DE69914382T2

DE69914382T2 - Verwendung der Leserahmen der adenoviralen E4-Region zur Verbesserung der Genexpression

Info

Publication number: DE69914382T2
Application number: DE69914382T
Authority: DE
Inventors: Majid Mehtali; Monika Lusky
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1998-07-07
Filing date: 1999-07-01
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2019-07-02
Also published as: EP0974668A1; ATE258228T1; DK1199368T3; DE69903229T2; ES2180258T3; EP0974668B1; PT1199368E; AU3800999A; US6475480B1; DE69914382D1; DK0974668T3; EP1199368A3; JP2000106875A; EP1199368B1; ES2210081T3; AU756607B2; CA2276791A1; PT974668E; DE69903229D1; HK1043390A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten adenoviralen Vektor, dessen E1-Region ganz oder teilweise und dessen E4-Region teilweise deletiert ist, jedoch noch genug E4-Sequenzen enthält, um die Expression und/oder das Andauern der Expression eines rekombinanten Gens in einer Wirtszelle oder einem Wirtsorganismus zu verbessern. Weiterhin betrifft sie die Verwendung adenoviraler offener E4-Leserahmen (ORFs) zur Verbesserung der Expression oder des Andauerns der Expression eines rekombinanten Gens in einem Expressionsvektor. Schließlich betrifft die Erfindung eine Methode zur Herstellung eines Viruspartikels, einer Zelle, eines Arzneimittels, das/die solche Vektoren beinhaltet, sowie deren therapeutische oder prophylaktische Verwendung. Die Erfindung ist hinsichtlich ihrer Möglichkeiten für eine Gentherapie, besonders beim Menschen, von äußerst speziellem Interesse.
Gentherapie kann als Übertragung genetischen Materials in eine Zelle oder einen Organismus definiert werden, um eine erbliche oder eine erworbene Krankheit zu behandeln oder ihr vorzubeugen. Die Möglichkeit, menschliche Leiden durch Gentherapie zu behandeln, hat sich innerhalb weniger Jahre vom Stadium der theoretischen Betrachtung zu jenem der klinischen Anwendung entwickelt. Die erste Anwendung beim Menschen wurde im September 1990 in den USA begonnen, und zwar bei einem Patienten, der eine genetisch bedingte Immunschwäche als Folge einer Mutation des Adenin-Desaminase (ADA) codierenden Gens aufwies. Der relative Erfolg dieses ersten Versuches ermutigte zur Entwicklung dieser Technologie für verschiedene erbliche und erworbene Krankheiten. Die große Mehrheit der heutigen Verfahren verwendet Vektoren zur Übertragung des therapeutischen Gens in die zu behandelnden Zellen. Zahlreiche virale oder synthetische Vektoren wurden in den letzten Jahren entwickelt. Ihre Struktur, ihr Aufbau und ihre Biologie sind in der Fachleuten allgemein zugänglichen Literatur beschrieben.
Adenoviren wurden in vielen Tierarten entdeckt; sie sind nicht integrativ und nicht sehr pathogen. Sie können viele verschiedene, sowohl im Teilungs- als auch im Ruhezustand befindliche Zelltypen infizieren. Sie weisen einen natürlichen Tropismus auf Atemwegsepithelien auf. Auch werden sie seit vielen Jahren mit einem ausgezeichneten Sicherheitsprofil als lebende Darmimpfstoffe verwendet. Schließlich können sie mit Leichtigkeit in großen Mengen gezüchtet und gereinigt werden. Diese Eigenschaften haben Adenoviren für die Benützung als Gentherapievektoren zu therapeutischen und Impfungszwecken besonders geeignet werden lassen. Ihr Genom besteht aus einem linearen, doppelsträngigen DNA-Molekül von etwa 36 kB, das mehr als etwa 30 Gene enthält, die für den Virenzyklus nötig sind. Die frühen Gene sind in 4 Regionen (E1 bis E4) über das adenovirale Genom verteilt, die 6 von ihren eigenen Promotorn gesteuerte Transkriptionseinheiten enthalten. Die Regionen E1, E2 und E4 sind für die Virusreplikation unerläßlich, wogegen die E3-Region, von der man annimmt, daß sie die anti-Virus-Immunantwort des Wirtes steuert, für das in-vitro-Wachstum des Virus entbehrlich ist. Die späten Gene (L1 bis L5) codieren mehrheitlich die Strukturproteine der Viruskapsel. Sie überlappen zumindest teilweise mit den frühen Transkriptionseinheiten und werden von einem einzigen Promotor (MLP für "major late promoter"/Später Hauptpromotor) aus transkribiert. Zusätzlich trägt das adenovirale Genom an beiden Enden cis-aktive Regionen, die für die DNA-Replikation essentiell sind. Es sind dies die 5'- und die 3'-ITR (Invers repetitive terminale Sequenzen), sowie eine auf die 5'-ITR folgende Verpackungssequenz.
Es wird angenommen, daß die E4-Region an der Replikation der Virus-DNA, der späten mRNA-Synthese, dem Zusammenbau des Virus und der Abschaltung der Proteinsynthese des Wirtes beteiligt ist. Es handelt sich um eine komplexe Transkriptionseinheit, die eine Vielzahl von Polypeptiden codiert. Es wird angenommen, daß die von den offenen Leserahmen (ORFs) 6 und 7 codierten Polypeptide mit dem RB-Protein der Zelle um die Bindung an den E2F-Transkriptionsfaktor konkurrieren und als Transaktivatoren fungieren. Das Expressionsprodukt des ORF4 vermag die Phosphatase 2A der Zelle zu binden und so zu regulieren, daß diese ihrerseits die Aktivität der Virus (E1A)- und der zellulären Transkriptionsfaktoren moduliert. Die von den ORFs 3 und 6 codierten Polypeptide sind für das Wachstum des Virus essentiell, da sie das primäre aus dem adenoviralen Genom abgeleitete 28-kB-Transkript reifen lassen oder es ins Cytoplasma exportieren können. Ihr Fehlen könnte in trans ausgeglichen werden, um das Wachstum des Virus zu ermöglichen. Weiterhin wechselwirkt das ORF6-Polypeptid mit dem E1B codierten 55K-Polypeptid und bildet einen Komplex, der die Anhäufung von späten Boten im Cytoplasma auf Kosten der zellulären mRNA erleichtert.
Den derzeit in den Gentherapieverfahren verwendeten adenoviralen Vektoren fehlt der größte Teil der E1-Region, um eine Verbreitung in der Umgebung und im Wirtskörper zu verhindern. Zusätzliche Deletionen in der E3-Region erlauben es, die Clonierungskapazität zu erhöhen. Das Gen von Interesse wird in die Viren-DNA anstelle einer deletierten Region eingebaut. Die Machbarkeit von Gentransfer mittels dieser Vektoren der „ersten Generation" wurde anhand mehrerer Fälle nachgewiesen. Jedoch ist die Frage nach ihrer Sicherheit noch nicht abschließend geklärt. Tatsächlich ist die Wahrscheinlichkeit nicht vernachlässigbar, daß im Zug ihrer Vermehrung in konventionellen, komplementierenden Zellinien replikationsfähige Viren erzeugt werden. Weiterhin kann die potentielle Immunogenität von Virusproteinen, die noch vom Rückgrat des Virus exprimiert werden, den Fortbestand transduzierter Zellen ebenso verringern, wie die Langzeitexpression des rekombinanten Transgens, und sie kann auch mit Entzündungsvorgängen einhergehen.
Diese bedeutenden Unzulänglichkeiten haben zur Konstruktion der Vektoren der zweiten Generation geführt, die die für die Virenreplikation nötigen cis-Regionen (ITRs und Verpackungssequenzen) beibehalten und substantielle genetische Modifikationen enthalten, die auf Abschaffung der Restsynthese viralen Antigens abzielen, welches als verantwortlich für die Stimulation inflammatorischer Antworten angesehen wird (vgl. z. B. die internationale Patentanmeldung WO 94/28152 oder US 5,670,488 , die adenovirale Vektoren offenbart, deren E4-Sequenzen teilweise deletiert sind, mit Ausnahme von ORF3 oder ORF6/7, der keine E4-Komplementierung benötigt). Ein Minimalvektor, dem die gesamten adenoviralen Funktionen fehlen, kann ebenfalls in Betracht gezogen werden.
Eine anhaltende Transgenexpression ist Voraussetzung, bevor die allgemeine Verwendung von adenoviralen Vektoren in Gentherapieverfahren bei Menschen ins Auge gefaßt werden kann, besonders im Hinblick auf die Behandlung chronischer und Erbkrankheiten. Jedoch wurde neuerdings gezeigt, daß die Deletion der E4-Region die Transgenexpression verändert, die von einem heterologen Promotor (z. B. CMV-Promotor, RSV-LTR) gesteuert wird. Co-Infektionsstudien ergaben, daß E4-Produkte in trans geliefert werden können, um eine stabile Transgenexpression wiederherzustellen (Armentano et al., J. Virol. 71 (1997) 2408–2416; Brough et al., J. Virol. 71 (1997), 9206–9213). Armentano et al. (loc. cit.) beschreiben Konstruktionen, die entweder die komplette Wildtyp-E4-Region oder nur ORF6 beinhalten, oder bei denen die E4-Region vollständig deletiert ist. Brough et al. (loc. cit.) beschreiben Konstruktionen, die entweder die gesamte E4-Region oder aber gar keine E4-ORFs beinhalten.
WO 98/46781 beschreibt ein Transgen-Expressionssystem, das eine Transkriptionseinheit, eine E3-Kassette und eine E4-Kassette umfaßt, das heißt eine modifizierte E4-Region, die entweder (i) E4-ORF3 und wenigstens ein anderes Teilstück von E4, sei es ORF4, ORF6/7 oder ORF3/4; oder (ii) nur E4-ORF4 enthält.
Somit ist das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem die Bereitstellung von Expressionsvektoren, die nicht jene Instabilität der Transgenexpression zeigen, wie sie in E4-deletierten Adenovirus-Vektoren beobachtet wird, und die Bereitstellung von Mitteln, die die Erzielung einer Langzeitexpression eines Transgens in Zellen erlauben.
Dieses Problem ist mit der Bereitstellung der in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen rekombinanten Vektor, der ein an regulatorische Elemente funktionell gebundenes Gen von Interesse umfasst, wobei der Vektor eine Kombination aus offenen E4-Leserahmen umfaßt, die aus:

(i) ORF3 und ORF6 und ORF7; oder
(ii) ORF3 und ORF4; oder
(iii) ORFs 1, 2, 3 und 4

