JP2020511521A - ｉｎ ｖｉｖｏでの核酸発現のためのシステム及び方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、（例えば、治療効果を生じるのに必要とされる長期間の治療レベルで）対象、ヒトまたは非ヒト哺乳動物において、１つ以上の生体分子を発現させるための組成物、システム、キット、及び方法を提供する。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、カチオン性ミセル、カチオン性エマルション、またはカチオン性ポリマー）を含む第１の組成物、及び、１つ以上の目的の生体分子をコードする発現ベクター（例えば、リポソームまたは他の担体に関連付けられていない非ウイルス発現ベクター）を含む第２の組成物を含む組成物、システム、キット、及び方法が提供される。

Description

本出願は、２０１７年３月２３日に出願された米国仮出願第６２／４７５，４７７号の優先権を主張し、この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［発明の分野］
本発明は、（例えば、治療効果を生じるのに必要とされる長期間の治療レベルで）対象、ヒトまたは非ヒト哺乳動物において、１つ以上の生体分子を発現させるための組成物、システム、キット、及び方法を提供する。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、カチオン性ミセル、カチオン性エマルション、またはカチオン性ポリマー）を含む第１の組成物、及び、１つ以上の目的の生体分子をコードする発現ベクター（例えば、リポソームまたは他の担体に関連付けられていない非ウイルス発現ベクター）を含む第２の組成物を含む組成物、システム、キット、及び方法が提供される。
最も単純な非ウイルス遺伝子送達システムは、裸の発現ベクターＤＮＡを使用する。特定の組織、特に筋肉への遊離ＤＮＡの直接注入は、高レベルの遺伝子発現を生じさせることが分かっており、このアプローチの単純さは、多数の臨床プロトコールにおいてその採用につながった。特に、このアプローチは、癌ワクチンとして機能するかもしれない腫瘍抗原を発現させるために、ＤＮＡを腫瘍内に直接注入するかまたは筋細胞に注入することが可能な癌の遺伝子治療に適用されてきた。
プラスミドＤＮＡの直接注入は遺伝子発現をもたらすことが分かっているが、全体的な発現レベルはウイルスベクターまたはリポソームベクターよりもはるかに低い。裸のＤＮＡはまた、一般に、血清ヌクレアーゼの存在のために、全身投与には不適当であると考えられている。その結果、プラスミドＤＮＡの直接注入は、皮膚及び筋肉細胞のような直接的注入に利用しやすい組織に関連する用途に限定されるようである。
本発明は、（例えば、治療効果を生じるのに必要とされる長期間の治療レベルで）対象、ヒトまたは非ヒト哺乳動物において、１つ以上の生体分子を発現させるための組成物、システム、キット、及び方法を提供する。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、カチオン性ミセル、カチオン性エマルション、またはカチオン性ポリマー）を含む第１の組成物、及び、１つ以上の目的の生体分子をコードする発現ベクター（例えば、リポソームまたは他の担体に関連付けられていない非ウイルス発現ベクター）を含む第２の組成物を含む組成物、システム、キット、及び方法が提供される。一部の実施形態では、組成物、システム、キット、及び方法は、２０１６年９月１６日に出願された米国特許出願第１５／２６８，０００号に記載の組成物、システム、キット、及び方法の１つ以上の構成要素を使用してもよく、この開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ａ）第１の量のポリカチオン性構造体リポソームを含む第１の組成物（第１の組成物は、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない）；及び、ｂ）発現ベクター（例えば、目的の生体分子を発現する１つ以上の発現ベクター）（例えば、治療有効量の１つ以上の発現ベクター）を含む第２の組成物、を含む組成物、キット、及び／またはシステムが本明細書で提供される。一部の実施形態では、組成物、キット、及び／またはシステムは、以下の特性：ｉ）上記ポリカチオン性構造体の第１の量と発現ベクターの比は、５：１〜２５：１である；ｉｉ）第１の組成物の２．０％〜６．０％または２．０％〜２０％（例えば、２％．．５％．．．１０％．．．１５％．．または２０％）は、デキサメタゾンパルミテート及び／またはデキサメタゾンを含む；ｉｉｉ）第１の組成物は、中性脂質をさらに含む；ならびにｉｖ）ポリカチオン性構造体は、空のリポソームを含む、のうちの１つ以上または全てを有し、第１の組成物中に存在する空のリポソームは、約２０〜８５ｎｍのｚ−平均直径を有する。
一部の実施形態では、ａ）５００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度で上記組成物中に存在するポリカチオン性構造体；ｂ）上記組成物の１〜１０％の濃度で上記組成物中に存在するデキサメタゾン及び／またはデキサメタゾンパルミテート；ｃ）生理学的に許容される緩衝液を含むか、またはそれから本質的になる水性組成物が、本明細書で提供され、上記組成物は、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない。一部の実施形態では、上記ポリカチオン性構造体は、小さな単層小胞として存在するカチオン性脂質である。一部の実施形態では、上記生理学的に許容される緩衝液は、生理食塩水緩衝液、５％のデキストロース水溶液、乳酸化リンガー緩衝液、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、上記ポリカチオン性構造体は、ＤＯＴＡＰを含む。一部の実施形態では、上記ポリカチオン性構造体は、８００ｎＭ〜１５００ｎＭまたは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。
一部の実施形態では、ａ）５００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する中性脂質；ｂ）上記組成物の１〜１０％の濃度で上記組成物中に存在するデキサメタゾン及び／またはデキサメタゾンパルミテート；ｃ）生理学的に許容される緩衝液を含むか、またはそれから本質的になる水性組成物が、本明細書で提供され、上記組成物は、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない。一部の実施形態では、上記中性脂質は、多層小胞として存在する。一部の実施形態では、上記生理学的に許容される緩衝液は、生理食塩水緩衝液、５％のデキストロース水溶液、乳酸化リンガー緩衝液、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、上記中性脂質は、ＤＭＰＣを含む。一部の実施形態では、上記中性脂質は、８００ｎＭ〜１５００ｎＭまたは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。
一部の実施形態では、ａ）５００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度で上記組成物中に存在するポリカチオン性構造体；ｂ）５００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する中性脂質、及びｃ）生理学的に許容される緩衝液を含むか、またはそれから本質的になる水性組成物が、本明細書で提供され、上記組成物は、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない。一部の実施形態では、上記中性脂質は、多層小胞として存在する。一部の実施形態では、組成物は、７５〜２５０ｎｍ（例えば、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍなど）の平均直径を有する（例えば、押出成形された）中性リポソームを含む。一部の実施形態では、上記ポリカチオン性構造体は、小さな単層小胞として存在するカチオン性脂質である。一部の実施形態では、上記ポリカチオン性構造体は、多層小胞として存在するカチオン性脂質である。一部の実施形態では、組成物は、ｄ）デキサメタゾンをさらに含み、上記デキサメタゾンは、上記組成物の１〜１０％であるような濃度で存在する。一部の実施形態では、組成物は、ｄ）デキサメタゾンパルミテートをさらに含み、上記デキサメタゾンパルミテートは、上記組成物の１〜１０％であるような濃度で存在する。一部の実施形態では、上記中性脂質は、ＤＭＰＣを含む。一部の実施形態では、上記中性脂質は、８００ｎＭ〜１３００ｎＭまたは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。一部の実施形態では、上記ポリカチオン性構造体は、ＤＯＴＡＰを含む。一部の実施形態では、上記ポリカチオン性構造体は、８００ｎＭ〜１５００ｎＭまたは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。
一部の実施形態では、ａ）第１の量のポリカチオン性構造体リポソームを含む第１の組成物（第１の組成物は、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない）；及び、ｂ）治療有効量の発現ベクターを含む第２の組成物（発現ベクターは、１つ以上の生体分子（例えば、治療用生体分子）をコードする環状合成増幅核酸またはミニサークルＤＮＡを含む）、を含む組成物、キット、及び／またはシステムが本明細書で提供される。一部の実施形態では、合成増幅核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応により生成される。一部の実施形態では、細胞は、ベクターの産生に使用されない（例えば、ベクターは、産生のために培養で組み換え発現しない）。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の生体分子、ならびに、それに作動可能に連結されている１つ以上のプロモーター及びエンハンサーをコードする核酸からなる。
一部の実施形態では、１つ以上の生体分子は、治療用生体分子である。一部の実施形態では、治療用生体分子は、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、広域中和抗体である。一部の実施形態では、広域中和抗体は、病原体または病原体構成要素に特異的に結合する。一部の実施形態では、病原体は、ウイルスである。一部の実施形態では、抗体は、腫瘍抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、ｍＡｂまたはその抗原結合部分は、サイトカインに特異的に結合する。
一部の実施形態では、１つ以上の抗体は、第１の標的分子に特異的に結合する第１の抗体、第２の異なる標的分子に特異的に結合する第２の抗体、及び、一部の実施形態では、第３の異なる標的分子に特異的に結合する第３の抗体、を含む。
一部の実施形態では、１つ以上の生体分子は、（例えば、遺伝子治療、研究、または診断用途に使用される）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を含む。
一部の実施形態では、１つ以上の生体分子は、核酸（例えば、治療用または診断用核酸）を含む。一部の実施形態では、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである（例えば、本明細書に全体が参照により組み込まれる７，５９２，４４０、７，９１９，４７２、及び９，０４５，７５４を参照のこと）。一部の実施形態では、核酸は、リボザイムである。一部の実施形態では、核酸は、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｔｓＲＮＡ、またはｓｒＲＮＡである。
一部の実施形態では、発現ベクターは、１つ以上の生体分子のうちの少なくとも１つの発現を調節するスーパーエンハンサーを含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、第１の治療用生体分子及び第２の治療用生体分子をコードし、上記第１及び第２の治療用生体分子は、互いに異なる時間で発現する（例えば、異なるプロモーター及び／またはエンハンサーを使用して発現するか、またはベクター内の異なる発現カセットで発現する）。特定の実施形態では、発現ベクターは、第１の治療用生体分子及び第２の治療用生体分子をコードし、上記第１及び第２の治療用生体分子は、同じである（例えば、単一のベクターは、共に同じまたは異なる治療用生体分子を発現する２つの発現カセットを有する）。さらなる実施形態では、発現ベクターは、第１の治療用生体分子、第２の治療用生体分子、及び第３の治療用生体分子をコードし、上記第１、第２、第３の治療用生体分子が全て同じである（例えば、単一のベクターは全て、同じまたは異なる治療用生体分子を発現する３つの発現カセットを有する）。
一部の実施形態では、発現ベクターは、Ｒ６Ｋ複製起点を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少である。一部の実施形態では、発現ベクターは、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少である。
さらに、本明細書に記載の組成物、キット、及び／またはシステムを使用する方法が、本明細書で提供される。例えば、一部の実施形態では、ａ）対象にシステムの第１の組成物を投与すること、及び、ｂ）上記対象にシステムの第２の組成物を投与することを含む、対象において１つ以上の治療用生体分子を発現させる方法が本明細書で提供される。
一部の実施形態では、ａ）対象にシステムの第１の組成物を投与すること、及び、ｂ）（例えば、続いて、３００分以内に）対象にシステムの第２の組成物を提供すること、を含む異なる期間で、対象において２つ以上の治療用生体分子を発現させる方法が本明細書で提供され、ベクターは、対象において第１及び第２の生体分子が互いに異なる時間で発現するように、別々のカセットでまたは異なるプロモーター及び／またはエンハンサーの制御下で、第１及び第２の生体分子それぞれを発現する。例えば、第１のカセットから発現する第１の分子は、注射後少なくとも７、または２１または１００日間存在するが、第２のカセットから発現する生体分子は依然として、７日または１４日間未満で存在する。
一部の実施形態では、方法のステップｂ）は、ステップａ）の１〜４００分（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００分、またはその間の任意の増分）後に現れる。一部の実施形態では、生体分子（複数可）は、少なくとも連続７日間（例えば、少なくとも３０日間、少なくとも１年間、またはその間の任意の増分）、対象において所望の（例えば、治療）レベルで発現する。特定の実施形態では、第１の治療用生体分子は、治療レベルで少なくとも７日（例えば、７．．．１４．．．２１．．．１９０．．．３６５日間）発現し、第２の治療用生体分子は、１日目の上記第２の治療用生体分子の初期発現と比較して、７日目に少なくとも５０％減少（例えば、少なくとも５０％．．．６５％．．．７５％．．．９０％．．．または９９％減少）するレベルで発現する。特定の実施形態では、第１の治療用生体分子は、治療レベルで少なくとも１４日間発現し、第２の治療用生体分子は、１日目の上記第２の治療用生体分子の初期発現と比較して、１４日目に少なくとも７５％減少するレベルで発現する。さらなる実施形態では、第１の治療用生体分子は、ＣＲＩＳＰまたはモノクローナル抗体配列（もしくはそのフラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ）２）を含み、第２の治療用生体分子は、Ｃａｓ９タンパク質を含む。
一部の実施形態では、（例えば、所望の生体分子の発現レベルを増加させるため）、方法は、ステップａ）及びｂ）を１回以上繰り返すステップｃ）をさらに含む。
一部の実施形態では、生体分子は、治療用生体分子である。任意の好適なまたは所望の治療用生体分子が選択され得る。一部の実施形態では、１つ以上の治療用生体分子は、（例えば、ヒト対象において）ＬＤＬを減少させるのに十分なレベルで発現する抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体を含む。一部の実施形態では、１つ以上の治療用生体分子は、（例えば、広範囲のインフルエンザＡ株に対して広く免疫する）抗インフルエンザＡ幹抗原モノクローナル抗体を発現する。一部の実施形態では、１つ以上の治療用生体分子は、抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の組み合わせを発現する。一部の実施形態では、１つ以上の治療用生体分子は、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、１つ以上の自己腫瘍新生抗原、及び任意に、１つ以上の免疫調節性サイトカインを発現する。
一部の実施形態では、本発明は、対象におけるタンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）の発現（例えば、宿主において治療効果を生じるために必要とされる長期間の治療レベルで）のための組成物、システム、キット、及び方法を提供する。特定の実施形態では、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルジョン）を含む第１の組成物、及び（すなわち、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少であり）治療有効量の発現ベクター（複数可）（例えば、リポソームと会合しない非ウイルス発現ベクター）を含む第２の組成物を含み、この発現ベクターが、ｉ）第１の治療用タンパク質（またはマーカータンパク質などの非治療用タンパク質）及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子を、コードする第１の核酸配列を含む、システム及びキットが提供される。特定の実施形態では、発現ベクターは、第２、第３、及び／または第４の治療用または非治療用タンパク質、及び／または第２、第３または第４の生物学的に活性な核酸分子をコードする第２、第３、または第４の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の核酸配列は、第２、第３、第４、第５及び／または第６の治療用タンパク質及び／または第２、第３、第４、第５及び／または第６の生物学的に活性な核酸分子をさらにコードする。他の実施形態では、そのような第１及び第２の組成物は、治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）が対象において発現されるように（例えば、疾患（複数可）もしくは状態（複数可）が処置されるか、または生理学的形質（複数可）が変更されるように、治療レベルで（例えば、少なくとも５もしくは少なくとも５０日間、または少なくとも１００．．．２００．．．もしくは少なくとも４００日間）、疾患（複数可）、状態（複数可）、及び／または感染（複数可）が阻止されるように、予防レベルで（例えば、少なくとも５もしくは少なくとも５０日間、または少なくとも１００．．．２００．．．もしくは少なくとも４００日間））、対象に（例えば、全身的に）逐次投与される。
一部の実施形態では、対象（例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物）において第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法であって、ａ）第１の組成物を対象に投与（例えば、全身的に）することであって、第１の組成物は、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセルまたは空のカチオン性エマルション）を含み、第１の組成物は核酸分子を含まないか、実質的に含まず（例えば、核酸が組成物中に検出不能またはほとんど検出できない）；そしてｂ）第２の組成物を対象に投与（例えば、全身的に、経脈管的に、など）する（例えば、第１の組成物を投与する約２．．．１０．．．５０．．．１００．．．２００．．．３００．．．４００分以内に開始する）ことであって、第２の組成物は、ある量の発現ベクター（例えば、リポソームまたは任意の他の任意のキャリアと会合していない非ウイルス発現ベクター）を含み、発現ベクターはＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少であり、各発現ベクターは、ｉ）第１、第２、第３、第４、第５及び／または第６の治療用または非治療用タンパク質（複数可）、及び／またはｉｉ）第１、第２、第３、第４、第５及び／または第６の生物学的に活性な核酸分子（複数可）をコードする核酸配列（複数可）を含む、方法が本明細書において提供される。特定の実施形態では、第１の組成物の投与及び第２の組成物の投与の結果として、第１の治療用または非治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子は、対象において発現する（例えば、疾患または状態に関して、少なくとも５．．．５０．．．１００．．．３００日、４００日以上の治療レベルで、または生理学的または疾患形質を変更するのに十分に有効なレベルで）。特定の実施形態では、第１の組成物中に存在するポリカチオン性構造体（例えば、空のリポソーム）は、約２０〜８５ｎｍ（例えば、２０．．．２５．．．３０．．．４０．．．４５．．．５０．．．５５．．．６０．．．６５．．．７０．．．７５．．．８０．．．８５ｎｍ）のｚ−平均直径を有する。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、約７２〜７６ｎｍのｚ−平均直径を有する空のリポソームであり、小さな単層小胞である。
一部の実施形態では、ａ）対象に第１の組成物を投与すること、（対象は、疾患もしくは状態の少なくとも１つの症状を有するか、または変更されるべき少なくとも生理学的形質を有し、第１の組成物は、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオンエマルション）を含み、第１の組成物は、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない）；ならびに、ｂ）上記第１の組成物の投与から約１００分または約２００．．．または４００分以内に、対象に第２の組成物を投与すること（または投与を開始すること）（第２の組成物は、治療有効量の発現ベクターを含み（例えば、発現ベクターは、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少である）、発現ベクターはそれぞれ、ｉ）第１の治療用もしくは非治療用タンパク質、及び／または、ｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子、をコードする第１の核酸配列を含む）、ｃ）（例えば、第１または第２の組成物の投与の１００または２００．．．または４００分以内に）上記第１及び／または第２の組成物中の、または第３の組成物中にいずれかに存在する、デキサメタゾンパルミテート及び／または中性脂質を対象に投与すること、を含む、対象において第１の治療用もしくは非治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、第１の組成物の投与、第２の組成物の投与、及びデキサメタゾンパルミテート及び／または中性脂質の投与の結果として、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子が、疾患または状態に関して治療レベルで、または生理学的または疾患形質を変更するのに十分に有効なレベルで対象において発現する。
特定の実施形態では、デキサメタゾンパルミテートは、第１の組成物中にあり、その第１の組成物の２．０％〜２０．０％（例えば、２．０％．．．２．５％．．．３．０％．．．１０％．．．１５％．．．または２０％）がデキサメタゾンパルミテートを含む。特定の実施形態では、デキサメタゾンパルミテートは、第１及び／または第２の組成物の投与前に投与される第３の組成物で投与されるか、または第１及び／または第２の組成物の後で投与されるが、１００〜４００分以内に投与される。特定の実施形態では、本方法は、さらに、ｄ）第１及び／または第２及び／または第３の組成物中のいずれかの、または第４の組成物中に存在するデキサメタゾンを対象に投与すること（例えば、第１または第２または第３の組成物の投与前１００または３００分以内に開始、例えばその投与のいずれかの前または他の投与の後）を含む。特定の実施形態では、第１の組成物中に存在するポリカチオン性構造体（例えば、空のリポソーム）は、約２０〜８５ｎｍ（例えば、２０．．．２５．．．３０．．．４０．．．４５．．．５０．．．５５．．．６０．．．６５．．．７０．．．７５．．．８０．．．８５ｎｍ）のｚ−平均直径を有する。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、約７２〜７６ｎｍのｚ−平均直径を有する空のリポソームであり、小さな単層小胞である。
一部の実施形態では、Ａ）比は１０：１〜１８：１であり、Ｂ）第１の組成物の２．０％〜２０．０％がデキサメタゾンまたはデキサメタゾンパルミテートを含み；及び／またはＣ）発現ベクターは、それぞれ単一の発現カセットのみを含み（すなわち、他の発現カセットは各ベクター中に存在しない）、発現カセットは、第１の治療用タンパク質をコードする第１の核酸配列及び第２の治療用タンパク質をコードする第２の核酸配列を含み、そして発現カセットは、第１及び第２の核酸配列間の自己切断ペプチド配列（または他の切断配列）をコードする。特定の実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、またはＥ２Ａを含む。一部の実施形態では、切断効率を高めるフリン認識部位及び／または（Ｓ）ＧＳＧリンカーは、自己切断ペプチドの上流に含まれる。特定の実施形態では、第１の治療用タンパク質は、モノクローナル抗体の軽鎖を含み、第２の治療用タンパク質は、上記モノクローナル抗体の重鎖を含む（例えば、対象において発現する場合、軽鎖及び重鎖が結合して、モノクローナル抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ）またはモノクローナル抗体を形成する）。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、空のリポソームを含む。特定の実施形態では、上記第１の組成物中に存在する空のリポソームは、約５０〜８５ｎｍの平均直径を有する。特定の実施形態では、本方法は、さらに、上記第１及び／または第２の組成物中の、または第３の組成物中に存在する作用物質または追加の調節発現ベクターを投与することを含み、その際、作用物質は、薬剤が上記対象に投与されていない場合と比較して、上記治療レベルまたは有効レベルでの発現及び／または治療レベルまたは有効レベルの発現時間長を増加または減少させる（例えば、特定の限定された時間だけ発現する必要のある治療薬の場合）。特定の実施形態では、作用物質は、コルヒチン、デキサメタゾン、デキサメタゾンパルミテート、中性脂質、バルプロ酸、テオフィリン、シルデナフィル、アンレキサノクス、クロロキン、ＳＡＨＡ、及びＬ−アルギニン＋シルデナフィルから選択される。
一部の実施形態では、発現ベクターはそれぞれ調節核酸配列をさらに含み、この調節核酸配列は、上記調節核酸配列の非存在下で生じるであろう第１核酸配列の発現期間を短縮する。他の実施形態では、調節核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、第２のタンパク質をコードする第２の核酸配列、及び／または第２の生物学的に活性な核酸分子からなる群より選択される。さらなる実施形態では、第１の組成物中の第１の量のポリカチオン性構造体は、上記第１のタイプのカチオン性リポソームのみまたは上記第２のタイプのカチオン性リポソームのみが上記方法において使用される場合のような発現と比較して、第１の治療用タンパク質及び／または第１の生物学的に活性な核酸分子の発現を減少させる少なくとも第１及び第２の異なるタイプのカチオン性リポソームの混合物を含む。特定の実施形態では、治療用タンパク質は、１ｕｇ／ｍｌ（例えば、１．１〜１．５ｕｇ／ｍｌ）を超えるレベルで発現し、上記治療用タンパク質は、少なくとも７日間連続して（例えば、少なくとも７．．．２１．．．５０．．．１００．．．または４００日）上記対象においてそのレベルで発現する。
特定の実施形態では、ａ）対象に第１の組成物を（例えば、全身）投与すること（対象は疾患または状態の少なくとも１つの症状を有するか、１つ以上の感染症により感染のリスクがあるか、または少なくとも、変更されるべき（例えば、造血幹細胞のレベル）生物学的形質を有し、第１の組成物は、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオンエマルション）を含み、第１の組成物は、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない）；ならびに、ｂ）第１の組成物の投与から約２．．．１０．．．２５．．．１００．．．２００または４００分以内に開始（または完了）される、対象に第２の組成物を（例えば、全身）投与すること（第２の組成物は、治療有効量の発現ベクター（例えば、プラスミド）を含み、発現ベクターは、ＣｐＧ非含有もしくはＣｐＧ減少であるか（例えば、発現ベクターの核酸配列は、ベクターの配列の野生型バージョンに通常存在するよりも少ないＣｐＧジヌクレオチドを含有するように変更されている）、またはＣｐＧ含有ベクターであり（例えば、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含有する野生型Ｃ−ＣＳＦが使用される）、発現ベクターはそれぞれ、ｉ）第１の治療用タンパク質（もしくは第１及び第２の治療用タンパク質、または第１、第２、及び第３の治療用タンパク質など）、及び／または、ｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子（もしくは第１及び第２もしくはそれ以上の生物学的に活性な核酸分子）、をコードする核酸配列（複数可）を含み、上記の結果として、第１の組成物の投与及び第２の組成物の投与の結果として、第１及び第２の組成物の投与の結果として、治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）は、疾患もしくは状態に関する治療レベルで、または、生理学的もしくは疾患形質を変更するのに十分有効なレベルで、対象において発現する）を含む、対象において第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法が本明細書で提供される。
