JPH1099084A

JPH1099084A - 新規タンパク質およびそのｄｎａ

Info

Publication number: JPH1099084A
Application number: JP9106510A
Authority: JP
Inventors: Koji Yoshimura; 浩二吉村; Yuichi Hikichi; 裕一引地
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-04-25
Filing date: 1997-04-24
Publication date: 1998-04-21

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】新規システインプロテアーゼの提供。【解決手段】新規システインプロテアーゼもしくはその
部分ペプチド、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該Ｄ
ＮＡを含有する組換えベクター、形質転換体、該タンパ
ク質の製造法、該タンパク質もしくはＤＮＡ含有してな
る医薬、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質のプ
ロテアーゼ活性を促進もしくは阻害する化合物のスクリ
ーニング方法、スクリーニング用キットおよびスクリー
ニングで得られる化合物またはその塩。【効果】タンパク質またはそれをコードするＤＮＡは、
例えば、糖尿病性腎症，子球体腎炎などの腎疾患、肝繊
維症などの肝疾患、肺繊維症、椎間板ヘルニア、脊髄す
べり症、坐骨神経痛、大理石病などの種々の疾病の治療
・予防剤などの医薬として使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なシステイン
プロテアーゼおよびそのＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】リソゾームは多数の加水分解酵素を含む
細胞内小器官であり、リソゾームのプロテアーゼ群は協
同的に働くことにより、細胞内・外より取り込まれたタ
ンパク質を分解する。これには、リソゾーム内のパパイ
ンファミリーに属するシステインプロテアーゼ群が主役
を演じていることが分かっている。また、これらの酵素
の一部は細胞外に活性を有しない前駆体の形で分泌さ
れ、活性化を受けた後にタンパク質の分解に関与する。
パパインファミリーに属するシステインプロテアーゼは
哺乳動物、植物、寄生虫、原虫、昆虫ウイルス等に広く
分布しており、マンソン住血吸虫のカテプシンＬ様シス
テインプロテアーゼはヘモグロビンの分解に関与するこ
とが示唆されている（A. M. Smithら、モレキュラー・
アンド・バイオケミカルパラサイトロジー、67巻、11-1
9頁、1994年）。ヒトでは、パパインファミリーに属す
るシステインプロテアーゼはカテプシンＢ，Ｈ，Ｌおよ
びＳのアイソザイムが古くから知られている。これらの
酵素は、活性に関与するシステイン、ヒスチジンおよび
アスパラギン酸およびこれらのアミノ酸の周辺のcataly
tic domainのアミノ酸配列は非常によく保存されている
が、異なった酵素特性を示すことが知られている。例え
ば、カテプシンＨやＢはエンドペプチダーゼ活性は弱
く、アミノペプチダーゼまたはカルボキシルペプチダー
ゼ活性が顕著である。一方、カテプシンＬおよびＳは強
いエンドペプチダーゼ活性を示す。最近、破骨細胞に発
現が顕著なカテプシンＯ（ＯＣ２）が報告され、新規の
アイソザイムが存在する可能性が示唆されている。

【０００３】カテプシンＢ，Ｈ，Ｌ（S. Galら、バイオ
ケミカルジャーナル、253巻、303-306頁、1988年）およ
びＳのシステインプロテアーゼはプロ酵素の活性化、酵
素の不活化、抗原提示、ホルモン成熟化、骨吸収および
組織の再構成等様々な生理活性を有することが知られて
いる。特に、組織の再構成におけるシステインプロテア
ーゼの持つ蛋白分解活性は非常に重要である。これらの
酵素自身がコラーゲンやプロテオグリカンなどの細胞外
マトリックスの分解酵素として働くだけでなく、他の細
胞外マトリックス分解酵素であるセリンプロテアーゼ群
やマトリックス金属プロテアーゼ群の活性化を引き起こ
すことが知られている。また、システインプロテアーゼ
は、慢性関節リウマチ，変形性関節炎などの関節炎、骨
粗鬆症、腫瘍転移・浸潤、肺気腫、アルツハイマー病等
の神経変成疾患、筋ジストロフィー症などの筋消耗性疾
患等の種々の疾病との関連が明らかにされている。従っ
て、これらの酵素の活性を調節する、阻害剤または促進
剤は上記の疾病の治療薬として用いられ得る。一方、欧
米では、パパインファミリーに属するキモパパインが椎
間板ヘルニアの治療に古くから用いられている。しか
し、アナフィラキシーを引き起こすことがあり、適応で
きる患者は限定され、ヒト由来の抗原性のないプロテア
ーゼが望まれている。

【０００４】ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選ん
だｃＤＮＡクローンの部分配列（expressed sequence t
ags、ＥＳＴｓと略される）を決定することにより、そ
の臓器や細胞における遺伝子発現のレベルや新規遺伝子
を見いだす試みが報告されている。M. D. Adamsらは脳
のｃＤＮＡライブラリーから得たＥＳＴｓを多数報告し
ている（ネイチャージェネティクス、4巻、373-380頁、
1993年）。これらのＥＳＴｓの一つであるＥＳＴ０６７
７１（GenBankアクセッション番号Ｔ０８８７９）は、
ＥＳＴのデータベースであるｄｂＥＳＴにおいて、大豆
等の植物やトリパノゾーマ等のシステインプロテアーゼ
と類似していることが記載されている。しかし、ＥＳＴ
ｓの配列は正確性に欠け、かつ一部分の塩基配列である
ことから、データベースに登録されているＥＳＴｓの塩
基配列と同一の遺伝子が実際に存在し、かつ生体内で機
能しているかどうかは明らかではなかった。

【０００５】

【本発明が解決しようとする課題】新たなヒト由来のシ
ステインプロテアーゼは、システインプロテアーゼに対
して阻害活性あるいは促進活性を発揮し、システインプ
ロテアーゼに基づく種々の疾患、例えば、関節炎、神経
変成疾患、筋消耗性疾患等の予防や治療に役立つ新たな
医薬品の開発を可能にする。したがって、本発明の分野
では、ヒト由来の新規システインプロテアーゼを見いだ
し、大量に産生する方法の開発が望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト脾臓由
来ｃＤＮＡライブラリーから、新規な塩基配列を有する
ｃＤＮＡをクローニングすることに成功し、それにコー
ドされるタンパク質がシステインプロテアーゼであるこ
とを見いだした。本発明者らは、これらの知見に基づい
て、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至っ
た。

【０００７】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列またはそれと実質的に同一の
アミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩、（２）
システインプロテアーゼ活性を有する第（１）項記載の
タンパク質、（３）第（１）項記載のタンパク質の部分
ペプチドまたはその塩、（４）第（１）項記載のタンパ
ク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ、（５）配列番号：３で表される塩基配列を有する
第（４）項記載のＤＮＡ、（６）第（４）項記載のＤＮ
Ａを含有する組換えベクター、（７）第（６）項記載の
組換えベクターを保持する形質転換体、（８）第（７）
項記載の形質転換体を培養し、第（１）項記載のタンパ
ク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する第（１）項記載のタンパク質またはその塩の製造方
法、（９）第（１）項記載のタンパク質、第（３）項記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる医
薬、（１０）糖尿病性腎症、子球体腎炎、肝繊維症、肺
繊維症、椎間板ヘルニア、脊髄すべり症、坐骨神経痛ま
たは大理石病の治療・予防剤である第（９）項記載の医
薬、

【０００８】（１１）第（４）項記載のＤＮＡを含有し
てなる医薬、（１２）糖尿病性腎症、子球体腎炎、肝繊
維症、肺繊維症、椎間板ヘルニア、脊髄すべり症、坐骨
神経痛または大理石病の治療・予防剤である第（１１）
項記載の医薬、（１３）第（１）項記載のタンパク質、
第（３）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対す
る抗体、（１４）第（１）項記載のタンパク質、第
（３）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いる
ことを特徴とする第（１）項記載のタンパク質、第
（３）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテ
アーゼ活性を促進または阻害する化合物のスクリーニン
グ方法、（１５）第（１）項記載のタンパク質、第
（３）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有し
てなる第（１）項記載のタンパク質、第（３）項記載の
部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促
進または阻害する化合物のスクリーニング用キット、お
よび（１６）第（１４）項記載のスクリーニング方法ま
たは第（１５）項記載のスクリーニング用キットを用い
て得られる第（１）項記載のタンパク質、第（３）項記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性
を促進または阻害する化合物またはその塩を提供する。

