防剤などの医薬として使用することができ
る。例えば、生体内において本発明のタンパク質などが
減少あるいは欠損しているために、細胞における情報伝
達が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場
合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内
で本発明のタンパク質を発現させることによって、
（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパ
ク質を発現させた後に、該細胞を患者に移植することに
よって、または（ハ）本発明のタンパク質を該患者に投
与することなどによって、該患者における本発明のタン
パク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させること
ができる。

【００２８】本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤とし
て使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイル
スアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベク
ターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血
動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、その
ままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学
的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイ
ドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与で
きる。本発明のタンパク質を上記の治療・予防剤として
使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％
以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９
９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。さ
らに本発明のタンパク等は、再生医学の領域で、各種細
胞の分化、臓器再生のための補助剤・保護剤として使用
することができる。本発明のタンパク質は、例えば、必
要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、本発明のタンパク質を生理学的に認
められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安
定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に
要求される単位用量形態で混和することによって製造す
ることができる。これら製剤における有効成分量は指示
された範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。

【００２９】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、
ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例
えば、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０など）など
と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、
大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベン
ジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。ま
た、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム
緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、
通常、適当なアンプルに充填される。本発明のＤＮＡが
挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、
非経口的に使用される。このようにして得られる製剤
は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血
動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、
トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、
チンパンジーなど）に対して投与することができる。本
発明のタンパク質の投与量は、対象疾患、投与対象、投
与ルートなどにより差異はあるが、例えば、悪性腫瘍の
治療目的で本発明のタンパク質を経口投与する場合、一
般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき
該タンパク質を約１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約
１０〜５００ｍｇ、より好ましくは約１０〜２００ｍｇ
投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質の
１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なる
が、例えば、悪性腫瘍の治療目的で本発明のタンパク質
を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する
場合、一日につき該タンパク質を約１〜１０００ｍｇ程
度、好ましくは約１〜２００ｍｇ程度、より好ましくは
約１０〜１００ｍｇ程度を患部に注射することにより投
与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ
当たりに換算した量を投与することができる。

【００３０】（３）疾病に対する医薬候補化合物のスク
リーニング 本発明のタンパク質は生体内（特にヒト胎児骨格筋、腸
管など）で細胞制御因子として存在するため、本発明の
タンパク質の機能を促進する化合物またはその塩は、例
えば、骨・軟骨・関節疾患、癌（悪性腫瘍）、前記以外
の病的血管新生、胎児発育不全、臓器不全、消化管障害
などの治療・予防剤などの医薬として使用できる。一
方、本発明のタンパク質の機能を阻害する化合物または
その塩は、本発明のタンパク質の産生過剰に起因する疾
患の治療・予防剤などの医薬として使用できる。したが
って、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の機
能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー
ニングのための試薬として有用である。すなわち、本発
明は、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそ
の塩を用いることを特徴とする本発明のタンパク質、そ
の部分ペプチドまたはその塩の機能を促進する化合物も
しくはその塩（以下、促進剤と略記する場合がある）、
または本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそ
の塩の機能を阻害する化合物（以下、阻害剤と略記する
場合がある）のスクリーニング方法を提供する。本発明
のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質、部
分ペプチドまたはその塩を含有するものである。本発明
のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを
用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチ
ド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵
生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血
漿などから選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質
の機能を促進または阻害する化合物である。該化合物の
塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様の
ものが用いられる。本発明のスクリーニング方法または
スクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述
の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って
実施することができる。例えば、前記した本発明のタン
パク質を含有する医薬と同様にして、例えば、必要に応
じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マ
イクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もし
くはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、
または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用でき
る。このようにして得られる製剤は安全で低毒性である
ので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、
ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネ
コ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与する
ことができる。

【００３１】該化合物またはその塩の投与量は、その作
用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異は
あるが、例えば、悪性腫瘍治療の目的で本発明のタンパ
ク質の機能を促進する化合物を経口投与する場合、一般
的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につ
き該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．
０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与
する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与
量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例え
ば、悪性腫瘍治療の目的で本発明のタンパク質の機能を
促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとし
て）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１
〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、
より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射によ
り投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０
ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。一
方、本発明のタンパク質の機能を阻害する化合物を経口
投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）に
おいては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍ
ｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約
１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合
は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などに
よっても異なるが、本発明のタンパク質の機能を阻害す
る化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に
投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０
ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好
ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与
するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当
たりに換算した量を投与することができる。

【００３２】（３）本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはその塩の定量 本発明のタンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体
と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質を特異
的に認識することができるので、被検液中の本発明のタ
ンパク質定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量
などに使用することができる。すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発
明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合し
た標識化された本発明のタンパク質の割合を測定するこ
とを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量
法、および（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の
抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時ある
いは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の
活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタ
ンパク質の定量法を提供する。また、本発明のタンパク
質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノク
ローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタ
ンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出
を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そ
のものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')
₂ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本
発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、
特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量
（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしく
は抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段によ
り検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作
製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの
測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合
法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に
用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイ
ッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を用いる測
定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位
元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放
射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、
〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが用いられる。上記
酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、
例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ
酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例
えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシア
ネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、
ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲ
ニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標
識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもで
きる。抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着
を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を
不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方
法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラ
ン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポ
リアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガ
ラス等が挙げられる。

【００３３】サンドイッチ法においては不溶化した本発
明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反
応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗
体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識
剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタン
パク質量を定量することができる。１次反応と２次反応
は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし
時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化
の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サ
ンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あ
るいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類で
ある必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種
類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明のサンド
イッチ法による本発明のタンパク質の測定法において
は、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクロ
ーナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相
異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応
および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応
で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認
識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくは
Ｃ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられ
る。本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外
の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法
あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競
合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して
競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、
抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分
離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗
原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体
を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗
体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１
抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体
は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用い
る固相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、
被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に
対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、ある
いは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応さ
せ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に
結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれ
かの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。

【００３４】また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。こ
れら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用す
るにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とさ
れない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に
当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質
の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段
の詳細については、総説、成書などを参照することがで
きる。例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕
（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイ
ムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治
ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医
学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Me
thods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochemical Techniq
ues(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniq
ues(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniq
ues(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniq
ues(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92
(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antib
odies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vo
l. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma
Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカ
デミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによっ
て、本発明のタンパク質を感度良く定量することができ
る。さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク
質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質
の濃度の減少が検出された場合、例えば、骨・軟骨・関
節疾患、癌（悪性腫瘍）、前記以外の病的血管新生、臓
器不全、消化管障害、外分泌障害などの疾病である、ま
たは将来罹患する可能性が高いと診断することができ
る。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中
に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用す
ることができる。また、本発明のタンパク質を精製する
ために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の
本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明
のタンパク質の挙動の分析などのために使用することが
できる。