Überraschenderweise fanden wir, daß die verminderte Transgenexpression in E4-deletierten adenoviralen Vektoren durch die Gegenwart und die Expression bestimmter E4-ORFs, besonders der vorstehend erwähnten E4-ORFs, wieder vollständig hergestellt werden konnte.
Obwohl die E4-Region bei den verschiedenen Adenovirus-Stämmen unterschiedlich sein kann, läßt sie sich aufgrund der Nucleotidsequenzen identifizieren, die aus verschiedenen Quellen (Veröffentlichungen oder Datenbanken) erhältlich sind, oder aber über die Homologie zur genau beschriebenen Ad5-E4-Region. Hinweis: Die E4-Region befindet sich am rechten Ende des adenoviralen Genoms, wobei der E4-Promotor von 5' zu 3'-ITR liegt. Die Transkription geschieht von rechts nach links, bezogen auf die adenovirale Karte. Die E4-Region weist 7 offene Leserahmen auf, von denen 6 ein AUG-Startcodon enthalten (die ORFs 1, 2, 3, 4, 6 und 7) und codiert wenigstens 6 Polypeptide (das vom ORF7 codierte Protein konnte noch nicht bestimmt werden), welche durch Sequenzanalyse bestimmt werden können. mRNA-Kartierungsversuche haben auch zwei neue ORFs bestimmt, die durch mRNA-Spleißvorgänge erzeugt wurden, und zwar ORF3/4 und ORF6/7. Insbesondere reicht im Ad5-Genom ORF6 von nt 34074 bis 33192, ORF7 von nt 33111 bis 32913 und ORF6/7 von nt 34074 bis 33901 (Spleißdonor) und 33189 (Spleißakzeptor) bis 32913 (vgl. z. B. Cutt et al., J. Virol. 61 (1987), 543–552; Freyer et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 3503–3519; Virtanen et al., J. Virol. 51 (1984), 822–831). Somit kann ein rekombinanter adenoviraler Vektor nach dieser Erfindung unter anderem das ORF6 und das ORF7 beibehalten. Eine Konstruktion, die ORF6 und ORF7 beibehält, enthält sowohl ORF6 als auch ORF7, was zur Produktion der entsprechenden mRNAs und des Spleißproduktes ORF6/7 führen kann. Eine solche Sequenz wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als ORF6 + 7 bezeichnet. Darüberhinaus kann der rekombinante adenovirale Vektor nach dieser Erfindung auch ORF3 und ORF4 umfassen, was folgende Kombinationen einschließt: ORF3 und ORF3/4, ORF3/4 und ORF4, ORF3 und ORF4 oder nur ORF3/4. Der Durchschnittsfachmann vermag die vorgenannte E4-Region eines adenoviralen Genoms mittels konventioneller molekularbiologischer Verfahren so zu modifizieren, daß er eine E4-Region erhält, die die genannten ORFs beibehält und die übrigen Sequenzen nicht aufweist. Insbesondere liegt es sehr wohl im Bereich der Möglichkeiten des Durchschnittsfachmanns, aus einer adenoviralen E4-Region ein spezifisches Teilstück DNA zu deletieren, z. B. durch geeignete Restriktion oder Endonucleasespaltung und Religierung. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die beibehaltenen E4-Sequenzen durch PCR zu isolieren.
Es ist dem Fachmann möglich, jene ORFs der E4-Region zu bestimmen, die die Transgenexpression günstig beeinflussen, z. B. durch Deletion dieser ORFs aus der E4-Region und Feststellung der Auswirkungen auf die Transgenexpression. Darüberhinaus ist es möglich, den Effekt eines E4-ORF zu testen, indem man es in cis oder trans an einen E4-deletierten Vektor liefert, der ein Transgen trägt, und die Auswirkung auf die Transgenexpression bestimmt. Solche Methoden werden in den Beispielen dargestellt. Der/die im adenoviralen Vektor verbliebene(n) E4-ORF(s) kann bzw. können allein oder im Zusammenwirken direkt oder mittels anderer zellulärer oder viraler Faktoren die Expression eines Gens von Interesse, das in den adenoviralen Vektor eingebaut wurde, verbessern. Diese positive Wirkung auf die Transgenexpression kann auf verschiedenen Stufen ausgeübt werden: Transkription, Verlängerung, Transport, Stabilität der transgenen mRNA oder alternativ Translation. Die Verbesserung wird durch Bestimmung des transgenen Expressionsproduktes oder des Fortdauerns seiner Expression in in-vivo- oder in-vitro-Versuchen bestimmt.
Darüberhinaus können die adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung eine verringerte Hepatotoxizität im Vergleich zu Vektoren aufweisen, die die komplette E4-Region enthalten.
Vorzugsweise werden den rekombinanten adenoviralen Vektoren die gesamten Codierungssequenzen für einen oder mehrere der vorstehend erwähnten E4-ORF(s) belassen, die vom Initiator-ATG bis zum Stop-Codon reichen. Es ist jedoch auch möglich, eine funktionelle Variante mit Promotor-Regulationsfähigkeit zu benützen. Eine solche Variante kann durch Mutation oder Verkürzung der nativen ORF-Sequenzen erhalten werden. Zur Veranschaulichung dieser Ausführungsform denke man sich eine E4-ORF6-Variante, deren Sequenz zwischen dem ersten und dem zweiten ATG-Codon deletiert wurde. Vorzugsweise enthalten die im adenoviralen Vektor beibehaltenen E4-ORFs regulatorische Elemente, die ihre Expression erlauben, stärker bevorzugt ihre natürlichen regulatorischen Elemente, besonders den E4-Promotor. Alternativ können sie auch funktionell an einen heterologen Promotor gebunden sein. Um die Expression der E4-ORFs zu stabilisieren, kann es vorteilhaft sein, daß der/die E4-ORF(s) Spleißsequenzen beibehält bzw. beibehalten oder enthält bzw. enthalten. Sie können homolog (zu den E4-Sequenzen) oder heterolog (d. h. aus jedem beliebigen Eukaryontengen abgeleitet oder aber synthetischen Ursprungs) sein. Prinzipiell sind alle bisher im Stand der Technik beschriebenen Spleißsequenzen geeignet, z. B. die der Gene für α- oder β-Globin, Apolipoprotein, Immunglobulin, Faktor IX, Faktor VIII, CFTR oder jene des pCl-Vektors (Promega). Die im adenoviralen Vektor gemäß der Erfindung verbliebenen E4-ORFs können die natürlicherweise in solch einem Vektor vorkommenden sein. Insbesondere können sie auch an ihrem natürlichen Platz bleiben. Es ist jedoch auch möglich, den Vektor durch Deletion aller E4-Sequenzen, insbesondere aller E4-ORFs, und durch Einfügung bestimmter E4-ORFs aus demselben oder aus anderen Adenovirus-Rückgraten in den adenoviralen Vektor an einer Stelle zu konstruieren, an der sich normalerweise die E4-Region befindet, oder an einer anderen Stelle, z. B. der der deletierten E1- oder E3-Region. Die ORFs können in Bezug auf die Transkriptionsrichtung der Wildtyp-E4-Region in Sinn- oder oder anti-Sinnorientierung angeordnet sein.
Der adenovirale Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein adenoviraler Vektor, in dem wenigstens die gesamte oder ein Teil der E1-Region deletiert oder funktionsunfähig ist. Solch ein Vektor kann aus einem Adenovirus-Genom abgeleitet sein, bei dem wenigstens die ganze oder ein Teil der E1-Region deletiert ist. Er kann von einem Eltern-Adenovirus erhalten werden, dessen Genom modifiziert wurde. Die Modifikationen können verschiedener Art sein (Deletion, Mutation und/oder Addition eines oder mehrerer Nucleotide) und eine beliebige virale Sequenz betreffen. Auch können sie in den Codierungssequenzen des viralen Genoms lokalisiert sein oder außerhalb dieser Sequenzen, z. B. in den regulatorischen Elementen wie Promotorn. Anleitung: Es können einige virale Sequenzen deletiert, funktionsunfähig gemacht oder durch heterologe Nucleotidsequenzen und insbesondere (ein) Gen(e), dessen oder deren Expression in der Wirtszelle gewünscht wird, ersetzt werden (ein oder mehrere Gene von Interesse).
Vorzugsweise wurde das Fehlen der E1-Funktionen des Vektors gemäß vorliegender Erfindung durch totale oder partielle Deletion der betreffenden Region erreicht. Die Deletion umfaßt wenigstens die E1a-Sequenzen und kann sich in die E1b-Transkriptionseinheit fortsetzen. Vorzugsweise sind die E1b-Sequenzen, die mit dem pIX-Gen überlappen, nicht deletiert. Solche E1-Deletionen finden sich in früheren Beschreibungen von Vektoren in der Literatur des Stands der Technik.
Selbstverständlich kann das adenovirale Rückgrat des Vektors gemäß der Erfindung zusätzliche Modifikationen umfassen, wie Deletionen, Insertionen oder Mutationen in einem oder mehreren Virusgenen. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist es aus einem adenoviralen Genom abgeleitet, in dem ein oder mehrere Virusgene der E2 und/oder der L1–L5-Regionen funktionsunfähig sind. Die Funktionsunfähigkeit kann durch eine partielle oder komplette Deletion oder durch Mutation einer oder mehrerer der erwähnten Regionen erhalten werden. Als Beispiel kann die thermosensible Mutation auf dem Gen der E2a-Region dienen, das DBP (DNA-Bindungsprotein) codiert (Ensinger et al., J. Virol. 10 (1972), 328–339). Es kann auch ein in allen frühen und späten Regionen defizienter adenoviraler Vektor ins Auge gefaßt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die gesamte oder ein Teil der E3-Region des Vektors deletiert. In diesem Zusammenhang könnte es interessant sein, jene E3-Sequenzen beizubehalten, die die Polypeptide codieren, die es erlauben, dem Immunsystem des Wirtes zu entkommen, insbesondere jene, die das Glycoprotein gp19k (Gooding et al., Critical Review of Immunology 10 (1990), 53–71) codieren.
Der adenovirale Vekor gemäß der vorliegenden Erfindung kann aus dem Genom eines menschlichen oder tierischen Adenovirus abgeleitet sein, besonders aus Hunden, Vögeln, Rindern, Mäusen, Schafen, Katzen, Schweinen oder Affen, oder alternativ aus Hybriden davon. Es kann jeglicher Serotyp verwendet, besonders das murine Adenovirus Mav1 (Beard et al., Virology 175 (1990), 81–90), die Hunde-Adenoviren CAV-1 oder CAV-2 (Spibey et Cavanagh, J. Gen. Virol. 70 (1989), 165–172; Linné, Virus Research 23 (1992), 119–133; Shibata et al., Virol. 172 (1989), 460–467; Jouvenne et al., Gene 60 (1987), 21–28), das Vogel-Adenovirus DAV (Zakharchuk et al., Arch. Virol. 128 (1993), 171–176) oder das Rinder-Adenovirus BAV3 (Mittal et al., J. Gen. Virol. 76 (1995) 93–102). Jedoch sind die menschlichen Adenoviren der Untergruppe C und besonders die Adenoviren 2 (Ad2) und 5 (Ad5) vorzuziehen. Allgemein sind die erwähnten Viren in Sammlungen wie ATCC erhältlich und waren Gegenstand zahlreicher Veröffentlichungen, die ihre Sequenz, ihren Aufbau und ihre Biologie beschreiben und dem Fachmann ihre Handhabung erlauben. Beispielsweise wird die Sequenz des menschlichen Adenovirus vom Typ 5 in der Genebank-Datenbank unter der Referenznummer M 73260 offenbart; sie ist hier zur Gänze unter Bezugnahme eingeschlossen.
