DE60017924T2

DE60017924T2 - Rekombinante, adenovirale vektoren und ihre verwendung zur behandlung von leberzirrhose

Info

Publication number: DE60017924T2
Application number: DE60017924T
Authority: DE
Inventors: Juan Armendariz Borunda; Estuardo Aguilar Cordova
Original assignee: TGT Laboratories SA de CV
Current assignee: TGT Laboratories SA de CV
Priority date: 1999-09-17
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2020-09-15
Also published as: DE60017924D1; CO5420199A1; HK1049860B; WO2001021761A3; DE1221490T1; CA2385538A1; AR025692A1; US8043855B2; JP2004500040A; WO2001021761A2; ES2183752T3; AU7322600A; HK1049860A1; EP1221490A2; US20040156827A1; PE20010610A1; US20050201984A1; US7858368B2; EP1221490B1; US20030003077A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Schaffung von rekombinanten adenoviralen Vektoren, die exogene Gene tragen, welche therapeutische Proteine codieren, die für die Behandlung von Leberzirrhose geeignet sind. Sie bezieht sich auch auf einen Mechanismus der gewebespezifischen Erkennung der betroffenen Zellen mittels Abgabe von therapeutischen Genen an zirrhotische Organe.
Außerdem stellt die Erfindung eine effektive Methode für die Behandlung von Fibrose durch Einsatz von rekombinanten adenoviralen Vektoren bereit, die hier beansprucht werden, sowie das Verfahren zur Herstellung dieser Vektoren und die pharmazeutische Zusammensetzung, die diese enthält, bereit und gibt ihre therapeutischen Verwendungen bei der Behandlung von mehreren Fibrosen an, was zu großen kommerziellen Erwartungen in der pharmazeutischen Industrie berechtigt und auch eine wichtige Alternative als Gentherapie zur Behandlung von chronisch-degenerativen Krankheiten, die durch Fibrose gekennzeichnet sind, mit großer therapeutischer Anwendung auf dem Gebiet der Medizin darstellt.
Einführung
Physiopathologie von Leberzirrhose
Leberzirrhose ist eine Krankheit, die aus einem chronischen Leberschaden resultiert. Der Schaden kann toxisch (chronischer Verzehr von Alkohol), infektiös (virale Hepatitis, hauptsächlich durch Hepatitis-B- und/oder -C-Virus), immuno logisch (primäre biliäre Zirrhose), durch Gallenwegsverschluss bedingt (sekundäre biliäre Zirrhose) oder metabolisch (Wilsonsche Krankheit) sein. Alle Formen der Zirrhose haben gemeinsame Merkmale: Synthese und übermäßige Ablagerung von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM), hauptsächlich Collagen I und in geringerem Maß Collagen IV und III) und in der Folge die Bildung von Hepatocytenknötchen, abnormale Vaskularisierung und portale Hypertonie (Antoni PP, Ishak KG, Nayak NC, Poulsen HE, Sheuer PJ, Sobin LH). Diese physiopathologischen Vorgänge führen zu einer Veränderung der Blutversorgung und in der Folge der Ernährung der Leberzellen. Ungeachtet des ätiologischen Agens und der morphologischen Unterschiede haben alle Formen der Zirrhose ein gemeinsames Ende, nämlich Leberversagen, das den Tod des Patienten verursacht.
Als Folge der übermäßigen Ablagerung von Collagenproteinen im subendothelialen Raum der Sinusoide (Disseschen Raum) erfolgen verschiedene Änderungen in der hepatischen Mikroumgebung: Verlust von Hepatocytenvilli, Bildung einer Basalmembran, die aus Collagen IV und I zusammengesetzt ist und die Sinusoide bedeckt, sowie Verlust der Fenestrierung von Endothelzellen, welche die Sinusoide bildet. Dieser ganze Vorgang ist als "Kapillarisierung" der Sinusoide bekannt (Scott L. Friedman, The cellular basis of hepatic fibrosis: Mechanisms and treatment strategies. The New England Journal of Medicine 1993, Vol. 328, Nr. 25: 1828–1835). Die Leber ist also nicht in der Lage, die physiologische Konzentration von gelösten Stoffen in der terminalen Lebervene aufrechtzuerhalten, mit anderen Worten, ein Leberversagen setzt ein. Diese Kapillarisierung mit der Bildung der kontinuierlichen Endothele (Collagen der Basalmembran) und der Akkumulation anderer Collagenproteine stellt eine Sperre für den normalen und bidirektionellen Austausch von Molekülen zwischen Plasma und Hepatocyten dar, wie aus 1 entnommen werden kann, wo Leberzirrhose durch die Akkumulation von Collagen Typ I in der Leber gekennzeichnet ist. Bei einer übermäßigen Abscheidung dieses Proteins ist der freie Austausch von Nährstoffen zwischen Blut und Leberzellen behindert, die Inaktivierung von toxischen Agentien durch dieses Organ kann nicht durchgeführt werden, was die Hauptursache für die Pathophysiologie der Krankheit ist. Bisher wurde kein Therapeuti kum beschrieben, das die progressive Akkumulation von hepatischem Collagen rückgängig machen und/oder mit 100%iger Wirkung verhindern konnte.
Solche physiopathologischen Veränderungen, die bei Leberzirrhose auftreten, sind immer gleich und bei allen Organen, die ebenfalls einer Fibrose unterliegen können, wie Lunge, Herz, Niere, Haut und anderen, dieselben, was nicht als Einschränkung des Schutzumfangs dieser Erfindung angesehen werden soll. Daher könnten die Methoden, die hier für die Behandlung von Leberzirrhose vorgestellt werden, auch auf diejenigen Organe angewendet werden, die anfällig für eine Fibrose oder von einer solchen befallen sind.
Virale Vektoren und hepatische Gentherapie
Diese Technologie kann mit viralen oder nichtviralen Vektoren ausgeführt werden. Frühere Studien wurden unter Verwendung von Plasmiden und Liposomen (DOTMA), kationisch und anionisch, usw. entworfen. Unter den Verfahren, bei denen virale Vektoren eingesetzt werden, beinhalten die am häufigsten verwendeten die Verwendung von Retroviren und Adenoviren.
Bei mehreren Vorschriften werden retrovirale Vektoren verwendet, um Gene in Hepatocyten einzuführen (Douglas JT und Curiel DT, Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy, Science and Medicine/1997, 44–53). Es sind jedoch Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, da diese Vektoren potentielle replikationskompetente Viren erzeugen können. Zu den Vorteilen dieser Vektoren gehört ihre Fähigkeit, ihr Genom stabil in die Chromosomen der Gastzelle zu integrieren, was eine Expression des in dem Retrovirus klonierten therapeutischen Transgens in unbestimmter Weise ermöglicht. Andererseits wurde bisher bei keiner Studie über Fälle von Mutagenese durch Insertion oder Aktivierung von Onkogenen durch den Einbau des replikationsdefizienten Retrovirus berichtet. Dennoch ist die Verwendung von retroviralen Vektoren, um Gene an die Leber zu transduzieren, aufgrund der folgenden Überlegungen beschränkt: 1) Diese Vektoren infizieren nur Zellen, die sich aktiv teilen, und 2) in den Verpackungszelllinien, die verwendet werden, um diese Viren zu amplifizieren, werden nur sehr geringe Titer der Viruspartikel erhalten (Graham FL und Van Der Eb AJ, A New Technique for the Assay of Infectivity of Human Adenovirus 5 DNA, Virology 1973, 52: 456–467). Diese beiden Beschränkungen wurden bei anderen Gentherapievorschriften durch die Induktion einer Hepatocytenproliferation "in vivo", durch die Verwendung von Leberwachstumsfaktoren und durch partielle Hepatektomie, ein chirurgisches Verfahren, bei dem die Entfernung von 70% der Lebermasse die Teilung der verbleibenden Leberzellen "in vivo" induziert, erfolgreich überwunden. Die Verwendung von lentiviralen Vektoren hat es erlaubt, diese Beschränkungen teilweise zu überwinden, da sie in der Lage sind, Zellen zu transduzieren, die sich nicht tatsächlich teilen.
Hintergrund der Erfindung
Leberzirrhose ist eine chronische Krankheit der Leber, bei der eine diffuse Zellnekrose und eine begrenzte Regeneration der parenchymalen Leberzellen zu einer diffusen prozentualen Zunahme des Bindegewebes führen, was eine Verzerrung der lobularen Leberarchitektur verursacht und hämodynamische Veränderungen induziert. Daher könnten einige Strategien für die Behandlung von Leberzirrhose die Prävention und/oder Umkehrung des "fibrogenen Prozesses", die Stimulation der hepatischen Mitose und die Umordnung der Architektur des Lebergewebes beinhalten. Die Dokumente des Standes der Technik, die mit der vorliegenden Erfindung zusammenhängen, werden im Folgenden nur als Referenzen genannt.
Das US-Patent Nr. 5,240,846 bezieht sich auf eine "CFTR" genannte Verwendung der Gentherapie, die eine stabile Korrektur der Regulation des Chlorkanals induziert. Dieser Mangel ist bei Epithelzellen vorhanden. In der Erfindung werden adenovirale rekombinante Vektoren sowie plasmidische Vektoren verwendet. Es gibt jedoch keine Verbindung zu den therapeutischen Genen der vorliegenden Erfindung. Genauso beschreibt das US-Patent Nr. 5,910,487 die Verwendung von plasmidischen Vektoren zur Überbringung von therapeutischen Molekülen, aber es gibt keine Verbindung zur Abgabe von Genen von latenter und/oder aktiver Metalloprotease MMP-8, MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-13 oder "uPA" (Wildtyp-uPA und/oder seine modifizierten Versionen) oder "Smad7" oder den verkürzten Rezeptoren für den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β Typ II), wie sie hier vorgestellt wird. Das US-Patent Nr. 5,827,703 bezieht sich auf die Verwendung von adenoviralem Vektor und modifiziertem adenoviralem Vektor zur Überbringung von Genen, doch keiner dieser Vektoren enthält die Gene, die in der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von Fibrose verwendet werden.
Das US-Patent Nr. 5,770,442 beansprucht die Verwendung eines rekombinanten Adenovirus, das ein einzelnes Gen enthält, das die Expression eines Proteins, das "Faser" genannt wird, oder eines Proteins, das "Faser-Chimäre" genannt wird, steuert, doch das Patent erwähnt nicht speziell, welches das therapeutische Gen ist. Außerdem wird ein Verfahren der Gentherapie, das die Verwendung eines solchen Adenovirus und eines Übertragungsvektors für die Erzeugung eines solchen rekombinanten Adenovirus beinhaltet, vorgestellt. Nichts wird jedoch erwähnt in Bezug auf die Verwendung von therapeutischen Genen, die in rekombinanten adenoviralen Vektoren, die in dieser Erfindung verwendet werden, kloniert und eingesetzt sind, bei fibrotischen Lebern oder bei anderen Zielorganen, wie Niere, Lunge und hypertrophischen Narben und anderen. Diese therapeutischen Gene sind das Gen, das für die latente und/oder aktive humane Metalloprotease MMP-8, MMP-1, MMP-2, MMP-9 und MMP-13, den humanen Urokinase-Plasminogen-Aktivator (Wildtyp und/oder modifizierter huPA), Smad7 und den verkürzten Rezeptor für TGF-β Typ II codiert, wie es hier beansprucht wird. Weitere Mitglieder der dargestellten Genfamilie gehören ebenfalls dazu.
