KR20020026465A

KR20020026465A - 신규 폴리펩티드 및 그의 ｄｎａ

Info

Publication number: KR20020026465A
Application number: KR1020017016470A
Authority: KR
Inventors: 이또야스아끼; 니시가즈노리; 오기가즈히로; 오오꾸보쇼이찌; 모기신이찌; 노구찌유꼬; 요시무라고지; 다나까히데유끼
Original assignee: 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date: 1999-06-30
Filing date: 2000-06-29
Publication date: 2002-04-10
Also published as: CA2377791A1; EP1191099B1; PL353065A1; HUP0201660A2; AU5705600A; NO20016344L; CN1359421A; EP1191099A1; ATE445013T1; DE60043106D1; EP1191099A4; WO2001002564A1; NO20016344D0; US6797483B1

Abstract

본 발명은 신규 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 DNA, 이 폴리펩티드 또는 DNA 를 함유하여 이루어진 의약, 이 폴리펩티드의 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법 / 스크리닝용 키트, 이 스크리닝으로 얻은 화합물 또는 그의 염, 이 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 의약 등에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 DNA 는 예컨대 골ㆍ관절질환, 병적혈관 신생의 진단, 치료, 예방 등에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝을 위한 시약으로서 유용하다.

Description

신규 폴리펩티드 및 그의 ＤＮＡ {NOVEL POLYPEPTIDE AND DNA THEREOF}

세포는 그 원핵성, 진핵성을 불문하고 그 고유한 기구에서 다중 다양한 단백질을 분비하고 있다. 특히 다세포 생물 (생체) 은 그 분화, 증식 및 항상성 유지를 위해서 각종 정보를 세포 사이에서 교환하고 있으나, 거기에서 중심적 역할을 다하는 각종 액성 인자도 그 대부분이 분비 단백질 또는 그 성숙체로서, 그 구조적, 기능적 특징 등에서 호르몬, 신경전달물질, 사이토카인, 증식인자 등으로 분류되어 있다. 최근 재조합 DNA 기술과 세포배향 기술의 진보에 따라 이들 분비 단백질을 코딩하는 유전자와 단백질 구조의 해명이 착실히 진행되고 있다. 한편, 이러한 인자 발현은 세포 표면에 발현되는 그 수용체 해석을 비약적으로 전진시키고, 나아가서는 각 세포 내에서의 정보 전달의 메커니즘 해명으로도 이어져, 그 생리기능을 특징짓게 된다. 인간의 많은 질병 또는 각종 질환 모델 동물의 병태에서는 이러한 본래 항상성을 유지해야 하는 어떠한 액성 인자의 이상한 발현이 그 원인이 되거나 결과적으로 더 악화되는 것으로 이어지는 경우도 많이 발견되는 것 이외에 예컨대 암에서 특이적으로 발현 항진이 보이는 이른바 종양 마커 등 각종 질환의 진단 분야에서 응용 가능한 현상도 있고, 그 발현 제어 기구는 창약연구를 하는 데에서 중요한 표적이 되기도 한다.

1994년에 Blesch 외가 발표한 흑색종 저해 단백질 MIA (melanoma inhibitory activity) 도 이러한 범주에 포함된 분비 단백질의 1 종류로서, 당초 그 이름이 나타낸 바와 같이 인체 흑색종 세포에 대한 항증식활성을 지표로 흑색종 세포의 배양 상청액에서 단리되어 그 유전자도 취득되었다 (Cancer Research 54, 5695-5701, 1994). 그 후 1996년 Sandell 외에 의해 본 단백질의 상동 유전자가 소 연골세포가 생산하는 레티노인산 감수성 단백질 CD-RAP (cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein) 로서 재차 동정되고, 생리학적으로는 관절의 형성ㆍ유지에 기능하는 것이 시사되어 있다 (The Journal of Biological Chemistry 271, 3311-3316, 1996). MIA/CD-RAP 유전자는 인간, 마우스, 래트, 소의 종 사이에서 아미노산 레벨로 85% 이상의 높은 상동성을 갖고 있으나, 지금까지 공지된 단백질로 상동성이 있는 것은 발견하지 못하고 또 소, 래트의 유전적 해석에서 본 유전자의 유사 유전자는 다른 데에 존재하지 않는다고 생각되었다 (The Journal of Biological Chemistry 271, 3311-3316, 1996).

한편, 현재 하나의 생물이 갖는 전체 DNA, 즉 게놈의 구조 해석이 박테리아에서는 이미 몇가지 종료되고, 인간의 그것도 몇년안에 완성될 것으로 전망되지만, 그 예상되는 유전자 수가 인간은 십만이라고도 한다. 확실히 지금까지 수많은 분비 단백질 또는 분비 펩티드를 코딩하는 유전자가 단리되어 왔으나, 그 수는 전체 게놈에서 보면 매우 그 전부를 망라했다고는 할 수 없다. 개체 레벨의 생명 현상을 이해하는 데에 그 중에서 일어나는 이른바 세포 사이의 정보 교환이 설명가능하게 되어 있어야 하는데, 이러한 이미 알려진 유전자 이외에도 아직 알려지지 않은 액성의 기능 분자가 중요한 생리적 역할을 다하고 있을 가능성이 높아서, 그러한 물질 발현이 강하게 요구되었다.

본 발명은 신규 세포기능조절 분비 단백질 (이하, MLP 단백질 또는 MLP 라고 하는 경우가 있음), 그 부분 펩티드 또는 그의 염, 이 단백질을 코딩하는 DNA, 재조합 벡터, 형질전환체, 이 단백질의 제조법, 이 단백질 또는 DNA 를 함유한 의약, 이 단백질에 대한 항체, 리셉터 아고니스트/앤타고니스트의 스크리닝방법 및 스크리닝용 키트, 이 스크리닝으로 얻은 리셉터 아고니스트/앤타고니스트 및 그의 의약 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

새로운 세포기능조절 분비 단백질의 단리는 세포 분화, 증식, 암화 등과 같은 메커니즘에 새로운 지견을 부여하고, 나아가서는 개체 발생, 항상성 유지 등과 같은 생명 현상의 해명을 한층 더 진전시킬 수 있으며, 이 단백질에 대하여 저해활성 또는 촉진활성을 발휘하고 각종 질환의 예방이나 진단, 치료에 도움이 되는 새로운 의약품을 개발할 수 있다.

본 발명은 신규 분비성 세포기능조절 단백질 및 그의 DNA 에 관한 것이다.

도 1 은 인간 MLP 전구체 (hMLP), 마우스 MLP 전구체 (mMLP), 인간 MIA 전구체 (hMIA), 마우스 MIA 전구체 (mMIA), 래트 MIA 전구체 (rMIA) 및 소 MIA 전구체 (bMIA) 의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2 는 실시예 6 에서 실시된 웨스턴 블로트 해석의 결과를 나타낸다. 1차 항체로서 항FLAG 항체를 사용한다. 도면 중 레인 1 은 마우스 MLP (FLAG 태그 없음), 레인 2 는 마우스 MLP-FLAG, 레인 3 은 마우스 MIA (FLAG 태그 없음), 레인 4 는 마우스 MIA-FLAG, 레인 5 는 인간 MLP (FLAG 태그 없음), 레인 6 은 마우스 MLP-FLAG 를 각각 도입한 COS-7 세포의 배양 상청액을 전기영동한 레인을 나타낸다.

도 3 은 실시예 6 에서 실시된 웨스턴 블로트 해석의 결과를 나타낸다. 1차 항체로서 항MLP 항혈청을 사용한다. 도면 중 레인 1 은 마우스 MLP (FLAG 태그 없음), 레인 2 는 마우스 MLP-FLAG, 레인 3 은 마우스 MIA (FLAG 태그 없음), 레인 4 는 마우스 MIA-FLAG, 레인 5 는 인간 MLP (FLAG 태그 없음), 레인 6 은 마우스 MLP-FLAG 를 각각 도입한 COS-7 세포의 배양 상청액을 전기영동한 레인을 나타낸다.

도 4 는 실시예 6 에서 실시된 면역 염색의 결과를 나타낸다. 왼쪽 패널은 면역전 토끼 혈청을 사용한 대조실험의 결과를 나타내고, 오른쪽 패널은 항MLP 항혈청을 사용한 실험 결과를 나타낸다.

발명의 실시를 하기 위한 최선의 형태

본 발명의 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드 (이하, 인간형 폴리펩티드라고 함), 서열번호:26 으로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드 (이하, 마우스형 폴리펩티드라고 함), 서열번호:49 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드 (이하, 래트형 폴리펩티드라고 함) 및 인간형 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드 (이하, 인간형 폴리펩티드 및 인간형 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드를 총칭하여 본 발명의 폴리펩티드라고 칭하기도 함) 는 인간이나 온혈동물 (예컨대, 모르모트, 래트, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 세포 (예컨대, 간 세포, 지라 세포, 신경 세포, 글리어 세포, 췌장β세포, 골수 세포, 메산기움 세포, 랑겔한스 세포, 표피 세포, 상피 세포, 내피 세포, 섬유아 세포, 섬유 세포, 근세포, 지방 세포, 면역 세포 (예, 매크로파지, T 세포, B 세포, 내추럴 킬러 세포, 비만 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단일구), 거핵구, 골막 세포, 연골 세포, 골 세포, 골아 세포, 파골 세포, 유선 세포 또는 간질 세포 또는 이들 세포의 전구 세포, 간 (幹) 세포 또는 암 세포 등) 또는 이들 세포가 존재하는 모든 조직, 예컨대 뇌, 뇌의 각 부위 (예, 후구, 편도핵, 대뇌기저구, 해마, 시상, 시상 하부, 대뇌 피질, 연수, 소뇌), 척수, 하수체, 위, 췌장, 신장, 간장, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 근육, 폐, 소화관 (예, 대장, 소장), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 타액선, 말초혈, 전립선, 고환, 난소, 태반, 자궁, 골, 연골, 관절, 골격근 등에서 유래하는 폴리펩티드일 수도 있고, 재조합 폴리펩티드일 수도 있으며, 합성 폴리펩티드일 수도 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드가 시그널 펩티드를 갖고 있는 경우에는 폴리펩티드를 효율적으로 세포 밖으로 분비시킬 수 있다.

서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는, 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 더 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 특히 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있고, 구체적으로는 서열번호:26 으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호:49 로 표시되는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인간 MLP 또는 인간 MLP 단백질, 서열번호:26 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 마우스 MLP 또는 마우스 MLP 단백질 및 서열번호:49 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 래트 MLP 또는 래트 MLP 단백질이라고 칭하며 이들을 MLP 라고 총칭한다.

서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드로서, 구체적으로는 예컨대 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드 등을 들 수 있다.

서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는, 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열과 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 더 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 특히 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있고, 구체적으로는 서열번호:12 로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호:47 로 표시되는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인간 MLP 전구체 또는 인간 MLP 전구체 단백질, 서열번호:12 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 마우스 MLP 전구체 또는 마우스 MLP 전구체 단백질 및 서열번호:47 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 래트 MLP 전구체 또는 래트 MLP 전구체라고 칭하며 이들을 MLP 전구체라고 총칭한다.

본 발명의 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로서는, 예컨대 상기 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 실질적으로 동질인 성질을 갖는 폴리펩티드 등이 바람직하다.

또한, 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로서는, 예컨대 상기 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 실질적으로 동질인 성질을 갖는 폴리펩티드 등이 바람직하다.

실질적으로 동질인 성질로는 예컨대 분비되고 액성 인자로서 작용하는 것 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질이라 함은 이들 성질이 정성적 (定性的) 으로동질임을 나타낸다. 따라서, 분비 작용이나 용해도 등의 성질이 동등 (예, 약 0.1 내지 100 배, 바람직하게는 약 0.5 내지 10 배, 더 바람직하게는 0.5 내지 2 배) 인 것이 바람직하지만, 이들 성질의 정도, 폴리펩티드의 분자량 등의 양적 요소는 다를 수도 있다.

또, 서열번호:24 또는 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드로서, 더 구체적으로는 예컨대 ① 서열번호:24 또는 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열 중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 내지 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 내지 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 몇 (1 내지 5) 개) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, ② 서열번호:24 또는 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 내지 40 개 정도, 더 바람직하게는 1 내지 30 개 정도, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 개 정도, 그 중에서도 바람직하게는 몇 (1 내지 5) 개) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, ③ 서열번호:24 또는 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 내지 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 내지 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 몇 (1 내지 5) 개) 의 아미노산이 삽입된 아미노산 서열, ④ 서열번호:24 또는 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열 중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 내지 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 내지 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 몇 (1 내지 5) 개) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 ⑤ 이들을 조합한 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드 등의 이른바 뮤테인도 포함된다.

상기와 같이 아미노산 서열이 삽입, 결실 또는 치환되어 있는 경우, 그 삽입, 결실 또는 치환되는 위치로서는 특별히 한정되지는 않지만, 서열번호:24, 서열번호:26 및 서열번호:49 각각의 서열번호로 표시되는 아미노산 서열에 공통되는 아미노산 서열 이외의 위치, 서열번호:6, 서열번호:12 및 서열번호:47 각각의 서열번호로 표시되는 아미노산 서열에 공통되는 아미노산 서열 이외의 위치 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 폴리펩티드는 펩티드 표기의 관례에 따라 좌단이 N 말단 (아미노 말단), 우단이 C 말단 (카르복실 말단) 이다. 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드를 비롯한 본 발명의 폴리펩티드는 C 말단이 통상 카르복실기(-COOH) 또는 카르복실레이트(-COO^-) 이지만, C 말단이 아미드(-CONH₂) 또는 에스테르(-COOR) 일 수도 있다.

여기에서 에스테르의 R 로서는 예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 또는 n-부틸 등과 같은 C_1-6알킬기, 예컨대, 시클로펜틸, 시클로헥실 등과 같은 C_3-8시클로알킬기, 예컨대 페닐, α-나프틸 등과 같은 C_6-12아릴기, 예컨대 벤질, 페네틸 등과 같은 페닐-C_1-2알킬기 또는 α-나프틸메틸 등과 같은 α-나프틸-C_1-2알킬기 등과 같은 C_7-14아르알킬기 이외에 경구용 에스테르로서 범용되고 있는 피바로일옥시메틸기 등이 사용된다.

본 발명의 폴리펩티드가 C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트)를 갖고 있는 경우 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것도 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다. 이 경우 에스테르로서는 예컨대 상기한 C 말단의 에스테르 등이 사용된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드에는 N 말단의 아미노산 잔기 (예, 메티오닌 잔기) 의 아미노기가 보호기 (예컨대, 포르밀기, 아세틸기 등과 같은 C_1-6알카노일 등과 같은 C_1-6아실기 등) 로 보호되어 있는 것, 생체 내에서 절단되어 생성되는 N 말단의 글루타민 잔기가 피로글루타민산화시킨 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄상의 치환기 (예컨대, -OH, -SH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등) 가 적당한 보호기 (예컨대, 포르밀기, 아세틸기 등과 같은 C_1-6알카노일기 등과 같은 C_1-6아실기 등) 로 보호되어 있는 것 또는 당쇄가 결합된 이른바 당폴리펩티드 등과 같은 복합 폴리펩티드 등도 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염으로서는 생리학적으로 허용되는 산 (예, 무기산, 유기산) 이나 염기 (예, 알칼리금속염) 등과의 염이 사용되고, 특히 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다. 이러한 염으로서는 예컨대 무기산 (예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염 또는 유기산 (예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸말산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 자리르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용된다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염은 상술한 인간이나 온혈동물의 세포 또는 조직으로부터 자체 공지된 폴리펩티드 (단백질) 의 정제방법으로 제조할 수도있고, 후술하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유한 형질전환체를 배양함으로써 제조할 수도 있다. 또한, 후술하는 펩티드 합성법에 준하여 제조할 수도 있다.

인간이나 포유동물의 조직 또는 세포으로부터 제조하는 경우, 인간이나 포유동물의 조직 또는 세포를 호모지나이즈한 후, 산 등으로 추출하고 이 추출액을 역상 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피를 조합함으로써 정제 단리할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염 또는 그의 아미드체의 합성에는 통상 시판되는 폴리펩티드 (단백질) 합성용 수지를 사용할 수 있다. 이러한 수지로서는 예컨대 클로로메틸수지, 히드록시메틸수지, 벤즈히드릴아민수지, 아미노메틸수지, 4-벤질옥시벤질알콜수지, 4-메틸벤즈히드릴아민수지, PAM 수지, 4-히드록시메틸메틸페닐아세토아미드메틸수지, 폴리아크릴아미드수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-히드록시메틸)페녹시수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc아미노에틸)페녹시수지 등을 들 수 있다. 이러한 수지를 사용하며 α-아미노기와 측쇄 관능기를 적당하게 보호한 아미노산을, 목적하는 폴리펩티드의 서열대로 자체 공지된 각종 축합방법으로 수지 상에서 축합시킨다. 반응 마지막에 수지로부터 폴리펩티드를 잘라냄과 동시에 각종 보호기를 제거하고, 다시 고희석 용액 중에서 분자 내 디술피드 결합형성 반응을 실시하여 목적하는 폴리펩티드 또는 이들 아미드체를 취득한다.

상기한 보호 아미노산의 축합에 관해서는 폴리펩티드 합성에 사용할 수 있는 각종 활성화 시약을 사용할 수 있으나, 특히 카르보디이미드류가 좋다. 카르보디이미드류로는 DCC, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프롤릴)카르보디이미드 등이 사용된다. 이들에 의한 활성화에는 라세미화 억제첨가제 (예컨대, HOBt, HOOBt) 와 함께 보호 아미노산을 직접 수지에 첨가하거나 또는 대칭 산무수물 또는 HOBt 에스테르 또는 HOOBt 에스테르로서 미리 보호 아미노산의 활성화를 실시한 후에 수지에 첨가할 수 있다.

보호 아미노산의 활성화나 수지와의 축합에 사용되는 촉매로서는 폴리펩티드 (단백질) 축합 반응에 사용할 수 있는 것이 알려져 있는 용매로부터 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세토아미드, N-메틸피롤리돈 등과 같은 산 아미드류, 염화메틸렌, 클로로포름 등과 같은 할로겐화 탄화수소류, 트리플루오로에탄올 등과 같은 알콜류, 디메틸술폭시드 등과 같은 술폭시드류, 피리딘, 디옥산, 테트라히드로푸란 등과 같은 에테르류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등과 같은 니트릴류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등과 같은 에스테르류 또는 이들의 적절한 혼합물 등이 사용된다. 반응온도는 폴리펩티드 (단백질) 결합형성 반응에 사용될 수 있는 것이 알려져 있는 범위에서 적절하게 선택되고, 통상 약 -20 내지 50 ℃ 범위에서 적절하게 선택된다. 활성화된 아미노산 유도체는 통상 1.5 내지 4배 과잉 사용된다. 닌히드린 반응을 이용한 테스트 결과, 축합이 불충분한 경우에는 보호기의 탈리를 실시하지 않고 축합반응을 반복함으로써 충분한 축합을 실시할 수 있다. 반응을 반복해도 충분한 축합을 얻을 수 없을 때에는 무수 아세트산 또는 아세틸아미다졸을 사용하여 미반응 아미노산을 아세틸화시킴으로써, 이후의 반응에 영향을 미치지 않도록 할 수 있다.

원료의 아미노기의 보호기로서는 예컨대 Z, Boc, t-펜틸옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 4-메톡시벤질옥시카르보닐, Cl-Z, Br-Z, 아다만틸옥시카르보닐, 트리플루오로아세틸, 프탈로일, 포르밀, 2-니트로페닐술페닐, 디페닐포스피노티오일, Fmoc 등이 사용된다.

카르복실기는 예컨대 알킬에스테르화 (예컨대, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, t-부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 2-아다만틸 등과 같은 직쇄형, 분지형 또는 고리형 알킬에스테르화), 아르알킬에스테르화 (예컨대, 벤질에스테르, 4-니트로벤질에스테르, 4-메톡시벤질에스테르, 4-클로로벤질에스테르, 벤즈히드릴에스테르화), 페나실에스테르화, 벤질옥시카르보닐히드라지드화, t-부톡시카르보닐히드라지드화, 트리틸히드라지드화 등에 의해 보호될 수 있다.

세린의 수산기는 예컨대 에스테르화 또는 에테르화에 의해 보호될 수 있다. 이 에스테르화에 적합한 기로서는 예컨대 아세틸기 등과 같은 저급 (C_1-6)알카노일기, 벤조일기 등과 같은 알로일기, 벤질옥시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등과 같은 탄산에서 유도되는 기 등이 사용된다. 또한, 에테르화에 적합한 기로서는 예컨대 벤질기, 테트라히드로피라닐기, t-부틸기 등이다.

