DE69534791T2

DE69534791T2 - Vektoren zur gewebsspezifischen replikation

Info

Publication number: DE69534791T2
Application number: DE69534791T
Authority: DE
Inventors: Paul L. Burtonsville HALLENBECK; Yung-Nien Cockeysville CHANG; Yawen L. Potomac CHIANG
Original assignee: Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1994-11-28
Filing date: 1995-11-28
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2015-11-29
Also published as: EP0791050A1; WO1996017053A1; FI972225A; AU716045B2; EP0791050B1; ES2258265T3; EP0791050A4; DE69534791D1; AU4504396A; JPH10509880A; NO972373D0; CA2206179C; CA2206179A1; FI972225A0; NO972373L; ATE317895T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein gezielte Gentherapie unter Verwendung rekombinanter Vektoren und insbesondere Adenovirus Vektoren. Die Erfindung betrifft insbesondere replikationsabhängige Vektoren und Verfahren zu ihrer Verwendung. Solche Vektoren sind in der Lage, selektiv in einem Zielgewebe zu replizieren, um einen therapeutischen Vorteil aus der Anwesenheit des Vektors per se oder von heterologen Genprodukten, die von dem Vektor exprimiert werden und über das Gewebe verteilt werden, bereitzustellen. In solchen Vektoren wird ein Gen, das für Replikation essentiell ist, unter der Kontrolle einer heterologen gewebespezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz angeordnet. Somit ist die Replikation abhängig von der Anwesenheit eines Faktor(s), der die Transkription induziert oder der Abwesenheit eines Faktor(s), der die Transkription eines Gens durch die transkriptionale regulatorische Sequenz inhibiert. Mit diesem Vektor kann deshalb ein Zielgewebe selektiv behandelt werden. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung der Vektoren, um ein Gewebe hinsichtlich der Anwesenheit oder Abwesenheit von transkriptionalen regulatorischen Funktionen zu screenen, die Vektor Replikation durch die transkriptionale regulatorische Sequenz erlauben. Die Erfindung betrifft auch Zellen zur Herstellung rekombinanter replikationsabhängiger Vektoren, die für die gezielte Gentherapie nützlich sind.
Stand der Technik
Ziel (Targeting) Vektoren
Eines der Hauptziele für die therapeutische Verwendung von exogenen Genen ist das Zelltargeting mit hoher Spezifität. Allgemeine Ansätze haben das systemische Einführen von DNA, DNA-Proteinkomplexen und Liposomen eingeschlossen. Die in situ Verabreichung von Retroviren wurde auch für Zellen verwendet, die aktiv replizieren.
Jedoch war aufgrund des Mangels an, oder der signifikant geringen, Zellspezifität und dem ineffizienten Gentransfer das Targeting von gewünschten Genen an spezifische Zellen in einem Organismus ein Haupthindernis für exogene Gen basierte Therapie. So war die Verwendung solcher Gene begrenzt.
Tumorzellen sind unter jenen Zellen, für die es besonders wünschenswert wäre, ein Mittel für exogenes Gentargeting bereitzustellen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen und Verfahren bereitgestellt, um exogene Gene sicher und effizient zu Tumorzellen zu transportieren.
Adenoviren im Allgemeinen
Adenoviren sind nicht umhüllte reguläre Ikosaeder. Die Proteinhülle (Kapsid) ist aus 252 Capsomeren zusammengesetzt, von denen 240 Hexone und 12 Pentone sind. Die meisten der detaillierten strukturellen Studien der Adenovirus Polypeptide wurden für die Adenovirus Typen 2 und 5 durchgeführt. Die virale DNA ist 23,85 × 10⁶ Dalton bei Adenovirus 2 groß und variiert abhängig vom Serotyp leicht in der Größe. Die DNA besitzt invertierte terminate Repetitionen, und ihre Länge variiert mit dem Serotyp.
Der replikative Zyklus ist in frühe (early - E) und späte (late - L) Phasen unterteilt. Die späte Phase definiert den Beginn der viralen DNA Replikation. Die Adenovirus Strukturproteine werden für gewöhnlich während der späten Phase synthetisiert. Nach der Adenovirus Infektion wird die Wirts DNA und Proteinsynthese in den Zellen durch die meisten infizierenden Serotypen inhibiert. Der Adenovirus lytische Zyklus ist bei Adenovirus 2 und Adenovirus 5 sehr effizient und führt zu ungefähr 10.000 Virionen pro infizierter Zelle zusammen mit der Synthese von überschüssigem viralen Protein und DNA, die nicht in das Virion eingebaut wird. Die frühre Adenovirus Transkription ist eine komplizierte Folge von miteinander verbundenen biochemischen Ereignissen, aber sie führt im Wesentlichen zur Synthese von viralen RNAs vor dem Beginn der viralen DNA Replikation.
Die Organisation des Adenovirus Genom ist in allen Adenovirus Gruppen ähnlich, und spezifische Funktionen sind im Allgemeinen an identischen Orten in jedem untersuchten Serotyp angeordnet. Die frühen zytoplasmatischen Boten RNAs sind komplementär zu vier definierten, nicht benachbarten Regionen auf der viralen DNA. Diese Regionen werden als (E1–E4) bezeichnet. Die frühen Transkripte wurden in eine Anordnung von sehr frühen (immediate early - E1a), verzögert frühen (delayed early – E1b, E2a, E2b, E3 und E4) und dazwischenliegenden (intermediate - IVa2.IX) Regionen klassifiziert.
Die E1a Region ist in die transkriptionale Transaktivierung von viralen und zellulären Genen ebenso wie in die transkriptionale Repression von anderen Sequenzen involviert. Das E1a Gen übt eine wichtige Kontrollfunktion auf alle anderen frühen Adenovirus Boten RNAs aus. In normalen Geweben wird, um die Regionen E1b, E2a, E2b, E3 oder E4 effizient zu transkribieren, aktives E1a Produkt benötigt. Jedoch kann, wie unten diskutiert, die E1a Funktion umgangen werden. Zellen können manipuliert werden, um E1a ähnliche Funktionen bereitzustellen, oder sie können natürlicherweise solche Funktionen enthalten. Das Virus kann auch manipuliert werden, um, wie unten beschrieben, die Funktionen zu umgehen.
Die E1b Region wird für die normale Progression von viralen Ereignissen, die spät in der Infektion stattfinden, benötigt. Das E1b Produkt wirkt im Wirtskern. Mutanten, die innerhalb der E1b Sequenzen gebildet werden, zeigen eine verringerte Akkumulation der späten viralen mRNA ebenso wie eine Beeinträchtigung in der Inhibition des zellulären Transports des Wirtes, der normalerweise spät in der Adenovirus Infektion beobachtet wird (Berkner, K.L., Biotechniques 6: 616–629 (1988)). E1b wird für die Veränderung von Funktionen der Wirtszelle benötigt, so dass die Verarbeitung und der Transport zugunsten der viralen späten Genprodukte verlagert werden. Diese Produkte führen dann zur viralen Verpackung und Freisetzung von Virionen. E1b bildet ein 19 kD Protein, das Apoptose verhindert. E1b bildet auch ein 55 kD Protein, das an p53 bindet.
Für eine vollständige Übersicht über Adenoviren und ihre Replikation, siehe Horwitz, M.S., Virology 2. Aufl., Fields, B.N., Hrsg., Raven Press Limited, New York (1990), Kapitel 60, S. 1679–1721.
Adenovirus als rekombinantes Transportvehikel
Das Adenovirus liefert Vorteile als ein Vektor für den adäquaten Gentransport aus den folgenden Gründen. Es ist ein doppelsträngiges DNA nicht umhülltes Virus mit einem Tropismus für das menschliche Atemwegssystem und den Magendarmtrakt. Es verursacht eine milde Grippe-ähnliche Erkrankung. Adenovirale Vektoren treten in Zellen durch Rezeptor vermittelte Endozytose ein. Das große (36 Kilobasen) Genom erlaubt die Entfernung von Genen, die für die Replikation essentiell sind und nicht essentieller Regionen, so dass Fremd DNA eingebaut und von dem viralen Genom exprimiert werden kann. Adenoviren infizieren eine große Vielzahl von Zelttypen in vivo und in vitro. Adenoviren wurden als Vektoren für die Gentherapie und zur Expression von heterologen Genen verwendet. Die Expression von viralen oder fremden Genen aus dem Adenovirus Genom benötigt keine replizierende Zelle. Adenovirus Vektoren integrieren selten in das Wirtschromosom; das Adenovirus Genom verbleibt als ein extrachromosomales Element im zellulären Kern. Es gibt keine Verbindung von menschlichen bösartigen Erkrankungen mit Adenovirus Infektion; es wurden attenuierte Stämme entwickelt und in Menschen als Lebenvakzine verwendet.
Für eine detaillierte Diskussion der Verwendung von Adenovirus Vektoren für die Gentherapie, siehe Berkner, K.L., Biotechniques 6:616–629 (1988); Trapnell, B.C., Advanced Drug Delivery Reviews 12:185–199 (1993).
Die Adenovirus Vektoren sind im Allgemeinen in der E1 Region des Virus deletiert. Die E1 Region kann dann mit den interessierenden DNA Sequenzen substituiert werden. Es wurde jedoch in einem kürzlichen Artikel über menschliche Gentherapie hervorgehoben, dass "der Hauptnachteil in der Verwendung von Adenovirus als ein Gentransfer Vektor die Tatsache ist, dass der vitale Vektor im Allgemeinen episomal verbleibt und nicht repliziert, so dass die Zellteilung schließlich zum Verlust des Vektors aus den Tochterzellen führt" (Morgan, R.A., et al., Annual Review of Biochemistry 62:191–217 (1993)) (Hervorhebung hinzugefügt).
Die Nichtreplikation des Vektors führt nicht nur zum schließlichen Verlust des Vektors ohne Expression in den meisten oder allen Zielzellen, sondern führt auch zur nicht ausreichenden Expression in den Zellen, die den Vektor aufnehmen, weil die Kopienzahl des Gens, dessen Expression gewünscht ist, für einen maximalen Effekt nicht ausreichend ist. Das Nichtausreichen der Genexpression ist eine allgemeine Beschränkung aller nicht replizierenden Transportvektoren. Deshalb ist es wünschenswert, einen Vektor einzuführen, der multiple Kopien eines Gens und damit größere Mengen des Produkts des Gens bereitstellen kann. Die vorliegende Erfindung überwindet die Nachteile, die oben diskutiert wurden, durch das Bereitstellen eines gewebespezifischen und insbesondere eines tumorspezifischen replizierenden Vektors mit mehrfachen DNA Kopien und damit gesteigerten Mengen des Genprodukts.
Herstellung von adenoviralen Vektoren
Adenovirale Vektoren für rekombinante Genexpression wurden in der menschlichen embryonalen Nieren Zelllinie 293 hergestellt (Graham, F.L., et al., J. Gen. Virol. 36:59–72 (1977)). Diese Zelllinie, die ursprünglich mit menschlichem Adenovirus 5 transformiert wurde, enthält jetzt das linke Ende des Adenovirus 5 Genoms und exprimiert E1. Deshalb sind diese Zellen permissiv für das Wachstum von Adenovirus 2 und Adenovirus 5 Mutanten, die in E1 Funktionen defizient sind. Sie wurden weitreichend für die Isolierung und Vermehrung von E1 Mutanten verwendet. Deshalb wurden 293 Zellen für Helfer unabhängige Klonierung und die Ex pression von Adenovirus Vektoren in Säugertierzellen verwendet. E1 Gene, die in zelluläre DNA von 293 Zellen integriert sind, werden in Mengen exprimiert, welche die Deletion dieser Gene aus dem viralen Vektorgenom erlauben. Die Deletion stellt eine nicht essentielle Region bereit, in die DNA eingebaut werden kann. Für einen Überblick, siehe Young, C.S.H., et al. in The Adenoviruses, Ginsberg, H.S., Hrsg., Plenum Press, New York und London (1984), S. 125–172.