Das US-Patent Nr. 5,166,320 bezieht sich auf die Verwendung eines zielgesteuerten Abgabesystems zur Einführung von exogenen Genen in Leberzellen von Säugern. Es gibt jedoch keine Verbindung zu mutmaßlichen Genen, die direkt an zirrhotische Lebern oder an eine fibrotische Niere oder Lunge übertragen werden.
Das US-Patent Nr. 5,872,154 beschreibt ein Verfahren zur Reduktion der Immunantwort, die durch einen adenoviralen rekombinanten Vektor und einen ausgewählten Immunmodulator induziert wird, und zwar durch Hemmung der Bildung von neutralisierenden Antikörpern und/oder Reduktion des Absterbens der viral infizierten Zellen.
Das US-Patent Nr. 5,871,982 betrifft einen Hybridvektor, bei dem ein Teil eines Adenovirus mitverwendet wird, zusammen mit einem Teil eines adenoassoziierten viralen Vektors, der ein ausgewähltes Transgen enthält. Ein Hybridvirus, das aus der Vereinigung eines Konjugats mit einem Polykation zu einem Gengitter des adenoassoziierten viralen Vektors unter Bildung eines einfachen Partikels besteht, wird ebenfalls beschrieben. Dies steht im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, in der keine Hybridviren, sondern nur adenovirale Vektoren eingesetzt werden. Daneben wird in dem oben genannten Patent das verwendete Gen, Transgen oder therapeutische Gen nicht genannt.
Das US-Patent Nr. 5,856,152 betrifft die Schaffung eines Hybridvektors, der den Teil eines adenoviralen Vektors in Kombination mit einem adenoassoziierten Virus und einem ausgewählten Gen enthält. Dadurch werden große Mengen von rekombinanten Vektoren erzeugt, doch sie tragen keine klonierten therapeutischen Gene, wie es in dieser Erfindung beschrieben ist, bei der spezielle therapeutische Gene für die Behandlung von renaler und hepatischer Fibrose und hypertrophischer Narben verwendet werden.
Das US-Patent Nr. 5,547,932 beansprucht eine Zusammensetzung mit Komplexen von Nucleinsäuren zum Transfizieren von eukaryontischen Zellen. Diese Komplexe werden von Nucleinsäuren und einer anderen Substanz mit Affinität zu Nucleinsäuren und gegebenenfalls einem internalisierenden Faktor, wie einem Virus oder einer Komponente des Virus, die konjugiert werden kann, gebildet. Es verwendet auch Komponenten von speziellen adenoviralen Vektoren oder spezielle Viren, wie Ad2 oder Ad5, erwähnt aber nicht die Gene, die im Cytoplasma und schließlich im Zellkern dieser eukaryontischen Zellen internalisiert werden. Ähnlich betrifft das US-Patent Nr. 5,521,291 ein konjugiertes Adenovirus, das über einen Antikörper an eine Substanz mit Affinität zu Nucleinsäuren gebunden ist. Auf diese Weise werden rekombinante Gene in das Innere von eukaryontischen Zellen transportiert. Diese konjugierten Komplexe und Nucleinsäuren werden in der Zelle internalisiert, aber die Gene, die übertragen werden können, werden nicht speziell erwähnt. In dem Patent wird im Gegensatz dazu, was in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, die Verwendung eines solchen Adenovirus zur Behandlung von Fibrose oder von Leberzirrhose oder eines anderen Fibrosetyps nicht erwähnt.
Das US-Patent Nr. 5,585,362 bezieht sich auf einen verbesserten adenoviralen Vektor und auf Verfahren zur Gewinnung und Verwendung solcher Vektoren. Die Verwendung von adenoviralen Vektoren wird in dem Patent nicht erwähnt. Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen adenoviralen Vektoren wurden jedoch wie Vektoren zum Übertragen von therapeutischen Genen verwendet.
Das US-Patent Nr. 5,756,086 beansprucht ein Adenovirus, das durch ein "Faser" genanntes Protein dargestellt wird, und das Adenovirus beinhaltet auch einen Liganden, der spezifisch für einen Rezeptor ist, der sich in einem speziellen Zelltyp befindet. Dieses Adenovirus kann wenigstens einen Teil dieses "Faser" genannten Proteins aufweisen, und es kann entfernt und durch einen Liganden ersetzt werden, der spezifisch für einen Rezeptor in speziellen Zellen der Ökonomie, wie Hepatocyten, ist. Dieses Adenovirus kann ein Gen beinhalten, das für ein therapeutisches Mittel codiert. Auf der Grundlage der vorigen Aussage ist der herausragende technische Unterschied der vorliegenden Erfindung im Vergleich zum Stand der Technik die Spezifität des therapeutischen Agens als aktive und latente humane Metalloproteasen MMP-8, MMP-1, MMP-2, MMP-9 und MMP-13, humaner uPA (Urokinase-Plasminogen-Aktivator, Wildtyp und/oder modifiziert), verkürzter Rezeptor für TGF-β Typ II und "Smad7" für die Behandlung verschiedener Fibrosen.
Das US-Patent Nr. 5,895,759 beansprucht einen gewebespezifischen (Leber) Vektor für die Gentherapie, der verwendet werden kann, um Gene an eine geschädigte Leber zu übertragen. Diese Vektoren sind chemisch oder über ein Enzym an einen Promotor gekoppelt und können auch an einen Antikörper gekoppelt sein, der in einer polypeptidischen Hülle verpackt ist. Daneben ist der Vektor oder das Virus, das bestimmt werden soll, das Hepatitis-B-Virus. Die Übertragung von Genen auf geschädigte Lebern, die in diesem Patent beschrieben wird, macht sieh also ein System zu Nutze, das völlig anders als das dieser Erfindung ist, und es gibt keinen Zusammenhang mit dem zu behandelnden Vorgang der Fibrose oder Zirrhose.
Das US-Patent Nr. 5,559,099 beschreibt einen adenoviralen rekombinanten Vektor, der ein chimärisches Protein aus dem Pentona genannten Adenovirus enthält, das eine Nicht-Pentona-Sequenz und ein therapeutisches Gen beinhaltet, um ein Gentherapieverfahren zu entwickeln, das die Verwendung eines solchen Adenovirus und die Übertragung von adenoviralen Vektoren für die Rekombination solcher adenoviraler Vektoren, die ein therapeutisches Gen enthalten, beinhaltet.
Das US-Patent Nr. 5,885,808 beansprucht auch die Verwendung von Adenoviren mit Molekülen zur Bindung von Adenovirus an verschiedene Zellen, deren Moleküle modifiziert wurden, wie in den US-Patenten Nr. 5,846,782 und 5,712,136, in denen adenovirale Vektoren eingesetzt werden, welche so modifiziert wurden, dass sie verschiedene peptidische Domänen enthalten.
Schließlich bezieht sich das US-Patent Nr. 5,670,488 auf Vektoren für die Gentherapie, die insbesondere für die cystische Fibrose geeignet sind, und erwähnt auch die Entwicklung von Verfahren zur Verwendung dieser Vektoren. Die mögliche Beziehung der vorliegenden Erfindung zum genannten Stand der Technik bezieht sich auf die Verwendung von adenoviralen Vektoren, die modifiziert werden können, sowie auf die Verwendung von induzierbaren Promotoren, die die Expression von Genen antreiben, welche in diese adenoviralen Vektoren eingesetzt werden sollen. Die technischen Merkmale der vorliegenden Erfindung konzentrieren sich jedoch auf die spezielle Verwendung von therapeutischen Genen zur Behandlung von Fibrose verschiedener Art: hepatische, renale und pulmonale Fibrose sowie hypertrophische Narben.
Die Bedeutung der vorliegenden Erfindung im Gegensatz zum Stand der Technik, der in den oben genannten Dokumenten beschrieben ist, beruht auf den technischen Merkmalen der Erfindung selbst sowie auf den zusätzlichen Vorteilen, die sich von dieser ableiten und die im Folgenden ausführlicher beschrieben sind.
Adenovirale Vektoren
In der vorliegenden Erfindung wurde die Verwendung von adenoviralen Vektoren auf der Grundlage von mehreren Überlegungen bestimmt: 1) Diese Vektoren können in sehr hohen Titern von infektiösen Partikeln pro ml erzeugt werden: (10⁹–10¹⁰); 2) sie infizieren eine große Vielfalt von Zellen, doch wenn sie intravenös verabreicht werden, befinden sich die meisten davon in der Leber; 3) sie übertragen effizient Gene auf Zellen, die sich nicht teilen, und 4) sie werden selten in das Gastgenom integriert, wodurch die Gefahr einer zellulären Transformation durch Insertionsmutagenese vermieden wird (Douglas JT und Curiel DT, Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy, Science and Medicine, März/April 1997, 44–53, und Zern AM und Kresina TF, Hepatic Drug Delivery and Gene Therapy, Hepatology 1997, Vol. 25, Nr. 2, 484–491).
Adenoviren sind wahrscheinlich die vielversprechendsten Vehikel oder Vektoren für die Abgabe von Genen in den Vorschriften der Gentherapie beim Menschen, da sie ein einzigartiges Attribut besitzen, das ihnen große Stabilität verleiht, wenn sie in den Blutstrom verabreicht werden. Dieses spezielle Merkmal erlaubt es ihnen, in klinischen Tests effizient mit einer bequemen intravenösen Verabreichung an den Patienten verwendet zu werden (Douglas JT und Curiel DT, Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy, Science and Medicine, März/April 1997, 44–53).
Adenoviren sind doppelsträngige DNA-Viren. Sie haben eine ikosaedrische Struktur, infizieren eine Vielzahl von Säugerzelltypen und unterstützen die ubiquitäre Expression eines spezifischen Rezeptors in der Zelloberfläche, der noch nicht identifiziert ist. Seine Vereinigung mit Zellen erfolgt mittels der Proteinkomponente des Capsids, und das Virus tritt durch rezeptorvermittelte Endocytose in die Zelle ein.
Mehr als 40 verschiedene humane Serotypen von Adenoviren wurden identifiziert, und davon wurden Typ 2 (Ad2) und 5 (Ad5) eingehender untersucht und werden daher verbreiteter als Vektoren für die Gentherapie verwendet. Ein sehr wichtiges Merkmal dieser beiden Ad-Serotypen besteht darin, dass sie nie mit malignen humanen Vorgängen in Verbindung gebracht wurden.
Die Strategie für die Schaffung von rekombinanten Adenoviren beruht auf der Organisation des adenoviralen Genoms. Die Expression der adenoviralen Gene erfolgt in zwei Phasen, früh und spät, die durch den Zeitpunkt der Replikation des adenoviralen Genoms definiert sind. Die frühen Gene codieren sich in 4 getrennten Transcriptionseinheiten: E1, E2 und E4 codieren essentielle regulatorische Proteine, die die Replikation der adenoviralen DNA induzieren. Das Gen E3 ist ein nichtessentielles Gen. Die Produkte der späten Gene umfassen die Hauptproteine des Capsids, die von einem einzigartigen Promotor aus transcribiert werden (Graham FL und Van Der Eb AJ, A New Technique for the Assay of Infectivity of Human Adenovirus 5 DNA, Virology 1973, 52: 456–467).