티로신의 페놀성 수산기의 보호기로서는 예컨대 Bzl, Cl₂-Bzl, 2-니트로벤질, Br-Z, t-부틸 등이 사용된다.

히스티딘의 이미다졸의 보호기로서는 예컨대 Tos, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐, DNP, 벤질옥시메틸, Bum, Boc, Trt, Fmoc 등이 사용된다.

원료의 카로복실기가 활성화된 것으로는 예컨대 대응하는 산무수물, 아지드,활성에스테르 [알콜 (예컨대, 펜타클로로페놀, 2,4,5-트리클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸알콜, 파라니트로페놀, HONB, N-히드록시숙시미드, N-히드록시프탈이미드, HOBt) 과의 에스테르] 등이 사용된다. 원료의 아미노기가 활성화된 것으로는 예컨대 대응하는 인산아미드가 사용된다.

보호기의 제거 (탈리) 방법으로는 예컨대 Pd-흑 또는 Pd-탄소 등과 같은 촉매 존재하에서 수소기류 중에서의 접촉 환원이나 또한 무수 플루오르화 수소, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로아세트산 또는 이들 혼합액 등에 의한 산 처리나 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피페리딘, 피페라진 등에 의한 염기처리, 그리고 액체 암모니아 중 나트륨에 의한 환원 등도 사용된다. 상기 산 처리에 의한 탈리 반응은 일반적으로 약 -20 내지 40℃ 온도에서 실시되지만, 산 처리에서는 예컨대 아니솔, 페놀, 티오아니솔, 메타크레졸, 파라크레졸, 디메틸술피드, 1,4-부탄디티올, 1,2-에탄디티올 등과 같은 양이온 보촉제의 첨가가 유효하다. 또, 히스티딘의 이미다졸 보호기로서 사용되는 2,4-디니트로페닐기는 티오페놀처리에 의해 제거되고, 트립토판의 인돌 보호기로서 사용되는 포르밀기는 상기 1,2-에탄디티올, 1,4-부탄디티올 등과 같은 존재하의 산처리에 의한 탈보호 이외에 묽은 수산화나트륨용액, 묽은 암모니아 등에 의한 알칼리 처리에 의해서도 제거된다.

원료의 반응에 관여해야 하지 않는 관능기의 보호 및 보호기, 그리고 그 보호기의 탈리, 반응에 관여한 관능기의 활성화 등은 공지된 기 또는 공지된 수단에서 적절하게 선택할 수 있다.

폴리펩티드의 아미드체를 얻는 다른 방법으로는 예컨대 먼저 카르복시 말단 아미노산의 α-카르복실기를 아미드화시켜 보호한 후, 아미노기측에 펩티드 (폴리펩티드) 사슬을 원하는 사슬 길이까지 신장시킨 후, 이 펩티드사슬의 N 말단의 α-아미노기의 탈보호만 제거한 폴리펩티드와 C 말단의 카르복실기의 보호기만 제거한 폴리펩티드를 제조하고, 이 두 폴리펩티드를 상기한 바와 같은 혼합 용액 중에서 축합시킨다. 축합 반응의 상세함에 대해서는 상기한 바와 동일하다. 축합에 의해 얻은 보호 폴리펩티드를 정제한 후, 상기 방법으로 모든 보호기를 제거하고 원하는 비정제 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 이 비정제 폴리펩티드는 이미 알려진 각종 정제수단을 사용하여 정제하고 주요 분획을 동결 건조시킴으로써 원하는 폴리펩티드의 아미드체를 얻을 수 있다.

폴리펩티드의 에스테르체를 얻기 위해서는, 예컨대 카르복시 말단 아미노산의 α-카르복실기를 원하는 알콜류와 축합하여 아미노산에스테르화시킨 후, 폴리펩티드의 아미드체와 동일하게 하여 원하는 폴리펩티드의 에스테르체를 얻을 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염은 자체 공지된 펩티드의 합성법에 따라 제조할 수 있다. 펩티드의 합성법으로는 예컨대 고상 합성법, 액상 합성법 중 어느 것에 의해서도 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 부분 펩티드를 구성할 수 있는 부분 펩티드 또는 아미노산과 잔여 부분을 축합시키고, 생성물이 보호기를 갖는 경우에는 보호기를 탈리함으로써 목적하는 펩티드를 제조할 수 있다. 공지된 축합방법이나 보호기의 탈리로서는 예컨대 이하 ① 내지 ⑤ 에 기재된 방법을들 수 있다.

① M.Bodanszky 및 M.A.Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966년)

② Schroeder 및 Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965년)

③ 이즈미야 노부오 외, 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠 (주) (1975년)

④ 야지마 하루아끼 및 사까끼바라 순페이, 생화학 실험강좌1, 단백질의 화학Ⅳ, 205, (1977년)

⑤ 야지마 하루아끼 감수, 속 의약품의 개발, 제14권, 펩티드 합성, 히로가와쇼뗑

또한, 반응 후에는 통상적인 정제법, 예컨대 용매추출ㆍ증류ㆍ칼럼 크로마토그래피ㆍ액체 크로마토그래피ㆍ재결정 등을 조합하여 본 발명의 폴리펩티드펩티드를 정제 단리할 수 있다. 상기 방법으로 얻은 폴리펩티드가 유리체인 경우에는, 공지된 방법 또는 이에 준하는 방법으로 적당한 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻은 경우에는 공지된 방법 또는 이에 준하는 방법으로 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로서는 상술한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열을 함유한 것이면 어떠한 것이어도 된다. 또한, 게놈 DNA, 상기한 세포ㆍ조직 유래의 cDNA, 합성 DNA 중 어느 것이어도 된다.

라이브러리에 사용되는 벡터는 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드, 파지미드 등 어느 것이어도 된다. 또한, 상기한 세포ㆍ조직에서 total RNA 또는 mRNA분획을 조제한 것을 사용하며 직접 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR 법이라고 약칭함) 으로 증폭할 수도 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:23 으로 표시되는 염기서열을 함유한 DNA 또는 서열번호:23 으로 표시되는 염기서열과 하이스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 가지고, 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 동질인 성질 (예, 면역원성 등) 을 갖는 폴리펩티디를 코딩하는 DNA 등을 가지며, 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 동질인 성질을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 라면 어느 것이어도 된다.

서열번호:23 으로 표시되는 염기서열을 함유한 DNA 로서는 서열번호:4 로 표시되는 염기서열을 함유한 DNA 등이 사용된다.

서열번호:23 으로 표시되는 염기서열과 하이스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:23 으로 표시되는 염기서열과 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 더 바람직하게는 약 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 함유한 DNA 등이 사용된다.

또한, 서열번호:23 으로 표시되는 염기서열과 하이스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 로서, 구체적으로는 서열번호:25 으로 표시되는 염기서열을 함유한 DNA 또는 서열번호:25 으로 표시되는 염기서열과 하이스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 가지고, 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 동질인 성질 (예, 면역원성 등) 을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 등을 가지며, 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 동질인 성질을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 등을 들 수 있다.

서열번호:25 로 표시되는 염기서열과 하이스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:25 로 표시되는 염기서열과 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 더 바람직하게는 약 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 함유한 DNA 등이 사용되고, 구체적으로는 서열번호:10 으로 표시되는 염기서열을 함유한 DNA 등이 사용된다.

또한, 서열번호:23 으로 표시되는 염기서열과 하이스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 로서, 구체적으로는 서열번호:48 로 표시되는 염기서열을 함유한 DNA 또는 서열번호:48 로 표시되는 염기서열과 하이스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 가지고, 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 동질인 성질 (예, 면역원성 등) 을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 등을 가지고, 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 동질인 성질을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 등을 들 수 있다.

서열번호:48 로 표시되는 염기서열과 하이스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:48 로 표시되는 염기서열과 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 더 바람직하게는 약 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 함유한 DNA 등이 사용되고, 구체적으로는 서열번호:41 또는 서열번호:46 으로 표시되는 염기서열을 함유한 DNA 등이 사용된다.

하이브리다이제이션은 자체 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법, 예컨대 Molecular Cloning 2nd (J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press,1989) 에 기재된 방법 등에 따라 실시할 수 있다. 또한, 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우, 첨부한 사용 설명서에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 더욱 바람직하게는 하이스트린젠트한 조건에 따라 실시할 수 있다.

하이스트린젠트한 조건이라 함은 예컨대 나트륨 농도가 약 19 내지 40mM, 바람직하게는 약 19 내지 20mM 이고, 온도가 약 50 내지 70℃, 바람직하게는 약 60 내지 65℃ 의 조건을 나타낸다.

서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로서는 서열번호:23 으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이, 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로서는 서열번호:4 로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이, 서열번호:26 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로서는 서열번호:25 로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이, 서열번호:12 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로서는 서열번호:10 으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이, 서열번호:49 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로서는 서열번호:48 로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이, 서열번호:47 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로서는 서열번호:46 으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이 사용된다.

본 발명의 폴리펩티드를 완전히 코딩하는 DNA 의 클로닝 수단으로는, 본 발명의 폴리펩티드의 부분 염기서열을 갖는 합성 DNA 프라이머를 사용하며 PCR 법으로 증폭하거나 또는 적당한 벡터에 조합한 DNA 를 본 발명의 폴리펩티드의 일부 또는 전체 영역을 코딩하는 DNA 단편 또는 합성 DNA 를 사용하여 표지한 것과의 하이브리다이제이션에 의해 선별할 수 있다. 하이브리다이제이션 방법은 예컨대 Molecular Cloning, 2nd (J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) 에 기재된 방법 등에 따라 실시할 수 있다. 또, 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우 첨부한 사용 설명서에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

DNA 의 염기서열의 변환은 PCR 이나 공지된 키트, 예컨대 Mutan^TM-G (다까라슈조(주)), Mutan^TM-K (다까라슈조(주)) 등을 사용하고 Gapped duplex 법이나 Kunkel 법 등의 자체 공지된 방법 또는 이들에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다.

클론화된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 는 목적에 따라 그대로 또는 원하는 바에 따라 제한효소로 소화시키거나 링커를 부가하여 사용할 수 있다. 이 DNA 는 그 5' 말단측에 번역 개시 코돈으로서의 ATG 를 갖고 있을 수도 있고, 또한 3' 말단측에는 번역 종지 코돈으로서의 TAA, TGA 또는 TAG 를 갖고 있을 수도 있다. 이들 번역 개시 코돈이나 번역 종지 코돈은 적당한 합성 DNA 어댑터를 이용하여 부가할 수도 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 발현 벡터는 예컨대 (가) 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로부터 목적하는 DNA 단편을 잘라내고, (나) 이 DNA 단편을 적당한 발현 벡터 중의 프로모터의 하류에 연결함으로써 제조할 수 있다.

벡터로서는 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 고초균 유래의 플라스미드 (예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래의 플라스미드 (예, pSH19, pSH15), λ파지 등의 박테리오파지, 레트로 바이러스, 백시니어 바이러스, 배큘로 바이러스 등과 같은 동물 바이러스 등 이외에 pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo 등이 사용된다.

본 발명에서 사용되는 프로모터로서는 유전자 발현에 사용되는 숙주에 대응하여 적절한 프로모터이면 어떠한 것이어도 된다. 예컨대, 동물세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, SRα프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV 프로모터, HSV-TK 프로모터, β-액틴 등을 들 수 있다.

이들 중 CMV (사이토메가로 바이러스) 프로모터, SRα프로모터 등을 사용하는 것이 바람직하다. 숙주가 에쉬리히아속균인 경우에는 trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등이, 숙주가 효모인 경우에는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 곤충세포인 경우에는 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터 등이 바람직하다.

발현 벡터에는 이상 이외에 원하는 바에 따라 엔핸서, 스프라이싱 시그널, 폴리A 부가 시그널, 선택 마커, SV40 복제 오리진 (이하, SV40ori 라고 약칭함) 등을 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다. 선택 마커로서는 예컨대 디히드로엽산 환원효소 (이하, dhfr 이라고 약칭함) 유전자 [메소트렉세이트 (MTX) 내성], 암피실린 내성 유전자 (이하, Amp^r라고 약칭함), 네오마이신 내성 유전자 (이하, Neo^r라고 약칭함, Geneticin 내성) 등을 들 수 있다. 특히, dhfr 유전자 결손 차이니스 햄스터 세포를 사용하며 dhfr 유전자를 선택 마커로서 사용하는 경우, 재조합 세포를 티미딘을 함유하지 않은 배지에 의해서도 선택할 수 있다.

또한, 필요에 따라 숙주에 맞는 시그널서열을 본 발명의 폴리펩티드의 N 단말측에 부가한다. 숙주가 에쉬리히아속균인 경우에는 PhoAㆍ시그널서열, OmpAㆍ시그널서열 등을, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제ㆍ시그널서열, 서브틸리신ㆍ시그널서열 등을, 숙주가 효모인 경우에는 MFαㆍ시그널서열, SUC2ㆍ시그널서열 등을, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린ㆍ시그널서열, α-인터페론ㆍ시그널서열, 항체 분자ㆍ시그널서열 등을 각각 이용할 수 있다.

이렇게 해서 구축된 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유한 벡터를 이용하여 형질전환체를 제조할 수 있다.

숙주로서는 예컨대 에쉬리히아속균, 바실러스속균, 효모, 곤충세포, 곤충, 동물세포 등이 사용된다.

에스케리키아속균의 구체예로서는 예컨대 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) K12ㆍDH1 [Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 60권, 160(1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9권, 309(1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology)], 120권, 517(1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41권, 459(1969)], C600 [Genetics, 39권, 440(1954)] 등이 사용된다.

바실러스속균으로는 예컨대 Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24권, 255(1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95권, 87(1984)] 등이 사용된다.

효모로서는 예컨대 Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R^-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastrois KM71 등이 사용된다.

곤충세포로서는 예컨대 바이러스가 AcNPV 인 경우에는 밤나방의 유충 유래 주화 세포 (Spodoptera frugiperda cell ; Sf 세포), Trichoplusia ni 의 중장 유래의 MGI 세포, Trichoplusia ni 의 알 유래의 High Five^TM세포, Mamestra brassicae 유래의 세포 또는 Estigmena acrea 유래의 세포 등이 사용된다. 바이러스가 BmNPV 인 경우에는 누에 유래 주화 세포 (Bombyx mori N 세포; BmN 세포) 등이 사용된다. 이 Sf 세포로서는 예컨대 Sf9 세포 (ATCC CRL1711), Sf21 세포 (이상, Vaughn, J.L. 외, In Vivo, 13, 213-217, (1977)) 등이 사용된다.

곤충으로서는 예컨대 누에의 유충 등이 사용된다 [마에다 외, Nature, 315권, 592(1985)].

동물세포로서는 예컨대 원숭이 세포 COS-7, Vero, 차이니스 햄스터 세포 CHO (이하, CHO 세포라고 약기함), dhfr 유전자 결손 차이니스 햄스터 세포 CHO (이하, CHO(dhfr^-) 세포라고 약기함), 마우스 L세포, 마우스 AtT-20, 마우스 미엘로마 세포, 래트 GH3, 인간 FL 세포 등이 사용된다.

에스케리키아속균을 형질 전환하기 위해서는, 예컨대 Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 69권, 2110(1972) 이나 Gene, 17권, 107(1982) 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

바실러스속균을 형질 전환하기 위해서는, 예컨대, Molecular & General Genetics, 168권, 111(1979) 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

효모를 형질 전환하기 위해서는, 예컨대 Methods in Enzymology, 194권, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75권, 1929(1978) 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

곤충세포 또는 곤충을 형질 전환하기 위해서는, 예컨대 Bio/Technology, 6, 47-55(1988) 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

동물세포를 형질 전환하기 위해서는, 예컨대 세포공학 별책 8 신세포공학 실험 프로토콜. 263-267 (1995) (슈쥰사 발행), Virology, 52권, 456 (1973) 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

이렇게 해서 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유한 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 얻을 수 있다.

숙주가 에스케리키아속균, 바실러스속균인 형질전환체를 배양할 때에 배양에 사용되는 배지로서는 액체 배지가 적당하고, 그 중에는 이 형질전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물 기타가 함유된다. 탄소원으로서는 예컨대 글루코스, 덱스트린, 가용성 전분, 자당 등, 질소원으로서는 예컨대 암모늄염류, 질산염류, 콘스팁 리커 펩톤, 카제인, 효모 추출액, 고기 추출액, 대두백, 감자 추출액 등과 같은 무기 또는 유기물질, 무기물로서는 예컨대 염화칼슘, 인산2수소나트륨,염화마그네슘 등을 들 수 있다. 또한, 효모 추출액, 비타민류, 생장촉진인자 등을 첨가해도 된다. 배지의 pH 는 약 5 내지 8 이 바람직하다.

에스케리키아속균을 배양할 때의 배지로서는 예컨대 글루코스, 카자미노산을 함유한 M9 배지 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] 가 바람직하다. 여기에 필요에 따라 프로모터를 효율적으로 작동시키기 위해서, 예컨대 3β-인돌릴아크릴산과 같은 약제를 첨가할 수 있다.

숙주가 에스케리키아속균인 경우, 배양은 통상 약 15 내지 43℃ 에서 약 3 내지 24 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 첨가할 수도 있다.

숙주가 바실러스속균인 경우 배양은 통상 약 30 내지 40℃ 에서 약 6 내지 24 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 첨가할 수도 있다.

숙주가 효모인 형질전환체를 배양할 때에 배지로서는 예컨대 Burkholder 최소 배지 [Bostian, K.L.외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77권, 4505(1980)] 나 0.5% 카자미노산을 함유한 SD 배지 [Bitter, G.A.외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81권, 5330 (1984)] 를 들 수 있다. 배지의 pH 는 약 5 내지 8 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 내지 35℃ 에서 약 24 내지 72 시간을 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 첨가한다.

숙주가 곤충세포나 곤충인 형질전환체를 배양할 때에, 배지로서는 Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C., Nature, 195, 788 (1962)) 에 비동화된 10% 소 혈청 등의 첨가물을 적절하게 첨가한 것 등이 사용된다. 배지의 pH 는 약 6.2 내지 6.4 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 27℃ 에서 약 3 내지 5 일간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 첨가한다.

숙주가 동물세포인 형질전환체를 배양할 때에, 배지로서는 예컨대 약 5 내지 20% 의 태아 소 혈청을 포함한 MEM 배지 [Science, 122권, 501(1952)], DMEM 배지 [Virology, 8권, 396 (1959)], RPMI 1640 배지 [The Journal of the American Medical Association) 199권, 519 (1967)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73권, 1 (1950)] 등이 사용된다. pH 는 약 6 내지 8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30 내지 40℃ 에서 약 15 내지 60 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 첨가한다.

이상과 같이 해서 형질전환체의 세포 외 또는 세포 내에 본 발명의 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다.

상기 배양물로부터 본 발명의 폴리펩티드를 분리 정제하기 위해서는, 예컨대 하기 방법으로 실시할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 배양 균체 또는 세포로부터 추출할 때에는 배양 후 공지된 방법으로 균체 또는 세포를 모아 그것을 적당한 완충액에 현탁하고, 초음파, 리조치임 및/또는 동결 융해 등으로 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심분리나 여과에 의해 폴리펩티드의 비정제 추출액을 얻는 방법 등이 적절하게 사용된다. 완충액 중에 요소나 염산 구아니딘 등과 같은 단백질 변성제나 트리톤X-100TM 등과 같은 계면활성제가 함유되어 있어도 된다. 배양액 중에 폴리펩티드가 분비되는 경우에는 배양 종료 후 그 자체 공지된 방법으로 균체 또는 세포와 상청액을 분리하여 상청액을 모은다.

이렇게 해서 얻은 배양 상청액 또는 추출액 중에 함유된 폴리페티드의 정제는 자체 공지된 분리ㆍ정제법을 적절하게 조합하여 실시할 수 있다. 이들 공지된 분리, 정제법으로는 염석이나 용매 침전법 등과 같은 용해도를 이용하는 방법, 투석법, 한외여과법, 겔여과법 및 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법 등의 주로 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온교환 크로마토그래피 등의 하중의 차이를 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기영동법 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등이 사용된다.

이렇게 해서 얻은 폴리펩티드가 유리체로 얻어진 경우에는, 자체 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻어진 경우에는 자체 공지된 방법 또는 이에 준하는 방법으로 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.

또한, 재조합체가 생산하는 폴리펩티드를 정제 전 또는 정제 후에 적당한 단백 수식 효소 또는 단백 분해 효소 등을 작용시킴으로써 임의로 수식을 부가하거나 폴리펩티드를 부분적으로 제거할 수 있다. 이들 효소로서는 예컨대, 트립신, 키모트립신, 아르기닐 엔드 펩티다아제, 단백질키나아제, 글리콕시다아제 등이 사용된다.