Wie vorstehend erwähnt fanden wir, daß bestimmte ORFs der E4-Region dazu befähigt sind, die Expression eines in einen adenoviralen Vektor inserierten Gens von Interesse positiv zu regulieren. Der Begriff „Gen" bezieht sich hierbei auf eine Nucleinsäure (DNA, RNA oder andere Polynucleotidderivate), die beliebiger Herkunft sein kann (Prokaryonten, Eukaryonten, Viren ...). Das Gen von Interesse kann z. B. eine anti-Sinn-RNA, ein Ribozym oder eine Boten-RNA (mRNA) codieren, die in ein Protein von Interesse übersetzt wird. Es beinhaltet genomische DNA, cDNA oder gemischte Typen (Minigene). Es kann ein reifes Polypeptid oder einen Vorläufer (d. h. ein Vorläufer, der dazu bestimmt ist, ausgeschieden zu werden und der eine Signalsequenz umfasst, oder ein Vorläufer, der zur Reifung durch proteolytische Spaltung bestimmt ist, ...) oder ein Proteinfragment (verkürztes Protein), ein chimäres Polypeptid, welches aus der Fusion verschiedener Sequenzen herrührt, oder ein mutiertes Polypeptid, das verbesserte und/oder veränderte biologische Eigenschaften aufweist, codieren. Das Gen kann mit den herkömmlichen molekularbiologischen Techniken (PCR, Clonieren mit geeigneten Sonden, chemische Synthese) aus jeglichem Organismus oder aus jeglicher Zelle isoliert werden, und nötigenfalls kann seine Sequenz mittels Mutagenese, PCR oder jedes anderen Verfahrens modifiziert werden.
Die folgenden Gene von Interesse sind besonders interessant. Sie können ein Cytokin (α-, β- oder γ-Interferon, Interleukine (IL), besonders IL-2, IL-6, IL-10 oder IL-12, einen Tumornekrosefaktor (TNF), einen koloniestimulierenden Faktor GM-CSF, C-CSF, M-CSF ...), einen Zell- oder Zellkernrezeptor, einen Rezeptorliganden (fas-Ligand), einen Koagulationsfaktor (FVIII, FIX ...), einen Wachstumsfaktor (FGF für Fibroblastenwachstumsfaktor, VEGF für Vaskulärendothelialer Wachstumsfaktor), ein Enzym (Urease, Renin, Thrombin, Metall proteinase, Stickstoffoxid-Synthase NOS, SOD, Katalase ...), einen Enzyminhibitor (α1-Antitrypsin, Antithrombin III, Virusprotease-Inhibitor, PAI-1 für Plasminogenaktivator-inhibitor), das CFTR-Protein, Insulin, Dystrophin, ein MHC-Antigen (Haupthistokompatibilitätskomplex) der Klasse I oder II oder ein Polypeptid, das die Expression entsprechender Gene modulieren/regulieren kann, ein Polypeptid, das in der Lage ist, bakterielle, parasitische oder Virusinfektionen oder deren Entwicklung zu hemmen (antigene Polypeptide, antigene Epitope, transdominante Varianten, die die Wirkung eines nativen Proteins durch Konkurrenz ... inhibieren ...), einen Apoptoseinduktor oder -inhibitor (Bax, Bcl2, BclX ...), ein cytostatisches Agens (p21, p16, Rb ...), ein Apolipoprotein (ApoAI, ApoAIV, ApoE ...), einen Angiogenese-Inhibitor (Angiostatin, Endostatin ...), einen Sauerstoffradikalfänger, ein Polypeptid mit anti-Tumor-Wirkung, einen Antikörper, ein Toxin, ein Immuntoxin und einen Marker (β-Galactosidase, Luciferase ...) oder jegliche anderen Gene von Interesse, die auf dem Fachgebiet als nützlich für die Behandlung oder zur Vorbeugung eines klinischen Zustandes anerkannt sind, codieren.
Beispielsweise kann man zur Behandlung einer erblichen Dysfunktion eine funktionsfähige Kopie eines defekten Gens verwenden, z. B. ein Gen, das den Faktor VIII oder IX codiert, im Zusammenhang mit Hämophilie A oder B, das Dystrophin (oder Minidystrophin) codiert, im Zusammenhang mit Myopathien, das Insulin codiert, im Zusammenhang mit Diabetes, das CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) codiert, im Zusammenhang mit cystischer Fibrose. Geeignete Gene von Interesse, um den Fortschritt von Tumoren oder Krebs hinauszuzögern oder zu inhibieren, beinhalten unter anderem solche, die eine anti-Sinn-RNA, ein Ribozym, ein cytotoxisches Produkt wie Thymidin-Kinase des Herpes1-Simplex-Virus (TK-HSV-1), Ricin, ein bakterielles Toxin, das Expressionsprodukt der Hefegene FCY1 und/oder FUR1 mit UPRTase (Uracil-Phosphoribosyl-Transferase)- und CDase (Cytosin-Desaminase)-Aktivitäten, einen Antikörper, ein Polypeptid, das die Zellteilungs- oder die Transduktionssignale inhibiert, ein Tumorsuppressor-Gen (p53, Rb, p73 ...), ein Polypeptid, das das Wirts-Immunsystem aktiviert, ein Tumorassoziiertes Antigen (MUC-1, BRCA-1, ein frühes oder spätes HPV-Antigen (E6, E7, L1, L2 ...) ...), wahlweise in Verbindung mit einem Cytokin-Gen, codieren. Schließlich kann man im Zusammenhang mit der anti-HIV- Therapie ein Gen verwenden, das ein Immunschutz-Polypeptid, ein antigenes Epitop, einen Antikörper (2F5; Buchacher et al., Vaccines 92 (1992), 191–195), den extrazellulären Bereich von CD4 (sCD4; Traunecker et al., Nature 331 (1988), 84–86), ein Immunadhäsin (d. h. CD4-IgG-Hybrid, CD4-2F5-Fusion; Capon et al., Nature 337 (1989) 525–531; Byrn et al., Nature 344 (1990) 667–670), ein Immuntoxin (d. h. resultierend aus der Fusion von Angiogenin und 2F5 oder CD4-2F5; Kurachi et al., Biochemistry 24 (1985), 5494–5499), eine trans-dominante Variante ( EP 0 614 980 , WO 95/16780), ein cytotoxisches Produkt (siehe vorstehend) oder IFNα oder β codiert.
Zusätzlich kann ein Gen von Interesse auch ein Selektionsgen umfassen, welches die Selektion transfizierter und transduzierter Zellen erlaubt. Diese Genen schließen das neo-Gen (codiert Neomycin-Phosphotransferase), das gegen G418 Widerstandsfähigkeit verleiht, dhfr (Dihydrofolat-Reduktase), CAT (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase), pac (Puromycin-Acetyl-Transferase) und gpt (Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Selektionsgene sind im Stand der Technik bekannt.
Das Gen von Interesse kann als funktionsfähige Expressionskassette unter Einschluß eines geeigneten Promotors konstruiert werden. Es kann aus jedem Viren, Bakterien- oder Eukaryontengen (selbst aus dem Gen von Interesse) erhalten werden und kann konstitutiv oder regulierbar sein. Wahlweise kann es modifiziert werden, um seine Transkriptionsaktivität zu verbessern, negative Sequenzen zu deletieren, seine Regulation zu modifizieren, geeignete Restriktionsstellen einzubauen usw.
Der Promotor ist ein Promotor, der in Tumor- oder in Krebszellen stimuliert wird. Man kann zum Beispiel die aus dem in Brust- und Prostatakrebszellen überexprimierten MUC-1-Gen isolierten Promotoren (Chen et al., J. Clin. Invest. 96 (1995), 2775–2782), CEA (Carcinoembryonales Antigen), das in Colonkrebs überexprimiert wird (Schrewe et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990), 2738–2748), Tyrosinose, die in Melanomen überexprimiert wird (Vile et al., Cancer Res. 53 (1993), 3860–3864), ERB-2, das in Brust- und Pankreaskrebs überexprimiert wird (Harris et al., Gene Therapy 1 (1994), 170–175) und α-Foetoprotein, das in Leberkrebs überexprimiert wird (Kanal et al., Cancer Res. 57 (1997), 461–465), verwenden.
Die regulatorischen Elemente können weiterhin zusätzliche Bestandteile umfassen, wie Intron(s), Sekretionssignal, Kern-Lokalisationssignal, IRES, Poly(A)-Transkriptions-Terminationssequenzen, Tripartitleader-Sequenz und Replikationsursprünge.
Der adenovirale Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein oder mehrere Gene von Interesse umfassen. Die verschiedenen Gene können in der gleichen Kassette zusammengeschlossen oder auf verschiedene Kassetten verteilt und damit separaten Steuerungseinheiten unterworfen sein. Die Kassetten können im Vektor in verschiedene Stellen in der gleichen oder in Gegenrichtung eingefügt sein.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren können verwendet werden, um die Expression und/oder das Andauern der Expression eines Gens von Interesse, das in einem Expressionsvektor enthalten und funktionell mit den vorstehend genannten regulatorischen Elementen verknüpft ist, zu verbessern.
Der Befund, daß die Gegenwart bestimmter ORFs der adenoviralen E4-Region vorteilhaft für die stabile Expression von Transgenen ist, ist auch für das Erreichen einer stabilen Expression von Transgenen in anderen als adenoviralen Expressionsvektoren von Bedeutung. Somit können die vorstehend genannten ORFs einer adenoviralen E4-Region allgemein dazu verwendet werden, eine stabile Expression von Transgenen in Expressionssystemen zu erzielen. In dieser Hinsicht ist es möglich, verbesserte Expression eines Transgens, d. h. Expression überhaupt oder stabile Expression auf längere Sicht zu erreichen, indem man die ORFs in cis oder in trans zur Verfügung stellt.
Wie vorstehend im Zusammenhang mit den adenoviralen Vektoren gemäß der Erfindung dargelegt, kann die E4-Region verschiedener Adenovirusstämme variieren. Jedoch ist es dem Durchschnittsfachmann ohne weiteres möglich, die E4-Region eines Adenovirus und die darin enthaltenen ORFs zu identifizieren. Somit ist der Durchschnittsfachmann in der Lage, die vorstehend genannten ORFs aus einem Adenovirusgenom zu isolieren, um sie gemäß der Erfindung zu nützen.
Der/die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete/n E4-ORF(s) kann bzw. können beliebigen adenoviralen (tierischen oder menschlichen) Ursprungs sein.
Vorzugsweise werden sie aus einem menschlichen Adenovirus der Untergruppe C abgeleitet, wobei Ad2 oder Ad5 besonders zu bevorzugen sind.
Das bzw. die E4-ORF(s) ist bzw. sind in der Lage, allein oder im Zusammenwirken direkt oder mittels anderer zellulärer oder viraler Faktoren die Expression eines in einen Expressionsvektor eingebauten Gens von Interesse zu verbessern. Diese positive Auswirkung auf die transgene Expression kann auf verschiedenen Stufen ausgeübt werden: Transkription, Verlängerung, Transport, Stabilität der transgenen mRNA oder alternativ Translation. Die Verbesserung wird durch die Bestimmung des transgenen Expressionsproduktes oder des Andauerns seiner Expression in in-vivo- oder in-vitro-Versuchen bestimmt. Eine Vorgehensweise besteht darin, einen Vektor, der das/die E4-ORF(s) enthält, zusammen mit einer Expressionskassette eines Gens für ein leicht detektierbares Produkt (LacZ, Luciferase, α1-Antitrypsin, Faktor IX, CFTR ...) zu injizieren und den Spiegel des transgenen Produktes über die Zeit im Vergleich zu einer Kontrolle ohne adenovirale E4-Sequenzen festzustellen. Die Verbesserung kann hinsichtlich der Menge des transgenen Produktes (mindestens Faktor 2) oder hinsichtlich des Andauerns der Expression (Stabilität über einen längeren Zeitraum) gesehen werden.
In der Anwendung gemäß der Erfindung wird ein Polynucleotid verwendet, das eine Kombination von offenen E4-Leserahmen umfaßt, die aus:

