JPH1080283A

JPH1080283A - 新規タンパク質およびそのｄｎａ

Info

Publication number: JPH1080283A
Application number: JP9106511A
Authority: JP
Inventors: Koji Yoshimura; 浩二吉村; Yuichi Hikichi; 裕一引地; Atsushi Nishimura; 篤西村
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-04-25
Filing date: 1997-04-24
Publication date: 1998-03-31
Also published as: WO1997040157A1; DE69736227D1; CA2252509A1; US7001997B2; US20030099631A1; EP0897426B1; ATE331786T1; US6566116B1; AU2406497A; EP0897426A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【解決手段】新規なメタロプロテアーゼ，その部分ペプ
チド又はそれらの塩、該タンパク質をコードするＤＮ
Ａ、これを含有する組換えベクター、形質転換体、該タ
ンパク質の製造法、該タンパク質又はＤＮＡ含有してな
る医薬、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質のプ
ロテアーゼ活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニ
ング方法／スクリーニング用キット、これで得られる化
合物、該タンパク質のプロテアーゼ活性を阻害する化合
物を含有してなる医薬等。【効果】上記メタロプロテアーゼ又はそれをコードする
ＤＮＡは、例えば、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肺繊維
症、肝繊維症，肝硬変等の肝疾患、大理石病、椎間板ヘ
ルニア等の種々の疾病の治療・予防剤として使用でき
る。上記タンパク質はそのプロテアーゼ活性を促進もし
くは阻害する化合物又はその塩をスクリーニングするた
めの試薬として有用である。上記抗体は、被検液中の該
タンパク質の定量に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なマトリック
ス・メタロプロテアーゼおよびそのＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞外マトリックスは、コラーゲンやプ
ロテオグリカン等からなる細胞支持組織であり、発生、
炎症、組織修復などに深く関与している。細胞外マトリ
ックスの分解に関与する酵素としては、アスパラギン酸
プロテアーゼに属するカテプシンＤ等、システインプロ
テアーゼに属するカテプシンＢ、Ｈ、Ｌ等、セリンプロ
テアーゼに属するプラスミン、カリクレイン、好中球エ
ラスターゼ、トリプターゼ、キマーゼ、カテプシンＧ
等、およびメタロプロテアーゼ群が知られている。この
うちメタロプロテアーゼ群はマトリックス・メタロプロ
テアーゼとも呼ばれるように、細胞外マトリックス分解
の中心的役割を果たしていることが知られている。コラ
ゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、膜結合型マ
トリックス・メタロプロテアーゼなど１３種類のヒト・
マトリックス・メタロプロテアーゼ群がクローニングさ
れ、その塩基配列とアミノ酸配列が報告されている〔T.
Takinoら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、270巻、23013頁、1995年；J. M. P. Freije
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、269巻、16766頁、1994年；H. Willら、ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、231巻、6
02頁、1995年〕。これらの酵素はいずれも亜鉛依存的メ
タロプロテアーゼであり、亜鉛結合領域であるＨｉｓ-
Ｇｌｕ-Ｘ-Ｇｌｙ-Ｈｉｓ-Ｓｅｒ-Ｌｅｕ-Ｇｌｙ-Ｌｅ
ｕ-Ｘ-Ｈｉｓ-Ｓｅｒというアミノ酸配列はよく保存さ
れ、ｏ−フェナンスロリンにより活性が阻害される。こ
れらの酵素は、活性型酵素のＮ末端にプロペプチドが結
合した活性を有しない潜在型酵素として分泌される。プ
ロペプチドのＣ末端付近には、Ｍｅｔ-Ａｒｇ-Ｌｙｓ-
Ｐｒｏ-Ａｒｇ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｖａｌ-Ｐｒｏ-Ａｓｐと
いうアミノ酸配列からなる保存領域が存在している。こ
の領域は、「システインスイッチ」と呼ばれ、領域中の
システインが活性中心の亜鉛原子と配位することによ
り、プロテアーゼ活性を抑制している。潜在型酵素はプ
ロペプチドの切断により活性化を受けるが、ＴＩＭＰと
名付けられた阻害タンパク質が３種類報告されており、
厳密な活性の調節が行なわれている。また、試験管内に
おいては潜在型酵素はトリプシンやアミノフェニル水銀
酢酸などの処理により活性化を受けることが知られてい
る。

【０００３】マトリックス・メタロプロテアーゼは、種
々のコラーゲン，変成コラーゲンであるゼラチン、種々
のプロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エ
ラスチンなどの細胞外マトリックスの分解に関与するだ
けでなく、他のマトリックスメタロプロテアーゼの活性
化やα１−プロテアーゼインヒビターなどのプロテアー
ゼ阻害剤の分解を行なう。また、ＴＮＦ、Ｆａｓリガン
ド、ＩＬ−６レセプターやＴＮＦレセプター等の膜タン
パク質および細胞表層タンパク質の可溶化に関与し、そ
の結果として、細胞の死・分化・増殖抑制・増殖および
遺伝子発現などを調節することが知られている。マトリ
ックス・メタロプロテアーゼは、生理的には、排卵、発
生分化、骨形成、退縮子宮、血管新生などの際に活性が
上昇することが知られている。また、病的状態において
は、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、ガン（転移・浸
潤）、歯周病、角膜潰瘍、胃潰瘍、心筋症、動脈瘤、耳
硬化症、表皮水泡症、早産、動脈硬化等において活性が
上昇することが知られている。また、逆に肺繊維症、肝
繊維症、肝硬変および大理石病等においては活性が低下
することが知られている。最近、新たに４番目の膜結合
型マトリックス・メタロプロテアーゼがクローニング
（X. S. Puenteら、キャンサー・リサーチ、56巻、944
頁、1996年）され、新規のマトリックス・メタロプロテ
アーゼが存在する可能性が示唆されていた。

【０００４】

【本発明が解決しようとする課題】新たなヒト由来のマ
トリックス・メタロプロテアーゼは、マトリックス・メ
タロプロテアーゼに対して阻害活性または促進活性を有
し、マトリックス・メタロプロテアーゼに起因する種々
の疾患（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節炎な
ど）の予防や治療に役立つ新たな医薬品の開発を可能に
する。したがって、本発明の分野では、ヒト由来の新規
なマトリックス・メタロプロテアーゼを見いだし、大量
に産生する方法の開発が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト肝臓お
よびラット肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーから、新規な
塩基配列を有するｃＤＮＡをクローニングすることに成
功し、それにコードされるタンパク質がマトリックス・
メタロプロテアーゼであることを見いだした。本発明者
らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結
果、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩、
（２）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する
第（１）項記載のタンパク質、（３）メタロプロテアー
ゼである第（１）項記載のタンパク質、（４）第（１）
項記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（５）第（１）項記載のタンパク質をコードする塩基配
列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（６）配列番号：
７で表わされる塩基配列を有する第（５）項記載のＤＮ
Ａ、（７）配列番号：８で表わされる塩基配列を有する
第（５）項記載のＤＮＡ、（８）第（５）項記載のＤＮ
Ａを含有する組換えベクター、（９）第（８）項記載の
組換えベクターを保持する形質転換体、（１０）第
（９）項記載の形質転換体を培養し、第（１）項記載の
タンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とする第（１）項記載のタンパク質またはその塩の
製造方法、（１１）第（１）項記載のタンパク質、第
（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有し
てなる医薬、（１２）糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肝繊
維症、肺繊維症、肝硬変、大理石病または椎間板ヘルニ
アの治療・予防剤である第（１１）項記載の医薬、（１
３）第（５）項記載のＤＮＡを含有してなる医薬、（１
４）糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肝繊維症、肺繊維症、
肝硬変、大理石病または椎間板ヘルニアの治療・予防剤
である第（１３）項記載の医薬、

【０００７】（１５）第（１）項記載のタンパク質、第
（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する
抗体、（１６）第（１）項記載のタンパク質、第（４）
項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを
特徴とする第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性
を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
ング方法、（１７）第（１）項記載のタンパク質、第
（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有し
てなる第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の
部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促
進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング
用キット、（１８）第（１６）項記載のスクリーニング
方法または第（１７）項記載のスクリーニング用キット
を用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質、第
（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテ
アーゼ活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
および（１９）第（１６）項記載のスクリーニング方法
または第（１７）項記載のスクリーニング用キットを用
いて得られる、第（１）項記載のタンパク質、第（４）
項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ
活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬
を提供する。

【０００８】さらに、本発明は、（２０）配列番号：３
〜配列番号：６のいずれかの配列番号で表わされるアミ
ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
有する第（４）項記載の部分ペプチド、（２１）配列番
号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイ
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配
列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２２）第（２
１）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、（２
３）第（２２）項記載の組換えベクターを保持する形質
転換体、（２４）第（２３）項記載の形質転換体を培養
し、タンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取するこ
とを特徴とする第（２１）項記載のＤＮＡにコードされ
るタンパク質またはその塩の製造方法、（２５）第（２
４）項記載の製造法で製造されるタンパク質またはその
塩、（２６）（ｉ）第（１）項記載のタンパク質、第
（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質を
接触させた場合と（ii）第（１）項記載のタンパク質、
第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質
および試験化合物を接触させた場合における、第（１）
項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドま
たはそれらの塩のプロテアーゼ活性を測定して、比較す
ることを特徴とする第（１６）項記載のスクリーニング
方法、（２７）創傷、慢性関節リウマチ、変形性関節
炎、腫瘍、歯周病、角膜潰瘍、胃潰瘍、心筋症、動脈
瘤、耳硬化症、表皮水泡症、早産、動脈硬化、敗血症、
多発性硬化症、悪液質、高カルシウム血症、白血病、リ
ンパ腫、糖尿病、全身性エリテマトーデス、喘息、アレ
ルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、外傷、火傷、急性膵
炎、虚血−再灌流傷害、心筋梗塞、鬱血性心不全、臓器
移植またはＧＶＨＤ（移植片対宿主反応）の治療・予防
剤である第（１９）項記載の医薬、（２８）第（１６）
項もしくは第（２６）項記載のスクリーニング方法また
は第（１７）項記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる、第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性
を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２９）糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肝繊維症、肺繊維
症、肝硬変、大理石病または椎間板ヘルニアの治療・予
防剤である第（２８）項記載の医薬、（３０）第（１
５）項記載の抗体と、被検液および標識化された第
（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプ
チドまたはそれらの塩とを競合的に反応させ、該抗体に
結合した標識化された第（１）項記載のタンパク質、第
（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の割合を
測定することを特徴とする被検液中の第（１）項記載の
タンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれ
らの塩の定量法、および（３１）被検液と担体上に不溶
化した第（１５）項記載の抗体および標識化された第
（１５）項記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応さ
せたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること
を特徴とする被検液中の第（１）項記載のタンパク質、
第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
法を提供する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列〔図１〕と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を有するタンパク質（以下、本発明のタン
パク質と称する）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモ
ット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツ
ジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細
胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メ
サンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮
細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪
細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細
胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基
球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨
細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは
間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしく
はガン細胞など）またはそれらの細胞が存在するあらゆ
る組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、
大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、
小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖
腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消
化管（大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下
腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関
節、骨格筋などや、ヒト由来株化細胞（例えば、ＭＥ
Ｌ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，Ｈ
Ｌ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬ
Ｔ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−Ｃ
ＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ
−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ
−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ
−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）など
に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質
であってもよい。

【００１０】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約
６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ま
しくは８０％、特に好ましくは９０％以上、最も好まし
くは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙
げられ、特に、タンパク質の構成アミノ酸配列として少
なくとも配列番号：３または配列番号：４で表わされる
アミノ酸配列を含有し、全体として配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０
％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましく
は８０％、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは
９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが好まし
い。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に
同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列などが用いられる。本
発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的
に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質としては、例
えば、前記の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に
同質の活性を有するタンパク質などが好ましく、特に、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパ
ク質などが用いられる。実質的に同質の活性としては、
例えば、プロテアーゼ活性（例、プロテイナーゼ活性、
ペプチダーゼ活性など）などが挙げられる。実質的に同
質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、
または薬理学的に）同質であることを示す。したがっ
て、プロテアーゼ活性などの活性が同等（例、約０．０
１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ま
しくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これ
らの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は
異なっていてもよい。プロテアーゼ活性の活性の測定
は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例
えば、後述するスクリーニング方法に従って測定するこ
とができる。

【００１１】また、本発明のタンパク質としては、例え
ば、配列番号：１または配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３
０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ま
しくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が欠失したア
ミノ酸配列、配列番号：１または配列番号：２で表わ
されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、
１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さら
に好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が付加
したアミノ酸配列、配列番号：１または配列番号：２
で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ま
しくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程
度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ
酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または
それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質な
どのいわゆるムテインも用いられる。上記のようにアミ
ノ酸配列が欠失または置換されている場合、その欠失ま
たは置換の位置としては、特に限定されないが、例え
ば、（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列のう
ち、第９８番目〜５０８番目のアミノ酸配列（すなわ
ち、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列）以外の位
置、より好ましくは第９３番目〜第５０８番目のアミノ
酸配列（すなわち、配列番号：４で表わされるアミノ酸
配列）以外の位置、（２）配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列のうち、第９９番目〜５１７番目のアミノ酸
配列（すなわち、配列番号：５で表わされるアミノ酸配
列）以外の位置、より好ましくは第９４番目〜第５１７
番目のアミノ酸配列（すなわち、配列番号：６で表わさ
れるアミノ酸配列）以外の位置などが挙げられる。ま
た、欠失・置換の位置としては、配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列と配列番号：２で表わされるアミノ酸
配列との共通アミノ酸配列以外の位置なども好ましく、
特に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列のうち、
第２１２番目〜２２５番目のアミノ酸配列（すなわち、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列のうち、第２１
３番目〜２２６番目のアミノ酸配列）以外の位置などが
好適である。

【００１２】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめ
とする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキ
シル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯ
Ｏ^-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）または
エステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステ
ルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ
_1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキ
シルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ
_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基のほ
か、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシ
メチル基などが用いられる。本発明のタンパク質がＣ末
端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を
有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエス
テル化されているものも本発明のタンパク質に含まれ
る。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末
端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のタン
パク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメ
チオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル
基、アセチルなどのＣ_1-5アルキル−カルボニル基など
のＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側
が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタ
ミル化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基
（例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、アミノ基、イミダゾー
ル基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護
基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_1-6アシ
ル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合
したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども
含まれる。本発明のタンパク質の具体例としては、例え
ば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する
ヒト肝臓由来のメタロプロテアーゼ〔図１〕などのヒト
由来メタロプロテアーゼ、配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列を含有するラット肝臓由来のメタロプロテア
ーゼ〔図６〕などのラット由来メタロプロテアーゼなど
が用いられる。

【００１３】本発明の部分ペプチドとしては、前記した
本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、本発明の
タンパク質と実質的に同質の活性（例、プロテアーゼ活
性など）を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち
少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに
好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、
最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペ
プチドなどが用いられる。本発明の部分ペプチドの具体
例としては、例えば、（１）配列番号：３または配列番
号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を有し、本発明の配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同
質の活性を有するペプチド、（２）配列番号：５または
配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは
実質的に同一のアミノ酸配列を有し、本発明の配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実
質的に同質の活性を有するペプチドなどが用いられる。
配列番号：３または配列番号：４で表わされるアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：３
または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と約５０
％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７
０％以上、さらに好ましくは８０％、特に好ましくは９
０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する
アミノ酸配列を示す。配列番号：５または配列番号：６
で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配
列とは、配列番号：５または配列番号：６で表わされる
アミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以
上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは８
０％、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５
％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。