特定の実施形態では、発現ベクターは、第２の組成物中において、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルション）または他の分子と会合していない（そして第２組成物中に存在する検出可能なポリカチオン性構造体はない）。他の実施形態では、発現ベクターは、裸の非ウイルス性の発現ベクター（例えば、プラスミド）である。特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルス発現ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターまたは合成ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムまたはｓｈＲＮＡ核酸ベクター）である。特定の実施形態では、第１及び／または第２の組成物は、全身、局所、経皮、皮内、経口、筋肉内、静脈内、消化管内、膀胱内、または肺吸入により、または髄腔内または脳室内経路により投与される。
特定の実施形態では、治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）が、少なくとも５．．．２０．．．６３．．．１００．．．２００．．．３００日．．．１年以上、連続した日の間で対象において治療レベルまたは有効レベルで発現する。一部の実施形態では、本方法は、さらに、ｃ）第１の組成物及び第２の組成物の投与から少なくとも５．．．２０．．．６３．．．１００．．．２００．．．３００日または１年後に、対象（例えば、体のイメージングまたはスキャニング）または対象からの試料（例えば血液、血清、血漿、組織、尿など）を試験すること、及び治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）が、治療レベルまたは有効レベルで対象において発現していること（例えば、第１及び第２の組成物の１回の治療に起因して対象において治療及び／または予防効果または効果を生じるのに必要な期間、対象において治療レベルが持続されている）を決定すること含む。さらなる実施形態では、本方法は、ｄ）治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子が、治療レベルまたは有効レベル（例えば、一定の時間）で対象において発現していることを示す報告書及び／または電子報告を作成することを含む。他の実施形態では、報告は、試験を行った研究室から治療臨床医または開業医及び／または患者に送られる。
一部の実施形態では、治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子は、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌ．．．１００．．．５００．．．１０００．．．１５００．．．４０００．．．８０００．．．９５００．．．１，０００，０００ｐｇ／ｍｌ（１ｕｇ／ｍｌ）．．．１．５ｕｇ／ｍｌ以上のレベルで発現し、そして対象由来の血液、血清または血漿試料（または他の生物学的試料）をアッセイして、治療レベルまたは有効レベルが、第１及び第２の組成物の投与後少なくとも５．．．７．．．１０．．．２５．．．４５．．．６３．．．１５０．．．３００日以上の間に達成されることを見極める。他の実施形態では、治療用タンパク質（複数可）は、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌまたは少なくとも１００ｐｇ／ｍｌまたは少なくも５００、１，０００，０００ｐｇ／ｍｌ（１ｕｇ／ｍｌ）．．．１．５ｕｇ／ｍｌ以上のレベルで発現し、治療用タンパク質は、対象内のレベルで、少なくとも５．．．７．．．１０．．．２５．．．４５．．．６３．．．１５０．．．３００．．．３５０日間連続して発現する。特定の実施形態では、治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子は、対象において、第１及び第２の組成物の投与後少なくとも４８時間後に、臨床的に顕著な毒性の上昇（例えば、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）及び／またはＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）により測定される）なしに発現する。
特定の実施形態では、治療用タンパク質は、ヒトＧ−ＣＳＦ（例えば、配列番号１によりコードされるもの、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有する配列）であり、血液、血清、または血漿試料中で測定して少なくとも１００ｐｇ／ｍｌの治療レベルで対象において発現し、そして治療用タンパク質は少なくとも７日間対象において発現し、疾患、状態、または生理学的形質が、以下：化学療法により引き起こされる好中球減少症、幹細胞ドナーまたはレシピエントの血液中の造血幹細胞のレベルが上昇しない、心臓変性、脳虚血、筋萎縮性側索硬化症、好中球欠損疾患及び放射線曝露からなる群より選択される。特定の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦは、少なくとも５、または６または７日間であるが、約１０日を超えないで発現する（例えば、薬剤、プロモーター／エンハンサーの組み合わせ、核酸ベクター内の追加の発現カセットまたは追加の発現したタンパク質を用いて産生を約１０日間に制限して、約１０日を超える発現による毒性好中球関連副作用を避ける）。他の実施形態では、治療用タンパク質は、リツキシマブまたは類似の抗ＣＤ２０抗体もしくは抗体フラグメントである。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、ヒト第ＩＸ因子または類似のタンパク質である。
特定の実施形態では、対象が、治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）を対象に提供する他の任意の処置を受けなくても、治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）が、少なくとも１つの症状（または全ての症状）を軽減または排除する治療レベルで十分な時間対象において発現する。さらなる実施形態では、十分な時間、対象は、任意の他の特定の治療（例えば、対象に治療用タンパク質または生物学的に活性な核酸分子（複数可）を提供する他の特定の治療処置）を受けない。特定の実施形態では、対象は疾患（複数可）の複数の症状を有し、その場合、十分な時間とは、疾患（複数可）及び／または状態（複数可）の複数の症状の全てまたは実質的に全てが軽減または排除されるような時間（例えば、永久に、または少なくとも２０日間．．．．５０日間．．．２００日間．．．１年以上）である。他の実施形態では、十分な時間、対象は、他の疾患特異的処置を受けない。
一部の実施形態では、ポリカチオン性構造体の第１の量（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルション）は、対象の１キログラム当たり約０．０１〜７０、３０〜５０、または２０〜６０μモル（例えば、１ｋｇ当たり、０．０１．．．１．．．１０．．．２０．．．４０．．．または６０μｍｏｌ）である。他の実施形態では、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性脂質）の第１の量対発現ベクターの治療有効量の比は、０．５：１〜２５：１であり、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性脂質）ナノモル対発現ベクター１μｇ（例えば、０．５：１．．．１：１．．．４：１．．．８：１．．．１２：１．．．１７：１．．．２１：１．．．または２５：１）である。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性脂質）の第１の量対発現ベクターの治療有効量の比は、７：１〜１３：１であり、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性脂質）ナノモル対発現ベクター１μｇである。特定の実施形態では、発現ベクターの治療有効量は、対象の１キログラム当たり０．００１〜８．０ミリグラムの発現ベクター（例えば、０．００１．．．０．１．．．３．０．．．４．５．．．．５．７．．．７．１．．．８．０ミリグラム／キログラム）である。一部の実施形態では、発現ベクターの治療有効量は、対象の１キログラム当たり０．００１〜１μｇ（例えば、対象の１キログラム当たり０．００１．．．０．０１．．．０．１．．．１μｇ）である。特定の実施形態では、発現ベクターの治療有効量は、対象の１キログラム当たり約０．０１〜４．０ミリグラムの発現ベクターである。
一部の実施形態では、第１の核酸配列は、第１または第１及び第２の、または第１、第２及び第３の治療用タンパク質（複数可）をコードする。さらなる実施形態では、第１の核酸配列は、生物学的に活性な核酸分子（複数可）をコードする。他の実施形態では、対象はヒトである。さらなる実施形態では、発現ベクターはＣｐＧを含まない。他の実施形態では、発現ベクターは、ＣｐＧ減少である。他の実施形態では、治療用タンパク質（複数可）は、ヒトタンパク質（複数可）または動物タンパク質（複数可）である。
一部の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、コレステロールを含有しない（例えば、コレステロールを含まない空のカチオン性ミセルまたはリポソーム）。特定の実施形態では、カチオン性リポソームはそれぞれ、少なくとも６０％のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰ（例えば、６０％．．．７５％．．．８５％．．．９５％．．．９８％．．．１００％のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰ）を含む。他の実施形態では、カチオン性リポソームの全てまたは実質的に全てが多層小胞である。さらなる実施形態では、カチオン性リポソームの全てまたは実質的に全てが単層小胞である。さらなる実施形態では、カチオン性リポソームはそれぞれ、少なくとも９９％のＤＯＴＡＰまたは９９％のＤＰＴＡＰを含む。さらなる実施形態では、空のカチオン性リポソームはそれぞれＤＯＴＡＰ及びコレステロールを含む。さらなる実施形態では、カチオン性リポソームはそれぞれ、約１／３のコレステロール及び約２／３のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰを含む。さらなる実施形態では、第１の核酸配列は、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする（例えば、配列番号１に示されるように）。
特定の実施形態では、生物学的に活性な核酸分子（複数可）は、ｓｈＲＮＡ配列（複数可）、ｍｉＲＮＡ配列（複数可）、アンチセンス配列（複数可）、リボザイム（複数可）、及び／またはＣＲＩＳＰＲ単一ガイドＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）（複数可）から選択される配列を含む。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡは、ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ−補充配列（ｔｒａｃＲＮＡ）、及びｉｉ）ｓｇＲＮＡ標的部位にハイブリダイズする標的特異的配列（ｃｒＲＮＡ）を含む。特定の実施形態では、生物学的に活性な核酸分子は、ヒトｐ６５（別名、ＮＦ−カッパ−Ｂｐ６５またはＲＥＬＡ）を標的とする。１つ以上のＲＮＡ配列の任意の所望の組み合わせは、ベクターにコードされても、目的の非ＲＮＡにコードされた分子と組み合わせてもよい。例えば、一部の実施形態では、複数の発現カセット（例えば、２、３、４など）がベクターに含まれ、それぞれは、目的の種々の分子を発現する。一部の実施形態では、目的の分子は、ベクターに含有される複数の単一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドカセットを含む。
さらなる実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、ｉ）第２の治療用タンパク質及び／またはｉｉ）第２の生物学的に活性な核酸分子をコードする第２の核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、ｉ）第３及び／または第４の治療用タンパク質及び／またはｉｉ）第３及び／または第４の生物学的に活性な核酸分子をコードする第３の核酸配列をさらに含む。さらなる実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、第１の核酸配列に会合する第１のプロモーター、及び第２の核酸配列に会合する第２のプロモーターをさらに含み、第１及び第２のプロモーターは同一でも異なってもよい。他の実施形態では、第１の核酸配列の治療的もしくは有効的な発現レベル、及び／または治療的もしくは有効的な発現レベルの時間長は、第２の核酸が発現ベクターに存在しない及び／または発現しない場合の発現レベルまたは時間長に比べて減縮される。他の実施形態では、第１の核酸配列は、少なくとも５日であるが２１日未満（例えば、５．．．７．．．１３．．．１６．．．２０．．．及び２１日）の治療レベルで発現する。特定の実施形態では、第１の核酸配列は治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質はヒトＧ−ＣＳＦを含む。
他の実施形態では、発現ベクターは、発現ベクターのそれぞれが第１の核酸に会合する第１のプロモーター及び第１のエンハンサーを含む場合に、第１の時間長の治療レベルまたは有効レベルで、及び／または第１の発現レベルで、発現を提供し、発現ベクター上で、第１のプロモーターとは異なる第２のプロモーターが第１のプロモーターと置換し、及び／または第２のエンハンサーとは異なる第２のエンハンサーが第２のプロモーターと置換する場合、第１の時間長及び／または発現レベルが変化する。他の実施形態では、第１の時間長の治療レベルまたは有効レベルでの発現は、少なくとも１０．．．１５．．．４５．．．１００．．．２００．．．３００日間であり、第２のプロモーター及び／または第２のエンハンサーによる置換は、治療レベルまたは有効レベルでの発現を１０．．．１５．．．４５．．．１００．．．２００日未満の第２の時間長まで減縮する。他の実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、第１のプロモーター及び第１のエンハンサーを含み、第１のプロモーター及び第１のエンハンサーは、少なくとも５日間で且つ２１．．．１５．．．または１０日間未満の治療レベルで発現を引き起こす。特定の実施形態では、第１の核酸配列は治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質はヒトＧ−ＣＳＦを含む。
一部の実施形態では、本方法は、第１の組成物及び／または第２の組成物のいずれか、または第３の組成物中で存在する、薬剤（複数可）を投与することをさらに含み、且つ薬剤（複数可）が対象に投与されない場合と比較して、薬剤（複数可）は第１の核酸の発現を増加または減少させる（例えば、治療レベルまたは有効レベルで、及び／または治療レベルまたは有効レベルでの発現の時間長）。特定の実施形態では、薬剤は、第１の核酸の発現レベルを対象において増加させるものであり、コルチシン、免疫抑制剤、デキサメタゾン、デキサメタゾンパルミテート、シルデナフィル、またはＬ−アルギニン＋シルデナフィルから選択される。特定の実施形態では、薬剤（例えば、デキサメタゾンまたはデキサメタゾンパルミテート）は、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性脂質組成物）の２．０％〜２０．０％、例えば、２．０％．．．２．５％．．．３．５％．．．４．５％．．．６．０％．．．１５％．．．または２０％で存在する。他の実施形態では、薬剤（例えば、デキサメタゾンまたはデキサメタゾンパルミテート）は、ポリカチオン性構造体及びベクター組成物が投与される前または後に対象に投与される。特定の実施形態では、第１の組成物中に存在するポリカチオン性構造体（例えば、空のリポソーム）は、約２０〜８５ｎｍ（例えば、２０．．．２５．．．３０．．．４０．．．４５．．．５０．．．５５．．．６０．．．６５．．．７０．．．７５．．．８０．．．８５ｎｍ）のｚ−平均直径を有する。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、約７２〜７６ｎｍのｚ−平均直径を有する空のリポソームであり、小さな単層小胞である。一部の実施形態では、薬剤（例えば、デキサメタゾン）は、そのような薬剤を第１の組成物に組み込むことに加えて、第１及び／または第２の組成物の投与前に対象に提供される。
他の実施形態では、薬剤が対象に投与されていない場合と比較して、薬剤が対象に投与される場合、治療用タンパク質は、少なくとも２倍高い（または少なくとも３または４または５倍高い）レベルで発現する。特定の実施形態では、薬剤は第１の核酸配列の発現レベルを低下させ、この場合薬剤はＬ−アルギニンである。さらなる実施形態では、薬剤が対象に投与されない場合と比較して、薬剤が対象に投与される場合、治療用タンパク質は少なくとも２倍（または少なくとも３倍または４倍）低いレベルで発現する。一部の実施形態では、薬剤は、抗炎症剤を含む。さらなる実施形態では、薬剤は、アンレキサノクス、クロロキン、バルプロ酸、テオフィリン、ＤＨＡ、プロスタグランジン、及びＳＡＨＡからなる群より選択される。
さらなる実施形態では、発現ベクターは、操作可能なマトリックス付着領域（ＭＡＲ）配列を含まない。特定の実施形態では、発現ベクターは、操作可能なＥＢＮＡ−１及び／またはＥＢＶウイルス配列を含まない。特定の実施形態では、上記第１及び第２の組成物を投与する直前の対象の血圧は変化しない（例えば、第１の核酸配列の発現を増加させるために対象に物理的トランスフェクション補助剤を適用しない）。特定の実施形態では、発現ベクターは、以下の：Ｒ６Ｋ複製起点（例えば、ベクター内の遺伝子の３’または５’ＵＴＲにある）、ｈｒ３エンハンサー、ＢＶ３シグナル配列、Ｓｙｎ２１配列、デルタｐ１０配列、またはＭＩＴＤ（ＭＨＣクラスＩ輸送シグナル）配列、のうちの少なくとも１つを含む。
特定の実施形態では、治療レベル及び／または有効レベルは、少なくとも１５０．．．１００．．．５００．．．１０００．．．１５００．．．５０００．．．１，０００，０００ｐｇ／ｍｌ（１ｕｇ／ｍｌ）．．．１．５ｕｇ／ｍｌ以上であり、対象由来の血液、血清または血漿試料（または他の生物学的試料）は、第１及び第２の組成物の投与後少なくとも７．．．１０．．．２５．．．４５．．．６３．．．１５０．．．３００．．．４００日以上の治療レベル及び／または有効レベルであると判定される。特定の実施形態では、対象由来の試料は、発現レベルを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイまたは質量分析により試験される。
一部の実施形態では、本方法は、治療有効量の中性リポソームを対象に投与することをさらに含み、その際、中性リポソームが第１及び／または第２の組成物中に存在し、及び／または第３の組成物で投与され、且つ第２の組成物を投与する前に、治療有効量の中性リポソームを対象に投与する。特定の実施形態では、中性リポソームは、少なくとも、ホスホリポン９０Ｈ、水素添加大豆ＰＣ、ステアリン酸及びパルミチン酸から選択される物質を含む。他の実施形態では、治療有効量の中性リポソームは、対象に投与される、第１の組成物中または第３の組成物中に存在する。さらなる実施形態では、中性リポソームは、多層小胞であるか、または０．２または０．１ｕｍに押出成形される。特定の実施形態では、治療有効な量の中性リポソームを投与することにより、対象における第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子の発現を、中性リポソームが対象に投与されない場合に生じるよりも、少なくとも３．．４．．．２５．．．１００．．．３５０．．．または６００倍高くなる。特定の実施形態では、対象に投与される空のカチオン性リポソームと中性リポソームの比は、約２：１〜１：５（例えば、２：１．．．１：１．．．２：５．．．１：５）である。
一部の実施形態では、対象において第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法であって、ａ）抗炎症剤を含む第１の組成物を対象に投与すること；ｂ）第２の組成物の投与を、第１の組成物の投与の約２分．．．２０分．．．１時間．．．２４時間．．．５日．．．７日．．．９日またはそれ以上の内に対象に投与するか、または投与を開始することを含み、第２の組成物が、治療有効量のポリプレックスを含み、それぞれのポリプレックスが発現ベクター及びポリエチレンイミンを含み、発現ベクターはＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少であり、各発現ベクターが以下：ｉ）第１の治療用タンパク質（及び／または第１及び第２のタンパク質）、及び／またはｉｉ）第１の（及び／または第１及び第２の）生物学的に活性な核酸分子をコードする第１の核酸配列を含み、第１の組成物の投与及び第２の組成物の投与の結果として、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を対象において発現させる、方法が本明細書で提供される。さらなる実施形態では、対象は、疾患または状態の少なくとも１つの症状を有するか、または変更が望まれる少なくとも１つの生理学的形質を有し、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子は、疾患、状態、または変更される生理学的形質に関連する治療レベルで発現する。一部の実施形態では、抗炎症剤は、アンレキサノクス、クロロキン、及びスベラニルヒドロキサム酸（Ｓｕｂｅｒａｎｉｌｏｈｙ ｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ）（ＳＡＨＡ）からなる群より選択される。
一部の実施形態では、発現ベクターは、プラスミドまたは他の非ウイルスベクターを含む。さらなる特定の実施形態では、ステップｂ）における投与は、第２の組成物を全身投与することにより達成される。
一部の実施形態では、ａ）第１の量のポリカチオン性構造体（例えば空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルション）を含み、核酸分子を含まないか実質的に含まない第１の組成物、及びｂ）治療有効量の発現ベクター（例えば、非ウイルス性であり、且つリポソームまたは他のキャリア分子と会合していない）を含む第２の組成物を含み、発現ベクターはＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少であり、それぞれの発現ベクターは以下：ｉ）第１の治療用タンパク質または非治療用タンパク質、及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子をコードする第１の核酸配列を含む上記第２の組成物を含む、システムまたはキットが本明細書で提供される。他の実施形態では、発現ベクターは、裸の非ウイルス発現ベクター（例えば、プラスミド）である。特定の実施形態では、以下のうちの少なくとも１つが適用される：ｉ）第１の量のポリカチオン性構造体（例えば空のカチオン性リポソーム）と治療有効量の発現ベクターとの比が２：１〜２５：１または５：１〜２５：１である；ｉｉ）第１の組成物の２．０％〜２０．０％がデキサメタゾンパルミテートを含み；ｉｉｉ）第１の組成物が中性脂質をさらに含み、そしてｉｖ）ポリカチオン性構造体が空のリポソームを含み、第１の組成物中に存在する空のリポソームが約２０〜８５ｎｍのｚ−平均直径（例えば、２０．．．３０．．．４０．．．４５．．．５０．．．５５．．．６０．．．６５．．．７０．．．７５．．．８０．．．８５ｎｍ）を有する。特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶまたはアデノウイルスベクター）である。特定の実施形態では、治療用タンパク質は、ヒトＧ−ＣＳＦ（例えば、配列番号１に示される）、または複数のＣｐＧジヌクレオチドを含有する野生型ヒトＧ−ＣＳＦである。
特定の実施形態では、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム）は、０．１〜７．０ミリモル（例えば、０．１．．．５．０．．．７．０ミリモル）または１．５及び５．０ミリモル（例えば、ヒト対象に対する適当な投与量）である。他の実施形態では、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム）の第１の量対発現ベクターの治療有効量の比は、０．５：１〜２５：１であり、空のカチオン性脂質ナノモル対発現ベクター１μｇ（例えば、０．５：１．．．１：１．．．５：１．．．１０：１．．．１５：１．．．２５：１）である。一部の実施形態では、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性脂質）第１の量対発現ベクターの治療有効量の比は、７：１〜１３：１のであり、ポリカチオン性構造体ナノモル対発現ベクター１μｇ（例えば７：１．．．１０：１．．．または１３：１）である。他の実施形態では、発現ベクターの治療有効量は、０．１〜８００ミリグラム（例えば、ベクターがプラスミドである場合などのヒト対象への投与に適した量）である。特定の実施形態では、その量は、１．．．２５．．．４００または８００ミリグラムのヒト投与のための発現ベクターである。
他の実施形態では、第１の核酸配列は、第１の治療用タンパク質をコードする。さらなる実施形態では、第１の核酸配列は、生物学的に活性な核酸分子をコードする。特定の実施形態では、発現ベクターはＣｐＧ非含有である。他の実施形態では、発現ベクターは、ＣｐＧ減少である。さらなる実施形態では、第１の治療用タンパク質はヒトタンパク質である。他の実施形態では、第１の核酸配列は治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質はヒトＧ−ＣＳＦ、リツキシマブ、モノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体フラグメント（例えばＦａｂ）、またはヒト第ＩＸ因子を含む。
特定の実施形態では、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルションはそれぞれ、少なくとも６０％のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰ（例えば、６０％．．．７５％．．．８５％．．．９５％．．．９８％．．．１００％のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰ）を含み、コレステロールを含み得ない（例えば、組成物中に検出可能なコレステロールがない）。他の実施形態では、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルションの全てまたは実質的に全てが多層小胞である。さらなる実施形態では、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルションの全てまたは実質的に全てが、単層、多層、またはオリゴ層小胞のいずれかである。さらなる実施形態では、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルションはそれぞれ少なくとも９９％のＤＯＴＡＰまたは少なくとも９９％のＤＰＴＡＰを含み、コレステロールは含み得ない。さらなる実施形態では、空のカチオン性リポソームはそれぞれＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰ及びコレステロールを含む。さらなる実施形態では、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルションはそれぞれ、約１／３のコレステロール及び約２／３のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰを含む。
