KR20020059726A - 신규 단백질 및 그의 ｄｎａ - Google Patents

Abstract

본 발명의 단백질 및 이것을 코딩하는 DNA 는 예컨대 감염증 등의 질병의 치료ㆍ예방제로서 사용될 수 있다. 또, 본 발명의 단백질은, 본 발명의 단백질의 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝을 위한 시약으로서 유용하다. 또한, 본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염, 본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 중화 항체는, 예컨대 기관지 천식, 만성 폐색성 폐질환 등과 같은 질병의 치료ㆍ예방제로서 사용할 수 있다.

Description

신규 단백질 및 그의 ＤＮＡ {NOVEL PROTEIN AND DNA THEREOF}

기관지 천식은 기도의 만성 염증성 질환으로, 기도 협착을 나타내고 발작성 호흡 곤란, 천식과 오열, 기침 등과 같은 증상이 보인다. 그 발증과 진전에는 기도 상피세포, 비만세포, 호산구, T 림프구 등과 같은 많은 세포가 관여된다. 기관지 천식에서 가장 중요한 특징의 하나는 기도가 자극에 대해 쉽게 반응한다는 점 (기도 과민성) 이다. 이 기도 과민성은 호산구 등 기도에 침윤된 세포에서 분비되는 화학전달물질에 의한 기도 상피의 박리를 중심으로 하는 기도 염증에서 기인되지만, 더불어 유전인자 또는 환경인자도 복잡하게 영향을 미치는 것으로 생각된다.

외부로부터의 자극 (알레르겐, 배기물) 이나 바이러스 감염에 의해 기도의 염증 반응의 계기가 생기면, 기도 상피세포나 기관지 주변의 모세혈관 내피세포 상에 VCAM-1이나 ICAM-1 등의 접착분자가 발현되어 [J. Allergy Clin. Immunol., 96권, p941 (1995)], 사이토카인이나 화학 유주 (遊走) 물질이 생산된다. 기관지 천식 환자는 Th2 형 헬퍼 T 세포의 기능이 항진되어 있어, IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF 등의 Th2 형 사이토카인이나 에오탁신 (eotaxin), RANTES 등의 케모카인 생산이 증가된다. IL-4 나 IL-13 은 IgE 의 생산유도작용이 있고, IL-3 이나 IL-4 는 비만세포의 증식유도작용이 있다. 또한, IL-5, GM-CSF 등의 작용에 의해 호산구가 분화 증식되고, 에오탁신, RANTES 에 의해 기도에 침윤된다 [Allergy Asthma Proc., 20권, p141 (1999)].

기관ㆍ기관지의 점막을 덮고 있는 상피세포는 외부로부터의 자극이 직접 점막하 조직에 전달되는 것을 방지하는 배리어 기능, 분비물이나 이물질의 배설기능을 갖고 있을 뿐 아니라, 상피 유래 평활근 이완인자의 분비 등에 따라 기관 수축을 제어하고 있다. 기관지 천식 환자의 기도에 침윤된 호산구는, 활성화된 MBP (주요 염기성 단백질) 나 ECP (호산구 양이온 단백질) 등과 같은 세포내의 과립 단백질을 탈과립으로 방출한다 [Compr. Ther., 20권, p651 (1994)]. 이들 과립 단백질의 세포상해작용에 의해 상피세포의 박리ㆍ손상이 야기된다. 상피세포 박리는 지각신경말단의 노출, 상피 투과성의 항진, 상피 유래 평활근 이완인자의 상실로 이어진다. 또한, 호산구가 생산하는 류코트리엔 C4 (LTC4) 나 혈소판 활성화인자 (PAF) 는 기관지 평활근의 긴장을 항진시킨다. 이상과 같은 변화가 반복되어 만성화되면, 기관지 벽이 두꺼워져 기도 과민성으로 연결되는 것으로 볼 수 있다.

이상과 같이 기도 염증에 따라 상기 사이토카인이나 접착분자의 유전자 발현이 상승되는 것으로 알려져 있으나, 폐ㆍ기관지의 병변 부위에 발현이 국한되어 기도 과민성 성립과 관련이 있는 유전자 변동을 체계적으로 해석한 보고는 없었다.

한편, 가우처병 환자 혈장 중에 키틴 분해효소 활성이 검출되고 [J. Clin. Invest., 93권, p1288 (1994)], 포유류에서 유일한 키틴 분해효소로서 정제 [J. Biol. Chem., 270권, p2198 (1995)]ㆍ클로닝 [J. Biol. Chem., 270권, p26252 (1995)] 되어 질환 마커로 되어 있으나, 기관지 천식과 키틴 분해효소의 관련은 보고되어 있지 않다.

본 발명은 기도 과민성이 항진된 폐ㆍ기관지에서 발현이 상승되는 신규 단백질 또는 그의 염, 부분 펩티드 또는 그의 염, 시그널 펩티드, 이 단백질, 부분 단백질 또는 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA, 재조합 벡터, 형질전환체, 이 단백질의 제조 방법, 이 단백질 또는 DNA 를 함유하여 이루어진 의약, 이 단백질에 대한 항체, 이 단백질의 발현을 억제하거나 또는 촉진하는 화합물의 스크리닝 방법, 이 단백질의 활성을 억제하거나 촉진하는 화합물의 스크리닝 방법, 이 스크리닝 방법으로 수득한 화합물 등을 제공한다.

본 발명은 기관지 천식이나 만성 폐색성 폐질환 등의 진단 마커, 약제 타겟 또는 감염증, 면역부전증 등의 치료약, 예방약 등으로서 유용한 신규 단백질 및 그의 DNA 에 관한 것이다.

도 1 은 실시예 2 에서 나타낸 정상 및 기도 민감성 항진 모델 마우스에서의 ECF-L 유전자산물 (mRNA) 의 조직분포를 나타낸다. 도면에서, Lu, H, Li, Ki, Br, Thy, Sp, SI, LI, St 및 PBL 은 각각 폐, 심장, 간장, 신장, 뇌, 흉선, 비장, 소장, 대장, 위 및 말초혈 림프구를 나타낸다.

도 2 는 실시예 3 에서 나타낸 실험의 투약 스케줄을 나타낸다.

도 3 은 아세틸콜린 500㎍/㎏ 투여에 대한 기도 반응성의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸다. Ach 는 아세틸콜린을 나타낸다.

도 4 는 실시예 3 에서 나타낸 폐포 세정액 중 침윤 세포수의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸다. Mφ, Eos, Neu 및 Lym 은 각각 매크로파지, 호산구, 호중구 및 림프구를 나타낸다.

도 5 는 실시예 3 에서 나타낸 기도 과민성 항진 모델 마우스에서의 ECF-L 유전자산물 (mRNA) 의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸다.

도 6 은 실시예 4 에서 나타낸 기도 과민성 항진 모델 마우스 및 정상 마우스의 폐 동결 절편에서의 ECF-L 유전자 발현부위를 나타낸다.

도 7 은 인간 유래 ECF-L 유사 단백질을 코딩하는 DNA (인간 ECF-L) 와 마우스 ECF-L 유전자 (마우스 ECF-L) 의 염기 서열의 비교를 나타낸다.

도 8 은 인간 유래 ECF-L 유사 단백질 (인간 ECF-L) 과 마우스 ECF-L 유전자 (마우스 ECF-L) 의 아미노산 서열의 비교를 나타낸다.

도 9 는 인간 유래 ECF-L 유사 단백질 (인간 ECF-L) 과 키틴 분해효소 패밀리에 속하는 다른 단백질 (인간 키토트리옥시다아제, 인간 HC-gp39prt, 인간 YKL-39) 의 아미노산 서열의 비교를 나타낸다 (도 10 으로 계속됨).

도 10 은 인간 유래 ECF-L 유사 단백질 (인간 ECF-L) 과 키틴 분해효소 패밀리에 속하는 다른 단백질 (인간 키토트리옥시다아제, 인간 HC-gp39prt, 인간 YKL-39) 의 아미노산 서열의 비교를 나타낸다 (도 9 에서 계속됨).

도 11 은 인간 유래 ECF-L 유사 단백질을 코딩하는 유전자 (mRNA) 의 조직분포를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 (이하, 본 발명의 단백질 Ⅰ 이라고 함) 또는 본 발명에서 사용되는 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 (이하, 단백질 Ⅱ 라고 함) 은, 인간이나 온혈동물 (예컨대, 모르모트, 래트, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 세포 (예컨대, 간세포, 지라세포, 신경세포, 글리아세포, 췌장β세포, 골수세포, 메산기움세포, 랑겔한스세포, 표피세포, 상피세포, 배(杯)세포, 내피세포, 평활근세포, 섬유아세포, 섬유세포, 근세포, 지방세포, 면역세포 (예, 매크로파지, T 세포, B 세포, 내추럴킬러세포, 비만세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단구), 거핵구, 골막세포, 연골세포, 골세포, 골아세포, 파골세포, 유선세포, 간세포 또는 간질세포, 또는 이들 세포의 전구세포, 줄기세포 또는 암세포 등) 또는 이들 세포가 존재하는 모든 조직, 예컨대 뇌, 뇌의 각 부위 (예, 후구, 편도핵, 대뇌기저구, 해마, 시상, 시상 하부, 대뇌 피질, 연수, 소뇌), 척수, 하수체, 위, 췌장, 신장, 간장, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 근육, 폐, 소화관 (예, 대장, 소장), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 악하선, 말초혈, 전립선, 고환, 난소, 태반, 자궁, 골, 관절, 골격근 등에서 유래하는 단백질이거나 합성 단백질일 수도 있다.

서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로서는, 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질로서는, 예컨대 상기 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며, 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 성질을 갖는 단백질 등이 바람직하다.

실질적으로 동질의 성질로서는, 예컨대 폐ㆍ기관지의 발현 패턴이나 발현 시기, 키틴 분해효소 활성 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질이라 함은, 이것들의 성질이 정성적(定性的)으로 동질임을 나타낸다. 따라서, 폐ㆍ기관지의 발현 패턴이나 시기 또는 키틴 분해효소 활성이 동등한 것이 바람직하지만, 이것들의 성질 정도, 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 다를 수도 있다.

또, 본 발명의 단백질 Ⅰ 로서는, 예컨대 ① 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼30 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, ② 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼30 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, ③ 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼30 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 삽입된 아미노산 서열, ④ 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼30 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 또는 ⑤ 이것들을 조합한 아미노산 서열을 함유한 단백질 등의 이른바 뮤테인도 포함된다.

서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로서는, 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질로서는, 예컨대 상기 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며, 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 성질을 갖는 단백질 등이 바람직하다.

실질적으로 동질의 성질로서는, 예컨대 폐ㆍ기관지의 발현 패턴이나 발현 시기 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질이라 함은, 이것들의 성질이 정성적으로 동질임을 나타낸다. 따라서, 폐ㆍ기관지의 발현 패턴이나 시기가 동등한 것이 바람직하지만, 이것들의 성질 정도, 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 다를 수도 있다.

또, 단백질 Ⅱ 로서는, 예컨대 ① 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼30 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, ② 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼30 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, ③ 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼30 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 삽입된 아미노산 서열, ④ 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼30 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 또는 ⑤ 이것들을 조합한 아미노산 서열을 함유한 단백질 등의 이른바 뮤테인도 포함된다.

본 명세서의 단백질은 펩티드 표기의 관례에 따라 좌단이 N 말단 (아미노말단), 우단이 C 말단 (카르복실말단) 이다. 서열번호:1 또는 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 단백질을 비롯한 본 발명의 단백질 Ⅰ 또는 단백질 Ⅱ 는, C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, C 말단이 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 일 수도 있다.

여기에서, 에스테르의 R 로서는, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸 등과 같은 C_1-6알킬기, 예컨대 시클로펜틸, 시클로헥실 등과 같은 C_3-8시클로알킬기, 예컨대 페닐, α-나프틸 등과 같은 C_6-12아릴기, 예컨대 벤질, 펜에틸 등과같은 페닐C_1-2알킬기 또는 α-나프틸메틸 등과 같은 α-나프틸메틸-C_1-2알킬기 등의 C_7-14아르알킬기, 피발로일옥시메틸기 등이 사용된다.

본 발명의 단백질 Ⅰ 또는 단백질 Ⅱ 가 C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 함유하는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것도 본 발명의 단백질 Ⅰ 또는 단백질 Ⅱ 에 포함된다. 이 경우 에스테르로서는, 예컨대 상기한 C 말단의 에스테르 등이 사용된다.

또한, 본 발명의 단백질 Ⅰ 에는, N 말단의 아미노산 잔기 (예, 메티오닌 잔기) 의 아미노기가 보호기 (예컨대, 포르밀기, 아세틸기 등과 같은 C_1-6알카노일 등의 C_1-6아실기 등) 로 보호되어 있는 것, 생체 내에서 절단되어 생성되는 N 말단의 글루타민 잔기가 피로글루타민화된 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄상의 치환기 (예컨대, -OH, -SH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등) 가 적당한 보호기 (예컨대, 포르밀기, 아세틸기 등과 같은 C_1-6알카노일 등의 C_1-6아실기 등) 로 보호되어 있는 것, 또는 당쇄가 결합된 이른바 당단백질 등의 복합 단백질 등도 포함된다.

본 발명의 단백질 Ⅰ 의 구체예로서는, 예컨대 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 인간 위 유래의 단백질 등을 들 수 있다.

또, 단백질 Ⅱ 의 구체예로서는, 예컨대 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 마우스 유래의 단백질 등을 들 수 있다.

본 발명의 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질에는, 예컨대 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 의 N 말단 또는(및) C 말단에 1개 또는 2 개 이상, 바람직하게는 1∼200 개 정도, 더 바람직하게는 1∼100 개 정도, 더더욱 바람직하게는 1∼50 개 정도의 아미노산이 결합된 전구체 단백질 (이하, 본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 이라고 함) 도 포함된다.

본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 은, 예컨대 상기한 인간이나 온혈동물 (예컨대, 모르모트, 래트, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 세포 또는 이것들의 세포가 존재하는 모든 조직 등에서 유래되는 단백질이거나 합성 단백질일 수도 있다.

또, 본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 은 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 을 생성할 수 있는 단백질이면 어느 것이도 된다. 따라서, 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 다를 수도 있다.

또한, 본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 은 C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 과 같이 C 말단이 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 일 수도 있다.

그리고, 본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 에는, 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 과 마찬가지로 C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 갖고 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것, N 말단의 아미노산 잔기 (예, 메티오닌 잔기) 의 아미노기가 보호기로 보호되어 있는 것, N 단측이 생체 내에서 절단되어 생성된 글루타민 잔기가 피로글루타민산화된 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄상의 치환기가 적당한 보호기로 보호되어 있는 것, 또는 당쇄가 결합된 이른바 당단백질 등의 복합 단백질 등도 포함된다.

본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 의 구체예로서는, 예컨대 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 본 발명의 단백질 Ⅰ 의 N 말단에, 후술하는 서열번호:2 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 본 발명의 시그널 펩티드가 결합된 단백질 (즉, 서열번호:5 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 단백질) 등을 들 수 있다.

예컨대, 후술하는 시그널 펩티드를 함유한 본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 은 본 발명의 단백질 Ⅰ 을 효율적으로 세포 밖으로 분비시킬 수 있다. 또, 본 발명의 단백질 Ⅰ 을 제조하기 위한 중간체로서 유용하다.

또한, 본 발명의 전구체 단백질은 본 발명의 단백질 Ⅰ 과 동일한 활성을 발휘할 수 있기 때문에, 본 발명의 단백질 Ⅰ 과 동일하게 사용할 수 있다.

서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질에는, 예컨대 상기한 단백질 Ⅱ 의 N 말단 또는(및) C 말단에 1개 또는 2 개 이상, 바람직하게는 1∼200 개 정도, 더 바람직하게는 1∼100 개 정도, 더더욱 바람직하게는 1∼50 개 정도의 아미노산이 결합된 전구체 단백질 (이하, 본 발명의 전구체 단백질 Ⅱ 라고 함) 도 포함된다.

전구체 단백질 Ⅱ 는, 예컨대 상기한 인간이나 온혈동물 (예컨대, 모르모트,래트, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 세포 또는 이들 세포가 존재하는 모든 조직 등에서 유래되는 단백질이거나 합성 단백질일 수도 있다.

또, 본 발명의 전구체 단백질 Ⅱ 는 상기한 단백질 Ⅱ 를 생성할 수 있는 단백질이면 어느 것이도 된다. 따라서, 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 다를 수도 있다.

또한, 전구체 단백질 Ⅱ 는 C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, 상기한 단백질 Ⅱ 와 같이 C 말단이 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 일 수도 있다.

그리고, 전구체 단백질 Ⅱ 에는 상기한 단백질 Ⅱ 와 마찬가지로 C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 갖고 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것, N 말단의 아미노산 잔기 (예, 메티오닌 잔기) 의 아미노기가 보호기로 보호되어 있는 것, N 단측이 생체 내에서 절단되어 생성된 글루타민 잔기가 피로글루타민산화된 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄상의 치환기가 적당한 보호기로 보호되어 있는 것, 또는 당쇄가 결합된 이른바 당단백질 등의 복합 단백질 등도 포함된다.

전구체 단백질 Ⅱ 의 구체예로서는, 예컨대 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 단백질 Ⅱ 의 N 말단에 시그널 펩티드가 결합된 단백질 (즉, 서열번호:17 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 단백질) 등을 들 수 있다.

예컨대, 시그널 펩티드 (서열번호:17 로 표시되는 아미노산 서열의 제 1∼21번째의 아미노산 잔기) 를 갖는 전구체 단백질 Ⅱ 는 단백질 Ⅱ 를 효율적으로 세포 밖으로 분비시킬 수 있다. 또, 단백질 Ⅱ 를 제조하기 위한 중간체로서 유용하다.

또한, 전구체 단백질 Ⅱ 는 단백질 Ⅱ 와 동일한 활성을 발휘할 수 있기 때문에, 단백질 Ⅱ 와 동일하게 사용할 수 있다.

본 발명의 단백질 Ⅰ 의 부분 펩티드 (이하, 본 발명의 부분 펩티드 Ⅰ 라고 함) 로서는, 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 의 부분 펩티드로서, 바람직하게는 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 과 동일한 성질을 갖는 것이면 어느 것이어도 된다. 예컨대, 본 발명의 단백질 Ⅰ 의 구성 아미노산 서열 중 적어도 20 개 이상, 바람직하게는 50 개 이상, 더더욱 바람직하게는 70 개 이상, 보다 바람직하게는 100 개 이상, 가장 바람직하게는 200 개 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 등이 사용된다.

또, 본 발명의 부분 펩티드 Ⅰ 은 그의 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼10 개 정도, 더 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 결실되거나, 그의 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼20 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 부가되거나, 그의 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼20 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 삽입되거나, 그의 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼10 개 정도, 더 바람직하게는 몇개, 더더욱 바람직하게는 1∼5 개 정도) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수도 있다.

또, 본 발명의 부분 펩티드 Ⅰ 은 C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 과 같이 C 말단이 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 일 수도 있다.

또한, 본 발명의 부분 펩티드 Ⅰ 에는, 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 과 마찬가지로 C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 갖고 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것, N 말단의 아미노산 잔기 (예, 메티오닌 잔기) 의 아미노기가 보호기로 보호되어 있는 것, N 단측이 생체 내에서 절단되어 생성된 글루타민 잔기가 피로글루타민산화된 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄상의 치환기가 적당한 보호기로 보호되어 있는 것, 또는 당쇄가 결합된 이른바 당펩티드 등의 복합 펩티드 등도 포함된다.

본 발명의 부분 펩티드 Ⅰ 은 항체 작성을 위한 항원으로서도 사용할 수 있다.

단백질 Ⅱ 의 부분 펩티드 (이하, 부분 펩티드 Ⅱ 라고 함) 로서는, 상기한 단백질 Ⅱ 의 부분 펩티드로서, 바람직하게는 상기한 단백질 Ⅱ 와 동일한 성질을 갖는 것이면 어느 것이어도 된다. 예컨대, 단백질 Ⅱ 의 구성 아미노산 서열 중 적어도 20 개 이상, 바람직하게는 50 개 이상, 더더욱 바람직하게는 70 개 이상, 보다 바람직하게는 100 개 이상, 가장 바람직하게는 200 개 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 등이 사용된다.

또, 부분 펩티드 Ⅱ 는 그의 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼10 개 정도, 더 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 결실되거나, 그의 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼20 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 부가되거나, 그의 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼20 개 정도, 더 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇(1∼5)개) 의 아미노산이 삽입되거나, 그의 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼10 개 정도, 더 바람직하게는 몇개, 더더욱 바람직하게는 1∼5 개 정도) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수도 있다.

