DE60034478T2 - Vektoren und transgene mit regulatorischen elementen zur genverabreichung in leber - Google Patents

Vektoren und transgene mit regulatorischen elementen zur genverabreichung in leber Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Vehikelkonstrukte zur Ablieferung von Nukleinsäure, welche in Zielzellen, nämlich Hepatozyten und anderen Leberzellen, besser exprimiert werden können.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Fähigkeit, Nukleinsäuren abzuliefern, welche transportiert werden von Ablieferungsvehikeln, z.B. rekombinanten Viren (Adenovirus, Adeno-assoziierter Virus, Herpesvirus, Retrovirus), die mit Nukleinsäuremolekülen, wie etwa einem Plasmid, umfassend ein Transgen, verwendet werden um eine Zielzelle zu transfizieren; molekulare Konjugatvektoren; und modifizierte virale Vektoren sind wichtig für die potenzielle Behandlung von Erbkrankheiten mittels Genablieferung.
  • Adenovirus ist ein nicht-umhülltes nukleares DNA-Virus mit einem Genom von etwa 36 kb. Siehe im Allgemeinen Horwitz, M. S., "Adenoviridae and Their Replication", in Virology, 2. Auflage, Hrsg. Fields et al., Raven Press, New York, 1990. Rekombinanten (Adenovirus-Dodekaeder und rekombinante Adenovirus-Konglomerate) für spezifische Zelltypen sind geeignet für verschiedene Anwendungen in Onkologie, Entwicklungsbiologie und Gentherapie. Adenoviren haben Vorteile zur Verwendung als Expressionssysteme für Nukleinsäuremoleküle, die unter anderem für Proteine, Ribozyme, RNA, antisense-RNA kodieren, welche für den Adenovirus-Träger fremd sind (d.h. ein Transgen), umfassend Tropismus für sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen, minimales pathogenes Potential, die Fähigkeit, zu einem hohen Titer zu replizieren, für die Herstellung von Vektorvorrat, und das Potential, große Inserts aufzunehmen. Siehe Berkner, K. L., 1992, Curr. Top. Micro. Immunol., 158:39–66; Jolly, D., 1994, Cancer Gene Therapy, 1:51–64.
  • Adenoviren haben einen natürlichen Tropismus für Zellen der Atemwege, was sie zu attraktiven Vektoren zur Verwendung bei der Ablieferung von Genen an Zellen der Atemwege gemacht hat. Beispielsweise wurden und werden Adenovirus-Vektoren konstruiert zur Verwendung bei der Behandlung von bestimmten Krankheiten, wie etwa Mukoviszidose (CF, cystic fibrosis): der häufigsten autosomal rezessiven Erkrankung bei Kaukasiern. Bei CF stören Mutationen im Gen für den Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) die cAMP-regulierte Chloridkanal-Funktion, was zu einer Funktionsstörung der Lunge führt. Es wurde herausgefunden, dass die Genmutationen für veränderte CFTR-Proteine kodieren, die nicht für ihre richtige Funktion zur Zellmembran transloziert werden können. Das CFTR-Gen wurde in Adenovirus-Vektoren eingebracht um CF in verschiedenen Tiermodellen und in Humanpatienten zu behandeln. Insbesondere haben Studien gezeigt, dass Adenoviren vollkommen in der Lage sind, CFTR an Luftwegsepithelien von CF-Patienten abzuliefern, sowie an Luftwegsepithelien von Baumwollratten und Primaten. Siehe z.B. Zabner et al., 1994, Nature Genetics, 6:75–83; Rich et al., 1993, Human Gene Therapy, 4:461–476; Zabner et al., 1993, Cell 75:207–216; Zabner et al., 1994, Nature Genetics, 6:75–83; Crystal et al., 1004, Nature Genetics, 8:42–51; Rich et al., 1993, Human Gene Therapy, 4:461–476.
  • Es wäre jedoch nützlich, das Genom von Adenovirus zu ändern, um dessen Verwendung zur Ablieferung eines Nukleinsäuremoleküls zu ermöglichen, welches verstärkt in der Leber exprimiert würde, insbesondere in Hepatozyten.