Jedoch weisen 293 Zellen ernste Beschränkungen als Herstellungs (Producer) Zellen für Adenovirus Vektoren auf. Die Wachstumsgeschwindigkeiten sind gering. Die Titer sind begrenzt, insbesondere wenn der Vektor ein heterologes Genprodukt bildet, das sich toxisch für die Zellen zeigt. Die Rekombination mit der viralen E1 Sequenz in dem Genom kann zu der Kontamination des rekombinanten defekten Virus mit unsicherem Wildtyp Virus führen. Die Qualität mancher viralen Präparationen ist bezüglich des Verhältnisses von Virus Partikel zu Plaque bildender Einheit schlecht. Darüber hinaus unterstützt die Zelllinie nicht das Wachstum von weiterreichend deletierten Mutanten, weil die Expression von E1 in Kombination mit anderen viralen Genen in dem zellulären Genom (notwendig um die weitere Deletion zu komplementieren), wie E4, für die Zellen toxisch ist. Deshalb ist die Menge an heterologer DNA, die in das virale Genom eingebaut werden kann, in diesen Zellen begrenzt. Es ist deshalb wünschenswert, Adenovirus Vektoren für die Gentherapie in einer Zelle herzustellen, die keine Wildtyp Rekombinanten herstellen kann und hohe Titer von Virus mit hoher Qualität bilden kann. Die vorliegende Erfindung überwindet diese Beschränkungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Angesichts der oben diskutierten Beschränkungen ist es ein allgemeines Ziel der Erfindung, neue Vektoren für gewebespezifische Vektor Replikation und Genexpression von dem replizierenden Vektor bereitzustellen. Folglich ist die Erfindung auf einen adenoviralen Vektor gerichtet, der ein Gen enthält, das für die Replikation essentiell ist, und dieses Gen ist funktional mit einer heterologen transkriptionalen regulatorischen Sequenz verbunden, so dass ein Vektor gebildet wird, dessen Replikation von der Anwesenheit eines trans-wirkenden transkriptionalen regulatorischen Faktors(en), der die Transkription von der transkriptionalen regulatorischen Sequenz erlaubt, oder von der Abwesenheit eines transkriptionalen regulatorischen Faktors(en), der normalerweise die Transkription von der transkriptionalen regulatorischen Sequenz verhindert, abhängt. So werden diese regulatorischen Sequenzen spezifisch in dem Zielgewebe aktiviert oder dereprimiert, so dass die Replikation des Vektors in diesem Gewebe stattfindet.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, eine gewebespezifische Behandlung von abnormalem Gewebe bereitzustellen. Somit ist es ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur selektiven Verteilung eines Vektors in vivo in einem Zielgewebe bereitzustellen, so dass eine größere Anzahl von Zellen behandelt wird als mit einem nicht replizierenden Vektor behandelt werden würde, und die Behandlung in Nichtzielgewebe verhindert oder signifikant verringert wird. Folglich wird ein Verfahren zur selektiven Verteilung eines Vektors in einem Zielgewebe durch Einführen des erfindungsgemäßen replikationsabhängigen Vektors in ein Zielgewebe, das einen transkriptionalen regulatorischen Faktor(en) enthält, der die Replikation des Vektors erlaubt, oder das in einem transkriptionsinhibierenden Faktor(en) defizient ist, der die Replikation des Vektors verhindert, bereitgestellt.
Zur Bereitstellung von gewebespezifischer Behandlung ist es ein anderes Ziel der Erfindung ein Polynukleotid in einem Zielgewebe in vivo selektiv zu verteilen. Folglich ist die Erfindung auf ein Verfahren zur selektiven Verteilung eines Polynukleotids in einem Zielgewebe in vivo durch Einführen eines erfindungsgemäßen replikationsabhängigen Vektors, der das Polynukleotid enthält, in das Zielgewebe, das einen transkriptionalen regulatorischen Faktor(en) enthält, der die Replikation des Vektors erlaubt oder das in dem transkriptionsinhibierenden Faktor(en), der die Replikation des Vektors verhindert, defizient ist, gerichtet.
Zum Bereitstellen einer gewebespezifischen Behandlung ist es ein weiteres Ziel der Erfindung, ein heterologes Genprodukt in einem Zielgewebe selektiv zu verteilen. Folglich werden die erfindungsgemäßen replikationsabhängigen Vektoren konstruiert, so dass sie eine heterologe DNA Sequenz enthalten, die ein Genprodukt kodiert, das in dem Vektor exprimiert wird. Wenn der Vektor in dem Zielgewebe repliziert, werden auch effektive Mengen des gewünschten Genprodukts in dem Zielgewebe hergestellt.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Identifizieren abnormalen Gewebes, das durch die erfindungsgemäßen Vektoren behandelt werden kann, bereitzustellen. Deshalb ist es ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Gewebe zu identifizieren, in dem die erfindungsgemäßen replikationsabhängigen Vektoren durch die transkriptionale regulatorische Sequenz, die auf dem Vektor enthalten ist, repliziert werden können. Folglich ist die Erfindung weiterhin auf ein Verfahren gerichtet, in dem die erfindungsgemäßen replikationsabhängigen Vektoren einem gegebenen abnormalen Gewebe ausgesetzt sind. Wenn das Gewebe einen transkriptionalen regulatorischen Faktor(en) enthält, der die Replikation des Vektors erlaubt, oder das in einem transkriptionsinhibierenden Faktor(en) defizient ist, wird die Replikation des Vektors stattfinden und kann nachgewiesen werden. Nach dem Identifizieren eines solchen Gewebes kann die gezielte Behandlung dieses Gewebes durch gewebespezifische Transkription und die anschließende Vektor Replikation in diesem Gewebe in vivo stattfinden.
Somit wird ein Verfahren zum Untersuchen der Nützlichkeit des Vektors für Gewebebehandlung bereitgestellt, umfassend die Schritte des Entfernens einer Gewebebiopsie aus einem Patienten, des Explantierens der Biopsie in Gewebekultur, des Einführens eines replikationsabhängigen Vektors in die Zellen der Biopsie und des Untersuchens hinsichtlich Vektor Replikation in den Zellen.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, Herstellungszelllinien für die Vektor Herstellung bereitzustellen. Vorzugsweise weisen die Zelllinien eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften auf: Virus Herstellung mit hohen Titern, Resistenz gegenüber toxischen Effekten aufgrund der heterologen Genprodukte, die in dem Vektor exprimiert werden, Abwesenheit der Herstellung von Wildtyp Virus, das die Virus Präparation kontaminiert und aus der Rekombination zwischen integrierten viralen Sequenzen und Vektorsequenzen resultiert, Wachstum zu hoher Dichte und in Suspension, unbegrenztes Passagierpotenzial, hohe Wachstumsgeschwindigkeit und das Erlauben des Wachstums von stark deletierten Viren, die hinsichtlich viraler Funktionen beeinträchtigt sind, und die Fähigkeit, große Stücke heterologer DNA aufzunehmen.
Folglich wird in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung eine Zelllinie bereitgestellt, die den erfindungsgemäßen replikationsabhängigen Vektor enthält, die Zellen dieser Zelllinie enthalten einen transkriptionalen regulatorischen Faktor(en), der die Replikation des Vektors erlaubt, oder sie sind in einem transkriptionsinhibierenden Faktor(en), der die Replikation des Vektors verhindert, defizient.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung enthält die Zelllinie Nukleinsäure Kopien des replizierten Vektors.
In weiteren Ausführungsformen wird ein Verfahren zur Herstellung eines replikationsabhängigen Vektors oder Virions bereitgestellt, umfassend die Schritte des Züchtens der oben beschriebenen Herstellungszelllinie und des Gewinnens des Vektors oder Virions aus den Zellen. In noch weiteren Ausführungsformen wird ein Verfahren zur Herstellung replikationsabhängiger Virionen, die frei von Wildtyp Virionen sind, oder viraler Vektoren, die frei sind von Wildtyp Vektoren, bereitgestellt, umfassend die Schritte des Züchtens der oben beschriebenen Herstellungszelllinie und des Gewinnens der replikationsdefizienten Virionen oder Vektoren aus den Zellen.
In bevorzugten Verfahren zur Behandlung und Diagnose proliferiert das Gewebe abnormal, und es ist insbesondere ein Tumorgewebe. Jedoch sind die Verfahren auch auf anderes abnormales Gewebe, wie hier beschrieben, gerichtet.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor ein Adenovirus Vektor. Jedoch wird verstanden, dass potenziell irgendeine Vektorquelle nützlich ist, wenn sie ein Gen enthält, das essentiell für die Replikation ist, das funktional mit einer gewebespezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz verbunden werden kann.
In weiteren Verfahren zur Behandlung und Diagnose wird der Vektor in das Gewebe durch Infektion eingeführt.
In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein Gen in der Adenovirus E1 Region funktional mit der gewebespezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz verbunden. Vorzugsweise ist das E1a oder das E1b Gen funktional mit der gewebespezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz verbunden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kodiert der Vektor ein heterologes Genprodukt. Dieses heterologe Genprodukt wird von dem Vektor, der in dem Zielgewebe repliziert, exprimiert.
In einer weiteren Ausführungsform der Verfahren zur Behandlung ist das heterologe Genprodukt für das Zielgewebe toxisch.
In einer weiteren Ausführungsform der Verfahren wirkt das heterologe Genprodukt auf ein nicht toxisches Vorläufer Arzneimittel und wandelt das nicht toxische Vorläufer Arzneimittel in eine Form um, die für das Zielgewebe toxisch ist. Vorzugsweise besitzt das Toxin Antitumor-Aktivität oder eliminiert die Zell Proliferation.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die transkriptionale regulatorische Sequenz ein Promotor. Bevorzugte Promotoren schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf carzinoembryonales Antigen (CEA), DE3, α-Fetoprotein (AFP), Erb-B2, grenzflächenaktives Mittel, und insbesondere Lungen grenzflächenaktives Mittel, und den Tyrosinase Promotor. Jedoch kann irgendeine genetische Kontrollregion, welche die Transkription des essentiellen Gens kontrolliert, verwendet werden, um das Gen zu aktivieren (oder zu dereprimieren). Somit können andere genetische Kontrollelemente, wie Enhancer, reprimierbare Sequenzen und Silencer verwendet werden, um die Replikation des Vektors in der Zielzelle zu regulieren. Die einzige Notwendigkeit ist es, dass das genetische Element durch Faktoren in der Wirtszelle und, bezüglich der Verfahren zur Behandlung, nicht in der Nichtzielzelle, aktiviert, dereprimiert, verstärkt oder auf andere Weise genetisch reguliert wird.
Bevorzugte Enhancer schließen den DF3 Brustkrebs spezifischen Enhancer und Enhancer von Viren und die Steroid Rezeptorfamilie ein. Andere bevorzugte transkriptionale regulatorische Sequenzen schließen NF1, SP1, AP1 und FOS/JUN ein.
In weiteren Ausführungsformen werden die Promotoren nicht notwendigerweise durch Faktoren in dem Zielgewebe aktiviert, sondern durch Faktoren dereprimiert, die in dem Zielgewebe anwesend sind. Somit wird in dem Zielgewebe die Repression gelöst.
Transkriptionale regulatorische Faktoren schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, transaktivierende Faktoren, die durch endogene virale Sequenzen gebildet werden, wie von Cytomegalovirus (CMV), HIV, Epstein-Barr Virus (EBV), Herpes simplex Virus (HSV), SV40 und andere solche Viren, die pathogen in Säugetieren und insbesondere im Menschen sind.
Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren sind dem Fachmann gut bekannt. Der Stand der Technik lehrt ausreichend die Herstellung von rekombinanten Vektoren mit Deletionen oder Modifikationen in spezifischen kodierenden Sequenzen und die funktionale Verbindung mit einer heterologen Transkriptionskontrollsequenz, so dass die Expression einer gewünschten kodierenden Region unter der Kontrolle der heterologen transkriptionalen regulatorischen Sequenz steht. Viele virale Sequenzen wurden ausreichend kartiert, so dass es Routinearbeit ist, ein Gen der Wahl zu identifizieren und geeignete, gut bekannte Techniken (wie homologe Rekombination des Virus mit deletierten oder auf andere Weise modifizierten Plasmi den) zu verwenden, um die Vektoren für gewebespezifische Replikation und Expression zu konstruieren.
