JP2002508956A - 遺伝子送達のための方法および組成物 - Google Patents

遺伝子送達のための方法および組成物

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cell
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デブス，ロバート，ジェイ．
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カリフォルニア パシフィック メディカル センター リサーチ インスティテュート
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Abstract

(57)【要約】 in vitroまたはin vivoでの動物細胞における組換えポリヌクレオチドの効率的な送達および発現のための方法および組成物を開示する。特に、送達されるベクターに関して最適化され、遺伝子発現の量および持続時間を最大化する非ウイルス型遺伝子送達の包括的な手法、ならびに患者をコンディショニングして遺伝子送達の効率を高めるための方法を提供する。ここに記載した方法は、遺伝子治療およびクローン化遺伝子産物のin vivoでの機能分析の両方において応用される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】1. 序論 本発明は、生化学、細胞生物学および分子遺伝学の分野に関する。特に、ポリ
ヌクレオチドまたはその他の生物活性物質を哺乳動物細胞にin vitroおよびin v
ivoで効率的に送達し、in vitroおよびin vivoでの発現レベルを増大させ、組織
特異的発現を増大させ、そしてin vitroおよびin vivoでの発現の持続時間を延 長する新規組成物および方法を開示する。さらに、本発明は、遺伝子送達の効率
を最適化するための方法に関する。
【０００２】2. 背景 分子生物学的手法によればポリヌクレオチドの効率的で正確な遺伝子工学的操
作が可能である。しかしながら、遺伝子またはcDNAを含む遺伝子工学的に操作さ
れたポリヌクレオチドを効率的に送達し、続いて発現させるための手法ならびに
in vivoでの遺伝子送達および発現を制御する宿主因子はまだ十分に成熟してい ない。例えば、広範な種類のウイルスベクターがポリヌクレオチドを哺乳動物細
胞に送達するために開発されている。これらのベクターはin vitroでの遺伝子送
達に関しては比較的効率的なツールであるが、特にin vivo環境においては物理 的および生物学的に考慮すべき要素に拘束される場合が多い。特に、パッケージ
ングという要素がしばしばウイルスベクターにより送達され得るポリヌクレオチ
ドの量を制限し、ウイルス生物学がしばしばウイルス媒介型遺伝子送達および染
色体修復または操作に適した細胞の多様性を制限する(一般に、Friedman, 1997 年6月, Scientific American, pp.97-101参照)。
【０００３】 さらに、ウイルス(例えば、エプスタイン・バーウイルス)は、ヒトにおける腫
瘍形成に結びついており、ラージT抗原、EBNA-1等のウイルスによりコードされ るタンパク質は培養中に細胞を形質転換し、in vivoで腫瘍を発生させることが 知られている(Wilsonら, 1996, EMBO, 15:3117−3126; Cooperら, 1997, Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 94:6450-6455)。
【０００４】 in vivoでのウイルス媒介型遺伝子送達の広範な適用を妨害し得る別の要因は 、宿主免疫系が、特にウイルスベクターの免疫コンピテント宿主への投与後にウ
イルス遺伝子送達の効率に重大な影響を及ぼし得るという事実である。
【０００５】 遺伝子工学的に操作されたポリヌクレオチドを細胞に送達する別の方法には、
リポソームの使用が関与する (一般的には、Felgner, 1997年6月, Scientific A
merican, pp. 102-106)。リポソームのリン脂質二重層は、典型的には、細胞膜 の成分と同様の物質からなる。したがって、リポソームと会合したポリヌクレオ
チド(外部、内部のいずれでもよい)は、リポソームエンベロープが細胞膜と融合
する場合に細胞に送達され得る。より典型的には、リポソーム／ポリヌクレオチ
ド複合体は細胞内にエンドサイトーシスされる。エンドサイトーシス後、送達さ
れたポリヌクレオチドなどのエンドソームの内部成分は細胞質に放出され得る。
【０００６】 古典的なリポソーム媒介型ポリヌクレオチド送達は、リポソームの比較的小さ
な内容積により制限される。したがって、リポソーム製剤内に十分な量のポリヌ
クレオチドを効率的に封入する(entrap)ことは困難である。
【０００７】 研究者は、正に荷電した両親媒性脂質成分をリポソーム製剤に加えることによ
りリポソーム封入の固有の効率の悪さを補う試みをしている。原則として、両親
媒性脂質の正に荷電した基は、負に荷電したポリヌクレオチドとイオン対を形成
しており、ポリヌクレオチドと脂質粒子との間の会合の量を増大させる。会合の
増大は、脂質二重層への核酸の結合を促進すると推測される。核酸を哺乳動物細
胞に導入するのに有用ないくつかのカチオン性脂質生成物が市販されている。特
に、LIPOFECTINTM(DOTMA、ジアシルグリセロールに結合したモノカチオン性コリ
ンヘッド基からなる。一般的にはEpsteinらの米国特許第5,208,036号参照)；TRA
NSFECTAMTM(DOGS、リポスペルミンヘッド基を有する合成カチオン性脂質。Prome
ga, Madison, Wisconsin); DMRIEおよびDMRIE・HP(Vical, La Jolla, CA)；DOTA
PTM(Boehringer Mannheim(Indianapolis, Indiana)、DOTIMおよびリポフェクタ ミン(DOSPA)(Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)が広く用いられ
ている。さらに、例えばポリエチレンイミン(22kDa PEI、ExGene500)などのカチ
オン性ポリマーも利用可能であり、核酸を哺乳動物細胞に導入するのに有用であ
ることが示されている(Goulaら, 1998, Gene Ther. 5:712-717; およびWO 95/FR
/00914参照)。
【０００８】 適切に用いた場合、上記化合物はin vitroで核酸の培養細胞への送達を媒介す
る。しかしながら、重大なレベルの細胞障害が市販のカチオン性脂質に付随して
いた。それゆえ、大部分の市販のカチオン性脂質は、本発明の遺伝子導入効率レ
ベルでのin vivoの遺伝子送達用途にはあまり適していない。
【０００９】 さらに、カチオン性脂質媒介型遺伝子送達のための従来の技術によれば、一般
に、in vivoの遺伝子発現レベルがアデノウイルスなどの一定のウイルスベクタ ーを用いて典型的に得られるレベルよりも低く、発現は一時的のみであり、存続
時間が比較的短い。
【００１０】3. 発明の概要 本発明は、in vitroおよびin vivoでの動物細胞への非ウイルス型遺伝子送達 のための方法および組成物に関する。特に、非ウイルス的に送達された遺伝子の
発現レベルを有意に増大させ、in vivoでの持続性発現を可能にする方法および 組成物を開示する。
【００１１】 したがって、本発明の１つの態様は、１対の新規発現ベクターである。第1の ベクターは、細胞保持活性をコードする遺伝子、例えばEBNA-1を、反復配列のEB
Vファミリー(FR)のDNA配列またはインタクトoriP(FR＋二回対称の領域)が欠失し
ているベクターに組み込んだものである。好ましくは、本発明のベクターには、
強力なウイルスまたは哺乳動物プロモーターエレメント、例えば目的の遺伝子の
発現を調節するヒトサイトメガロウイルス(HCMV)IE-1プロモーターエンハンサー
エレメントなどが組込まれている。この場合、EBNA-1遺伝子は、HCMV IE-1プロ モーター／エンハンサー領域によって発現される。
【００１２】 第2のベクターは、送達すべき遺伝子、すなわち目的の遺伝子を含み、さらに 、第1のベクターによりコードされる保持活性と直接的または間接的に相互作用 する調節エレメントをコードする。例えば、第1のベクターがEBNA-1遺伝子をコ ードする場合、第2のベクターは典型的にはEBV-FR DNA配列をコードし、または 任意にヒト細胞において複製を可能にするインタクトoriPをコードし得る。一方
、これらの配列を第1のベクターの後ろまたはその反対側に付加して、細胞また は核保持活性、保持活性により認識される調節エレメント、および目的の遺伝子
を含む発現カセットをコードする単一のベクターを作製することができる。
【００１３】 任意に、第2のベクターにはインタクトまたは機能的oriP配列が欠失した改変 型EBV-FR領域を組込むことができる。典型的には、かかるベクターは二回対称の
領域(DS)が欠失している。しかしながら、霊長類またはヒト細胞においてベクタ
ー複製が望まれる場合、そのようなベクターは一般的にはインタクトoriP配列、
またはその機能的等価物を含む。
【００１４】 ともに送達されると、上記のベクターは標的細胞における発現のレベルおよび
持続時間を著しく増大させる。したがって、本発明のさらなる実施形態は、上記
のベクターの標的細胞への同時送達である。ベクターは、「むき出しの」DNAと して、またはDNAを保護し、標的細胞への遺伝子送達を促進する化学物質または 共同因子とともに送達され得る。このように、本発明のさらなる態様は、目的の
組換え遺伝子、細胞保持活性をコードする組換え核酸配列、および細胞保持活性
をコードする組換え核酸配列を含む脂質複合体である。本発明の開示の目的では
、「組換え」ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、遺伝子工学的に操作されたベ
クター(すなわち、非天然構成の配列エレメントを含むベクター)に存在する天然
または遺伝子工学的に操作された配列を意味する。
【００１５】 本発明の別の実施形態は、目的の遺伝子を、真核生物、好ましくは哺乳動物の
生体または細胞にin vitroまたはin vivoで送達するための、脂質またはポリマ ー複合体中の上記配列の使用である。
【００１６】 本発明のさらなる実施形態は、標的細胞における送達された遺伝子の発現レベ
ルを、細胞保持活性をコードする遺伝子を標的細胞に実質的に同時に(すなわち 、同時にまたは約24〜48時間以内に)送達することによって、または予め送達す ることによって増大させる方法である。
【００１７】 本発明の別の実施形態は、標的細胞における送達された遺伝子の発現の持続時
間を、送達される遺伝子の導入前に、好ましくはそれと実質的に同時に、または
その数時間前に細胞保持活性および核結合配列をコードする遺伝子を標的細胞に
送達することによって増大させる方法である。
【００１８】 本発明のさらなる実施形態は、希釈剤、溶液、およびin vivoでの使用に適し た化合物を含有する遺伝子送達組成物、および該組成物の製造方法を含む。その
ような希釈剤、溶液および化合物としては、例えば、乳酸加リンガー、無菌I.V.
グレードのデキストロース溶液、カチオン性ポリマー、脂質エマルジョン、デキ
ストラン(デキストラン40など)、硫酸プロタミン、アルブミン、ヒト血清、コラ
ーゲンビーズまたは支持体のような製薬上有用な固体支持体、マイクロキャリア
ビーズ、ポリマーおよび徐放性(time release)製剤および／またはそれらの懸濁
物など、ならびに上記の任意のまたは全ての組合せまたは混合物が挙げられるが
、これらに限定されるものではない。
【００１９】 本発明のさらなる実施形態は、遺伝子送達レシピエントを、遺伝子送達前、遺
伝子送達中、および／または遺伝子送達後に1種以上の適当な化合物で処理する 方法を含む。そのような化合物の具体例としては、デキサメタゾン、コルチコス
テロイド類、塩化アンモニウム、クロロキン、キニーネ、キニジン、4-APP(4-ア
ミノピラゾロ[3,4d]ピリミジン)、レチン酸、バルプロ酸(valproiac acid)、上 記の混合物、例えばデキサメタゾンとバルプロ酸の混合物などが挙げられる。
【００２０】4. 図面の説明 (図面の簡単な説明については下記参照)5. 発明の説明 非ウイルス媒介型の方法によって送達された遺伝子のインターナリゼーション
および発現には、種々の生物学的プロセスが関与する。これらのプロセスのそれ
ぞれは外因的に導入されたポリヌクレオチドの発現レベルと該発現の持続時間の
両方を最適化する機会をもたらす。例えば、荷電分子のような生物学的に関連の
あるポリヌクレオチドは細胞膜を容易に横切らない。したがって、ポリヌクレオ
チドが標的細胞に移入する能力を高める機構はどれも典型的に遺伝子送達の効率
を高める。しかしながら、ポリヌクレオチドが細胞に入った後、コード化遺伝子
の発現は確実ではない。インターナリゼーション後、ポリヌクレオチドは典型的
にはインターナリゼーションプロセスに関与したどの細胞因子(例えばエンドソ ーム／リソソーム)からも解放されているはずであり、次いで、典型的に必須の 転写およびスプライシング機構が存在している核内への道筋を見つけるはずであ
る。核に入ると、ポリヌクレオチドは、一般に、核にとどまって所望の産物を発
現し続けるために、染色体、または核エンベロープの核マトリックスのようなそ
の他の核因子と直接的または間接的に会合するはずである。遺伝子送達のさらに
別の課題は、ポリヌクレオチドの組織特異的発現を獲得することである。
【００２１】 a. 遺伝子送達用のベクター 本発明は、上記の考慮すべき要素に取り組む技術を包括的に組み入れた非ウイ
ルス型遺伝子送達への新規アプローチを開示する。例えば、本明細書に記載した
ベクターは、一般的にエピソームベクターであり、目的の遺伝子の少なくとも1 個のコピーに加えて目的の遺伝子を発現させる少なくとも1個のプロモーター／ エンハンサー領域；任意に真核細胞において機能的な複製起点またはFR-様配列 ；機能し得るように配置されたスプライスドナーおよびスプライスアクセプター
領域；ならびに少なくとも1個以上の核保持配列および／または1個以上の細胞保
持配列をコードするのが好ましい。任意に、ベクターは細胞保持活性(CRA)およ び／または核保持活性(NRA)もコードする。しかしながら、別の好ましい実施形 態においては、CRAおよび／またはNRAは別のベクターにコードされている。
【００２２】 i. CRA/CRS系 多くのウイルスも上記で概説した障害を克服して宿主細胞に増殖的に感染する
にちがいないと仮定して、本発明の１つの態様としてウイルス生物学を利用して
適当な合成代理物(proxies)を構築した。
【００２３】 例えば、エピソーム的に複製するその他のウイルスのようなエプスタイン・バ
ーウイルス(EBV)は、感染細胞中に複製性エピソームプラスミドとしてそのゲノ ムを維持する。EBVゲノムの大部分は、約172,000bpの超コイル型DNAとして存在 する。EBVは、そのプラスミドの複製を促進するためにEBV核抗原1(EBNA-1)を生 じさせる。EBNA-1は部位特異的様式でEBV DNA配列(この配列はウイルスDNAの複 製起点(oriP)をともに構成する)に結合するウイルスDNA結合性タンパク質である
。EBV oriPは、２つの非連続の領域を含む。１つの領域は、30bp配列の約20個の
縦列不完全コピー、反復配列のファミリー(FR)、およびFRから約1000bp離れたそ
の他のものからなり、二回対照の65bpの領域(DS)を含む。EBV oriPは、cis作用 してEBVゲノムを有する細胞またはEBNA-1コード配列を発現する細胞における組 換えプラスミドの複製および維持を可能にする。DSおよびFR配列の領域は両方と
も複製のためにcis位置で存在するはずである。さらに、FRは転写エンハンサー として作用し、細胞内および核内の両方におけるプラスミド維持に関与する。
【００２４】 EBNA-1の存在下では、FRを含むがDSが欠失しているプラスミドは培養細胞中に
一時的のみ、すなわち２〜３週間保持される(D.Reismanら, 1985, Mol. Cell Bi
ol., 5:1822-1832; D. Reismanら. 1986, Mol. Cell Biol., 6:3838-3846; Krys
anら, 1989, Mol Cell Biol., 9:1026-1033)。さらに、EBNA-1の存在下では、ご
く少量のFR-含有プラスミドだけが、プラスミド送達後の数日間にわたって細胞 中に保持される(MiddletonおよびSugden, 1994, J. Virol. 68(6):4067-4071)。
さらに、インタクトoriPを含むプラスミドは霊長類およびヒト細胞で複製可能で
あるが、EBNA-1の存在下では齧歯動物細胞では複製できない(Yatesら, 1985, Na
ture, 313:812-814; KrysanおよびCalos, 1993, Gene, 1993, 136:137-143)。し
かしながら、EBV DSをヒトゲノムDNAの大きい(21kb)断片で置換すると、in vitr
oで培養した場合、齧歯動物細胞におけるFRを含み且つEBNA-1をコードするプラ スミドの安定的な維持がもたらされ得る(KrysanおよびCalos, 1993, 前掲)。
【００２５】 本明細書に記載したベクターは、核保持配列および／または細胞保持配列（同
一のものであってもよい）を含む。核保持配列は、細胞保持配列のサブセットで
ある。本明細書で用いられる場合、細胞保持配列という用語は、標的細胞にベク
ターがとどまるのを助ける細胞保持活性または核保持活性により直接的または間
接的に認識され、結合される領域を意味する。さらに、ベクターは、適当な細胞
特性、細胞でコードされる因子、または外因的に付加またはコードされる因子と
相互作用して核内におけるベクターの保持をさらに増大させ得る1個以上の核保 持配列(例えば、核マトリックス、エンベロープ、または細胞染色体に特異的に 結合するDNA配列など)を含み得る。本発明の目的では、細胞保持活性(CRA)およ び核保持活性(NRA)という用語は、タンパク質、ペプチド、またはDNA配列を意味
するものであり、これらは、核保持配列または細胞保持配列を含むまたはコード
するポリヌクレオチドが、核および細胞保持配列をコードしない対照ポリヌクレ
オチドよりも高い発現レベルを示し、または発現の持続時間の増加を示すように
、直接的または間接的に核保持配列または細胞保持配列と相互作用する。
【００２６】 適当な細胞および核保持活性とともに用いられ場合、核および／または細胞保
持配列を有するベクターは、目的の遺伝子の発現の持続時間の増加を示す。典型
的には、発現の持続時間の増加は、記載したベクターが標的細胞中で長期間（例
えば、核保持配列が欠失しているベクターよりも少なくとも約20％長く、より典
型的には核保持配列が欠失しているエピソームベクターよりも少なくとも約50％
長く、好ましくは少なくとも約100％長い）検出可能なレベルの目的遺伝子をエ ピソーム的に発現するという事実を特徴とする。本発明に使用するのに適した代
表的な核保持配列としては、例えば、HCMV IE-1のカルボキシ末端の酸性ドメイ ン、またはマトリックス結合領域(MAR)に結合するEBV配列(Hillら, 1988, Cell,
55(3):459-466)が挙げられるが、これらに限定するものではない。代表的な細 胞保持配列としては、例えば、EBV-FR配列(MiddletonおよびSugden, J. Virol., 1994, 68(6):4067-4071(特にp.4068, 5))および同様の配列が挙げられるが、こ
れらに限定するものではない。FR配列を記載したベクターに組み込んだことによ
るin vivoで観察された利点は、特に、in vitro研究ではFRが転写エンハンサー であることが示されたが、同様のエンハンサー活性はin vivoでは検出できなか ったという驚くべき事実であった。
【００２７】 同様に、細胞または核保持配列のいずれかを有するベクターは、典型的には、
適当なCRAおよび／またはNRAとともに用いられた場合、目的の遺伝子を、細胞保
持配列も核保持配列も欠失している以外は同一のベクターよりも、少なくとも約
20％高く(および／または長く)、より典型的には少なくとも約50％高く(および ／または長く)、好ましくは少なくとも約100％高く(および／または長く)、そし
て特に少なくとも3〜5倍高く(および／または長く)発現する。
【００２８】 好ましくは、細胞および核保持配列(それぞれCRSまたはNRS)は、ベクター内の
遺伝子発現を妨害しない領域に位置する。例えば、これらの配列は、目的の遺伝
子のためのエンハンサー／プロモーター領域と目的遺伝子の5'末端との間(すな わち、エンハンサー／プロモーター領域と目的の遺伝子のAUG開始コドンのすぐ 上流の領域との間)に位置していないのが好ましい。タンパク質EBNA-1を好まし い細胞保持活性(CRA)の具体例として示したが、本発明は、この特定のタンパク 質に何ら限定されるものではない。実際、限定するものではないが、カリオフェ
リン(karyopherin)(N.Fisherら, 1997, J. Biol. Chem., 272(7):3999-4005)お よびその他のインポルチン類(importins)／カリオフェリン類、ならびにその機 能的断片および融合物、ならびにアデノウイルス末期前(preterminal)タンパク 質をコードする配列、プラスミドまたはベクターとアデノウイルスITR配列をコ ードする第2の配列、プラスミドまたはベクターとのペアリングなどの種々のCRA
/CRSおよびNRA/NRSペアリングが本発明の使用に適していると考えられる。
【００２９】 サイズの大きい本発明のベクターは、単一のベクターでCRSまたはNRSとCRAお よび／またはNRAをコードする遺伝子の両方をコードすることが可能である。し かしながら、一時的のみCRAおよび／またはNRAを発現することが好ましい場合も
ある。このような場合、CRAをコードし且つ発現する遺伝子は、NRSおよび目的の
遺伝子とは別個のベクター(好ましくはEBV-FRが欠失しており、よって一時的の み発現または保持されるベクター)にて標的細胞に導入され得る。このような場 合、それぞれ目的の遺伝子またはCRAについての発現カセットをコードするベク ターが標的細胞または標的組織に実質的に同時に加えられる。本明細書で用いら
れる場合、実質的に同時にという用語は、2種以上の化合物が、互いに24時間以 内に、好ましくは互いに30分以内に、約15分以内に、より好ましくは約5分以内 に、特に約1分以内に、最も好ましくは同時に、試験動物または患者の身体に導 入されるかさもなければ加えられる、あるいは培養中の組織または細胞に加えら
れることを意味する。CRAまたはNRAの比較的短期間の一過性発現をもたらす別個
のベクターを用いた目的の遺伝子をコードするベクターの実質的に同時の導入は
、CRAまたはNRAの長期の発現が細胞にとって有害な場合に特に有用である。
【００３０】 ii．目的遺伝子の発現カセット 本発明の目的に関して、「目的遺伝子」は、一般に、標的細胞中で正常に発現
されないか、又はここに記載された遺伝子送達方法で処理した細胞で得られたよ