【００１４】ここで、配列番号：３で表わされるアミノ
酸配列は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第
９８番目のＴｙｒ〜第５０８番目のＴｙｒまでのアミノ
酸配列を示す。配列番号：４で表わされるアミノ酸配列
は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９３番
目のＧｌｎ〜第５０８番目のＴｙｒまでのアミノ酸配列
を示す。両アミノ酸配列は、本発明のタンパク質の活性
中心部位のアミノ酸配列であり、本発明の配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質の成熟体
（活性体）のアミノ酸配列である。また、配列番号：５
で表わされるアミノ酸配列は、配列番号：２で表わされ
るアミノ酸配列の第９９番目のＴｙｒ〜第５１７番目の
Ｔｙｒまでのアミノ酸配列を示す。配列番号：６で表わ
されるアミノ酸配列は、配列番号：２で表わされるアミ
ノ酸配列の第９４番目のＧｌｎ〜第５１７番目のＴｙｒ
までのアミノ酸配列を示す。両アミノ酸配列は、本発明
のタンパク質の活性中心部位のアミノ酸配列であり、本
発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する
タンパク質の成熟体（活性体）のアミノ酸配列である。
すなわち、本発明のタンパク質は、例えば、配列番号：
１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質として
発現されるが、生体内において、配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列の第１番目〜９７番目または第１番目
〜９２番目のアミノ酸配列部分が切断され、配列番号：
１で表わされるアミノ酸配列の第９８番目〜５０８番目
のアミノ酸配列（すなわち、配列番号：３で表わされる
アミノ酸配列〔図２〕）または配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列の第９３番目〜５０８番目のアミノ酸配
列（すなわち、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列
〔図３〕）を有するペプチドなどが成熟体（活性体）と
してプロテアーゼ活性等を発揮する。また、本発明のタ
ンパク質は、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ
酸配列を有するタンパク質として発現されるが、生体内
において、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第
１番目〜９８番目または第１番目〜９３番目のアミノ酸
配列部分が切断され、配列番号：２で表わされるアミノ
酸配列の第９９番目〜５１７番目のアミノ酸配列（すな
わち、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列）または
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第９４番目〜
５１７番目のアミノ酸配列（すなわち、配列番号：６で
表わされるアミノ酸配列）を有するペプチドなどが成熟
体（活性体）としてプロテアーゼ活性等を発揮する。
「実質的に同質の活性」とは前記と同意義を示す。「実
質的に同質の活性」の測定は前記と同様に行なうことが
できる。

【００１５】また、本発明の部分ペプチドとしては、例
えば、配列番号：３または配列番号：４で表わされる
アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜
３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好
ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が欠失した
アミノ酸配列、配列番号：３または配列番号：４で表
わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましく
は、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が
付加したアミノ酸配列、配列番号：３または配列番
号：４で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１
０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））の
アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、ま
たはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を有するペプ
チドなども用いられる。さらに、本発明の部分ペプチド
としては、例えば、配列番号：５または配列番号：６
で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ま
しくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程
度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ
酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：５または配列
番号：６で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上
（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１
０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））の
アミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：５また
は配列番号：６で表わされるアミノ酸配列中の１または
２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましく
は１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５
個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸
配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を有
するペプチドなども用いられる。

【００１６】本発明の部分ペプチドは、Ｃ末端が通常カ
ルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート
(−ＣＯＯ^-）であるが、前記した本発明のタンパク質の
ごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステ
ル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部
分ペプチドには、前記の本発明のタンパク質と同様に、
Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護され
ているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタ
ミル基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸
の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているも
の、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの
複合ペプチドなども含まれる。本発明の部分ペプチドの
具体例としては、例えば、配列番号：３（図２）または
配列番号：４（図３）で表わされるアミノ酸配列を有す
るペプチド、配列番号：５または配列番号：６で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するペプチドなどが用いられ
る。

【００１７】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加
塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例
えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、ある
いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマ
ル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リン
ゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンス
ルホン酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク
質またはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞また
は組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製
造することもできるし、後述するタンパク質をコードす
るＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって
も製造することができる。また、後述のペプチド合成法
に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の組織
または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織ま
たは細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行な
い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わ
せることにより精製単離することができる。

【００１８】本発明のタンパク質、その部分ペプチドも
しくはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成には、
通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセト
アミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocア
ミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の
配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で
縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出
すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で
分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタン
パク質またはそれらのアミド体を取得する。上記した保
護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用で
きる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カ
ルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DC
C、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-
(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用
いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤
（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹
脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステ
ルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ
酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができ
る。

【００１９】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十
分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十
分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチ
ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化し
て、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができ
る。

【００２０】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボ
ルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシ
カルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニ
ル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２
−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノ
チオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキシル基は、
例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、
シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２
−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アル
キルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベ
ンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メ
トキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステ
ル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル
化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブト
キシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化な
どによって保護することができる。セリンの水酸基は、
例えば、エステル化またはエーテル化によって保護する
ことができる。このエステル化に適する基としては、例
えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイ
ル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、
エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基など
が用いられる。また、エーテル化に適する基としては、
例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチ
ル基などである。チロシンのフェノール性水酸基の保護
基としては、例えば、Bzl、Cl₂-Bzl、２−ニトロベンジ
ル、Br-Z、ｔ−ブチルなどが用いられる。ヒスチジンの
イミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、４-メト
キシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベン
ジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いら
れる。

【００２１】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対
応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、例えば、Ｐｄ黒あるいはＰｄ-炭素
などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、ま
た、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロ
メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの
混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミ
ン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどに
よる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる
還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、
一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処
理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオ
アニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチ
ルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチ
オールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効であ
る。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用い
られる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理に
より除去され、トリプトファンのインドール保護基とし
て用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオー
ル、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。

【００２２】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。

【００２３】本発明のタンパク質の部分ペプチドまたは
その塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、ある
いは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断す
ることによって製造することができる。ペプチドの合成
法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれ
によっても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成
し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮
合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離す
ることにより目的のペプチドを製造することができる。
公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下
の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合成
広川書店また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれ
に準じる方法によって適当な塩に変換することができる
し、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれ
に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換するこ
とができる。

【００２４】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基
配列を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、
前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組
織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれで
もよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリ
オファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなど
いずれであってもよい。また、前記した細胞・組織より
totalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用い
て直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain React
ion（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅す
ることもできる。本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａとしては、例えば、（１）配列番号：７で表わされる
塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：７で表わ
される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の
活性（例、プロテアーゼ活性などの活性）を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ、（２）配列番号：８で表わ
される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：８
で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下
でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：２で
表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に
同質の活性（例、プロテアーゼ活性などの活性）を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのもので
もよい。配列番号：７で表わされる塩基配列とハイブリ
ダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７で
表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０
％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましく
は約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤ
ＮＡなどが用いられる。配列番号：８で表わされる塩基
配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、
配列番号：８で表わされる塩基配列と約７０％以上、好
ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以
上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基
配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００２５】ハイブリダイゼーションは、自体公知の方
法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook
etal., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記
載の方法などに従って行なうことができる。また、市販
のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記
載の方法に従って行なうことができる。より好ましく
は、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことが
できる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナ
トリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜
２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０
〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９
ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体
的には、（１）配列番号：１のアミノ酸配列を含有する
タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：７
で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ〔図４の第９５番
目〜１６１８番目の塩基配列〕、（２）配列番号：２の
アミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡ
としては、配列番号：８で表わされる塩基配列を有する
ＤＮＡ〔図６の第９０番目〜第１６４０番目の塩基配
列〕などが用いられる。

【００２６】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、（１）配列番号：７で表わされる
塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮ
Ａ、配列番号：７で表わされる塩基配列とハイストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有
し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質と実質的に同質の活性（例、プロテアーゼ活性
などの活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡの
部分塩基配列を有するＤＮＡ、（２）配列番号：８で
表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を
有するＤＮＡ、配列番号：８で表わされる塩基配列と
ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩
基配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列
を有するタンパク質と実質的に同質の活性（例、プロテ
アーゼ活性などの活性）を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。

【００２７】より具体的には、本発明の部分ペプチドを
コードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：９で
表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：
９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタン
パク質と実質的に同質の活性を有する部分ペプチドをコ
ードするＤＮＡ、配列番号：１０で表わされる塩基配
列を有するＤＮＡ、または配列番号：１０で表わされる
塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズする塩基配列を有し、本発明のタンパク質と実質的
に同質の活性を有する部分ペプチドをコードするＤＮ
Ａ、配列番号：１１で表わされる塩基配列を有するＤ
ＮＡ、または配列番号：１１で表わされる塩基配列とハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基
配列を有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性
を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡ、配列番
号：１２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または
配列番号：１２で表わされる塩基配列とハイストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、
本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有する部分
ペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。

【００２８】配列番号：９または配列番号：１０で表わ
される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：９または配列番号：１０で表わ
される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以
上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９
５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡな
どが用いられる。配列番号：１１または配列番号：１２
で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡと
しては、例えば、配列番号：１１または配列番号：１２
で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８
０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましく
は約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤ
ＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションの方法
およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のもの
が用いられる。より具体的には、配列番号：３で表わ
されるアミノ酸配列を有する本発明の部分ペプチドをコ
ードするＤＮＡとしては、配列番号：９で表わされる塩
基配列〔図４の第３８６番目〜１６１８番目の塩基配
列〕を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどが、配列番
号：４で表わされるアミノ酸配列を有する本発明の部分
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１０
で表わされる塩基配列〔図４の第３７１番目〜１６１８
番目の塩基配列〕を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなど
が、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を有する
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：１１で表わされる塩基配列〔図６の第２９５番
目〜１６４０番目の塩基配列〕などが、配列番号：６
で表わされるアミノ酸配列を有する本発明の部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２で表わ
される塩基配列〔図６の第２８０番目〜１６４０番目の
塩基配列〕などが用いられ。

【００２９】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ド（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）
を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段として
は、（１）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの部
分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣ
Ｒ法によって増幅するか、または（２）適当なベクター
に組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるい
は全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを
標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別
すること、などが挙げられる。ハイブリダイゼーション
の方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Mole
cular Cloning）２nd（J. Sambrook etal., Cold Sprin
g Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従っ
て行なうことができる。また、市販のライブラリーを使
用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行
なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換（欠失・付
加・置換）は、公知のキット、例えば、Mutan^TM-G（宝
酒造（株））、Mutan^TM-K（宝酒造（株））などを用い
て、Gapped duplex法やKunkel法などの自体公知の方法
あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができ
る。クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは
目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化
したり、リンカーを付加したりして使用することができ
る。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとして
のＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンと
してのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよ
い。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当
な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもでき
る。本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、
（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的
とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適
当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結するこ
とにより製造することができる。

【００３０】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
スなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病
原ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ
／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなど
が用いられる。本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細
胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、Ｓ
Ｖ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サ
イトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロ
モーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロ
モーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好まし
い。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロ
モーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモータ
ー、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プ
ロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、
ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎ
Ｐプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ
５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモー
ター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーターなど
が好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリ
ンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。

【００３１】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）
等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニー
ズハムスター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択
マーカーとして使用する場合、目的遺伝子で形質転換さ
れた細胞をチミジンを含まない培地によっても選択でき
る。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列
を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主が
エシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配
列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌
である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチ
リシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合
は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列な
ど、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シ
グナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗
体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。この
ようにして構築された本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造
する。

【００３２】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。

【００３３】酵母としては、例えば、サッカロマイセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)ＡＨ２２，
ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０
Ｂ−１２、シゾサッカロマイセスポンベ（Schizosacc
haromyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹ２０３
６、ピキアパストリス（Pichia pastoris）などが用
いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃ
ＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodopte
ra frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの
中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHig
h Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEs
tigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルス
がＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori
N cell；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞と
しては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２
１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Viv
o）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫とし
ては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記する），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャ
イニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞と略記する），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ
−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦ
Ｌ、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、
Ｓｐ−２細胞などが用いられる。これらの中でも、ＣＨ
Ｏ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞、２９３細胞などが
好ましい。

【００３４】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mole
cular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９
７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４
巻，１８２−１８７(１９９１)に記載の方法に従って行
なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換する
には、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technolog
y）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行なう
ことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、
細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール，２６３
−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー
（Virology），５２巻，４５６（１９７３）などに記載
の方法に従って行なうことができる。発現ベクターの細
胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法
〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー
（Virology） 52, 456-467（1973）〕、電気穿孔法〔Nu
emann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.） 1,8
41-845（1982）〕等が挙げられる。このようにして、本
発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベ
クターで形質転換された形質転換体を得ることができ
る。なお、動物細胞を用いて、本発明のタンパク質を安
定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入さ
れた発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクロー
ン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記
の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さ
らに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細
胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより
本発明のタンパク質の高発現能を有する安定な動物細胞
株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培
養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子と
ともに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを細胞
内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ること
もできる。

【００３５】上記の形質転換体を本発明のタンパク質を
コードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明
のタンパク質を生成、蓄積せしめることによって、本発
明のタンパク質またはその塩を製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、ア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、
ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液などの無機または有機物質、無機物としては、例え
ば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マ
グネシウムなどが挙げられる。また、酵母抽出液、ビタ
ミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐ
Ｈは約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する
際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を
含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・
エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティッ
クス（Journal of Experiments in Molecular Genetic
s），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laborator
y, New York１９７２〕が好ましい。ここに必要により
プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β
−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることがで
きる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１
５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気
や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場
合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行な
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bo
stian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ
・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），
７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を
含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が
挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ま
しい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間
行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００３６】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Seience），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Jounal of the American Medical
Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９
培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of
the Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞およびｄｈｆｒ遺
伝子を選択マーカーとして用いる場合、チミジンをほと
んど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用
いるのが好ましい。以上のようにして、形質転換体の細
胞膜に本発明のタンパク質を生成せしめることができ
る。

【００３７】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体、昆虫あるいは
細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌
体、昆虫あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸
濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解など
によって菌体、昆虫あるいは細胞を破壊したのち、遠心
分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法など
が適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン
などの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^TMなどの界
面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質
が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方
法で菌体、昆虫あるいは細胞と上清とを分離し、上清を
集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽
出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離
・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こ
れらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法
などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲ
ルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオ
ン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方
法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新
和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー
などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法な
どの等電点の差を利用する方法などが用いられる。かく
して得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、
自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に
変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公
知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体また
は他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産
生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白
修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えた
り、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋
白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプ
シン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナ
ーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくして生成
する本発明のタンパク質またはその塩の活性は、標識し
たリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザ
イムイムノアッセイなどにより測定することができる。

【００３８】本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体で
あれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何
れであってもよい。本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質と略
記する）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原と
して用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従っ
て製造することができる。

【００３９】〔モノクローナル抗体の作製〕（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免
疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種ま
たは異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することが
できる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識
化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合
した標識剤の活性を測定することにより行なうことがで
きる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミル
スタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (197
5)〕に従い実施することができる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが
用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、
ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）
が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベート
することにより効率よく細胞融合を実施できる。