【０００９】さらに、本発明は、（１７）配列番号：２
で表わされるアミノ酸配列を有する第（３）項記載の部
分ペプチド、（１８）配列番号：３で表わされる塩基配
列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
る塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（１９）
第（１８）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（２０）第（１９）項記載の組換えベクターを保持する
形質転換体、（２１）第（２０）項記載の形質転換体を
培養し、タンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とするタンパク質またはその塩の製造方
法、（２２）第（２１）項記載の製造法で製造されるタ
ンパク質またはその塩、（２３）第（１４）項記載のス
クリーニング方法または第（１５）項記載のスクリーニ
ング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタン
パク質、第（３）項記載の部分ペプチドまたはそれらの
塩のプロテアーゼ活性を促進する化合物またはその塩を
含有してなる医薬、（２４）糖尿病性腎症、子球体腎
炎、肝繊維症、肺繊維症、椎間板ヘルニア、脊髄すべり
症、坐骨神経痛または大理石病の治療・予防剤である第
（２３）項記載の医薬、（２５）第（１４）項記載のス
クリーニング方法または第（１５）項記載のスクリーニ
ング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタン
パク質、第（３）項記載の部分ペプチドまたはそれらの
塩のプロテアーゼ活性を阻害する化合物またはその塩を
含有してなる医薬、（２６）慢性関節リウマチ、変形性
関節炎、骨粗鬆症、腫瘍転移・浸潤、肺気腫、アルツハ
イマー病、筋ジストロフィー症、角膜疾患、水疱泡症、
歯周病、天疱瘡、早産または分娩遅延の治療・予防剤で
ある第（２５）項記載の医薬、（２７）第（１３）項記
載の抗体と、被検液および標識化された第（１）項記載
のタンパク質、第（３）項記載の部分ペプチドまたはそ
れらの塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識
化された第（１）項記載のタンパク質、第（３）項記載
の部分ペプチドまたはそれらの塩の割合を測定すること
を特徴とする被検液中の第（１）項記載のタンパク質、
第（３）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
法、および（２８）被検液と担体上に不溶化した第（１
３）項記載の抗体および標識化された第（１３）項記載
の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被
検液中の第（１）項記載のタンパク質、第（３）項記載
の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量法を提供する。

【００１０】本発明の配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有
するタンパク質（以下、本発明のタンパク質と称する）
は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マ
ウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルな
ど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリ
ア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ラ
ンゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊
維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞
（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキ
ラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単
球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細
胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、ま
たはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞な
ど）またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例え
ば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、
海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊
髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、
胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（大腸、
小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前
立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など
に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質
であってもよい。配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：
１で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましく
は約７０％以上、より好ましくは約８０％、特に好まし
くは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同
性を有するアミノ酸配列などが挙げられ、特に、タンパ
ク質の構成アミノ酸配列として少なくとも配列番号：２
で表わされるアミノ酸配列を含有し、全体として配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ま
しくは約７０％以上、より好ましくは約８０％、特に好
ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の
相同性を有するアミノ酸配列などが好ましい。

【００１１】本発明の配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク
質としては、例えば、前記の配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク
質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま
しい。実質的に同質の活性としては、例えば、プロテア
ーゼ活性（例、プロテイナーゼ活性、ペプチダーゼ活性
など）などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの
活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的
に）同質であることを示す。したがって、プロテアーゼ
活性などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好
ましくは約０．５〜１０倍、より好ましくは約０．５〜
２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、
タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ
い。プロテアーゼ活性の測定は、自体公知の方法に準じ
て行なうことができるが、例えば、後述するスクリーニ
ング方法に従って測定することができる。

【００１２】また、本発明のタンパク質としては、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個
以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１
〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５
個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上
（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１
０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））の
アミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましく
は、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれ
らを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質な
どのいわゆるムテインも含まれる。上記のようにアミノ
酸配列が欠失、付加または置換されている場合、その欠
失、付加または置換の位置としては、特に限定されない
が、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の
うち、第１７９番目のＡｌａ〜第３９２番目のＡｓｐま
でのアミノ酸配列（すなわち、配列番号：２で表わされ
るアミノ酸配列）以外の位置などが挙げられる。

【００１３】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
表記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめ
とする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキ
シル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯ
Ｏ^-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）または
エステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステ
ルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ
_1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキ
シルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ
_1-2アルキル基などのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口
用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基
などが用いられる。本発明のタンパク質がＣ末端以外に
カルボキシル基（またはカルボキシレート）を有してい
る場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化さ
れているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場
合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステ
ルと同様のエステルなどが用いられる。さらに、本発明
のタンパク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末
端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホル
ミル基、アセチル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護
されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグ
ルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内のアミ
ノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、
−ＳＯ₃Ｈなど）が適当な保護基（例えば、ホルミル
基、アセチル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護され
ているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパ
ク質などの複合タンパク質なども含まれる。本発明のタ
ンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列を含有するヒト脾臓由来のシステ
インプロテアーゼなどが用いられる〔図１〕。

【００１４】本発明の部分ペプチドとしては、前記した
本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましく
は、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性（例、プ
ロテアーゼ活性など）を有するものであればいずれのも
のでもよい。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ
酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個
以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１
００個以上、もっとも好ましくは２００個以上のアミノ
酸配列を有するペプチドなどが用いられる。本発明の部
分ペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：２で
表わされるアミノ酸配列を有するペプチドの他、配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列〔図２〕と実質的に同
一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有
するペプチドなどが用いられる。配列番号：２で表わさ
れるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約６０％以
上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０
％、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９
５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。ここ
で、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列は、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列の第１７９番目のＡｌ
ａ〜第３９２番目のＡｓｐまでのアミノ酸配列を示す。
このアミノ酸配列は、本発明のタンパク質の活性中心部
位のアミノ酸配列であり、本発明の配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列を有するタンパク質の成熟体（活性
体）のアミノ酸配列である。すなわち、本発明のタンパ
ク質は、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を有するタンパク質として発現されるが、生体内にお
いて、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１番
目〜１７８番目のアミノ酸配列部分が切断され、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列の第１７９番目〜３９
２番目のアミノ酸配列（すなわち、配列番号：２で表わ
されるアミノ酸配列）を有するペプチドが成熟体（活性
体）としてプロテアーゼ活性等を発揮する。「実質的に
同質の活性」とは、前記と同意義を示す。「実質的に同
質の活性」の測定は後述するスクリーニング方法に従っ
て測定することができる。

【００１５】また、本発明の部分ペプチドには、例え
ば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ま
しくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例、１
〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列
番号：２で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上
（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１
０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））の
アミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：２で表
わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましく
は、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれ
らを組み合わせたアミノ酸配列を含有するペプチドなど
も用いられる。また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が
通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレ
ート(−ＣＯＯ^-）であるが、前記した本発明のタンパク
質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエ
ステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明
の部分ペプチドには、前記の本発明のタンパク質と同様
に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護
されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグ
ルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内のアミ
ノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されている
もの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなど
の複合ペプチドなども含まれる。本発明の部分ペプチド
は抗体作成のための抗原として用いることもできるの
で、必ずしもプロテアーゼ活性を有する必要はない。

【００１６】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加
塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例
えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、ある
いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマ
ル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リン
ゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンス
ルホン酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク
質またはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞また
は組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製
造することもできるし、後述するタンパク質をコードす
るＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって
も製造することができる。また、後述のペプチド合成法
に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の組織
または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織ま
たは細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行な
い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わ
せることにより精製単離することができる。

【００１７】本発明のタンパク質、その部分ペプチドも
しくはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成には、
通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセト
アミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocア
ミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の
配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で
縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出
すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で
分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタン
パク質またはそれらのアミド体を取得する。上記した保
護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用で
きる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カ
ルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DC
C、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-
(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用
いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤
（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹
脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステ
ルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ
酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができ
る。

【００１８】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十
分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十
分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチ
ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化し
て、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができ
る。

【００１９】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボ
ルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシ
カルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニ
ル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２
−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノ
チオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキシル基は、
例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、
シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２
−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アル
キルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベ
ンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メ
トキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステ
ル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル
化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブト
キシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化な
どによって保護することができる。セリンの水酸基は、
例えば、エステル化またはエーテル化によって保護する
ことができる。このエステル化に適する基としては、例
えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイ
ル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、
エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基など
が用いられる。また、エーテル化に適する基としては、
例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチ
ル基などである。チロシンのフェノール性水酸基の保護
基としては、例えば、Bzl、Cl₂-Bzl、２−ニトロベンジ
ル、Br-Z、ｔ−ブチルなどが用いられる。ヒスチジンの
イミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、４-メト
キシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベン
ジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いら
れる。

【００２０】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対
応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、例えば、Ｐｄ黒あるいはＰｄ-炭素
などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、ま
た、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロ
メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの
混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミ
ン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどに
よる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる
還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、
一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処
理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオ
アニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチ
ルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチ
オールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効であ
る。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用い
られる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理に
より除去され、トリプトファンのインドール保護基とし
て用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオー
ル、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。

【００２１】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。

【００２２】本発明のタンパク質の部分ペプチドまたは
その塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、ある
いは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断す
ることによって製造することができる。ペプチドの合成
法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれ
によっても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成
し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮
合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離す
ることにより目的のペプチドを製造することができる。
公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下
の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合成
広川書店また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれ
に準じる方法によって適当な塩に変換することができる
し、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれ
に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換するこ
とができる。