  • Es wäre nützlich, die Expression des von dem Adenovirus-Vektor transportierten Transgens durch die Verwendung von einem oder mehreren spezialisierten regulatorischen Elementen zu vermitteln. Auf diese Weise kann die Expression des Transgens in gewünschten Zellen verstärkt werden, und können die Wirkungen des Adenovirus zielgenau auf bestimmte Zellen oder Gewebe in einem Organismus gerichtet werden.
  • Wie Adenoviren wurden auch Retroviren zur Ablieferung von Transgenen an Zielzellen verwendet. Wie vorstehend angegeben ist ein Transgen ein Nukleinsäuremolekül, welches unter anderem für ein Protein, RNA, Ribozym, antisense-RNA kodiert, das bzw. die nicht von dem Virus produziert wird. Der Durchmesser von Retrovirus-Virionen liegt im Bereich von 80 bis 130 nm, und sie bestehen aus einem Proteinkapsid, das mit Lipid eingekapselt ist. Das virale Genom ist zusammen mit den Proteinen Integrase und reverser Transkriptase in dem Kapsid eingeschlossen. Das Retrovirus-Genom besteht aus zwei RNA-Strängen. Nachdem das Virus in die Zelle eingedrungen ist, synthetisiert die reverse Transkriptase virale DNA unter Verwendung der viralen RNA als deren Templat. Die zelluläre Maschinerie synthetisiert danach die komplementäre DNA, welche danach zirkularisiert wird und in das Wirtsgenom insertiert wird. Nach der Insertion wird das virale RNA-Genom transkribiert und die virale Replikation ist vollständig.
  • Beispiele von Retroviren umfassen Moloney Maus-Leukämie-Virus (Mo-MuLV, Moloney murine leukemia virus), HTLV und HIV-Retroviren. Mo-MuLV-Vektoren werden am häufigsten verwendet und werden einfach hergestellt, indem man virale Gene, welche für die Replikation erforderlich sind, durch die gewünschten Transgene, die transferiert werden sollen, ersetzt. Das Genom in retroviralen Vektoren enthält eine lange terminale Wiederholungssequenz (LTR, long terminal repeat) an jedem Ende, mit dem gewünschten Transgen oder den gewünschten Transgenen dazwischen. Das am häufigsten verwendete System zur Erzeugung von retroviralen Vektoren besteht aus zwei Teilen, dem retroviralen Vektor und der Verpackungszelllinie.
  • Retroviren werden typischerweise in Bezug auf ihr Wirtsspektrum klassifiziert. Ecotropische Viren sind beispielsweise Viren, die an Rezeptoren binden, die nur in Mäusen vorkommen, und sind nur fähig, in der Spezies Maus zu replizieren. Xenotropische Viren binden an Rezeptoren, die auf allen Zellen in den meisten Spezies außer denen von Maus gefunden werden. Polytropische und amphotropische Viren binden an verschiedene Rezeptoren, die sowohl in der Spezies Maus als auch in von Maus verschiedenen Spezies gefunden werden. Das Wirtsspektrum wird primär bestimmt durch die Bindungswechselwirkungen zwischen Glykoproteinen der viralen Hülle und spezifischen Proteinen auf der Oberfläche von Wirtszellen, die als virale Rezeptoren wirken. Beispielsweise dient in Mauszellen ein Aminosäuretransporter als der Rezeptor für das Hüllglykoprotein gp70 von ecotropischem Moloney Maus-Leukämie-Virus (Mo-MuLV). Der Rezeptor für das amphotropische MoMuLV wurde vor kurzem kloniert und zeigt Homologie zu einem Phosphattransporter. Es gibt sechs bekannte Rezeptoren für Retroviren: CD4 (für HIV); CAT (für MLV-E (ecotropisches Maus-Leukämie-Virus-E); RAM1/GLVR2 (für Maus-Leukämie-Virus-A (MLV-A)); GLVR1 (für Gibbonaffe-Leukämie-Virus (GALV) und Katze-Leukämie-Virus-B (FeLV-B). Die Rezeptoren RAM1 und GLVR1 werden in Humangeweben in breitem Umfang exprimiert.