이렇게 해서 생성되는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염의 존재는 특이 항체를 사용한 엔자임 이뮤노 어세이나 웨스턴 블로트 해석 등에 의해 따라 측정할수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염에 대한 항체는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염을 인식할 수 있는 항체이면 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이어도 된다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염에 대한 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 항원으로 사용하고, 자체 공지된 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라 제조할 수 있다.

[모노클로날 항체의 제조]

(a) 모노클로날 항체 생산 세포의 제조

본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염은 온혈동물에 대하여 투여에 의해 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여할 때에 항체 생산능을 높이기 위해서, 완전 프로인트 아주반트나 불완전 프로인트 아주반트를 투여해도 된다. 투여는 통상 2 내지 6 주마다 1회씩, 총 2 내지 10 회 정도 실시된다. 사용되는 온혈동물로서는 예컨대 원숭이, 토끼, 개, 모르모트, 마우스, 래트, 양, 염소, 닭을 들 수 있으나 마우스 및 래트가 바람직하게 사용된다.

모노클로날 항체 생산 세포의 제조시에는 항원으로 면역된 온혈동물, 예컨대 마우스로부터 항체가를 알 수 있는 개체를 선택하여 최종 면역의 2 내지 5 일 후에 비장 또는 임파절을 채취하고, 이들에 포함된 항체 생산 세포를 동종 또는 이종 동물의 골수종 세포와 융합시킴으로써, 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 조제할수 있다. 항혈청 중의 항체가의 측정은 예컨대 후술하는 표지화 폴리펩티드와 항혈청을 반응시킨 후, 항체에 결합된 표지제의 활성을 측정함으로써 실시할 수 있다. 융합 조작은 이미 알려진 방법, 예컨대 켈러와 밀스타인의 방법 [Nature, 256, 495 (1975)] 에 따라 실시할 수 있다. 융합 촉진제로서는 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 이나 센다이 바이러스 등을 들 수 있으나 바람직하게는 PEG 가 사용된다.

골수종 세포로서는 예컨대 NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 등과 같은 온혈동물의 골수종 세포를 들 수 있는데 P3U1 이 바람직하게 사용된다. 사용되는 항체 생산 세포 (비장 세포) 수와 골수종 세포수의 바람직한 비율은 1:1 내지 20:1 정도이고, PEG (바람직하게는 PEG 1000 내지 PEG 6000) 가 10 내지 80% 정도의 농도로 첨가되고, 약 20 내지 40℃, 바람직하게는 약 30 내지 37℃ 에서 약 1 내지 10 분간 인큐베이트함으로써 효율적으로 세포 융합을 실시할 수 있다.

모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝에는 여러 방법을 사용할 수 있으나, 예컨대 폴리펩티드 항원을 직접 또는 담체와 함께 흡착시킨 고상 (예, 마이크로플레이트) 에 하이브리도마 배양 상청액을 첨가하고 이어서 방사성 물질이나 효소 등으로 표지한 항면역 글로불린 항체 (세포 융합에 사용되는 세포가 마우스인 경우 항마우스 면역 글로불린 항체가 사용됨) 또는 단백질A 를 첨가하여 고상에 결합된 모노클로날 항체를 검출하는 방법, 항면역 글로불린 항체 또는 단백질A 를 흡착시킨 고상에 하이브리도마 배양 상청액을 첨가하고 방사성 물질이나 효소 등으로 표지한 폴리펩티드를 첨가하여 고상에 결합된 모노클로날 항체를 검출하는 방법 등을 들 수 있다.

모노클로날 항체의 선별은 자체 공지 또는 이에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다. 통상 HAT (히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 를 첨가한 동물세포용 배지에서 실시할 수 있다. 선별 및 육종용 배지로서는 하이브리도마를 생육할 수 있는 것이라면 어떠한 배지를 사용해도 된다. 예컨대, 약 1 내지 20%, 바람직하게는 약 10 내지 20% 의 소 태아 혈청을 포함한 RPMI 1640 배지, 약 1 내지 10% 의 소 태아 혈청을 포함한 GIT 배지 (와꼬오쥰야꾸 고오교 (주)) 또는 하이브리도마 배양용 무혈청 배지 (SFM-101, 닛쓰이 세이야꾸 (주)) 등을 사용할 수 있다. 배양온도는 통상 약 20 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. 배양시간은 통상 5일 내지 3주일, 바람직하게는 1주일 내지 2주일이다. 배양은 통상 5% 탄산 가스하에서 실시할 수 있다. 하이브리도마 배양 상청액의 항체가는 상기 항체가 중의 항체가의 측정과 동일하게 하여 측정할 수 있다.

(b) 모노클로날 항체의 정제

모노클로날 항체의 분리 정제는 자체 공지된 방법, 예컨대 면역 글로불린의 분리 정제법 [예, 염석법, 알콜침전법, 등전점 침전법, 전기영동법, 이온교환체 (예, DEAE) 에 의한 흡탈착법, 초원심법, 겔여과법, 항원결합고상 또는 단백질 A 또는 단백질 G 등의 활성흡착제에 의해 항체만 채취하고 결합을 해리시켜 항체를 얻는 특이적 정제법] 에 따라 실시할 수 있다.

[폴리클로날 항체의 제조]

본 발명의 폴리클로날 항체는 그 자체 공지 또는 이에 준하는 방법에 따라제조할 수 있다. 예컨대, 면역 항원 (폴리펩티드 항원) 자체 또는 이것과 캐리어 단백질의 복합체를 제조하고 상기 모노클로날 항체의 제조법과 마찬가지로 온혈동물에게 면역을 실시하고, 이 면역동물로부터 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염에 대한 항체 함유물을 채취하여 항체의 분리 정제를 실시함으로써 제조할 수 있다.

온혈동물을 면역시키기 위해서 사용되는 면역 항원과 캐리어 단백질의 복합체에 관하여, 캐리어 단백질의 종류 및 캐리어와 햅텐의 혼합비는 캐리어에 가교시켜 면역시킨 햅텐에 대하여 항체를 효율적으로 할 수 있으면 어떠한 것을 어떠한 비율로 가교시켜도 되지만, 예컨대 소 혈청 알부민이나 소 사일로 글로불린, 헤모시아닌 등을 중량비로 햅텐 1 에 대하여 약 0.1 내지 20, 바람직하게는 약 1 내지 5 의 비율로 커플시키는 방법이 사용된다.

또한, 햅텐과 캐리어의 커플링에는 각종 축합체를 사용할 수 있으나, 글루탈알데히드나 카르보디이미드, 말레이미드 활성 에스테르, 티올기, 디티올피리딜기를 함유한 활성 에스테르 시약 등이 사용된다.

축합 생성물은 온혈동물에 대하여 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여할 때에 항체 생산능을 높이기 위해서, 완전 프로인트 아주반트나 불완전 프로인트 아주반트를 투여해도 된다. 투여는 통상 약 2 내지 6 주마다 1회씩, 총 약 3 내지 10 회 정도 실시된다.

폴리클로날 항체는 상기 방법으로 면역된 온혈동물의 혈액, 복수 등 바람직하게는 혈액에서 채취할 수 있다.

항혈청 중의 폴리클로날 항체가의 측정은 상기 항혈청 중의 항체가의 측정과 동일하게 하여 측정할 수 있다. 폴리클로날 항체의 분리 정제는 상기 모노클로날 항체의 분리 정제와 동일한 면역 글로불린의 분리 정제법에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA (이하, 본 발명의 DNA 라고 칭하기도 함) 에 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 염기서열을 갖는 안티센스 DNA 로서는 본 발명의 DNA 에 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 염기서열을 가지며 이 DNA 의 발현을 억제할 수 있는 작용을 갖는 것이면 어떠한 안티센스 DNA 여도 된다.

본 발명의 DNA 에 실질적으로 상보적인 염기서열이란 예컨대 본 발명의 DNA 에 상보적인 염기서열 (즉, 본 발명의 DNA 의 상보사슬) 의 전체 염기서열 또는 부분 염기서열과 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 염기서열 등을 들 수 있다. 특히, 본 발명의 DNA 의 상보사슬의 전체 염기서열 중 본 발명의 폴리펩티드의 N 말단 부위를 코딩하는 부분의 염기서열 (예컨대, 개시 코돈 부근의 염기서열 등) 의 상보사슬과 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 안티센스 DNA 가 바람직하다. 이들 안티센스 DNA 는 공지된 DNA 합성장치 등으로 제조할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드가 시그널 펩티드를 갖는 경우에는, 세포 밖으로 효율적으로 분비되고 액성 인자로서 시그널 전달이나 자기 방위 등을 위한 중요한 생물 활성을 발휘한다.

이하에, 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염 (이하, 본 발명의 폴리펩티드라고 약기함), 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA (이하, 본 발명의 DNA 라고 약기함), 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염에 대한 항체 (이하, 본 발명의 항체라고 약기함) 및 안티센스 DNA 의 용도를 설명한다.

(1) 본 발명의 폴리펩티드는 연골조직 특이적으로 발현되고 있어 조직 마커로서 사용할 수 있다. 즉, 조직 분화, 병상, 암의 전이 등의 검출을 위한 마커로서 유용하다. 또, 대응하는 리셉터, 리간드, 결합 폴리펩티드 등의 분취에도 이용할 수 있다. 또한, 자체 공지된 하이스루풋 스크리닝을 위한 패널로 하여금 생물 활성을 조사하는 데에 이용될 수 있다. 그리고, 염색체 맵핑을 실시하여 유전병의 연구에도 이용할 수 있다.

(2) 본 발명의 폴리펩티드가 관여하는 각종 질환의 치료ㆍ예방제

본 발명의 폴리펩티드는 생체 내 (특히 연골조직) 에서 액성 인자로서 존재하고 연골 분화를 억제하는 기능을 갖고 있기 때문에, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 DNA 등에 이상이 있거나 결손된 경우 또는 발현량이 이상하게 감소하거나 또는 항진하는 경우 여러 질병이 발증한다.

발명의 DNA 등이 결손된 경우 또는 발현량이 이상하게 감소하는 경우, 예컨대 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘, 대리석병 등의 골ㆍ관절질환, 병적혈관 신생 등 각종 질병이 발증한다.

따라서, 본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 DNA 는 예컨대 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘, 대리석병 등의 골ㆍ관절질환, 병적혈관 신생 등 각종 질병의치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

예컨대, 생체 내에서 본 발명의 폴리펩티드가 감소하거나 또는 결손되기 때문에, 세포에서의 정보전달이 충분히 또는 정확하게 발휘되지 않는 환자가 있는 경우에, (가) 본 발명의 DNA 를 이 환자에게 투여하여 생체 내에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킴으로써, (나) 세포에 본 발명의 DNA 를 삽입하여 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킨 후에, 이 세포를 환자에게 이식함으로써 또는 (다) 본 발명의 폴리펩티드를 이 환자에게 투여함으로써 이 환자에게 본 발명의 폴리펩티드의 역할을 충분히 또는 정확하게 발휘시킬 수 있다.

본 발명의 DNA 를 상기 치료ㆍ예방제로서 사용하는 경우에는, 이 DNA 를 단독 또는 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 어소시에이티드 바이러스 벡터 등과 같은 적당한 벡터에 삽입한 후, 통상적인 수단에 따라 인간 또는 온혈동물에게 투여할 수 있다. 본 발명의 DNA 는 그대로 또는 섭취 촉진을 위한 보조제 등의 생리학적으로 인정되는 담체와 함께 제제화하여 유전자총이나 하이드로 겔 카테터와 같은 카테터에 의해 투여할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 상기 치료ㆍ예방제로서 사용하는 경우에는 90 % 이상, 바람직하게는 95 % 이상, 더 바람직하게는 98 % 이상, 더욱 바람직하게는 99 % 이상으로 정제된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드는 예컨대 필요에 따라 당의를 실시한 정제, 캡슐, 에릭시르제, 마이크로캡슐제 등으로서 경구적으로 또는 물 또는 그 이외의 약제학으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제 등의 주사제 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예컨대 본 발명의 폴리펩티드를 생리학적으로 인정되는 담체, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제제 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 제조할 수 있다. 이들 제제에서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다.

정제, 캡슐제 등에 혼화할 수 있는 첨가제로서는 예컨대 젤라틴, 옥수수전분, 트라간트, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수전분, 젤라틴, 아르긴산 등과 같은 팽화제, 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 젖당 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 아까모노 (학명:Gaultheria ovatifolia ssp. adenothrix) 오일 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용된다. 조제단위형태가 캡슐인 경우에는 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상담체를 함유시킬 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용수와 같은 비히클 중의 활성물질, 참기름, 유자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등 통상적인 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.

주사용 수성액으로서는 예컨대 생리식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 함유한 등장액 (예컨대, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등을 들 수 있고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알코올 (예컨대, 에탄올 등), 폴리알코올 (예컨대, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트80^TM, HCO-50 등) 등과 병용해도 된다. 유성액으로서는 예컨대참깨유, 대두유 등을 들 수 있고, 용해보조제로서 벤조산벤질, 벤질알코올 등과 병용해도 된다. 또, 완충제 (예컨대, 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액 등), 무통화제 (예컨대, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예컨대, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예컨대, 벤질알코올, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다.

본 발명의 DNA 가 삽입된 벡터도 상기와 마찬가지로 제제화되어 통상 비경구적으로 사용된다.

이렇게 해서 얻은 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 인간 또는 온혈동물 (래트, 마우스, 모르모트, 토끼, 새, 양, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 투여량은 대상질환, 투여대상, 투여루트 등에 따라 차이는 있지만, 예컨대 골ㆍ관절질환의 치료 목적에서 본 발명의 폴리펩티드를 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (60kg) 에게 하루에 본 발명의 폴리펩티드를 약 1mg 내지 1000mg, 바람직하게는 약 10 내지 500mg, 더 바람직하게는 10 내지 200mg 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 본 발명의 폴리펩티드의 1회 투여량은 투여대상, 대상질환에 따라 다르지만, 예컨대 골ㆍ관절질환의 치료 목적에서 본 발명의 폴리펩티드를 주사제 형태로 성인 (60kg) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 폴리펩티드를 약 1 내지 1000mg, 바람직하게는 약 1 내지 200mg 정도, 더 바람직하게는 약 10 내지 100mg 정도를 환부에 주사함으로써 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(2) 질병에 대한 의약 후보 화합물의 스크리닝

본 발명의 폴리펩티드는 생체 내 (특히, 연골조직 등) 에서 액성인자로서 존재하고 연골분화를 억제하는 기능을 갖고 있기 때문에, 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 촉진하는 화합물 또는 그의 염은 예컨대 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘, 대리석병 등의 골ㆍ관절질환, 병적혈관 신생 등의 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 저해하는 화합물 또는 그의 염은 본 발명의 폴리펩티드의 생산 과잉에서 기인하는 질환, 예컨대 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘, 골형성 부전증, 골다공증, 골절, 대퇴골 두괴사증, 연골형성 부전증 등의 골ㆍ관절질환, 병적혈관 신생 등의 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝을 위한 시약으로서 유용하다.

즉, 본 발명은

(1) 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염의 기능을 촉진하는 화합물 또는 그의 염 (이하, 촉진제라고 약기함) 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염의 기능을 저해하는 화합물 (이하, 저해제라고 약기함) 의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝용 키트는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염을 함유한 것이다.

본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻는 화합물 또는 그의 염은 예컨대 펩티드, 단백, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물, 세포추출액, 식물추출액, 동물조직추출액, 혈장 등에서 선택된 화합물로서, 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물이다.

이 화합물의 염으로서는 상기한 본 발명의 폴리펩티드의 염과 동일한 것이 사용된다.

본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻은 화합물을 상술한 치료ㆍ예방제로서 사용하는 경우, 통상적인 수단에 따라 실시할 수 있다. 예컨대, 상기한 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 의약과 동일한 방법으로 정제, 캡슐제, 에릭시르제, 마이크로캡슐제, 무균성 용액, 현탁액제 등으로 할 수 있다.

이렇게 해서 얻은 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 인간 또는 온혈동물 (마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 새, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그의 염의 투여량은 그 작용, 대상질환, 투여대상, 투여루트 등에 따라 차이는 있지만, 예컨대 골ㆍ관절질환의 치료 목적에서 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 촉진하는 화합물을 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (60kg) 에게 하루에 이 화합물을 약 0.1mg 내지 100mg, 바람직하게는 약 1.0 내지 50mg, 더 바람직하게는 1.0 내지 20mg 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 이 화합물의 1회 투여량은 투여대상, 대상질환에 따라 다르지만, 예컨대 골ㆍ관절질환의 치료 목적에서 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 촉진하는 화합물을 주사제 형태로 통상 성인 (60kg) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 화합물을 약 0.01 내지 30mg 정도, 바람직하게는 약 0.1 내지 20mg 정도, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 10mg 정도를 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

한편, 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 저해하는 화합물을 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (60kg) 에게 하루에 이 화합물을 약 0.1mg 내지 100mg, 바람직하게는 약 1.0 내지 50mg, 더 바람직하게는 1.0 내지 20mg 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 이 화합물의 1회 투여량은 투여대상, 대상질환에 따라 다르지만, 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 저해하는 화합물을 주사제 형태로 통상 성인 (60kg) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 화합물을 약 0.01 내지 30mg 정도, 바람직하게는 약 0.1 내지 20mg 정도, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 10mg 정도를 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(3) 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염의 정량

본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체 (이하, 본 발명의 항체라고 약기함) 는 본 발명의 폴리펩티드를 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 피검액 중의 본 발명의 폴리펩티드의 정량, 특히 샌드위치 면역측정법에 의한 정량 등에 사용할 수 있다.

즉, 본 발명은

(ⅰ) 본 발명의 항체와 피검액 및 표지화된 본 발명의 폴리펩티드를 경쟁적으로 반응시켜 이 항체에 결합된 표지화된 본 발명의 폴리펩티드의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 본 발명의 폴리펩티드의 정량법 및,

(ⅱ) 피검액과 담체상에 불용화된 본 발명의 항체 및 표지화된 본 발명의 다른 항체를 동시 또는 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 본 발명의 폴리펩티드의 정량법을 제공한다.

또, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 모노클로날항체 (이하, 본 발명의 모노클로날 항체라고 칭함) 를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드의 정량을 실시할 수 있는 것 외에 조직염색 등에 의한 검출을 실시할 수도 있다. 이들 목적에는 항체 분자 자체를 사용할 수도 있고 또한 항체 분자의 F(ab')₂, Fab' 또는 Fab 분획을 사용할 수도 있다.

본 발명의 항체를 사용하는 본 발명의 폴리펩티드의 정량법은 특별히 제한되어야 하는 것은 아니지만, 피측정액 중의 항원량 (예컨대, 본 발명의 폴리펩티드량) 에 대응한 항체, 항원 또는 항체-항원 복합체의 양을 화학적 또는 물리적 수단으로 검출하고, 이것을 이미 알려진 양의 항원을 함유한 표준액을 사용하여 제조한 표준 곡선에서 산출하는 측정법이면, 어떠한 측정법을 사용할 수도 있다. 예컨대, 네프로메트리, 경합법, 이뮤노 메트릭법 및 샌드위치법이 바람직하게 사용되지만, 감도, 특이성의 면에서 후술하는 샌드위치법을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

표지물질을 사용하는 측정법에 사용되는 표지제로서는 예컨대 방사성동위원소, 효소, 형광물질, 발광물질 등이 사용된다. 방사성 동위원소로서는 예컨대 [¹²⁵I], [¹³¹I], [³H], [¹⁴C] 등이 사용된다. 상기 효소로서는 안정하고 비활성 (比活性) 이 큰 것이 바람직하고, 예컨대 β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산탈수소효소 등이 사용된다. 형광물질로서는 예컨대 플루오레스카민, 플루오레센이소티오시아네이트 등이 사용된다. 발광물질로서는 예컨대 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등이 사용된다. 또한, 항체 또는 항원과 표지제의 결합에 비오틴-아비딘계를 사용할 수도 있다.

항원 또는 항체의 불용화에 있어서는 물리흡착을 사용해도 되고 또한 통상 폴리펩티드 또는 효소 등을 불용화, 고정화시키기에 사용되는 화학결합을 사용하는 방법이어도 된다. 담체로서는 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스 등의 불용성다당류, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 실리콘 등의 합성수지 또는 유리 등을 들 수 있다.