(i) ORF3, ORF6 und ORF7; oder
(ii) ORF3 und ORF4; oder
(iii) ORF1, ORF2, ORF3 und ORF4

Vorzugsweise umfaßt ein solches ORF die komplette Codierungssequenz, d. h. vom Initiator-ATG bis zum Stoppcodon. Jedoch ist es auch möglich, eine funktionsfähige Variante eines solchen ORF zu verwenden, z. B. Varianten, die durch Deletion, Mutation oder Verkürzung erhalten wurden und noch ein funktionsfähiges Polypeptid codieren. Zu den Varianten zählen insbesondere solche ORFs, die einen hohen Grad von Homologie zum nativen Gegenstück aufweisen, und zwar mindestens 70% Sequenzgleichheit, stärker vorzuziehen sind 80%, noch stärker vorzuziehen 90%. Ganz besonders vorzuziehen ist völlige Gleichheit.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Polynucleotid ist mit regulatorischen Elementen funktionell verbunden, um seine Expression in einer Wirtszelle oder in einem Wirtsorganismus zu erlauben. Zu diesen Elementen gehört ein Promotor, der aus einem beliebigen Gen eukaryontischen oder viralen Ursprungs isoliert werden kann. Wenn das Polynucleotid mehrere E4-ORFs umfaßt, können diese von einem einzigen oder von unabhängigen Promotorn exprimiert werden. In diesem Fall können die verschiedenen E4-Kassetten in der gleichen oder in der entgegengesetzten Richtung und an der gleichen und an verschiedenen Stellen innerhalb eines Vektors oder mehrerer Vektoren liegen. Vorzuziehen ist jedoch die Verwendung eines einzigen Promotors zur Steuerung der ausgewählten E4-Sequenzen. Eine erste Möglichkeit ist, sie unter die Kontrolle des homologen E4-Promotors zu setzen. Alternativ kann ein heterologer Promotor verwendet werden. Solch ein heterologer Promotor ist vorzugsweise konstitutiv und kann aus den nachstehend erwähnten ausgewählt werden. Der Durchschnittsfachmann vermag das Polynucleotid so an einen geeigneten Promotor zu binden, daß die Funktionsfähigkeit gewährleistet ist. Um die Expression zu stabilisieren, kann es vorteilhaft sein, daß der/die E4-ORF(s) Spleiß-Sequenzen beibehält/beibehalten bzw. umfasst/umfassen. Sie können homolog (aus den E4-Sequenzen abgeleitet) oder heterolog (aus einem beliebigen Eukaryontengen abgeleitet oder synthetischen Ursprungs) sein. Der Stand der Technik kennt eine große Vielfalt an Spleiß-Sequenzen; sind zur Verwendung im Rahmen der Erfindung geeignet. Zu erwähnen wären hier besonders jene, die aus Genen isoliert werden, die α- oder β-Globin, Apolipoprotein, Immunglobulin, Faktor IX, Faktor VIII, CFTR codieren, und jene aus dem pCl-Vektor (Promega).
Vorteilhafterweise wird die Polynucleotidsequenz in einen Expressionsvektor eingefügt. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann es sich um ein Plasmid, einen synthetischen oder einen viralen Vektor handeln. Ein Plasmid ist eine extrachromosomale, zirkuläre DNA, die in einer gegebenen Zelle zu autonomer Replikation befähigt ist. Die Auswahl an Plasmiden ist sehr groß. Es ist vorzugsweise zur Amplifikation in Bakterien und zur Expression in eukaryontischen Wirtszellen entworfen. Solche Plasmide können von vielen Herstellern bezogen werden.
Geeignete Plasmide schließen pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCl (Promega) und p Poly (Lathe et al., Gene 57 (1987), 193–201) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Es ist auch möglich, ein solches Plasmid durch molekularbiologische Techniken zu erzeugen (Sambrook et al., Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), NY). Ein Plasmid kann auch ein Selektionsgen, um die transfizierten Zellen auszusuchen oder zu identifizieren (durch Komplementierung einer Zellauxotrophie, durch antibiotische Widerstandsfähigkeit), Stabilisationselemente (d. h. cer-Sequenz; Summers und Sherrat, Cell 36 (1984), 1097–1103) oder integrative Elemente (virale LTR-Sequenzen) beinhalten.
Ein Expressionsvektor kann ebenfalls viralen Ursprungs und aus einer Vielzahl von Viren abgeleitet sein, wie Herpesviren, Cytomegalieviren, AAV (adeno-assoziiertes Virus), Pockenviren (Kanarienvogelpocken, Vogelpocken, Vacciniaviren, MVA) und Retroviren.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden das Polynucleotid und das Gen von Interesse in den selben Expressionsvektor eingebaut. Sie können am gleichen Ort (d. h. anstelle der deletierten E1-Sequenzen in einen adenoviralen E1^–-Vektor) oder an verschiedenen Orten (d. h. das Gen von Interesse anstelle der deletierten E1-Sequenzen und das Polynucleotid anstelle der nativen E4-Region eingebaut werden). Die Verwendung zweier unabhängiger Expressionsvektoren, von denen jeder das Polynucleotid und ein Gen von Interesse trägt, ist auch durchführbar. In diesem Fall können beide Vektoren zusammen (Co-Transfektion oder Co-Infektion) oder getrennt in die Wirtszelle eingeführt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor, in den das die E4-ORFs umfassende Polynucleotid eingefügt wird, ein adenoviraler Vektor, vorzugsweise einer, dessen E4-Region deletiert wurde.
Hinsichtlich der Art und Struktur des adenoviralen Vektors, des Ortes der eingefügten E4-ORFs, der Art des Gens von Interesse und der Steuerungsregionen gilt das schon über die adenoviralen Vektoren gemäß der Erfindung Gesagte.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen nichtadenoviralen Vektor, der ein Gen von Interesse umfasst, das funktionell mit regulatorischen Elementen verbunden ist, wobei dieser Vektor eine Kombination aus offenen E4-Leserahmen umfaßt, die aus

Hinsichtlich der Eigenschaften der ORFs und der Art des Gens von Interesse gilt das schon über die Verwendung eines Polynucleotids gemäß der Erfindung Gesagte.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein infektiöses Viruspartikel, das einen adenoviralen Vektor gemäß der Erfindung oder einen Expressionsvektor umfaßt, der E4-ORFs, wie vorstehend beschrieben, umfasst. Es kann nach jeder herkömmlichen Technik des Fachgebietes hergestellt werden. Wird an einen adenoviralen Vektor gedacht, kann man über eine Co-Transfektion geeigneter adenoviraler Fragmente in eine Zellinie wie die Linie 293 vorgehen (wie beschrieben bei Graham und Prevect, Methods in Molecular Biology, Bd. 7 (1991), Gene Transfer and Expression Protocols; Hrsg. E. J. Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJ). Es ist auch möglich, den Vektor in Escherichia coli durch Ligierung oder homologe Rekombination (wie in WO 96/17070 beschrieben) zu erstellen, bevor die Zellinie transfiziert wird. Weiterhin können die Virionen durch Passage in einer permissiven Zelle amplifiziert werden, um eine Virenstammlösung mit hohem Titer zu erzeugen, die zur Herstellung klinischer Chargen verwendet werden kann. Es kann in einer Komplementierungs-Zellinie vermehrt werden, die die deletierten/mutierten Virenfunktionen in trans zur Verfügung stellt. Die Linie 293 aus menschlichen embryonalen Nierenzellen (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977), 59–72) wird gemeinhin verwendet, um die E1-Funktion zu komplementieren. Andere Zellinien wurden entworfen, um doppelt defekte Vektoren (E1°E4° oder E1°E2°) zu komplementieren, wie beschrieben bei: Yeh et al. (J. Virol. 70 (1996), 559–565), Krougliak und Graham (Human Gene Therapy 6 (1995), 1575–1586), Wang et al. (Gene Therapy 2 (1995), 775–783), Lusky et al. (J. Virol. 72 (1998), 2022–2033) und in den internationalen Patentanmeldungen WO 94/28152 und WO 97/04119. Alternativ kann auch ein Hilfsvirus verwendet werden, der wenigstens einen Teil der viralen Defizienzen in trans liefert.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Herstellung eines infektiösen Viruspartikels gemäß der Erfindung, nach der

(i) der adenovirale Vektor der Erfindung oder der Expressionsvektor mit E4-ORFs, wie vorstehend beschrieben, in eine Komplementierungszelle eingeführt wird, die in der Lage ist, den Vektor in trans zu komplementieren, um eine transfizierte Komplementierungszelle zu erhalten;
(ii) die transfizierte Komplementierungszelle unter geeigneten Bedingungen gezüchtet wird, um die Herstellung des infektiösen Viruspartikels zu erlauben; und
(iii) das infektiöse Viruspartikel aus der Zellkultur gewonnen wird.

Der Vektor kann mittels jeder der vielen, auf dem Fachgebiet hierfür bekannten Methoden in die Zelle eingeführt werden. Man kann dabei über Transfektion des Vektors oder seiner Fragmente durch Lipofektion, Elektroporation und Infektion vorgehen. Die infektiösen Viruspartikel können aus dem Kulturüberstand gewonnen werden, jedoch auch aus den Zellen, die sich z. B. durch mehrmaliges aufeinanderfolgendes Auftauen und Gefrieren lysieren lassen. Wahlweise können die Virionen auch durch Standardtechniken (Chromatographie, Ultrazentrifugierung z. B. in einem Cäsiumchloridgradienten ...) amplifiziert und gereinigt werden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, die einen adenoviralen Vektor der Erfindung oder ein Polynucleotid und einen Expressionsvektor umfaßt, wie vorstehend beschrieben, oder die von einem infektiösen viralen Partikel der Erfindung infiziert ist. Vorzugsweise stammt eine solche Zelle von einem Säuger, insbesondere vom Menschen. Der Vektor kann ins Zellgenom eingebaut werden oder auch nicht (Episom). Geeignete Zellen schließen primäre oder Tumorzellen hämatopoetischen Ursprungs (totipotente Stammzellen, Leukocyte, Lymphocyte, Monocyte, Makrophage ...), muskulären Ursprungs (Satellitenzelle, Myocyte, Myoblaste, glatte Muskelzellen ...), von Herz, Lunge, Luftröhre, Leber, Gefäßen sowie epithelialen, fibroblastischen oder endothelialen Ursprungs ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, vorzugsweise ein Arzneimittel, das als Wirkstoff einen adenoviralen Vektor gemäß der Erfindung, ein Polynucleotid und einen Expressionsvektor, wie vorstehend beschrieben, eine Wirtszelle oder ein infektiöses Viruspartikel gemäß der Erfindung oder gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt umfasst. Die Zusammensetzung der Erfindung ist besonders für die vorbeugende oder heilende Behandlung von Krankheiten wie Erbkrankheiten (Hämophilie, Diabetes, Cystische Fibrose, Duchenne- oder Becker-Myopathien, Autoimmunkrankheiten) oder erworbenen Krankheiten (Krebs, Tumoren, kardiovaskuläre Krankheiten, Viruserkrankungen wie AIDS oder Hepatitis B oder C ...) gedacht.
Die Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann auf konventionelle Weise für lokale, allgemeine oder orale Verabreichung hergestellt werden. Es kann eine Anwendung als Aerosol, Instillation oder Injektion ins Auge gefaßt werden. Geeignete Verabreichungswege sind: intragastral, subkutan, intrakardial, intramuskulär, intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonär oder endotracheal. Die Verabreichung kann in einer einzigen Dosis oder in einer nach einem bestimmten Zeitintervall ein- oder mehrere Male wiederholten Einnahme erfolgen. Der geeignete Verabreichungsweg und die geeignete Dosierung richten sich nach verschiedenen Parametern, z. B. dem Individuum, der zu behandelnden Krankheit oder nach dem zu transferierenden Gen von Interesse. Die Viruspartikel gemäß der Erfindung können in Dosierungen von zwischen 10⁴ und 10¹⁴ IU (infektiöse Einheiten), besser zwischen 10⁵ und 10¹³ IU und vorzugsweise zwischen 10⁶ und 10¹² IU formuliert werden. Der Titer kann durch konventionelle Techniken (vgl. z. B. Lusky et al., 1998, supra) bestimmt werden. Dosierungen auf der Basis von Vektoren können zwischen 0,01 und 100 mg DNA, besser zwischen 0,05 und 10 mg und vorzugsweise zwischen 0,5 und 5 mg umfassen. Zusätzlich kann der Wirkstoff der Zusammensetzung mit einem vom pharmazeutischen Standpunkt aus verträglichen Vehikel kombiniert werden. Die Formulierung kann auch ein Verdünnungsmittel, ein Adjuvans oder einen Excipienten enthalten. Sie kann als direkt injizierbare Flüssigkeit dargeboten werden, oder als Trockenpulver (lyophilisiert usw.), das vor Gebrauch rekonstituiert werden kann.
Zusätzlich können der Vektor, die Wirtszelle und die Viruspartikel gemäß der vorliegenden Erfindung wahlweise mit einer oder mehreren Substanzen kombiniert werden, die die Effizienz oder die Stabilität des Gentransfers verbessern. Solche Substanzen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt (vgl. z. B. Felgner et al. (Proc. West. Pharmacol. Soc. 32 (1987), 115–121); Hodgson und Solaiman (Nature Biotechnology 14 (1996), 339–342); Remy et al. (Bioconjugate Chemistry 5 (1994), 647–654)); sie beinhalten vor allem Polymere, kationische Lipide, Liposomen, Kernproteine und neutrale Lipide. Sie können auch in Kombination (d. h. kationische und neutrale Lipide) verwendet werden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines adenoviralen Vektors gemäß der Erfindung, eines Polynucleotids und eines Expressionsvektors, wie vorstehend beschrieben, eines Viruspartikels oder einer Wirtszelle gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Arzneistoffes für den Gentransfer in eine Wirtszelle oder einen Wirtsorganismus, und zwar vorzugsweise für die Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Gentherapie oder Immuntherapie. Gemäß einer ersten Möglichkeit kann der Arzneistoff direkt in vivo gegeben werden (z. B. durch intravenöse Injektion in einen zugänglichen Tumor, durch Aerosol in die Lungen usw.). Es ist jedoch auch möglich, den ex-vivo-Weg zu gehen, der darin besteht, Zellen des Patienten zu entnehmen (Knochenmarkstammzellen, periphere Blut-Lymphocyten, Muskelzellen usw.), diese in vitro nach Standardverfahren zu transfizieren oder zu infizieren und sie anschließend dem Patienten wieder zu verabreichen In einer bevorzugten Ausführungsform der Verwendung der vorliegenden Erfindung sind die beibehaltenen E4-Sequenzen des adenoviralen Vektors eine Kombination von offenen E4-Leserahmen, die aus:

(i) ORFs 3 und 4; oder
(ii) ORFs 3 und 6 und 7

Die entsprechenden Arzneimittel dienen vorzugsweise dem Gentransfer in Lungengewebe.
Die im Zusammenhang mit diesen bevorzugten Ausführungsformen der Anwendung der vorliegenden Erfindung erwähnten adenoviralen Vektoren weisen eine verringerte Toxizität auf und/oder rufen in der Wirtszelle oder im Wirtsorganismus eine verringerte inflammatorische Antwort hervor. Dies wird anhand der folgenden Beispiele gezeigt.
Die beschriebenen Vektoren, Viruspartikel und Wirtszellen sind für eine Behandlungsmethode nützlich, nach der eine therapeutisch wirksame Menge eines adenoviralen Vektors gemäß der Erfindung, eines Polynucleotids und eines Expressionsvektors, wie im Zusammenhang mit der Verwendung gemäß der Erfindung beschrieben, eines Viruspartikels oder einer Wirtszelle gemäß der Erfindung einem Patienten verabreicht wird, der eine solche Behandlung benötigt.
Materialien und Verfahren
Die nachstehend beschriebenen Konstruktionen wurden gemäß der allgemeinen Verfahren der gentechnischen Herstellung und des molekularen Clonierens ausgeführt, wie sie bei Sambrook et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, oder neuere Auflagen) detailliert beschrieben sind, oder bei Verwendung handelsüblicher Kits wurde der Empfehlung des Herstellers gefolgt. Homologe Rekombinationsschritte verwenden vorzugsweise den Stamm E, coli BJ 5183 (Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (1983), 557–580) und werden, wie bei Chartier et al. (J. Virol. 70 (1996), 4805–4810) beschrieben, ausgeführt. Hinsichtlich der Reparatur von Restriktionsstellen besteht die verwendete Technik im Auffüllen der überstehenden 5'-Enden unter Verwendung des großen Fragments der E.-coli-DNA-Polymerase I (Klenow). Die Fragmente des Adenovirusgenoms, die in den verschiedenen nachstehend beschriebenen Konstruktionen verwendet wurden, werden hinsichtlich ihrer Position in der Nucleotidsequenz des Ad5-Genoms, wie in der Genebank-Datenbank unter Referenznummer M73260 offenbart, genau angegeben.
Hinsichtlich der Zellbiologie werden die Zellen nach den Standardmethoden transfiziert oder transduziert, die dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt sind. Zu erwähnen wäre die Calciumphosphat-Technik, doch kann auch irgendein anderes Verfahren angewandt werden. Die Kulturbedingungen sind ihrerseits konventionell. Linie 293 (Graham et al., 1977, supra; ATCC CRL-1573) resultiert aus der Integration des 5'-Endes des Ad5-Genoms in ihre Chromosomen. Linie TG5606 (beschrieben bei Lusky et al. (1998), supra) ist aus Linie 293 abgeleitet, die stabil vom Plasmid pTG5606, Träger der Ad5-E4-ORF6+7-Sequenzen (d. h. einer Sequenz, die sowohl ORF6 als auch ORF7 enthält und erlaubt, die entsprechenden Polynucleotide und das Spleiß-Produkt ORF6/7 herzustellen) sowie des pac-Selektionsgens, transfiziert wurde. A549 ist von der ATCC (CCL-125) erhältlich. Auch andere Zellinien können verwendet werden.
Herstellung, Züchtung und Titration der Viren: Zur Herstellung von Viren wurden die Virusgenome durch Pac-I-Verdau aus dem jeweiligen rekombinanten Plasmid freigesetzt und in die geeignete Komplementierungs-Zellinie transfiziert, wie vorstehend beschrieben (Chartier et al. (J. Virol. 70 (1996), 4805–4810). Wildtyp-E4-Vektoren wurden in 293-Zellen, alle E4 modifizierten Vektoren dagegen in TG5606-Zellen erzeugt. Vermehrung und Reinigung der Viren und Titration der infektiösen Einheiten (IU/ml) durch indirekte DBP-Immunfluoreszenz geschahen genau, wie beschrieben (Lusky et al., 1998, supra). Die Viruspartikelkonzentration (P/ml) eines jeden Vektoransatzes wurde unter Verwendung der optischen Dichte zur Messung des Virus-DNA-Gehaltes (Mittereder et al., J. Virol. 70 (1996), 7498–7509) berechnet. Das Wachstum der E4 modifizierten Vektoren in Gegenwart und in Abwesenheit von E4-Komplementierung wurde in 293-Zellen bestimmt und mit jenem in TG5606-Zellen verglichen.
Tierversuche: Für diese Studie wurden 6 bis 8 Wochen alte, immunkompetente C57BI/6, CBA oder immundefiziente C.B17-scid/scid (IFFA Credo, L'albresle, Frankreich) Mäuseweibchen verwendet. Die Vektoren mit dem CFTR-Transgen wurden intratracheal (I.T.) oder intravenös (I.V.) in den angegebenen Dosierungen verabreicht. Die Tiere wurden zu den angegebenen Zeiten getötet. Die Organe wurden entnommen, in gleiche Teile zerschnitten und sofort bis zur Analyse in flüssigem Stickstoff eingefroren.
DNA-Analyse: Die gesamte DNA wurde aus Gewebekultur-Zellen und Organen, wie beschrieben (Lusky et al., 1998, supra), extrahiert. Kurz gesagt wurden die Zellen oder Gewebe über Nacht mit Proteinase-K-Lösung (1 mg Proteinase K in 1% SDS) in DNA-Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mM NaCl, 2 mM EDTA) verdaut. Die DNA wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion mit anschließender Ethanol-Fällung isoliert. 10 μg DNA wurden mit BamHI verdaut und mit Southern-Blot-Analyse unter Verwendung eines aus genomischer DNA von Ad5 (nt 27331 bis 31993) gereinigten und ³²P-markierten EcoRI-HindIII-Restriktionsfragments untersucht.
RNA-Analyse: Die gesamte RNA wurde aus Gewebekultur-Zellen und Organen, wie beschrieben und wie vom Hersteller empfohlen, extrahiert. Zur Northern-Blot-Analyse wurden 10–15 μg Gesamt-RNA der Gelelektrophorese unterworfen und auf Nitrocellulosefilter überführt. CTFR-spezifische mRNA wurde unter Verwendung eines aus der CFTR-cDNA gereinigten ³²P-markierten BamHI-Restriktionsfragments (2540 bp) ermittelt. Virusspezifische mRNA wurde unter Verwendung eines ³²P-markierten Oligonucleotids, das spezifisch mit der Hexon-mRNA der viralen L3-Boten hybridisiert, ermittelt.
Toxizitätsstudien: Studien zur Toxizität der verschiedenen Adenoviruskonstruktionen wurden an 6 Wochen alten immunkompetenten Mäuseweibchen (C57BI/6, Balb/c, C3H oder CBA) vorgenommen, die von IFFA Credo (L'albresle, Frankreich) bezogen wurden. Die Mäuse waren in speziellen, pathogenfreien Vorrichtungen untergebracht. Die adenoviralen Vektoren wurden intravenös (I.V.) durch Einspritzung von 100 μl in die Schwanzvene verabreicht. Die Tiere wurden zu verschiedenen Zeitpunkten über einen Gesamtzeitraum von wenigstens einem Monat (5, 16, und 30 oder 4, 14, 30 und 60 Tage) getötet. Die Leber wurde entnommen und bis zur pathologisch-anatomischen Analyse in 10% Formaldehyd-Puffer aufbewahrt. Die Virusteilchenkonzentration wurde unter Verwendung der optischen Dichte zur Messung des Virus-DNA-Gehaltes (Mittereder et al., J. Virol. 70 (1996), 7498–7509) berechnet.
Pathologisch-anatomischen Analyse: Sie wurde anhand von hämatoxilin- und eosingefärbten, in 10% Formalin fixierten und in Paraffin eingebettetem Gewebe ausgeführt. Leberschäden (Dystrophie) und Entzündungszustand (lymphocytische Infiltration) wurden visuell geschätzt.
Lebertoxizität: Sie wurde durch Analyse des Transaminasegehaltes in Serumproben beurteilt, die zum Zeitpunkt der Tötung des Tieres entnommen wurden. Die GOT (Glutamat-Oxalacetat-Transaminase)- und GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase)-Spiegel wurden nach einer enzymatischen Standardmethode gemessen. GOT ist für die Aspartat-Aminotransferase (AST)-Aktivität repräsentativ, die den Transfer einer Aminogruppe zwischen L-Aspartat und 2-Oxalglutarat katalysiert, wobei L-Glutamat und Oxalacetat entstehen; das letztere wiederum reagiert in Gegenwart von Malat-Dehydrogenase mit NADH. Die NADH-Oxidationsrate wird über die Verringerung der optischen Absorption bei 340 nm (Cobas Integra) beurteilt, und sie ist zur Katalyseaktivität der AST direkt proportional. GPT ist für die Alanin-Aminotransferase (ALT)-Aktivität repräsentativ, die die Reaktion zwischen L-Alanin und 2-Oxoglutarat katalysiert, wobei L-Glutamat und Pyruvat entstehen; das letztere wiederum reagiert in Gegenwart von Lactat-Dehydrogenase mit NADH. Die NADH-Oxidationsrate wird über die Verringerung der optischen Absorption bei 340 nm beurteilt, und sie ist zur Katalyseaktivität der ALT direkt proportional.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung:
BEISPIEL 1
Herstellung modifizierter E4-Vektoren
Es wurde eine Serie isogener AdE1°- und AdE1°E4°-Vektoren mit CMV-Promotor-gesteuerten Expressionskassetten hergestellt. In den Adenoviren-Rückgraten aller Vektoren wurden die essentiellen E1-Sequenzen (von nt 459 bis nt 3327) und E3-Sequenzen (entweder eine kleine Deletion (S) von nt 28592 bis nt 30470 oder eine große Deletion (L) von nt 27871 bis nt 30748) vorgenommen. Die Numerierung der Nucleotide in dieser Beschreibung folgt Chroboczek et al. (Virology 186 (1992), 280–285) (oder ATCC M73260). Sie alle enthalten die menschliche CFTR-cDNA, die vom hCMV-Promotor transkribiert und durch das β-Globin-Poly(A)-Signal, das an der Stelle der E1-Region eingefügt wurde, terminiert wird. Die folgenden Vektoren unterscheiden sich hinsichtlich der Größe der E4-Deletion. Doch sie alle verwenden den viralen E4-Promotor, um die Expression der E4-Region oder eines einzelnen E4- ORF oder einzelner E4-ORFs zu steuern. Sie sind, wie bei Chartier et. al. (1997, supra) und Lusky et al. (1998, supra) beschrieben, durch homologe Rekombination in E. coli als infektiöse Plasmide konstruiert. Die Viren werden je nach ihrer Defizienz entweder in E1- (293) oder E1- und E4- (TG5606) Komplementierungs-Zellinien erzeugt. Die Vektoren, die die vollständige E4-Region und E4-ORF6/7 enthalten, benötigen keine Komplementierung von E4-Funktionen. Zusätzlich wird in allen Vektoren die endogene Poly(A)-Stelle verwendet.
AdTG6421 enthält die E4-ORFs 6 + 7 (d. h. eine Sequenz, die sowohl ORF6 als auch ORF7 enthält und befähigt ist, die entsprechenden Polynucleotide und das Spleißprodukt ORF6/7 herzustellen). Die Sequenz zwischen den Restriktionsstellen BglII (nt 34112) und AvrII (nt 35461) wurde deletiert, die Enden wurden in glatte Enden überführt und ligiert.
AdTG6447 enthält die ORFs 1 bis 4; die ORFs 6 und 7 wurden deletiert. Dies geschah durch Deletion der viralen Sequenzen von nt 32827 bis nt 33985 zwischen der MunI-Stelle (nt 32822) und der AccI-Stelle (nt 33984). Die Enden wurden in glatte Enden überführt und ligiert.
AdTG6449 enthält die E4-ORFs 3 und 4. Er wird aus AdTG6447 durch weitere Deletion der Sequenzen der ORFs 1 und 2 von nt 34799 bis nt 35503 durch Restriktionsspaltung mit PvuII (nt 34796) und Eco47-3 (nt 35501) und Religierung erhalten.
AdTG6477 ist aus AdTG6449 abgeleitet, und sein ORF4 ist durch teilweise Deletion zwischen den Stellen TthI (nt 34064) und NarI (nt 34189) inaktiviert. Somit enthält dieser Vektor den E4-ORF3.