  • Verpackungszelllinien für Retroviren stellen alle die viralen Proteine bereit, welche für die Produktion von Kapsid und die Virionenreifung des Vektors erforderlich sind, d.h. die Gene gag, pol und env. Bei den MMLV-Vektoren ist es die Verpackungszelllinie, welche bestimmt ob der Vektor ecotropisch, xenotropisch oder amphotropisch ist. Die Auswahl der Verpackungszelllinie bestimmt die Zellen, auf welche abgezielt wird. Somit ist die Nützlichkeit von Retroviren für Gentransfer durch die Tatsache begrenzt, dass sie Rezeptor-spezifisch sind.
  • Retroviren sind jedoch nützlich für Systeme zur Ablieferung von Genen, da sie eine hohe Infektionseffizienz haben, und da die retrovirale Nukleinsäure (nach reverser Transkription) in das Wirtsgenom integriert, was zu einer Langzeitexpression der von dem Vektor transportierten Transgene führt. Typische retrovirale Vektoren sind jedoch dahingehend eingeschränkt, dass sie für Infektiosität sich teilende Zellen benötigen. Weiterhin ist die in vivo Ablieferung dieser Vektoren gering und nur dann effektiv, wenn man mit Helferzelllinien infiziert. Somit wäre es nützlich, über ein System zur Erhöhung der Effizienz retroviraler Infektion zu verfügen.
  • Es gibt bestimmte Situationen, bei denen es nützlich wäre, die Expression von Transgenen, welche von Viren transportiert werden, zu modifizieren. Beispielsweise könnte eine Gewebe-spezifische Expression des Transgens in Zielzellen die Infektionseffizienz erhöhen, und folglich könnte ein kleineres Virusvolumen im Körper effektiv sein. Es wäre nützlich, über ein Verfahren zu verfügen, um die Expression des Transgens in einer Gewebe-spezifischen Weise nach oben zu regulieren.
  • Ein Verfahren um darauf abzuzielen, dass spezifische Zellpopulationen ein interessierendes Protein exprimieren, besteht darin, heterologe regulatorische Elemente zu verwenden, die spezifisch in den gewünschten Zielgewebe- oder Zielzellpopulationen exprimiert werden. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung von Kombinationen von Gewebespezifischen Enhancern, Promotoren und/oder anderen regulatorischen Elementen. Die regulatorischen Elemente können konstitutiv oder induzierbar sein, so dass sie durch die Abwesenheit oder Gegenwart von anderen DNA-Sequenzen, Proteinen oder anderen Elementen oder Umweltfaktoren reguliert werden. Wenn das interessierende Transgen ein zytotoxisches Gen ist, wäre lückenhaft kontrollierte Expression in hohem Maße unerwünscht.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung verbesserte regulatorische Elemente bereit, welche geeignet sind für die zielgerichtete Expression von Transgenen in der Leber. Die erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfassen Kombinationen von Promotor- und Enhancer-Elementen, welche die Expression von Transgenen präferentiell in der Leber dirigieren können. In besonderen Ausführungsformen der Erfindung werden die regulatorischen Elemente in rekombinanten Vektoren verwendet, wie etwa Vektoren auf Basis von nicht-viralen Plasmiden. Die erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfassen rekombinante Vektoren, welche für die Expression von Transgenen geeignet sind, insbesondere für hohe Expression und Langzeitexpression in der Leber.
  • Die Transgene können in rekombinanten Vektoren verwendet werden, wie etwa rekombinanten viralen Vektoren, für eine zielgerichtete Expression der assoziierten kodierenden DNA-Sequenzen präferentiell in der Leber. In erfindungsgemäßen Ausführungsformen ist der starke konstitutive Promotor aus der Gruppe, umfassend den humanen Serum-Albumin-Promotor und den α-1-Anti-Trypsin-Promotor, ausgewählt.