Die rekombinanten Adenoviren werden durch Einführung des interessierenden exogenen Gens oder der exogenen DNA-Sequenz als Ersatz für die adenoviralen Genombereiche, die für die Replikation des Virus erforderlich sind, erzeugt. Die adenoviralen rekombinanten Vektoren weisen Deletionen in den Genombereichen E1 und E3 auf. Die Erzeugung von rekombinanten Adenoviren wird entweder durch den Ersatz der Bereiche E1 oder E3 oder durch Insertion des exogenen Gens zwischen dem E4-Bereich und dem rechten Ende des adenoviralen Genoms durchgeführt. Vektoren, die auf der Insertion des exogenen Gens am rechten Ende des adenoviralen Genoms oder auf dem Ersatz des E3-Bereichs beruhen, behalten ihre Replikationsfähigkeit. Dagegen erzeugt die Substitution des frühen Bereichs E1 einen Vektor, dem die Replikationsfähigkeit fehlt und der sich daher nur in einer Zelllinie, die die fehlenden Funktionen des ersetzten adenoviralen Bereichs "in trans" liefert, oder in Gegenwart eines Helfervirus ausbreiten kann.
Von diesen sind die am häufigsten als Genübertragungsvektoren verwendeten die replikationsdefizienten Adenoviren (Douglas JT und Curiel DT, Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy, Science and Medicine, März/April 1997, 44–53).
Die Schaffung von adenoviralen Vektoren sowie ihre Anwendung für die Behandlung der Fibrose sind in den im Folgenden beschriebenen Beispielen gezeigt.
Ziele der Erfindung
Im Folgenden werden die von dieser Erfindung abgeleiteten Ziele und Vorteile vorgestellt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten adenoviralen Vektoren pAdGFP-MMP-8 mittels Klonierung der Reportergene lac-7 und GFP und des therapeutischen Gens von Collagenase oder Metalloprotease MMP-8 in ihrer latenten und/oder aktiven Form bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, einen adenoviralen rekombinanten Vektor mit einem interessierenden exogenen Gen oder einer exogenen DNA-Sequenz bereitzustellen, das bzw. die therapeutische Proteine codiert, die für die Behandlung der generalisierten Fibrose in Zielorganen, die daran leiden können, geeignet sind. Diese Gene sind aktives und latentes MMP-8 (Wildtyp und/oder modifiziert).
Außerdem werden in der vorliegenden Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die die rekombinanten adenoviralen Vektoren in therapeutisch wirksamen Mengen von viralen Partikeln enthalten, für die Behandlung von generalisierter Fibrose bereitgestellt sowie ihre Verwendungen und therapeutischen Anwendungen bei der Behandlung der Fibrose angegeben.
Ein Vorteil von größerer Wichtigkeit bei der Behandlung der generalisierten Fibrose, insbesondere von Leberzirrhose, besteht darin, dass die Abgabe von therapeutischen Genen durch gewebespezifische Erkennung mittels der eingesetzten Verabreichung durchgeführt wird.
Ein weiterer Vorteil der therapeutischen Verwendungen der Erfindung, die zunächst die Umkehrung von Leberzirrhose betrifft, ist die Behandlung von generalisierter Fibrose in anderen Zielorganen, die daran leiden können, unter anderem bei Säugern einschließlich des Menschen; nicht dazu gehört die Behandlung von Fibrose in Lunge, Herz, Haut und Niere.
Ein weiteres Ziel ist die Gestaltung einer Technologie, um Gene effizient auf die Leber von Tieren zu übertragen, die an Zirrhose leiden, welche zwei Typen von Zirrhose ähnelt, an denen gewöhnlich Menschen leiden (alkoholische Zirrhose und primäre biliäre Zirrhose).
Ein weiterer Vorteil, der aus der Fibrosebehandlung resultiert, besteht darin, dass rekombinante Adenoviren bei keinem der Tiere, denen die Vektoren injiziert wurden, eine letale Toxizität induzieren.
Ein weiteres Ziel der Erfindung erlaubt es uns, die Modifikation der Färbereaktion mit X-Gal zwischen der endogenen-Gewebe-Galactosidase-Aktivität und der bakteriellen Galactosidase, die durch die infektiöse Wirkung des adenoviralen Vektors induziert wird, zu diskriminieren. Die Verwendung des grünen fluoreszenten Proteins erlaubt es uns, die in-vivo-Transduktion von verschiedenen Organen bei Ratten zu überprüfen, um zu überprüfen, ob die Vektorverabreichung erfolgreich war, ob die Expression bleibt, und außer dass die Tiere nicht getötet werden, ist es möglich, nach der Operation eine Nachsorgebeobachtung durchzuführen.
Schließlich lassen uns alle diese Beweise vermuten, dass unser System ein effizientes Vehikel umfasst, um therapeutische Gene, wie aktive und latente humane Metalloproteasen MMP-8, auf die Lebern von zirrhotischen Ratten zu übertragen, um normale Leberfunktionen oder normale Funktionen anderer Organe, die von derselben Pathologie betroffen sind, wiederherzustellen.
In der vorliegenden Erfindung wird also ein Herstellungsverfahren angegeben, durch das adenovirale rekombinante Vektoren, pharmazeutische Zusammensetzungen und therapeutische Verwendungen für die Fibrosebehandlung, insbesondere für die Behandlung von Leberzirrhose, ermöglicht wird.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Weitere Besonderheiten und Vorteile dieser Erfindung gehen aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ziele und Ausführungsformen, aus den beigefügten Ansprüchen und aus den beigefügten Zeichnungen oder Figuren hervor.
1 zeigt die zelluläre Physiopathologie der Leberzirrhose;
2 zeigt den Beleg des Konzepts, gemäß dem die Gentherapie durch Umkehrung des Zirrhosevorgangs funktioniert;
3 ist die schematische Darstellung, die das Klonieren und die Produktion des adenoviralen Vektors Ad5-gal zeigt;
4 zeigt die schematische Entwicklung des AdEasy-Systems zur Erzeugung von rekombinanten Adenoviren, insbesondere pAdGFP-MMP-8;
5 zeigt die Analyse der Expression von Galactosidase in kultivierten Zellen;
6 zeigt die Bestimmung der Expression von grünem fluoreszentem Protein (GFP) in kultivierten Zellen;
7 zeigt die Expression von Galactosidase in verschiedenen Organen nach der Infusion von Ad5-gal durch die Darmbeinvene;
8 zeigt die Analyse des Tropismus des Vektors Ad5-gal zu verschiedenen Organen von durch chronische Vergiftung mit CCl₄ zirrhotischen Versuchstieren, was beweist, dass die Leber das Hauptzielorgan ist;
9 zeigt die Analyse des Tropismus des Vektors Ad5-gal zu verschiedenen Organen von zirrhotischen Versuchstieren. Die Zirrhose wurde durch Abbinden des Gallengangs induziert, und es wurde bewiesen, dass die Leber das Hauptzielorgan ist;
10 zeigt histologische Schnitte von repräsentativen Bildern der in-vivo-Effizienz-Transduktionsassays des Vektors Ad5-gal bei durch chronische Verabreichung von CCl₄ zirrhotischen Ratten;
10 zeigt histologische Schnitte von repräsentativen Bildern der in-vivo-Effizienz-Transduktionsassays des Vektors Ad5-gal bei durch gewöhnliches Abbinden des Gallengangs zirrhotischen Ratten;
12 zeigt die in-vivo-Bestimmung der Expression des grünen fluoreszenten Proteins;
13 zeigt die Klonierungsstrategie des latenten MMP-8 und des aktiven MMP-8;
14 zeigt die Mechanismen der Komplexbildung von MMP-8 mit DNA für in-vitro-Transfektionsassays bei Zellen hepatischen Ursprungs (HepG2);
15 zeigt die Bestätigung des Erfolgs der Klonierung von MMP-8-cDNAs in den geeigneten Plasmiden durch Elektrophorese in Agarose-Gelen;
16 zeigt die Transfektionseffizienz bei HepG2-Zellen (Zellen hepatischen Ursprungs) mit den Plasmiden von Galactosidase und cDNA-MMP-8;
17 zeigt die Analyse von MMP-8-mRNAs durch Polymerase-Kettenreaktion in Verbindung mit Reverser Transcriptase (RT-PCR);
18 zeigt die Analyse der collagenolytischen Aktivität in dem Protein, das von HepG2-Zellen nach Transfektion mit cDNAs für latentes MMP-8 und aktives MMP-8 in das Kulturmedium sezerniert wird;
19 zeigt die hormonelle Regulation der MMP-8-Genexpression unter der transcriptionalen Kontrolle des regulierbaren Promotors PEPCK; und
20 zeigt den Dosis-Wirkungs-Assay für die verschiedenen Dosen, der verwendet wurde, um die beste Reaktion einer "in-vivo"-Lebertransduktion mit dem Galactosidase-Reportergen zu bestimmen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es gibt viele Berichte, die zeigen, dass durch eine systemische Verabreichung von rekombinanten adenoviralen Vektoren (AdR) an gesunde Versuchstiere eine spezifische Zielsteuerung und ein hochpräferentieller Tropismus dieser Vektoren in die Leber beobachtet wird. Bisher war nicht bekannt, ob die AdR in der Lage sind, zirrhotische Rattenlebern zu transduzieren. Wie schon früher erwähnt, ist Leberzirrhose durch eine Zunahme der Zirrhose im gesamten Leberparenchym gekennzeichnet, hauptsächlich um die Lebervene und Pfortader herum, wodurch eine Barriere entsteht, die den Austausch von Makromolekülen zwischen dem Sinusoid und den Hepatocyten behindert (Antoni PP, Hishack KG, Nayak NC, Poulsen HE, Scheuer PJ, Sobin LH. The morphology of cirrhosis: Definition, nomenclature and classification. Bulletin of the World Health Organization, 1977; 55: 521–540; und Scott L. Friedman: The cellular basis of hepatic fibrosis: Mechanisms and treatment strategies, The New England Journal of Medicine, 1993, Vol. 328, Nr. 25: 1828–1835), und diese Vorschrift wurde entworfen, um zu überprüfen, ob die exogenen Gene selbst in Anwesenheit dieser Barriere systemisch an die zirrhotische Leber abgegeben werden können.
Daher lautet unsere Hypothese, dass AdRs, die LacZ und GFP (grünes fluoreszentes Protein) als Reportergene enthalten, in der Lage sind, Lebern von zirrhotischen Ratten zu transduzieren, auch wenn die lobulare Architektur der Leber verzerrt ist.
Wir konnten auf diese Lebern also therapeutische Gene übertragen, wie humane Metalloproteasen oder Collagenasen, aktives und latentes humanes MMP-8, MMP-1, MMP-2, MMP-9 und MMP-3, humaner Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA, Wildtyp und/oder modifiziert), den verkürzten Rezeptor für TGF-β Typ II und Smad7, die den Überschuss an abgelagerten collagenen Proteinen abbauen und/oder die exazerbierende Synthese von collagenen Proteinen verhindern, wie in den 2 und 18 gezeigt ist; und/oder Gene, die für Proteine codieren, die die Regeneration der Leber stimulieren, wie uPA, um die normale Funktion der Leber wiederherzustellen, wie in 2 gezeigt ist.