りも実質的に低いレベル（例えば、最少で約3倍低い）で通常発現される任意の 組換え的にコードされた配列をいう。目的遺伝子はまた、相同的組換えを用いた
遺伝子活性化、修復又は置換の目的のための特定のゲノム座を標的とする置換配
列でもあり得る。目的遺伝子として働くことができる特定配列の例は、これらに
限定されないが、サイトカイン及び生長因子（例えば、GM-CSF、神経成長因子（
NGF）、毛様体神経栄養因子（CNTF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、インター ロイキン1-2及び4-6、腫瘍壊死因子−α（TNF-α）、α又はγインターフェロン
、エリスロポエチンなど）、嚢胞性線維症膜貫通伝導性（transmembrane conduc
tance）レギュレーター（CFTR）、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、D−アミノ
酸デカルボキシラーゼ（DD）、例えば、L−ドーパレベルを増加させることによ ってパーキンソン病を治療するためにTH及びDDと共に又はそれら無しに送達され
得るGTPシクロヒドロラーゼ（GTP）、レプチン（leptin）、レプチン受容体、第
VIII及び第IX因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、G-CSF、エポ
（epo）、セレクチン類（selectins）、アドヘリン類（adherins）、インテグリ
ン類、プロテオグリカン類、CRA類、NRA類などをコードする配列を含む。
【００３１】 本明細書中で用いる語句「発現」とは、目的のDNAの転写、並びに、場合によ っては、対応するMRNA転写産物のスプライシング、プロセッシング、安定性、及
び翻訳をいう。送達されたDNA分子の構造によって、発現は、一時的、断続的、 又は連続的であり得る。「永続的な」又は「持続した」発現とは、記載されたベ
クター中のNRS又はCRSの存在によって(適当な外因性に付加されたか、若しくは 内生のCRA又はNRAとともに）もたらされる目的遺伝子の一時的な発現の持続時間
が増大した発現をいう。好ましくは、そのようなベクターは、組込みによる宿主
細胞染色体の構造を中断させない。従って、永続的にトランスフェクションされ
た細胞は、宿主細胞染色体中に組み込まれたベクターによって安定に形質導入さ
れた細胞と区別できる。
【００３２】 「発現カセット」は、目的遺伝子、及び目的遺伝子に近接して機能し得るよう
に配置された目的遺伝子の発現を媒介する少なくとも１つのエンハンサー／プロ
モーター領域の両者を含む。もし遺伝子発現がコピー数に関係するなら、ここに
記載されたベクターのさらなる実施態様は、目的遺伝子の複数のコピー、又は目
的遺伝子を含む発現カセットの複数のコピーを組み入れたベクターである。発現
カセットの複数のコピーが所定のベクター上に存在する場合、それらは、ベクタ
ー内で同じ又は反対方向のいずれかで位置することができ、並んで位置すること
ができ、又はベクター中に少なくとも約200〜2000塩基からなる非コード配列の スペーシング領域を用いて散在させることができる。一般的には、典型的なベク
ター内の重複した発現カセット又は目的遺伝子の数は、約2個〜約100個であろう
。より典型的には、約3個〜約60個であり、好ましくは約3個〜約20個である。
【００３３】 これらに限定されないが、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、サイ
トメガロウイルスエンハンサー／プロモーター、SV40プロモーター類、及びレト
ロウイルスの長い末端反復配列（LTR）エンハンサー／プロモーター類、GRE類、
AP-1、SP-1、Et類、NF-1、CREB類、又はNFk-B結合DNA配列などを含むホルモン応
答エレメント類（hormone response elements）、並びに十分に確立された分子 生物学技術（一般には、参照によって本明細書中に組み込まれる、Sambrookら (
1989) 分子クローニング（Molecular Cloning）, I〜III巻、Cold Spring Harbo
r Laboratory Press発行, Cold Spring Harbor, New York及び分子生物学の最新 プロトコール （Current Protocols in Molecular Biology） (1989) John Wiley
& Sons発行, 全巻及びその期間最新版を参照されたい。）を用いて製造され得 る、これらの任意の置換体及び変異体を含む多数の転写プロモーター及びエンハ
ンサーが、目的遺伝子を発現させるために使用できる。エンハンサー／プロモー
ター領域はまた、血管内皮細胞、単球、マクロファージ、リンパ球、種々の前駆
細胞及び幹細胞（例えば、造血幹細胞）などを標的とする発現を含む、組織特異
的発現を与えるために選択できる。本発明の目的のためには、エンハンサー／プ
ロモーターエレメントは、単なる既知の共通配列のマルチマーではなく、インタ
クトの、好ましくは最適化された、エンハンサー配列に連結されたプロモーター
類である。
【００３４】 ここに記載された方法を用いて送達され得る目的のRNA類は、自己複製RNA類、
細胞質中で直接翻訳され得る上記遺伝子のいずれかに対応するmRNA転写産物、又
は触媒的RNA類（例えば、in vivoで特定のRNA配列を特異的に標的にでき、及び ／又は開裂できる、「ハンマーヘッド」ヘアピン類、デルタ肝炎ウイルス、I群 イントロン）を含む。酵素的RNA類によるターゲッティングに特に興味深いのは 、RNAウイルス、並びに広範な種類の細胞又はウイルス転写産物のいずれかのも のである。
【００３５】 あるいは、RNA、DNA、又は両者の混合物のアンチセンス形態は、細胞に送達さ
れて、その細胞中での特定の目的遺伝子の発現を阻害することができる。
【００３６】 さらに、ここに記載されたベクターは、これらに限定されないが、それぞれが
1以上のエンハンサー／プロモーターエレメント、cDNA類及び／又はゲノムクロ ーン類、及びポリアデニル化配列を含む、複数の（1以上の）発現カセット、好 ましくは2〜約100以上のカセットなどの特徴を組み入れることができる。1以上 のカセットはまた、CRA類及び／又はNRA類を含むこともできる。各ベクターはま
た、各発現カセットの間に特定の介在配列を含むように設計できる。これらの介
在配列は、長さが10〜5,000 bpであり、CRA類若しくはNRA、転写エンハンサー若
しくはリプレッサー配列類、SV40由来の核局在及びアンカー(anchoring)配列又 は他のDNA配列などをコードする配列を含むこともできる。さらに、各ベクター は、転写及び／又は転写後エンハンサーエレメント又は転写因子（例えば、これ
らに限定されないが、AP-1、Sp-1、Nfkβ、ETS-1若しくは2、NF-1など）をコー ドするcDNAを含むように設計できる。このような因子は、一般化されているか、
或いは組織−及び細胞型特異的な、転写若しくは転写後イベントのアップレギュ
レーションまたはダウンレギュレーションを誘導できる。さらに、ゲノムクロー
ン内の発現カセットのエンハンサー／プロモーター成分又はイントロン配列中に
含まれる特定エレメントに特異的に結合し、それからの遺伝子発現をモジュレー
トする、エンハンサー又はサプレッサー配列が含まれ得る。そのような配列は、
例えば、その発現カセット中に含まれるHCMVエンハンサー／プロモーターエレメ
ントからもたらされる遺伝子発現レベルをモジュレートするためのHCMV IE1及び
／又はIE2 cDNA類を含むことができる。本発明のベクター類はまた、誘導可能な
配列（例えば、GRE類を含む、ホルモン応答エレメント、及び／又は発現カセッ トそれ自身の中又は好ましくはエンハンサー／プロモーターエレメントの上流及
び／又は介在配列内のいずれかで操作され得るレチノイン酸応答エレメント）を
含むように設計することもできる。
【００３７】 さらに、本発明のベクター中で用いる発現カセットのもう１つの態様は、目的
遺伝子に機能し得るように連結された複数のエンハンサー／プロモーターエレメ
ントを組み込んだものである。例えば、2個以上の縦列エンハンサー／プロモー ターエレメントが目的遺伝子の上流に配置される。驚いたことに、これらのエン
ハンサー／プロモーターエレメントは、エンハンサー／プロモーターエレメント
の少なくとも１つが目的遺伝子の上流（好ましくは、第１又は第２のエンハンサ
ー／プロモーターエレメントが目的遺伝子に最も近接している）に正しい向きで
位置する限り、5'→3'又は3'→5'方向のいずれかで遺伝子発現を増大させるよう
に機能できる。
【００３８】 本発明のさらにもう１つの態様は、組織特異的エンハンサー／プロモーターエ
レメントである。組織特異的エンハンサー／プロモーターエレメントは、一般に
発現が弱いが、機能し得るように連結されたエンハンサー／プロモーター配列に
隣接する複数のエンハンサー／プロモーターエレメントの付加により、組織特異
性を維持しつつ、遺伝子発現をさらに増加させることができる。
【００３９】 本発明のさらなる実施態様は、例えば、メチル化、再編成、欠失、又は直接抑
制によって、宿主細胞がベクターがコードする遺伝子発現を抑制する（silencin
g）のを防ぐ配列をコードするベクターを含む。そのような配列の例には、これ らに限定されないが、ここに記載された核保持配列、細胞保持配列、ならびにそ
の細胞及び核保持活性が含まれ得る。
【００４０】 本発明のさらなる実施態様は、核ターゲッティングペプチド、又は特異的又は
非特異的DNA結合活性、細胞保持及び核ターゲッティングドメインを含む融合タ ンパク質と共にパッケージングされたベクターを含む。好適なDNA結合活性の例 は、これらに限定されないが、p53結合ドメイン、ヒストンタンパク質、糖質コ ルチコイド応答エレメント結合ドメイン、レトロウイルスインテグラーゼタンパ
ク質の非特異的DNA結合ドメイン、又はEBNA-1タンパク質（上記Middleton及びSu
gden, 1994）を含む。そのようなドメインの特に好ましい実施態様は、DNA結合 及び／又はEBNA-1タンパク質の核保持ドメインを含む。N末端半分、C末端半分、
若しくはEBNA-1コード領域の中程1/3、又はそれ由来の約10〜約100アミノ酸、又
は好ましくは約20〜約60アミノ酸の任意の実質的に連続したストレッチ（stretc
h）に位置できるこれらの領域が好ましい。なぜなら、分子の末端切断形態は、i
n vitroでの哺乳動物細胞の悪性の形質転換を媒介するEBNA-1タンパク質のドメ インを優先的に欠失させるからである。例えば、EBNA-1の核局在化ドメイン（NL
）は、およそアミノ酸379〜およそアミノ酸387の間に位置し、EBNA-1の二量化及
びDNA結合ドメインは、およそアミノ酸451及びおよそ604の間に位置する。最小 で、本発明で用いる変異EBNA-1タンパク質は、欠失（特に、アミノ酸89〜およそ
328をコードする領域中で、20〜約100塩基又はそれ以上の欠失）、フレームシフ
ト、又は点突然変異、又はEBNA-1タンパク質のN末端378アミノ酸をコードする配
列中のそれらの混合物の任意の組み合わせを組み入れながら、少なくとも1以上 のこれらの領域をコードするだろう。好適な点突然変異の例は、決してこれらに
限定されないが、保存的アミノ酸置換、並びに、所定のアミノ酸がEBNA-1コード
領域中に正常に生じる、任意の1つの位置、幾つかの位置、若しくは全ての位置 での、phe及びtyr残基、ser及びthr残基（又はala、cal、leuなどのいずれかに よって）、asp及びgly残基（又はasn又はglnのいずれかによって）の交換、又は
cysの非硫黄含有アミノ酸での置換などの活性部位を破壊するためにデザインさ れた置換を含む。そのような変異したEBNA-1タンパク質は、好ましくは実質的に
形質転換されていない。勿論、ポリヌクレオチド複合体と共にパッケージングさ
れ得るこれらの核ターゲッティングドメインのいずれも、所望のCRA/NRAの一部 としてヌクレオチドによってコードされ得る。
【００４１】 上記DNA結合ドメインに融合されるか、又はそうでなければ、ここに記載され たポリヌクレオチド複合体中に組み入れられる好適な核ターゲッティングドメイ
ンの例は、これらに限定されないが、SV40 T抗原、ヒストンアミノ酸配列（特に
カルボキシ末端ドメイン）、Qip 1、核リボヌクレオタンパク質A1（特にM9ドメ イン）、核タンパク質輸送因子p97(特にタンパク質のC末端60％)、網膜芽細胞腫
瘍サプレッサー（特にヒト網膜芽細胞腫瘍サプレッサーのアミノ酸860-877）、 ヌクレオプラスミン、c-Myc、又はCMV p65低級マトリックス（lower matrix）リ
ンタンパク質由来の核局在化配列を含む。
【００４２】 iii．本発明のベクターの他の態様 具体的に開示されたベクターに加えて、ここに記載されたポリヌクレオチド複
合体もまた、これらに限定されないが、目的遺伝子を最適に適合させるための、
プラスミド、コスミド、YAC、BAC、P-1又は関連ベクター、哺乳類人工染色体、 及びヒト人工染色体（HAC）を含む広範囲の発現ベクターを用いて形成できる。 さらに、大きなサイズのポリヌクレオチド挿入物が本発明の発現ベクターによっ
てサポートされているなら、前記の発現ベクター（すなわち、YAC類、HAC類、BA
C類、P1、コスミドなど）の幾つか、又はそれらの任意の複合物（multiples）若
しくは混合物は、記載されたベクター中に物理的に組み入れることができる。
【００４３】 遺伝子送達の非ウイルス法が、ウイルスを基礎とする遺伝子送達法が本来持っ
ているDNAパッケージング制限によって拘束されないと仮定すると、本発明の１ つの実施態様は大きなベクターである。一般的には、大きなベクターは、少なく
とも約18 kbの組換え遺伝物質、より一般的には少なくとも約20 kbの組換え遺伝
物質、好ましくは少なくとも約25 kb〜約1,000 kbまでの組換え遺伝物質を有し ているだろう。一般的には、遺伝物質は、RNA又はDNAのいずれかであり、好まし
くはDNAであり、ヌクレアーゼ耐性修飾塩基又は化学結合の部分を含むことがで きる。
【００４４】 そのような改質ポリヌクレオチドの例は、これらに限定されないが、ホスホロ
チオエート結合、2'−O−メチルホスホジエステル、p−エトキシヌクレオチド、
p−イソプロピルヌクレオチド、ホスホロアミダイト、キメラ結合、及びポリヌ クレオチドを内因性ヌクレアーゼ活性に対して実質的に耐性にする任意の他の骨
格鎖修飾を組み入れたものを含む。ポリヌクレオチドをヌクレアーゼ耐性にする
さらなる方法は、これらに限定されないが、ポリヌクレオチド中のプリン又はピ
リミジン塩基の共有結合的修飾を含む。例えば、塩基を、メチル化、ヒドロキシ
メチル化、そうでなければ、置換（グリコシル化）して、修飾塩基を含むポリヌ
クレオチドが実質的にヌクレアーゼ耐性となるようにすることができる。
【００４５】 さらに、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドを、例えば脂質エマルジ
ョン、マイクロキャリアビーズ、ポリマー物質、タンパク質（好ましくは塩基性
タンパク質）などの任意の多様なパッケージング剤と複合体化することによって
実質的にヌクレアーゼ耐性にすることができる。
【００４６】 一般に、実質的にヌクレアーゼ耐性のポリヌクレオチドは、15分間のヌクレア
ーゼ（例えば、ヒトDNアーゼ（DNase））暴露後、対応する配列を有する非修飾 型ポリヌクレオチドよりも、ヌクレアーゼ分解に対して少なくとも約25％耐性が
高く、通常は少なくとも約50％耐性が高く、好ましくは約75％耐性が高く、そし
てより好ましくは少なくとも約1桁体制が高い。
【００４７】 さらに、ベクターは、直線状であり得るが、好ましくは共有結合的に閉じた環
である。一般には、この環は、正又は負に超コイル化されているだろうが、ニッ
ク環の場合には、任意に緩やかなトポロジーを有することができる。
【００４８】 望まれる場合には、ベクターに、目的遺伝子を有し、発現する細胞の制御絶滅
を可能にする自殺（suicide）シグナルをさらに組み込むことができる。例えば 、チミジンキナーゼ(tk)遺伝子をベクターに組み込んで、実行者（practitioner
）が、正確な量のアシクロビル、ガンシクロビル(gangcyclovir)、又はその概念
的若しくは機能的等価物を投与することによって、チミジンキナーゼ（tk）遺伝
子を発現する細胞を殺すことを可能にする。
【００４９】 iv．送達及び発現 ここに記載されたベクターが、長期間目的遺伝子を発現する能力を有すると仮
定すると、そのベクターがin vitro及びin vivoの両者において遺伝子送達適用 に理想的であることは明らかである。従って、本発明のさらなる態様は、広範な
種類の技術（一般的には、参照によって本明細書中に組み入れられる、Sambrook
ら (1989), 分子クローニング（Molecular Cloning） 第I〜III巻, Cold Spring
Harbor Laboratory Press発行, Cold Spring Harbor, New York, 及び分子生物 学の最新プロトコール （Current Protocols in Molecular Biology） (1989) Jo
hon Wiley & Sons発行, 全巻及びその定期的な最新版を参照されたい）のいずれ
かによって目的遺伝子を好適な動物細胞に送達するためのここに記載されたベク
ター／発現系の使用である。特に興味深いのは、CLDC媒介型遺伝子送達、ウイル
ス型遺伝子送達、ポリマー型遺伝子送達、エレクトロポレーション、ナノ粒子／
マイクロキャリアビーズ媒介型遺伝子送達、抗体コンジュゲートDNA複合体、化 学トランスフェクション、複合体化された形態およびむき出しの（naked）形態 の修飾及び／又は非修飾ポリヌクレオチドを用いた送達などである。
【００５０】 一般的には、記載されたベクターの非複製及び／又は非保持形態を用いる発現
は、一時的であるが、しかし、目的の組換え遺伝物質の一時的発現がより望まし
い多くの例がある。例えば、一時的発現は、目的のクローニングされた遺伝物質
を組込み、安定に発現させる形質導入ウイルス（例えば、レトロウイルス又はア
デノ関連ウイルス）の伝染性を増加又は増強させるために単純にウイルス受容体
を標的細胞に送達する場合に好ましい。
【００５１】 さらに、一時的発現は、急性疾患が関係する場合に特に好ましい。例えば、細
胞を、薬物耐性因子の導入によって一時的に特異的な抗生物質又は化学療法剤に
対して免疫性にすることができる。多くの細胞集団は、化学療法薬剤治療の効果
によってしばしば悪影響を受けるので、そのような細胞を形質導入して、その細
胞の、及び周囲の細胞の所定の処理に対する耐性を増強させる因子を一時的に発
現させることができる。さらに、ここに記載されたEBNA-1遺伝子を一時的に発現
させる方法は、長期間の、又は永続的なEBNA-1発現の不利な結果を回避又は改善
しながら、FR又はoriPを含む、同時に送達されるプラスミドの永続的な発現を媒
介できる。
【００５２】 増強された発現がここに記載されたベクターによってもたらされるなら、その
ベクターの「むき出しの」形態は、例えば、筋肉細胞がそのベクターによってコ
ードされる種々の遺伝子産物を取り込み、発現する場合、筋肉中に直接注入でき
る。従って、「むき出しの」DNAは、ワクチンとして作用することができる。さ らに、むき出しのDNAは、宿主細胞にそのDNAを取り込ませ、植え付け（engraftm
ent）を増加させる因子を一時的に発現させ、または特に望ましい治療利益を生 じさせるために、コラーゲン支持体、人工血管、ステント、骨代用品若しくは骨
用セメント、軟骨、生体適合性ポリマー及びプラスチック、腱及び靱帯などを含
む広範な種類の移植可能な任意の物質中又はその上に組み込むことができる。そ
のような技術の追加的な応用は、網膜症などの合併症を予防又は軽減するために
、好適なDNA製剤によって種々の外科用器具（例えば、血管形成術用バルーン） をコーティングすることを含む。
【００５３】 ここに記載されたベクター／発現系はまた、精製されたプラスミドDNAを、塩 化カルシウム、グリセロール、及びリポタンパク質、特に高密度リポタンパク質
などの作用物質と混合することによって、むき出しのDNA（例えば、ウイルス、 リポソーム、又は他のリガンド指定送達媒体などの通常の送達媒体中にパッケー
ジングされていないもの）としてin vivoでも導入された。記載されたベクター のむき出しのDNA形態をこれらの製剤を用いて全身に送達する場合、ベクターの みの対照と比べて顕著なレベルのリポーター遺伝子の発現が観察された。その後
の研究は、「むき出しの」DNAの発現は、そのDNA混合物に追加的な作用物質を添
加することによって、並びにベクター導入の前又は後に宿主動物を、例えば、糖
質コルチコイド、エンドサイトーシスを促進するか、又は細胞代謝を刺激する作
用物質、及びリソソームインヒビターによって処理することによって、さらに増
強できることを示した。同様の方法はまた、局在化された遺伝子送達にも好適で
ある。
【００５４】 任意に、ポリヌクレオチドベクターは、in vivo送達のために、製剤化の前又 は間に、好適な陽イオン又はカチオン性ポリマーを用いて圧縮できる。
【００５５】 上記ポリヌクレオチドはまた、ポリマーDNA複合体（上記、Goulaら, 1998を参
照されたい）、ポリリジン−DNA複合体にコンジュゲートされた抗体及び他の非 ウイルス性、非脂質系DNAコンジュゲート系と、並びにむき出しのDNAそれ自身と
共に製剤化することもできる。さらに、ウイルス遺伝子送達の従来の形態は、こ
こに開示されたNRS/NRAまたはCRS/CRA系の組み込みによって恩恵を受けることが
できる。ここに開示された方法及び組成物を用いて送達できるさらなるベクター
は、これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルス
ベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイ
ルスベクター、仮性狂犬病ウイルス、α−ヘルペスウイルスベクターなどを含む
。ウイルスベクター、特に非複製細胞を改変するのに好適なウイルスベクター、
及び目的のポリヌクレオチドの発現とともにそのようなベクターをどのように使
用するかの詳細な総説は、ウイルスベクター：遺伝子治療及び神経科学の応用（ Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications ）, Caplitt及び
Loewy編集, Academic Press発行, San Diego (1995)の書籍中に見出すことがで きる。さらに、ここに記載された方法は、目的の遺伝物質をコードするか、若し
くはそれを含むウイルス性又はサブウイルス性（subviral）粒子を複合体化し、
送達するのに使用できる。
【００５６】 ここに記載された脂質及びポリマー複合体は、目的の遺伝物質をin vivoで細 胞又は組織に送達するために特定的に設計される。その結果、記載された複合体
中に組み入れられるか、又は複合体の製剤化中に使用される遺伝物質は、生来の
毒性が低いことが重要である。例えば、本発明の種々の生化学的成分は、好まし
くは高純度で、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくと
もナショナル・フード（NF）グレード、一般的には少なくとも分析グレード、及
び好ましくは少なくとも医薬グレード）。所定の化合物が使用の前に合成されな
ければならない程度で、そのような合成又はその後の精製によって、好ましくは
合成又は精製工程の間に使用され得るいかなる潜在的に毒性の作用物質をも実質
的に含まない生産物を得る。さらに、遺伝子送達レシピエントの、例えば、デキ
サメタゾン又は他のコルチコステロイドによる前処理もまた、宿主毒性を低減し
得る。
【００５７】 さらに、送達されるポリヌクレオチドは、実質的に純粋であるべきである（す
なわち、汚染タンパク質、脂質、多糖類、リポ多糖類、核酸、及び免疫原性とな
りうる潜在的なCpG配列を実質的に含まない）。プラスミドDNAを用いる場合、調
製物は、一般に、フェノールもしくはフェノール：クロロホルムを含むプロセス
、抽出、及び等密度遠心分離（CsClなどを使用する）、又はそれらの機能的に等
価な手段を含む方法によって調製されるだろう。好ましくは、DNA調製物はまた 、RNアーゼによって処理され、有機溶媒による複数回の抽出、そして少なくとも
2回の超遠心分離（又は少なくとも純粋なDNAを製造する任意の他の手段）に付さ
れるだろう。一般的には、核酸の実質的に純粋な調製物は、核酸総量の少なくと
も約80％、一般には少なくとも約90％、そして好ましくは少なくとも約95％が、
所望の核酸からなっている調製物である。
【００５８】 さらに、多くの市販のアシル鎖カチオン性脂質は、標的細胞及び組織にとって
比較的毒性である。その結果、そのような化合物は、請求の範囲に記載の発明の
実施には好ましくない。特に興味深いのは、コレステロールと共に使用されるカ
チオン性脂質である。そのような化合物、特にジメチルジオクタデシルアンモニ
ウムブロミド（DDAB）又はDOTIM（好ましくはコレステロールと1:1で用いられる
）をポリヌクレオチドと共に製剤化すると、比較的in vivo毒性の低い複合体を 得ることができる。従って、カチオン性群と好適に混合されるか、又はカチオン
性群に誘導されたコレステロール群は、ここに記載された発明の実施に特によく
適している。
【００５９】 好適なコレステロール脂質のカチオン性成分は、pH5〜pH8の間の正荷電を保持
する種々の任意の化学基、例えばこれらに限定されないが、アミノ基（又はオリ
ゴ若しくはポリアミン）（例えば、スペルミン、スペルミジン、ペンタエチレン
ヘキサミン（PEHA）、ジエチレントリアミン、ペンタメチレンヘキサミン、ペン
タプロピレンヘキサミンなど）、アミド基、アミジン基、正に荷電したアミノ酸
（例えば、リシン、アルギニン、及びヒスチジン）、イミダゾール基、グアニジ
ウム基、又はこれらの混合物及び誘導体などを含むことができる。
【００６０】 さらに、上記基のいずれかのカチオン性ポリマー（多糖類又は他の化学リンカ
ーが連結したもの）もまた、遺伝子送達に有用であることが証明されており、こ
こに記載された脂質複合体中に組み込むことができる。そのようなポリマーを製
造するために用いる架橋剤は、好ましくは生体適合性であるか又は生体許容性（
biotolerable）であり、一般には、それぞれカチオンの好適な化学基と結合を形
成できる、少なくとも２つの化学基（すなわち、架橋剤は、2官能性である）を 含むだろう。この開示の目的に対しては、生体適合性という語句は、その化合物
が意図された投薬量で重大な毒性又は不都合な免疫学的作用を示さないことを意
味し、生体許容性という語句は、所与の化合物と関連した不都合な生物学的結果
が適当な投薬計画又は対向治療（counter-therapy）によってうまく処理できる ことを意味する。リンカー基（linker group）は、同種2官能性（同じ化学基） 又は異種２官能性（異なる化学基）であり得る。任意に、複合体からのベクター
の放出を促進するために、連結基とカチオン性部分との間に形成される化学結合
は、好ましくは生理学的条件下で加水分解可能である（すなわち、pH不安定性、
そうでなければ、標的細胞中で分解される）。さらに、架橋剤は、連結基の間に
生理学的条件下で加水分解され得る結合を含むことができる。
【００６１】 任意に、架橋剤は、分岐したポリマーを形成させる追加的な架橋剤と組み合わ
せることができる。分岐連結分子と重合架橋剤の割合を変化させることで、多様
な化学的特性を有するカチオン性ポリマーが製造される。
【００６２】 適当な場合には、幾つかの又は多様な（すなわち、混合物）他の「ヘルパー（
helper）」脂質成分を、所望の特性を有する複合体をもたらすのに必要なものと
してここに記載された脂質又はポリマー／ポリヌクレオチド送達媒体に添加する
ことができる。そのようなものとしては、これらに限定されないが、ジステロイ
ルホスファチジル−グリセロール（DSPG）、水素添加大豆（hydrogenated soy）
、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノール
アミン、スフィンゴミエリン、モノ−、ジ−及びトリアシルグリセロール、セラ
ミド、セレブロシド、ホスファチジルグリセロール（HSPG）、ジオレオイル−ホ
スファチジルコリン（DOPC）、ジラウロイルホスファチジル−エタノールアミン
（DLPE）、カルジオリピンなどを含む、任意の多数の周知のリン脂質が添加でき
る。一般的には、ヘルパー、そうでなければ中性脂質は、ポリヌクレオチド送達
複合体の脂質成分を約15％〜約70％、好ましくは約15％〜約60％、より好ましく
は約30％〜約60％、そしてより一般的には少なくとも約60％、そして具体的には
少なくとも約50％含む。逆に、カチオン性脂質のパーセンテージは、好ましくは
複合体の正味の脂質成分の約30〜約70％、より好ましくは約40〜約60％、そして
具体的には約50％を構成するだろう。
【００６３】 遺伝子送達のウイルスを基礎とする系は、一般に、遺伝子送達を達成するため
に用いるビリオンの生来の免疫原性によって制約される。一旦、患者が所定のウ
イルスに対して応答するように初回抗原刺激されると、中和抗体及び細胞障害性
Tリンパ球が、ウイルスまたは抗原性により関連したウイルスを用いた遺伝子送 達を妨害し得る。それ故、本発明のさらなる実施態様は、低い免疫原性を有する
ことによって特徴付けられる非ウイルス性脂質及び／又はポリマー−ポリヌクレ
オチド複合体を含む。本開示の目的に関しては、低免疫原性という語句は、複合
体特異的抗体の中和力価又はベクター特異的Tリンパ球の免疫量が、その複合体 を患者に3回以上in vivo適用した後の免疫応答能のある患者の大多数の血液中に
見出されないことを意味する。あるいは、低免疫原性という語句は、複合体特異
的抗体の力価、又は複合体特異的免疫Tリンパ球のレベルが、一般に、少なくと も約1011個の複製不完全（replication defective）アデノウイルス粒子のi.v. （静脈内）又はi.m.（筋肉内）注射後に観察される力価よりも、少なくとも約50
％低いことを意味することもできる。
【００６４】 さらに、非ウイルス型という語句は、所定の遺伝子送達複合体又は方法が、ウ
イルスタンパク質に対する宿主の免疫応答を刺激する、ウイルスキャプシド若し
くはエンベロープタンパク質、又はそれらの部分の充分な量を包含していないと
いう事実をいう。一般的には、ここに記載された遺伝子送達の非ウイルス法（例
えば、CLDC、ポリヌクレオチド複合体及び／又はポリマーなど）は、in vitro又
はin vivoでの遺伝子送達の第１の手段として使用できる。しかしながら、この 事実は、初期のウイルス媒介型遺伝子送達後のフォローアップまたは追加免疫遺
伝子送達処理としてのここに記載した非ウイルス方遺伝子送達の使用を決して除
外するものではない。
【００６５】 さらに、ポリヌクレオチド複合体を確立された方法によって修飾して、それら
のin vivo安定性並びに多様な薬理学的特性（例えば、in vivo半減期の増加、毒
性のさらなる低減など）のいずれかを増強することもできる。例えば、ポリヌク
レオチド複合体は、徐放性様式で体にポリヌクレオチドを送達するように、又は
ポリエチレングリコールなどの、循環物質の循環時間を延長する作用物質を含む
ように製剤化することができる。そのような徐放性製剤は、一時的な遺伝子送達
の期間を延長させ、又はin vivoで核酸を投薬し、送達する別の手段を実行者に 提供することによって急性症状の治療を促進することが意図されている。特に、
ここに記載された複合体は、ポリヌクレオチド系ワクチンのパッケージング及び
送達に理想的である。特に興味深いワクチンは、寛容原(toleragen)をコードす るヌクレオチド、真核及び原核の両者の病原体由来の免疫原、ウイルス、及び腫
瘍関連抗原を含む。
【００６６】 ここに記載されたポリヌクレオチド複合体の診断、治療又は医薬使用が意図さ
れている場合、複合体は、細菌汚染を避けるために、滅菌条件下で調製され、保
存され得る。複合体は比較的サイズが小さく、元々安定なので、それらはまた、
使用の前に滅菌濾過することもできる。上記滅菌調製及び濾過滅菌方法に加えて
、抗菌剤を添加することもできる。一般に製剤総量の約3％w/vまで、好ましくは
約0.5〜2.5％の量で使用できる抗菌剤は、これらに限定されないが、メチルパラ
ベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、フェノール、デヒ
ドロ酢酸、フェニルエチルアルコール、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、チモ
ール、チメロサール、ジヒドロ酢酸ナトリウム、ベンジルアルコール、クレゾー
ル、p−クロロ−m−クレゾール、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀、硼酸フ
ェニル水銀、硝酸フェニル水銀及び塩化ベンザルコニウム(benylalkonium chlor
ide)を含む。好ましくは、抗菌添加剤は、ポリヌクレオチド複合体の生化学的特
性を増強するか、又は複合体活性に関して不活性であるかのいずれかであろう。
【００６７】 in vivo遺伝子送達のためのDNA：脂質複合体の調製方法は、参照によって本明
細書中に組み入れられる、Liuら, 1995, J. Biol. Chem., 270(42):24864-24870
に、一般的に記載されている。簡単に言えば、D5Wの600μl中精製されたベクタ ーDNAの360μgを、カチオン性リポソーム（脂質総量の5.760μモルのコレステロ
ールと１：１の比のDDAB、DOTIM、又はDOTMA）を含むチューブに素早く導入し、
穏やかに混合した。
【００６８】 アセンブル中、カチオン性成分は、一般に、所定の用途に対して最適化された
陽イオン／リン酸比でポリヌクレオチドと混合される。通常は、DNAリン酸塩： 陽イオン比は、約1:8（μg DNA：ナノモル陽イオン性脂質）、好ましくは静脈内
投与については約2:1及び1:16の間、そしてi.p.(腹腔内)、若しくはエアゾール 適用のためには約1:1の間などであろう。
【００６９】 イオン対は、陽イオン／ポリヌクレオチド複合体の形成において役割を果たす
ので、複合体形成の間のpHを、特定成分の相互作用を最適化又は安定化するため
に変化させることができる。例えば、非pH感受性カチオン性脂質を用いる場合、
約5という低いpHは、所定のポリヌクレオチド（例えば、RNA）又はポリヌクレオ
チドと同時に組み込まれ得る他の化学物質を複合体化するのに好ましい。さらに
、ポリヌクレオチド（例えば、DNA）が塩基性加水分解に実質的に感受性でない 場合、約10までのpHが複合体形成の間使用されるという状況を要求してもよい。
一般に、約5〜約9の範囲内、好ましくは約7のpHに複合体形成及びトランスフェ クションの間維持されるだろう。
【００７０】 同様に、塩濃度（例えば、NaCl、KCl、MgCl2など）を、複合体形成を最適化す
るか、又は遺伝子送達及び発現の効率を高めるために変化させることができる。
さらに、カチオン性脂質がポリヌクレオチドと複合体化される温度などの因子を
、得られる複合体の構造的及び機能的属性を最適化するために変化させることが
できる。さらに、複合体が形成される溶液のオスモル濃度（osmolarity）は、塩
又は他の希釈剤濃度を調整することによって変化させることができる。
【００７１】 適度な塩濃度は、複合体形成を妨げるので、これらに限定されないが、ブドウ
糖、ショ糖、乳糖、果糖、トレハロース、麦芽糖、マンノースなどの、好適な賦
形剤を添加するか又はこれを代用することによってオスモル濃度を調整すること
もできる。複合体形成の間に存在し得る糖（デキストロース、ショ糖など、上記
のリストを参照されたい）の量は、一般に、約2％と約15％との間であり、好ま しくは、約3％と約8％との間、そしてより好ましくは約5％である。
【００７２】 あるいは、溶液のオスモル濃度はまた、塩と糖、又はデキストラン40、アルブ
ミン、血清、リポタンパク質などを含む他の希釈剤の混合物によって調整するこ
ともできる。当業者であれば、どのようにして塩及び糖の濃度を適当に変化させ
て、遺伝子送達の効率を最適化すればよいかを明確に知っている。さらなる最適
化のための出発点としての役割を果たすことができる塩及び糖の一般的濃度は、
約250 mM（ブドウ糖）及び約25 mMの塩（NaCl）である。
【００７３】 複合体形成のさらなる特徴は、温度調節である。一般的に、カチオン性脂質は
、約4℃と約65℃の間、より一般的には約10℃と約42℃の間、好ましくは約15℃ と約37℃の間、そしてより好ましくは室温程度の温度でポリヌクレオチドと複合
体を形成する。多くの場合、複合体形成の間の正確な温度調節（例えば、+/-1℃
）は、生成物の多様性を最小化するために重要である。
【００７４】 本発明のポリヌクレオチド複合体の製造に用いられる処方によって、得られる
複合体は、一般的に、サイズ及び構造が変化するだろう。例えば、DOPE又はコレ
ステロールと共にDOTMAを用いて形成される脂質複合体は、一般に、約50 nmと約
100 nmの間の直径を有する小さな単層状の（unilamellar）小胞（SUV）を形成す
る。DOTIMと共に製剤化され、手で振るか、又はかき混ぜることによって調製さ れた脂質複合体は、一般に、実質的に200 nmより大きい可変の直径を有する多層
状の小胞を生じる。
【００７５】 ここに記載された脂質／ポリヌクレオチド又はポリマー／ポリヌクレオチド複
合体は、特定範囲のサイズを有する安定な小胞に製剤化され得るので、ターゲッ
ティング剤を媒体中に組み入れて、その媒体を特定の細胞及び／又は組織に誘導
することができる。従って、多様なターゲッティング剤のいずれかを送達媒体中
に組み込むこともできる。
【００７６】 本開示の目的に関しては、ターゲッティング剤という語句は、送達媒体中に組
み込むことができる任意の及び全てのリガンド又はリガンド受容体をいう。その
ようなリガンドは、これらに限定されないが、例えばIgM、IgG、IgA、IgDなどの
抗体、又はそれらの任意の部分又はサブセット、細胞因子、例えばインテグリン
、プロテオグリカン、シアル酸残基などの細胞表面受容体、及びそれらに対する
リガンド、MHC又はHLAマーカー、ウイルスエンベロープタンパク質、ペプチド又
は小さな有機リガンド、それらの誘導体などを含むことができる。
【００７７】 ターゲッティングリガンドは、ポリヌクレオチド送達媒体の形成の前にカチオ
ン性ポリマーの適当な部分に誘導され得る。例えば、ターゲッティング剤（例え
ば、免疫グロブリン）は、N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）及び1−エチル −3−（3−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDAC）、若しくはそのメ
チオジド（EDCメチオジド）、及びターゲッティング分子上の遊離アミノ基を用 いて先ず脱離基をカルボキシル基に誘導することによって、分岐した架橋分子の
極性領域の遊離のカルボキシル基とN結合（N-linked）できる。あるいは、ター ゲッティング剤は、適切に調整された連結剤又は陽イオンに（チオ酢酸、ヒドロ
キシルアミン、及びEDTAを用いて）ジスルフィド結合することができる。
【００７８】 あるいは、ターゲッティング剤はまた、ポリヌクレオチド複合体と「標的（ta
rgeted）」細胞又は組織との間の架橋として作用することもできる。例えば、タ
ーゲッティング剤が単に複合体と会合する場合、該ターゲッティング剤は、複合
体形成又は単離のかなり後にその複合体に添加することができる。ターゲッティ
ング剤がまた、細胞表面上の分子も認識できるか、又はそれによって認識され得
る程度まで、該ターゲッティング剤は、細胞表面と緊密に接触した状態に複合体
を効率的に配置する架橋分子として作用し得る。
【００７９】 ポリヌクレオチド複合体と会合するタンパク質はまた、ターゲッティングリガ
ンドとも誘導体を形成することができ、特定細胞及び組織に複合体を誘導するた
めに使用できる。この様式では、例えば内皮細胞、幹細胞、生殖細胞系細胞、上
皮細胞、島細胞（islets）、ニューロン若しくは神経組織、中皮細胞、骨細胞、
軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主な腺若しくは器官（例えば、肺、心臓、胃、
膵臓、腎臓、皮膚など）の細胞、外分泌及び／又は内分泌細胞などの多様な細胞
のいずれも、遺伝子送達のための標的となり得る。あるいは、上記細胞若しくは
組織のいずれか又は全てが、特定のターゲッティングリガンドを組み入れていな
いポリヌクレオチド複合体を用いた遺伝子送達の標的として作用することができ
る。
【００８０】 上記に概要を述べたものに類似した、標的化遺伝子送達用途に関して特に興味
深いのは、種々の細胞表面マーカー及び受容体をコードするタンパク質である。
そのようなタンパク質の例示である簡単なリストは、これらに限定されないが、
CD1（a-c)、CD4、CD8-11(a-c)、CD15、CDw17、CD18、CD21-25、CD27、CD30-45(R
(O, A, 及びB))、CD46-48、CDw49(b,d,f)、CDw50、CD51、CD53-54、CDw60、CD61
-64、CDw65、CD66-69、CDw70、CD71、CD73-74、CDw75、CD76-77、LAMP-1及びLAM
P-2、並びにT細胞受容体、インテグリン受容体類、増殖性内皮のためのエンドグ
リン（endoglin）、若しくはそれらに対する抗体を含む。
【００８１】 ターゲッティング剤がポリヌクレオチド複合体内に組み込まれている場合、好
適なリガンド若しくは抗体、又はそれらの混合物は、好適な固体支持体（すなわ
ち、ラテックスビーズ、マイクロキャリアビーズ、膜若しくはフィルターなど）
に固定することができ、調製物の残分からターゲッティング受容体又はリガンド
が組み込まれる複合体を選択的に結合し単離するために使用できる。したがって
、所望のポリヌクレオチド複合体を使用の前に単離する方法を提供する。
【００８２】 さらに、多様な化学安定化剤のいずれも記載された複合体と共に利用できる。
好適な製薬的に許容可能な酸化防止剤は、没食子酸プロピル、ブチル化ヒドロキ
シアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビン酸若しくはアスコル
ビン酸ナトリウム、DL−若しくはD−α−トコフェロール及び酢酸DL−又はD−α
−トコフェロールを含む。もし存在するなら、酸化防止剤は、例えば、0.1％（w
/v）まで、好ましくは0.0001〜0.05％の量での媒体組み立ての前、間、又は後の
いずれかに、単独に又はポリヌクレオチド送達媒体と組み合わせて添加できる。
【００８３】 陽イオン性リポソームは、一般に不活性ガス下4℃で貯蔵されるか、又は凍結 乾燥され、複合化の前に再生される。DNA：脂質複合体は、凍結乾燥し、使用の 前に再生できる。
【００８４】 所望により、より優れた貯蔵安定性のために、1以上の安定化剤及び／又は可 塑剤をポリヌクレオチド複合体に添加することができる。安定化剤及び／又は可
塑剤として有用な物質は、これらに限定されないが、ブドウ糖、ガラクトース、
ショ糖、又は乳糖を含む単純な炭水化物、デキストリン、アカシア、カルボキシ
ポリメチレン及びコロイド状水酸化アルミニウムを含む。安定化剤／可塑剤を添
加する場合、調製物総量の約10％（w/v）まで、好ましくは約0.5〜6.5％の量で 、それらを組み入れることができる。さらに、ここに記載されたポリヌクレオチ
ド複合体は、凍結して、又は凍結乾燥されたケーキ若しくは粉末として貯蔵でき
る。
【００８５】ｂ. 体細胞トランスジェニック非ヒト動物および機能的ゲノム研究 ヒトゲノムの断片、ならびに様々な動物種のゲノムが、これまでに次々と配列
決定されており、この配列決定されたDNA内において多くのコード領域が同定さ れている。しかし、これらの莫大な数の配列決定されたコード領域の、タンパク
質産物または核酸産物の機能が未知のままであり、機能的ゲノム研究において現
在利用可能な方法によっては、それを導き出すことができない。さらに、潜在的
に重要なタンパク質/核酸産物をコードする多数の核酸配列が、サブストラクシ ョンハイブリダイゼーション技術を使用することにより同定されている。これら
の技術を用いて、in vivoならびにin vitroの広範な生物学的条件下で特異的に 発現する遺伝子を、単離することができる。これらの特異的に発現する遺伝子の
多くが、インタクトな宿主内において重要な生物学的機能を成す核酸/タンパク 質産物をコードし得る。しかし、これらの特異的に発現するクローンの多くは、
これまでに既知の機能が何ら同定されていない産物をコードしている。
【００８６】 本発明の方法および組成物は、in vivoにおける遺伝子送達に特に適している 。従って、本発明の更なる特徴として、目的の遺伝子または遺伝子群を発現する
ように遺伝的に改変された、非ヒト体細胞トランスジェニック動物がある。
【００８７】 本明細書に記載の体細胞トランスジェニック動物の使用により、機能的ゲノム
研究に革命をもたらすことができる。特に、本発明の方法およびベクターは、本
質的にどんなcDNAまたはゲノムクローンをも生物学的に有意なレベルで、動物内
において、持続して発現する能力を提供する。本発明のこの特徴によって所与の
遺伝子産物の（以前は未知の）機能を体細胞トランスジェニック動物系において
評価して同定できる。さらに、病状の進行、回復、予防を、適当な遺伝的に改変
した体細胞トランスジェニック動物モデルを用いて観察できる。この方法を用い
て、外見（皮膚、毛、など）、全血球算定および血液化学、サイトカインレベル
、全組織病理学分析（障害の生じ得る器官の変化の観察を含む）、炎症応答およ
び/また病状の誘発（癌、心臓病、アテローム硬化症、高血圧症、糖尿病、ぜん そく、体重の維持）などを含む様々なパラメーターを、体細胞トランスジェニッ
ク動物内で観察する。あるいは、この方法を用いて、癌、心臓病、アテローム硬
化症、高血圧症、糖尿病、ぜんそくなどの動物モデル内で、その機能が未知であ
る遺伝子を発現させて、in vivoにおけるこれらの遺伝子の1以上の発現が一般的
なヒトの疾病に直接関連する動物モデルに、重要な治療効果をもたらすかどうか
決定することができる。観察された表現型の変化と特定のcDNAの導入とを相関さ
せることにより（処理した動物を、偽処理した動物および非処理の対照動物と比