샌드위치법에서는 불용화된 본 발명의 모노클로날 항체에 피검액을 반응시키고 (1차 반응), 추가로 표지화된 다른 발명의 모노클로날 항체를 반응시킨 (2차 반응) 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정함으로써, 피검액 중의 본발명의 폴리펩티드량을 정량할 수 있다. 1차 반응과 2차 반응은 반대 순서로 실시해도 또한 동시에 실시해도 되고, 시간을 어긋나게 실시해도 된다. 표지화제 및 불용화 방법은 상기의 이들에 준하여 실시할 수 있다. 또, 샌드위치법에 의한 면역측정법에서 고상용 항체 또는 표지용 항체에 사용되는 항체는 반드시 1 종류일 필요는 없고, 측정감도를 향상시키는 등의 목적으로 2 종류 이상의 항체의 혼합물을 사용해도 된다.

본 발명의 샌드위치법에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 측정법에서는 1차 반응과 2차 반응에 사용되는 본 발명의 모노클로날 항체는 본 발명의 폴리펩티드가 결합되는 부위가 상이한 항체가 바람직하게 사용된다. 즉, 1차 반응 및 2차 반응에 사용되는 항체는 예컨대 2차 반응에서 사용되는 항체가 본 발명의 폴리펩티드의 C 단부를 인식하는 경우, 1차 반응에서 사용되는 항체는 바람직하게는 C 단부 이외에, 예컨대 N 단부를 인식하는 항체가 사용된다.

본 발명의 모노클로날 항체를 샌드위치법 이외의 측정시스템, 예컨대 경합법, 이뮤노 메트릭법 또는 네프로메트리 등에 사용할 수 있다.

경합법에서는 피검액 중의 항원과 표지 항원을 항체에 대하여 경합적으로 반응시킨 후, 미반응 표지항원 (F) 과, 항체와 결합한 표지항원 (B) 을 분리하고 (B/F 분리), B, F 중 어느 하나의 표지량을 측정하여 피검액 중의 항원량을 정량한다. 본 반응법에는 항체로서 가용성 항체를 사용하여 B/F 분리를 폴리에틸렌글리콜, 상기 항체에 대한 제 2 항체를 사용하는 액상법 및 제 1 항체로서 고상화 항체를 사용하거나 또는 제 1 항체는 가용성의 것을 사용하고 제 2 항체로서 고상화 항체를 사용하는 고상화법이 이용된다.

이뮤노 메트릭법에서는 피검액 중의 항원과 고상화 항원을 일정량의 표지화항체에 대하여 경합 반응시킨 후, 고상과 액상을 분리하거나 또는 피검액 중의 항원과 과잉량의 표지화 항체를 반응시키고, 이어서 고상화 항원을 첨가하고 미반응 표지화 항체를 고상으로 결합시킨 후 고상과 액상을 분리한다. 이어서, 어느 하나의 상의 표지량을 측정하여 피검액 중의 항원량을 정량한다.

또, 네프로메트리에서는 겔내 또는 용액 중에서 항원 항체 반응의 결과 발생된 불용성 침강물의 양을 측정한다. 피검액 중의 항원량이 아주 적어 소량의 침강물 밖에 얻을 수 없는 경우에도 레이저의 산란을 이용하는 레이저 네프로메트리 등이 바람직하게 사용된다.

이들 개개의 면역학적 측정법을 본 발명의 정량방법에 적용함에 있어서는 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요하지 않게 된다. 각각의 방법에서의 통상 조건, 조작법에 당업자의 통상 기술적 배려를 가하여 본 발명의 폴리펩티드의 측정계를 구축하면 된다. 이들 일반적인 기술수단의 상세함에 대해서는 총설, 도서 등을 참조할 수 있다.

예컨대, 이리에 히로시 저 「라디오 이뮤노 어세이」(코우단사, 1974년 발행), 이리에 히로시 저 「속 라디오 이뮤노 어세이」(코우단사, 1979년 발행), 이시까와 에이지 외 편 「효소면역 측정법」(이가꾸쇼잉, 1978년 발행), 이시까와 에이지 외 편 「효소면역 측정법」(제 2 판) (이가꾸쇼잉, 1982년 발행), 이시까와 에이지 외 편 「효소면역 측정법」(제 3 판) (이가꾸쇼잉, 1987년 발행), 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70 (Immunochemical Techniques (Part A)), 동서 Vol.73 (Immunochemical Techniques (Part B)), 동서 Vol.74 (ImmunochemicalTechniques (Part C)), 동서 Vol.84 (Immunochemical Techniques (Part D : Selected Immunoassays)), 동서 Vol.92 (Immunochemical Techniques (Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 동서 Vol.121 (Immunochemical Techniques (Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (이상, 아카데믹 프레스사 발행) 등을 참조할 수 있다.

이상과 같이 하여 본 발명의 항체를 사용함으로써 본 발명의 폴리펩티드를 감도좋게 정량할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드의 농도를 정량함으로써, (1) 본 발명의 폴리펩티드 농도의 증대가 검출된 경우, 예컨대 골ㆍ관절질환 (예컨대, 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘, 골형성 부전증, 골다공증, 골절, 대퇴골 두괴사증, 연골형성 부전증 등), 병적혈관 신생 (예컨대, 종양혈관 신생 등) 의 질병이고 또는 장래 병에 걸릴 가능성이 높다고 진단할 수 있다. 또 (2) 본 발명의 폴리펩티드 농도의 감소가 검출된 경우, 예컨대 골ㆍ관절질환 (예컨대, 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘, 대리석병 등), 병적혈관 신생 (예컨대, 종양혈관 신생 등) 의 질병이고 또는 장래 병에 걸릴 가능성이 높다고 진단할 수 있다.

또, 본 발명의 항체는 체액이나 조직 등의 피검체 중에 존재하는 본 발명의 폴리펩티드를 검출하기 위하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 정제하기 위하여 사용하는 항체 칼럼의 제조, 정제시의 각 분획 중의 본 발명의 폴리펩티드의 검출, 피검세포내에 있어서의 본 발명의 폴리펩티드의 거동 분석 등을 위하여 사용할 수 있다.

(4) 유전자 진단제

본 발명의 DNA 는 예컨대 프로브로서 사용함으로써, 인간 또는 온혈동물 (래트, 마우스, 모르모트, 토끼, 새, 양, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 원숭이 등) 에서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 mRNA 의 이상 (유전자 이상) 을 검출할 수 있기 때문에, 예컨대 이 DNA 또는 mRNA 의 손상, 돌연변이 또는 발현저하나, 이 DNA 또는 mRNA 의 증가 또는 발현과다 등의 유전자 진단제로서 유용하다.

본 발명의 DNA 를 사용하는 상기 유전자 진단은 예컨대 자체 공지된 노던 하이브리다이제이션이나 PCR-SSCP 법 (Genomics, 제5권, p.874 내지 879 (1989년), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 제86권, p.2766 내지 2770 (1989년)), DNA 마이크로 어레이 등에 의해 실시할 수 있다.

예컨대, 노던 하이브리다이제이션이나 DNA 마이크로 어레이에 의해 발현저하가 검출된 경우나 PCR-SSCP 법이나 DNA 마이크로어레이에 의해 DNA 의 돌연변이가 검출된 경우에는, 예컨대 골ㆍ관절질환 (예컨대, 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘, 대리석병 등), 병적혈관 신생 (예컨대, 종양혈관 신생 등) 의 질병일 가능성이 높다고 진단할 수 있다.

(5) 안티센스 DNA 를 함유한 의약

본 발명의 DNA 에 상보적으로 결합하여 이 DNA 의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 DNA 는 생체 내에서 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 DNA 의 기능을 억제할 수 있기 때문에, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드의 발현과다에서 기인하는 질환 (예컨대, 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘, 골형성 부전증, 골다공증, 골절, 대퇴골 두괴사증, 연골형성 부전증 등의 골ㆍ관절질환, 종양혈관 신생 등의 병적혈관 신생) 의 치료ㆍ예방제로서 사용할 수 있다.

상기 안티센스 DNA 를 상기 치료ㆍ예방제로서 상기한 본 발명의 DNA 를 함유한 각종 질병의 치료ㆍ예방제와 마찬가지로 사용할 수 있다.

예컨대, 상기 안티센스 DNA 를 단독 또는 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 어소시에이티드 바이러스 벡터 등과 같은 적당한 벡터에 삽입한 후, 통상적인 수단에 따라 투여할 수 있다. 이 안티센스 DNA 는 그대로 또는 섭취 촉진을 위해 보조제 등의 생리학적으로 인정되는 담체와 함께 제제화하여 유전자총이나 하이드로 겔 카테터와 같은 카테터에 의해 투여할 수 있다.

또한, 이 안티센스 DNA 는 조직이나 세포에서의 본 발명의 DNA 의 존재나 그 발현상황을 조사하기 위한 진단용 올리고누클레오티드 프로브로서 사용할 수도 있다.

(6) 본 발명의 항체를 함유한 의약

본 발명의 폴리펩티드의 활성을 중화시키는 작용을 갖는 본 발명의 항체는, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드의 발현과다에서 기인하는 질환 (예컨대 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘, 골형성 부전증, 골다공증, 골절, 대퇴골 두괴사증, 연골형성 부전증 등의 골ㆍ관절질환, 종양혈관 신생 등의 병적혈관 신생) 의 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 항체를 함유한 상기 질환의 치료ㆍ예방제는 그대로 액제로서 또는적당한 제형의 의약조성물로서 인간 또는 포유동물 (예, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 투여량은 투여대상, 대상질환, 증상, 투여루트 등에 따라서도 다르지만, 예컨대 골ㆍ관절질환의 치료 목적에서 본 발명의 항체를 1회량으로서, 통상 0.01mg 내지 20mg/kg 체중 정도, 바람직하게는 0.1mg 내지 10mg/kg 체중 정도, 더욱 바람직하게는 0.1mg 내지 5 mg/kg 체중 정도를, 1 일 1 내지 5회 정도 바람직하게는 1 일 1 내지 3회 정도, 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 비경구 투여 및 경구 투여의 경우에도 이에 준하는 양을 투여할 수 있다. 증상이 특히 무거운 경우에는 그 증상에 따라 증량해도 된다.

본 발명의 항체는 그 자체 또는 적당한 의약조성물로서 투여할 수 있다. 상기 투여에 사용되는 의약조성물은 상기 또는 그의 염과 약리학적으로 허용될 수 있는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유한 것이다. 이러한 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 제형으로서 제공된다.

즉, 예컨대 경구 투여를 위한 조성물로서는 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로는 정제 (당의정, 필름코팅정을 포함함), 환제, 과립제, 산제, 캡슐제 (소프트캡슐제를 포함함), 시럽제, 유제, 현탁제 등을 들 수 있다. 이러한 조성물은 자체 공지된 방법으로 제조되고, 제제 분야에서 통상 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 것이다. 예컨대, 정제용 담체, 부형제로서는 젖당, 전분, 자당, 스테아르산마그네슘 등을 이용된다.

비경구 투여를 위한 조성물로서는 예컨대 주사제, 좌제 등이 사용되고, 주사제는 정맥주사제, 피하주사제, 피내주사제, 근육주사제, 점적주사제 등의 제형을 포함한다. 이러한 주사제는 자체 공지된 방법에 따라 예컨대 상기 항체 또는 그의 염을 통상 주사제에 사용되는 무균 수성 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 조제한다. 주사용 수성액으로서는 예컨대 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약을 포함한 등장액 등이 사용되고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알콜 (예, 에탄올), 폴리알콜 (예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면활성제 (예, 폴리소르베이트80, HCO-50 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated castor oil)] 등과 병용할 수도 있다. 유성액으로서는 예컨대 참깨유, 대두유 등이 사용되고, 용해 보조제로서 벤조산벤질, 벤질알콜 등을 병용해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다. 직장 투여에 사용되는 좌제는 상기 항체 또는 그의 염을 통상적인 좌약용 기제에 혼합함으로써 조제된다.

상기 경구용 또는 비경구용 의약조성물은 활성성분의 투여량에 적합한 투약 단위의 제형으로 조제되는 것이 바람직하다. 이러한 투약 단위의 제형으로서는 정제, 환제, 캡슐제, 주사제 (앰플), 좌제 등이 예시되고, 각각의 투약 단위 제형당 통상 5 내지 500㎎ 정도, 특히 주사제에서는 5 내지 100㎎ 정도, 기타 제형에서는 10 내지 250㎎ 정도의 상기 항체가 함유되어 있는 것이 바람직하다.

또, 상기한 각 조성물은 상기 항체와의 배합으로 바람직하지 않은 상호 작용을 발생시키지 않는 한 다른 활성성분을 함유할 수도 있다.

(7) DNA 전이동물

본 발명은 외래성 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA (이하, 본 발명의 외래성 DNA 라고 약기함) 또는 그 변이 DNA (본 발명의 외래성 변위 DNA 라고 약기함) 를 갖는 비인간 포유동물을 제공한다.

즉, 본 발명은

(1) 본 발명의 외래성 DNA 또는 그의 변이 DNA 를 갖는 비인간 포유동물,

(2) 비인간 포유동물이 설치동물인 제 (1) 에 기재된 동물,

(3) 설치동물이 마우스 또는 래트인 제 (2) 에 기재된 동물 및

(4) 본 발명의 외래성 DNA 또는 그의 변이 DNA 를 함유하고 포유동물에서 발현될 수 있는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 외래성 DNA 또는 그의 변이 DNA 를 갖는 비인간 포유동물 (이하, 본 발명의 DNA 전이동물이라고 약기함) 은 미수정란, 수정란, 정자 및 그 시원세포를 포함한 배아세포 등에 대하여 바람직하게는 비인간 포유동물의 발생에서의 배 발생의 단계 (더욱 바람직하게는 단세포 또는 수정란 세포의 단계에서 그리고 일반적으로 8 세포기 이전) 에 인산칼슘법, 전기펄스법, 리포펙션법, 응집법, 마이크로 인젝션법, 파티클건법, DEAE-덱스트란법 등으로 목적하는 DNA 를 전이함으로써 작출할 수 있다. 또한, 이 DNA 전이 방법으로 체세포, 생체의 장기, 조직 세포 등에 목적하는 본 발명의 외래성 DNA 를 전이하여 세포 배양, 조직 배양 등에 이용할 수도 있으며, 또한 이들 세포를 상술한 배아세포와 자체 공지된 세포 융합법으로 융합시킴으로써 본 발명의 DNA 전이동물을 작출할 수도 있다.

비인간 포유동물로서는 예컨대 소, 돼지, 양, 염소, 토끼, 개, 고양이, 모르모트, 햄스터, 마우스, 래트 등이 사용된다. 그 중에서도 병체 동물 모델계의 작성 면에서 개체 발생 및 생물 사이클이 비교적 짧고, 또한 번식이 쉬운 설치동물, 특히 마우스 (예컨대, 순수 계통으로서 C57BL/6 계통, DBA2 계통 등, 교배 계통으로서 B6C3F₁계통, BDF₁계통, B6D2F₁계통, BALB/C 계통, ICR 계통 등) 또는 래트 (예컨대 Wistar, SD 등) 등이 바람직하다.

포유동물에서 발현될 수 있는 재조합 벡터에 있어서의「포유동물」로서는 상기 비인간 포유동물 이외에 인간 등을 들 수 있다.

본 발명의 외래성 DNA 란 비인간 포유동물이 본래 갖고 있는 본 발명의 DNA 가 아니라 일단 포유동물로부터 단리 배출된 본 발명의 DNA 를 말한다.

본 발명의 변이 DNA 로서는 원래 본 발명의 DNA 염기서열에 변이 (예컨대, 돌연변이 등) 가 발생한 것, 구체적으로는 염기 부가, 결손, 다른 염기로의 치환 등이 발생한 DNA 등이 사용되고, 또한 이상한 DNA 도 포함된다.

이 이상한 DNA 로서는 이상한 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 DNA 를 의미하고, 예컨대 정상적인 본 발명의 폴리펩티드 기능을 억제하는 폴리펩티드를 발현시키는 DNA 등이 사용된다.

본 발명의 외래성 DNA 는 대상으로 하는 동물과 동종 또는 이종 중 어느 포유동물 유래의 것이어도 된다. 본 발명의 DNA 를 대상 동물에게 전이시키는 데에 있어서는 이 DNA 를 동물세포에서 발현시킬 수 있는 프로모터의 하류에 결합된 DNA 컨스트럭트로서 사용하는 것이 일반적으로 유리하다. 예컨대, 본 발명의인간 DNA 를 전이시키는 경우, 이것과 상동성이 높은 본 발명의 DNA 를 갖는 각종 포유동물 (예컨대, 토끼, 개, 고양이, 모르모트, 햄스터, 래트, 마우스 등) 유래의 DNA 를 발현시킬 수 있는 각종 프로모터의 하류에 본 발명의 인간 DNA 를 결합한 DNA 컨스트럭트 (예, 벡터 등) 를 대상 포유동물의 수정란, 예컨대 마우스 수정란에 마이크로인젝션함으로써 본 발명의 DNA 를 고발현하는 DNA 전이 포유동물을 작출할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 발현 벡터로서는 대장균 유래의 플라스미드, 고초균 유래의 플라스미드, 효모 유래의 플라스미드, λ파지 등과 같은 박테리오파지, 모로니 백혈병 바이러스 등과 같은 레트로 바이러스, 백시니어 바이러스 또는 배큘로 바이러스 등과 같은 동물 바이러스 등이 사용된다. 그 중에서도 대장균 유래의 플라스미드, 고초균 유래의 플라스미드 또는 효모 유래의 플라스미드 등이 바람직하게 사용된다.

상기 DNA 발현을 조절하는 프로모터로서는 예컨대 ① 바이러스 (예, 시미안 바이러스, 사이토메가로 바이러스, 모로니 백혈병 바이러스, JC 바이러스, 유방암 바이러스, 폴리오 바이러스 등) 에서 유래하는 DNA 의 프로모터, ② 각종 포유동물 (인간, 토끼, 개, 고양이, 모르모트, 햄스터, 래트, 마우스 등) 유래의 프로모터, 예컨대 알부민, 인슐린Ⅱ, 우로프라킨Ⅱ, 엘라스타아제, 에리트로포이에틴, 엔도셀린, 근(筋) 크레아틴 키나아제, 글리어선유성 산성 단백질, 글루타티온S-트란스페라아제, 혈소판 유래 성장인자β, 케라틴K1, K10 및 K14, 콜라겐Ⅰ형 및 Ⅱ형, 사이클릭 AMP 의존 단백질 키나아제βI서브유닛, 디스트로핀, 타르타르산 저항성 알칼리 포스파타아제, 심방 나트륨 이뇨성 인자, 내피 리셉터 티로신 키나아제 (일반적으로 Tie2 라고 함), 나트륨칼륨아데노신3인산화효소 (Na, K-ATPase), 뉴로필라멘트 경쇄, 메탈로티오네인Ⅰ 및 ⅡA, 메탈로프로티나아제 1조직 인히비터, MHC 클래스Ⅰ항원 (H-2L), H-ras, 레닌, 도파민β-수산화효소, 갑상선퍼옥시다아제 (TPO), 폴리펩티드사슬 연장인자1α(EF-1α), β악틴, α및 β미오신 중쇄, 미오신 경쇄 1 및 2, 미엘린 기초 단백질, 티로글로불린, Thy-1, 면역 글로불린, H쇄 가변부 (VNP), 혈청 아밀로이드 P 컴포넌트, 미오글로빈, 트로포닌C, 평활근α악틴, 프리프로엔케파린A, 바소프레신 등과 같은 프로모터 등이 사용된다. 그 중에서도 전신에서 고발현될 수 있는 사이토메가로 바이러스 프로모터, 인간 폴리펩티드사슬 연장인자1α(EF-1α) 의 프로모터, 인간 및 닭β악틴프로모터 등이 바람직하다.

상기 벡터는 DNA 전이 포유동물에서 목적하는 메신저 RNA 의 전사를 종결하는 서열 (일반적으로 터미네이터라고 함) 을 갖고 있는 것이 바람직하고, 예컨대 바이러스 유래 및 각종 포유동물 유래의 각 DNA 서열을 사용할 수 있고, 바람직하게는 시미안 바이러스의 SV40 터미네이터 등이 사용된다.

그 밖에 목적하는 외래성 DNA 를 더욱 고발현시키는 목적에서 각 DNA 의 스프라이싱 시그널, 엔핸서 영역, 진핵 DNA 의 인트론의 일부 등을 프로모터 영역의 5'상류, 프로모터 영역과 번역 영역 사이 또는 번역 영역의 3'하류에 연결하는 것도 목적에 따라 가능하다.

이 번역 영역은 전이동물에서 발현될 수 있는 DNA 컨스트럭트로서 상기 프로모터의 하류 및 원하는 바에 따라 전사종결 부위의 상류에 연결시키는 통상적인DNA 공학적 수법으로 제조할 수 있다.

