JPH09322783A

JPH09322783A - 新規タンパク質およびそのｄｎａ

Info

Publication number: JPH09322783A
Application number: JP9086170A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Nishi; 一紀西; Tomohiro Kawamoto; 朋広河本; Yasushi Shintani; 靖新谷
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-04-05
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 1997-12-16

Abstract

(57)【要約】【課題】新規カルパインの提供。【解決手段】新規カルパインタンパク質もしくはその部
分ペプチド、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを含有する組換えベクター、形質転換体、該タンパク
質の製造法、該タンパク質もしくはＤＮＡ含有してなる
医薬、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質のプロ
テアーゼ活性を促進または阻害する化合物のスクリーニ
ング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物。【効果】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、
癌、脳卒中、脳梗塞、クモ膜下出血、アルツハイマー
病、筋ジストロフィー、白内障、虚血性心疾患、動脈硬
化症、関節炎、膠原病などの種々の疾病の治療・予防剤
として使用することができる。本発明の抗体は、被検液
中の本発明のタンパク質の定量などに使用することがで
きる。本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の機
能を促進もしくは阻害する化合物またはその塩のスクリ
ーニングのための試薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カルシウム依存性
中性プロテアーゼであるカルパイン等の活性を示す新規
タンパク質に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内反応の実質的な担い手であるタン
パク質は、生合成されて直ちに機能するものばかりでな
く、必要に応じて活性を発現させたり消失させたりする
調節機能が存在する。これらのタンパク質の質的変化は
通常、種々の翻訳後修飾（例えば、リン酸化修飾や脂質
修飾）や他の分子との相互作用（例えば、サブユニット
や内在性阻害因子との結合）により秩序正しく行われて
いる。従って、これらタンパク質の機能の調節が乱れる
と種々の疾患の原因となり、さらには細胞、組織の死へ
と至る。こうした制御を司る調節タンパク質として、細
胞質内にあって細胞内構成タンパク質に直接作用できる
プロテアーゼが注目されている（トレンド・イン・バイ
オロジカル・サイエンス, 14，268-271（1989））。カ
ルパインは、システインプロテアーゼに属する細胞内プ
ロテアーゼの一つであり、細胞機能の主要調節因子であ
るＣａ²⁺によりその活性が制御されるため、情報伝達を
介した細胞機能の変化に関与していると考えられてい
る。カルパインは、初期の研究において、ニワトリや多
くの哺乳動物から発見され、その活性発現に必要なＣａ
²⁺濃度の差異と相同性比較からμ−カルパイン、ｍ−カ
ルパインという二つの分子種に分類されてきた。しか
し、最近、線虫やショウジョウバエなど進化的に脊椎動
物から遠く離れた動物でも複数のカルパイン分子種の存
在（例えば、ショウジョウバエのｓｏｌやＣａｌｐＡ、
線虫のＣｅ−ＣＬ２やＣｅ−ＣＬ３）が報告されている
とともに、高等脊椎動物において組織特異的カルパイン
の存在も明らかになってきた。例えば、ｐ９４（ｎＣＬ
−１）はヒト，ラット，ニワトリの骨格筋に特異的に存
在するカルパインであり、またｎＣＬ−２およびｎＣＬ
−２'はラットにおいて発見され、胃で最も強く発現す
るカルパインである。このように、カルパインはファミ
リーを形成していることが明らかになってきた。一般
に、多くの情報伝達系酵素（例えばプロテインキナーゼ
ＣやＭＡＰキナーゼ）には多様な情報伝達を実行可能に
すべく多種の分子種が存在することが知られており、カ
ルパインを上記に述べたようなモジュレータータンパク
質として考えるとき、さらに多くの分子種が存在すると
考えられる。ヒトでは、脊椎動物に普遍的に存在するμ
−カルパインおよびｍ−カルパインと、骨格筋に特異的
に発現するｐ９４（ｎＣＬ−１）が知られているにすぎ
ない。

【０００３】

【本発明が解決しようとする課題】新たなカルパインタ
ンパク質の単離は、Ｃａ²⁺を介した情報伝達系へのカル
パインの関与、また臓器特異的に発現していれば臓器別
各種疾患とカルパインとの関連について、一層詳細な究
明を可能にし、新たなカルパインに対して阻害活性ある
いは促進活性を発揮し、種々の疾患の予防や治療に役立
つ新たな医薬品の開発ができる。このように、本発明の
分野では、ヒト由来の新規カルパインを見いだし、大量
に産生する方法の開発が望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト白血球
由来ｃＤＮＡライブラリーから、新規な塩基配列を有す
るｃＤＮＡをクローニングすることに成功し、それにコ
ードされるタンパク質がカルパインであることを見いだ
した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに
検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩、
（２）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する
第（１）項記載のタンパク質、（３）ヒト型カルパイン
である第（１）項記載のタンパク質、（４）第（１）項
記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、（５）
第（１）項記載のタンパク質をコードする塩基配列を有
するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（６）配列番号：５また
は配列番号：６で表わされる塩基配列を有する第（５）
項記載のＤＮＡ、（７）第（５）項記載のＤＮＡを含有
する組換えベクター、（８）第（７）項記載の組換えベ
クターを保持する形質転換体、（９）第（８）項記載の
形質転換体を培養し、第（１）項記載のタンパク質を生
成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする第
（１）項記載のタンパク質またはその塩の製造方法、
（１０）第（５）項記載のＤＮＡを含有してなる医薬、
（１１）腫瘍、脳卒中、脳梗塞、クモ膜下出血、アルツ
ハイマー病、筋ジストロフィー、白内障、虚血性心疾
患、動脈硬化、関節炎または膠原病の治療・予防剤であ
る第（１０）項記載の医薬、（１２）第（１）項記載の
タンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれ
らの塩に対する抗体、（１３）第（１）項記載のタンパ
ク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩
を用いることを特徴とする第（１）項記載のタンパク
質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の
プロテアーゼ活性を促進または阻害する化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法、（１４）第（１）項記載の
タンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれ
らの塩を含有してなる第（１）項記載のタンパク質、第
（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテ
アーゼ活性を促進または阻害する化合物またはその塩の
スクリーニング用キット、および（１５）第（１３）項
記載のスクリーニング方法または第（１４）項記載のス
クリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記
載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたは
それらの塩のプロテアーゼ活性を促進または阻害する化
合物またはその塩、

【０００６】さらには、本発明は、（１６）配列番号：
５または配列番号：６で表わされる塩基配列とハイスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を
有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（１７）第（１６）項
記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、（１８）第
（１７）項記載の組換えベクターを保持する形質転換
体、（１９）第（１８）項記載の形質転換体を培養し、
タンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とするタンパク質またはその塩の製造方法、（２
０）第（１９）項記載の製造法で製造され得るタンパク
質またはその塩、（２１）第（１）項記載のタンパク
質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩含
有してなる医薬、（２２）腫瘍、脳卒中、脳梗塞、クモ
膜下出血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、白内
障、虚血性心疾患、動脈硬化、関節炎または膠原病の治
療・予防剤である第（２１）項記載の医薬、（２３）
（ｉ）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の
部分ペプチドまたはそれらの塩に基質を接触させた場合
と（ii）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載
の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質および試験化合
物を接触させた場合における、第（１）項記載のタンパ
ク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩
のプロテアーゼ活性を測定して、比較することを特徴と
する第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部
分ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促進
または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方
法、

【０００７】（２４）第（１３）項または第（２３）項
記載のスクリーニング方法または第（１４）項記載のス
クリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記
載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたは
それらの塩のプロテアーゼ活性を促進する化合物または
その塩を含有してなる医薬、（２５）抗腫瘍剤である第
（２４）項記載の医薬、（２６）第（１３）項または第
（２３）項記載のスクリーニング方法または第（１４）
項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第
（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプ
チドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性を阻害する化
合物またはその塩を含有してなる医薬、（２７）脳卒
中、脳梗塞、クモ膜下出血、アルツハイマー病、筋ジス
トロフィー、白内障、虚血性心疾患、動脈硬化、関節炎
または膠原病の治療・予防剤である第（２６）項記載の
医薬、（２８）第（１２）項記載の抗体と、被検液およ
び標識化された第（１）項記載のタンパク質、第（４）
項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩とを競合的に反
応させ、該抗体に結合した標識化された第（１）項記載
のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそ
れらの塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の
第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペ
プチドまたはそれらの塩の定量法、および（２９）被検
液と担体上に不溶化した第（１２）項記載の抗体および
標識化された第（１２）項記載の抗体とを同時あるいは
連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性
を測定することを特徴とする被検液中の第（１）項記載
のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそ
れらの塩の定量法を提供する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質と
称する）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラ
ット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経
細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウ
ム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内
皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免
疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュ
ラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸
球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨
芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細
胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン
細胞など）またはそれらの細胞が存在するあらゆる組
織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳
基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小
脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、
甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管
（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下
腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関
節、骨格筋などや、ヒト由来株化細胞（例えば、ＭＥ
Ｌ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，Ｈ
Ｌ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬ
Ｔ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−Ｃ
ＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ
−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ
−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ
−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）など
に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質
であってもよい。

【０００９】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約
９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を
有するアミノ酸配列などが挙げられ、特に、タンパク
質の構成アミノ酸配列として配列番号：３または（およ
び）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を含有し、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約８５％以
上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５
％以上の相同性を有するアミノ酸配列、タンパク質の
構成アミノ酸配列として配列番号：３または（および）
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を含有し、配列
番号：２で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好
ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上
の相同性を有するアミノ酸配列などが好ましい。本発明
の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同
一のアミノ酸配列を有するタンパク質としては、例え
ば、前記した配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に
同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。実質的
に同質の活性としては、例えば、プロテアーゼ活性
（例、プロテイナーゼ活性、ペプチダーゼ活性など）や
Ｃａ²⁺結合活性などが挙げられる。実質的に同質とは、
それらの活性が性質的に同質であることを示す。したが
って、プロテアーゼ活性やＣａ²⁺結合活性などの活性が
同等（例、約０．１〜１００倍、好ましくは約０．５〜
１０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが
好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量
などの量的要素は異なっていてもよい。プロテアーゼ活
性やＣａ²⁺結合活性などの活性の測定は、自体公知の方
法に準じて行なうことができるが、例えば、後述するス
クリーニング方法に従って測定することができる。

【００１０】また、本発明のタンパク質としては、例え
ば、配列番号：１または配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３
０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ま
しくは、数個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
配列番号：１または配列番号：２で表わされるアミノ酸
配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程
度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましく
は、数個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列
番号：１または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列
中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、
より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは、数
個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配
列、またはそれらを組み合わせてなるアミノ酸配列を
含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれ
る。上記のようにアミノ酸配列が欠失または置換されて
いる場合、その欠失または置換の位置としては、特に限
定されないが、例えば、配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列のうち、第９８番目〜１０５番目のアミノ酸配
列（すなわち、配列番号：３で表わされるアミノ酸配
列）以外の位置または第２６２番目〜２８６番目のアミ
ノ酸配列（すなわち、配列番号：４で表わされるアミノ
酸配列）以外の位置などが挙げられる。上記のようにア
ミノ酸配列が付加されている場合、具体的には、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列のＮ末端にさらに９個
のアミノ酸が付加した、配列番号：２で表わされるアミ
ノ酸配列などが用いられる。

【００１１】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめ
とする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキ
シル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯ
Ｏ^-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）または
エステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステ
ルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ
_1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキ
シルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ
_1-2アルキル基などのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口
用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエ
ステルなどが用いられる。本発明のタンパク質がＣ末端
以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有
している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステ
ル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。
この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端の
エステルなどが用いられる。さらに、本発明のタンパク
質には、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基
（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_1-6アシル
基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生
成するＮ末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化し
たもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯ
Ｈ、ＣＯＯＨ、ＮＨ₂、ＳＨなどが適当な保護基（例え
ば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_1-6アシル基な
ど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したい
わゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれ
る。本発明のタンパク質の具体例としては、ヒト型カル
パイン、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を含有するヒト白血球由来のタンパク質、配列番号：
２で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト白血球由来
のタンパク質などが用いられる〔図１〕。