또, 부분 펩티드 Ⅱ 는 C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, 상기한 단백질 Ⅱ 와 같이 C 말단이 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 일 수도 있다.

또한, 부분 펩티드 Ⅱ 에는, 상기한 본 발명의 단백질 Ⅱ 와 마찬가지로 C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 갖고 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것, N 말단의 아미노산 잔기 (예, 메티오닌 잔기) 의 아미노기가 보호기로 보호되어 있는 것, N 단측이 생체 내에서 절단되어 생성된 글루타민 잔기가 피로글루타민산화된 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄상의 치환기가 적당한 보호기로 보호되어 있는 것, 또는 당쇄가 결합된 이른바 당펩티드 등의 복합 펩티드 등도 포함된다.

부분 펩티드 Ⅱ 는 항체 작성을 위한 항원으로서도 사용할 수 있다.

본 발명의 시그널 펩티드는 예컨대 서열번호:2 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 (이하, 본 발명의 시그널 펩티드 Ⅰ 이라고 함) 등이 사용된다.

본 발명의 시그널 펩티드 Ⅰ 은, 예컨대 상기한 인간이나 온혈동물 (예컨대, 모르모트, 래트, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 세포 또는 이들 세포가 존재하는 모든 조직 등에서 유래되는 펩티드이거나 합성 펩티드일 수도 있다.

서열번호:2 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는, 서열번호:2 로 표시되는 아미노산 서열과 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 서열번호:2 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며, 시그널 펩티드로서의 기능을 발휘할 수 있는 펩티드이면 어느 것이어도 된다. 따라서, 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 다를 수도 있다.

또, 본 발명의 시그널 펩티드 Ⅰ 은, 그의 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼10 개 정도, 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개) 의 아미노산이 결실되거나, 그의 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼10 개 정도, 바람직하게는 1∼5 개 정도, 더욱 바람직하게는 1∼3개) 의 아미노산이 부가되거나, 그의 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼10 개 정도, 바람직하게는 1∼5 개 정도, 더욱 바람직하게는 1∼3개) 의 아미노산이 삽입되거나, 그의 아미노산 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1∼10 개 정도, 바람직하게는 1∼5 개 정도, 더욱 바람직하게는 1∼3개) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수도 있다.

또, 본 발명의 시그널 펩티드 Ⅰ 은, C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 과 같이 C 말단이 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 일 수도 있다.

또, 본 발명의 시그널 펩티드 Ⅰ 에는, 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 과 마찬가지로, C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 갖고 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것, N 말단의 아미노산 잔기 (예, 메티오닌 잔기) 의 아미노기가 보호기로 보호되고 있는 것, N 단측이 생체 내에서 절단되어 생성된 글루타민 잔기가 피로글루타민산화된 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄상의 치환기가 적당한 보호기로 보호되어 있는 것, 또는 당쇄가 결합된 이른 당펩티드 등의 복합 펩티드 등도 포함된다.

본 발명의 시그널 펩티드 Ⅰ 의 구체예로서는, 예컨대 서열번호:5 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 로부터 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질 Ⅰ 을 제거한, 서열번호:2 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 펩티드 등이 사용된다.

본 발명의 시그널 펩티드 Ⅰ 은 본 발명의 단백질 Ⅰ 을 비롯한 각종 세포외분비 단백질을 효율적으로 세포 밖으로 분비시킬 수 있다.

본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ, 부분 펩티드 Ⅰ 또는 시그널 펩티드 Ⅰ 또는 단백질 Ⅱ, 전구체 단백질 Ⅱ 또는 부분 펩티드 Ⅱ 의 염으로서는, 생리학적으로 허용되는 산 (예, 무기산, 유기산) 이나 염기 (예, 알칼리 금속염) 등과의 염이 사용되고, 특히 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다. 이러한 염으로는, 예컨대 무기산 (예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염, 또는 유기산 (예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸말산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용된다.

본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ, 부분 펩티드 Ⅰ, 단백질 Ⅱ, 전구체 단백질 Ⅱ, 부분 펩티드 Ⅱ 또는 그의 염은, 전술한 인간이나 온혈동물의 세포 또는 조직에서 자체 공지된 단백질의 정제방법으로 제조할 수도 있고, 이것들의 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유한 형질전환체를 배양함으로써 제조할 수도 있다. 또, 후술하는 펩티드 합성법에 따라 제조할 수도 있다.

인간이나 포유동물의 조직 또는 세포로 제조하는 경우, 인간이나 포유동물의 조직 또는 세포를 호모지나이징한 후 산 등으로 추출하고, 이 추출액을 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피를 조합함으로써 정제 단리할 수 있다.

본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ, 부분 펩티드 Ⅰ, 시그널 펩티드 Ⅰ, 단백질 Ⅱ, 전구체 단백질 Ⅱ, 부분 펩티드 Ⅱ 또는 그의 염 또는 그의 아미드체의 합성에는, 통상 시판되는 단백질 합성용 수지를 사용할 수 있다. 이러한 수지로서는, 예컨대 클로로메틸수지, 히드록시메틸수지, 벤즈히드릴아민수지, 아미노메틸수지, 4-벤질옥시벤질알콜수지, 4-메틸벤즈히드릴아민수지, PAM수지, 4-히드록시메틸메틸페닐아세트아미드메틸수지, 폴리아크릴아미드수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-히드록시메틸)페녹시수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc아미노에틸)페녹시수지 등을 들 수 있다. 이러한 수지를 사용하여 α-아미노기와 측쇄 관능기를 적당히 보호한 아미노산을, 목적하는 단백질 또는 펩티드의 서열대로 자체 공지된 각종 축합방법에 따라 수지 상에서 축합시킨다. 반응 마지막에 수지로부터 단백질 또는 펩티드를 절단하는 동시에 각종 보호기를 제거하고, 추가로 고희석된 용액 중에서 분자 내 디술피드결합 형성반응을 실시하여 목적하는 단백질 또는 펩티드 또는 그의 아미드체를 취득한다.

상기한 보호 아미노산의 축합에 관해서는, 단백질 합성에 사용할 수 있는 각종 활성화 시약을 사용할 수 있으나 특히 카르보디이미드류가 좋다. 카르보디이미드류로서는, DCC, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프롤릴)카르보디이미드 등이 사용된다. 이것들에 의한 활성화에는 라세미화 억제첨가제 (예컨대, HOBt, HOOBt) 와 함께 보호 아미노산을 직접 수지에 첨가하거나, 대칭 산 무수물 또는 HOBt 에스테르 또는 HOOBt 에스테르로서 미리 보호 아미노산의 활성화를 실시한 후에 수지에 첨가할 수 있다.

보호 아미노산의 활성화 또는 수지와의 축합에 사용되는 용매로서는, 단백질 축합 반응에 사용할 수 있음이 알려져 있는 용매에서 적절하게 선택할 수 있다.예컨대, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등과 같은 산 아미드류, 염화메틸렌, 클로로포름 등과 같은 할로겐화 탄화수소류, 트리플루오로에탄올 등과 같은 알콜류, 디메틸술폭시드 등과 같은 술폭시드류, 피리딘, 디옥산, 테트라히드로푸란 등과 같은 에테르류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등과 같은 니트릴류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등과 같은 에스테르류 또는 이것들의 적절한 혼합물 등이 사용된다. 반응 온도는 단백질 결합 형성반응에 사용될 수 있음이 알려져 있는 범위에서 적절하게 선택되고, 통상 약 -20℃∼50℃ 범위에서 적절하게 선택된다. 활성화된 아미노산 유도체는 통상 1.5∼4 배 과잉으로 사용된다. 닌히드린 반응을 사용한 테스트 결과, 축합이 불충분한 경우에는 보호기의 탈리를 실시하지 않고 축합반응을 반복함으로써 충분한 축합을 실시할 수 있다. 반응을 반복해도 충분한 축합을 수득할 수 없을 때에는 무수아세트산 또는 아세틸이미다졸을 사용하여 미반응 아미노산을 아세틸화시킴으로써 이후의 반응에 영향을 주지 않도록 할 수 있다.

원료의 아미노기의 보호기로서는, 예컨대 Z, Boc, t-펜틸옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 4-메톡시벤질옥시카르보닐, Cl-Z, Br-Z, 아다만틸옥시카르보닐, 트리플루오로아세틸, 프탈로일, 포르밀, 2-니트로페닐술페닐, 디페닐포스피노티오일, Fmoc 등이 사용된다.

카르복실기는 예컨대 알킬 에스테르화 (예컨대, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, t-부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 2-아다만틸 등과 같은 직쇄형, 분지형 또는 고리형 알킬에스테르화), 아르알킬에스테르화 (예컨대, 벤질에스테르, 4-니트로벤질에스테르, 4-메톡시벤질에스테르, 4-클로로벤질에스테르, 벤즈히드릴 에스테르화), 페나실 에스테르화, 벤질옥시카르보닐 히드라지드화, t-부톡시카르보닐 히드라지드화, 트리틸 히드라지드화 등에 의해 보호될 수 있다.

세린의 수산기는, 예컨대 에스테르화 또는 에테르화에 의해 보호될 수 있다. 이 에스테르화에 적합한 기로서는, 예컨대 아세틸기 등의 저급 (C_1-6) 알카노일기, 벤조일기 등의 아로일기, 벤질옥시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등 탄산에서 유도되는 기 등이 사용된다. 또, 에테르화에 적합한 기로서는, 예컨대 벤질기, 테트라히드로피라닐기, t-부틸기 등이다.

티로신의 페놀성 수산기의 보호기로서는, 예컨대 Bzl, Cl₂-Bzl, 2-니트로벤질, Br-Z, t-부틸 등이 사용된다.

히스티딘의 이미다졸의 보호기로서는, 예컨대 Tos, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐, DNP, 벤질옥시메틸, Bum, Boc, Trt, Fmoc 등이 사용된다.

원료의 카르복실기가 활성화된 것으로는, 예컨대 대응하는 산 무수물, 아지드, 활성 에스테르 [알콜 (예컨대, 펜타클로로페놀, 2,4,5-트리클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸알콜, 파라니트로페놀, HONB, N-히드록시숙시미드, N-히드록시프탈이미드, HOBt) 과의 에스테르] 등이 사용된다. 원료의 아미노기가 활성화된 것으로는 예컨대 대응하는 인산아미드가 사용된다.

보호기의 제거 (탈리) 방법으로는, 예컨대 Pd-블랙 또는 Pd-탄소 등의 촉매 존재하에서 수소기류 중에서의 접촉 환원이나, 또한 무수 플루오르화수소, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로아세트산 또는 이것들의 혼합액 등에 의한 산 처리나, 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피페리딘, 피페라진 등에 의한 염기 처리, 그리고 액체 암모니아 중 나트륨에 의한 환원 등도 사용된다. 상기 산 처리에 의한 탈리 반응은 일반적으로 약 -20℃∼40℃ 온도에서 실시되지만, 산 처리에서는, 예컨대 아니솔, 페놀, 티오아니솔, 메탄크레졸, 파라크레졸, 디메틸술피드, 1,4-부탄디티올, 1,2-에탄디티올 등과 같은 양이온 보족제의 첨가가 유효하다. 또, 히스티딘의 이미다졸 보호기로서 사용되는 2,4-디니트로페닐기는 티오페놀 처리에 의해 제거되고, 트립토판의 인돌 보호기로서 사용되는 포르밀기는 상기 1,2-에탄디티올, 1,4-부탄디티올 등의 존재하의 산 처리에 의한 탈보호 이외에 묽은 수산화나트륨 용액, 묽은 암모니아 등에 의한 알칼리 처리에 의해서도 제거된다.

원료의 반응에 관여해야 하지 않는 관능기의 보호 및 보호기, 그리고 이 보호기의 탈리, 반응에 관여한 관능기의 활성화 등은 공지된 기 또는 공지된 수단에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

목적하는 단백질 또는 펩티드의 아미드체를 수득하는 다른 방법으로는, 예컨대 먼저 카르복시 말단 아미노산의 α-카르복실기를 아미드화시켜 보호한 후, 아미노기측에 펩티드 (단백질) 쇄를 원하는 사슬길이까지 신장시킨 후, 이 펩티드쇄의 N 말단의 α-아미노기의 보호기만 제거한 단백질 또는 펩티드와 C 말단의 카르복실기의 보호기만 제거한 단백질 또는 펩티드를 제조하고, 이 두 단백질 또는 펩티드를 상기한 바와 같은 혼합 용액 중에서 축합시킨다. 축합 반응의 상세함에 대해서는 상기한 바와 같다. 축합에 의해 수득된 보호 단백질 또는 펩티드를 정제한 후, 상기 방법으로 모든 보호기를 제거하여 원하는 조(粗)단백질 또는 펩티드를 수득할 수 있다. 이 조단백질 또는 펩티드는 이미 알려진 각종 정제수단을 구사하여 정제하고, 주요 분획을 동결 건조시킴으로써 원하는 단백질 또는 펩티드의 아미드체를 수득할 수 있다.

목적하는 단백질 또는 펩티드의 에스테르체를 수득하기 위해서는, 예컨대 카르복시 말단 아미노산의 α-카르복실기를 원하는 알콜류와 축합시켜 아미노산에스테르로 한 후, 단백질 또는 펩티드의 아미드체와 동일하게 하여 원하는 단백질 또는 펩티드의 에스테르체를 수득할 수 있다.

본 발명의 부분 펩티드 Ⅰ, 시그널 펩티드 Ⅰ 또는 부분 펩티드 Ⅱ 또는 그의 염은 자체 공지된 펩티드의 합성법에 따라, 또는 본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ, 단백질 Ⅱ 또는 전구체 단백질 Ⅱ 를 적당한 펩티다아제로 절단함으로써 제조할 수 있다. 펩티드의 합성법으로서는, 예컨대 고상 합성법, 액상 합성법 중 어느 방법이어도 된다. 즉, 본 발명의 부분 펩티드 또는 시그널 펩티드를 구성할 수 있는 부분 펩티드 또는 아미노산과 잔여 부분을 축합시키고, 생성물이 보호기를 갖는 경우에는 보호기를 탈리함으로써 목적하는 펩티드를 제조할 수 있다. 공지된 축합방법이나 보호기의 탈리로서는, 예컨대 다음과 같은 ①∼⑤ 에 기재된 방법을 들 수 있다.

① M. Bodanszky 및 M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966년)

② Schroeder 및 Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965년)

③ 이즈미야 노부오 외, 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠(주) (1975년)

④ 야지마 하루아끼 및 사까끼바라 순페이, 생화학 실험강좌 1, 단백질 화학Ⅳ, 205 (1977년)

⑤ 야지마 하루아끼 감수, 속 의약품 개발, 제 14 권, 펩티드 합성, 히로가와쇼뗑

또, 반응 후에는 통상적인 정제법, 예컨대 용매 추출ㆍ증류ㆍ칼럼 크로마토그래피ㆍ액체 크로마토그래피ㆍ재결정 등을 조합하여 본 발명의 단백질 또는 펩티드를 정제 단리할 수 있다. 상기 방법으로 수득된 단백질 또는 펩티드가 유리체인 경우에는, 공지 방법 또는 이에 준하는 방법으로 적당한 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 수득된 경우에는, 공지 방법 또는 이에 준하는 방법으로 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.

본 발명의 단백질 Ⅰ 또는 단백질 Ⅱ 를 코딩하는 DNA 로서는, 전술한 본 발명의 단백질 Ⅰ 또는 단백질 Ⅱ 를 코딩하는 염기 서열을 함유한 것이면 어떠한 것이어도 된다. 또, 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 상기한 세포ㆍ조직 유래의 cDNA, 상기한 세포ㆍ조직 유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 중 어느 것이어도 된다.

라이브러리에 사용되는 벡터는 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드, 파지미드 등 어느 것이어도 된다. 또, 상기한 세포ㆍ조직에서 전체 RNA 또는 mRNA 분획을 정제한 것을 사용하여 직접 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응 (ReverseTranscriptase Polymerase Chain Reaction, 이하 RT-PCR 법이라고 함) 으로 증폭할 수도 있다.

본 발명의 단백질 Ⅰ을 코딩하는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:3 으로 표시되는 염기 서열을 함유한 DNA, 또는 서열번호:3 으로 표시되는 염기 서열을 함유한 DNA 와 높은 스트린전트 조건 하에서 부합 (hybridizing) 하는 염기 서열을 가지며, 본 발명의 단백질 Ⅰ 과 실질적으로 동질의 성질을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 이면 어느 것이어도 된다. 단백질 Ⅱ 를 코딩하는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 72∼1142 번째의 염기 서열을 함유한 DNA, 또는 서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 72∼1142 번째의 염기 서열을 함유한 DNA 와 높은 스트린전트 조건 하에서 부합하는 염기 서열을 가지며, 단백질 Ⅱ 와 실질적으로 동질의 성질을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 이면 어느 것이어도 된다.

서열번호:3 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 높은 스트린전트 조건 하에서 부합할 수 있는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:3 으로 표시되는 염기 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 함유한 DNA 등이 사용된다.

서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 72∼1142 번째의 염기 서열을 갖는 DNA 와 높은 스트린전트 조건 하에서 부합할 수 있는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 72∼1142 번째의 염기 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 함유한 DNA 등이 사용된다.

부합화 (hybridization) 는 자체 공지 방법 또는 이에 준하는 방법, 예컨대 [Molecular Cloning, 2nd, J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989] 에 기재된 방법 등에 따라 실시할 수 있다. 또, 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우, 첨부된 사용설명서에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 보다 바람직하게는 높은 스트린전트 조건에 따라 실시할 수 있다.

높은 스트린전트 조건이란, 예컨대 나트륨 농도가 약 19∼40mM, 바람직하게는 약 19∼20mM 이고, 온도가 약 50∼70℃, 바람직하게는 약 60∼65℃ 인 조건을 나타낸다. 특히, 나트륨 농도가 약 19mM 이고 온도가 약 65℃인 경우가 가장 바람직하다.

보다 구체적으로는, 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 단백질을 코딩하는 DNA 로서는, 서열번호:3 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유한 DNA 등이 사용된다.

서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 단백질을 코딩하는 DNA 로서는, 보다 구체적으로는 서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 72∼1142 번째의 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유한 DNA 등이 사용된다.

본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 또는 전구체 단백질 Ⅱ 를 코딩하는 DNA 로서는, 전술한 본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 또는 전구체 단백질 Ⅱ 를 코딩하는 염기 서열을 함유한 것이면 어떠한 것이어도 된다. 또, 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 상기한 세포ㆍ조직 유래의 cDNA, 상기한 세포ㆍ조직 유래의 cDNA 라이브러리,합성 DNA 중 어느 것이어도 된다.

본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 을 코딩하는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:16 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 또는 염기 서열:16으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 높은 스트린전트 조건 하에서 부합하는 염기 서열을 가지며, 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 을 생성할 수 있는 단백질을 코딩하는 DNA 등이 사용된다.

전구체 단백질 Ⅱ 를 코딩하는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 9∼1142 번째의 염기 서열을 함유한 DNA, 또는 서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 9∼1142 번째의 염기 서열을 함유한 DNA 와 높은 스트린전트 조건 하에서 부합하는 염기 서열을 가지며, 단백질 Ⅱ 를 생성할 수 있는 단백질을 코딩하는 DNA 등을 들 수 있다.

서열번호:16 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 높은 스트린전트 조건 하에서 부합할 수 있는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:16 으로 표시되는 염기 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 함유한 DNA 등이 사용된다.

서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 9∼1142 번째의 염기 서열을 함유한 DNA 와 높은 스트린전트 조건 하에서 부합할 수 있는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 9∼1142 번째의 염기 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 함유한 DNA 등이 사용된다.

부합화 방법 및 높은 스트린전트 조건은 상기와 동일한 것이 이용된다.

보다 구체적으로는, 서열번호:5 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 본 발명의 전구체 단백질 Ⅰ 을 코딩하는 DNA 로서는, 서열번호:16 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유한 DNA 등이 사용된다.

또, 서열번호:17 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 전구체 단백질 Ⅱ 를 코딩하는 DNA 로서는, 보다 구체적으로는 서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 9∼1142 번째의 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유한 DNA 등이 사용된다.

본 발명의 부분 펩티드 Ⅰ 또는 부분 펩티드 Ⅱ 를 코딩하는 DNA 로서는, 전술한 본 발명의 부분 펩티드 Ⅰ 또는 부분 펩티드 Ⅱ 를 코딩하는 염기 서열을 함유한 것이면 어떠한 것이어도 된다. 또, 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 상기한 세포ㆍ조직 유래의 cDNA, 상기한 세포ㆍ조직 유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 중 어느 것이어도 된다.