較することにより）、これらの特性評価されていないDNA配列の特定の機能を評 価できる。この方法は、完全長cDNAまたはゲノムクローン、または完全長クロー
ンを作製するのに用いられ得る部分クローンに対して用いるのに最も有用である
。
【００８８】 本発明のトランスジェニック動物のある程度一過性の性質により、動物の遺伝
子型の一時的な操作を評価することもできる。この特徴は、安定かつ継続的に発
現するとはなはだ有毒となる、外来性添加遺伝子の影響を調査している場合に特
に有用である。本発明の方法の別の特性により、目的の遺伝子の一過性の発現に
関連する効果、ならびに発現がゆっくりと減少する時に試験細胞または動物に生
じる変化の一時的な評価ができる。結局本発明の方法は、その他の本質的な細胞
遺伝子の発現を、特異的に阻害または減縮することによる一時的な影響を評価す
るのに理想的に適している。例えば、このようなベクター内の目的の遺伝子は、
所与の細胞遺伝子の正常な発現を妨害するアンチセンスメッセージ、標的リボソ ーム、または阻害性のタンパク質またペプチドをコードし得る。上記のように処
理した試験動物または細胞を観察することにより、実質的に細胞内のどんな遺伝
子でも、その発現を選択的に阻害することの細胞的および表現型的な影響を調査
できる。従って、本発明の主要な態様は、所与の細胞遺伝子の発現を標的として
減縮または増強させることによってどの遺伝子が影響を受けるかを連続して試験
することにより、所与の調節経路に含まれるそれらの遺伝子を同定するための方
法を、提供することである。
【００８９】 機能的ゲノム研究に対する体細胞トランスジェニック法の別の強みは、この方
法を用いて非常に大きなDNAベクターを動物内に送達して効果的に発現させるこ とができることである。したがって、機能が未知の５〜10またはそれ以上の異な
るDNA配列を単一ベクターに組み込み、単一の動物内で発現させることができる 。この方法は、一度に評価できる未知のDNAコード領域の数を劇的に増加させ、 そのためこの方法はより経済的に便利なものである。更に、CNSにおいてまたは 初期の発育段階において新規な機能（例えば広範囲にわたる全身性の機能のよう
なもの）を有する遺伝子を同定する能力を最大化するために、目的の遺伝子を全
身的に、中枢神経系に、特定の組織にまたはin uteroで成長している胎児に注射
することにより動物をトランスジェニックにできる。
【００９０】 典型的には、機能的ゲノム研究を行うための本発明の方法は、重大な進行性の
宿主毒を生じることなく、宿主の免疫応答、毒応答または形質転換応答に基づく
表現型を生じることなく、生物学的におよび治療上適切なレベルで、目的の遺伝
子を持続的に発現させるであろう。さらに、本発明の方法は、免疫宿主への再注
射後の目的の遺伝子の効率的な再発現を可能にする。したがって、表現型を誘発
するために必要ならば、非常に長い期間発現を維持させることができる。また本
発明の方法は、非常に大きなDNAベクターの送達および発現を可能にし、これに より複数の異なるcDNAおよび/またはゲノムクローンの単一の動物内への送達お よび発現を可能にする。この方法では、2以上の遺伝子のin vivoにおける潜在的
な相互作用を、容易に評価できる。さらに、多数の未知の遺伝子を、単一の動物
内で発現させることができるので、非常に多数の未知遺伝子の機能スクリーニン
グを、比較的少数の動物しか用いずに、行うことができる。本発明の方法のこの
特性は、スクリーニングの効率をかなり上昇させ、多数の遺伝子をスクリーニン
グするのに必要とされる動物の数を有意に減少させる。本発明の方法は、全身的
な投与を含む様々な投与経路を経て直接CNSに、および直接in uteroで成長中の 胎児に有効に用いることもできる。したがって、未知の遺伝子の機能を複数の組
織内ならびにin uteroおよび出産後初期の成長の間において、評価することがで
きる。これは、胎児から成人に至るまでの異なる成長の過程において、最大数の
組織および細胞部位内で未知遺伝子の機能を同定する可能性を最大化する。
【００９１】 この方法論を用いて、試験動物内のクローン化遺伝子またはcDNA配列の機能を
、すばやく決定するかまたは推定することができる。従って、本発明の方法およ
び技術は、機能的ゲノム研究の実施に特によく適合している。このようなin viv
oの機能的ゲノム研究は、本明細書に記載の方法のサブセットに固有の、持続性 はあるがなお一過性である遺伝子発現の性質から特に恩恵をうけるだろう。例え
ば、哺乳動物細胞中の遺伝子操作した遺伝子を制御可能に発現させることは、遺
伝学者の未だとらえどころのないゴールである。本発明の系を用いて、適したポ
リヌクレオチド複合体を生きている試験動物に単に注射することにより、目的の
遺伝子を「誘導」することができる。遺伝子の発現を、以後の処理によって維持
することができ、遺伝子の発現をさらなる処理を中止することによって、終結さ
せることができる。本質において、本発明の系は、生きている動物における、試
験遺伝子の制御可能な発現にとって有効な系について記載する。このように、機
能的ゲノム研究の試験のための本発明の技術の潜在的な応用、または緊急の医療
状態の治療でさえ、当業者に明らかである。例えば、ヒト第VIII因子、第IX因子
などの組換え体にコードされる産物を比較的大量に産生するために使用する体細
胞トランスジェニック動物を作製するために、ここで記載の方法を使用すること
もできる。
【００９２】 特異的に例証されたマウスに加えて、本発明の実施に使用し得る哺乳動物種の
例としては、これに限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チ
ンパンジー）、ブタ、ラット（または他の、齧歯類）、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒ
ツジ、およびモルモットが挙げられる。さらに、遺伝子送達の非ウイルス的方法
は、特定の種または動物タイプの場合に限定されないので、本発明の方法は、例
えば昆虫、節足動物、甲殻類、鳥類および魚類のような非哺乳動物体細胞トラン
スジェニック動物の作製に使用するのにも適している。
【００９３】 遺伝子の送達のための本発明の方法は、in vivoおよびin vitroの機能的ゲノ ム研究の実施にもよく適合する。例えば、遺伝子発現プロファイルを、目的の遺
伝子を永続的に発現するように、一時的に形質転換された細胞または動物につい
て決定することができ、正常なおよび偽形質転換した細胞の発現プロファイルと
比較できる。該遺伝子が細胞群から徐々に消失していくとき、遺伝子発現プロフ
ァイルの変化を観察して、送達された遺伝子の機能性の非常に詳細なまでの理解
を深めることができる。任意に、同様の方法論を用いて、遺伝子の異なる組合わ
せ、および細胞または動物に特定の規則で導入された遺伝子の組合わせを試験す
ることができる。さらに、本発明の方法を用いて、マーカーまたは試験遺伝子を
、十分に特性評価されよく知られた遺伝的バックグラウンドを有する細胞群に、
細胞ゲノムを破壊することなく送達することができる。したがって、本発明の方
法およびベクターは、ハイスループットスクリーニングアッセイに使用するため
の細胞への試験遺伝子およびマーカー遺伝子の両方の送達に、特によく適してい
る。このようなアッセイの例は、とりわけ、米国特許第5,491,084号および第5,6
25,048号で見ることができる。これらの双方を参照により本明細書に組み入れる
。上記で定義した遺伝子に加えて、Gタンパク質、粗製のGタンパク質、β-ラク タマーゼおよびそれらの誘導体、緑色蛍光タンパク質およびその誘導体、細胞表
面受容体、細胞膜タンパク質、細胞間および細胞内シグナル形質導入タンパク質
、発ガン性タンパク質、分裂促進性タンパク質、DNA修復タンパク質、細胞骨格 タンパク質、その他同種のものを、記載のベクターおよび方法を用いて標的の細
胞に導入できる。
【００９４】 好ましくは、本発明のベクターおよび方法を用いて形質導入した細胞は、タン
パク質、ヌクレオチド、および小有機分子のコンビナトリアルライブラリーのス
クリーニングにも適している。さらに、本発明の方法は、組合せて作製したまた
はその他の試験化合物のスクリーニングとも両立する。該化合物は試験遺伝子ま
たは遺伝子群の導入の前、同時、後に添加する。
【００９５】 本質的に、いかなる動物からのいかなる細胞をも、該細胞の本発明の組換えベ
クターの取り込みおよび発現が可能なかぎり、上記のスクリーニングアッセイに
使用できる。任意に、標的の細胞を形質導入して、プロテオグリカンまたはその
他、本発明のベクターまたはポリヌクレオチド複合体の取り込みを媒介または促
進する受容体を、発現または過剰発現させることができる。特に好ましい細胞タ
イプには、これに限定するものではないが、肝細胞、肺細胞、血液細胞、幹細胞
、繊維芽細胞、白血球、内皮細胞、マクロファージ、単細胞、樹状細胞、神経細
胞、星状細胞、筋細胞およびその他同種のものが挙げられる。
【００９６】 まとめると、本発明は、動物内の体細胞遺伝子送達を用いた、機能的ゲノム研
究に対する新規かつ効果的なアプローチに関する。この非ウイルス的な、生殖細
胞系に基づかないin vivo遺伝子送達方法を用いることにより、無傷の生存生物 内の本質的にいずれの遺伝子産物（RNAまたはタンパク質）の未知の機能の同定 も、既知の機能の研究も可能である。生きている動物の初の遺伝子機能の決定に
より、新規な疾病を引き起こすかまたはそれに関連する遺伝子、ならびにそのin
vivoでの導入および発現によりヒトおよび家畜の疾病の治療のための治療的遺 伝子産物を産生するような新規遺伝子を多数同定できる。
【００９７】 本発明以前に、CLDCに基づくin vivo遺伝子送達により、その機能が同定され ていない遺伝子および/またはcDNAの機能活性の同定ができなかった。また、上 記の遺伝子送達は、すでにその限られた機能性が同定されている遺伝子/cDNAの 、新規かつ予想外の機能を同定するためには使用されなった。本発明は、動物内
の遺伝子機能を同定するために、非ウイルス的な送達系を使用することを初めて
可能にした。従って本発明は、動物内の遺伝子機能を同定するための、CLDCに基
づくin vivo遺伝子送達を含む非ウイルス的な遺伝子送達の初の使用について述 べる。この研究において、次のブレイクスルーが必要とされ/成された。
【００９８】 A)送達遺伝子またはcDNAの、動物への直接投与後の生物学的かつ治療上有効な
レベルでの長期間の発現、および免疫応答動物への再注射後の効果的な再発現の
両方をもたらす、新規プラスミドに基づく発現系（図８参照）。
【００９９】 B)腫瘍を有するマウスへのCLDCに基づく遺伝子の送達により、別の、全く無関
係の抗腫瘍機能がすでに同定されている遺伝子の、新規かつ予想外の抗腫瘍機能
の同定を可能になることの初の実証。
【０１００】 C)既知の機能を有する遺伝子/cDNAとともに同時送達される、機能が未知であ る1以上の個々の遺伝子が、ｉ)既知の機能に対して付加的または共働的な活性を
持つかどうか、ii)既知の機能を阻害するかどうか、またはiii）その機能に対し
てなんら影響を及ぼさないかどうか、を決定するため、そして機能測定の増減に
より未知の遺伝子の機能を同定するための、複数の遺伝子のin vivo同時投与。
【０１０１】 D)複数の発現カセットを含み、複数の異なる遺伝子を効率的にかつ同時に、持
続して、生物学的かつ治療上有効なレベルで発現できる、単一の発現プラスミド
。
【０１０２】 本発明に記載のベクターおよび方法を使用することは好ましいが、in vivo に
おける遺伝子機能の評価のため、およびin vivoにおける生物学的、生化学的、 および遺伝学的経路を同定するための、CLDC（または、その他の非ウイルス的な
遺伝子送達方法）の使用について、特に記載したベクターに限られるものとは考
えられない。本発明の教示により、適切に構築された非常に多様なベクターはど
れも、CLDCの形成および送達、宿主前処理などの記載の方法の1以上と組合せて 、機能的ゲノム研究の実施に用いることができる。
【０１０３】 例えば、原理の証拠として本発明は、ヒト顆粒細胞コロニー刺激因子（hG-CSF
）遺伝子の導入および発現によって生じる重要なin vivo表現型である、完全な 好中球増加症（Petros, 1992, Pharmacotherapy,12:32S-38S）が、本発明のベク
ター系を用いて該hG-CSF遺伝子を送達した場合のみ、CLDCに基づくin vivo遺伝 子送達を用いてマウス中で同定できることを示した。p4305を組み込んだCLDCの 使用（以前は技術常識とされた従来のhG-CSF発現プラスミド(Y.Liuら、1997, Na
ture Biotechnology: 15:167-173)）は、注入したマウスにおいて高レベルのhG-
CSF遺伝子発現を一時的にもたらすが、hG-CSFのCLDCの静脈注射後のいずれの時 点における好中球数をも上昇させるほど十分に長期間の発現はもたらさなかった
（下の表2参照）。
【０１０４】 さらに、本発明のEBVに基づく２-プラスミド系を用いて、CLDCの免疫応答動物
への再注射後に送達遺伝子を効率的に再発現させることができる（図３）。した
がって、本発明により、in vivoの表現型を明らかにするために長期間の発現ま たは慢性の発現のいずれかを必要とする遺伝子の同定が可能になる。本発明のEB
Vに基づくベクター系モデルを使用しなければ、マウスへの非ウイルス的遺伝子 送達の後で、かなりの数の遺伝子（hG-CSF遺伝子、その他のCSF、増殖因子など を含む）の表現型を同定することはできないであろう。
【０１０５】C. 遺伝子治療 題目の発明の別の実施形態には、遺伝子治療に有効な本発明の方法および組成
物の使用が含まれる。このような遺伝子治療は、傷ついた個体のゲノムの欠失を
補うことを意図し、ex vivo体細胞遺伝子治療よって達成される。ex vivo体細胞
遺伝子治療とは、宿主細胞を体内から取り出して欠失遺伝子を発現するように形
質導入し、宿主に再導入するものである。また、体細胞遺伝子治療は、所望の遺
伝子を担持するベクターをin vivoで個体に直接注入することによって達成され 、遺伝子は宿主組織によって送達および発現される。本発明の例においては、ベ
クターは好ましくは細胞保持活性および/または核保持活性をコードするポリヌ クレオチド配列と実質的に同時に標的細胞に導入する。
【０１０６】 本発明のポリヌクレオチド複合体を、様々な確立された方法のいずれかによっ
て、in vivoで導入することができる。例えば、吸入により、皮下注射（sub-q）
、静脈注射（I.V.)、腹腔内注射（I.P.)、頭蓋内注射、心室内注射、鞘内注射、
または筋肉内注射（I.M.）によって、直腸に、局所的に作用させる薬剤（皮膚用
のパッチ、傷薬、クリーム、軟膏、目薬、およびこれと同種のもの）として、ま
たは腫瘍もしくは他の器官などの組織に、または内蔵の中もしくは周囲に直接注
射することによって投与できる。
【０１０７】 本発明の方法および組成物は、正常細胞および癌細胞双方への遺伝子送達に適
しているため、本発明のさらなる実施形態は、開示した方法を使用して、抗癌剤
をコードする遺伝子を患者に送達することである。例えば、免疫作用薬、癌抑制
遺伝子、または癌細胞の増殖、局所性の伸張、転移性拡散を阻害する遺伝子を、
腫瘍細胞およびその他の標的細胞、例えばこれらに限定するものではないが、欠
陥内皮細胞および免疫作用および調節細胞などに送達でき、これらはその後腫瘍
障害性の遺伝子を発現する。このような遺伝子の個々の例として、これらに限定
するものではないが、アンギオスタチン、p53、GM-CSF、IL-2、G−CSF、BRCA1、
BRCA2、RAD51、エンドスタチン（O'Reillyら、1997, Cell,88（2）:277-285）、
TIMP1、TIMP-2、Bcl-2、およびBAXが挙げられる。さらに、同様の方法を使用し て、Dranoffら出願の米国特許第5,637,483号（参照により、本明細書に組み入れ
る）に記載のものに類似の癌ワクチンを作製することができる。上記の観点から
、本発明の方法および組成物は、癌の治療にも有用である。本発明の方法によっ
て予防または治療できる癌としては、これらに限定するものではないが、心臓、
肺、胃腸、尿生殖器管、肝臓、骨、神経系、婦人科系、血液、皮膚、および副腎
の癌がある。本発明のベクターおよび方法は、このような癌が生じてくる正常組
織の治療的または予防的処置にも適している。
【０１０８】 当業者であれば、開業医のまたは患者の観点から、好ましくない症状（例えば
、疾患に関連する症状、環境因子への感受性、通常の老化、およびこれらに同種
のもの）の緩和または予防は、本質的にいかなるものでも望まれるであろうこと
を認識するであろう。したがって、この出願の目的においては、本明細書で使用
する用語「治療」、「処置」、「予防的処置」、「治療的使用」または「医療上
の使用」は、疾病状態または症状を治療するか、さもなくば疾病またはその他の
どんな形であれ全く好ましくない症状の進行を予防、阻害、遅延または後退させ
る、請求項に記載の組成物のいずれかまたはすべての使用をいう。
【０１０９】 疾病の治療的または予防的処置に使用するとき、ポリヌクレオチド送達複合体
またはその誘導体の適切な用量は、いくつかの十分に確立された方法のうちのい
ずれかによって決定できる。例えば、通常、動物実験を用いて、体重１kgあたり
の生物活性薬剤の最大耐用用量（またはＭＴＤ）を決定する。一般的に、試験す
る動物種の内の少なくとも一種は哺乳動物である。当業者は、ヒトを含む他の種
にとって効果的かつ毒性のない用量を規則的に推測する。ヒトにおける効果の調
査を実施する前には、正常な被検体のフェーズ1臨床調査が、安全な用量の確立 に役立つ。
【０１１０】ｄ． 遺伝子送達における宿主特異的因子 in vivo遺伝子送達実験は、所与の種の株によって、遺伝子の導入および発現 の効率が広範な多様性を示し得ることを立証した。例えば、本発明の開示は、Sw
iss WebsterマウスがICRマウスと比べて異なる発現レベルを示すことを立証する
、非ウイルス性遺伝子送達実験について記載する。同様に、本発明の開示は、FV
Bマウスが有意に異なる遺伝子送達効率を示すことを明らかにする。つまり、宿 主の生理が、遺伝子送達の効率において明らかに重要な役割を果たし得る。
【０１１１】 このように、本発明の別の態様は、遺伝子送達の前、同時、後の患者の薬剤によ
る処置を含めたin vivo遺伝子送達の方法である。このような薬剤の一例として デキサメタゾンがある。付加的な薬剤として、これらに限定するものではないが
、コルチコステロイドまたはカチオン性リポソーム製剤：デキストラン40、乳酸
化リンガー、アルブミン、硫酸プロタミン、および/または血清を含む希釈液中 のDNA複合体、およびその他同種のものが含まれる。
【０１１２】 本発明の研究は、脂質/ポリヌクレオチド複合体のカチオン性の部分は、膜結 合プロテオグリカンに結合すること、およびプロテオグリカンがin vivoにおけ るカチオン性の脂質介在遺伝子送達にとって重要であることを示す。従って、細
胞表面に存在するプロテオグリカンのレベルを調節することによって、遺伝子送
達を調節できる。
【０１１３】 さらに、膜結合プロテオグリカンがカチオン性ビヒクルポリヌクレオチド複合
体すべての細胞内取り込みに関与したとき、細胞表面プロテオグリカンに結合し
得るリガンドを取り込むポリヌクレオチド複合体は増強された遺伝子導入効率を
示し得る。あるいは、プロテオグリカンのCLDC結合と競合するフコイダンまたは
ヘパリンのような化合物を患者に投与して、脂質/ポリヌクレオチド複合体によ って遺伝子送達のタイミングまたは効率を調節することができる。
【０１１４】 以下の実施例は、対象となる発明を説明するために提供する。当業者の技術常
識より、上記または以下の記載のいずれかを本発明で特に記載した特性に本質的
な違いを生じさせることなく改変することが期待できる。本発明は、次の実施例
に詳細に記載するが、発明の範囲を限定するものではない。
【０１１５】実施例 6. 実施例：脂質/ポリヌクレオチド複合体の構築 a. 試薬 試薬グレードDOTIMはTim Heath博士より、コレステロールはCalbiochemより入
手した。特に、in vivoでの使用が想定される場合には、全ての試薬は、入手し 得る最高の純度、好ましくは医薬品グレードまたはそれより上のものとされるで
あろう。
【０１１６】 b. ベクター構築 プラスミドp4331は、EBNA-1 cDNAを含むp630（MiddletonおよびSugden, 1992, J. Virol 66:489-495.）のHindIII+AccI DNA断片を、HCMV-CAT, p4119（Liuら 、1995、上記）のHindIII-AccI部位中にライゲーションすることによって構築し
た。プラスミド4395は、p630のHindIII+AccI DNA断片を単離し、P.Felgner博士 及びR.Zaugg博士から恵与されたVR1255（Hartikkaら、1996, Hum. Gene Ther. 7
:1205-1217）のEcoRV+BamHI部位に平滑末端化ライゲーションにより挿入して構 築した。プラスミド4329は、p985（Middletonら、 1992、上記）をBamHI、続い てKpnIで部分消化し、次いでルシフェラーゼcDNAに連結されたTKプロモーターの
上流のリピート配列のファミリーを含む約3kbのDNA断片を、p4119（Liuら、1997
、上記）のBamHI-KpnI部位へライゲーションすることにより構築した。プラスミ
ドp4379は、p985（Middletonら、 1992、上記）をBamHIで消化し、続いてFRを含
む約0.9 kbのDNA断片を単離し、それをVR1225（Harttika, 1996）のBamHI部位（
ルシフェラーゼcDNAに対し3’側）中にライゲーションして構築した。
【０１１７】 プラスミドp4402, CMV-hG-CSF-FRは、FRを含む0.9kbpのp985由来のBamHI DNA 断片を、Vical由来のVR1223(Hartikkaら、1996, Hum. Gene Ther. 7:1205-1217)
の部位にまず挿入し、続いてVR1223由来の約1.7 kbpのPstI-XbaIルシフェラーゼ
cDNAを、p4195（Liuら、1994、上記）由来の650bpのヒトG-CSF cDNAを含むHindI
II-SalI断片で、平滑末端化ライゲーションによって置換して構築した。p4195、
HCMV-IE1-ヒト G-CSF発現プラスミド（Liuら、1995、上記）、oriP-BamHI-Luc(p
1033)、oriP-minus(p1381)、競合（competitor）DNA(p1380)(KirchmaierおよびS
ugden, 1997, J. Virol. 71:1766-1775)およびHCMV-luc-AAV-ITR(Philip, 1994)
の構築は以前に報告されている。プラスミドはアルカリ溶解および酢酸アンモニ
ウム沈殿を使用して以前に記述されたように精製した（Liuら、1995、上記）。
【０１１８】 c. 脂質/ポリヌクレオチド複合体の製剤方法 カチオン性脂質1-[2-(9(Z)-オクタデセノイルオキシ)エチル]-2-(8(Z)-ヘプタ
デセニル)-3-(2-ヒドロキシエチル)-イミダゾリニウムクロライド（DOTIM）を、
以前に記述された通りに合成し（Solodin, 1995）、コレステロールはSigma(St.