【００２３】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基
配列を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、
前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組
織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれで
もよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリ
オファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなど
いずれであってもよい。また、前記した細胞・組織より
totalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用い
て直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain React
ion（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅す
ることもできる。本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａとしては、例えば、配列番号：３で表わされる塩基配
列を含有するＤＮＡ、または配列番号：３で表わされる
塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズする塩基配列を有し、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列を有するタンパク質と同質の活性（例、プロ
テアーゼ活性などの活性）を有するタンパク質をコード
するＤＮＡであれば何れのものでもよい。

【００２４】配列番号：３で表わされる塩基配列とハイ
ブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：
３で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約
８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ま
しくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有す
るＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーション
は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例え
ば、モレキュラー・クローニング（Molecular Clonin
g）２nd（J. Sambrook etal., Cold Spring Harbor La
b. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうこと
ができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、
添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことがで
きる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に
従って行なうことができる。ハイストリンジェントな条
件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、
好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０
℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナ
トリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最
も好ましい。より具体的には、配列番号：１のアミノ酸
配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
〔図３の第５６番目〜１２３１番目の塩基配列〕などが
用いられる。

【００２５】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：３で表わされる塩基配
列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号：３で表わされる塩基配列とハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク
質と同質の活性（例、プロテアーゼ活性などの活性）を
有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を
有するＤＮＡなどが用いられる。より具体的には、本発
明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮ
Ａ、または配列番号：４で表わされる塩基配列とハイス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有す
るタンパク質と同質の活性を有する部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡなどが用いられる。配列番号：４で表わさ
れる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、
例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列と約７０％
以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０
％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する
塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリ
ダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条
件は前記と同様のものが用いられる。より具体的には、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する本発明
の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番
号：４で表わされる塩基配列〔図３の第５９０番目〜１
２３１番目の塩基配列〕を有するＤＮＡを含有するＤＮ
Ａなどが用いられる。

【００２６】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ド（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）
を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段として
は、（１）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの部
分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、Ｐ
ＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とす
るＤＮＡを増幅するか、または（２）適当なベクターに
組み込んだＤＮＡと、本発明のタンパク質の一部あるい
は全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識
したものとのハイブリダイゼーションによって選別する
こと、などが挙げられる。ハイブリダイゼーションの方
法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecula
r Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring H
arbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行
なうことができる。また、市販のライブラリーを使用す
る場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なう
ことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換（欠失・置換・
付加）は、公知のキット、例えば、Mutan^TM-G（宝酒造
（株））、Mutan^TM-K（宝酒造（株））などを用いて、G
apped duplex法やKunkel法などの自体公知の方法あるい
はそれらに準じる方法に従って行なうことができる。ク
ローン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ
は、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で
消化したり、リンカーを付加したりして使用することが
できる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開始コドンと
してのＡＴＧを有し、また３'末端側には翻訳終止コド
ンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していても
よい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適
当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもでき
る。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現ベク
ターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードす
るＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの
下流に連結することにより製造することができる。

【００２７】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
スなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病
原ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ
／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなど
が用いられる。本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細
胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、Ｓ
Ｖ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サ
イトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロ
モーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロ
モーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好まし
い。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロ
モーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモータ
ー、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プ
ロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、
ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎ
Ｐプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ
５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモー
ター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーターなど
が好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドロ
ンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。

【００２８】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）
等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニー
ズハムスター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択
マーカーとして使用する場合、目的遺伝子で形質転換さ
れた細胞をチミジンを含まない培地によっても選択でき
る。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列
を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主が
エシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配
列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌
である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチ
リシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合
は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列な
ど、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シ
グナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗
体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。この
ようにして構築された本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造
する。

【００２９】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae)ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，
ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾ
サッカロマイセスポンベ（Schizosaccharomyces pomb
e）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹ２０３６、ピキアパス
トリス（Pichia pastoris）などが用いられる。

【００３０】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N cell；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in
Vitro）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆
虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる
〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２
(１９８５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞Ｃ
ＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ
（以下、ＣＨＯ細胞と略記する），ｄｈｆｒ遺伝子欠損
チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄ
ｈｆｒ^-）細胞と略記する），マウスＬ細胞，マウスＡ
ｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒ
トＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ
３細胞、Ｓｐ−２細胞などが用いられる。これらの中で
も、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞、２９３細
胞などが好ましい。

【００３１】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mole
cular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９
７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４
巻，１８２−１８７(１９９１)に記載の方法に従って行
なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換する
には、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technolog
y）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行なう
ことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、
細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール，２６３
−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー
（Virology），５２巻，４５６（１９７３）などに記載
の方法に従って行なうことができる。発現ベクターの細
胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法
〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー
（Virology） 52, 456-467（1973）〕、電気穿孔法〔Nu
emann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.） 1,8
41-845（1982）〕等が挙げられる。このようにして、本
発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベ
クターで形質転換された形質転換体を得ることができ
る。

【００３２】なお、動物細胞を用いて、本発明のタンパ
ク質を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞
に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞
をクローン選択によって選択する方法がある。具体的に
は、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択
する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られ
た動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうこ
とにより本発明のタンパク質の高発現能を有する安定な
動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子
を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に
上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ
遺伝子とともに、本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を
得ることもできる。上記の形質転換体を本発明のタンパ
ク質をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、
本発明のタンパク質を生成、蓄積せしめることによっ
て、本発明のタンパク質またはその塩を製造することが
できる。

【００３３】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、
酵母抽出液、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒ
ア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコー
ス、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジ
ャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラ
ー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Mo
lecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Ha
rbor Laboratory, New York１９７２〕が好ましい。こ
こに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤
を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場
合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行な
い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿
主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で
約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加える
こともできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する
際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkho
lder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や
０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３
３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜
８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５
℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌
を加える。

【００３４】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Seience），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Jounal of the American Medical
Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９
培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of
the Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞およびｄｈｆｒ遺
伝子を選択マーカーとして用いる場合、チミジンをほと
んど含まない透析ウシ胎児血清を含むＣＭＥＭ培地を用
いるのが好ましい。以上のようにして、形質転換体に本
発明のタンパク質を生成せしめることができる。

【００３５】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体、昆虫あるいは
細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌
体、昆虫あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸
濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解など
によって菌体、昆虫あるいは細胞を破壊したのち、遠心
分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法など
が適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン
などの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^TMなどの界
面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質
が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方
法で菌体、昆虫あるいは細胞と上清とを分離し、上清を
集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽
出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離
・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こ
れらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法
などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲ
ルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオ
ン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方
法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新
和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー
などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法な
どの等電点の差を利用する方法などが用いられる。かく
して得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、
自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に
変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公
知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体また
は他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産
生するタンパク質に、精製前または精製後に適当な蛋白
修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えた
り、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋
白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプ
シン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナ
ーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくして生成
する本発明のタンパク質またはその塩の活性は、標識し
たリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザ
イムイムノアッセイなどにより測定することができる。

【００３６】本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体で
あれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何
れであってもよい。本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質と略
記する）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原と
して用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従っ
て製造することができる。〔モノクローナル抗体の作製〕（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免
疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種ま
たは異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することが
できる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識
化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合
した標識剤の活性を測定することにより行なうことがで
きる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミル
スタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (197
5)〕に従い実施することができる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが
用いられる。

【００３７】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、
ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）
が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベート
することにより効率よく細胞融合を実施できる。モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を
直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する
方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着
させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性
物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げら
れる。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいは
それに準じる方法に従って行なうことができる。通常Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を
添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別お
よび育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できる
ものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１
〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含む
ＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含
むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリ
ドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

【００３８】（ｂ）モノクロナール抗体の精製モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。

【００３９】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法にしたがって製造することができる。例えば、免
疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリ
アー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル
抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫
動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取
して、抗体の分離精製を行なうことにより製造すること
ができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗
原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋
白質の種類およびキャリアーとハプテン（抗原）との混
合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対
して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な
比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミ
ンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比で
ハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜
５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプ
テンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用
いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイ
ミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビ
リジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部
位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与され
る。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイ
ントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投
与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、
計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体
は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水な
ど、好ましくは血液から採取することができる。抗血清
中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗
体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗
体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製
と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうこ
とができる。

【００４０】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記す
る場合がある）に実質的に相補的な塩基配列を有するア
ンチセンスＤＮＡとしては、本発明のＤＮＡに実質的に
相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る
作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮ
Ａであってもよい。本発明のＤＮＡに実質的に相補的な
塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基
配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配
列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約
８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好まし
くは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げ
られる。特に、本発明のＤＮＡの全塩基配列うち、本発
明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配
列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）に相補的
な塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、
より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％
以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適であ
る。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成
装置などを用いて製造することができる。