수정란 세포단계에서 본 발명의 외래성 DNA 의 전이는 대상 포유동물의 배아세포 및 체세포 전체에 존재하도록 확보된다. DNA 전이 후의 작출동물의 배아세포에서 본 발명의 외래성 DNA 가 존재하는 것은 작출동물의 후대가 모두 그 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명의 외래성 DNA 를 유지하는 것을 의미한다. 본 발명의 외래성 DNA 를 이어받은 이런 종류의 동물 자손은 그 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명의 외래성 DNA 를 갖는다.

본 발명의 외래성 정상 DNA 를 전이시킨 비인간 포유동물은 교배에 의해 외래성 DNA 를 안정적으로 유지하는 것을 확인하고, 이 DNA 보유동물로서 통상적인 사육환경에서 계대 사육할 수 있다.

수정란 세포단계에서 본 발명의 외래성 DNA 의 전이는 대상 포유동물의 배아세포 및 체세포 전체에 과잉으로 존재하도록 확보된다. DNA 전이 후의 작출동물의 배아세포에서 본 발명의 외래성 DNA 가 과잉으로 존재하는 것은 작출동물의 자손이 모두 그 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명의 외래성 DNA 를 과잉으로 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 외래성 DNA 를 이어받은 이런 종류의 동물 자손은 그 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명이 외래성 DNA 를 갖는다.

도입 DNA 를 상동 염색체 양쪽에 갖는 호모자이고트 동물을 취득하여 이 암수동물을 교배함으로써 모든 자손이 이 DNA 를 과잉으로 갖도록 번식 계대할 수 있다.

본 발명의 정상 DNA 를 갖는 비인간 포유동물은 본 발명의 정상 DNA 가 고발현되어 있어, 내재성있는 정상 DNA 의 기능을 촉진함으로써 최종적으로 본 발명의 폴리펩티드의 기능 항진증을 발증하기 때문에 그 병태 모델 동물로서 이용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 정상 DNA 전이동물을 사용하고, 본 발명의 폴리펩티드의 기능 항진증이나 본 발명의 폴리펩티드가 관련되는 질환의 병태 기서의 해명 및 이들 질환의 치료 방법의 검토를 할 수 있다.

또한, 본 발명의 외래성 정상 DNA 를 전이시킨 포유동물은 유리된 본 발명의 폴리펩티드의 증가 증상을 갖고 있기 때문에 본 발명의 폴리펩티드에 관련된 질환에 대한 치료약의 스크리닝 시험에도 이용 가능하다.

한편, 본 발명의 외래성 이상 DNA 를 갖는 비인간 포유동물은 교배에 의해 외래성 DNA 를 안전하게 유지하는 것을 확인하여 이 DNA 보유동물로서 통상적인 사육 환경에서 계대 사육할 수 있다. 또한, 목적하는 외래성 DNA 를 상술한 플라스미드에 조합하여 원료로서 사용할 수 있다. 프로모터와의 DNA 컨스트럭트는 통상적인 DNA 공학적 수법으로 제조할 수 있다. 수정란 세포 단계에서 본 발명의 이상 DNA 의 전이는 대상 포유동물의 배아세포 및 체세포 전체에 존재하도록 확보된다. DNA 전이 후의 작출동물의 배아세포에서 본 발명의 이상 DNA 가 존재하는 것은 작출동물의 자손이 모두 그 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명의 이상 DNA 를 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 외래성 DNA 를 이어받은 이 종류의 동물 자손은 이 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명의 이상 DNA 를 갖는다. 도입 DNA 를 상동 염색체 양쪽에 갖는 호모자이고트 동물을 취득하여 이 암수컷 동물을 교배함으로써 모든 자손이 이 DNA 를 갖도록 번식 계대할 수 있다.

본 발명의 이상 DNA 를 갖는 비인간 포유동물은 본 발명의 이상 DNA 가 고발현되어 있어, 내재성있는 정상 DNA 의 기능을 저해함으로써 최종적으로 본 발명의 폴리펩티드의 기능 불활성형 불응증이 되는 경우가 있어 그 병태 모델 동물로서 이용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 이상 DNA 전이동물을 사용하고, 본 발명의 폴리펩티드의 기능 불활성형 불응증의 병태 기서의 해명 및 이 질환의 치료 방법의 검토를 할 수 있다.

또, 구체적인 이용 가능성으로서는 본 발명의 이상 DNA 고발현동물은 본 발명의 폴리펩티드의 기능 불활성형 불응증에 있어서의 본 발명의 이상 폴리펩티드에 의한 정상 폴리펩티드의 기능 저해 (dominant negative 작용) 를 해명하는 모델이 된다.

또한, 본 발명의 외래 이상 DNA 를 전이시킨 포유동물은 유리된 본 발명의 폴리펩티드의 증가 증상을 갖고 있기 때문에 본 발명의 폴리펩티드의 기능 불활성형 불응증에 대한 치료약 스크리닝 시험에도 이용 가능하다.

그리고, 상기 2 종류의 본 발명의 DNA 전이동물의 기타 이용 가능성으로 예컨대

① 조직 배양을 위한 세포원으로서의 사용,

② 본 발명의 DNA 전이동물의 조직 중의 DNA 또는 RNA 를 직접 분석하거나 또는 DNA 에 의해 발현된 폴리펩티드 조직을 분석하는 것에 의한 본 발명의 폴리펩티드에 의해 특이적으로 발현 또는 활성화시키는 폴리펩티드의 관련성에 대한 해석,

③ DNA 를 갖는 조직 세포를 표준 조직 배양기술로 배양하고, 이들을 사용하여 일반적으로 배양하기 어려운 조직으로부터의 세포기능의 연구,

④ 상기 ③ 에 기재된 세포를 사용하는 것에 의한 세포기능을 높이는 약제의 스크리닝 및

⑤ 본 발명의 변이 폴리펩티드를 단리 정제 및 그의 항체 제조 등을 생각할 수 있다.

또, 본 발명의 DNA 전이동물을 사용하며 본 발명의 폴리펩티드의 기능 불활성형 불응증 등을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드에 관련된 질환의 임상증상을 조사할 수 있고, 또한 본 발명의 폴리펩티드에 관련된 질환 모델의 각 장기에서의 상세한 병리학적 소견을 얻을 수 있어 새로운 치료 방법의 개발, 그리고 이 질환에 의한 2차적 질환의 연구 및 치료에 공헌할 수 있다.

또한, 본 발명의 DNA 전이동물로부터 각 장기를 꺼내어 자른 후, 트립신 등의 폴리펩티드 (단백질) 분해 효소에 의해 유리된 DNA 전이세포의 취득, 그 배양 또는 그 배양세포의 계통화를 실시할 수 있다. 또, 본 발명의 폴리펩티드 생산 세포의 특정화, 아포토시스, 분화 또는 증식과의 관련성 또는 이들의 시그널 전달기구를 조사하여 이들의 이상함 등을 조사할 수 있고, 본 발명의 폴리펩티드 및 그 작용해명을 위한 유효한 연구 재료가 된다.

그리고, 본 발명의 DNA 전이동물을 사용하며 본 발명의 폴리펩티드의 기능 불활성형 불응증을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드에 관련된 질환의 치료약 개발을 실시하기 위해서, 상술한 검사법 및 정량법 등으로 유효하고 신속한 이 질환 치료약의 스크리닝법을 제공할 수 있게 된다. 또한, 본 발명의 DNA 전이동물 또는 본 발명의 외래성 DNA 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드가 관련된 질환의 DNA 치료법을 검토, 개발할 수 있다.

(8) 노크아웃 동물

본 발명은 본 발명의 DNA 가 불활성화된 비인간 포유동물 배아세포 및 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물을 제공한다.

즉, 본 발명은

(1) 본 발명의 DNA 가 불활성화된 비인간 포유동물 배아세포,

(2) 이 DNA 가 리포터 유전자 (예, 대장균 유래의 β-갈락토시다아제 유전자) 를 도입함으로써 불활성화된 제 (1) 항에 기재된 배간세포,

(3) 네오마이신 내성인 제 (1) 항에 기재된 배간세포,

(4) 비인간 포유동물이 설치동물인 제 (1) 항에 기재된 배간세포,

(5) 설치동물이 마우스인 제 (4) 항에 기재된 배간세포,

(6) 본 발명의 DNA 가 불활성화된 이 DNA 발현부전 비인간 포유동물,

(7) 이 DNA 가 리포터 유전자 (예, 대장균 유래의 β-갈락토시다아제 유전자) 를 도입함으로써 불활성화되고, 이 리포터 유전자가 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터의 제어하에서 발현될 수 있는 제 (6) 항에 기재된 비인간 포유동물,

(8) 비인간 포유동물이 설치동물인 제 (6) 항에 기재된 비인간 포유동물,

(9) 설치동물이 마우스인 제 (8) 항에 기재된 비인간 포유동물 및

(10) 제 (7) 항에 기재된 동물에게 시험화합물을 투여하고 리포터 유전자의발현을 검출하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 DNA 가 불활성화된 비인간 포유동물 배간세포란 이 비인간 포유동물이 갖는 본 발명의 DNA 에 인위적으로 변이를 부가함으로써 DNA 의 발현능을 억제하거나 또는 이 DNA 가 코딩되어 있는 본 발명의 폴리펩티드 활성을 실질적으로 상실시킴으로써 DNA 가 실질적으로 본 발명의 폴리펩티드의 발현능을 갖지 않는 (이하, 본 발명의 노크아웃 DNA 라고 함) 비인간 포유동물의 배간세포 (이하, ES 세포라고 약기함) 를 말한다.

비인간 포유동물로서는 상기와 동일한 것이 사용된다.

본 발명의 DNA 에 인위적으로 변이를 부가하는 방법으로는 예컨대 유전자 공학적 수법으로 이 DNA 서열의 일부 또는 전부의 삭제, 다른 DNA 를 삽입 또는 치환시킴으로써 실시할 수 있다. 이들 변이에 따라 예컨대 코돈의 판독구조를 어긋나게 하거나 프로모터 또는 엑손 기능을 파괴함으로써 본 발명의 노크아웃 DNA 를 제조하면 된다.

본 발명의 DNA 가 불활성화된 비인간 포유동물 배간세포 (이하, 본 발명의 DNA 불활성화 ES 세포 또는 본 발명의 노크아웃 ES 세포라고 약기함) 의 구체예로서는, 예컨대 목적하는 비인간 포유동물이 갖는 본 발명의 DNA 를 단리하고 그 엑손 부분에 네오마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자를 대표로 하는 약제 내성 유전자 또는 lacZ(β-갈락토시다아제 유전자), cat (쿠로람페니콜 아세틸 트랜스페라아제 유전자) 를 대표로 하는 리포터 유전자 등을 삽입함으로써, 엑손기능을 파괴하거나 또는 엑손 사이의 인트론 부분에 유전자의 전사를 종결시키는 DNA 서열 (예컨대, polyA 부가 시그널 등) 을 삽입하고 완전한 메신저 RNA 를 합성할 수 없게 함으로써, 결과적으로 유전자를 파괴하도록 구축된 DNA 서열을 갖는 DNA 사슬 (이하, 타깃팅 벡터라고 약기함) 을, 예컨대 상동 재조합법으로 이 동물의 염색체로 도입하며, 얻은 ES 세포에 대해서 본 발명의 DNA 상 또는 그 근방의 DNA 서열을 프로브로 한 서던 하이브리다이제이션 해석 또는 타깃팅 벡터 상의 DNA 서열과 타깃팅 벡터 제조에 사용된 본 발명의 DNA 이외의 근방영역의 DNA 서열을 프라이머로 한 PCR 법으로 해석하고, 본 발명의 노크아웃 ES 세포를 선별함으로써 얻을 수 있다.

또, 상동 재조합법 등으로 본 발명의 DNA 를 불활성화시키는 원래의 ES 세포로는, 예컨대 상술한 바와 같은 이미 수립된 것을 사용해도 되고, 또한 공지된 Evans 와 Kaufma 의 방법에 준하여 새롭게 수립된 것이어도 된다. 예컨대, 마우스의 ES 세포의 경우 현재 일반적으로는 129 계의 ES 세포가 사용되고 있으나, 면역학적 배경이 확실하지 않기 때문에, 이를 대신하는 순수 계통에서 면역학적으로 유전적 배경이 명확한 ES 세포를 취득하는 등의 목적에서 예컨대 C57BL/6 마우스나 C57BL/6 의 채란 수의 적음을, DBA/2 와의 교배에 의해 개선된 BDF₁마우스 (C57BL/6 과 DBA/2 의 F₁) 를 사용하여 수립한 것 등도 양호하게 사용할 수 있다. BDF₁마우스는 채란 수가 많으면서 난이 건강하다는 이점에 추가로 C57BL/6 마우스를 배경에 갖고 있어 이를 사용하여 얻은 ES 세포는 병태 모델 마우스를 작출하였을 때에 C57BL/6 마우스와 복귀 교배 (백 크로스) 함으로써 그 유전적 배경을 C57BL/6 마우스로 대신할 수 있다는 면에서 유리하게 사용할 수 있다.

또, ES 세포를 수립하는 경우 일반적으로는 수정 후 3.5일째의 배반포를 사용하지만, 그 이외에 8 세포기 배를 채란하고 배반포까지 배양하여 사용함으로써 효율적으로 다수의 초기 배를 취득할 수 있다.

또한, 암수 어느 한쪽의 ES 세포를 사용할 수도 있으나, 통상 수컷 ES 세포가 생식계열 키메라를 작출하는 데에 바람직하다. 또, 번잡한 배양에 드는 수고를 삭감하기 위해서도 될 수 있으면 빨리 암수 판별을 하는 것이 바람직하다.

ES 세포의 암수 판정방법으로는 예컨대 PCR 법으로 Y 염색체 상의 성 결정영역의 유전자를 증폭, 검출하는 방법을 그 일례로서 들 수 있다. 이 방법을 사용하면 종래 핵형 분석을 하는 데에 약 10⁶개의 세포수를 필요로 한 반면에, 1 콜로니 정도의 ES 세포수 (약 50개) 이면 충분하기 때문에 배양 초기의 ES 세포의 제 1차 셀렉션을 암수 판별로 할 수 있고, 조기에 수컷 세포의 선정을 가능하게 함으로써 배양 초기의 수고는 대폭 삭감할 수 있다.

또, 제 2차 셀렉션으로서는 예컨대 G-밴딩법에 따른 염색체 수의 확인 등에 의해 실시할 수 있다. 얻은 ES 세포의 염색체 수는 정상수의 100% 가 바람직하지만, 수립시의 물리적 조작 등의 관계상 어려운 경우에는 ES 세포의 유전자를 노크아웃한 후, 정상 세포 (예컨대, 마우스는 염색체 수가 2n=40 인 세포) 에 다시 클로닝하는 것이 바람직하다.

이렇게 해서 얻은 배간세포주는 통상 그 증식성은 매우 좋지만, 개체 발생할 수 있는 능력을 잃기 쉬워 주위깊게 계대 배양하는 것이 필요하다. 예컨대, STO 섬유아세포와 같은 피더 세포 상에서 LIF (1-10000U/㎖) 존재하에 탄산가스 배양기 내 (바람직하게는 약 5% 탄산가스, 약 95% 공기 또는 약 5% 산소, 약 5% 탄산가스, 약 90% 공기) 에서 약 37℃ 에서 배양하는 등의 방법으로 배양하고, 계대시에는 예컨대 트립신/EDTA 용액 (통상 약 0.001-0.5% 트립신/약 0.1-5mM EDTA, 바람직하게는 약 0.1% 트립신/약 1mM EDTA) 처리로 단세포화시키고, 새롭게 준비한 피더 세포 상에 파종하는 방법 등을 들 수 있다. 이러한 계대는 통상 1-3일마다 행하지만, 이 때에 세포를 관찰하여 형태적으로 이상한 세포가 보인 경우에는 그 배양세포는 포기하는 것이 요구된다.

ES 세포는 적당한 조건에 의해 고밀도에 이를 때까지 단층 배양하거나 또는 세포 집괴를 형성할 때까지 부유 배양함으로써, 두정근, 내장근, 심근 등의 여러 타입 세포에 분화시키는 것이 가능하고 [M.J.Evans 및 M.H.Kaufman, Nature 제292권, p.154, 1981년; G.R.Martin Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 제78권, p.7634, 1981년; T.C.Doetschman 외, 저널 오브 엠블리올로지 앤드 엑스페리멘탈 모르폴로지, 제87권, p.27, 1985년], 본 발명의 ES 세포를 분화시켜 얻은 본 발명의 DNA 발현부전 세포는 인 비트로에서의 본 발명의 폴리펩티드의 세포생물학적 검토에서 유용하다.

본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물은 이 동물의 mRNA 량을 공지 방법으로 측정하여 간접적으로 그 발현량을 비교함으로써 정상 동물과 구별할 수 있다.

상기 비인간 포유동물로서는 상기와 동일한 것이 사용된다.

본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물은 예컨대 상술한 바와 같이 하여 제조된 타깃팅 벡터를 마우스 배간세포 또는 마우스 난세포에 도입하고, 도입에 의해 타깃팅 벡터의 본 발명의 DNA 가 불활성화된 DNA 서열이 유전자 상동 재조합에 의해 마우스 배간세포 또는 마우스 난세포의 염색체 상의 본 발명의 DNA 와 교체되는 상동 재조합을 시킴으로써 본 발명의 DNA 를 노크아웃시킬 수 있다.

본 발명의 DNA 가 노크아웃된 세포는, 본 발명의 DNA 상 또는 그 근방의 DNA 서열을 프로브로 한 서던 하이브리다이제이션 해석 또는 타깃팅 벡터 상의 DNA 서열과, 타깃팅 벡터에 사용한 마우스 유래의 본 발명의 DNA 이외의 근방영역의 DNA 서열을 프라이머로 한 PCR 법에 따른 해석으로 판정할 수 있다. 비인간 포유동물 배간세포를 사용한 경우에는, 유전자 상동 재조합에 의해 본 발명의 DNA 가 불활성화된 세포주를 클로닝하여 이 세포를 적당한 시기, 예컨대 8 세포기의 비인간 포유동물 배 또는 배반포에 주입하며 제조된 키메라 배를 가짜로 임신시킨 이 비인간 포유동물의 자궁에 이식한다. 작출된 동물은 정상적인 본 발명의 DNA 자리를 갖는 세포와 인위적으로 변이된 본 발명의 DNA 자리를 갖는 세포 모두로 구성된 키메라 동물이다.

상기 키메라 동물의 생식세포 일부가 변이된 본 발명의 DNA 자리를 갖는 경우, 이러한 키메라 개체와 정상 개체를 교배함으로써 얻은 개체군에서 모든 조직이 인위적으로 변이를 부가한 본 발명의 DNA 자리를 갖는 세포로 구성된 개체를, 예컨대 코트컬러의 판정에 의해 판별함으로써 얻을 수 있다. 이렇게 해서 얻은 개체는 통상 본 발명의 폴리펩티드의 헤테로 발현부전 개체로서, 본 발명의 폴리펩티드의 헤테로 발현부전 개체끼리 교배하여 이들의 새끼로부터 본 발명의 폴리펩티드의 호모 발현부전 개체를 얻을 수 있다.

난세포를 사용하는 경우에는 예컨대 난세포 핵 내에 마이크로 인젝션법으로 DNA 용액을 주입함으로써 타깃팅 벡터를 염색체 내로 도입한 트랜스제닉 비인간 포유동물을 얻을 수 있고, 이들 트랜스제닉 비인간 포유동물에 비하여 유전자 상동 재조합에 의해 본 발명의 DNA 자리에 변이가 있는 것을 선택함으로써 얻을 수 있다.

이렇게 해서 본 발명의 DNA 가 노크아웃되어 있는 개체는 교배로 얻은 동물 개체도 이 DNA 가 노크아웃되어 있는 것을 확인하여 통상적인 사육환경에서 사육 계대를 할 수 있다.

또한, 생식계열의 취득 및 유지에 대해서도 통상적인 방법에 따르면 된다. 즉, 이 불활성 DNA 가 보유하는 암수 동물을 교배함으로써 이 불활성 DNA 를 상동 염색체 양쪽에 갖는 호모자이고트 동물을 취득할 수 있다. 얻은 호모자이고트 동물은 모친동물에 대하여 정상 개체 1, 호모자이고트 복수가 되는 상태에서 사육함으로써 효율적으로 얻을 수 있다. 헤테로자이고트 동물의 암수를 교배함으로써 이 불활성화 DNA 를 갖는 호모자이고트 및 헤테로자이고트 동물을 번식 계대한다.

본 발명의 DNA 가 불활성화된 비인간 포유동물 배간세포는 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물을 작출하는 데에 매우 유용하다.