【００４０】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着さ
せた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培
養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した
抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマ
ウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられ
る）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノク
ローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタン
パク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検
出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選
別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行な
うことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノ
プテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行な
うことができる。選別および育種用培地としては、ハイ
ブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用
いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２
０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜
１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業
（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（Ｓ
ＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることがで
きる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３
７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましく
は１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下
で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体
価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。

【００４１】（ｂ）モノクロナール抗体の精製モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。

【００４２】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法にしたがって製造することができる。例えば、免
疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリ
アー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル
抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫
動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取
して、抗体の分離精製を行なうことにより製造すること
ができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗
原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋
白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、
キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体
が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架
橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシ
サイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン
１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合
でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキ
ャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いること
ができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マ
レイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基
を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成
物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ
自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に
際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュ
バントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ
い。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１
０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、上記の方
法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは
血液から採取することができる。抗血清中のポリクロー
ナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同
様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製
は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫
グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。

【００４３】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記す
る場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩
基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、本発明の
ＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を
有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するもので
あれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例え
ば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列あ
るいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０
％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは
約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられ
る。特に、本発明のＤＮＡの全塩基配列うち、本発明の
タンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列
（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）に相補的な
塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、よ
り好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以
上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。
これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置
などを用いて製造することができる。

【００４４】本発明のタンパク質は、タンパク質部分の
分子量が通常約２〜７万、好ましくは約２〜６万、活性
中心部位の分子量が通常約２〜５万のメタロプロテアー
ゼ（好ましくは、ヒト型メタロプロテアーゼ）であり、
例えば、排卵、発生分化、骨形成、退縮子宮、血管新生
などの際に活性が上昇する。また、例えば、慢性関節リ
ウマチ、変形性関節炎、ガン（転移・浸潤）、歯周病、
角膜潰瘍、胃潰瘍、心筋症、動脈瘤、耳硬化症、表皮水
泡症、早産、動脈硬化などにおいて活性が上昇する。一
方、例えば、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肺繊維症、肝
繊維症、肝硬変、大理石病、椎間板ヘルニアなどにおい
ては活性が低下する。以下に、本発明のタンパク質、そ
の部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタン
パク質等と略記する場合がある）、本発明のタンパク質
またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本
発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパ
ク質等に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場
合がある）およびアンチセンスＤＮＡの用途を説明す
る。

【００４５】（１）本発明のタンパク質が関与する各種
疾病の治療・予防剤メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡに異常があった
り、欠損している場合、あるいはメタロプロテアーゼの
発現量や活性が減少している場合、例えば、糖尿病性腎
症、糸球体腎炎、肺繊維症、肝繊維症，肝硬変などの肝
疾患、大理石病、椎間板ヘルニアなどのメタロプロテア
ーゼの発現異常や活性異常に関与する種々の疾病が発症
する。したがって、本発明のタンパク質等およびＤＮＡ
は、例えば、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肺繊維症、肝
繊維症，肝硬変などの肝疾患、大理石病、椎間板ヘルニ
アなどのメタロプロテアーゼの発現異常や活性異常に関
与する種々の疾病の治療・予防剤などの医薬として使用
することができる。例えば、生体内においてメタロプロ
テアーゼが減少あるいは欠損しているために、細胞にお
ける、メタロプロテアーゼ活性が十分に、あるいは正常
に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮ
Ａを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質等を
発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡ
を挿入し、本発明のタンパク質等を発現させた後に、該
細胞を患者に移植することによって、（ハ）本発明のタ
ンパク質等を該患者に投与することなどによって、該患
者における本発明のタンパク質等の役割を十分に、ある
いは正常に発揮させることができる。

【００４６】本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤とし
て使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイル
スアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベク
ターに挿入した後、常套手段に従ってヒトまたは温血動
物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのま
まで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的
に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイド
ロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき
る。本発明のタンパク質等を上記の治療・予防剤として
使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％
以上、より好ましく９８％以上、さらに好ましくは９９
％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。本発
明のタンパク質等は、例えば、必要に応じて糖衣を施し
た錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル
剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の
薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤
などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本
発明のタンパク質等を生理学的に認められる担体、香味
剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などと
ともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量
形態で混和することによって製造することができる。こ
れら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な
容量が得られるようにするものである。

【００４７】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、
ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例
えば、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０など）など
と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、
大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベン
ジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。ま
た、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム
緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液など
の医薬組成物は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製
剤化され、通常、非経口的に使用される。

【００４８】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例え
ば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与
することができる。本発明のタンパク質等の投与量は、
対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はある
が、例えば、糖尿病性腎症治療目的で本発明のタンパク
質等を経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき該タンパク質等を約０.１
ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、よ
り好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に
投与する場合は、該タンパク質等の１回投与量は投与対
象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、椎間板
ヘルニア治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形
で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日に
つき該タンパク質等を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ま
しくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．
１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与する
のが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たり
に換算した量を投与することができる。

【００４９】（２）疾病に対する医薬候補化合物のスク
リーニング本発明のタンパク質の機能（例、プロテアーゼ活性な
ど）を促進する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病
性腎症、糸球体腎炎、肺繊維症、肝繊維症，肝硬変など
の肝疾患、大理石病、椎間板ヘルニアなどの各種疾病の
治療・予防剤などの医薬として使用できる。したがっ
て、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の機能
を促進する化合物またはその塩をスクリーニングするた
めの試薬として有用である。一方、本発明のタンパク質
等の機能（例、プロテアーゼ活性など）を阻害する化合
物またはその塩は、例えば、創傷、慢性関節リウマチ、
変形性関節炎、ガン（転移・浸潤）、肝繊維症，肝硬変
などの肝疾患、歯周病、肺繊維症、角膜潰瘍、胃潰瘍、
心筋症、動脈瘤、耳硬化症、表皮水泡症、早産、動脈硬
化、敗血症、多発性硬化症、悪液質、高カルシウム血
症、白血病、リンパ腫、糖尿病、全身性エリテマトーデ
スなどの全身性自己免疫疾患、喘息、アレルギー性鼻炎
やアトピー性皮膚炎などの免疫疾患、外傷・火傷・急性
膵炎などによる全身性炎症反応、虚血−再灌流傷害、心
筋梗塞や鬱血性心不全などの循環系疾患、臓器移植やＧ
ＶＨＤ（移植片対宿主反応）などの各種疾病の治療・予
防剤などの医薬として使用できる。したがって、本発明
のタンパク質等は、本発明のタンパク質等の機能を阻害
する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬
として有用である。

【００５０】すなわち、本発明は、（１）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩を用いることを特徴とする本発明のタンパク質
の機能（例、プロテアーゼ活性など）を促進する化合物
もしくはその塩（以下、促進剤と略記する場合があ
る）、または本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩の機能（例、プロテアーゼ活性など）を
阻害する化合物（以下、阻害剤と略記する場合がある）
のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例え
ば、（２）（ｉ）本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩に基質を接触させた場合と（ii）本発明
のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に基
質および試験化合物を接触させた場合との比較を行なう
ことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング
方法を提供する。具体的には、上記スクリーニング方法においては、例え
ば、（ｉ）と（ii）の場合における、本発明のタンパク
質等のプロテアーゼ活性（例、プロテイナーゼ活性、ペ
プチダーゼ活性など）を測定して、比較することを特徴
とするものである。

【００５１】基質としては、本発明のタンパク質等の基
質となり得るものであれば何れのものでもよい。例え
ば、カゼイン、アゾカゼイン、ＦＩＴＣ化したカゼイ
ン、放射線標識（例、¹⁴Ｃ、³Ｈなど）したカゼイン、
コラーゲン、アゾコラーゲン、ＦＩＴＣ化したコラーゲ
ン、放射線標識（例、¹⁴Ｃ、³Ｈなど）したコラーゲ
ン、またはＮ末端側に（７−メトキシクマリン−４−イ
ル）アセチル基を、さらにそれより数残基Ｃ末側にＮ³
−（２，４−ジニトロフェニル）−２，３−ジアミノプ
ロピオニル基を持ったオリゴペプチド類などが用いられ
る。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げら
れ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公
知の化合物であってもよい。上記のスクリーニング方法
を実施するには、本発明のタンパク質等を、スクリーニ
ングに適したバッファーに懸濁することにより本発明の
タンパク質等の標品を調製する。バッファーには、ｐＨ
約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッ
ファー、トリス−塩酸バッファーなどの、本発明のタン
パク質等と基質との結合を阻害しないバッファーであれ
ばいずれでもよい。本発明のタンパク質等のプロテアー
ゼ活性は、公知のＰＥＲ法〔F. T. Lundyら、エレクト
ロフォレシス（Electrophoresis）、16巻、43頁、1995
年〕に従って測定することができる。例えば、上記（i
i）の場合におけるプロテアーゼ活性等が上記（ｉ）の
場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、
より好ましくは約５０％以上上昇させる試験化合物を本
発明のタンパク質等のプロテアーゼ活性を促進する化合
物として、一方、上記（ii）の場合におけるプロテアー
ゼ活性等が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、
好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻
害する試験化合物を本発明のタンパク質等のプロテアー
ゼ活性を阻害する化合物として選択することができる。

【００５２】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有
するものである。本発明のスクリーニング用キットの例
としては、次のものが挙げられる。〔スクリーニング用試薬〕測定用緩衝液ｐＨ８.０のトリス−塩酸バッファー（塩化ナトリウ
ム、塩化カルシウム含有）タンパク質標品本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩基質カゼイン２０ｍｇ／ｍｌ検出クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色〔測定法〕本発明のタンパク質等にアミノフェニル水銀
酢酸（最終濃度１ｍＭ）を加え、３７℃、３０分間反応
させた後に、ＰＥＲ法（F. T. Lundyら、Electrophores
is、16巻、43頁、1995年）に従ってＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動（非還元）を行なった後、ポリアクリル
アミドゲルに基質を浸透させ、反応液中で３７℃、１６
時間反応させる。反応後のゲルをＣＢＢ染色することに
よってプロテアーゼ活性を測定する。

【００５３】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選ばれ
た化合物であり、本発明のタンパク質等の機能を促進ま
たは阻害する化合物である。該化合物の塩としては、前
記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられ
る。本発明のタンパク質等のプロテアーゼ活性などの機
能を促進する化合物は、例えば、糖尿病性腎症、糸球体
腎炎、肺繊維症、肝繊維症，肝硬変などの肝疾患、大理
石病、椎間板ヘルニアなどの各種疾病に対する安全で低
毒性な治療・予防剤として有用である。一方、本発明の
タンパク質等のプロテアーゼ活性などの機能を阻害する
化合物は、例えば、創傷、慢性関節リウマチ、変形性関
節炎、ガン（転移・浸潤）、肝繊維症，肝硬変などの肝
疾患、歯周病、肺繊維症、角膜潰瘍、胃潰瘍、心筋症、
動脈瘤、耳硬化症、表皮水泡症、早産、動脈硬化、敗血
症、多発性硬化症、悪液質、高カルシウム血症、白血
病、リンパ腫、糖尿病、全身性エリテマトーデスなどの
全身性自己免疫疾患、喘息、アレルギー性鼻炎やアトピ
ー性皮膚炎などの免疫疾患、外傷・火傷・急性膵炎など
による全身性炎症反応、虚血−再灌流傷害、心筋梗塞や
鬱血性心不全などの循環系疾患、臓器移植やＧＶＨＤ
（移植片対宿主反応）などの各種疾病に対する安全で低
毒性な治療・予防剤として有用である。

【００５４】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療
・予防剤として使用する場合、前述した本発明のタンパ
ク質等を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、
懸濁液剤などの製剤とすることができる。得られる製剤
は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動
物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、
ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に
対して投与することができる。該化合物またはその塩の
投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより
差異はあるが、例えば、慢性関節リウマチ治療の目的で
本発明のタンパク質等の機能を阻害する化合物を経口投
与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）にお
いては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、
好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．
０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該
化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによって
も異なるが、例えば、慢性関節リウマチ治療の目的で本
発明のタンパク質等の機能を阻害する化合物を注射剤の
形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日
につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましく
は約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜
１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。

【００５５】（３）本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩の定量本発明の抗体は、本発明のタンパク質等を特異的に認識
することができるので、被検液中の本発明のタンパク質
等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量など
に使用することができる。すなわち、本発明は、（ｉ）
本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタ
ンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標
識化された本発明のタンパク質等の割合を測定すること
を特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量
法、および（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の
抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは
連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性
を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパ
ク質等の定量法を提供する。上記（ii）の定量法におい
ては、一方の抗体が本発明のタンパク質等のＮ端部を認
識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質等のＣ
端部に反応する抗体であることが望ましい。

【００５６】また、本発明のタンパク質等に対するモノ
クローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と
称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の定
量を行なえるほか、組織染色等による本発明のタンパク
質等の検出を行なうこともできる。これらの目的には、
抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ
(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよ
い。本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質等の定量
法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中
の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗
原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的
手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を
用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、
いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリ
ー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法
が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述する
サンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を
用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放
射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いら
れる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、
〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが用いられる。上記
酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、
例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ
酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例
えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシア
ネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、
ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲ
ニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標
識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもで
きる。

【００５７】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵
素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用
いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキス
トラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ある
いはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては
不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応
させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化
担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の
本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反
応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質等の測
定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発
明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質等の結
合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すな
わち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例
えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク
質等のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗
体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する
抗体が用いられる。

【００５８】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ
／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、
前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量
を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少量の沈降
物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレ
ーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００５９】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質等の測定系を構築すればよい。これらの
一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを
参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイ
ムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江寛
編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochem
ical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochem
ical Techniques(Part B))、同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochem
ical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明の抗体を用い
ることによって、本発明のタンパク質等を感度良く定量
することができる。

【００６０】さらには、本発明の抗体を用いて本発明の
タンパク質等の濃度を定量することによって、本発明の
タンパク質の濃度の減少が検出された場合は、例えば、
糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肝繊維症、肝硬変、大理石
病、椎間板ヘルニアなどの各種疾病の可能性が高いと診
断することができる。一方、本発明のタンパク質の濃度
の増加が検出された場合は、例えば、創傷、慢性関節リ
ウマチ、変形性関節炎、ガン（転移・浸潤）、肝繊維
症，肝硬変などの肝疾患、歯周病、肺繊維症、角膜潰
瘍、胃潰瘍、心筋症、動脈瘤、耳硬化症、表皮水泡症、
早産、動脈硬化、敗血症、多発性硬化症、悪液質、高カ
ルシウム血症、白血病、リンパ腫、糖尿病、全身性エリ
テマトーデスなどの全身性自己免疫疾患、喘息、アレル
ギー性鼻炎やアトピー性皮膚炎などの免疫疾患、外傷・
火傷・急性膵炎などによる全身性炎症反応、虚血−再灌
流傷害、心筋梗塞や鬱血性心不全などの循環系疾患、臓
器移植やＧＶＨＤ（移植片対宿主反応）などの各種疾病
の可能性が高いと診断することができる。このように、
本発明の抗体は、上記疾患の診断剤として有用である。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存
在する本発明のタンパク質等を検出するために使用する
ことができる。また、本発明のタンパク質等を精製する
ために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の
本発明のタンパク質等の検出、被検細胞内における本発
明のタンパク質の挙動の分析などのために使用すること
ができる。