Die vorliegende Erfindung startet eine Forschungslinie zur Durchführung von Gentherapie als Alternative für die Behandlung einer chronischen degenerativen Krankheit, insbesondere von Leberzirrhose beim Menschen, durch die Etablierung eines effizienten Vehikels, um auf die Leber Gene zu übertragen, die therapeutische Proteine erzeugen, um die Wiederherstellung der normalen Leberfunktionen zu unterstützen, siehe 2. 2 zeigt, wie man effizient ein therapeutisches Gen auf die Leber überträgt, in diesem Fall eine Collagenase (Matrixmetalloproteasen, MMPs), und es ist möglich, den Abbau von Collagen durch die Überexpression dieser Metalloproteasen zu fördern.
In 3 ist die Strategie zum Klonieren und für die Produktion eines adenoviralen Vektors gezeigt. Das Plasmid pDeltaE1sp1B enthält Adenovirus-Ad5-Sequenzen, bei denen das bakterielle Gen Lac-z insertiert wurde. Dieses Plasmid wurde mit pBHG10 rekombiniert, so dass man nach der Cotransfektion in der Zelllinie 293 vollständige virale Partikel erhielt. Der Vektor pAdGFP wurde wie folgt erhalten: das MMP-8-Gen (das aus dem Plasmid PEPCK-MMP-8 stammt) wurde in den Vehikelvektor pAdTrack-CMV kloniert, das resultierende Plasmid wird mit der Restriktionsendonuclease PmeI linearisiert und wird dann in E. coli (BJ5183) mit dem Plasmid pAdEASY-1 transformiert. Die rekombinanten Kolonien wurden anhand der Kanamycin-Resistenz selektiert, und die Rekombination wird durch Restriktionsanalyse mit Endonucleasen bestätigt. Schließlich wird das linearisierte rekombinante Plasmid in die Verpackungszelllinie (293-Zellen) transfiziert, und die rekombinanten Adenoviren werden innerhalb von 7 bis 12 Tagen erhalten, wie in den 3 und 4 gezeigt ist (Tong Chuan H, Shibin Z, Luis T, Jian Y, Kenneth W und Volgestein Bert: A simplified system for genera ting recombinant adenoviruses. Prod. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95: 2509–2514, März 1998). Um den Grad der Transduktion in vitro zu bewerten, wurden die Leber-HepG2-Zelllinie und peritoneale Makrophagen, die aus einer Maus isoliert wurden, verwendet. In 5 ist die Expression von Galactosidase in kultivierten Zellen gezeigt. A), B) und C) entsprechen HepG2-Zellen (32OX), D), E) und F) sind peritoneale Makrophagen der Maus (100x). In C) und F) sind die transduzierten Zellen mit 1 × 10⁸ viralen Partikeln/ml aus dem Ad5-Gal-Vektor gezeigt. Drei Techniken wurden durchgeführt, um den Grad des Einbaus des Reportergens Lac-Z, das an jede Kulturschale in Form von plasmidischer DNA PGK-Gal verabreicht wurde, zu vergleichen, und zwar durch Fällung mit Ca²⁺-Phosphat (Chen C und Okayama H, Calcium phosphate mediated gene transfer, a highly efficient system to establish transforming cells with plasmidic DNA, Biotechniques 1988, 6: 632–638), DNA-Komplexe-Polylysin-Lactose (Martinez-Fong D, Mullersman JE, Purchio AF, Armendariz-Borunda J und Martinez-Hernandez A, Non-enzymatic glycosylation of poly-L-lysine: A new tool for targeted gene delivery, Hepatology, Vol. 20, Nr. 6: 1602–1608), mit den Vektoren Ad5-gal und pAdGFP-MMP8. Die Visualisierung der Aktivität von Gal wurde mit dem reaktiven Xgal und die des GFP in einem Fluoreszenz-Mikroskop-Stereoskop überprüft. Für den in-vivo-Assay wurde gal-Färbung unter Verwendung von verschiedenen pH-Werten der Suspension mit dem reaktiven Xgal standardisiert (Weiss DJ, Ligitt D und Clark JG, In situ photochemical detection of galactosidase activity in lung: assessment of Xgal reagent in distinguished Lac-Z gene expression and endogenous galactosidase activity, Human Gene Therapy, 1. September 1997, 8: 1545–1554).
Die verwendeten Modelle der experimentellen Leberzirrhose sind: a) chronische Vergiftung, verursacht durch Tetrachlorkohlenstoff (CCl₄), wobei Leberzirrhose ab der 8. Woche der peritonealen Verabreichung festgestellt wird (Mion F, Geloen A, Agosto E und Minaire Y, Carbon tetrachloride induced cirrhosis in rats: influence of the acute effects of the toxin on glucose metabolism, Hepatology 1996, Vol. 23, Nr. 2: 582–587); und b) Abbinden des Gallengangs (LCB), wobei Zirrhose in der vierten Woche nach der Operation beobachtet wird (Lee S, Giraud C, Draillon A, HADengue A und Lebec D, Hemodynamic characterization of chronic bile duct ligated rats; effect of pentobarbital sodium, AM Journal fisiol. 1986; 251: 176–180; Nakano 5, Harakane J und Hashimoto N, Alteration in peribiliary ducts microcirculation in rats after common bile duct ligation, Hepatology, 1995, Vol. 21, Nr. 5: 1380–1995; Dumas Walla R, Belcowitz D und H. Eubi JE, Adaptive response of the enterohepatic circulation of bile acid to extra hepatic cholestiasis, Hepatology 1996, Vol. 23, Nr. 3: 623–629, und Poo JL, Stanes A, Pedraza-Chaverri J, Cruz C, Perez C, Huberman A und Uribe M: Cronologia de la Hipertensión Portal, Disminución de a Excreción de sodio y activación del sistema renina-angiotensina en cirrosis biliar experimental, Rev. Invest Clin, 49: 15–23, 1997).
Ad5-gal wurde gleichzeitig und aus derselben Charge Kontrollratten ohne Zirrhose verabreicht. Ratten mit 5 und 8 Wochen CCl₄-Vergiftung und Ratten mit 2 und 4 Wochen Abbindung des Gallengangs (BDL) wurden 72 h nach der Verabreichung des rekombinanten Adenovirus für die histologische Analyse und Bestimmung der Expression des Galactosidase-Proteins (gal), das vom AdR codiert wird, getötet. Zu diesem Zweck wurden Leber, Milz, Herz, Lungen, Nieren und Gehirn entnommen, Gewebeschnitte wurden in Würfelform von 5 bis 6 mm geschnitten und in Gefriermedium Tissue-Tek O.C.T. absorbiert, die Gewebe wurden bei –30 °C eingefroren und mit einem Kryostat geschnitten, so dass man 8-μm-Schnitte erhielt. Diese Schnitte wurden auf Objektträger aus silanisiertem Glas gelegt und 15–30 Minuten lang mit Formalin, pH 8,5, fixiert und 16–18 Stunden lang Xgal ausgesetzt sowie mit Neutralrot-Farbstoff gegengefärbt (Weiss DJ, Ligitt D und Clark JG, In situ photochemical detection of galactosidase activity in lung: assessment of Xgal reagent in distinguishing Lac-Z gene expression and endogenous galactosidase activity, Human Gene Therapy, 1. September 1997, 8: 1545–1554). Der Prozentsatz der positiven Zellen wurde durch morphometrische Analyse in mehreren Feldern derselben Größe und Berechnung des Mittelwerts bestimmt. Daneben wurden Leberschnitte von zirrhotischen Ratten erhalten, und in Paraffin absorbierte Gewebe wurden geschnitten und mit Siriusrot angefärbt, das spezifisch collagene Proteine färbt (Armendariz-Borunda J und Rojkind M, A simple quantitative method for collagen typing in tissue samples: its application to human liver with schistosomiasis, Collagen Rel. Res. 1984, Vol. 4, 35–47). Durch diese Technik können wir den Grad der Fibrose und die Zunahme der Gallengänge im Leberparenchym eindeutig überprüfen. Um die in-vivo-Transduktion von Zellen mit GFP zu überprüfen, verwendeten wir gesunde Wistar-Ratten, die den pAdGFP-MMP-8-Vektor erhielten. 72 Stunden später wurde eine Laparotomie durchgeführt, und die freigelegten Organe wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht, wobei die Wunde hinterher geschlossen wurde, um das Tier am Leben zu halten.
Die früheren Ergebnisse, die hier in Bezug auf die Studie der Physiopathologie von experimenteller Leberzirrhose vorgelegt werden, sind in 2 zusammengefasst. Die Figur zeigt die Rolle von vorentzündlichen und profibrogenen Cytokinen, die in vivo von Kupffer-Zellen erzeugt werden, die wiederum die hepatischen Sternzellen (HSC) aktivieren, so dass diese überschüssige Collagene erzeugen, die im subendothelialen Raum abgelagert werden und so den Austausch zwischen Hepatocyten und Sinusoiden behindern (Armendariz-Borunda J, Katayama K und Seyer JM: Transcriptional mechanisms of type I collagen gene expression are differentially regulated by IL-1beta, TNFalfa and TGF into cells, J. Biol. Chem. 267: 14316–14321, 1992; Armendariz-Borunda J, Katai H, Jones CM, Seyer JM, Kang AH und Raghow R: Transforming growth factor beta is transiently enhanced at a critical stage during liver regeneration following CCL4 treatment. Laboratory Investigation 69: 283–294, 1993, und Armendariz-Borunda J, Roy N, Simjewish C, Raghow R, Seyer JM und Kang AH; activation of Ito cells involves regulation of API collagen gene expression, Biochemical Journal 304: 817–824, 1994). Der Grad des Einbaus des Lac-z-Gens in kultivierte Zellen zeigte sichtbare Unterschiede zwischen den Techniken mit Calciumphosphat, DNA-Polylysin-Lactose-Komplexen und mit dem rekombinanten adenoviralen Vektor bei HepG2 und PMM (peritoneale Maus-Makrophagen). Der Grad der Transduktion mit Adenovirus erreicht 100% und mit den anderen beiden Techniken etwa 1%, wie in 5 gezeigt ist. 6 zeigt die Expression von grünem fluoreszentem Protein (GFP) in kultivierten Zellen. A) Peritoneale Maus-Makrophagen, transduziert mit dem adenoviralen Vektor pAdGFP-MMP8, 72 Stunden nach seiner Verabreichung (50x), B) HepG2-Zellen, transduziert mit dem adenoviralen Vektor pAdGFP-MMP8, 72 Stunden nach seiner Verabreichung (50x), und C) HepG2-Zellen ohne den adenoviralen Vektor. Alle Bilder wurden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop-Stereoskop aufgenommen. Es ist notwendig, herauszustellen, dass die Zellen bei der Entwicklung zur Identifizierung der Galactosidase-Aktivität fixiert werden müssen und sterben. Im GFP-Assay sind die Zellen noch intakt und lebendig.