또한, 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물은 본 발명의 폴리펩티드에 의해 유도될 수 있는 각종 생물활성을 결실하기 때문에, 본 발명의 폴리펩티드의 생물활성의 불활성화를 원인으로 하는 질병의 모델이 될 수 있어 이들 질병의 원인 규명 및 치료법 검토에 유용하다.

(8a) 본 발명의 DNA 의 결손이나 손상 등에서 기인하는 질병에 대하여 치료ㆍ예방 효과를 갖는 화합물의 스크리닝 방법

본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물은 본 발명의 DNA 의 결손이나 손상 등에서 기인되는 질병 (골ㆍ관절질환 (예컨대, 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘 대리석병 등), 병적혈관 신생 (예컨대 종양혈관 신생) 등) 에 대하여 치료ㆍ예방 효과를 갖는 화합물의 스크리닝에 사용할 수 있다.

즉, 본 발명은 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물에 시험화합물을 투여하고 이 동물의 변화를 관찰ㆍ측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 DNA 의 결손이나 손상 등에서 기인되는 질병에 대하여 치료ㆍ예방 효과를 갖는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법을 제공한다.

이 스크리닝 방법에서 사용되는 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물로서는 상기한 바와 동일한 것을 들 수 있다.

시험화합물로서는 예컨대 펩티드, 단백, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물, 세포추출액, 식물추출액, 동물조직 추출액, 혈장 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물일 수도 있고, 공지된 화합물일 수도 있다.

구체적으로는 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물을 시험화합물로 처리하여 처리되지 않은 대조 동물과 비교하여, 이 동물의 각 기관, 조직, 질병의 증상 등과 같은 변화를 지표로 삼아 시험화합물의 치료ㆍ예방 효과를 시험할 수 있다.

시험동물을 시험화합물로 처리하는 방법으로는 예컨대 경구 투여, 정맥 주사 등이 사용되고, 시험동물의 증상, 시험화합물의 성질 등에 맞춰서 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 시험화합물의 투여량은 투여방법, 시험화합물의 성질 등에 맞춰 적절하게 선택할 수 있다.

예컨대, 종양혈관 신생에 대하여 치료ㆍ예방 효과를 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우, 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물에 암세포를 이식하고, 암세포 이식 전 또는 이식 후에 시험화합물을 투여하여 이 동물의 종양 마커값 및 종양괴 크기 등을 시간경과에 따라 측정한다.

본 발명의 스크리닝 방법으로 얻은 화합물은 상기한 시험화합물에서 선택된 화합물로서, 본 발명의 폴리펩티드의 손상이나 파손 등에 따라 야기되는 질환 (골ㆍ관절질환 (예컨대, 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘 대리석병 등), 병적혈관 신생 (예컨대, 종양혈관 신생) 등) 에 대하여 치료ㆍ예방 효과를 가지므로, 이 질환에 대한 안전하고 저독성의 치료ㆍ예방제 등과 같은 의약으로서 사용할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝으로 얻은 화합물에서 유도되는 화합물도 동시에 사용할 수 있다.

이 스크리닝 방법으로 얻은 화합물은 염을 형성할 수도 있고, 이 화합물의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산 (예, 무기산, 유기산) 이나 염기 (예, 알칼리금속) 등과의 염이 사용되고, 특히 생리학적으로 허용되는 산 부가염이 바람직하다. 이러한 염으로는 예컨대 무기산 (예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염 또는 유기산 (예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸말산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 자리르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용된다.

이 스크리닝 방법으로 얻은 화합물 또는 그의 염을 함유한 의약은 상기한 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 의약과 동일하게 하여 제조할 수 있다.

이렇게 해서 얻은 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 인간 또는 포유동물 (예컨대, 래트, 마우스, 모르모트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그의 염의 투여량은 대상 질환, 투여 대상, 투여 루트 등에 따라 차이는 있지만, 예컨대 골ㆍ관절질환의 치료 목적에서 이 화합물을 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏) 에게 하루에 상기 화합물을 약 0.1 내지 100㎎, 바람직하게는 약 1.0 내지 50㎎, 더 바람직하게는 약 1.0 내지 20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 이 화합물의 1회 투여량은 투여 대상, 대상 질환 등에 따라 다르지만, 예컨대 골ㆍ관절질환의 치료 목적에서 이 화합물을 주사제 형태로 통상 성인 (60㎏) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 화합물을 약 0.01 내지 30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 내지 20㎎ 정도, 더 바람직하게는 0.1 내지 10㎎ 정도를 정맥 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(8b) 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물을 스크리닝하는 방법

본 발명은 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물에게 시험화합물을 투여하여 리포터 유전자의 발현을 검출하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법에서 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물로서는 상기한 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물 중에서도 본 발명의 DNA 가 리포터 유전자를 도입함으로써 불활성화되고, 이 리포터 유전자가 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터의 제어하에서 발현될 수 있는 것이 사용된다.

시험화합물로서는 상기한 바와 동일한 것을 들 수 있다.

리포터 유전자로서는 상기한 바와 동일한 것이 사용되고, β-갈락토시다아제 유전자 (lacZ), 가용성 알칼리포스파타아제 유전자 또는 루시페라아제 유전자 등이 바람직하다.

본 발명의 DNA 를 리포터 유전자로 치환된 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물에서는 리포터 유전자가 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터의 지배하에 존재하기 때문에, 리포터 유전자가 코딩되는 물질의 발현을 트레이스함으로써 프로모터 활성을 검출할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 영역 일부를 대장균 유래의 β-갈락토시다아제 유전자 (lacZ) 로 치환하는 경우, 본래 본 발명의 폴리펩티드가 발현되는 조직에서 본 발명의 폴리펩티드 대신에 β-갈락토시다아제가 발현된다.따라서, 예컨대 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드 (X-gal) 와 같은 β-갈락토시다아제의 기질이 되는 시약을 사용하여 염색함으로써, 간편하게 본 발명의 폴리펩티드의 동물 생체 내에서의 발현 상태를 관찰할 수 있다. 구체적으로는 본 발명의 폴리펩티드 결손 마우스 또는 그 조직 절편을 글루탈알데히드 등으로 고정하고 인산 완충 생리식염액 (PBS) 로 세정한 후, X-gal 을 함유한 염색액으로 실온 또는 37℃ 부근에서 약 30분 내지 1시간 반응시킨 후, 조직 표본을 1mM EDTA/PBS 용액으로 세정함으로써 β-갈락토시다아제 반응을 정지시키고 띠는 색을 관찰하면 된다. 또한, 통상적인 방법에 따라 lacZ 를 코딩하는 mRNA 를 검출해도 된다.

상기 스크리닝 방법으로 얻은 화합물 또는 그의 염은 상기한 시험화합물에서 선택된 화합물로, 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물이다.

상기 스크리닝 방법으로 얻은 화합물 또는 그의 염은 상기한 시험화합물에서 선택된 화합물로서, 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물이다.

이 스크리닝 방법으로 얻은 화합물은 염을 형성할 수도 있고, 이 화합물의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산 (예, 무기산) 이나 염기 (예, 유기산) 등과의 염이 사용되고, 특히 생리학적으로 허용되는 산 부가염이 바람직하다. 이러한 염으로는 예컨대 무기산 (예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염 또는 유기산 (예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸말산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 자리르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용된다.

본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하는 화합물 또는 그의 염은 본 발명의 폴리펩티드 발현을 촉진시키고 이 폴리펩티드 기능을 촉진시킬 수 있어, 예컨대 골ㆍ관절질환 (예컨대, 변형성 관절증, 만성 관절류머티즘 대리석병 등), 병적혈관 신생 (예컨대, 종양혈관 신생) 등과 같은 질병에 대한 안전하고 저독성의 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 유용하다.

또한, 상기 스크리닝으로 얻은 화합물에서 유도된 화합물도 동일하게 사용할 수 있다.

이 스크리닝 방법으로 얻은 화합물 또는 그의 염을 함유한 의약은 상기한 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염을 함유한 의약과 동일하게 하여 제조할 수 있다.

이렇게 해서 얻은 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 인간 또는 포유동물 (예컨대 래트, 마우스, 모르모트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그의 염의 투여량은 대상 질환, 투여 대상, 투여 루트 등에 따라 차이는 있지만, 예컨대 골ㆍ관절질환의 치료 목적에서 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하는 화합물을 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏) 에게 하루에 이 화합물을 약 0.1 내지 100㎎, 바람직하게는 약 1.0 내지 50㎎, 더 바람직하게는 약 1.0 내지 20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 상기 화합물의 1회 투여량은 투여 대상, 대상 질환 등에 따라 다르지만, 예컨대 골ㆍ관절질환의 치료 목적에서 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하는 이 화합물을 주사제 형태로 통상 성인 (체중 60㎏) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 화합물을 약 0.01 내지 30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 내지 20㎎ 정도, 더 바람직하게는 0.1 내지 10㎎ 정도를 정맥 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

한편, 예컨대 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 저해하는 화합물을 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏) 에게 하루에 이 화합물을 약 0.1 내지 100㎎, 바람직하게는 약 1.0 내지 50㎎, 더 바람직하게는 약 1.0 내지 20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는 이 화합물의 1회 투여량은 투여 대상, 대상 질환 등에 따라 다르지만, 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 저해하는 화합물을 주사제 형태로 통상 성인 (60㎏) 에게 투여하는 경우, 하루에 상기 화합물을 약 0.01 내지 30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 내지 20㎎ 정도, 더 바람직하게는 0.1 내지 10㎎ 정도를 정맥 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

이렇게 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물은 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염을 스크리닝하는 데에 매우 유용하고, 본 발명의 DNA 발현부전에서 기인하는 각종 질환의 원인 규명 또는 예방ㆍ치료약의 개발에 크게 공헌할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 마우스나 인간에게 있어서 특히 연골조직에서 매우 대량으로 발현되고 있기 때문에, 이 유전자의 프로모터 서열은 목적 단백질 (임의의 유용유전자 산물 등) 을 비인간 온혈동물의 연골조직에서 대량으로 발현시키기 위한 프로모터로서 바람직하다. 비인간 온혈동물로서는 예컨대 상술한 온혈동물로서 예시한 것과 동일한 것 등을 들 수 있다.

즉, 본 발명은 서열번호:6, 서열번호:12 또는 서열번호:47 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 프로모터 영역의 하류 (3' 말단측) 에 목적 단백질 (임의의 유용 유전자 산물 등) 을 연결하고, 비인간 온혈동물에게 도입하는 것에 의한 목적 단백질 (임의의 유용 유전자 산물 등) 을 비인간 온혈동물의 연골조직 우위로 발현시키는 방법을 제공한다.

이 목적 단백질 (임의의 유용 유전자 산물 등) 로서는 예컨대 사이토카인 (예, 인터로이킨, 인터페론, 케모카인, 조혈인자), 증식인자 (예, EGF (epidermal growth factor) 또는 이와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 물질 (예컨대, EGF, 할레그린 (HER2리간드) 등), 인슐린 또는 이와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 물질 (예컨대, 인슐린, IGF (insulin-liki growth factor)-1, IGF-2 등), FGF (fibroblast growth factor) 또는 이와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것 (예컨대, aFGF, bFGF, KGF (Keratindcyte Growth Factor), HGF (Hepatocyte Growth Factor), FGF-10 등), 기타 세포증식인자 (예컨대, CSF (colony stimulating factor), EPO (erythropoietin), IL-2 (interleukin-2), NGF (nerve growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), TGFβ(transforming growth factorβ)) 등), 호르몬 (예, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (LH-RH), 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬 (GH-RH), 프롤락틴, 멜라노사이트 자극 호르몬, 갑상선 호르몬 방출 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 호르몬, 난포 자극 호르몬, 가스트린, 모틸린, 소마토스타틴, 세크레틴, 글루카곤, PACAP, VIP 등, 소화효소 (예, 아밀라아제, 펩시노겐, 리파아제 등), 병원체에 대한 항체 (예, 병원성 살모넬라균 등의 병원성 세포에 대한 항체, 인플루엔자 등의 병원성 바이러스에 대한 항체, 에키노코쿠스 등의 기생충에 대한 항체 등), 항균 폴리펩티드 (예, 세크로핀, 히스타틴, 인돌리시딘, 프로테그린, 디펜신, 리조치임 등) 등의 유용 유전자 산물 등을 들 수 있다.

상기 목적 단백질 중에서

① 사이토카인을 연골 특이적으로 발현시킴으로써 예컨대 비인간 온혈동물의 면역활성의 증강, 조절 등을 달성할 수 있고,

② 증식인자를 연골 특이적으로 발현시킴으로써 예컨대 비인간 온혈동물의 연골조직의 보호 등을 달성할 수 있다.

이하, 서열번호:6, 서열번호:12 또는 서열번호:47 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 프로모터 영역의 하류 (3' 말단측) 에 목적 단백질 (임의의 유용 유전자 산물 등) 을 코딩하는 DNA 또는 RNA 을 연결하고, 비인간 동물에게 도입하는 것에 의한 목적 단백질 (임의의 유용 유전자 산물 등) 을 비인간 온혈동물의 연골 특이적으로 발현시키는 방법에 대해서 더욱 구체적으로 기재한다.

먼저, 서열번호:6, 서열번호:12 또는 서열번호:47 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 프로모터는 콜로니 하이브리다이제이션, 플라크 하이브리다이제이션이나 PCR 등과 같은 자체 공지된 방법 (예컨대, Molecular Cloning 2nd (J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) 에 기재된 방법 등) 으로 얻을 수 있다. 또한, 프로모터 활성을 갖는 영역의 동정은 리포터 어세이 등의 자체 공지된 방법 (예컨대, Analytical Biochemistry, 188권, p.245 (1990년)) 에 기재된 방법 등) 으로 얻을 수 있다.

이어서 상기 방법으로 얻은 프로모터의 하류 (3' 말단측) 에 목적 단백질 (임의의 유용 유전자 산물 등) 을 연결하기 위해서는, T4DNA 리가아제를 사용하여 플라스미드를 구축하기 위한 자체 공지된 방법 (예컨대, Molecular Cloning 2nd (J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) 에 기재된 방법 등) 으로 목적을 달성할 수 있다.

프로모터 영역의 하류 (3' 말단측) 에 목적 단백질 (임의의 유용 유전자 산물 등) 을 코딩하는 DNA 를 연결한 것을 비인간 온혈동물에게 도입하기 위해서는, 일렉트로포레이션을 사용하는 방법, 유전자총을 사용하는 방법, 레트로 바이러스 벡터를 사용하는 방법 (예컨대, Blood Cells, 17권, p.407 (1991년) 에 기재된 방법 등), 아데노 바이러스 벡터를 사용하는 방법 (예컨대, Pathology, 30권, p.335 (1998) 에 기재된 방법 등) 등이 있다.

본 명세서 및 도면에서 염기나 아미노산 등을 약칭으로 표시하는 경우 IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature 에 의한 약칭 또는 당해 분야에서 관용되는 약칭에 의거한 것으로, 그 예를 이하에 기재한다. 또, 아미노산에관하여 광학이성체가 있을 수 있는 경우에는 특히 명시하지 않으면 L 체를 나타내는 것으로 한다.

DNA: 데옥시리보핵산

cDNA: 상보적 데옥시리보핵산

A: 아데닌

T: 티민

G: 구아닌

C: 시토신

RNA: 리보핵산

mRNA: 메신저리보핵산

dATP: 데옥시아데노신3인산

dTTP: 데옥시티미딘3인산

dGTP: 데옥시구아노신3인산

dCTP: 데옥시시티딘3인산

ATP: 아데노신3인산

EDTA: 에틸렌디아민4아세트산

SDS: 도데실황산나트륨

Gly: 글리신

Ala: 알라닌

Val: 밸린

Leu: 로이신

Ile: 이소로이신

Ser: 세린

Thr: 트레오닌

Cys: 시스테인

Met: 메티오닌

Glu: 글루타민산

Asp: 아스파라긴산

Lys: 리진

Arg: 아르기닌

His: 히스티딘

Phe: 페닐알라닌

Tyr: 티로신

Trp: 트립토판

Pro: 프롤린

Asn: 아스파라긴

Gln: 글루타민

pGlu: 피로글루타민산

또한, 본 명세서 중에서 자주 사용되는 치환기, 보호기 및 시약을 아래와 같은 기호로 표기한다.

Me: 메틸기

Et: 에틸기

Bu: 부틸기

Ph: 페닐기

TC: 티아졸리딘-4(R)-카르복사미드기

Tos: p-톨루엔술포닐

CHO: 포르밀

Bzl: 벤질

Cl₂-Bzl : 2,6-디클로로벤질

Bom: 벤질옥시메틸

Z: 벤질옥시카르보닐

Cl-Z: 2-클로로벤질옥시카르보닐

Br-Z: 2-브로모벤질옥시카르보닐

Boc: t-부톡시카르보닐

DNP: 디니트로페닐

Trt: 트리틸

Bum: t-부톡시메틸

Fmoc: N-9-플루오레닐메톡시카르보닐

HOBt: 1-히드록시벤즈트리아졸

HOOBt: 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진

HONB: 1-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드

DCC: N,N'-디시클로헥실카르보디이미드

본원 명세서의 서열표의 서열번호는 아래와 같은 서열을 나타낸다.

[서열번호:1]

실시예 1 에서 사용된 안티센스사슬 프라이머의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:2]

실시예 1 에서 사용된 센스사슬 프라이머의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:4]

서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 MLP 전구체를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:5]

서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 MLP 전구체에 함유된 시그널서열의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:6]

인간 MLP 전구체의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:7]

실시예 2 에서 사용된 안티센스사슬 프라이머의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:8]

실시예 2 에서 사용된 센스사슬 프라이머의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:10]

서열번호:12 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 마우스 MLP 전구체를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:11]

서열번호:12 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 마우스 MLP 전구체에 함유된 시그널서열의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:12]

마우스 MLP 전구체의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:13]

실시예 3 에서 사용된 G3PDH 특이적 올리고 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:14]

[서열번호:15]

실시예 3 에서 사용된 어그리칸 (aggrecan) 특이적 올리고 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:16]

실시예 3 에서 사용된 어그리칸 특이적 올리고 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:17]

실시예 3 에서 사용된 Ⅱ형 콜라겐 특이적 올리고 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:18]

[서열번호:19]

실시예 3 에서 사용된 Ⅹ형 콜라겐 특이적 올리고 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:20]

[서열번호:21]

실시예 3 에서 사용된 마우스 MLP 특이적 올리고 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:22]

[서열번호:23]

서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 MLP 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:24]

인간 MLP 의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:25]

서열번호:26 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 마우스 MLP 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:26]

마우스 MLP 의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:27]

실시예 4 및 실시예 6 에서 사용된 프라이머의 염기서열을 나타낸다

[서열번호:28]

실시예 4 에서 사용된 프라이머의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:29]

실시예 1 에서 얻은 cDNA 단편의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:30]

실시예 2 에서 얻은 cDNA 단편의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:31]

실시예 6 에서 사용된 합성 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:32]

실시예 6 에서 PCR 프라이머로서 사용된 올리고 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:33]

[서열번호:34]

[서열번호:35]

[서열번호:36]

[서열번호:37]

[서열번호:38]

[서열번호:39]

실시예 9 에서 얻은 DNA 에 코딩되는 래트 MLP 전구체의 부분 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:40]

실시예 9 에서 얻은 래트 MLP 전구체의 일부를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:41]

실시예 9 에서 얻은 래트 MLP 전구체의 일부를 코딩하는 DNA 를 함유한 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:42]

실시예 9 에서 PCR 프라이머로서 사용된 올리고 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:43]

[서열번호:44]

[서열번호:45]

[서열번호:46]

서열번호:47 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 래트 MLP 전구체를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:47]

래트 MLP 전구체의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:48]

서열번호:49 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 래트 MLP 전구체를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호:49]

래트 MLP 의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:50]

서열번호:47 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 래트 MLP 전구체에 함유된 시그널서열의 아미노산 서열을 나타낸다.

후술하는 실시예 1 에서 얻은 형질전환체 에스케리키아 콜리 XL10-Gold/pDRL128vH 는 1999년 6월 11일부터 일본 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1-1-3 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-6750 으로서, 1999년 6월 25일부터 일본 오오사까후 오오사까시 요도가와꾸 주산본마찌 2-17-85 재단법인 발효연구소 (IFO) 에 기탁번호 IFO 16292 로서 기탁되어 있다.

후술하는 실시예 2 에서 얻은 형질전환체 에스케리키아 콜리 XL10-Gold/pDRL128vM 은 1999년 6월 9일부터 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-6747 로서, 1999년 6월 25일부터 재단법인 발효연구소 (IFO) 에 기탁번호 IFO 16293 으로서 기탁되어 있다.