【００４１】本発明のタンパク質は、タンパク質部分の
分子量が約３〜６万、好ましくは約４〜５万であり、活
性中心部位の分子量が約２〜３万のシステインプロテア
ーゼ（好ましくは、ヒト型システインプロテアーゼ）で
あり、プロ酵素の活性化、酵素の不活化、抗原提示、ホ
ルモン成熟化、骨吸収、組織の再構成などの生理活性を
示す。以下に、本発明のタンパク質またはその塩、その
部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパ
ク質等を略記する場合がある）、本発明のタンパク質ま
たはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発
明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク
質等に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合
がある）およびアンチセンスＤＮＡの用途を説明する。

【００４２】（１）本発明のタンパク質が関与する各種
疾病の治療・予防剤システインプロテアーゼは、プロ酵素の活性化、酵素の
不活化、抗原提示、ホルモン成熟化、骨吸収、組織の再
構成などの生理活性を発揮するため、システインプロテ
アーゼをコードするＤＮＡに異常があったり、欠損して
いる場合、あるいはシステインプロテアーゼの発現量が
減少している場合、例えば、糖尿病性腎症，子球体腎炎
などの腎疾患、角膜疾患、肝繊維症などの肝疾患、肺繊
維症、椎間板ヘルニア、脊髄すべり症、坐骨神経痛、大
理石病などのシステインプロテアーゼの異常発現に関与
する種々の疾病が発症する。したがって、本発明のタン
パク質等およびＤＮＡは、例えば、糖尿病性腎症，子球
体腎炎などの腎疾患、肝繊維症などの肝疾患、肺繊維
症、椎間板ヘルニア、脊髄すべり症、坐骨神経痛、大理
石病などのシステインプロテアーゼの異常発現に関与す
る種々の疾病の治療・予防剤などの医薬として使用する
ことができる。例えば、生体内においてシステインプロ
テアーゼが減少あるいは欠損しているために、細胞にお
けるプロテアーゼ活性などが十分に、あるいは正常に発
揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のタンパク
質をコードするＤＮＡを該患者に投与し、生体内で該タ
ンパク質を発現させることによって、（ロ）細胞に本発
明のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、該タンパ
ク質を発現させた後に、該細胞を患者に移植することに
よって、または（ハ）本発明のタンパク質等を該患者に
投与することなどによって、該患者における本発明のタ
ンパク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させるこ
とができる。

【００４３】本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤とし
て使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイル
スアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベク
ターに挿入した後、常套手段に従ってヒトまたは温血動
物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのま
まで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的
に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイド
ロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき
る。本発明のタンパク質等を上記の治療・予防剤として
使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％
以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９
９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。本
発明のタンパク質等は、例えば、必要に応じて糖衣を施
した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセ
ル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外
の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液
剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、
本発明のタンパク質等を生理学的に認められる担体、香
味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤など
とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用
量形態で混和することによって製造することができる。
これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当
な容量が得られるようにするものである。錠剤、カプセ
ル剤などに混和することができる添加剤としては、例え
ば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビア
ゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形
剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのよう
な膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、
ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパー
ミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤など
が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合に
は、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を
含有することができる。注射のための無菌組成物は注射
用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油な
どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させる
などの通常の製剤実施に従って処方することができる。

【００４４】注射用の水性液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアル
コール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポ
リソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０など）などと
併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大
豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジ
ル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、
緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液などの医薬組成
物は、通常、適当なアンプルに充填される。本発明のＤ
ＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、
通常、非経口的に使用される。このようにして得られる
製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは
温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサ
ギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サ
ルなど）に対して投与することができる。本発明のタン
パク質等の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート
などにより差異はあるが、例えば、大理石病治療の目的
で本発明のタンパク質等を経口投与する場合、一般的に
該タンパク質等を成人（６０ｋｇとして）においては、
一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
投与する。非経口的に投与する場合は、本発明のタンパ
ク質等の１回投与量は投与対象、対象疾患などによって
も異なるが、例えば、椎間板ヘルニア治療の目的で本発
明のタンパク質等を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋ
ｇとして）に投与する場合は、一日につき該タンパク質
等を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜
２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度
をヘルニア部分に注射することにより投与するのが好都
合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算し
た量を投与することができる。

【００４５】（２）疾病に対する医薬候補化合物のスク
リーニング本発明のタンパク質等は、プロ酵素の活性化、酵素の不
活化、抗原提示、ホルモン成熟化、骨吸収、組織の再構
成などの生理活性を発揮するので、本発明のタンパク質
等のプロテアーゼ活性を阻害する化合物またはその塩
は、例えば、慢性関節リウマチ，変形性関節炎などの関
節炎、骨粗鬆症、腫瘍転移・浸潤、肺気腫、アルツハイ
マー病などの神経変成疾患、筋ジストロフィー症などの
筋消耗性疾患、角膜疾患、肝繊維症などの肝疾患、肺繊
維症、水疱泡症などの皮膚疾患、歯周病、天疱瘡、早
産、分娩遅延などの各種疾病の治療・予防剤などの医薬
として使用できる。したがって、本発明のタンパク質等
は、本発明のタンパク質等のプロテアーゼ活性を阻害す
る化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬と
して有用である。一方、本発明のタンパク質等のプロテ
アーゼ活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、
糖尿病性腎症，子球体腎炎などの腎疾患、肝繊維症など
の肝疾患、肺繊維症、椎間板ヘルニア、脊髄すべり症、
坐骨神経痛、大理石病などの細胞外マトリックスの蓄積
を伴う疾病などの各種疾病の治療・予防剤などの医薬と
して使用できる。したがって、本発明のタンパク質等
は、本発明のタンパク質等のプロテアーゼ活性を促進す
る化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬と
して有用である。

【００４６】すなわち、本発明は、（１）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩を用いることを特徴とする本発明のタンパク質
のプロテーアゼ活性を促進する化合物もしくはその塩
（以下、促進剤と略記する場合がある）または本発明の
タンパク質のプロテアーゼ活性を阻害する化合物（以
下、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方
法を提供し、より具体的には、例えば、（２）（ｉ）本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩に基質を接触させた場合と（ii）本発明
のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に基
質および試験化合物を接触させた場合との比較を行なう
ことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング
方法を提供する。具体的には、上記スクリーニング方法
においては、例えば、（ｉ）と（ii）の場合における、
該タンパク質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩の
プロテアーゼ活性（あるいは、ペプチダーゼ活性など）
を測定して、比較することを特徴とするものである。

【００４７】基質としては、本発明のタンパク質、その
部分ペプチドまたはそれらの塩の基質となり得るもので
あれば何れのものでもよい。例えば、カゼイン、アゾカ
ゼイン、アゾアルブミン、アゾコラーゲン、ＦＩＴＣ化
したカゼイン、ＦＩＴＣ化したコラーゲン、放射線標識
（例、¹⁴Ｃ、³Ｈなど）したカゼイン、放射線標識
（例、¹⁴Ｃ、³Ｈなど）したコラーゲン、Ｃ末側に４−
メチル−クマリン−７−アミドやＰ−ニトロアニリド等
を結合させたオリゴペプチド類などが用いられる。試験
化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプ
チド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、
植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化
合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物で
あってもよい。上記のスクリーニング方法を実施するに
は、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその
塩（以下、本発明のタンパク質等と略記する場合があ
る）を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁する
ことにより本発明のタンパク質等の標品を調製する。バ
ッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約５
〜７）の酢酸ナトリウムバッファー、リン酸バッファ
ー、トリス−塩酸バッファーなどの、本発明のタンパク
質等と基質との結合を阻害しないバッファーであればい
ずれでもよい。本発明のタンパク質等のプロテアーゼ活
性（あるいは、ペプチダーゼ活性）は、公知のアゾカゼ
イン法〔A. J. Barrettら、メソッズ・イン・エンザイ
モロジー（Methods in ENZYMOLOGY）、80巻、535頁、19
81年〕に従って測定することができる。例えば、上記
（ii）の場合におけるプロテアーゼ活性等が上記（ｉ）
の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以
上、さらに好ましくは約５０％以上上昇させる試験化合
物を本発明のタンパク質等の活性を促進する化合物とし
て、一方、上記（ii）の場合におけるプロテアーゼ活性
等が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好まし
くは約３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上阻害
する試験化合物を本発明のタンパク質等の活性を阻害す
る化合物として選択することができる。

【００４８】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有
するものである。本発明のスクリーニング用キットの例
としては、次のものが挙げられる。〔スクリーニング用試薬〕測定用緩衝液ｐＨ５.５の酢酸ナトリウムバッファータンパク質標品本発明のタンパク質または本発明の部分ペプチド基質アゾカゼイン１０ｍｇ／ｍｌ反応停止液１０％トリクロロ酢酸〔測定法〕本発明のタンパク質等に測定用緩衝液、基質
を加え、混合後３７℃、１時間反応させた後に、反応停
止液を加え、４℃で５分間静置後、遠心した上清の３６
６ｎｍの吸光度を計測することによってプロテアーゼ活
性を測定する。