【００６１】（４）遺伝子診断剤本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードす
るＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出す
ることができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡ
の損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたは
ｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤と
して有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子
診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼー
ションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomic
s），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロ
シージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceeding
s ofthe Natinal Academy of Sciences of the United
States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０
頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより該ｍＲ
ＮＡの発現低下が検出された場合は、例えば、糖尿病性
腎症、糸球体腎炎、肝繊維症，肝硬変などの肝疾患、大
理石病、椎間板ヘルニアなどの疾病である、または将来
罹患する可能性が高いと診断することができる。一方、
ノーザンハイブリダイゼーションにより該ｍＲＮＡの発
現過多が検出された場合は、例えば、創傷、慢性関節リ
ウマチ、変形性関節炎、ガン（転移・浸潤）、肝繊維
症，肝硬変などの肝疾患、歯周病、肺繊維症、角膜潰
瘍、胃潰瘍、心筋症、動脈瘤、耳硬化症、表皮水泡症、
早産、動脈硬化、敗血症、多発性硬化症、悪液質、高カ
ルシウム血症、白血病、リンパ腫、糖尿病、全身性エリ
テマトーデスなどの全身性自己免疫疾患、喘息、アレル
ギー性鼻炎やアトピー性皮膚炎などの免疫疾患、外傷・
火傷・急性膵炎などによる全身性炎症反応、虚血−再灌
流傷害、心筋梗塞や鬱血性心不全などの循環系疾患、臓
器移植やＧＶＨＤ（移植片対宿主反応）などの疾病であ
る、または将来罹患する可能性が高いと診断することが
できる。また、ＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変
異が検出された場合は、例えば、創傷、慢性関節リウマ
チ、変形性関節炎、ガン（転移・浸潤）、肝繊維症，肝
硬変などの肝疾患、歯周病、肺繊維症、角膜潰瘍、胃潰
瘍、心筋症、動脈瘤、耳硬化症、表皮水泡症、早産、動
脈硬化、敗血症、多発性硬化症、悪液質、高カルシウム
血症、白血病、リンパ腫、糖尿病、全身性エリテマトー
デスなどの全身性自己免疫疾患、喘息、アレルギー性鼻
炎やアトピー性皮膚炎などの免疫疾患、外傷・火傷・急
性膵炎などによる全身性炎症反応、虚血−再灌流傷害、
心筋梗塞や鬱血性心不全などの循環系疾患、臓器移植や
ＧＶＨＤ（移植片対宿主反応）、糖尿病性腎症、糸球体
腎炎、大理石病、椎間板ヘルニアなどの疾病である、ま
たは将来罹患する可能性が高いと診断することができ
る。

【００６２】（５）アンチセンスＤＮＡ本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内にお
ける本発明のタンパク質またはＤＮＡの機能を抑制する
ことができるので、例えば、創傷、慢性関節リウマチ、
変形性関節炎、ガン（転移・浸潤）、肝繊維症，肝硬変
などの肝疾患、歯周病、肺繊維症、角膜潰瘍、胃潰瘍、
心筋症、動脈瘤、耳硬化症、表皮水泡症、早産、動脈硬
化、敗血症、多発性硬化症、悪液質、高カルシウム血
症、白血病、リンパ腫、糖尿病、全身性エリテマトーデ
スなどの全身性自己免疫疾患、喘息、アレルギー性鼻炎
やアトピー性皮膚炎などの免疫疾患、外傷・火傷・急性
膵炎などによる全身性炎症反応、虚血−再灌流傷害、心
筋梗塞や鬱血性心不全などの循環系疾患、臓器移植やＧ
ＶＨＤ（移植片対宿主反応）などの各種疾病の治療・予
防剤などの医薬として使用することができる。上記アン
チセンスＤＮＡを上記の医薬として使用する場合、前記
した本発明のＤＮＡを含有する医薬と同様にして実施す
ることができる。

【００６３】（６）本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡを有する非ヒト動物の作製本発明のＤＮＡを用いて、本発明のタンパク質等を発現
するトランスジェニック非ヒト動物を作製することがで
きる。非ヒト動物としては、哺乳動物（例えば、ラッ
ト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）（以下、動物と略記する）が挙げれる
が、特に、マウス、ウサギなどが好適である。本発明の
ＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡ
を動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合し
た遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利で
ある。例えば、ウサギ由来の本発明のＤＮＡを転移させ
る場合、これと相同性が高い動物由来のプロモーターで
あって、本発明のＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種
プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクト
を、例えば、ウサギ受精卵へマイクロインジェクション
することによって本発明のタンパク質等を高産生するＤ
ＮＡ転移動物を作出できる。このプロモーターとして
は、例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネ
イン等のユビキタスな発現プロモーターも使用すること
ができる。

【００６４】受精卵細胞段階におけるＤＮＡの転移は、
対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するよう
に確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞にお
いて本発明のタンパク質等が存在することは、作出動物
の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明の
タンパク質等を有することを意味する。遺伝子を受け継
いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の
全てに本発明のタンパク質等を有する。本発明のＤＮＡ
転移動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを
確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼
育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有
する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相
同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、こ
の雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該Ｄ
ＮＡを有するように繁殖継代することができる。本発明
のＤＮＡが転移された動物は、本発明のタンパク質等が
高発現させられているので、本発明のタンパク質等のプ
ロテアーゼ活性を促進または阻害する化合物またはその
塩のスクリーニング用の動物などとして有用である。本
発明のＤＮＡ転移動物を、組織培養のための細胞源とし
て使用することもできる。例えば、本発明のＤＮＡ転移
マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析する
か、または遺伝子により発現された本発明のタンパク質
等が存在する組織を分析することにより、本発明のタン
パク質等について分析することができる。本発明のタン
パク質等を有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、例えば、脳や末梢組織由来
のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究
することができる。また、その細胞を用いることによ
り、例えば、各種組織の機能を高めるような医薬の選択
も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこか
ら、本発明のタンパク質等を単離精製することも可能で
ある。

【００６５】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム

【００６６】Ｇｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸Ｍｅ：メチル基Ｅｔ：エチル基Ｂｕ：ブチル基Ｐｈ：フェニル基ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基

【００６７】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニルＣＨＯ：ホルミルＢｚｌ：ベンジル Cl₂Bzl ：２，６−ジクロロベンジルＢｏｍ：ベンジルオキシメチルＺ：ベンジルオキシカルボニルＣｌ−Ｚ：２−クロロベンジルオキシカルボニルＢｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニルＢｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニルＤＮＰ：ジニトロフェニルＴｒｔ：トリチルＢｕｍ：ｔ−ブトキシメチルＦｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾールＨＯＯＢｔ：３−ヒドロキシ−３,４−ジヒドロ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジンＨＯＮＢ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドＣｈａ：シクロヘキシルアラニルＡｂｕ：アミノ酪酸Ａｂｚ：２−アミノベンゾイル

【００６８】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。〔配列番号：１〕本発明のヒト肝臓由来メタロプロテア
ーゼのアミノ酸配列を示す〔図１〕。〔配列番号：２〕本発明のラット肝臓由来メタロプロテ
アーゼのアミノ酸配列を示す〔図６〕。〔配列番号：３〕本発明のヒト肝臓由来メタロプロテア
ーゼの部分ペプチドのアミノ酸配列を示す〔図２〕。配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から９７
個のアミノ酸が欠失している。〔配列番号：４〕本発明のヒト肝臓由来メタロプロテア
ーゼの部分ペプチドのアミノ酸配列を示す〔図３〕。配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から９２
個のアミノ酸が欠失している。〔配列番号：５〕本発明のラット肝臓由来メタロプロテ
アーゼの部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から９８個の
アミノ酸が欠失している。〔配列番号：６〕本発明のラット肝臓由来メタロプロテ
アーゼの部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から９３個の
アミノ酸が欠失している。

【００６９】〔配列番号：７〕配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列を有する本発明のヒト肝臓由来メタロプ
ロテアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：８〕配列番号：２で表わされるアミノ酸配
列を有する本発明のラット肝臓由来メタロプロテアーゼ
をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：９〕配列番号：３で表されるアミノ酸配列
を有する本発明のヒト肝臓由来メタロプロテアーゼの部
分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：１０〕配列番号：４で表されるアミノ酸配
列を有する本発明のヒト肝臓由来メタロプロテアーゼの
部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：１１〕配列番号：５で表されるアミノ酸配
列を有する本発明のラット肝臓由来メタロプロテアーゼ
の部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：１２〕配列番号：６で表されるアミノ酸配
列を有する本発明のラット肝臓由来メタロプロテアーゼ
の部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。

【００７０】〔配列番号：１３〕実施例１において、本
発明のヒト肝臓由来メタロプロテアーゼをコードするＤ
ＮＡのクローニングに使用した合成プライマーの塩基配
列を示す。〔配列番号：１４〕実施例１において、本発明のヒト肝
臓由来メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡのクロー
ニングに使用した合成プライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：１５〕実施例４において、本発明のヒト肝
臓由来メタロプロテアーゼの大腸菌用発現ベクターの構
築に使用した合成プライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：１６〕実施例４において、本発明のヒト肝
臓由来メタロプロテアーゼの大腸菌用発現ベクターの構
築に使用した合成プライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：１７〕実施例９において、本発明のラット
肝臓由来メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡのクロ
ーニングに使用した合成プライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：１８〕実施例９において、本発明のラット
肝臓由来メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡのクロ
ーニングに使用した合成プライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：１９〕実施例９において、本発明のラット
肝臓由来メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡのクロ
ーニングに使用した合成プライマーの塩基配列を示す。

【００７１】後述の実施例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒアコリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴ
Ｂ１９２１は、平成８年４月２２日から通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号
ＦＥＲＭＢＰ−５５１６として、平成８年４月１９日
から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ
１５９５０として寄託されている。後述の実施例９で
得られた形質転換体エシェリヒアコリ（Escherichia
coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９８２は、平成９年４月９
日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−５９０６とし
て、平成９年４月９日から財団法人・発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に寄託番号ＩＦＯ１６０７４として寄託されてい
る。

【００７２】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular cloning）に記載され
ている方法に従った。

【００７３】

【実施例１】ヒト肝臓由来メタロプロテアーゼをコード
する遺伝子のクローニングｃＤＮＡのクローニングは、ジーントラッパーポジティ
ブ選択システム（ギブコビーアールエル社）を用いて行
なった。ヒト肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（ギブコ
ビーアールエル社）を保有する大腸菌ＤＨ１２Ｓ株をTe
rrific Broth（１２ｇ/ｌ bacto−tryptone（ディフコ
社），２４ｇ/ｌ bacto−yeast extract（ディフコ
社），２.３ｇ/ｌリン酸一カリウム，１２.５ｇ/ｌリ
ン酸二カリウム）で３０℃で１６時間培養し、キアジェ
ンプラスミドキット（キアジェン社）を用いて、プラス
ミドｃＤＮＡライブラリーを精製した。精製したプラス
ミドｃＤＮＡライブラリーをＧｅｎｅII，ＥｘｏIII
（いずれもギブコビーアールエル社）によって消化し、
一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作成した。一方、プロー
ブとして、合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１３）
をｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。プ
ローブは、ＴｄＴ，ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（ギブコ
ビーアールエル社）を用いて、３'末端をビオチン化す
ることで標識した。一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを９５
℃で１分間処理した後、氷中で急冷し、ビオチン化した
プローブを加えて３７℃で１時間、室温でハイブリダイ
ゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、ジ
ーントラッパーポジティブ選択システム・マグネットビ
ーズ（ギブコビーアールエル社）を加えて、室温で２分
ごとに撹拌しながら３０分間放置した。その後、ジーン
トラッパーポジティブ選択システム・マグネットラック
（ギブコビーアールエル社）中に入れ、２分間放置し
た。上清を捨て、マグネットビーズをジーントラッパー
ポジティブ選択システム・ウオッシュバッファーで洗浄
した。このウオッシュバッファーによる洗浄を３回行な
った。その後、マグネットラックに入れて放置し、上清
を捨て、ジーントラッパーポジティブ選択システム・溶
出バッファーを加え、５分間室温で放置した。マグネッ
トラックに入れて５分間放置した後、その上清のＤＮＡ
溶液を回収した。

【００７４】取得したＤＮＡ溶液にプライマーとして合
成オリゴヌクレオチド（配列番号：１３）を入れ、９５
℃で１分間放置した。ジーントラッパーポジティブ選択
システム・修復酵素を加え、７０℃で１５分間放置して
二本鎖ＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ＤＮＡをエレ
クトロポレーション装置（バイオ・ラッド社）により、
大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入した。得られた形質転換株を
用いて２本のオリゴヌクレオチド（配列番号：１３、配
列番号：１４）をプライマーとしてコロニーＰＣＲによ
るスクリーニングを行なった。ＰＣＲにより約５１０ｂ
ｐの増幅断片が形成されたコロニーを陽性クローンとし
て１株選択した。選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽
出し、ABI PRISM Dye Terminator CycleSequencing Rea
dy Peaction Kit with AmpliTaq DNA polymerase, ＦＳ
（パーキンエルマー社）を用いて反応を行ない、３７７
ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社）により、
ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。取得したクローン
は、poly(Ａ)⁺鎖および配列番号：７で表される１５２
４個の塩基配列を含有する２２６４個の塩基配列を有し
ていた。このｃＤＮＡ断片には、配列番号：１で表され
る５０８個のアミノ酸からなる新規メタロプロテアーゼ
がコードされており、活性中心であるヒスチジン残基も
保存されていた。また、公知のヒト由来メタロプロテア
ーゼ（例、ＭＭＰ−１，ＭＭＰ−２，ＭＭＰ−３，ＭＭ
Ｐ−７，ＭＭＰ−８，ＭＭＰ−９，ＭＭＰ−１０，ＭＭ
Ｐ−１１，ＭＭＰ−１２，ＭＭＰ−１３，ＭＭＰ−１
７，ＭＴ−ＭＭＰ−１，ＭＴ−ＭＭＰ−２，ＭＴ−ＭＭ
Ｐ３）とのアミノ酸レベルでの相同性は３０〜３６％し
かなかった。本発明のヒト肝臓由来メタロプロテアーゼ
をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９２
１を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂに導入し
て、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０
Ｂ／ｐＴＢ１９２１を得た。

【００７５】

【実施例２】ヒト肝臓由来メタロプロテアーゼの一過性
発現と培養上清の調製実施例１で得たｐＴＢ１９２１はすでに発現プラスミド
ｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ（ギブコビーアールエル社）に組
み込まれており、動物細胞における発現に用いられる。
ＣＯＳ−７細胞（財団法人発酵研究所より購入）を血清
含有ＤＭＥＭ培地で培養し、遺伝子導入の前日に継代し
５０％コンフルエントとなったＣＯＳ−７細胞を血清不
含ＤＭＥＭ培地で洗浄後、２.５mlの無血清培地を添加
し、そこに５μgのｐＴＢ１９２１を含むＴＲＡＮＳＦ
ＥＣＴＡＭ（ニッポンジーン社）混合液を加えた。３７
℃，５％ＣＯ₂の条件で４時間培養した後、２０％牛血
清含有ＤＭＥＭ培地（２.５ｍｌ）を加え、さらに２０
時間培養した。血清不含ＤＭＥＭ培地に交換し、３日後
に細胞培養上清を回収した。また、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴ
ＡＭ溶液のみを加え同様の処理を行なった細胞培養上清
をコントロールとして用いた。