【００３５】（５）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードす
るＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出す
ることができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡ
の損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたは
ｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤と
して有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子
診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼー
ションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomic
s），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロ
シージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceeding
s ofthe National Academy of Sciences of the United
States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０
頁（１９８９年））、ＤＮＡマイクロアレイなどにより
実施することができる。例えば、ノーザンハイブリダイ
ゼーション、 ＤＮＡマイクロアレイなどにより発現低
下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、 ＤＮＡマ
イクロアレイなどによりＤＮＡの突然変異が検出された
場合は、例えば、骨・軟骨・関節疾患、癌（悪性腫
瘍）、前記以外の病的血管新生、胎児発育不全、臓器不
全、消化管障害、外分泌障害などの疾病である可能性が
高いと診断することができる。

【００３６】（６）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬 本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内にお
ける本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能を
抑制することができるので、例えば、本発明のタンパク
質などの発現過多に起因する疾患の治療・予防剤として
安全に使用することができる。上記アンチセンスＤＮＡ
を上記の治療・予防剤として使用する場合、前記した本
発明のＤＮＡを含有する各種疾病の治療・予防剤と同様
にして実施することができる。例えば、該アンチセンス
ＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独ある
いはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ
ー、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター
などの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従っ
て、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口
的または非経口的に投与することができる。該アンチセ
ンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために
補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化
し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテー
テルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して
吸入剤として気管内に投与することもできる。該アンチ
センスＤＮＡの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ル
ートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のアンチ
センスＤＮＡを吸入剤として気管内に局所投与する場
合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日に
つき該アンチセンスＤＮＡを約０．１〜１００ｍｇ投与
する。さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞に
おける本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるた
めの診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用する
こともできる。

【００３７】（７）本発明の抗体を含有する医薬 本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発
明の抗体は、例えば、本発明のタンパク質などの発現過
多に起因する疾患の治療・予防剤などの医薬として使用
することができる。本発明の抗体を含有する上記疾患の
治療・予防剤は、安全で低毒性のため、そのまま液剤と
して、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまた
は哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経
口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対
象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例
えば、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２
０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／
ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ
体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３
回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他
の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を
投与することができる。症状が特に重い場合には、その
症状に応じて増量してもよい。本発明の抗体は、それ自
体または適当な医薬組成物として投与することができ
る。上記投与に用いられる医薬組成物は、本発明の抗体
と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤
とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経
口投与に適する剤形として提供される。すなわち、例え
ば、経口投与のための組成物としては、固体または液体
の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティン
グ錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフ
トカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤など
があげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって
製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈
剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤
用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ス
テアリン酸マグネシウムなどが用いられる。

【００３８】非経口投与のための組成物としては、例え
ば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射
剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤
などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方
法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射
剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁
または乳化することによって調製する。注射用の水性液
としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補
助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、
例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコー
ル（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、
ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of
hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通
常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられ
る坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に
混合することによって調製される。上記の経口用または
非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するよ
うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。
かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル
剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞ
れの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ
注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２
５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ま
しくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有し
てもよい。

【００３９】（８）ＤＮＡ転移動物 本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）または
その変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する
場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。すな
わち、本発明は、（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはそ
の変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（２）非ヒト哺
乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、（３）ゲ
ッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動
物、および（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異
ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベ
クターを提供するものである。本発明の外来性ＤＮＡま
たはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本
発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精
卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対し
て、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生
の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の
段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム
法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイ
クロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移
することによって作出することができる。また、該ＤＮ
Ａ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞など
に目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培
養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これ
ら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により
融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出す
ることもできる。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウ
シ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモ
ット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。
なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生お
よび生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲ
ッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５
７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ
６Ｃ３Ｆ₁系統，ＢＤＦ₁系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ₁系統，ＢＡ
ＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例え
ば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。

【００４０】哺乳動物において発現しうる組換えベクタ
ーにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動
物の他にヒトなどが挙げられる。本発明の外来性ＤＮＡ
とは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡ
ではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発
明のＤＮＡをいう。本発明の変異ＤＮＡとしては、元の
本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異な
ど）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他
の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、ま
た、異常ＤＮＡも含まれる。該異常ＤＮＡとしては、異
常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、
例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタ
ンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。本発明
の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種
のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明
のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮ
Ａを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合
したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利
である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場
合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺
乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハ
ムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現さ
せうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡ
を結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）
を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイ
クロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡ
を高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができ
る。本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸
菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由
来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファー
ジ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワ
クシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウ
イルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラ
スミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラ
スミドなどが好ましく用いられる。

【００４１】上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモータ
ーとしては、例えば、ウイルス（例、シミアンウイル
ス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、
ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に
由来するＤＮＡのプロモーター、各種哺乳動物（ヒ
ト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラ
ット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アル
ブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスタ
ーゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチン
キナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質ク、グルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケ
ラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およ
びＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼ
βＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アル
カリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内
皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略さ
れる）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素
（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽
鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティ
ナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−
２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵
素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド
鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよび
βミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基
礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロ
ブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコン
ポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αア
クチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなど
のプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高
発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモータ
ー、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）の
プロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモー
ターなどが好適である。上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺
乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写
を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有
していることが好ましく、例えば、ウィルス由来および
各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることがで
き、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネ
ターなどが用いられる。その他、目的とする外来性ＤＮ
Ａをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシン
グシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロ
ンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモー
ター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に
連結することも目的により可能である。該翻訳領域は転
移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとし
て、前記のプロモーターの下流および所望により転写終
結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法によ
り作製することができる。

【００４２】受精卵細胞段階における本発明の外来性Ｄ
ＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の
すべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作
出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存
在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞
および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持す
ることを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだ
この種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべ
てに本発明の外来性ＤＮＡを有する。本発明の外来性正
常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外
来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ
保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出
来る。受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの
転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに
過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出
動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に
存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞お
よび体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有す
ることを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだ
この種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全て
に本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。導入ＤＮＡを
相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、
この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該
ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができ
る。本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本
発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正
常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明の
タンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病
態モデル動物として利用することができる。例えば、本
発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク
質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患
の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討
を行なうことが可能である。