【００４９】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選ばれ
た化合物であり、本発明のタンパク質等のプロテアーゼ
活性、ペプチダーゼ活性を促進または阻害する化合物で
ある。該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパ
ク質の塩と同様のものが用いられる。本発明のタンパク
質等の活性を阻害する化合物は、例えば、慢性関節リウ
マチ，変形性関節炎などの関節炎、骨粗鬆症、腫瘍転移
・浸潤、肺気腫、アルツハイマー病などの神経変成疾
患、筋ジストロフィー症などの筋消耗性疾患、角膜疾
患、肝繊維症などの肝疾患、肺繊維症、水疱泡症などの
皮膚疾患、歯周病、天疱瘡、早産、分娩遅延などの各種
疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬と
して有用である。一方、本発明のタンパク質等の活性を
促進する化合物は、例えば、糖尿病性腎症，子球体腎炎
などの腎疾患、肝繊維症などの肝疾患、肺繊維症、椎間
板ヘルニア、脊髄すべり症、坐骨神経痛、大理石病など
の細胞外マトリックスの蓄積を伴う疾病などの各種疾病
に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として
有用である。

【００５０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療
・予防剤として使用する場合、前述した本発明のタンパ
ク質等を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、
懸濁液剤などの製剤とすることができる。得られる製剤
は安全で低毒性であるので、例えばヒトまたは温血動物
（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーな
ど）に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与
ルートなどにより差異はあるが、例えば、慢性関節リウ
マチ治療の目的で本発明のタンパク質等の機能を阻害す
る化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０
ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.
１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より
好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投
与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象
疾患などによっても異なるが、例えば、慢性関節リウマ
チ治療の目的で本発明のタンパク質等の機能を阻害する
化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投
与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍ
ｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ま
しくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与す
るのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当た
りに換算した量を投与することができる。

【００５１】（３）本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩の定量本発明の抗体は、本発明のタンパク質等を特異的に認識
することができるので、被検液中の本発明のタンパク質
等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量など
に使用することができる。すなわち、本発明は、（ｉ）
本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタ
ンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標
識化された本発明のタンパク質等の割合を測定すること
を特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量
法、および（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の
抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは
連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性
を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパ
ク質等の定量法を提供する。上記（ii）の定量法におい
ては、一方の抗体が本発明のタンパク質等のＮ端部を認
識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質等のＣ
端部に反応する抗体であることが望ましい。

【００５２】また、本発明のタンパク質等に対するモノ
クローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と
称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の定
量を行なえるほか、組織染色等による本発明のタンパク
質等の検出を行なうこともできる。これらの目的には、
抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ
(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよ
い。本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質等の定量
法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中
の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗
原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的
手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を
用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、
いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリ
ー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法
が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述する
サンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を
用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放
射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いら
れる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、
〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが用いられる。上記
酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、
例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ
酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例
えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシア
ネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、
ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲ
ニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標
識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもで
きる。

【００５３】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵
素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用
いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキス
トラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ある
いはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては
不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応
させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化
担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の
本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反
応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質等の測
定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発
明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質等の結
合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すな
わち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例
えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク
質等のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗
体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する
抗体が用いられる。

【００５４】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ
／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、
前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量
を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少量の沈降
物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレ
ーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００５５】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質等の測定系を構築すればよい。これらの
一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを
参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイ
ムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江寛
編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochem
ical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochem
ical Techniques(Part B))、同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochem
ical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明の抗体を用い
ることによって、本発明のタンパク質等を感度良く定量
することができる。

【００５６】さらには、本発明のタンパク質抗体を用い
て本発明のタンパク質等の濃度を定量することによっ
て、本発明のタンパク質が関与する疾病の診断を行なう
ことができる。本発明のタンパク質等の濃度の減少が検
出された場合は、例えば、糖尿病性腎症，子球体腎炎な
どの腎疾患、肝繊維症などの肝疾患、肺繊維症、椎間板
ヘルニア、脊髄すべり症、坐骨神経痛、大理石病などの
疾病である可能性が高いと診断できる。一方、本発明の
タンパク質等の濃度の増加が検出された場合は、例え
ば、慢性関節リウマチ，変形性関節炎などの関節炎、骨
粗鬆症、腫瘍転移・浸潤、肺気腫、アルツハイマー病な
どの神経変成疾患、筋ジストロフィー症などの筋消耗性
疾患、角膜疾患、肝繊維症などの肝疾患、肺繊維症、水
疱泡症などの皮膚疾患、歯周病、天疱瘡、早産、分娩遅
延などの疾病の可能性が高いと診断することができる。
このように、本発明の抗体は、上記疾病の診断剤として
有用である。また、本発明の抗体は、体液や組織などの
被検体中に存在する本発明のタンパク質等を検出するた
めに使用することができる。また、本発明のタンパク質
等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時
の各分画中の本発明のタンパク質等の検出、被検細胞内
における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために
使用することができる。

【００５７】（４）遺伝子診断剤本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードす
るＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出す
ることができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡ
の損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたは
ｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤と
して有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子
診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼー
ションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomic
s），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロ
シージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceeding
s ofthe Natinal Academy of Sciences of the United
States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０
頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより該ｍＲ
ＮＡの発現低下が検出された場合は、例えば、糖尿病性
腎症，子球体腎炎などの腎疾患、肝繊維症などの肝疾
患、肺繊維症、椎間板ヘルニア、脊髄すべり症、坐骨神
経痛、大理石病などの各種疾病等である、または将来罹
患する可能性が高いと診断することができる。一方、該
ｍＲＮＡの発現過多が検出された場合は、例えば、慢性
関節リウマチ，変形性関節炎などの関節炎、骨粗鬆症、
腫瘍転移・浸潤、肺気腫、アルツハイマー病などの神経
変成疾患、筋ジストロフィー症などの筋消耗性疾患、糖
尿病性腎症，子球体腎炎などの腎疾患、角膜疾患、肝繊
維症などの肝疾患、肺繊維症、水疱泡症などの皮膚疾
患、歯周病、天疱瘡、早産、分娩遅延などの各種疾病等
である、または将来罹患する可能性が高いと診断するこ
とができる。また、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの
突然変異が検出された場合は、例えば、糖尿病性腎症，
子球体腎炎などの腎疾患、肝繊維症などの肝疾患、肺繊
維症、椎間板ヘルニア、脊髄すべり症、坐骨神経痛、大
理石病、慢性関節リウマチ，変形性関節炎などの関節
炎、骨粗鬆症、腫瘍転移・浸潤、肺気腫、アルツハイマ
ー病などの神経変成疾患、筋ジストロフィー症などの筋
消耗性疾患、糖尿病性腎症，子球体腎炎などの腎疾患、
角膜疾患、水疱泡症などの皮膚疾患、歯周病、天疱瘡、
早産、分娩遅延などの各種疾病等である、または将来罹
患する可能性が高いと診断することができる。

【００５８】（５）アンチセンスＤＮＡ前記のとおり、本発明のタンパク質等は、プロ酵素の活
性化、酵素の不活化、抗原提示、ホルモン成熟化、骨吸
収、組織の再構成などの生理活性を発揮し、例えば、慢
性関節リウマチ，変形性関節炎などの関節炎、骨粗鬆
症、腫瘍転移・浸潤、肺気腫、アルツハイマー病などの
神経変成疾患、筋ジストロフィー症などの筋消耗性疾
患、糖尿病性腎症，子球体腎炎などの腎疾患、角膜疾
患、肝繊維症などの肝疾患、肺繊維症、水疱泡症などの
皮膚疾患、歯周病、天疱瘡、早産、分娩遅延などの各種
疾病に関与している。したがって、本発明のＤＮＡに相
補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる
アンチセンスＤＮＡは、生体内における本発明のタンパ
ク質等またはＤＮＡの機能を抑制することができるの
で、例えば、慢性関節リウマチ，変形性関節炎などの関
節炎、骨粗鬆症、腫瘍転移・浸潤、肺気腫、アルツハイ
マー病などの神経変成疾患、筋ジストロフィー症などの
筋消耗性疾患、角膜疾患、肝繊維症などの肝疾患、肺繊
維症、水疱泡症などの皮膚疾患、歯周病、天疱瘡、早
産、分娩遅延などの各種疾病の治療・予防剤などの医薬
として使用することができる。上記アンチセンスＤＮＡ
を上記の医薬として使用する場合、前記した本発明のＤ
ＮＡを含有する医薬と同様にして実施することができ
る。