Kurzbeschreibung der Figuren
1. Klonierung von pAVE1a02i: pAVSAFP.TK1 wurde mit NheI/MunI gespalten. Ein 10667 bp Fragment wurde isoliert. pSE280-E1 wurde mit SpeI/MunI gespalten. Ein 3397 bp Fragment wurde isoliert. Die isolierten Fragmente wurden ligiert, um pAVE1a02i zu bilden.
2A–C. PCR Identifizierung von rekombinantem Adenovirus mit E1a, das von dem Heptatom spezifischen AFP Promotor exprimiert wird. 2A zeigt, dass virale Plaques durch virale Genome gebildet werden, die den AFP Promotor funktional verknüpft mit E1a enthalten. 2B zeigt, dass es keine Kontamination mit Wildtyp Virus gab. 2C zeigt, dass es keine Kontamination mit AV1lacZ DNA gab.
3A–F. Gewebespezifisches Adenovirus mit E1a, das von dem AFP Promotor exprimiert wird. Das Experiment zeigt zytopathogene Effekte und die Ausbreitung von Zelltod nach Infektion mit dem Virus AVAFPE1a. Die 3A–3C zeigen nicht infizierte Kontrollen jeweils in A549.30, A549 und HuH 7 Zellen. Die 3D–3F zeigen die Ergebnisse der Infektion mit dem Virus jeweils in A549.30, A549 und HuH 7 Zellen.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Definitionen
Der Begriff "abnormal proliferierend" soll eine Zelle mit einem höheren mitotischen Index als ihr normal funktionierendes Gegenstück bedeuten, so dass es eine abnormale Akkumulation solcher Zellen gibt.
Der Begriff "Antitumor-Aktivität" soll irgendeine Aktivität bedeuten, die das Wachstum eines Tumors inhibiert, verhindert oder zerstört.
Ein Begriff "Verteilen" soll die Ausbreitung eines Vektors und seines begleitenden heterologen Gens (Produkts) (wenn es auf dem Vektor anwesend ist) in dem Zielgewebe, und insbesondere in abnormal proliferierendem Gewebe (nicht bösartig oder bösartig) bedeuten. Das Ziel der Verteilung ist es, den Vektor, das Genprodukt oder die Effekte des Genprodukts (wie zum Beispiel durch einen unbeteiligten Effekt) zu im Wesentlichen allen oder einer signifikanten Zahl von Zellen des Zielgewebes zu transportieren, so dass im Wesentlichen das gesamte Zielgewebe behandelt wird.
Der Begriff "Enhancer" wird gemäß seiner Bedeutung im Stand der Technik verwendet. Er soll eine Sequenz bedeuten, die in Eukaryonten und gewissen eukaryonten Viren gefunden wird, welche die Transkription von einem Gen verstärken kann, wenn sie (in jeder Orientierung) bis zu einigen Kilobasen von dem untersuchten Gen entfernt angeordnet ist. Diese Sequenzen wirken für gewöhnlich als Enhancer, wenn sie auf der 5' Seite (oberhalb) des fraglichen Gens angeordnet sind. Jedoch sind einige Enhancer aktiv, wenn sie auf der 3' Seite (unterhalb) des Gens angeordnet sind. In einigen Fällen können Enhancer Elemente die Transkription von einem Gen mit keinem (bekannten) Promotor aktivieren.
Der Begriff "funktionale Inaktivierung" soll eine genetische Läsion bedeuten, welche die normale Aktivität eines Genprodukts verhindert. Somit könnte funktionale Inaktivierung von einer Mutation in dem Gen, welches das Genprodukt kodiert, stammen. Eine solche Läsion schließt Insertionen, Deletionen und Basenänderungen ein. Alternativ dazu kann eine funktionale Inaktivierung in der abnormalen Interaktion des normalen Genprodukts mit einem oder mehreren anderen zellulären Genprodukten stattfinden, die an die funktionale Aktivität des Genprodukts binden oder sie auf andere Weise verhindern. Somit kann das Genprodukt ein Protein sein, das von einem normalen Gen hergestellt wird, aber das seine ge wöhnliche und normale Funktion aufgrund einer Interaktion mit einem zweiten Faktor nicht ausführen kann.
Der Begriff "essentielles Gen für Replikation" betrifft eine genetische Sequenz, deren Transkription benötigt wird, damit der Vektor in der Zielzelle repliziert.
Der Begriff "Genprodukt" soll DNA, RNA, Protein, Peptide oder virale Partikel bedeuten. Somit dient die Verteilung, zum Zweck der Erfindung, irgendeiner dieser Bestandteile.
Der Begriff "heterolog" bedeutet eine DNA Sequenz, die in dem nativen Vektor Genom nicht gefunden wird. Bezüglich einer "heterologen transkriptionalen regulatorischen Sequenz" bezeichnet "heterolog", dass die transkriptionale regulatorische Sequenz nicht natürlicherweise mit der DNA Sequenz für das Gen ligiert ist, das für die Replikation des Vektors essentiell ist.
Der Begriff "Promotor" wird gemäß seiner Bedeutung im Stand der Technik verwendet. Er soll die DNA Region, für gewöhnlich oberhalb der kodierenden Sequenz eines Gens oder eines Operons, bedeuten, die RNA Polymerase bindet und das Enzym zu der richtigen transkriptionalen Startseite leitet.
Der Begriff "Replikation" bedeutet die Duplikation eines Vektors. Diese Duplikation kann im Fall von Viren auf der Ebene von Nukleinsäure oder auf der Ebene von infektiösen viralen Partikeln stattfinden. Im Fall von DNA Viren ist die Replikation auf der Ebene der Nukleinsäure DNA Replikation. Im Fall von RNA Viren ist die Nukleinsäure Replikation die Replikation in Plus- oder Minusstrang (oder beides). Im Fall von Retroviren schließt die Replikation auf Nukleinsäure Ebene die Herstellung von cDNA ebenso wie die weitere Herstellung von RNA viralen Genomen ein. Das wesentliche Merkmal sind Nukleinsäure Kopien des original viralen Vektors. Jedoch schließt Replikation auch die Bildung von infektiösen DNA oder RNA viralen Partikeln ein. Solche Partikel können erfolgreich Zellen in einem gegebe nen Zielgewebe infizieren, wodurch der Vektor durch das gesamte oder einen signifikanten Anteil des Zielgewebes verteilt wird.
Der Begriff "replikationsabhängiger Vektor" betrifft einen Vektor der, wenn er in ein Gewebe eingeführt wird, nicht repliziert, es sei denn eine transkriptionale regulatorische Sequenz in diesem Vektor wird aktiviert oder in diesem Gewebe dereprimiert. Das bedeutet, dass die Replikation von der Transkription durch diese transkriptionale regulatorische Sequenz abhängt. Ein solcher Vektor ist, wie oben beschrieben, replikationsabhängig, weil er in der folgenden Weise modifiziert wurde. Ein Gen, das für die Replikation essentiell ist, wurde modifiziert durch Austauschen der transkriptionalen regulatorischen Sequenz, von der die Transkription des Gens normalerweise abhängt, gegen eine heterologe transkriptionale regulatorische Sequenz. Diese transkriptionale regulatorische Sequenz hängt von der Anwesenheit von transkriptionalen regulatorischen Faktoren oder von der Abwesenheit von transkriptionalen regulatorischen Inhibitoren ab. Die Anwesenheit dieser Faktoren in einem gegebenen Gewebe oder die Abwesenheit von solchen Inhibitoren in einem gegebenen Gewebe stellt die Replikationsabhängigkeit bereit. Folglich kann die native transkriptionale regulatorische Sequenz durch die heterologe transkriptionale regulatorische Sequenz ersetzt werden. Alternativ dazu kann die native transkriptionale regulatorische Sequenz unterdrückt oder durch teilweise Entfernung (Deletion) oder andere Mutation (eine oder mehrere Basenänderungen, Insertionen, Inversionen, etc.) gestört sein.
Die Gensequenz kann eine kodierende Sequenz sein. Sie kann einen oder mehrere offene Leserahmen, ebenso wie Intronsequenzen enthalten. Jedoch ist eine solche Sequenz nicht auf eine kodierende Sequenz beschränkt, sondern sie schließt Sequenzen ein, die in RNA transkribiert werden, wobei die RNA selbst essentiell für die Vektor Replikation ist. Es ist das wesentliche Merkmal, dass die Transkription der Gensequenzen nicht von den nativen transkriptionalen regulatorischen Sequenzen abhängt.
Der Begriff "Silencer", verwendet in seiner Bedeutung des Standes der Technik, bedeutet eine Sequenz, die in eukaryonten Viren und Eukaryonten gefunden wird, welche die Transkription eines Gens verringern oder ruhigstellen kann, wenn sie innerhalb einiger Kilobasen von diesem Gen angeordnet ist.
Der Begriff "gewebespezifisch" soll bedeuten, dass die transkriptionale regulatorische Sequenz, mit der das für die Replikation essentielle Gen funktional verbunden ist, spezifisch in diesem Gewebe wirkt, so dass die Replikation in diesem Gewebe stattfindet. Dies kann durch die Anwesenheit von positiven Transkriptionsfaktoren in diesem Gewebe, und nicht in Nichtzielgeweben, stattfinden, welche die transkriptionale regulatorische Sequenz aktivieren. Dies kann auch durch die Abwesenheit von transkriptionsinhibierenden Faktoren stattfinden, die normalerweise in Nichtzielgeweben auftreten und Transkription als ein Ergebnis der transkriptionsregulatorischen Sequenz verhindern. Wenn somit Transkription auftritt, schreitet sie in das Gen, das für die Replikation essentiell ist, fort, so dass in diesem Zielgewebe die Replikation des Vektors und seiner begleitenden Funktionen stattfindet.
So wie hier beschrieben, ist Gewebespezifität insbesondere in der Behandlung der abnormalen Gegenstücke eines normalen Gewebes relevant. Solche Gegenstücke schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Lebergewebe und Leberkrebs, Brustgewebe und Brustkrebs, Melanome und normales Hautgewebe. Gewebespezifität schließt auch die Anwesenheit eines abnormalen Gewebetyps, der verteilt zwischen normalem Gewebe eines anderen Gewebetyps vorkommt, wie zum Beispiel im Fall von Metastasen von Darmkrebs, Brustkrebs und ähnlichem, in Geweben, wie der Leber, ein. In diesem Fall ist das Zielgewebe das abnormale Gewebe, und die Gewebespezifität reflektiert die Beschränkung der Vektorreplikation auf das abnormale Gewebe, das verteilt zwischen dem normalen Gewebe vorkommt. Es wird auch verstanden, dass Gewebespezifität, im Zusammenhang mit Behandlung, insbesondere in vivo relevant ist. Jedoch fallen, wie hier beschrieben, die ex vivo Behandlung und der Gewebeaustausch ebenfalls innerhalb das Konzept der Gewebespezifität gemäß der vorliegenden Erfindung.
Der Begriff "transkriptionale regulatorische Funktion" oder "transkriptionaler regulatorischer Faktor" soll irgendeine zelluläre Funktion, deren Anwesenheit die hier beschriebene heterologe transkriptionale regulatorische Sequenz aktiviert oder deren Abwesenheit die Transkription als ein Ergebnis der hier beschriebenen transkriptionalen regulatorischen Sequenzen erlaubt, bedeuten. Es wird verstanden, dass in einem gegebenen Zielgewebe sich ein Gewebe, das "den transkriptionalen regulatorischen Faktor nicht aufweist" oder hinsichtlich des transkriptionalen regulatorischen Faktors "defizient" ist, auf entweder die Abwesenheit des Faktors oder die funktionale Inaktivierung des Faktors in dem Zielgewebe beziehen könnte.