【００４３】また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移さ
せた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症
状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾
患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能で
ある。一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト
哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持する
ことを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境
で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来
ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用い
ることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク
卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することが
できる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの
転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに
存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の
胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在すること
は、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の
全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本
発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫
は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常Ｄ
ＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホ
モザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配する
ことによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖
継代することができる。本発明の異常ＤＮＡを有する非
ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられ
ており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することによ
り最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症と
なることがあり、その病態モデル動物として利用するこ
とができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用
いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態
機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうこ
とが可能である。

【００４４】また、具体的な利用可能性としては、本発
明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機
能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質によ
る正常タンパク質の機能阻害（dominant negative作
用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外来異常
ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタン
パク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク
質の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング
試験にも利用可能である。また、上記２種類の本発明の
ＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲ
ＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現された
タンパク質組織を分析することによる、本発明のタンパ
ク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質
との関連性についての解析、 ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織から
の細胞の機能の研究、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作
製などが考えられる。さらに、本発明のＤＮＡ転移動物
を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症な
どを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症
状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関
連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的
所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾
患による二次的疾患の研究および治療に貢献することが
できる。また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取
り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素
により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養また
はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さ
らに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトー
シス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにお
けるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べるこ
となどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明
のための有効な研究材料となる。

【００４５】さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用い
て、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、
本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行
なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、
有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供す
ることが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物ま
たは本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発
明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、
開発することが可能である。 （９）ノックアウト動物 本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、（１）本発明の
ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不
活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、（３）ネオマ
イシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、（４）非
ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹
細胞、（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載
の胚幹細胞、（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（７）該ＤＮＡがレポ
ーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポー
ター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制
御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記
載の非ヒト哺乳動物、（９）ゲッ歯動物がマウスである
第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および（１０）第
（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポータ
ー遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤ
ＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化
合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本
発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞
とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為
的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制す
るか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタン
パク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡ
が実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以
下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）
非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記す
る）をいう。

【００４６】非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のも
のが用いられる。本発明のＤＮＡに人為的に変異を加え
る方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該Ｄ
ＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または
置換させることによって行なうことができる。これらの
変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらした
り、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊するこ
とにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよ
い。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚
幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または
本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例と
しては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本
発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシ
ン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とす
る薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター
遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊す
るか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の
転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグ
ナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合
成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊す
るように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、
ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同
組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ
細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮ
Ａ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション
解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列
とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤ
ＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰ
ＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を
選別することにより得ることができる。また、相同組換
え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細
胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたもの
を用いてもよく、また公知のＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａ
の方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、
マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系の
ＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきり
していないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的
背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例え
ば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の
少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ₁マ
ウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ₁）を用いて
樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ₁マウス
は、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に
加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これ
を用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出し
たとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすること
でその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えること
が可能である点で有利に用い得る。

【００４７】また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には
受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８
細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより
効率よく多数の初期胚を取得することができる。また、
雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ
細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。
また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ
早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。ＥＳ細胞の雌
雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色
体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、そ
の１例として挙げることができる。この方法を使用すれ
ば、従来、核型分析をするのに約１０⁶個の細胞数を要
していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約
５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一
次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ
り、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初
期の手間は大幅に削減できる。また、第二次セレクショ
ンとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体
数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞
の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際
の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝
子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスで
は染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニン
グすることが望ましい。このようにして得られた胚幹細
胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる
能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必
要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフ
ィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下
に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５
％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で
約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、
例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−
０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好まし
くは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理によ
り単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種
する方法などがとられる。このような継代は、通常１−
３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的
に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄
することが望まれる。

【００４８】ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に
至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するま
で浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋など
の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり
〔M. J. Evans および M. H. Kaufman, ネイチャー（Na
ture）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman
ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エ
クスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、19
85年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明
のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明の
タンパク質の細胞生物学的検討において有用である。本
発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲ
ＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量
を比較することにより、正常動物と区別することが可能
である。該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のもの
が用いられる。本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティン
グベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入
し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤ
ＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えに
より、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の
本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることに
より、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができ
る。本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発
明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブと
したサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッ
ティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティング
ベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の
近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法に
よる解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明
のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変
異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成さ
れるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部
が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキ
メラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体
群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤ
ＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コート
カラーの判定等により選別することにより得られる。こ
のようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク
質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質の
ヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本
発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができ
る。卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマ
イクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入すること
によりターゲッティングベクターを染色体内に導入した
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、
これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、
遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のある
ものを選択することにより得られる。

【００４９】このようにして本発明のＤＮＡがノックア
ウトされている個体は、交配により得られた動物個体も
該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常
の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。さらに、
生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよ
い。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を
交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両
方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホ
モザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，
ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することに
より効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物
の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有する
ホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代
する。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物
胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を
作出する上で、非常に有用である。また、本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質によ
り誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明
のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病の
モデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治
療法の検討に有用である。

【００５０】（９ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷など
に起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物
のスクリーニング方法 本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤ
ＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病（例、骨・軟骨・
関節疾患、癌（悪性腫瘍）、前記以外の病的血管新生、
胎児発育不全、臓器不全、消化管障害、外分泌障害な
ど）に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリー
ニングに用いることができる。すなわち、本発明は、本
発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投
与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とす
る、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に
対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法に
おいて用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動
物としては、前記と同様のものが挙げられる。試験化合
物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド
性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物
抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら
化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物
であってもよい。具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全
非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照
動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状など
の変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験
することができる。試験動物を試験化合物で処理する方
法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いら
れ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて
適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量
は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選
択することができる。本発明のスクリーニング方法を用
いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれ
た化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷など
によって引き起こされる疾患（例、骨・軟骨・関節疾
患、癌（悪性腫瘍）、病的血管新生、臓器不全、消化管
障害、外分泌障害など）に対して治療・予防効果を有す
るので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤な
どの医薬として使用することができる。さらに、上記ス
クリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も
同様に用いることができる。