후술하는 실시예 9 에서 얻은 형질전환체 에스케리키아 콜리 XL10-Gold/pDRL128vR 은 2000년 5월 19일부터 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-7167 로서, 2000년 5월 26일부터 재단법인 발효연구소 (IFO) 에 기탁번호 IFO 16439 로서 기탁되어 있다.

발명의 개시

본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 인간 태아 뇌, 마우스 태아 유래의 cDNA 라이브러리에서 각각 신규 염기서열을 갖는 cDNA 를 클로닝하는 데에 성공하였다. 그리고, 본 발명자들은 얻은 cDNA 에 코딩되는 단백질이 유용한 세포기능조절 활성을 갖는 MIA/CD-RAP 형상 단백질 MLP 의 전구체 단백질로서, MLP 전구체로부터 시그널서열이 절단되어 생성되는 MLP 가 분비 단백질임을 발견하였다. 이들 지견에 따라 더욱 검토를 거듭한 결과 본 발명을 완성하는 데에 이르렀다.

즉, 본 발명은

(1) 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염,

(2) 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염,

(3) 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 서열번호:26 으로 표시되는 아미노산 서열인 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염,

(4) 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 서열번호:12 로 표시되는 아미노산 서열인 상기 (2) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염,

(5) 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 서열번호:49 로 표시되는 아미노산 서열인 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염,

(6) 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 서열번호:47 로 표시되는 아미노산 서열인 상기 (2) 에 기재된 폴리펩티드,그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염,

(7) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 를 함유한 DNA,

(8) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:23 으로 표시되는 염기서열인 상기 (6) 에 기재된 DNA,

(9) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:4 로 표시되는 염기서열인 상기 (6) 에 기재된 DNA,

(10) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:25 로 표시되는 염기서열인 상기 (6) 에 기재된 DNA,

(11) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:10 으로 표시되는 염기서열인 상기 (6) 에 기재된 DNA,

(12) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:48 로 표시되는 염기서열인 상기 (6) 에 기재된 DNA,

(13) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:46 으로 표시되는 염기서열인 상기 (6) 에 기재된 DNA,

(14) 상기 (6) 에 기재된 DNA 를 함유한 재조합 벡터,

(15) 상기 (14) 에 기재된 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체,

(16) 상기 (15) 에 기재된 형질전환체를 배양하고, 이 폴리펩티드를 생성시키는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염의 제조법,

(17) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염에 대한 항체,

(18) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법,

(19) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트,

(20) 상기 (18) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (19) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻은 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염,

(21) 상기 (18) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (19) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻은 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 의약,

(22) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 의약,

(23) 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 골ㆍ관절질환 또는 병적혈관 신생의 예방ㆍ치료제,

(24) 상기 (17) 에 기재된 항체를 함유하여 이루어진 진단제 등에 관한다.

또한, 본 발명은

(25) 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 약 50% 이상 (바람직하게는 약 60% 이상, 더 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상) 의 상동성을 갖는 아미노산 서열인 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염,

(26) 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 ① 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 내지 30 개 정도) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, ② 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 내지 40 개 정도, 더 바람직하게는 1 내지 30 개 정도) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, ③ 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열 중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 내지 30 개 정도) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 ④ 이들을 조합한 아미노산 서열인 상기 (1) 에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염 등을 제공한다.

또한, 본 발명의 DNA 및 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염 등은 분자량 마커, 조직 마커, 염색체 맵핑, 유전병의 동정, 프라이머, 프로브의 설계 등과 같은 기초 연구에 이용할 수 있는 가능성이 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하겠으나, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 또, 대장균을 사용한 유전자 조작은 Molecular cloning 에 기재되어 있는 방법에 따른다.

실시예 1인간 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 cDNA 의 클로닝

인간 태아 뇌 유래 poly(A⁺)RNA 를 사용하여 다음과 같은 영역에서 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA End), 3'RACE 를 실시함으로써 인간 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 cDNA 의 클로닝을 실시한다. 인간 태아 뇌 유래 poly(A⁺)RNA (Clontech사) 1㎍ 에서 제한효소 부위에 이어지는 poly(T) 를 갖는 anchored primer 와 Superscript Ⅱ MMLV 역전사효소 (Gibco BRL 사) 를 사용하여 1st. strand cDNA 를 합성한 후, RNA ligase (다까라슈조(주)) 를 사용하여 이 1st. strand cDNA 의 3' 말단에 anchored primer 를 부가한다. 이어서, 서열번호:1 로 표시되는 올리고 DNA 를 안티센스사슬 프라이머로서 5'RACE 를, 마찬가지로 서열번호:2 로 표시되는 올리고 DNA 를 센스사슬 프라이머로서 3'RACE 를 실시하여 각각 각 프라이머를 기점으로 하는 5'상류측의 서열, 3'하류측의 서열을 얻는다. 여기에서 얻은 각 2개 사슬 DNA 의 염기서열을 결정한 바, 오버랩되는 공통 서열이존재하기 때문에, 두 서열은 동일 유전자에서 유래됨을 알 수 있다. 그래서, 이 5'RACE, 3'RACE 에서 얻은 각 cDNA 단편을 이 공통 서열 부분에서 접합하고 최종적으로 poly(A⁺) 사슬을 포함한 서열번호:29 로 표시되는 전체 길이 923 염기쌍 (bp) 의 cDNA 단편을 얻는다. 이 cDNA 단편에는 서열번호:5 로 표시되는 18 아미노산 잔기의 전형적인 시그널서열을 포함하며 서열번호:6 으로 표시되는 128 개의 아미노산으로 이루어진 신규 인간 MLP 전구체 단백질이 코딩되어 있다. 이 인간 MLP 전구체 단백질은 인간 MIA 전구체 단백질과 상동성이 가장 높고, 4군데 존재하는 시스테인 잔기의 위치가 일치하지만 (도 1), 그 양자간의 상동성은 아미노산 레벨에서 23.4% 에 지나지 않는다.

본 실시예에서 얻은 인간 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 DNA 를 유지하는 플라스미드 pDRL128vH 를 대장균 (에스케리키아 콜리)XL10-Gold 에 도입하여 형질전환체 : 대장균 (에스케리키아 콜리)XL10-Gold/pDRL128vH 를 얻는다.

실시예 2마우스 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 cDNA 의 클로닝

마우스 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 cDNA 의 클로닝은 생후 17.5일 된 마우스 태아 유래 poly(A⁺) RNA 를 사용하여 인간 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 cDNA 의 클로닝의 경우와 동일하게 하여 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA End), 3'RACE 를 실시한다. 생후 17.5일 된 마우스 태아부터 구아니딘티오시아네이트법으로 total RNA 를 분획한 후, 이 total RNA 를 올리고 (dT) 스판칼럼 (팔마시아) 을 이용하여 poly(A⁺)RNA 를 조제한다. 이 생후 17.5일 된 마우스 태아 유래 poly(A⁺)RNA 1㎍ 에서 제한효소 부위에 이어지는 poly(T) 을 갖는 anchored primer 와 Superscript Ⅱ MMLV 역전사효소 (Gibco BRL 사) 를 사용하여 1st. strand cDNA 를 합성한 후, RNA ligase (다까라슈조(주)) 를 사용하여 합성한 1st. strand cDNA 의 3' 말단에 anchored primer 를 부가한다. 5'RACE, 3'RACE 에 사용된 프라이머 서열은 실시예 1 에서 얻은 인간 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 cDNA 의 염기서열을 query 로 하여 public EST (Expressed Sequence Tag) 데이터 베이스에서 발견한, 마우스 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 cDNA 의 3' 측의 영역을 포함하는 것으로 생각되는 유일한 EST 인 AA222797 의 서열을 기본으로 제조한다. 서열번호:7 로 표시되는 올리고 DNA 를 안티센스사슬 프라이머로서 5'RACE 를, 서열번호:8 로 표시되는 올리고 DNA 를 센스사슬 프라이머로서 3'RACE 를 실시하여 각각 각 프라이머를 기점으로 하는 5'상류측의 서열, 3'하류측의 서열을 얻는다. 여기에서 얻은 2개 사슬 DNA 의 염기서열을 결정한 바, 오버랩되는 공통 서열이 존재하고 있기 때문에, 두 서열은 동일 유전자에서 유래함을 알 수 있다. 그래서, 이 5'RACE, 3'RACE 에서 얻은 각 cDNA 단편을 그 공통 서열부분에서 접합하고 최종적으로 poly(A⁺) 사슬을 포함한 전체 길이 947 bp 의 cDNA 단편을 얻는다 (서열번호:30). 이 cDNA 단편에는 인간 MLP 전구체 단백질과 마찬가지로 서열번호:11 로 표시되는 18 아미노산 잔기의 전형적인 시그널서열을 포함하며 서열번호:12 로 표시되는 128 개의 아미노산으로 이루어진 신규 마우스 MLP 전구체 단백질이 코딩되어 있다. 이 마우스 MLP 전구체 단백질은 인간 및 마우스의MIA 전구체 단백질, 그리고 인간 MLP 전구체 단백질로 4군데 존재하는 시스테인 잔기의 위치가 일치한다 (도 1). 또한, 마우스 MLP 전구체 단백질과 인간 MLP 전구체 단백질의 아미노산 레벨에서의 상동성은 84.3% 에 도달하나, 마우스 MIA 전구체 단백질과 마우스 MLP 전구체 단백질의 상동성은 22.6% 에 그친다.

본 실시예에서 얻은 마우스 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 DNA 를 유지하는 플라스미드 pDRL128vM 을 대장균 (에스케리키아 콜리)XL10-Gold 에 도입하여 형질전환체 : 대장균 (에스케리키아 콜리)XL10-Gold/pDRL128vM 을 얻는다.

실시예 3in vitro 연골 분화 모델에서의 MLP 의 발현

마우스 배성 종양 유래 세포주 ATDC5 는 전구 연골세포의 성질을 매우 좋게 유지하고, 또한 인슐린 존재하의 배양에서 고율로 연골 분화가 유도되고, 그 후 골형성에서 보이는 연골 분화의 모든 단계를 시뮬레이션할 수 있기 때문에, in vitro 연골 분화 모델로서 사용된다 (Cell Diff. Dev., 30:109-116, 1990, J.Cell Biol., 133:457-468, 1996, J.Bone Min. Res., 10:S234, 1995). 그래서, 다음과 같은 영역에서 RT-PCR 법을 실시함으로써 각 분화 단계에서의 각종 유전자의 발현 변화를 조사한다. 먼저, 분화 모델 배양계의 각 스테이지의 ATDC5 세포에서 동 세포를 페놀과 티오시안산 구아니딘을 함유한 균일한 액체 ISOGEN (니뽕 진) 에 용해하고 클로로포름을 첨가하여 원심분리함으로써 RNA 를 함유한 수상 분획을 채취하고, 그리고 이소프로판올을 첨가하여 교반한 후 다시 원심하고 침전시킴으로써 정제 total RNA 를 취득한다. 이어서, TAKARA RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1 (다까라슈조(주)) 중의 AMV Reverse Transcriptase XL 과 Random 9 mers 를 사용하여 각 피검total RNA 를 역전사하여 cDNA 를 얻고, 이어서 이들을 주형 DNA 으로서 사용하고 그리고 하우스 킵핑 유전자로서 G3PDH (글리셀알데히드-3-인산탈수소 효소) 특이적 올리고 DNA (서열번호:13, 서열번호:14) 또는 연골 분화 마커 유전자 특이적 올리고 DNA (어그리칸 (서열번호:15, 서열번호:16), Ⅱ형 콜라겐 (서열번호:17, 서열번호:18), Ⅹ형 콜라겐 (서열번호:19, 서열번호:20) 을 프라이머 DNA 로서 사용하여 TaKaRaEx Taq^TM(다까라슈조(주)) 의 반응계에서 PCR 반응을 실시한다. 얻은 반응 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하여 그 생성량을 비교한다. 그 결과, 각 유전자에 대해서 각각 연골세포의 분화 단계에 대응한 표 1 과 같은 발현 패턴을 검출할 수 있다. 그래서, 동 cDNA 샘플군에 대하여 마우스 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 cDNA 에 특이적인 올리고 DNA (서열번호:21, 서열번호:22) 를 프라이머 DNA 로서 사용하고 그 이외에는 완전히 동일한 반응조건에서 RT-PCR 을 실시한 바, 스테이지 2 에서 스테이지 4 에 걸쳐 마우스 MLP 전구체 mRNA 량의 현저한 항진이 보인다. 이런 점에서 MLP 전구체의 유전자는 연골 분화의 초기 단계에 발현이 증가되는 유전자임을 알 수 있다.

단계	1	2	3	4	5	6	7
MLP	＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋	＋＋	＋
어그리칸	＋	＋＋	＋＋	＋＋	＋＋＋	＋＋	＋＋
Ⅱ형콜라겐	＋	＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋	＋＋
Ⅹ형콜라겐	＋	＋	＋＋	＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋
G3PDH	＋＋	＋＋	＋＋	＋＋	＋＋	＋＋	＋＋
표에서, ＋ 의 수는 각 분화 스테이지에서의 각각의 유전자의 발현량의 차이를 나타내고, 그 수가 많을수록 발현량이 많음을 나타낸다

실시예 4COS-7 세포에서의 마우스 MLP-FLAG 융합 단백질의 발현과 그 검출

MLP 가 분비 단백질임을 확신하기 위해서, 마우스 MLP 에 대해서 다음과 같은 영역에서 COS-7 세포에서의 마우스 MLP-FLAG 융합 단백질의 발현과 그 검출을 실시한다. 먼저, 실시예 2 에서 얻은 마우스 MLP 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 의 염기서열에 따라 2 종류의 프라이머 DNA 를 화학 합성한다. 하나는 5'-CGAATTCCCACCATGGCAAGGATATTGATTCTTTTGCTTG-3' (서열번호:27) 이고, 이것은 제한효소 EcoRI 인식부위를 포함한 앵커 서열을 5'말단측에 갖는 +1 내지 +28 (번역 개시 부위를 +1 로 함) 까지의 센스 서열을 포함한 올리고 DNA 이다. 또 하나는 5'-GTACAGTCGACTTCACAGAAGAAGTCAATATCCGTGGTTG-3' (서열번호:28) 이고, 이것은 제한효소 SalI 인식부위를 포함한 앵커 서열의 3' 측에 +355 내지 +378 까지의 안티센스 서열이 이어진 서열을 갖는 올리고 DNA 이다. 실시예 2 에서 얻은 플라스미드pDRL128vM 을 주형으로 하여 이들 2 종류의 프라이머 DNA 및 TaKaRa LA Taq^TM(다까라슈조(주)) 을 사용하고, 서멀 사이클러 GeneAmp^TMPCR system9700 (퍼킨 엘머사) 로 최초 98℃ 에서 30초간 놓은 후, 98℃ 에서 10초, 55℃ 에서 20초, 72℃ 에서 2분을 1반응 사이클로 하여 25사이클 증폭 반응을 반복하고, 마지막에 72℃ 에서 5분간 신장 반응을 실시한다. 얻은 DNA 단편을 정제한 후, 제한효소 EcoRI 와 SalI 로 말단 소화한 후 재정제하고, 동물세포용 발현 벡터 pCAN618FLAG 의 EcoRI, SalI 부위로 삽입, 연결한다. pCAN618FLAG 는 플라스미드 벡터 pCAN618 에서 유래하고, 선택 마커로서의 네오마이신 내성 유전자를 가짐과 동시에 목적 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 그 클로닝 부위인 EcoRI, SalI 부위로 삽입함으로써 사이토메가로 바이러스의 극초기 유전자 엔핸서와 그 하류의 β-악틴프로모터 제어하에서 이 단백질을 발현시킬 수 있을 뿐아니라 SalI 부위 직후에 존재하는 8아미노산의 FLAG 에피토프 서열 (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) 을 코딩하는 염기서열과 종지 코돈에 판독 프레임을 맞춤으로써 이 목적 단백질을 FLAG 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다. 상술한 PCR 클로닝 DNA 단편의 pCAN618FLAG 로의 삽입도 마우스 MLP 전구체 전체길이와 FLAG 에피토프의 융합 단백질 (사이에 Val 을 1잔기 삽입함) 을 발현시키는 목적에서 실시하고, 그 결과 발현 벡터 플라스미드 pMMLP-F 를 얻는다.

이어서, COS-7 세포 1.2 ×10⁵세포를 6 웰 플레이트를 사용하고 10% 소 태아 혈청 (FBS) 을 함유한 달베코 변법 최소 배지 (DMEM) 에서 24시간 배양하고, 이 세포에 상기 발현 플라스미드 pMMLP-F (1웰당 0.4㎍) 를 리포펙트아민 (Gibco BRL) 을 사용하여 도입한다. 도입 24시간 후 상기 새로운 배지로 교환하고, 다시 5시간 후에 FBS 불함유 Opti-MEM (Gibco BRL) 으로 바꿔 36시간 배양 후, 그 배양 상청액과 세포 추출액을 얻는다. 세포 추출액은 세포를 생리식염을 함유한 인산완충액 (PBS) 으로 2회 세정한 후 트리스 SDS 샘플 완충액으로 용해 추출하고, 한편 배양 상청액은 한외여과 (분자량 3000 컷) 에서 적절하게 농축한 후 동일 용량의 트리스 SDS 샘플 완충액과 혼합한다. 이들 샘플을 열 처리한 후 15% - 25% SDS-폴리아크릴아미드겔로 전기영동하고, 다시 그 겔로부터 PVDF 막상 (Amersham pharmacia biotech 사) 에 전사한다. 이어서, 이 PVDF 막을 블럭 에이스 (유끼지루시 뉴교(주)) 에서 1시간 블러킹하고 0.05% Tween 20 을 함유한 PBS (PBS-T) 중에서 항FLAG 모노클로날 항체 (10㎍/㎖ ; Kodak 사) 와 2시간 반응시킨다. PBS-T 에서 3회 세정한 후, PBS-T 중에서 서양 고추냉이 과산화효소 표지 항마우스 IgG 염소 항체 (Amersham pharmacia biotech 사 ; 5000배 희석) 와 1시간 반응시킨다. PBS-T 에서 5회 세정한 후, ECLplus 발색 키트 (Amersham pharmacia biotech 사) 및 ECL film (Amersham pharmacia biotech 사) 를 사용하여 화학 발광을 검출한다. 그 결과, 세포 추출액과 함께 배양 상청액 중에도 약 14kDa 의 유전자 산물이 검출되기 때문에, COS-7 세포에서 마우스 MLP-FLAG 융합 단백질이 발현되고 분비되고 있음이 밝혀졌다.

그래서, 이어서 이 마우스 MLP-FLAG 융합 단백질의 N 말단 아미노산 서열을 결정한다. 먼저, 상술한 방법에 준하여 발현시킨 마우스 MLP-FLAG 를 함유한 COS-7 세포 배양 상청액에서 Anti-FLAG^TMM2-Agarose Affinity Gel (Sigma 사) 을 사용한 어피니티 크로마토그래피로 산성 용출 분획 (Glycine-HCl 버퍼 (pH3.5) 로 용출) 을 취득한다. 이 분획을 농축한 후, 본 실시예에 이미 서술한 바와 같은 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 계속해서 CBB 염색을 한 결과, 목적 단백질인 마우스 MLP-FLAG 에 상당하는 단일 밴드만 관찰된다. 그래서, 동 분획의 농축 시료를 동일하게 전기영동하고, 그 겔로부터 이 단백질을 PVDF 막 상에 전사한 후, 펄스리키드 아미노산 시퀀서 Procise CLC491 (PE 바이오시스템사 제조) 을 이용하여 N 말단 아미노산 서열을 결정한다. 그 결과, N 말단에서 순서대로 1.히스티딘, 2.글리신, 3.밸린, 4.페닐알라닌의 각 아미노산 잔기가 검출되고, 서열번호:26 으로 표시되는 마우스 MLP 의 N 말단 서열에 일치한다. 이상과 같은 결과에서 마우스 MLP-FLAG 단백질은 마우스 MLP-FLAG 전구체 단백질의 N 말단의 18 아미노산 잔기의 시그널서열이 절단되어 19 잔기째의 히스티딘 잔기에서 비롯된 마우스 MLP-FLAG 성숙 단백질로서 COS-7 세포에서 배지 중으로 분비됨을 알 수 있다.