特定の実施形態では、第１の生物学的に活性な核酸分子は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列、アンチセンス配列、ＣＲＩＳＰＲ多量体化単一ガイド、及びＣＲＩＳＰＲ単一ガイドＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）から選択される配列を含む。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡは、ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ−補充配列（ｔｒａｃＲＮＡ）、及びｉｉ）ｓｇＲＮＡ標的部位にハイブリダイズする標的特異的配列（ｃｒＲＮＡ）を含む。
さらなる実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、ｉ）第２の治療用タンパク質及び／またはｉｉ）第２の生物学的に活性な核酸分子をコードする第２の核酸配列をさらに含む。さらなる実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、第１の核酸配列に会合する第１のプロモーター、及び第２の核酸配列に会合する第２のプロモーターをさらに含み、第１及び第２のプロモーターは同一でも異なってもよい。
一部の実施形態では、キット及びシステムは、第１の容器及び第２の容器をさらに含み、第１の組成物は第１の容器に存在し、第２の組成物は第２の容器に存在する。他の実施形態では、キット及びシステムは、さらにパッケージング構成要素（例えば、段ボール箱、プラスチック袋など）を含み、第１の容器及び第２の容器はパッケージング構成要素の内側にある。
特定の実施形態では、キット及びシステムは、さらに薬剤（複数可）を含み、薬剤（複数可）は第１及び／または第２の組成物中に存在するか、または第３の組成物中に存在する。さらなる実施形態では、薬剤は、コルヒチン、免疫抑制剤、デキサメタゾン、シルデナフィル、Ｌ−アルギニン、またはＬ−アルギニン＋シルデナフィルから選択される。さらなる実施形態では、薬剤は、抗炎症剤を含む。さらなる実施形態では、薬剤は、アンレキサノクス、バルプロ酸、テオフィリン、クロロキン、及びＳＡＨＡからなる群より選択される。
特定の実施形態では、発現ベクターは、操作可能なマトリックス付着領域（ＭＡＲ）配列を含まない。さらなる実施形態では、発現ベクターは、操作可能なＥＢＮＡ−１及び／またはＥＢＶウイルス配列を含まない。
特定の実施形態では、キット及びシステムは、治療有効量の中性リポソームをさらに含み、中性リポソームが第１及び／または第２の組成物中に存在するか、または第３の組成物中に存在する。さらなる実施形態では、治療有効量の中性リポソームが第１の組成物中に存在する。他の実施形態では、中性リポソームは、多層またはオリゴ層または単層小胞である。さらなる実施形態では、空のカチオン性リポソームまたはミセルと中性リポソームとの比は、約２：１〜１：５（例えば、２：１．．．１：１．．．３：５．．．１：５）である。
一部の実施形態では、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子のｉｎ ｖｉｖｏ発現での治療に適している疾患の治療における併用のための第１の組成物及び第２の別個の組成物であって、第１の組成物は第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセルまたは空のカチオン性エマルション）を含み、第１の組成物は、核酸分子を含まないか、または実質的に含まず；Ｂ）第２の組成物は治療有効量の発現ベクターを含み、発現ベクターは、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少であり、発現ベクターのそれぞれが、ｉ）第１の治療用タンパク質及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子を含む、組成物が本明細書において提供される。
特定の実施形態では、対象に第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法であって、ａ）対象に第１の組成物を投与することであって、第１の組成物は、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルジョン）を含み、第１の組成物は核酸分子を含まないかまたは実質的に含まず；ｂ）第１の組成物の投与の約１００分または２００分以内に第２の組成物を対象に投与することを含み、第２の組成物は治療有効量の非ウイルス発現ベクターを含み、発現ベクターはＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少であり、発現ベクターがそれぞれ、ｉ）第１の治療用タンパク質、及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子を、コードする第１の核酸配列を含み；第１の組成物の投与及び第２の組成物の投与の結果として、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を、対象において、上記レベル（例えば、少なくとも１５０．．．３００．．．５７５．．．１０００．．．１５００．．．２０００．．．５０００．．．または１，０００，０００ｐｇ／ｍｌ）（例えば、（例えば、第１及び第２の投与から７．．．２５．．．５０日後の）対象からの血清試料で測定される）で発現させる、方法が本明細書において提供される。
特定の実施形態では、ＣｐＧ非含有もしくはＣｐＧ減少またはＣｐＧ含有ベクターであり、且つ、ｉ）第１の治療用タンパク質、及び／または、ｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子、をコードする第１の核酸配列を含む、治療有効量の非ウイルス発現ベクターを含む組成物を対象に投与することを含む方法が提供され、第１及び第２の組成物の投与の結果として、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子は、（例えば、（例えば、第１及び第２の投与の７．．．２５．．．５０日後の）対象由来の血清試料で測定された）１００ｐｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも１５０．．．４００．．．１２００．．．２０００．．．５０００．．．または１，０００，０００ｐｇ／ｍｌ超）を超えるレベルで、対象において発現する。
特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルションを含む。他の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、以下の、単独またはポリカチオン性構造体と組み合わせた１つ以上：線状または分岐のポリエチレンイミン、デンドリマー（例えば、エチレンジアミン、ポリリシン、ポリアルギニン、及び硫酸プロタミン系第４世代ｐａｍａａｍデンドリマー）、ポリリジン及び硫酸プロタミンを含む。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体はカチオン性エマルションとして提供される。特定の実施形態では、エマルション中の界面活性剤は、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムなどから選択される。他の実施形態では、エマルションはさらに、トゥイーン、スパン及びトリグリセリドなどの中性構成要素を含む。特定の実施形態では、エマルションは、例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、またはＤＤＡＢなどのカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、エマルションは、自己乳化エマルションまたはマイクロエマルション（ＳＥＤＤＳ、ＳＭＥＤＤＳ）である。
一部の実施形態では、対象において第１及び第２のタンパク質及び／または第１及び第２の生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法であって、ａ）第１の組成物を対象に投与することであって、対象が疾患または病態の少なくとも１つの症状を有するか、または少なくとも変更される生理学的形質を有し、第１の組成物が第１の量のポリカチオン性構造体を含み、そして第１の組成物が核酸分子を含まないかまたは実質的に含まず；及びｂ）第１の組成物を投与して約１００分以内に第２の組成物を対象に投与することを含み、第２の組成物は治療有効量の発現ベクターを含み、発現ベクターは非ウイルス性であり、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少であり、発現ベクターはそれぞれ、ｉ）Ａ）第１のタンパク質及び／またはＢ）第１の生物学的に活性な核酸分子をコードする第１の発現カセット、及びｉｉ）Ａ）第２のタンパク質及び／またはＢ）第２の生物学的に活性な核酸分子をコードする第２の発現カセットを含む上記ステップを含む、方法が本明細書において提供される。特定の実施形態では、第１の組成物の投与及び第２の組成物の投与の結果として、第１及び第２のタンパク質及び／または第１及び第２の生物学的に活性な核酸分子は、疾患または状態に関して治療レベルで、または上記生理学的または疾患形質を変更するのに十分に有効なレベルで、対象において発現する。
特定の実施形態では、第１のタンパク質はモノクローナル抗体軽鎖を含み、第２のタンパク質は上記モノクローナル抗体の重鎖を含む。他の実施形態では、第１及び第２の発現カセットは共に調節エレメントを含む。さらなる実施形態では、調節エレメントは、上記第１及び第２の発現カセットにおいて同一であるか、または異なっている。
一部の実施形態では、ａ）対象に第１の組成物を投与すること、（対象は、疾患もしくは状態の少なくとも１つの症状を有するか、または変更されるべき少なくとも生理学的形質を有し、第１の組成物は、第１の量のポリカチオン性構造体を含み、第１の組成物は、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない）；ならびに、ｂ）第１の組成物の投与の約３００分以内に、対象に第２の組成物を投与すること（第２の組成物は、ｍＡｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、及び／またはｓｃＦｖをコードする治療有効量の発現ベクターを含み、第１の組成物の投与及び第２の投与の結果、第１の治療用タンパク質は、疾患もしくは状態に対する治療レベルで、または、生物学的もしくは疾患形質を変更するのに十分に有効なレベルで、対象において発現する）を含む、対象においてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、及び／またはｓｃＦｖを発現させる方法が本明細書で提供される。
特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体の第１の量と発現ベクターの治療的有効量の比は、５：１〜２５：１である。さらなる実施形態では、発現ベクターは、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少である。他の実施形態では、発現ベクターは、複数のＣｐＧモチーフを含有し、及び／またはＣｐＧ非含有もしくはＣｐＧ減少でない。さらなる実施形態では、ｍＡｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、及び／またはｓｃＦｖは、さらなる任意の投与なしで、少なくとも連続７日間、対象において治療レベルで発現する。他の実施形態では、少なくとも連続７日間は、さらなる任意の投与なしで、少なくとも連続１９０日間である。
一部の実施形態では、Ｆ（ａｂ）２は、Ｆ（ａｂ’）２アフェリモマブ、アラシズマブペゴル、ドルリモマブアリトックス（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、エルリズマブ、及びイゴボマブからなる群より選択される。さらなる実施形態では、Ｆａｂは、アブシキシマブ、アナツモマブマフェナトキス（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、シタツズマブボガトキス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）、ナコロマブタフェナトキス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナプツモマブエスタフェナトキス（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ノフェツモマブメルペンタン、ラニビズマブ、タドシズマブ、テリモマブアリトックス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、アルシツモマブ、ベクツモマブ、ビシロマブ、セルトリズマブペゴル、及びスレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）からなる群より選択される。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、エフングマブ、オポルトツマブモナトックス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｍｏｎａｔｏｘ）、及びペキセリズマブからなる群より選択される。
特定の実施形態では、ｍＡｂは、３Ｆ８、８Ｈ９、アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アビツズマブ（Ａｂｉｔｕｚｕｍａｂ）、アブリルマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アデュカヌマブ、アファセビクマブ、アフツズマブ（Ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブペンテテート、アマツキシマブ、アネツマブラブタンシン（Ａｎｅｔｕｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、アニフロルマブ、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アスクリンバクマブ（Ａｓｃｒｉｎｖａｃｕｍａｂ）、アセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アテゾリズマブ、アチヌマブ（Ａｔｉｎｕｍａｂ）、アトリズマブ（Ａｔｌｉｚｕｍａｂ）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、アベルマブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベゲロマブ（Ｂｅｇｅｌｏｍａｂ）、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビマグルマブ、ビメキズマブ、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブレセルマブ、ブロンツヴェトマブ（Ｂｌｏｎｔｕｖｅｔｍａｂ）、ブロソズマブ、ボコシズマブ、ブラジクマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、ブロンチクツズマブ、ブロスマブ、カビラリズマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カロツキシマブ、ｃＢＲ９６−ドキソルビシン免疫複合体、セデリズマブ、セルグツズマブアムナロイキン、セツキシマブ、Ｃｈ．１４．１８、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ（Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、クリバツズマブテトラキセタン、コドリツズマブ（Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）、コルツキシマブラブタンシン（Ｃｏｌｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、コナツムマブ、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、ＣＲ６２６１、クレネズマブ、クロテデュマブ、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダピロリズマブペゴル（Ｄａｐｉｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ダラツムマブ、デクトレクマブ（Ｄｅｃｔｒｅｋｕｍａｂ）、デムシズマブ、デニンツズマブマホドチン、デノスマブ、デパツキシズマブマホドチン、デルロツキシマブビオチン、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ジヌツキシマブ、ディリダブマブ（Ｄｉｒｉｄａｖｕｍａｂ）、ドマグロズマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ（Ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュピルマブ、デュルバルマブ、デュシギツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エルデルマブ、エルゲムツマブ（Ｅｌｇｅｍｔｕｍａｂ）、エロツズマブ、エルシリモマブ、エマクツヅマブ、エミベツズマブ（Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、エミシズマブ、エナバツズマブ、エンホルツマブベドチン、エンリモマブペゴル（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、エノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、及びエプラツズマブからなる群より選択される。
一部の実施形態では、ｍＡｂは、エレヌマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エビナクマブ（Ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）、エボロクマブ、エクスビビルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ファノレソマブ、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィバツズマブ（Ｆｉｂａｔｕｚｕｍａｂ）、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フィリブマブ（Ｆｉｒｉｖｕｍａｂ）、フランボツマブ、フレチクマブ（Ｆｌｅｔｉｋｕｍａｂ）、フォントリズマブ、フォラルマブ（Ｆｏｒａｌｕｍａｂ）、フォラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガルカネズマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブべドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、グセルクマブ、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イダルシズマブ、ＩＭＡＢ３６２、イマルマブ（Ｉｍａｌｕｍａｂ）、インシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、インデュサツマブベドチン（Ｉｎｄｕｓａｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、イネビリズマブ、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、イサツキシマブ、イトリズマブ（Ｉｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、イキセキズマブ、ケリキシマブ（Ｋｅｌｉｘｉｍａｂ）、ラベツズマブ、ラムパリズマブ、ラナデルマブ、ランドグロズマブ、ラプリツキシマブエムタンシン（Ｌａｐｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、レブリキズマブ、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レンダリズマブ（Ｌｅｎｄａｌｉｚｕｍａｂ）、レンジルマブ、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レクサツムマブ、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、リファスツズマブベドチン、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、リロトマブサテトラキセタン（Ｌｉｌｏｔｏｍａｂ ｓａｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、リリルマブ、ロデルシズマブ（Ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）、ロキベトマブ（Ｌｏｋｉｖｅｔｍａｂ）、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルリズマブペゴル（Ｌｕｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ルミリキシマブ、ルムレツズマブ、ＭＡＢｐ１、マパツムマブ、マルジェツキシマブ、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、マブリリムマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミルベツキシマブソラブタンシン、ミツモマブ、モガムリズマブ、モナリズマブ（Ｍｏｎａｌｉｚｕｍａｂ）、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、モタビズマブ、モキセツモマブパスードトクス、ムロモナブ−ＣＤ３、ナミルマブ（Ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、ナラツキシマブエムタンシン（Ｎａｒａｔｕｘｉｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ナビシキシズマブ、ナビブマブ（Ｎａｖｉｖｕｍａｂ）、ネバクマブ、ネチツムマブ、ネモリズマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オンツキシズマブ（Ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、オピシヌマブ、オレゴボマブ、オルティクマブ、オテリキシズマブ、オトレツズマブ（Ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パジバキシマブ、パリビズマブ、パムレブルマブ、パニツムマブ、パンコマブ（Ｐａｎｋｏｍａｂ）、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、パルサツズマブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パスコリズマブ、及びパソツキシズマブ（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）からなる群より選択される。
特定の実施形態では、ｍＡｂは、パテクリズマブ、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ、ペラキズマブ（Ｐｅｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ、ピディリズマブ、ピナツズマブベドチン（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プラクルマブ、プロザリズマブ、ポガリズマブマブ、ポラツズマブベドチン、ポネズマブ、プレザリズマブ（Ｐｒｅｚａｌｉｚｕｍａｂ）、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ（Ｐｒｉｔｏｘａｘｉｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、キリズマブ、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラルパンシズマブ（Ｒａｌｐａｎｃｉｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ、ラキシバクマブ、レファネズマブ（Ｒｅｆａｎｅｚｕｍａｂ）、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リヌクマブ（Ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）、リサンキズマブ、リツキシマブ、リババズマブペゴル（Ｒｉｖａｂａｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ロバツムマブ、ロレデュマブ（Ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロバルピツズマブテシリン、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サシツズマブゴビテカン、サマリズマブ、サペリズマブ（Ｓａｐｅｌｉｚｕｍａｂ）、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セリバンツマブ（Ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、セトキサキシマブ（Ｓｅｔｏｘａｘｉｍａｂ）、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ（Ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、シプリズマブ、シルクマブ、ソフィツズマブベドチン、ソラネズマブ、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、スタムルマブ、スビズマブ（Ｓｕｖｉｚｕｍａｂ）、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タリズマブ、タムツベトマブ（Ｔａｍｔｕｖｅｔｍａｂ）、タネズマブ、タプリツモマブパプトックス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）、タレクスツマブ（Ｔａｒｅｘｔｕｍａｂ）、テフィバズマブ、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、テシドルマブ（Ｔｅｓｉｄｏｌｕｍａｂ）、テツロマブ（Ｔｅｔｕｌｏｍａｂ）、テゼペルマブ（Ｔｅｚｅｐｅｌｕｍａｂ）、チシリムマブ（Ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）、チガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、チルドラキズマブ、チモルマブ（Ｔｉｍｏｌｕｍａｂ）、チソツマブベドチン（Ｔｉｓｏｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、トシリズマブ、トラリズマブ、トサトクスマブ（Ｔｏｓａｔｏｘｕｍａｂ）、トベツマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トレガリズマブ（Ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）、トレメリムマブ、トレボグルマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ウブリツキシマブ、ウロクプルマブ（Ｕｌｏｃｕｐｌｕｍａｂ）、ウレルマブ、ウルトキサズマブ（Ｕｒｔｏｘａｚｕｍａｂ）、ウステキヌマブ、ウトミルマブ、バダスツキシマブタリリン、バンドルツズマブベドチン、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、バルリルマブ（Ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）、バテリズマブ（Ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボバリリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマホドチン、ボツムマブ、センツズマブ（Ｘｅｎｔｕｚｕｍａｂ）、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ（Ｚａｔｕｘｉｍａｂ）、ジラリムマブ（Ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）、及びゾリモマブアリトックスからなる群より選択される。
特定の実施形態では、疾患または状態は、ウイルス感染または細菌感染を含む。他の実施形態では、疾患または状態は、心血管疾患またはアテローム性動脈硬化症を含む。さらなる実施形態では、疾患または状態は、自己免疫疾患を含む。特定の実施形態では、疾患または状態は、癌（例えば、肺癌、卵巣癌、皮膚癌、リンパ腫、脳癌、前立腺癌、膵癌、乳癌、甲状腺癌、結腸癌など）を含む。さらなる実施形態では、この方法は、以下の：ｉ）第１の組成物の２．０％〜２０％は、デキサメタゾンパルミテートを含む；ｉｉ）第１の組成物は、中性脂質をさらに含む；及び、ｉｉｉ）ポリカチオン性構造体は、空のリポソームを含み、上記第１の組成物中に存在する空のリポソームは、約２０〜８５ｎｍのｚ−平均直径を有する、のうちの少なくとも１つをさらに含む。