【００５１】該スクリーニング方法で得られた化合物は
塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理
学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例
アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学
的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩として
は、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素
酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタン
スルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いら
れる。該スクリーニング方法で得られた化合物またはそ
の塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を
含有する医薬と同様にして製造することができる。この
ようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、
例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができ
る。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与
対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、悪
性腫瘍の治療目的で該化合物を経口投与する場合、一般
的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につ
き該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．
０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与
する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与
量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例え
ば、悪性腫瘍の治療目的で該化合物を注射剤の形で通常
成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該
化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．
１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ
程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の
動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与する
ことができる。 （９ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を
促進または阻害する化合物をスクリーニング方法 本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、
試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出す
ることを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ーの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。

【００５２】上記スクリーニング方法において、本発明
のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本
発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明
のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活
性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対す
るプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられ
る。試験化合物としては、前記と同様のものが挙げられ
る。レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用
いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可
溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラ
ーゼ遺伝子などが好適である。本発明のＤＮＡをレポー
ター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト
哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対
するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター
遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることによ
り、プロモーターの活性を検出することができる。例え
ば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部
を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃ
Ｚ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の
発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガ
ラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノ
シド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基
質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発
明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察す
ることができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損
マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで
固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ
−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約
３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ
ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガ
ラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよ
い。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡ
を検出してもよい。上記スクリーニング方法を用いて得
られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から
選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモ
ーター活性を促進または阻害する化合物である。該スク
リーニング方法で得られた化合物は塩を形成していても
よく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸
（例、無機酸）や塩基（例、有機酸）などとの塩が用い
られ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明のＤＮＡに対する
プロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本
発明のタンパク質の発現を促進し、該タンパク質の機能
を促進することができるので、例えば、骨・軟骨・関節
疾患、癌（悪性腫瘍）、前記以外の病的血管新生、臓器
不全、消化管障害、外分泌障害などの疾病に対する安全
で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導
される化合物も同様に用いることができる。

【００５３】該スクリーニング方法で得られた化合物ま
たはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパ
ク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造する
ことができる。このようにして得られる製剤は、安全で
低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例え
ば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与
することができる。該化合物またはその塩の投与量は、
対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はある
が、例えば、悪性腫瘍の治療目的で本発明のＤＮＡに対
するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する
場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）において
は、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ま
しくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜
２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合
物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異
なるが、例えば、悪性腫瘍の治療目的で本発明のＤＮＡ
に対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の
形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日
につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましく
は約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜
１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。一方、例えば、本発明のＤＮＡ
に対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与
する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）におい
ては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好
ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０
〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化
合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても
異なるが、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を
阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとし
て）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１
〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、
より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射によ
り投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０
ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。この
ように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本
発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または
阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で
極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する
各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく
貢献することができる。

【００５４】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸

【００５５】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ₂−Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【００５６】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕本発明のタンパク質（ヒトＮＣＨＭ）
のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の４９番目〜３
１７番目のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３〕 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の２１５番目〜
３１７番目のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４〕 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有する本発明
のタンパク質（ヒトＮＣＨＭ）をコードするＤＮＡの塩
基配列を示す。 〔配列番号：５〕 配列番号：２で表わされるアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：６〕 配列番号：３で表わされるアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：７〕後述の実施例１で使用したオリゴＤＮ
Ａの塩基配列を示す。 〔配列番号：８〕後述の実施例１で使用したオリゴＤＮ
Ａの塩基配列を示す。

【００５７】後述の実施例１で得られた形質転換体Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ｐＴＢＮ３
は、２０００年１月１８日から日本国大阪府大阪市淀川
区十三本町２−１７−８５の発酵研究所（ＩＦＯ）に寄
託番号 ＩＦＯ １６３５４として、２０００年２月２日
から日本国茨城県つくば市東１−１−３の通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番
号 ＦＥＲＭ ＢＰ−７０１７としてそれぞれ寄託され
ている。

【００５８】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular cloning）に記載され
ている方法に従った。 実施例１ ヒトＮＣＨＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ のクロ
ーニング 本発明のヒトＮＣＨＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ
を、以下のようなＰＣＲ法により取得した。 配列番号：７で表されるオリゴＤＮＡ（ＴＣＡＧＣＡＧ
ＴＧＧＴＣＴＣＴＣＡＧＴＣＣＴＣＴＣＡ）をセンス鎖
プライマーとして、配列番号：８で表されるオリゴＤＮ
Ａ（ＡＣＡＡＧＴＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＣ
ＴＡＣＣＡ）をアンチセンス鎖プライマーとして各々５
０pmol、Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ^TM（ＥｘＴａｑ^TM Ｖｅ
ｒｓｉｏｎ）（宝酒造（株）） ２５μｌ、鋳型ＤＮＡ
としてヒト胎児骨格筋ｃＤＮＡ溶液（クロンテック
（株））０．５μｌを含む混合液５０μｌを調製し、サ
ーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ^R ＰＣＲ ｓｙｓｔ
ｅｍｍｏｄｅｌ ９７００（パーキンエルマー社））を
用いて、最初に９４℃で1分間置いた後、９４℃で２０
秒、５０℃で３０秒、７２℃で３分を１サイクルとして
３５サイクル繰り返し、さらに７２℃で５分間伸長反応
させるプログラムでＰＣＲ反応を行った。反応終了液を
１％アガロースゲルを用いて電気泳動後エチジウムブロ
マイド染色したところ、分子量マーカー換算で１．２ｋ
ｂ付近の位置にＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡに対応す
るバンドを確認した。キアクィックゲルエキストラクシ
ョンキット（キアゲン社）を用いて該ＤＮＡ断片を回収
し、塩基配列を決定する為にｐＣＲ^R２．１−ＴＯＰＯ
（インビトロジェン社）を用いてＴＡクローニングし、
該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセルに
導入した。アンピシリン含有LB寒天培地上で出現するア
ンピシリン耐性形質転換株のコロニーの中から外来ＤＮ
Ａ断片が挿入がされていたプラスミドを保持していたク
ローンを選択し、該プラスミドＤＮＡ、ｐＴＢＮ３を調
製した。挿入ＤＮＡの塩基配列を決定するため、ｐＴＢ
Ｎ３を鋳型ＤＮＡとし、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^RＢｉｇＤｙ
ｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ ＦＳＲｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パ
ーキンエルマー社）を用いたシーケンス反応を添付資料
の条件にしたがって、サーマルサイクラー〔ＧｅｎｅＡ
ｍｐ^RＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｍｏｄｅｌ ９７００（パー
キンエルマー社）〕で行った後、該反応試料をＤＮＡシ
ーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^R ３７７（パーキンエル
マー社）で分析した。その結果、ｐＴＢＮ３のクローニ
ング部位には、 公知のタンパク質とは全く相同性がな
い配列番号：１で表される３１７個のアミノ酸からなる
新規タンパク質ＮＣＨＭをコードする配列番号：４で表
される９５１塩基の塩基配列からなるオープンリーディ
ングフレーム（Open reading frame）を含む図１の配列
を有するＤＮＡ断片が挿入されていた（図１では、ベク
ターＤＮＡのＥｃｏＲＩ認識部位より挿入配列側を示
す）。コードされるＮＣＨＭタンパク質には、２８番目
セリン（Ser）から４９番目グリシン（Gly）のアミノ酸
残基にかけて細胞膜局在タンパク質が有する膜貫通領域
に相当する疎水性に富む領域が存在する。また、公知の
タンパク質に相同性の高いものは見あたらず、図２に示
すラットコンドロモジュリンＩ前駆体タンパク質、ヒト
コンドロモジュリンＩ前駆体タンパク質、ウシコンドロ
モジュリンＩ前駆体タンパク質、ウサギコンドロモジュ
リンＩ前駆体タンパク質との相同性はアミノ酸レベルで
それぞれ３９％、３７％、３７％、３５％であった。こ
うして得られたプラスミドｐＴＢＮ３を大腸菌ＤＨ５α
に導入し、形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＤＨ５α／ｐＴＢＮ３を得た。