【００１２】本発明の部分ペプチドとしては、前記した
本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、本発明の
タンパク質と実質的に同質の活性（例、プロテアーゼ活
性など）を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち
少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに
好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、
最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、プ
ロテアーゼ活性を有するペプチドなどが用いられる。本
発明の部分ペプチドの具体例としては、例えば、本発明
の配列番号：３または（および）配列番号：４で表わさ
れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
配列を有し、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有す
るペプチドなどが好ましい。配列番号：３または（およ
び）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と実質的に
同一のアミノ酸配列とは、配列番号：３または（およ
び）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と約８５％
以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５
％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。ここで、
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列は配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列の第９８番目のＣｙｓ〜第１
０５番目のＣｙｓまでのアミノ酸配列を示し、配列番
号：４で表わされるアミノ酸配列は配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列の第２６２番目のＨｉｓ〜第２８６
番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列を示す。両アミノ酸配
列は、本発明のタンパク質の活性中心部位のアミノ酸配
列を示す。

【００１３】ここで、「実質的に同質の活性」とは前記
と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は前記
と同様に行なうことができる。また、本発明の部分ペプ
チドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ま
しくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個）のア
ミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または
２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましく
は１〜１０個程度、さらに好ましくは数個）のアミノ酸
が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個
以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数
個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されていてもよい。また、本発明の部分
ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）
またはカルボキシレート(−ＣＯＯ^-）であるが、前記し
た本発明のタンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−Ｃ
ＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよ
い。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発
明のタンパク質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のア
ミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内
で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン化し
たもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保
護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したい
わゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。

【００１４】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加
塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例
えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、ある
いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマ
ル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リン
ゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンス
ルホン酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク
質またはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞また
は組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製
造することもできるし、後述するタンパク質をコードす
るＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって
も製造することができる。また、後述のペプチド合成法
に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の組織
または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織ま
たは細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行な
い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わ
せることにより精製単離することができる。

【００１５】本発明のタンパク質、その部分ペプチドも
しくはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成には、
通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセト
アミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocア
ミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の
配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で
縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出
すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で
分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタン
パク質またはそれらのアミド体を取得する。上記した保
護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用で
きる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カ
ルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DC
C、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-
(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用
いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤
（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹
脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステ
ルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ
酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができ
る。

【００１６】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十
分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十
分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチ
ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化す
ることができる。

【００１７】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキ
シカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホ
ルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニル
ホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキ
シル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、
シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シ
クロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状
もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステ
ル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジル
エステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロ
ベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェ
ナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジ
ド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、
トリチルヒドラジド化などによって保護することができ
る。セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエー
テル化によって保護することができる。このエステル化
に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル
化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、t-ブチル基などである。チロシンのフ
ェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl₂
-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチル
などが用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基
としては、例えば、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチ
ルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、B
um、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。

【００１８】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対
応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、例えば、Ｐｄ黒あるいはＰｄ-炭素
などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、ま
た、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロ
メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの
混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミ
ン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどに
よる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる
還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、
一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処
理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオ
アニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチ
ルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチ
オールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効であ
る。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用い
られる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理に
より除去され、トリプトファンのインドール保護基とし
て用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオー
ル、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。

【００１９】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。

【００２０】本発明のタンパク質の部分ペプチドまたは
その塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、ある
いは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断す
ることによって製造することができる。ペプチドの合成
法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれ
によっても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成
し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮
合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離す
ることにより目的のペプチドを製造することができる。
公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下
の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合
成、広川書店また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な
塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。

【００２１】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基
配列を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、
前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組
織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれで
もよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリ
オファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなど
いずれであってもよい。また、前記した細胞・組織より
totalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用い
て直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain React
ion（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅す
ることもできる。本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａとしては、例えば、配列番号：５で表わされる塩基
配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５で表わされ
る塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性
（例、プロテアーゼ活性、Ｃａ²⁺結合活性などの活性）
を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または配列
番号：６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、また
は配列番号：６で表わされる塩基配列とハイストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパ
ク質と実質的に同質の活性（例、プロテアーゼ活性、Ｃ
ａ²⁺結合活性などの活性）を有するタンパク質をコード
するＤＮＡであれば何れのものでもよい。

【００２２】配列番号：５または配列番号：６で表わさ
れる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、
例えば、配列番号：５で表わされる塩基配列と約７０
％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約
９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有
する塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：６で表わ
される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以
上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約
９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ
などが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公
知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sa
mbrook etal., Cold Spring Harbor Lab. Press, 198
9）に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好
ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なう
ことができる。ハイストリンジェントな条件とは、例え
ば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約
１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは
約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が
約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。よ
り具体的には、配列番号：１のアミノ酸配列を含有する
タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５
で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが、配列番
号：２のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードす
るＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡなどが用いられる〔図１〕。

【００２３】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：５で表わされる塩基配
列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、また
は配列番号：５で表わされる塩基配列とハイストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパ
ク質と同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａの部分塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：６で表
わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有す
るＤＮＡ、または配列番号：６で表わされる塩基配列と
ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩
基配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列
を有するタンパク質と同質の活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが
用いられる。

【００２４】より具体的には、本発明の部分ペプチドを
コードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７で
表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：
７で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする塩基配列を有し、前記の本発明
のタンパク質と同質の活性を有する部分ペプチドをコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：８で表わ
される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：８で
表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズする塩基配列を有し、前記の本発明のタ
ンパク質と同質の活性を有する部分ペプチドをコードす
る塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリ
ダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条
件は前記と同様のものが用いられる。より具体的には、
配列番号：３で表わすアミノ酸配列を有する部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７で表わさ
れる塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡが、配列
番号：４で表わすアミノ酸配列を有する部分ペプチドを
コードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる
塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどが用いら
れる。

【００２５】本発明のタンパク質または部分ペプチド
（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）を
完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段として
は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基
配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法に
よって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだ
ＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコ
ードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識し
たものとのハイブリダイゼーションによって選別するこ
とができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例え
ば、モレキュラー・クローニング（Molecular Clonin
g）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor La
b. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうこと
ができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、
添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことがで
きる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例え
ば、Mutan^TM-G（宝酒造（株））、Mutant^TM-K（宝酒造
（株））などを用いて、Gapped duplex法やKunkel法な
どの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従っ
て行なうことができる。クローン化されたタンパク質を
コードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望に
より制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして
使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻
訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側に
は翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧ
を有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終
止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加
することもできる。本発明のタンパク質の発現ベクター
は、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該Ｄ
ＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流
に連結することにより製造することができる。

【００２６】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
スなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病
原ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ
／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなど
が用いられる。本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細
胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、Ｓ
Ｖ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロ
モーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられ
る。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Lプロモーター、
ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主が
バチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、Ｓ
ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主
が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプ
ロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモータ
ー、ＡＯＸ１プロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫
細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０
プロモーターなどが好ましい。

【００２７】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）
等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニー
ズハムスター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択
マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを
含まない培地によっても選択できる。また、必要に応じ
て、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質
のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である
場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列な
どが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラー
ゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列など
が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、
ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場
合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフ
ェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などが
それぞれ利用できる。このようにして構築された本発明
のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを
用いて、形質転換体を製造することができる。

【００２８】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン（g
ene），２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１
〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of
Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用
いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２、シゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccha
romyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３
６、ピキアパストリス（Pichia pastoris）などが用
いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃ
ＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodopte
ra frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの
中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHig
h Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEs
tigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルス
がＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori
N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞と
しては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２
１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（in Viv
o）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫とし
ては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。

【００２９】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mo
lecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１
９７９)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９
４巻，１８２−１８７（１９９１）に記載の方法に従っ
て行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換
するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Techno
logy）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行
なうことができる。動物細胞を形質転換するには、例え
ば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール，２
６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジ
ー（Virology），５２巻，４５６頁（１９７３）などに
記載の方法に従って行なうことができる。このようにし
て、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベク
ターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、ア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、
ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液などの無機または有機物質、無機物としては、例え
ば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マ
グネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン
類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは
約５〜８が望ましい。

【００３０】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５
０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ
培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、
必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００３１】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Seience），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Jounal of the American Medical
Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９
培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of
the Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞内や培養上清
に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。

【００３２】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ
る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変
性剤や、トリトンＸ−１００^TMなどの界面活性剤が含ま
れていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場
合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるい
は細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにし
て得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタン
パク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み
合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精
製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用す
る方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として
分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフ
ィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、
逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利
用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用
する方法などが用いられる。

【００３３】かくして得られるタンパク質が遊離体で得
られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる
方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られ
た場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に
より、遊離体または他の塩に変換することができる。な
お、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精
製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任
意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去する
こともできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプ
シン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダー
ゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いら
れる。かくして生成する本発明のタンパク質またはその
塩の量は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗
体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定す
ることができる。

【００３４】本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体で
あれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何
れであってもよい。本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質と略
記する）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原と
して用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従っ
て製造することができる。〔モノクローナル抗体の作製〕（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免
疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗
体価の測定は、例えば後記の標識化タンパク質と抗血清
とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測
定することにより行なうことができる。融合操作は既知
の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイ
チャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施するこ
とができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げ
られるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。

【００３５】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、
Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細
胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は
１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥ
Ｇ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃
度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃
で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく
細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる
が、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体ととも
に吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリ
ドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで
標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる
細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用
いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した
モノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン
抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリド
ーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識し
たタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗
体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗
体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従っ
て行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地
で行なうことができる。選別および育種用培地として
は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような
培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは
１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培
地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純
薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培
地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いるこ
とができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましく
は約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好
ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸
ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清
の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にし
て測定できる。

【００３６】（ｂ）モノクロナール抗体の精製モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。

【００３７】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法にしたがって製造することができる。例えば、免
疫抗原（タンパク質抗原）とキャリアー蛋白質との複合
体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様
に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタ
ンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精
製を行なうことにより製造できる。温血動物を免疫する
ために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合
体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーと
ハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫し
たハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様な
ものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウ
シ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニ
ン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好
ましくは約１〜５の割合でカップルさせる方法が用いら
れる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、
種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデ
ヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオ
ール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬
等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週
毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。ポリク
ローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血
液、腹水など、好ましくは血液から採取することができ
る。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の
血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリク
ローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体
の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従っ
て行なうことができる。

【００３８】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記す
る場合がある）に実質的に相補的な塩基配列を有するア
ンチセンスＤＮＡとしては、本発明のＤＮＡに実質的に
相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る
作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮ
Ａであってもよい。本発明のＤＮＡに実質的に相補的な
塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基
配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配
列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約
８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有
する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡ
の相補鎖の全塩基配列うち、本発明のタンパク質のＮ末
端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コド
ン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ま
しくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相
同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これら
のアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを
用いて製造することができる。

【００３９】本発明のタンパク質は、分子量約７〜９
万、好ましくは約８万のカルパイン（好ましくは、ヒト
型カルパイン）タンパク質であり、細胞内カルシウム濃
度に依存したプロテアーゼ活性を有し、カルシウムの関
与する情報伝達系に従い、細胞内タンパク質（例えば、
フォドリンなどの細胞骨格タンパク質、キナーゼなどの
酵素タンパク質、転写因子、サイトカインなど）の分解
を行なう。また、本発明のタンパク質をカルパインの小
サブユニット、コネクチン（ザ・ジャーナル・オブ・バ
イオノジカル・ケミストリー（The Journal of Biologi
cal Chemistry）,Vol.270, No.52, 9931158-31162, 199
5）などと併用することによって、さらに安定性、溶解
性などを向上させることができる。カルパインの小サブ
ユニットとしては、配列番号：９で表わされるアミノ酸
配列を有する公知のヒトカルパイン小サブユニット〔図
２〕の他、今後新たに見いだされる新規なカルパイン小
サブユニットであってもよい。カルパインの小サブユニ
ットは、カルパイン小サブユニットをコードする公知の
ＤＮＡ、例えば、配列番号：１０で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡ〔図２〕などを用いて前記の遺伝子工学
的手法を用いて製造することができる。以下に、本発明
のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以
下、本発明のタンパク質等と略記する場合がある）、本
発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする
ＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合があ
る）、本発明のタンパク質等に対する抗体（以下、本発
明の抗体と略記する場合がある）およびアンチセンスＤ
ＮＡの用途を説明する。

