DE60115070T2

DE60115070T2 - Expressionsvektoren mit hybriden ubiquitin-promotoren

Info

Publication number: DE60115070T2
Application number: DE60115070T
Authority: DE
Inventors: Nelson Yew
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2000-09-18
Filing date: 2001-09-13
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2021-09-14
Also published as: ES2252293T3; JP2016019524A; JP6209566B2; JP2004516016A; EP1319082B1; US7452716B2; JP2013048624A; AU2001290984A1; ATE310096T1; WO2002024932A3; US20070003521A1; DE60115070D1; US20020090719A1; WO2002024932A2; EP1319082A2; US6667174B2; JP2018007673A; CA2423082A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Expressionsvektoren, die hybride Ubiquitin-Promotoren enthalten. Die Promotoren sind, neben anderen Verwendungen, brauchbar für eine hohe und dauerhafte Transgenexpression bei der in vivo und ex vivo-Gentherapie und für eine rekombinante Protein-Expression in vitro.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ubiquitin ist ein reichlich vorhandenes, kleines Protein mit 76 Aminosäuren, das in allen eukaryotischen Zellen exprimiert wird (Ciechanover et al., 2000; Wilkinson et al., 2000). Dieses Protein bindet kovalent an anormale, fehlgefaltete oder kurzlebige Proteine und markiert sie dabei zur Zerstörung in Proteasomen (Ciechanover, siehe oben). Ubiquitin assoziiert auch mit Histonen und kann bei der Regulierung der Genexpression eine Rolle spielen (Spencer und Davie, 1999). Die Codierungssequenz ist evolutionär bemerkenswert konserviert und vom Insekt bis zum Menschen identisch. Beim Menschen gibt es mindestens drei bekannte Ubiquitin-Gene namens UbA, UbB und UbC, die jeweils eine, drei oder neun genaue, direkte Repeats der Codierungseinheit mit 76 Aminosäuren zu enthalten scheinen (Baker und Board, Nucleic Acids Research, 15: 443–463 (1987); Lund et al. 1985; Nenoi, et al. 1996, und Wiborg et al., EMBO J., 4: 755–759 (1985). Die menschlichen UbB- und UbC-Gene wurden sequenziert, und es zeigte sich, dass sie zwar keine Introns in ihren Codierungsregionen, aber jeweils ein Intron in der 5'-flankierenden Region enthalten (Baker und Board, siehe oben; Nenoi, siehe oben). Es wurde gezeigt, dass der UbC-Promoter eine ubiquitäre Expression mit hohem Niveau ergab, wenn er in transgene Mäuse eingesetzt bzw. in Plasmid-DNA-Vektoren integriert wurde (Johansen et al., FEBS 267: 289–294 (1990); Schorpp et al., Nucleic Acids Research, 24: 1787–1788 (1996); Wulff et al., 1990).
Der Promoter des menschlichen Cytomegalovirus (CMV) (siehe US-Patent 5,849,522, US-Patent 5,168,062) stellt bekanntlich eine starke konstitutive Expression von Transgenen mit hohen Niveaus bereit. Bei gentherapeutischen Anwendungen zeigte sich jedoch, dass sich die mit dem CMV-Promoter erzielten Expressionsniveaus mit der Zeit signifikant verringerten.
Daher besteht weiterhin ein Bedarf, verbesserte Regulierungselemente bereitzustellen, die in der Lage sind, eine hohe und dauerhafte Expression von Transgenen bei solchen Anwendungen wie der Gentherapie zu ergeben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt hybride Regulierungsregionen bereit, die einen Ubiquitin-Promoter zusammen mit einem oder mehreren starken Enhancern verwenden. Ferner stellt die vorliegende Erfindung DNA-Vektoren bereit, die eine hohe und dauerhafte Expression assoziierter Codierungssequenzen ergeben.
Gemäß einer Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf einen rekombinanten Expressionsvektor gerichtet, der einen oder mehrere Enhancer umfasst, die mit dem 5'-Ende eines Ubiquitin-Promoters verbunden sind, welcher operabel mit einer ein therapeutisches Gen codierenden DNA-Sequenz verknüpft ist.
Nach einer anderen Ausführungsform ist die Erfindung auf einen rekombinanten Expressionsvektor gerichtet, der einen CMV-Enhancer umfasst, welcher mit dem 5'-Ende eines Promoters verbunden ist, der aus humanem Ubiquitin B isoliert ist, welches operabel mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die Alpha-Galactosidase codiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf einen rekombinanten Expressionsvektor gerichtet, der einen CMV-Enhancer umfasst, welcher mit dem 5'-Ende eines Promoters verbunden ist, der aus humanem Ubiquitin B isoliert ist, das operabel mit einer Glucocerebrosidase codierenden DNA-Sequenz verknüpft ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Diagramm von Plasmid-DNA-Vektoren. Ub, humaner Ubiquitin B-Promoter; Intron, ein Hybrid eines Adenovirus- und Maus-Immunoglobulin-Genintrons; SEAP, sezernierte humane, alkalische Phosphatase-cDNA aus der Plazenta; pA, Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignal; Ub-Intron, das endogene Intron im UBB-Gen; CAT, Chloramphenicolacetyltransferase-cDNA; CMV enh, unmittelbare, frühe Gen-Enhancer-Region des menschlichen Cytomegalovirus (–522 bis –219, bezogen auf die Transkriptionsanfangsstelle); CMV, unmittelbarer, früher Cytomegalovirus-Gen-Enhancer-Promoter (–522 bis +78, bezogen auf die Anfangsstelle).
2: SEAP-Expression aus pUB-SEAP und pUBI-SEAP in menschlichen Atemwegsepithelzellen. A) CFT-1-Zellen wurden mit pUB-SEAP, pUBI-SEAP oder mit pCF1-SEAP, komplexiert mit dem kationischen Lipid GL-67 (10,5 μM GL-67:30 μM pDNA), transfiziert. Das Gewebekulturmedium wurde 2 Tage nach Transfektion gesammelt und auf SEAP-Expression getestet. B) BEAS-Zellen wurden mit pUB-SEAP, pUBI-SEAP oder mit pCF1-SEAP, komplexiert mit dem kationischen Lipid GL-67 (10,5 μM GL-67:30 μM pDNA), transfiziert. Das Gewebekulturmedium wurde 2, 4 und 6 Tage nach Transfektion gesammelt und auf SEAP-Expression getestet. n = 4 Vertiefungen pro pDNA. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.