【００７６】

【実施例３】ＰＥＲ法によるヒト肝臓由来メタロプロテ
アーゼのメタロプロテアーゼ活性の検出実施例２で得た細胞培養上清にアミノフェニル水銀酢酸
（最終濃度１mM）を加え、３７℃，３０分間反応させた
後に、ＰＥＲ法（F. T. Lundyら、Electrophoresis、16
巻、43頁、1995年）にて活性を検出した。その結果、ｐ
ＴＢ１９２１をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の
培養上清に、コントロールの培養上清には認められない
カゼイン分解活性が認められた。また、この活性はｏ−
フェナンスロリンにより阻害された。

【００７７】

【実施例４】大腸菌発現ベクターの構築本発明のヒト肝臓由来メタロプロテアーゼをコードする
ｃＤＮＡにＳｐｈＩとＰｓｔＩ切断点を付与するため、
実施例１で得たｐＴＢ１９２１をテンプレートとし、２
種のプライマー：５'−ＣＣＣＧＣＡＴＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧ−３' （配列番号：１５）５'−ＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＣＴＴＧＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＡ −３' （配列番号：１６）を用いてＰＣＲ amplificationキット（宝酒造社製）の
プロトコールに従い、ＰＣＲ反応（９４℃で３０秒、５
５℃で３０秒、７２℃で１分、２５回）を行なった。Ｐ
ＣＲ産物をSpinBind PCR Purification System（ＦＭＣ
社製）を用いて精製後、ｐＣＲII（インビトロゲン社
製）に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。この
大腸菌よりプラスミドを抽出し、ヒト肝臓由来メタロプ
ロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列に誤りのないことを確認
した後、ＳｐｈＩとＰｓｔＩで切断し、同様に処理した
ｐＱＥ３０（キアゲン社製）とライゲーションした。ラ
イゲーション液を用いて大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社
製）を形質転換し、本発明のヒト肝臓由来メタロプロテ
アーゼを発現する大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０
９／ｐＮＨＭＢを取得した。

【００７８】

【実施例５】組換え型メタロプロテアーゼの大腸菌での
発現と精製実施例４で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＨＭＢを用
いて、本発明の組換え型ヒト肝臓由来メタロプロテアー
ゼを取得した。大腸菌での発現および精製はＱＩＡｅｘ
ｐｒｅｓｓＳｙｓｔｅｍ（キアゲン社製）添付のプロ
トコールに準じて行なった。その結果、目的の約４６ｋ
ＤａのメタロプロテアーゼはバッファーＥ（ＱＩＡｅｘ
ｐｒｅｓｓＳｙｓｔｅｍ）で溶出された。次に、分画
分子量１２０００〜１４０００の透析膜（スペクトラポ
ア社製）を用いて緩衝液〔０.２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ９.０），３ｍＭ２−メルカプトエタノール，
０.３ｍＭ２−ヒドロキシエチルジスルフィド，２Ｍ
尿素，０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００〕に対して、４
℃にて１６時間透析後、緩衝液〔０.０５ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８.０），０.１５ＭＮａＣｌ，０.１Ｍ
尿素，１ｍＭ２−メルカプトエタノール，０.１ｍＭ
２−ヒドロキシエチルジスルフィド，０.０５％Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００〕、緩衝液〔０.０５ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８.０），０.１５ＭＮａＣｌ，０.０５％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００〕に対し、４℃にて順次４
時間ずつ透析した。このようにして、８００ｍＬの大腸
菌培養液から、１８.２ｍｇの組換え型ヒト肝臓由来メ
タロプロテアーゼが取得できた。

【００７９】

【実施例６】阻害剤探索系の設定９６穴プレート（フルオロＢプレート、大日本製薬製）
に３０μＬの緩衝液〔０.２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８.０），５ｍＭＣａＣｌ₂，１００ｍＭＮａＣｌ，
１０μＭＺｎＣｌ₂〕と実施例５で得られた組換え型ヒ
ト肝臓由来メタロプロテアーゼ（２.４ｍｇ／ｍｌ）を
２０μＬ添加した。３７℃にて１０分間プレインキュベ
ーション後、１０μＭの基質〔ＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｃｈａ
−Ａｂｕ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
（Ｎ−Ｍｅ−Ａｂｚ）−ＮＨ₂，バッケム社製〕を１０
０μＬ添加することによって酵素反応を開始した。３７
℃にて１６時間反応後、マイクロプレートリーダー（Ｍ
ＴＰ−３２、コロナ電気社製）を用いて、励起波長３６
５ｎｍ、吸収波長４６０ｎｍで反応液中の蛍光強度を測
定した。無添加の場合の蛍光強度（−２０）に対し、再
生させた組換え型メタロプロテアーゼを添加した場合
は、２３０の蛍光強度を示した。この反応に各種濃度の
金属プロテアーゼの阻害剤であるアクチノニン（ペプチ
ド研究所製）を添加することによりメタロプロテアーゼ
活性が阻害され、アクチノニンは約１０μＭでこの酵素
反応を５０％阻害した。このことから、本アッセイ系を
用いて、メタロプロテアーゼ阻害剤の探索が可能である
ことを確認した。

【００８０】

【実施例７】抗メタロプロテアーゼポリクローナル抗体
の取得実施例５で得られた組換え型ヒト肝臓由来メタロプロテ
アーゼ（２００μｇ）を完全フロイントアジュバントに
懸濁し、日本白色ウサギに初回免疫を行なった。以後、
２週間毎４回、４００μｇの組換え型ヒト肝臓由来メタ
ロプロテアーゼを不完全フロイントアジュバントに懸濁
後免疫した。最終免疫の１週後に全採血することによ
り、約５０ｍｌの血清が取得できた。抗体価の測定は以
下のように行なった。組換え型ヒト肝臓由来メタロプロ
テアーゼを０.５μｇ／ウェルとなるように固定化した
後、ＢＳＡでブロッキングした９６穴プレートに、希釈
したウサギ血清を添加し、室温で２時間静置した。０.
１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄後、抗ウサ
ギＩｇＧ−パーオキシダーゼ（Capel製）を加え２時間
静置した。洗浄後、ｏ−フェニレンジアミンと過酸化水
素を含むクエン酸一リン酸緩衝液を加え、２０分間発色
させた。反応を１Ｍ硫酸で停止させた後、プレートリー
ダーを用いて４９２ｎｍの発色を測定した。その結果、
非免疫ウサギの約１万倍の抗体価を示す抗血清が得られ
た。

【００８１】

【実施例８】ヒト肝臓由来メタロプロテアーゼの昆虫細
胞での発現と抗メタロプロテアーゼ抗体を用いたウエス
タブロッティング組換えバキュロウイルスの作製と昆虫細胞での発現は、
インビトロゲン社のＢａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴｒａｎｓ
ｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて、添付のプロトコール
に従った。メタロプロテアーゼｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢ
ａｃ４（インビトロゲン社製）のＳａｃＩ、ＰｓｔＩ制
限酵素切断点に導入したプラスミドとＢａｃ−Ｎ−Ｂｌ
ｕｅ（インビトロゲン社製）ウイルスＤＮＡをＳｆ−９
昆虫細胞に導入し、細胞内で相同組換えを起こさせた。
青いプラークからメタロプロテアーゼｃＤＮＡを含む組
換えウイルスを選択し、ＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（イ
ンビトロゲン社製）に感染させた。この昆虫細胞の培養
上清を実施例７で得た抗メタロプロテアーゼ抗体を用い
てウエスタンブロッティングを行なった。なお、２次抗
体には抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼコンジ
ュゲートを、また発色試薬には５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−１−フォスフェートとニトロブルー
テトラゾリウム（いずれもプロメガ社製）を用いた。図
５に示すように、約４４Ｋｄのバンドがメタロプロテア
ーゼ発現組換えウイルスを感染させたＨｉｇｈＦｉｖｅ
細胞の培養上清にのみ認められた。以上から、実施例７
で作成した抗体は本発明のヒト肝臓由来メタロプロテア
ーゼを認識することが確認できた。

【００８２】

【実施例９】ラット肝臓由来メタロプロテアーゼをコー
ドする遺伝子のクローニング実施例１で得られたヒト肝臓由来メタロプロテアーゼを
コードするｃＤＮＡの塩基配列を基に作成した２種の合
成プライマー：５'−ＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣ−３' （配列番号：１７）５'−ＴＧＣＡＴＣＣＡＧＧＴＴＡＧＧＴＴＣ−３' （配列番号：１８）を用いて、ラット脳および肝臓ｃＤＮＡライブラリー
（ギブコ／ビーアールエル社製）を基質としてＰＣＲを
行なった。その結果、ラット肝臓由来メタロプロテアー
ゼの一部をコードする約４００ｂｐの断片が両ｃＤＮＡ
ライブラリーから増幅された。ラット脳ｃＤＮＡライブ
ラリーから得たＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩ（インビトロゲ
ン社）にサブクローンし、実施例１に記載の方法で塩基
配列を決定した。ラット由来メタロプロテアーゼをコー
ドする全長ｃＤＮＡは、この４００ｂｐの塩基配列を基
に作成した合成オリゴヌクレオチドプライマー：５'−ＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧ−３' （配列番号：１８）とラット肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーを用いて、実施
例１に記載の方法で取得した。取得したｃＤＮＡは２０
４９ｂｐであり、５１７アミノ酸からなるラット肝臓由
来メタロプロテアーゼをコードする１５５１ｂｐのオー
プンリーディングフレームとpoly(Ａ)⁺配列を含んでい
た〔図６〕。このラット肝臓由来メタロプロテアーゼ
は、アミノ酸レベルで、実施例１で得られたヒト肝臓由
来メタロプロテアーゼと８０％の相同性を示した。本発
明のラット肝臓由来メタロプロテアーゼをコードするＤ
ＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９８２を大腸菌（Es
cherichia coli）ＤＨ１０Ｂに導入して、形質転換体：
大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９８
２を得た。

【００８３】

【発明の効果】本発明のタンパク質等またはＤＮＡは、
例えば、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肺繊維症、肝繊維
症，肝硬変などの肝疾患、大理石病、椎間板ヘルニアな
どの種々の疾病の治療・予防剤などの医薬として使用す
ることができる。また、本発明のタンパク質等は、本発
明のタンパク質等のプロテアーゼ活性を促進もしくは阻
害する化合物またはその塩のスクリーニング用試薬とし
て有用である。さらに、本発明のタンパク質等に対する
抗体は、本発明のタンパク質等を特異的に認識すること
ができるので、被検液中の本発明のタンパク質等の定量
などに使用することができる。

【００８４】

【配列表】

【配列番号：１】配列の長さ：５０８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Asn Cys Gln Gln Leu Trp Leu Gly Phe Leu Leu Pro Met Thr Val 1 5 10 15 Ser Gly Arg Val Leu Gly Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Asp Tyr Leu 20 25 30 Ser Gln Tyr Gly Tyr Leu Gln Lys Pro Leu Glu Gly Ser Asn Asn Phe 35 40 45 Lys Pro Glu Asp Ile Thr Glu Ala Leu Arg Ala Phe Gln Glu Ala Ser 50 55 60 Glu Leu Pro Val Ser Gly Gln Leu Asp Asp Ala Thr Arg Ala Arg Met 65 70 75 80 Arg Gln Pro Arg Cys Gly Leu Glu Asp Pro Phe Asn Gln Lys Thr Leu 85 90 95 Lys Tyr Leu Leu Leu Gly Arg Trp Arg Lys Lys His Leu Thr Phe Arg 100 105 110 Ile Leu Asn Leu Pro Ser Thr Leu Pro Pro His Thr Ala Arg Ala Ala 115 120 125 Leu Arg Gln Ala Phe Gln Asp Trp Ser Asn Val Ala Pro Leu Thr Phe 130 135 140 Gln Glu Val Gln Ala Gly Ala Ala Asp Ile Arg Leu Ser Phe His Gly 145 150 155 160 Arg Gln Ser Ser Tyr Cys Ser Asn Thr Phe Asp Gly Pro Gly Arg Val 165 170 175 Leu Ala His Ala Asp Ile Pro Glu Leu Gly Ser Val His Phe Asp Glu 180 185 190 Asp Glu Phe Trp Thr Glu Gly Thr Tyr Arg Gly Val Asn Leu Arg Ile 195 200 205 Ile Ala Ala His Glu Val Gly His Ala Leu Gly Leu Gly His Ser Arg 210 215 220 Tyr Ser Gln Ala Leu Met Ala Pro Val Tyr Glu Gly Tyr Arg Pro His 225 230 235 240 Phe Lys Leu His Pro Asp Asp Val Ala Gly Ile Gln Ala Leu Tyr Gly 245 250 255 Lys Lys Ser Pro Val Ile Arg Asp Glu Glu Glu Glu Glu Thr Glu Leu 260 265 270 Pro Thr Val Pro Pro Val Pro Thr Glu Pro Ser Pro Met Pro Asp Pro 275 280 285 Cys Ser Ser Glu Leu Asp Ala Met Met Leu Gly Pro Arg Gly Lys Thr 290 295 300 Tyr Ala Phe Lys Gly Asp Tyr Val Trp Thr Val Ser Asp Ser Gly Pro 305 310 315 320 Gly Pro Leu Phe Arg Val Ser Ala Leu Trp Glu Gly Leu Pro Gly Asn 325 330 335 Leu Asp Ala Ala Val Tyr Ser Pro Arg Thr Gln Trp Ile His Phe Phe 340 345 350 Lys Gly Asp Lys Val Trp Arg Tyr Ile Asn Phe Lys Met Ser Pro Gly 355 360 365 Phe Pro Lys Lys Leu Asn Arg Val Glu Pro Asn Leu Asp Ala Ala Leu 370 375 380 Tyr Trp Pro Leu Asn Gln Lys Val Phe Leu Phe Lys Gly Ser Gly Tyr 385 390 395 400 Trp Gln Trp Asp Glu Leu Ala Arg Thr Asp Phe Ser Ser Tyr Pro Lys 405 410 415 Pro Ile Lys Gly Leu Phe Thr Gly Val Pro Asn Gln Pro Ser Ala Ala 420 425 430 Met Ser Trp Gln Asp Gly Arg Val Tyr Phe Phe Lys Gly Lys Val Tyr 435 440 445 Trp Arg Leu Asn Gln Gln Leu Arg Val Glu Lys Gly Tyr Pro Arg Asn 450 455 460 Ile Ser His Asn Trp Met His Cys Arg Pro Arg Thr Ile Asp Thr Thr 465 470 475 480 Pro Ser Gly Gly Asn Thr Thr Pro Ser Gly Thr Gly Ile Thr Leu Asp 485 490 495 Thr Thr Leu Ser Ala Thr Glu Thr Thr Phe Glu Tyr 500 505