【００４０】（１）本発明のタンパク質が関与する各種
疾病の治療・予防剤本発明のタンパク質等は、カルパインとしての特徴、す
なわち、細胞内カルシウム濃度に依存したプロテアーゼ
活性を有し、カルシウムの関与する情報伝達系に従い、
細胞内タンパク質（例えば、フォドリンなどの細胞骨格
タンパク質、キナーゼなどの酵素タンパク質、転写因
子、サイトカインなど）の分解を行なうので、本発明の
タンパク質等または本発明のＤＮＡに異常があったり、
欠損している場合、あるいは発現量が減少もしくは増加
している場合、また細胞内Ｃａ²⁺の上昇がみられる場
合、例えば、癌、脳卒中、脳梗塞、クモ膜下出血、アル
ツハイマー病、筋ジストロフィー、白内障、虚血性心疾
患、動脈硬化症、関節炎、膠原病などの種々の疾病が発
症する。したがって、本発明のタンパク質等またはＤＮ
Ａは、例えば、癌、脳卒中、脳梗塞、クモ膜下出血、ア
ルツハイマー病、筋ジストロフィー、白内障、虚血性心
疾患、動脈硬化症、関節炎、膠原病などの種々の疾病の
治療・予防剤として使用することができる。例えば、生
体内において本発明のタンパク質等が減少あるいは欠損
しているために、細胞における情報伝達が十分に、ある
いは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発
明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパ
ク質等を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明
のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質等を発現させた
後に、該細胞を患者に移植することによって、または
（ハ）本発明のタンパク質等を患者に投与することなど
によって、該患者における本発明のタンパク質等の役割
を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。

【００４１】本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤とし
て使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイル
スアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベク
ターに挿入した後、常套手段に従って実施することがで
きる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促
進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカ
テーテルのようなカテーテルによって投与できる。本発
明のタンパク質等を上記の治療・予防剤として使用する
場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、よ
り好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上
に精製されたものを使用するのが好ましい。本発明のタ
ンパク質等またはＤＮＡは、例えば、必要に応じて糖衣
を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカ
プセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ
以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸
濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例え
ば、本発明のタンパク質等またはＤＮＡを生理学的に認
められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安
定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に
要求される単位用量形態で混和することによって製造す
ることができる。これら製剤における有効成分量は指示
された範囲の適当な容量が得られるようにするものであ
る。

【００４２】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、
ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例
えば、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０など）など
と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、
大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベン
ジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。ま
た、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム
緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は、
通常、適当なアンプルに充填される。

【００４３】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例え
ば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーな
ど）に対して投与することができる。本発明のタンパク
質等またはＤＮＡの投与量は、症状などにより差異はあ
るが、経口投与の場合、一般的に成人（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍ
ｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約
１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、
その１回投与量は投与対象、対象組織、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．
０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程
度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。

【００４４】（２）疾病に対する医薬候補化合物のスク
リーニング本発明のタンパク質等は、細胞の増殖制御を司るプロテ
インキナーゼＣのダウンレギュレーションに関与し、ま
た細胞にアポトーシスと呼ばれる細胞死を惹起する作用
を有するため、本発明のタンパク質等の機能、例えば、
プロテアーゼ活性などの機能を促進する化合物またはそ
の塩は、癌などの治療・予防剤として使用できる。一
方、本発明のタンパク質等は、細胞内タンパク質（例え
ば、フォドリンなどの細胞骨格タンパク質、キナーゼな
どの酵素タンパク質、転写因子、サイトカインなど）の
分解作用を有するため、本発明のタンパク質等の機能、
例えば、プロテアーゼ活性などの機能を阻害する化合物
またはその塩は、細胞ひいてはそれを構成する組織の破
壊を伴う疾病（例えば、脳卒中、脳梗塞、クモ膜下出
血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、白内障、虚
血性心疾患、動脈硬化症、関節炎、膠原病など）の治療
・予防剤として使用できる。したがって、本発明のタン
パク質等は、本発明のタンパク質等の機能を促進または
阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための
試薬として有用である。

【００４５】すなわち、本発明は、（１）本発明のタン
パク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を用いるこ
とを特徴とする本発明のタンパク質、その部分ペプチド
またはそれらの塩の機能、例えば、プロテアーゼ活性な
どの機能を促進する化合物もしくはその塩（以下、促進
剤と略記する場合がある）、または本発明のタンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩の機能、例え
ば、プロテアーゼ活性などの機能を阻害する化合物（以
下、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方
法を提供し、より具体的には、例えば、（２）（ｉ）本
発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩
に基質を接触させた場合と（ii）本発明のタンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩に基質および試験化
合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とす
る促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供す
る。具体的には、上記スクリーニング方法においては、
例えば、（ｉ）と（ii）の場合における、本発明のタン
パク質等のプロテアーゼ活性（あるいは、ペプチダーゼ
活性など）を測定して、比較することを特徴とするもの
である。

【００４６】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。基質としては、本発明のタンパク質等
の基質となり得るものであれば何れのものでもよい。例
えば、カゼイン、アゾカゼイン、ＦＩＴＣ化したカゼイ
ン、放射線標識（例、¹⁴Ｃ、³Ｈなど）したカゼイン、
コラーゲン、アゾコラーゲン、ＦＩＴＣ化したコラーゲ
ン、放射線標識（例、¹⁴Ｃ、³Ｈなど）したコラーゲ
ン、またはＮ末端側に（７−メトキシクマリン−４−イ
ル）アセチル基を、さらにそれより数残基Ｃ末側にＮ³
−（２，４−ジニトロフェニル）−２，３−ジアミノプ
ロピオニル基を持ったオリゴペプチド類などが用いられ
る。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げら
れ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公
知の化合物であってもよい。上記のスクリーニング方法
を実施するには、本発明のタンパク質等を、スクリーニ
ングに適したバッファーに懸濁することにより本発明の
タンパク質等の標品を調製する。バッファーには、ｐＨ
約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッ
ファー、トリス−塩酸バッファーなどの、本発明のタン
パク質等と基質との結合を阻害しないバッファーであれ
ばいずれでもよい。本発明のタンパク質等のプロテアー
ゼ活性（あるいは、ペプチダーゼ活性）は、公知のプロ
テアーゼ活性測定法、例えば、生物化学実験法蛋白質
分解酵素Ｉ（学会出版センター）５７−７６頁に記載の
方法などに従って測定することができる。具体的には、
上記（ii）の場合におけるプロテアーゼ活性等が上記
（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３
０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇させる試験
化合物を本発明のタンパク質等のプロテアーゼ活性を促
進する化合物として、一方、上記（ii）の場合における
プロテアーゼ活性等が上記（ｉ）の場合に比べて、約２
０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約
５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質等
のプロテアーゼ活性を阻害する化合物として選択するこ
とができる。

【００４７】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有
するものである。本発明のスクリーニング用キットの例
としては、次のものが挙げられる。〔スクリーニング用試薬〕測定用緩衝液ｐＨ７.５の１Ｍトリス−塩酸緩衝液タンパク質標品本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩基質溶液（例、カゼイン溶液）カゼイン（メルク、和光純薬（株））１.５ｇを測定用
緩衝液（ｐＨ７.５）に溶解し、５０ｍｌとする。これ
は１ｍｌずつ分注して冷凍保存しておくとよい。活性測定用基質溶液カゼイン溶液３ｍｌに、１ＭＣａＣｌ₂ ６０μｌ、２−
メルカプトエタノール（２−ＭＥ）１０μｌを加えて、
蒸留水で全量を３０ｍｌにする。対照用に１ＭＣａＣｌ
₂の代わりに、０.５ＭＥＤＴＡ溶液を加えたものを用
意する。これらの溶液は冷凍保存できるが、２週間程度
で作り直すようにする。最終濃度は、３ｍｇ／ｍｌカゼ
イン、２ｍＭＣａＣｌ₂、５ｍＭ２−ＭＥを含む０．
１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７.５）となる。検出２８０ｎｍの吸光度〔測定法〕基質溶液（０.５ｍｌ）を３０℃で５分間保
温してから、カルパインを含む溶液（カルパインとして
０.５〜５μｇ）を加え、３０℃で２０分間反応させ
る。１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）０.５ｍｌを加え
て反応を止め、４℃で１５分間放置後、３,０００×ｇ
で５分間遠心する。カルシウムを加えない基質溶液を用
いた反応を対照として、カルシウム依存的な上清の２８
０ｎｍの吸光度の上昇を測定し、カルパイン活性とす
る。試験化合物を添加した時に２８０ｎｍの吸光度が上
昇した場合は、該試験化合物は本発明のタンパク質のプ
ロテアーゼ活性を促進する化合物であると判定できる。
逆に、試験化合物を添加した時に２８０ｎｍの吸光度が
減少した場合は、該試験化合物は本発明のタンパク質の
プロテアーゼ活性を阻害する化合物であると判定でき
る。

【００４８】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選ばれ
た化合物であり、本発明のタンパク質等のプロテアーゼ
活性、ペプチダーゼ活性などの機能を促進または阻害す
る化合物である。該化合物の塩としては、前記した本発
明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。本発明
のタンパク質等のプロテアーゼ活性などの機能を促進す
る化合物は、例えば、癌などの各種疾病に対する安全で
低毒性な治療・予防剤として有用である。一方、本発明
のタンパク質等のプロテアーゼ活性などの機能を阻害す
る化合物は、例えば、脳卒中、脳梗塞、クモ膜下出血、
アルツハイマー病、筋ジストロフィー、白内障、虚血性
心疾患、動脈硬化症、関節炎、膠原病などの各種疾病に
対する安全で低毒性な治療・予防剤として有用である。

【００４９】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療
・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施す
ることができる。例えば、前記した本発明のタンパク質
等またはＤＮＡを含有する医薬と同様にして、錠剤、カ
プセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性
溶液、懸濁液剤などとすることができる。このようにし
て得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒ
トまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパ
ンジーなど）に対して投与することができる。該化合物
またはその塩の投与量は、症状などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好
ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０
〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１
回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに
よっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人
（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１
〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、
より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射によ
り投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０
ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。

【００５０】（３）本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩の定量本発明の抗体は、本発明のタンパク質等を特異的に認識
することができるので、被検液中の本発明のタンパク質
等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量など
に使用することができる。すなわち、本発明は、（ｉ）
本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタ
ンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標
識化された本発明のタンパク質等の割合を測定すること
を特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量
法、および（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の
抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは
連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性
を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパ
ク質等の定量法を提供する。上記（ii）の定量法におい
ては、一方の抗体が本発明のタンパク質等のＮ端部を認
識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質等のＣ
端部に反応する抗体であることが望ましい。

【００５１】また、本発明のタンパク質等に対するモノ
クローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と
称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の定
量を行なえるほか、組織染色等による本発明のタンパク
質等の検出を行なうこともできる。これらの目的には、
抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ
(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよ
い。本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質等の定量
法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中
の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗
原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的
手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を
用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、
いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリ
ー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法
が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述する
サンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を
用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放
射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いら
れる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、
〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが用いられる。上記
酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、
例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ
酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例
えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシア
ネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、
ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲ
ニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標
識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもで
きる。

【００５２】抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、
物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは
酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を
用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキ
ストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ある
いはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては
不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応
させ（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノクロ
ーナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体
上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発
明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と
２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なって
もよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤およ
び不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相
用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも
１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目
的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明
のサンドイッチ法による本発明のタンパク質等の測定法
においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明の
モノクローナル抗体は、本発明のタンパク質等の結合す
る部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわ
ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例え
ば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質
等のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体
は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗
体が用いられる。