7 zeigt die Expression von gal in verschiedenen Organen nach der Infusion von Ad5-gal durch die Darmbeinvene. Fixierung, Waschen und Xgal-Lösungen unter Verwendung von verschiedenen pH-Werten wurden verwendet, um zwischen der endogenen Expression und der bakteriellen exogenen Galactosidase zu diskriminieren. In Igur A wurde ein pH-Wert von 7,0 verwendet, und in Figur B betrug der pH-Wert 8,5. Dies ist die Zusammenfassung der Ergebnisse der Assays unter den verschiedenen experimentellen Bedingungen, und es ist einzusehen, dass die Einwirkung von Xgal-Lösung mit pH 8,5 auf das Gewebe es uns ermöglichte, die Expression von endogener Galactosidase zu eliminieren. Wir erhielten gefrorene Gewebeschnitte von verschiedenen Organen: Leber, Niere, Lunge, Herz, Gehirn und Milz, von normalen Ratten und von Ratten, die fünf bzw. acht Wochen lang mit CCl₄ vergiftet wurden. Wie in 8 gezeigt ist, zeigen die Graphiken eindeutig, dass das Hauptzielorgan die Leber ist, sowohl bei gesunden Ratten als auch bei Ratten mit chronischer Verabreichung von CCl₄. A) 5 Wochen CCl₄-Verabreichung und B) 8 Wochen CCl₄-Verabreichung. Milz und Lunge weisen einen Transduktionsgrad von unter 1% auf, und somit geht dies nicht aus den Graphiken hervor. Ratten erhielten Dosen von 3 × 10¹¹ viralen Partikeln/ml Ad5gal-Vektor. Die gesunden Kontrollratten wiesen insgesamt 70% transduzierte Hepatocyten auf, während Milz und Lunge weniger als 1% Transduktion zeigten. In den anderen Organen wurde keine Transduktion gefunden. Gewebeschnitte wurden von gesunden Ratten erhalten, wie es oben beschrieben ist, und mit Geweben von Ratten mit 2 bzw. 4 Wochen BDL verglichen. 9 zeigt eindeutig, dass die Leber das Hauptzielorgan ist, sowohl bei gesunden Ratten als auch bei BDL-Ratten. A) 2 Wochen LCB und B) 4 Wochen BDL. Die Milz und die Lunge weisen einen Transduktionsgrad von unter 1% auf, und somit ist er in Graphiken kaum festzustellen. Mit einer Dosis von 3 × 10¹¹ viralen Partikeln/ml des AD5gal-Vektors weisen BDL-Ratten insgesamt 10% transduzierte Hepatocyten auf. Neben der Leber wiesen Milz und Lunge weniger als 1% Transduktion auf. Die anderen Organe zeigten keine Transduktion. In 10 sind histologische Ergebnisse bei dem Leberzirrhosemodell, das durch die chronische Verabreichung von CCl₄ induziert wurde, gezeigt, wobei A) einen Leberschnitt einer normalen Ratte 72 Stunden nach der Verabreichung von Ad5-gal durch die Darmbeinvene darstellt (ein repräsentativer Schnitt der Experimente an insgesamt 5 Ratten). Mehr als 70% der Hepatocyten sind positiv in Bezug auf die Expression von gal (200 x); D) dieselbe Leber wie in Figur A, aber mit Siriusrot angefärbt, um die Collagensynthese und -ablagerung zu beobachten (200 x); B) Leber mit 5 Wochen chronischer Vergiftung mit CCl₄. Etwa 30–40% der Hepatocyten wurden erfolgreich transduziert; E) dieselben Lebern wie in B, aber mit Siriusrot angefärbt; die Erhöhung der Menge an Collagen ist zu bemerken, und die Leberarchitektur beginnt sich zu verzerren (200 x); C) Rattenleber nach 8 Wochen chronischer Vergiftung mit CCl₄, so dass eine Zirrhose induziert wurde; wiederum waren mehr als 40% der Leberzellen positiv in Bezug auf die βgal-Expression; und F) dieselben Lebern wie in C, aber mit Siriusrot angefärbt. Große Ablagerungen von Collagen, die sich zwischen der Lebervene und der Pfortader bildeten (200 x), sind charakteristisch. In 11 sind Ergebnisse gezeigt, die im Modell der durch Abbindung des Gallengangs (BDL) induzierten Zirrhose erhalten wurden. A) zeigt einen Leberschnitt einer normalen Ratte 72 Stunden nach der Verabreichung von Ad5-gal durch die Darmbeinvene (ein repräsentativer Schnitt der Experimente an insgesamt 5 Ratten). Mehr als 70% der Hepatocyten sind positiv in Bezug auf die Expression von gal (200 x); D) dieselbe Leber wie in Figur A, aber mit Siriusrot angefärbt, um Collagen zu beobachten (200 x); B) Rattenleber nach 2 Wochen BDL. Ein β-gal-Assay wurde 72 Stunden nach der Ad5βGal-Verabreichung durch die Darmbeinvene durchgeführt. Etwa 10% der Hepatocyten wurden erfolgreich mit dem Reportergen transduziert; E) dieselben Lebern wie in B, aber mit Siriusrot angefärbt. Die Leberarchitektur beginnt sich aufgrund einer Colestaseinduzierten Fibrose sowie aufgrund der großen Zunahme der Gallengänge zu verzerren (200 x); C) Rattenleber nach 4 Wochen BDL, so dass eine Zirrhose verursacht wurde. Ein β-gal-Assay wurde 72 Stunden nach der Ad5βGal- Verabreichung durch die Darmbeinvene durchgeführt. Wiederum wurden 10% der Hepatocyten erfolgreich transduziert; und F) dieselben Lebern wie in C, aber mit Siriusrot angefärbt. Man beobachte die große Ablagerung von Collagenproteinen, die sich gebildet hat, sowie die Proliferation von Gallengängen (200 x). 12 zeigt eine Laparotomie einer gesunden Wistar-Ratte, die den pAdGFP-MMP-8-Vektor erhielt. Die Expression des GFP ist eindeutig in der Leber und in unbedeutenden Mengen in der Milz zu erkennen. Eine sehr wichtige Tatsache besteht darin, dass die Injektion von adenoviralen Vektoren bei Versuchstieren, sowohl gesunden als auch Kontrollen, keine letale Toxizität induzierte.
Die bevorzugte Methode, um die vorliegende Erfindung anzuwenden, erfolgt durch die endovenöse Verabreichung der rekombinanten adenoviralen Vektoren dieser Erfindung oder der diese enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei eine therapeutisch effektive Menge mit einem zweckmäßigen Dosierungsschema an ein Individuum verabreicht wird. Dieses Schema kann gemäß dem Grad der Erkrankung eingestellt werden. Im Allgemeinen werden Dosiseinheiten von etwa 10⁷ bis 10¹⁴ viralen Partikeln pro Individuum eingesetzt. Die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die adenoviralen rekombinanten Vektoren dieser Erfindung enthält, kann durch den Einsatz von Standardtechniken durchgeführt werden, die dem Fachmann sehr gut bekannt sind, in Kombination mit irgendwelchen der pharmazeutisch annehmbaren Trägern, die im Stand der Technik beschrieben sind, einschließlich unter anderem Stärke, Glucose, Lactose, Saccharose, Gel, Malz, Reis, Weizenmehl, Kreide, Silicagel, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerylmonostearatpulver, NaCl, Glycerin, Propylenglycol, Wasser, Ethanol und ähnliche. Diese Zusammensetzungen können die pharmazeutische Form von Lösungen, Suspensionen, Pillen, Tabletten, Kapseln, Pulvern und Formulierungen mit langsamer Freisetzung und ähnlichen annehmen.
Die obige Beschreibung und die folgenden Beispiele haben den Zweck, besondere Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen und sollten nicht als den Umfang dieses Patents einschränkend angesehen werden.
Beispiele
Beispiel 1
Methode, um die Aktivität von Metalloprotease oder Collagenase (MMP-8) nachzuweisen, und wie man ihre Funktion reguliert
a) Zellkultur
HepG2-Zellen sind eine Zelllinie mit parenchymaler Herkunft, die von einem humanen Hepatom abgeleitet ist, und wurden in 60-mm-Kulturschalen bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit einer Atmosphäre aus 95% Luft und 5% CO₂ in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das mit 10% fetalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamax und Antibiotika (100 E/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin) versetzt war, kultiviert.
b) Vektoren für die Expression von latenten und aktiven MMP-8-Genen
Zwei Plasmide wurden mit 2 Arten von MMP-8-Genen verwendet, um die Leberzellen zu transfizieren: Das Plasmid pcDNA-MMP-8, das die cDNA, die latentes MMP-8 (pro-MMP-8) codiert, zusammen mit dem starken viralen Promotor des Cytomegalievirus (CMV) enthält; und das Plasmid pcDNA₃-MMP-8, das die cDNA, die das aktive MMP-8 codiert, zusammen mit dem CMV-Promotor enthält. Letzteres wurde durch Subklonierung unter Verwendung von pcDNA₃- und PETIIa-HNC-Plasmiden, Schneiden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI und Einsetzen des PCR-Produkts, das für die katalytische Domäne von MMP-8 codiert (der das Propeptid- und das carboxyterminale Fragment fehlt), erzeugt, wie in 13 gezeigt ist, zur Abgabe von latenten und aktiven MMP-8-Genen. Zwei Typen von Plasmiden mit dem MMP-8-Gen wurden verwendet, um sie an Leberzellen in Kultur abzugeben: 1) pcDNA₃-MMP-8, Plasmid mit dem starken viralen Promotor des Cytomegalievirus (CMV) und der cDNA, die die Collagenase in ihrer aktiven Form codiert.
Als Reportergen wurde das Plasmid pSV₂-gal verwendet. Das Plasmid hat das Gen, das das Enzym Galactosidase codiert, neben dem SV40-Virus-Promotor insertiert.
C) Plasmidtransformation, Amplifikation und Reinigung
Um eine genügend große Menge jedes der Plasmide zu erhalten, die in den verschiedenen Assays verwendet werden sollen, wurde jedes Plasmid gemäß den Anweisungen des Herstellers (Life Technologies, Gaithersburg, MD) in E. coli DH5^TM eingeführt (dieser Vorgang ist als Transformation bekannt): In einem Reaktionsröhrchen wurden 50 μl des kompetenten Stamms DH5 verwendet, und 2 μl Plasmide (1–10 ng DNA) wurden hinzugefügt. Nach dem Mischen wurde 30 Minuten lang auf Eis inkubiert, ein thermischer Schock (37 °C während 20 Sekunden) wurde angewendet, und es wurde sofort 2 Minuten lang auf Eis abgeschreckt. Am Ende dieser Zeitspanne wurden 0,95 ml des Bakterienkulturmediums Luria Base (LB) hinzugefügt, und es wurde eine Stunde lang mit 225 U/min bei 37 °C gerührt, um eine Plasmidexpression zu ermöglichen. Nach der Expression wurden 50 μl der Reaktionsmischung entnommen und auf einer Agarplatte mit 100 g/ml Ampicillin ausgesät, und es wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Kolonien, die nach dieser Zeit wachsen, sind wegen der Resistenz gegenüber dem Antibiotikum diejenigen, die das interessierende Plasmid enthalten.
Um das Plasmid zu amplifizieren, wurden zwei Kolonien aus der Agarplatte entnommen und 24 Stunden lang bei 37 °C in einem Liter LB-Medium, das 100 g/ml Ampicillin enthielt, unter ständigem Rühren mit 225 U/min gezüchtet. Sobald die optische Dichte der Kultur 0,6 betrug, wurde sie 20 Minuten lang mit 6000 U/min zentrifugiert, um das Bakteriensediment zu gewinnen. Aus diesem Bakteriensediment wurde plasmidische DNA aus der genomischen DNA der Bakterien abgetrennt, wobei man einen Kit für Plasmidreinigung (Monster-Prep, BIO101, Vista, CA) verwendete, der auf der alkalischen Lyse der Bakterienwand, der Freisetzung des Plasmids ins Innere und der Abtrennung dieser DNA durch ein besonderes Harz beruht. Die Quantifizierung der plasmidischen DNA wurde durch spektrophotometrisches Messen der resultierenden Extinktion bei λ = 260 nm durchgeführt.
d) Transfektion von kultivierten Zellen