【００５９】（６）本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡを有する非ヒト動物の作製本発明のＤＮＡを用いて、本発明のタンパク質等を発現
するトランスジェニック非ヒト動物を作製することがで
きる。非ヒト動物としては、哺乳動物（例えば、ラッ
ト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）（以下、動物と略記する）が挙げれる
が、特に、マウス、ウサギなどが好適である。本発明の
ＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡ
を動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合し
た遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利で
ある。例えば、ウサギ由来の本発明のＤＮＡを転移させ
る場合、これと相同性が高い動物由来のプロモーターで
あって、本発明のＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種
プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクト
を、例えば、ウサギ受精卵へマイクロインジェクション
することによって本発明のタンパク質等を高産生するＤ
ＮＡ転移動物を作出できる。このプロモーターとして
は、例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネ
イン等のユビキタスな発現プロモーターも使用すること
ができる。

【００６０】受精卵細胞段階におけるＤＮＡの転移は、
対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するよう
に確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞にお
いて本発明のタンパク質等が存在することは、作出動物
の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明の
タンパク質等を有することを意味する。遺伝子を受け継
いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の
全てに本発明のタンパク質等を有する。本発明のＤＮＡ
転移動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを
確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼
育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有
する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相
同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、こ
の雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該Ｄ
ＮＡを有するように繁殖継代することができる。本発明
のＤＮＡが転移された動物は、本発明のタンパク質等が
高発現させられているので、本発明のタンパク質等のプ
ロテアーゼ活性を促進または阻害する化合物またはその
塩のスクリーニング用の動物などとして有用である。本
発明のＤＮＡ転移動物を、組織培養のための細胞源とし
て使用することもできる。例えば、本発明のＤＮＡ転移
マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析する
かあるいは遺伝子により発現された本発明のタンパク質
等が存在する組織を分析することにより、本発明のタン
パク質等について分析することができる。本発明のタン
パク質等を有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、例えば、脳や末梢組織由来
のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究
することができる。また、その細胞を用いることによ
り、例えば、各種組織の機能を高めるような医薬の選択
も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこか
ら、本発明のタンパク質等を単離精製することも可能で
ある。

【００６１】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム

【００６２】Ｇｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸Ｍｅ：メチル基Ｅｔ：エチル基Ｂｕ：ブチル基Ｐｈ：フェニル基ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基

【００６３】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニルＣＨＯ：ホルミルＢｚｌ：ベンジル Cl₂Bzl ：２，６−ジクロロベンジルＢｏｍ：ベンジルオキシメチルＺ：ベンジルオキシカルボニルＣｌ−Ｚ：２−クロロベンジルオキシカルボニルＢｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニルＢｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニルＤＮＰ：ジニトロフェニルＴｒｔ：トリチルＢｕｍ：ｔ−ブトキシメチルＦｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾールＨＯＯＢｔ：３−ヒドロキシ−３,４−ジヒドロ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジンＨＯＮＢ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【００６４】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。〔配列番号：１〕本発明のヒト脾臓由来システインプロ
テアーゼのアミノ酸配列を示す。〔配列番号：２〕本発明のヒト脾臓由来システインプロ
テアーゼの部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。〔配列番号：３〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を有する本発明のヒト脾臓由来システインプロテアー
ゼをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：４〕配列番号：２で表されるアミノ酸配列
を有する本発明のヒト脾臓由来システインプロテアーゼ
の部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：５〕本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａのクローニングに使用した合成プライマーの塩基配列
を示す。〔配列番号：６〕本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａのクローニングに使用した合成プライマーの塩基配列
を示す。

【００６５】後述の実施例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒアコリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴ
Ｂ１９２０は、平成８年４月２２日から通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号
ＦＥＲＭＢＰ−５５１５として、平成８年４月１９日
から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ
１５９４９として寄託されている。

【００６６】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular cloning）に記載され
ている方法に従った。

【００６７】

【実施例１】ヒト脾臓由来システインプロテアーゼをコ
ードする遺伝子のクローニングｃＤＮＡのクローニングは、ジーントラッパーポジティ
ブ選択システム（ギブコビーアールエル社）を用いて行
った。ヒト脾臓由来のｃＤＮＡライブラリー（ギブコビ
ーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株をTerrific Bro
th（１２ｇ/ｌ bacto−tryptone（ディフコ社），２４
ｇ/ｌ bacto−yeast extract（ディフコ社），２.３ｇ/
ｌリン酸一カリウム，１２.５ｇ/ｌリン酸二カリウ
ム）で３０℃で１６時間培養し、キアジェンプラスミド
キット（キアジェン社）を用いて、プラスミドｃＤＮＡ
ライブラリーを精製抽出した。精製したプラスミドｃＤ
ＮＡライブラリーをＧｅｎｅII，ＥｘｏIII（いずれも
ギブコビーアールエル社）によって消化し、一本鎖ｃＤ
ＮＡライブラリーを作成した。一方、プローブとして、
合成オリゴヌクレオチド（配列番号：５）をｃＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングに用いた。プローブは、Ｔ
ｄＴ，ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（ギブコビーアールエ
ル社）を用いて、３'末端をビオチン化することで標識
した。一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを９５℃で１分間処
理した後、氷中で急冷し、ビオチン化したプローブを加
えて３７℃で１時間、室温でハイブリダイゼーションを
行った。ハイブリダイゼーション後、ジーントラッパー
ポジティブ選択システム・マグネットビーズ（ギブコビ
ーアールエル社）を加えて、室温で２分ごとに撹拌しな
がら３０分間放置した。その後、ジーントラッパーポジ
ティブ選択システム・マグネットラック（ギブコビーア
ールエル社）中に入れ、２分間放置した。上清を捨て、
マグネットビーズをジーントラッパーポジティブ選択シ
ステム・ウオッシュバッファーで洗浄した。このウオッ
シュバッファーによる洗浄を３回行った。その後、マグ
ネットラックに入れて放置し、上清を捨て、ジーントラ
ッパーポジティブ選択システム・溶出バッファーを加
え、５分間室温で放置した。マグネットラックに入れて
５分間放置した後、その上清のＤＮＡ溶液を回収した。

【００６８】取得したＤＮＡ溶液にプライマーとして合
成オリゴヌクレオチド（配列番号：５）を入れ、９５℃
で１分間放置した。ジーントラッパーポジティブ選択シ
ステム・修復酵素を加え、７０℃で１５分間放置して二
本鎖ＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ＤＮＡをエレク
トロポレーション装置（バイオ・ラッド社）により、大
腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入した。得られた形質転換株を用
いて２本のオリゴヌクレオチド（配列番号：５、配列番
号：６）をプライマーとしてコロニーＰＣＲによるスク
リーニングを行った。ＰＣＲにより１０８ｂｐの増幅断
片が形成されたコロニーを陽性クローンとして２株選択
した。選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽出し、Ｔａ
ｑダイデオキシターミネーターサイクルシーケンシング
キット（パーキンエルマー社）を用いて反応を行い、３
７７ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社）によ
り、ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。取得したクロ
ーンは、poly(Ａ)⁺鎖および配列番号：３で表わされる
１１７６個の塩基配列を含有する１７４０個の塩基配列
を有していた。このｃＤＮＡ断片には、配列番号：１で
表される３９２個のアミノ酸からなる新規システインプ
ロテアーゼがコードされており、活性中心であるシステ
イン，ヒスチジン，アスパラギン残基も保存されてい
た。また、ヒト由来カテプシンＬとのアミノ酸レベルで
の相同性は４０％、マンソン住血吸虫由来システインプ
ロテアーゼとのアミノ酸レベルでの相同性は４９％しか
なかった。本発明のヒト脾臓由来システインプロテアー
ゼをコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９
２０を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂに導入し
て、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０
Ｂ／ｐＴＢ１９２０を得た。

【００６９】

【実施例２】本発明のヒト脾臓由来システインプロテア
ーゼの一過性発現と細胞抽出液の調製実施例１で得たｐＴＢ１９２０はすでに発現プラスミド
ｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ（ギブコビーアールエル社）に組
み込まれており、動物細胞における発現に用いられる。
ＣＯＳ−７細胞（財団法人発酵研究所より購入）を血清
含有ＤＭＥＭ培地で培養し、遺伝子導入の前日に継代し
５０％コンフルエントとなったＣＯＳ−７細胞を血清不
含ＤＭＥＭ培地で洗浄後、２.５ｍｌの無血清培地を添
加し、そこに５μｇのｐＴＢ１９２０を含むＴＡＮＳＦ
ＥＣＴＡＭ（ニッポンジーン社）混合液を加えた。３７
℃，５％ＣＯ₂の条件で４時間培養した後、２０％牛血
清含有ＤＭＥＭ培地を加え、さらに２０時間培養した。
血清不含ＤＭＥＭ培地に交換し、３日後に細胞を回収し
た。細胞はGuo-Ping Shiらの方法（ジャーナル・バイオ
ロジカル・ケミストリー、267巻、7258-7262頁、1992
年）に従って、lysisbuffer（４０mM 酢酸ナトリウム、
１mM ＥＤＴＡ、１％ Triton Ｘ−１００、ｐＨ５.５）
に懸濁し、３７℃で１時間静置後、遠心（１,５００rp
m，１０分）し、新規システインプロテアーゼを含む細
胞抽出液を得た。また、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ溶液の
みを加え同様の処理を行なった細胞抽出液をコントロー
ルとして用いた。