【００５３】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、お
よび、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるい
は、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリ
ック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の
標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離
するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００５４】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質等の測定系を構築すればよい。これらの
一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを
参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイ
ムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江寛
編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochem
ical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochem
ical Techniques(Part B))、同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochem
ical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明のタンパク質
抗体を用いることによって、本発明のタンパク質等を感
度良く定量することができる。さらには、本発明のタン
パク質抗体を用いて本発明のタンパク質等の濃度を定量
することによって、例えば、癌、脳卒中、脳梗塞、クモ
膜下出血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、白内
障、虚血性心疾患、動脈硬化症、関節炎、膠原病などの
各種疾病の診断を行なうことができる。また、本発明の
抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明の
タンパク質等を検出するために使用することができる。
また、本発明のタンパク質等を精製するために使用する
抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパ
ク質等の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質
の挙動の分析などのために使用することができる。

【００５５】（４）遺伝子診断剤本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、
ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における本発明
のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮ
ＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出すること
ができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損
傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として
有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断
は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーショ
ンやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），
第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings ofth
e Natinal Academy of Sciences of the United States
of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１
９８９年））などにより実施することができる。例え
ば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現低下
が、あるいは、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然
変異が検出された場合は、例えば、癌、脳卒中、脳梗
塞、クモ膜下出血、アルツハイマー病、筋ジストロフィ
ー、白内障、虚血性心疾患、動脈硬化症、関節炎、膠原
病等である可能性が高いと診断することができる。

【００５６】（５）アンチセンスＤＮＡ前記のとおり、本発明のタンパク質等は、細胞内タンパ
ク質（例えば、フォドリンなどの細胞骨格タンパク質、
キナーゼなどの酵素タンパク質、転写因子、サイトカイ
ンなど）の分解作用を有する。したがって、本発明のＤ
ＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制すること
ができるアンチセンスＤＮＡは、生体内における本発明
のタンパク質等またはＤＮＡの機能を抑制することがで
きるので、細胞ひいてはそれを構成する組織の破壊を伴
う疾病（例えば、脳卒中、脳梗塞、クモ膜下出血、アル
ツハイマー病、筋ジストロフィー、白内障、虚血性心疾
患、動脈硬化症、関節炎、膠原病など）の治療・予防剤
として使用することができる。上記アンチセンスＤＮＡ
を上記の治療・予防剤として使用する場合、前記した本
発明のタンパク質等またはＤＮＡを含有する各種疾病の
治療・予防剤と同様にして実施することができる。

【００５７】（６）本発明のタンパク質をコードする外
来性ＤＮＡを有する非ヒト動物の作製本発明のＤＮＡを用いて、本発明のタンパク質等を発現
するトランスジェニック非ヒト動物を作製することがで
きる。非ヒト動物としては、哺乳動物（例えば、ラッ
ト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）など（以下、動物と略記する）が挙げれ
るが、特に、マウス、ウサギなどが好適である。本発明
のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮ
Ａを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合
した遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利
である。例えば、ウサギ由来の本発明のＤＮＡを転移さ
せる場合、これと相同性が高い動物由来の本発明のＤＮ
Ａを動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に
結合した遺伝子コンストラクトを、例えば、ウサギ受精
卵へマイクロインジェクションすることによって本発明
のタンパク質等を高産生するＤＮＡ転移動物を作出でき
る。このプロモーターとしては、例えば、ウイルス由来
プロモーター、メタロチオネイン等のユビキタスな発現
プロモーターも使用することができる。

【００５８】受精卵細胞段階におけるＤＮＡの転移は、
対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するよう
に確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞にお
いて本発明のタンパク質等が存在することは、作出動物
の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明の
タンパク質等を有することを意味する。遺伝子を受け継
いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の
全てに本発明のタンパク質等を有する。本発明のＤＮＡ
転移動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを
確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼
育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有
する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相
同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、こ
の雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該Ｄ
ＮＡを有するように繁殖継代することができる。本発明
のＤＮＡが転移された動物は、本発明のタンパク質等が
高発現させられているので、本発明のタンパク質等のプ
ロテアーゼ活性を促進または阻害する化合物またはその
塩のスクリーニング用の動物などとして有用である。本
発明のＤＮＡ転移動物を、組織培養のための細胞源とし
て使用することもできる。例えば、本発明のＤＮＡ転移
マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析する
かあるいは遺伝子により発現された本発明のタンパク質
等が存在する組織を分析することにより、本発明のタン
パク質等について分析することができる。本発明のタン
パク質等を有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、例えば、脳や末梢組織由来
のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究
することができる。また、その細胞を用いることによ
り、例えば、各種組織の機能を高めるような医薬の選択
も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこか
ら、本発明のタンパク質等を単離精製することも可能で
ある。

【００５９】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム

【００６０】Ｇｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸Ｍｅ：メチル基Ｅｔ：エチル基Ｂｕ：ブチル基Ｐｈ：フェニル基ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基

【００６１】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニルＣＨＯ：ホルミルＢｚｌ：ベンジル Cl₂Bzl ：２，６−ジクロロベンジルＢｏｍ：ベンジルオキシメチルＺ：ベンジルオキシカルボニルＣｌ−Ｚ：２−クロロベンジルオキシカルボニルＢｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニルＢｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニルＤＮＰ：ジニトロフェノールＴｒｔ：トリチルＢｕｍ：ｔ−ブトキシメチルＦｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾールＨＯＯＢｔ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジンＨＯＮＢ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【００６２】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。〔配列番号：１〕本発明のヒト白血球由来タンパク質の
アミノ酸配列を示す。〔配列番号：２〕本発明のヒト白血球由来タンパク質の
アミノ酸配列を示し、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列のＮ末端にさらに９個のアミノ酸が付加したアミ
ノ酸配列を示す。〔配列番号：３〕本発明のヒト白血球由来タンパク質の
部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。〔配列番号：４〕本発明のヒト白血球由来タンパク質の
部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。〔配列番号：５〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を有する本発明のヒト白血球由来タンパク質をコード
するＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：６〕配列番号：２で表わされるアミノ酸配
列を有する本発明のヒト白血球由来タンパク質をコード
するＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：７〕配列番号：３で表されるアミノ酸配列
を有する本発明のヒト白血球由来タンパク質の部分ペプ
チドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：８〕配列番号：４で表されるアミノ酸配列
を有する本発明のヒト白血球由来タンパク質の部分ペプ
チドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：９〕カルパイン小サブユニットのアミノ酸
配列を示す。〔配列番号：１０〕配列番号：９で表されるアミノ酸配
列を有するカルパイン小サブユニットをコードするＤＮ
Ａの塩基配列を示す。

【００６３】〔配列番号：１１〕本発明のタンパク質を
コードするＤＮＡのクローニングに使用した合成プライ
マーの塩基配列を示す。〔配列番号：１２〕本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡのクローニングに使用した合成プライマーの塩基配
列を示す。〔配列番号：１３〕本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡのクローニングに使用した合成プライマーの塩基配
列を示す。〔配列番号：１４〕実施例２のノーザンブロッティング
に用いた本発明のＤＮＡ断片の塩基配列を示す。〔配列番号：１５〕実施例２のノーザンブロッティング
に用いたヒトμカルパイン大サブユニットＤＮＡ断片の
塩基配列を示す。〔配列番号：１６〕実施例２のノーザンブロッティング
に用いたヒトカルパイン小サブユニットＤＮＡ断片の塩
基配列を示す。〔配列番号：１７〕実施例３の本発明のタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列の構築に用いた合成プライマーの塩
基配列を示す。〔配列番号：１８〕実施例３の本発明のタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列の構築に用いた合成プライマーの塩
基配列を示す。

【００６４】後述の実施例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒアコリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴ
Ｂ１９１５は、平成８年４月２日から通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号Ｆ
ＥＲＭＢＰ−５４９６として、平成８年４月３日から
財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ１５
９３５として寄託されている。

【００６５】

【実施例】以下に、参考例および実施例を挙げて本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定され
るものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法
は、モレキュラー・クローニング（Molecular clonin
g）に記載されている方法に従った。

【００６６】

【実施例１】ヒト型カルパインタンパク質をコードする
遺伝子のクローニングｃＤＮＡのクローニングは、ジーントラッパーポジティ
ブ選択システム（ギブコビーアールエル社）を用いて行
なった。ヒト白血球由来のｃＤＮＡライブラリー（ギブ
コビーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株をTerrific
Broth（１２ｇ/ｌ bacto−tryptone（ディフコ社），
２４ｇ/ｌ bacto−yeast extract（ディフコ社），２.
３ｇ/ｌリン酸一カリウム，１２.５ｇ/ｌリン酸二カ
リウム）で３０℃で１６時間培養し、キアジェンプラス
ミドキット（キアジェン社）を用いて、プラスミドｃＤ
ＮＡライブラリーを精製抽出した。精製したプラスミド
ｃＤＮＡライブラリーをＧｅｎｅII，ＥｘｏIII（いず
れもギブコビーアールエル社）によって消化し、一本鎖
ｃＤＮＡライブラリーを作成した。一方、プローブとし
て、合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１１）をｃＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。プローブ
は、ＴｄＴ，ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（ギブコビーア
ールエル社）を用いて、３'末端をビオチン化すること
で標識した。一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを９５℃で１
分間処理した後、氷中で急冷し、ビオチン化したプロー
ブを加えて３７℃で１時間、室温でハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。ハイブリダイゼーション後、ジーント
ラッパーポジティブ選択システム・マグネットビーズ
（ギブコビーアールエル社）を加えて、室温で２分ごと
に撹拌しながら３０分間放置した。その後、ジーントラ
ッパーポジティブ選択システム・マグネットラック（ギ
ブコビーアールエル社）中に入れ、２分間放置した。上
清を捨て、マグネットビーズをジーントラッパーポジテ
ィブ選択システム・ウオッシュバッファーで洗浄した。
このウオッシュバッファーによる洗浄を３回行なった。
その後、マグネットラックに入れて放置し、上清を捨
て、ジーントラッパーポジティブ選択システム・溶出バ
ッファーを加え、５分間室温で放置した。マグネットラ
ックに入れて５分間放置した後、その上清のＤＮＡ溶液
を回収した。

【００６７】取得したＤＮＡ溶液にプライマーとして合
成オリゴヌクレオチド（配列番号：１１）を入れ、９５
℃で１分間放置した。ジーントラッパーポジティブ選択
システム・修復酵素を加え、７０℃で１５分間放置して
二本鎖ＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ＤＮＡをエレ
クトロポレーション装置（バイオ・ラッド社）により、
大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入した。得られた形質転換株を
用いて２本のオリゴヌクレオチド（配列番号：１２、配
列番号：１３）をプライマーとしてコロニーＰＣＲによ
るスクリーニングを行なった。ＰＣＲにより７１２ｂｐ
の増幅断片が形成されたコロニーを陽性クローンとして
２株選択した。選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽出
し、Ｔａｑダイデオキシターミネーターサイクルシーケ
ンシングキット（パーキンエルマー社）を用いて反応を
行い、３７３ＡＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマ
ー社）により、ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。取
得した２クローンは同一の遺伝子をコードしており、po
ly(Ａ)⁺鎖を含む２９７０個の塩基配列〔図１〕を有し
ていた。このｃＤＮＡ断片には、配列番号：１で表され
る７０３個のアミノ酸または配列番号：２で表される７
１２個のアミノ酸からなる新規カルパインタンパク質が
コードされており、活性中心であるシステイン，ヒスチ
ジンおよびアスパラギン残基（それぞれ、配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列の第１０５番目、第２６２番
目および第２８６番目のアミノ酸）も保存されていた
〔図１〕。また、ラットのｎＣＬ−２と最も相同性が高
かったが、アミノ酸レベルでの相同性は８４％しかなか
った。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを保持す
るプラスミドｐＴＢ１９１５を大腸菌（Escherichia co
li）ＤＨ１０Ｂに導入して、形質転換体：大腸菌（Esch
erichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９１５を得た。