AdTG6487 ist aus AdTG6447 durch Deletion der Sequenzen von nt 34632 bis nt 35503 zwischen den SspI- und Eco47-3-Stellen abgeleitet. Somit enthält dieser Vektor den E4-ORF4.
AdTG6490 enthält zwei separate Deletionen. Erstens sind die ORFs 1 und 2 von nt 34799 bis nt 35503 zwischen den PvuII (nt 34796)- und Eco47-3 (nt 35501)-Stellen deletiert. Zusätzlich ist ORF4 durch die Deletion der Sequenzen nt 34069 bis nt 34190 zwischen den TthI (nt 34064)- und NarI (nt 34189)-Stellen inaktiviert. Somit enthält dieser Vektor die ORFs 3, 6+7. Man beachte, daß dem E4-ORF6 das erste ATG (nt 34074) fehlt. Nachdem sich der Vektor in 293-Zellen in Abwesenheit von E4- Komplementierung vermehren läßt, kann man annehmen, daß die Translation beim zweiten ATG (nt 34047) beginnt und das Produkt funktionsfähig ist.
AdTG6418 ist eine positive Kontrolle mit allen vorstehend beschriebenen Eigenschaften und mit der E4-Region des Wildtyps (E4+). AdTG5643 ist die negative Kontrolle, die eine große Deletion in der E4-Region enthält (E4°). Diese E4-Deletion ist mit der H2dl808-Deletion bei Ad2 (Challberg und Ketner, Virology 114 (1981) 196–209) identisch; sie entfernt den größten Teil der E4-Codierungssequenzen, mit der Ausnahme von ORF1 (Lusky et al., (1998), supra).
Die Viruspartikel wurden, wie bei Lusky et al. (1998, supra) beschrieben, geerntet, gereinigt und titriert. AdTG6418 wurde in 293-Zellen hergestellt, alle anderen in 293-E4-(TG5606)-Zellen. Die Titrationsdaten und die Eigenschaften der Vektoren-Rückgrate sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1
Die Ergebnisse zeigen, daß eine Deletion innerhalb der E4-Region das Viruswachstum nicht beeinträchtigt, wie es die ähnlichen Titer zeigen, sobald angemessene Komplementierung geliefert wird. Mehr noch: die Deletion aller E4-ORFs außer ORF 3, 6 und 7 hat eine günstige Wirkung; sie erlaubt die Produktion einer größeren Zahl infektiöser Viren.
Frühere Studien hatten darauf hingedeutet, daß Ad-Vektoren, die einen der E4-ORFs 3 oder 6 oder 6 + 7 enthalten, ihre Vermehrungsfähigkeit in Abwesenheit von E4-Komplementierung beibehalten (Huang und Hearing, J. Virol. 63 (1989), 2605–2615). Deshalb, um die Funktionsfähigkeit einzelner oder von Kombinationen von E4-ORFs in unseren Vektoren sicherzustellen, wurde die Vermehrung dieser Vektoren in Abwesenheit von E4-Komplementierung (293-Zellen) oder in Gegenwart von E4-Komplementierung (TG5606-Zellen) verfolgt. In Übereinstimmung mit den Daten von Huang und Hearing waren die Vektoren, die E4-ORFs 6 + 7 (AdTG6421) oder die E4-ORFs 3, 6 + 7 (AdTG6490) enthielten, in der Lage, sich in 293-Zellen zu hohen Erträgen zu vermehren, und zwar zu ähnlichen Erträgen wie der Vektor mit der Wildtyp-E4-Region (AdTG6418). In diesem Zusammenhang sollte darauf hingewiesen werden, daß im Vektor AdTG6421 die Translation der E4-ORF6- und der E4-ORF6/7-Proteine beim ersten ATG im ORF6-Translationsrahmen starten kann. Demgegenüber wurde das erste ATG der E4-ORF6- und E4-ORF6/7-Proteine im Vektor AdTG6490 im Zug der Herstellung dieses Vektors deletiert. Somit muß die Translation der E4-ORFs 6 und 6/7 das zweite ATG (Aminosäure 10) im ORF6-Translationsrahmen benützen. Nachdem sich dieser Vektor (AdTG 6490) in 293-Zellen in hohem Ausmaß vermehrt, weisen diese Daten darauf hin, daß die ersten neun N-terminalen Aminosäuren der E4-ORFs 6 und 6/7 zumindest für das Viruswachstum entbehrlich sind.
Die Vektoren, die die E4-ORFs 1–4 (AdTG6447) und die E4-ORFs 3 + 4 (AdTG6449) enthielten, waren ebenfalls zur Vermehrung in Abwesenheit von E4-Komplementierung befähigt, wenn auch auf niedrigerem Niveau (100-fach geringer als beim WT-E4-Vektor). Das Wachstum des Vektors, der nur ORF3 enthielt (AdTG6477), war in 293-Zellen augenscheinlich, obwohl die Viruserträge ungefähr 1000-fach geringer als beim WT-E4-Vektor waren. Somit bestätigte das Wachstum der Vektoren AdTG6447, AdTG6449 und AdTG6477 die Funktionsfähigkeit des ORF3 in diesen Konstruktionen. Die Vektoren, die E4-ORF4 (AdTG6487) oder ORF1 (AdTG5643) enthielten, konnten sich in 293-Zellen nicht vermehren, wie dies früher schon berichtet worden war (Lusky et al., 1998, supra). Jedoch konnten sich alle Vektoren in der Gegenwart von E4-Komplementierung zu hohen Titern vermehren.
BEISPIEL 2
CFTR-Expression
A. Auswirkung der E4-Funktionen auf die Aktivierung des CMV-Promotors E1º- (AdTG6418) und E1º-E4º-Vektoren (AdTG5643) wurden dazu verwendet, nichtkomplementierende menschliche A549-Zellen in vitro bei einer MOI von 100 IU/Zelle zu infizieren. Die gesamte zelluläre RNA wurde bei 72 h p.i. aus der infizierten Zelle extrahiert und der stationäre Zustand der CFTR-mRNA mittels einer CF-spezifischen Sonde untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine starke CFTR-Expression des E1º-Vektors. Beim E1ºE4º-Vektor hingegen konnte keine CFTR-Expression festgestellt werden. Diese Daten deuten darauf hin, daß die virale E4-Region die Transkription vom CMV-Promotor, der zur Steuerung der CFTR-Expression verwendet wurde, beeinflußt. Jedoch stellen sich bei Co-Infektion mit Vektoren ohne CFTR-Gen, die die Wildtyp-E4-Region oder die E4-Region ORF1-4 enthielten, erneut hohe stationäre Zustände ein, was dafür spricht, daß bestimmte E4-Gen-Produkte die CMV-gesteuerte Transgenexpression aktivieren können. Ähnliche Resultate wurden bei Verwendung des RSV-Promotors gemacht. In Abwesenheit der E4-Region wurde die RSV gesteuerte Transgenexpression abgeschaltet und konnte durch eine E4-Region in trans wiederhergestellt werden.
B. Transgenexpression in Immundefizienten Mäusen
Die AdE1º- und die E1ºE4º-Vektoren wurden Scid-Mäusen intratracheal (IT) injiziert (Virusdosis 1,5 × 10⁹ IU/Tier). Beim E1º-Vektor wurde der Fortbestand von Virusgenomen und CFTR-mRNA bis zu 100 Tage p.i. überwacht. Die Viren-DNA wurde durch Southern-Blot-Analyse mit einem radioaktiven adenoviralen Restriktionsfragment nachgewiesen. Das Signal wurde dann durch Densitometrie-Scanning der Autoradiographien (GS-700 Imaging-Densitometer; Bio-Rad) quantifiziert. Der stationäre Zustand der CFTR-mRNA wurde wie vorstehend bewertet.
Obwohl die Menge des AdE1º-Genoms im Lauf der Zeit stetig bis auf 10% des Ausgangswertes abnahm, wurde die von Anfang an starke CFTR-Expression vom CMV-Promotor überraschenderweise beibehalten und über einen Zeitraum von 100 Tagen induziert – trotz der Beseitigung des Virusgenoms. Somit wurden bei Vektoren, die die E4-Region enthielten, Virusgenome aktiv beseitigt, doch die Transgenexpression blieb konstant, sie schien im Lauf der Zeit sogar noch aktiviert zu werden.
Eine ähnliche Untersuchung wurde am entsprechenden AdE1º-E4º-Vektor vorgenommen. Die Beseitigung des Virusgenoms verlief praktisch identisch, wie es beim E1º-Vektor beobachtet wurde. Während die CMV gesteuerte Transgenexpression nach 3 Tagen p.i. jener des E1º-Vektors sehr ähnelte, wurde nach 14 Tagen p.i. die Transgenexpression des E1º-E4º-Vektors unvermittelt abgeschaltet. Da der Fortbestand und die Beseitigung von Virusgenomen bei den E1º- und E1º-E4º-Vektoren praktisch identisch sind, deuten die Expressionsdaten darauf hin, daß die Fähigkeit der CMV-Expressionskassette in Gegenwart der E4-Region verstärkt zu sein scheint.
Um diesen Punkt zu erforschen, wurde der E1ºE4º-CFTR-Vektor mit dem Vektor E1ºE4ORF1-4 ohne CFTR-Gen (AdTG 4680) co-injiziert. Das Ergebnis zeigt, daß die Anwesenheit der E4-ORF1-4 in trans eine starke und stabile CFTR-Transgenexpression erlaubte. In einem zweiten Versuch wurden Scid-Mäuse, denen der AdE1º-E4º-CFTR-Vektor injiziert worden war, am 45. Tag p.i. mit AdTG4680 erneut injiziert, was zur Bewahrung der CMV-gesteuerten Transgenexpression innerhalb von 14 Tagen führte. Diese Ergebnisse zeigen, daß der CMV-Promotor nicht irreversibel ruhiggestellt worden war.
C. Transgenexpression in immunkompetenten Mäusen
Der Fortbestand des Virusgenoms und die CFTR-Trangenexpression wurden auch in immunkompetenten Mäusen verfolgt und verglichen, denen AdTG6418 (E1º) oder AdTG5643 (E1ºE4º), der die CMV-CFTR-Expressionskassette enthielt, injiziert worden war. Bei C57BI/6-Mäusen war die Kinetik der DNA-Abnahme bei beiden Vektortypen sehr ähnlich; die Kopienzahl der Virusgenome wurde innerhalb von 14 Tagen p.i. auf weniger als 10% des ursprünglichen Wertes reduziert. Bei CBA-Mäusen wurde das AdE1 ºE4º-Vektorgenom mit einer ähnlichen Kinetik beseitigt. Im Gegensatz dazu fiel das AdE1º-Genom innerhalb von 14 Tagen p.i. auf weniger als 1% des ursprünglichen Wertes.
Die Transgenexpression des Vektors AdE1º-E4º- sowohl in C57BI/6- als auch in CBA-Mäusen war nicht stabil und nach 14 Tagen p.i. nicht mehr feststellbar.
Überraschenderweise wurde die Tansgenexpression beim Vektor AdE1º 14 Tage p.i. nur bei CBA-Mäusen abgeschaltet. In C57BI/6-Mäusen hingegen wurde auch noch nach 120 Tagen p.i. die CFTR-Expression vom Vektor AdE1º beobachtet. Diese Befunde sprechen für die Annahme, daß C57BI/6-Mäuse irgendwie gegen das Transgen tolerant sind. Die Beibehaltung der AdE1º-CFTR-Transgenexpression könnte zusätzlich auch noch von den Transkriptionsaktivierungsfunktionen der E4-Region beeinflußt werden.
D. Funktionelle Untersuchung der viralen E4-Region
Zur weiteren Erforschung der Transkriptionsaktivierung durch die virale E4-Region wurden Vektoren mit einzelnen E4-ORFs und mit Kombinationen davon in vitro und in vivo in Scid-Mäusen, wie vorstehend beschrieben, ausgewertet.
Nach der Transduktion von A549-Zellen wurde in allen Proben Virus-DNA nachgewiesen, was darauf hindeutet, daß Deletionen innerhalb der E4-Region den in-vitro-Fortbestand der DNA nicht ändern. Jedoch variierte der stationäre Zustand der CFTR-mRNA bei den verschiedenen Stichproben dramatisch. Wie erwartet, wurde bei der positiven Kontrolle AdTG6418 (E1º E4+) ein starkes Signal beobachtet, während die Deletion der E4-Region (AdTG5643) zur kompletten Abschaltung der CFTR-Expression führte. Die Gegenwart von ORF3 (AdTG6477), ORF4 (AdTG6487) oder ORF6 + 7 (AdTG6421) stellte die Transgenexpression teilweise wieder her. Jedoch blieb der Spiegel der CFTR-mRNA sehr niedrig im Vergleich zu jenem der positiven Kontrolle (Wildtyp-E4). Die Gegenwart der ORFs 3 und 4 (AdTG6449) stellte die Aktivität des CMV-Promotors fast vollständig wieder her; ebenso die der ORFs 1 bis 4 (AdTG6447). Jedoch ist die Aktivität des CMV-Promotors in Gegenwart der ORFs 3, 6 + 7 (AdTG6490) im Vergleich zu jener des Wildtyps sogar noch verbessert.