【００７０】

【実施例３】ヒト脾臓由来システインプロテアーゼによ
るアゾカゼインの分解実施例２で得た０.０５ｍｌの細胞抽出液を０.１５mlの
酵素反応液（終濃度５mg/ml アゾカゼイン｛シグマ社
製｝、１００mM 酢酸ナトリウム、１mM ＥＤＴＡ、２mM
ＤＴＴ、ｐＨ５.５）に混合し、３７℃，１時間反応さ
せた。０.２mlの１０％トリクロロ酢酸溶液を加え、４
℃で５分静置後、遠心し（１,０００rpm，１０分）、得
られた上清の３６６nmの吸光度を測定した。コントロー
ルのｍｏｃｋの細胞抽出液にくらべ、新規システインプ
ロテアーゼを含む細胞抽出液を用いた場合、吸光度が
０.１上昇した。このことから、実施例２で得た細胞抽
出液に含まれるヒト脾臓由来システインプロテアーゼ
が、アゾカゼインを分解することが分かった。

【００７１】

【実施例４】阻害剤探索系の設定９６穴プレート（フルオロＢプレート、大日本製薬製）
に実施例２で得られた細胞破砕液１０μＬと０．１％ B
rij３５（シグマ社）１５μＬおよび５０μＬの緩衝液
〔０.２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.５），４ｍＭ１，
４−ジチオスレイトール，２．５ｍＭエチレンジアミ
ンテトラ酢酸，０．０５％トリトンＸ−１００〕を加
え、３７℃にて５分間プレインキュベーションした後、
２０μＭの基質〔Ｚ−Leu−Arg−ＭＣＡ〕を２５μＬ添
加することによって酵素反応を開始した。３７℃にて１
０分反応後、マイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３
２、CORONA ELECTRONIC製）を用いて、励起波長３６５
ｎｍ、吸収波長４６０ｎｍで反応液中の蛍光強度を測定
した。細胞破砕液無添加の場合の蛍光強度（８６）に対
し、細胞破砕液を添加した場合は、１５２０の蛍光強度
を示した。この反応にシステインプロテアーゼ阻害剤で
あるＥ−６４（ペプチド研究所）を各種濃度添加するこ
とによりプロテアーゼ活性が阻害され、Ｅ−６４は約２
５ｎＭでこの酵素反応を５０％阻害した。このことか
ら、本アッセイ系を用いて、システインプロテアーゼ阻
害剤の探索が可能であることを確認した。

【００７２】

【実施例５】抗システインプロテアーゼポリクローナル
抗体の取得実施例１でｐＴＢ１９２０を得た際に同時に得られたシ
ステインプロテアーゼ遺伝子の８２番目のグアニンから
以降を含むプラスミドを制限酵素SalI，NotIで切断し、
その挿入部分を同様に処理したｐＧＥＸ４Ｔ−３（ファ
ルマシア）にライゲーションした。このライゲーション
液を用いて大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造（株））を形質転
換し、大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＧＥ
Ｘ４Ｔ−３／Ｃｙｓを得た。次に、この大腸菌を用い
て、本発明の組換え型ヒト脾臓由来システインプロテア
ーゼを取得した。大腸菌での発現・精製は、Bulk and R
ediPack GST Purification Modules（ファルマシア）添
付のプロトコールに準じて行なった。その結果、目的の
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパ
ク質は、１Ｌの大腸菌培養液から１．８ｍｇ取得でき
た。得られた組換え型ヒト脾臓由来システインプロテア
ーゼ（２００μｇ）を完全フロイントアジュバントに懸
濁し、日本白色ウサギに初回免疫を行なった。以後、２
週間毎４回、４００μｇの組換え型ヒト脾臓由来システ
インプロテアーゼを不完全フロイントアジュバントに懸
濁後免疫した。最終免疫の１週後に全採血することによ
り、約５０ｍｌの血清が取得できた。抗体価の測定は以
下のように行なった。組換え型ヒト脾臓由来システイン
プロテアーゼを０.５μｇ／ウェルとなるように固定化
した後、ＢＳＡでブロッキングした９６穴プレートに、
希釈したウサギ血清を添加し、室温で２時間静置した。
０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄後、抗ウ
サギＩｇＧ−パーオキシダーゼ（Capel製）を加え２時
間静置した。洗浄後、ｏ−フェニレンジアミンと過酸化
水素を含むクエン酸一リン酸緩衝液を加え、２０分間発
色させた。反応を１Ｍ硫酸で停止させた後、プレートリ
ーダーを用いて４９２ｎｍの発色を測定した。その結
果、非免疫ウサギの約１万倍の抗体価を示す抗血清が得
られた。

【００７３】

【発明の効果】本発明のタンパク質等またはＤＮＡは、
例えば、糖尿病性腎症，子球体腎炎などの腎疾患、肝繊
維症などの肝疾患、肺繊維症、椎間板ヘルニア、脊髄す
べり症、坐骨神経痛、大理石病などの種々の疾病の治療
・予防剤として使用することができる。また、本発明の
タンパク質等は、本発明のタンパク質等のプロテアーゼ
活性を促進もしくは阻害する化合物またはその塩のスク
リーニング用試薬として有用である。さらに、本発明の
タンパク質等に対する抗体は、本発明のタンパク質等を
特異的に認識することができるので、被検液中の本発明
のタンパク質等の定量などに使用することができる。

【００７４】

【配列表】

【配列番号：１】配列の長さ：３９２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク配列 Met Val Cys Arg Leu Pro Val Ser Lys Lys Thr Leu Leu Cys Ser Phe 1 5 10 15 Gln Val Leu Asp Glu Leu Gly Arg His Val Leu Leu Arg Lys Asp Cys 20 25 30 Gly Pro Val Asp Thr Lys Val Pro Gly Ala Gly Glu Pro Lys Ser Ala 35 40 45 Phe Thr Gln Gly Ser Ala Met Ile Ser Ser Leu Ser Gln Asn His Pro 50 55 60 Asp Asn Arg Asn Glu Thr Phe Ser Ser Val Ile Ser Leu Leu Asn Glu 65 70 75 80 Asp Pro Leu Ser Gln Asp Leu Pro Val Lys Met Ala Ser Ile Phe Lys 85 90 95 Asn Phe Val Ile Thr Tyr Asn Arg Thr Tyr Glu Ser Lys Glu Glu Ala 100 105 110 Arg Trp Arg Leu Ser Val Phe Val Asn Asn Met Val Arg Ala Gln Lys 115 120 125 Ile Gln Ala Leu Asp Arg Gly Thr Ala Gln Tyr Gly Val Thr Lys Phe 130 135 140 Ser Asp Leu Thr Glu Glu Glu Phe Arg Thr Ile Tyr Leu Asn Thr Leu 145 150 155 160 Leu Arg Lys Glu Pro Gly Asn Lys Met Lys Gln Ala Lys Ser Val Gly 165 170 175 Asp Leu Ala Pro Pro Glu Trp Asp Trp Arg Ser Lys Gly Ala Val Thr 180 185 190 Lys Val Lys Asp Gln Gly Met Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Val 195 200 205 Thr Gly Asn Val Glu Gly Gln Trp Phe Leu Asn Gln Gly Thr Leu Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Glu Gln Glu Leu Leu Asp Cys Asp Lys Met Asp Lys Ala 225 230 235 240 Cys Met Gly Gly Leu Pro Ser Asn Ala Tyr Ser Ala Ile Lys Asn Leu 245 250 255 Gly Gly Leu Glu Thr Glu Asp Asp Tyr Ser Tyr Gln Gly His Met Gln 260 265 270 Ser Cys Asn Phe Ser Ala Glu Lys Ala Lys Val Tyr Ile Asn Asp Ser 275 280 285 Val Glu Leu Ser Gln Asn Glu Gln Lys Leu Ala Ala Trp Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gly Pro Ile Ser Val Ala Ile Asn Ala Phe Gly Met Gln Phe Tyr 305 310 315 320 Arg His Gly Ile Ser Arg Pro Leu Arg Pro Leu Cys Ser Pro Trp Leu 325 330 335 Ile Asp His Ala Val Leu Leu Val Gly Tyr Gly Asn Arg Ser Asp Val 340 345 350 Pro Phe Trp Ala Ile Lys Asn Ser Trp Gly Thr Asp Trp Gly Glu Lys 355 360 365 Gly Tyr Tyr Tyr Leu His Arg Gly Ser Gly Ala Cys Gly Val Asn Thr 370 375 380 Met Ala Ser Ser Ala Val Val Asp 385 390