본 발명의 부분 펩티드 Ⅰ 을 코딩하는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:3 으로 표시되는 염기 서열의 일부분을 갖는 DNA, 또는 서열번호:3 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 높은 스트린전트 조건 하에서 부합하는 염기 서열을 가지며, 본 발명의 단백질 Ⅰ 과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 의 일부분을 갖는 DNA 등이 사용된다.

서열번호:3 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 부합할 수 있는 DNA 는 상기와 동일한 의미를 나타낸다.

부분 펩티드 Ⅱ 를 코딩하는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 72∼1142 번째의 염기 서열 중 일부분을 갖는 DNA, 또는 서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 72∼1142 번째의 염기 서열을 갖는 DNA 와 높은 스트린전트 조건 하에서 부합하는 염기 서열을 가지며, 단백질 Ⅱ 와 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 의 일부분을 갖는 DNA 등이 사용된다.

서열번호:14 로 표시되는 염기 서열에서 제 72∼1142 번째의 염기 서열을 갖는 DNA 와 부합할 수 있는 DNA 는 상기와 동일한 의미를 나타낸다.

부합화 방법 및 높은 스트린전트 조건은 상기와 동일한 것이 사용된다.

본 발명의 시그널 펩티드 Ⅰ 을 코딩하는 DNA 로서는, 전술한 본 발명의 시그널 펩티드 Ⅰ 을 코딩하는 염기 서열을 함유한 것이면 어떠한 것이어도 된다. 또, 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 상기한 세포ㆍ조직 유래의 cDNA, 상기한 세포ㆍ조직 유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 중 어느 것이어도 된다.

본 발명의 시그널 펩티드 Ⅰ 을 코딩하는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:4 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 또는 염기 서열:4로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 높은 스트린전트 조건 하에서 부합하는 염기 서열을 가지며, 시그널 펩티드로서의 기능을 발휘할 수 있는 펩티드를 코딩하는 DNA 등이 사용된다.

서열번호:4 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 부합할 수 있는 DNA 로서는, 예컨대 서열번호:4 로 표시되는 염기 서열과 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 함유한 DNA 등이 사용된다.

부합화 방법 및 높은 스트린전트 조건은 상기와 동일한 것이 사용된다.

보다 구체적으로는, 서열번호:2 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 시그널 펩티드 Ⅰ 을 코딩하는 DNA 로서는, 서열번호:4 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유한 DNA 등이 사용된다.

본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ, 부분 펩티드 Ⅰ, 시그널 펩티드 Ⅰ 또는 단백질 Ⅱ, 전구체 단백질 Ⅱ 또는 부분 펩티드 Ⅱ (이하, 이것들을 단순히 본 발명의 단백질이라고 함) 를 완전히 코딩하는 DNA 의 클로닝 수단으로는, 본 발명의 단백질의 부분 염기 서열을 갖는 합성 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 법으로 증폭하거나, 적당한 벡터에 조합한 DNA 를 본 발명의 단백질 일부 또는 전영역을 코딩하는 DNA 단편 또는 합성 DNA 를 사용하여 표지한 것과의 부합화로 선별할 수 있다. 부합화 방법은, 예컨대 [Molecular Cloning, 2nd, J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989] 에 기재된 방법 등에 따라 실시할 수 있다. 또, 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우, 첨부된 사용설명서에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

DNA 의 염기 서열 변환은 PCR이나 공지된 키트, 예컨대 Mutan^TM-super Express Km (다까라슈조(주)), Mutan^TM-K (다까라슈조(주)) 등을 이용하여 ODA-LA PCR 법이나 Gapped duplex 법이나 Kunkel 법 등의 자체 공지 방법 또는 이것들에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다.

클론화된 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 는 목적에 따라 그대로 또는 원하는 바에 따라 제한효소로 소화시키거나 링커를 부가하여 사용할 수 있다. 이DNA 는 그 5' 말단측에 번역 개시 코돈으로서의 ATG를 가지며, 그리고 3' 말단측에 번역 정지 코돈으로서의 TAA, TGA 또는 TAG 를 가질 수도 있다. 이들 번역 개시 코돈이나 번역 정지 코돈은 적당한 합성 DNA 어댑터를 사용하여 부가할 수도 있다.

본 발명의 단백질의 발현 벡터는, 예컨대 (가) 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 로부터 목적하는 DNA 단편을 절단하고, (나) 이 DNA 단편을 적당한 발현 벡터 중의 프로모터 하류에 연결함으로써 제조할 수 있다.

벡터로서는 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 고초균 유래의 플라스미드 (예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래의 플라스미드 (예, pSH19, pSH15), λ파지 등의 박테리오파지, 레트로 바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로 바이러스 등과 같은 동물 바이러스 등 이외에, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo 등이 사용된다.

본 발명에서 사용되는 프로모터로서는 유전자 발현에 사용되는 숙주에 대응하여 적절한 프로모터이면 어떠한 것이어도 된다. 예컨대, 동물세포를 숙주로 하여 사용하는 경우에는, SRα프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV 프로모터, HSV-TK 프로모터 등을 들 수 있다.

이들 중에서 CMV (사이토메갈로 바이러스) 프로모터, SRα프로모터 등을 사용하는 것이 바람직하다. 숙주가 에쉬리히아 (Escherichia) 속 균인 경우에는, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이, 숙주가 바실러스 (Bacillus) 속 균인 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2프로모터, penP 프로모터 등이, 숙주가 효모인 경우에는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 곤충세포인 경우에는 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터 등이 바람직하다.

발현 벡터에는 상기 이외에 원하는 바에 따라 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 선택 마커, SV40 복제 오리진 (이하, SV40ori 라고 함) 등을 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다. 선택 마커로서는, 예컨대 디히드로엽산 환원효소 (이하, dhfr 이라고 함) 유전자 [메토트렉세이트 (MTX) 내성], 암피실린 내성 유전자 (이하, Amp^r이라고 함), 네오마이신 내성 유전자 (이하, Neo^r이라고 함, G418 내성) 등을 들 수 있다. 특히, dhfr 유전자 결손 차이니스 햄스터 세포를 사용하며 dhfr 유전자를 선택 마커로서 사용하는 경우, 목적 유전자를 티미딘을 함유하지 않은 배지에 의해서도 선택할 수 있다.

또한, 필요에 따라 숙주에 맞는 시그널 서열을 본 발명의 폴리펩티드의 N 단말측에 부가한다. 숙주가 에쉬리히아속 균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등을, 숙주가 바실러스속 균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등을, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등을, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 각각 이용할 수 있다.

이렇게 해서 구축된 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유한 벡터를 이용하여 형질전환체를 제조할 수 있다.

숙주로서는, 예컨대 에쉬리히아속 균, 바실러스속 균, 효모, 곤충세포, 곤충, 동물세포 등이 사용된다.

에쉬리히아속 균의 구체예로서는, 예컨대 대장균 (Escherichia coli) K12ㆍDH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60권, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9권, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120권, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41권, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39권, 440 (1954)] 등이 사용된다.

바실러스속 균으로는, 예컨대 고초균 (Bacillus subtilis) MI114 [Gene, 24권, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95권, 87 (1984)] 등이 사용된다.

효모로서는, 예컨대 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R^-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913, NCYC2036, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) KM71 등이 사용된다.

곤충세포로서는, 예컨대 바이러스가 AcNPV 인 경우에는 야행성 나방의 유충 유래 주화세포 (Spodoptera frugiperda cell; Sf세포), Trichoplusia ni 의 중장(中腸) 유래의 MGI 세포, Trichoplusia ni 의 알 유래의 High Five^TM세포, Mamestra brassicae 유래의 세포 또는 Estigmena acrea 유래의 세포 등이 사용된다. 바이러스가 BmNPV 인 경우에는 누에 유래 주화세포 (Bombyx mori N 세포; BmN 세포)등이 사용된다. 이 Sf 세포로서는, 예컨대 Sf9 세포 (ATCC CRL1711), Sf21 세포 (이상, Vaughn, J.L. 외, In Vivo, 13, 213-217 (1977)) 등이 사용된다.

곤충으로서는, 예컨대 누에의 유충 등이 사용된다 [마에다 외, Nature, 315권, 592 (1985)].

동물세포로서는, 예컨대 원숭이 세포 COS-7, Vero, 차이니스 햄스터 세포 CHO (이하, CHO 세포라고 함), dhfr 유전자 결손 차이니스 햄스터 세포 CHO (이하, CHO(dhfr^-) 세포라고 함), 마우스 L 세포, 마우스 AtT-20, 마우스 미엘로마 세포, 래트 GH3, 인간 FL 세포 등이 사용된다.

에쉬리히아속 균을 형질전환하기 위해서는, 예컨대 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69권, 2110 (1972)] 이나 [Gene, 17권, 107 (1982)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

바실러스속 균을 형질전환하기 위해서는, 예컨대 [Molecular & General Genetics, 168권, 111 (1979)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

효모를 형질전환하기 위해서는, 예컨대 [Methods in Enzymology, 194권, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75권, 1929 (1978)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

곤충세포 또는 곤충을 형질전환하기 위해서는, 예컨대 [Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

동물세포를 형질전환하기 위해서는, 예컨대 [세포공학 별책 8 신세포공학 실험 프로토콜. 263-267 (1995) (슈쥰사 발행), Virology, 52권, 456 (1973)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

이렇게 해서 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유한 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 얻을 수 있다.

숙주가 에쉬리히아속 균, 바실러스속 균인 형질전환체를 배양할 때에 배양에 사용되는 배지로서는 액체 배지가 적당하고, 그 중에는 이 형질전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물 기타가 함유된다. 탄소원으로서는 예컨대 글루코스, 덱스트린, 가용성 전분, 자당 등, 질소원으로서는 예컨대 암모늄염류, 질산염류, 콘스팁 리커 (corn steep liquor), 펩톤, 카제인, 고기 추출액, 대두박, 감자 추출액 등과 같은 무기 또는 유기물질, 무기물로서는 예컨대 염화칼슘, 인산2수소나트륨, 염화마그네슘 등을 들 수 있다. 또한, 효모, 비타민류, 생장촉진인자 등을 첨가할 수도 있다. 배지의 pH 는 약 5∼8 이 바람직하다.

에쉬리히아속 균을 배양할 때의 배지로서는, 예컨대 글루코스, 카자미노산을 함유한 M9 배지 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] 가 바람직하다. 여기에 필요에 따라 프로모터를 효율적으로 작동시키기 위해서, 예컨대 3β-인돌릴아크릴산과 같은 약제를 첨가할 수 있다.

숙주가 에쉬리히아속 균인 경우, 배양은 통상 약 15∼43℃ 에서 약 3∼24 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 가할 수도 있다.

숙주가 바실러스속 균인 경우, 배양은 통상 약 30∼40℃ 에서 약 6∼24 시간실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 가할 수도 있다.

숙주가 효모인 형질전환체를 배양할 때에 배지로서는, 예컨대 버크홀더 (Burkholder) 최소 배지 [Bostian, K.L. 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77권, 4505 (1980)] 나 0.5% 카자미노산을 함유한 SD 배지 [Bitter, G.A. 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81권, 5330 (1984)]를 들 수 있다. 배지의 pH 는 약 5∼8 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20∼35℃ 에서 약 24∼72 시간을 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 가한다.

숙주가 곤충세포나 곤충인 형질전환체를 배양할 때에, 배지로서는 그레이스 곤충 배지 (Grace's Insect Medium, Grace, T.C.C., Nature, 195, 788 (1962)) 에 비동화(非動化)된 10% 소 혈청 등의 첨가물을 적절하게 첨가한 것 등이 사용된다. 배지의 pH 는 약 6.2∼6.4 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 27℃ 에서 약 3∼5 일간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 가한다.

숙주가 동물세포인 형질전환체를 배양할 때에, 배지로서는 예컨대 약 5∼20% 의 태아 소 혈청을 포함한 MEM 배지 [Science, 122권, 501 (1952)], DMEM 배지 [Virology, 8권, 396 (1959)], RPMI 1640 배지 [The Journal of the American Medical Association, 199권, 519 (1967)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73권, 1 (1950)] 등이 사용된다. pH 는 약 6∼8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30∼40℃ 에서 약 15∼60 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 가한다.

이상과 같이 해서 형질전환체의 세포막에 본 발명의 단백질을 생성시킬 수있다.

상기 배양물로부터 본 발명의 단백질을 분리 정제하기 위해서는, 예컨대 다음과 같은 방법으로 실시할 수 있다.

본 발명의 단백질을 배양균체 또는 세포로부터 추출할 때에는, 배양 후 공지 방법으로 균체 또는 세포를 모아 이것을 적당한 완충액에 현탁하고, 초음파, 리소자임 및/또는 동결 융해 등으로 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심분리나 여과에 의해 단백질의 비정제 추출액을 수득하는 방법 등이 적절하게 사용된다. 완충액 중에 요소나 염산 구아니딘 등과 같은 단백질 변성제나 트리톤 X-100^TM등과 같은 계면활성제가 함유되어 있어도 된다. 배양액 중에 본 발명의 단백질이 분비되는 경우에는, 배양 종료 후 그 자체 공지 방법으로 균체 또는 세포와 상등액을 분리하여 상등액을 모은다.

이렇게 해서 얻은 배양 상등액 또는 추출액 중에 함유된 본 발명의 단백질의 정제는 자체 공지된 분리ㆍ정제법을 적절하게 조합하여 실시할 수 있다. 이것들의 공지된 분리, 정제법으로는, 염석이나 용매 침전법 등과 같은 용해도를 이용하는 방법, 투석법, 한외여과법, 겔여과법 및 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법 등과 같은 주로 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피 등의 하전의 차이를 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기영동법 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등이 사용된다.

이렇게 해서 수득된 본 발명의 단백질이 유리체로 수득된 경우에는, 자체 공지 방법 또는 이에 준하는 방법으로 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 수득된 경우에는 자체 공지 방법 또는 이에 준하는 방법으로 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.

또한, 재조합체가 생산하는 단백질을 정제 전 또는 정제 후에 적당한 단백질 수식 효소를 작용시킴으로써 임의로 수식을 가하거나 폴리펩티드를 부분적으로 제거할 수도 있다. 단백질 수식 효소로서는 예컨대, 트립신, 키모트립신, 아르기닐 엔드 펩티다아제, 프로테인키나아제, 글리콕시다아제 등이 사용된다.

이렇게 해서 생성된 본 발명의 단백질의 존재는 특이 항체를 사용한 엔자임 이뮤노 어세이나 웨스턴 블로팅 등에 따라 측정할 수 있다.

본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ, 부분 펩티드 Ⅰ, 단백질 Ⅱ, 전구체 단백질 Ⅱ, 부분 펩티드 Ⅱ 또는 그의 염에 대한 항체는, 본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ, 부분 펩티드 Ⅰ, 단백질 Ⅱ, 전구체 단백질 Ⅱ, 부분 펩티드 Ⅱ 또는 그의 염을 인식할 수 있는 항체이면 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이어도 된다.

본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ, 부분 펩티드 Ⅰ, 단백질 Ⅱ, 전구체 단백질 Ⅱ, 부분 펩티드 Ⅱ 또는 그의 염 (이하, 이것들을 단순히 본 발명의 단백질이라고 함) 에 대한 항체는, 본 발명의 단백질을 항원으로 사용하며 자체 공지된 항체 또는 항혈청의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.

[모노클로날 항체의 제조]

(a) 모노클로날 항체 생산 세포의 제조

본 발명의 단백질은 온혈동물에 대하여 투여에 의해 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여할 때에 항체 생산능을 높이기 위해서, 완전 프로인트 아주반트나 불완전 프로인트 아주반트를 투여해도 된다. 투여는 통상 2∼6 주마다 1 회씩, 총 2∼10 회 정도 실시된다. 사용되는 온혈동물로서는, 예컨대 원숭이, 토끼, 개, 모르모트, 마우스, 래트, 양, 염소, 닭을 들 수 있으나, 마우스 및 래트가 바람직하게 사용된다.

모노클로날 항체 생산 세포의 제조시에는 항원으로 면역된 온혈동물, 예컨대 마우스로부터 항체가를 알 수 있는 개체를 선택하여 최종 면역의 2∼5 일 후에 비장 또는 림프절을 채취하고, 이것들에 함유된 항체 생산 세포를 동종 또는 이종 동물의 골수종 세포와 융합시킴으로써, 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 제조할 수 있다. 항혈청 중의 항체가의 측정은, 예컨대 후술하는 표지화 단백질과 항혈청을 반응시킨 후, 항체에 결합된 표지제의 활성을 측정함으로써 실시할 수 있다. 융합 조작은 기존 방법, 예컨대 켈러와 밀스타인의 방법 [Nature, 256, 495 (1975)] 에 따라 실시할 수 있다. 융합 촉진제로서는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 이나 센다이 바이러스 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 PEG 가 사용된다.

골수종 세포로서는 예컨대 NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 등과 같은 온혈동물의 골수종 세포를 들 수 있으나 P3U1 이 바람직하게 사용된다. 사용되는 항체 생산 세포 (비장세포) 수와 골수종 세포수의 바람직한 비율은 1:1∼20:1 정도이고,PEG (바람직하게는 PEG 1000∼PEG 6000) 가 10∼80% 정도의 농도로 첨가되고, 20∼40℃, 바람직하게는 30∼37℃ 에서 1∼10 분간 인큐베이트함으로써 효율적으로 세포 융합을 실시할 수 있다.

모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝에는 여러 방법을 사용할 수 있으나, 예컨대 단백질 항원을 직접 또는 담체와 함께 흡착시킨 고상 (예, 마이크로플레이트) 에 하이브리도마 배양 상등액을 첨가하고, 다음으로 방사성 물질이나 효소 등으로 표지한 항면역 글로불린 항체 (세포 융합에 사용되는 세포가 마우스인 경우 항마우스 면역 글로불린 항체가 사용됨) 또는 프로테인 A 를 첨가하여 고상에 결합된 모노클로날 항체를 검출하는 방법, 항면역 글로불린 항체 또는 프로테인 A 를 흡착시킨 고상에 하이브리도마 배양 상등액을 첨가하고, 방사성 물질이나 효소 등으로 표지한 단백질을 첨가하여 고상에 결합된 모노클로날 항체를 검출하는 방법 등을 들 수 있다.

모노클로날 항체의 선별은 자체 공지되거나 이에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다. 통상 HAT (히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 를 첨가한 동물세포용 배지에서 실시할 수 있다. 선별 및 육종용 배지로서는 하이브리도마를 생육할 수 있는 것이라면 어떠한 배지를 사용해도 된다. 예컨대, 1∼20%, 바람직하게는 10∼20% 의 소 태아 혈청을 포함한 RPMI 1640 배지, 1∼10% 의 소 태아 혈청을 포함한 GIT 배지 (와꼬오쥰야꾸 고오교㈜) 또는 하이브리도마 배양용 무혈청 배지 (SFM-101, 닛쓰이 세이야꾸㈜) 등을 사용할 수 있다. 배양온도는 통상 20∼40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 배양시간은 통상 5 일∼3 주일, 바람직하게는1 주일∼2 주일이다. 배양은 통상 5% 탄산 가스하에서 실시할 수 있다. 하이브리도마 배양 상등액의 항체가는 상기 항혈청 중의 항체가의 측정과 동일하게 하여 측정할 수 있다.

(b) 모노클로날 항체의 정제

모노클로날 항체의 분리 정제는 자체 공지 방법, 예컨대 면역 글로불린의 분리 정제법 [예, 염석법, 알콜침전법, 등전점 침전법, 전기영동법, 이온교환체 (예, DEAE) 에 의한 흡탈착법, 초원심법, 겔여과법, 항원결합고상 또는 프로테인 A 또는 프로테인 G 등과 같은 활성흡착제로 항체만 채취하고 결합을 해리시켜 항체를 수득하는 특이적 정제법] 에 따라 실시할 수 있다.

[폴리클로날 항체의 제조]

본 발명의 폴리클로날 항체는 그 자체 공지되거나 이에 준하는 방법에 따라 제조할 수 있다. 예컨대, 면역 항원 (단백질 항원) 자체 또는 이것과 캐리어 단백질의 복합체를 제조하고 상기 모노클로날 항체의 제조 방법과 마찬가지로 온혈동물에게 면역을 실시하고, 이 면역동물로부터 본 발명의 단백질에 대한 항체 함유물을 채취하고 항체의 분리 정제를 실시함으로써 제조할 수 있다.