【００６８】

【実施例２】ノーザンブロッティングによる遺伝子の発
現臓器の特異性の解析ノーザンブロッティングによる遺伝
子の発現臓器の特異性の解析は、ヒューマンマルチプル
ティシュノーザンブロット（クローンテック社）および
ヒューマンマルチプルティシュノーザンブロットII（ク
ローンテック社）のメンブレンフィルターを用いて行な
った。このメンブレンフィルターをハイブリダイゼーシ
ョン用緩衝液（５０％脱イオン化ホルムアミド，５×Ｓ
ＳＰＥ，２×Denhardt's液，２％ＳＤＳ，１００μg/m
l 熱変性ニシン精子ＤＮＡ）中、５０℃で３時間プレハ
イブリダイゼーションを行なった。一方、プローブとし
て配列番号：１４で表される本発明のタンパク質をコー
ドするＤＮＡのＤＮＡ断片を（α−³²Ｐ）ｄＣＴＰ（ア
マシャム社）とＢｃａベストラベリングキット（宝酒
造）を用いて標識した。ハイブリダイゼーションは、標
識プローブを含むハイブリダイゼーション用緩衝液（５
０％脱イオン化ホルムアミド，５×ＳＳＰＥ，２×Denh
ardt's液，２％ＳＤＳ，１００μｇ/ｍｌ熱変性ニシ
ン精子ＤＮＡ）中、５０℃で１８時間行なった。フィル
ターは、２×ＳＳＣ，０.０５％ＳＤＳ液中、室温で２
回洗浄し、さらに、０.１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ液
中、５０℃で２回洗浄した。オートラジオグラムをとっ
てプローブとハイブリダイズしたバンドを調べた。その
結果、肺と大腸においてバンドが検出され、ＲＮＡの大
きさは、いずれも約３.０ｋｂであった。また、このフ
ィルターを沸騰した０.５％ＳＤＳ液中で１０分間処理
を行うことでハイブリダイズしたプローブをフィルター
から除き、ヒトμカルパイン大サブユニットに対して
は、配列番号：１５で表されるＤＮＡ断片をプローブと
し、ヒトカルパイン小サブユニットに対しては、配列番
号：１６で表されるＤＮＡ断片をプローブとし、β−ア
クチンに対しては、ヒトβ−アクチンコントロールプロ
ーブ（クローンテック社）をプローブとして、同様の条
件でハイブリダイゼーションを行なった。その結果、ヒ
トμカルパイン大サブユニットは約３.０ｋｂの大きさ
のバンドが全臓器で検出され、ヒトカルパイン小サブユ
ニットは約１.５ｋｂと約５.０ｋｂの大きさのバンドが
全臓器で検出された〔図３〕。

【００６９】

【実施例３】大腸菌での本発明の組換えタンパク質の発
現発現プラスミドＧＳＴ−calpainは、１）大腸菌replica
tionオリジン、２）アンピシリン耐性遺伝子および３）
ｔａｃプロモーターとその下流にグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）、トロンビン切断部位および
マルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むベクターｐＧ
ＥＸ−４Ｔ−３（ファルマシア・バイオテック社）に由
来する。本発明の完全長カルパインをコードするＤＮＡ
断片をベクターのＭＣＳの中へクローニングする。した
がって、組換えタンパク質はＧＳＴからその５'末端フ
レームに融合され、その発現はｔａｃプロモーターの制
御下で行なわれる。目的タンパク質のＧＳＴへの融合に
より、ＧＳＴエピトープを認識する抗体を用いて組換え
タンパク質を容易に検出することができ、アフィニティ
ー・マトリックス・グルタチオン・セファロース４Ｂを
用いて組換えタンパク質を容易に精製することができ
る。プラスミド構築は次のように行なわれる。本発明の
カルパインをコードするＤＮＡ断片は、次の２つのプラ
イマーを用いて、ＰＣＲ法により調製できる。５'−プライマー：（配列番号：１７）５'−ＡＴＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＡ
ＣＧＧＣＣＡ−３' （このプライマーは、BamHI認識配列の下流に、カルパ
イン・コーディング配列の開始コドンを除くＮ末端１６
塩基を有する）３'−プライマー：（配列番号：１８）５'−ＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＣＣＧＧＧＴＣ
ＡＧＡＣ−３’ （このプライマーは、ＰｓｔＩ認識配列と終始コドンを
含むカルパイン・コーディング配列のＣ末端６塩基を有
する）ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をBamHI，PstIで消化後、BamHI/P
stI末端連結によりプラスミドpBluescript^R II（ストラ
タジーン社）にサブクローンする。BamHIとPstIでプラ
スミドを切断した後、カルパイン・コーディング領域を
含むＤＮＡ断片を回収し、BamHI/PstI末端をBamHI，Pst
Iで消化したｐＧＥＸ−４Ｔ−３に連結する。プラスミ
ドＤＮＡは形質転換体から単離し、目的のＤＮＡ断片の
挿入はシークエンス分析で確認できる。組換えタンパク
質の発現のために、発現ベクターを保持する大腸菌ＪＭ
１０９を１.０ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトピ
ラノシド（ＩＰＴＧ）の存在下で培養する。組換えタン
パク質の発現は、ＧＳＴエピトープを認識する抗体を含
むＧＳＴ検出キットを用いて検出することができる。グ
ルタチオン・セファロース４Ｂまたは充填済グルタチオ
ン・セファロース４Ｂを用いて細胞抽出物から組換えタ
ンパク質を精製することができる。

【００７０】

【実施例４】ＣＯＳ細胞での本発明の組換えタンパク質
の発現発現ベクタープラスミドｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ（ギブコ
／ビーアールエル社）に由来する実施例１で得られたｐ
ＴＢ１９１５は動物細胞での発現に用いられる。このベ
クターはｐＵＣ由来のプラスミドであって、ＣＭＶプロ
モーターとその下流にＭＣＳおよびＳＶ４０ポリ
（Ａ⁺）付加部位を有する。ＣＯＳ細胞（発酵研究所、
大阪）を５０％コンフルエントに達するまで、１０％ウ
シ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭを用いて培養す
る。該ＣＯＳ細胞にTRANSFECTAM（日本ジーン社）を用
いてｐＴＢ１９１５を形質導入する。該ＣＯＳ細胞を、
ＦＢＳ非存在下で５％ＣＯ₂、３７℃で４時間培養した
後、該ＣＯＳ細胞に最終濃度１０％のＦＢＳを添加す
る。さらに、２０時間培養した後、無血清ＤＭＥＭ培地
に交換する。培養３日後に培養上清を回収し、細胞をＲ
ＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４
０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％Ｄ
ＯＣ、４０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５））で分解す
る。

【００７１】

【発明の効果】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ
は、例えば、腫瘍、脳卒中、脳梗塞、クモ膜下出血、ア
ルツハイマー病、筋ジストロフィー、白内障、虚血性心
疾患、動脈硬化症、関節炎、膠原病などの種々の疾病の
治療・予防剤として使用することができる。また、本発
明のタンパク質は、本発明のタンパク質の機能を促進も
しくは阻害する化合物またはその塩のスクリーニングの
ための試薬として有用である。さらに、本発明のタンパ
ク質に対する抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認
識することができるので、被検液中の本発明のタンパク
質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量など
に使用することができる。

【００７２】

【配列表】

【配列番号：１】配列の長さ：７０３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Ala Ala Gln Ala Ala Gly Val Ser Arg Gln Arg Ala Ala Thr Gln 1 5 10 15 Gly Leu Gly Ser Asn Gln Asn Ala Leu Lys Tyr Leu Gly Gln Asp Phe 20 25 30 Lys Thr Leu Arg Gln Gln Cys Leu Asp Ser Gly Val Leu Phe Lys Asp 35 40 45 Pro Glu Phe Pro Ala Cys Pro Ser Ala Leu Gly Tyr Lys Asp Leu Gly 50 55 60 Pro Gly Ser Pro Gln Thr Gln Gly Ile Ile Trp Lys Arg Pro Thr Glu 65 70 75 80 Leu Cys Pro Ser Pro Gln Phe Ile Val Gly Gly Ala Thr Arg Thr Asp 85 90 95 Ile Cys Gln Gly Gly Leu Gly Asp Cys Trp Leu Leu Ala Ala Ile Ala 100 105 110 Ser Leu Thr Leu Asn Glu Glu Leu Leu Tyr Arg Val Val Pro Arg Asp 115 120 125 Gln Asp Phe Gln Glu Asn Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Gln Phe Trp 130 135 140 Gln Tyr Gly Glu Trp Val Glu Val Val Ile Asp Asp Arg Leu Pro Thr 145 150 155 160 Lys Asn Gly Gln Leu Leu Phe Leu His Ser Glu Gln Gly Asn Glu Phe 165 170 175 Trp Ser Ala Leu Leu Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Asn Gly Cys Tyr 180 185 190 Glu Ala Leu Ala Gly Gly Ser Thr Val Glu Gly Phe Glu Asp Phe Thr 195 200 205 Gly Gly Ile Ser Glu Phe Tyr Asp Leu Lys Lys Pro Pro Ala Asn Leu 210 215 220 Tyr Gln Ile Ile Arg Lys Ala Leu Cys Ala Gly Ser Leu Leu Gly Cys 225 230 235 240 Ser Ile Asp Val Ser Ser Ala Ala Glu Ala Glu Ala Ile Thr Ser Gln 245 250 255 Lys Leu Val Lys Ser His Ala Tyr Ser Val Thr Gly Val Glu Glu Val 260 265 270 Asn Phe Gln Gly His Pro Glu Lys Leu Ile Arg Leu Arg Asn Pro Trp 275 280 285 Gly Glu Val Glu Trp Ser Gly Ala Trp Ser Asp Asp Ala Pro Glu Trp 290 295 300 Asn His Ile Asp Pro Arg Arg Lys Glu Glu Leu Asp Lys Lys Val Glu 305 310 315 320 Asp Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Ser Asp Phe Val Arg Gln Phe Ser 325 330 335 Arg Leu Glu Ile Cys Asn Leu Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ser Glu Glu 340 345 350 Val His Lys Trp Asn Leu Val Leu Phe Asn Gly His Trp Thr Arg Gly 355 360 365 Ser Thr Ala Gly Gly Cys Gln Asn Tyr Pro Ala Thr Tyr Trp Thr Asn 370 375 380 Pro Gln Phe Lys Ile Arg Leu Asp Glu Val Asp Glu Asp Gln Glu Glu 385 390 395 400 Ser Ile Gly Glu Pro Cys Cys Thr Val Leu Leu Gly Leu Met Gln Lys 405 410 415 Asn Arg Arg Trp Arg Lys Arg Ile Gly Gln Gly Met Leu Ser Ile Gly 420 425 430 Tyr Ala Val Tyr Gln Val Pro Lys Glu Leu Glu Ser His Thr Asp Ala 435 440 445 His Leu Gly Arg Asp Phe Phe Leu Ala Tyr Gln Pro Ser Ala Arg Thr 450 455 460 Ser Thr Tyr Val Asn Leu Arg Glu Val Ser Gly Arg Ala Arg Leu Pro 465 470 475 480 Pro Gly Glu Tyr Leu Val Val Pro Ser Thr Phe Glu Pro Phe Lys Asp 485 490 495 Gly Glu Phe Cys Leu Arg Val Phe Ser Glu Lys Lys Ala Gln Ala Leu 500 505 510 Glu Ile Gly Asp Val Val Ala Gly Asn Pro Tyr Glu Pro His Pro Ser 515 520 525 Glu Val Asp Gln Glu Asp Asp Gln Phe Arg Arg Leu Phe Glu Lys Leu 530 535 540 Ala Gly Lys Asp Ser Glu Ile Thr Ala Asn Ala Leu Lys Ile Leu Leu 545 550 555 560 Asn Glu Ala Phe Ser Lys Arg Thr Asp Ile Lys Phe Asp Gly Phe Asn 565 570 575 Ile Asn Thr Cys Arg Glu Met Ile Ser Leu Leu Asp Ser Asn Gly Thr 580 585 590 Gly Thr Leu Gly Ala Val Glu Phe Lys Thr Leu Trp Leu Lys Ile Gln 595 600 605 Lys Tyr Leu Glu Ile Tyr Trp Glu Thr Asp Tyr Asn His Ser Gly Thr 610 615 620 Ile Asp Ala His Glu Met Arg Thr Ala Leu Arg Lys Ala Gly Phe Thr 625 630 635 640 Leu Asn Ser Gln Val Gln Gln Thr Ile Ala Leu Arg Tyr Ala Cys Ser 645 650 655 Lys Leu Gly Ile Asn Phe Asp Ser Phe Val Ala Cys Met Ile Arg Leu 660 665 670 Glu Thr Leu Phe Lys Leu Phe Ser Leu Leu Asp Glu Asp Lys Asp Gly 675 680 685 Met Val Gln Leu Ser Leu Ala Glu Trp Leu Cys Cys Val Leu Val 690 695 700