Der Begriff "transkriptionale regulatorische Sequenz" wird gemäß seiner Bedeutung im Stand der Technik verstanden. Er soll irgendeine DNA Sequenz bedeuten, die, durch ihre Sequenz, bewirkt, dass das verbundene Gen in einer bestimmten Zelle entweder hoch oder herunter reguliert wird. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die native transkriptionale regulatorische Sequenz vollständig aus dem Vektor deletiert und durch eine heterologe transkriptionale regulatorische Sequenz ersetzt. Die transkriptionale regulatorische Sequenz kann benachbart zu der kodierenden Region für das Gen, das für die Replikation essentiell ist, liegen, oder es kann von ihr entfernt sein. Folglich wird im Falle eines Promotors der Promotor für gewöhnlich benachbart zu der kodierenden Region liegen. Im Falle eines Enhancers kann der Enhancer jedoch in einiger Entfernung von der kodierenden Region gefunden werden, so dass es eine zwischenliegende DNA Sequenz zwischen dem Enhancer und der kodierenden Region gibt. In einigen Fällen verbleibt die native transkriptionale regulatorische Sequenz auf dem Vektor, aber sie ist nicht funktional bezüglich der Transkription des Gens, das für die Replikation essentiell ist.
Verschiedene Kombinationen von transkriptionalen regulatorischen Sequenzen können in einen Vektor eingeschlossen werden. Eine oder mehrere können heterolog sein. Weiterhin können eine oder mehrere die Gewebespezifität aufweisen.
Zum Beispiel könnte eine einzige transkriptionale regulatorische Sequenz verwendet werden, um die Replikation von mehr als einem Gen, das für die Replikation essentiell ist, zu steuern. Dies ist zum Beispiel der Fall, wenn das Genprodukt eines der Gene die Transkription eines weiteren Gens/von weiteren Genen steuert. Ein Beispiel ist ein heterologer Promotor, der mit einer Kassette verbunden ist, die eine E1a kodierende Sequenz (E1a Promotor deletiert) und das gesamte E1b Gen enthält. In einer solchen Kaskade kann nur eine heterologe transkriptionale regulatorische Sequenz notwendig sein. Wenn jedoch Gene individuell (getrennt) kontrolliert werden, kann mehr als eine transkriptionale regulatorische Sequenz verwendet werden, wenn mehr als ein solches Gen die Replikation kontrollieren soll.
Die erfindungsgemäßen Vektoren schließen deshalb auch Kombinationen von transkriptionalen regulatorischen Sequenzen ein, in denen mehr als eine heterologe transkriptionale regulatorische Sequenz vorkommt, aber in denen eine oder mehrere davon nicht gewebespezifisch ist/sind. Zum Beispiel kann eine transkriptionale regulatorische Sequenz eine konstitutive transkriptionale regulatorische Sequenz auf Ausgangsniveau sein. Zum Beispiel kann ein gewebespezifischer Enhancer mit einem konstitutiven Promotor auf Ausgangsniveau kombiniert werden.
Vektoren
Die bevorzugten Vektoren der vorliegenden Erfindung sind adenovirale Vektoren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält ein Adenovirus Vektor eine gewebespezifische transkriptionale regulatorische Sequenz, die mit einem Gen in der E1 Region verbunden ist. In einer alternativen Ausführungsform ist nur E1a verbunden; E1b bleibt intakt.
Die Erfindung führt weiterhin die Verwendung von Plasmiden und Vektoren aus, in denen nur die essentiellen Regionen von Adenovirus, die für die Replikation mit entweder E1a, E1b 19 kDa Gen oder E1b 55 kDa Gen oder einige Kombinationen davon, benötigt werden, modifiziert sind. Ein solches Plasmid, das keine Struktur gene aufweist, wäre in der Lage, DNA Replikation zu durchlaufen. Folglich können die erfindungsgemäßen Vektoren im Wesentlichen aus der transkriptionalen regulatorischen Sequenz oder einem oder mehreren Genen, die essentiell für die Replikation des Vektors sind, bestehen. Im Fall von viralen Vektoren können die Vektoren im Wesentlichen aus der transkriptionalen regulatorischen Sequenz und dem Gen oder den Genen, das/die essentiell ist/sind für die Replikation oder für Funktionen des Lebenszyklus des Virus, bestehen. Es wird auch verstanden, dass diese Vektoren weiterhin auch im Wesentlichen aus einer DNA Sequenz bestehen können, die ein oder mehrere toxische heterologe Genprodukte kodiert, wenn es beabsichtigt ist, solche Vektoren als Expressionsvektoren für die Behandlung zu verwenden.
Die alternativen Viren werden vorzugsweise aus irgendeiner Gruppe von Viren ausgewählt, in denen die für die Replikation des Virus essentiellen Gene unter der Kontrolle einer gewebespezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz angeordnet werden können. Alle Serotypen von Adenoviren sind eingeschlossen. Die einzige gemeinsame Eigenschaft solcher Viren ist es deshalb, dass sie in Zielgewebe transduzierbar, genetisch manipulierbar und nichttoxisch, wenn sie nicht replizieren, sind.
Die hier beschriebenen Vektoren können unter Verwendung von Standard molekularbiologischen Techniken hergestellt werden. Standardtechniken für die Herstellung solcher Vektoren sind dem Fachmann gut bekannt, und sie können in Referenzen wie Sambrook et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989) oder in irgendeiner der Vielzahlen von Laborhandbüchern über rekombinante DNA Technologie, die weitreichend zur Verfügung stehen, gefunden werden. Eine Vielzahl von Strategien steht zur Ligation von Fragmenten von DNA zur Verfügung, die Auswahl hängt von der Natur der Enden der DNA Fragmente ab und kann einfach durch den Fachmann bestimmt werden.
Ein Adenovirus Vektor wird in einer bevorzugten Ausführungsform zunächst hergestellt durch das Herstellen eines Shuttle Plasmids nach Standardtechniken, das, beginnend am 5' Ende, die "kritischen linksseitigen Elemente" enthält, die einen adenoviralen 5' ITR, ein adenovirales Verpackungssignal und eine E1a Enhancer Sequenz; einen Promotor (der ein adenoviraler Promotor oder ein fremder Promotor sein kann); eine dreiteilige Leitsequenz, eine multiple Klonierungsstelle (die derart sein kann wie hier beschrieben); ein poly A Signal; und ein DNA Segment, das einem Segment des adenoviralen Genoms entspricht, enthält. Ein solches DNA Segment dient als ein Substrat für die homologe Rekombination mit einem modifizierten oder mutierten Adenovirus. Das Plasmid kann auch einen selektierbaren Marker und einen Replikationsursprung einschließen. Der Replikationsursprung kann ein bakterieller Replikationsursprung sein. Repräsentative Beispiele solcher Shuttle Plasmide schließen pAVS6, wie hier diskutiert, ein und siehe Trapnell, B., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 12: 185–189 (1994). Ein gewünschte DNA Sequenz, die ein heterologes Gen enthält, kann anschließend in die multiple Klonierungsstelle eingeführt werden, um einen Plasmid Vektor herzustellen.
Dieses Konstrukt kann anschließend verwendet werden, um einen adenoviralen Vektor herzustellen. Die homologe Rekombination wird anschließend mit einem modifizierten oder mutierten Adenovirus durchgeführt, indem eine oder mehrere native transkriptionale regulatorische Sequenzen deletiert wurden und gegen die gewünschte transkriptionale regulatorische Sequenz ausgetauscht wurden. Eine solche homologe Rekombination kann durch Kotransfektion des Plasmidvektors und des modifizierten Adenovirus in eine Helferzelllinie durch CaPO₄ Präzipitation durchgeführt werden.
Durch eine solche homologe Rekombination wird ein Vektor gebildet, der adenovirale DNA einschließt, die frei ist von einer oder mehreren der nativen transkriptionalen regulatorischen Sequenzen. Dieser Vektor kann anschließend in eine Helferzelllinie zur viralen Replikation und zur Bildung infektiöser viraler Partikel transfiziert werden. Transfektionen können durch Elektroporation, Calciumphosphat Präzipitation, Mikroinjektion oder durch Proteoliposomen stattfinden.
Der Vektor kann eine multiple Klonierungsstelle einschließen, um den Einbau von DNA Sequenz(en), die das heterologe Gen enthält/enthalten, in den Kloniervektor, zu erleichtern. Im Allgemeinen schließt die multiple Klonierungsstelle "seltene" Restriktionsenzymstellen ein; d.h. Stellen, die in eurkaryonten Genen mit einer Häufigkeit von ungefähr einer in 10.000 bis ungefähr einer in 100.000 Basenpaaren gefunden werden. Ein geeigneter Vektor wird somit durch Schneiden des Kloniervektors durch Standardtechniken an geeigneten Restriktionsstellen in der multiplen Klonierungsstelle und dem anschließenden Ligieren der DNA Sequenz, die das heterologe Gen enthält, in den Kloniervektor, gebildet.
Die DNA Sequenz, die das heterologe Genprodukt enthält, steht unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf adenovirale Promotoren, wie den adenoviralen Major Late Promotor; oder heterologe Promotoren, wie den Cytomegalovirus Promotor; den Rous Sarkom Virus Promotor; induzierbare Promotoren, wie den Maus Mamma Tumorvirus (MMTV) Promotor, den Metallothionein Mamma Promotor; Hitzestock Promotoren; den Albumin Promotor; den ApoE Promotor; und den ApoAl Promotor. Es wird jedoch verstanden, dass der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht auf spezifische Fremdgene oder Promotoren beschränkt ist.
In einer Ausführungsform kann das Adenovirus durch Verwendung eines künstlichen Hefechromosoms, welches das adenovirale Genom enthält, gemäß dem Verfahren, das in Ketner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:6186–6190 (1994) in Übereinstimmung mit den hier enthaltenen Lehren, hergestellt werden. In dieser Ausführungsform wird das Adenovirus künstliche Hefechromosom durch homologe Rekombination in vivo zwischen adenoviraler DNA und künstlichen Hefechromosom Plasmid Vektoren, die Segmente der adenoviralen linken und rechten genomischen Enden tragen, hergestellt. Eine DNA Sequenz, die das heterologe Gen enthält, kann anschließend in die adenovirale DNA kloniert werden. Das modifizierte adenovirale Genom kann anschließend aus dem Adenovirus künstlichen Hefechromosom ausgeschnitten werden, um zur Herstellung infektiöser adenoviraler Partikel verwendet zu werden.
Die infektiösen viralen Partikel können anschließend in vivo an einen Wirt verabreicht werden. Der Wirt kann ein tierischer Wirt, einschließlich Säugetier, nicht menschlichen Primaten und menschlichen Wirten sein.
Die viralen Partikel können in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden, der zur Verabreichung an einen Patienten geeignet ist. Der Träger kann ein flüssiger Träger (zum Beispiel eine Salzlösung) oder ein fester Träger, wie zum Beispiel Mikroträger Kügelchen, sein.
Behandlung
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Verfahren insbesondere auf die Einführung eines replikationsabhängigen adenoviralen Vektors in ein Zielgewebe gerichtet. Dieser Vektor repliziert selektiv in den Zellen des Zielgewebes. Die Replikation hängt von der Funktion einer transkriptionalen regulatorischen Sequenz ab, mit der das virale Gen funktional verknüpft ist, wobei dieses Gen für die Vektor Replikation notwendig ist. Somit kann in dem Zielgewebe die Replikation stattfinden, weil entweder eine zelluläre Funktion in der Zielzelle die Transkription erlaubt. Alternativ dazu gibt es eine Defizienz in einer zellulären Funktion in dem Zielgewebe, die normalerweise die Transkription verhindert oder inhibiert. Die Anwesenheit oder Abwesenheit solcher Funktionen stellt die Selektivität bereit, welche die Behandlung eines spezifischen Gewebes mit einem minimalen Effekt auf das umliegende Gewebe/die umliegenden Gewebe erlaubt.