3: Persistenz der CAT-Expression aus pUBI-CAT in der Mäuselunge. A) 75 μl des kationischen Lipides GL-67, komplexiert mit pUBI-CAT oder mit pCF1-CAT (0,6:3,6 mM GL67:pDNA), wurden BALB/c-Nacktmäusen intranasal eingeflößt. Die Lungen wurden an unterschiedlichen Tagen nach Injektion geerntet und die CAT-Mengen in den Lungenhomogenisaten gemessen. B) 100 μl des kationischen Lipides GL-62, komplexiert mit pUBI-CAT oder mit pCF1-CAT (0,75:0,75 mM GL62:pDNA) wurden BALB/c-Nacktmäusen über die Schwanzvene injiziert. Die Lungen wurden an unterschiedlichen Tagen nach Injektion geerntet und die CAT-Mengen in den Lungenhomogenaten gemessen. n = 4 Mäuse pro Zeitpunkt. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.
4: Persistenz der CAT-Expression aus pCUBI-CAT in der Mäuselunge. A) 75 μl des kationischen Lipides GL-67, komplexiert mit pCUBI-CAT oder mit pCF1-CAT (0,6:3,6 mM GL-62:pDNA), wurden BALB/c-Nacktmäusen intranasal eingeflößt. Die Lungen wurden an unterschiedlichen Tagen nach Injektion geerntet und die CAT-Mengen in den Lungenhomogenisaten gemessen. B) Gruppen von Mäusen wurde am 26. Tag eine zweite Dosis des GL-67:pCUBI-CAT-Komplexes eingeflößt. Die Lungen wurden am 28. und 84. Tag (nach der ersten Dosis) geerntet, und es wurden CAT-Assays durchgeführt. n = 4 Mäuse pro Gruppe. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.
5: Persistenz der SEAP-Expression aus pCUBI-SEAP in der Mäuseleber. 1,9 ml einer Mirus-Freisetzungslösung (siehe Methoden), die 10 μg pCUBI-SEAP oder pCF1-SEAP enthielt, wurde Beige/SCID-Mäusen über die Schwanzvene injiziert. Blut wurde 1, 14, 28 und 42 Tage nach Injektion entnommen, und die Niveaus der SEAP-Aktivität im Serum wurden gemessen. Jede Linie steht für eine einzelne Maus.
6: Diagramm von α-Galactosidase A-Vektoren. CMV enh, unmittelbare, frühe Gen-Enhancer-Region des menschlichen Cytomegalovirus (–522 bis –219, bezogen auf die Transkriptionsanfangsstelle); Ub, humaner Ubiquitin B-Promoter; Ub-Intron, das endogene Intron im UBB-Gen; HAGA, humane α-Galactosidase-cDNA; BGH pA, Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignal; ori-min, minimaler Ursprung der Replikationsregion; Kan-syn, synthetisches, Nicht-CpG-Kanamycin-Widerstandsgen. pGZA-HAGA ist, abgesehen davon, dass der gesamte CMV-Promoter an Stelle des CMV-Ub-Promoters vorliegt, identisch.
7. Persistenz der α-Galactosidase A-Expression aus pGZCUBI-HAGA und pGZA-HAGA in der Mäuselunge. A) 75 μl des kationischen Lipides GL-67, komplexiert mit pGZCUBI-HAGA, pGZA-HAGA oder pCFA-HAGA (0,6:3,6 mM GL-62:pDNA) wurden BALB/c-Nacktmäusen intranasal eingeflößt. B) 100 μl des kationischen Lipides GL-62, komplexiert mit pGZCUBI-HAGA oder pGZA-HAGA (0,6:3,6 mM GL-62:pDNA) wurden BALB/c-Nacktmäusen intravenös injiziert. Sowohl bei A) als auch bei B) wurden Lungen an unterschiedlichen Tagen nach der Verabreichung geerntet und die α-Galactosidase A-Mengen mittels ELISA bestimmt. n = 4 Mäuse pro Gruppe. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.
8. Sequenz des CMV-Enhancer-Ubiquitin B-Promoters und seiner Intronregion. Die CMV-Enhancer-Region erstreckt sich von –522 bis –219, bezogen auf die Transkriptionsstartstelle. Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren Sp1, CREB/ATF und NF B sind angegeben. Die UbB-Promoter-Region beginnt bei –1093, bezogen auf die Translations-ATG-Startstelle. Die putative TATA-Box ist eingerahmt und die mögliche CAP-Stelle ist durch das ausgefüllte Dreieck angegeben. Die Intron-Region ist mit Kleinbuchstaben dargestellt. Zwei direkte Repeats innerhalb des UbB-Introns sind durch einen Überstrich angegeben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
DNA-Vektoren, bei denen der Ubiquitin B-Promoter das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Reportergen steuert, führten zu einer dauerhaften Expression, wenngleich mit niedrigen Niveaus. Es wurde ein Hybrid konstruiert, bei dem der CMV-Enhancer und der Ubiquitin B-Promoter miteinander ligiert waren, um CAT zu exprimieren. Das Ergebnis war eine dauerhafte Expression mit signifikant höheren Niveaus als mit dem Ubiquitin B-Promoter alleine. Eine dauerhafte Expression unter Verwendung der hybriden Ubiquitin-Promoter nach der vorliegenden Erfindung wurde in verschiedenen Geweben, einschließlich Lunge und Leber, erreicht.
Bei bevorzugten Ausführungsformen wird ein Expressionsvektor konstruiert, in dem der Promoter aus den humanen Ubiquitin A-, Ubiquitin B- oder Ubiquitin C-Genen oder aus Ubiquitin-Genen anderer Spezien isoliert ist. Zu den bevorzugten Enhancern zählen Mensch- und Maus-Cytomegalovirus(CMV)- Enhancer (siehe US-Patent 5,849,522; US-Patent 5,168,062), Elongationsfaktor 1-alpha-Enhancer, endothelspezifische Enhancer und leberspezifische Enhancer, sowie andere konstitutive oder induzierbare Enhancer-Elemente, die in der Lage sind, die Expression, insbesondere in der Lunge, zu unterstützen.
Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen können Plasmidvektoren vollständig oder teilweise hinsichtlich immunstimulatorischer CpG-Sequenzen deletiert sein. Verfahren und Materialien zur Herstellung solcher CpG-deletierten Plasmide und DNA-Sequenzen sind in der PCT-Veröffentlichung WO 00/14262 beschrieben.
Zu den bevorzugten therapeutischen Genen zur Abgabe an Zellen zählen die hämatopoietischen Faktoren, einschließlich Faktor VIIa [ US 4,784,950 ], Faktor VIII [US 4,965,199; US 4,868,112 [B-Domäne deletiert] und US 5,661,008 ] und Faktor IX [ US 4,994,371 ]. Andere bevorzugte Transgene sind diejenigen, die lysosomale Speicherenzyme codieren, wie Gene, die Glucocerebrosidase [Gaucher-Krankheit; US 5,879,680; US 5,236,838]; alpha-Galactosidase [Fabry-Krankheit; US 5,401,650 ]; saure alpha-Glucosidase [Pompe-Krankheit; WO00/12740]; alpha-n-Acetylgalactosaminidase [Schindler-Krankheit; US 5,382,524 ]; saure Sphingomyelinase [Niemann-Pick-Krankheit; US 5,686,240 ] und alpha-Iduronidase [WO9310244A1], codieren. Weitere bevorzugte Transgene umfassen die Gene für den Zystische Fibrose Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR), Dystrophin, Insulin und alpha-1-Antitrypsin.
Eine anhaltende Genexpression ist für zahlreiche genetische Erkrankungen erforderlich, die für eine Gentherapie sowie für eine rekombinante Proteinexpression in vitro in Frage kommen. Die Expression erfolgt häufig vorübergehend aus Plasmid-DNA (pDNA)-Vektoren, die virale Promoter wie den des Cytomegalovirus (CMV) enthalten. Wir konstruierten Expressionsvektoren, die das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Reportergen enthielten, das aus dem Ubiquitin B-Promoter (pUBI-CAT) exprimiert wird, und bewerteten die Persistenz ihrer Expression in der Mäuselunge. Kationische Lipid-pDNA-Komplexe wurden BALB/c-Nacktmäusen intranasal verabreicht und die CAT-Mengen in der Lunge untersucht. Die CAT-Expression aus pUBI-CAT war zunächst niedrig, stieg dann jedoch am 35. Tag auf das 4- bis 9-Fache derjenigen eines Vektors an, der den CMV-Promoter (pCF1-CAT) einsetzt. Dann fügten wir den CMV-Enhancer am 5'-Ende des UbB-Promoters an. Die CAT-Expression aus diesem Vektor (pCUBI-CAT) war am 2. Tag gleich der von pCF1-CAT und am 58. Tag 40-mal höher als die von pCF1-CAT. Da frühere Studien zeigten, dass das Entfernen immunstimulatorischer CpG-Motive aus pDNA-Vektoren deren Toxizität verringert, konstruierten wir auch CpG-defiziente Versionen von pCUBI-CAT und synthetisierten CpG-defiziente, Codon-optimierte cDNAs, die alpha-Galactosidase, Glucocerebrosidase und Faktor IX codieren, zur Insertion in den pCUBI-Vektor. Diese Kombination eines dauerhaften Promoters und einer CpG-Verringerung kann die größere Persistenz und Wirksamkeit ergeben, die für ein gewerblich anwendbares Gen-Therapeutikum erforderlich sind.
Dauerhafte therapeutische Mengen eines Genproduktes aus einer vorgegebenen Dosis eines Gentherapie-Vektors sind bei zahlreichen Erkrankungsindikationen erwünscht. Wir zeigten hier, dass die Transgenexpression aus pDNA-Vektoren, die den humanen Ubiquitin B-Promoter enthalten, sehr stabil sein kann und in manchen Situationen die einzigartige Eigenschaft aufweist, mit der Zeit sogar anzusteigen. Wenn die starken Enhancer-Elemente des humanen CMV-Promoters an den Ub-Promoter angefügt wurden, war die Reportergen-Expression aus dem CMV-Ub-Hybrid-Promoter in der Lunge robust und hielt mindestens drei Monate an. Die Expression eines therapeutischen Transgens, alpha-Galactosidase A, wurde ebenfalls aufrechterhalten, wobei die Niveaus während des einmonatigen Zeitraums der Studie stetig anstiegen.
Die Erkenntnis, dass eine langfristige Transgenexpression aus einer episomalen pDNA aufrecht erhalten werden konnte, stützt die Behauptung, dass der Haupteinschränkungsfaktor für eine dauerhafte Expression die Promoter-Aktivität ist. Systeme, welche die Stabilität von pDNA in der Zelle erhöhen, wie z. B. die Verwendung von Kern-Retentionselementen, Replikationsursprüngen oder eukaryotischen Transposons, tragen zwar zur Verlängerung der Genexpression [1, 2, 27] bei. Jedoch wurde gezeigt, dass nach dem anfänglichen massiven Verlust an Input-pDNA äußerst niedrige, aber detektierbare Mengen an pDNA über mehrere Monate stabil in den Geweben beibehalten werden [3, 28]. Die Target-Zellen für die meisten synthetischen Vektoren, d.h. die Lungenepithel- oder -endothelzellen (bei kationischen Lipid-pDNA-Komplexen), die Leber-Hepatocyten oder Skelettmuskeln sind vollständig differenziert und haben einen sehr niedrigen Stoffumsatz [29]. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die im transduzierten Gewebe vorhandenen Restmengen an pDNA ausreichend stabil sind, um eine dauerhafte Expression zu vermitteln.
Der Mechanismus für die dauerhafte Transkriptionsaktivität des Ubiquitin-Promoters ist nicht bekannt, und wir können nur spekulieren, dass die Aktivität wohl zumindest teilweise mit den normalen Funktionen von Ubiquitin in der Zelle zusammenhängt. Ubiquitin ist konstitutiv zum Entfernen anormaler oder fehlgefalteter Proteine sowie zur Modifikation von Histonen, die zur Genaktivierung führen, erforderlich und unterliegt daher möglicherweise nicht der Herunterregulierung, die bei zahlreichen viralen Promotoren zu beobachten ist [12, 14]. Ubiquitin wird auch als Antwort auf Zell-Stress induziert, und die Expression kann möglicherweise als Antwort auf Zellnekrose and -apoptose induziert werden, die bekanntlich mit der Verabreichung der kationischen Lipid-pDNA-Komplexe zusammenhängen, was den mit der Zeit beobachteten Anstieg der Expression erklären könnte [25, 30]. Andere Möglichkeiten sind, dass der Promoter zu frühen Zeitpunkten unterdrückt werden kann oder dass mit der Zeit eine allmähliche Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren zum Promoter hin vorliegt.