一部の実施形態では、ａ）第１の量のポリカチオン性構造体リポソームを含む第１の組成物（第１の組成物は、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない）；ならびに、ｂ）治療有効量の発現ベクターを含む第２の組成物（発現ベクターは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、及び／またはｓｃＦｖをコードする核酸配列を含む）を含むシステム及びキットが本明細書で提供される。さらなる実施形態では、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、及び／またはｓｃＦｖは、上で列挙されるもの及び以下の表３に列挙されるものから選択される。
特定の実施形態では、以下の：ｉ）ポリカチオン性構造体の第１の量と発現ベクターの治療有効量の比は、５：１〜２５：１である；ｉｉ）第１の組成物の２．０％〜２０％は、デキサメタゾンパルミテートを含む；ｉｉｉ）第１の組成物は、中性脂質をさらに含む；及び、ｉｖ）ポリカチオン性構造体は、空のリポソームを含み、第１の組成物中に存在する空のリポソームは、約２０〜８５ｎｍのｚ−平均直径を有する、のうちの少なくとも１つが適用される。
一部の実施形態では、中性脂質は、１，２−ジミリストイル−ＳＮ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ；ジミリストイルホスファチジルコリン）を含む。他の実施形態では、中性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、水素添加もしくは水素未添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、またはヒマワリホスファチジルコリンから選択される。
ｈ−ＧＣＳＦ（配列番号１）のＣｐＧ非含有改変核酸配列及びｈ−ＧＣＳＦ（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。ＣｐＧジヌクレオチドが除去された位置は、配列番号１に下線で示されている。これらの配列は、本明細書の方法、組成物、システム、及びキットで使用することができる修飾ｈ−ＧＣＳＦの例である。 カチオン性リポソーム、続いて、リツキシマブをコードするデュアルカセットまたは単一の発現カセットプラスミドＤＮＡベクターのいずれかの単回逐次ＩＶ注射が、長期の治療血清レベルのリツキシマブタンパク質を生成することを示す。 実施例１に記載されているように、カチオン性リポソーム、続いて、１６２、その後、１７６日前のデュアルカセット抗ＣＤ２０ ＤＮＡ発現ベクター（図２Ａを参照）が逐次注射されたマウス由来の血清は、高濃度の組み換えリツキシマブモノクローナル抗体タンパク質と同じ効率で、ＣＤ２０陽性ＲａｊｉヒトＢリンパ腫細胞を溶解させる。 逐次ＩＶカチオン性リポソーム注射、続いて、マウスのデュアルカセットまたは単一カセット２Ａ含有ＤＮＡベクターのいずれかのＩＶ注射により、マウスにおいて産生された血清抗ＣＤ２０レベルを示す。 デュアルカセット抗ＣＤ２０ ＤＮＡベクターを単回ＩＶ注射した２４時間後の、スーパーエンハンサーエレメントのＤＮＡ発現ベクターへの組み込みは、マウスの血清抗ＣＤ２０ ｍＡｂレベルを増加させることを示している。 ２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＣＤ２０ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするプラスミド７１５．１ ２ａ（Ｐ２Ａ）（配列番号３）を示す。 それぞれ抗ＣＤ２０ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターであるプラスミド７１８．１（配列番号４）を示す。 ２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＣＤ２０ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするプラスミド９０２．８（Ｐ２Ａ）（配列番号５）を示す。 ｐ７１８．１と同一であるが、第２のコードカセットの上流に単一のスーパーエンハンサーを含むプラスミドｐ１１３．２（配列番号６）を示す。 それぞれマウスにＩＶ注射した８日後及び１日後のマウスＮＦｋＢ−ｐ６５タンパク質の抗ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び抗ｐ６５リボザイム媒介性ノックダウンを示す。 ＩＶ注射の１３日後のマウスＮＦｋＢ−ｐ６５タンパク質の抗ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ媒介性ノックダウンを示す。 それぞれマウスにＩＶ注射した１３日後及び１日後のマウスＮＦｋＢ−ｐ６５タンパク質の抗ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ及び抗ｐ６５アンチセンス媒介性ノックダウンを示す。 マウスにＩＶ注射した１日後のマウスＮＦｋＢ−ｐ６５タンパク質の抗ｐ６５ ｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンを示す。 リボザイム抗ｐ６５プラスミド（配列番号７）を示す。 ＣＲＩＳＰＲ１抗ｐ６５プラスミド（配列番号８）を示す。 ＣＲＩＳＰＲ２抗ｐ６５プラスミド（配列番号９）を示す。 ＣＲＩＳＰＲ抗ｐ６５プラスミド（配列番号１０）を示す。 カチオン性リポソーム、続いて、ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡベクターの単回ＩＶ逐次注射が、上掲の治療的ヒトＧ−ＣＳＦ血清タンパク質レベルを生じさせることを実証する、行われた実験について説明する実施例３の結果を示す。 カチオン性リポソーム、続いて、ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡベクターの単回ＩＶ逐次注射が、マウスにおいて、次の少なくとも５８２日間、正常な絶対好中球数（ＡＮＣ）レベル（青線）を超えてＡＮＣを上昇させたことを実証する、行われた実験について説明する実施例３の結果を示す。 ＤＯＴＡＰカチオン性リポソーム、続いて、ＨＧ−ＣＳＦをコードするプラスミドＤＮＡの逐次ＩＶ注射後のラット血清における好中球の上昇を示す。 抗ｐ６５アンチセンスプラスミドに対するプラスミド配列（配列番号１１）を示す。 抗マウスＮＦｋＢ−ｐ６５ ｓｈＲＮＡベクターｐ６５ ｓｈＢのプラスミド配列を示す（図２０、配列番号１２）。 １０５０ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソーム、続いて、７０ｕｇのＨＧ−ＣＳＦプラスミドＤＮＡまたは異なる形態のＰＣＲ生成ＨＧ−ＣＳＦ発現カセットＤＮＡのいずれかの逐次ＩＶ注射の２４時間後のマウス血清中のヒトＧ−ＣＳＦのレベルを示す。 マウスの血清または血漿中のヒトＧ−ＣＳＦのレベル（左軸）及び最初の注射後の次の少なくとも３０２日間のマウスの全血中のマイクロリットル当たりの数千の絶対好中球数（ＡＮＣ）（右軸）を示す。 カチオン性リポソーム、続いて、Ｒ６Ｋ複製起点を含むか、または含まないＰＣＲ生成ＤＮＡの単回逐次注射後の１０６日間のマウス血清中のヒトＧ−ＣＳＦレベルを示す。 中性脂質またはデキサメタゾンパルミテートを含むか、または含まないカチオン性リポソーム、続いて、プラスミドＤＮＡが逐次注射されたマウスにおけるヒトＧ−ＣＳＦ及び対応する絶対好中球数（ＡＮＣ、右軸）レベルを示す。 実施例６の結果を示し、これは、第２のエンハンサーの使用が、逐次ＩＶ注射の１及び８日後のマウスにおけるヒトＧ−ＣＳＦ発現を増加させることを示す。 プラスミドｓｖ４０−ｍＣＭＶＥＦ１の核酸配列（配列番号１３）を示す。 プラスミドｍＣＭＶ−ｍＣＭＶＥＦ１の核酸配列（配列番号１４）を示す。 プラスミドｍＣＭＶ−ｈＣＭＶＥＦ１の核酸配列（配列番号１５）を示す。 プラスミドｍＣＭＶＥＦ１の核酸配列（配列番号１６）を示す。 リポソーム、続いて、プラスミドＤＮＡの逐次ＩＶ注射の２４時間後のヒトＧ−ＣＳＦのマウス血清レベルを示す（図中の最初の３つのグループは、スーパーエンハンサーエレメントを含有する）。 プラスミドｈｒ３−ｍＣＭＶＥＦ１＃２の核酸配列（配列番号１７）を示す。 プラスミドｈｒ３−ｍｃｍｖＥＦ１＃５の核酸配列（配列番号１８）を示す。 プラスミドｈｒ３−ｍｃｍｖＥＦ１＃１８の核酸配列（配列番号１９）を示す。 リポソーム及び種々の異なるＦＩＸ ＤＮＡ発現プラスミドの逐次ＩＶ注射の２４時間後のヒト第ＩＸ因子の血漿濃度を示す。 ＦＩＸプラスミドの核酸配列（配列番号２０）を示す。 ＦＩＸ Ｒ６Ｋ１の核酸配列（配列番号２１）を示す。 ＦＩＸ Ｒ６Ｋ２の核酸配列（配列番号２２）を示す。 ＦＩＸ Ｓｕｐｅｒｅｎｈの核酸配列（配列番号２３）を示す。 ＦＩＸ ＲＮＡ−ｏｕｔの核酸配列（配列番号２４）を示す。 マウスに逐次ＩＶ注射した４０日後の、マウスＮＦｋＢ−ｐ６５タンパク質の抗ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックダウンを示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９抗ＮＦｋＢ ｐ６５プラスミドＤＮＡベクターの単回逐次ＩＶ注射によるマウスにおける実験の免疫組織化学染色スライドを示す。図４１Ａは、リンガー処置対照を示し、図４１Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９抗ＮＦｋＢ ｐ６５処置されたマウスの組織を示す。 カチオン性リポソーム、次に、ＨＧ−ＣＳＦ ＤＮＡ発現ベクターの単回逐次ＩＶ注射の５８２日後の対照及び処置マウスの骨髄におけるＩＨＣ結果を示す。対照骨髄の図４２Ａ（２０×）及び４２Ｂ（６０×）は、正常な大腿髄腔の骨梁を取り囲む細胞型の多種多様な混合を示し、濃染性の赤血球細胞が特に明白である。処置骨髄の図４２Ｃ（２０×）及び４２Ｄ（６０×）は、単色のほぼ固体シートの淡染性の細胞が、大腿骨髄の淡染性の骨髄系細胞（多形核白血球）の骨梁エレメントを置換することを示し、楕円形、くぼんだ楕円形、帯状、及びセグメント化形態は、大腿骨髄内の他のほとんどの細胞型を置換する。 カチオン性リポソーム、次に、ＨＧ−ＣＳＦ ＤＮＡ発現ベクターの単回逐次ＩＶ注射の５８２日後の対照及び処置マウスの脾臓組織におけるＩＨＣ結果を示す。対照脾臓の図４３Ａ（２０×）及び図４３Ｂ（６０×）は、多種多様な細胞集団を示す正常な脾臓の白色（リンパ系）髄の赤／暗色の部分を示す。処置脾臓の図４３Ｃ（２０×）及び図４３Ｄ（６０×）は、淡染性の骨髄細胞（多形核白血球）を示し、楕円形、くぼんだ楕円形、帯状、及びセグメント化形態は、他のほとんどの細胞型を置換する。 カチオン性リポソーム、次に、ＨＧ−ＣＳＦ ＤＮＡの最後の逐次ＩＶ注射の１６８日後の対照及び処置ラットの骨髄組織におけるＩＨＣ結果を示す。対照骨髄の図４４Ａ（２０×）及び図４２Ｂ（６０×）は、大腿骨髄において特に明らかな円形の濃染性の赤血球系統を含む細胞型の多様性を示す。処置骨髄の図４４Ｃ（２０×）及び図４４Ｄ（６０×）は、淡染性の骨髄系細胞（多形核白血球）を示し、楕円形、くぼんだ楕円形、帯状、及びセグメント化形態は、大腿骨髄で優勢である。濃染性の赤血球系統細胞のごく少ないクラスターが残留する。 図４４と同じ実験からの図４５Ａは、４０×の対照ラットの椎体を示し、図４５Ｂは、４０ｘのＨＧＣＳＦラット椎体を示す。 ２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするプラスミドＤＮＡＲｘ−３１Ｈ４−２Ａの核酸配列（配列番号２５）を示す。 異なるバージョンの抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターであるプラスミドＤＮＡＲｘ−３１Ｈ４の核酸配列（配列番号２６）を示す。 ２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするプラスミドＤＮＡＲｘ−２１Ｂ１２（Ｐ２Ａ）の核酸配列（配列番号２７）を示す。 異なるバージョンの抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターであるプラスミドＤＮＡＲｘ−２１Ｂ１２の核酸配列（配列番号２８）を示す。 ２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＣＤ４７ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするプラスミドＤＮＡＲｘ−ＣＤ４７−２Ａ（Ｐ２Ａ）の核酸配列（配列番号２９）を示す。 それぞれ抗ＣＤ４７ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターであるプラスミドＤＮＡＲｘ−ＣＤ４７の核酸配列（配列番号３０）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ｄ８−２Ａの核酸配列（配列番号３１）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ｆ１０−２Ａの核酸配列（配列番号３２）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ａ６６−２Ａ（Ｐ２Ａ）の核酸配列（配列番号３３）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ｄ８の核酸配列（配列番号３４）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ｆ１０の核酸配列（配列番号３５）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ａ６６の核酸配列（配列番号３６）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−ＨＡ−ＭＩＴＤの核酸配列（配列番号３７）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−ＳＥＣ部分ＨＡ−ＭＩＴＤの核酸配列（配列番号３８）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ｄ８−２Ａ−ＨＡ−ＭＩＴＤの核酸配列（配列番号３９）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ｆ１０−２Ａ−ＨＡ−ＭＩＴＤの核酸配列（配列番号４０）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ａ６６−２Ａ−ＨＡ−ＭＩＴＤの核酸配列（配列番号４１）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ｄ８−２Ａ−ＳＥＣ部分ＨＡ−ＭＩＴＤの核酸配列（配列番号４２）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ｆ１０−２Ａ−ＳＥＣ部分ＨＡ−ＭＩＴＤの核酸配列（配列番号４３）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−Ａ６６−２Ａ ＳＥＣ部分ＭＩＴＤの核酸配列（配列番号４４）を示す。 プラスミド０１１２１５＃７の核酸配列（配列番号４５）を示す。 プラスミド０１１３１５＃２の核酸配列（配列番号４６）を示す。 プラスミド１２２０１４＃２３５の核酸配列（配列番号４７）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−ＰＤ１−２Ａ（Ｐ２Ａ）の核酸配列（配列番号４８）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−ＳＥＣ−ＯＶＡ−ＭＩＴＤの核酸配列（配列番号４９）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−ＳＥＣ−ｇｐ７０−ＭＩＴＤの核酸配列（配列番号５０）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−ＰＤ１−２Ａ ＯＶＡの核酸配列（配列番号５１）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ−ＰＤ１−２Ａ ｇｐ７０の核酸配列（配列番号５２）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ ＣＤ２０−２Ａ Ｃａｓ９の核酸配列（配列番号５３）を示す。 プラスミドＤＮＡＲｘ ＣＤ２０−２Ａ ＨＧ−ＣＳＦの核酸配列（配列番号５４）を示す。 プラスミドｐ６５ ｓｈＡ２の核酸配列（配列番号５５）を示す。 プラスミドＰＥＣＡＭ ｓｈ対照の核酸配列が、配列番号５６であることを示す。 ＩＶ注射の１０日後のマウスＮＦｋＢ−ｐ６５タンパク質の抗ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ媒介性ノックダウンを示す。 プラスミドＥＦ１／Ｕ６ ＲｅｌＡ１（０２０１１７＃５）の核酸配列（配列番号５７）を示す。 プラスミドＥＦ１／Ｕ６ ＲｅｌＡ４（０２０１１７＃８）の核酸配列（配列番号５８）を示す。 プラスミドｈｕ１／ＥＦ１／Ｕ６ ＲｅｌＡ１（０２１４１７＃３）の核酸配列（配列番号５９）を示す。 実施例１８の結果を示し、これは、中性脂質（ＤＭＰＣ）がカチオン性リポソームに含まれることが、マウスの血清抗ＣＤ２０モノクローナル抗体レベルをいかに増加させるかについて説明する。 実施例１９の結果を示し、これは、デキサメタゾンパルミテートを中性リポソームと共に使用すると、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子発現がさらに増加することを示す。 実施例２０の結果を示し、これは、Ｓｙｎ ２１及び／またはデルタｐ１０配列がベクターに含まれることが、遺伝子発現をいかに増加させるかについて説明する。 抗ＣＤ２０抗体を発現するベクター構築物の核酸配列を示し、Ｓｙｎ２１及びデルタｐ１０配列（配列番号８２）を含む。 実施例２１の結果を示し、これは、ｈｒ３スーパーエンハンサーがプラスミドに含まれる場合の、Ｇ ＣＳＦ発現の増加（図８６Ａ）及びリツキシマブ抗ＣＤ２０発現の増加（図８６ｂ）を示す。 実施例２２の結果を示し、これは、第ＩＸ因子遺伝子の３’または５’ＵＴＲにＲ６Ｋ複製起点を配置すると、７５ｕｇレベル（図８７Ａ）及び６０ｕｇレベル（図８７Ｂ）で発現レベルが増加したことについて説明する。 図８８Ａは、実施例２３の結果を示し、これは、２８４日にわたる異なる時点の、長期発現を示す長期リツキシマブ発現レベルを示す。図８８Ｂは、実施例２３の結果を示し、これは、抗ＣＤ２０マウス血清が、リツキシマブタンパク質に匹敵するレベルでヒト腫瘍細胞溶解を誘導することができたことを示す。 実施例２４の結果を示し、これは、マウスにおいて少なくとも９２日間発現した治療的抗ＩＬ−５ ｍＡｂ（２Ｂ６）血清レベルを示す。 実施例２４で使用されたデュアルカセット、単一プラスミドＤＮＡベクターの核酸配列を示し、これは、抗ヒトインターロイキン−５ ｍＡｂ（メポルジマブ（Ｍｅｐｏｌｕｚｉｍａｂ）；２Ｂ６）重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードする。 図９１Ａは、実施例２５の結果を示し、これは、マウスにおいて少なくとも８５日間、完全中和抗インフルエンザ抗体（５Ｊ８）が発現することを示す。図９１Ｂは、実施例２５の結果を示し、これは、発現した抗インフルエンザ抗体は、９２日間を超えて、Ｃａｌ０９流行インフルエンザ株を効果的に中和することを示す。 実施例２５で使用されるデュアルカセット、単一プラスミドＤＮＡベクターの核酸配列（配列番号８４）を示し、これは、抗インフルエンザ抗体（５Ｊ８）重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードする。 実施例２６の結果を示し、これは、マウスにおける抗ＩＬ−５ｍＡｂ及びｈＧ−ＣＳＦの発現レベルが少なくとも６６日間治療レベルであったことを示す。 実施例２６で使用されるトリプルカセット、単一のプラスミドＤＮＡベクターの核酸配列（配列番号８５）を示し、これは、抗ヒトインターロイキン−５ ｍＡｂ（メポルジマブ；２Ｂ６）重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡならびにヒトＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡをコードする。 実施例２７の結果を示し、これは、ｈＧ−ＣＳＦ発現用のデュアルカセットｃＤＮＡが、マウスにおいて、ｈＧ−ＣＳＦ発現の単一カセットよりも高い血清レベルを提供することを示す。 実施例２８の結果を示し、これは、抗ヒトＩＬ−５重鎖及び軽鎖を発現するデュアルカセットベクターが、単一カセット抗ヒトＩＬ−５をコードするＤＮＡベクターよりも高い抗ヒトＩＬ−５血清ｍＡｂレベルを生じることを示す。 実施例２９の結果を示し、これは、抗５Ｊ８ ｍＡｂを発現するデュアルカセットベクターが、単一カセット抗５Ｊ８をコードするＤＮＡベクターよりも高い抗５Ｊ８血清ｍＡｂレベルをｉｎ ｖｉｖｏで生じることを示す。 実施例３０の結果を示し、これは、デュアルカセット単一プラスミドが、いかにｉｎ ｖｉｖｏで異なるｍＡｂを発現するか、且つ同時注射される２つの単一カセットプラスミドが、いかにｉｎ ｖｉｖｏで異なるｍＡｂを発現するかを示す。 図９９Ａは、実施例３１の結果を示し、これは、４３日間にわたる抗ヒトＩＬ−５ ｍＡｂの血清発現レベルを示し、図９９Ｂは、４３日間にわたる抗インフルエンザＡ ｍＡｂの血清発現レベルを示す。 実施例３２の結果を示し、これは、単一ベクター由来の（左側）、ならびに３つの別々のベクターの同時注射による（右側）のリツキシマブ（抗ＣＤ２０）、抗ＩＬ５ ｍＡｂ、及び抗インフルエンザｍＡｂの同時発現を示す。 実施例３３の結果を示し、これは、抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂを発現する単一プラスミドベクターが、マウスのＬＤＬレベルを減少させることを示す。 実施例３４の結果を示し、これは、抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂを発現するマウスにおけるＬＤＬレベルの長期的な減少を示す。 実施例３５の結果を示し、これは、抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂを発現するマウスが、対照抗ＣＤ２０抗体を発現する対照マウスと比較して、低い経時的なＬＤＬレベルを有したことを示す。 実施例３６の結果を示し、これは、約２５日間の抗インフルエンザＦＩ６ ｍＡｂの発現、１００日間を超える抗インフルエンザ５Ｊ８ ｍＡｂ及び抗ＩＬ４ ｍＡＢの発現、ならびに２７５日を超えるリツキシマブの発現を示す。 実施例３７の結果を示し、試験した４つのプラスミド用量全てからの良好な発現レベルを示す。 実施例３８の結果を示し、これは、ＢＶ３シグナル配列を使用することによる５Ｊ８ ｍＡｂの発現の増強を示す。 実施例３９の結果を示す。図１０７Ａは、対照マウス肺組織を示し、図１０７Ｂは、ｐ５３について染色されたヒトｐ５３が注射されたマウス肺組織を示し、ｐ５３遺伝子がマウス肺で広く発現していることを示す。図１０７Ｃ及び図１０７Ｄは、ｐ５３が注射されたマウスにおける優勢な血管内皮細胞ヒトｐ５３発現を示す染色マウス組織を示す。 実施例３９で使用されるヒトｐ５３をコードする核酸配列（配列番号８６）プラスミドＤＮＡベクターを示す。 ＳＵＶ、０．１μｍの押出成形、またはＭＬＶがそれぞれマウスでｈＧ−ＣＳＦを効率的に発現する場合のＤＯＴＡＰリポソームの注射を示す。１グループ当たり３匹のマウスに逐次ＩＶ注射を投与した。第１の注射は、８００ｎｍｏｌまたは１０００ｎｍｏｌのカチオン性リポソームのいずれかを含んでいた。カチオン性リポソームは、３つのサイズ：ＭＬＶ、ＳＵＶ、または０．１ミクロンの押出成形、のうちの１つであった。第１の注射の２分後に、１００ｕｇまたは１２０ｕｇのいずれかで注射されるＧ−ＣＳＦをコードするプラスミドベクターの第２の注射を注射した。 ０．２μｍの押出成形またはＭＬＶのいずれかがそれぞれ、マウスにおいてｈＧ−ＣＳＦを効率的に発現する場合のＤＭＰＣまたは卵ＰＣ中性リポソームのいずれかを同時注射を示す。１グループ当たり３匹のマウスに逐次ＩＶ注射を投与した。第１の注射は、５００ｎｍｏｌの中性リポソームと共に、８００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶカチオン性リポソームを含有していた。中性リポソームは、卵ＰＣまたはＤＭＰＣのいずれかであり、ＭＬＶまたは０．２ミクロンの押出成形であった。第１の注射の２分後に、ｈＧ−ＣＳＦ ＤＮＡをコードするプラスミドベクター９０ｕｇを注射した。［定義］ 明細書中で使用される場合、「ＣｐＧ減少」という語句は、配列またはベクターの野生型に存在するよりも少ないＣｐＧジヌクレオチドを有する核酸配列または発現ベクターを指す。「ＣｐＧ非含有」とは、本核酸配列またはベクターが任意のＣｐＧジヌクレオチドを有しないことを意味する。ＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ヒトＧ−ＣＳＦの野生型）を含む初期配列は、核酸配列を変更することによりＣｐＧジヌクレオチドを除去するように改変され得る。このようなＣｐＧジヌクレオチドは、コード配列だけでなく、例えば５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ、ＩＴＲ、イントロン、及び核酸分子またはベクター中に存在する任意の他の配列などを含む非コード配列においても、適切に減少または排除することができる。
本明細書で使用される「空のリポソーム」とは、核酸分子を含まないが他の生物活性分子を含み得るリポソーム（例えば、脂質分子それ自体のみで構成されるリポソーム、または脂質分子及び小分子薬剤のみを含むリポソーム）を指す。
本明細書で使用される「空のカチオン性ミセル」とは、核酸分子を含まないが、他の生物活性分子を含み得るカチオン性ミセル（例えば、脂質及び界面活性剤分子のみで構成されるミセル、または脂質及び界面活性剤分子及び小分子薬剤のみで構成されるミセルなど）を指す。
本明細書で使用される「空のカチオン性エマルション」は、核酸分子を含まないが他の生物活性分子を含み得るカチオン性エマルションまたはマイクロエマルションを指す。
本発明は、（例えば、治療効果を生じるのに必要とされる長期間の治療レベルで）対象、ヒトまたは非ヒト哺乳動物において、１つ以上の生体分子を発現させるための組成物、システム、キット、及び方法を提供する。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、カチオン性ミセル、カチオン性エマルション、またはカチオン性ポリマー）を含む第１の組成物、及び、１つ以上の目的の生体分子をコードする発現ベクター（例えば、リポソームまたは他の担体に関連付けられていない非ウイルス発現ベクター）を含む第２の組成物を含む組成物、システム、キット、及び方法が提供される。
本開示は、カチオン性リポソームの単回注射（例えば、静脈内注射）、その直後、治療用タンパク質をコードするベクターの注射（例えば、静脈内注射）が、長期間、例えば、１９０日または５００日以上、治療血清レベルよりも、数倍（例えば、２〜２０倍高い）の循環タンパク質レベルを生じることを可能にする方法、システム、及び組成物を提供する。従って、本明細書で提供されるアプローチは、全身性非ウイルス遺伝子送達の成功した治療適用を可能にする。
さらに、本明細書で提供されるシステム、方法及び組成物は、治療レベルで送達された遺伝子の発現期間をはるかにより正確に制御することができる、多用途（例えば、非ウイルス）遺伝子送達及び発現プラットフォームを提供する。送達された遺伝子の発現の期間を制御するこの能力は、遺伝子治療分野内のニーズに対処するものであり、タンパク質が治療レベルで発現する期間を制御する能力である。具体的には、ＦＤＡが認可した組み換え分泌型ヒトタンパク質療法の広範且つ拡大したスペクトルが現在存在する。効果的且つ安全に患者を治療するためには、承認された異なるタンパク質療法が、極めて様々な期間にわたって治療レベルになければならない。異なるタンパク質療法の推奨治療期間は、２週間未満（ＨＧ−ＣＳＦ）から患者の生存期間（第ＩＸ因子）まで様々である。例えば、組み換えヒトＧ−ＣＳＦタンパク質、ニューポジェンは、３週間毎の化学療法サイクルの最初の１０日間だけ毎日与えられる。血清ＨＧ−ＣＳＦレベルは、それぞれ毎日のニューポジェン投与の約１４時間後にベースラインに戻る。この１０日間の治療スケジュールは、その好中球増加効果が、この約１０日間の化学療法誘導性好中球減少の間にのみ示されるので、使用される。患者自身の好中球産生能力が回復するので、１１日目から２１日目までのＧ−ＣＳＦ上昇は一般に有益ではない。１０日を超えてニューポジェンを与えると、有毒な好中球関連の副作用を引き起こす可能性がある。対照的に、抗ＴＮＦ抗体は、数ヶ月または数年間にわたって日常的に投与され、第ＩＸ因子は、患者の生涯にわたって置換される。従って、異なるタンパク質は、２週間未満から患者の生存期間まで、様々な期間の治療レベルで産生されなければならない。それゆえ、患者において産生する治療レベルでの遺伝子発現の期間を制御することができる遺伝子治療アプローチは、現在ＦＤＡが承認するヒト治療用タンパク質の広範なスペクトルに対する有毒な副作用を回避しながら、治療のエンドポイントに達する。本明細書では、この制御を提供するために使用することができる様々な技術が提供される。