온혈동물을 면역시키기 위해서 사용되는 면역 항원과 캐리어 단백질의 복합체에 관하여, 캐리어 단백질의 종류 및 캐리어와 합텐의 혼합비는, 캐리어에 가교시켜 면역시킨 합텐에 대하여 항체를 효율적으로 할 수 있으면 어떠한 것을 어떠한 비율로 가교시켜도 되지만, 예컨대 소 혈청 알부민이나 소 사일로 글로불린, 헤모시아닌 등을 중량비로 합텐 1 에 대하여 약 0.1∼20, 바람직하게는 약 1∼5 의 비율로 커플시키는 방법이 사용된다.

또한, 합텐과 캐리어의 커플링에는 각종 축합체를 사용할 수 있으나, 글루타르알데히드나 카르보디이미드, 말레이미드 활성 에스테르, 티올기, 디티올피리딜기를 함유한 활성 에스테르 시약 등이 사용된다.

축합 생성물은 온혈동물에 대하여 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여할 때에 항체 생산능을 높이기 위해서, 완전 프로인트 아주반트나 불완전 프로인트 아주반트를 투여해도 된다. 투여는 통상 약 2∼6 주마다 1 회씩, 총 약 3∼10 회 정도 실시된다.

폴리클로날 항체는 상기 방법으로 면역된 온혈동물의 혈액, 복수 등 바람직하게는 혈액에서 채취할 수 있다.

항혈청 중의 폴리클로날 항체가의 측정은 상기 항혈청 중의 항체가의 측정과 동일하게 하여 측정할 수 있다. 폴리클로날 항체의 분리 정제는 상기 모노클로날 항체의 분리 정제와 동일한 면역 글로불린의 분리 정제법에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ, 부분 펩티드 Ⅰ, 시그널 펩티드 Ⅰ, 단백질 Ⅱ, 전구체 단백질 Ⅱ 또는 부분 펩티드 Ⅱ 를 코딩하는 DNA (이하, 이것들의 DNA 를 본 발명의 DNA 라고 함) 에 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열을 갖는 안티센스 DNA 로서는, 본 발명의 DNA 에 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열을 가지며, 이 DNA 의 발현을 억제할 수 있는 작용을 갖는 것이면 어떤 안티센스 DNA 여도 된다.

본 발명의 DNA 에 실질적으로 상보적인 염기 서열이란, 예컨대 본 발명의 DNA 에 상보적인 염기 서열 (즉, 본 발명의 DNA 의 상보쇄) 의 전체 염기 서열 또는 부분 염기 서열과 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열 등을 들 수 있다. 특히, 본 발명의 DNA 의 상보쇄의 전체 염기 서열 중, 본 발명의 단백질의 N 말단 부위를 코딩하는 부분 염기 서열 (예컨대, 개시 코돈 부근의 염기 서열 등) 의 상보쇄와 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 안티센스 DNA 가 적합하다. 이들 안티센스 DNA 는 공지된 DNA 합성장치 등을 사용하여 제조할 수 있다.

다음에 본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ 또는 부분 펩티드 Ⅰ 또는 그의 염 (이하, 본 발명의 단백질 a 로 약기하는 경우가 있음), 단백질 Ⅱ, 전구체 단백질 Ⅱ 또는 부분 펩티드 Ⅱ 또는 그의 염 (이하, 단백질 b 로 약기하는 경우가 있음), 본 발명의 단백질 a 를 코딩하는 DNA (이하, 본 발명의 DNAa 로 약기하는 경우가 있음), 단백질 b 를 코딩하는 DNA (이하, DNAb 로 약기하는 경우가 있음), 본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ, 부분 펩티드 Ⅰ, 단백질 Ⅱ, 전구체 단백질 Ⅱ, 부분 펩티드 Ⅱ 또는 시그널 펩티드 Ⅰ 또는 그의 염에 대한 항체 (이하, 본 발명의 항체로 약기하는 경우가 있음) 및 안티센스 DNA 의 용도를 설명한다. 본 발명의 단백질 a 와 단백질 b 를 본 발명의 단백질로 총칭하고, 그리고 본 발명의 DNAa 와 DNAb 를 본 발명의 DNA 로 총칭하는 경우가 있다.

본 발명의 단백질 a 및 단백질 b 는 천식 모델 동물의 폐ㆍ기관지에서 조직 특이적으로 발현이 상승되므로, 질환 마커로서 이용할 수 있다. 즉, 폐ㆍ기도의 염증을 수반하는 폐ㆍ흉부 질환의 조기 진단, 증상의 중증도 판정, 질환 진행을 예측하기 위한 마커로서 유용하다.

(1) 본 발명의 단백질 a 가 관여된 각종 질환의 치료ㆍ예방제

본 발명의 단백질 a 는 키틴 분해효소의 패밀리에 속한다. 키틴 분해효소는 외부로부터 진입된 세균, 바이러스 등과 같은 병원체에 대한 생체 방어기구에 있어서 중요하다. 즉, 본 발명의 단백질 a 또는 본 발명의 DNAa 는 면역질환 (예, 자기면역질환, 면역부전, 알레르기성 질환 등), 감염증 (예컨대, HIV (인간 면역결핍 바이러스) 감염, HBV (B 형 간염 바이러스) 감염, HCV (C 형 간염 바이러스) 감염, 결핵 감염, 기회 감염 (opportunistic infection) 등) 등과 같은 각종 질환의 치료ㆍ예방약 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

예컨대, 생체내에서 본 발명의 단백질 a 등이 감소되거나 결손되기 때문에, 생체 방어기구가 충분히 또는 정상적으로 발휘되지 않는 환자가 있는 경우에, (가) 본 발명의 DNAa 를 이 환자에게 투여하여 생체내에서 본 발명의 단백질을 발현시킴으로써, (나) 세포에 본 발명의 DNAa 를 삽입하여 본 발명의 단백질을 발현시킨 후에 이 세포를 환자에게 이식함으로써, 또는 (다) 본 발명의 단백질 a 를 이 환자에게 투여함으로써, 이 환자에서 본 발명의 단백질 a 의 역할을 충분히 또는 정상적으로 발휘시킬 수 있다.

본 발명의 DNAa 를 상기 치료ㆍ예방제로서 사용하는 경우에는, 이 DNA 를 단독으로 또는 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 어소시에이티드 바이러스 벡터 등과 같은 적당한 벡터에 삽입한 후, 통상적인 수단에 따라 인간 또는 온혈동물에게 투여할 수 있다. 본 발명의 DNAa 는 그대로 또는 섭취 촉진을 위한 보조제 등의 생리학적으로 인정되는 담체와 함께 제제화하여 유전자 총이나 하이드로 겔 카테터와 같은 카테터로 투여할 수 있다.

본 발명의 단백질 a 를 상기 치료ㆍ예방제로서 사용하는 경우에는, 적어도 90%, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 98% 이상, 더더욱 바람직하게는 99% 이상으로 정제된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 단백질 a 는, 예컨대 필요에 따라 당의를 피복시킨 정제, 캡슐제, 엘릭서제, 마이크로캡슐제 등으로서 경구적으로, 또는 에어로졸화시켜 흡입제 형태로, 또는 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제 등의 주사제 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 단백질 a 를 생리학적으로 인정되는 담체, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제제 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 제조할 수 있다. 이들 제제의 유효 성분량은 지지받은 범위의 적당한 용량을 수득할 수 있도록 하는 것이다.

정제, 캡슐제 등에 혼화할 수 있는 첨가제로서는, 예컨대 젤라틴, 옥수수전분, 트라간트, 아라비아 고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수전분, 젤라틴, 아르긴산 등과 같은 팽화제, 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 젖당 또는 사카린과 같은 감미제, 페파민트, 아까모노 (akamono) 오일또는 체리와 같은 향미제 등이 사용된다. 제조 단위형태가 캡슐인 경우에는 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유시킬 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용수와 같은 비히클 중의 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등의 통상적인 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.

주사용 수성액으로서는, 예컨대 생리식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 함유한 등장액 (예컨대, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등을 들 수 있고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알코올 (예컨대, 에탄올 등), 폴리알코올 (예컨대, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트80^TM, HCO-50 등) 등과 병용해도 된다. 유성액으로서는, 예컨대 참깨유, 대두유 등을 들 수 있고, 용해보조제로서 벤조산벤질, 벤질알코올 등과 병용해도 된다. 또, 완충제 (예컨대, 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액 등), 무통화제 (예컨대, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예컨대, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예컨대, 벤질알코올, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 제조된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다.

본 발명의 DNAa 가 삽입된 벡터도 상기와 마찬가지로 제제화되어 통상 비경구적으로 사용된다.

이렇게 해서 수득된 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 인간 또는 온혈동물 (예컨대, 래트, 마우스, 모르모트, 토끼, 닭, 양, 돼지, 소, 말, 고양이,개, 원숭이, 침팬지 등)에 대하여 투여할 수 있다.

본 발명의 단백질 a 의 투여량은 대상 질환, 투여 대상, 투여 루트 등에 따라 차이는 있지만, 예컨대 감염증의 치료 목적에서 본 발명의 단백질 a 를 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏) 에게는 하루에 이 단백질을 약 0.1㎎∼100㎎, 바람직하게는 약 1.0∼50㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0∼20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 이 단백질의 1 회 투여량은 투여 대상, 대상 질환 등에 따라서도 다르지만, 예컨대 감염증의 치료 목적에서 본 발명의 단백질 a 를 주사제 형태로 성인 (체중 60㎏) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 단백질을 약 0.01∼30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1∼20㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1∼10㎎ 정도를 환부에 주사하여 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(2) 질병에 대한 의약 후보 화합물의 스크리닝

본 발명의 단백질 a 는 키틴 분해효소의 패밀리에 속하기 때문에, 본 발명의 단백질 a 의 활성 (예, 키틴 분해효소 활성 등) 을 촉진하는 화합물 또는 그의 염은 면역질환 (예컨대, 자기면역질환, 면역부전, 알레르기성 질환 등), 감염증 (예컨대, HIV 감염, HBV 감염, HCV 감염, 결핵 감염, 기회 감염 등) 등과 같은 각종 질환의 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 단백질 a 는 폐ㆍ기도의 염증에 앞서 발현이 증가되기 때문에, 본 발명의 단백질 a 의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염은 기관지 천식이나 만성 폐색성 폐질환 등 폐ㆍ기도의 염증을 수반하는 폐ㆍ흉부 질환의 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 단백질 a 는 본 발명의 단백질 a 의 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝을 위한 시약으로서 유용하다.

즉, 본 발명은

(1) 본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ 또는 부분 펩티드 Ⅰ 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ 또는 부분 펩티드 Ⅰ 또는 그의 염의 활성 (예컨대, 키틴 분해효소 활성 등) 을 촉진하는 화합물 또는 그의 염 (이하, 촉진제라고 하는 경우가 있음) 또는 본발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ 또는 부분 펩티드 Ⅰ 또는 그의 염의 활성을 저해하는 화합물 (이하, 저해제라고 하는 경우가 있음) 의 스크리닝 방법을 제공하고, 보다 구체적으로는, 예컨대

(2) (i) 본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ 또는 부분 펩티드 Ⅰ 또는 그의 염에 키틴 분해효소의 기질을 접촉시킨 경우와 (ii) 본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ 또는 부분 펩티드 Ⅰ 또는 그의 염에 키틴 분해효소의 기질 및 시험 화합물을 접촉시킨 경우를 비교하는 것을 특징으로 하는 촉진제 또는 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로는 상기 스크리닝 방법에서는, 예컨대 (i) 과 (ii) 의 경우, 본 발명의 단백질 a 의 키틴 분해효소 활성을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 것이다.

기질로서는, 예컨대 4-메틸움벨리페릴 β-D-N,N'-디아세틸키토바이오스, 4-메틸움벨리페릴 β-D-N,N',N"-트리아세틸키토바이오스, p-니트로페닐 β-D-N,N'-디아세틸키토바이오스, p-니트로페닐 β-D-N,N',N"-트리아세틸키토바이오스, 키틴 아주르 등을 들 수 있다.

시험 화합물로서는, 예컨대 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물이거나 공지 화합물일 수도 있다.

상기 스크리닝 방법을 실시하기 위해서는, 본 발명의 단백질 a 를 스크리닝에 적합한 버퍼에 현탁함으로써 본 발명의 단백질 a 의 표품을 제조한다. 버퍼에는 pH 약 4∼10 (바람직하게는 pH 약 6∼8) 의 인산 버퍼, 트리스-염산 버퍼 등의 본 발명의 단백질 a 와 기질의 반응을 저해하지 않는 버퍼이면 어떤 것이어도 된다.

본 발명의 단백질 a 의 키틴 분해효소 활성은 자체 공지 방법, 예컨대 [J. Biol. Chem., 270권, p2198 (1995)] 에 기재된 방법 또는 이에 준하는 방법에 따라 측정할 수 있다.

예컨대, 상기 (ii) 의 경우의 키틴 분해효소 활성을 상기 (i) 의 경우에 비하여 약 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 약 50% 이상 상승시키는 시험 화합물을 본 발명의 단백질 a 의 키틴 분해효소 활성을 촉진하는 화합물로서, 한편 상기 (ii) 의 경우의 키틴 분해효소 활성을 상기 (i) 의 경우에 비하여 약 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 약 50% 이상 저해하는 시험 화합물을 본 발명의 단백질 a 의 키틴 분해효소 활성을 저해하는 화합물로서 선택할 수 있다.

본 발명의 스크리닝용 키트는 본 발명의 단백질 Ⅰ, 전구체 단백질 Ⅰ 또는 부분 펩티드 Ⅰ 또는 그의 염을 함유하는 것이다.

본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 수득된 화합물 또는 그의 염은, 상기한 시험 화합물, 예컨대 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액, 혈장 등에서 선택된 화합물로서, 본 발명의 단백질 a 의 활성(예, 키틴 분해효소 활성 등)을 촉진하거나 저해하는 화합물이다.

이 화합물의 염으로는 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 의 염과 동일한 것이 사용된다.

본 발명의 단백질 a 의 활성 (예, 키틴 분해효소 활성 등) 을 촉진하는 화합물은, 예컨대 면역질환 (예컨대, 자기면역질환, 면역부전, 알레르기성 질환 등), 감염증 (예컨대, HIV 감염, HBV 감염, HCV 감염, 결핵 감염, 기회 감염 등) 등과 같은 각종 질환의 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 단백질 a 의 활성을 저해하는 화합물은, 예컨대 기관지 천식이나 만성 폐색성 폐질환 등 폐ㆍ기도의 염증을 수반하는 폐ㆍ흉부 질환의 질병에 대한 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 유용하다.

본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 수득된 화합물을 전술한 치료ㆍ예방제로서 사용하는 경우, 통상적인 수단에 따라 실시할 수 있다. 예컨대, 상기한 본 발명의 단백질 a 를 함유한 의약과 동일하게 하여 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로캡슐제, 무균성 용액, 현탁액제 등으로 할 수 있다.

이렇게 해서 수득된 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 인간 또는 온혈동물 (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 닭, 고양이, 개, 원숭이, 침팬지 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그의 염의 투여량은 그 작용, 대상 질환, 투여 대상, 투여 루트 등에 따라 차이는 있지만, 예컨대 기관지 천식의 치료 목적에서 본 발명의 단백질 a 의 활성을 저해하는 화합물을 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏) 에게는 하루에 이 화합물을 약 0.1∼100㎎, 바람직하게는 약 1.0∼50㎎, 보다 바람직하게는 1.0∼20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 이 화합물의 1 회 투여량은 투여 대상, 대상 질환 등에 따라서도 다르지만, 예컨대 기관지 천식의 치료의 목적에서 본 발명의 단백질 a 의 활성을 저해하는 화합물을 주사제 형태로 통상 성인 (60㎏) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 화합물을 약 0.01∼30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1∼20㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1∼10㎎ 정도를 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

한편, 감염증의 치료 목적에서 본 발명의 단백질 a 의 활성을 촉진하는 화합물을 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏) 에게는 하루에 이 화합물을 약 0.1∼100㎎, 바람직하게는 약 1.0∼50㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0∼20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 이 화합물의 1 회 투여량은 투여 대상, 대상 질환에 따라서도 다르지만, 예컨대 감염증의 치료 목적에서 본 발명의단백질 a 의 활성을 촉진하는 화합물을 주사제 형태로 통상 성인 (60㎏) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 화합물을 약 0.01∼30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1∼20㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1∼10㎎ 정도를 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(3) 본 발명의 단백질 a 또는 단백질 b 가 관여된 질병에 대한 의약 후보 화합물의 스크리닝

본 발명의 단백질은 분비 단백질로서, 예컨대 단백질 Ⅱ 는 마우스 천식 모델의 폐ㆍ기도에서 염증에 앞서 생산되어 호산구나 매크로파지 등의 침윤, 활성화에 관여된 것으로 볼 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질 a 또는 단백질 b 의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염은 기관지 천식이나 만성 폐색성 폐질환 등 폐ㆍ기도의 염증을 수반하는 폐ㆍ흉부 질환의 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 단백질은 본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝을 위한 시약으로서 유용하다.

즉, 본 발명은

(1) 본 발명의 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 단백질의 활성 (예컨대, 호산구 유주 활성 등) 을 저해하는 화합물 (이하, 저해제라고 함) 의 스크리닝 방법을 제공하고, 보다 구체적으로는, 예컨대

(2) (i) 본 발명의 단백질에 호산구를 접촉시킨 경우와 (ii) 본 발명의 단백질에 호산구 및 시험 화합물을 접촉시킨 경우를 비교하는 것을 특징으로 하는 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로는 상기 스크리닝 방법에서는, 예컨대 (i)와 (ii) 의 경우 본 발명의 단백질의 호산구 유주 활성을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 것이다.

호산구로서는, 예컨대 마우스 호산구가 사용되며 자체 공지 방법, 예컨대 [J. Leukocyte Biol., 60권, p573 (1996)] 에 기재된 방법 또는 이에 준하는 방법에 따라 제조할 수 있다.

시험 화합물로서는, 예컨대 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물이거나 공지 화합물일 수도 있다.

상기 스크리닝 방법을 실시하기 위해서는, 본 발명의 단백질을 스크리닝에 적합한 버퍼에 현탁함으로써 본 발명의 단백질의 표품을 제조한다. 버퍼에는 pH 약 4∼10 (바람직하게는 pH 약 6∼8) 의 인산 버퍼, 트리스-염산 버퍼 등의 호산구의 유주 반응을 저해하지 않는 버퍼이면 어떤 것이어도 된다.

본 발명의 단백질의 호산구 유주 활성은 자체 공지 방법, 예컨대 [Immunity, 4권, p1 (1996)] 에 기재된 방법 또는 이에 준하는 방법에 따라 측정할 수 있다.

예컨대, 상기 (ii) 의 경우, 호산구 유주 활성을 상기 (i) 의 경우에 비하여 약 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 약 50% 이상 저해하는 시험 화합물을 본 발명의 단백질의 호산구 유주 활성을 저해하는 화합물로서 선택할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 수득된 화합물또는 그의 염은, 상기한 시험 화합물, 예컨대 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액, 혈장 등에서 선택된 화합물로, 본 발명의 단백질의 활성 (예, 호산구 유주 활성 등) 을 저해하는 화합물이다.

이 화합물의 염으로는 상기한 본 발명의 단백질 Ⅰ 의 염과 동일한 것이 사용된다.

본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 화합물은, 예컨대 기관지 천식이나 만성 폐색성 폐질환 등 폐ㆍ기도의 염증을 수반하는 폐ㆍ흉부 질환의 질병에 대한 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 유용하다.

본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 수득된 화합물을 전술한 치료ㆍ예방제로서 사용하는 경우, 통상적인 수단에 따라 실시할 수 있다. 예컨대, 상기한 본 발명의 단백질 a 를 함유한 의약과 동일하게 하여 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로캡슐제, 무균성 용액, 현탁액제 등으로 할 수 있다.

이렇게 해서 수득된 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 인간 또는 온혈동물 (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 닭, 고양이, 개, 원숭이, 침팬지 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그의 염의 투여량은 그 작용, 대상 질환, 투여 대상, 투여 루트 등에 따라 차이는 있지만, 예컨대 기관지 천식의 치료 목적에서 본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 화합물을 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏) 에게는 하루에 이 화합물을 약 0.1∼100㎎, 바람직하게는 약 1.0∼50㎎, 더 바람직하게는 약 1.0∼20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 이 화합물의 1 회 투여량은 투여 대상, 대상 질환 등에 따라 다르지만, 예컨대 기관지 천식의 치료 목적에서 본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 화합물을 주사제 형태로 통상 성인 (60㎏) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 화합물을 약 0.01∼30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1∼20㎎ 정도, 더 바람직하게는 약 0.1∼10㎎ 정도를 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(4) 본 발명의 단백질 a 또는 단백질 b 의 정량

본 발명의 단백질에 대한 항체 (이하, 본 발명의 항체라고 함) 는 본 발명의 단백질을 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 피검액 중의 본 발명의 단백질의 정량, 특히 샌드위치 면역측정법에 의한 정량 등에 사용할 수 있다.