Die vorliegende Erfindung stellt somit Verfahren zur selektiven Verteilung eines Polynukleotids in einem gegebenen Gewebe in vivo bereit, die signifikant die Verteilung in Nichtzielgewebe reduzieren oder verhindern. Das Polynukleotid wird in einem replikationsabhängigen Vektor bereitgestellt, der selektiv in einem gegebenen Gewebe verteilt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum selektiven Exprimieren eines Genprodukts in einem gegebenen Gewebe bereit, welche die Expression in Nichtziel- oder Nichttumorgewebe verhindern oder signifikant reduzieren. Die Erfindung stellt Verfahren zur Verteilung der oben genannten in einer größeren Anzahl von Zielzellen, als jene die unter Verwendung eines nicht replizierenden Vektors erreicht würden, bereit. Die anschließende Infektion stellt einen "Dominoeffekt" bereit, so dass alle oder im Wesentlichen alle der Zellen des Zielgewebes erreicht werden. So werden Zellen zusätzlich zu jenen, die zunächst gegenüber dem Polynukleotid, Vektor oder Genprodukt ausgesetzt waren, möglicherweise durch diese Verfahren erreicht.
Eine solche Behandlung ist insbesondere notwendig in den Fällen, in denen ein chirurgischer Eingriff nicht machbar ist. Zum Beispiel kann in Patienten, in denen abnormales Gewebe unmittelbar mit neuronalem Gewebe assoziiert ist, eine Operation ausgeschlossen oder sehr gefährlich sein. Darüber hinaus ist im Fall von multiplen Metastasen oder mikroskopischen Metastasen eine Operation nicht machbar.
In dem Zielgewebe kann die DNA Replikation alleine stattfinden. Auch die späten viralen Funktionen, die zur Verpackung von Vektor DNA in Virionen führen, können stattfinden.
Der Vektor kann in das Zielgewebe als nackte DNA oder mittels Verkapselung (als ein infektiöses Viruspartikel oder Virion) eingeführt werden. Im zuletzt genannten Fall wird die Verteilung durch anschließende Infektion von Zellen im Gewebe durch das Virus erreicht, so dass im Wesentlichen alle oder eine signifikante Anzahl der Tochterzellen infiziert werden.
Gewebespezifität ist insbesondere relevant bezüglich des Targetings eines abnormalen Gegenstücks eines bestimmten Gewebetyps, während das normale Gegenstück des Gewebes vermieden werden soll, oder das Vermeiden des umge benden Gewebes einer anderen Art als das abnormale Gewebe, während das abnormale Gewebe behandelt wird. Zum Beispiel sind die erfindungsgemäßen Vektoren zur Behandlung von Metastasen der Leber nützlich. Ein spezifisches Beispiel ist Darmkrebs, der häufig in die Leber metastasiert. Es wurde gefunden, dass selbst wenn Darmkrebs in die Leber metastasiert, der CEA Promotor in den Zellen der Metastasen, aber nicht in normalen Leberzellen aktiv ist. Folglich sollte normale menschliche Leber eines Erwachsenen die Replikation eines Virus nicht unterstützen, das vitale Gene, die für die Replikation essentiell sind, verbunden mit dem Darmkrebs CEA spezifischen Promotor aufweist. Die Replikation sollte in den primären Krebszellen stattfinden. Ein anderes Beispiel ist Brustkrebs, der auch in die Leber metastasiert. In diesem Fall ist der DF3 Mucin Enhancer mit einem Gen verbunden, das essentiell für die Replikation ist, wie E1a. Die Replikation sollte im Brustkrebs aber nicht in der normalen Leber stattfinden. Ein weiteres Beispiel ist der α-Fetoprotein Promotor, der in hepatozellulärem Karzinom aktiv ist. Dieser Promotor ist mit einem Gen verbunden, das essentiell für die Replikation ist. Es wurde gefunden, dass der Promotor nur im hepatozellulären Karzinom aktiv ist. Folglich wird ein Virus verwendet, das ein für die Replikation essentielles Gen verbunden mit diesem Promotor aufweist. Die Replikation sollte auf das hepatozelluläre Karzinom beschränkt sein. Ein weiteres Beispiel ist der Tyrosinase Promotor. Dieser Promotor ist mit einem für die Replikation essentiellen Gen verbunden. Die Replikation sollte im Melanom und nicht in der normalen Haut stattfinden. In jedem der Fälle wird erwartet, dass die Replikation in den abnormalen aber nicht in den normalen Zellen stattfindet.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kodiert der Vektor ein heterologes Genprodukt, das von dem Vektor in Gewebezellen exprimiert wird. Das heterologe Genprodukt kann für die Zellen in dem Zielgewebe toxisch sein oder eine andere gewünschte Eigenschaft verleihen.
Ein Genprodukt, das durch den Vektor hergestellt wird, kann in dem Gewebe verteilt werden, weil der Vektor selbst in dem Gewebe verteilt ist. Alternativ dazu, obwohl die Expression des Genprodukts lokalisiert sein kann, kann ihr Effekt auf grund von unbeteiligten Effekten oder der Herstellung von Molekülen, die lang anhaltende Effekte, wie Chemokine, haben, weitreichender sein. Das Genprodukt kann RNA, wie Antisense RNA oder Ribozym oder Protein sein. Beispiele von toxischen Produkten schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Thymidin Kinase in Verbindung mit Ganciclovir.
Ein weiter Bereich von toxischen Effekten ist möglich. Toxische Effekte können direkt oder indirekt sein. Indirekte Effekte können aus der Umwandlung eines Vorläufer Arzneimittels in ein direkt toxisches Arzneimittel resultieren. Zum Beispiel phosphoryliert die Herpes simplex Virus Thymidin Kinase Ganciclovir, um das Nukleotidtoxin Ganciclovirphosphat herzustellen. Diese Verbindung wirkt als ein Kettenterminator und DNA Polymerase Inhibitor, verhindert die DNA Synthese, und ist somit zytotoxisch. Ein anderes Beispiel ist die Verwendung von Cytosindesaminase, um 5'-Fluorcytosin in das Antikrebs Arzneimittel 5'-Fluoruracil umzuwandeln. Zur Diskussion solcher "Suizid" Gene, siehe Blaese, R.M., et al., Eur. J. Cancer 30A: 1190–1193 (1994).
Direkte Toxine schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Diphtherietoxin (Brietman et al., Mol. Cell Biol. 10:474–479 (1990)), Pseudomonastoxin, Cytokine (Blankenstein, T., et al., J. Exp. Med. 173.1047–1052 (1991); Colombo, M.P., et al., J. Exp. Med. 173:889–897 (1991), Leone, A., et al., Cell 65:25–35 (1991)), Antisense RNAs und Ribozyme (Zaia, J.A. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:95–106 (1992)), Tumorvakzinierungsgene und DNA, die für Ribozyme kodiert.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann das Mittel, das befähigt ist, die Inhibition, Verhinderung oder Zerstörung des Wachstums des Zielgewebes oder der Tumorzellen nach der Expression eines solchen Mittels bereitzustellen, ein negativer Selektionsmarker, d.h. ein Material, das in Kombination mit einem chemotherapeutischen oder Interaktionsmittel das Wachstum der Zielzellen inhibiert, verhindert oder zerstört, sein.
Somit wird nach der Einführung des negativen Selektionsmarkers in die Zellen ein Interaktionsmittel an den Wirt verabreicht. Das Interaktionsmittel interagiert mit dem negativen Selektionsmarker, um das Wachstum der Zielzellen zu verhindern, zu inhibieren oder zu zerstören.
Die negativen Selektionsmarker, die verwendet werden können, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Thymidin Kinase und Cytosindesaminase. In einer Ausführungsform ist der negative Selektionsmarker eine virale Thymidin Kinase, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der Herpes simplex Virus Thymidin Kinase, Cytomegalovirus Thymidin Kinase und Varicellazoster Virus Thymidin Kinase besteht. Wenn virale Thymindin Kinasen verwendet werden, ist die Interaktion oder das chemotherapeutische Mittel vorzugsweise ein Nukleosidanalogon, zum Beispiel, eines, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ganciclovir, Acyclovir und 1-2-Desoxy-2-fluor-β-D-arabinofuranosil-5-ioduracil (FIAU) besteht. Solche Interaktionsmittel werden effizient von den viralen Thymidin Kinasen als Substrate verwendet, und solche Interaktionsmittel werden somit letal in die DNA der Tumorzellen eingebaut, welche die viralen Thymidin Kinasen exprimieren, was zu dem Tod der Zielzellen führt.
Wenn Cytosindesaminase der negative Selektionsmarker ist, ist ein bevorzugtes Interaktionsmittel 5-Fluorcytosin. Cytosindesaminase wandelt 5-Fluorcytosin in 5-Fluoruracil, das sehr zytotoxisch ist, um. Somit wandeln die Zielzellen, die das Cytosindesaminase Gen exprimieren, das 5-Fluorcytosin in 5-Fluoruracil um und werden getötet.
Das Interaktionsmittel wird in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um das Wachstum der Zielzellen zu inhibieren, zu verhindern oder zu zerstören. Zum Beispiel wird das Interaktionsmittel in einer Menge verabreicht, die auf dem Körpergewicht und der Gesamttoxizität gegenüber einem Patienten beruht. Das Interaktionsmittel wird vorzugsweise systemisch verabreicht, wie zum Beispiel durch intravenöse Verabreichung, durch parenterale Verabreichung, durch intraperitoneale Verabreichung oder durch intramuskuläre Verabreichung.
Wenn die erfindungsgemäßen Vektoren einen negativen Selektionsmarker induzieren und an ein Gewebe oder einen Tumor in vivo verabreicht werden, kann ein "unbeteiligter Effekt" entstehen, d.h. Zellen, die zunächst nicht mit der Nukleinsäure Sequenz transduziert wurden, die den negativen Selektionsmarker kodiert, können nach Verabreichung des Interaktionsmittels abgetötet werden. Obwohl es nicht beabsichtigt ist, den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung durch irgendeine theoretische Begründung zu beschränken, könnten die transduzierten Zellen eine diffundierbare Form des negativen Selektionsmarkers bilden, der entweder extrazellulär auf das Interaktionsmittel wirkt oder durch benachbarte, Nichtzielzellen aufgenommen wird, die anschließend für die Wirkung des Interaktionsmittels empfänglich werden. Es ist auch möglich, dass der negative Selektionsmarker und das Interaktionsmittel, entweder eines davon oder beide, zwischen den Zielzellen vermitteln.
In einer Ausführungsform ist das Mittel, welches die Inhibition, die Verhinderung oder die Zerstörung des Wachstums der Tumorzellen bereitstellt, ein Cytokin. In einer Ausführungsform ist das Cytokin ein Interleukin. Andere Cytokine, die verwendet werden können, schließen Interferone und Kolonie stimulierende Faktoren, wie GM-CSF, ein. Interleukine schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, Interleukin-1, Interleukin-1β und Interleukine-2-15. In einer Ausführungsform ist das Interleukin Interleukin-2.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform proliferiert das Zielgewebe abnormal, und es ist vorzugsweise Tumorgewebe. Der Vektor oder das Virus wird in dem Gewebe oder der Tumormasse verteilt.
Alle Tumore sind potenziell der Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verfahren zugänglich. Tumorarten schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf hämatopoetische, pankreatische, neurologische, hepatische, Magendarmtrakt, endokrine, Gallentrakt, sinopulmonare, Kopf und Hals, Weichgewebesarkom und Karzinom, dermatologisch, Reproduktionstrakt und ähnliche. Bevorzugte Tumoren zur Be handlung sind jene mit einem hohen mitotischen Index im Vergleich zu normalem Gewebe. Bevorzugte Tumoren sind feste Tumore, und insbesondere Tumore des Gehirns, am meisten bevorzugt Gliome.
Die Verfahren können auch für das Targeting von anderen abnormalen Zellen, zum Beispiel irgendwelcher Zellen, die gefährlich oder auf andere Weise ungewünscht in vivo sind, verwendet werden. Breite Beispiele schließen Zellen ein, die Autoimmunerkrankung, Restenose und Narbengewebebildung verursachen.