실시예 5마우스 MLP-FLAG 융합 단백질 발현 CHO-K1 세포주의 수립

다음과 같은 영역에서 마우스 MLP-FLAG 융합 단백질 발현 CHO-K1 세포주를 수립한다. CHO-K1 세포 3.3 ×10⁴세포를 10㎝ 직경 플라스틱 샬레 상, 10% 소 태아 혈청 (FBS) 을 함유한 F-12 배지 (Gibco BRL 사) 에서 24시간 배양하고, 이들 세포에 실시예 4 에서 얻은 발현 플라스미드 pMMLP-F (1 샬레당 1.5㎍) 를 인산칼슘법 (Cell Phect Transfection Kit (Amersham Pharmacia Biotech 사)) 을 사용하여 도입한다. 도입 12 시간 후 세포를 FBS 를 함유하지 않은 F-12 배지에서 2회 세정한 후, 15% 글리세롤을 함유한 등장 HEPES 용액 (pH7.5) 3㎖ 을 사용하여 3분간 글리세롤 쇼크를 가한다. 그 후 재차 FBS 를 함유하지 않은 F-12 배지에서 2회 세정하고, FBS 를 함유한 F-12 배지에서 다시 12시간 배양한 후에 500㎎/L Geneticin (Gibco BRL 사) 와 10% FBS 를 함유한 F-12 선택 배지 (이하, 선택 배지) 로 교환한다. 10일 후, 샬레 내에서 형성된 Geneticin 내성의 콜로니를 각각 24웰 플레이트에 옮기고 선택 배지에서 3일간 배양한다. 이어서, 선택 배지 내에서 증식된 세포를 6웰 플레이트에 옮기고, 다시 선택 배지에서 4일간 배양한후, 0.02% CHAPS, 0.1mMp-ABSF (와꼬오쥰야꾸 고오교 (주)) 를 함유한 Opti-MEM (Gibco BRL 사) 배지 1㎖ 로 교환하고, 다시 48시간 배양한 후 그 배양 상청액을 회수한다. 얻은 배양 상청액은 Centricon YM-3 한외여과막 (Amicon 사) 을 사용하여 농축한 후, 등용의 트리스 SDS 샘플 완충액과 혼합한다. 이 샘플을 95℃, 5분간 열처리를 실시한 후 18% SDS-폴리아크릴아미드겔로 전기영동하고, 다시 그 겔로부터 영동 단백질을 나일론막 상에 전사한다. 이어서, 이 나일론막을 블럭 에이스 (유끼지루시 뉴쿄(주)) 로 1시간 블러킹하고, 0.05% Tween 20 을 함유한 PBS(PBS-T) 내에서 항FLAG 항체 (1/2000 희석, SIGMA) 와 1시간 반응시킨다. PBS-T 에서 5회 세정한 후 PBS-T 내에서 HRP 표지 항마우스 IgG 양 항체 (1/2000 희석, Amersham Pharmacia Biotech 사) 와 1시간 반응시킨다. PBS-T 에서 5회 세정한 후, ECL 발색 키트 (Amersham Pharmacia Biotech 사) 및 Hyperfilm ECL (Amersham Pharmacia Biotech 사) 를 사용하여 화학 발광을 검출한다. 그 결과, CHO-Kl/mMLP.FLAG#2-1주 유래의 세포 배양 상청액 중에 약 16kDa 의 목적 유전자 산물이 많이 검출되기 때문에 이 세포주를 마우스 MLP-FLAG 융합 단백질 발현 CHO-K1 세포주로서 선택한다.

실시예 6MLP 항혈청의 제조와 이 항혈청을 사용한 재조합 MLP 단백질의 검출

항MLP 항혈청은 다음과 같은 영역에서 제조한다. 먼저, 마우스 MLP 전구체 단백질의 105 잔기째의 밸린에서 124 잔기째의 아스파라긴산까지의 아미노산 서열에 대응하는 펩티드사슬의 C말단에 추가로 시스테인 1개가 부가된 서열번호:31 로 표시되는 합성 펩티드 (Val-Lys-Glu-Gln-Arg-Val-Tyr-Gln-Glu-Ala-Thr-Lys-Glu-Ile-Pro-Thr-Thr-Asp-Ile-Asp-Cys) 를 공지된 방법으로 화학 합성한다. 이 펩티드에 캐리어로서 KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) 를 결합한 것을 항원으로 하여 토끼 (SPF Japanese White Rabbit) 에 면역시킨다. 총 7 회 면역을 실시한 후 전체 채혈하여 공지된 방법으로 혈청 분획을 취득하고, 보존제로서 아지화나트륨 (최종 농도 0.1%) 을 첨가한 후 이 표품을 항MLP 항혈청으로 한다.

이어서, 이 항혈청의 각종 재조합 단백질에 대한 반응성을 웨스턴 블로트 해석에 따라 조사한다. 먼저, 실시예 4 에 기재된 마우스 MLP-FLAG 융합 단백질에 추가로 마우스 MLP 단백질 (FLAG 태그 없음), 인간 MLP-FLAG 융합 단백질, 인간 MLP 단백질 (FLAG 태그 없음), 마우스 MIA-FLAG 융합 단백질, 마우스 MIA 단백질 (FLAG 태그 없음) 의 각 발현 벡터 플라스미드를 구축한다. 구축은 실시예 4 와 동일한 방법으로 pCAN618FLAG 의 클로닝 부위인 EcoRI, SalI 부위에 미리 PCR 클로닝된 목적 DNA 단편을 삽입함으로써 실시한다. 각 PCR 반응에 사용된 프라이머 DNA 세트의 각 염기서열은 마우스 MLP 단백질 (FLAG 태그 없음) 에 대해서는 서열번호:27 과 서열번호:32, 인간 MLP-FLAG 융합 단백질에 대해서는 서열번호:33 과 서열번호:34, 인간 MLP 단백질 (FLAG 태그 없음) 에 대해서는 서열번호:33 과 서열번호:35, 마우스 MIA-FLAG 융합 단백질에 대해서는 서열번호:36 과 서열번호:37, 마우스 MIA 단백질 (FLAG 태그 없음) 에 대해서는 서열번호:36 과 서열번호:38 로 표시되는 염기서열이다. 또한, 주형 DNA 로서는 마우스 MLP 단백질 (FLAG 태그 없음) 은 실시예 4 와 동일한 방법으로 pDRL128vM 을, 인간 MLP-FLAG 융합 단백질과 인간 MLP 단백질 (FLAG 태그 없음) 은 실시예 1 에서 얻은pDRL128vH 를, 그리고 마우스 MIA-FLAG 융합 단백질과 마우스 MIA 단백질 (FLAG 태그 없음) 은 마우스 멜라노머 세포주 B16 에서 조제된 cDNA 를 사용한다. 이렇게 해서 얻은 각 발현 벡터 플라스미드의 COS-7 세포로의 도입, 그리고 취득된 각 배양 상청액에 대한 항FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블로트 해석은 실시예 4 의 방법에 준거하여 실시한다. 또한, 항MLP 항혈청을 사용한 웨스턴 블로트 해석은 1차 항체로서 이 항혈청 (1000 배 희석) 을 2차 항체로서 서양 고추냉이 과산화효소 표지 항토끼 IgG 항체 (Amersham pharmacia biotech 사 ; 5000배 희석) 를 사용하는 것 이외에는 항FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블로트 해석시의 방법에 준거하여 실시한다.

도 2 에 항FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블로트 해석, 도 3 에 항MLP 항혈청을 사용한 웨스턴 블로트 해석의 결과를 나타낸다. 항MLP 항혈청은 항원 펩티드의 유래 단백질인 마우스 MLP 와 함께 인간 MLP 에 대해서도 교차성을 나타내고, 그 반응성은 거의 바뀌지 않는다. 또한, 마우스 MLP-FLAG 융합 단백질, 인간 MLP-FLAG 융합 단백질도 이 항혈청에 반응하기 때문에, FLAG 태그의 존재에도 영향받지 않는다. 한편, 마우스 MIA-FLAG 융합 단백질과 마우스 MIA 단백질 (FLAG 태그 없음) 에 대해서는 전혀 시그널이 검출되지 않기 때문에 이 항혈청이 MLP 분자종으로 특이적임을 알 수 있다.

또한, 이 항혈청을 사용하여 실시예 5 에서 취득된 마우스 MLP-FLAG 발현 CHO 세포주에 대하여 공지된 방법에 준하여 면역 염색을 실시한 결과를 도 4 에 나타낸다. 면역전 토끼 혈청을 사용한 대조 실험에서는 각 세포는 염색되지 않지만 이 항혈청 사용시에는 모든 세포가 염색되기 때문에, 이 항혈청은 미변성의 MLP 단백질과도 반응함을 알 수 있다.

실시예 7연골조직 중에서의 MLP 단백질의 발현

실시예 6 에서 얻은 항MLP 항혈청을 사용하여 연골조직 중에서의 MLP 단백질의 검출을 시도한다. 피검시료로서는 마우스 (BALB/c) 대퇴골 골두 연골을 액체 질소로 동결 파쇄하고, TRIS SDS βME SAMPLE BUFFER (다이이찌 가가꾸 야꾸힝) 로 추출한 후, 원심하여 잔류물을 제거한 것을 사용한다. 1 레인당 마우스 1마리분 유래 상당량의 시료를 SDS-PAGE (15-25%) 로 전기영동 다음에, 실시예 6 과 동일한 방법으로 항MLP 항혈청에 의한 웨스턴 블로트 해석을 실시한다. 그 결과, 마우스 MLP 재조합 단백질과 거의 동일한 영동 위치에 시그널이 검출되기 때문에 MLP 단백질이 이 연골조직 중에서 발현되고 있음을 알 수 있다.

또한, 연골조직 이외의 각종 인간 조직에서의 인간 MLP mRNA 의 발현을 조사하기 위해서, 실시예 1 에서 얻은 인간 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 DNA 단편과 [α-³²P]dCTP (Amersham pharmacia biotech 사 : 6000 Ci/mmol) 을 사용하며 Multiprime DNA labelling system (Amersham pharmacia biotech 사 : RPN. 1601Y) 의 방법으로 프로브를 제조하고, 이 프로브 (비활성 1.3 ×10¹⁰cpm/㎍) 를 사용하며 Human MTE^TMArray (CLONTECH 사 : #7775-1) 에 대하여 하이브리다이제이션을 실시한다. 하이브리다이즈의 조건은 이 어레이막 첨부의 매뉴얼에 따라 최종적인 세정은 0.1 ×SSC, 0.1% SDS 55℃ 에서 실시하고, 검출은 BAS-2000 (후지 필름) 을사용하여 실시한다. 그 결과, 이 어레이 상에서 시그널을 얻을 수 있는 것은 컨트롤의 인간 염색체 DNA (100ng, 500ng) 와 함께 약간 흑질, 태아 뇌의 스폿이었으나, 어떠한 시그널도 검출 한계부근으로, 그 발현량은 전사 단계에서 매우 낮은 것으로 판단된다. 즉, MLP 단백질은 연골조직으로 특이적으로 발현되고 있음이 강하게 시사된다.

실시예 8in vitro 연골 분화 모델에서의 각종 유전자 발현 변동에 대한 MLP 재조합 단백질의 첨가 효과

실시예 3 에 기재된 ATDC5 세포를 사용한 in vitro 연골 분화 모델에서 각종 유전자 발현 변동에 대한 MLP 재조합 단백질의 첨가 효과를 조사한다. MLP 재조합 단백질은 실시예 4 와 동일한 방법으로 마우스 MLP-FLAG 융합 단백질을 발현시킨 COS-7 세포 배양 상청액에서 항FLAG 항체에 의한 어피니티 칼럼 크로마토그래피를 공지된 방법으로 실시하여 정제 농축된 표품을 사용한다. 이 단백질을 모델계 설정 첫날부터 ATDC5 세포에 2일 마다 첨가하고 10일간 배양 후 세포를 회수하여 실시예 3 과 동일한 RT-PCR 법으로 각 유전자 발현을 조사한다. 그 결과, 이 단백질 첨가 세포군에서는 어그리칸, Ⅱ형 콜라겐, Ⅹ형 콜라겐 등 분화에 따라 발현량이 증가되는 각 마커 유전자의 발현 억제가 보인다. 한편, 연골에 대한 분화에 억제적으로 작용하는 PTH/PTHr 수용체 발현에는 그 변동에 유의한 영향은 보이지 않는다. 이런 점에서 MLP 단백질은 ATDC5 를 사용한 본 모델계에서 연골 분화에 억제적으로 작용함을 알 수 있다.

실시예 9래트 MLP 전구체 단백질 (rMLP) 을 코딩하는 유전자의 해석

먼저, rMLP 의 일부를 코딩하는 DNA 단편을 아래와 같은 PCR 법으로 취득한다. 즉, 서열번호:21 로 표시되는 올리고 DNA 를 센스사슬 프라이머로서, 서열번호:22 로 표시되는 올리고 DNA 를 안티센스사슬 프라이머로서 각각 4 pmol 함유하고, 추가로 10 ×Advantage^TM2 PCR Buffer (클론테크사) 2㎕, 50 ×dNTP mix (클론테크사) 0.4㎕, 50 ×Advantage 2 Polymerase Mix (클론테크사) 0.4㎕, 주형 DNA 로서 SD(IGS) 래트 하수체 유래의 cDNA 용액 2㎕ 를 함유한 혼합액 20㎕ 를 조제하고, 서멀 사이클러 (GeneAmp^TMPCR system model 9700 (퍼킨 엘머사)) 를 사용하여 95℃, 1분, 계속해서 95℃, 10초 →54℃, 10초 →72℃, 1분을 35사이클 반복하고, 다시 72℃, 3분으로 신장 반응시키는 프로그램에서 PCR 반응을 실시한다. 반응 종료액을 2.0% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동 후 그 겔을 SYBR^TMGreen I nucleic acid gel stain (모레큘러 프로브사) 으로 염색한 결과, 분자량 마커 환산으로 300bp 부근의 위치에 PCR 반응으로 증폭된 DNA 에 대한 밴드를 확인한다. 키아퀵겔 엑스트라 쿠션 키트 (키아겐사) 를 사용하여 이 DNA 단편을 회수하고, 염기서열을 결정하기 위해서 pCR^TM2.1-Topo (인비드로젠사) 를 사용하여 TA 클로닝하여 이 플라스미드를 대장균 (Escherichia coli) Epicurian Coli XL10-Gold^TM주 (스트래터 진사) 의 컴피턴트 셀로 도입한다. 암피실린 함유 LB 한천 배지 상에서 출현하는 암피실린 내성 형질전환체의 콜로니 중에서 외래 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 유지한 클론을 선택하고, 동 클론에서 이 플라스미드 DNA, pDRL128vR 을 조제한다. 삽입 DNA 의 염기서열을 결정하기 위해서 pDRL128vR 을 주형 DNA, 시판 프라이머 DNA (Bca BEST Primer RV-P (다까라슈조 (주)) 를 시퀀스 프라이머로 하고, ABI PRISM^TMBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (퍼킨 엘머사) 를 사용한 시퀀스 반응을 첨부자료의 조건에 따라 서멀 사이클러 (GeneAmp^TMPCR system model 9700 (퍼킨 엘머사)) 로 실시한 후, 이 반응 시료를 DNA 시퀀서 ABI PRISM^TM377 (퍼킨 엘머사) 로 분석한다.

그 결과, pDRL128vR 에는 서열번호:39 로 표시되는 87개의 아미노산으로 이루어진 신규 래트 MLP 전구체 단백질의 일부를 코딩하는 서열번호:40 으로 표시되는 261 염기쌍의 DNA 단편을 함유하며 서열번호:41 로 표시되는 307 염기쌍의 DNA 단편이 함유된다.

이어서, 이 단백질을 코딩하는 유전자에 대해서 상기 염기서열로부터 5'상류측 및 3'하류측의 구조를 더욱 조사하기 위해서 genome walking 을 실시한다. 피검재료로서 Rat GenomeWalker^TMKit (클론테크사) 를 사용하고, 방법은 PCR 반응용의 효소로서 TaKaRaEx Taq^TM(다까라슈조(주)) 을 사용한 점을 제외하고는 동 키트의 첨부자료에 따른다. 먼저, gene specific primer 로서 서열번호:40 으로 표시되는 염기서열의 일부에 해당하는 2 종류의 올리고 DNA (rMLPGWF1 (서열번호:42), rMLPGWF2 (서열번호:43)) 와 이 서열의 일부에 상보적인 서열의 2 종류의 올리고 DNA (rMLPGWR1 (서열번호:44), rMLPGWR2 (서열번호:45)) 를 각각 화학 합성한다. 이들은 3'하류측 DNA 취득을 위한 1st PCR 반응에서는 rMLPGWF1, 계속되는 nested PCR 반응에서는 rMLPGWF2 를 사용하고, 그리고 5'상류측 DNA 취득을 위한 1st PCR 반응에서는 rMLPGWR1, 계속되는 nested PCR 반응에서는 rMLPGWR2 를 사용한다. 이들 반응으로 얻은 각 증폭 DNA 단편에 대해서 상기 프라이머 서열 부위를 기점으로 하여 인간 및 마우스 MLP 전구체 단백질을 코딩하는 cDNA 의 염기서열과의 상동성을 비교하면서 각각의 염기서열을 해석한다. 그 결과, 판명된 게놈의 1차 구조에서, 래트 MLP 전구체 단백질은 서열번호:46 으로 표시되는 384 염기의 DNA 로 코딩되는 서열번호 : 47 로 표시되는 128개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질임을 알 수 있다. 래트 MLP 전구체 단백질과 인간 MLP 전구체 단백질 및 마우스 MLP 전구체 단백질의 아미노산 레벨에서의 상동성은 각각 84.3%, 96.0% 에 도달하나, 래트 MIA 전구체 단백질과 래트 MLP 전구체 단백질의 상동성은 26.5% 에 그친다. 래트 MLP 는 서열번호:48 로 표시되는 330 염기의 DNA 로 코딩하는 서열번호:49 로 표시되는 110개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질로서, 래트 MLP 전구체 단백질로부터 서열번호:50 으로 표시되는 마우스 MLP 와 동일하게 18 아미노산 잔기로 이루어진 시그널 펩티드가 프로세스되어 생성된 것으로 생각된다.

본 실시예에서 얻은 래트 MLP 전구체 단백질의 일부를 코딩하는 DNA 를 유지하는 플라스미드 pDRL128vR 을 대장균 (Escherichia coli) XL10-Gold 에 도입하여 형질전환체 : 대장균 (Escherichia coli) XL10-Gold / pDRL128vR 을 얻는다.

본 발명의 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 DNA 는 예컨대 골ㆍ관절질환, 병적혈관 신생의 진단, 치료, 예방 등에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝을 위한 시약으로서 유용하다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 피검액 내의 본 발명의 폴리펩티드의 검출, 정량, 중화 등에 사용할 수 있다.

또, 본 발명의 프로모터를 사용함으로써 단백질 (임의의 유용 유전자 산물 등) 을 비인간 온혈동물의 연골에서 우위적으로 (바람직하게는 특이적으로) 그리고 대량으로 발현시킬 수 있게 되어 유전자 치료 분야에 공헌할 수 있다.

Claims

서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염.
제 1 항에 있어서, 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염.
제 1 항에 있어서, 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 서열번호:26 으로 표시되는 아미노산 서열인 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염.
제 2 항에 있어서, 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 서열번호:12 로 표시되는 아미노산 서열인 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염.
제 1 항에 있어서, 서열번호:24 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 서열번호:49 로 표시되는 아미노산 서열인 폴리펩티드, 그의아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염.
제 2 항에 있어서, 서열번호:6 으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 서열번호:47 로 표시되는 아미노산 서열인 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염.
제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA.
제 6 항에 있어서, 제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:23 으로 표시되는 염기서열인 DNA.
제 6 항에 있어서, 제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:4 로 표시되는 염기서열인 DNA.
제 6 항에 있어서, 제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:25 로 표시되는 염기서열인 DNA.
제 6 항에 있어서, 제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:10 으로 표시되는 염기서열인 DNA.
제 6 항에 있어서, 제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:48 로 표시되는 염기서열인 DNA.
제 6 항에 있어서, 제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열이 서열번호:46 으로 표시되는 염기서열인 DNA.
제 6 항에 기재된 DNA 를 함유하는 재조합 벡터.
제 14 항에 기재된 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체.
제 15 항에 기재된 형질전환체를 배양하고, 이 폴리펩티드를 생성시키는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염의 제조법.
제 1 항에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염에 대한 항체.
제 1 항에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 염의활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
제 1 항에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 제 1 항에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트.
제 18 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 19 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻은 제 1 항에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염.
제 18 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 19 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻은 제 1 항에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 의약.
제 1 항에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 의약.
제 1 항에 기재된 폴리펩티드, 그의 아미드 또는 그의 에스테르 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 골ㆍ관절질환 또는 병적혈관 신생의 예방ㆍ치료제.
제 17 항에 기재된 항체를 함유하여 이루어진 진단제.