즉, 본 발명은

(ⅰ) 본 발명의 항체와 피검액 및 표지화된 본 발명의 단백질을 경합적으로 반응시키고, 이 항체에 결합된 표지화된 본 발명의 단백질의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 본 발명의 단백질의 정량법 및,

(ⅱ) 피검액과 담체상에 불용화된 본 발명의 항체 및 표지화된 본 발명의 다른 항체를 동시 또는 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 본 발명의 단백질의 정량법을 제공한다.

상기 (ii) 의 정량법에서는, 한쪽 항체가 본 발명의 단백질 (바람직하게는 본 발명의 단백질 Ⅰ 또는 단백질 Ⅱ) 의 N 단부를 인식하는 항체이고, 다른 쪽 항체가 본 발명의 단백질 (바람직하게는 본 발명의 단백질 Ⅰ 또는 단백질 Ⅱ) 의 C 단부에 반응하는 항체인 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 단백질에 대한 모노클로날 항체 (이하, 본 발명의 모노클로날 항체라고 함) 를 사용하여 본 발명의 단백질의 정량을 실시할 수 있는 것 외에 조직염색 등에 의한 검출을 실시할 수도 있다. 이들 목적에는 항체 분자 그 자체를 사용할 수도 있고, 또한 항체 분자의 F(ab')₂, Fab' 또는 Fab 분획을 사용할 수도 있다.

본 발명의 항체를 사용하는 본 발명의 단백질의 정량법은 특별히 제한되어야 하는 것은 아니지만, 피측정액 중의 항원량 (예컨대, 단백질량) 에 대응한 항체, 항원 또는 항체-항원 복합체의 양을 화학적 또는 물리적 수단으로 검출하고, 이것을 이미 알려진 양의 항원을 함유한 표준액을 사용하여 제조한 표준 곡선에서 산출하는 측정법이면, 어떠한 측정법을 사용할 수도 있다. 예컨대, 네프로메트리, 경합법, 이뮤노메트릭법 및 샌드위치법이 바람직하게 사용되지만, 감도, 특이성의 면에서 후술하는 샌드위치법을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

표지물질을 사용하는 측정법에 사용되는 표지제로서는, 예컨대 방사성 동위원소, 효소, 형광물질, 발광물질 등이 사용된다. 방사성 동위원소로서는, 예컨대 [¹²⁵I], [¹³¹I], [³H], [¹⁴C] 등이 사용된다. 상기 효소로서는, 안정하고 비활성 (比活性) 이 큰 것이 바람직하고, 예컨대 β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산탈수소효소 등이 사용된다. 형광물질로서는, 예컨대 플루오레스카민, 플루오레센이소티오시아네이트 등이 사용된다. 발광물질로서는, 예컨대 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등이 사용된다. 또한, 항체 또는 항원과 표지제의 결합에 비오틴-아비딘계를 사용할 수도 있다.

항원 또는 항체의 불용화에 있어서는, 물리흡착을 사용해도 되고, 또한 통상 단백질 또는 효소 등을 불용화, 고정화시키기에 사용되는 화학결합을 사용하는 방법이어도 된다. 담체로서는, 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스 등과 같은 불용성다당류, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 실리콘 등의 합성수지 또는 유리 등을 들 수 있다.

샌드위치법에서는 불용화된 본 발명의 모노클로날 항체에 피검액을 반응시키고 (1 차 반응), 추가로 표지화된 다른 발명의 모노클로날 항체를 반응시킨 (2 차 반응) 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정함으로써 피검액 중의 본 발명의 단백질량을 정량할 수 있다. 1 차 반응과 2 차 반응은 반대 순서로 실시해도, 또한 동시에 실시해도 되고, 시간을 어긋나게 실시해도 된다. 표지화제 및 불용화 방법은 상기 이것들에 준하여 실시할 수 있다. 또, 샌드위치법에 의한 면역측정법에서 고상용 항체 또는 표지용 항체에 사용되는 항체는 반드시 1 종류일 필요는 없고, 측정감도를 향상시키는 등의 목적에서 2 종류 이상의 항체의 혼합물을 사용해도 된다.

본 발명의 샌드위치법에 의한 본 발명의 단백질의 측정법에서, 1 차 반응과 2 차 반응에 사용되는 본 발명의 모노클로날 항체는 본 발명의 단백질이 결합되는부위가 상이한 항체가 바람직하게 사용된다. 즉, 1 차 반응 및 2 차 반응에 사용되는 항체는 예컨대 2 차 반응에서 사용되는 항체가 본 발명의 단백질의 C 단부를 인식하는 경우, 1 차 반응에서 사용되는 항체는 바람직하게는 C 단부 이외에, 예컨대 N 단부를 인식하는 항체가 사용된다.

본 발명의 모노클로날 항체를 샌드위치법 이외의 측정시스템, 예컨대 경합법, 이뮤노메트릭법 또는 네프로메트리 등에 사용할 수 있다.

경합법에서는, 피검액 중의 항원과 표지 항원을 항체에 대하여 경합적으로 반응시킨 후, 미반응 표지항원 (F) 와, 항체와 결합한 표지항원 (B) 를 분리하고 (B/F 분리), B, F 중 어느 하나의 표지량을 측정하여 피검액 중의 항원량을 정량한다. 본 반응법에는 항체로서 가용성 항체를 사용하여 B/F 분리를 폴리에틸렌글리콜, 상기 항체에 대한 제 2 항체를 사용하는 액상법, 및 제 1 항체로서 고상화 항체를 사용하거나 또는 제 1 항체는 가용성의 것을 사용하고 제 2 항체로서 고상화 항체를 사용하는 고상화법이 이용된다.

이뮤노메트릭법에서는, 피검액 중의 항원과 고상화 항원을 일정량의 표지화 항체에 대하여 경합 반응시킨 후, 고상과 액상을 분리하거나, 또는 피검액 중의 항원과 과잉량의 표지화 항체를 반응시키고, 이어서 고상화 항원을 첨가하고 미반응 표지화 항체를 고상으로 결합시킨 후 고상과 액상을 분리한다. 이어서, 어느 하나의 상의 표지량을 측정하여 피검액 중의 항원량을 정량한다.

또, 네프로메트리에서는, 겔내 또는 용액 중에서 항원 항체 반응의 결과 발생된 불용성 침강물의 양을 측정한다. 피검액 중의 항원량이 아주 적어 소량의침강물 밖에 수득할 수 없는 경우에도 레이저의 산란을 이용하는 레이저 네프로메트리 등이 바람직하게 사용된다.

이들 개개의 면역학적 측정법을 본 발명의 정량방법에 적용함에 있어서는, 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요하지 않게 된다. 각각의 방법에서의 통상 조건, 조작법에 당업자의 통상적인 기술적 배려를 가하여 본 발명의 단백질의 측정계를 구축하면 된다. 이들 일반적인 기술수단의 상세함에 대해서는, 총설, 도서 등을 참조할 수 있다.

예컨대, 이리에 히로시 편 「라디오이뮤노어세이」(코우단사, 1974년 발행), 이리에 히로시 편 「속 라디오이뮤노어세이」(코우단사, 1979년 발행), 이시까와 에이지 외 편 「효소면역 측정법」(이가꾸쇼잉, 1978년 발행), 이시까와 에이지 외 편 「효소면역 측정법」(제2판) (이가꾸쇼잉, 1982년 발행), 이시까와 에이지 외 편 「효소면역 측정법」(제3판) (이가꾸쇼잉, 1987년 발행), 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70 (Immunochemical Techniques (Part A)), 상기 문헌 Vol.73 (Immunochemical Techniques (Part B)), 상기 문헌 Vol.74 (Immunochemical Techniques (Part C)), 상기 문헌 Vol.84 (Immunochemical Techniques (Part D : Selected Immunoassays)), 상기 문헌 Vol.92 (Immunochemical Techniques (Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 상기 문헌 Vol.121 (Immunochemical Techniques (Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (이상, 아카데믹 프레스사 발행) 등을 참조할 수 있다.

이상과 같이 하여 본 발명의 항체를 사용함으로써, 본 발명의 단백질을 우수한 감도로 정량할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체를 사용하여 본 발명의 단백질 농도를 정량함으로써, (1) 본 발명의 단백질 농도의 증대가 검출된 경우, 예컨대 기관지 천식이나 만성 폐색성 폐질환 등 폐ㆍ기도의 염증을 수반하는 폐ㆍ흉부 질환 등의 질병이나, 또는 장래에 발병될 가능성이 높은 것을 진단할 수 있다.

또, 본 발명의 항체는 체액이나 조직 등의 피검체 중에 존재하는 본 발명의 단백질을 검출하기 위하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질을 정제하기 위하여 사용하는 항체 칼럼의 제조, 정제시의 각 분획 중의 본 발명의 단백질 검출, 피검 세포내에서의 본 발명의 단백질의 거동 분석 등을 위하여 사용할 수 있다.

(5) 유전자 진단제

본 발명의 DNA 를 예컨대 프로브로서 사용함으로써, 인간 또는 온혈동물 (예컨대, 래트, 마우스, 모르모트, 토끼, 닭, 양, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 원숭이, 침팬지 등) 에서 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 또는 mRNA 의 이상 (유전자 이상) 을 검출할 수 있기 때문에, 예컨대 이 DNA 또는 mRNA 의 손상, 돌연변이 또는 발현 저하나, 이 DNA 또는 mRNA 의 증가 또는 발현 과다 등의 유전자 진단제로서 유용하다.

본 발명의 DNA 를 사용하는 상기 유전자 진단은, 예컨대 자체 공지된 노던 부합화나 PCR-SSCP 법 (Genomics, 5권, p874∼879(1989년), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86권,pp2766∼2770(1989년)) 등에 의해 실시할 수 있다.

예컨대, 노던 부합화에 의해 발현 과다가 검출된 경우 또는 PCR-SSCP법에 의해 DNA 의 돌연변이가 검출된 경우에는, 예컨대 기관지 천식이나 만성 폐색성 폐질환 등 폐ㆍ기도의 염증을 수반하는 폐ㆍ흉부 질환 등의 질병일 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다.

(6) 안티센스 DNA 를 함유한 의약

본 발명의 DNA 에 상보적으로 결합하여 이 DNA 의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 DNA 는 생체 내에서 본 발명의 단백질 생산을 억제할 수 있기 때문에, 예컨대 기관지 천식이나 만성 폐색성 폐질환 등 폐ㆍ기도의 염증을 수반하는 폐ㆍ흉부 질환 등의 치료ㆍ예방제로서 사용할 수 있다.

상기 안티센스 DNA 를 상기 치료ㆍ예방제로서 사용하는 경우, 상기한 본 발명의 DNA 를 함유한 각종 질병의 치료ㆍ예방제와 동일하게 하여 실시할 수 있다.

예컨대, 상기 안티센스 DNA 를 사용하는 경우, 이 안티센스 DNA 를 단독으로, 또는 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 어소시에이티드 바이러스 벡터 등과 같은 적당한 벡터에 삽입한 후, 통상적인 수단에 따라 실시할 수 있다. 이 안티센스 DNA 는 그대로 또는 섭취 촉진을 위해 보조제 등의 생리학적으로 인정되는 담체와 함께 제제화하여 유전자 총이나 하이드로 겔 카테터의 카테터에 의해 투여할 수 있다. 또는 에어로졸화시켜 흡입제로서 기관내에 국소 투여할 수도 있다.

또한, 이 안티센스 DNA 는 조직이나 세포내의 본 발명의 DNA 존재나 그 발현상황을 조사하기 위한 진단용 올리고뉴클레오티드 프로브로서 사용할 수도 있다.

(7) 본 발명의 항체를 함유한 의약

본 발명의 단백질의 활성을 중화시키는 작용을 갖는 본 발명의 항체는, 기관지 천식이나 만성 폐색성 폐질환 등 폐ㆍ기도의 염증을 수반하는 폐ㆍ흉부 질환 등의 질환에 대한 의약으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 항체를 함유한 상기 질환의 치료ㆍ예방제는, 그대로 액제로서 또는 적당한 제형의 의약조성물로서, 인간 또는 포유동물 (예, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 투여량은 투여 대상, 대상 질환, 증상, 투여 루트 등에 따라 다르지만, 예컨대 성인의 기관지 천식의 치료ㆍ예방을 위해서 사용하는 경우에는, 본 발명의 항체를 1 회량으로서, 통상 0.01∼20㎎/체중 ㎏ 정도, 바람직하게는 0.1∼10㎎/체중 ㎏ 정도, 더욱 바람직하게는 0.1∼5㎎/체중 ㎏ 정도를, 1 일 1∼5회 정도, 바람직하게는 1 일 1∼3회 정도, 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 비경구 투여 및 경구 투여의 경우에도 이에 준하는 양을 투여할 수 있다. 증상이 특히 심한 경우에는 그 증상에 따라 증량해도 된다.

본 발명의 항체는 그 자체 또는 적당한 의약조성물로서 투여할 수 있다. 상기 투여에 사용되는 의약조성물은 상기 또는 그의 염과 약리학적으로 허용될 수 있는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유한 것이다. 이러한 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 제형으로서 제공된다.

즉, 예컨대 경구 투여를 위한 조성물로서는, 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로는 정제 (당의정, 필름코팅정을 포함함), 환제, 과립제, 산제, 캡슐제 (소프트캡슐제를 포함함), 시럽제, 유제, 현탁제 등을 들 수 있다. 이러한 조성물은 자체 공지 방법으로 제조되고, 제제 분야에서 통상 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 것이다. 예컨대, 정제용 담체, 부형제로서는, 젖당, 전분, 자당, 스테아르산마그네슘 등이 사용된다.

비경구 투여를 위한 조성물로서는, 예컨대 주사제, 좌제 등이 사용되고, 주사제는 정맥주사제, 피하주사제, 피내주사제, 근육주사제, 점적주사제 등의 제형을 포함한다. 이러한 주사제는 자체 공지 방법에 따라, 예컨대 상기 항체 또는 그의 염을 통상 주사제에 사용되는 무균 수성 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제조된다. 주사용 수성액으로서는, 예컨대 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약을 포함한 등장액 등이 사용되고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알콜 (예, 에탄올), 폴리알콜(예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면활성제 (예, 폴리소르베이트80, HCO-50 (수소화 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50mol) 부가물)] 등과 병용할 수도 있다. 유성액으로서는 예컨대 참깨유, 대두유 등이 사용되고, 용해 보조제로서 벤조산벤질, 벤질알콜 등을 병용할 수도 있다. 제조된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다. 직장 투여에 사용되는 좌제는 상기 항체 또는 그의 염을 통상적인 좌약용 기제에 혼합함으로써 제조된다.

상기 경구용 또는 비경구용 의약조성물은 활성성분의 투여량에 적합한 투약 단위의 제형으로 제조되는 것이 바람직하다. 이러한 투약 단위의 제형으로서는, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제 (앰플), 좌제 등이 예시되고, 각각의 투약 단위제형당 통상 5∼500㎎, 특히 주사제에서는 5∼100㎎, 기타 제형에서는 10∼250㎎ 의 상기 항체가 함유되어 있는 것이 바람직하다.

또, 상기한 각 조성물은 상기 항체와의 배합에 의해 바람직하지 않은 상호 작용을 발생시키지 않는 한 다른 활성성분을 함유할 수도 있다.

(8) DNA 전이동물

본 발명은 외래성 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA (이하, 본 발명의 외래성 DNA 라고 함) 또는 그 변이 DNA (본 발명의 외래성 변이 DNA 라고 함) 를 갖는 비인간 포유동물을 제공한다.

즉, 본 발명은

(1) 본 발명의 외래성 DNA 또는 그 변이 DNA 를 갖는 비인간 포유동물,

(2) 비인간 포유동물이 설치동물인 제 (1) 에 기재된 동물,

(3) 설치동물이 마우스 또는 래트인 제 (2) 에 기재된 동물 및

(4) 본 발명의 외래성 DNA 또는 그 변이 DNA 를 함유하고 포유동물에서 발현될 수 있는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 외래성 DNA 또는 그 변이 DNA 를 갖는 비인간 포유동물 (이하, 본 발명의 DNA 전이동물이라고 함) 은, 미수정란, 수정란, 정자 및 그 시원세포를 포함한 배아세포 등에 대하여, 바람직하게는 비인간 포유동물의 발생에서 배 발생의 단계 (더욱 바람직하게는 단세포 또는 수정란 세포의 단계이며 일반적으로 8 세포기 이전) 에 인산칼슘법, 전기펄스법, 리포펙션법, 응집법, 마이크로인젝션법, 파티클건법, DEAE-덱스트란법 등으로 목적하는 DNA 를 전이시킴으로써 작출할 수 있다. 또한, 이 DNA 전이 방법으로 체세포, 생체의 장기, 조직 세포 등에 목적하는 본 발명의 외래성 DNA 를 전이하여 세포 배양, 조직 배양 등에 이용할 수도 있으며, 또한 이들 세포를 전술한 배아세포와 자체 공지된 세포 융합법으로 융합시킴으로써 본 발명의 DNA 전이동물을 작출할 수도 있다.

비인간 포유동물로서는, 예컨대 소, 돼지, 양, 염소, 토끼, 개, 고양이, 모르모트, 햄스터, 마우스, 래트 등이 사용된다. 그 중에서도 병체 동물 모델계의 작성 면에서, 개체 발생 및 생물 사이클이 비교적 짧고, 또한 번식이 쉬운 설치동물, 특히 마우스 (예컨대, 순수 계통으로서 C57BL/6 계통, DBA2 계통 등, 교배 계통으로서 B6C3F₁계통, BDF₁계통, B6D2F₁계통, BALB/c 계통, ICR 계통 등) 또는 래트 (예컨대 Wistar, SD 등) 등이 바람직하다.

포유동물에서 발현될 수 있는 재조합 벡터에 있어서의「포유동물」로서는, 상기 비인간 포유동물 이외에 인간 등을 들 수 있다.

본 발명의 외래성 DNA 란, 비인간 포유동물이 본래 갖고 있는 본 발명의 DNA 가 아니라 일단 포유동물로부터 단리 배출된 본 발명의 DNA 를 말한다.

본 발명의 변이 DNA 로서는, 원래 본 발명의 DNA 염기 서열에 변이 (예컨대, 돌연변이 등) 가 발생한 것, 구체적으로는 염기의 부가, 결손, 다른 염기로의 치환 등이 발생한 DNA 등이 사용되고, 또한 이상 DNA 도 포함된다.

이 이상 DNA 로서는 이상한 본 발명의 단백질을 발현시키는 DNA 를 의미하고, 예컨대 정상적인 본 발명의 단백질 기능을 억제하는 단백질을 발현시키는 DNA등이 사용된다.

본 발명의 외래성 DNA 는 대상 동물과 동종 또는 이종 중 어느 종의 포유동물 유래의 것이어도 된다. 본 발명의 DNA 를 대상 동물에게 전이시키는 데에 있어서는, 이 DNA 를 동물세포에서 발현시킬 수 있는 프로모터의 하류에 결합된 DNA 컨스트럭트로서 사용하는 것이 일반적으로 유리하다. 예컨대, 본 발명의 인간 DNA 를 전이시키는 경우, 이것과 상동성이 높은 본 발명의 DNA 를 갖는 각종 포유동물 (예컨대, 토끼, 개, 고양이, 모르모트, 햄스터, 래트, 마우스 등) 유래의 DNA 를 발현시킬 수 있는 각종 프로모터의 하류에 본 발명의 인간 DNA 를 결합한 DNA 컨스트럭트 (예, 벡터 등) 를 대상 포유동물의 수정란, 예컨대 마우스 수정란에 마이크로인젝션함으로써, 본 발명의 DNA 를 고발현하는 DNA 전이 포유동물을 작출할 수 있다.

본 발명의 단백질의 발현 벡터로서는, 대장균 유래의 플라스미드, 고초균 유래의 플라스미드, 효모 유래의 플라스미드, λ파지 등과 같은 박테리오파지, 몰로니 백혈병 바이러스 등과 같은 레트로 바이러스, 백시니어 바이러스 또는 배큘로 바이러스 등과 같은 동물 바이러스 등이 사용된다. 그 중에서도 대장균 유래의 플라스미드, 고초균 유래의 플라스미드 또는 효모 유래의 플라스미드 등이 바람직하게 사용된다.