Eines der am häufigsten verwendeten Verfahren zur Einführung von Genen in eukaryontische Zellen ist die DNA-Transfektion mit Calciumphosphat, bei der die exogene DNA als feiner Komplex auf der Zelloberfläche ausgefällt wird, um später von der Zelle einverleibt und transient in die chromosomale DNA integriert zu werden. Um die DNA mit größerer Selektivität an die Leberzellen abzugeben, wird DNA in Form eines Komplexes mit Polylysin-Lactose verwendet, da Leberzellen einen spezifischen Rezeptor für Galactose in ihrer Zellmembran aufweisen. Dazu wurden HepG2-Zellen bei 70–80% Konfluenz kultiviert und dann mit den Plasmiden pcDNA-MMP-8, pcDNA₃-MMP-8 und pSV₂-Galactosidase transfiziert. Die Transfektion erfolgte durch DNA-Fällung mit Calciumphosphat (Graham und Van der Eb, 1973; Chen und Okayama 1988) und durch Komplexbildung mit Polylysin-Lactose (Martinez-Fong et al., 1994). Kurz gesagt, kultivierte Zellen wurden mit dem neu gebildeten Niederschlag versetzt, einem Produkt der Zugabe einer Lösung von DNA mit 2 M CaCl₂ in HEPES-Pufferlösung, pH 7,12, zu plasmidischer DNA im Falle der Transfektion mit Calciumphosphat, oder ein DNA-Komplex mit Polylysin-Lactose wird hinzugefügt. Zellen werden 4–16 Stunden lang inkubiert, damit der Niederschlag auf der Zelloberfläche erscheinen kann, und später kann die DNA endocytiert und transient in den Zellkern eingeführt werden. Am Ende dieser Zeit wird das Kulturmedium durch frisches ersetzt, siehe 14, wobei HepG2-Zellen mit DMEM-Medium mit 10% fetalem Rinderserum kultiviert werden. Wenn eine Konfluenz von 60–80% erreicht ist, werden 10 mg Plasmid mit MMP-8-Gen in seiner latenten Form sowie in der aktiven oder reifen Form hinzugefügt. Gleichzeitig wird das prokaryontische Gen von Galactosidase (gal) hinzugefügt, um die Transfektion und Expressionseffizienz zu überwachen. Das MMP-8-Gen wurde in verschiedenen Formen übertragen: nackt, im Komplex mit Calciumphosphat oder im Komplex mit Polylysin-Lactose.
e) Bildung von Komplexen aus Polylysin-Lactose und DNA: Polylysin-Lactose DNA:PL
Der Polylysin-Lactose-Komplex wird gebildet, wenn 14,8 mg Poly-L-Lysin (0,1 N) mit 200 μl 0,5 N Lactose reagieren (Lactose-Polylysin-Verhältnis: 1,0 N). Dann werden 20 mg des Reduktionsmittels Natriumcyanoborhydrid, 3 M, hinzugefügt, und es wird 48 Stunden lang bei 37 °C unter ständigem Rühren mit 225 U/min inkubiert. Dann geht die Reaktion durch eine Entsalzungssäule (BioRad 10-DG), die zuvor mit Phosphatpuffer (PBS pH 7,2) konditioniert wurde und mit demselben Puffer eluiert wird. Der Kohlenhydratgehalt der eluierten Fraktionen wird nach dem Verfahren von DuBois (1956) bestimmt, um den Grad der Lactosylierung des Komplexes zu analysieren, und der Gehalt an Polylysin wird nach dem Verfahren von Shen et al. (1984) bestimmt, das als Grundlage angesehen wird, um die endgültige Konzentration des PL-Komplexes zu bewerten. Die Fraktion mit einer hauptsächlichen Konzentration an PL wird für ihre weitere Reaktion mit der DNA des Plasmids, die das interessierende Gen enthält, verwendet, wie in den 14 und 16 gezeigt ist.
Um das optimale Stoffmengenverhältnis von DNA:PL zu bewerten, das in Transfektionsassays verwendet werden soll, ließ man die DNA mit mehreren Konzentrationen von PL reagieren. Am Ende von einer Stunde Inkubation wurden die Proben auf ein 1%iges Retardierungs-Agarose-Gel aufgetragen und einer DNA-Elektrophorese (60 Millivolt, 1,5 h) unterzogen, bei der der DNA: PL-Komplex mit den größten PL-Gehalten eine kürzere Strecke zurücklegt als das freie Plasmid (0% Retardierung). Das DNA: PL-Verhältnis, das 80 bis 90% Retardierung der Migration im Agarose-Gel verursacht, wurde verwendet, wie in 16 gezeigt ist, wobei man eine effiziente Expression von exogenen Genen von Galactosidase und pcDNA-MMP-8 erhielt, die in Komplexen mit Calciumphosphat und Polylysin-Lactose an HepG2-Zellen abgegeben wurden.
f) Assays der transienten Expression unter Verwendung des Reportergensystems von Galactosidase (gal)
Dieses System bestimmt die Aktivität des Galactosidase-Enzyms als Maß für das Expressionsniveau des interessierenden transfizierten Gens zusammen mit dem LacZ-Gen, das dieses Enzym codiert. Galactosidase ist ein bakterielles Enzym, das die Umwandlung des farblosen Substrats X-gal in ein blaues Produkt katalysiert. Deswegen weist die Galactosidase-Aktivität, die man bei eukaryontischen Zellen, die einer Transfektion unterzogen wurden, beobachtet, auf den erfolgreichen Einbau des interessierenden Gens hin, das mit dem bakteriellen Gen assoziiert ist.
Der gal-Assay auf Färbung von Zellen in Kulturschalen besteht in der Fixierung von Zellen bei 4 °C während 5 Minuten mit 2% p-Formaldehyd, dem anschließenden Waschen mit PBS (3x) und der Zugabe von 1 ml einer Färbelösung in PBS, die 20 mM Kaliumhexacyanoferrat(III), 20 mM Kaliumhexacyanoferrat(II) und 2 mM Magnesiumchlorid enthält, und der anschließenden Zugabe des Substrats Xgal in einer endgültigen Konzentration von 0,5 mg/ml. Nach der Inkubation bei 4 °C über Nacht (18 Stunden) werden blaue Zellen unter dem Mikroskop identifiziert (Ausubel, 1995).
g) RNA-Extraktion
48 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen gewonnen, um RNA nach dem Verfahren von Chomczynski und Sacchi (1987) zu extrahieren, wobei man das Reagens Trizol^TM verwendet, wie im Folgenden beschrieben ist: in jede der Zellschalen wurde 1 ml PBS-Lösung gegeben, und Zellen wurden gewonnen, indem man sie aus der Schale kratzte, und in ein Eppendorf-Röhrchen übertragen. Dann wurde eine Minute lang bei 1000 U/min zentrifugiert, und das Zellsediment wurde mit 500 μl Trizol behandelt, homogenisiert und 5 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. 100 μl Chloroform wurden hinzugefügt, und die Inkubation wurde 5 Minuten lang bei 4 °C durchgeführt. Danach wurde 15 Minuten lang bei 4 °C und mit 12 000 × g zentrifugiert, und die wässrige obere Phase wurde in ein sauberes Röhrchen, in das ein gleiches Volumen Isopropanol gegeben wird, übertragen und 15 Minuten lang bei –70 °C inkubiert, um die extrahierte RNA auszufällen. Dann wird 15 Minuten lang bei 4 °C mit 12 000 × g zentrifugiert, der Überstand wird durch Dekantieren und Trocknen des Röhrchens mit sauberem und sterilem Papier entfernt. Dann wurden 500 μl 75%iges Ethanol hinzugefügt, und es wurde 10 Minuten lang bei 40 °C mit 12 000 x g zentrifugiert. Schließlich wurde das RNA-Sediment mit 20 bis 50 μl entionisiertem Wasser, das mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt wurde, resuspendiert, und die RNA-Konzentration wurde durch Spektrophotometrie bei λ = 260 nm quantifiziert.
Analyse der Expression des MMP-8-Gens durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit der Reaktion von Reverser Transcriptase RT-PCR)
Um den Grad der Expression des exogenen Gens von MMP-8, das in die Zelle eingebaut wurde, zu bestimmen, wurde komplementäre DNA (cDNA) erhalten, wobei man von zuvor extrahierter RNA ausging und dann das Expressionssignal durch die Polymerase-Kettenreaktion amplifizierte.
Um die cDNA zu erhalten, wurde das folgende Verfahren verwendet: 2 g Gesamt-RNA wurden mit entionisiertem, sterilisiertem Wasser auf ein Volumen von 8 μl gebracht und 10 Minuten lang bei –70 °C inkubiert. Dann wurde die Probe 5 Minuten lang in Eiswasser gerührt, und immer noch im Eis wurden die folgenden Reagentien hinzugefügt: 4 μl 5x-Puffer für das RT-Enzym, 4 μl 2,5 mM dNTP-Mischung, 1 μl statistische Primer (1 g/l), 1 μl Inhibitor von RNase (1 E/I) und schließlich 2 μl des Enzyms Reverse Transcriptase (200 E/I). Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und dann eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurde es sofort 10 Minuten lang in eine Temperatur von 95 °C gegeben, und dann wurde es 5 Minuten lang unter ständigem Rühren auf Eiswasser gestellt und bis zur weiteren Verwendung bei –70 °C aufbewahrt.
Um die spezifische Expression des MMP-8-Gens zu analysieren, wurde eine PCR-Reaktion aufgebaut, wobei die für dieses Gen spezifischen Primer oder Oligonuc leotide gemäß den im Folgenden beschriebenen experimentellen Bedingungen verwendet wurden: In ein Reaktionsröhrchen, das 2 μl cDNA enthält, wurden 5 μl 2,5 mM MgCl₂, 5 μl 5x Puffer für das Polymerase-Enzym aus dem Moloney-Mäuseleukämievirus (MMLV), μl 2,5 mM dNTPs, 5 μl des Sense-Primers, 3 μM, 5 μl des Antisense-Primers, 3 μM, und 1 μl des Polymeraseenzyms (E/μl) gegeben, und es wird mit entionisiertem Wasser (Innis et al., 1990) auf ein Endvolumen von 50 μl gebracht. Der Oligonucleotid-Sense-Primer, der für MMP-8 spezifisch ist, ist 5'-AGCTGTCAGAGGCTGGAGGTAGAAA-3', und der Antisense-Primer ist 5'-CCTGAAAGCATAGTTGGGATACAT-3' (Cole et al., 1996). Nach der Zugabe dieser Reagentien wurde die Mischung gemäß dem folgenden Programm während 30 Cyclen in einen Thermocycler gegeben: Denaturierung (94 °C, 5 min), Assoziation (60 °C, 1 min) und Verlängerung (72 °C, 1,5 min). Dann werden die PCR-Produkte einer Elektrophorese (60 mV, 1,5 h) in einem 1,5%igen Agarose-Gel unterzogen.
i) Assay der Collagenase-Aktivität
Die Analyse der enzymatischen Aktivität von Collagenase wurde durchgeführt, um die Funktionalität des erzeugten Enzyms zu bestimmen, da dieses Protein sich als enzymatisch inaktiv erweisen könnte, selbst wenn die RNA-Expression positiv war. Die Zellen werden 24 Stunden lang in serumfreiem Medium kultiviert, das Kulturmedium wird gewonnen, und die Aktivität der von den Zellen sezernierten Collagenase wird durch ein modifiziertes Verfahren nach Hasty et al. (1986) bestimmt, um Abbauprodukte von spezifischem Collagensubstrat durch Elektrophorese auf 8%igem Polyacrylamid-Gel zu identifizieren.
Kurz: Zellüberstände, die 1–1,5 g Protein enthalten, wurden 18 Stunden lang bei 27 °C mit 5 g nativem Collagen Typ I und 60 μl des folgenden Inkubationspuffers inkubiert: 50 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl₂, 0,02% NaN₃, 50 mM Arginin, 1% Triton X-100, und zwar in Abwesenheit oder Anwesenheit von 1 mM APMA, pH 7,6. Schließlich wurden 30 μl Reaktionsprodukt mit 30 μl Probenpuffer für Proteine gemischt, und eine Elektrophorese in SDS-Polyacrylamid-Gelen (7,5%) wurde durchgeführt, um die Abbauprodukte 1^A und 2^A von Collagen Typ 1 zu identifizieren.
Beispiel 2