【００７３】

【配列番号：２】配列の長さ：７１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列ＭｅｔＧｌｙＬｅｕＬｙｓＧｌｎＧｌｕＰｒｏＴｈｒＡｌａ
ＭｅｔＡｌａＡｌａＧｌｎＡｌａＡｌａＧｌｙ１５
１０１５ＶａｌＳｅｒＡｒｇＧｌｎＡｒｇＡｌａＡｌａＴｈｒＧｌｎ
ＧｌｙＬｅｕＧｌｙＳｅｒＡｓｎＧｌｎＡｓｎ２０２５
３０ＡｌａＬｅｕＬｙｓＴｙｒＬｅｕＧｌｙＧｌｎＡｓｐＰｈｅ
ＬｙｓＴｈｒＬｅｕＡｒｇＧｌｎＧｌｎＣｙｓ３５４０
４５ＬｅｕＡｓｐＳｅｒＧｌｙＶａｌＬｅｕＰｈｅＬｙｓＡｓｐ
ＰｒｏＧｌｕＰｈｅＰｒｏＡｌａＣｙｓＰｒｏ５０５５
６０ＳｅｒＡｌａＬｅｕＧｌｙＴｙｒＬｙｓＡｓｐＬｅｕＧｌｙ
ＰｒｏＧｌｙＳｅｒＰｒｏＧｌｎＴｈｒＧｌｎ６５７０
７５８０ＧｌｙＩｌｅＩｌｅＴｒｐＬｙｓＡｒｇＰｒｏＴｈｒＧｌｕ
ＬｅｕＣｙｓＰｒｏＳｅｒＰｒｏＧｌｎＰｈｅ８５
９０９５ＩｌｅＶａｌＧｌｙＧｌｙＡｌａＴｈｒＡｒｇＴｈｒＡｓｐ
ＩｌｅＣｙｓＧｌｎＧｌｙＧｌｙＬｅｕＧｌｙ１００１０５
１１０ＡｓｐＣｙｓＴｒｐＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｌａＩｌｅＡｌａ
ＳｅｒＬｅｕＴｈｒＬｅｕＡｓｎＧｌｕＧｌｕ１１５１２０
１２５ＬｅｕＬｅｕＴｙｒＡｒｇＶａｌＶａｌＰｒｏＡｒｇＡｓｐ
ＧｌｎＡｓｐＰｈｅＧｌｎＧｌｕＡｓｎＴｙｒ１３０１３５
１４０ＡｌａＧｌｙＩｌｅＰｈｅＨｉｓＰｈｅＧｌｎＰｈｅＴｒｐ
ＧｌｎＴｙｒＧｌｙＧｌｕＴｒｐＶａｌＧｌｕ１４５１５０
１５５１６０ＶａｌＶａｌＩｌｅＡｓｐＡｓｐＡｒｇＬｅｕＰｒｏＴｈｒ
ＬｙｓＡｓｎＧｌｙＧｌｎＬｅｕＬｅｕＰｈｅ１６５
１７０１７５ＬｅｕＨｉｓＳｅｒＧｌｕＧｌｎＧｌｙＡｓｎＧｌｕＰｈｅ
ＴｒｐＳｅｒＡｌａＬｅｕＬｅｕＧｌｕＬｙｓ１８０１８５
１９０ＡｌａＴｙｒＡｌａＬｙｓＬｅｕＡｓｎＧｌｙＣｙｓＴｙｒ
ＧｌｕＡｌａＬｅｕＡｌａＧｌｙＧｌｙＳｅｒ１９５２００
２０５ＴｈｒＶａｌＧｌｕＧｌｙＰｈｅＧｌｕＡｓｐＰｈｅＴｈｒ
ＧｌｙＧｌｙＩｌｅＳｅｒＧｌｕＰｈｅＴｙｒ２１０２１５
２２０ＡｓｐＬｅｕＬｙｓＬｙｓＰｒｏＰｒｏＡｌａＡｓｎＬｅｕ
ＴｙｒＧｌｎＩｌｅＩｌｅＡｒｇＬｙｓＡｌａ２２５２３０
２３５２４０ＬｅｕＣｙｓＡｌａＧｌｙＳｅｒＬｅｕＬｅｕＧｌｙＣｙｓ
ＳｅｒＩｌｅＡｓｐＶａｌＳｅｒＳｅｒＡｌａ２４５
２５０２５５ＡｌａＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａＩｌｅＴｈｒＳｅｒＧｌｎ
ＬｙｓＬｅｕＶａｌＬｙｓＳｅｒＨｉｓＡｌａ２６０２６５
２７０ＴｙｒＳｅｒＶａｌＴｈｒＧｌｙＶａｌＧｌｕＧｌｕＶａｌ
ＡｓｎＰｈｅＧｌｎＧｌｙＨｉｓＰｒｏＧｌｕ２７５２８０
２８５ＬｙｓＬｅｕＩｌｅＡｒｇＬｅｕＡｒｇＡｓｎＰｒｏＴｒｐ
ＧｌｙＧｌｕＶａｌＧｌｕＴｒｐＳｅｒＧｌｙ２９０２９５
３００ＡｌａＴｒｐＳｅｒＡｓｐＡｓｐＡｌａＰｒｏＧｌｕＴｒｐ
ＡｓｎＨｉｓＩｌｅＡｓｐＰｒｏＡｒｇＡｒｇ３０５３１０
３１５３２０ＬｙｓＧｌｕＧｌｕＬｅｕＡｓｐＬｙｓＬｙｓＶａｌＧｌｕ
ＡｓｐＧｌｙＧｌｕＰｈｅＴｒｐＭｅｔＳｅｒ３２５
３３０３３５ＬｅｕＳｅｒＡｓｐＰｈｅＶａｌＡｒｇＧｌｎＰｈｅＳｅｒ
ＡｒｇＬｅｕＧｌｕＩｌｅＣｙｓＡｓｎＬｅｕ３４０３４５
３５０ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＳｅｒＬｅｕＳｅｒＳｅｒＧｌｕＧｌｕ
ＶａｌＨｉｓＬｙｓＴｒｐＡｓｎＬｅｕＶａｌ３５５３６０
３６５ＬｅｕＰｈｅＡｓｎＧｌｙＨｉｓＴｒｐＴｈｒＡｒｇＧｌｙ
ＳｅｒＴｈｒＡｌａＧｌｙＧｌｙＣｙｓＧｌｎ３７０３７５
３８０ＡｓｎＴｙｒＰｒｏＡｌａＴｈｒＴｙｒＴｒｐＴｈｒＡｓｎ
ＰｒｏＧｌｎＰｈｅＬｙｓＩｌｅＡｒｇＬｅｕ３８５３９０
３９５４００ＡｓｐＧｌｕＶａｌＡｓｐＧｌｕＡｓｐＧｌｎＧｌｕＧｌｕ
ＳｅｒＩｌｅＧｌｙＧｌｕＰｒｏＣｙｓＣｙｓ４０５
４１０４１５ＴｈｒＶａｌＬｅｕＬｅｕＧｌｙＬｅｕＭｅｔＧｌｎＬｙｓ
ＡｓｎＡｒｇＡｒｇＴｒｐＡｒｇＬｙｓＡｒｇ４２０４２５
４３０ＩｌｅＧｌｙＧｌｎＧｌｙＭｅｔＬｅｕＳｅｒＩｌｅＧｌｙ
ＴｙｒＡｌａＶａｌＴｙｒＧｌｎＶａｌＰｒｏ４３５４４０
４４５ＬｙｓＧｌｕＬｅｕＧｌｕＳｅｒＨｉｓＴｈｒＡｓｐＡｌａ
ＨｉｓＬｅｕＧｌｙＡｒｇＡｓｐＰｈｅＰｈｅ４５０４５５
４６０ＬｅｕＡｌａＴｙｒＧｌｎＰｒｏＳｅｒＡｌａＡｒｇＴｈｒ
ＳｅｒＴｈｒＴｙｒＶａｌＡｓｎＬｅｕＡｒｇ４６５４７０
４７５４８０ＧｌｕＶａｌＳｅｒＧｌｙＡｒｇＡｌａＡｒｇＬｅｕＰｒｏ
ＰｒｏＧｌｙＧｌｕＴｙｒＬｅｕＶａｌＶａｌ４８５
４９０４９５ＰｒｏＳｅｒＴｈｒＰｈｅＧｌｕＰｒｏＰｈｅＬｙｓＡｓｐ
ＧｌｙＧｌｕＰｈｅＣｙｓＬｅｕＡｒｇＶａｌ５００５０５
５１０ＰｈｅＳｅｒＧｌｕＬｙｓＬｙｓＡｌａＧｌｎＡｌａＬｅｕ
ＧｌｕＩｌｅＧｌｙＡｓｐＶａｌＶａｌＡｌａ５１５５２０
５２５ＧｌｙＡｓｎＰｒｏＴｙｒＧｌｕＰｒｏＨｉｓＰｒｏＳｅｒ
ＧｌｕＶａｌＡｓｐＧｌｎＧｌｕＡｓｐＡｓｐ５３０５３５
５４０ＧｌｎＰｈｅＡｒｇＡｒｇＬｅｕＰｈｅＧｌｕＬｙｓＬｅｕ
ＡｌａＧｌｙＬｙｓＡｓｐＳｅｒＧｌｕＩｌｅ５４５５５０
５５５５６０ＴｈｒＡｌａＡｓｎＡｌａＬｅｕＬｙｓＩｌｅＬｅｕＬｅｕ
ＡｓｎＧｌｕＡｌａＰｈｅＳｅｒＬｙｓＡｒｇ５６５
５７０５７５ＴｈｒＡｓｐＩｌｅＬｙｓＰｈｅＡｓｐＧｌｙＰｈｅＡｓｎ
ＩｌｅＡｓｎＴｈｒＣｙｓＡｒｇＧｌｕＭｅｔ５８０５８５
５９０ＩｌｅＳｅｒＬｅｕＬｅｕＡｓｐＳｅｒＡｓｎＧｌｙＴｈｒ
ＧｌｙＴｈｒＬｅｕＧｌｙＡｌａＶａｌＧｌｕ５９５６００
６０５ＰｈｅＬｙｓＴｈｒＬｅｕＴｒｐＬｅｕＬｙｓＩｌｅＧｌｎ
ＬｙｓＴｙｒＬｅｕＧｌｕＩｌｅＴｙｒＴｒｐ６１０６１５
６２０ＧｌｕＴｈｒＡｓｐＴｙｒＡｓｎＨｉｓＳｅｒＧｌｙＴｈｒ
ＩｌｅＡｓｐＡｌａＨｉｓＧｌｕＭｅｔＡｒｇ６２５６３０
６３５６４０ＴｈｒＡｌａＬｅｕＡｒｇＬｙｓＡｌａＧｌｙＰｈｅＴｈｒ
ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＧｌｎＶａｌＧｌｎＧｌｎ６４５
６５０６５５ＴｈｒＩｌｅＡｌａＬｅｕＡｒｇＴｙｒＡｌａＣｙｓＳｅｒ
ＬｙｓＬｅｕＧｌｙＩｌｅＡｓｎＰｈｅＡｓｐ６６０６６５
６７０ＳｅｒＰｈｅＶａｌＡｌａＣｙｓＭｅｔＩｌｅＡｒｇＬｅｕ
ＧｌｕＴｈｒＬｅｕＰｈｅＬｙｓＬｅｕＰｈｅ６７５６８０
６８５ＳｅｒＬｅｕＬｅｕＡｓｐＧｌｕＡｓｐＬｙｓＡｓｐＧｌｙ
ＭｅｔＶａｌＧｌｎＬｅｕＳｅｒＬｅｕＡｌａ６９０６９５
７００ＧｌｕＴｒｐＬｅｕＣｙｓＣｙｓＶａｌＬｅｕＶａｌ７０５７１０