  • In Ausführungsformen der Erfindung werden die Leber-spezifischen Enhancer-Elemente ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus humanem Prothrombin-Enhancern [HPrT] und α-1 Mikroglobulin-Enhancern. Zwei dieser Leber-spezifischen Enhancer-Elemente werden in Kombination mit dem Promotor verwendet. In einer Ausführungsform werden die Enhancer-Elemente ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HPrT-Enhancern und A1MB-Enhancern, und werden in Kombination mit dem α-1-Anti-Trypsin-Promotor verwendet.
  • Die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind rekombinante virale Vektoren, insbesondere adenovirale Vektoren. In den bevorzugten Ausführungsformen kann die kodierende DNA-Sequenz für ein therapeutisches Protein kodieren, welches bei Ablieferung an die Leber am effektivsten ist. Die adenoviralen Vektoren können zusätzlich zu den Promotoren und Enhancern der vorliegenden Erfindung eines oder mehrere adenovirale Gene umfassen, um die effiziente Expression der kodierenden DNA-Sequenz zu unterstützen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine Abbildung der Transkriptionsfaktor-Bindestellen, welche in den Promotorregionen von CMV, HSA und α-1-Anti-Trypsin vorhanden sind.
  • 2 ist eine Abbildung der Transkriptionsfaktor-Bindestellen, welche in den HSA-Enhancern (HSA-1.7, Nukleotide -1806 bis -1737; HSA-6, Nukleotide -6081 bis -6000), einem humanen Prothrombin-Enhancer (-940 bis -860), einem α-1 Mikroglobulin-Enhancer (-2806 bis -2659) und einem Aldolaseintron-Enhancer (+1916 bis +2329) vorhanden sind.
  • 3 ist eine schematische Darstellung einer anfänglichen Reihe von Enhancer/Promotor-Kombinationen. Gruppe A gibt die Kombinationen der HSA-Enhancer an, die entweder mit dem mCMV- oder dem HSA-Promotor verknüpft waren. Die Gruppen B und C stellen die Kombinationen von entweder dem humanen Prothrombin-(HPrT) oder dem α-1 Mikroglobulin-(A1MB)Enhancer, verknüpft mit dem mCMV-Promotor, dar. Die Gruppen D und E stellen die Kombinationen von entweder HPrT oder A1MB, verknüpft mit dem α-1-Antitrypsin-Promotor, dar.
  • 4 zeigt die Expression vom mCMV-Promotor im Vergleich zu der des hCMV-Promotors, und die Wirkungen einer Hinzufügung von mehreren HSA-Enhancern (HSA-1.7 und HSA-6).
  • 5 zeigt die Expression von Konstrukten, die den HPrT-Enhancer enthalten. Die Verknüpfung dieses Enhancers mit dem mCMV-Promotor (Graph B) erhöhte die Expression nahezu auf Werte, die mit dem CMV-Promotor erreicht worden waren, überstieg sie jedoch nicht. Expression vom α-1-Anti-Trypsin-Promotor war ziemlich mäßig, wenn jedoch zwei Kopien des HPrT-Enhancers hinzugefügt werden übersteigt die Expression von dieser Kombination diejenige vom CMV-Promotor.
  • 6 zeigt Expressionsergebnisse von Konstrukten, die den A1MB-Enhancer enthalten. Eine progressiv steigende Expression wird erkannt mit einer zunehmenden Kopienzahl dieses Enhancers (bis zu acht Kopien), verknüpft mit dem mCMV-Promotor (Graph C). Alle Kombination von Kopien dieses Enhancers, verknüpft mit dem α-1-Anti-Trypsin-Promotor, ergaben Expressionswerte, welche vergleichbar waren zu denen, die mit dem CMV-Promotor erhalten worden waren (Graph E).
  • 7 zeigt Expressionsergebnisse, welche erhalten wurden mit repräsentativen Kandidaten von jeder Vektorreihe, die im Vergleich mit dem CMV-Promotor äquivalente oder höhere Werte der α-Galactosidase-Expression ergaben.