Louis, MO)から購入した。DOTIM：コレステロールの多重膜リポソームを、1:1の
モル比で、本質的に以前に記述された通りに調製した（Liuら、1997、上記）。
【０１１９】 d. in vitroでの遺伝子送達 上記のベクター及び方法を用いて形成された遺伝子送達複合体は、標的細胞初
代培養物、細胞二次培養物、胚幹細胞培養物、細胞系、形質転換された細胞系、
腫瘍細胞系等に添加できる。典型的には、遺伝子送達複合体は、約２μｇのポリ
ヌクレオチド：約100,000〜約500,000細胞という、ベクターポリヌクレオチド：
標的細胞比率で添加される。この遺伝子送達複合体は、典型的には、細胞培養培
地へ添加し、約30分〜無限に保温できる。
【０１２０】 e. in vivoでの遺伝子送達 4匹ずつの群の個々のマウスに、全体で60μｇのDNAについて各プラスミド30μ
ｇから調製されたCLDCを静脈内注射した。注射に先立って、2種類のDNAを混合し
、続いて以前に記述された通りに、1μｇDNA：16nmol総脂質というプラスミドDN
A：カチオン性リポソーム比で、5% w/vグルコース中のカチオン性リポソームに 対して複合体化した（Liuら、1995、上記）。CLDCは尾静脈へ、1匹のマウス当た
り総容量200μｌで注射した。CLDCのi.v.注射に続く24時間〜15週間に、マウス 群をCO2に曝露させて犠牲にし、心臓穿刺によって採血し、組織を切開し、ルシ フェラーゼ活性（Liuら、1997、上記）またはhG-CSFタンパク質レベル（Liuら、
1995、上記）を、以前の記述の通りに測定した。総白血球計数を、Unopette白血
球試験システム（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）に希釈したEDTA抗凝
固血を使用し、血球計により測定した。分類計数（differential count）を、Di
ff-Quik（Scientific Products, McGaw Park, IL）で染色した血液スミアを使用
し、実験計画を知らされない個体により実行した。これらの研究の結果を図１〜
３に示す。
【０１２１】 遺伝子発現の持続時間は、EBV-FR DNA配列に加えてルシフェラーゼまたはhG-C
SF cDNAのいずれかを含む発現プラスミドを含むCLDCのi.v.同時注射の後に測定 した。このプラスミドは二回対称（DS）のEBV領域を含まず、そしてそれ故にイ ンタクトのoriPを欠失しており、細胞内で複製できない（すなわち複製欠損性で
ある）。このプラスミドを、一過性でEBNA-1遺伝子を発現させEBV-FR配列を欠失
している発現プラスミドとともに同時送達させた。それらがマウス中で複製でき
ないにもかかわらず、そしてEBNA-1遺伝子が一過性のみでの発現であるにもかか
わらず、このベクター系は、CLDCに基づく一回のi.v.同時注射に続いて、少なく
とも14週間にわたって顕著なレベルのルシフェラーゼ活性を、並びに少なくとも
2ヶ月にわたって治療に有効なhG-CSFタンパク質の血清レベルを産生した。さら には、マウスにおいて免疫原性である遺伝子産物の長期間発現をもたらすにもか
かわらず、ルシフェラーゼ遺伝子及びhG-CSF遺伝子の双方とも、これらのEBVを ベースとするベクターを含むCLDCの反復i.v.同時注射に続いて、免疫応答性のマ
ウスにおいて再発現され得る。
【０１２２】 以前、AAV-ITR配列をプラスミドベクター中に挿入することにより、培養細胞 （Philip, MCB）中で遺伝子発現が有意に長期化されたことが報告されている。 しかしながら、HCMV-luc-AAV-ITRプラスミドをAAV-rep遺伝子を発現するHCMVプ ラスミドとともに同時注射すると、HCMV-luc-AAV-ITRプラスHCMV-CATと比べた場
合ルシフェラーゼの発現を延長しなかった。これらの結果は、EBNA-1の存在はマ
ウス肺におけるFRを含むプラスミドからのルシフェラーゼの発現を、EBNA-1の非
存在下またはAAV-ITRをベースとしたベクターの場合と比較して延長することを 示している。全ての実験において、FR含有プラスミドとEBNA-1発現プラスミドと
の組み合わせを受容しなかったマウスは、注射後14日目またはそれ以降に、バッ
クグラウンドを有意に超える組織ルシフェラーゼ活性を示さなかった。
【０１２３】 免疫応答性ICRマウスまたはSCIDマウスのいずれかにおいて産生されたルシフ ェラーゼ活性のレベルを、p4329、HCMV-ルシフェラーゼ-FRおよびp4331、HCMV-E
BNA-1を含むCLDCのi.v.注射に続く24時間、6週間および14週間で比較した。FRの
不在下でのEBNA-1の効果を試験するために、HCMV-EBNA-1およびp4241、FRを欠失
したHCMV-lucを受容したICRマウス中でルシフェラーゼ活性を測定した。肺組織 および心臓組織におけるルシフェラーゼの量は、注射して24時間後に犠牲にした
免疫応答性マウスおよびSCIDマウスにおいては同程度であったが、i.v.同時注射
後6週間で犠牲にしたSCIDマウスにおけるルシフェラーゼ活性は、免疫応答性ICR
マウスと比較して有意に高いものであった（p<0.025）。SCIDマウスの肺組織に おけるルシフェラーゼの量は、一度のi.v.注射後14週では、同じEBVベースのプ ラスミドで処理されたICRマウス（p<0.01）または処理されていない対照マウス （p<0.005）と比較して有意に高いまま維持されていた。これらの結果は、EBNA-
1はHCMV-lucの発現をFRの不在下では延長させないことを示しており、このこと は、EBNA-1が、FR含有プラスミドを細胞内で維持する能力を介して機能していて
（Middletonら、1994、上記）、HCMVプロモータによる発現への影響よりもその 方が大であるという解釈と一致している。しかしながら、24時間目に産生された
ルシフェラーゼのピークレベルは、FRを含むかまたは含まないHCMV-lucプラスミ
ドを受容したマウスにおいても同程度である。このことは、FRは、マウスにおい
てEBNA-1の存在下では、転写エンハンサーとしては機能しないことを示唆してお
り、それは培養細胞を用いたin vitroでの研究によって予測されている通りであ
る。
【０１２４】 HCMV-luc-FRとHCMV-ENBA-1とを受容したSCIDマウスおよびICRマウスの双方に おいて、ルシフェラーゼのレベルは、24時間では同程度であったが、注射後6週 および14週ではSCIDマウスにおいて有意に高かったことは、ルシフェラーゼ遺伝
子産物に対する免疫応答が、免疫応答性ICRマウスにおいて産生されたルシフェ ラーゼ遺伝子発現の持続時間を限定し得ることを示唆している。ルシフェラーゼ
並びに他のレポーター遺伝子産物に対する宿主免疫応答が、以前に報告されてい
る（Mittalら、1993, Virus Res., 28:67, Michou, 1997, Gene Ther., 4:473-4
82）。
【０１２５】 このような免疫応答が、それに続く治療を有意に妨害するかどうかを評価する
ために、p4379、HCMV-ルシフェラーゼ-FR、それとともにp4331, HCMV-EBNA-1を 第二のi.v.注射として、同じCLDCで31日前にトランスフェクトされた同じICRマ ウスに投与した。これらのEBVベースのプラスミドのi.v.再注射により、ルシフ ェラーゼの効率的な再発現がもたらされた（図３ａおよび３ｂ）。事実、31日目
の第二のCLDC注射の一日後に観察されたルシフェラーゼのレベルは、一度のCLDC
注射後の31日目に犠牲とされたマウスにおいて見られたものより100倍を超えて 高く、24時間前にEBVベースのプラスミドを含むCLDCを、一度のi.v.注射で受容 したマウスにおいて産生されたピークルシフェラーゼレベルと有意な差はなかっ
た（３ａ）。これらの結果は、EBVベースの、長期発現プラスミドからのタンパ ク質の発現は、同じCLDCを再度注射することによって再度実現され得ることを示
唆している。この結果は、以前の、非EBVベースのプラスミドのCLDC媒介性送達 を用いたi.v.再注射の研究と一致するものである（Liuら、1995、上記）。例え ば、p4395、HCMV-EBNA-1ベクターの複数回の再注射はCLDCに基づくIV遺伝子送達
の効能を減少させない。このことは、現在記述したEBVベースのシステムが、非 常に延長された期間にわたり、完全に免疫応答性である宿主中で、送達された遺
伝子を継続的に再発現させ得ることを示すものである。これらの実験において、
プラスミドp4379(HCMV-ルシフェラーゼ-FR)、p4395、HCMV-EBNA-1およびp4119お
よび/またはHCMV-CATは、1:1のモル比（DNA:脂質比＝1:16（μｇプラスミドDNA
対 nmol全脂質））でDOTIM:コレステロールMLV中へ製剤化され、そして動物（25
ｇICRメスマウス、Simonsen Labs, Gilroy, CA）一匹あたり200μｌの5%デキス トロース水溶液(D5W)中40μｇプラスミドDNAを、尾静脈経由で注射した。3週間 の間隔を置いて二度、20μｇのCMV-CATと20μｇのCMV-EBNA-1を含むCLDC注射を 受けたあるマウス群は、続いて20μｇのCMV-ルシフェラーゼ-FRと20μｇのCMV-E
BNA-1の注射を3週間後に受け、最後の注射の3週間後に犠牲とされた。最初の二 度の注射についてはCMV-CATをCMV-EBNA-1とともに同時注射し、指示分子（ルシ フェラーゼ）に対する免疫応答の誘導を予防した。第二群のマウスは、20μｇの
CMV-EBNA-1と20μｇのCMV-ルシフェラーゼ-FRを含む一度のCLDC注射を受け、3週
間後に犠牲とされた。第三群のマウスは20μｇのCMV-CATと20μｇのCMV-ルシフ ェラーゼ-FRを含む一用量のCLDC注射を受容し、3週間後に犠牲とされた。第四群
は未処理のまま残された（対照）。全てのマウスはCO2チャンバー中で犠牲とさ れ、肺、心臓、脾臓および肝臓を回収し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイ
した。相対光単位（relative light unit）をルシフェラーゼ活性に換算し、さ らにスチューデントのt検定を、前記のグループの間の潜在的な差異を統計的に 分析するために、独立的に、両側検定にて適用した（Liuら、NatBioT, 1997）。
【０１２６】 一用量のCMV-EBNA-1、または全部で三用量のCMV-EBNA-1のいずれかを受容した
マウス群におけるルシフェラーゼ活性のレベルは類似しており、有意な差はなか
った（p<4）（図３ｂを参照）。この2群のマウスにおけるルシフェラーゼ活性は
、CMV-ルシフェラーゼ-FRをCMV-CATと同時注射された群のマウスと比較して有意
に高かった。このことは、CMV-EBNA-1プラスミドは、同時注射されたCMV-ルシフ
ェラーゼ-FRの長期発現を、それ以前の6週間にわたり二度のCMV-EBNA-1前注射を
受容したマウスにおいてすらまだ媒介可能であったことを示している。このよう
に、CMV-EBNA-1プラスミドを完全免疫応答性マウスに繰り返し注射することは、
続いてCMV-EBNA-1と同時注射されるCMV-ルシフェラーゼ-FRプラスミドの長期発 現を減少させなかった。このことは、CMV-EBNA-1を繰り返し注射されたマウス中
でのEBNA-1に対する免疫応答が存在するとは思われないことを示し、本発明に記
載されたEBVベースのシステムが、宿主の生涯にわたって顕著なレベルでの遺伝 子導入および発現をもたらし得ることを示唆している。
【０１２７】 図３ａおよび３ｂに示されているデータは、ウイルスまたは他の本質的に抗原
性/免疫原性である遺伝子送達媒体とは異なり、本発明に記載されたCLDCは、送 達された遺伝子の発現に不当に影響する遺伝子送達媒体に対する宿主の免疫応答
に対する不安が少なく、繰り返し使用して遺伝子送達を実行することができるこ
とを示唆している。
【０１２８】 以前の研究では、oriP含有プラスミドは、げっ歯類細胞系ではEBNA-1の存在下
では複製しないことが示されている。インタクトのoriPを含むEBVベースのプラ スミドが初期マウス肺組織中において複製可能かどうかを決定するため、マウス
に、oriP-BamHI C-Luc、oriP-minus及びp4331、HCMV-EBNA-1またはp4241(HCMV-l
uc)のいずれかをi.v.で各々20ｍｇ注射した。14日後、マウスを犠牲にし、低分 子DNAを肺組織から単離した。表1のデータはoriP-BamHI C-LucおよびoriP-minus
DNAの双方が、i.v.注射の14日後にマウス肺中に存在することを示しているが、
EBNA-1の存在下または不在下のいずれにおいても、プラスミドはどちらも検出可
能である程度には複製されていなかった。これとは対照的に、ヒトPPC-1細胞に おいては、EBNA-1の存在下では、oriP-BamHI C-Lucは効率的に複製されていた（
表１）。しかしながら、oriP-BamHI C-Lucは、EBNA-1の不在下では、PPC-1細胞 のトランスフェクション後96時間で検出可能な程度に複製されてはいなかった（
表１）。これらの結果は、インタクトのoriPを含むEBVベースのプラスミドは、E
BNA-1の存在下または不在下で、初期マウス組織中で検出可能な程度には複製し ないことを示唆している。以前、BKVをベースとした発現プラスミドが、マウス へのCLDCに基づくi.v.注射の後2週間でマウス肺にて複製することが示されてお り（Thierry, 1995, Proc, Natl. Acad. Sci., USA, 92:9742-9746）、このよう
な複製が好適な配列が存在する場合には可能であることが示される。
【０１２９】 EBNA-1タンパク質が存在することにより、oriP-FR含有プラスミドが細胞内に 入った直後に核侵入（nuclear entry）／核送達をすることが容易になることが 考えられるため、HCMV-ルシフェラーゼプラスoriP-FRをHCMV-EBNA-1とともにi.v
.で同時注射し、HCMV-ルシフェラーゼプラスoriP-FRを注射する6、24または48時
間前にHCMV-EBNA-1を前注射したものと比較した。CLDCのi.v.注射の2週間後に行
った測定により、2つのプラスミドの同時注射のみが、バックグラウンドを有意 に超える組織ルシフェラーゼ活性レベルをもたらすことが示された。このことは
、最初のi.v.注射に続く最初の数日間におけるCLDCのi.v.再注射により、マウス
を効率的に再トランスフェクトすることが一時的にできなくなるためと思われた
。
【０１３０】 表１ oriPベースのベクターは、EBNA-1の存在下では初期マウス組織中で検出
可能な程度に増殖されない。
【０１３１】
【表１】 aデータは、1×105細胞あたりのプラスミドDNA分子を示す。データは、肺組織
のトランスフェクション効率またはPPC1細胞系のトランスフェクション効率に関
して補正されていない。
【０１３２】 b検出される競合DNAの最低量未満。
【０１３３】 c試験せず。
【０１３４】 f. hG-CSF遺伝子を含むCLDCのi.v.注射に続くヒトG-CSFタンパク質の循環レ ベル EBVベースの2つのプラスミド系（FRを含むが二回対称領域を欠失している）も
また使用して、生物学的に関連するhG-CSF遺伝子の延長された発現、および、免
疫応答性マウスにおける第二の注射に続くhG-CSFの再発現の双方を実証した。hG
-CSFのマウス血清におけるレベルを、p4402またはp4195、それぞれFRを有するか
または有さないHCMV-hG-CSFのいずれかをp4395、HCMV-EBNA-1プラスミドととも に含むCLDCのi.v.注射に続いて、ELISAによって測定した。表2に示す通り、hG-C
SF発現プラスミドプラスFRで注射されたICRマウスは、注射後1、14、31および62
日で、それぞれ4,861±2,606、636±45、457±86および187±74ｐｇ／ｍｌのhG-
CSFをマウス血清中に発現した。これと対照的に、FRを欠失しているhG-CSFベク タープラスHCMV-1-EBNAで注射されたマウスは、1日目に血清中に5,274±3,333ｐ
ｇ／ｍｌのhG-CSFタンパク質を発現したが、注射に続いての3日目および７日目 には、hG-CSFのレベルは検出できなかった（25ｐｇ／ｍｌを下回る）（表２）。
【０１３５】 表２．EBVベースのプラスミドベクターを含むCLDCのiv注射によるhG-CSF遺伝子 送達に続いて、延長された期間にわたりICRマウスの血清中に顕著なレベルのヒ トG-CSFタンパク質が維持されている。
【０１３６】
【表２】 a30μｇの示されたベクターと30μｇのHCMV-EBNA-1を含むCLDCを、4匹のICRマウ
スの群に0日目にiv注射した。マウスは示された日に犠牲にされ、採血された。
【０１３７】b hG-CSFの血清レベルはELISAにより測定した（Liu,JBC）。データは、ベクター 及び各時点につき4匹のマウスの平均±S.E.M.である。
【０１３８】c ４匹のマウスよりなる群に、「a」で記載したように、それらの最初のhG-CSFベ
クターの投与後31日目または62日目に再注射し、第二の注射から24時間後に犠牲
にした。
【０１３９】d 両側検定型のスチューデントのt検定によって対照マウスと比較した場合にp<0.