【００５９】実施例２ ヒトＮＣＨＭ発現部位の解析 実施例１に記載の挿入ＤＮＡ断片（ｐＴＢＮ３のＥｃｏ
ＲＩ−ＥｃｏＲＩ １．１ｋｂ断片）２０ｎｇと［α−
³²Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ：６０００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ）５μｌとを用いて、Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ Ｄ
ＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ (Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ：ＲＰＮ．１６０１Ｙ)の方法でＤＮＡプローブを作
製した。このプローブを用いて、ヒトマルチティッシュ
ノーザンブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社：＃７７５９−
１，＃７７６０−１）およびヒトＲＮＡマスターブロッ
ト（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社：＃７７７０−１）に対してハ
イブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズおよび
洗浄の条件は、添付のマニュアルに従い、検出は、ＢＡ
Ｓ−２０００（フジフィルム）を用いて行った。その結
果、実施例１記載のヒト胎児骨格筋以外に、少なくとも
大腸、小腸、外分泌腺などを含む特定の組織、臓器で発
現していることが明らかとなった。

【００６０】実施例３ ＮＣＨＭタンパク質細胞外領域とＦＬＡＧエピトープペ
プチドの融合タンパク質のＣＯＳ７細胞での発現とその
検出 以下の要領で、ＮＣＨＭタンパク質細胞外領域とＦＬＡ
Ｇエピトープペプチドの融合タンパク質のＣＯＳ７細胞
での発現およびその検出を行う。まず実施例１で得られ
たＮＣＨＭタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列
に基づき、２種のプライマーＤＮＡを化学合成する。一
つは、５’−ＣＧＡＡＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡ
ＧＣＡＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧＧＣＣＧＧＡＧＧＴＡＣ−
３’（配列番号：９）であり、これは制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ認識部位を含むアンカー配列を５’末端側に持ち、開
始コドンと＋１４５〜＋１７２（翻訳開始部位を＋１と
する）までのセンス配列を含むオリゴＤＮＡである。も
う一つは、５’−ＧＴＡＣＡＧＴＣＧＡＣＧＡＣＣＣＴ
ＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＣＣＣＡ−３’
（配列番号：１０）であり、これは制限酵素ＳａｌＩ認
識部位を含むアンカー配列の３’側に＋９２５〜＋９５
１までのアンチセンス配列がつながった配列を有するオ
リゴＤＮＡである。実施例１で得られたプラスミドｐＴ
ＢＮ３を鋳型として、これら２種のプライマーＤＮＡお
よびＴａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造）を用い、サ
ーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ^TM ＰＣＲ ｓｙｓｔ
ｅｍ ９７００（パーキンエルマー社）にて、最初９８
℃で３０秒間置いた後、９８℃で１０秒、５５℃で２０
秒、７２℃で２分を１反応サイクルとして２５サイクル
増幅反応を繰返し、最後に７２℃で５分間伸長反応を行
う。得られるＤＮＡ断片を精製後、制限酵素ＥｃｏＲＩ
とＳａｌＩで末端消化の後再精製し、動物細胞用発現ベ
クターｐＣＡＮ６１８ＦＬＡＧのＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ
部位へ挿入、連結する。ｐＣＡＮ６１８ＦＬＡＧは、プ
ラスミドベクターｐＣＡＮ６１８に由来し、選択マーカ
ーとしてのネオマイシン耐性遺伝子を持つと共に、目的
タンパク質をコードするＤＮＡ断片をそのクローニング
部位であるＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ部位に挿入することで
サイトメガロウイルスの極初期遺伝子エンハンサーとそ
の下流のβ−アクチンプロモーター制御下で該タンパク
質を発現させることができるのみならず、ＳａｌＩ部位
直後に存在する８アミノ酸のＦＬＡＧエピトープ配列
（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ）をコードする塩基配列と終止コドンに
読み取り枠を合わせることで該目的タンパク質をＦＬＡ
Ｇ融合タンパク質として発現させることも可能である。
上述のＰＣＲクローニングＤＮＡ断片のｐＣＡＮ６１８
ＦＬＡＧへの挿入もＮＣＨＭタンパク質細胞外領域とＦ
ＬＡＧエピトープの融合タンパク質（間にＶａｌを１残
基挿む）を発現する目的で行い、その結果、発現ベクタ
ープラスミドｐＮＣＨＭｔｒａ−Ｆを得る。