  • 8 zeigt die Expression von FVIII in hellbraunen SCID-Mausen. Die verwendeten FVIII-Expressionskassetten enthielten entweder den CMV-Promotor oder einen Hybridpromotor, zusammengesetzt aus zwei Kopien des hprt-Enhancers, verknüpft mit einem humanen α-1-Anti-Trypsin-Promotorfragment (Hprt(2)AAT). Zehn μg Plasmid-DNA, enthaltend jede Kassette, wurden über die Schwanzvene von hellbraunen SCID-Mäusen injiziert, unter Verwendung von Mirus Plasmidablieferungstechnologie. Den Mäusen wurde an den Tagen Eins, Sieben und Vierzehn nach der Injektion Blut abgenommen, und die FVIII Konzentrationen im Plasma wurden mittels eines ELISA, der für humanen FVIII spezifisch ist, bestimmt. Jeder Balken stellt die mittlere FVIII-Expression im Plasma von vier Mäusen dar.
  • Die an Tag Eins nachgewiesenen Expressionswerte waren vergleichbar in Mäusen, welche ein beliebiges Plasmid empfangen hatten, was darauf hindeutet, dass der Hybridpromotor Expressionswerte ergeben konnte, welche annäherungsweise denen des CMV-Promotors entsprachen. Die Expression vom CMV-Promotor war jedoch transient und sank am Tag Sieben unter die Nachweisgrenze, während die Expression vom Hybridpromotor bis Tag Vierzehn (dem letzten Zeitpunkt dieses Experiments) andauerte. Dies legt nahe, dass dieser Hybridpromotor eine bessere Wahl ist, um eine Langzeitexpression eines Transgens in der Leber zu erreichen.
  • 9 zeigt die AAV-vermittelte Expression von rekombinantem humanem Erythropoietin [EPO] in Mäusen. Von Promotor-Studien in kultivierten Hep3 B Zellen wurden mehrere Enhancer/Promotor-Kombinationen als viel versprechende Kandidaten identifiziert, um eine Langzeitexpression in der Leber zu erreichen. Aus diesem Spektrum von Kombinationen wurden mehrere in AAV-Vektoren kloniert, um ihre Eignung zu testen, die Expression von rekombinantem humanem EPO anzutreiben. 1 × 1011 Partikel jedes AAV-Vektors wurden NCR-Nacktmäusen mittels Injektion in die Pfortader verabreicht. An den Tagen 14, 28 und 42 nach der Injektion wurde den Mäusen retroorbital Blut abgenommen, und EPO-Konzentrationen wurden mittels eines für humanes EPO spezifischen ELISA bestimmt. Alle in der vorstehenden Figur gezeigten Promotoren ergaben eine andauernde Expression bis zum Tag 42. Aus dieser Analyse gehen jedoch drei Enhancer/Promotor-Kombinationen hervor als die am meisten versprechenden um hohe, andauernde Expressionswerte zu ergeben. Zwei Kopien des hprt-Enhancers, verknüpft mit entweder dem α-1-AT- oder dem HSA-Promotor, und zwei Kopien des α-1 Mikroglobulin-Enhancers, verknüpft mit dem α1-AT-Promotor, ergaben eine Expression im Bereich von 1500 bis 3000 mU EPO/ml oder von 300 μg bis 600 μg Protein/ml.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Ablieferung von Genen in die Leber für therapeutische Zwecke ist intensiv untersucht worden. Dies schließt Untersuchungen ein, welche auf eine Korrektur von Erbkrankheiten der Leber abzielten, sowie systemische Erkrankungen, welche korrigiert werden könnten unter Verwendung der Leber als ein Depot für die Produktion von therapeutischem Protein. Damit dieser Gentherapie-Ansatz machbar wird, muss die Expression des therapeutischen Gens über einen langen Zeitraum erfolgen und annähernd geeignete Konzentrationen erreichen. In verschiedenen Berichten wurde die Verwendung einer Reihe von viralen, nicht-viralen und Leber-spezifischen Promotoren sowie von verschiedenen Enhancer/Promotor-Kombinationen im Kontext von Vektoren auf Basis von Adenoviren, AAV, Retroviren und Plasmiden zur Genexpression in kultivierten Zellen und in vivo untersucht. Bei vielen dieser Beispiele war die Expression des Transgens transient und/oder nicht ausreichend um einen therapeutischen Nutzen zu erzielen. Im Kontext von adenoviralen Vektoren dirigieren der CMV-Promotor und der RSV-Promotor hohe Werte der Expression des Transgens, die Langlebigkeit der Expression hängt jedoch davon ab, dass die adenovirale E4-Region im Vektor beibehalten wird. Die Entwicklung einer Enhancer/Promotor-Kombination, welche lang andauernde und geeignete Werte der Expression eines Transgens im Kontext einer Reihe von Vektorsystemen dirigieren könnte, wäre somit von Nutzen.