Auf der Suche nach potentiellen Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen im Ub-Promoter wurden mögliche Stellen für CEBP/B, CREB, GATA-2, Sp1 und andere gefunden, aber die tatsächlichen Faktoren, die diesem Promoter zuzuordnen sind, werden eine weitere Analyse erfordern. Die CMV-Enhancer-Region, die im CMV-Ub-Hybrid verwendet wird, fügt mehrere Sp1-, CREB- und NFkB-Stellen hinzu, die zur signifikant erhöhten Transkriptionsaktivität beitragen [31]. Anders als CMV wurde der CMV-Ub-Hybrid jedoch mit der Zeit nicht herunterreguliert. Der in CMB-Ub verwendeten CMV-Enhancer-Sequenz fehlen zwar einige bekannte Repressor-Bindungsstellen, wie z. B. die Stellen für den zellulären Gfi-Repressor, doch sie enthält noch Stellen für YY1, das als Repressor fungieren kann [32, 33]. Die CMV-Sequenz alleine, ohne den Ub-Promoter, ergab von sich aus ebenfalls keine dauerhafte Expression (Daten nicht gezeigt). In gewisser Weise scheint die Gruppe von am Ub-Abschnitt des Hybrid-Promoters beteiligten Faktoren die normale Inaktivierung von CMV aufgehoben und die Aktivität bewahrt zu haben.
Die hier unter Verwendung der alpha-Galactosidase A-Vektoren gezeigten Ergebnisse legen nahe, dass eine Eliminierung von CpG-Motiven innerhalb des Plasmids mit der Zeit ebenfalls die Inaktivierung von CMV beeinflusste. Der pGZA-HAGA-Vektor, der einen unmodifizierten CMV-Promoter, aber auch ein CpG-reduziertes Rückgrat enthielt, war nach IN-Gabe dauerhafter als sein nicht-CpG-reduziertes Gegenstück (7A). Nach IV-Gabe war der Vektor nicht so dauerhaft, aber die Abnahme der Expression war deutlich geringer, als dies üblicherweise bei einem nicht-CpG-reduzierten Vektor zu beobachten ist. Wenngleich der diesem Effekt zugrunde liegende Mechanismus unklar ist, wurde gezeigt, dass immunstimulatorische CpG-Motive eine wichtige Rolle bei der entzündlichen Reaktion im Zusammenhang mit kationischen Lipid-pDNA-Komplexen und folglich bei der Inhibierung der Transgenexpression aus pDNA-Vektoren spielen [34, 35]. Der Verlust der Expression könnte durch direkte Inhibierung der Promoter-Aktivität oder durch Eliminierung transfizierter Zellen aufgrund einer CTL-Antwort auf die immunstimulatorischen CpG-Motive auftreten [36]. Somit wäre bei einer Verringerung dieses negativen Effektes durch Verringerung des Gehaltes an immunstimulatorischen CpG-Motiven und durch Aufnahme des inhärent dauerhafteren CMV-Ub-Promoters ein Expressionsprofil zu erwarten, das eine Kombination beider positiven Faktoren ist, und die Daten scheinen diese Annahme zu bestätigen.
Trotz der verbesserten Leistungsfähigkeit dieser Vektoren waren die Mengen an alpha-Galactosidase A, die nach IV- oder IN-Gabe erhalten werden konnten, noch immer niedriger als die, die erforderlich gewesen wären, um therapeutisch zu sein [23]. Ein bereits vorhandener Ansatz für dieses Problem besteht darin, Gentransfer-Vehikel zu entwickeln, die potenter sind als derzeitige kationische Lipid-pDNA-Formulierungen. Angesichts der zu beobachtenden dauerhaften und stetig steigenden Mengen an alpha-Galactosidase A (7) kann es auch möglich sein, die Gesamtmengen durch mehrfache Neudosierung des Vektors zu erhöhen. Es wäre vorherzusehen, dass eine wiederholte Dosierung zu signifikant höheren Expressionsniveaus führen würde, als sie mit einer Einzeldosis erreicht werden könnten. Diese Möglichkeit wird derzeit untersucht.
Der CMV-Ubiquitin-Hybrid-Promoter wird für jede in vitro- oder in vivo-Anwendung brauchbar sein, die eine dauerhafte Genexpression erfordert. Im Zusammenhang mit der Gentherapie kann dies Pulmonarerkrankungen, wie zystische Fibrose und alpha-1-Antitrypsin-Defizienz, sowie andere vererbten genetischen Störungen, wie Hämophilie, Störungen des Harnstoffzyklus, familiäre Hypercholesterolämie, Phenylketonurie, und die Familie der Störungen der lysosomalen Speicherung umfassen. Für gewisse Erkrankungen kann die Lunge oder die Leber potentiell als Depotorgan zur Sezernierung des Proteins in den Blutstrom dienen. Dies erfordert notwendigerweise eine relativ dauerhafte Expression, um im Blut ausreichende therapeutische Niveaus zu erreichen, damit das Protein wiederum von den Zielorganen aufgenommen wird. Der CMV-Ubiquitin-Hybrid-Promoter kann auch im Zusammenhang mit viralen Vektoren (z. B. Adenovirus- und adenoassoziierte Virusvektoren) und in anderen Geweben, wie Muskeln oder Gehirn, brauchbar sein. Es gibt noch immer signifikante Einschränkungen, denen mit synthetischen Gen-Abgabevektoren zu begegnen ist, aber die Fähigkeit, eine dauerhafte Genexpression aus dem CMV-Ubiquitin-Hybrid-Promoter zu verleihen, wird eine wichtige Komponente eines praktikablen und effektiven Gentherapeutikums bereitstellen.