【００８５】

【配列番号：２】配列の長さ：５１７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Asp Trp Gln Gln Leu Trp Leu Ala Phe Leu Leu Pro Val Thr Val 1 5 10 15 Ser Gly Arg Ala Leu Gly Pro Ala Glu Lys Glu Ala Val Val Asp Tyr 20 25 30 Leu Leu Gln Tyr Gly Tyr Leu Gln Lys Pro Leu Glu Gly Ala Asp Asp 35 40 45 Phe Arg Leu Glu Asp Ile Thr Glu Ala Leu Arg Thr Phe Gln Glu Ala 50 55 60 Ser Glu Leu Pro Val Ser Gly Gln Met Asp Asp Ala Thr Arg Ala Arg 65 70 75 80 Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Leu Glu Asp Pro Phe Asn Gln Lys Thr 85 90 95 Leu Lys Tyr Leu Leu Leu Gly His Trp Arg Lys Lys His Leu Thr Phe 100 105 110 Arg Ile Leu Asn Val Pro Ser Thr Leu Ser Pro Ser Arg Val Arg Ala 115 120 125 Ala Leu His Gln Ala Phe Lys Tyr Trp Ser Asn Val Ala Pro Leu Thr 130 135 140 Phe Arg Glu Val Lys Ala Gly Trp Ala Asp Ile Arg Leu Ser Phe His 145 150 155 160 Gly Arg Gln Ser Pro Tyr Cys Ser Asn Ser Phe Asp Gly Pro Gly Lys 165 170 175 Val Leu Ala His Ala Asp Val Pro Glu Leu Gly Ser Val His Phe Asp 180 185 190 Asn Asp Glu Phe Trp Thr Glu Gly Thr Tyr Gln Gly Val Asn Leu Arg 195 200 205 Ile Ile Ala Ala His Glu Val Gly His Ala Leu Gly Leu Gly His Ser 210 215 220 Arg Tyr Thr Gln Ala Leu Met Ala Pro Val Tyr Ala Gly Tyr Gln Pro 225 230 235 240 Tyr Phe Arg Leu His Pro Asp Asp Val Ala Gly Ile Gln Ala Leu Tyr 245 250 255 Gly Lys Arg Arg Pro Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu Glu Val Glu Met 260 265 270 His Thr Val Ser Thr Val Thr Thr Lys Pro Ser Pro Met Pro Asn Pro 275 280 285 Cys Ser Ser Glu Val Asp Ala Met Met Leu Gly Pro Arg Gly Lys Thr 290 295 300 Tyr Ala Phe Lys Gly Asp Tyr Val Trp Thr Val Thr Asp Ser Gly Pro 305 310 315 320 Gly Pro Leu Phe Arg Val Ser Ala Leu Trp Glu Gly Leu Pro Gly Asn 325 330 335 Leu Asp Ala Ala Val Tyr Ser Pro Arg Thr Gln Arg Thr His Phe Phe 340 345 350 Lys Gly Asn Lys Val Trp Arg Tyr Val Asp Phe Lys Leu Ser Pro Gly 355 360 365 Phe Pro Met Lys Leu Asn Arg Val Glu Pro Asn Leu Asp Ala Ala Leu 370 375 380 Tyr Trp Pro Val Asn Gln Lys Val Phe Leu Phe Lys Gly Ser Gly Tyr 385 390 395 400 Trp Gln Trp Asp Glu Leu Thr Arg Thr Asp Leu Ser Arg Tyr Pro Lys 405 410 415 Pro Ile Lys Glu Leu Phe Thr Gly Val Pro Asp Gln Pro Ser Ala Ala 420 425 430 Met Ser Trp Gln Asp Gly Gln Val Tyr Phe Phe Lys Gly Lys Glu Tyr 435 440 445 Trp Arg Leu Asn Gln Gln Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Pro Arg Asn 450 455 460 Thr Thr His Trp Met His Cys Ser Pro Arg Thr Pro Asp Thr Asn Ser 465 470 475 480 Leu Thr Gly Asp Val Thr Thr Pro Ala Thr Val Glu Ser Val Leu Asp 485 490 495 Val Pro Ser Ala Thr Asp Ala Ala Ser Leu Ser Ser Ser Ala Asn Val 500 505 510 Thr Leu Leu Gly Ala 515

【００８６】

【配列番号：３】配列の長さ：４１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Tyr Leu Leu Leu Gly Arg Trp Arg Lys Lys His Leu Thr Phe Arg Ile 1 5 10 15 Leu Asn Leu Pro Ser Thr Leu Pro Pro His Thr Ala Arg Ala Ala Leu 20 25 30 Arg Gln Ala Phe Gln Asp Trp Ser Asn Val Ala Pro Leu Thr Phe Gln 35 40 45 Glu Val Gln Ala Gly Ala Ala Asp Ile Arg Leu Ser Phe His Gly Arg 50 55 60 Gln Ser Ser Tyr Cys Ser Asn Thr Phe Asp Gly Pro Gly Arg Val Leu 65 70 75 80 Ala His Ala Asp Ile Pro Glu Leu Gly Ser Val His Phe Asp Glu Asp 85 90 95 Glu Phe Trp Thr Glu Gly Thr Tyr Arg Gly Val Asn Leu Arg Ile Ile 100 105 110 Ala Ala His Glu Val Gly His Ala Leu Gly Leu Gly His Ser Arg Tyr 115 120 125 Ser Gln Ala Leu Met Ala Pro Val Tyr Glu Gly Tyr Arg Pro His Phe 130 135 140 Lys Leu His Pro Asp Asp Val Ala Gly Ile Gln Ala Leu Tyr Gly Lys 145 150 155 160 Lys Ser Pro Val Ile Arg Asp Glu Glu Glu Glu Glu Thr Glu Leu Pro 165 170 175 Thr Val Pro Pro Val Pro Thr Glu Pro Ser Pro Met Pro Asp Pro Cys 180 185 190 Ser Ser Glu Leu Asp Ala Met Met Leu Gly Pro Arg Gly Lys Thr Tyr 195 200 205 Ala Phe Lys Gly Asp Tyr Val Trp Thr Val Ser Asp Ser Gly Pro Gly 210 215 220 Pro Leu Phe Arg Val Ser Ala Leu Trp Glu Gly Leu Pro Gly Asn Leu 225 230 235 240 Asp Ala Ala Val Tyr Ser Pro Arg Thr Gln Trp Ile His Phe Phe Lys 245 250 255 Gly Asp Lys Val Trp Arg Tyr Ile Asn Phe Lys Met Ser Pro Gly Phe 260 265 270 Pro Lys Lys Leu Asn Arg Val Glu Pro Asn Leu Asp Ala Ala Leu Tyr 275 280 285 Trp Pro Leu Asn Gln Lys Val Phe Leu Phe Lys Gly Ser Gly Tyr Trp 290 295 300 Gln Trp Asp Glu Leu Ala Arg Thr Asp Phe Ser Ser Tyr Pro Lys Pro 305 310 315 320 Ile Lys Gly Leu Phe Thr Gly Val Pro Asn Gln Pro Ser Ala Ala Met 325 330 335 Ser Trp Gln Asp Gly Arg Val Tyr Phe Phe Lys Gly Lys Val Tyr Trp 340 345 350 Arg Leu Asn Gln Gln Leu Arg Val Glu Lys Gly Tyr Pro Arg Asn Ile 355 360 365 Ser His Asn Trp Met His Cys Arg Pro Arg Thr Ile Asp Thr Thr Pro 370 375 380 Ser Gly Gly Asn Thr Thr Pro Ser Gly Thr Gly Ile Thr Leu Asp Thr 385 390 395 400 Thr Leu Ser Ala Thr Glu Thr Thr Phe Glu Tyr 405 410

【００８７】

【配列番号：４】配列の長さ：４１６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gln Lys Thr Leu Lys Tyr Leu Leu Leu Gly Arg Trp Arg Lys Lys His 1 5 10 15 Leu Thr Phe Arg Ile Leu Asn Leu Pro Ser Thr Leu Pro Pro His Thr 20 25 30 Ala Arg Ala Ala Leu Arg Gln Ala Phe Gln Asp Trp Ser Asn Val Ala 35 40 45 Pro Leu Thr Phe Gln Glu Val Gln Ala Gly Ala Ala Asp Ile Arg Leu 50 55 60 Ser Phe His Gly Arg Gln Ser Ser Tyr Cys Ser Asn Thr Phe Asp Gly 65 70 75 80 Pro Gly Arg Val Leu Ala His Ala Asp Ile Pro Glu Leu Gly Ser Val 85 90 95 His Phe Asp Glu Asp Glu Phe Trp Thr Glu Gly Thr Tyr Arg Gly Val 100 105 110 Asn Leu Arg Ile Ile Ala Ala His Glu Val Gly His Ala Leu Gly Leu 115 120 125 Gly His Ser Arg Tyr Ser Gln Ala Leu Met Ala Pro Val Tyr Glu Gly 130 135 140 Tyr Arg Pro His Phe Lys Leu His Pro Asp Asp Val Ala Gly Ile Gln 145 150 155 160 Ala Leu Tyr Gly Lys Lys Ser Pro Val Ile Arg Asp Glu Glu Glu Glu 165 170 175 Glu Thr Glu Leu Pro Thr Val Pro Pro Val Pro Thr Glu Pro Ser Pro 180 185 190 Met Pro Asp Pro Cys Ser Ser Glu Leu Asp Ala Met Met Leu Gly Pro 195 200 205 Arg Gly Lys Thr Tyr Ala Phe Lys Gly Asp Tyr Val Trp Thr Val Ser 210 215 220 Asp Ser Gly Pro Gly Pro Leu Phe Arg Val Ser Ala Leu Trp Glu Gly 225 230 235 240 Leu Pro Gly Asn Leu Asp Ala Ala Val Tyr Ser Pro Arg Thr Gln Trp 245 250 255 Ile His Phe Phe Lys Gly Asp Lys Val Trp Arg Tyr Ile Asn Phe Lys 260 265 270 Met Ser Pro Gly Phe Pro Lys Lys Leu Asn Arg Val Glu Pro Asn Leu 275 280 285 Asp Ala Ala Leu Tyr Trp Pro Leu Asn Gln Lys Val Phe Leu Phe Lys 290 295 300 Gly Ser Gly Tyr Trp Gln Trp Asp Glu Leu Ala Arg Thr Asp Phe Ser 305 310 315 320 Ser Tyr Pro Lys Pro Ile Lys Gly Leu Phe Thr Gly Val Pro Asn Gln 325 330 335 Pro Ser Ala Ala Met Ser Trp Gln Asp Gly Arg Val Tyr Phe Phe Lys 340 345 350 Gly Lys Val Tyr Trp Arg Leu Asn Gln Gln Leu Arg Val Glu Lys Gly 355 360 365 Tyr Pro Arg Asn Ile Ser His Asn Trp Met His Cys Arg Pro Arg Thr 370 375 380 Ile Asp Thr Thr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Thr Pro Ser Gly Thr Gly 385 390 395 400 Ile Thr Leu Asp Thr Thr Leu Ser Ala Thr Glu Thr Thr Phe Glu Tyr 405 410 415

【００８８】

【配列番号：５】配列の長さ：４１９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Tyr Leu Leu Leu Gly His Trp Arg Lys Lys His Leu Thr Phe Arg Ile 1 5 10 15 Leu Asn Val Pro Ser Thr Leu Ser Pro Ser Arg Val Arg Ala Ala Leu 20 25 30 His Gln Ala Phe Lys Tyr Trp Ser Asn Val Ala Pro Leu Thr Phe Arg 35 40 45 Glu Val Lys Ala Gly Trp Ala Asp Ile Arg Leu Ser Phe His Gly Arg 50 55 60 Gln Ser Pro Tyr Cys Ser Asn Ser Phe Asp Gly Pro Gly Lys Val Leu 65 70 75 80 Ala His Ala Asp Val Pro Glu Leu Gly Ser Val His Phe Asp Asn Asp 85 90 95 Glu Phe Trp Thr Glu Gly Thr Tyr Gln Gly Val Asn Leu Arg Ile Ile 100 105 110 Ala Ala His Glu Val Gly His Ala Leu Gly Leu Gly His Ser Arg Tyr 115 120 125 Thr Gln Ala Leu Met Ala Pro Val Tyr Ala Gly Tyr Gln Pro Tyr Phe 130 135 140 Arg Leu His Pro Asp Asp Val Ala Gly Ile Gln Ala Leu Tyr Gly Lys 145 150 155 160 Arg Arg Pro Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu Glu Val Glu Met His Thr 165 170 175 Val Ser Thr Val Thr Thr Lys Pro Ser Pro Met Pro Asn Pro Cys Ser 180 185 190 Ser Glu Val Asp Ala Met Met Leu Gly Pro Arg Gly Lys Thr Tyr Ala 195 200 205 Phe Lys Gly Asp Tyr Val Trp Thr Val Thr Asp Ser Gly Pro Gly Pro 210 215 220 Leu Phe Arg Val Ser Ala Leu Trp Glu Gly Leu Pro Gly Asn Leu Asp 225 230 235 240 Ala Ala Val Tyr Ser Pro Arg Thr Gln Arg Thr His Phe Phe Lys Gly 245 250 255 Asn Lys Val Trp Arg Tyr Val Asp Phe Lys Leu Ser Pro Gly Phe Pro 260 265 270 Met Lys Leu Asn Arg Val Glu Pro Asn Leu Asp Ala Ala Leu Tyr Trp 275 280 285 Pro Val Asn Gln Lys Val Phe Leu Phe Lys Gly Ser Gly Tyr Trp Gln 290 295 300 Trp Asp Glu Leu Thr Arg Thr Asp Leu Ser Arg Tyr Pro Lys Pro Ile 305 310 315 320 Lys Glu Leu Phe Thr Gly Val Pro Asp Gln Pro Ser Ala Ala Met Ser 325 330 335 Trp Gln Asp Gly Gln Val Tyr Phe Phe Lys Gly Lys Glu Tyr Trp Arg 340 345 350 Leu Asn Gln Gln Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Pro Arg Asn Thr Thr 355 360 365 His Trp Met His Cys Ser Pro Arg Thr Pro Asp Thr Asn Ser Leu Thr 370 375 380 Gly Asp Val Thr Thr Pro Ala Thr Val Glu Ser Val Leu Asp Val Pro 385 390 395 400 Ser Ala Thr Asp Ala Ala Ser Leu Ser Ser Ser Ala Asn Val Thr Leu 405 410 415 Leu Gly Ala