  • Promotoren, welche für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind der humane Serum-Albumin-Promotor [HAS] und der α-1-Anti-Trypsin-Promotor.
  • Die Leber-spezifischen Enhancer-Elemente, welche für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind humane Prothrombin-Enhancer und α-1 Mikroglobulin-Enhancer. In bevorzugten Ausführungsformen können mehrere Enhancer-Elemente kombiniert werden, um eine höhere Expression zu erreichen.
  • Zu den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gehören Vektoren, umfassend zwei Enhancer-Elemente, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HPrT-Enhancern und A1MB-Enhancern, in Kombination mit einem α-1-Anti-Trypsin-Promotor.
  • Die Strategie, um hohe und lang andauernde Werte der Expression eines Transgens zu erreichen, umfasst das Kombinieren von Promotor-Elementen, welche das Potential haben, effektive und lang andauernde Expressionswerte zu dirigieren, mit Leber-spezifischen Enhancer-Elementen, welche die Expression weiter erhöhen können. Der humane Serum-Albumin-Promotor und der α-1-Anti-Trypsin-Promotor enthalten Elemente, welche eine basale, jedoch Leber-spezifische Expression dirigieren. Die Transkriptionsfaktor-Bindestellen in diesen Promotor-Regionen sind in 1 abgebildet. Die hier verwendeten Enhancer-Elemente umfassen zwei HSA-Enhancer (HSA-1.7, Nukleotide -1806 bis -1737; HSA-6, Nukleotide -6081 bis -6000), einen humanen Prothrombin-Enhancer (-940 bis -860), einen α-1 Mikroglobulin-Enhancer (-2806 bis -2659) und einen Aldolaseintron-Enhancer (+1916 bis +2329). Es ist gezeigt worden, dass jeder dieser Enhancer bei Verknüpfung mit einem Minimalpromotor die Expression eines Transgens erheblich steigert, und Transkriptionsfaktor-Bindestellen in diesen Enhancer-Elementen sind in 2 abgebildet. 3 ist eine schematische Darstellung einer anfänglichen Reihe von Enhancer/Promotor-Kombinationen. Gruppe A gibt die Kombinationen der HSA-Enhancer an, die entweder mit dem mCMV- oder dem HSA-Promotor verknüpft waren. Die Gruppen B und C stellen die Kombinationen von entweder dem humanen Prothrombin-(HPrT) oder dem α-1 Mikroglobulin-(A1MB)Enhancer, verknüpft mit dem mCMV-Promotor, dar. Die Gruppen D und E stellen die Kombinationen von entweder HPrT oder A1MB, verknüpft mit dem α-1-Anti-Trypsin-Promotor, dar.