Transgenexpression aus dem Ubiquitin-Promoter in kultivierten menschlichen Atemwegsepithelzellen
Die bei diesen Studien verwendeten pDNA-Vektoren sind in 1 gezeigt. Das pUB-SEAP-Plasmid enthält die sezernierte Form der humanen, plazentalen alkalischen Phosphatase (SEAP)-cDNA unter der Transkriptionskontrolle des humanen Ubiquitin B(Ub)-Promoters, und enthält ein Intron (ein Hybrid eines Adenovirus- und Maus-Immunglobulin-Genintrons) unmittelbar stromabwärts der Ub-Promotersequenz. Das Plasmid pUBI-SEAP ist, abgesehen davon, dass es das Ubiquitin B-Intron an Stelle des Hybrid-Introns enthält, mit pUB-SEAP identisch. Das Kontrollplasmid pCF1-SEAP enthält die unmittelbare, frühe Gen-Enhancer- und -Promoter-Sequenz des menschlichen Cytomegalovirus (CMV).
Zunächst bestimmten wir wegen unseres Interesses an nicht-viral vermittelter Genabgabe für Pulmonar-Indikationen die Expression aus dem Ub-Promoter in Lungenepithelzellen. CFT1-Zellen, eine menschliche CF-Atemwegsepithelzelllinie, wurden mit pUB-SEAP, pUBI-SEAP oder pCF1-SEAP transfiziert, und zwei Tage später wurden die SEAP-Mengen im Medium getestet (2A). Die Expression aus pUB-SEAP war deutlich niedriger als die aus pCF1-SEAP, das den CMV-Promoter enthielt. Die Expression aus pUBI-SEAP war ebenfalls niedriger als die von pCF1-SEAP, aber im Vergleich zu pUB-SEAP etwa 5-mal höher, was einen vorteilhaften Effekt der Verwendung des eigenen Introns des Ubiquitin-Gens auf die Expression zeigt. Die Konstrukte wurden auch in BEAS-Zellen, eine menschliche Bronchialepithel-Zelllinie, transfiziert, und die SEAP-Expression wurde während sechs Tagen gemessen (2B). Wie bei den CFT1-Zellen beobachtet wurde, war die SEAP-Expression aus pCF1-SEAP am 2. Tag nach der Transfektion signifikant höher als aus pUB-SEAP oder pUBI-SEAP. Bis zum 6. Tag nach der Transfektion war die Expression aus pCF1-SEAP jedoch deutlich gesunken, während die Expression aus pUBI-SEAP konstanter war. Die Zellzahl und die Konfluenz waren für jede Vertiefung gleich, wobei es für eine erhöhte Toxizität in mit pCF1-SEAP transfizierten Zellen im Vergleich zu Zellen, die pUBI-SEAP erhielten, keine Anzeichen gab. Diese in vitro-Daten legten nahe, dass pDNA-Vektoren, die den Ubiquitin-Promoter beherbergen, im Vergleich zu Vektoren, die den CMV-Promoter enthalten, eine niedrigere, aber stabilere Transgenexpression ergaben.
Persistenz der Transgenexpression aus pUBI-CAT in der Mäuselunge
Zur Untersuchung, ob das oben beobachtete Expressionsprofil auch in vivo realisiert wurde, bestimmten wir Niveau und Dauer der CAT-Expression aus UBI-CAT in der Mäuselunge. Das Expressionsprofil wurde mit dem Plasmid pCF1-CAT verglichen, das den CMV-Promoter enthält. Die pDNAs wurden mit dem kationischen Lipid GL-67 komplexiert und dann BALB/c-Nacktmäusen intranasal eingeflößt. Um die Komplikationen einer Immunantwort auf das Escherichia coli-CAT- Enzym bei der Bestimmung der Promoter-Persistenz zu vermeiden, wurden immundefiziente Mäuse verwendet. Im Einklang mit früher beobachteten Ergebnissen [24] war die Expression aus pCF1-CAT am 2. Tag nach dem Einflößen zunächst hoch, sank dann jedoch innerhalb der ersten 21 Tage um das 100-fache (3A). Im Gegensatz dazu war die Expression aus pUBI-CAT am 2. Tag sehr niedrig, stieg dann mit der Zeit aber stetig an und war bis zum 35. Tag etwa 8- bis 10-mal höher als die CAT-Niveaus aus pCF1-CAT zu diesem Zeitpunkt. Als der pUBI-CAT-Vektor intravenös verabreicht wurde, war die CAT-Expression zunächst wieder äußerst niedrig und lag am 1. Tag nach Injektion bei nahezu undetektierbaren Niveaus (3B). Bis zum 35. Tag war die Expression jedoch um 2 log gestiegen und war 3- bis 4-mal höher als die Niveaus von CAT aus pCF1-CAT zu diesem Zeitpunkt. Somit wurde eine größere Persistenz der Transgenexpression sowohl in Lungenepithel- als auch -endothelzellen in vivo erreicht, wenn das Transgen sich unter der Transkriptionskontrolle des Ubiquitin-Promoters befand.
Persistenz der Transgenexpression aus pCUBI-CAT in der Mäuselunge
Wenn gleich signifikant verlängert, sind die Niveaus der Transgenexpression aus pUBI-CAT für eine praktische Anwendung wahrscheinlich zu niedrig. Zur Erhöhung der absoluten Niveaus der Transgenexpression fügten wir einen Abschnitt des humanen CMV-Enhancers unmittelbar bei 5' am Ubiquitin B-Promotersequenz an, um pCUBI-CAT zu erzeugen (1). Für die in vivo-Studien wurden BALB/c-Nacktmäusen kationische Lipid-pCUBI-CAT-Komplexe eingeflößt und die Niveaus der CAT-Expression in der Lunge bis zu 84 Tage gemessen (4A). Wenn gleich sie im Vergleich zu pCF1-CAT niedriger war, war die anfängliche CAT-Expression aus pCUBI-CAT im Vergleich zu pUBI-CAT, dem der CMV-Enhancer fehlt, signifikant erhöht (etwa 2 log) (siehe 3). Wie zuvor zu sehen war, ging die CAT-Expression aus pCF1-CAT innerhalb der ersten paar Wochen rasch zurück, wobei am 84. Tag eine vernachlässigbare CAT-Expression verblieb. Im Gegensatz dazu war die CAT-Expression aus pCUBI-CAT über diesen Zeitraum nahezu konstant, wobei am 84. Tag etwa 50% der CAT-Niveaus vom 2. Tag verblieben. Gruppen von Mäusen wurde auch eine zweite Dosis pCUBI-CAT gegeben, um festzustellen, ob eine erneute Dosierung die Expressionsniveaus weiter erhöhen könnte (4B). Die CAT-Expression am 28. Tag bei Mäusen, die am 26. Tag eine zweite Dosis erhielten, stieg gegenüber den Mäusen, die nur eine Einzeldosis erhalten hatten, etwa um das Zweifache- an, und dieser Unterschied blieb bis zum 84. Tag bestehen. Die CAT-Mengen der Mäuse mit der erneuten Dosis betrugen am 84. Tag etwa 100% der Mengen vom 2. Tag. Diese Ergebnisse zeigten, dass der CMV-Ub-Hybrid-Promoter über mindestens 12 Wochen eine robuste, im Wesentlichen unverminderte Expression bereitstellen konnte, und dass eine erneute Dosierung inkremental höhere Niveaus einer dauerhaften Expression ergeben konnte.