【００７５】

【配列番号：２】配列の長さ：２１４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Pro Pro Glu Trp Asp Trp Arg Ser Lys Gly Ala Val Thr Lys Val 1 5 10 15 Lys Asp Gln Gly Met Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Val Thr Gly 20 25 30 Asn Val Glu Gly Gln Trp Phe Leu Asn Gln Gly Thr Leu Leu Ser Leu 35 40 45 Ser Glu Gln Glu Leu Leu Asp Cys Asp Lys Met Asp Lys Ala Cys Met 50 55 60 Gly Gly Leu Pro Ser Asn Ala Tyr Ser Ala Ile Lys Asn Leu Gly Gly 65 70 75 80 Leu Glu Thr Glu Asp Asp Tyr Ser Tyr Gln Gly His Met Gln Ser Cys 85 90 95 Asn Phe Ser Ala Glu Lys Ala Lys Val Tyr Ile Asn Asp Ser Val Glu 100 105 110 Leu Ser Gln Asn Glu Gln Lys Leu Ala Ala Trp Leu Ala Lys Arg Gly 115 120 125 Pro Ile Ser Val Ala Ile Asn Ala Phe Gly Met Gln Phe Tyr Arg His 130 135 140 Gly Ile Ser Arg Pro Leu Arg Pro Leu Cys Ser Pro Trp Leu Ile Asp 145 150 155 160 His Ala Val Leu Leu Val Gly Tyr Gly Asn Arg Ser Asp Val Pro Phe 165 170 175 Trp Ala Ile Lys Asn Ser Trp Gly Thr Asp Trp Gly Glu Lys Gly Tyr 180 185 190 Tyr Tyr Leu His Arg Gly Ser Gly Ala Cys Gly Val Asn Thr Met Ala 195 200 205 Ser Ser Ala Val Val Asp 210

【００７６】

【配列番号：３】配列の長さ：１１７６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 ATGGTGTGCC GGCTCCCCGT GTCCAAGAAA ACCCTGCTCT GCAGCTTCCA AGTCCTGGAT 60 GAGCTCGGAA GACACGTGCT GCTGCGGAAG GACTGTGGCC CAGTGGACAC CAAGGTTCCA 120 GGTGCTGGGG AGCCCAAGTC AGCCTTCACT CAGGGCTCAG CCATGATTTC TTCTCTGTCC 180 CAAAACCATC CAGACAACAG AAACGAGACT TTCAGCTCAG TCATTTCCCT GTTGAATGAG 240 GATCCCCTGT CCCAGGACTT GCCTGTGAAG ATGGCTTCAA TCTTCAAGAA CTTTGTCATT 300 ACCTATAACC GGACATATGA GTCAAAGGAA GAAGCCCGGT GGCGCCTGTC CGTCTTTGTC 360 AATAACATGG TGCGAGCACA GAAGATCCAG GCCCTGGACC GTGGCACAGC TCAGTATGGA 420 GTCACCAAGT TCAGTGATCT CACAGAGGAG GAGTTCCGCA CTATCTACCT GAATACTCTC 480 CTGAGGAAAG AGCCTGGCAA CAAGATGAAG CAAGCCAAGT CTGTGGGTGA CCTCGCCCCA 540 CCTGAATGGG ACTGGAGGAG TAAGGGGGCT GTCACAAAAG TCAAAGACCA GGGCATGTGT 600 GGCTCCTGCT GGGCCTTCTC AGTCACAGGC AATGTGGAGG GCCAGTGGTT TCTCAACCAG 660 GGGACCCTGC TCTCCCTCTC TGAACAGGAG CTCTTGGACT GTGACAAGAT GGACAAGGCC 720 TGCATGGGCG GCTTGCCCTC CAATGCCTAC TCGGCCATAA AGAATTTGGG AGGGCTGGAG 780 ACAGAGGATG ACTACAGCTA CCAGGGTCAC ATGCAGTCCT GCAACTTCTC AGCAGAGAAG 840 GCCAAGGTCT ACATCAATGA CTCCGTGGAG CTGAGCCAGA ACGAGCAGAA GCTGGCAGCC 900 TGGCTGGCCA AGAGAGGCCC AATCTCCGTG GCCATCAATG CCTTTGGCAT GCAGTTTTAC 960 CGCCACGGGA TCTCCCGCCC TCTCCGGCCC CTCTGCAGCC CTTGGCTCAT TGACCATGCG 1020 GTGTTGCTTG TGGGCTACGG CAACCGCTCT GACGTTCCCT TTTGGGCCAT CAAGAACAGC 1080 TGGGGCACTG ACTGGGGTGA GAAGGGTTAC TACTACTTGC ATCGTGGGTC CGGGGCCTGT 1140 GGCGTGAACA CCATGGCCAG CTCGGCGGTG GTGGAC 1176

【００７７】

【配列番号：４】配列の長さ：６４２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列ＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＧＧＧ
ＧＣＴＧＴＣＡＣＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＣＣＡＧＧＧＣ６０ＡＴＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＡＣＡ
ＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＴＴＴＣＴＣ１２０ＡＡＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＣＡＧ
ＧＡＧＣＴＣＴＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣ１８０ＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＧＣＧＧＣＴＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣ
ＴＡＣＴＣＧＧＣＣＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＧＡＧＧＧ２４０ＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＡＴＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴ
ＣＡＣＡＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＣＴＣＡＧＣＡ３００ＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＣＴＡＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＧＴＧ
ＧＡＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧ３６０ＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣ
ＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧ４２０ＴＴＴＴＡＣＣＧＣＣＡＣＧＧＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＧ
ＣＣＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣ４８０ＣＡＴＧＣＧＧＴＧＴＴＧＣＴＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＧＣＡＡＣＣＧＣ
ＴＣＴＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧ５４０ＡＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＴ
ＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＴＧＣＡＴＣＧＴＧＧＧＴＣＣＧＧＧ６００ＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＴＣＧＧＣＧ
ＧＴＧＧＴＧＧＡＣ６４２

【００７８】

【配列番号：５】配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＴＧ
２３

【００７９】

【配列番号：６】配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TTGTTGCCAG GCTCTTTTCT CAGG 24

【００８０】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のヒト脾臓由来システインプロテアーゼ
（プロ領域＋成熟体）のアミノ酸配列を示す。

【図２】本発明のヒト脾臓由来システインプロテアーゼ
の活性部位（成熟体）のアミノ酸配列を示す。

【図３】本発明のヒト脾臓由来システインプロテアーゼ
をコードするＤＮＡを含むＤＮＡの塩基配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＪＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＬＡＢＬＡＣＤＡＣＤＡＣＫＡＣＫＡＣＳＡＣＳＡＣＶＡＣＶＡＤＡＡＤＡＡＤＰＡＤＰＡＤＴＡＤＴＡＤＵＡＤＵＡＥＤＡＥＤＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/50 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9/50 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/08 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/54 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタン
パク質またはその塩。
【請求項２】システインプロテアーゼ活性を有する請求
項１記載のタンパク質。
【請求項３】請求項１記載のタンパク質の部分ペプチド
またはその塩。
【請求項４】請求項１記載のタンパク質をコードする塩
基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項５】配列番号：３で表わされる塩基配列を有す
る請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項６】請求項４記載のＤＮＡを含有する組換えベ
クター。
【請求項７】請求項６記載の組換えベクターを保持する
形質転換体。
【請求項８】請求項７記載の形質転換体を培養し、請求
項１記載のタンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とする請求項１記載のタンパク質または
その塩の製造方法。
【請求項９】請求項１記載のタンパク質、請求項３記載
の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる医薬。
【請求項１０】糖尿病性腎症、子球体腎炎、肝繊維症、
肺繊維症、椎間板ヘルニア、脊髄すべり症、坐骨神経痛
または大理石病の治療・予防剤である請求項９記載の医
薬。
【請求項１１】請求項４記載のＤＮＡを含有してなる医
薬。
【請求項１２】糖尿病性腎症、子球体腎炎、肝繊維症、
肺繊維症、椎間板ヘルニア、脊髄すべり症、坐骨神経痛
または大理石病の治療・予防剤である請求項１１記載の
医薬。
【請求項１３】請求項１記載のタンパク質、請求項３記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体。
【請求項１４】請求項１記載のタンパク質、請求項３記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴
とする請求項１記載のタンパク質、請求項３記載の部分
ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促進ま
たは阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１５】請求項１記載のタンパク質、請求項３記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる請求
項１記載のタンパク質、請求項３記載の部分ペプチドま
たはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促進または阻害す
る化合物のスクリーニング用キット。
【請求項１６】請求項１４記載のスクリーニング方法ま
たは請求項１５記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる請求項１記載のタンパク質、請求項３記載の部
分ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促進
または阻害する化合物またはその塩。