상기 DNA 발현을 조절하는 프로모터로서는, 예컨대 ① 바이러스 (예, 시미안 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, 몰로니 백혈병 바이러스, JC 바이러스, 유방암 바이러스, 폴리오 바이러스 등) 에서 유래하는 DNA 프로모터, ② 각종 포유동물 (인간, 토끼, 개, 고양이, 모르모트, 햄스터, 래트, 마우스 등) 유래의 프로모터, 예컨대 알부민, 인슐린Ⅱ, 우로프라킨Ⅱ, 엘라스타아제, 에리트로포에틴, 엔도세린, 근(筋)크레아틴 키나아제, 글리아선유성 산성 단백질, 글루타티온S-트란스페라아제, 혈소판 유래 성장인자β, 케라틴K1, K10 및 K14, 콜라겐Ⅰ형 및 Ⅱ형, 사이클릭 AMP 의존 단백질 키나아제βI 서브유닛, 디스트로핀, 타르타르산 저항성 알칼리 포스파타아제, 심방 나트륨 이뇨성 인자, 내피 리셉터 티로신 키나아제 (일반적으로 Tie2 라고 함), 나트륨칼륨아데노신3인산화효소 (Na, K-ATPase), 뉴로필라멘트 경쇄, 메탈로티오네인Ⅰ 및 ⅡA, 메탈로프로티나아제 1 조직 인히비터, MHC 클래스Ⅰ항원 (H-2L), H-ras, 레닌, 도파민β-수산화효소, 갑상선퍼옥시다아제 (TPO), 단백질쇄 연장인자1α(EF-1α), β악틴, α및 β미오신 중쇄, 미오신 경쇄 1 및 2, 미엘린 기초 단백질, 티로글로불린, Thy-1, 면역 글로불린, H 쇄 가변부 (VNP), 혈청 아밀로이드 P 컴포넌트, 미오글로빈, 트로포닌 C, 평활근α악틴, 프리프로엔케파린 A, 바소프레신 등과 같은 프로모터 등이 사용된다. 그 중에서도 전신에서 고발현될 수 있는 사이토메갈로 바이러스 프로모터, 인간 폴리펩티드쇄 연장인자 1α(EF-1α) 의 프로모터, 인간 및 닭 β악틴 프로모터 등이 바람직하다.

상기 벡터는 DNA 전이 포유동물에서 목적하는 메신저 RNA 의 전사를 종결하는 서열 (일반적으로 터미네이터라고 함) 을 갖고 있는 것이 바람직하고, 예컨대 바이러스 유래 및 각종 포유동물 유래의 각 DNA 서열을 사용할 수 있고, 바람직하게는 시미안 바이러스의 SV40 터미네이터 등이 사용된다.

그 밖에 목적하는 외래성 DNA 를 더욱 고발현시키는 목적에서, 각 DNA 의 스플라이싱 시그널, 인핸서 영역, 진핵 DNA 의 인트론 일부 등을 프로모터 영역의 5'상류, 프로모터 영역과 번역 영역 사이 또는 번역 영역의 3'하류에 연결하는 것도 목적에 따라 가능하다.

정상적인 본 발명의 단백질의 번역 영역은, 인간 또는 각종 포유동물 (예컨대, 토끼, 개, 고양이, 모르모트, 햄스터, 래트, 마우스 등) 유래의 간장, 신장, 갑상선세포, 선유아세포 유래 DNA 및 시판되는 각종 게놈 DNA 라이브러리로부터 게놈 DNA 의 전체 또는 일부로서, 또는 간장, 신장, 갑상선세포, 선유아세포 유래 RNA 로부터 공지 방법으로 제조된 상보 DNA 를 원료로서 취득할 수 있다. 또, 외래성 이상 DNA 는, 상기 세포 또는 조직에서 수득된 정상적인 단백질의 번역 영역이 점 돌연변이 유발법에 의해 변이된 번역 영역을 제조할 수 있다.

이 번역 영역은 전이동물에서 발현될 수 있는 DNA 컨스트럭트로, 상기 프로모터의 하류 및 원하는 바에 따라 전사종결 부위의 상류에 연결시키는 통상적인 유전자 공학적 수법으로 제조할 수 있다.

수정란 세포단계에서 본 발명의 외래성 DNA 의 전이는 대상 포유동물의 배아세포 및 체세포 전체에 존재하도록 확보된다. DNA 전이 후의 작출동물의 배아세포에서 본 발명의 외래성 DNA 가 존재하는 것은, 작출동물의 후대가 모두 그 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명의 외래성 DNA 를 유지하는 것을 의미한다. 본 발명의 외래성 DNA 를 이어받은 이런 종류의 동물 자손은 그 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명의 외래성 DNA 를 갖는다.

본 발명의 외래성 정상 DNA 를 전이시킨 비인간 포유동물은, 교배로 외래성DNA 를 안정적으로 유지하는 것을 확인하고 이 DNA 보유동물로서 통상적인 사육환경에서 계대 사육할 수 있다.

수정란 세포단계에서 본 발명의 외래성 DNA 의 전이는 대상 포유동물의 배아세포 및 체세포 전체에 과잉으로 존재하도록 확보된다. DNA 전이 후의 작출동물의 배아세포에서 본 발명의 외래성 DNA 가 과잉으로 존재하는 것은 작출동물의 자손이 모두 그 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명의 외래성 DNA 를 과잉으로 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 외래성 DNA 를 이어받은 이런 종류의 동물 자손은 그 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명의 외래성 DNA 를 과잉으로 갖는다.

도입 DNA 를 상동 염색체 양쪽에 갖는 호모자이고트 동물을 취득하여 이 암수동물을 교배함으로써, 모든 자손이 이 DNA 를 과잉으로 갖도록 번식 계대할 수 있다.

본 발명의 정상 DNA 를 갖는 비인간 포유동물은, 본 발명의 정상 DNA 가 고발현되어 있어 내재성 정상 DNA 의 기능을 촉진함으로써, 최종적으로 본 발명의 단백질의 기능 항진증을 발증하기 때문에 그 병태 모델 동물로서 이용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 정상 DNA 전이동물을 사용하고, 본 발명의 단백질의 기능 항진증이나 본 발명의 단백질이 관련된 질환의 병태 기서의 해명 및 이들 질환의 치료 방법의 검토를 할 수 있다.

또한, 본 발명의 외래성 정상 DNA 를 전이시킨 포유동물은 유리된 본 발명의 단백질의 증가 증상을 갖고 있기 때문에, 본 발명의 단백질에 관련된 질환에 대한 치료약의 스크리닝 시험에도 이용 가능하다.

한편, 본 발명의 외래성 이상 DNA 를 갖는 비인간 포유동물은 교배에 의해 외래성 DNA 를 안정적으로 유지하는 것을 확인하고 이 DNA 보유동물로서 통상적인 사육 환경에서 계대 사육할 수 있다. 또한, 목적하는 외래성 DNA 를 전술한 플라스미드에 끼워넣어 원료로써 사용할 수 있다. 프로모터와의 DNA 컨스트럭트는 통상적인 유전자 공학적 수법으로 제조할 수 있다. 수정란 세포 단계에서 본 발명의 이상 DNA 의 전이는 대상 포유동물의 배아세포 및 체세포 전체에 존재하도록 확보된다. DNA 전이 후의 작출동물의 배아세포에서 본 발명의 이상 DNA 가 존재하는 것은, 작출동물의 자손이 모두 그 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명의 이상 DNA 를 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 외래성 DNA 를 이어받은 이런 종류의 동물 자손은 그 배아세포 및 체세포 전체에 본 발명의 이상 DNA 를 갖는다. 도입 DNA 를 상동 염색체 양쪽에 갖는 호모자이고트 동물을 취득하여 이 암수컷 동물을 교배함으로써, 모든 자손이 이 DNA 를 갖도록 번식 계대할 수 있다.

본 발명의 이상 DNA 를 갖는 비인간 포유동물은, 본 발명의 이상 DNA 가 고발현되어 있어 내재성 정상 DNA 의 기능을 저해함으로써, 최종적으로 본 발명의 단백질의 기능 불활성형 불응증이 되는 경우가 있어 그 병태 모델 동물로서 이용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 이상 DNA 전이동물을 사용하고, 본 발명의 단백질의 기능 불활성형 불응증의 병태 기서의 해명 및 이 질환의 치료 방법의 검토를 할 수 있다.

또, 구체적인 이용 가능성으로서는, 본 발명의 이상 DNA 고발현 동물은, 본 발명의 단백질의 기능 불활성형 불응증에 있어서의 본 발명의 이상 단백질에 의한정상 단백질의 기능 저해 (dominant negative 작용) 를 해명하는 모델이 된다.

또한, 본 발명의 외래 이상 DNA 를 전이시킨 포유동물은 유리된 본 발명의 단백질의 증가 증상을 갖고 있기 때문에, 본 발명의 단백질의 기능 불활성형 불응증에 대한 치료약 스크리닝 시험에도 이용 가능하다.

그리고, 상기 2 종류의 본 발명의 DNA 전이동물의 기타 이용 가능성으로서, 예컨대

① 조직 배양을 위한 세포원으로서의 사용,

② 본 발명의 DNA 전이동물의 조직 중의 DNA 또는 RNA 를 직접 분석하거나 또는 DNA 에 의해 발현된 단백질 조직을 분석하는 것에 의한, 본 발명의 단백질에 의해 특이적으로 발현 또는 활성화하는 단백질과의 관련성에 대한 해석,

③ DNA 를 갖는 조직 세포를 표준 조직 배양기술로 배양하고, 이것들을 사용하여 일반적으로 배양하기 어려운 조직으로부터의 세포 기능의 연구,

④ 상기 ③ 에 기재된 세포를 사용하는 것에 의한 세포 기능을 높이는 약제의 스크리닝 및

⑤ 본 발명의 변이 단백질을 단리 정제 및 그 항체 제조 등을 생각할 수 있다.

또, 본 발명의 DNA 전이동물을 사용하며 본 발명의 단백질의 기능 불활성형 불응증 등을 포함하는 본 발명의 단백질에 관련된 질환의 임상증상을 조사할 수 있고, 또한 본 발명의 단백질에 관련된 질환 모델의 각 장기에서의 보다 상세한 병리학적 소견을 얻을 수 있어, 새로운 치료 방법의 개발, 그리고 이 질환에 의한 2 차적 질환의 연구 및 치료에 공헌할 수 있다.

또한, 본 발명의 DNA 전이동물로부터 각 장기를 꺼내어 가늘게 자른 후, 트립신 등의 단백질 분해효소에 의해 유리된 DNA 전이세포의 취득, 그 배양 또는 그 배양세포의 계통화를 실시할 수 있다. 또, 본 발명의 단백질 생산 세포의 특정화, 아폽토시스, 분화 또는 증식과의 관련성 또는 이들의 시그널 전달기구를 조사하고 이것들의 이상 등을 조사할 수 있어, 본 발명의 단백질 및 그 작용해명을 위한 유효한 연구 재료가 된다.

그리고, 본 발명의 DNA 전이동물을 사용하며 본 발명의 단백질의 기능 불활성형 불응증을 포함하는 본 발명의 단백질에 관련된 질환의 치료약 개발을 실시하기 위해서, 전술한 검사법 및 정량법 등으로 유효하고 신속한 이 질환의 치료약의 스크리닝법을 제공할 수 있게 된다. 또한, 본 발명의 DNA 전이동물 또는 본 발명의 외래성 DNA 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 단백질이 관련된 질환의 DNA 치료법을 검토, 개발할 수 있다.

(9) 노크아웃 동물

본 발명은 본 발명의 DNA 가 불활성화된 비인간 포유동물 배간세포 및 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물을 제공한다.

즉, 본 발명은

(1) 본 발명의 DNA 가 불활성화된 비인간 포유동물 배간세포,

(2) 이 DNA 가 리포터 유전자 (예, 대장균 유래의 β-갈락토시다아제 유전자) 를 도입함으로써 불활성화된 제 (1) 항에 기재된 배간세포,

(3) 네오마이신 내성인 제 (1) 항에 기재된 배간세포,

(4) 비인간 포유동물이 설치동물인 제 (1) 항에 기재된 배간세포,

(5) 설치동물이 마우스인 제 (4) 항에 기재된 배간세포,

(6) 본 발명의 DNA 가 불활성화된 이 DNA 발현부전 비인간 포유동물,

(7) 이 DNA 가 리포터 유전자 (예, 대장균 유래의 β-갈락토시다아제 유전자) 를 도입함으로써 불활성화되고, 이 리포터 유전자가 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터의 제어하에서 발현될 수 있는 제 (6) 항에 기재된 비인간 포유동물,

(8) 비인간 포유동물이 설치동물인 제 (6) 항에 기재된 비인간 포유동물,

(9) 설치동물이 마우스인 제 (8) 항에 기재된 비인간 포유동물 및

(10) 제 (7) 항에 기재된 동물에게 시험 화합물을 투여하고 리포터 유전자의 발현을 검출하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 DNA 가 불활성화된 비인간 포유동물 배간세포란, 이 비인간 포유동물이 갖는 본 발명의 DNA 에 인위적으로 변이를 가함으로써 DNA 의 발현능을 억제하거나, 또는 이 DNA 가 코딩되어 있는 본 발명의 단백질의 활성을 실질적으로 상실시킴으로써, DNA 가 실질적으로 본 발명의 단백질의 발현능을 갖지 않는 (이하, 본 발명의 노크아웃 DNA 라고 함) 비인간 포유동물의 배간세포 (이하, ES 세포라고 함) 를 말한다.

비인간 포유동물로서는 상기와 동일한 것이 사용된다.

본 발명의 DNA 에 인위적으로 변이를 가하는 방법으로는, 예컨대 유전자 공학적 수법으로 이 DNA 서열의 일부 또는 전부의 삭제, 다른 DNA 를 삽입 또는 치환시킴으로써 실시할 수 있다. 이것들의 변이에 따라, 예컨대 코돈의 판독구조를 어긋나게 하거나 프로모터 또는 엑손 기능을 파괴함으로써 본 발명의 노크아웃 DNA 를 제조하면 된다.

본 발명의 DNA 가 불활성화된 비인간 포유동물 배간세포 (이하, 본 발명의 DNA 불활성화 ES 세포 또는 본 발명의 노크아웃 ES 세포라고 함) 의 구체예로서는, 예컨대 목적하는 비인간 포유동물이 갖는 본 발명의 DNA 를 단리하고 그 엑손 부분에 네오마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자를 대표로 하는 약제 내성 유전자 또는 lacZ(β-갈락토시다아제 유전자), cat (클로람페니콜 아세틸 트랜스페라아제 유전자) 를 대표로 하는 리포터 유전자 등을 삽입함으로써, 엑손 기능을 파괴하거나 또는 엑손 사이의 인트론 부분에 유전자의 전사를 종결시키는 DNA 서열 (예컨대, polyA 부가 시그널 등) 을 삽입하고 완전한 메신저 RNA 를 합성할 수 없게 함으로써, 결과적으로 유전자를 파괴하도록 구축된 DNA 서열을 갖는 DNA 쇄 (이하, 타겟팅 벡터라고 함) 를, 예컨대 상동 재조합법으로 이 동물의 염색체로 도입하며, 수득된 ES 세포에 대해서 본 발명의 DNA 상 또는 그 근방의 DNA 서열을 프로브로 한 서던 부합화 해석, 또는 타겟팅 벡터 상의 DNA 서열과 타겟팅 벡터 제조에 사용된 본 발명의 DNA 이외의 근방영역의 DNA 서열을 프라이머로 한 PCR 법으로 해석하고, 본 발명의 노크아웃 ES 세포를 선별함으로써 수득할 수 있다.

또, 상동 재조합법 등으로 본 발명의 DNA 를 불활성화시키는 원래의 ES 세포로는, 예컨대 전술한 바와 같은 이미 수립된 것을 사용해도 되고, 또한 공지된Evans 와 Kaufma 의 방법에 준하여 새롭게 수립된 것이어도 된다. 예컨대, 마우스의 ES 세포의 경우, 현재 일반적으로는 129 계의 ES 세포가 사용되고 있으나, 면역학적 배경이 확실하지 않기 때문에, 이를 대신하는 순수 계통에서 면역학적으로 유전적 배경이 명확한 ES 세포를 취득하는 등의 목적에서, 예컨대 C57BL/6 마우스나 C57BL/6 의 적은 채란수가 DBA/2 와의 교배에 의해 개선된, BDF₁마우스 (C57BL/6 과 DBA/2의 F₁) 를 사용하여 수립한 것 등도 양호하게 사용할 수 있다. BDF₁마우스는 채란수가 많으면서 난이 건강하다는 이점에 추가로, C57BL/6 마우스를 배경으로 하고 있어 이것을 사용하여 수득된 ES 세포는 병태 모델 마우스를 작출하였을 때에, C57BL/6 마우스와 복귀 교배 (백 크로스) 함으로써 그 유전적 배경을 C57BL/6 마우스에 대신할 수 있다는 면에서 유리하게 사용할 수 있다.

또, ES 세포를 수립하는 경우 일반적으로는 수정 후 3.5 일째의 상실배를 사용하지만, 그 이외에 8 세포기 배를 채란하고 배반포까지 배양하여 사용함으로써 효율적으로 다수의 초기 배를 취득할 수 있다.

또한, 암수 어느 한쪽의 ES 세포를 사용할 수도 있으나, 통상 수컷 ES 세포가 생식계열 키메라를 작출하는 데에 바람직하다. 또, 번잡한 배양에 드는 수고를 삭감하기 위해서도 될 수 있으면 빨리 암수 판별을 하는 것이 바람직하다.

ES 세포의 암수 판정방법으로는, 예컨대 PCR 법으로 Y 염색체 상의 성 결정영역의 유전자를 증폭, 검출하는 방법을 그 일례로서 들 수 있다. 이 방법을 사용하면 종래 핵형 분석을 하는 데에 약 10⁶개의 세포수를 필요로 한 반면에, 1콜로니 정도의 ES 세포수 (약 50개) 면 충분하기 때문에, 배양 초기의 ES 세포의 제 1 차 셀렉션을 암수 판별로 할 수 있고, 조기에 수컷 세포의 선정을 가능하게 함으로써 배양 초기의 수고를 대폭 삭감할 수 있다.

또, 제 2 차 셀렉션으로서는, 예컨대 G-밴딩법에 따른 염색체 수의 확인 등에 의해 실시할 수 있다. 수득된 ES 세포의 염색체 수는 정상수의 100% 가 바람직하지만, 수립시의 물리적 조작 등의 관계상 어려운 경우에는 ES 세포의 유전자를 노크아웃한 후, 정상 세포 (예컨대, 마우스는 염색체 수가 2n=40 인 세포) 에 다시 클로닝하는 것이 바람직하다.

이렇게 해서 수득된 배간세포주는 통상 그 증식성은 매우 좋지만, 개체 발생할 수 있는 능력을 잃기 쉽기 때문에 주의깊게 계대 배양하는 것이 필요하다. 예컨대, STO 섬유아세포와 같은 피더 세포 상에서 LIF (1-10000U/㎖) 존재하에 탄산가스 배양기 내 (바람직하게는 5% 탄산가스, 95% 공기 또는 5% 산소, 5% 탄산가스, 90% 공기) 에서 약 37℃ 에서 배양하는 등의 방법으로 배양하고, 계대시에는 예컨대 트립신/EDTA 용액 (통상 0.001-0.5% 트립신/0.1-5mM EDTA, 바람직하게는 0.1% 트립신/1mM EDTA) 처리로 단세포화시키고, 새롭게 준비한 피더 세포 상에 파종하는 방법 등을 들 수 있다. 이러한 계대는 통상 1-3 일마다 행하지만, 이 때에 세포를 관찰하여 형태적으로 이상한 세포가 발견된 경우에는 그 배양세포는 포기할 필요가 있다.

ES 세포는 적당한 조건에 의해 고밀도에 이를 때까지 단층 배양하거나 또는 세포 집괴를 형성할 때까지 부유 배양함으로써, 두정근, 내장근, 심근 등과 같은여러 타입 세포로 분화시키는 것이 가능하고 [M. J. Evans 및 M. H. Kaufman, Nature 292권, p154, 1981년; G. R. Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78권, p7634, 1981년; T. C. Doetschman 외, 저널 오브 엠블리올로지 앤드 엑스페리멘탈 모르폴로지, 87권, p27, 1985년], 본 발명의 ES 세포를 분화시켜 수득된 본 발명의 DNA 발현부전 세포는, 인 비트로에서의 본 발명의 단백질의 세포생물학적 검토에서 유용하다.

본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물은 이 동물의 mRNA 량을 공지 방법으로 측정하여 간접적으로 그 발현량을 비교함으로써 정상 동물과 구별할 수 있다.

상기 비인간 포유동물로서는 상기와 동일한 것이 사용된다.