【００６１】次にＣＯＳ７細胞（１．２×１０⁵細胞）
を６穴プレートを用いて、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）
を含むダルベッコ変法最小培地（ＤＭＥＭ）で２４時間
培養し、この細胞に上記の発現プラスミドｐＮＣＨＭｔ
ｒａ−Ｆ（１ウェルあたり０．４ μｇ）をリポフェク
トアミン（ＧＩｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて導入する。導
入２４時間後、上記の新しい培地に交換し、さらに５時
間後、ＦＢＳ不含有ＯｐｔＩ−ＭＥＭ（ＧＩｂｃｏ Ｂ
ＲＬ）に換えて３６時間培養後、その培養上清と細胞抽
出液を得る。細胞抽出液は細胞を生理食塩を含むリン酸
緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄後、トリスＳＤＳサンプル
緩衝液で溶解抽出し、一方、培養上清は限外濾過（分子
量 ３０００ カット）で適宜濃縮後、等容のトリスＳＤ
Ｓサンプル緩衝液と混合する。これらのサンプルを熱処
理後、１５％−２５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動し、さらにそのゲルからＰＶＤＦ膜上（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ
社）に転写する。次に、該ＰＶＤＦ膜をブロックエース
（雪印乳業）で１時間ブロッキングし、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ ２０ を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中で抗ＦＬ
ＡＧ モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ；Ｋｏｄａ
ｋ社）と２時間反応させる。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、
ＰＢＳ−Ｔ中で、西洋ワサビ過酸化酵素標識抗マウス
ＩｇＧヤギ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ ｂｉｏｔｅｃｈ社；５０００倍希釈）と１時間反応
する。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、ＥＣＬｐｌｕｓ発色キ
ット（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔ
ｅｃｈ社）およびＥＣＬ ｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて該融
合タンパク質に対応する化学発光を検出する。また、該
融合タンパク質の精製は、上記ＣＯＳ７細胞への遺伝子
導入実験をスケールアップし、大量調製した該培養上清
またはＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ，１％ Ｎ
ｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０），０．１％ ＳＤ
Ｓ，０．５％ デオキシコール酸ナトリウム，４０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ７．５））を用いた細胞粗抽出液よ
り、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（シグマ社）を
カラムに結合したアフィニティクロマトグラフィーにて
行う。このようにして得られる目的タンパク質は各種生
物活性の検定に用いるが、血管新生への影響を調べる一
つの評価系としては、例えば血管新生キット（クラボ
ウ）により検定を行う。

【００６２】

【発明の効果】本発明のタンパク質およびそれをコード
するＤＮＡは、例えば、骨・軟骨・関節疾患、癌（悪性
腫瘍）、前記以外の病的血管新生、胎児発育不全、臓器
不全、消化管障害、外分泌障害などの疾病の治療・予防
剤として使用することができる。また、本発明のタンパ
ク質は、本発明のタンパク質の活性を促進もしくは阻害
する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬
として有用である。さらに、本発明のタンパク質に対す
る抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識すること
ができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量な
どに使用することができる。