Weiterhin kann die Behandlung ex vivo sein. Die ex vivo Transduktion von Tumorzellen würde viele der Probleme mit gegenwärtigen viralen Transportsystemen überwinden. Das Gewebe wird unter sterilen Bedingungen geerntet, mechanisch und/oder enzymatisch getrennt und unter sterilen Bedingungen in geeigneten Medien angezogen. Vektor Präparationen, von denen gezeigt wurde, dass sie frei von Endotoxinen und bakterieller Kontamination sind, werden verwendet, um Zellen unter sterilen Bedingungen in vitro unter Verwendung von Standardprotokollen zu transduzieren. Der Eintritt von Virus in Zellen in Kultur ist gegenwärtig der in vivo Injektion überlegen und ertaubt die Einführung von Vektor viralen Sequenzen in im Wesentlichen alle Zellen. Nach dem Entfernen von Virus enthaltendem Medium werden die Zellen sofort in den Patienten zurückgeführt oder für einige Tage in Kultur gehalten, während Tests hinsichtlich Funktion oder Sterilität durchgeführt werden.
Zum Beispiel wurden Patienten mit Hypercholesterolämie erfolgreich behandelt durch das Entfernen von Leberteilen, dem Explantieren der Hepatozyten in Kultur, deren genetische Modifikation durch Aussetzen gegenüber einem Retrovirus und dem Reinfundieren der korrigierten Zellen in die Leber (Grossmann et al., 1994).
Die virale Transduktion findet auch mögliche Anwendungen im Bereich der experimentellen Medizin. Die transiente Expression von biologischen Modifizierern von Immunsystemfunktion, wie IL-2, IFN-γ, GM-CSF oder dem B7 kostimulatorischen Protein wurde als ein mögliches Mittel zur Induktion von Antitumor Antworten in Krebspatienten vorgeschlagen.
Diagnostik
Es ist wichtig zu wissen, ob die erfindungsgemäßen Vektoren in einem spezifischen Gewebe eines Patienten replizieren. Wenn gefunden wird, dass die Vektorreplikation vorteilhaft für die Therapie ist, wird ein Screen für jene Patienten bereitgestellt, die am besten auf die hier offenbarte Therapie ansprechen. Wenn gefunden wird, dass sie schädlich ist, gibt es einen Screen zur Verhinderung der Behandlung von Patienten, die eine gegenteilige Antwort auf die Behandlung hervorrufen würden. Gegenwärtig sind die einzigen nicht biologischen Assays, die allgemein verwendet werden, das Expressionsscreening, PCR und Sequenzierung. Diese führen oft zu falsch negativen Ergebnissen, sind zeitaufwändig, teuer und liefern in den besten Fällen nur Information über den Status der Gene und nicht über ihre biologische Funktion.
Folglich wird ein Verfahren zum Identifizieren eines abnormalen Gewebes bereitgestellt, dessen Zellen einen Transkriptionsfaktor enthalten, der die Replikation eines replikationsabhängigen Vektors erlaubt, oder die in einem inhibitorischen Faktor der Transkription defizient sind.
In diesem Verfahren wird eine Gewebebiopsie explantiert, ein replikationsabhängiger Vektor wird in die Zellen der Biopsie eingeführt, und die Vektor DNA Replikation in den Zellen wird quantifiziert. Folglich wird ein Verfahren zum Screenen von Gewebe hinsichtlich der Anwesenheit von Faktoren, welche die Vektor Replikation erlauben oder hinsichtlich einer Defizienz in einem Faktor, der die Transkription inhibiert, bereitgestellt. Ein solches Screen ist unter anderem nützlich zum Identifizieren von Gewebe vor der Behandlung, das der Behandlung mit einem bestimmten Vektor, der in dem Gewebe repliziert werden soll, zugänglich ist.
Deshalb wird ein Verfahren zum Testen der Nützlichkeit eines Vektors zur Behandlung durch Entfernen einer Gewebebiopsie aus einem Patienten, Explantieren der Biopsie in Gewebekultur, Einführen des replikationsabhängigen Vektors in die Biopsie und Testen der Vektor Replikation in den Zellen der Biopsie bereitgestellt.
Das Testen oder Screenen von Geweben schließt einen Test hinsichtlich Vektor Nukleinsäure Replikation oder hinsichtlich Virus Replikation ein, wenn der Vektor befähigt ist, infektiöse Virionen zu bilden.
Somit stellt die Erfindung ein Verfahren um Screenen eines Tumors hinsichtlich transkriptionaler Funktionen, die Vektor Replikation erlauben oder hinsichtlich der Abwesenheit dieser Funktionen, die normalerweise die Replikation eines Virus Vektors verhindern, bereit.
Jedoch kann jedes abnormale Gewebe hinsichtlich der oben beschriebenen Funktionen durch einen Test für Nukleinsäure oder Virus Replikation gescreent werden.
Herstellungszellen
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Zelle bereitgestellt, die ein Virion enthält, das in der Zelle durch Replikation von erfindungsgemäßen replikationsabhängigen Vektoren in der Zelle hergestellt wurde. Somit stellt die Erfindung "Herstellungszellen" für die effiziente und sichere Herstellung von rekombinanten replikationsabhängigen Vektoren zur weiteren Verwendung für gezielte Gentherapie in vivo bereit.
Eines der Hauptprobleme der gegenwärtig zur Verfügung stehenden Herstellungszellen ist es, dass solche Zellen im Genom virale Sequenzen enthalten, die komplementierende Funktionen für den replizierenden Vektor bereitstellen. Weil die Zelle solche Sequenzen enthält, kann homologe Rekombination zwischen der viralen Sequenz im Genom und den viralen Vektorsequenzen stattfinden. Eine solche Rekombination kann rekombinante Wildtyp Viren regenerieren, welche die Vektor- oder Viruspräparation, die in der Herstellungszelle hergestellt wird, kontaminieren. Eine solche Kontamination ist ungewünscht, weil die Wildtyp Viren oder Vektoren anschließend in Nichtzielgewebe replizieren können und dadurch Nichtzielzellen beeinträchtigen oder abtöten können. Deshalb ist einer der primären Vorteile der erfindungsgemäßen Herstellungszellen, dass sie keine endogenen viralen Sequenzen enthalten, die homolog sind zu Sequenzen, die im Vektor gefunden werden, der in den Zellen repliziert werden soll. Die Abwesenheit solcher Sequenzen verhindert die homologe Rekombination und die Herstellung von Wildtyp viralen Rekombinanten, die Nichtzielgewebe beeinflussen können.
Folglich führt die Erfindung Verfahren zur Konstruktion und Herstellung replikationsabhängiger Virionen in einer Zelle aus, umfassend das Einführen des erfindungsgemäßen replikationsabhängigen Vektors in die Zelle, wobei das Genom der Zelle keine Vektorsequenzen aufweist, das Replizieren des Vektors in der Zelle, das Bilden des Virions, und das Reinigen des Virions aus der Zelle. Bevorzugte Vektoren sind DNA virale Vektoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Herpes Virus, Papillom Virus, Hepatitis Virus und Papova Virus Vektoren. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Virion ein adenovirales Virion, und der Vektor ist ein adenoviraler Vektor. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist die Zelle eine Tumorzelle.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kodiert der Vektor ein heterologes Genprodukt, so dass das Virion auch das Genprodukt kodiert, und wenn der Vektor oder das Virion für die Gentherapie verwendet werden, wird die Therapie durch die Expression des heterologen Genprodukts ermöglicht. Alternativ dazu kann die Herstellungszelle für die Herstellung eines heterologen Genprodukts, das per se von dem Vektor kodiert wird, verwendet werden. Wenn der Vektor in der Herstellungszelle repliziert, wird das Genprodukt von den multiplen Kopien des Gens, welches das Genprodukt kodiert, exprimiert. Nach der Expression kann das Genprodukt aus den Herstellungszellen durch herkömmliche Lyseverfahren gereinigt oder aus der Herstellungszelle durch geeignete Sekretionssignale, die mit dem heterologen Gen durch bekannte Verfahren verbunden sind, sekretiert werden. Die Transduktion von Zellen durch adenovirale Vektoren wurde beschrieben. Die Transfektion von Plasmid DNA in Zellen durch Calciumphosphat (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166:577 (1983)), Lipofektion (Feigner, et al., PNAS 84: 7413 (1987)) oder Elektroporation (Seed, B., Nature 329: 840 ()) wurde beschrieben. DNA, RNA und Virus Reinigungsverfahren wurden beschrieben (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59–72 (1977).
Bevorzugte Wirte für Herstellungszelllinien schließen ein, aber sind nicht beschräkt auf HuH7, SW480, BIGF10, HepG2, MCF-7 und SK-MEL2. Primäre Tumore, von denen Zelllinien abgeleitet sein können, oder bestehende Zelllinien, können hinsichtlich der Fähigkeit, die Replikation durch die gewebespezifische transkriptionale regulatorische Sequenz zu erlauben, untersucht werden. Irgendein Primärtumor könnte explantiert und zu Herstellungszellen für die erfindungsgemäßen Vektoren entwickelt werden. Solange die Zelle nicht endogene Vektor oder virale Sequenzen enthält, die mit dem Vektor oder dem Virus rekombinieren könnten, um Wildtyp Vektor oder Virus zu bilden, ist die Zelle potenziell als ein Wirt geeignet. Es wird verstanden, dass irgendeine Zelle, und nicht nur Tumorzellen, potenziell nützlich ist.
Das ultimative Ziel für eine Herstellungszelllinie, und insbesondere für eine adenovirale Herstellungslinie, ist es, die größtmögliche Ausbeute an Vektor mit der geringsten Möglichkeit an Kontamination durch Wildtyp Vektor zu bilden. Die Ausbeute hängt von der Zahl der infizierten Zellen ab. Je mehr Zellen somit angezogen und infiziert werden können, desto mehr Virus wird möglicherweise gebildet. Folglich haben Kandidatenzellen eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit und wachsen in einer hohen Dichte. Die Zelle sollte auch eine große Menge an viralem Rezeptor aufweisen, so dass das Virus leicht die Zelle infizieren kann. Eine andere Eigenschaft ist die Qualität des gebildeten Vektors (d.h. die Präparation sollte nicht hohe Mengen an nicht infektiösen viralen Partikeln enthalten). Folglich sollten Kandidaten Herstellungszellen ein niedriges Verhältnis von Partikel zu Plaque bildender Einheit aufweisen. Somit sind diese Zellen ein bevorzugter Zelltyp für das Herstellen einer Herstellungszelllinie. Primäre Explantate und die bekannten Zelllinien können verwendet werden.
Somit können derart erhältliche Zellen als Herstellungszellen für rekombinante replikationsabhänige Vektoren, Viren und Genprodukte dienen.
Einführung von Vektoren in Zellen
Eine Vielzahl von Wegen wurde entwickelt, um Vektoren in Zellen in Kultur und in Zellen und Gewebe in einem tierischen oder einem menschlichen Patienten einzuführen. Verfahren zum Einführen von Vektoren in Säugetier oder andere tierische Zellen schließen Calciumphosphat Transfektion, die DEAE-Dextrantechnik, Mikroinjektion, Liposomen vermittelte Techniken, kationische Lipid basierte Techniken, Transfektion unter Verwendung von Polybren, Protoplasten Fusionstechniken, Elektroporation und andere ein. Diese Techniken sind dem Fachmann gut bekannt, sind in vielen einfach zur Verfügung stehenden Veröffentlichungen beschrieben und wurden weitreichend in Übersichtsartikeln zusammengefasst. Einige der Techniken sind in Transcription and Translation, A Practical Approach, Hames, B.D. und Higgins, S.J., Hrsg., IRL Press, Oxford (1984), hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen, und Molecular Cloning, Zweite Auflage, Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen, zur Übersicht zusammengefasst.
Einige dieser Techniken wurden verwendet, um Vektoren in Gewebe und Zellen in tierischen und menschlichen Patienten einzuführen. Am meisten wurden die systemische Verabreichung und die direkte Injektion in Stellen in situ verwendet. In Abhängigkeit vom Verabreichungsweg und dem Vektor wurden die Techniken verwendet, um nackte DNA, DNA komplexiert mit kationischem Lipid, viralen Vektoren und Vektor Herstellungszelllinien in normale und abnormale Zellen und Gewebe, im Allgemeinen durch direkte Injektion in eine Zielstelle, einzuführen.