본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물은, 예컨대 전술한 바와 같이 하여 제조된 타겟팅 벡터를 마우스 배간세포 또는 마우스 난세포에 도입하고, 도입에 의해 타겟팅 벡터의 본 발명의 DNA 가 불활성화된 DNA 서열이 유전자 상동 재조합에 의해 마우스 배간세포 또는 마우스 난세포의 염색체 상의 본 발명의 DNA 와 교체되는 상동 재조합을 시킴으로써 본 발명의 DNA 를 노크아웃시킬 수 있다.

본 발명의 DNA 가 노크아웃된 세포는, 본 발명의 DNA 상 또는 그 근방의 DNA 서열을 프로브로 한 서던 부합화 해석, 또는 타겟팅 벡터 상의 DNA 서열과 타겟팅 벡터에 사용한 마우스 유래의 본 발명의 DNA 이외의 근방영역의 DNA 서열을 프라이머로 한 PCR 법에 따른 해석으로 판정할 수 있다. 비인간 포유동물 배간세포를 사용한 경우에는, 유전자 상동 재조합에 의해 본 발명의 DNA 가 불활성화된 세포주를 클로닝하여 이 세포를 적당한 시기, 예컨대 8 세포기의 비인간 포유동물 배 또는 배반포에 주입하며, 만들어진 키메라 배를 위임신시킨 이 비인간 포유동물의 자궁에 이식한다. 만들어진 동물은 정상적인 본 발명의 DNA 자리를 갖는 세포와 인위적으로 변이된 본 발명의 DNA 자리를 갖는 세포 모두로 구성된 키메라 동물이다.

상기 키메라 동물의 생식세포의 일부가, 변이된 본 발명의 DNA 자리를 갖는 경우, 이러한 키메라 개체와 정상 개체를 교배함으로써 수득된 개체군에서 모든 조직이 인위적으로 변이를 가한 본 발명의 DNA 자리를 갖는 세포로 구성된 개체를, 예컨대 코트컬러의 판정 등으로 선별함으로써 수득할 수 있다. 이렇게 해서 수득된 개체는 통상 본 발명의 단백질의 헤테로 발현부전 개체로서, 본 발명의 단백질의 헤테로 발현부전 개체끼리 교배하고 이들의 새끼로부터 본 발명의 단백질의 호모 발현부전 개체를 수득할 수 있다.

난세포를 사용하는 경우에는, 예컨대 난세포 핵 내에 마이크로인젝션법으로 DNA 용액을 주입함으로써 타겟팅 벡터를 염색체 내로 도입한 트랜스제닉 비인간 포유동물을 수득할 수 있고, 이들 트랜스제닉 비인간 포유동물에 비하여 유전자 상동 재조합에 의해 본 발명의 DNA 자리에 변이가 있는 것을 선택함으로써 수득된다.

이렇게 해서 본 발명의 DNA 가 노크아웃되어 있는 개체는, 교배에 의해 수득된 동물 개체도 이 DNA 가 노크아웃되어 있는 것을 확인하고 통상적인 사육환경에서 사육 계대를 할 수 있다.

또한, 생식계열의 취득 및 유지에 대해서도 통상적인 방법에 따르면 된다. 즉, 이 불활성 DNA 를 보유하는 암수 동물을 교배함으로써 이 불활성 DNA 를 상동염색체 양쪽에 갖는 호모자이고트 동물을 얻을 수 있다. 수득된 호모자이고트 동물은 모친동물로부터 정상 개체 1, 호모자이고트 복수가 수득되는 상태에서 사육함으로써 효율적으로 얻을 수 있다. 헤테로자이고트 동물의 암수를 교배함으로써 이 불활성화 DNA 를 갖는 호모자이고트 및 헤테로자이고트 동물을 번식 계대한다.

본 발명의 DNA 가 불활성화된 비인간 포유동물 배간세포는 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물을 작출하는 데에 매우 유용하다.

또한, 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물은 본 발명의 단백질에 의해 유도될 수 있는 각종 생물활성을 결실하기 때문에, 본 발명의 단백질의 생물활성의 불활성화를 원인으로 하는 질병의 모델이 될 수 있어 이들 질병의 원인 규명 및 치료법 검토에 유용하다.

(10) 본 발명의 DNA 의 결손이나 손상 등에서 기인되는 질병에 대하여 치료ㆍ예방 효과를 갖는 화합물의 스크리닝 방법

본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물은 본 발명의 DNA 의 결손이나 손상 등에서 기인되는 질병 (예, 감염증 등) 에 대하여 치료ㆍ예방 효과를 갖는 화합물의 스크리닝에 사용할 수 있다.

즉, 본 발명은 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물에 시험 화합물을 투여하고 이 동물의 변화를 관찰ㆍ측정하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 DNA 의 결손이나 손상 등에서 기인되는 질병에 대하여 치료ㆍ예방 효과를 갖는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법을 제공한다.

이 스크리닝 방법에서 사용되는 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물로서는 상기한 바와 동일한 것을 들 수 있다.

시험 화합물로서는, 예컨대 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액, 혈장 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물이거나 공지 화합물일 수도 있다.

구체적으로는 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물을 시험 화합물로 처리하고, 처리되지 않은 대조 동물과 비교하여, 이 동물의 각 기관, 조직, 질병의 증상 등과 같은 변화를 지표로 삼아 시험 화합물의 치료ㆍ예방 효과를 시험할 수 있다.

시험 동물을 시험 화합물로 처리하는 방법으로는, 예컨대 경구 투여, 정맥 주사 등이 사용되고, 시험 동물의 증상, 시험 화합물의 성질 등에 맞춰서 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 시험 화합물의 투여량은 투여방법, 시험 화합물의 성질 등에 맞춰 적절하게 선택할 수 있다.

예컨대, 기관지 천식에 대하여 치료ㆍ예방 효과를 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우, 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물에 항원 (예컨대, OVA) 을 면역시키고, 그리고 이 항원 (예컨대, OVA) 을 흡입시켜 기도 과민성을 항진시킬 때에 시험 화합물을 투여하고 이 동물의 기도 저항이나 호산구의 침윤 등을 시간경과에 따라 측정한다.

이 스크리닝 방법에서 시험 동물에게 시험 화합물을 투여한 경우, 이 시험 동물의 항원 흡입 또는 기도 저항 상승이 약 10% 이상, 바람직하게는 약 30% 이상,보다 바람직하게는 약 50% 이상 억제된 경우, 이 시험 화합물을 기관지 천식에 대하여 치료ㆍ예방 효과를 갖는 화합물로서 선택할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법으로 수득된 화합물은 상기한 시험 화합물에서 선택된 화합물로서, 본 발명의 단백질의 발현 상승 등에 의해 야기되는 질환 (예, 기관지 천식 등) 에 대하여 치료ㆍ예방 효과를 가지기 때문에, 이 질환에 대한 안전하고 저독성의 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝으로 수득된 화합물에서 유도되는 화합물도 마찬가지로 사용할 수 있다.

이 스크리닝 방법으로 수득된 화합물은 염을 형성해도 되고, 이 화합물의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산 (예, 무기산, 유기산) 이나 염기 (예, 알칼리 금속) 등과의 염이 사용되고, 특히 생리학적으로 허용되는 산 부가염이 바람직하다. 이러한 염으로는, 예컨대 무기산 (예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염 또는 유기산 (예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸말산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용된다.

이 스크리닝 방법으로 수득된 화합물 또는 그의 염을 함유한 의약은 상기한 본 발명의 단백질을 함유한 의약과 동일하게 하여 제조할 수 있다. 이렇게 해서 수득된 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 인간 또는 포유동물 (예컨대, 래트, 마우스, 모르모트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그의 염의 투여량은 대상 질환, 투여 대상, 투여 루트 등에따라 차이는 있지만, 예컨대 기관지 천식의 치료 목적에서 이 화합물을 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏) 에게 하루에 상기 화합물을 약 0.1∼100㎎, 바람직하게는 약 1.0∼50㎎, 더 바람직하게는 약 1.0∼20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 이 화합물의 1 회 투여량은 투여 대상, 대상 질환 등에 따라서도 다르지만, 예컨대 기관지 천식의 치료 목적에서 이 화합물을 주사제 형태로 통상 성인 (60㎏) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 화합물을 약 0.01∼30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1∼20㎎ 정도, 보다 바람직하게는 0.1∼10㎎ 정도를 정맥 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(11) 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물을 스크리닝하는 방법

본 발명은 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물에게 시험 화합물을 투여하여 리포터 유전자의 발현을 검출하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법에서 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물로서는, 상기한 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물 중에서, 본 발명의 DNA 가 리포터 유전자를 도입함으로써 불활성화되고 이 리포터 유전자가 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터의 제어하에서 발현될 수 있는 것이 사용된다.

시험 화합물로서는 상기한 바와 동일한 것을 들 수 있다.

리포터 유전자로서는 상기한 바와 동일한 것이 사용되고, β-갈락토시다아제 유전자 (lacZ), 가용성 알칼리포스파타아제 유전자 또는 루시페라아제 유전자 등이 바람직하다.

본 발명의 DNA 를 리포터 유전자로 치환된 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물에서는, 리포터 유전자가 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터의 지배하에 존재하기 때문에, 리포터 유전자가 코딩되는 물질의 발현을 트레이스함으로써 프로모터 활성을 검출할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 영역의 일부를 대장균 유래의 β-갈락토시다아제 유전자 (lacZ) 로 치환하는 경우, 본래 본 발명의 단백질이 발현되는 조직에서 본 발명의 단백질 대신에 β-갈락토시다아제가 발현된다. 따라서, 예컨대 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토피라노시드 (X-gal) 와 같은 β-갈락토시다아제의 기질이 되는 시약을 사용하여 염색함으로써, 간편하게 본 발명의 단백질의 동물 생체 내에서의 발현 상태를 관찰할 수 있다. 구체적으로는 본 발명의 단백질 결손 마우스 또는 그 조직 절편을 글루탈알데히드 등으로 고정시키고 인산 완충 생리식염액 (PBS) 으로 세정한 후, X-gal을 함유한 염색액으로 실온 또는 37℃ 부근에서 약 30 분 내지 1 시간 반응시킨 후, 조직 표본을 1mM EDTA/PBS 용액으로 세정함으로써 β-갈락토시다아제 반응을 정지시키고 띄는 색을 관찰하면 된다. 또한, 통상적인 방법에 따라 lacZ 를 코딩하는 mRNA 를 검출해도 된다.

상기 스크리닝 방법으로 수득된 화합물 또는 그의 염은 상기한 시험 화합물에서 선택된 화합물로, 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물이다.

상기 스크리닝 방법으로 수득된 화합물은 염을 형성해도 되고, 이 화합물의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산 (예, 무기산 또는 유기산) 이나 염기 (예, 알칼리금속) 등과의 염이 사용되고, 특히 생리학적으로 허용되는 산 부가염이 바람직하다. 이러한 염으로는, 예컨대 무기산 (예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염 또는 유기산 (예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸말산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용된다.

본 발명의 DNAa 에 대한 프로모터 활성을 촉진하는 화합물 또는 그의 염은 본 발명의 단백질 a 의 발현을 촉진시키고 이 단백질의 활성을 촉진시킬 수 있기 때문에, 예컨대 감염증 (예컨대, HIV 감염, HBV 감염, HCV 감염, 결핵 감염, 기회 감염 등) 등의 질병에 대한 안전하고 저독성의 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 유용하다.

한편, 본 발명의 DNAa 또는 DNAb 에 대한 프로모터 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염은 본 발명의 단백질의 발현을 저해하고 이 단백질의 활성을 저해할 수 있기 때문에, 예컨대 기관지 천식이나 만성 폐색성 폐질환 등 폐ㆍ기도의 염증을 수반하는 폐ㆍ흉부 질환 등의 질병에 대한 안전하고 저독성의 치료ㆍ예방제 등의 의약으로서 유용하다.

또한, 상기 스크리닝으로 수득된 화합물에서 유도된 화합물도 동일하게 사용할 수 있다.

이 스크리닝 방법으로 수득된 화합물 또는 그의 염을 함유한 의약은 상기한 본 발명의 단백질을 함유한 의약과 동일하게 하여 제조할 수 있다.

이렇게 해서 수득된 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 인간 또는 포유동물 (예컨대 래트, 마우스, 모르모트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그의 염의 투여량은 대상 질환, 투여 대상, 투여 루트 등에 따라 차이는 있지만, 예컨대 기관지 천식의 치료 목적에서 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 저해하는 화합물을 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏) 에게는 하루에 이 화합물을 약 0.1∼100㎎, 바람직하게는 약 1.0∼50㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0∼20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 상기 화합물의 1 회 투여량은 투여 대상, 대상 질환 등에 따라서도 다르지만, 예컨대 기관지 천식의 치료 목적에서 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 저해하는 화합물을 주사제 형태로 통상 성인 (60㎏) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 화합물을 약 0.01∼30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1∼20㎎ 정도, 더 바람직하게는 0.1∼10㎎ 정도를 정맥 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

한편, 예컨대 감염증의 치료 목적에서 본 발명의 DNAa 에 대한 프로모터 활성을 촉진하는 화합물을 경구 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏) 에게는 하루에 이 화합물을 약 0.1∼100㎎, 바람직하게는 약 1.0∼50㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0∼20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는 이 화합물의 1 회투여량은 투여 대상, 대상 질환 등에 따라서도 다르지만, 예컨대 감염증의 치료 목적에서 본 발명의 DNAa 에 대한 프로모터 활성을 촉진하는 화합물을 주사제 형태로 통상 성인 (60㎏) 에게 투여하는 경우, 하루에 이 화합물을 약 0.01∼30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1∼20㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1∼10㎎ 정도를 정맥 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

이렇게 본 발명의 DNA 발현부전 비인간 포유동물은 본 발명의 DNA 에 대한 프로모터 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염을 스크리닝하는 데에 매우 유용하고, 본 발명의 DNA 발현부전에서 기인되는 각종 질환의 원인 규명 또는 예방ㆍ치료약의 개발에 크게 공헌할 수 있다.

또, 본 발명의 단백질의 프로모터 영역을 함유한 DNA 를 사용하여 그 하류에 각종 단백질을 코딩하는 유전자를 연결하고, 이것을 동물의 난세포에 주입하여 이른바 트랜스제닉 동물 (유전자 이입동물) 을 제조하면, 특이적으로 그 단백질을 합성시키고 그 생체 내에서의 작용을 검토할 수도 있게 된다. 또한, 상기 프로모터 부분에 적당한 리포터 유전자를 결합시키고 이것이 발현되는 세포주를 수립하면 본 발명의 단백질 그 자체의 체내에서의 생산능력을 특이적으로 촉진하거나 또는 억제하는 작용을 갖는 저분자 화합물의 검색계로서 사용할 수 있다. 또, 이 프로모터 부분을 해석함으로써 새로운 시스 엘리먼트나 이에 결합되는 전사 인자를 발견할 수도 있다.

본 명세서 및 도면에서 염기나 아미노산 등을 약칭으로 표시하는 경우IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature 에 의한 약칭 또는 당해 분야에서 관용되는 약칭에 의거한 것으로, 그 예를 다음과 같이 기재한다. 또, 아미노산에 관하여 광학이성체가 있을 수 있는 경우에는 특히 명시하지 않으면 L체를 나타내는 것으로 한다.

DNA: 디옥시리보핵산

cDNA: 상보적 디옥시리보핵산

A: 아데닌

T: 티민

G: 구아닌

C: 시토신

RNA: 리보핵산

mRNA: 메신저 리보핵산

dATP: 디옥시아데노신3인산

dTTP: 디옥시티미딘3인산

dGTP: 디옥시구아노신3인산

dCTP: 디옥시시티딘3인산

ATP: 아데노신3인산

EDTA: 에틸렌디아민4아세트산

SDS: 도데실황산나트륨

Gly: 글리신

Ala: 알라닌

Val: 밸린

Leu: 류신

Ile: 이소류신

Ser: 세린

Thr: 트레오닌

Cys: 시스테인

Met: 메티오닌

Glu: 글루타민산

Asp: 아스파라긴산

Lys: 리진

Arg: 아르기닌

His: 히스티딘

Phe: 페닐알라닌

Tyr: 티로신

Trp: 트립토판

Pro: 프롤린

Asn: 아스파라긴

Gln: 글루타민

pGlu: 피로글루타민산

또한, 본 명세서 중에서 자주 사용되는 치환기, 보호기 및 시약을 다음과 같은 기호로 표기한다.

Me: 메틸기

Et: 에틸기

Bu: 부틸기

Ph: 페닐기

TC: 티아졸리딘-4(R)-카르복사미드기

Tos: p-톨루엔술포닐

CHO: 포르밀

Bzl: 벤질

Cl₂-Bzl : 2,6-디클로로벤질

Bom: 벤질옥시메틸

Z: 벤질옥시카르보닐

Cl-Z: 2-클로로벤질옥시카르보닐

Br-Z: 2-브로모벤질옥시카르보닐

Boc: t-부톡시카르보닐

DNP: 디니트로페닐

Trt: 트리틸

Bum: t-부톡시메틸

Fmoc: N-9-플루오레닐메톡시카르보닐

HOBt: 1-히드록시벤즈트리아졸

HOOBt: 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진

HONB: 1-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드

DCC: N,N'-디시클로헥실카르보디이미드

본원 명세서의 서열목록의 서열번호는 다음과 같은 서열을 나타낸다.

[서열번호:1]

본 발명의 인간 위 유래 단백질 (성숙체) 의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:2]

본 발명의 시그널 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:3]

서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 인간 위 유래 단백질 (성숙체) 을 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:4]

서열번호:2 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:5]

본 발명의 인간 위 유래 단백질의 전구체 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:6]

실시예 1 에서 사용된 프라이머 PR1 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:7]

실시예 1 에서 사용된 프라이머 PR2 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:8]

실시예 1, 4 에서 사용된 프라이머 PR3 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:9]

실시예 1 에서 사용된 프라이머 PR4 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:10]

실시예 1 에서 사용된 프라이머 PR5 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:11]

실시예 1 에서 사용된 프라이머 PR6 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:12]

실시예 1 에서 사용된 프라이머 PR7 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:13]

실시예 1 에서 사용된 프라이머 PR8 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:14]

실시예 1 에서 취득한 ECF-L 전체길이 유전자를 포함한 cDNA 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:15]

실시예 2 에서 사용된 ECF-L 유전자 프로브의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:16]

실시예 5 에서 취득한 클론 hECF-L-2 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호:17]

실시예 1 에서 취득한 ECF-L 전체길이 유전자가 코딩하는 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호:18]

ECF-L 단백질 (성숙체) 의 아미노산 서열을 나타낸다.

발명의 개시

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 마우스 천식 모델의 폐ㆍ기관지에서 발현이 현저히 증가되는 유전자를 발견하였다. 또한, 이 유전자의 염기 서열을 기초로 인간 위 cDNA 라이브러리에서 신규 염기 서열을 갖는 cDNA 를 클로닝하는 데에 성공하고, 여기에서 코딩되는 단백질이 키틴 분해효소의 패밀리에 속하는 것을 발견하였다.

본 발명자들은 이러한 지식에 기초하여 더욱 검토를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하는 데에 이르렀다.

즉, 본 발명은

(1) 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 염,

(2) 상기 (1) 에 기재된 단백질의 부분 펩티드 또는 그의 염,

(3) 서열번호:2 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 시그널 펩티드 또는 그의 염,

(4) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유한 DNA,

(5) 서열번호:3 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 상기 (4) 에 기재된 DNA,

(6) 상기 (3) 에 기재된 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유한 DNA,

(7) 서열번호:4 로 표시되는 염기 서열을 갖는 상기 (6) 에 기재된 DNA,

(8) 상기 (4) 에 기재된 DNA 를 함유한 재조합 벡터,

(9) 상기 (8) 에 기재된 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체,

(10) 상기 (9) 에 기재된 형질전환체를 배양하고, 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드를 생성, 축적시켜 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염의 제조 방법,

(11) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는그의 염을 함유하여 이루어진 의약,

(12) 상기 (4) 에 기재된 DNA 를 함유하여 이루어진 의약,

(13) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염에 대한 항체,

(14) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법,

(15) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염을 함유하여 이루어진, 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트,

(16) 상기 (14) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (15) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 수득한, 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염,

(17) 상기 (14) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (15) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 수득한, 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 의약,

(18) 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 부분 펩티드 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법,

(19) 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 부분 펩티드 또는 그의 염을 함유하여 이루어진, 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트,

(20) 상기 (18) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (19) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 수득된, 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염,

(21) 상기 (20) 에 기재된 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 의약 등에 관한 것이다.

다음에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다. 또, 대장균을 사용한 유전자 조작법은 [Molecular cloning] 에 기재되어 있는 방법에 따른다.