特定の実施形態では、本開示は、ベクター投与前に対象に投与される、ベクターＤＮＡを含有しないポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセルまたは空のカチオン性エマルション）を使用する。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体はカチオン性脂質であるか、及び／またはエマルションとして提供される。本開示は、使用されるカチオン性脂質に限定されず、一部の実施形態では、以下の１つ以上のものから構成することができる：ＤＤＡＢ、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム；ＤＰＴＡＰ（１，２−ジパルミトイル３−トリメチルアンモニウムプロパン）；ＤＨＡ；プロスタグランジン、Ｎ−［１−（２，３−ジオロイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート；１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ジオレオイル（ＤＯＴＡＰ）、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジセアロイル（ｄｉｓｅａｒｏｙｌ）を含むが限定されない）；１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ジオレオイル、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジセアロイルを含むが限定されない）、ＤＯＴＭＡ、Ｎ−［１−［２，３−ビス（オレオイルオキシ）］プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニムクロリド；ＤＯＧＳ、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン；ＤＣコレステロール、３．ベータ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール；ＤＯＳＰＡ、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−（２（スペルミンカルボキサミド）−エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ジオレオイル（ＤＯＥＰＣ）、ジラウロイル、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、パルミトイル−オレオイルを含むが限定されない）；ベータ−アラニルコレステロール；ＣＴＡＢ、セチルトリメチルアンモニウムブロミド；ジＣ１４−アミジン；Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ’−テトラデシル−３−テトラデシルアミノプロピオアミジン；１４Ｄｅａ２，Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド；ＤＯＳＰＥＲ、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシルエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタン−ジアンモニウムヨージド；１−［２−（９（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ）エチル］−２−８（Ｚ）−ヘプタデセニル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）などの１−［２−アシルオキシ］エチル］２−アルキル（アルケニル）−３−（２−ヒドロキシエチル−）イミダゾリニウムクロリド誘導体；１−［２−（ヘキサデカノイルオキシ）エチル］−２−ペンタデシル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＰＴＩＭ）；１−［２−テトラデカノイルオキシ）エチル］−２−トリデシル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリウムクロリド（ＤＭＴＩＭ）（例えば、Ｓｏｌｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３：１３５３７−１３５４４に記載されており、本明細書中に参考として組み込まれる）；４級アミン上にヒドロキシアルキル部分を含有する２，３−ジアルキルオキシプロピル４級アンモニウム化合物誘導体、例えば、１，２−ジオレオイル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩ）；１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシプロピルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ−ＨＰ）；１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシブチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ−ＨＢ）；１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシペンチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ−ＨＰｅ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；１，２−ジパルミチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＰＲＩＥ）；１，２−ジステリル（ｄｉｓｔｅｒｙｌ）オキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＳＲＩＥ）（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。上記の脂質の多くは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；及びＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている。
特定の実施形態では、方法、組成物、システム、及びキットで使用される中性脂質は、アシル鎖の長さが一般に少なくとも１２の炭素（例えば、長さが１２．．．１４．．．２０．．．２４．．．またはそれ以上の炭素）であるジアシルグリセロホスホリルコリンを含み、１つ以上のシスまたはトランス二重結合を含有し得る。上記化合物の例としては、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、水素添加もしくは水素未添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、またはヒマワリホスファチジルコリンが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、中性脂質は、例えば、最大７０ｍｏｌのジアシルグリセロホスホリルエタノールアミン／１００ｍｏｌのリン脂質（例えば、１０／１００モル．．．２５／１００モル．．．５０／１００．．．７０／１００ｍｏｌ）を含む。一部の実施形態では、ジアシルグリセロホスホリルエタノールアミンは、長さが一般に少なくとも１２の炭素（例えば、長さが１２．．．１４．．．２０．．．２４．．．またはそれ以上の炭素）のアシル鎖を有し、１つ以上のシスまたはトランス二重結合を含有してもよい。このような化合物の例としては、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、卵ホスファチジルエタノールアミン（ＥＰＥ）、及びトランスホスファチジル化ホスファチジルエタノールアミン（ｔ−ＥＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、ホスホリパーゼＤを使用して、種々の天然または半合成のホスファチジルコリンから生成することができる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣｐＧ減少またはＣｐＧ非含有発現ベクターを使用する。ＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ヒトＧ−ＣＳＦの野生型）を含む初期配列は、核酸配列を変更することによりＣｐＧジヌクレオチドを除去するように改変され得る。図１は、ヒトＧ−ＣＳＦのＣｐＧ非含有バージョンを示し、その配列は下線を引いたＣｐＧを除去するように変更されている。このようなＣｐＧジヌクレオチドは、コード配列だけでなく、例えば５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ、ＩＴＲ、イントロン、及び核酸分子またはベクター中に存在する任意の他の配列などを含む非コード配列においても、適切に減少または排除することができる。ＣｐＧジヌクレオチドは、選択されたアミノ酸のコドントリプレット内に位置し得る。ＣｐＧジヌクレオチドを含む１つ以上のコドントリプレットを有する５つのアミノ酸（セリン、プロリン、スレオニン、アラニン及びアルギニン）が存在する。これらのアミノ酸の５つは全て、ＣｐＧは避けるが、以下の表１に示す同じアミノ酸を依然としてコードするように変更することができるＣｐＧジヌクレオチドを含まない代替コドンを有する。それゆえ、選択されたアミノ酸のコドントリプレット内に割り当てられたＣｐＧジヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドを欠く同じアミノ酸のコドントリプレットに変更することができる。
さらに、コーディング領域内では、トリプレット間の接合部分が考慮されるべきである。例えば、アミノ酸トリプレットがＣ−ヌクレオチドで終わった後、Ｇ−ヌクレオチド（例えば、バリン、グリシン、グルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸）のみで開始することができるアミノ酸トリプレットが続く場合、第１のアミノ酸トリプレットのトリプレットはＣ−ヌクレオチドで終わらないものに変更される。ＣｐＧ非含有配列を作製するための方法は、例えば、米国特許第７，２４４，６０９号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＮＶＩＶＯＧＥＮにより提供される商業サービスは、ＣｐＧ非含有（または減少）核酸配列／ベクター（プラスミド）を生成するためにも利用可能である。ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより提供される商業サービスは、ＣｐＧ非含有ヌクレオチドを生成する。
下記の表２に、本明細書に記載のベクターに使用することができるプロモーター及びエンハンサーの例を示す。このようなプロモーター、及び当該技術分野で公知の他のプロモーターは、単独で、または任意のエンハンサーのいずれかまたは当該技術分野で公知のエンハンサーと共に使用され得る。さらに、複数のタンパク質または生物学的に活性な核酸分子（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）を同じベクターから発現させる場合、同一または異なるプロモーターを目的の核酸配列と組み合わせて使用することができる。
本開示は、発現する治療用タンパク質の種類により制限されない。特定の実施形態では、治療用タンパク質は、抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２）を含む。他の実施形態では、治療用タンパク質は、抗炎症性タンパク質、凝固タンパク質、抗癌タンパク質、抗敗血症タンパク質などからなる群より選択される。本明細書に記載の方法、システム、及び組成物で発現させることができる治療用タンパク質の例としては、以下の表３に示される治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、及びｓｃＦｖが挙げられる。
本明細書に記載の方法、システム、及び組成物で発現させることができる治療用タンパク質のさらなる例としては、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、及びｓｃＦｖ、例えば、抗体１０−１０７４（本明細書に全体が参照により組み込まれるＣａｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１７ Ｆｅｂ；２３（２）：１８５−１９１，Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｊａｎ １６）；ＨＩＶ−１抗体３ＢＮＣ１１７（本明細書に全体が参照により組み込まれるＳｃｈｅｉｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１６ Ｊｕｌ ２８；５３５（７６１３）：５５６−６０）；及びＶＲＣ０１（例えば、本明細書に全体が参照により組み込まれるＢａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６ Ｎｏｖ ２４；３７５（２１）：２０３７−２０５０を参照のこと）を含む広域中和抗ＨＩＶモノクローナルが挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書の組成物及びシステムは、適切な対象（例えば、マウス、ヒトなど）において治療及び／または予防効果を誘発するように選択された用量で提供及び／または投与される。一部の実施形態では、治療的用量が提供される。一部の実施形態では、予防的用量が提供される。投与及び投与レジメは、限定されないが、所望のレベルの薬理学的効果、実用的なレベルを得ることができる薬理学的効果、毒性を含む周知の薬理学的及び治療的／予防的考慮事項に基づいて、臨床医または薬理学分野の他の熟練者により調整される。一般に、医薬品を投与するための周知の薬理学的原理に従うことが望ましい（例えば、一般に、投与量を、一度に５０％以上、且つ３〜４以下の薬剤半減期毎に、変更しないことが望ましい）。用量関連の毒性の考慮事項が比較的少ないか、またはない組成物では、最大の有効性が望まれる場合、平均必要用量を超過する用量は珍しくない。投与に対するこのアプローチは一般に、「最大用量」方策と呼ばれる。特定の実施形態では、用量（例えば、予防的または治療薬）は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、またはそれらの間の範囲（例えば、５．０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ））である。一部の実施形態では、対象は、０．１ｋｇ（例えば、マウス）〜１５０ｋｇ（例えば、ヒト）、例えば、０．１ｋｇ、０．２ｋｇ、０．５ｋｇ、１．０ｋｇ、２．０ｋｇ、５．０ｋｇ、１０ｋｇ、２０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、２００ｋｇ、またはそれらの間の範囲（例えば、４０〜１２５ｋｇ）である。一部の実施形態では、用量は、０．００１ｍｇ〜４０，０００ｍｇ（例えば、０．００１ｍｇ、０．００２ｍｇ、０．００５ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｋｇ、０．２ｍｇ、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．０ｍｇ、５．０ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、１，０００ｍｇ、２，０００ｍｇ、５，０００ｍｇ、１０，０００ｍｇ、２０，０００ｍｇ、４０，０００ｍｇ、またはそれらの間の範囲である。
［実施例］
以下の例の全てにおいて、発現ベクターの全ては、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ｐｘ４５８−ｒｅｌＡ１（配列番号８）及びＧｅｎｓｃｒｉｐｔ ｐｘ４５８−ｒｅｌＡ４（配列番号９）を除き、ＣｐＧ非含有であり、これらの両方は、市販されているＣｐＧ搭載配列である（ｗｗｗ、続いて、「ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ＣＲＩＳＰＲ−ｇＲＮＡ−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．ｈｔｍｌ．」参照のこと）。
［実施例１］
［長期治療用リツキシマブ発現］
この実施例は、リツキシマブをコードするデュアルカセットまたは単一カセットプラスミドベクターのいずれかの単回注射後の治療用血清レベルでのモノクローナル抗体リツキシマブの長期発現を実証する、行われた実験について説明する。
第１の実施例：
第１の実施例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。各マウスは、リポソーム二重層に組み込まれた２．５％のデキサメタゾンパルミテート（ＤＰ）を含有する１０５０ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソームの単回ＩＶ注射を投与された。この２分後に、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）をコードする２つの異なるプラスミドＤＮＡのうちの１つを７５ｕｇで単回ＩＶ注射した。両方のグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇデキサメタゾンのＩＰ注射で処置した。図５（配列番号３）に示されるプラスミド７１５．１ ２ａ（Ｐ２Ａ）は、２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＣＤ２０ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードする。図６（配列番号４）に示されるプラスミド７１８．１は、それぞれ抗ＣＤ２０ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターである。抗ＣＤ２０の血清レベルを、注射の２４時間後及びその後７日間隔で、ＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡキットを、Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
結果を図２Ａに示す。各プラスミドの注射は、注射の２４時間後にｕｇ／ｍｌレベルで１に近いまたはそれを超える血清抗ＣＤ２０ ｍＡｂタンパク質レベルを生じさせた。血清抗ＣＤ２０ ｍＡｂタンパク質レベルは、次の少なくとも１７８日間、両方のグループでこの範囲内に維持される。血清抗ＣＤ２０ ｍＡｂタンパク質レベルは、ＤＮＡベクターがヒトＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡをコードしたことを除いて同じプロトコールが投与されたマウスにおいて検出できなかった。これらのデータは、抗ＣＤ２０ ｍＡｂをコードするデュアルカセット及び単一カセットプラスミドＤＮＡベクターが、単回ＩＶ注射後の長時間の持続血清抗ＣＤ２０ ｍＡｂのタンパク質レベルを生じ得ることを実証する。
第２の実施例：
第２の実施例では、ＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳ培地を使用して、Ｒａｊｉ細胞（５×１０ ４の細胞／ウェル）を、９６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞を室温で１時間、リツキシマブ（０．５、１、１０ｕｇ／ｍｌ）またはマウス血清試料（２０ｕｌ／ウェル、２反復試料）と共にインキュベートした。次に、プールされた２０マイクロリットルの正常ヒト血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を全てのウェルに添加し（リツキシマブ対照条件を除く）、プレートを３７Ｃでさらに１２時間インキュベートした。細胞生存率を、ＰＲＯＭＥＧＡ Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ試薬を製造者の指示書に従って使用して測定した。結果を図２Ｂに示し、値は、対照条件（無処置）からの変化百分率として示す。静置した各マウス試料のリツキシマブ濃度を図２Ｂに示す。対照１〜２試料は、対照プラスミド（Ｇ−ＣＳＦをコードする）を注射したマウスのマウス血清を指す。バーは、２反復試料の標準偏差を表す。
カチオン性リポソーム、次に、１４８日前の抗ＣＤ２０ ｍＡｂまたはヒトＧ−ＣＳＦのいずれかをコードするプラスミドＤＮＡベクターを逐次注射されたマウスの血清を、抗ＣＤ２０の濃度測定のためにＥＬＩＳＡで最初に分析した。バーの上にある赤いフォントの数字は、対応する血清試料のリツクスマブの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表す。細胞溶解アッセイを使用して、１４８日前に抗ＣＤ２０ ＤＮＡベクターが注射されたマウスから単離された血清は、ＣＤ−２０＋ヒトＲａｊｉ細胞を高濃度の組み換えリツキシマブタンパク質（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で処置されたＲａｊｉ細胞に匹敵するレベルで溶解した。これらのデータ（図２Ｂ）は、抗ＣＤ２０ ＤＮＡベクターが注射されたマウスが、単回ＤＮＡベクター注射後の少なくとも１７６日間、完全に生物活性なリツキシマブｍＡｂタンパク質を産生することを示す。
第３の実施例：
第３の例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。各マウスは、リポソーム二重層に組み込まれた２．５％のデキサメタゾンパルミテート（ＤＰ）を含有する１０００ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソームの単回ＩＶ注射を投与された。この２分後に、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）をコードする２つの異なるプラスミドＤＮＡのうちの１つを７５ｕｇで単回ＩＶ注射した。両方のグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇデキサメタゾンのＩＰ注射で処置した。図７（配列番号５）に示されたプラスミド９０２．８（Ｐ２Ａ）は、２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＣＤ２０ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードする。図６（配列番号４）に示されたプラスミド７１８．１は、それぞれ抗ＣＤ２０ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターである。抗ＣＤ２０の血清レベルを、注射の２４時間後及びその後７日間隔で、ＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡキットを、Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。図３の結果は、各プラスミドの注射が、注射の２４時間後にｕｇ／ｍｌレベルで１に近いまたはそれを超える血清抗ＣＤ２０ ｍＡｂタンパク質レベルを生じさせたことを示す。血清抗ＣＤ２０ ｍＡｂタンパク質レベルは、注射後５７日で両方のグループでこの範囲内であった。
第４の実施例：
第４の例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。各マウスは、１０００ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソーム及び１０００ナノモルのＤＭＰＣ中性リポソームの単回ＩＶ注射を投与され、それぞれは、リポソーム二重層に組み込まれた２．５％のデキサメタゾンパルミテート（ＤＰ）を含有する。この２分後に、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）をコードする７５ｕｇのプラスミドＤＮＡを単回ＩＶ注射した。両方のグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇデキサメタゾンのＩＰ注射で処置した。プラスミドｐ７１８．１は、それぞれ抗ＣＤ２０ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターである。図８（配列番号６）に示されるプラスミドｐ１１３．２は、同一であるが、第２のコードカセットの上流に単一のスーパーエンハンサーを含む。抗ＣＤ２０の血清レベルを、注射後２４時間で、ＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡキットは、Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供された。結果を図４に示す。両方のグループは、逐次注射の２４時間後に抗ＣＤ２０を発現する。単一のスーパーエンハンサーエレメントの付加は、この時点でマウスの血清抗ＣＤ２０ ｍＡｂタンパク質の産生を増加させる。
［実施例２］
［生物学的に活性な核酸の発現］
この実施例は、カチオン性リポソーム、次に、ＣＰＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマウスＮＦｋＢ−ｐ６５を特異的に標的とするアンチセンス配列をコードするプラスミドＤＮＡベクターのＩＶ逐次注射はそれぞれ、マウスにおけるｐ６５発現を抑制することを実証する、行われた実験について説明する。
第１の実施例：
第１の実施例では、１グループ当たり３匹または４匹のマウスに注射した。各マウスは、リポソーム二重層に組み込まれた２．５％のデキサメタゾンパルミテート（ＤＰ）を含有する１０００ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソームの単回ＩＶ注射を投与された。この２分後に、内因性マウスＮＦｋＢ−ｐ６５の発現を抑制するために、示されたＣＲＩＳＰＲベースまたはリボザイムベースのプラスミドをコードする７５ｕｇのプラスミドＤＮＡを単回ＩＶ注射した。使用されたプラスミドは、以下の通りである：リボザイム（図１３、配列番号７）、ＣＲＩＳＰＲ１（図１４、配列番号８）、ＣＲＩＳＰＲ２（図１５、配列番号９）、及びＣＲＩＳＰＲ（図１６、配列番号１０）。対照群は、その代わりにマウスＰＥＣＡＭを標的とした２０ｂｐの標的化配列を除いて、抗ＮＦｋＢ−ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲプラスミドと同一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを投与された。全てのグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンのＩＰ注射により処置した。
組織調製及び抗マウス−ｐ６５ ＥＬＩＳＡ法は、以下の通りであった。氷上で調製した１ＸＴｒｉｔｏｎ溶解緩衝液５００ｕＬに解離させることにより、注射（抗−ｐ６５リボザイム）の２４時間後に、及び注射（抗−ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ１／２）の８日後に、肺溶解物を生成した。試料は、動物毎に両方の肺を含む。３０秒間、各試料を均質化し（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ ２１００）、パルス超音波処理し（Ｍｉｓｏｎｉｘ ＸＬ２０００ Ｍｉｃｒｏｓｏｎ超音波細胞破壊器ＸＬ ２０００）、４Ｃで１０分間遠心分離し、溶解物を組織ペレットから吸引した。次に、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入したＢＣＡ全タンパク質アッセイを使用して、各溶解物からのタンパク質濃度を決定した。製造者の指示書により、タンパク質標準化溶解物を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの９６ウェルプレートＥＬＩＳＡ（ＰａｔｈＳｃａｎ Ｔｏｔａｌ ＮＦ−κＢ ｐ６５ Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ）に２回添加した。次に、プレートを（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５）プレートリーダーで分析した。プレートの吸光度を記録した後、４ＰＬ分析により、マウスＢ１６メラノーマ細胞上清を使用して作成された標準曲線を適合させた。エラーバーは、標準誤差を表す。
この実施例の結果を図９に示す。これらのデータは、抗マウスＮＦｋＢ−ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びリボザイム、プラスミドベースの標的化ベクターが、それぞれ全身注射の８日後及び１日後に、内因性マウスｐ６５の発現を低下させることを実証する。
第２の実施例：
この実施例の方法は、上記と同じである。結果を図１０に示す。これらのデータは、抗マウスＮＦｋＢ−ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドベースの標的化ベクターが、マウスにおける全身注射の１３日後に、内因性マウスｐ６５の発現を低下させることを実証する。加えて、これらのマウスの組織切片で、ＮＦｋＢ−ｐ６５免疫組織化学法を実施した。
マウス肺のパラフィン包埋切片は、ｐ６５のＣ末端（抗ＮＦ−ｋＢ ｐ６５抗体［Ｅ３７９］（ａｂ３２５３６）−ＡＢＣＡＭ）に、初代ウサギＭａｂを用いて、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ自動染色装置で染色されたバッチ（対照及び処置動物由来の切片）であった。２次標識ペルオキシダーゼ。Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒデジタルパソロジーシステムを使用して、２０Ｘの倍率で明視野で、ＩＨＣ染色スライドをスキャンした。次に、デジタル画像を、定量分析のためにＶｉｓｉｏｐｈａｒｍソフトウェアに取り込んだ。
Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ画像解析モジュールを使用して、各試料の肺実質の５つの点在する代表的な領域（ＲＯＩ）を、ＨＩＣ画像解析技術によりランダムに選択し、さらなる定量分析のために手で輪郭を描く。ソフトウェアは、３つの特徴：平均多項式平滑化フィルターを用いるＲＧＢ−Ｂ、コントラスト赤−青、及び最小のＨ＆Ｅエオシンフィルターを用いるＨＤＡＢ−ＤＡＢを使用して、グレースケール値に初期デジタル画像を変換した。次に、Ｂａｙｅｓｉａｎ分類スキームを使用して、陽性の褐色染色、ヘマトキシリン対比染色剤、及びブランク空間をラベル化するために、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍソフトウェアを調整する。この構成を使用して、全てのＲＯＩを、バッチモードで処理して、目的のアウトプットを生成した。
ＮＦｋＢの面積を肺実質の総面積で割ることにより、ＮＦｋＢの比率を決定した。対照（リンガー）及び処理肺（１４３〜３９）の比の差は、ＮｆＫｂ染色において約５３％の減少を示す。この知見は、染色された切片の目視観察と一致している。結果を図４１に示す。図４１Ａは、リンガー処置対照を示し、４１Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９抗ＮＦｋＢ ｐ６５処置マウス組織を示す。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９抗ＮＦｋＢ ｐ６５プラスミドＤＮＡベクターの単回ＩＶ注射が、対照ＤＮＡベクターに対して、１３日前に抗ＮＦｋＢ ｐ６５が注射されたマウス肺全体にわたって、ｐ６５タンパク質レベルを５０％以上減少させたことを実証する。
第３の実施例：
この実施例の方法は、上記と同じである。結果を図１１に示す。これらのデータは、抗マウスＮＦｋＢ−ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びアンチセンスプラスミドベースの標的化ベクター（図１９、配列番号１１）が、全身注射のそれぞれ１３日及び１日後で内因性マウスｐ６５の発現を低減させることを実証する。
第４の実施例：
この実施例の方法は、上記と同じである。結果を図１２に示す。これらのデータは、抗マウスＮＦｋＢ−ｐ６５ ｓｈＲＮＡベクターｐ６５ ｓｈＢ（図２０、配列番号１２）及びプラスミドｐ６５ ｓｈＡ２（配列番号５５；図７６）プラスミドベースの標的化ベクターが、全身注射の１日後の内因性マウスｐ６５の発現を減少させることを実証する。対照プラスミドＰＥＣＡＭ ｓｈ対照は、図７７の配列番号５６である。
［実施例３］
［長期Ｇ−ＣＳＦ発現］
この例では、カチオン性リポソーム、続いて、ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡベクターの単回ＩＶ逐次注射が、マウスにおいて、次の少なくとも５８２日間、上掲の治療用ヒトＧ−ＣＳＦ血清タンパク質レベルを生じさせ（図１７Ａ）、且つ絶対好中球数（ＡＮＣ）を上昇させた（図１７Ｂ）ことを実証する、行われた実験について説明する。従って、単回ＩＶ逐次リポソームＤＮＡ注射は、完全な免疫コンピテントマウスにおいて一年半以上、治療的血清レベルのＤＮＡベクターでコードされたタンパク質を生成し得る。使用された２つのＨＧ−ＣＳＦプラスミドは、０１１２１５＃７（配列番号４５；図６６）及び０１１３１５＃２（配列番号４６；図６７）であり、陰性対照は、プラスミド１２２０１４＃２３５（配列番号４７；図６８）であった。
別の例では、ＨＧ−ＣＳＦをコードするプラスミドをラットに注射した。ラット番号１０及び番号１２に、それぞれ１回の逐次注射を投与し、ラット１４に、最初の注射後７及び２１日目に２回再注射した。ラット番号１０に、３０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、続いて、ＨＧ−ＣＳＦをコードする３００ｕｇのＭＡＲｌｅｓｓプラスミドＤＮＡをＩＶ注射した。ラット番号１２に、３ｍｇのデキサメタゾン（ＩＰ）を注射し、続いて、３０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、ＨＧ−ＣＳＦをコードする３００ｕｇのＭＡＲｌｅｓｓプラスミドＤＮＡをＩＶ注射した。ラット番号１４に、実験の開始時に、３０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、ＨＧ−ＣＳＦをコードする３００ｕｇのＭＡＲ含有プラスミドＤＮＡを注射した。その後、ラット１４に、７日目に３ｍｇのデキサメタゾン（ＩＰ）を後で注射し、続いて、３３００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、ＨＧ−ＣＳＦをコードする３３０ｕｇのＭＡＲ含有プラスミドＤＮＡをＩＶ注射した。２１日目に、ラット番号１４に、３ｍｇのデキサメタゾン（ＩＰ）を注射し、続いて、４４００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、ＨＧ−ＣＳＦをコードする３３０ｕｇのＭＡＲ含有プラスミドＤＮＡをＩＶ注射した。
結果を図１８に示し、これは、ＤＯＴＡＰカチオン性リポソーム、続いて、ＨＧ−ＣＳＦをコードするプラスミドＤＮＡの逐次ＩＶ注射後のラット血清における好中球の上昇を示す。これらの結果は、反復逐次ＩＶカチオン性リポソーム注射、続いて、ＨＧ−ＣＳプラスミドＤＮＡベクターが、少なくとも次の１００日間は、絶対好中球数の持続的な上昇を十分に生じ得ることを実証する。それらはまた、デキサメタゾンの前注射、続いて、単回逐次ＩＶカチオン性リポソーム注射、続いて、ＨＧ−ＣＳＦプラスミドＤＮＡベクターは、絶対好中球数の持続的な上昇も生じ得ることを示す。
［実施例４］
［ＰＣＲ生成ＤＮＡベクターの投与は、タンパク質産物の産生レベル及び期間の両方を実質的に増加させる。］
この実施例は、ＰＣＲ生成ＤＮＡベクターの投与が、プラスミドＤＮＡと比較した場合、マウスでのＤＮＡベクター遺伝子でコードされたタンパク質産物の産生レベル及び期間の両方を実質的に増加させることを実証する、行われた実験について説明する。
環状のＰＣＲ生成ＤＮＡベクターは、マウスの血清ヒトＧ−ＣＳＦ産生のレベルを増加させる。
方法：Ｑ５ Ｈｉｇｈ忠実度ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して、対応する酵素制限部位を含有するプライマーペアまたはステムループ構造を含むプライマーペア（保護された直鎖産物の場合）を使用して、ＰＣＲによりＤＮＡ発現ベクターを生成するために、ＨＧ−ＣＳＦ発現カセットをＰＣＲで増幅した。精製ＰＣＲ産物を、１０Ｕ／ｕｇの対応する酵素（ＢａｍＨＩ）で消化し、次に、８５Ｃで２０分間熱失活させた。精製消化ＰＣＲのライゲーションを、１または５０ｎｇ／ｕｌで８０のＴ４ＤＮＡリガーゼ単位／ｕｇの消化ＰＣＲで室温で１時間実施し、次に、６５Ｃで２０分間熱不活化した。１ｎｇ／ｕｌのライゲーション条件では、精製前にＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過Ｕｌｔｒａ１５を用いて、体積を減少させた。次に、ライゲーションされたＰＣＲ産物を、精製カラムから乳酸化リンガーで溶出した後、最終０．２ｕＭの濾過にかけた。Ｐｕｒｅｌｉｎｋ ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して、全ての精製ステップを実施した。
１０５０ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソーム、続いて、７０ｕｇのＨＧ−ＣＳＦプラスミドＤＮＡまたは異なる形態のＰＣＲ生成ＨＧ−ＣＳＦ発現カセットＤＮＡのいずれかの逐次ＩＶ注射の２４時間後のマウス血清中のヒトＧ−ＣＳＦのレベルを示す結果を図２１に示す。環状のＰＣＲ生成ＤＮＡが投与されるマウスは、直鎖ＰＣＲ生成ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡのいずれかが投与されたものよりも高いレベルの血清ＨＧ−ＣＳＦを示す。
環状のＰＣＲ生成ＤＮＡベクターは、血清ヒトＧ−ＣＳＦ及びＡＮＣのレベル及び期間を増加させる。さらに、ＤＮＡを生成するＰＣＲの単回再注射は、マウスの長期の高レベルのヒトＧ−ＣＳＦレベルを実質的に増加させる。
図２２は、マウスの血清または血漿中のヒトＧ−ＣＳＦのレベル（左軸）及び最初の注射後の次の少なくとも３０２日間のマウスの全血中のマイクロリットル当たりの数千の絶対好中球数（ＡＮＣ）（右軸）を示す。マウスに、カチオン性リポソーム、続いて、ＰＣＲ生成ＤＮＡを、ＩＶ逐次注射した。１つのグループに、３５日目に脂質及びＰＣＲ ＤＮＡの反復逐次注射を投与し、次の２００日間で有意に高い血清ＨＧ−ＣＳＦレベルがもたらされた。ヘパリン化全血をＡＮＣについて分析し、血漿をＥＬＩＳＡによりＨＧ−ＣＳＦについて分析した。マウスは、注射の３００日後の好中球の著しく上昇したレベルを示す。対照（モック及び非注射）マウスの平均ＡＮＣは、２Ｋ／ｕＬである。従って、ＰＣＲ生成ベクターＤＮＡの単回反復注射は、ベクター発現タンパク質産物の血清ＨＧ−ＣＳＦレベル及びＡＮＣを実質的に長期間上昇させることができる。
Ｒ６Ｋ ＤＮＡ配列が環状のＰＣＲ生成ＤＮＡベクターに含まれることが、マウスの血清ヒトＧ−ＣＳＦ産生のレベル及び期間を増加させる。
方法：２７ｇのマウスに、ＤＯＴＡＰ ＳＵＶカチオン性リポソーム、続いて、複製起点（Ｒ６Ｋ）を含むか、または含まないＨＧ−ＣＳＦをコードする環状のＰＣＲ ＤＮＡをＩＶ注射した。その後、７または１４日毎に、マウスから採血した。図２３は、カチオン性リポソーム、続いて、Ｒ６Ｋ複製起点を含むか、または含まないＰＣＲ生成ＤＮＡの単回逐次注射後の１０６日間のマウス血清中のヒトＧ−ＣＳＦレベルを示す。従って、Ｒ６Ｋを含む、選択されたＤＮＡ配列が組み込まれることは、長期間、ＤＮＡベクターでコードされたタンパク質の血清レベルを有意に増加させることができる。
［実施例５］
［中性脂質及びデキサメタゾンパルミテートは、血清レベルを上昇させる。］
この実施例は、ヒトＧ−ＣＳＦ発現ベクターの逐次ＩＶ投与への中性脂質及びデキサメタゾンパルミテートの添加が、マウスにおいて、長期間、ヒトＧ−ＣＳＦ血清レベル及びＡＮＣの両方を有意に増加させることを実証する、行われた実験について説明する。
方法：マウスに、３つの異なるリポソーム製剤のうちの１つを注射した。１０５０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ単独、１０５０ｎｍｏｌのＤＭＰＣ中性脂質と混合された１０５０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、または１０５０ｎｍｏｌのＤＭＰＣと混合された２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０５０ｎｍｏｌのＳＵＶ。脂質注射の２分後に、ヒトＧ−ＣＳＦの発現をコードするプラスミドを含有するＭＡＲを注射した。その後、７または１４日毎に、マウスから採血した。ヘパリン化全血を好中球数について分析し、血漿をＥＬＩＳＡでＨＧ−ＣＳＦについて分析した。未処置の対照マウスは、一貫して３Ｋ／ｕＬ未満である。
図２４は、中性脂質またはデキサメタゾンパルミテートを含むか、または含まないカチオン性リポソーム、続いて、プラスミドＤＮＡが逐次注射されたマウスのヒトＧ−ＣＳＦ及び対応する絶対好中球数（ＡＮＣ、右軸）のレベルを示す。マウスは、注射の９９日後の好中球の有意に上昇したレベルを示す。中性脂質及びデックスパルミテートが投与されたマウスは、経時的な最高のＡＮＣ数を示す。
［実施例６］
［発現タンパク質の血清レベルを増加させるための第２のエンハンサーの使用］
この実施例は、ヒトＧ−ＣＳＦ ＤＮＡ発現プラスミドへの第２エンハンサーの付加が、マウスへの逐次ＩＶ注射後にヒトＧ−ＣＳＦ血清レベルを増加させることができることを実証する、行われた実験について説明する。
方法：マウスに２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有するＤＯＴＡＰ及び２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有するＤＭＰＣをそれぞれ１０００ｎｍｏｌ、最初に注射した。この２分後に、ＨＧ−ＣＳＦをコードするプラスミドが続いた。使用された４つのプラスミドは、ｓｖ４０−ｍＣＭＶＥＦ１（配列番号１３；図２６）；ｍＣＭＶ−ｍＣＭＶＥＦ１（配列番号１４；図２７）；ｍＣＭＶ−ｈＣＭＶＥＦ１（配列番号１５；図２８）；及びｍＣＭＶＥＦ１（配列番号１６；図２９）である。最初の３つの発現構築物は、余剰のエンハンサー配列を含有していた。上述のようにマウスから採血した。
図２５に、この実施例の結果を示す。この図に示されているように、エンハンサーの組み合わせは、逐次ＩＶ注射の１日後及び８日後にマウスにおけるヒトＧ−ＣＳＦ発現を増加させた。リポソーム、続いて、ヒトＧ−ＣＳＦをコードし且つ２つの組み合わせで一連の異なるエンハンサーエレメントを含有するプラスミドの単回処置の結果を示す。
［実施例７］
［スーパーエンハンサーの使用］ この実施例は、ヒトＧ−ＣＳＦ ＤＮＡ発現プラスミドへのスーパーエンハンサー配列の付加が、マウスへの逐次ＩＶ注射後にヒトＧ−ＣＳＦ血清レベルを増加させることができることを実証する、行われた実験について説明する。
方法：マウスに、２．５％デキサメタゾンパルミテートを含有するＤＯＴＡＰ及び２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有するＤＭＰＣ中性脂質をそれぞれ１０００ｎｍｏｌ、最初に注射した。この２分後に、スーパーエンハンサーエレメント（ｈｒ３）を含むか、または含まないＨＧ−ＣＳＦをコードするプラスミドが続く。ｈｒ３含有プラスミドは、以下の通りである：ｈｒ３−ｍＣＭＶＥＦ１＃２（配列番号１７；図３１）；ｈｒ３−ｍｃｍｖＥＦ１＃５（配列番号１８；図３２）；及びｈｒ３−ｍｃｍｖＥＦ１＃１８（配列番号１９；図３３）。スーパーエンハンサーエレメントのないプラスミドを投与されたグループの１つ（４番目のバー）に、２．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充した。
図３０では、リポソーム、続いて、プラスミドＤＮＡの逐次ＩＶ注射の２４時間後のヒトＧ−ＣＳＦのマウス血清レベルを示す。最初の３つのグループのプラスミドは、スーパーエンハンサーエレメントを含有する。さらに、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と一緒に注射されたプラスミドを示す。スーパーエンハンサーエレメントを含有する３つの異なるＤＮＡベクターのそれぞれは、スーパーエンハンサーを欠く対応するＤＮＡベクターよりも高い血清ヒトＧ−ＣＳＦレベルを生じた。
［実施例８］
［スーパーエンハンサーの使用］
この実施例では、ヒト第９因子ＤＮＡ発現プラスミドへのスーパーエンハンサー、Ｒ６Ｋ、またはＲＮＡ−ｏｕｔ ＤＮＡ配列の付加が、マウスへの逐次ＩＶ注射後にヒト第９因子血清レベルを増加させることができることを実証する、行われた実験について説明する。
方法：２７ｇのマウスに、ＤＯＴＡＰ ＳＵＶカチオン性リポソーム、続いて、ヒト第ＩＸ因子をコードするＤＮＡをＩＶ注射した。複製起点（Ｒ６Ｋ）を含むか、または含まないプラスミド及び環状のＰＣＲ構築物の両方を使用した。
図３４は、リポソーム及び種々の異なるＦＩＸ ＤＮＡ発現プラスミドの逐次ＩＶ注射の２４時間後のヒト第ＩＸ因子の血漿濃度を示す。使用されたプラスミドは、ＦＩＸプラスミド（配列番号２０；図３５）；ＦＩＸ Ｒ６Ｋ１（配列番号２１；図３６）；ＦＩＸ Ｒ６Ｋ２（配列番号２２；図３７）；ＦＩＸ Ｓｕｐｅｒｅｎｈ（配列番号２３；図３８）；及びＦＩＸ ＲＮＡ−ｏｕｔ（配列番号２４；図３９）である。対照ＦＩＸプラスミド（第１のバー）に加えて、プラスミドは、Ｒ６Ｋエレメントを含む２つの異なるＰＣＲ生成ＤＮＡ、スーパーエンハンサーを含有するＦＩＸプラスミド、及びＲＮＡ−ｏｕｔを使用して生成されたＦＩＸプラスミドを含んでいた。修飾ＤＮＡベクターのそれぞれは、注射の１日後により高いヒトＦＩＸ血清タンパク質レベルを生じた。
［実施例９］
［ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、注射の１０日後及び４０日後のノックダウンを媒介した］
この実施例は、マウスへの逐次ＩＶ注射の１０日後及び４０日後のマウスＮＦｋＢ−ｐ６５タンパク質の抗ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックダウンを実証する、行われた実験について説明する。
マウスの処置方法：１グループ当たり３または４匹のマウスに注射した。各マウスは、リポソーム二重層に組み込まれた２．５％のデキサメタゾンパルミテート（ＤＰ）を含有する１０００ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソームの単回ＩＶ注射を投与された。この２分後に、内因性マウスＮＦｋＢ−ｐ６５の発現を抑制するために、示されたＣＲＩＳＰＲベースまたはリボザイムベースのプラスミドをコードする７５ｕｇのプラスミドＤＮＡを単回ＩＶ注射した。ＰＥＣＡＭ ＣＲＩＳＰＲ対照を配列番号１０に示し、ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ ＲｅｌＡ１を配列番号８に示す。プラスミドＥＦ１／Ｕ６ ＲｅｌＡ１（０２０１１７＃５）（配列番号５７）を図７９に示し；プラスミドＥＦ１／Ｕ６ ＲｅｌＡ４（０２０１１７＃８）（配列番号５８）を図８０に示し；プラスミドｈｕ１／ＥＦ１／Ｕ６ ＲｅｌＡ１（０２１４１７＃３）（配列番号５９）を図８１に示す。対照群は、その代わりにマウスＰＥＣＡＭを標的とした２０ｂｐの標的化配列を除いて、抗ＮＦｋＢ−ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲプラスミドと同一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを投与された。全てのグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンのＩＰ注射により処置した。
組織調製及び抗マウスｐ６５ ＥＬＩＳＡ法。氷上で調製した１ＸＴｒｉｔｏｎ溶解緩衝液５００ｕＬに解離させることにより、注射（抗−ｐ６５リボザイム）の２４時間後に、及び注射（抗−ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ１／２）の８日後に、肺溶解物を生成した。試料は、動物毎に両方の肺を含む。３０秒間、各試料を均質化し（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ ２１００）、パルス超音波処理し（Ｍｉｓｏｎｉｘ ＸＬ２０００ Ｍｉｃｒｏｓｏｎ超音波細胞破壊器ＸＬ ２０００）、４Ｃで１０分間遠心分離し、溶解物を組織ペレットから吸引した。次に、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入したＢＣＡ全タンパク質アッセイを使用して、各溶解物からのタンパク質濃度を決定した。製造者の指示書により、タンパク質標準化溶解物を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの９６ウェルプレートＥＬＩＳＡ（ＰａｔｈＳｃａｎ Ｔｏｔａｌ ＮＦ−κＢ ｐ６５ Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ）に２回添加した。次に、プレートを（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５）プレートリーダーで分析した。プレートの吸光度を記録した後、４ＰＬ分析により、マウスＢ１６メラノーマ細胞上清を使用して作成された標準曲線を適合させた。エラーバーは、標準誤差を表す。
結果の説明：これらのデータは、図７８及び図４０に示され、これは、抗マウスＮＦｋＢ−ｐ６５ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びリボザイムプラスミドベースの標的化ベクターが、全身注射の１０及び４０日後の内因性マウスｐ６５の発現を減少させることを実証する。
［実施例１０］
［マウスにおける長期ＨＧ−ＣＳＦ発現］
この実施例では、カチオン性リポソーム、続いて、ＨＧ−ＣＳＦ ＤＮＡ発現ベクターの単回逐次ＩＶ注射の５８２日後に死亡させたマウスが、対照マウスに存在しない脾臓及び骨髄に非常に多くの好中球を示すことを実証する、行われた実験について説明する。方法は、次の通りであった。対照マウスは、未注射であった。処置された２７ｇのマウスに、８００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶカチオン性リポソーム、続いて、ｈＧ−ＣＳＦをコードする９０ｕｇのプラスミドＤＮＡをＩＶ注射し、注射の５８２日後に安楽死させた。マウスを瀉血させ、臓器を１０％の中性緩衝ホルマリン中で保存した。図４２は、骨髄におけるＩＨＣの結果を示す。特に、対照骨髄の図４２ａ（２０×）及び４２ｂ（６０×）は、正常な大腿髄腔の骨梁を取り囲む細胞タイプの多種多様な混合を示し、濃染性の赤血球細胞が特に明白である。処置骨髄の図４２ｃ（２０×）及び４２ｄ（６０×）は、単色のほぼ固体シートの淡染性の細胞が、大腿骨髄の淡染性の骨髄系細胞（多形核白血球）の骨梁エレメントを置換することを示し、楕円形、くぼんだ楕円形、帯状、及びセグメント化形態が、大腿骨髄内の他のほとんどの細胞型を置換する。図４３は、脾臓組織におけるＩＨＣの結果を示す。対照脾臓の図４３ａ（２０×）及び４３ｂ（６０×）は、多種多様な細胞集団を示す正常な脾臓の白色（リンパ系）髄の赤／暗色の部分を示す。処置脾臓の図４３ｃ（２０×）及び４３ｄ（６０×）は、淡染性の骨髄系細胞（ｐｍｎ）を示し、楕円形、くぼんだ楕円形、帯状、及びセグメント化形態は、他のほとんどの細胞型を置換する。
［実施例１１］
［ラットにおける長期ＨＧ−ＣＳＦ発現］
この実施例は、カチオン性リポソーム、続いて、ＨＧ−ＣＳＦ ＤＮＡ発現ベクターの最後の逐次ＩＶ注射の１６８日後に死亡させたラットが、対照ラットに存在しない骨髄に非常に多くの好中球を示すことを実証する、行われた実験について説明する。方法は、次の通りである。対照ラットは、未注射であった。処置ラット：実験開始時に、１５０ｇの雌ラットに、３０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、ＨＧ−ＣＳＦをコードする３００ｕｇのＤＮＡ発現ベクターを注射した。その後、処置ラットに、７日目に３ｍｇのデキサメタゾン（ＩＰ）、続いて、３３００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ及びＨＧ−ＣＳＦをコードする３３０ｕｇのＤＮＡ発現ベクターをＩＶ注射した。２１日目に、処置ラットに、３ｍｇのデキサメタゾン（ＩＰ）を再注射し、続いて、４４００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、ＨＧ−ＣＳＦをコードする３３０ｕｇのＤＮＡ発現ベクターをＩＶ注射した。ラットを安楽死させ、瀉血させ、臓器を、１０％の中性緩衝ホルマリン中で保存した。図４４は、骨髄におけるＩＨＣの結果を示す。特に、対照骨髄の図４４ａ（２０×）及び４２ｂ（６０×）は、大腿骨髄で特に明らかな、円形の濃染性の赤血球系統を有する細胞型の多様性を示す。処置骨髄の図４４ｃ（２０×）及び４４ｄ（６０×）は、淡染性の骨髄系細胞（多形核白血球）を示し、楕円形、くぼんだ楕円形、帯状、及びセグメント化形態は、大腿骨髄で優勢である。濃染性の赤血球系統細胞のごく少ないクラスターが残留する。図４５ａは、４０×の対照ラットの椎体を示すが、図４５ｂは、４０×のＨＧＣＳＦラットの椎体を示す。
［実施例１２］
［抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の発現］
この実施例は、マウスのＬＤＬを減少させるための、カチオン性リポソーム、続いて、抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ発現ベクターの逐次ＩＶ注射について説明している。１グループ当たり５匹のＣＤ−１マウスに注射する。注射前の２か月間、ＬＤＬコレステロールを増加させるために、マウスを、高コレステロール及びコール酸の食餌に置く（Ｅｎｖｉｇｏ Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ Ｔｅｋｌａｄ Ｄｉｅｔ ＴＤ．０２０２８）。次に、各マウスは、リポソーム二重層に組み込まれた２．５％のデキサメタゾンパルミテート（ＤＰ）を含有する１０５０ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソームの単回ＩＶ注射を投与され、２分後に、７５ｕｇの、抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をコードする３つの異なるプラスミドＤＮＡのうちの１つまたは対照グループとしての抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体をコードするプラスミドＤＮＡの単回ＩＶ注射を投与される。全てのグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンのＩＰ注射で処置した。ＤＮＡＲｘ−３１Ｈ４−２Ａ（配列番号２５；図４６）及びＤＮＡＲｘ−２１Ｂ１２（Ｐ２Ａ）（配列番号２７；図４８）は、２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードする。プラスミドＤＮＡＲｘ−３１Ｈ４（配列番号２６；図４７）及びＤＮＡＲｘ−２１Ｂ１２（配列番号２８；図４９）は、それぞれ異なるバージョンの抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターである。マウスのＬＤＬコレステロールの血清レベルを、注射の１週間前に、次に、注射の２４時間後に、その後７日間隔で測定した。血清ＬＤＬアッセイは、色素を形成するために、他の化合物の存在下でＬＤＬ基質を酵素分解することを含む、光度測定アッセイである。次に、吸光度アッセイにより、染料の色強度を測定し、カリフォルニア大学デービス校獣医診断研究所（ＵＣ Ｄａｖｉｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が実施する。処置マウスでは、ＬＤＬレベルが減少するが、対照マウスでは、減少しないことが予想される。
［実施例１３］
［抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の発現］
この実施例は、カチオン性リポソーム、続いて、担腫瘍ヌードマウスにおいてＲａｊｉ、ヒトＢ細胞リンパ腫腫瘍の進行を抑制するための、抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ発現ベクターの逐次ＩＶ注射について説明する。１グループ当たり５匹の無胸腺ヌードマウスに注射する。マウスの肩または脇腹は、０．１×１０５〜２×１０６のＲａｊｉ細胞が皮下投与される。１０〜１４日後、または腫瘍が７０〜１００ｍｍ３の体積に達する時、各マウスは、リポソーム二重層に組み込まれた２．５％のデキサメタゾンパルミテート（ＤＰ）を含有する１０５０ナノモルのＤＯＴＡＰ、２分後に、７５ｕｇの、抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ発現プラスミド、または対照グループとしての抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体をコードするプラスミドＤＮＡの単回ＩＶ注射を投与される。全てのグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンのＩＰ注射で処置した。ＤＮＡＲｘ−ＣＤ４７−２Ａ（Ｐ２Ａ）（配列番号２９；図５０）は、２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＣＤ４７ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードする。ＤＮＡＲｘ−ＣＤ４７（配列番号３０；図５１）は、それぞれ抗ＣＤ４７ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターである。ＤＮＡ発現ベクターを注射した後、腫瘍体積を、ノギスで１週１回または１週２回測定する。処置マウスでは、腫瘍体積が減少するが、対照マウスでは、減少しないことが予想される。
［実施例１４］
［抗ヒトＣＤ４７及び抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体の発現］
この実施例は、担腫瘍ヌードマウスにおいてＲａｊｉ、ヒトＢ細胞リンパ腫腫瘍の進行を抑制するための、カチオン性リポソーム、続いて、抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体、抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体、または抗ヒトＣＤ４７及び抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の両方をコードするＤＮＡ発現ベクターの逐次ＩＶ注射について説明する。１グループ当たり５匹の無胸腺ヌードマウスに注射する。マウスの肩または脇腹に、０．１×１０５〜２×１０６のＲａｊｉ細胞が皮下投与される。１０〜１４日後、または腫瘍が７０〜１００ｍｍ３の体積に達する時、各マウスは、リポソーム二重層に組み込まれた２．５％のデキサメタゾンパルミテート（ＤＰ）を含有する１０５０ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソームの単回ＩＶ注射、２分後、７５ｕｇの、抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体、抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ヒトＣＤ４７＋抗ＣＤ２０モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ発現プラスミド、または対照グループとしての抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体をコードするプラスミドＤＮＡの単回ＩＶ注射を投与される。全てのグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンのＩＰ注射により処置した。