【００７４】

【配列番号：３】配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＣｙｓＧｌｎＧｌｙＧｌｙＬｅｕＧｌｙＡｓｐＣｙｓ１５

【００７５】

【配列番号：４】配列の長さ：２５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 His Ala Tyr Ser Val Thr Gly Val Glu Glu Val Asn Phe Gln Gly His 1 5 10 15 Pro Glu Lys Leu Ile Arg Leu Arg Asn 20 25

【００７６】

【配列番号：５】配列の長さ：２１０９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ATGGCAGCCC AGGCAGCTGG TGTATCTAGG CAGCGGGCAG CCACTCAAGG TCTTGGCTCC 60 AACCAAAACG CTTTGAAGTA CTTGGGCCAG GATTTCAAGA CCCTGAGGCA ACAGTGCTTG 120 GACTCAGGGG TCCTATTTAA GGACCCTGAG TTCCCAGCAT GTCCATCAGC TTTGGGCTAC 180 AAGGATCTTG GACCAGGCTC TCCGCAAACT CAAGGCATCA TCTGGAAGCG GCCCACGGAG 240 TTGTGTCCCA GCCCTCAGTT TATCGTTGGT GGAGCCACGC GCACAGACAT TTGTCAGGGT 300 GGTCTAGGTG ACTGCTGGCT TCTGGCTGCC ATTGCCTCCC TGACCCTGAA TGAAGAGCTG 360 CTTTACCGGG TGGTCCCCAG GGACCAGGAC TTCCAGGAGA ACTATGCGGG AATCTTTCAC 420 TTTCAGTTCT GGCAGTACGG AGAGTGGGTG GAGGTGGTCA TTGACGACAG GCTGCCCACC 480 AAGAATGGAC AGCTGCTCTT CCTACACTCG GAACAAGGCA ATGAATTCTG GAGTGCCCTG 540 CTGGAGAAAG CCTATGCCAA GCTTAATGGT TGTTATGAGG CTCTCGCTGG AGGTTCCACA 600 GTGGAGGGGT TTGAGGATTT CACAGGTGGC ATCTCTGAGT TTTATGACCT GAAGAAACCA 660 CCAGCCAATC TATATCAGAT CATCCGGAAG GCCCTCTGTG CGGGGTCTCT GCTGGGCTGC 720 TCCATTGATG TCTCCAGTGC AGCCGAAGCC GAAGCCATCA CCAGCCAGAA GCTGGTTAAG 780 AGTCATGCGT ACTCTGTCAC TGGAGTCGAA GAGGTGAATT TCCAGGGCCA TCCAGAGAAG 840 CTGATCAGAC TCAGGAATCC ATGGGGTGAA GTGGAGTGGT CGGGAGCCTG GAGCGATGAT 900 GCACCAGAGT GGAATCACAT AGACCCCCGG CGGAAGGAAG AACTGGACAA GAAAGTTGAG 960 GATGGAGAAT TCTGGATGTC ACTTTCAGAT TTCGTGAGGC AGTTCTCTCG GTTGGAGATC 1020 TGCAACCTGT CCCCGGACTC TCTGAGTAGC GAGGAGGTGC ACAAATGGAA CCTGGTCCTG 1080 TTCAACGGCC ACTGGACCCG GGGCTCCACA GCTGGGGGCT GCCAGAACTA CCCAGCCACG 1140 TACTGGACCA ATCCCCAGTT CAAAATCCGT TTGGATGAAG TGGATGAGGA CCAGGAGGAG 1200 AGCATCGGTG AACCCTGCTG TACAGTGCTG CTGGGCCTGA TGCAGAAAAA TCGCAGGTGG 1260 CGGAAGCGGA TAGGACAAGG CATGCTTAGC ATCGGCTATG CCGTCTACCA GGTTCCCAAG 1320 GAGCTGGAGA GTCACACGGA CGCACACTTG GGCCGGGATT TCTTCCTGGC CTACCAGCCC 1380 TCAGCCCGCA CCAGCACCTA CGTCAACCTG CGGGAGGTCT CTGGCCGGGC CCGGCTGCCC 1440 CCTGGGGAGT ACCTGGTGGT GCCATCCACA TTTGAACCCT TCAAAGACGG CGAGTTCTGC 1500 TTGAGAGTGT TCTCAGAGAA GAAGGCCCAG GCCCTAGAAA TTGGGGATGT GGTAGCTGGA 1560 AACCCATATG AGCCACATCC CAGTGAGGTG GATCAGGAAG ATGACCAGTT CAGGAGGCTG 1620 TTTGAGAAGT TGGCAGGGAA GGATTCTGAG ATTACTGCCA ATGCACTCAA GATACTTTTG 1680 AATGAGGCGT TTTCCAAGAG AACAGACATA AAATTCGATG GATTCAACAT CAACACTTGC 1740 AGGGAAATGA TCAGTCTGTT GGATAGCAAT GGAACGGGCA CTTTGGGGGC GGTGGAATTC 1800 AAGACGCTCT GGCTGAAGAT TCAGAAGTAT CTGGAGATCT ATTGGGAAAC TGATTATAAC 1860 CACTCGGGCA CCATCGATGC CCACGAGATG AGGACAGCCC TCAGGAAGGC AGGTTTCACC 1920 CTCAACAGCC AGGTGCAGCA GACCATTGCC CTGCGGTATG CGTGCAGCAA GCTCGGCATC 1980 AACTTTGACA GCTTCGTGGC TTGTATGATC CGCCTGGAGA CCCTCTTCAA ACTATTCAGC 2040 CTTCTGGACG AAGACAAGGA TGGCATGGTT CAGCTCTCTC TGGCCGAGTG GCTGTGCTGC 2100 GTGTTGGTC 2109

【００７７】

【配列番号：６】配列の長さ：２１３６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ATGGGCTTGA AGCAAGAGCC CACGGCCATG GCAGCCCAGG CAGCTGGTGT ATCTAGGCAG 60 CGGGCAGCCA CTCAAGGTCT TGGCTCCAAC CAAAACGCTT TGAAGTACTT GGGCCAGGAT 120 TTCAAGACCC TGAGGCAACA GTGCTTGGAC TCAGGGGTCC TATTTAAGGA CCCTGAGTTC 180 CCAGCATGTC CATCAGCTTT GGGCTACAAG GATCTTGGAC CAGGCTCTCC GCAAACTCAA 240 GGCATCATCT GGAAGCGGCC CACGGAGTTG TGTCCCAGCC CTCAGTTTAT CGTTGGTGGA 300 GCCACGCGCA CAGACATTTG TCAGGGTGGT CTAGGTGACT GCTGGCTTCT GGCTGCCATT 360 GCCTCCCTGA CCCTGAATGA AGAGCTGCTT TACCGGGTGG TCCCCAGGGA CCAGGACTTC 420 CAGGAGAACT ATGCGGGAAT CTTTCACTTT CAGTTCTGGC AGTACGGAGA GTGGGTGGAG 480 GTGGTCATTG ACGACAGGCT GCCCACCAAG AATGGACAGC TGCTCTTCCT ACACTCGGAA 540 CAAGGCAATG AATTCTGGAG TGCCCTGCTG GAGAAAGCCT ATGCCAAGCT TAATGGTTGT 600 TATGAGGCTC TCGCTGGAGG TTCCACAGTG GAGGGGTTTG AGGATTTCAC AGGTGGCATC 660 TCTGAGTTTT ATGACCTGAA GAAACCACCA GCCAATCTAT ATCAGATCAT CCGGAAGGCC 720 CTCTGTGCGG GGTCTCTGCT GGGCTGCTCC ATTGATGTCT CCAGTGCAGC CGAAGCCGAA 780 GCCATCACCA GCCAGAAGCT GGTTAAGAGT CATGCGTACT CTGTCACTGG AGTCGAAGAG 840 GTGAATTTCC AGGGCCATCC AGAGAAGCTG ATCAGACTCA GGAATCCATG GGGTGAAGTG 900 GAGTGGTCGG GAGCCTGGAG CGATGATGCA CCAGAGTGGA ATCACATAGA CCCCCGGCGG 960 AAGGAAGAAC TGGACAAGAA AGTTGAGGAT GGAGAATTCT GGATGTCACT TTCAGATTTC 1020 GTGAGGCAGT TCTCTCGGTT GGAGATCTGC AACCTGTCCC CGGACTCTCT GAGTAGCGAG 1080 GAGGTGCACA AATGGAACCT GGTCCTGTTC AACGGCCACT GGACCCGGGG CTCCACAGCT 1140 GGGGGCTGCC AGAACTACCC AGCCACGTAC TGGACCAATC CCCAGTTCAA AATCCGTTTG 1200 GATGAAGTGG ATGAGGACCA GGAGGAGAGC ATCGGTGAAC CCTGCTGTAC AGTGCTGCTG 1260 GGCCTGATGC AGAAAAATCG CAGGTGGCGG AAGCGGATAG GACAAGGCAT GCTTAGCATC 1320 GGCTATGCCG TCTACCAGGT TCCCAAGGAG CTGGAGAGTC ACACGGACGC ACACTTGGGC 1380 CGGGATTTCT TCCTGGCCTA CCAGCCCTCA GCCCGCACCA GCACCTACGT CAACCTGCGG 1440 GAGGTCTCTG GCCGGGCCCG GCTGCCCCCT GGGGAGTACC TGGTGGTGCC ATCCACATTT 1500 GAACCCTTCA AAGACGGCGA GTTCTGCTTG AGAGTGTTCT CAGAGAAGAA GGCCCAGGCC 1560 CTAGAAATTG GGGATGTGGT AGCTGGAAAC CCATATGAGC CACATCCCAG TGAGGTGGAT 1620 CAGGAAGATG ACCAGTTCAG GAGGCTGTTT GAGAAGTTGG CAGGGAAGGA TTCTGAGATT 1680 ACTGCCAATG CACTCAAGAT ACTTTTGAAT GAGGCGTTTT CCAAGAGAAC AGACATAAAA 1740 TTCGATGGAT TCAACATCAA CACTTGCAGG GAAATGATCA GTCTGTTGGA TAGCAATGGA 1800 ACGGGCACTT TGGGGGCGGT GGAATTCAAG ACGCTCTGGC TGAAGATTCA GAAGTATCTG 1860 GAGATCTATT GGGAAACTGA TTATAACCAC TCGGGCACCA TCGATGCCCA CGAGATGAGG 1920 ACAGCCCTCA GGAAGGCAGG TTTCACCCTC AACAGCCAGG TGCAGCAGAC CATTGCCCTG 1980 CGGTATGCGT GCAGCAAGCT CGGCATCAAC TTTGACAGCT TCGTGGCTTG TATGATCCGC 2040 CTGGAGACCC TCTTCAAACT ATTCAGCCTT CTGGACGAAG ACAAGGATGG CATGGTTCAG 2100 CTCTCTCTGG CCGAGTGGCT GTGCTGCGTG TTGGTC 2136

【００７８】

【配列番号：７】配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 TGTCAGGGTG GTCTAGGTGA CTGC 24

【００７９】

【配列番号：８】配列の長さ：７５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 CATGCGTACT CTGTCACTGG AGTCGAAGAG GTGAATTTCC AGGGCCATCC AGAGAAGCTG 60 ATCAGACTCA GGAAT 75