실시예 1 에서 마우스 ECF-L 전체길이 유전자 DNA 단편을 pT7 Blue-T Vector 에 클로닝하여 수득된 플라스미드를 유지하는 대장균 JM109/pT7-mECFL 은 1999년 9월 20일에 일본 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1-1-3 (우편번호 305-8566) 의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH) 에 FERM BP-6881 로서 기탁되어 있고, 1999년 8월 24일에 일본 오사까시 요도가와꾸 주산본마찌 2-17-85 (우편번호 532-8686) 의 재단법인 발효연구소 (IFO) 에 IFO16315 로서 기탁되어 있다.

실시예 6에서 수득된 플라스미드 pcDNA-hECFL 을 유지하는 대장균 DH5α/pcDNA-hECFL 은 1999년 9월 20일에 NIBH 에 FERM BP-6878 로서 기탁되어 있고, 그리고 1999년 8월 24일에 IFO 에 IFO16312 로서 기탁되어 있다.

실시예 1

기도 과민성 항진 모델 마우스에서 발현이 증가되는 유전자로서의 ECF-L 유전자의 클로닝

기도 과민성 항진 모델 마우스는 BALB/c 마우스 (수컷, 생후 6주) 에 20㎍ OVA (오보알부민), 2㎎ 알람 함유 생리식염수를 400㎕ 복강 주사하고, 1 주일 후에 10㎍ OVA, 1㎎ 알람 함유 생리식염수를 200㎕ 복강 주사함으로써 감작을 실시한 후, 다시 1 주일 후부터 7 일간 연속해서 1/2 농도의 PBS에 용해시킨 5% OVA용액을 무마취 자발 호흡하에서 25 분간 흡입시킴으로써 제조된다. 스테로이드 투여군은 OVA 흡입 1 시간 전에 덱사메사존을 1㎎/㎏ 복강 주사함으로써 제조된다. 에어로졸화는 초음파 네블라이저 (소닉라이저305, ATOM 메디컬) 를 사용하여 실시한다. 기도 과민성의 항진은 최종 항원 흡입의 24 시간 후에 아세틸콜린 (62.5-2000㎍/㎏) 에 의한 기도협착 반응을 콘제트-로스커 (Konzett-Rossker) 법으로 측정하여 판정한다. 또, 기관지 폐포 세정액 (BALF) 은 마우스를 펜토바르비탈 마취에 의한 치사 후, 기관 카뉠레를 삽입하고 0.5㎖ 의 PBS 로 3 회 세정함으로써 제조된다. 다음으로, 사이토스핀 (700rmp, 1 분) 으로 도말 표본을 제조하여 Diff-Quick 염색 후 검사하고, 매크로파지, 호산구, 호중구, 림프구 및 기타 세포의 비율을 계산한다.

샘플로 사용된 poly(A)+ RNA 는 정상 마우스 폐ㆍ기관지 및 기도 과민성 항진 모델 마우스 폐ㆍ기관지 및 그 덱사메사존 투여군에서 ISOGEN (와꼬오 쥰야꾸사 제조) 을 사용하여 전체 RNA 를 추출하고, 다시 올리고-dT 셀룰로오스 칼럼 (파마시아사 제조) 을 통해 제조된다. 이것들의 poly(A)+ RNA 각각 2㎍ 을 출발원료로서 PCR-select cDNA 서브트랙션 키트 (클론텍사 제조) 를 사용한 서브트랙션에 의해 기도 과민성 항진 모델 마우스 폐ㆍ기관지에서 특이적으로 발현되는 cDNA 단편 (cDNA 의 일부를 PCR 로 증폭한 단편) 을 수집한다. 수득된 PCR 단편의 양단에 부가되어 있는 서브트랙션을 위한 어댑터 서열을 제한효소 RsaI 로 소화시킴으로써 제거하고, 평활말단의 DNA 단편으로 한 후, 이 단편을 pT7Blue T-Vector (노바겐사 제조) 로 서브클로닝한다. 서브클로닝된 cDNA 단편의 DNA 염기 서열을 해독하여 밝혀진 염기 서열을 기초로 공적인 데이터베이스인 Geneble 데이터베이스를 사용하여 blastN 에 의한 호몰로지 검색을 한다.

그 결과, 조사된 120 클론 중 10 클론은 모두 공지된 마우스 ECF-L 유전자 (GENBANK ACCESSION NUMBER:D87757) 를 코딩하고 있는 염기 서열과 동일함이 판명되었다. 그래서, 기도 과민성 항진 모델 마우스 폐의 poly(A)+ RNA 에서 cDNA 합성 키트 (다까라슈조사 제조) 를 사용하여 cDNA 를 합성하고, 이것을 주형으로 하여 ECF-L 유전자 5'-비번역 영역 (PR1:서열번호 6) 과 3'-비번역 영역 (PR2:서열번호 7) 의 2 종류의 프라이머 DNA 를 사용하여 PCR 을 실시하여 ECF-L 전체길이 유전자를 취득한다 (서열번호:14). 반응은 Takara EX Taq (다까라슈조사 제조) 를 사용하고 서멀사이클러 Gene Amp PCR System 9700 (파킨엘머사 제조) 에서 처음에 98℃ 에서 1 분간 정치한 후에 98℃ 에서 10 초, 60℃ 에서 1 분, 72℃ 에서 3 분을 1 반응 사이클로 하여 30 사이클 반복하면서 마지막에는 72℃ 에서 10 분간 반응시킨다. 수득된 ECF-L 전체길이 유전자 DNA 단편은 pT7 Blue-TVector 에 클로닝한다. 다시 합성 프라이머 (PR1-8:서열번호 6-13) 를 사용하여 사이클 시퀀스 반응시키고, 형광 DNA 시퀀서 (ABI PRISM TM377, 파킨엘머사 제조) 에서 수득된 반응물의 염기 서열을 확인한다.

실시예 2

기도 과민성 항진 모델 마우스에서의 ECF-L 유전자산물의 조직분포 해석

정상 및 기도 과민성 항진 모델 마우스로부터 각 조직 (폐, 심장, 간장, 신장, 뇌, 흉선, 비장, 소장, 대장, 위) 을 적출하고, ISOGEN (와꼬오 쥰야꾸사 제조) 을 사용하여 전체 RNA 를 제조한다. 이 전체 RNA 에서 올리고-dT 셀룰로오스 칼럼 (파마시아사 제조) 을 통해 poly(A)+ RNA 를 제조한다. 이 poly(A)+ RNA 0.5㎍ 을 2.2M 포르말린을 함유한 1.1% 아가로스 겔 전기영동에 부가한 후, 나일론 멤브레인 필터 (하이본드N+, 아마샴파마시아바이오테크사 제조) 에 캐필러리 블로팅으로 18 시간 블로팅한다. 자외선 처리로 이 나일론 멤브레인 필터 상에 RNA를 고정시킨 후, Express Hyb Hybridization Solution (클론텍사 제조) 안에서 65℃ 에서 프리 부합화를 한다. 한편, 프로브로서 실시예 1 에서 나타낸 ECF-L cDNA 단편의 하나 (서열번호 15) 를 [α-³²P]dCTP 와 BcaBEST Labeling Kit (다까라슈조사 제조) 를 사용하여 표지한다. 부합화는 표지 프로브를 포함한 Express Hyb Hybridization Solution 안에서 65℃ 에서 2 시간 동안 실시한다. 필터는 마지막에 0.1 xSSC, 0.1% SDS 액 중에서 50℃ 에서 세정하고, 검출은 BAS-2000 (후지필름사 제조) 을 사용하여 실시한다. 그 결과, ECF-L 유전자산물 (mRNA) 은정상 마우스에서는 폐, 흉선, 위에서 발현이 보인다. 기도 과민성 항진 모델 마우스에서는 폐에서 현저히 발현이 보이고, 기도 과민성 항진에 따라 발현이 강하게 유도되는 것으로 판명되었다. 또한, 흉선, 위에서도 발현의 증강이 보인다 (도 1).

실시예 3

기도 과민성 항진 모델 마우스에서의 ECF-L 유전자 발현의 시간경과에 따른 변화 해석

상기 실시예 1 에서 설명한 기도 과민성 항진 모델 마우스를 사용하며, OVA 흡입 전, OVA 흡입 후 2, 3, 4, 5, 6, 7 일째의 기도 과민성 항진 및 폐포 세정액 중으로의 침윤 세포수를 실시예 1 과 동일하게 하여 측정한다 (도 2, 도 3, 도 4). 또, OVA 흡입 전, OVA 흡입 후 1, 2, 3, 5, 7 일째의 폐를 적출하고, 실시예 2 와 동일하게 하여 노던 블롯 해석을 한다 (도 5). 그 결과, 기도 민감성의 항진 및 폐포 세정액으로의 호산구의 침윤은 OVA 흡입 후 4 일째부터 유도되는 반면에, ECF-L 유전자의 발현은 OVA 흡입 후 2 일째부터 현저히 유도된다. 즉, ECF-L 유전자의 발현은 기도 과민성의 항진 및 호산구의 침윤에 앞서 일어나고, 기도 염증의 결과로서 ECF-L 유전자가 발현된 것이 아니라, ECF-L 유전자의 발현 유도가 기도 과민성의 항진 및 폐포 세정액으로의 호산구의 침윤을 야기시킬 가능성을 시사한다.

실시예 4

기도 과민성 항진 모델 마우스에서의 ECF-L 유전자 발현 부위의 동정

정상 및 기도 과민성 항진 모델 마우스 폐를 4% 파라포름알데히드로 관류 고정한 후 적출하여 4℃ 에서 하룻밤 고정시킨다. 그 뒤 수크로오스-HBSS 용액에 수크로오스 농도를 순차적으로 올려 치환하고, 마지막에 18% 수크로오스-HBSS 용액으로 치환, 드라이아이스로 동결시킨다. 동결된 폐는 르리오스태트 내에서 -14℃ 에서 3 시간 정치한 후 10-15㎕ 두께로 절단하고, APS 코팅된 슬라이드 유리에 점착시킨다. DIG 라벨 프로브를 제조하기 위해서는, 먼저 실시예 1 에서 수득된 ECF-L 전체길이 유전자 단편을 주형으로 합성 프라이머 (PR3:서열번호 8, PR6:서열번호 11) 를 사용하여 PCR 로 0.6kb 의 ECF-L DNA 단편을 증폭시킨다. 반응은 Takara EX Taq (다까라슈조사 제조) 를 사용하고 서멀사이클러 Gene Amp PCR System 9700 (파킨엘머사 제조) 에서 처음에 94℃ 에서 1 분간 정치한 후에 94℃ 에서 10 초, 60℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 90 초를 1 반응 사이클로 하여 30 사이클 반복하면서 마지막에는 72℃ 에서 10 분간 반응시킨다. 다음으로, 증폭된 DNA 단편을 pCRII-TOPO vector (인비트로겐사 제조) 에 삽입하고, DIG Labeling Kit (베링거 맨하임사 제조) 를 사용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 SF6 RNA 폴리머라아제 및 T7 RNA 폴리머라아제로 벡터의 양방향에서 신장시켜 DIG 라벨 안티센스 및 센스 프로브를 제조한다. 인 시츄 (In situ) 부합화는 ISHR Starter Kit (닛뽕 진사 제조) 를 사용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 실시한다. 그 결과, ECF-L 유전자는 기도 과민성 항진 모델에서 고발현되어 있음이 보인다. 정상 마우스에서는, ECF-L 유전자의 발현이 폐의 어느 부위에서도 보이지 않는다 (도 6).

실시예 5

인간 유래 ECF-L 유사 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝

실시예 1 에서 나타낸 마우스 ECF-L 전체길이 유전자를 프로브로 사용하고, 인간 RNA 마스터 블롯 (클론텍사 제조) 에 대하여 노던 블롯 해석을 한다. 부합화는 표지 프로브를 포함한 Express Hyb Hybridization Solution 안에서 68℃ 에서 2 시간 동안 실시하고, 세정은 마지막에 0.1 xSSC, 0.1% SDS 액 중에서 50℃ 에서 실시한다. 검출은 BAS-2000 (후지필름사 제조) 을 사용하여 실시한다. 그 결과, 위에서 현저한 시그널이 검출된다. 그래서, ECF-L 유전자의 인간 카운터 파트를 인간 위 cDNA 라이브러리에서 얻는 것으로 한다.

인간 위 5'-스트레치 플러스 cDNA 라이브러리 (벡터로서 λgt11 파지 DNA 를 사용, 클론텍사 제조) 를 대장균 Y1090r^-주에 감염시킨 후, 부드러운 한천 플레이트 상에 약 20 만 플라크씩 7 개에 뿌리고 37℃ 에서 하룻밤 배양하여 플라크를 형성시킨다. 플라크를 나일론 멤브레인 필터 (Hybond-N, 아마샴파마시아바이오테크사 제조) 상으로 옮긴 후, 변성용액 (0.5N NaOH, 1.5M NaCl), 중화액 (0.5M Tris Cl pH8.0, 1.5M NaCl), 2 xSSC에서 순차적으로 처리하고 바람에 건조시킨 후, 자외선 조사를 실시하여 파지 DNA 를 나일론 멤브레인 필터 상에 고정시킨다. 플라크 부합화는 표지 프로브를 포함한 Express Hyb Hybridization Solution 안에서 68℃ 에서 3시간 이상 실시한다. 필터는 마지막에 0.1 xSSC, 0.1% SDS 액 중에서 50℃ 에서 세정한 후, 오토라디오그램을 취하여 프로브와 부합화하는 플라크를 검색한다. 이 방법을 반복하여 싱글 클론으로까지 순화된 파지 클론 hECF-L-1,2, 3, 10, 13, a, b 의 7 클론에 의해 퀴아겐 람다 미니 키트 (퀴아겐사 제조) 를 사용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 람다 DNA 를 제조한다. 계속해서 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (파킨엘머사 제조) 를 사용하여 반응시키고, 삽입되어 있는 cDNA 단편의 염기 서열을 DNA 시퀀서 377 (파킨엘머사 제조) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, 취득한 7 클론은 동일한 DNA 단편을 포함하고 있고, 가장 긴 DNA 단편을 갖는 클론 hECF-L-2는 1678개의 염기 서열을 갖고 있다 (서열번호 16). 이 cDNA 단편에는 476개의 아미노산이 코딩되어 있고, 인간 유래의 신규 ECF-L 유사 단백질이 코딩되어 있다 (서열번호 5). 이 단백질은 마우스 ECF-L 과는 염기 레벨로 70%, 아미노산 레벨로 68% 의 상동성을 갖고 있다 (도 7, 도 8). 또, Geneble 데이터베이스를 사용하여 blast N 에 의한 호몰로지 검색을 한 결과, 이 cDNA 는 키틴 분해효소에 속하는 신규 유전자임이 판명되었다 (도 9, 도 10). 이 단백질은 키틴 분해효소의 촉매 중심에 유지되어 있는 서열을 가지며, 인간에게 보고되어 있는 유일한 키틴 분해효소인 인간 키토트리옥시다아제 [J. Biol. Chem., 270권, p26252 (1995)] 와는 염기 레벨로 57%, 아미노산 레벨로 51% 의 상동성을 나타낸다.

실시예 6

인간 유래 신규 ECF-L 유사 단백질을 코딩하는 유전자를 동물세포로 발현시키기 위한 벡터 구축

실시예 5 에서 나타낸 인간 유래 ECF-L 유사 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 λgt11 파지 DNA 를 EcoRI 으로 소화시키고, 수득된 인간 유래 ECF-L 유사 단백질을 코딩하는 유전자를 함유한 1.7kbp의 DNA 단편을 마찬가지로 EcoRI 으로 소화시킨 pcDNA 3.1 플라스미드 (Invitrogen사 제조) 에 삽입하여, 사이토메갈로 바이러스 인핸서/프로모터 하류에 인간 유래 ECF-L 유사 단백질을 코딩하는 유전자를 가지며 선택 마커로서 네오마이신 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pcDNA-hECFL 을 수득한다.

실시예 7

인간 유래 신규 ECF-L 유사 단백질을 코딩하는 유전자의 COS-7 세포에서의 발현과 키틴 분해효소 활성의 검정

COS-7 세포 9 ×10⁵개를 T-75 플라스크를 사용하여 10% 소 태아 혈청 (FCS) 을 함유한 달베코 변법 최소 배지 (DMEM) 에서 24 시간 배양하고, 실시예 6 에서 나타낸 발현 플라스미드 (pcDNA-hECFL) 7.5㎍ 을 리포펙트아민 (GIBCO BRL) 을 사용하여 도입한다. 도입 2 일 후 배지를 FCS 를 함유하지 않은 DMEM 으로 바꿔 4 일간 배양한 후 배양 상등액을 수득한다. 키틴 분해효소 활성의 측정은 Renkema, G.H.외의 보고 [J. Biol. Chem., 20권, p2198 (1995)] 에 따라 실시한다. 즉, 최종 농도 0.027mM 이 되도록 형광기질 (4-메틸움벨리페릴 β-D-N,N'-디아세틸키토비오시드 (4MU-키토비오시드), 4-메틸움벨리페릴 β-D-N,N,N'-트리아세틸키토트리오시드 (4MU-키토트리오시드)) 을 용해시킨 반응 버퍼 (McIlvain buffer, pH5.2) 100㎕ 에 상기 배양 상등액 10㎕ 를 첨가하고 37℃ 에서 30 분간 인큐베이트한다. 1㎖ 의 반응 정지 버퍼 (0.3M 글리신/NaOH 완충액, pH10.6) 를 첨가하여 반응을 정지시키고 키틴 분해효소 활성을 형광측정장치 (여기파장 355㎚, 측정파장 460㎚) 로 측정한다. 음성 컨트롤로서는, 플라스미드 미도입 COS-7 세포 배양 상등액을, 양성 컨트롤로서는, Serratia marcescens 키티나아제 0.001U 를 사용한다. 그 결과, 발현 플라스미드 (pcDNA-hECFL) 도입 COS-7 세포 배양 상등액 중의 키틴 분해효소 활성을 검출한다.

실시예 8

인간 유래 신규 ECF-L 유사 단백질을 코딩하는 유전자 조직분포의 해석

실시예 4 에서 나타낸 인간 유래 ECF-L 유사ECF-L 유사을 코딩하는 유전자 삽입 DNA 단편 (1.7kbp) 을 프로브에 사용하고, 인간 RNA 마스터 블롯 (클론텍사 제조) 에 대하여 노던 블롯 해석을 한다. 부합화는 표지 프로브를 포함한 Express Hyb Hybridization Solution 안에서 68℃ 에서 2시간동안 실시하고, 세정은 마지막에 0.1 xSSC, 0.1% SDS 액 중에서 50℃ 에서 실시한다. 검출은 BAS-2000 (후지필름사 제조) 을 사용하여 실시한다. 그 결과, 위에서 현저한 시그널이 검출되고, 폐나 태아 폐에서도 발현이 관찰된다 (도 11).

본 발명의 단백질 및 이것을 코딩하는 DNA 는 예컨대 감염증 등의 질병의 치료ㆍ예방제로서 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 단백질은 본 발명의 단백질의 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝을 위한 시약으로서 유용하다. 또한, 본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염, 본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 중화 항체는, 예컨대 기관지 천식, 만성 폐색성 폐질환 등과 같은 질병의 치료ㆍ예방제로서 사용할 수 있다. 그리고, 본 발명의 단백질에 대한 항체는, 본 발명의 단백질을 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 피검액 중의 본 발명의 단백질의 정량 등에 사용할 수 있다.

Claims (21)

1. 서열번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 염.
2. 제 1 항에 기재된 단백질의 부분 펩티드 또는 그의 염.
3. 서열번호:2 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 시그널 펩티드 또는 그의 염.
4. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유한 DNA.
5. 제 4 항에 있어서, 서열번호:3 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA.
6. 제 3 항에 기재된 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유한 DNA.
7. 제 6 항에 있어서, 서열번호:4 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA.
8. 제 4 항에 기재된 DNA 를 함유한 재조합 벡터.
9. 제 8 항에 기재된 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
10. 제 9 항에 기재된 형질전환체를 배양하고, 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드를 생성, 축적시키고, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염의 제조 방법.
11. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 의약.
12. 제 4 항에 기재된 DNA 를 함유하여 이루어진 의약.
13. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염에 대한 항체.
14. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
15. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트.
16. 제 14 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 15 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 수득된 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염.
17. 제 14 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 15 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 수득된 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 의약.
18. 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 부분 펩티드 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
19. 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 부분 펩티드 또는 그의 염을 함유하여 이루어진, 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트.
20. 제 18 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 19 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 수득된, 서열번호:18 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 그의 부분 펩티드 또는 그의 염의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염.
21. 제 20 항에 기재된 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어진 의약.