【００６３】

【配列表】 <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel Protein and its Production <130> B00363 <150> JP 11-369946 <151> 1999-12-27 <150> JP 2000-45124 <151> 2000-02-17 <160> 10 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Ala Lys Asn Pro Pro Glu Asn Cys Glu Asp Cys His Ile Leu Asn 1 5 10 15 Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Lys Ile Cys Lys Ser Leu Lys Ile Cys 20 25 30 Gly Leu Val Phe Gly Ile Leu Ala Leu Thr Leu Ile Val Leu Phe Trp 35 40 45 Gly Ser Lys His Phe Trp Pro Glu Val Pro Lys Lys Ala Tyr Asp Met 50 55 60 Glu His Thr Phe Tyr Ser Asn Gly Glu Lys Lys Lys Ile Tyr Met Glu 65 70 75 80 Ile Asp Pro Val Thr Arg Thr Glu Ile Phe Arg Ser Gly Asn Gly Thr 85 90 95 Asp Glu Thr Leu Glu Val His Asp Phe Lys Asn Gly Tyr Thr Gly Ile 100 105 110 Tyr Phe Val Gly Leu Gln Lys Cys Phe Ile Lys Thr Gln Ile Lys Val 115 120 125 Ile Pro Glu Phe Ser Glu Pro Glu Glu Glu Ile Asp Glu Asn Glu Glu 130 135 140 Ile Thr Thr Thr Phe Phe Glu Gln Ser Val Ile Trp Val Pro Ala Glu 145 150 155 160 Lys Pro Ile Glu Asn Arg Asp Phe Leu Lys Asn Ser Lys Ile Leu Glu 165 170 175 Ile Cys Asp Asn Val Thr Met Tyr Trp Ile Asn Pro Thr Leu Ile Ser 180 185 190 Val Ser Glu Leu Gln Asp Phe Glu Glu Glu Gly Glu Asp Leu His Phe 195 200 205 Pro Ala Asn Glu Lys Lys Gly Ile Glu Gln Asn Glu Gln Trp Val Val 210 215 220 Pro Gln Val Lys Val Glu Lys Thr Arg His Ala Arg Gln Ala Ser Glu 225 230 235 240 Glu Glu Leu Pro Ile Asn Asp Tyr Thr Glu Asn Gly Ile Glu Phe Asp 245 250 255 Pro Met Leu Asp Glu Arg Gly Tyr Cys Cys Ile Tyr Cys Arg Arg Gly 260 265 270 Asn Arg Tyr Cys Arg Arg Val Cys Glu Pro Leu Leu Gly Tyr Tyr Pro 275 280 285 Tyr Pro Tyr Cys Tyr Gln Gly Gly Arg Val Ile Cys Arg Val Ile Met 290 295 300 Pro Cys Asn Trp Trp Val Ala Arg Met Leu Gly Arg Val 305 310 315 <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Human <400> 2 Gly Ser Lys His Phe Trp Pro Glu Val Pro Lys Lys Ala Tyr Asp Met 1 5 10 15 Glu His Thr Phe Tyr Ser Asn Gly Glu Lys Lys Lys Ile Tyr Met Glu 20 25 30 Ile Asp Pro Val Thr Arg Thr Glu Ile Phe Arg Ser Gly Asn Gly Thr 35 40 45 Asp Glu Thr Leu Glu Val His Asp Phe Lys Asn Gly Tyr Thr Gly Ile 50 55 60 Tyr Phe Val Gly Leu Gln Lys Cys Phe Ile Lys Thr Gln Ile Lys Val 65 70 75 80 Ile Pro Glu Phe Ser Glu Pro Glu Glu Glu Ile Asp Glu Asn Glu Glu 85 90 95 Ile Thr Thr Thr Phe Phe Glu Gln Ser Val Ile Trp Val Pro Ala Glu 100 105 110 Lys Pro Ile Glu Asn Arg Asp Phe Leu Lys Asn Ser Lys Ile Leu Glu 115 120 125 Ile Cys Asp Asn Val Thr Met Tyr Trp Ile Asn Pro Thr Leu Ile Ser 130 135 140 Val Ser Glu Leu Gln Asp Phe Glu Glu Glu Gly Glu Asp Leu His Phe 145 150 155 160 Pro Ala Asn Glu Lys Lys Gly Ile Glu Gln Asn Glu Gln Trp Val Val 165 170 175 Pro Gln Val Lys Val Glu Lys Thr Arg His Ala Arg Gln Ala Ser Glu 180 185 190 Glu Glu Leu Pro Ile Asn Asp Tyr Thr Glu Asn Gly Ile Glu Phe Asp 195 200 205 Pro Met Leu Asp Glu Arg Gly Tyr Cys Cys Ile Tyr Cys Arg Arg Gly 210 215 220 Asn Arg Tyr Cys Arg Arg Val Cys Glu Pro Leu Leu Gly Tyr Tyr Pro 225 230 235 240 Tyr Pro Tyr Cys Tyr Gln Gly Gly Arg Val Ile Cys Arg Val Ile Met 245 250 255 Pro Cys Asn Trp Trp Val Ala Arg Met Leu Gly Arg Val 260 265 <210> 3 <211> 103 <212> PRT <213> Human <400> 3 Gly Ile Glu Gln Asn Glu Gln Trp Val Val Pro Gln Val Lys Val Glu 1 5 10 15 Lys Thr Arg His Ala Arg Gln Ala Ser Glu Glu Glu Leu Pro Ile Asn 20 25 30 Asp Tyr Thr Glu Asn Gly Ile Glu Phe Asp Pro Met Leu Asp Glu Arg 35 40 45 Gly Tyr Cys Cys Ile Tyr Cys Arg Arg Gly Asn Arg Tyr Cys Arg Arg 50 55 60 Val Cys Glu Pro Leu Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr Pro Tyr Cys Tyr Gln 65 70 75 80 Gly Gly Arg Val Ile Cys Arg Val Ile Met Pro Cys Asn Trp Trp Val 85 90 95 Ala Arg Met Leu Gly Arg Val 100 <210> 4 <211> 951 <212> DNA <213> Human <400> 4 ATGGCAAAGA ATCCTCCAGA GAATTGTGAA GACTGTCACA TTCTAAATGC AGAAGCTTTT 60 AAATCCAAGA AAATATGTAA ATCACTTAAG ATTTGTGGAC TGGTGTTTGG TATCCTGGCC 120 CTAACTCTAA TTGTCCTGTT TTGGGGGAGC AAGCACTTCT GGCCGGAGGT ACCCAAAAAA 180 GCCTATGACA TGGAGCACAC TTTCTACAGC AATGGAGAGA AGAAGAAGAT TTACATGGAA 240 ATTGATCCTG TGACCAGAAC TGAAATATTC AGAAGCGGAA ATGGCACTGA TGAAACATTG 300 GAAGTACACG ACTTTAAAAA CGGATACACT GGCATCTACT TCGTGGGTCT TCAAAAATGT 360 TTTATCAAAA CTCAGATTAA AGTGATTCCT GAATTTTCTG AACCAGAAGA GGAAATAGAT 420 GAGAATGAAG AAATTACCAC AACTTTCTTT GAACAGTCAG TGATTTGGGT CCCAGCAGAA 480 AAGCCTATTG AAAACCGAGA TTTTCTTAAA AATTCCAAAA TTCTGGAGAT TTGTGATAAC 540 GTGACCATGT ATTGGATCAA TCCCACTCTA ATATCAGTTT CTGAGTTACA AGACTTTGAG 600 GAGGAGGGAG AAGATCTTCA CTTTCCTGCC AACGAAAAAA AAGGGATTGA ACAAAATGAA 660 CAGTGGGTGG TCCCTCAAGT GAAAGTAGAG AAGACCCGTC ACGCCAGACA AGCAAGTGAG 720 GAAGAACTTC CAATAAATGA CTATACTGAA AATGGAATAG AATTTGATCC CATGCTGGAT 780 GAGAGAGGTT ATTGTTGTAT TTACTGCCGT CGAGGCAACC GCTATTGCCG CCGCGTCTGT 840 GAACCTTTAC TAGGCTACTA CCCATATCCA TACTGCTACC AAGGAGGACG AGTCATCTGT 900 CGTGTCATCA TGCCTTGTAA CTGGTGGGTG GCCCGCATGC TGGGGAGGGT C 951 <210> 5 <211> 807 <212> DNA <213> Human <400> 5 GGGAGCAAGC ACTTCTGGCC GGAGGTACCC AAAAAAGCCT ATGACATGGA GCACACTTTC 60 TACAGCAATG GAGAGAAGAA GAAGATTTAC ATGGAAATTG ATCCTGTGAC CAGAACTGAA 120 ATATTCAGAA GCGGAAATGG CACTGATGAA ACATTGGAAG TACACGACTT TAAAAACGGA 180 TACACTGGCA TCTACTTCGT GGGTCTTCAA AAATGTTTTA TCAAAACTCA GATTAAAGTG 240 ATTCCTGAAT TTTCTGAACC AGAAGAGGAA ATAGATGAGA ATGAAGAAAT TACCACAACT 300 TTCTTTGAAC AGTCAGTGAT TTGGGTCCCA GCAGAAAAGC CTATTGAAAA CCGAGATTTT 360 CTTAAAAATT CCAAAATTCT GGAGATTTGT GATAACGTGA CCATGTATTG GATCAATCCC 420 ACTCTAATAT CAGTTTCTGA GTTACAAGAC TTTGAGGAGG AGGGAGAAGA TCTTCACTTT 480 CCTGCCAACG AAAAAAAAGG GATTGAACAA AATGAACAGT GGGTGGTCCC TCAAGTGAAA 540 GTAGAGAAGA CCCGTCACGC CAGACAAGCA AGTGAGGAAG AACTTCCAAT AAATGACTAT 600 ACTGAAAATG GAATAGAATT TGATCCCATG CTGGATGAGA GAGGTTATTG TTGTATTTAC 660 TGCCGTCGAG GCAACCGCTA TTGCCGCCGC GTCTGTGAAC CTTTACTAGG CTACTACCCA 720 TATCCATACT GCTACCAAGG AGGACGAGTC ATCTGTCGTG TCATCATGCC TTGTAACTGG 780 TGGGTGGCCC GCATGCTGGG GAGGGTC 807 <210> 6 <211> 309 <212> DNA <213> Human <400> 6 GGGATTGAAC AAAATGAACA GTGGGTGGTC CCTCAAGTGA AAGTAGAGAA GACCCGTCAC 60 GCCAGACAAG CAAGTGAGGA AGAACTTCCA ATAAATGACT ATACTGAAAA TGGAATAGAA 120 TTTGATCCCA TGCTGGATGA GAGAGGTTAT TGTTGTATTT ACTGCCGTCG AGGCAACCGC 180 TATTGCCGCC GCGTCTGTGA ACCTTTACTA GGCTACTACC CATATCCATA CTGCTACCAA 240 GGAGGACGAG TCATCTGTCG TGTCATCATG CCTTGTAACT GGTGGGTGGC CCGCATGCTG 300 GGGAGGGTC 309 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 TCAGCAGTGG TCTCTCAGTC CTCTCA 26 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ACAAGTAATT CTGGAGAGCT GGCTACCA 28 <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 CGAATTCCCA CCATGGGGAG CAAGCACTTC TGGCCGGAGG TAC 43 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 GTACAGTCGA CGACCCTCCC CAGCATGCGG GCCACCCA 38