05であった。
【０１４０】e 同時に注射され再投与されなかったマウスと比較した場合にp<0.05であった。
【０１４１】f 各パーセントは、絶対好中球計数（Absolute neutrophil counts; ANC）に関し
て増加し、またはバンド計数対非処理対照は、477±55および2.0±1.1、p<0.005
であった。
【０１４２】g 各パーセントは、絶対好中球計数（ANC）に関して増加し、またはバンド計数対
非処理対照は、457±86および3.0±2.0、p<0.005であった。
【０１４３】 以前、100ｐｇ／ｍｌを超えるhG-CSFの持続的血清レベルによって、げっ歯類 において好中球計数が有意に増加することが示されている（21）（Koeberl, 199
7）。故に、好中球のパーセンテージ及び全血のｍｌあたりの好中球の絶対数の 双方を、CMV-hG-CSF-FRまたはCMV-luc-FRのいずれかプラスCMV-EBNA-1を含むCLD
Cを8週間前に一度i.v.注射したマウス、並びに処理されていないマウスにおいて
測定した。CMV-luc-FRプラスCMV-EBNA-1を受容したマウスまたは非処理マウスは
、バンド（未成熟好中球）型が完全に不在な状態で9.4±1.3%または8.9±1.3%の
好中球、および血液mm3あたり551±90または673±58の絶対好中球計数をそれぞ れ示し、一方、CMV-hG-CSF-FRプラスCMV-EBNA-1を受容したマウスは、1%のバン ド型とともに24.0±2.5%の好中球、および血液mm3あたり2,805±488の絶対好中 球計数をそれぞれ示した（p<0.005、CMV-luc-FR処理マウスまたは非処理マウス に対して、好中球のパーセンテージおよび絶対数の両方に関して。表2）。CMV-h
G-CSF-FRプラスCMV-EBNA-1を一度i.v.注射した後2週間で犠牲とされたマウスま たは非処理マウスは、ルシフェラーゼを注射されたかまたは注射されなかったマ
ウスに対して、好中球のパーセンテージおよび絶対数の両方に関して同程度の上
昇を示した（両方ともp<0.005）。このことは、この効果は8週間の期間にわたっ
て持続したことを示している。総合すると、これらの結果は、生物学的に意義の
あるレベルのhG-CSFが、マウスにおいてはEBVベースのベクターから延長された 期間にわたって発現され得ることを示唆している。さらに、先行する2ヶ月にわ たってhG-CSFを治療上適切なレベルで発現していたICRマウス中にHCMV-hG-CSF-F
RをHMCV-EBNA-1とともに二度目に注射した24時間後には、hG-CSFのレベルは有意
に増加（p<0.05）した（表2）。
【０１４４】 上記のデータは、非複製EBVベースの2つのプラスミド系は、FR含有プラスミド
の細胞内保持の増加（Middletonら、1994、上記）およびそれらの核マトリック スへの結合の媒介（Jankelvich, 1992）の双方を、小胞内皮細胞（正常な成体で
は大部分は分裂しない細胞型、Denekamp, 1982, Bicknell, 1992）を選択的に標
的として遺伝子発現させるCLDCに基づくi.v.遺伝子送達（Liuら、1997、上記） により実現できることを示している。このCLDCに基づくこれらのEBVプラスミド の送達は、遺伝子発現の持続期間を有意に延長し、潜在的に免疫原性であるタン
パク質をコードする遺伝子の再発現（Bonham, 1996）を免疫応答性マウスで可能
とする。この方法はEBNA-1をウイルスDNA結合タンパク質として利用する。EBNA-
1についてトランスジェニックであるマウスがB細胞腫瘍を増殖させることが報告
されているが（Wilson, 1996）、EBNA-1それ自体はEBVウイルスの状況から一次B
リンパ球をin vitroで不死化するには不十分であり、付加的に潜在性（latent）
ウイルスタンパク質EBNA2（Hammerschmidt, 1989, Cohen, 1989, Marchini, 199
2）、EBNA3A（Tomkinson, 1993）、EBNA3C（Tomkinson, 1993）およびLMP-1（Ka
ye, 1993）の存在を必要とする。
【０１４５】 BKVベースの、またはSV40ベースの、ラージT抗原の発現の進行を利用する複製
ベクター（Thierry, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 92:9742-9746, Coope
r, 1997）とは異なり、EBNA-1遺伝子はFRを欠失したプラスミドから発現され、 それ故に一過性でのみEBNA-1を発現する。EBNA-1の形質転換の可能性（potentia
l）を最小とするために設計されたこのアプローチにもかかわらず、EBNA-1は同 時注射されたFR含有プラスミドによってコードされた遺伝子の持続的発現を媒介
可能であった。このように、このEBVをベースとした２プラスミドシステムは、 ヒト遺伝子治療に必要である、唯一の利用し得る長期発現（３日間超）プラスミ
ドベクターシステムなのである。
【０１４６】 別の考慮すべきこととは、in vitroでの研究は、典型的には急速に分裂してい
る形質転換された細胞を使用して行われるが、その一方でin vivoでの用途は、 典型的には細胞分裂速度が遥かに遅い（すなわち、実質的に複製していない）細
胞に関与している。そのようなことを考慮すると、なぜin vivoでのCRAの一過性
発現が長期発現を可能とする一方、in vitroでは同様の結果が見られないのかを
部分的に説明し得るであろう。
【０１４７】 このことはまた、EBNA-1特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答を制限する能
力（抗原のプロセシングとMHCクラスI制限提示を妨害するcis作用性阻害シグナ ルを発生させる、EBNA-1内部のGly-Alaリピートにより媒介される）によっても 部分的に説明される（Levitskaya, 1995, Khanna, 1992, 1995, Murray, 1992）
。EBNA-1特異的CTLの発生を制限する能力はまた、これらの遺伝子をEBNA-1発現 プラスミドとともに反復注射した後に、ルシフェラーゼまたはhG-CSFのいずれか
で免疫応答性マウスを再トランスフェクトするという本システムが示した能力に
も貢献し得るであろう。
【０１４８】 EBVをベースとするプラスミドの使用は、嚢胞性繊維症、血友病等の遺伝的遺 伝子疾患治療のために特に適切であることが証明されるが、というのもそれらの
疾患は、遺伝子導入ベクターが、一度の投与に続き、導入遺伝子を治療的レベル
で延長された期間にわたって発現しなくてはならず、そして、次いで行われる規
則的な間隔での患者の生涯にわたる投与に続いて、その遺伝子の延長された発現
を効果的に維持しなくてはならないことを要するからである。（Knowles, 1995
Sorscher, 1994, Caplen, 1995, Hyde, 1993, Alton, 1993, Zabner, 1993, Sny
der, 1997, Kay, 1993）。FRを含有するがインタクトのoriPを欠失するEBVをベ ースとしたプラスミドは、in vivoでの非複製細胞を標的とした持続的遺伝子発 現を可能とする。さらに、注射されたマウスで観察された延長された遺伝子発現
（ここでEBVベクターは複製しない）が、霊長類においてさらに増幅可能であり 、ここで、インタクトoriPを含むEBVをベースとするプラスミドを取り込む複製 中の細胞の画分がプラスミドを増幅することは非常に可能性が高いと考えられる
。
【０１４９】 同時注射研究により、EBV FR DNA配列が相同性イントロンとルシフェラーゼcD
NAとの間に挿入されたHCMV-ルシフェラーゼ発現プラスミドが、EBV DNA配列を欠
失したベクターと比較して5〜10倍低いルシフェラーゼ活性のピークをもたらす こともまた明らかとなった。この位置に配置されたEBV DNA配列は推定的には遺 伝子発現を妨害しているのであろう；しかしながら、この効果は明らかにベクタ
ー特異的である。引き続いての研究により、コード配列の下流へのEBV配列の配 置によって、EBV配列を欠失している親ベクターのルシフェラーゼ遺伝子発現ピ ークレベルに匹敵し、イントロンの3’側にEBV配列を含むベクターよりも有意に
高いピークレベルを産生するベクターがもたらされることが示された。実際に、
より効果的なこのHCMV-ルシフェラーゼプラスFRベクターを用いた一度のi.v.CLD
Cに基づく同時注射により、免疫応答性ICRマウスの肺及び心臓の双方において、
少なくとも12週間にわたりルシフェラーゼ活性が有意に増加した。
【０１５０】7. 実施例：異なる希釈剤中でのCLDCの製剤化 以下に詳述する実施例によって示される通り、DNA及びカチオン性リポソーム が複合体化される希釈剤を変化させると、CDLCベースのIV遺伝子送達の効率を顕
著に増加させることができる。
【０１５１】 プラスミド：p4241(HCMV-ルシフェラーゼ) リポソーム：DOTIM:chol MLV（1:1のモル比） DNA:リポソームの比：リポソーム：プラスミド=1:16（μｇプラスミドDNA対nm
ol総脂質） CLDCの調製：CLDCは、4種類の異なった希釈剤中に製剤化された：製剤A、B、C
、D。製剤Aは以下のように調製した：40μｇのプラスミドDNA、および640nmolの
ローダミン標識化DOTIM:chol MLVをそれぞれ100μｌのD5W中に希釈し、続いて以
前に記載されたようにともに混合した（Liuら、JBC, 1995）。製剤Bについては 、プラスミドDNAをデキストラン40および乳酸加リンガーを9:1の比率で含む溶液
中に希釈し、カチオン性リポソームは純粋な乳酸加リンガー中に希釈した。製剤
Cは、プラスミドDNAを、デキストラン40および乳酸加リンガーの9:1混合物の代 わりに胎児ウシ血清（Gibco）中に希釈したことを除いては製剤Bと同様である。
製剤Dについては、プラスミドDNAは70μｌの胎児ウシ血清中に、リポソームは70
μｌのD5W中に希釈した。DNAとリポソームをともに混合した後で、60μｌの乳酸
加リンガー溶液をCLDCへ添加し、混合するために穏やかに二度ピペッッティング
した。
【０１５２】 DNA用量：マウス1匹あたり、200μｌの製剤A、B、CまたはD中40μｇのプラス ミドDNAを尾静脈に注射した。
【０１５３】 動物：ICRマウス：メス、25ｇ ルシフェラーゼの定量：CLDCの注射の24時間後、マウスをCO2チャンバー中で 犠牲にし、肺、心臓、脾臓および肝臓を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイ
した。相対光単位をルシフェラーゼ活性に換算し、以前に記述された通り（Liu ら、1997）、統計的分析のために、スチューデントのt検定を独立的に両側検定 にて適用した。
【０１５４】 結果：上記の製剤B、C、DのいずれかのCLDC調製物は、D5W中に調製したCLDCを
IV注射したマウスにおいて生じたルシフェラーゼ活性と比較した場合に、有意に
ルシフェラーゼを増加させた（図４）。このように、DNAおよびカチオン性リポ ソームを希釈する物質を選択的に変化させることにより、続いてCLDCを注射され
る動物において生ずる遺伝子発現のレベルを有意に増加させることができる。こ
れらの希釈剤によってもたらされる遺伝子発現の促進レベルは、Swiss Webster
マウス（低発現体）においては、ICRマウス（高発現体）と比較して、有意に高 かった。このことは、そのような操作が、D5Wまたはその他の標準的な希釈剤中 のCLDCを静脈内注射した後に続き低レベルの遺伝子発現を示す個体において特に
有用であり得ることを示している。
【０１５５】8. 実施例：in vivo遺伝子送達における種変異性 この実施例は、CLDCが静脈内注射されるマウス系統が、遺伝子送達および発現
の効率の決定において重要な役割を果たすことを示すものである。
【０１５６】 プラスミド：p4241(HCMV-ルシフェラーゼ) リポソーム：DOTIM:chol MLV（1:1のモル比） DNA:リポソームの比：リポソーム：プラスミド=1:16（μｇプラスミドDNA対nm
ol総脂質） DNA用量：マウス1匹あたり、200μｌの5%デキストロース水溶液（D5W）中40μ
ｇのプラスミドDNAを尾静脈に注射した。
【０１５７】 動物：この実験においては、3種類の異なるマウス系統を、CLDCに基づくIV遺 伝子送達後のルシフェラーゼ遺伝子発現、ローダミン標識化リポソーム分布およ
び組織からのルシフェラーゼDNA回収（サザン解析による）に関して比較した。 生後6週間のメスのICRマウス、FVBマウス、Swiss WebsterマウスをSimonsen Lab
s, Gilroy, CAより購入した。
【０１５８】 ルシフェラーゼの定量：CLDCの注射の24時間後、マウスをCO2チャンバー中で 犠牲にし、脳、肺、心臓、脾臓および肝臓を回収した。同じマウスに由来する肝
臓および肺組織の一部をドライアイス中で急速冷凍し、サザン分析および蛍光ア
ッセイ用に保存した。残りの組織を、ルシフェラーゼ活性についてアッセイし、
相対光単位をルシフェラーゼ活性に換算し、以前に記述された通り（Liuら、199
7）、統計的分析のために、スチューデントのt検定を独立的に両側検定にて適用
した。以前に記述された通り（Liuら、1997）、脂質を組織から抽出し、ローダ ミン蛍光レベルを測定し、そしてサザン分析を行った。
【０１５９】 結果：ルシフェラーゼ遺伝子を含む同一のCLDCを3種類の異なるマウス系統にI
.V.注射することより、非常に異なるレベルのルシフェラーゼ遺伝子発現のレベ ルがもたらされた。ICRマウスにおいて生じたルシフェラーゼ遺伝子発現のレベ ルは、マウスのFVB系統またはSwiss Webster系統のいずれかにおいて生ずるもの
よりも有意に高かった（図５）。このように、CLDCのIV注射によって生ずる遺伝
子発現のレベルは、いくつかのマウス系統においては他のマウス系統におけるよ
りも有意に高く、このことはin vivo遺伝子導入において、高発現変異体および 低発現変異体が存在することを示している。図６に示す通り、低発現体系統は、
プラスミドDNAおよびカチオン性リポソーム成分の希釈剤を変更することによっ て高発現体に変換し得る。同様のストラテジーを低発現性ヒト患者を処置するた
めにも使用し得る。
【０１６０】９．実施例：宿主の前処理 本実施例は、デキサメタゾンまたは4-APPまたは他の選択された作用物質のい ずれかによる前処理が、CLDCに基づくIV遺伝子送達効率を有意に増大させること
を示す。
【０１６１】 プラスミド： p4241（HCMV-ルシフェラーゼ、Liuら, 1997を参照のこと。） リポソーム： DOTIM:chol MLVはモル比で1:1。
【０１６２】 DNA:リポソーム比： リポソーム:プラスミドは1:16（μgプラスミドDNA 対 n
mol全脂質） 前処理： ５匹づつの群の各マウス個体に、CLDCのIV注射の４時間前に、IV注
射によるD5Wのみ200μl、IV尾静脈注射によるD5W 200μl中１mgのデキサメタゾ ン(Sigma)、IV注射による200μlのD5W中に溶解した250μgのチクロピジン(Sigma
)、IP注射による1000μlのD5Wに溶解した175μgの塩化アンモニウム(Fisher)の 各々いずれかを与えた。4-APPの前処理として、マウス５匹の１群には上述の通 り、p4241含有CLDCのIV注射を施す前の３日間は毎日、pH2.5の0.01Mリン酸ナト リウム１ml中に溶解した1.5mgの4-アミノピラゾロ(3,4d)-ピリミジン(Sigma,A26
30)をIP注射した。別群のマウス５匹には、上記の通り、IV CLDC注射を施す前の
３日間は毎日、pH2.5の0.01Mリン酸ナトリウム溶液１mlをIP注射により与えて、
4-PP前処理群の対照となるようにした。
【０１６３】 DNA投与量： マウス１匹ごとに、5％デキストロース水200μl中40μgのプラ スミドDNA(D5＠)を尾静脈注射した。
【０１６４】 動物： ICRマウスのメス、25g(Simonsen Labs, Gilroy, CA)。
【０１６５】 ルシフェラーゼの定量：CLDCの注射の24時間後、マウスをCO2チャンバー内で 殺し、肺、心臓、脾臓、および肝臓を集めてルシフェラーゼ活性について評価し
た。相対的光単位をルシフェラーゼ活性に換算し、先に記載の通り、群間の潜在
的差違を統計的に解析するために、スチューデントのｔ検定を独立的に、両側検
定にて適用した(Liuら, 1997)。
【０１６６】 結果： デキサメタゾンの前静脈注射または4-APPの前腹腔内注射によって、C
LDCをiv注射したマウス群では、バッファーのみ、または様々な他の化合物によ って前処理したマウス群において生ずるルシフェラーゼ活性と比較して、ルシフ
ェラーゼ活性が有意な増大を示した（図６参照）。したがって、デキサメタゾン
または4-APPの前注射は、続いてCLDCをiv注射した動物において生ずる遺伝子発 現のレベルを有意に増加させ得る。
【０１６７】 考察： 本実施例は、宿主の前処理が、送達された遺伝子治療用ベクターから
の以降の発現レベルに影響を与え得ることを示している。処理宿主と未処理宿主
の間の差の比較により、導入遺伝子発現に限定されるこれらの要因および経路速
度が明らかになるであろう。そのような経路および要因は効率を増大させるため
に操作し得る。例えば、特異的遺伝子発現は、数多くの技術（限定するものでは
ないが、SAGE(Veculescuら, 1995, Science 270:484)およびゲノムワイドな(gen
ome-wide)遺伝子発現(Eisenら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 95:14863
)を含む）のいずれを用いても解析できる。
【０１６８】10．実施例：カチオン性脂質／ポリヌクレオチド複合体に対する細胞表面受容体 の同定 プロテオグリカンは細胞外マトリックスの形成から細胞間接触および細胞間連
絡までにわたる広範な機能を果たす。プロテオグリカンはまた、多くのウイルス
（単純ヘルペスウイルス、マウスサイトメガロウイルス、およびHIVを含む）の 結合、および細胞内への進入においても作用する。プロテオグリカンはまた、増
殖因子の貯蔵庫としても機能し、場合により例えばbFGFなどの増殖因子の機能を
制御し得る。これらのタンパク質により果たされる機能の多様性をさらに例示す
ると、プロテオグリカンはまた、脂質代謝の調節および内皮細胞下マトリックス
に対する単球の結合にも関与する。
【０１６９】 プロテオグリカンは、ポリ-リシンまたはカチオン性リポソームを用いた方法 によるin vitroでの培養細胞への遺伝子導入を媒介することが示されている(Mis
lickおよびBaldeschwieler, 1996)。この知見は、細胞表面プロテオグリカンがi
n vivoでCLDCの取り込みにはたらいている可能性を示唆する。しかしながら、可
溶性ヘパリン硫酸がin vitroでCLDCからDNAを放出させ得ることも示され、この ことから血清または組織液中に存在するグリコサミノグリカン(GAG)保有プロテ オグリカンが、CLDCからのDNA放出およびDNAの内在化妨害によってCLDCに基づく
トランスフェクションを妨げ得ることが示される(XuおよびSzoka, 1996; Zelpha
tiおよびSzoka, 1996)。その上、in vitro系での結果は、同一の遺伝子送達方法
をin vivoで用いる場合に得られる結果を予想する上では、信頼性が無いことで 知られている(Liuら, 1997)。したがって、in vivoでのCLDCに基づく遺伝子送達
を媒介する上でのプロテオグリカンの役割は分かっていない。
【０１７０】 以下に考察するように、プロテオグリカンはCLDC媒介性送達および異種遺伝子
の発現において、in vitroおよびin vivoの両方で、重要な役割を果たす。特に 、プロテオグリカン シンデカン１は、in vitroでの遺伝子導入の媒介体として
関わっていることが示されている。動物のヘパリナーゼＩ前処理は、マウスのin vivoでのCLDCに基づく静脈内トランスフェクションにおける、ヘパリン硫酸プ ロテオグリカンの特異的重要性を示している。多糖（フコイダンまたはヘパリン
）またはヘパリナーゼＩのいずれかによってin vivoで動物を前処理することに より、CLDCの細胞内取り込みが制限され、それによりCLDC媒介性遺伝子導入およ
び発現が厳しく制限される。これらのデータは、複合体DNAの細胞内への移入に 先立って、CLDCが細胞表面プロテオグリカンに結合することを示している。
【０１７１】 a. 材料と方法 プラスミド p4241の構築は既に記載されている(Liuら, 1997)。プラスミドは
先に記載の通り精製した(Liuら, 1997)。
【０１７２】 カチオン性リポソームおよびCLDCの調製 DOTIM:DOPE SUVおよびDOTIM:Chol M
LVは先に記載の通り調製した(Liuら, 1997)。CLDCは記載の通り調製した(Liuら, 1995)。
【０１７３】 in vitroトランスフェクション in vitroでのCLDCトランスフェクションを行
うため、12または24ウェルプレート中の各ウェルに1〜2×105細胞を播いた。用 いた細胞型は、ハムスターCHO細胞、マウスB16メラノーマ細胞、ヒト前立腺癌系
統PPC-1およびDU-145、ヒト乳癌系統MDA-435、ラージ細胞、およびシンデカン１
で安定的にトランスフェクトしたラージ細胞であった。CHO細胞は10％ウシ胎児 血清(FBS)を含むHam's F-12中で増殖させた。B16およびPPC-1細胞は５％および1
0％FBSをそれぞれ含むRPMI-1640中で増殖させた。DU-145およびMDA-435はEarle'
s BSS/10% FBSおよびLiebovitz's L15/10% FBSをそれぞれ含むMEM Eagle's中で 増殖させた。ラージ野生型、およびシンデカン１安定的トランスフェクトラージ
(S1-ラージ)細胞は、RPMI-1640/10% FBS（S1-ラージのためにはハイグロマイシ ンB300μg/mlを補充する）中で培養させた。細胞は５％ CO2下で（CO2無しで増 殖するMDA-435を除く）37℃で増殖させた。細胞は先に記載の通りトランスフェ クトした(Liuら, 1997)。
【０１７４】 CLDCトランスフェクションに先立ち、細胞をSigma(St.Louis, MO)から購入し たフコイダン(50,000 M.W.)、デキストラン(40,000 M.W.)またはデキストラン硫
酸(500,000 M.W.)で処理した。ヘパリンはSoloPak Laboratories, Inc.(Elk Gro
ve Village, IL)から購入した。ルシフェラーゼアッセイはすべて記載の通りに 行った(Liuら, 1997)。
【０１７５】 BioRad(Hercules, CA)のGenePulser IIの説明書に従って、B16細胞にp4241を エレクトロポレーションした。メーカーの説明書に記載された通りに、リン酸カ
ルシウムトランスフェクションを行った(Gibco BRL, Grand Island, NY)。先に 記載の通りに、PPC-1細胞をアデノウィルス感染させた(GrahamおよびPrevec, 19
91)。
【０１７６】 in vivoトランスフェクション 50μgのp4241と、1mol％ローダミン-PEを含む
DOTIM:コレステロールMLVとの1:16の比率(μgDNAに対するnmol全脂質)での複合 体を、各マウスに与えた。約25gのICRメスマウス(Simonson, Gilroy, CA)に尾静
脈注射によってCLDCを200μl静脈内投与した。マウスの前処理もまた、尾静脈注
射によってなされた。リン酸緩衝化生理的食塩水(PBS)に溶解させたフコイダン を、CLDCを注射する0、1、2、10、24、48時間前に、マウス１匹当り投与量500μ
gで前注射した。へパリナーゼＩおよびIII(Sigma)は、100μl当り75単位の濃度 で0.15M塩化ナトリウムに溶解させ、そしてマウス１匹当り100μlを、CLDCを注 射する15分前に注射した。対照マウスには、適切な時間にPBSまたは0.15M塩化ナ
トリウムのいずれかを前注射した。さらなる対照として、前注射に先立ってヘパ
リナーゼＩを10分間煮沸し、該酵素を変性および不活性化した。CLDC注射後24時
間にマウスを殺し、肺、肝臓、心臓、および脾臓の小片をルシフェラーゼアッセ
イのために氷上の1×溶解バッファー(Progma, Madison, WI)中に置いた(Liuら,
1997)。肝臓および肺のサンプルは、ドライアイス上で凍結させた後、記載の通 りにローダミン−リポソーム蛍光分析のためのブライ・ダイアー抽出、サザン解 析のためのDNA単離を行った(Liuら, 1997)。
【０１７７】 サザン解析 マウス組織からの全DNA単離を記載の通り行った(Liuら, 1997)。
培養細胞からの各DNA抽出物のために、約2×106 B16細胞を100mmプレート中で培
養した。レーン当り200ngのDNAを１％アガロース／1×TAEゲル上に一晩で分画し
た。Hybondメンブレン(Amersham, Arlington Heights, IL)上へのブロッティン グ、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を記載
の通り行った(Sambrookら, 1989)。p4241由来のルシフェラーゼのゲル精製した1
.2kb HindIII/EcoRV断片を、Random Primed DNA Labeling Kit(Boehringer Mann
heim, Indianapolis, IN)を用いて放射活性標識した。記載の通りに核を2×106
B16細胞から単離し(Sambrookら, 1989)、NP40溶解バッファー(10mM Tris, pH7.4
、10mM塩化ナトリウム、3mM塩化マグネシウム、および0.5％ nonidet P-40)中に
溶解させた。次いで全DNA単離のためのものと同じ技術を用いて、洗浄した核か ら核DNAを単離した(Sambrookら, 1989)。
【０１７８】 DNaseからの保護 1mlのCLDCをDNA対脂質比1:8で、DNAの最終濃度は2μg/100 μlとなるように作製した。CLDCはDOTIM:DOPE SUVまたはDOTAP:DOPE SUVのいず れかを用いて作製した。得られた100μlの複合体は、1μMフコイダンもしくは1 μMデキストラン硫酸で10分間処理するかまたは未処理のままで、次に10〜20単 位のDNaseI(Boehringer Mannheim)を用いて5、30または90分間DNaseI消化を施し
た。リポソームと複合体形成していない100μl中2μgのDNAを、10〜20単位のDNa
seIで90分間処理した。CLDCおよびむきだしのDNAを、50mM Tris, pH7.4および0.