Die zuvor genannten Techniken zum Einführen von Polynukleotiden, viralen und anderen Vektoren in Zellen in Kultur, in Tiere und in Patienten können verwendet werden, um Vektoren in Übereinstimmung mit der Erfindung zu entwickeln, zu testen und herzustellen, ebenso wie zu verwenden. Zum Beispiel können Zellen, die einen Vektor, der durch diese Verfahren eingeführt wurde, enthalten, zur Herstellung des Vektors verwendet werden. Zusätzlich können Zellen, die einen Vektor enthalten, als Herstellungszellen und eingeführt in Zellen oder Gewebe eines Tieres, um den Vektor in situ herzustellen, verwendet werden.
Assay von DNA und viraler Replikation
Die Replikation eines Polynukleotids, eines viralen oder anderen Vektors kann durch gut bekannte Techniken untersucht werden. Assays zur Replikation eines Vektors in einer Zelle schließen im Allgemeinen das Nachweisen eines Polynukleotids oder eines infektiösen Virus ein. Eine Vielzahl von gut bekannten Verfahren, die für diesen Zweck verwendet werden können, schließen das Bestimmen der Menge eines markierten Substrats, das in ein Polynukleotid während eines gegebenen Zeitraums in einer Zelle eingebaut wird, ein.
Wenn die Replikation ein DNA Polynukleotid einschließt, wird ³H-Thymidin häufig als das markierte Substrat verwendet. In diesem Fall wird die Menge der Replikation bestimmt durch das Trennen der DNA des Vektors von der Masse der zellulären DNA und dem Messen der Menge von Tritium, das spezifisch in die Vektor DNA eingebaut wurde.
Die Replikation eines Polynukleotid Vektors kann auch nachgewiesen werden durch das Lysieren oder das Veranlassen von Zellen, das Polynukleotid freizusetzen, das anschließende Isolieren des Polynukleotids und das direkte Quantifizieren der DNA oder RNA, die gewonnen wurde. Polynukleotid Replikation kann auch durch quantitative PCR unter Verwendung von Primern, die spezifisch für das untersuchte Polynukleotid sind, nachgewiesen werden.
Irgendeine dieser gut bekannten Techniken kann unter anderem verwendet werden, um die Replikation eines Vektors in einer Zelle oder einem Gewebe in Übereinstimmung mit der Erfindung zu untersuchen. Es wird verstanden, dass verschiedene Techniken für manche Vektoren und für manche Zellen oder Gewebe besser geeignet sind als für andere.
Nachdem die Erfindung hier in allgemeinen Begriffen beschrieben wurde, werden die folgenden Beispiele angegeben, um die Erfindung darzustellen. Die Beispiele 1–4 zeigen den Austausch des konstitutiven E1a Promotors auf einem adenoviralen Vektor gegen einen tumorspezifischen Promotor. Die Konstrukte, die auf diese Weise hergestellt wurden, exprimieren das E1a Protein nur in Tumorzellen und werden deshalb nur in Tumorzellen replizieren.
Beispiel 1
Der Hepatom spezifische Promotor, α-Fetoprotein Promotor, verbunden mit E1a
Von dem α-Fetoprotein Promotor wurde kürzlich gezeigt, dass er in Hepatomzellen sehr aktiv und in adulten Hepatozyten und anderen adulten Geweben in Ruhe ist. Ein 4,9 kb α-Fetoprotein Promotor enthaltendes Konstrukt wurde verwendet, um den Promotor zu erhalten. Alternativ dazu könnte der Promotor basierend auf den zur Verfügung stehenden Referenzen hergestellt werden.
Das Adenovirus Shuttle Plasmid pAVS21.TK1 (1), welches das TK Gen unter der Kontrolle des 4,9 kb α-Fetoprotein Promotors aufweist, wurde exakt wie in den 11 und 12 der US Patentanmeldung von Chiang et al., für "Gene Therapy of Hepatocellular Carcinoma Through Cancer-Specific Gene Expression", eingereicht am 18. Mai 1995, das hier durch Bezugnahme hinsichtlich seiner relevanten Lehre eingeschlossen ist, hergestellt, pAVE1a02i (1), das die E1a/E1b Gene unter die Kontrolle des α-Fetoprotein Promotors in einem Adenovirus Shuttle Plasmid anordnet, wurde durch Reinigen des Restriktionsfragments, das nur die E1a kodierende Region und das gesamte E1b Gen durch Spalten des Plasmids pSE280-E1 (1) mit SpeI und MunI und sein Ligieren in pAVS21.TK1, gespalten mit MunI und NheI, enthielt, kloniert. Das Plasmid SE280-E1, das den E1A ORF und das gesamte E1b enthält, wurde wie in der US Patentanmeldung Nr. 08/458,403 an Kadan et al. für "Improved Adenoviral Vectors and Producer Cells", eingereicht am 2. Juni 1995, das hier durch Bezugnahme hinsichtlich seiner relevanten Lehre eingeschlossen ist, beschrieben, hergestellt. pAVE1a02i wird mit dem großen ClaI Fragment von AddI327 durch Standardverfahren in 293 Zellen kotransfiziert, um rekombinantes Virus zu bilden.
Konstruktion eines Virus mit dem Hepatom spezifischen AFP Promotor, der funktional mit dem E1a Gen verbunden ist
Das Adenovirus AVE1a04i wurde durch homologe Rekombination des Shuttle Plasmids, pAVE1a04i (siehe 2) mit dem großen (ClaI) Fragment der AV1lacZ4 DNA in 293 Zellen hergestellt. Die Herstellung des Plasmids pAVE1a02i ist oben beschrieben. Die Herstellung von pAVE1a04i ist nahezu identisch zu jener von pAVE1a02i. pAVE1a02i enthält den gesamten AFP Promotor. pAVE1a04i verwendet ein Derivat dieses Promotors, der sechs Silencer Elemente und eine duplizierte Enhancer Region aufweist.
Das Plasmid pAF(AB)₂(S_d)₆-CAT wurde hergestellt indem sechs Kopien des distalen Silencers unmittelbar oberhalb des basalen 200 Basenpaar AFP Promotors angeordnet wurden. Zwei Kopien der Enhancer AB Region, in gegenläufiger Orientierung, wurden unmittelbar oberhalb der Silencer Elemente angeordnet. Dieser Promotor, der sich von dem Enhancer Element über den basalen AFP Promotor erstreckte, wurde verwendet, um das AV/AFP kurze E1a Virus mit dem hier beschriebenen Shuttle Plasmid herzustellen. Das distale Silencer Element, der basale Promotor und die Enhancer Elemente sind in Nakabayashi et al. (Molec. & Cell. Biol. 11:5885–5893 (1991)) beschrieben.
Das Plasmid pAVE1a04i wurde in STBL2 Zellen angezogen und wurde durch Standard Cäsiumbanden Verfahren vor der Verwendung in der Transfektion gereinigt. Genomische AV1lacZ4 DNA wurde aus Cäsiumgradienten gereinigtem Virus (hier beschrieben) isoliert. Das AV1lacZ4 gereinigte Virus wurde durch mit Proteinase K gespalten, und die DNA wurde durch Phenol/Chloroform Extraktion isoliert. Die gereinigte DNA wurde mit ClaI gespalten, und das große Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert und quantifiziert. 5 μg des Plasmids pA-VE1a04i und 2,5 μg des großen ClaI Fragments von AV1lacZ4 wurden in 293 Zellen unter Verwendung eines Calciumphosphat vermittelten Transfektionsverfahrens (Promega, E1200 Kit) kotransfiziert. Die Transfektionsplatte wurde mit einer 1 % Agaroseschicht überschichtet und inkubiert bis sich Plaques bildeten. Sobald sich die Plaques gebildet hatten, wurden sie gepickt, und das Virus wurde in 500 μl IMEM Medium durch alternierende Zyklen von Gefrieren und Auftauen (5 x) freigesetzt. Die eluierten vitalen Plaques wurden auf A30 Zellen für 48 Stunden reamplifiziert, und anschließend wurden die Zellen zur Verwendung im Screenen durch PCR lysiert.
Spezifische Primer für den kurzen AFP (sAFP) Promotor in dem Plasmid pA-VE1a04i wurden verwendet, um die putativen Plaques zu identifizieren. Die 2A zeigt, dass die vitalen Plaques eine sAFP spezifische Bande mit dem vorhergesagten Molekulargewicht und die spezifisch ist für die sAFP Primer, enthält. Um zu bestätigen, dass dieses rekombinant Virus nicht mit Ad5dl327 (Wildtyp) kontaminiert war, wurden E1a Primer verwendet. Die 2B zeigt, dass kein Wildtyp Virus anwesend war und dass pAVE1a04i Plasmidsequenzen in dem rekombinanten Virus anwesend waren. Die 2C zeigt, dass wenig oder gar kein AV1lacZ4 anwesend war. Die Daten zeigen die Herstellung eines Virus mit E1a unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors und dass das Virus zur Replikation in A30 Zellen befähigt ist.
Einzelne Plaques wurden in A30 Zellen angezogen und durch PCR hinsichtlich der Anwesenheit des AFP Promotors (2) analysiert. Der Pfeil zeigt die AFP spezifische Bande, die durch die PCR gebildet wird. Die Figur zeigt, dass die Ban de in jedem der Viren in den ausgewählten Plaques (L6, L10, L11, M1 und M2) anwesend ist. Die Kontrolle in dem Experiment war ein A30 Zelllysat, von dem erwartet wurde, dass es keine Bande enthält. Das Experiment schloss auch die PCR Reaktion mit dem Plasmid pAVE1a04i (das Shuttle Plasmid aus dem das Virus hergestellt wurde und das deshalb das AFP spezifische Fragment bilden sollte) ein. So bestätigt 2A die Anwesenheit eines rekombinanten Virus, das den AFP Promotor enthält. Die 2B und 2C bestätigen, dass diese Ergebnisse nicht das Ergebnis von Kontamination in den einzelnen Plaques war. Die 2B verwendet E1a spezifische Primer, um die Anwesenheit irgendeines kontaminierenden Wildtyp Virus nachzuweisen. Der Pfeil zeigt die Bande, die mit E1a spezifischen Primern gebildet wurde. Die Figur zeigt, dass keines der rekombinanten Viren die relevante Bande bildete. Die 2C bestätigt, dass es keine AV1.lacZ Kontamination in den viralen Plaques gibt (weil die Viren unter Verwendung von AV1.lacZ DNA hergestellt wurden). Die Figur zeigt, dass nur die Spur, die AV1.lacZ DNA enthält, die Bande bildet.
Gewebespezifische virale Replikation
Zytopathisches virales Lysat dieses Virus ("AVAFPE1a") wurde in Reihen in Logstufen von 10 auf A549.30 Zellen, A549 Zellen und HuH7 Zellen verdünnt. Die A549.30 Zellen exprimieren das E1a von dem Glucocorticoid Rezeptor (GRE) Promotor in der Anwesenheit von Dexamethason, weil dieses Konstrukt in das Genom dieser Zelllinie integriert ist. Somit sollte irgendein E1a deletiertes Virus oder irgendein Virus, das kein E1a exprimiert, in der Lage sein, in dieser Zelllinie zu replizieren. Dies wurde kürzlich für E1 deletierte Vektoren (nicht veröffentlichte Mitteilung) gezeigt. Wie auf den 3A und 3D gesehen werden kann, repliziert der AVAFPE1a Vektor in den infizierten Zellen, wie durch charakteristische zytopathogene Effekte und das Ausbreiten des Zelltods angezeigt wird. Die A549 Zellen exprimieren kein AFP und sollten nicht befähigt sein, den AFP Promotor zu transaktivieren. Zusätzlich exprimieren A549 Zellen kein E1a. Somit sollte AVAFPE1a nicht in der Lage sein, in dieser Zelllinie zu replizieren. Wie aus den 3B und 3E entnommen werden kann, scheinen sowohl nicht infizierte als auch infizierte Vertiefungen identisch, mit keinen charakteristischen zytopathogenen Effekten oder dem Ausbreiten, das bei allen getesteten Verdünnungen beobachtet wird. HuH7 Zellen exprimieren kein AFP, sie sollten den AFP Promotor transaktivieren, und sie sollten E1a mit anschließender Replikation bilden. Wie in den 3C und 3F gezeigt ist, repliziert AVAFPE1a eindeutig, wie durch die zytopathogenen Effekte angezeigt wird. Zusätzlich begann die Replikation auf einigen Vertiefungen von infizierten HuH7 Zellen mit einem einzelnen Plaque, der sich über den Rest der Vertiefung innerhalb einer Woche ausbreitete. Alle HuH7 Vertiefungen, die zytopathogene Effekte zeigten, wurden durch PCR untersucht, und es wurde gezeigt, dass sie frei von Wildtyp Virus von AV1LacZ4 Virus waren, und dass sie einen intakten AFP Promotor enthalten. Diese Daten zeigen klar, dass ein Virus hergestellt wurde, das zur Replikation spezifisch in Tumorzellen, die AFP exprimieren, befähigt ist.