Ergebnisse, um die Aktivität von Metalloprotease oder Collagenase (MMP-8) nachzuweisen und daher ihre Funktion zu regulieren
Eine Subklonierung ermöglichte es, MMP-8-cDNA, die das voll funktionsfähige Enzym codiert, in einen für unsere Bedürfnisse geeigneten Vektor einzubauen. 15 zeigt also eine Elektrophorese der DNA-Fragmente, die durch Schneiden von MMP-8-Plasmiden mit Restriktionsenzymen freigesetzt werden. Spur A) bp-Marker für 1-kb-DNA-Leiter (Gibco BRL); B) perfekter DNA-Marker (Novagen, Inc.); 1) pcDNA-MMP-8, Schneiden mit BamHI und XbaI; 2) pcDNA3-MMP-8, Schneiden mit BamHI und XbaI; C) ϕX174-Marker (Gibco BRL); λ-HindIII-Marker (Gibco BRL), wobei die latente MMP-8-DNA (Spur 1) und die reife MMP (Spur 2) erfolgreich in die Expressionsvektoren pcDNA und pcDNA3 subkloniert wurden. Die freigesetzten Einschübe werden nach Behandlung mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI beobachtet. Die mit Ethidiumbromid angefärbten Banden entsprechen jeweils der cDNA (zwischen 506 und 560 Basenpaaren) für reife bzw. latente MMP-8-cDNA. Um die Effizienz des Einbaus der cDNA für MMP-8, die in Form eines Komplexes mit Calciumphosphat und mit Polylysin-Lactose an HepG2-Zellen abgegeben wurde, zu bewerten, wurde die Cotransfektion dieses Plasmids zusammen mit dem Reportergen von Galactosidase realisiert. Auf diese Weise weisen unter dem Mikroskop durch blaue Färbung beobachtete Zellen indirekt darauf hin, dass sie ebenfalls in das interessierende Plasmid eingebaut wurden. 16 zeigt die Expression von Galactosidase in HepG2-Zellen, die mit freiem Plasmid in Form des Komplexes mit Calciumphosphat oder in Form des Komplexes mit Polylysin-Lactose cotransfiziert wurden. Diese Figur zeigt, dass die DNA-Bindung an Polylysin-Lactose erreicht wurde, weil die Retardierung des gal-Plasmids um so eindeutiger war, je höher die Polylysin-Konzentration war. Das zum Transfizieren der Zellen gewählte Verhältnis war eines, das die Plasmidmigration zu 80% verzögerte.
Sobald nachgewiesen war, dass die Zellen in Kultur in der Lage sind, Gene einzubauen und nach der Transfektion zu exprimieren, war es notwendig, mittels RT-PCR-Assays zu bestätigen, dass solche Gene durch die Maschinerie von Wirtszellen transcribiert wurden. 17 zeigt eine RT-PCR-Analyse von mRNA für MMP-8 und MMP-13 (dieses Plasmid wurde als weitere positive Kontrolle der Transfektion verwendet), wobei eine DNA-Elektrophorese von PCR-amplifizierten Produkten der cDNA für MMP-8, die als Komplex mit Calciumphosphat und Polylysin-Lactose abgegeben wurde, für beide Fälle in transfizierten HepG2-Zellen transcribiert wurde. Es wird beobachtet, dass das PCR-Produktsignal für MMP-8 (359 Basenpaare) intensiver war, wenn das Plasmid als Komplex mit Polylysin-Lactose abgegeben wurde.
Um nachzuweisen, dass durch HepG2-Zellen exprimierte MMP-8-Transcripte zu einem funktionsfähigen Protein translatiert wurden, wurde der Assay für die enzymatische Aktivität durchgeführt, wobei Collagen Typ I als Substrat verwendet wurde. 18 zeigt die enzymatische Aktivität des in das Kulturmedium sezernierten Proteins in Bezug auf Abbau von Collagen Typ I, die bei den Zellen beobachtet wurde, die mit dem Gen für latentes MMP-8 bei vorheriger Aktivierung mit dem Quecksilberreagens APMA (Spur 7) und mit dem Gen für aktives MMP-8, komplexiert mit Calciumphosphat (Spur 9) und mit Polylysin-Lactose (Spur 10), transfiziert waren und ihre spezifische Hemmung mit 2 mM EDTA. Negative Kontrollen: Typ-I-Collagen ohne Zugabe von Überständen von Zellen (Spur 1) und mit Zugabe von Trypsin (Spur 3), Collagen mit Überständen von Zellen ohne Transfektion (Spur 2). Positive Kontrollen: Typ-I-Collagen mit Überstand von humanen Leukocyten (Spur 3), Typ-I-Collagen mit Zugabe von 0,015% bakterieller Collagenase (Spur 4); und Zersetzungsprodukte von nativem Collagen Typ I, aufgetrennt in einem 6%igen Polyacrylamid-Gel, nachdem es mit dem Überstand von Zellen inkubiert wurde, die mit latentem und aktivem MMP-8-Gen transfiziert waren. Es wurde beobachtet, wie in beiden Fällen die collagenolytische Aktivität in Gegenwart von APMA im Falle von latentem MMP-8 eindeutig ist, und ihre Hemmung durch EDTA sowohl bei latentem als auch bei aktivem MMP-8. Diese Tatsache zeigt, dass diese proteolytische Aktivität einer Metalloprotease der interstitiellen Matrix entspricht. Die Inkubation von nativem Collagen Typ I mit Trypsin zeigte keinen Abbau. Dieses Experiment zeigt also eindeutig, dass die MMP-8-Wirkung spezifisch war, wenn man die intakte Natur des Collagenmoleküls in Betracht zieht.
19 zeigt einen Beweis dafür, dass die Aktivitäten der Enzyme, die Collagen spezifisch abbauen, gesteuert (abgeschaltet und/oder eingeschaltet) werden können, indem man ihre jeweiligen cDNAs kloniert, die sich selbst unter der Transcriptionskontrolle von Promotoren von regulierbaren Genen, wie des PEPCK-(Phosphoenol-Pyruvat-Carboxykinase)-Gens, befinden. Es ist klar, dass die Stimulation von Zellen in Kultur mit Glucagon (Spur 5 und 6) und cyclischem AMP (Spur 7 und 8) deren Produktion von mRNA, die für MMP-8 codiert, hochreguliert. Es ist auch klar, dass Insulin diese Produktion senkt (Spur 9 und 10).
Die Beobachtungen bezüglich der Aktivität von endogener Galactosidase lassen vermuten, dass diese Aktivität gewöhnlich granulär ist und eine schwächere Farbe hat als das Dunkelblau als Ergebnis der Aktivität des exogenen Enzyms (Shimohama S, Rosenbergh MB, Fagan AM, Wolff JA, Short MP, Bradfield XO, Friedman T und Gage FH: Genetically Modified Cells into the rat brain: Characteristics of E. coli-Galactosidase as a reporter gene, Brain Res. 5: 271–278, 1989). Viele Modifikationen wurden beschrieben, um die Spezifität bei der Bestimmung von exogenem LacZ-Gen zu erhöhen. So etwa gemäß früheren Informationen von Weiss DJ, Ligitt D und Clark JG, In situ histochemical detection of betagalactosidase activity in lung. Assessment of Xgal reagent in distinguishing Lac Z gene Expression and endogenous galactosidase activity. Human Gene Therapy, 1. September 1997, 8: 1545–1554; in der vorliegenden Erfindung wurde eine Lösung von X-gal mit einem pH-Wert von 8,5 verwendet; auf diese Weise wurde die Aktivität von exogenem gal nachgewiesen, was die endogene Aktivität in vivo minimiert.
Einer der Indikatoren, die tatsächlich für die in-vivo-Überwachung der Effizienz und des Ortes von mit rekombinanten Adenoviren transduzierten Zellen verwendet werden, ist der Nachweis der Expression von grünem fluoreszentem Protein (GFP). Zu diesem Zweck wird das Gen, das für dieses Protein codiert, in adeno viralen Vektoren subkloniert, und dann kann durch Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops die von GFP abgegebene Fluoreszenz direkt beobachtet werden, ohne das Versuchstier, das den Vektor erhielt, zu töten (Rojas-Martinez A, Wyde PR, Montgomery CA, Chen SH, Woo SLC und Aguilar-Cordova E: Distribution toxicity and lack of replication of an E1A-recombinant adenoviral vector after systemic delivery in the cotton rat, Cancer Gene Ther. 1998, und TongChuan H, Shibin Z, Luis T, Jian Y, Kenneth W und Vogelstein Berth: A simplified system for generating recombinant adenoviruses, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95: 2509–2514, März 1998). Eine große Datenmenge wurde erhalten, die zeigt, dass die Hauptzielzellen nach der intravenösen Verabreichung von Adenoviren bei gesunden Tieren Hepatocyten waren. Dies wurde bei Mäusen, Kaninchen, Hunden und Primaten beobachtet (Zern AM und Kresina TF, Hepatic drug delivery and gene therapy, Hepatology 1997, Vol. 25, Nr. 2, 484–491), aber nicht bei zirrhotischen Ratten. Wahrscheinlich könnte die Injektion in die Pfortader effizienter sein, um zu den Zielzellen in der Leber zu gelangen, wobei man sie mit einem günstigen Impfmaterial aus viralen Partikeln für die gesamte Leber versorgt, bevor sie im Blutstrom verdünnt werden. Dieser Weg ist effizient, aber er hat den Nachteil, dass er eine Laparotomie erfordert. Andererseits ist die peritoneale Verabreichung eine schnellere und einfachere Infusion, fördert aber nicht die Transduktion von Hepatocyten. Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung zeigen, dass die Injektion von 3 × 10¹¹ viralen Partikeln durch die Darmbeinvene bei normalen Wistar-Ratten von ungefähr 200 g ein sehr hohes Expressionsniveau erzeugt (70% transduzierte Hepatocyten). Unsere Ergebnisse sind mit einem früheren Bericht konsistent, bei dem die spezifische Abgabe von Reportergenen bei Primaten über die Rosenvene fast dasselbe Niveau der Transduktion und Expression des Transgens in der Leber erzeugte wie die Infusion durch die Pfortader (Marie Jean TFD, Poeters V, Lieber A, Perkins J und Kay MA, Methods for multiple portal vein infusion in mice: Quantitation of adenovirusmediated hepatic gene transfer, Biotechniques Februar 1996, 20; 278–285, und Zhu G, Nicholson AG, Zheng X, Strom TB und Sukhame VP, Adenovirus mediated galactosidase gene delivery to the liver leads to protein deposition in kidney glomeruli, Kidney International, 1997, Vol. 52, 992–999). Weiterhin war die Expression des Reportergens bei unseren Tieren mit durch chronische Verabrei chung von CCl₄ induzierter Zirrhose überraschenderweise fast so hoch wie bei normalen Ratten (40% transduzierte Hepatocyten). Diese Ergebnisse sind sehr aufregend, da unsere zirrhotischen Tiere kaum das chirurgische Verfahren überleben konnten, das erforderlich wäre, um das Adenovirus über die Pfortader zu verabreichen. Dies ist auf veränderte Leberfunktionstests und eine erhöhte Prothrombinzeit sowie starkes Bluten zurückzuführen. Obwohl Ratten mit einer Abbindung des Gallengangs eine erhebliche Reduktion in der Anzahl der transduzierten Hepatocyten (5–10%) zeigten, ist auch die Zahl der Hepatocyten wichtig, die schließlich mit therapeutischen Genen, wie Metalloproteasen (MMP-8) und/oder Genen, die für die Leberregeneration stimulierende Proteine, wie uPA (Urokinase-Plasminogen-Aktivator) und Smad 7, codieren, transduziert werden konnten.
* Die Definitionen der in den Figuren, die der vorliegenden Erfindung entsprechen, verwendeten Symbole sind im Folgenden gezeigt:
1:

CEH

= hepatische Sternzelle

CES

= Sinusoid-Endothelzelle

CK

= Kupffer-Zelle

ES

ET = subendothelialer Raum

HE

= Hepatocyten

HIDC

= Leber mit chronischem Schaden

HN

= normale Leber

SINU

= Sinusoid

2:

COLASA

= Collagenase

DCA

= Abbau von Collagen

TGE

= experimentelle Gentherapie

MMPs

= Metalloproteasen

3:

CT293

= Cotransfektion in 293-Zellen

PG CsCl

= Reinigung mit CsCl-Gradienten

4:

BD

= rechter Arm

BI

= linker Arm

CTBK

= Cotransfektion in Bakterien und Selektion in Kanamycin

CUL

= Kultur

Li PacI

= linearisieren mit PacI

Li PmeI

= linearisieren mit PmeI

PV

= virale Partikel

T293

= Transfektion von 293-Zellen

GENADR

= Erzeugung von rekombinantem Adenovirus

7:

B

= Milz

CE

= Hirn

CO

= Herz

%CT

= Prozent der transduzierten Zellen

H

= Leber

P

= Lunge

R

= Niere

Sad5β-gal

= ohne den Ad-gal-Vektor

CAD5β-gal

= mit dem Ad-gal-Vektor

X-GAL7

= reaktives X-gal, pH 7,0

X-GAL8.5

= reaktives X-gal, pH 8,5

8:

B

= Milz

CCl45

= 5 Wochen Vergiftung mit CCl₄

CCl48

= 8 Wochen Vergiftung mit CCl₄

CE

= Hirn

CO

= Herz

%CT

= Prozent der transduzierten Zellen

H

= Leber

P

= Lunge

R

= Niere

PV

= virale Partikel

HN

= normale Leber

9:

B

= Milz

CE

= Hirn

C

O = Herz

%CT

= Prozent der transduzierten Zellen

H

= Leber

LCB2S

= 2 Wochen Abbinden des Gallengangs

LCB4S

= 4 Wochen Abbinden des Gallengangs

P

= Lunge

R

= Niere

PV

= virale Partikel

HN

= normale Leber

13:

PR

OT = Protein

APMA

:Quecksilberaminophenylacetat

14:

ACT-β-gal

= Galactosidase-Aktivität

CES

= Zellen

EAC

= enzymatische Aktivität

PL

= Polylysin

PR

OT = Protein

RGAL

= Galactosereste

SNAD

= Überstand

16:

ADND

= nackte DNA

GELRADN-PL

= Retardierungsgel für Polylysin

18:

CA

= mit APMA

CACE

= mit APMA und EDTA

CaPO₄

= Phosphat

CE

= mit EDTA

COB

= bakterielle Collagenase

COL1

= Collagen Typ I

PL

= Polylysin

SA

= ohne APMA

SNL

= Leukocytenüberstand

ST

= nicht transfiziert

TRIP

= Trypsin

20:

%CT

= Prozent der transduzierten Zellen

PV

= virale Partikel

Claims

Rekombinanter adenoviraler Vektor, der ein adenovirales Genom enthält, von dem die offenen Leseraster E1 und/oder E3 deletiert wurden, das aber noch genügend Sequenz behält, um den adenoviralen Vektor zur Replikation in vitro zu befähigen, wobei der Vektor auch ein therapeutisches Gen oder eine interessierende DNA-Sequenz enthält, das bzw. die von ubiquitären Promotoren und/oder gewebespezifischen Promotoren reguliert wird und für das therapeutische Protein MMP-8 codiert.
Rekombinanter adenoviraler Vektor gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem gewebespezifischen Promotor um PEPCK handelt.
Rekombinanter adenoviraler Vektor gemäß Anspruch 1, der aus einem viralen Vektor oder einem nichtviralen Vektor besteht.
Rekombinanter adenoviraler Vektor gemäß Anspruch 3, der aus einem nichtviralen Vektor besteht, der aus einem Plasmid oder einem kationischen oder anionischen Liposom ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten adenoviralen Vektors gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei das Verfahren den Schritt des Klonierens der Reporter-Gene LacZ und GFP und des therapeutischen Gens oder der interessierenden DNA-Sequenz umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen rekombinanten adenoviralen Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–4, kombiniert mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei für ein Individuum mit Fibrose jede Einheitsdosis 10⁷ bis 10¹⁴ Viruspartikel umfasst.
Verwendung des rekombinanten adenoviralen Vektors gemäß einem der Ansprüche 1–4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Leberzirrhose.