ＤＮＡＲｘ−ＣＤ４７−２Ａ（Ｐ２Ａ）（配列番号２９；図５０）は、２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＣＤ４７ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードし、プラスミド７１５．１ ２ａ（Ｐ２Ａ）（配列番号３）は、２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＣＤ２０ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードする。ＤＮＡＲｘ−ＣＤ４７（配列番号３０；図５１）は、抗ＣＤ４７ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターである。ＤＮＡ発現ベクターを注射した後、腫瘍体積を、ノギスで１週１回または１週２回測定する。処置マウスでは、腫瘍体積が減少するが、対照マウスでは、減少しないことが予想される。
［実施例１５］
［抗インフルエンザ幹抗原モノクローナル抗体の発現］
この実施例は、カチオン性リポソーム、続いて、マウスにおいてインフルエンザＡを予防及び／または処置するための、抗インフルエンザＡ幹抗原をコードするＤＮＡ発現ベクターの逐次ＩＶ注射について説明する。１グループ当たり５匹のＣ５７Ｂｌ６マウスに注射する。注射の前に、２×ＭＬＤ５０のインフルエンザのＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、ＨＫｘ３１（Ｈ３Ｎ１）、またはＢ／Ｌｅｅ／４０ウイルス株をマウスに接種する。漸増量のウイルスに、未接種マウスを感染させることにより、チャレンジウイルスのそれぞれのＭＬＤ５０を決定する。感染後１４〜２０日間、マウスを体重減少及び死亡率について監視する。次に、各マウスは、リポソーム二重層に組み込まれた２．５％のデキサメタゾンパルミテート（ＤＰ）を含有する１０５０ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソームの単回ＩＶ注射、２分後に、７５ｕｇの、抗インフルエンザＡ幹抗原モノクローナル抗体をコードする３つの異なるプラスミドＤＮＡのうちの１つまたは対照グループとしての抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体をコードするプラスミドＤＮＡの単回ＩＶ注射を投与される。全てのグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンのＩＰ注射で処置した。
プラスミドＤＮＡＲｘ−Ｄ８−２Ａ（配列番号３１；図５２）、ＤＮＡＲｘ−Ｆ１０−２Ａ（配列番号３２；図５３）、及びＤＮＡＲｘ−Ａ６６−２Ａ（Ｐ２Ａ）（配列番号３３；図５４）は、２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗インフルエンザＡ幹抗原ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードする。プラスミドＤＮＡＲｘ−Ｄ８（配列番号３４；図５５）、ＤＮＡＲｘ−Ｆ１０（配列番号３５；図５６）、及びＤＮＡＲｘ−Ａ６６（配列番号３６；図５７）は、それぞれ異なるバージョンの抗インフルエンザＡステム抗原重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターである。プラスミドＤＮＡＲｘ−ＨＡ−ＭＩＴＤ（配列番号３７；図５８）は、ＭＨＣクラスＩ膜貫通型及びサイトゾルドメイン（ＭＩＴＤ）を含むＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）由来のそのＨＡをコードし、プラスミドＤＮＡＲｘ−ＳＥＣ部分ＨＡ−ＭＩＴＤ（配列番号３８；図５９）は、ＭＨＣクラスＩシグナルペプチドフラグメント（ＳＥＣ）ならびに膜貫通型及びサイトゾルドメイン（ＭＩＴＤ）を含むＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）由来の部分ＨＡをコードする。プラスミドＤＮＡＲｘ−Ｄ８−２Ａ−ＨＡ−ＭＩＴＤ（配列番号３９；図６０）、ＤＮＡＲｘ−Ｆ１０−２Ａ−ＨＡ−ＭＩＴＤ（配列番号４０；図６１）、ＤＮＡＲｘ−Ａ６６−２Ａ−ＨＡ−ＭＩＴＤ（配列番号４１；図６２）、ＤＮＡＲｘ−Ｄ８−２Ａ−ＳＥＣ部分ＨＡ−ＭＩＴＤ（配列番号４２；図６３）、ＤＮＡＲｘ−Ｆ１０−２Ａ−ＳＥＣ部分ＨＡ−ＭＩＴＤ（配列番号４３；図６４）、及びＤＮＡＲｘ−Ａ６６−２Ａ ＳＥＣ部分ＭＩＴＤ（配列番号４４；図６５）は、第１の発現カセットが、２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗インフルエンザＡ幹抗原ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードし且つ第２の発現カセットが、ＭＨＣクラスＩ膜貫通型及びサイトゾルドメイン（ＭＩＴＤ）を含むＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＨＡ、またはＭＨＣクラスＩシグナルペプチドフラグメント（ＳＥＣ）ならびに膜貫通型及びサイトゾルドメイン（ＭＩＴＤ）を含む部分ＨＡをコードするデュアル発現カセットプラスミドである。インフルエンザＡまたはＢ特異的抗核タンパク質抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用したＥＬＩＳＡで、マウス血清中のインフルエンザ核タンパク質の存在を検出する。処置マウスは、インフルエンザが予防または処置されるが、対照は、インフルエンザが予防または処置されないことが予想される。
［実施例１６］
［抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体、オボアルブミン、及びｇｐ−７０の発現］
この実施例は、担腫瘍マウスのＢ１６メラノーマまたはＣＴ２６結腸腫瘍の進行を抑制するための、カチオン性リポソーム、次に、抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体、オボアルブミン、ｇｐ−７０、抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体＋オボアルブミン、または抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体＋ｇｐ−７０をコードするＤＮＡ発現ベクターの逐次ＩＶ注射について説明する。５匹のＣ５７Ｂｌ６マウスの脇腹に、動物当たり２×１０５のＢ１６細胞を皮下注射するか、または５匹のＢＡＬＢＣマウスの脇腹に、動物当たり２×１０５のＣＴ２６細胞を皮下注射する。接種後４日目に、各マウスは、リポソーム二重層に組み込まれた２．５％のデキサメタゾンパルミテート（ＤＰ）を含有する１０５０ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソームの単回ＩＶ注射、２分後に、７５ｕｇの、抗マウスＰＬ−１モノクローナル抗体、オボアルブミン、ｇｐ−７０をコードするＤＮＡ発現プラスミド、または対照グループとしての抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体をコードするプラスミドＤＮＡの単回ＩＶ注射を投与される。全てのグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンのＩＰ注射で処置した。プラスミドＤＮＡＲｘ−ＰＤ１−２Ａ（Ｐ２Ａ）（配列番号４８；図６９）は、２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＰＤ−１ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードし、プラスミドＤＮＡＲｘ−ＳＥＣ−ＯＶＡ−ＭＩＴＤ（配列番号４９；図７０）は、オボアルブミン拘束性エピトープＨ２Ｋｂ及びＭＨＣクラスＩシグナルペプチドフラグメント（ＳＥＣ）ならびに膜貫通型及びサイトゾルドメイン（ＭＩＴＤ）をコードし、プラスミドＤＮＡＲｘ−ＳＥＣ−ｇｐ７０−ＭＩＴＤ（配列番号５０；図７１）は、Ｈ−２Ｌｄ拘束性ペプチド抗原ＡＨ１及びＭＨＣクラスＩペプチドフラグメント（ＳＥＣ）ならびに膜貫通型及びサイトゾルドメイン（ＭＩＴＤ）をコードする。プラスミドＤＮＡＲｘ−ＰＤ１−２Ａ ＯＶＡ（配列番号５１；図７２）またはＤＮＡＲｘ−ＰＤ１−２Ａ ｇｐ７０（配列番号５２；図７３）は、第１の発現カセットにおいて２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＰＤ−１ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードし、且つ、第２の発現カセットにおいてオボアルブミン拘束性エピトープＨ２ＫｂまたはＨ−２Ｌｄ拘束性ペプチド抗原ＡＨ１及びＭＨＣクラスＩシグナルペプチドフラグメント（ＳＥＣ）ならびに膜貫通型及びサイトゾルドメイン（ＭＩＴＤ）のいずれかをコードするデュアル発現カセットプラスミドベクターである。腫瘍体積を、３〜４日毎にノギスで測定し、体積直径が１５ｍｍを超える腫瘍を有し、及び／または悪化した健康状態の徴候を示す動物を安楽死させる。処置マウスでは、腫瘍体積が減少するが、対照マウスでは、減少しないことが予想される。
［実施例１７］
［抗ヒト抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、ヒトＧ−ＣＳＦ、及び連鎖球菌Ｃａｓ９の発現］
この実施例は、カチオン性リポソーム、続いて、マウス抗のヒト抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、ヒトＧ−ＣＳＦ、連鎖球菌Ｃａｓ９、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体＋ＨＧ−ＣＳＦ、または抗ＣＤ２０モノクローナル抗体＋Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ発現ベクターの逐次ＩＶ注射について説明する。１グループ当たり５匹のＣＤ−１マウスに注射する。各マウスは、リポソーム二重層に組み込まれた２．５％のデキサメタゾンパルミテート（ＤＰ）を含有する１０５０ナノモルのＤＯＴＡＰカチオン性リポソームの単回ＩＶ注射、２分後に、７５ｕｇの、抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＨＧ−ＣＳＦ、Ｃａｓ９、抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体＋ＨＧ−ＣＳＦ、抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体＋ＨＧ−ＣＳＦをコードするプラスミドＤＮＡ、または対照グループとしての抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体＋ルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡの単回ＩＶ注射を投与される。全てのグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンのＩＰ注射で処置した。プラスミドＤＮＡＲｘ ＣＤ２０−２Ａ Ｃａｓ９（配列番号５３；図７４）またはＤＮＡＲｘ ＣＤ２０−２Ａ ＨＧ−ＣＳＦ（配列番号５４；図７５）は、第１の発現カセットが、２Ａ自己切断ペプチドにより隔てられている抗ＣＤ２０ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードし、且つｍＣＭＶ−ＥＦ１により駆動されるが、第２の発現カセットが、Ｃａｓ９またはＨＧ−ＣＳＦをコードし且つｈＣＭＶ−フェリチン重鎖プロモーターにより駆動されるデュアル発現カセットプラスミドベクターである。抗ＣＤ２０及びＨＧ−ＣＳＦの血清レベルは、方法で上述したように、注射後７日毎に特定のＥＬＩＳＡで測定され、Ｃａｓ９タンパク質レベルは、以前に注射されたマウスのマウス肺溶解物のＣａｓ９ ＥＬＩＳＡ及び／またはウェスタンブロットで注射後７日毎に測定されるであろう。両方のアッセイは、以下の検証済みの捕捉抗体：ＭＡＣ１３３ 抗Ｃａｓ９抗体、クローン７Ａ９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が使用されるであろう。
［実施例１８］
［抗ヒト抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ発現を、中性リポソームを用いて増加させる。］
この実施例は、中性リポソームのカチオン性リポソームとの同時注射が、中性リポソームなしで同じカチオン性リポソームを注射することに対して、経時的にマウス血清抗ＣＤ２０モノクローナル抗体レベルをいかに増加させるかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ＳＮ−グリセロ−３−ホスホコリン）中性脂質を用いるか、または用いない１０００ｎｍｏｌまたは１２５０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶを、次に、リツキシマブ（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）を含有する７５ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。リツキシマブタンパク質の血清レベルを、２４時間後及びその後２〜３週間毎にＥＬＩＳＡで測定した。結果を図８２に示し、これは、カチオン性リポソームと共に中性脂質が含まれることが、血清抗ＣＤ２０モノクローナル抗体レベルを増加させることを示す。
［実施例１９］
［抗ヒト抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ発現を、中性リポソーム及びデキサメタゾンパルミテートを用いて増加させる。］
この実施例は、デキサメタゾンパルミテートを中性リポソームに組み込むことが、いかに遺伝子発現をさらに増加させるかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、１、２．５、５、または１０％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ中性脂質、次に、リツキシマブｃＤＮＡを含有する７５ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。リツキシマブタンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後に測定した。結果を図８３に示し、これは、デキサメタゾンパルミテートを中性リポソームと共に使用すると、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子発現がさらに増加することを示す。
［実施例２０］
［Ｓｙｎ ２１及び／またはデルタ−ｐ１０がベクターに含まれると、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現が増加する。］
この実施例は、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの５’または３’に、Ｓｙｎ２１及び／またはデルタｐ１０配列が含まれることが、マウスにおける血清抗ＣＤ２０ ｍＡｂレベルをいかに増加させるかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、１０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ及び１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ中性脂質（両方が２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する）、次に、リツキシマブｃＤＮＡを含有する７５ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。Ｓｙｎ２１及びデルタｐ１０配列の両方を含有する代表的なベクター構築物を、配列番号８２に示す（図８５）。リツキシマブタンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後に測定した。結果を図８４に示し、これは、ベクターに、Ｓｙｎ２１及び／またはデルタｐ１０配列が含まれると、遺伝子発現が増加することを示す。
［実施例２１］
［ベクターにｈｒ３スーパーエンハンサーが含まれることは、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現を増加させる。］
この実施例は、５つのプライムｈｒ３スーパーエンハンサー配列の付加が、マウスにおけるヒトＧ ＣＳＦ及び抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の発現をいかに増加させるかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、１０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ及び１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ中性脂質（両方がデキサメタゾンパルミテートを含有する）、次に、ヒトＧ−ＣＳＦまたはリツキシマブｃＤＮＡを含有する７５ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。ｈＧ−ＣＳＦまたはリツキシマブタンパク質の血清レベルを、２４時間後にＥＬＩＳＡで測定した。結果を図８６に示し、これは、ｈｒ３スーパーエンハンサーがプラスミドに含まれている時、Ｇ ＣＳＦ発現の増加（図８６Ａ）及びリツキシマブ抗ＣＤ２０発現の増加（図８６ｂ）を示す。
［実施例２２］
［３’または５’ＵＴＲ領域にＲ６Ｋが含まれると、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現が増加する。］
この実施例は、ヒト第９因子ｃＤＮＡの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲのいずれかへの、Ｒ６Ｋ複製起点配列の挿入が、マウスで産生されるヒト第９因子血清レベルをいかに増加させるかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、１０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ及び１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ中性脂質（両方が２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する）、次に、７５ｕｇ（図８７Ａ）または６０ｕｇ（図８７Ｂ）の第ＩＸ因子ｃＤＮＡを含有するプラスミドベクターを逐次注射した。第ＩＸ因子タンパク質の血漿レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後に測定した。結果を図８７に示し、これは、第ＩＸ因子遺伝子の３’または５’ＵＴＲに、Ｒ６Ｋ複製起点を配置すると、７５ｕｇレベル（図８７Ａ）及び６０ｕｇレベル（図８７Ｂ）の両方で発現レベルが増加したことを示す。
［実施例２３］
［単回ベクター注射後の長期抗ＣＤ２０抗体発現］
この実施例は、組み換えリツキシマブタンパク質に匹敵するＣＤ２０＋ヒト腫瘍細胞溶解のレベルを誘導する単回リツキシマブＤＮＡ注射の１４８、２３２、及び２８４日後に生じたマウス血清リツキシマブのレベルが、依然として、いかに治療上有効である（図８８Ａ）かについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０５０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、リツキシマブｃＤＮＡを含有する７５ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。リツキシマブタンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで、２４時間後及びその後１〜２週間毎に測定した。結果を図８８に示す。図８８Ａは、長期発現を示す、２８４日間にわたる異なる時点での長期リツキシマブレベルを示す。図８８Ｂは、抗ＣＤ２０マウス血清が、リツキシマブタンパク質に匹敵するレベルでヒト腫瘍細胞溶解を誘導することができたことを示す。
［実施例２４］
［単回ベクター注射後の長期抗ＩＬ５抗体発現］
この実施例は、抗ヒトインターロイキン−５ ｍＡｂ（メポルジマブ；２Ｂ６）重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアルカセット単一プラスミドＤＮＡベクター（配列番号８３；図９０）の単回逐次ＩＶ注射が、ＥＬＩＳＡでアッセイされた、マウスにおいて治療的抗ＩＬ−５ ｍＡｂ血清レベルを、９２日を超えて生じる。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それに、最初に、５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＢと共に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１１２０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、抗ＩＬ−５ ｃＤＮＡを含有する８５ｕｇのプラスミドベクター（２Ｂ６）を逐次注射した。抗ＩＬ−５ ｍＡｂの血清レベルを、ＥＬＩＳＡで、２４時間後及びその後１〜２週間毎に測定した。結果を図８９に示し、これは、少なくとも９２日間発現した治療的抗ＩＬ−５ ｍＡｂ（２Ｂ６）血清レベルを示す。
［実施例２５］
［単回ベクター注射後の長期抗インフルエンザ抗体発現］
この実施例では、抗インフルエンザ５Ｊ８ ｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするデュアルカセット単一プラスミドＤＮＡベクター（配列番号８４、図９２）の単回逐次ＩＶ注射が、ＥＬＩＳＡによる治療的抗インフルエンザＡ ｍＡｂ血清レベルをいかに生じるか（図９１Ａ）、Ｃａｌ０９流行株を８５日間を超えて、いかに効果的に中和する（図９１Ｂ）かについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶと共に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１１２０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、抗インフルエンザ抗体に対するｃＤＮＡを含有する８５ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。抗インフルエンザタンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで、２４時間後及びその後１〜２週間毎に測定した。中和方法は、次の通りであった。種々の時点で抗インフルエンザｃＤＮＡが注射されたマウスの血清を熱で死滅させ、ＤＭＥＭ／ＢＳＡで１：４０に希釈し、１００×ＴＣＩＤ５０のＸ−１７９ Ｃａｌ０９ Ｈ１Ｎ１ウイルスと混合した。１時間後、３０，０００のＭＤＣＫ２細胞を、ＴＰＣＫ処置トリプシンと共に、血清／ウイルス混合物に添加した。１６〜１８時間のインキュベーション後、ウイルス核タンパク質に対するインフルエンザＡ特異的イムノアッセイを使用して、ＭＤＣＫ２細胞の感染を記録した。
［実施例２６］
［長期発現］
この実施例は、抗ヒトインターロイキン５ ｍＡｂ（メポルジマブ；２Ｂ６）重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡならびにヒトＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡをコードする単一プラスミドＤＮＡベクター（配列番号８５、図９４）の逐次ＩＶ注射が、６６日間を超えてＥＬＩＳＡで治療的抗ＩＬ−５ｍＡｂ及びｈＧ−ＣＳＦ血清レベルをいかに生じるかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶと共に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１１２０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、抗ＩＬ−５ ｍＡｂ及びｈＧ−ＣＳＦに対するｃＤＮＡを含有するプラスミドベクター８８ｕｇを逐次注射した。各タンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後及びその後１〜３週間毎に測定した。結果を図９３に示し、これは、マウスにおいて抗ＩＬ−５ｍＡｂ及びｈＧ−ＣＳＦの発現レベルが、少なくとも６６日間、治療レベルにあったことを示す。
［実施例２７］
［デュアルカセットは、発現の増加を提供する。］
この実施例は、２つのｈＧ−ＣＳＦカセットを含有するデュアル発現カセット単一プラスミドベクターが、単一カセットｈＧ−ＣＳＦベクターよりも高い絶対好中球数を長期にわたって、いかに生じるかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、１０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ及び１０００ｎｍｏｌのＭＬＶ ＤＭＰＣ（両方が２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する）、次に、ｈＧ−ＣＳＦに対するデュアルカセットｃＤＮＡを含有する７５ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。ｈＧ−ＣＳＦタンパク質の血漿レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後及びその後１〜２週間毎に測定した。全血の絶対好中球数（ＡＮＣ）を評価した。図９５は、この実施例の結果を示し、これは、同じコードされたタンパク質のデュアルカセット発現は、マウスにおいて、コードされたタンパク質の単一カセット発現よりも高い血清レベルを提供することを示す。
［実施例２８］
［デュアルカセットは、発現の増加を提供する。］
この実施例は、デュアル発現カセット単一プラスミドベクター（各カセットがブタテスコウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）自己切断ペプチド配列により隔てられている同一の抗ヒトＩＬ−５重鎖及び軽鎖ｍＡｂ ｃＤＮＡを含有する）が、マウスにおける、単一カセット抗ヒトＩＬ−５ ｍＡｂをコードするＤＮＡベクターよりも高い抗ヒトＩＬ−５血清ｍＡｂレベルをいかに生じるかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶと共に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１１２０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、ＩＬ−５に対するｃＤＮＡを含有する８８ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。ＩＬ−５タンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後に測定した。結果を図９６に示し、これは、抗ヒトＩＬ−５重鎖及び軽鎖を発現するデュアルカセットベクターが、単一カセット抗ヒトＩＬ−５をコードするＤＮＡベクターよりも高い抗ヒトＩＬ−５血清ｍＡｂレベルを生成することを示す。
［実施例２９］
［デュアルカセットは、発現の増加を提供する。］
この実施例は、デュアル発現カセット単一プラスミドベクター（各カセットが、ブタテスコウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）自己切断ペプチド配列により隔てられている同一の抗インフルエンザＡ重鎖及び軽鎖モノクローナル抗体５Ｊ８ ｃＤＮＡを含有する）が、マウスにおいて、単一カセット抗ヒトＩＬ−５ ｍＡｂをコードするＤＮＡベクターよりも高い抗５Ｊ８ ｍＡｂ血清レベルをいかに生じさせるかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶと共に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１１２０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、ＩＬ−５に対するｃＤＮＡを含有する８８ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。ＩＬ−５タンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後に測定した。結果を図９７に示し、これは、抗５Ｊ８を発現するデュアルカセットベクターが、単一カセット抗５Ｊ８をコードするＤＮＡベクターよりも高い抗５Ｊ８血清ｍＡｂレベルを生じたことを示した。