  • Jede dieser Enhancer/Promotor-Kombinationen wurde mit α-Galactosidase verknüpft, und wurde in Hep3 B-Zellen auf Aktivität getestet, durch Messen der Konzentrationen von α-Galactosidase im Mediumüberstand nach transienter Transfektion. Wie in 4 gezeigt ist die Expression vom mCMV-Promotor im Vergleich zum CMV-Promotor verringert. Die Kombination von fünf Kopien des HSA-1.7-Enhancers mit einer Kopie des HSA-6-Enhancers, verknüpft mit dem mCMV-Promotor, ergab jedoch eine Expression, die höher war als diejenige, welche mit dem CMV-Promotor erhalten wurde. Die Expressionsergebnisse von Konstrukten, welche den HPrT-Enhancer enthalten, sind in 5 gezeigt. Die Verknüpfung dieses Enhancers mit dem mCMV-Promotor (Graph B) erhöhte die Expression nahezu auf Werte, die mit dem CMV-Promotor erreicht worden waren, überstieg diese jedoch nicht. Die Expression vom α-1-Anti-Trypsin-Promotor war ziemlich mäßig, wenn jedoch zwei Kopien des HPrT-Enhancers hinzugefügt werden, übersteigt die Expression von dieser Kombination diejenige vom CMV-Promotor. Die Expressionsergebnisse von Konstrukten, welche den A1MB-Enhancer enthalten, sind in 6 gezeigt. Mit zunehmender Kopienzahl dieses Enhancers (bis zu acht Kopien), verknüpft mit dem mCMV-Promotor, wird eine progressiv steigende Expression erkannt (Graph C). Alle Kombinationen von Kopien dieses Enhancers, verknüpft mit dem α-1-Anti-Trypsin-Promotor, ergaben Expressionswerte, welche mit denjenigen vergleichbar sind, die mit dem CMV-Promotor erhalten wurden (Graph E). Repräsentative Kandidaten von jeder Vektorreihe, welche äquivalente oder höhere Werte von α-Galactosidase-Expression im Vergleich zu dem CMV-Promotor ergaben, wurden in einem einzelnen Experiment getestet. Wie in 7 gezeigt, ergaben alle Enhancer/Promotor-Kombinationen vergleichbare Expression, wobei die Expression von den Promotoren HSA-1.7(5) HSA-6(1)mCMV und HPrT(2)A1AT am höchsten war. Diese Ergebnisse zeigen, dass durch Kombination von mehreren Kopien von Leber-spezifischen Enhancern mit verschiedenen Promotor-Elementen hohe Expressionswerte erreicht werden können.
  • BEISPIELE
  • 1. Plasmidkonstruktionen
  • Der alpha-eins-Anti-Trypsin-Promotor (-1200 bis +44) wurde PCR-amplifiziert mit Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) von einem hauseigenen pBr322-Vektor, welcher ein 19 kb genomisches SalI-Fragment enthält, das Human-PI enthält, abgeleitet von dem Phagenklon αNN (Dycaico et al., Science 242:1409–1412, 1988). Der Promotor wurde danach zwischen die HindIII-EcoRI-Stellen von pBluescript II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) kloniert, wodurch pBs A1AT erzeugt wurde. Die Sequenz wurde analysiert unter Verwendung eines automatisierten Sequencers PE Biosystems 377. Die Hybrid-α-Galactosidase-Kassette von einem hauseigenen Vektor wurde in die SpeI-Stelle von pBs A1AT kloniert, wodurch pBs A1AT HI AGAL erzeugt wurde. Die alpha-eins-Anti-Trypsin-Hybrid-Intron-alpha-Galactosidase-Kassette wurde danach in den pAdQuick (früher pAdvantage) Shuttlevektor Sv2 ICEU I subkloniert, wodurch Sv2 A1AT HI AGAL erzeugt wurde.
  • Humane Leber-spezifische Enhancer-Elemente von Albumin 60 bp und 81 bp (1,7 kb bzw. 6 kb von der Transkriptionsinitiationsstelle), Prothrombin 81 bp (-940 bis -860) und Alpha-1 Mikroglobulin/Bikunin 154 bp (-2806 bis -2653) wurden über PCR von genomischer DNA oder durch Oligosynthese erhalten. Mehrere Kopien wurden in Bluescript II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) kloniert. Diese Enhancer-Elemente wurden danach über Cla1-Stu1 in Sv2 A1AT HI AGAL subkloniert, wobei der alpha-eins-Anti-Trypsin-Promotor auf (-844 bis +44) verkürzt wird, oder über Cla1-SnaB1 in den hauseigenen Vektor Sv2 CMV HI AGAL 11 subkloniert, wobei der Wildtyp-Cytomegalovirus-Promotor auf (-245 bis -14) verkürzt wird.