Beispiel 2
Der Brustkrebs spezifische DF3 Mucin Enhancer
Das DF3 Brustkarzinom assoziiertes Antigen (MUC1) wird in menschlichen Brustkarzinomen stark überexprimiert. Die Expression des Gens wird auf der transkriptionellen Ebene reguliert. Die DNA Sequenz zwischen -458 -588 ist notwendig und hinreichend um einen mehr als 10-fachen Anstieg der Transkription des Reportergens CAT zu verleihen, wenn dieses unmittelbar oberhalb des basalen Promotors, der von dem Herpesvirus TK Promotor abgeleitet ist, angeordnet wird, in transienten Transfektionsassays, die in der humanen Brustkrebs Zelllinie MCF-7 durchgeführt wurden. Ein spezifischer Transkriptionsfaktor, der an diese Region der DNA bindet, wurde auch innerhalb von Zellen gefunden, die von der Brustkrebs Zelllinie MCF-7 abgeleitet sind, aber nicht in der Nichtbrustkrebs Zelllinie HL-60. Von derselben Region der DNA wurde gefunden, dass sie die Brustkrebs spezifische Expression des TK Gens im Kontext eines retroviralen Konstrukts oder eines adenoviralen Konstrukts fördert.
Der DF3 Enhancer von –598 bis –485 (erhalten aus der GenBank) wurde synthetisiert indem vier Oligonukleotide hergestellt wurden, die in einer solchen Weise synthetisiert waren, dass sie überlappen und sich aneinander anlagern würden. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 1 gezeigt. Zusätzliche Restriktionsstellen wurden an beiden Enden für die zukünftige Erleichterung in der Klonierung hinzugefügt. Ein Ende wurde glatt belassen, um die Klonierung in die SmaI-Stelle des Vektors pTK-Luc zu erlauben. Dieser Vektor enthält den basalen Promotor des Herpesvirus TK Gens, der niedrige Mengen an Basalaktivität in einer Vielzahl von Zellen ergibt. Er wurde als eine Quelle für diesen basalen Promotor verwendet. Das andere Ende wies eine überlappende BglII Stelle zur Erleichterung der Klonierung in die BglII Stelle des pTK-Luc auf. 1.000 ng jedes Oligonukleotids wurden in 0,017 M Tris, pH 8,0, 0,16 M NaCl in einem Gesamtvolumen von 26,5 μl durch Erhitzen bei 95°C für zwei Minuten und Abkühlen auf Raumtemperatur nach einigen Stunden aneinander angelagert. Schließlich wurde 1 μl dieses Gemisches mit 100 ng von zuvor SmaI/BglII – und Glasmilch (BIO 101) – gereinigtem Vektor durch Standardbedingungen ligiert. Nach der Transformation in DH5α Zellen (GIBCO) wurden die Kolonien hinsichtlich der Anwesenheit des Inserts durch Standard Restriktionsspaltungen gescreent. Die DNA, die von diesem Vektor abstammt, wird anschließend mit HindIII gespalten und mit Klenow stumpfendig gemacht. Anschließend wird sie mit AscI gespalten. Dieses Fragment, das den DF3 Enhancer verbunden mit dem basalen TK Promotor enthält, wird anschließend durch Agarosegel Elektrophorese und Glasmilch gereinigt und in das Plasmid pAVE1a02i ligiert, mit SpeI gespalten und mit AscI stumpfendig gemacht und wie oben gereinigt. Das resultierende Plasmid weist das E1a Genprodukt unter der Kontrolle des DF3 Enhancers und des basalen TK Promotors auf, und es ist ein adenovirales Shuttle Plasmid. 5 μg dieses Plasmids, pAVE1a03i, wird mit 5 μg des rechten ClaI Fragmentarmes, der von Addl327 abgeleitet ist, in 293 Zellen kotransfiziert. Die Plaques werden hinsichtlich des erwarteten rekombinanten Virus durch Standardverfahren gescreent.
Ein Roh Viruslysat wird verwendet, um MCF-7 mit einer MOI von 10 zu infizieren. Es wird durch Standardverfahren bestätigt, dass die Virusstocks spezifisch in Brustkrebszellen replizieren. Das Virus wird in MCF-7 Zellen und/oder in 293 Zellen in größerem Maßstab, wie zuvor für die Maßstabsvergrößerung und die Reinigung von 293 Zellen beschrieben, verwendet. Die Virusstocks werden hinsichtlich der Replikation in vivo unter Verwendung eines Mode Maus Modells von MCF-7 getestet und, als eine Negativkontrolle, wird ein Gebärmutterhalskrebs (HeLa) abgeleiteter Tumor verwendet. Das Virus wurde mittels PCR Assay des Original E1a Promotors, der nur in Wildtyp Virus vorhanden wäre hinsichtlich eines rekombinatorischen Ereignisses in 293 Zellen getestet, die ein Wildtyp Virus bilden würden. Eine Vielzahl von anderen menschlichen und Ratten Brustkrebs Zelllinien und nicht verwandten Zelllinien wurden ebenfalls getestet. Das TK Gen kann in die E3 Region eingebaut und durch TK gesteuert werden, entweder durch einen E1a abhängigen Promotor, der dort anwesend ist, oder unter der Kontrolle des RSV oder CMV Promotors.
Beispiel 3
Der Melanom spezifische Tyrosinase Promotor
PCR Primer und PCR wurden verwendet, um ein DNA Fragment 800 bp oberhalb des Tyrosinase Gens aus der Maus genomischen DNA unter Verwendung von PFU und den beschriebenen Primern, wie bei Stratogene beschrieben, zu klonieren. Das resultierende PCR Fragment wurde in pCRSCRIPT kloniert und anschließend in pAVE1a02i durch Spalten des neuen Plasmids mit AscI/SpeI und pAVE1a01 i mit AscI/SpeI und Ligieren der beiden aneinander, erneut kloniert. Das End Shuttle Plasmid, pAVE1a04i, das E1a/E1b unter der Kontrolle des Tyrosinase Promotors aufweist, wurde verwendet, um ein rekombinantes Virus, identisch wie oben beschrieben, herzustellen.
Beispiel 4
Der Darmkrebs spezifische CEA Promotor
Der CEA Promotor wurde aus menschlicher genomischer DNA wie oben beschrieben kloniert, und er wurde in einer ähnlichen Weise in das pAVE1a01i Plasmid unter Verwendung der in Tabelle 1 gezeigten Primer kloniert. Das End Shuttle Plasmid, pAVE1a05i, wurde verwendet, um rekombinantes Virus wie oben beschrieben zu bilden.
Beispiel 5
A. Austausch des Promotors von E2a auf einem retroviralen Vektor gegen einen Tumor spezifischen Promotor
Die wie oben hergestellten Konstrukte werden das E2a Protein (essentiell für virale Replikation) nur in Tumorzellen exprimieren. Deshalb findet die Replikation des Vektors nur in Tumorzellen statt. Alle vier dieser spezifischen Promotoren (in den Beispielen oben) werden verwendet, um die E2a kodierende Region, die von pSE280-E2a (siehe US Patentanmeldung an Kayden et al., "Improved adenoviral vectors and producer cells", eingereicht am 2. Juni 1995) unter der Kontrolle dieses Tumor spezifischen Promotors anzuordnen. Das resultierende Plasmid wird mit Addl327 unter Verwendung von Standardverfahren der homologen Rekombination, rekombiniert. Das Endvirus wird in den Zelllinien, die in der oben genannten Patentanmeldung beschrieben sind oder in den Tumor spezifischen Zelllinien angezogen. Das E2a Protein, weil es in stöchiometrischen Mengen benötigt wird, besitzt die Fähigkeit, den Grad der Replikation über einen weiten Bereich zu regulieren. Dies ist für die Therapie wünschenswert. Die verwendeten Verfahren sind die gleichen wie die für E1a beschriebenen. Der Unterschied ist, dass ein Shuttle Plasmid verwendet wird, das E2a unter der Kontrolle des Tumor spezifischen Promotors anordnet und es an das Virus Rückgrad (durch homologe Rekombination), in welchem die E2a und E3 Gene deletiert sind, zurückgibt.
B. Austausch von anderen therapeutisch toxischen Genen in den Tumor spezifischen replikationskompetenten Vektoren
Gene wie TK, Cytokine oder irgendwelche anderen therapeutischen Gene können in der E3 Region des Vektor Rückgrads durch Standard Plasmid Herstellung und homologe Rekombination angeordnet werden. Diese Gene können unter der Kontrolle eines E1a abhängigen Promotors oder eines konstitutiven Promotors, wie RSV oder CMV, angeordnet werden.
Tabelle 1: Oligonukleotid Primer zur Konstruktion von gewebespezifischen Promotoren
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Adenoviraler Vektor, befähigt zur gewebsspezifischen Replikation, welcher eine gewebsspezifische transkriptionale regulatorische Sequenz umfasst, die funktional mit der kodierenden Region des E1a-Gens des Vektors verbunden ist.
Vektor nach Anspruch 1, wobei die transkriptionale regulatorische Sequenz aus der Gruppe, bestehend aus Promotoren und Enhancern, ausgewählt ist.
Vektor nach Anspruch 2, wobei der Promotor aus der Gruppe, bestehend aus a-Fetoprotein, DF3, Tyrosinase, CEA, grenzflächenaktivem Mittel und ErbB2, ausgewählt ist.
Vektor nach Anspruch 1, wobei der Vektor eine heterologe kodierende Sequenz enthält, die befähigt ist, von dem Vektor exprimiert zu werden.
Verwendung eines replikationsabhängigen adenoviralen Vektors, enthaltend ein Polynukleotid, wobei das E1a-Gen funktional mit einer transkriptionalen regulatorischen Sequenz verbunden ist, die spezifisch in einem Gewebe wirkt, so dass Replikation des Vektors in dem Gewebe auftritt und nicht in einem Gewebe, in dem die transkriptionale regulatorische Sequenz nicht wirkt, zur Herstellung eines Mittels für die Behandlung eines Tumors.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die transkriptionale regulatorische Sequenz aus der Gruppe, bestehend aus Promotoren und Enhancern, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Promotor aus der Gruppe, bestehend aus a-Fetoprotein, DF3, Tyrosinase, CEA, grenzflächenaktivem Mittel und ErbB2, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Gewebe Tumorgewebe ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Vektor für ein heterologes Genprodukt kodiert, und wobei der Vektor das heterologe Genprodukt in den Zellen des Gewebes exprimiert.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das heterologe Genprodukt Antitumor-Aktivität in den Zellen des Gewebes bereitstellt.
Zelle, enthaltend einen adenoviralen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, befähigt zur gewebsspezifischen Replikation, wobei der Vektor eine gewebsspezifische transkriptionale regulatorische Sequenz umfasst, die funktional mit der kodierenden Region des E1a-Gens des Vektors verbunden ist, wobei die transkriptionale regulatorische Sequenz in der Zelle wirkt, so dass Replikation des Vektors in der Zelle auftritt.
Verfahren zur Herstellung eines Vektors, befähigt zur gewebsspezifischen Replikation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches das Züchten der Zelle von Anspruch 11 und das Gewinnen des Vektors von der Zelle umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.