【００８９】

【配列番号：６】配列の長さ：４２４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＧｌｎＬｙｓＴｈｒＬｅｕＬｙｓＴｙｒＬｅｕＬｅｕＬｅｕ
ＧｌｙＨｉｓＴｒｐＡｒｇＬｙｓＬｙｓＨｉｓ１５
１０１５ＬｅｕＴｈｒＰｈｅＡｒｇＩｌｅＬｅｕＡｓｎＶａｌＰｒｏ
ＳｅｒＴｈｒＬｅｕＳｅｒＰｒｏＳｅｒＡｒｇ２０２５
３０ＶａｌＡｒｇＡｌａＡｌａＬｅｕＨｉｓＧｌｎＡｌａＰｈｅ
ＬｙｓＴｙｒＴｒｐＳｅｒＡｓｎＶａｌＡｌａ３５４０
４５ＰｒｏＬｅｕＴｈｒＰｈｅＡｒｇＧｌｕＶａｌＬｙｓＡｌａ
ＧｌｙＴｒｐＡｌａＡｓｐＩｌｅＡｒｇＬｅｕ５０５５
６０ＳｅｒＰｈｅＨｉｓＧｌｙＡｒｇＧｌｎＳｅｒＰｒｏＴｙｒ
ＣｙｓＳｅｒＡｓｎＳｅｒＰｈｅＡｓｐＧｌｙ６５７０
７５８０ＰｒｏＧｌｙＬｙｓＶａｌＬｅｕＡｌａＨｉｓＡｌａＡｓｐ
ＶａｌＰｒｏＧｌｕＬｅｕＧｌｙＳｅｒＶａｌ８５
９０９５ＨｉｓＰｈｅＡｓｐＡｓｎＡｓｐＧｌｕＰｈｅＴｒｐＴｈｒ
ＧｌｕＧｌｙＴｈｒＴｙｒＧｌｎＧｌｙＶａｌ１００１０５
１１０ＡｓｎＬｅｕＡｒｇＩｌｅＩｌｅＡｌａＡｌａＨｉｓＧｌｕ
ＶａｌＧｌｙＨｉｓＡｌａＬｅｕＧｌｙＬｅｕ１１５１２０
１２５ＧｌｙＨｉｓＳｅｒＡｒｇＴｙｒＴｈｒＧｌｎＡｌａＬｅｕ
ＭｅｔＡｌａＰｒｏＶａｌＴｙｒＡｌａＧｌｙ１３０１３５
１４０ＴｙｒＧｌｎＰｒｏＴｙｒＰｈｅＡｒｇＬｅｕＨｉｓＰｒｏ
ＡｓｐＡｓｐＶａｌＡｌａＧｌｙＩｌｅＧｌｎ１４５１５０
１５５１６０ＡｌａＬｅｕＴｙｒＧｌｙＬｙｓＡｒｇＡｒｇＰｒｏＧｌｕ
ＰｒｏＧｌｕＡｓｐＧｌｕＧｌｕＧｌｕＧｌｕ１６５
１７０１７５ＶａｌＧｌｕＭｅｔＨｉｓＴｈｒＶａｌＳｅｒＴｈｒＶａｌ
ＴｈｒＴｈｒＬｙｓＰｒｏＳｅｒＰｒｏＭｅｔ１８０１８５
１９０ＰｒｏＡｓｎＰｒｏＣｙｓＳｅｒＳｅｒＧｌｕＶａｌＡｓｐ
ＡｌａＭｅｔＭｅｔＬｅｕＧｌｙＰｒｏＡｒｇ１９５２００
２０５ＧｌｙＬｙｓＴｈｒＴｙｒＡｌａＰｈｅＬｙｓＧｌｙＡｓｐ
ＴｙｒＶａｌＴｒｐＴｈｒＶａｌＴｈｒＡｓｐ２１０２１５
２２０ＳｅｒＧｌｙＰｒｏＧｌｙＰｒｏＬｅｕＰｈｅＡｒｇＶａｌ
ＳｅｒＡｌａＬｅｕＴｒｐＧｌｕＧｌｙＬｅｕ２２５２３０
２３５２４０ＰｒｏＧｌｙＡｓｎＬｅｕＡｓｐＡｌａＡｌａＶａｌＴｙｒ
ＳｅｒＰｒｏＡｒｇＴｈｒＧｌｎＡｒｇＴｈｒ２４５
２５０２５５ＨｉｓＰｈｅＰｈｅＬｙｓＧｌｙＡｓｎＬｙｓＶａｌＴｒｐ
ＡｒｇＴｙｒＶａｌＡｓｐＰｈｅＬｙｓＬｅｕ２６０２６５
２７０ＳｅｒＰｒｏＧｌｙＰｈｅＰｒｏＭｅｔＬｙｓＬｅｕＡｓｎ
ＡｒｇＶａｌＧｌｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕＡｓｐ２７５２８０
２８５ＡｌａＡｌａＬｅｕＴｙｒＴｒｐＰｒｏＶａｌＡｓｎＧｌｎ
ＬｙｓＶａｌＰｈｅＬｅｕＰｈｅＬｙｓＧｌｙ２９０２９５
３００ＳｅｒＧｌｙＴｙｒＴｒｐＧｌｎＴｒｐＡｓｐＧｌｕＬｅｕ
ＴｈｒＡｒｇＴｈｒＡｓｐＬｅｕＳｅｒＡｒｇ３０５３１０
３１５３２０ＴｙｒＰｒｏＬｙｓＰｒｏＩｌｅＬｙｓＧｌｕＬｅｕＰｈｅ
ＴｈｒＧｌｙＶａｌＰｒｏＡｓｐＧｌｎＰｒｏ３２５
３３０３３５ＳｅｒＡｌａＡｌａＭｅｔＳｅｒＴｒｐＧｌｎＡｓｐＧｌｙ
ＧｌｎＶａｌＴｙｒＰｈｅＰｈｅＬｙｓＧｌｙ３４０３４５
３５０ＬｙｓＧｌｕＴｙｒＴｒｐＡｒｇＬｅｕＡｓｎＧｌｎＧｌｎ
ＬｅｕＡｒｇＶａｌＡｌａＬｙｓＧｌｙＴｙｒ３５５３６０
３６５ＰｒｏＡｒｇＡｓｎＴｈｒＴｈｒＨｉｓＴｒｐＭｅｔＨｉｓ
ＣｙｓＳｅｒＰｒｏＡｒｇＴｈｒＰｒｏＡｓｐ３７０３７５
３８０ＴｈｒＡｓｎＳｅｒＬｅｕＴｈｒＧｌｙＡｓｐＶａｌＴｈｒ
ＴｈｒＰｒｏＡｌａＴｈｒＶａｌＧｌｕＳｅｒ３８５３９０
３９５４００ＶａｌＬｅｕＡｓｐＶａｌＰｒｏＳｅｒＡｌａＴｈｒＡｓｐ
ＡｌａＡｌａＳｅｒＬｅｕＳｅｒＳｅｒＳｅｒ４０５
４１０４１５ＡｌａＡｓｎＶａｌＴｈｒＬｅｕＬｅｕＧｌｙＡｌａ４２０

【００９０】

【配列番号：７】配列の長さ：１５２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列ＡＴＧＡＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＡ
ＣＴＣＣＣＣＡＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＧＧＴＣ６０ＣＴＧＧＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣ
ＣＴＧＴＣＡＣＡＡＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＴＡＣＡＧＡＡＧ１２０ＣＣＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＴＣＴＡＡＴＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡ
ＧＡＴＡＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＴＴＴ１８０ＣＡＧＧＡＡＧＣＡＴＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＴＣＡＧ
ＣＴＧＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＣＣＧＣＡＴＧ２４０ＡＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＴＴＧＴＧＧＣＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣ
ＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＡＣＣＴＧＴＴＧ３００ＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣ
ＣＧＣＡＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＴ３６０ＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＣＧＴＣＡＡ
ＧＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＴＧＧＣＴ４２０ＣＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＧＣＧ
ＧＣＴＧＡＣＡＴＣＣＧＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣ４８０ＣＧＣＣＡＡＡＧＣＴＣＧＴＡＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＡＣＴＴＴＴＧＡＴ
ＧＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＧＣＣＣＡＴＧＣＣ５４０ＧＡＣＡＴＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＣＡＣＴＴＣＧＡＣ
ＧＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧＧＧＡＣＣ６００ＴＡＣＣＧＴＧＧＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＣ
ＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴ６６０ＧＧＧＣＡＣＴＣＣＣＧＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣ
ＣＣＡＧＴＣＴＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣ７２０ＴＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣ
ＣＡＧＧＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣＡ７８０ＧＴＧＡＴＡＡＧＧＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧ
ＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡ８４０ＧＡＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＡＴＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴ
ＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＣ９００ＣＧＴＧＧＧＡＡＧＡＣＣＴＡＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＧＧＧＡＣＴＡＴ
ＧＴＧＴＧＧＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＧＡＣＣＧ９６０ＧＧＣＣＣＣＴＴＧＴＴＣＣＧＡＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＴＴＧＧＧＡＧ
ＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴ１０２０ＧＴＣＴＡＣＴＣＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＣ
ＴＴＴＡＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＴＧＴＧＧＣＧＣＴＡＣ１０８０ＡＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧ
ＡＡＧＣＴＧＡＡＴＡＧＧＧＴＡＧＡＡＣＣＴＡＡＣＣＴＧ１１４０ＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＣＴＣＡＡＣＣＡＡＡＡＧ
ＧＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＴＡＣ１２００ＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＡＣＧＡＧＣＴＡＧＣＣＣＧＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣ
ＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＴＣＡＡＧＧＧＴ１２６０ＴＴＧＴＴＴＡＣＧＧＧＡＧＴＧＣＣＡＡＡＣＣＡＧＣＣＣＴＣＧＧＣＴ
ＧＣＴＡＴＧＡＧＴＴＧＧＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＣ１３２０ＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣ
ＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＧＴＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣ１３８０ＴＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＴＡＴＴＴＣＣＣＡＣＡＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣ
ＴＧＴＣＧＴＣＣＣＣＧＧＡＣＴＡＴＡＧＡＣＡＣＴＡＣＣ１４４０ＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＧＧＡＡＴＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＧＴＡＣＧ
ＧＧＣＡＴＡＡＣＣＴＴＧＧＡＴＡＣＣＡＣＴＣＴＣＴＣＡ１５００ＧＣＣＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＧＴＴＴＧＡＡＴＡＣ
１５２４

【００９１】

【配列番号：８】配列の長さ：１５５１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ATGGACTGGC AGCAGCTGTG GCTGGCCTTC TTACTTCCTG TGACAGTCTC AGGCCGGGCT 60 CTGGGGCCTG CAGAGAAGGA GGCGGTGGTG GATTACCTGT TGCAGTATGG GTATCTACAG 120 AAACCTCTGG AAGGAGCTGA TGACTTCAGG CTAGAAGATA TCACAGAGGC TCTAAGAACT 180 TTCCAGGAAG CATCTGAACT GCCTGTTTCC GGTCAGATGG ATGATGCCAC AAGGGCCCGT 240 ATGAAGCAGC CCCGTTGTGG CCTGGAGGAT CCTTTCAACC AGAAGACTCT GAAATACCTG 300 CTTCTGGGCC ACTGGAGAAA GAAGCACTTG ACATTCCGCA TCTTGAACGT GCCCTCCACC 360 CTCTCACCCT CCAGAGTCCG AGCAGCCCTG CATCAAGCCT TTAAGTATTG GAGCAATGTA 420 GCCCCCCTGA CCTTCCGGGA GGTGAAAGCT GGTTGGGCTG ATATCCGCCT CTCGTTCCAT 480 GGCCGCCAAA GCCCATACTG CTCCAACAGC TTTGATGGGC CTGGGAAGGT CCTGGCCCAT 540 GCTGACGTCC CAGAGCTTGG CAGTGTACAC TTCGATAACG ATGAATTCTG GACCGAGGGC 600 ACCTACCAGG GAGTGAACCT ACGCATCATT GCGGCCCATG AGGTGGGCCA CGCCCTGGGA 660 CTTGGGCATT CCCGATATAC CCAGGCACTC ATGGCGCCTG TTTACGCTGG CTACCAGCCC 720 TACTTCAGGC TGCATCCGGA TGATGTGGCA GGGATCCAGG CGCTCTATGG CAAGAGGAGG 780 CCGGAGCCAG AAGATGAGGA GGAAGAGGTG GAGATGCACA CTGTGTCAAC AGTGACCACA 840 AAACCCAGTC CCATGCCAAA CCCCTGCAGC AGTGAAGTGG ATGCCATGAT GCTAGGGCCT 900 CGGGGGAAGA CCTATGCTTT CAAGGGTGAC TATGTGTGGA CTGTAACAGA TTCAGGGCCA 960 GGGCCCTTGT TCCGAGTGTC TGCCCTTTGG GAGGGGCTTC CTGGAAACCT GGATGCTGCT 1020 GTCTACTCTC CCCGGACACA GCGGACTCAT TTCTTCAAGG GAAACAAGGT GTGGCGGTAT 1080 GTGGATTTCA AGTTGTCTCC TGGCTTTCCC ATGAAACTCA ACAGAGTGGA ACCCAACCTA 1140 GATGCAGCTC TCTATTGGCC TGTTAATCAG AAGGTGTTCC TTTTTAAGGG CTCAGGATAC 1200 TGGCAATGGG ATGAACTGAC CAGAACTGAC CTCAGTCGCT ACCCCAAACC AATCAAGGAA 1260 CTTTTCACTG GAGTGCCAGA CCAACCCTCA GCAGCTATGA GCTGGCAAGA TGGCCAAGTC 1320 TACTTCTTCA AGGGCAAAGA GTACTGGCGC CTTAACCAGC AACTTCGAGT GGCAAAGGGC 1380 TATCCCAGAA ATACGACACA CTGGATGCAC TGTAGTCCTC GGACTCCAGA CACTAACTCA 1440 TTAACTGGGG ATGTGACCAC TCCTGCAACC GTGGAATCAG TCTTGGATGT TCCCTCTGCC 1500 ACAGACGCTG CCTCCCTCTC ATCCTCAGCT AATGTCACCT TGCTAGGGGC C 1551

【００９２】

【配列番号：９】配列の長さ：１２３３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 TACCTGTTGC TGGGCCGCTG GAGAAAGAAG CACCTGACTT TCCGCATCTT GAACCTGCCC 60 TCCACCCTTC CACCCCACAC AGCCCGGGCA GCCCTGCGTC AAGCCTTCCA GGACTGGAGC 120 AATGTGGCTC CCTTGACCTT CCAAGAGGTG CAGGCTGGTG CGGCTGACAT CCGCCTCTCC 180 TTCCATGGCC GCCAAAGCTC GTACTGTTCC AATACTTTTG ATGGGCCTGG GAGAGTTCTG 240 GCCCATGCCG ACATCCCAGA GCTGGGCAGT GTGCACTTCG ACGAAGACGA GTTCTGGACT 300 GAGGGGACCT ACCGTGGGGT GAACCTGCGC ATCATTGCAG CCCATGAAGT GGGCCATGCT 360 CTGGGGCTTG GGCACTCCCG ATATTCCCAG GCCCTCATGG CCCCAGTCTA CGAGGGCTAC 420 CGGCCCCACT TTAAGCTGCA CCCAGATGAT GTGGCAGGGA TCCAGGCTCT CTATGGCAAG 480 AAGAGTCCAG TGATAAGGGA TGAGGAAGAA GAAGAGACAG AGCTGCCCAC TGTGCCCCCA 540 GTGCCCACAG AACCCAGTCC CATGCCAGAC CCTTGCAGTA GTGAACTGGA TGCCATGATG 600 CTGGGGCCCC GTGGGAAGAC CTATGCTTTC AAGGGGGACT ATGTGTGGAC TGTATCAGAT 660 TCAGGACCGG GCCCCTTGTT CCGAGTGTCT GCCCTTTGGG AGGGGCTCCC CGGAAACCTG 720 GATGCTGCTG TCTACTCGCC TCGAACACAA TGGATTCACT TCTTTAAGGG AGACAAGGTG 780 TGGCGCTACA TTAATTTCAA GATGTCTCCT GGCTTCCCCA AGAAGCTGAA TAGGGTAGAA 840 CCTAACCTGG ATGCAGCTCT CTATTGGCCT CTCAACCAAA AGGTGTTCCT CTTTAAGGGC 900 TCCGGGTACT GGCAGTGGGA CGAGCTAGCC CGAACTGACT TCAGCAGCTA CCCCAAACCA 960 ATCAAGGGTT TGTTTACGGG AGTGCCAAAC CAGCCCTCGG CTGCTATGAG TTGGCAAGAT 1020 GGCCGAGTCT ACTTCTTCAA GGGCAAAGTC TACTGGCGCC TCAACCAGCA GCTTCGAGTA 1080 GAGAAAGGCT ATCCCAGAAA TATTTCCCAC AACTGGATGC ACTGTCGTCC CCGGACTATA 1140 GACACTACCC CATCAGGTGG GAATACCACT CCCTCAGGTA CGGGCATAAC CTTGGATACC 1200 ACTCTCTCAG CCACAGAAAC CACGTTTGAA TAC 1233