Die Versuche zeigen, daß bei Vorhandensein der viralen E4-Region die Transgenexpression in der Lunge (I.T.) bis zu 100 Tage lang stabil blieb. Im Gegensatz dazu führte die Deletion der viralen E4-Region zur kompletten Abschaltung der Genexpression zwischen Tag 3 und Tag 14 p.i. In einem AdE1ºE4º-Hintergrund konnte die Transgenexpression in trans durch die Virus-E4-ORFs 1–4 aktiviert werden. Weiterhin konnte bei Mäusen, die den AdE1ºE4ºCFTR-Vektor enthielten, die Transgenexpression durch Injektion eines AdE1ºE4-ORF1–4-Vektors 45 d nach der ursprünglichen Injektion bewahrt werden. Dieses Ergebnis zeigt, daß der CMV-Promotor nicht irreversibel beruhigt worden war und daß (das) E4-Genprodukt(e) den CMV-Promotor positiv beeinflußt/beeinflussen. Unsere Daten mit (einem) einzelnen E4-ORFs weisen darauf hin, daß die Transaktivierungsfunktion(en) in Vektoren erhalten bleibt/bleiben, die die E4-Region-ORFs ORF3 plus ORF4 oder ORF3 plus ORF6 + 7 enthalten.
E. Gewebespezifische Expression
Um die Auswirkung der E4-Modifikationen auf die Aktivierung und den Fortbestand der Transgenexpression in vivo ohne jegliche Beeinflussung durch die Immunantwort des Wirtes zu verfolgen, wurden 1,5 × 10⁹ Virionen von jeder Konstruktion (die WT-E4, ORFs 1–4, ORFs 3 und 4, ORFs 3, 6 und 7, nur ORF3 oder nur ORF1 enthalten) an immundefiziente Scid-Mäuse durch intratracheale (I.T.) und intravenöse (I.V.) Injektion verabreicht. Der Fortbestand des Vektors und die Transgenexpression wurden im Verlauf der Zeit (3, 14, 45 und 83 Tage im Lungengewebe und 3, 14 und 30 Tage im Lebergewebe) in den Lungen und in den Lebern der infizierten Tiere mittels Southern-Blot-Analyse bzw. CFTR-Northern-Blot-Analyse verfolgt.
In der Lunge war die Abnahme des Vektors bei allen Vektoren ähnlich und vollzog sich in ähnlichen Raten, mit Ausnahme der Vektoren, die die E4-ORFs 3 (AdTG6477) und die E4-ORFs 3, 6 + 7 (AdTG6490) enthielten, die über die Zeit stabiler erschienen. Alle Vektoren exprimierten das Transgen anfänglich (Tag 3 p.i.) auf hohem, vergleichbarem Niveau. Jedoch wurde, wie beim doppelt deletierten Vektor AdE1ºE4º beobachtet, die CFTR-Expression bei den Vektoren, die den E4-ORF3 (AdTG6477), den E4-ORF4 (AdTG6487) und die E4-ORFs 6 + 7 (AdTG6421) enthielten, zwischen Tag 3 und Tag 14 p.i. abgeschaltet. Im Gegensatz dazu dauerte die CFTR-Expression, wenn auch auf unterschiedlichem Niveau, bei jenen Vektoren, die die E4-ORFs 1–4 (AdTG6477), E4-ORFs 3 + 4 (AdTG6449) enthielten, und beim Vektor, der die E4-ORFs 3, 6 + 7 (AdTG6490) enthielt, über einen Zeitraum von 83 Tagen (Dauer des Versuches) fort. Interessanterweise schien die Transgenexpression, die mit dem Vektor AdTG6490 erhalten wurde, während des ganzen Beobachtungszeitraums auf einem konstitutiv hohem Spiegel fortzudauern, und der stationäre Zustand der CFTR-mRNA war sogar höher als jener, der mit dem WT-E4-Vektor (AdTG6418) erhalten wurde. Im Gegensatz dazu war die Transgenexpression der Vektoren E4-ORF1-4 (AdTG6447) und E4-ORF3, 4 (AdTG6449) zwar anhaltend, aber nicht auf konstitutiv hohem Spiegel. Bei diesen Vektoren schien die Transgenexpression ab Tag 14 p.i. reduziert; es folgte eine Induktion am Tag 45 und dann eine erneute Abnahme am Tag 83 p.i.
Ein ähnliches Muster des Andauerns der CFTR-Expression wurde bei immunkompetenten C57BI/6-Mäusen beobachtet.
Überraschenderweise genügte in der Leber E4-ORF3 allein, um eine stabile und dauerhafte Expression des Transgens zu unterstützen. Die Kombinationen von E4-ORFs 3 + 4 und E4-ORFs 3, 6 + 7 erlaubten auch eine dauerhafte Genexpression. Der Befund, daß E4-ORF3 allein die Transgenexpression in der Leber bewahren kann, in der Lunge jedoch nicht, deutet darauf hin, daß gewebs- oder zellspezifische Faktoren mit den E4-Funktionen bei der Regulation der Genexpression vom CMV-Promotor zusammenwirken könnten.
Zusammengenommen bestätigen unsere Ergebnisse die Vorstellung, daß der Status der AdE4-Region die Expression heterologer Promotorn, wie des CMV-Promotors reguliert, und zwar höchstwahrscheinlich über einen Transaktivierungsmechanismus bzw. Transaktivierungsmechanismen. Zusätzlich deuten unsere Daten darauf hin, daß der Einfluß der E4-Region komplexer Art ist. Das E4-ORF3 ist eindeutig für die Regulation des CMV-Promotors erforderlich. In der Leber genügt die Wirkung des E4-ORF3 allein, um eine dauerhafte Genexpression zu unterstützen. Diese Wirkung des ORF3 wurde durch die Gegenwart von ORF4 oder ORFs 6 + 7 zusätzlich verstärkt. Die Wiederaufnahme der Transgenexpression in den Lungen nach I.T.-Verabreichung wurde nur durch die Kombination von E4-ORF3 + ORF4 oder mit den E4-ORFs 3, 6 + 7 erreicht. Ein zweiter Versuch, in dem die Beständigkeit des Vektors und der Transgenexpression über 3, 21, 45 und 90 Tage in der Leber verfolgt wurden, erbrachte ähnliche Ergebnisse.
BEISPIEL 3
Einfluß von Ad5-E4-Genprodukten auf die späte virale Genexpression
Um die Wirkung von E4-Genprodukten auf die späte virale Genexpression zu verfolgen, wurden A549-Zellen bei einer MOI von 1000 IU/Zelle mit AdE1º-Vektoren infiziert, die einzelne E4-ORFs oder Kombinationen von solchen enthielten. Als Kontrolle wurden AdE1ºE4wt und Ad5 in ähnlicher Weise infiziert. Nach 72 Stunden nach der Infektion wurde die gesamte Boten-RNA aus den infizierten Zellen isoliert und einer Northern-Blot-Analyse unterworfen; eine spezifische DNA-Sonde für Hexon-mRNA wurde zur Ermittlung viraler Hexon-mRNA, die für die späte virale Genexpression repräsentativ ist, verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt: Tabelle 2 Die späte virale Genexpression und die Transgenexpression (CMV-CFTR) von E4 modifizierten Ad-Vektoren
Die Ergebnisse zeigen, daß die Deletion der gesamten E4-Region zum Verschwinden der späten viralen Genexpression führt. Vektoren, die die E4-ORFs 1–4 oder die E4-ORFs 3, 4 enthielten, zeigten im Vergleich zum Ad5E1ºE4wt ähnliche Ausmaße bei der späten viralen Genexpression. Die späte virale Genexpression war in der Gegenwart von ORF3 oder ORFs 6 + 7 vermindert. Interessanterweise führte die Kombination von E4-ORF3 mit den ORFs 6 + 7 (Ad5E1ºORF3, 6 + 7) zu einem weiteren deutlichen Rückgang der späten viralen Genexpression. Wichtig ist, daß die Kombination der E4-ORFs 3, 6 + 7 den höchsten Spiegel und die höchste Dauerhaftigkeit der Transgenexpression in vitro und in vivo zeigen.
Dies zeigt, daß ein Vektor wie Ad5E1º, der die E4-ORFs 3, 6 + 7 enthält, tatsächlich wichtige Eigenschaften im Hinblick auf therapeutische Anwendungen in sich vereint: ein hohes Ausmaß und eine hohe Dauerhaftigkeit der Transgenexpression bei einem extrem niedrigen Ausmaß an viraler Antigenexpression und deshalb ein niedriges Immunogenitätsrisiko im Wirt.
BEISPIEL 4
Hepatotoxizität adenoviraler Vektoren
A. Hepatotoxizität E1-deletierter adenoviraler Vektoren
Die Hepatotoxizität E1-deletierter adenoviraler Konstruktionen wurde in Balb/c-Mäusen C57BI/6-Mäusen beurteilt, denen 1,2 × 10¹¹ Viruspartikel, hergestellt aus leeren Vektoren (kein Transgen), intravenös verabreicht worden waren. Die pathologische Analyse von Leberschnitten ergab verschiedene Schädigungen der Leberzellen, wie hepatozelluläre Schwellung, Schrumpfung, acidophile Degeneration, Apoptose und Mythonekrose. Es wurde keine konfluierende Nekrose festgestellt. Die Canaliculi der Leberpforte waren normal. Die Läsionen waren diffus, ohne daß ein bestimmter Bereich besonders davon betroffen gewesen wäre. Mit den Leberschäden einher ging eine Vergrößerung vieler Trakte der Leberpforte durch Eindringen von Lymphocyten. Einige Herde mononukleärer Zellen waren dicht an den Wänden der Leberpforte und der centrilobulären Ader verteilt. In manchen Versuchen waren die Leberschäden schon nach 4 Tagen sichtbar und verstärkten sich bis Tag 21–30.
Darüber hinaus induzierte die intravenöse Verabreichung E1-deletierter adenoviraler Vektoren gehobene Spiegel von Serum-Transaminasen (GOT, GPT), verglichen mit den Spiegeln der Kontrollen. In manchen Versuchen ließ sich die Transaminase-Zunahme schon nach 4–5 Tagen nach der Injektion beobachten. Das Maximum wird gewöhnlich zwischen den Tagen 14 und 21 nach der Injektion erreicht und ist bei der GPT stärker ausgeprägt als bei der GOT. GPT ist ein empfindlicher Marker für hepatozelluläre Verletzungen und Lebernekrosen, wogegen der GOT-Spiegel bei Herzinfarkten hoch ist. Die bei E1-Vektoren erhaltenen Transaminasewerte bestätigten die durch die pathologische Analyse festgestellten Leberschäden.
B. Hepatotoxizität E4-deletierter adenoviraler Vektoren
Zweck dieser Studie ist es, die Toxizität leerer, doppelt E1- und E4-deletierter Adenovirus-Vektoren mit jener von einfach E1-deletierten zu vergleichen. Der Versuch wurde unter den gleichen Versuchsbedingungen, wie vorstehend dargelegt, vorgenommen. Die pathologisch- anatomische Untersuchung von Leberschnitten der mit 1,2 × 10¹¹ E1-E4-Partikeln injizierten Mäuse zeigen eine verringerte Lebertoxizität. Dystrophische Läsionen wurden manchmal zwar beobachtet, doch waren sie deutlich geringer als bei E1-deletierten Adenovirus-Vektoren. Interessanterweise wurde eine gewisse Lymphocyten-Infiltration beobachtet, ohne dystrophische Läsionen hervorzurufen.
Darüberhinaus entsprach die Konzentration von GOT- und GPT-Transaminasen im Serum von Mäusen, die mit leeren, E1- und E4-deletierten Vektoren geimpft wurden, dem Hintergrundspiegel (Kontrollen). Diese Ergebnisse bestätigten die pathologischen Beobachtungen, die eine geringere Leberschädigung anzeigte, wenn die E4-Region aus dem adenoviralen Rückgrat eliminiert wurde.
Dementsprechend verursachten die AdE1/E4-deletierten Vektoren reproduzierbar eine viel geringere toxische und inflammatorische Antwort als ihre E1-deletierten Gegenstücke, womit nahegelegt wird, daß E4-Genprodukte an der Induktion dieser inflammatorischen Antworten beteiligt sind.
C. Die Rolle der einzelnen E4-ORFs bei der Toxizität der adenoviralen Vektoren
Um die Rolle der E4-Genprodukte bei der Toxizität von adenoviralen Vektoren zu verstehen, wurde eine Reihe leerer und isogener Vektoren mit einzelnen E4-ORFs und Kombinationen von solchen entworfen und hergestellt. Diese Vektoren unterscheiden sich von den in Beispiel 1 beschriebenen nur durch das Fehlen der CFTR-Expressionskassette, um die transgene Beeinflussung der Immun- und der inflammatorischen Antwort des Wirtes auszuschalten. 2 × 10¹¹ Partikel dieser Konstruktionen wurden CBA-Mäusen intravenös injiziert, um ihre Lebertoxizität festzustellen. Die Ergebnisse der pathologischen Analyse der Leberschnitte sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3 Leberpathologie nach intravenöser Injektion leerer, E4-modifizierter adenoviraler Vektoren (2 Mäuse pro Gruppe pro Zeitpunkt)