Dauerhafte Transgenexpression aus pCU81-SEAP in der Mäuseleber
Die Leber ist ein weiteres wichtiges Zielorgan für virale und auch synthetische Genabgabe-Vektoren. Zur Bestimmung des Expressionsprofils des CMV-Ubiquitin-Hybrid-Promoters in der Leber wurde pDNA unter Anwendung eines Protokolls abgegeben, das Leberhepatocyten wirksam transduziert (siehe Verfahren). 10 μg pCUBI-SEAP oder pCF1-SEAP würden Beige/SCID-Mäusen über die Schwanzvene injiziert, und die in das Serum sezernierten SEAP-Mengen wurden 1, 14, 28, und 42 Tage nach Injektion gemessen (5). Die anfänglichen Mengen an SEAP im Serum waren sowohl bei pCUBI-SEAP als auch bei pCF1-SEAP äußerst hoch (größer als 1 mg/ml am 1. Tag). Wie in der Lunge zu sehen war, ging die Expression aus pCF1-SEAP in den ersten zwei Wochen drastisch zurück, wobei am 42. Tag niedrige Niveaus vorlagen. Die Expression aus pCUBI-SEAP ging wesentlich langsamer zurück, wobei am 42. Tag signifikante Mengen an SEAP verblieben. Die Mengen an SEAP in der Leber waren am 42. Tag ebenfalls entsprechend hoch (1198 μg SEAP ± 208 μg pro 100 mg Gewebe). Diese Ergebnisse zeigten, dass der CMV-Ub-Hybrid-Promoter auch eine dauerhafte Expression aus der Leber sowie aus der Lunge bereitstellen konnte.
Persistenz der Transgenexpression aus einem CpG-reduzierten CMV-Ubiquitin-Promoter-Vektor
Wir und andere haben zuvor gezeigt, dass die im pDNA-Vektor vorhandenen immunstimulatorischen CpG-Motive eine wichtige Rolle beim Hervorrufen einer akuten entzündlichen Reaktion nach IN- oder IV-Gabe von kationischen Lipid-pDNA-Komplexen spielen [25, 26]. Um den pCUBI-Vektor für die systemische Verwendung geeigneter zu machen, konstruierten wir eine CpG-reduzierte Version, pGZCUBI, die einen unmodifizierten Ub-Promoter und ein unmodifiziertes Intron, aber ein CpG-reduziertes Rückgrat, das aus einem synthetischen Nicht-CpG-Gen besteht, das Kanamycin widerstandsfähig macht, und einen minimalen Replikationsursprung enthält. In diesen Vektor setzten wir die cDNA ein, die humane alpha-Galactosidase A (HAGA) codiert (6). Der pGZCUBI-HAGA-Vektor enthält 306 CpG-Motive (beide pDNA-Stränge werden gezählt), was mit pGZA-HAGA, einem CpG-reduzierten Vektor, der alpha-Galactosidase A aus dem CMV-Promoter exprimiert und 292 CpG-Motive enthält, vergleichbar ist. Im Gegensatz dazu enthält der nicht-CpG-reduzierte CMV-Promoter-Vektor pCFA-HAGA 482 CpG-Motive. Komplexe, die pGZCUBI-HAGA, pGZA-HAGA, oder pCFA-HAGA enthielten, wurden BALB/c-Nacktmäusen IN eingeflößt oder IV injiziert, und die Niveaus der alpha-Galactosidase A-Expression in der Lunge im Laufe der Zeit wurden gemessen (7). Nach IN-Gabe ging die alpha-Galactosidase A-Expression aus pCFA-HAGA rasch zurück, wie dies zuvor bei der CAT-Expression aus pCF1-CAT zu beobachten war (7A). Die Expression aus dem CpG-reduzierten pGZA-HAGA war jedoch mit unverminderten Niveaus bis zum 35. Tag deutlich dauerhafter. Die Expression von alpha-Galactosidase A aus pGZCUBI-HAGA war am 2. Tag nach dem Einflößen sowohl mit pCFA-HAGA als auch mit pGZA-HAGA vergleichbar, stieg dann jedoch mit der Zeit stetig an, und am 35. Tag war die Expression zehnmal höher als die anfänglichen Niveaus am 2. Tag (7A).