【００９３】

【配列番号：１０】配列の長さ：１２４８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 CAGAAGACCC TTAAATACCT GTTGCTGGGC CGCTGGAGAA AGAAGCACCT GACTTTCCGC 60 ATCTTGAACC TGCCCTCCAC CCTTCCACCC CACACAGCCC GGGCAGCCCT GCGTCAAGCC 120 TTCCAGGACT GGAGCAATGT GGCTCCCTTG ACCTTCCAAG AGGTGCAGGC TGGTGCGGCT 180 GACATCCGCC TCTCCTTCCA TGGCCGCCAA AGCTCGTACT GTTCCAATAC TTTTGATGGG 240 CCTGGGAGAG TTCTGGCCCA TGCCGACATC CCAGAGCTGG GCAGTGTGCA CTTCGACGAA 300 GACGAGTTCT GGACTGAGGG GACCTACCGT GGGGTGAACC TGCGCATCAT TGCAGCCCAT 360 GAAGTGGGCC ATGCTCTGGG GCTTGGGCAC TCCCGATATT CCCAGGCCCT CATGGCCCCA 420 GTCTACGAGG GCTACCGGCC CCACTTTAAG CTGCACCCAG ATGATGTGGC AGGGATCCAG 480 GCTCTCTATG GCAAGAAGAG TCCAGTGATA AGGGATGAGG AAGAAGAAGA GACAGAGCTG 540 CCCACTGTGC CCCCAGTGCC CACAGAACCC AGTCCCATGC CAGACCCTTG CAGTAGTGAA 600 CTGGATGCCA TGATGCTGGG GCCCCGTGGG AAGACCTATG CTTTCAAGGG GGACTATGTG 660 TGGACTGTAT CAGATTCAGG ACCGGGCCCC TTGTTCCGAG TGTCTGCCCT TTGGGAGGGG 720 CTCCCCGGAA ACCTGGATGC TGCTGTCTAC TCGCCTCGAA CACAATGGAT TCACTTCTTT 780 AAGGGAGACA AGGTGTGGCG CTACATTAAT TTCAAGATGT CTCCTGGCTT CCCCAAGAAG 840 CTGAATAGGG TAGAACCTAA CCTGGATGCA GCTCTCTATT GGCCTCTCAA CCAAAAGGTG 900 TTCCTCTTTA AGGGCTCCGG GTACTGGCAG TGGGACGAGC TAGCCCGAAC TGACTTCAGC 960 AGCTACCCCA AACCAATCAA GGGTTTGTTT ACGGGAGTGC CAAACCAGCC CTCGGCTGCT 1020 ATGAGTTGGC AAGATGGCCG AGTCTACTTC TTCAAGGGCA AAGTCTACTG GCGCCTCAAC 1080 CAGCAGCTTC GAGTAGAGAA AGGCTATCCC AGAAATATTT CCCACAACTG GATGCACTGT 1140 CGTCCCCGGA CTATAGACAC TACCCCATCA GGTGGGAATA CCACTCCCTC AGGTACGGGC 1200 ATAACCTTGG ATACCACTCT CTCAGCCACA GAAACCACGT TTGAATAC 1248

【００９４】

【配列番号：１１】配列の長さ：１２５７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 TACCTGCTTC TGGGCCACTG GAGAAAGAAG CACTTGACAT TCCGCATCTT GAACGTGCCC 60 TCCACCCTCT CACCCTCCAG AGTCCGAGCA GCCCTGCATC AAGCCTTTAA GTATTGGAGC 120 AATGTAGCCC CCCTGACCTT CCGGGAGGTG AAAGCTGGTT GGGCTGATAT CCGCCTCTCG 180 TTCCATGGCC GCCAAAGCCC ATACTGCTCC AACAGCTTTG ATGGGCCTGG GAAGGTCCTG 240 GCCCATGCTG ACGTCCCAGA GCTTGGCAGT GTACACTTCG ATAACGATGA ATTCTGGACC 300 GAGGGCACCT ACCAGGGAGT GAACCTACGC ATCATTGCGG CCCATGAGGT GGGCCACGCC 360 CTGGGACTTG GGCATTCCCG ATATACCCAG GCACTCATGG CGCCTGTTTA CGCTGGCTAC 420 CAGCCCTACT TCAGGCTGCA TCCGGATGAT GTGGCAGGGA TCCAGGCGCT CTATGGCAAG 480 AGGAGGCCGG AGCCAGAAGA TGAGGAGGAA GAGGTGGAGA TGCACACTGT GTCAACAGTG 540 ACCACAAAAC CCAGTCCCAT GCCAAACCCC TGCAGCAGTG AAGTGGATGC CATGATGCTA 600 GGGCCTCGGG GGAAGACCTA TGCTTTCAAG GGTGACTATG TGTGGACTGT AACAGATTCA 660 GGGCCAGGGC CCTTGTTCCG AGTGTCTGCC CTTTGGGAGG GGCTTCCTGG AAACCTGGAT 720 GCTGCTGTCT ACTCTCCCCG GACACAGCGG ACTCATTTCT TCAAGGGAAA CAAGGTGTGG 780 CGGTATGTGG ATTTCAAGTT GTCTCCTGGC TTTCCCATGA AACTCAACAG AGTGGAACCC 840 AACCTAGATG CAGCTCTCTA TTGGCCTGTT AATCAGAAGG TGTTCCTTTT TAAGGGCTCA 900 GGATACTGGC AATGGGATGA ACTGACCAGA ACTGACCTCA GTCGCTACCC CAAACCAATC 960 AAGGAACTTT TCACTGGAGT GCCAGACCAA CCCTCAGCAG CTATGAGCTG GCAAGATGGC 1020 CAAGTCTACT TCTTCAAGGG CAAAGAGTAC TGGCGCCTTA ACCAGCAACT TCGAGTGGCA 1080 AAGGGCTATC CCAGAAATAC GACACACTGG ATGCACTGTA GTCCTCGGAC TCCAGACACT 1140 AACTCATTAA CTGGGGATGT GACCACTCCT GCAACCGTGG AATCAGTCTT GGATGTTCCC 1200 TCTGCCACAG ACGCTGCCTC CCTCTCATCC TCAGCTAATG TCACCTTGCT AGGGGCC 1257

【００９５】

【配列番号：１２】配列の長さ：１２７２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 CAGAAGACTC TGAAATACCT GCTTCTGGGC CACTGGAGAA AGAAGCACTT GACATTCCGC 60 ATCTTGAACG TGCCCTCCAC CCTCTCACCC TCCAGAGTCC GAGCAGCCCT GCATCAAGCC 120 TTTAAGTATT GGAGCAATGT AGCCCCCCTG ACCTTCCGGG AGGTGAAAGC TGGTTGGGCT 180 GATATCCGCC TCTCGTTCCA TGGCCGCCAA AGCCCATACT GCTCCAACAG CTTTGATGGG 240 CCTGGGAAGG TCCTGGCCCA TGCTGACGTC CCAGAGCTTG GCAGTGTACA CTTCGATAAC 300 GATGAATTCT GGACCGAGGG CACCTACCAG GGAGTGAACC TACGCATCAT TGCGGCCCAT 360 GAGGTGGGCC ACGCCCTGGG ACTTGGGCAT TCCCGATATA CCCAGGCACT CATGGCGCCT 420 GTTTACGCTG GCTACCAGCC CTACTTCAGG CTGCATCCGG ATGATGTGGC AGGGATCCAG 480 GCGCTCTATG GCAAGAGGAG GCCGGAGCCA GAAGATGAGG AGGAAGAGGT GGAGATGCAC 540 ACTGTGTCAA CAGTGACCAC AAAACCCAGT CCCATGCCAA ACCCCTGCAG CAGTGAAGTG 600 GATGCCATGA TGCTAGGGCC TCGGGGGAAG ACCTATGCTT TCAAGGGTGA CTATGTGTGG 660 ACTGTAACAG ATTCAGGGCC AGGGCCCTTG TTCCGAGTGT CTGCCCTTTG GGAGGGGCTT 720 CCTGGAAACC TGGATGCTGC TGTCTACTCT CCCCGGACAC AGCGGACTCA TTTCTTCAAG 780 GGAAACAAGG TGTGGCGGTA TGTGGATTTC AAGTTGTCTC CTGGCTTTCC CATGAAACTC 840 AACAGAGTGG AACCCAACCT AGATGCAGCT CTCTATTGGC CTGTTAATCA GAAGGTGTTC 900 CTTTTTAAGG GCTCAGGATA CTGGCAATGG GATGAACTGA CCAGAACTGA CCTCAGTCGC 960 TACCCCAAAC CAATCAAGGA ACTTTTCACT GGAGTGCCAG ACCAACCCTC AGCAGCTATG 1020 AGCTGGCAAG ATGGCCAAGT CTACTTCTTC AAGGGCAAAG AGTACTGGCG CCTTAACCAG 1080 CAACTTCGAG TGGCAAAGGG CTATCCCAGA AATACGACAC ACTGGATGCA CTGTAGTCCT 1140 CGGACTCCAG ACACTAACTC ATTAACTGGG GATGTGACCA CTCCTGCAAC CGTGGAATCA 1200 GTCTTGGATG TTCCCTCTGC CACAGACGCT GCCTCCCTCT CATCCTCAGC TAATGTCACC 1260 TTGCTAGGGG CC 1272

【００９６】

【配列番号：１３】配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GCTGACATCC GCCTCTCCTT 20

【００９７】

【配列番号：１４】配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＧＧＧＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧ２
０

【００９８】

【配列番号：１５】配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＣＣＣＧＣＡＴＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧ
ＣＣＧＣＴＧ

【００９９】

【配列番号：１６】配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 AAGCTGCAGA TCTACGGTCT TGCGCCTGCT ACA

【０１００】

【配列番号：１７】配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣ
１９

【０１０１】

【配列番号：１８】配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＴＧＣＡＴＣＣＡＧＧＴＴＡＧＧＴＴＣ
１８

【０１０２】

【配列番号：１９】配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GCCGGAGCCA GAAGATGAGG 20

【０１０３】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のヒト肝臓由来メタロプロテアーゼのア
ミノ酸配列を示す。

【図２】本発明のヒト肝臓由来メタロプロテアーゼの部
分ペプチドのアミノ酸配列を示す。図１に示したアミノ
酸配列のＮ末端から９７個のアミノ酸が欠失したアミノ
酸配列である。

【図３】本発明のヒト肝臓由来メタロプロテアーゼの部
分ペプチドのアミノ酸配列を示す。図１に示したアミノ
酸配列のＮ末端から９２個のアミノ酸が欠失したアミノ
酸配列である。

【図４】本発明のヒト肝臓由来メタロプロテアーゼをコ
ードするＤＮＡを含むＤＮＡの塩基配列を示す。

【図５】本発明のヒト肝臓由来メタロプロテアーゼと抗
ヒト肝臓由来メタロプロテアーゼ抗体を用いてウエスタ
ンブロッティングを行なった時の電気泳動写真を示す。
横軸は各サンプル番号を示し、レーン１は分子量マーカ
ーを、レーン２は非感染のＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞の培養
上清を、レーン３はβ−ガラクトシダーゼ発現組換えウ
イルス（インビトロゲン社製）を感染させたＨｉｇｈＦ
ｉｖｅ細胞の培養上清を、レーン４はヒト肝臓由来メタ
ロプロテアーゼ発現組換えウイルスを感染させたＨｉｇ
ｈＦｉｖｅ細胞の培養上清を示す。縦軸は泳動距離（ｃ
ｍ）を示す。

【図６】本発明のラット肝臓由来メタロプロテアーゼの
アミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡを含むＤＮ
Ａの塩基配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＢＬＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＭＡＢＭＡＢＮＡＢＮＡＢＳＡＢＳＡＢＸＡＢＸＡＣＢＡＣＢＡＣＤＡＣＤＡＣＫＡＣＫＡＣＬＡＣＬＡＣＳＡＣＳＡＣＶＡＣＶＡＤＡＡＤＡＡＤＤＡＤＤＡＤＰＡＤＰＡＤＴＡＤＴＡＤＵＡＤＵＡＤＶＡＤＶＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/50 9/50 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ａ６１Ｋ 37/54 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタン
パク質またはその塩。
【請求項２】配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を
有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】メタロプロテアーゼである請求項１記載の
タンパク質。
【請求項４】請求項１記載のタンパク質の部分ペプチド
またはその塩。
【請求項５】請求項１記載のタンパク質をコードする塩
基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項６】配列番号：７で表わされる塩基配列を有す
る請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】配列番号：８で表わされる塩基配列を有す
る請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項８】請求項５記載のＤＮＡを含有する組換えベ
クター。
【請求項９】請求項８記載の組換えベクターを保持する
形質転換体。
【請求項１０】請求項９記載の形質転換体を培養し、請
求項１記載のタンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採
取することを特徴とする請求項１記載のタンパク質また
はその塩の製造方法。
【請求項１１】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる医
薬。
【請求項１２】糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肝繊維症、
肺繊維症、肝硬変、大理石病または椎間板ヘルニアの治
療・予防剤である請求項１１記載の医薬。
【請求項１３】請求項５記載のＤＮＡを含有してなる医
薬。
【請求項１４】糖尿病性腎症、糸球体腎炎、肝繊維症、
肺繊維症、肝硬変、大理石病または椎間板ヘルニアの治
療・予防剤である請求項１３記載の医薬。
【請求項１５】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体。
【請求項１６】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴
とする請求項１記載のタンパク質、請求項４記載の部分
ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方
法。
【請求項１７】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる請求
項１記載のタンパク質、請求項４記載の部分ペプチドま
たはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促進または阻害す
る化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１８】請求項１６記載のスクリーニング方法ま
たは請求項１７記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる、請求項１記載のタンパク質、請求項４記載の
部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促
進または阻害する化合物またはその塩。
【請求項１９】請求項１６記載のスクリーニング方法ま
たは請求項１７記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる、請求項１記載のタンパク質、請求項４記載の
部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性を阻
害する化合物またはその塩を含有してなる医薬。