【００８０】

【配列番号：９】配列の長さ：２６８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Phe Leu Val Asn Ser Phe Leu Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Gly Asn Val Leu Gly Gly Leu 20 25 30 Ile Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ala Met Arg Ile Leu Gly Gly 50 55 60 Val Ile Ser Ala Ile Ser Glu Ala Ala Ala Gln Tyr Asn Pro Glu Pro 65 70 75 80 Pro Pro Pro Arg Thr His Tyr Ser Asn Ile Glu Ala Asn Glu Ser Glu 85 90 95 Glu Val Arg Gln Phe Arg Arg Leu Phe Ala Gln Leu Ala Gly Asp Asp 100 105 110 Met Glu Val Ser Ala Thr Glu Leu Met Asn Ile Leu Asn Lys Val Val 115 120 125 Thr Arg His Pro Asp Leu Lys Thr Asp Gly Phe Gly Ile Asp Thr Cys 130 135 140 Arg Ser Met Val Ala Val Met Asp Ser Asp Thr Thr Gly Lys Leu Gly 145 150 155 160 Phe Glu Glu Phe Lys Tyr Leu Trp Asn Asn Ile Lys Arg Trp Gln Ala 165 170 175 Ile Tyr Lys Gln Phe Asp Thr Asp Arg Ser Gly Thr Ile Cys Ser Ser 180 185 190 Glu Leu Pro Gly Ala Phe Glu Ala Ala Gly Phe His Leu Asn Glu His 195 200 205 Leu Tyr Asn Met Ile Ile Arg Arg Tyr Ser Asp Glu Ser Gly Asn Met 210 215 220 Asp Phe Asp asn Phe Ile Ser Cys Leu Val Arg Leu Asp Ala Met Phe 225 230 235 240 Arg Ala Phe Lys Ser Leu Asp Lys Asp Gly Thr Gly Gln Ile Gln Val 245 250 255 Asn Ile Gln Glu Trp Leu Gln Leu Thr Met Tyr Ser 260 265

【００８１】

【配列番号：１０】配列の長さ：８０４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ATGTTCCTGG TTAACTCGTT CTTGAAGGGC GGCGGCGGCG GCGGCGGGGG AGGCGGGGGC 60 CTGGGTGGGG GCCTGGGAAA TGTGCTTGGA GGCCTGATCA GCGGGGCCGG GGGCGGCGGC 120 GGCGGCGGCG GCGGCGGCGG CGGTGGTGGA GGCGGCGGTG GCGGTGGAAC GGCCATGCGC 180 ATCCTAGGCG GAGTCATCAG CGCCATCAGC GAGGCGGCTG CGCAGTACAA CCCGGAGCCC 240 CCGCCCCCAC GCACACATTA CTCCAACATT GAGGCCAACG AGAGTGAGGA GGTCCGGCAG 300 TTCCGGAGAC TCTTTGCCCA GCTGGCTGGA GATGACATGG AGGTCAGCGC CACAGAACTC 360 ATGAACATTC TCAATAAGGT TGTGACACGA CACCCTGATC TGAAGACTGA TGGTTTTGGC 420 ATTGACACAT GTCGCAGCAT GGTGGCCGTG ATGGATAGCG ACACCACAGG CAAGCTGGGC 480 TTTGAGGAAT TCAAGTACTT GTGGAACAAC ATCAAAAGGT GGCAGGCCAT ATACAAACAG 540 TTCGACACTG ACCGATCAGG GACCATTTGC AGTAGTGAAC TCCCAGGTGC CTTTGAGGCA 600 GCAGGGTTCC ACCTGAATGA GCATCTCTAT AACATGATCA TCCGACGCTA CTCAGATGAA 660 AGTGGGAACA TGGATTTTGA CAACTTCATC AGCTGCTTGG TCAGGCTGGA CGCCATGTTC 720 CGTGCCTTCA AATCTCTTGA CAAAGATGGC ACTGGACAAA TCCAGGTGAA CATCCAGGAG 780 TGGCTGCAGC TGACTATGTA TTCC 804

【００８２】

【配列番号：１１】配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TCTGTGCGGG GTCTCTGCTG 20

【００８３】

【配列番号：１２】配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GGAGTTGTGT CCCAGCCCTC A 21

【００８４】

【配列番号：１３】配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TTGTCCAGTT CTTCCTTCCG 20

【００８５】

【配列番号：１４】配列の長さ：５１７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 GGAATTCAAG ACGCTCTGGC TGAAGATTCA GAAGTATCTG GAGCTCTATT GGGAAACTGA 60 TTATAACCAC TCGGGCACCA TCGATGCCCA CGAGATGAGG ACAGCCCTCA GGAAGGCAGG 120 TTTCACCCTC AACAGCCAGG TGCAGCAGAC CATTGCCCTG CGGTATGCGT GCAGCAAGCT 180 CGGCATCAAC TTTGACAGCT TCGTGGCTTG TATGATCCGC CTGGAGACCC TCTTCAAACT 240 ATTCAGCCTT CTGGACGAAG ACAAGGATGG CATGGTTCAG CTCTCTCTGG CCGAGTGGCT 300 GTGCTGCGTG TTGGTCTGAC CCGGGGTTTC GGACATCAGT GACACTCCCT GCCCCACTGC 360 TTGCTTCTTG TCACCCCTTC TCTACAATTT TGTGAACATT TATGCTCCAG TGGCATTCAC 420 TGGTTGTTCA TACCTTTCTT GCCCTGGGTC TATTTCAGCA GCACTGAGCT ATGAGCTATG 480 TAAGCCGACC CGGTGGGCCC AGTGGAGGGA AAGCAAT 517

【００８６】

【配列番号：１５】配列の長さ：６６４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 TGTGGTGGTG CCCTCCACCT TCGAGCCCAA CAAGGAGGGC GACTTCGTGC TGCGCTTCTT 60 CTCAGAGAAG AGTGCTGGGA CTGTGGAGCT GGATGACCAG ATCCAGGCCA ATCTCCCCGA 120 TGAGCAAGTG CTCTCAGAAG AGGAGATTGA CGAGAACTTC AAGGCCCTCT TCAGGCAGCT 180 GGCAGGGGAG GACATGGAGA TCAGCGTGAA GGAGTTGCGG ACAATCCTCA ATAGGATCAT 240 CAGCAAACAC AAAGACCTGC GGACCAAGGG CTTCAGCCTA GAGTCGTGCC GCAGCATGGT 300 GAACCTCATG GATCGTGATG GCAATGGGAA GCTGGGCCTG GTGGAGTTCA ACATCCTGTG 360 GAACCGCATC CGGAATTACC TGTCCATCTT CCGGAAGTTT GACCTGGACA AGTCGGGCAG 420 CATGAGTGCC TACGAGATGC GGATGGCCAT TGAGTCGGCA GGCTTCAAGC TCAACAAGAA 480 GCTGTACGAG CTCATCATCA CCCGCTACTC GGAGCCCGAC CTGGCGGTCG ACTTTGACAA 540 TTTCGTTTGC TGCCTGGTGC GGCTAGAGAC CATGTTCCGA TTTTTCAAAA CTCTGGACAC 600 AGATCTGGAT GGAGTTGTGA CCTTTGACTT GTTTAAGTGG TTGCAGCTGA CCATGTTTGC 660 ATGA 664

【００８７】

【配列番号：１６】配列の長さ：６４０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ATGTTCCTGG TTAACTCGTT CTTGAAGGGC GGCGGCGGCG GCGGCGGGGG AGGCGGGGGC 60 CTGGGTGGGG GCCTGGGAAA TGTGCTTGGA GGCCTGATCA GCGGGGCCGG GGGCGGCGGC 120 GGCGGCGGCG GCGGCGGCGG CGGTGGTGGA GGCGGCGGTG GCGGTGGAAC GGCCATGCGC 180 ATCCTAGGCG GAGTCATCAG CGCCATCAGC GAGGCGGCTG CGCAGTACAA CCCGGAGCCC 240 CCGCCCCCAC GCACACATTA CTCCAACATT GAGGCCAACG AGAGTGAGGA GGTCCGGCAG 300 TTCCGGAGAC TCTTTGCCCA GCTGGCTGGA GATGACATGG AGGTCAGCGC CACAGAACTC 360 ATGAACATTC TCAATAAGGT TGTGACACGA CACCCTGATC TGAAGACTGA TGGTTTTGGC 420 ATTGACACAT GTCGCAGCAT GGTGGCCGTG ATGGATAGCG ACACCACAGG CAAGCTGGGC 480 TTTGAGGAAT TCAAGTACTT GTGGAACAAC ATCAAAAGGT GGCAGGCCAT ATACAAACAG 540 TTCGACACTG ACCGATCAGG GACCATTTGC AGTAGTGAAC TCCCAGGTGC CTTTGAGGCA 600 GCAGGGTTCC ACCTGAATGA GCATCTCTAT AACATGATCA 640

【００８８】

【配列番号：１７】配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ATGGGATCCA AGCAAGAGCC CACGGCCA 28

【００８９】

【配列番号：１８】配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TGACTGCAGA AACCCCCGGG TCAGAC 26

【００９０】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のヒト型カルパインタンパク質をコード
するＤＮＡの塩基配列とそれにコードされるヒト型カル
パインタンパク質のアミノ酸配列を示す。

【図２】カルパイン小サブユニットをコードするＤＮＡ
の塩基配列とそれにコードされるカルパイン小サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。

【図３】各種タンパク質をコードするｍＲＮＡのヒトの
各組織における発現量をノザンハイブリダイゼーション
で調べた時の電気泳動写真を示す。（１）は心臓を、
（２）は脳を、（３）は胎盤を、（４）は肺を、（５）
は肝臓を、（６）は骨格筋を、（７）は腎臓を、（８）
は膵臓を、（９）は脾臓を、（１０）は胸腺を、（１
１）は前立腺を、（１２）は精巣を、（１３）は卵巣、
（１４）は小腸を、（１５）は大腸を、（１６）は末梢
血白血球を示す。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれ本発
明のヒト型カルパインタンパク質をコードするｍＲＮ
Ａ、ヒトμ−カルパイン大サブユニットをコードするｍ
ＲＮＡ、ヒトカルパイン小サブユニットをコードするｍ
ＲＮＡおよびヒトβ−アクチンをコードするｍＲＮＡの
発現量を示す。右側の数字（ｋｂ）はＲＮＡの分子量マ
ーカーの大きさを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 9/64 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 31/70 Ｇ０１Ｎ 33/53 35/14 Ｚ // Ａ６１Ｋ 31/70 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 35/14 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 38/46 ＡＡＭ 9282−4Ｂ 15/00 ＣＡＢＪＡ６１Ｋ 37/54 ＡＡＭＡＢＬＡＢＪＡＢＮＡＢＬＡＢＳＡＢＮＡＢＸＡＢＳＡＤＵＡＢＸＣ０７Ｈ 21/04 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタン
パク質またはその塩。
【請求項２】配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を
有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】ヒト型カルパインである請求項１記載のタ
ンパク質。
【請求項４】請求項１記載のタンパク質の部分ペプチド
またはその塩。
【請求項５】請求項１記載のタンパク質をコードする塩
基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項６】配列番号：５または配列番号：６で表わさ
れる塩基配列を有する請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】請求項５記載のＤＮＡを含有する組換えベ
クター。
【請求項８】請求項７記載の組換えベクターを保持する
形質転換体。
【請求項９】請求項８記載の形質転換体を培養し、請求
項１記載のタンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とする請求項１記載のタンパク質または
その塩の製造方法。
【請求項１０】請求項５記載のＤＮＡを含有してなる医
薬。
【請求項１１】腫瘍、脳卒中、脳梗塞、クモ膜下出血、
アルツハイマー病、筋ジストロフィー、白内障、虚血性
心疾患、動脈硬化、関節炎または膠原病の治療・予防剤
である請求項１０記載の医薬。
【請求項１２】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体。
【請求項１３】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴
とする請求項１記載のタンパク質、請求項４記載の部分
ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方
法。
【請求項１４】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる請求
項１記載のタンパク質、請求項４記載の部分ペプチドま
たはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促進または阻害す
る化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１５】請求項１３記載のスクリーニング方法ま
たは請求項１４記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる、請求項１記載のタンパク質、請求項４記載の
部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテアーゼ活性を促
進または阻害する化合物またはその塩。