  • 2. Hep3 B-Transfektionen
  • Platten mit sechs Vertiefungen wurden mit Hep3 B-Zellen in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Vertiefung angeimpft. 2,5 μg verdünntes Enhancer-Konstrukt + 2,5 μg CMV B (Stratagene, La Jolla, CA, USA) in 1,5 ml opti-mem reduziertem Serummedium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA). 20 μl verdünntes Lipofectamin 2000 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) in 1,5 ml opti-mem reduziertem Serummedium. Die zwei Lösungen wurden gemischt und danach 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Während sich Komplexe bildeten, wurden Zellen zweimal mit opti-mem reduziertem Serummedium gespült. Inkubierte Zellen mit der Lipidlösung (1,5 ml Lösung pro Vertiefung) für 3–4 Stunden bei 37°C in einem 5% CO2-Inkubator. Zellen wurden einmal mit 1 × PBS gespült, und die Lipidlösung wurde ersetzt durch 2 ml Mem-Medium, enthaltend 1 mM Natriumpyruvat und 10% fötales Rinderserum (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA).
  • 3. Alpha-Galactosidase-Fluoreszenzassay
  • Einhundert Mikroliter Überstand von Hepatom-Transfektionen wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen (Corning flat bottom) transferiert. Fünffache Verdünnungen wurden bis zu 1:125 hergestellt. Alpha-Galactosidase A-Enzym (Genzyme, Framingham, MA, USA) wurde zweifach verdünnt von 1250 μU/ml bis zu 19,5 μU/ml, um eine Standardkurve zu erzeugen. Substratlösung (1,69 mg/ml 4-Methylumbelliferyl-a-D-Galactosid und 26 mg/ml N-Acetyl-D-Galactosamin) in einem Puffer, enthaltend 27 mM Zitronensäure, 46 mM dibasisches Natriumphosphat, pH 4,4, wurde zu den Proben zugegeben. Die Proben wurden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden terminiert durch die Zugabe von fünfzig Mikrolitern einer einmolaren Natriumhydroxid-Lösung. Spectra Max Gemini (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA) wurden ausgelesen, mit einem 365 nm Erregungsfilter und einem 450 nm Emissionsfilter. Alpha-Galactosidase-Aktivität wurde normalisiert auf α-Galactosidase-Aktivität in Transfektion-Zelllysaten unter Verwendung des Kits Galacto-light Plus (Tropix, Redford, MA, USA). Alle Reagenzien für den α-Galactosidase-Assay wurden von Sigma, St. Louis, MO, USA, bezogen.
  • Die Erfindung wurde ausführlich, unter besonderer Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsformen davon, beschrieben.

Claims (7)

  1. Rekombinanter Vektor, umfassend zwei Kopien des humanen Prothrombin-Enhancers wirksam verbunden mit dem humanen Serum-Albumin-Promotor.
  2. Rekombinanter Vektor, umfassend zwei Kopien des humanen Prothrombin-Enhancers wirksam verbunden mit einem α-1-Anti-Trypsin-Promotor.
  3. Rekombinanter Vektor, umfassend zwei Kopien des α-1 Mikroglobulin-Enhancers und einen α-1-Anti-Trypsin-Promotor.
  4. Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 1–3, weiter umfassend eine kodierende Sequenz von Interesse.
  5. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 4, wobei die kodierende Sequenz alpha-Galactosidase ist.
  6. Rekombinantes DNA-Virus, umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 1–5.
  7. Rekombinantes DNA-Virus nach Anspruch 6, wobei das DNA-Virus ein adeno-assoziiertes Virus oder ein Adenovirus ist.
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