–: bedeutet kein pathologischer Befund,
+++: bedeutet zahlreiche Läsionen und/oder Entzündungen

Wie vorhin gezeigt, riefen die E1-deletierten Vektoren (mit einer Wildtyp-E4-Region) schon 4 Tage nach der Injektion Dystrophie und Entzündung hervor, und die Toxizität nahm 21 Tage nach der Injektion zu. Die Deletion der gesamten E4-Region ließ diese Toxizität dramatisch absinken. Mit Ausnahme des Vektors, der ORF3, 6 + 7 enthielt, zeigten die Vektoren, die einzelne E4-ORFs und die Kombinationen ORF6 + 7 und ORF3, 4 enthielten, im Vergleich zum E4-deletierten Adenovirus-Vektor verringerte Toxizität und Entzündung. Im Gegensatz dazu rief der Vektor, der die E4-ORFs 3, 6 + 7 enthielt, ebenso wie ein Adenovirus-Vektor mit der Wildtyp-E4-Region Leberdystrophie und Entzündung hervor.
Diese Ergebnisse wurden durch GOT- und GPT-Bestimmungen 4 und 21 Tage nach der Infektion vervollständigt. Wie schon erwähnt, induzierten die Injektionen von Virionen, die Wildtyp-E4-Genprodukte exprimieren, 21 Tage p.i. hohe Transaminase- Spiegel, was die Toxizität dieser Produkte für Leberzellen anzeigt. Eine ähnliche, wenn auch etwas schwächer ausgeprägte Induktion beobachtet man bei E1-Vektoren, die das E4-ORF4 allein und die Kombination von E4-ORF3 mit 6 + 7 tragen. Im Gegensatz dazu bewegen sich die Transaminase-Konzentrationen, die mit Adenoviren erhalten werden, die ORF3 allein oder die ORFs 3, 4 tragen, im selben Bereich wie jene, die mit Kontrollen und E1-/E4-Vektoren gemessen wurden; sie können deshalb als für Leberzellen ungiftig bezeichnet werden. Vektoren, die nur ORF6 + 7 enthalten, weisen eine leicht erhöhte GOT- und GPT-Serumkonzentration auf.
Um zu überprüfen, ob der toxische bzw. nichttoxische Status nicht vielleicht eine Folge niedrigeren Viren-Inputs bei der Injektion war, wurde der Fortbestand der viralen DNA in der Leber durch Southern-Blot-Analyse ermittelt. Bei allen Vektoren wurden ähnliche Mengen viraler DNA festgestellt, was nahelegt, daß die hohe Toxizität der Vektoren mit Wildtyp-E4, E4-ORF3, 6 + 7 oder E4-ORF4 tatsächlich der Wirkung einiger E4-Genprodukte zuzuschreiben ist.
Schlußfolgerung: Das Aufspalten der E4-Region und die Überprüfung E4 modifizierter Vektoren auf die Beständigkeit von Transgenexpression in Lunge und Leber sowie auf ihre Hepatotoxizität hin ergab einige unerwartete Ergebnisse:

– Die Kombination von E4-ORF3 entweder mit E4-ORF4 oder mit E4-ORF6 + 7 erlaubte ein Andauern der Transgenexpression in der Lunge. Jedoch war das Profil der Transgenexpression bei den verschiedenen Kombinationen qualitativ und quantitativ unterschiedlich. Die Transgenexpression in Gegenwart der E4-ORFs 3, 6 + 7 schien konstitutiv und auf einem noch höheren Niveau als in der Gegenwart der WT-E4-Region. Im Gegensatz dazu schien die Transgenexpression in Gegenwart der E4-ORFs 3 und 4 zwar dauerhaft, jedoch periodisch verringert und induziert zu verlaufen. Interessanterweise führten die Vektoren mit den E4-ORFs 3, 4 zu einer geringen Hepatotoxizität.
– In der Leber genügte die Anwesenheit von E4-ORF3, um die CFTR-Genexpression vom CMV-Promotor zu regulieren. Ähnlicherweise erlaubten die Kombinationen E4-ORF3, 4 oder E4-ORF3, 6 + 7 eine dauerhafte Transgenexpression. Darüberhinaus zeigten die Vektoren, die E4-ORF3 oder E4-ORF3, 4 enthielten, einen sehr geringen Grad von Lebertoxizität und Entzündungswirkung. Da diese Vektoren dauerhafte Transgenexpression mit geringer Toxizität verbinden, könnten sie für die Anwendung im Rahmen von leberspezifischen Gentherapieverfahren nützlich sein.

Claims

Rekombinanter Vektor umfassend ein Gen von Interesse, das funktionell verbunden ist mit regulatorischen Elementen, wobei der Vektor eine Kombination von E4-offenen Leserastern umfasst, die aus: (i) ORF3, ORF6 und ORF7; oder (ii) ORF3 und ORF 4; oder (iii) ORF1, ORF2, ORF3 und ORF4, besteht, wobei die regulatorischen Elemente einen Promotor umfassen, der in Tumor- oder Krebszellen stimuliert ist.
Vektor nach Anspruch 1, wobei der Promotor ein Promotor von einem MUC-1-, CEA-, Tyrosinase-, ERB-2- oder α-Foetoprotein-Gen ist.
Vektor nach Anspruch 1 oder 2, der ein rekombinanter adenoviraler Vektor ist, der von einem Adenovirusgenom abgeleitet ist.
Vektor nach Anspruch 3, wobei der rekombinante adenovirale Vektor von einem Adenovirusgenom abgeleitet ist, in dem die gesamte E1-Region oder ein Teil davon deletiert oder nicht-funktionell ist, die gesamte E3-Region deletiert ist und ein Teil der E4-Region deletiert ist und wobei die beibehaltenen E4-Sequenzen eine Kombination von E4-offenen Leserastern ist, die aus: (i) ORF3, ORF6 und ORF7; oder (ii) ORF3 und ORF4; oder (iii) ORF1, ORF2, ORF3 und ORF4 besteht.
Vektor nach Anspruch 4, wobei die gesamte E2-Region oder ein Teil davon und/oder die gesamten L1-L5-Regionen oder Teile davon des Adenovirusgenoms deletiert oder nicht-funktionell ist/sind.
Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die beibehaltenen E4-Sequenzen funktionell verbunden sind mit dem homologen E4-Promotor.
Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die beibehaltenen E4-Sequenzen funktionell verbunden sind mit einem heterologen Promotor.
Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei das Adenovirusgenom vom Mensch, Hund, Vogel, Rind, Maus, Schaf, Katze, Schwein oder Affe stammt, oder als eine Alternative ein Hybrid davon ist.
Vektor nach Anspruch 8, wobei der Vektor abgeleitet ist aus dem humanen Adenovirus 5 (Ad5) oder 2 (Ad2).
Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Gen von Interesse ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Genen, die für ein Cytokin, einen Zell- oder Kernrezeptor, einen Liganden, einen Gerinnungsfaktor, das CFTR-Protein, Insulin, Dystrophin, einen Wachstumsfaktor, ein Enzym, einen Enzyminhibitor, einen Apoptose-Induktor, einen Apoptose-Inhibitor, einen cytostatischen Wirkstoff, ein Apolipoprotein, einen Sauerstoffradikalfänger, ein Polypeptid, das einen Antitumor-Effekt aufweist, ein Polypeptid, das in der Lage ist, eine bakterielle, parasitische oder virale Infektion zu inhibieren, einen Antikörper, ein Toxin, ein Immunotoxin und einen Marker codieren.
Arzneimittel umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Infektiöses Viruspartikel, umfassend den rekombinanten adenoviralen Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 10.
Verfahren zur Herstellung eines infektiösen adenoviralen Viruspartikels nach Anspruch 12, demgemäss: (i) der rekombinante adenovirale Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 10 in eine Komplementationszelle eingeführt wird, die in der Lage ist, in trans den adenoviralen Vektor zu komplementieren, um eine transfizierte Komplementationszelle zu erhalten; (ii) die transfizierte Komplementationszelle unter geeigneten Bedingungen gezüchtet wird, um die Herstellung des infektiösen adenoviralen Viruspartikels zu erlauben; und (iii) das infektiöse adenovirale Viruspartikel aus der Zellkultur gewonnen wird.
Wirtszelle, umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder infiziert mit einem infektiösen Viruspartikel nach Anspruch 12.
Zusammensetzung, umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, ein infektiöses Viruspartikel nach Anspruch 12 oder eine Wirtszelle nach Anspruch 14.
Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 10, eines infektiösen Viruspartikels nach Anspruch 12 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 14, für die Herstellung eines Arzneimittels, das zum Gentransfer vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei in dem Vektor die beibehaltenen E4-Sequenzen eine Kombination von E4-offenen Leserastern sind, die aus: (i) ORF3 und ORF4; oder (ii) ORF3, ORF6 und ORF7; besteht, und wobei das Arzneimittel zum Gentransfer in Lungengewebe vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei in dem Vektor die beibehaltenen E4-Sequenzen eine Kombination von E4-offenen Leserastern sind, die aus: (i) ORF3 und ORF 4; oder (ii) ORF3, ORF6 und ORF7; besteht, und wobei das Arzneimittel zum Gentransfer in Lebergewebe vorgesehen ist.