【００６４】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた本発明のタンパク質をコー
ドするＤＮＡの塩基配列および該塩基配列から推定され
るアミノ酸配列を示す。図は、ベクターＤＮＡのＥｃｏ
ＲＩ認識部位より挿入配列側を示す。

【図２】ヒトＮＣＨＭタンパク質と既知各種コンドロモ
ジュリンＩ前駆体タンパク質との相同性を示す。図中、
Nchm.pro はヒトＮＣＨＭタンパク質を、CHM1_HUMAN.pr
o はヒトコンドロモジュリンＩ前駆体タンパク質を、CH
M1_BOVIN.pro はウシコンドロモジュリンＩ前駆体タン
パク質を、CHM1_RABBIT.pro はウサギコンドロモジュリ
ンＩ前駆体タンパク質を、CHM1_RAT.pro はラットコン
ドロモジュリンＩ前駆体タンパク質をそれぞれ示す（図
３につづく）。

【図３】ヒトＮＣＨＭタンパク質と既知各種コンドロモ
ジュリンＩ前駆体タンパク質との相同性を示す（図２の
つづき）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/00 ４Ｃ０８５ 48/00 15/00 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 1/00 19/00 ４Ｈ０４５ 15/00 19/02 19/00 35/00 19/02 43/00 １０５ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/52 43/00 １０５ 16/24 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/53 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB03 4B024 BA21 CA04 DA02 DA06 EA04 GA13 HA01 HA12 HA15 4B064 AG02 AG27 CA02 CA10 CA19 CA20 CC24 CE12 CE13 DA13 DA14 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA05 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA07 AA13 AA17 BA01 BA22 BA23 MA01 NA14 ZA312 ZA662 ZA962 ZB212 ZB262 ZC752 4C085 AA13 AA14 CC32 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA31 ZA66 ZA96 ZB21 ZB26 ZC75 4H045 AA11 AA20 AA30 CA40 DA01 DA76 DA86 EA22 EA28 EA50 EA51 FA74 GA26

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
   同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
   パク質またはその塩。
2. 【請求項２】請求項１記載のタンパク質の部分ペプチド
   またはその塩。
3. 【請求項３】配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を
   有する請求項２記載の部分ペプチドまたはその塩。
4. 【請求項４】配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を
   有する請求項２記載の部分ペプチドまたはその塩。
5. 【請求項５】請求項１記載のタンパク質または請求項２
   記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮ
   Ａ。
6. 【請求項６】配列番号：４で表される塩基配列を含有す
   る請求項５記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】配列番号：５で表される塩基配列を含有す
   る請求項５記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】配列番号：６で表される塩基配列を含有す
   る請求項５記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】請求項１記載のタンパク質または請求項２
   記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換
   えベクターで形質転換された形質転換体。
10. 【請求項１０】請求項１記載のタンパク質または請求項
    ２記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する組
    換えベクターで形質転換された形質転換体を培養し、該
    タンパク質または該部分ペプチドを生成せしめることを
    特徴とする、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項
    ２記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法。
11. 【請求項１１】請求項１記載のタンパク質もしくは請求
    項２記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
12. 【請求項１２】請求項１記載のタンパク質もしくは請求
    項２記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特
    徴とする、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項２
    記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻
    害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
13. 【請求項１３】請求項１記載のタンパク質もしくは請求
    項２記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、
    請求項１記載のタンパク質もしくは請求項２記載の部分
    ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合
    物またはその塩のスクリーニング用キット。
14. 【請求項１４】請求項１２記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項１３記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られうる、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項
    ２記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または
    阻害する化合物またはその塩。
15. 【請求項１５】請求項１２記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項１３記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られうる、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項
    ２記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または
    阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
16. 【請求項１６】請求項１１記載の抗体を含有してなる診
    断剤。
17. 【請求項１７】請求項１記載のタンパク質もしくはその
    塩または請求項２記載の部分ペプチドもしくはその塩を
    含有してなる医薬。
18. 【請求項１８】骨・軟骨・関節疾患、癌、病的血管新
    生、胎児発育不全、臓器不全、消化管障害または外分泌
    障害の治療・予防剤である請求項１７記載の医薬。
19. 【請求項１９】請求項１記載のタンパク質もしくはその
    塩または請求項２記載の部分ペプチドもしくはその塩を
    投与することを特徴とする骨・軟骨・関節疾患、癌、病
    的血管新生、胎児発育不全、臓器不全、消化管障害また
    は外分泌障害の治療・予防方法。
20. 【請求項２０】請求項１記載のタンパク質もしくはその
    塩または請求項２記載の部分ペプチドもしくはその塩を
    含有してなる骨・軟骨・関節疾患、癌、病的血管新生、
    胎児発育不全、臓器不全、消化管障害または外分泌障害
    の治療・予防剤を製造するための請求項１記載のタンパ
    ク質もしくはその塩または請求項２記載の部分ペプチド
    もしくはその塩の使用。