Nach IV-Gabe ging die alpha-Galactosidase A-Expression aus pGZA-HAGA bis einschließlich zum 21. Tag rasch zurück und erholte sich dann am 35. Tag leicht (7B). Obwohl die Expression aus pGZCUBI-HAGA anfangs niedriger als die von pGZA-HAGA war, stieg sie über den Zeitraum von 35 Tagen stetig an. Zusammen genommen zeigten diese Ergebnisse, dass der CMV-Ub-Promoter eine dauerhafte Expression von alpha-Galactosidase ergab und dass eine Verringerung des CpG-Gehaltes der pDNA alleine ebenfalls die Persistenz der alpha-Galactosidase-Expression verbesserte. Eine CpG-Verringerung war für eine dauerhafte Expression aus dem CMV-Ub-Promoter nicht erforderlich, wie mit den nicht-CpG-reduzierten Vektoren pCUBI-CAT und pCUBI-SEAP gezeigt wurde (4 und 5). Als jedoch sowohl die CpG-Reduktion als auch der CMV-Ub-Promoter in einen Vektor eingebracht wurden, waren die Mengen an alpha-Galactosidase A am 35. Tag sowohl bei IN- als auch bei IV-Gabe nicht nur aufrechterhalten worden, sondern deutlich höher als die Mengen zu Beginn.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Plasmidvektor-Konstruktionen
Zur Konstruktion von pUB-SEAP, das die sezernierte Form der humanen plazentalen, alkalischen Phosphatase (SEAP) exprimiert, wurde der humane Ubiquitin B-Promoter [17] aus menschlicher Genom-DNA (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Pfu-Polymerase amplifiziert. Die amplifizierte Sequenz entspricht den Nukleotiden –1093 bis –741, bezogen auf den Rest A des ATG-Initiationscodons. Der CMV-Promoter in pCF1-SEAP [8] wurde mit PmeI und XbaI exzisiert und durch das PCR-Produkt ersetzt, das den UBB-Promoter enthielt, um pUB-SEAP zu bilden. Zur Konstruktion von pUBI-SEAP wurden der humane UBB-Promoter und sein Intron wie oben mittels PCR amplifiziert, dann in pBC12/PL/SEAP (Tropix, Bedford, MA) eingesetzt, wobei das Translations-initiierende ATG von SEAP an Stelle des Ubiquitin-ATG-Codons positioniert wurde. Das UBB-Promoter-Intron-SEAP-Fragment wurde mit BglII und XhoI exzisiert, mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I gebluntet, dann in die geblunteten PmeI- und NotI-Stellen von pCFA [8] eingesetzt, um pUBI-SEAP zu erzeugen. pUBI-CAT wurde in ähnlicher Weise wie pUBI-SEAP konstruiert, wobei der UBB-Promoter und das Intron stromaufwärts von CAT insertiert wurden.
Zur Konstruktion von pCUBI-SEAP wurde pUBI-SEAP mit MfeI linearisiert und gebluntet. pCFA wurde mit SphI und NcoI verdaut und gebluntet, und das 300 bp CMV-Enhancer-Fragment wurde gereinigt. Das CMV-Enhancer-Fragment wurde in die MfeI-Stelle von pUBI-SEAP ligiert, um pCUBI-SEAP zu bilden. Die Sequenz der Enhancer/Promoter/Intron-Region von pCUBI-SEAP/pCUBI-CAT ist in 8 gezeigt. Zur Konstruktion von pCUBI-CAT wurde pCUBI-SEAP mit BamHI und SphI verdaut und das 3.2 kb-Vektor-Rückgratfragment isoliert. pUBI-CAT wurde mit BamHI und SphI verdaut, und das 1.7 kb-Fragment, welches das UBB Intron-CAT cDNA-BGH-Poly A enthielt, wurde isoliert und dann mit dem 3.2 kb-Fragment ligiert, um pCUBI-CAT zu bilden.
Zur Konstruktion von pCFA-HAGA, das humane alpha-Galactosidase A (HAGA) exprimiert, wurde pCFA mit NotI verdaut und dann mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I gebluntet. Die humane alpha-Galactosidase A-cDNA wurde aus pGB83 (freundlicherweise von Dr. G. Barsomian bereitgestellt) mit BamHI und EcoRI exzisiert, mit Klenow gebluntet, und in die gebluntete NotI-Stelle von pCFA ligiert, um pCFA-HAGA zu bilden. Zur Konstruktion des CpG-reduzierten Vektors pGZA-HAGA wurde pGZA-sCAT (zuvor als pGZA-CAT bezeichnet) [35] mit NotI verdaut (um die sCAT-cDNA zu entfernen) und gebluntet, und das Vektorrückgrat wurde gereinigt. Dieses Vektorrückgrat enthält ein synthetisches Nicht-CpG-Kanamycin-Widerstandsgen und eine minimale Replikationsursprungsregion [35]. Das gebluntete humane alpha-Galactosidase A-cDNA-Fragment aus pGB83 (siehe oben) wurde dann in die gebluntete NotI-Stelle von pGZA ligiert, um pGZA-HAGA zu bilden.
Zur Konstruktion des CpG-reduzierten Vektors pGZCUBI-HAGA wurde die CMV-Enhancer-UBB-Promoter-UBB-Intron-Region mittels PCR aus pCUBI-CAT unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die eine MfeI-Stelle am 5'-Ende und eine NotI-Stelle am 3'-Ende des PCR-Produktes aufweisen. Das PCR-Produkt wurde in einen Shuttle-Vektor kloniert, dann mit MfeI und NotI exzisiert. pGZA-sCAT wurde mit MfeI und NotI verdaut, wobei die CMV-Promoter-Intron-sCAT-cDNA entfernt wurde, und das PCR-Produkt wurde hineinligiert, um pGZCUBI zu erzeugen. Das gebluntete humane alpha-Galactosidase A-cDNA-Fragment aus pGB83 (siehe oben) wurde dann in die gebluntete NotI-Stelle von pGZCUBI ligiert, um pGZCUBI-HAGA zu erzeugen.
Kanonische Lipide und Plasmid-DNA
Die kanonischen Lipide GL-67 (N⁴-Spermincholesterlcarbamat) und GL-62 (N¹-Spermincholesterlcarbamat) wurden zuvor beschrieben [24]. Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Diphytanoylphosphatidylethanolamin (DphPE) und Dimyristoylphosphatidylethanolamin (DMPE), kovalent mit Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 5000 Dalton (DMPE-PEG₅₀₀₀) gekoppelt, wurden von Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) erworben. GL-67 wurde als GL-67:DOPE:DMPE-PEG₅₀₀₀ (1:2:0,05 Mol:Mol) formuliert und GL-62 wurde als GL-62:DPhPE:DMPE-PEG₅₀₀₀ (1:1:0,05 Mol:Mol), wie beschrieben [24].
Plasmid-DNA wurde mittels alkalischer Lyse, Ultrafiltration und Säulenchromatographie gereinigt [24]. Die bei diesen Studien verwendete, gereinigte pDNA enthielt weniger als 10 μg E. coli-Chromosom-DNA pro mg pDNA und weniger als 10 Endotoxineinheiten pro mg pDNA, wie mit dem chromogenen Limulus-Amöbocyten-Lysat-Assay festgestellt wurde (BioWhittaker, Walkersville, MD).