［実施例３０］
［異なるｍＡｂのデュアルカセット単一プラスミド発現、及び異なるｍＡｂを発現する２つの単一カセットプラスミドの同時注射］
この実施例は、デュアル発現カセット単一プラスミドベクター（１つのカセットが、ブタテスコウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）自己切断ペプチド配列により隔てられている抗インフルエンザＡ重鎖及び軽鎖モノクローナル抗体５Ｊ８ ｃＤＮＡを含有し、第２のカセットが、ブタテスコウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）自己切断ペプチドにより隔てられている抗ヒトＩＬ−５重鎖及び軽鎖モノクローナル抗体ｃＤＮＡ（２Ｂ６）を含有する）の単回ＩＶ注射が、マウスにおいて両方のモノクローナル抗体の有意な血清レベルをいかに生じさせるかについて説明する。さらに、インタクト重鎖及び軽鎖モノクローナル抗体抗インフルエンザ５Ｊ８及び抗ヒトＩＬ−５（２Ｂ６）をそれぞれコードする２つの異なる単一発現カセットＤＮＡベクターの単回ＩＶ同時注射は、マウスにおいて、両方のモノクローナル抗体の有意な血清レベルも生成する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶと共に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１１２０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、８８ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。タンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後に測定した。結果を図９８に示し、これは、デュアルカセット単一プラスミドが、異なるｍＡｂをｉｎ ｖｉｖｏでいかに発現するか、及び同時注射される２つの単一カセットプラスミドが異なるｍＡｂをｉｎ ｖｉｖｏでいかに発現するかを示す。
［実施例３１］
［異なるｍＡｂのデュアルカセット単一プラスミド発現］
この実施例は、デュアル発現カセット単一プラスミドベクター（１つのカセットが、ブタテスコウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）自己切断ペプチド配列により隔てられている抗インフルエンザＡ重鎖及び軽鎖モノクローナル抗体５Ｊ８ ｃＤＮＡを含有し、第２のカセットが、ブタテスコウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）自己切断ペプチドにより隔てられている抗ヒトＩＬ−５重鎖（２Ｂ６）及び軽鎖モノクローナル抗体ｃＤＮＡを含有する）が、マウスにおいて、両方のモノクローナル抗体の有意な血清レベルをいかに生じさせるかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶと共に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１１２０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、８８ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。タンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後に測定した。結果を図９９に示す。図９９Ａは、４３日間にわたる抗ヒトＩＬ−５ ｍＡｂの血清発現レベルを示し、図９９Ｂは、４３日間にわたる抗インフルエンザＡ ｍＡｂの血清発現レベルを示す。
［実施例３２］
［異なるｍＡｂのトリプルカセット単一プラスミド発現］
この実施例は、トリプル発現カセット単一プラスミドベクター（１つのカセットが、ブタテスコウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）自己切断ペプチド配列により隔てられている抗インフルエンザＡ重鎖及び軽鎖モノクローナル抗体５Ｊ８ ｃＤＮＡを含有し、第２のカセットが、ブタテスコウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）自己切断ペプチドにより隔てられている抗ヒトＩＬ−５重鎖及び軽鎖モノクローナル抗体ｃＤＮＡを含有し、且つ第３のカセットが、ブタテスコウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）自己切断ペプチドにより隔てられている抗ヒトＣＤ２０重鎖及び軽鎖モノクローナル抗体ｃＤＮＡを含有する）が、マウスにおける３つの異なるモノクローナル抗体全ての有意な血清レベルをいかに生じるかについて説明する。さらに、インタクト重鎖及び軽鎖モノクローナル抗体をコードする３つの異なる単一発現カセットＤＮＡベクター：抗インフルエンザ５Ｊ８、抗ヒトＩＬ−５、及び抗ヒトＣＤ２０ ｍＡｂの単回ＩＶ同時注射はそれぞれ、マウスにおける３つの異なるモノクローナル抗体全ての有意な血清レベルも生じる。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶと共に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１１２０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、８８ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。タンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後に測定した。結果を図１００に示し、これは、単一ベクター（左側）及び３つの別々のベクター（右側）の同時注射の両方で、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、抗ＩＬ５ ｍＡｂ、及び抗インフルエンザｍＡｂの同時発現を示す。
［実施例３３］
［ＬＤＬレベルを減少させる抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂの発現］
この実施例は、抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂを発現する単一プラスミドベクターの単回ＩＶ注射が、マウスにおけるＬＤＬレベルをいかに減少させるかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、１０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ及び１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶ（両方が２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する）、次に、７５ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。注射の１５日後に、ＬＤＬコレステロールの血漿レベルを測定し、注射前の同じマウスにおけるＬＤＬコレステロール測定値に対する割合に応じてプロットした。図１０１は、結果を示し、これは、抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂを発現する単一のプラスミドベクターが、マウスのＬＤＬレベルを減少させることを示す。
［実施例３４］
［抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂの発現は、ＬＤＬレベルの長期の減少を提供する。］
この実施例は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂの発現が、ＬＤＬレベルの長期の減少をいかに提供するかについて説明する。注射前に、マウスを血清ＬＤＬレベルについて評価した。注射の日に、１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンのＩＰ注射を投与した。２時間後、それらに、最初に、１０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ及び１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶ（両方が２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する）、次に、抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂの軽鎖及び重鎖をコードする７５ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。その後７〜２１日毎に、ＬＤＬコレステロールの血清レベルを測定した。結果を図１０２に示し、これは、抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂを発現するマウスにおけるＬＤＬレベルの長期的な減少を示す。
［実施例３５］
［抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂの発現は、脂肪食餌のマウスのＬＤＬレベルを減少させる。］
この実施例は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂの発現が、対照と比較して脂肪食餌のマウスにおけるＬＤＬレベルの減少をいかに提供するかについて説明する（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ発現）。注射前に、マウスを血清ＬＤＬレベルについて評価した。注射の日に、１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンのＩＰ注射を投与した。２時間後、それらに、１０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ及び１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶ（両方が２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する）、次に、７５ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。注射の翌日、マウスを、脂肪の多いコレステロール上昇食餌に切り替えた。ＬＤＬコレステロールの血清レベルを、その後７〜１４日毎に測定した。図１０３は、結果を示し、抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂを発現するマウスは、対照抗ＣＤ２０抗体を発現する対照マウスと比較して、経時的に低いＬＤＬレベルを有することを示す。
［実施例３６］
［ｍＡｂ発現の持続性］
この実施例は、リツキシマブ（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）、抗インフルエンザｍＡｂ（ＦＩ６）、抗インフルエンザｍＡｂ（５Ｊ８）、及び抗ＩＬ５ ｍＡｂを含むｍＡｂの発現がいかに長いかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらを逐次注射した。リツキシマブの逐次注射は、４０ｍｇ／ｋｇのレベルのデキサメタゾンの注射を含んでいた。２時間後、それらに、最初に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０５０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、リツキシマブｃＤＮＡを含有する７５ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。抗インフルエンザ及び抗ＩＬ−５抗体の逐次注射は、５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶと共に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１１２０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、８８ｕｇのプラスミドベクターを含んでいた。タンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後に、次に、その後７〜２１日毎に測定した。結果を図１０４に示し、これは、約２５日間の抗インフルエンザＦＩ６ ｍＡｂの発現、１００日間以上の抗インフルエンザ５Ｊ８ ｍＡｂ及び抗ＩＬ４ ｍＡＢの発現、ならびに２７５日間以上のリツキシマブの発現を示す。
［実施例３７］
［種々のプラスミドベクター用量］
この実施例は、リツキシマブを発現するプラスミドベクターの４つの異なる用量からの発現レベルの比較について説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、次のように、それらを逐次注射した。リポソームを最初に注射し、５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶ、及び２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００、１０８０、１１７０、または１２５０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶから構成され、プラスドベクターを、７５、８１、８８、または９５ｕｇの用量で２回目に注射した。タンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後に測定した。結果を図１０５に示し、これは、４つのプラスミド用量全てからの良好な発現レベルを示す。
［実施例３８］
［ｍＡｂ発現の増強］
この実施例は、ＡＬＢ及びＡＺＵシグナル配列が、５Ｊ８ ｍＡｂの発現をいかに増強するかについて説明する。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１０００ｎｍｏｌのＤＭＰＣ ＭＬＶと共に、２．５％のデキサメタゾンパルミテートを含有する１１２０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、次に、８８ｕｇのプラスミドベクターを逐次注射した。タンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡで２４時間後に測定した。結果を図１０６に示し、これは、ＡＬＢ及びＡＺＵシグナル配列を使用することによる、５Ｊ８ ｍＡｂの発現の増強を示す。
［実施例３９］
［Ｐ５３のｉｎ ｖｉｖｏ発現］
この実施例は、ヒトｐ５３遺伝子は、ＩＶ注射の２４時間後のマウス肺において、広範囲にわたって、いかに発現するか、さらに、ヒトｐ５３遺伝子が、主に血管内皮細胞において、いかに発現するかについて説明している。１グループ当たり３匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのレベルでデキサメタゾンをＩＰ注射した。２時間後、それらに、最初に、ＤＯＴＡＰ ＳＵＶリポソーム及びＤＭＰＣ中性脂質（共に１０００ｎｍｏｌ、２．５重量％のデックスパルミテートを含む）、次に、２分後、マウス１匹当たり７５ｕｇの、ヒトｐ５３をコードするプラスミドベクターを逐次注射した（図１０８、配列番号８６）。肺を採取し、注射の２４時間後に免疫組織化学のために処理した。肺切片をヒトｐ５３（茶色）で染色した。図１０７Ａは、対照マウス肺組織を示し、図１０７Ｂは、ｐ５３について染色されたヒトｐ５３が注射されたマウス肺組織を示し、ｐ５３遺伝子がマウス肺で広く発現していることを示す。処置マウス肺組織は、血管内皮細胞特異的マーカーであるヒトｐ５３及びマウスＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）について二重染色した。図１０７Ｃ及び１０７Ｄのｐ５３及びＣＤ３１の共局在化は、ｐ５３が注射されたマウスの主な血管内皮細胞ヒトｐ５３発現を示す。図１０７Ｃ及び１０７Ｄは、異なる染色の同じ組織切片を示す。肺胞壁は連続的な内皮で内側を覆われているので、両方の図のＣＤ３１染色は、広範囲である。
本出願において言及された全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれている。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本発明の記載された方法及び組成物の様々な改変及び変形が当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、請求される本発明はこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されるべきである。実に、当該関連分野の当業者には自明である、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内にあると意図されている。

Claims (47)

  1. システムであって、
    ａ）第１の量のポリカチオン性構造体を含み、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない第１の組成物、及び
    ｂ）治療有効量の発現ベクターを含む第２の組成物を含み、
    前記発現ベクターが、１つ以上の治療用生体分子をコードする核酸配列を含み、
    以下：
    ｉ）前記ポリカチオン性構造体の前記第１の量と発現ベクターの前記治療有効量の比が、５：１〜２５：１であり、
    ｉｉ）前記第１の組成物の２．０％〜１５．０％が、デキサメタゾンパルミテート及び／またはデキサメタゾンを含み、
    ｉｉｉ）前記第１の組成物が、中性脂質をさらに含み、
    ｉｖ）前記ポリカチオン性構造体が空のリポソームを含み、前記第１の組成物中に存在する前記空のリポソームが約２０〜８５ｎｍのｚ−平均直径を有する、のうちの少なくとも１つを含む、前記システム。
  2. 前記発現ベクターが、環状合成増幅核酸、プラスミドベースのベクター、またはミニサークルＤＮＡを含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記１つ以上の治療用生体分子が、１つ以上のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、またはその抗原結合部分を含む、請求項１に記載のシステム。
  4. 前記ｍＡｂの前記抗原結合部分が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、及び／またはｓｃＦｖから選択される、請求項３に記載のシステム。
  5. 前記ｍＡｂまたはその抗原結合部分が、病原体または病原体構成要素に特異的に結合する、請求項３に記載のシステム。
  6. 前記ｍＡｂまたはその抗原結合部分が、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項３に記載のシステム。
  7. 前記ｍＡｂまたはその抗原結合部分が、サイトカインに特異的に結合する、請求項３に記載のシステム。
  8. 前記１つ以上のｍＡｂまたはその抗原結合部分が、第１の標的分子に特異的に結合する第１のｍＡｂまたはその抗原結合部分、及び第２の異なる標的分子に特異的に結合する第２のｍＡｂまたはその抗原結合部分を含む、請求項３に記載のシステム。
  9. 前記１つ以上のｍＡｂまたはその抗原結合部分が、第１の標的分子に特異的に結合する第１のｍＡｂまたはその抗原結合部分、第２の標的分子に特異的に結合する第２のｍＡｂまたはその抗原結合部分、及び第３の標的分子に特異的に結合する第３のｍＡｂまたはその抗原結合部分を含み、前記第１、第２、及び第３の標的分子が異なる分子である、請求項８に記載のシステム。
  10. 前記１つ以上の治療用生体分子が、前記発現ベクター内の１つ以上の発現カセット内に１つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を含む、請求項１に記載のシステム。
  11. 前記１つ以上の治療用生体分子が、核酸を含む、請求項１に記載のシステム。
  12. 前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｔｓＲＮＡ、またはｓｒＲＮＡである、請求項１１に記載のシステム。
  13. 前記発現ベクターが、第１の治療用生体分子及び第２の治療用生体分子をコードし、前記第１及び第２の治療用生体分子が、ｉ）互いに異なる時間で発現し、及び／または、ｉｉ）同じである、請求項１に記載のシステム。
  14. 前記発現ベクターが、以下の：Ｒ６Ｋの複製起点、ｈｒ３エンハンサー、ＢＶ３シグナル配列、Ｓｙｎ２１配列、デルタｐ１０配列、またはＭＩＴＤ（ＭＨＣクラスＩ輸送シグナル）配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のシステム。
  15. 前記発現ベクターが、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧ減少である、請求項１に記載のシステム。
  16. 前記発現ベクターが、複数のＣｐＧモチーフを含有するか、及び／またはＣｐＧ非含有もしくはＣｐＧ減少である、請求項１に記載のシステム。
  17. 対象において１つ以上の治療用生体分子を発現させる方法であって、ａ）請求項１に記載のシステムの第１の組成物を対象に投与すること、及びｂ）前記システムの第２の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  18. 対象においてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、及び／またはｓｃＦｖを発現させる方法であって、
    ａ）第１の組成物を対象に投与することであって、
    前記第１の組成物が、第１の量のポリカチオン性構造体を含み、
    前記第１の組成物が、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない、前記投与すること、ならびに
    ｂ）前記第１の組成物の投与の約３００分以内に、前記対象に第２の組成物を投与することであって、
    前記第２の組成物が、前記ｍＡｂ、前記Ｆａｂ、前記Ｆ（ａｂ）２、及び／またはｓｃＦｖをコードする治療有効量の発現ベクターを含み、
    前記第１の組成物を前記投与すること及び前記第２の組成物を前記投与することの結果として、前記第１の治療用タンパク質が、前記対象において発現する、前記投与することを含む、前記方法。
  19. 前記対象が、疾患もしくは状態の少なくとも１つの症状を有するか、または変更されるべき少なくとも生理学的形質を有し、前記疾患もしくは状態に対する治療レベルで、または前記生理学的もしくは疾患形質を変更するのに十分な有効なレベルで、前記第１の治療用タンパク質を、前記対象において発現させる、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記対象が１つ以上の感染症にならないようにするのに十分な予防レベルで、前記第１の治療用タンパク質を、前記対象において発現させる、請求項１８に記載の方法。
  21. 水性組成物であって、
    ａ）５００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度で、前記組成物中に存在するポリカチオン性構造体、
    ｂ）上記組成物の１〜１０％の濃度で上記組成物中に存在するデキサメタゾン及び／またはデキサメタゾンパルミテート、及び
    ｃ）生理学的に許容される緩衝液を含むか、またはそれから本質的になり、
    前記組成物が、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない、前記水性組成物。
  22. 前記ポリカチオン性構造体が、小さな単層小胞として存在するカチオン性脂質である、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記生理学的に許容される緩衝液が、生理食塩水緩衝液、５％のデキストロース水溶液、乳酸リンガー緩衝液、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
  24. 前記ポリカチオン性構造体が、ＤＯＴＡＰを含む、請求項２１に記載の組成物。
  25. 前記ポリカチオン性構造体が、８００ｎＭ〜１５００ｎＭまたは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、前記組成物に存在する、請求項２１に記載の組成物。
  26. 水性組成物であって、
    ａ）５００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度で、前記組成物中に存在する中性脂質；
    ｂ）上記組成物の１〜１０％の濃度で上記組成物中に存在するデキサメタゾン及び／またはデキサメタゾンパルミテート、及び
    ｃ）生理学的に許容される緩衝液を含むか、またはそれから本質的になり、
    前記組成物が、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない、前記水性組成物。
  27. 前記中性脂質が、多層小胞として存在する、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記生理学的に許容される緩衝液が、生理食塩水緩衝液、５％のデキストロース水溶液、乳酸リンガー緩衝液、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２６に記載の組成物。
  29. 前記中性脂質が、ＤＭＰＣを含む、請求項２６に記載の組成物。
  30. 前記中性脂質が、８００ｎＭ〜１５００ｎＭまたは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、前記組成物中に存在する、請求項２６に記載の組成物。
  31. 水性組成物であって、
    ａ）５００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度で、前記組成物中に存在するポリカチオン性構造体、
    ｂ）５００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する中性脂質、及び
    ｃ）生理学的に許容される緩衝液を含むか、またはそれから本質的になり、
    前記組成物が、核酸分子を含まないか、または実質的に含まない、前記水性組成物。
  32. 前記中性脂質が、多層小胞として存在する、請求項３１に記載の組成物。
  33. ７５〜２５０ｎｍの平均直径に押出成形された中性リポソームを含む、請求項３１に記載の組成物。
  34. 前記ポリカチオン性構造体が、小さな単層小胞として存在するカチオン性脂質である、請求項３１に記載の組成物。
  35. 前記ポリカチオン性構造が、多層小胞として存在するカチオン性脂質である、請求項３１に記載の組成物。
  36. ｄ）デキサメタゾンをさらに含むか、またはそれから本質的になり、前記デキサメタゾンが、前記組成物の１〜１０％であるような濃度で存在する、請求項３１に記載の組成物。
  37. ｄ）デキサメタゾンパルミテートをさらに含むか、またはそれから本質的になり、前記デキサメタゾンパルミテートが、前記組成物の１〜１０％であるような濃度で存在する、請求項３１に記載の組成物。
  38. 前記中性脂質が、ＤＭＰＣを含む、請求項３１に記載の組成物。
  39. 前記中性脂質が、８００ｎＭ〜１３００ｎＭまたは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、前記組成物中に存在する、請求項３１に記載の組成物。
  40. 前記ポリカチオン性構造体が、ＤＯＴＡＰを含む、請求項３１に記載の組成物。
  41. 前記ポリカチオン性構造体が、８００ｎＭ〜１５００ｎＭまたは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、前記組成物に存在する、請求項３１に記載の組成物。
  42. システムであって、
    ａ）請求項１８に記載の組成物、及び
    ｂ）前記組成物の少なくとも一部が内部にある注射器、を含む、前記システム。
  43. 前記注射器内部にある前記組成物が、治療的及び／または予防的用量の前記ポリカチオン性構造体を含有する、請求項４２に記載のシステム。
  44. システムであって、
    ａ）請求項２６に記載の組成物、及び
    ｂ）前記組成物の少なくとも一部が内部にある注射器、を含む、前記システム。
  45. 前記注射器内部にある前記組成物が、治療的及び／または予防的用量の前記中性脂質を含有する、請求項４４に記載のシステム。
  46. システムであって、
    ａ）請求項３１に記載の組成物、及び
    ｂ）前記組成物の少なくとも一部が内部にある注射器、を含む、前記システム。
  47. 前記注射器内部にある前記組成物が、治療的及び／または予防的用量の前記ポリカチオン性構造体を含有し、及び／または治療的及び／または予防的用量の前記中性脂質を含有する、請求項４６に記載のシステム。
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