9mM 塩化マンガンを含む５％デキストロース中に調製し、DNaseI処理の反応条件
に近づけた。各サンプル100μlをフェノール：クロロホルム(1:1)にて１回抽出 し、クロロホルムにて２回抽出し、そして50μlを1×TAE中の１％アガロースゲ ルにロードして、１ロードがウェル当りDNA1μgになるようにした。
【０１７９】 b. 結果 i. プロテオグリカンはin vitroでのCLDCによるトランスフェクションを媒介 する 安定的にシンデカン１を発現するラージ細胞は、ある程度複合体の実効正電荷
に依存してCLDCによりトランスフェクトされた。このことは、シンデカン１プロ
テオグリカンがin vitroでのCLDC取り込みに働いていることを示した。野生型ラ
ージ細胞は本質的にCLDCによってトランスフェクトされ得なかった。しかしなが
ら、シンデカン１遺伝子で安定的にトランスフェクトされた野生型ラージ細胞は
、CLDCによってずっと効率的にトランスフェクトされた。さらに、シンデカン１
保持細胞のCLDC媒介性トランスフェクションは、前記複合体が実効電荷において
より正電荷になるにつれて有意に増大した。1:1、1:2、1:4、および1:6(μgDNA/
nmol全脂質)の比率で作製したCLDCにより細胞をトランスフェクトすると、野生 型とシンデカン１安定トランスフェクト体との間でCLDCトランスフェクション効
率に最も大きな差がみられるのは、1:6比で作製したCLDCであった。これらのデ ータは、ラージ細胞培養物においてプロテオグリカン発現が効率的なCLDC媒介性
トランスフェクションに重要であることを示した。
【０１８０】 ii. フコイダンはin vitroでのCLDC媒介性トランスフェクションを妨害する CLDCの取り込みは、CLDCの正のカチオン性頭部基と負に荷電した細胞表面分子
との相互作用によって媒介されることが考えられる。この機構を調べるために、
トランスフェクションに先立ち細胞を多アニオン性化合物で前処理して、これに
よってトランスフェクションが妨げられるようにした。フコイダン、ヘパリン、
またはデキストラン硫酸、全ての多硫酸化多糖のいずれかによる細胞の前処理に
よって、in vitroでのCLDCトランスフェクションはほとんど妨げられた。ヘパリ
ンおよびへパリン硫酸は両方とも、ポリ-リシン：DNA 複合体により媒介される トランスフェクションを妨げるという報告が以前になされている(Mislickおよび
Baldeschweiler, 1996)。フコイダン、ヘパリン、またはデキストラン硫酸は、 マウスB16細胞のトランスフェクションを妨げるのに100nMという低い濃度で十分
であった。デキストラン硫酸は、10nMでトランスフェクションを妨げ、CLDCトラ
ンスフェクションの最も効率のよいインヒビターであった。多糖の電荷は、CLDC
トランスフェクションを妨げる上で重要な要因であると思われる。フコイダンと
同程度の分子量を有する非荷電デキストランは、トランスフェクションを妨げる
ことができず、高濃度ではトランスフェクションの有意な上昇を引き起こしさえ
した。フコイダンによるCLDC媒介性トランスフェクションの妨害と同程度のレベ
ルであることが、PPC-1、MDA-435、DU-145およびCHO細胞において観察され、こ のことは、これが一般化された効果であることを示している。CLDC媒介性トラン
スフェクションに対しほとんど影響を与えないフコイダン濃度(10nM)でも、CLDC
を細胞に代わって前処理する場合には、やはりトランスフェクションを妨げる上
でより効果的であり、このことはこれらアニオン性化合物がCLDCのカチオン性頭
部基に結合することによってトランスフェクションを妨げることを示している。
さらに、正電荷に依存した方法、すなわちCLDCおよびリン酸カルシウムを用いる
場合にだけ、フコイダンは細胞のトランスフェクションを妨げた。フコイダンは
in vitroでのトランスフェクション法であるアデノウイルス法またはエレクトロ
ポレーション法を用いれば妨害をせず、このことは、これらの方法は異なる侵入
経路により機能することを示した。
【０１８１】 フコイダンは、細胞によるDNA取り込みを妨害することによってin vitroでのC
LDC媒介性トランスフェクションを妨げた。未処理またはフコイダンにより前処 理をした細胞を次いでCLDCによりトランスフェクトし、この細胞から核を単離し
、そして複合体作製に用いたルシフェラーゼプラスミドの存在に関して核のDNA をアッセイした。未処理の細胞で観察される高レベルのルシフェラーゼ活性から
予想されたように、フコイダンで未処理の細胞の核はルシフェラーゼプラスミド
を含んでいた。したがって、DNAは未処理の細胞の細胞膜を通り抜けたのである 。対照的に、1μMのフコイダンで30分間前処理した細胞はルシフェラーゼを発現
せず、その核内にルシフェラーゼDNAをもたなかった。全細胞抽出物に由来する 全DNAのサザン解析では、フコイダンにより前処理した培養細胞の細胞膜を横断 しているDNAの証拠が示されなかった。塩化ナトリウムによる細胞の前処理はグ リコサミノグリカンの硫酸化を妨げ、細胞膜へのDNAの結合を減少させることが 以前に示されている(MislickおよびBaldeschweiler, 1996)。
【０１８２】 カチオン性リポソームを含むDOPEまたはコレステロールは、フコイダン存在下
であっても消化からDNAを保護できることから、CLDCの分解は、フコイダンが細 胞内へのDNA取り込みと続いてのレポーター遺伝子発現の両方を妨害する機構で あるとは考えにくい。既に、デキストラン硫酸は純粋にカチオン性脂質により構
成されるリポソームと複合体を形成しているDNAを分解することが示されている 。カチオン性脂質：DOPEの1:1混合物より調製されたCLDCからDNAが放出されるの
かどうかを決定するために、CLDCを1μMのフコイダンと共に10分間インキュベー
トし、5, 30, 90分間ヌクレアーゼ消化を施した。フコイダンによって前処理さ れたCLDCにおいて、検出可能なDNAの分解は観察されなかった。逆に、非保護DNA
はDNaseIに90分間曝露することにより容易に分解された。同様のDNAのリポソー ム媒介性保護が、CLDCをデキストラン硫酸と共にプレインキュベートした場合に
観察された。DOTIM:コレステロールの多重膜リポソームは複合体と同程度にDNas
eI消化からDNAを保護できた（データは示さない）。しかしながら、純粋なカチ オン性脂質（DOTAP単独）によって作製されたCLDCは、フコイダン前処理をして もしなくても、DNaseI消化からDNAを保護しなかった。
【０１８３】 (1) フコイダンはマウスへの静脈注射に続くCLDC媒介性トランスフェクショ ンを妨害する フコイダンはin vivoでもin vitroと同じ機構でCLDC媒介性トランスフェクシ ョンを妨害すると考えられた。マウスはCLDCを静脈注射する前に様々な時間の間
フコイダンによって前処理された。CLDC注射の24時間後、組織をルシフェラーゼ
活性についてアッセイし、非フコイダン処理マウス由来の組織におけるルシフェ
ラーゼ発現レベルと比較した。肺および心臓組織は、DOTIM:Chol MLVを含むCLDC
の静脈注射により最も効率よくトランスフェクトされ、それらの組織はマウスを
フコイダンで１時間前処理した後のルシフェラーゼ活性において激烈な低減を示
した。フコイダンでの前処理がそれより長いと、CLDC媒介性トランスフェクショ
ン効率に対する影響は小さくなった。これはおそらく高度に負に荷電したフコダ
インが血液循環から継続的に排除されるためである。in vivoでフコダインによ り１時間前処理した組織におけるルシフェラーゼ低減の程度は、in vitroでみら
れたのと同程度、すなわち約100倍である。マウスの肺および肝臓に由来する全D
NAのサザン解析によって、フコイダンで１時間前処理した動物の組織においてp4
241プラスミドのレベルが減少することが示された。また肺から単離された核DNA
は、フコイダン処理した動物に存在するp4241プラスミドが、未処理の動物と比 べて３倍減少していることを示した。フコイダンによる１時間の前処理はまた、
肺および肝臓にみられるローダミン-脂質のレベルを有意に減少させた。これは 組織からの全脂質の抽出およびRh-PE-MLVの蛍光定量によってアッセイされたも のである。これらのデータはin vitroでの観察と一致し、フコイダン前処理がCL
DCにより細胞内に送達されるDNAレベルを低下させ、in vivoでのフコイダン処理
動物におけるルシフェラーゼ発現を有意に減少させることを示唆している。
【０１８４】 (2) プロテオグリカンはin vivoでのCLDCトランスフェクションに関与する CLDC静脈注射の前にヘパリナーゼＩでマウスを前処理することにより、ルシフ
ェラーゼの発現レベルが有意に低下した。これはプロテオグリカンがCLDCの静脈
内トランスフェクションにとって重要であることを示す。ヘパリナーゼＩは細胞
表面プロテオグリカンのヘパリン硫酸グリコサミノグリカン鎖を特異的に切断し
、それゆえヘパリナーゼＩの静脈注射はマウスにおいてプロテオグリカンのレベ
ルを有意に減少させることが示されている。マウスは、CLDC注射の15分前に該酵
素の生理的食塩水溶液を静脈注射することによってヘパリナーゼＩで前処理した
。対照マウスは15分間、生理的食塩水単独または煮沸したヘパリナーゼＩのいず
れかで前処理した。CLDCのトランスフェクション効率は、未処理マウス由来の組
織におけるトランスフェクション効率と比較すると、ヘパリナーゼＩ処理マウス
の肺、心臓および脾臓において有意に減少した。ヘパリナーゼＩの煮沸および変
性によってマウスにおけるCLDCトランスフェクション効率に対する活性酵素の効
果は無くなったが、このことは、ヘパリン硫酸切断作用がCLDC媒介性トランスフ
ェクションを妨げる上で必要であることを示している。ヘパリナーゼＩおよびヘ
パリナーゼIIIの混合物によるマウスの前処理は、ヘパリナーゼＩのみによって 前処理したマウスと比較して、CLDCトランスフェクションによるルシフェラーゼ
の発現を同程度に妨害することを示した。フコイダンの効果と同様に、マウスの
ヘパリナーゼＩ前処理もまた、未処理マウスと比較して、前処理マウスの肺から
回収したローダミン標識化脂質のレベルを有意に低下させた。サザン解析によっ
て、対照肺にみられるDNAレベルと比較して、ヘパリナーゼＩで前処理したマウ ス由来の肺におけるレポータープラスミドDNAは２倍少ないことが示された。こ れらの結果は、ヘパリナーゼＩで前処理したマウスはCLDCにより送達されるDNA を取り込む能力が損なわれること、したがって細胞表面のインタクトなヘパリン
およびヘパリン硫酸グリコサミノグリカンは、in vivoでのCLDC媒介性静脈内ト ランスフェクションにおいて重要な役割を果たしていることを示唆している。
【０１８５】 c．考察 in vitroおよびin vivoの両方においてCLDCベースの遺伝子送達を媒介する共 通の経路により機能すると考えられている因子を、CLDCベースの遺伝子送達を理
解し、制御し、そして改良するために同定することが特に重要である。本発明者
らの研究室における最近のデータは、in vitroにおける実験結果から、該因子が
in vivoにおけるCLDC媒介型遺伝子導入の制御に関与するということを矛盾なく 正確に推論できないことを強調している。特に、プロテオグリカンの除去のよう
に、他の主要な陰イオン性細胞表面分子であるシアル酸の除去により、CLDCkに よるin vivoトランスフェクションがブロックされる。反対に、in vitroにおけ るプロテオグリカンの除去により、CLDCベースのトランスフェクションはブロッ
クされるが、シアル酸の除去により該トランスフェクションはin vitroにおいて
増強される。このin vitro効果とin vivo効果の間に相関関係がないことは、in
vivo系におけるin vitroの実験結果を確証することの重要性を示している。本発
明者らは、プロテオグリカンをin vitroおよびin vivoの両方におけるCLDC媒介 型トランスフェクションの重要なメディエーターとみなした。
【０１８６】 in vivoのカチオン性リポソームによるDNA送達を媒介するプロテオグリカンの
役割、およびその役割が抑制性であるか支持性であるかが論議の主題であった。
ポリリシン／DNA複合体およびカチオン性リポソーム／DNA複合体の両方を用いた
実験により、プロテオグリカンがin vitroにおける遺伝子送達を補助しているこ
とが示された（MislickおよびBaldeschweiler、1996）。細胞表面上のプロテオ グリカンのディスプレイで欠損しているCHO突然変異細胞および細胞表面上の硫 酸部分を置換するために塩化ナトリウムで処理した細胞上のトランスフェクショ
ンはあまり有効ではなく、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン上の硫
酸がin vitroにおけるDNA送達および発現で機能していることを示す（Mislickお
よびBaldeschweiler、1996）。対照的に、同様に記述されている結果は、硫酸デ
キストランおよびヘパリンを含むポリアニオン性多糖がin vitroにおいてCLDCを
分解しうることを示している。電荷相互作用はCLDCの構造を崩壊させ、結果とし
て該複合体からDNAを放出させることが仮定された。これらの知見に基づき、Szo
kaおよび同僚研究者ら（1996）は、プロテオグリカンがポリアニオン性多糖ヘパ
リンおよび硫酸デキストランに類似するポリ硫酸化グリコサミノグリカン鎖を展
示しているので、細胞表面上のプロテオグリカンはin vivoにおいてDNAの取り込
みを妨げうると推測した。更に、in vitroにおけるCLDCベースのトランスフェク
ション研究の結果より、in vivoにおける実験結果からの予測はよく知られてい るようにあてにできないことを証明した。
【０１８７】 100％カチオン性脂質からなるリポソームを用いてCLDCを調製して得た過去の 結果（XuおよびSzoka、1996）に対して、本実験の結果は、ポリ硫酸化多糖がin
vitroにおける等モル量のカチオン性および中性脂質で調製された複合体を分解 しないことを示している。
【０１８８】 更に、ヘパリンおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンの切断に特異的な酵素で
あるヘパリナーゼIおよびIIIを用いた研究により、CLDCを静脈注射したマウスの
組織内の細胞に効率的にDNA送達するためには完全なプロテオグリカンが必要で あることが示された。更に、CLDCにより不完全にトランスフェクトされるラージ
細胞には、CLDC媒介型遺伝子導入によってトランスフェクトされうるようにシン
デカン1の発現が必要である。
【０１８９】 CLDC媒介型トランスフェクションにおけるプロテオグリカンの役割と一致する
、in vivoにおけるフコイダンの前処理は、CLDCを静脈注射したマウスにおいて ルシフェラーゼの発現を抑制する。同様に、ヘパリンはフコイダンと同程度の効
果でCLDC媒介型遺伝子導入を無効にさせた。フコイダンおよびヘパリンは両方と
も陽性に荷電するCLDCに結合し、陰性に荷電する細胞表面のプロテオグリカンへ
の結合を阻害しうる。この仮説と一致して、フコイダンを用いてCLDCを予めイン
キュベートすることにより、フコイダンを用いて予めインキュベートした細胞よ
りも有効にin vitroにおけるトランスフェクションをブロックした。これに対し
て、大きなポリアニオン性多糖フコイダンおよびヘパリンは、細胞外マトリック
ス成分と似ていて、細胞性プロテオグリカンと複合体を形成し、CLDCに結合でき
ないタンパク質とさせうる。
【０１９０】 特異的酵素ヘパリナーゼIおよびIIIの、CLDCの静脈注射に続いて起こるマウス
組織における遺伝子発現に対する抑制効果は、プロテオグリカンまたは少なくと
もこれらの細胞表面タンパク質のグリコサミノグリカン鎖の細胞へのCLDC取り込
みにおける特異的な関与を示している。グリコサミノグリカン鎖の切断および放
出により、ヘパリナーゼの前処理による細胞へのCLDC取り込みの抑制に関する少
なくとも2つの可能な機構が生じる。第一に、ヘパリナーゼで前処理してグリコ サミノグリカン鎖を取り除いた細胞は、陰性に荷電した「CLDC受容体」を欠き、
その結果CLDCに結合できなくなりうるというものである。他方は、ヘパリナーゼ
で前処理した動物組織において酵素的切断によって放出されたグリコサミノグリ
カン鎖は、おそらくCLDCに結合し、その複合体が細胞表面上で適当な「受容体」
と接触することを妨げうるというものである。いずれの仮定においても、CLDCは
ポリカチオン性グリコサミノグリカン鎖に結合するにちがいなく、プロテオグリ
カンのグリコサミノグリカン部分がin vivoにおけるCLDCの最初の結合部位であ ることを示唆している。
【０１９１】 結合後のin vitroおよびin vivoの両方における細胞へのCLDC取り込みを媒介 するプロテオグリカンの正確な役割をまだ説明しなければならない。プロテオグ
リカンはCLDCに結合し、その後プロテオグリカン／CLDC複合体として細胞内にイ
ンターナリゼーションされうる。また、プロテオグリカンは最初にCLDCに結合し
、第二の細胞表面タンパク質または受容体に複合体を生じ、続いてリパーゼのイ
ンターナリゼーションを媒介するプロテオグリカンの関与と同様に、順番にエン
ドサイトーシスをうける。エンドサイトーシスを受ける他のタンパク質を必要と
するプロテオグリカンの少なくとも一つの例として、細胞質プロテオグリカンで
あるデコリンの結合およびエンドサイトーシスを媒介する51kDおよび26kDの2つ の受容体がある（Gotteら、1995）。CLDC取り込みにおける未同定タンパク質の 潜在的な関与を考慮して、フコイダンがスカベンジャー受容体のインヒビターで
あることに留意するのは重要である。これは、スカベンジャー受容体がCLDC取り
込みにおいて一つの役割を果たしうる可能性を示唆している。
【０１９２】 この研究とほかの研究から、プロテオグリカンスーパーファミリーが、カチオ
ン性DNA複合体を産生する遺伝子送達ベクターの全てに対する主要な受容体とし て働くという結論を出すことができる。そうであるので、該細胞との該複合体の
相互作用は、主として静電的であり、カチオン性部分に対する結合部位の受容体
特異性に関与しない。従って、種々のカチオン性の系の間におけるトランスフェ
クションの有効性の実質的な違いは、おそらく大きさ、安定性、表面の実効電荷
または電荷密度などの複合体の物理的性質における差異により生じるようである
。この推論は、これらの系の将来的な開発に対して最も有効な分野を示すので重
要である。
【０１９３】 in vivoにおけるCLDC受容体としてプロテオグリカンを同定することは、CLDC 媒介型遺伝子導入の研究における重要な進歩を提示する。例えば、異種遺伝子の
導入により、in vivoにおけるプロテオグリカン発現または機能の操作を可能に し、in vivoにおけるCLDC媒介型遺伝子導入の過程を制御することができる。本 明細書に記載されたin vivoにおける実験結果より、in vivoにおけるCLDC媒介型
遺伝子導入を有効にモジュレートすることができる。例えば、宿主動物をプロテ
オグリカン受容体をコードするポリヌクレオチドを用いて単独または複数で前処
理して宿主動物の細胞表面上のプロテオグリカン量を増加させ、in vivo CLDCト
ランスフェクションを上にモジュレートできる。本明細書において記載の方法お
よびベクターを用いて、この種のプロテオグリカンを増強した細胞をより効率的
にトランスフェクトしうる。反対に、ヘパリナーゼまたはフコイダンで宿主動物
を処理して、それぞれプロテオグリカン受容体を除去するか、またはCLDCに結合
するプロテオグリカンを競合的に阻害することにより、CLDC媒介型遺伝子導入を
下にモジュレートすることができる。更に、宿主細胞および組織はヘパリンまた
はフコイダン処理からの回収率が多様なので、このような処理はまた、特定の動
物細胞、器官または組織の有効なターゲッティングを可能にする。例えば、フコ
イダンへの暴露後10時間において、フコイダンは依然として肺細胞のCLDC媒介型
トランスフェクションを抑制しているが、肝細胞はCLDC媒介型遺伝子送達により
永続的にトランスフェクトされうる。
【０１９４】11．実施例：抗癌遺伝子治療 B16メラノーマ誘導性腫瘍を用いて、CLDC媒介型癌治療の可能性を評価した。C
57Black6マウスの尾に同系B16−F−10メラノーマ細胞25,000個を静脈注射した。
CLDCは、マウスアンギオスタチン遺伝子、マウスGM−CSF遺伝子、ヒトp53遺伝子
またはCAT遺伝子（疑似処理対照として使用）をサブクローニングした、HCMV駆 動性発現プラスミド（p4109、Liuら、1995、J. Biol. Chem.、270(42):24864-24
860）25μgを用いて、実質的に上述のように調製された。CLDCを、最初の腫瘍投
与後3日間静脈注射し、10日目に再び静脈注射した。マウスを30日目に犠牲にし 、解剖顕微鏡を用いて肺転移の総数および2mmより大きい転移数を計数した。こ のデータを図７に示す。未処理対照マウスまたはCAT−CLDC処理対照マウスと相 対的に、マウスアンギオスタチン遺伝子、マウスGM−CSF遺伝子、またはヒトp53
遺伝子を含むCLDCで処理した試験マウス（「試験CLDC」）は、有意な抗転移効果
をもたらした（p■0.05の観察される転移において50％を上回る減少）。同様に 、血管／腫瘍の総数を定量化した（血管をFVIII、抗VWF抗体を用いて染色した）
場合の結果を得た。試験CLDCの異なる組み合わせを用いて動物を処理した場合、
GM−CSF遺伝子を含む混合組成物において、わずかであるが更に有意な減少が観 察された。この腫瘍試験は、初期世代のCLDC／ベクターであっても所望の生物学
的産物の治療上適した濃度で送達および発現しうることを明らかに示している。
これらのデータは、本明細書に記載の方法および手段を実行して、アンギオスタ
チン、エンドスタチン、GM−CSFまたはp53などの抗血管新生促進遺伝子の全身性
送達を介した抗転移性腫瘍活性を顕著に与えることを示している。
【０１９５】 5つのC57BL6雌マウス群を用いた更なる研究では、CMV−P53発現プラスミド25 μg、CMV−ルシフェラーゼ発現プラスミド（疑似処理）25μg、または未処理（ 対照）のいずれかを含むCLDCの1回の尾静脈注射を行った。CLDC静脈注射の1日後
に全マウスを犠牲にし、その後マウスの肺を除去して、マウスがどの処理群から
のものかを知らない研究者によって、標準的な免疫組織化学的手法を用いて顕微
鏡の切片標本をヒトp53の発現について分析した。p53抗原の存在は赤らんだ染色
細胞によって示され、メラニンを含む腫瘍細胞は暗褐色に着色する。
【０１９６】 結果： CMV−p53発現プラスミドを含むCLDCを注射したマウスから得た肺は、p53抗原 に対し、正常肺細胞の有意数と同じく、肺転移性B−16メラノーマ細胞の全体で 約20％の陽性染色を示している。更なる観察により、p53遺伝子処理マウスから の腫瘍細胞において広範囲にわたりp53抗原に対し陽性であることが示された。C
MV−ルシフェラーゼ発現プラスミド処理マウス（疑似処理対照）も未処理マウス
のどちらの肺もp53遺伝子発現に対して有意な陽性染色を示さなかった。従って 、ヒト野生型p53遺伝子を含むCLDCの静脈注射により、転移性腫瘍細胞の大多数 がp53でトランスフェクトされる。
【０１９７】12．実施例：GM−CSFについてのin vivoにおける新規遺伝子機能の同定 同時に行う遺伝子同時送達（co-delivery）を実施して新規機能性を確立する ことにより、腫瘍を患う動物において抗血管新生促進性の抗腫瘍活性をもたらす
と知られている遺伝子と共にGM−CSF遺伝子を同時送達することにより、GM−CSF
遺伝子が抗血管新生促進性の抗腫瘍活性を有意に媒介しうることが発見された（
O’Reillyら、1997）。特に本発明者らは、マウス個体群へのアンギオスタチン およびGM−CSF遺伝子の同時注射により、個々の遺伝子のみを注射した場合と比 較して、付加的または相乗的抗腫瘍活性がもたらされるか否かを試験した。各遺
伝子を個々の、並びに遺伝子を組み合わせたCLDCベースの静脈注射により、対照
マウスと比較した場合の相当レベル（データは示さない）で、肺腫瘍の総数およ
び2mmを上回る腫瘍数の両方が減少した。従って、遺伝子の組み合わせは、個々 の各遺伝子によりもたらされる抗腫瘍活性と比較した場合、その活性レベルを増
強せず、これは付加的または相乗的抗腫瘍活性の明らかな欠如を示している。こ
れらの結果は、各遺伝子が共通の抗腫瘍経路を介して作用していることを示した
。
【０１９８】 GM−CSFの抗血管新生促進機能は腫瘍内血管計数（以下を参照）を行うことに より証明され、アンギオスタチンおよび／またはGM−CSF発現がin vivoにおける
腫瘍性血管形成をどの位もたらすかを定量的に比較した。これらの研究は、腫瘍
性新生血管形成において、アンギオスタチンおよびGM−CSF遺伝子のCLDCベース の送達が、対照マウスと比較した場合（p＜0.005）にそれぞれ非常に有意で同程
度の減少をもたらし（表３参照）、そのことが腫瘍を患うマウスにおいて各遺伝
子産物が非常に有意で類似の腫瘍内抗血管新生促進活性を誘導したことを示して
いることを確証した。
【０１９９】