In vitro-Transfektionen
CFT1-Zellen, eine immortalisierte, menschliche Trachealepithel-Zelllinie eines Patienten mit zystischer Fibrose (CF), wurden freundlicherweise von Dr. James Yankaskas bereitgestellt [37]. BEAS-Zellen, eine menschliche Bronchialepithel-Zelllinie, wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) erhalten. Mit den Zellen wurden Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung beimpft. In jede Vertiefung wurden 0,5 ml von Komplexen aus kationischem Lipid GL-67:pDNA (10,5:30 μM) gegeben. Fünf Stunden nach Transfektion wurden die Komplexe entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Die SEAP-Mengen in den Zellkulturmedien wurden achtundvierzig Stunden später bestimmt. Für jeden pDNA-Vektor wurden vier Vertiefungen transfiziert.
Verabreichung von Komplexen aus kationischem Lipid: pDNA und von blanker pDNA an Mäuse
Zur intrapulmonaren Freisetzung wurden BALB/c (nu/nu)-Mäusen 75 μl kationisches Lipid GL-67:pDNA (0,6:3,6 mM), wie zuvor beschrieben, intranasal eingeflößt [24]. Zur systemischen Freisetzung wurden Mäusen 100 μl kationisches Lipid GL-62:pDNA (0,75:0,75 mM oder 1:1 mM) über die Schwanzvene injiziert. Zur Abgabe von pDNA an die Leber erhielten Mäuse Injektionen (Mirus Corporation, Madison, WI) über die Schwanzvene unter Verwendung des von Zhang et al. beschriebenen, raschen Protokolls für große Volumina [38]. Kurzum, 10 μg Plasmid-DNA (bei 1 mg/ml) wurden mit Trans IT In Vivo-Polymerlösung (Mirus Corporation) im Verhältnis 1:1 (v:w) vermischt, mit Wasser auf ein Volumen von 200 μl eingestellt, 2 bis 4 Sekunden vortexiert, und dann 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde dann in der Mirus-Freisetzungslösung auf etwa 2 ml verdünnt und anschließend über einen Zeitraum von 6 bis 8 Sekunden in die Schwanzvene injiziert. Mit dieser Prozedur wurde gezeigt, dass pDNA hauptsächlich von den Leberhepatocyten aufgenommen wird [38, 39]. 14, 28 und 42 Tage nach Injektion wurden die Mäuse anästhetisiert und deren Blut mittels retroorbitaler Blutentnahme gesammelt. Das Serum wurde dann bei –80 C gelagert.
Enzym-Assays
Die in die Medien von Gewebekulturzellen sezernierten SEAP-Mengen wurden mit einem Fluoreszenz-Enzymaktivitäts-Assay wie beschrieben bestimmt [8]. Die SEAP-Mengen in Mäuseserum wurden mit einem kolorimetrischen Assay getestet. Das Serum wurde in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung auf bis zu 1:200 verdünnt und dann 20 Minuten bei 65°C hitzeinaktiviert. Ein alkalisches Phosphatase-Reagens (150 μl) (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) wurde zu 50 μl der verdünnten Probe (in einer Platte mit 96 Vertiefungen) gegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und dann wurde die Absorption bei 405 nm bestimmt. Humane, plazentale alkalische Phosphatase (Calbiochem, San Diego, CA) wurde als Standard verwendet. Die CAT-Enzymaktivität wurde aus Lungenhomogenisaten wie beschrieben bestimmt [24]. Die alpha-Galactosidase A-Mengen in der Lunge wurden durch eine enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen alpha-Galactosidase A wie beschrieben quantifiziert [23]. Dieser Antikörper erkennt spezifisch Menschen- aber nicht Mäuse-alpha-Galactosidase A.
Die obigen Beispiele sind nicht einschränkend und nur zu Veranschaulichungszwecken angegeben. Für den Fachmann ist nach Studium der hier enthaltenen Offenbarung ohne weiteres ersichtlich, dass zahlreiche Modifikationen, Ergänzungen und Verbesserungen möglich sind. Solche Modifikationen, Ergänzungen und Verbesserungen sind Teil der vorliegenden Erfindung.

Claims

Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend einen oder mehrere Enhancer, die mit dem 5'-Ende eines Ubiquitin-Promoters verbunden sind, der opperabel mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die ein therapeutisches Gen kodiert.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei der Ubiquitin-Promoter aus einem Gen isoliert ist, das unter der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus humanem Ubiquitin A, Ubiquitin B und Ubiquitin C.
Rekombinanter Expressionsvektor nach den Ansprüchen 1 oder 2, ferner umfassend ein Hybrid-Intron, welches ein Hybrid-Intron eines adenoviralen und maus-immunglobulin-Gen Intron ist.
Rekombinanter Expressionsvektor nach den Ansprüchen 1 oder 2, ferner umfassend ein Ubiquitin B-Intron.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 2, wobei der Enhancer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Cytomegalovirus(CMV)-Enhancer, einem Elongationsfaktor 1-Alpha-Enhancer, endothelial-spezifischen Enhancern und leber-spezifischen Enhancern.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei der Enhancer ein CMV-Enhancer ist.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei der Expressionsvektor verändert wurde, um zumindest eine CpE-Sequenz zu eliminieren, die in den nativen Sequenzen vorliegt.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei der Ubiquitin-Promoter aus humanem Ubiquitin B isoliert ist.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei das therapeutische Gen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Faktor VIIa, Faktor VIII und Faktor IX besteht.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei das therapeutische Gen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glukocerebrosidase, Alpha-Galaktosidase, Säure-Alpha-Glukosidase, Alpha-n-Acetylgalaktosaminidase, Säure-Singomyelinase und Alpha-Iduronidase besteht.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei das therapeutische Gen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus CFTR, Distrophin und Alpha-1-Antitrypsin.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend einen CMV-Enhancer, der mit dem 5'-Ende eines Promoters verbunden ist, der aus humanem Ubiquitin B isoliert ist, welches operabel mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die für Alpha-Galaktosidase kodiert.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend einen CMV-Enhancer, der mit dem 5'-Ende eines Promoters verbunden ist, der aus humanem Ubiquitin B isoliert ist, welches operabel mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die Glykocerebrosidase kodiert.