【表３】 13．実施例：CC3についてのin vivoにおける新規遺伝子機能の同定 本発明を実施して、新しく予期されない遺伝子機能、すなわち特定の遺伝子に
ついて以前に特定された／同定された特異的な機能と相関しない機能を同定する
こともできる。例えば、CC3遺伝子は、その遺伝子の機能欠失により攻撃的な転 移性表現型を生じる、転移サプレッサー遺伝子として同定されている。これは野
生型遺伝子のコピーの両方を欠失し、それゆえ野生型タンパク質が全く産生され
ない細胞内でのみ生じる（E. Shtivelman、1997、Oncogene、14:2167-2173）。C
C3遺伝子の機能欠失により神経外胚葉起源の非常に転移性の癌のサブセットにお
いて生じる攻撃的な転移性表現型が導かれる。野生型CC3はヒトメラノーマ内に 存在し、そして野生型遺伝子産物の機能が欠失した場合にのみサプレッサー遺伝
子が腫瘍を生じさせるので、CC3はメラノーマ腫瘍に対し抗腫瘍性効果を生じて はならない。予想外にも、野生型ヒトCC3 cDNAのCLDCベースの静脈内遺伝子送達
により、腫瘍を患うマウスにおいてB16メラノーマに対する抗転移性腫瘍効果が 有意に生じた（図８）。この結果は、B16メラノーマ細胞が内因性野生型CC3遺伝
子産物をすでに発現していたので予想外であり、またCC3について既に同定され た抗腫瘍性機能は腫瘍サプレッサー遺伝子ということである（E. Shtivelman、O
ncogene、1997）。自明であるが、内因性野生型CC3遺伝子産物はB−16腫瘍を患 うマウスの腫瘍内に存在するので、CC3は特異的な腫瘍サプレッサー遺伝子とし て機能することはない。
【０２００】14．単一プラスミドのin vivo発現 複数の独立し機能的な発現カセットを含む単一発現プラスミドを用いて、単一
プラスミドのCLDCベースのin vivo送達に続いて起こる、複数の異なる遺伝子の 長期間の高レベル発現を産生させることもできる。特に、発現プラスミドp4458 は完全なHCMV−ルシフェラーゼcDNA＋EBV反復ファミリー（family of repeat：F
R）発現カセットおよび完全なHCMV−EBNA−1 cDNA発現カセットの両方を含んで いる。p4458は、動物へのCLDCベースの静脈注射に続いて起こる長期間の高レベ ルルシフェラーゼ遺伝子発現をもたらす。この実験に用いられたプラスミドは図
９に図解し、これらの構築は以下に記載の通りである。
【０２０１】 p4458を調製するため、以下の構築物が作製された。
【０２０２】 p630（MiddletonおよびSugden、1994、前述）からのEBNA−1 cDNAを含む約2kb
の断片（bp 839−2873）をHindIIIおよびAccIを用いて切断し、ベクターp4109（
Liuら、1995、前述）のHindIII−AccI部位にライゲートし、プラスミドp4331を 構築した。更に、ベクターpVR1255（Hartikkaら、1996、Hum. Gene. Ther.、7:1
205−1217）をEcoRVおよびBamHIを用いて制限消化し、エンドフィリングし、そ の後同じp630から切断した2kbのEBNA−1 cDNAをエンドフィリングし、pVR1255に
ライゲートしてプラスミドp4395（CMV−EBNA−1）を構築した。
【０２０３】 プラスミドp4329を、p985（MiddletonおよびSugden、1992、前述）をBamHIで 、続いてKpnIを用いて部分的に制限消化し、断片（bp 1099−4043）を含む約3kb
の反復ファミリー（FR）＋TKプロモーター＋ルシフェラーゼをプラスミドp4109 （Liuら、1995）のBamHIおよびKpnI部位にライゲートして構築した。
【０２０４】 プラスミドp4379（CMF−luc−FR−2）は、BamHI制限消化してp985から単離し 、続いてベクターpVR1255のBamHI部位へインサートした約900bpの反復ファミリ ー断片（bp3157−4043）を含む。従って、FRはルシフェラーゼ遺伝子の下流に位
置している。
【０２０５】 p4458は、XmnIで制限消化しエンドフィリングしたp4379に基づいている。完全
p4379発現カセット（CMV−イントロ−EBNA−1−ポリA断片）を含む3.5kb断片を 、XhoI＋BglIIを用いてp4331から切断し、エンドフィリングして、続いてp4379 のXmnI部位にライゲートして、CMV−CMV−EBNA−1CMV−luc−FR−2を含む単一プ
ラスミドであるp4458を構築した。
【０２０６】 Liuら（1995、前述）に記載のようにアルカリ性溶解および酢酸アンモニウム 沈殿を用いて前記プラスミドを精製した。
【０２０７】 p4458の単一CLDCベースの静脈注射により、免疫応答性マウスにおけるルシフ ェラーゼ遺伝子の長期発現（12週より長期）が生じる。本発明者らは、EBVベー スの2つのプラスミド系の同時注射に続いて、HCMV−ルシフェラーゼcDNA＋FR発 現プラスミドおよびHCMV−EBNA−1 cDNA発現プラスミドの両方がそれぞれ発現さ
れ、ルシフェラーゼ遺伝子の長期発現をもたらすはずであると既に示した。従っ
て、CMV−luc−FRおよびCMV−EBNA−1の両方の発現カセットは、単一プラスミド
p4458によってin vivoで発現される。FR含有発現カセットおよびEBNA−1 cDNAを
有する発現カセットなどの複数の機能性発現カセットを含む単一発現プラスミド
の使用により、in vivoでの非ウイルス型遺伝子送達に続いて独特の表現型が生 じるのに必要な持続時間について生物学的におよび治療学的に有意なレベルで複
数の遺伝子を発現する能力が引き起こされる。このアプローチは、送達または評
価されうる遺伝子数およびcDNA数を実質的に増大させ、個々の動物において遺伝
子機能を同定することができる。これは、個々の動物において複数の異なる発現
プラスミドを共送達するために必要である高いDNA投与量が、しばしば毒性が強 すぎたり致命的であるので特に重要である。従って、複数の異なるcDNA／遺伝子
を複数の発現カセットに含む、」単一の長期発現プラスミドの使用により、動物
への非ウイルス性in vivo遺伝子送達に続く機能的ゲノム研究の評価が科学的お よび経済的に適したものとなる。更に、CLDCベースの遺伝子送達は細胞へメガベ
ースサイズのDNA断片を送達しうるので（J. Harringtonら、1997、Nat Genet.、
4:345-355）、本明細書に記載のアプローチを用いて非常に大きいサイズ（30kb 以上）のプラスミドをマウスに送達しうる。in vivoに特異的なcDNA（処理動物 を疑似処理動物および未処理対照動物と比較による）の特徴付けられていないDN
A配列の特異的な機能は評価されうる。このアプローチは完全長cDNAクローン若 しくはゲノムクローン、または完全長クローン作製のもとになりうる部分クロー
ンに対して非常に有効であるものである。
【０２０８】 本発明を用いて、予測された遺伝子機能に基づく表現型マーカーを標的するこ
ともできる。例えば、ヘマトクリットの上昇、白血球数または標的化酵素（MnSO
Dなど）などの予測または所望のエンドポイントに関連する表現型について焦点 をあててスクリーニングすることにより、赤血球形成活性しうる進化の遺伝子を
標的することができる。この焦点をあてたスクリーニングは、遺伝子機能が仮定
またはより密接に分類されうるスループットを増強する。
【０２０９】16．実施例：縦列エンハンサー／プロモーターエレメント この実施例において、ルシフェラーゼの発現を指令する縦列プロモーターの効
果をin vivoで調査した。発現プラスミドを6節および14節に記載のようにマウス
にCLDCで投与した。
【０２１０】 ａ．ベクターの構築 p4531（hmCMVSA11）を、pMH5（Microbix Biosystems, Inc.から購入した）のC
MVエンハンサー／プロモーターエレメントの1.3kbのXbaI−EcoRI断片を単離し、
それを平滑末端ライゲーションによりpVR1255（Hartikkaら、1996、Human Gene
Therapy、7:1205-1217）のSacII部位にライゲートして構築した。
【０２１１】 p4610（hm4CMVSA23）は合成hCMVおよび短いmCMVエンハンサー／プロモーター を含むが、これは、平滑末端ライゲーションによりpMH5からの529bpのBstI1071 −EcoRI断片をp4377のSacII部位にライゲートして構築した。
【０２１２】 p4588を、ルシフェラーゼDNA（Morishitaら、1995、J. Biol. Chem.、270:279
48-27953）に結合されたFLT−1 5’UTR（−748/＋284）の1kbのSpeI−HindIII断
片を、pVR1255のPstI部位への平滑末端ライゲーションにより構築した。
【０２１３】 p4590の構築はp4588と類似しているが、1kbのSpeI−HindIII断片をhmCMVSA11 のPstIにライゲートした。プラスミドp4377（pVR1255としても知られている）は
、最適化hCMVエンハンサー／プロモーター、イントロンA、カナマイシン耐性遺 伝子およびポリA終止シグナルを含み、対照として用いた。
【０２１４】 ｂ．結果 肺、心臓および脾臓におけるプラスミドpmhCMVSA11からのルシフェラーゼ発現
は、ルシフェラーゼ発現プラスミドp4377（最適化ヒトCMVプロモーターの単一コ
ピーを含む）およびpmCMVSA2（マウスCMVプロモーターの単一コピーを含む）か らの発現以上に劇的に増加していた（6〜ほぼ20倍）。従って、縦列エンハンサ ー／プロモーターエレメントは相乗的に機能し、遺伝子発現レベルを増加させた
。
【０２１５】 Flt−1プロモーターは血管内皮細胞において特異的に発現される組織特異的プ
ロモーターである。mCMVエンハンサー／プロモーターおよび／またはhCMVエンハ
ンサー／プロモーターの添加により、ルシフェラーゼ発現プラスミド駆動性Flt −1プロモーターに機能的に結合された場合、ルシフェラーゼの組織特異的発現 が増加した。これらの結果は、エンハンサー／プロモーター多量体を用いて、in
vivoにおける所望の目的遺伝子の発現を増加させうるが、細胞型および組織特 異性は保持されることを示している。
【０２１６】 等価物 前述の明細書は、当業者が本発明を広く実施するのに十分であると考えられる
。実際に、微生物学、生化学、有機化学、医学または関連分野の当業者に明らか
な本発明を実施するための上記に記載の様々な改変は、本発明の特許請求の範囲
内であることを意図している。引用した特許、特許出願および出版物の全ては参
照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、開示したベクターのin vivo導入の24時間後または7日後の、試験動物
の心臓および肺におけるルシフェラーゼ発現レベルを示す図である。
【図２】 図２は、開示したベクターのin vivo導入の24時間後、6週間後、または14週間
後の、試験動物の心臓および肺におけるルシフェラーゼ発現レベルを示す図であ
る。
【図３】 図3aおよび図3bは、試験動物の心臓および肺におけるルシフェラーゼ発現が、
開示したベクターのin vivo導入の31日後に継続しており、再投与後、著しく増 大することを示す図である。図3bは、luc-FR-EBNA-1のカチオン性脂質DNA複合体
(以下「CLDC」という)送達によって先の2回のCAT-EBNA-1注射後(各注射の間隔は
3週間あけた)に著しいルシフェラーゼ発現が生じたことを示している。
【図４】 図４は、種々の希釈剤の存在下でのCLDCの製剤化がin vivoでのCLDC媒介型ル シフェラーゼ発現のレベルに影響を及ぼし得ることを示す図である。
【図５】 図５は、in vivoでのCLDC媒介型ルシフェラーゼ発現が異なる系統のマウスで 相違することを示す図である。
【図６】 図６は、種々の作用物質による動物の前処理がin vivoでのCLDC媒介型ルシフ ェラーゼ発現のレベルに影響を及ぼし得ることを示す図である。
【図７】 図７は、GM-CSF、アンギオスタチン、およびp53遺伝子のCLDC媒介型送達によ ってin vivoで有意な抗転移作用が生じたことを示す図である。
【図８】 図８は、どのようにしてCLDC媒介型送達を用いてCC3についての新規抗腫瘍遺 伝子機能を同定したかを示す図である。
【図９】 図９は、発現ベクターp4329、p4379、p4395、p4402、およびp4458の概略図で ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 47/48 38/43 48/00 47/28 Ａ６１Ｐ 35/00 47/36 Ａ０１Ｋ 67/027 47/48 (Ａ６１Ｋ 31/711 48/00 31:716） Ａ６１Ｐ 35/00 (Ａ６１Ｋ 31/711 // Ａ０１Ｋ 67/027 31:573） (Ａ６１Ｋ 31/711 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 31:716） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ａ６１Ｋ 31/711 37/24 31:573） 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA04 DA02 DA03 EA04 FA02 FA06 GA13 HA17 HA20 4C076 AA11 AA16 AA19 CC27 DD16 DD43 DD67 DD70 EE51 FF31 FF43 4C084 AA02 AA13 BA44 DA19 DC01 NA14 ZB261 ZB262 4C086 AA01 AA02 DA10 EA16 NA14 ZB26

Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 目的の遺伝子を動物細胞にin vivoで導入する方法であって 、 a) 細胞保持活性をコードする第1の組換えポリヌクレオチド配列を動物に導入
    すること、 b) 目的の遺伝子をコードし且つ細胞保持配列を有する第2の組換えポリヌクレ
    オチド配列を該動物に導入すること を含んでなり、 該細胞保持活性が細胞中で発現され、細胞保持配列に結合し、それによって第
    2の組換えポリヌクレオチド配列を動物細胞中に細胞保持配列が存在しない場合 よりも少なくとも50％長く維持させるものである、上記方法。
  2. 【請求項２】 目的の遺伝子が、該目的の遺伝子の転写を指令する配列に機
    能し得るように連結されている、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 細胞保持活性をコードする第1の組換えポリヌクレオチド配 列が、第2の組換えポリヌクレオチド配列とは別個のベクターに導入される、請 求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 第1および第2の組換えポリヌクレオチド配列が、実質的に同
    時に動物に導入される、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 第1の組換えポリヌクレオチド配列が、第2の組換えポリヌク
    レオチド配列を導入する４〜24時間前に動物に導入される、請求項３に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 細胞保持活性をコードする第1の組換えポリヌクレオチド配 列および第2の組換えポリヌクレオチド配列が同一ベクターに存在する、請求項 １に記載の方法。
  7. 【請求項７】 第1および第2の組換えポリヌクレオチド配列が、カチオン性
    脂質またはカチオン性ポリマー複合体を介して動物に導入される、請求項１に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 第1および第2の組換えポリヌクレオチド配列が、むき出しの
    DNAとして動物に導入される、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 動物が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 哺乳動物がマウスである、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 哺乳動物がヒトである、請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 細胞保持活性が、EBNA-1、カリオフェリン(karyopherin) 、HCMV IE-1、およびアデノウイルス末期前タンパク質(preterminal protein)か
    らなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 細胞保持活性がEBNA-1である、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 目的の遺伝子が、少なくとも2個の縦列エンハンサー／プ ロモーター配列に機能し得るように連結されている、請求項２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 目的の遺伝子が、アンギオスタチン、エンドスタチン、p5
    3、GM-CSF、IL-2、G-CSF、BRCA1、BRCA2、RAD51、エンドスタチン、TIMP 1、TIM
    P-2、Bcl-2、およびBAXからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 目的の遺伝子によってコードされる産物のin vivoでの機 能を決定するために用いられる、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 機能的ゲノム研究(functional genomics)を行う方法であ って、 a) 少なくとも1種の目的の遺伝子の発現を指令する組換えポリヌクレオチドを
    試験動物に導入すること、 b) 該動物と対照動物の表現型を比較すること、および c) 試験動物と対照動物の表現型の相違を同定すること を含んでなる、上記方法。
  18. 【請求項１８】 試験動物および対照動物の表現型が遺伝子発現のプロファ
    イリングを用いて比較される、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 機能的ゲノム研究を行う方法であって、 a) 細胞保持活性をコードする第1の組換えポリヌクレオチドを動物に導入する
    こと、 b) 目的の遺伝子をコードし且つ細胞保持配列を有する第2の組換えポリヌクレ
    オチドを動物に導入すること、 ここで、該細胞保持活性は細胞保持配列を有する第2の組換えポリヌクレオチ ドを細胞中に維持させる能力を有するものであること、および c) 該動物と対照動物の表現型を比較すること を含んでなる、上記方法。
  20. 【請求項２０】 細胞保持活性をコードする第1の組換えポリヌクレオチド が、第2の組換えポリヌクレオチドとは別個のベクターに導入される、請求項１ ９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 細胞保持活性をコードする第1の組換えポリヌクレオチド および第2の組換えポリヌクレオチドが同一ベクターに存在する、請求項１９に 記載の方法。
  22. 【請求項２２】 比較工程が、遺伝子発現のプロファイリングを含む、請求
    項１９に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 動物が哺乳動物である、請求項１９に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 哺乳動物がマウスである、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 遺伝子治療によって動物に投与される目的の遺伝子の発現
    レベルを増大させる方法であって、 該動物を目的の遺伝子の投与前に45分〜約72時間にわたって作用物質で処理す
    ること、ここで該作用物質はその後の目的の遺伝子の発現を増大させるものであ
    る、および 遺伝子治療によって目的の遺伝子を該動物に投与すること を含んでなる、上記方法。
  26. 【請求項２６】 作用物質がデキサメタゾンである、請求項２５に記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】 作用物質が4-APPである、請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 作用物質が内因性プロテオグリカンの発現を誘導するか、
    またはプロテオグリカン受容体をコードするポリヌクレオチドである、請求項２
    ５に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 遺伝子送達の効率に影響を及ぼす遺伝的宿主因子を同定す
    る方法であって、 遺伝子治療ベクター中の目的の遺伝子の発現レベルを増大させる作用物質で処
    理された動物の発現プロファイルを、作用物質で処理されていない動物の発現プ
    ロファイルと比較すること、 発現プロファイルの相違を解析すること、および 遺伝子送達の効率に影響を及ぼす特異的な内因性遺伝子を同定すること を含んでなる、上記方法。
  30. 【請求項３０】 作用物質がデキサメタゾンである、請求項２９に記載の方
    法。
  31. 【請求項３１】 作用物質が4-APPである、請求項２９に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 非ウイルス型遺伝子送達の効率に影響を及ぼす遺伝的宿主
    因子を同定する方法であって、 a) 目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドを、第1系統の動物にin vivoで非ウ イルス的に送達すること、 b) 第1の動物における遺伝子発現のレベルおよび程度を評価すること、 c) 目的の遺伝子を第2系統の動物にin vivoで非ウイルス的に送達すること、 d) 第2の動物における遺伝子発現のレベルおよび程度を評価すること、および e) 第1系統の遺伝子型を第2系統の遺伝子型と比較すること を含んでなる、上記方法。
  33. 【請求項３３】 動物が哺乳動物である、請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 哺乳動物がマウスである、請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 第1系統がICBマウスであり、第2系統がSwiss Websterマウ
    スまたはFVBマウスである、請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 哺乳動物がヒトである、請求項３３に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 動物において遺伝子治療を用いて遺伝子の送達および発現
    を最適化する方法であって、 遺伝子治療のために選択された動物の遺伝子型を決定すること、および 動物の該遺伝子型に対する遺伝子の送達方法を最適化すること を含んでなる、上記方法。
  38. 【請求項３８】 動物がマウスである、請求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 a) 目的の遺伝子、 b) 目的の遺伝子に機能し得るように連結された少なくとも2個のエンハンサー
    ／プロモーター領域 を含んでなる、エピソームベクター。
  40. 【請求項４０】 c) 細胞保持配列 をさらに含む、請求項３９に記載のベクター。
  41. 【請求項４１】 エンハンサー／プロモーター領域の１つが組織特異的プロ
    モーターである、請求項３９に記載のベクター。
  42. 【請求項４２】 細胞保持配列に結合する細胞保持活性をさらにコードする
    、請求項３９に記載のベクター。
  43. 【請求項４３】 a) 生体適合性のカチオン性脂質またはカチオン性ポリマ ー、 b) 中性脂質、および c) 請求項３９に記載のベクター を含んでなる、カチオン性分子／DNA複合体。
  44. 【請求項４４】 カチオン性脂質が累計すると約60％未満のコレステロール
    またはDOPEを含む、請求項４３に記載の複合体。
  45. 【請求項４５】 デキストラン40および乳酸加リンガーを含む溶液中で形成
    された、請求項４３に記載の複合体。
  46. 【請求項４６】 ５％デキストロースを含む溶液中で形成された請求項４３
    に記載の複合体。
  47. 【請求項４７】 動物における腫瘍の成長を抑制する方法であって、アンギ
    オスタチン、エンドスタチン、p53、GM-CSF、TIMP-2、CC3およびBAXからなる群 から選択される遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを動物に送達すること
    を含んでなり、該遺伝子産物がポリヌクレオチドから発現され、動物における腫
    瘍の成長を抑制するものである、上記方法。
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