PT931830E - Virus citopaticos para terapia e profilaxia de neoplasia - Google Patents

Description

86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ DESCRICÃO "Vírus citopáticos para terapia e profilaxia de neoplasia"

Domínio Técnico O invento proporciona composições de vírus citopáticos recombinantes que são capazes de replicação e/ou expressão de genes da região tardia em células neoplásicas de mamíferos mas que são essencialmente não replicáveis em células não neoplásicas; métodos para construir e propagar estes vírus recombinantes, métodos para tratar a doença neoplásica com estes vírus recombinantes, e composições terapêuticas que incluem estes vírus recombinantes.

Antecedentes

Pensa-se que a proliferação de células normais é regulada por proto-oncogenes promotores do crescimento contrabalançados por genes supressores de tumores, e limitadores do crescimento. As mutações que potenciam as actividades dos proto-oncogenes geram os oncogenes que forçam o crescimento das células neoplásicas. Inversamente, as lesões genéticas que inactivam os genes supressores de tumores, geralmente através de uma ou mais mutações que levam a que uma célula seja homozigota para o alelo supressor de tumores inactivado, podem libertar a célula dos constrangimentos à replicação impostos por estes genes. Habitualmente um gene supressor de tumor inactivado (por exemplo, p53, RB, DCC, NF-J) em combinação com a formação de um oncogene activado (isto é, um proto-oncogene que contém uma mutação activante, estrutural ou reguladora) pode originar uma célula neoplásica capaz de crescimento essencialmente não constrangido (isto é, uma célula transformada). A transformação oncogénica das células leva a várias alterações do metabolismo, fisiologia e morfologia celulares. Uma alteração característica das células oncogenicamente transformadas é a perda de capacidade de resposta a constrangimentos à proliferação e à diferenciação celulares normalmente impostas pela expressão apropriada de gene reguladores do crescimento celular. 2 86 426

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Embora tipos diferentes de alterações genéticas possam, todos levarem à expressão ou função alteradas dos genes reguladores do crescimento celular e ao crescimento anormal, acredita-se que geralmente é preciso mais de um evento para levar à transformação neoplásica de uma célula normal numa maligna (Land et al. (1983) Nature 304: 596; Weinberg RA (1989) Câncer Res. 49: 3713). Os percursos moleculares e as alterações secundárias, precisos, que levam à transformação maligna de muitos tipos de células, não são claros. Foram relatados vários casos onde a expressão ou a actividade alteradas de algumas proteínas com funções putativas de controlo do ciclo celular e/ou implicadas na formação de complexos transcricionais funcionais tais com p53 e RB podem levar à perda do controlo da proliferação em células (Ullrich et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 15259; Hollstein et al. (1991) Science 253: 49; Sager R (1992) Curr. Opin. Cell. Biol. 4: 155; Levine et al. (1991) Nature 351: 453).

Verificou-se que alguns oncogenes possuem mutações activadoras características numa fracção significativa de certos cancros. Por exemplo, determinadas mutações nas regiões codificantes rasH e rasK (por exemplo, codão 12, codão 61; Parada et al. (1984) Nature 312: 649) e o gene APC (Powell et al. (1992) Nature 359: 235) estão associados à transformação oncogénica de células cultivadas e estão presentes numa percentagem impressionante de cancros humanos específicos (por exemplo, o adenocarcinoma do cólon, o carcinoma da bexiga, o carcinoma e o adenocarcinoma do pulmão, o carcinoma hepático). Estas verificações levaram ao desenvolvimento de reagentes de diagnóstico e terapêuticos (por exemplo, sondas polinucleotídicas e anticorpos) que reconhecem especificamente a ou as formas activadas destes oncogenes (patente U.S. 4 798 787 e patente U.S. 4 762 706). A expressão excessiva ou desapropriada de outros oncogenes, tais como myc, erbB-2 e pim-1, parece ser capaz de potenciar a transformação oncogénica sem exigir necessariamente a presença da, ou das mutações activadoras na região codificante. Encunlra-se frequentemente super-expressão de erbB-2 no adenocarcinoma da mama, do estômago e do ovário e os níveis de erbB-2 nestes tipos de células podem servir como um marcador de diagnóstico para a neoplasia e/ou podem correlacionar-se com um fenótipo específico de tumor (por exemplo, resistência a drogas específicas, taxa de crescimento, estado de diferenciação). 3 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ

Animais transgénicos albergando vários oncogenes (patente U.S. 4 736 866 e patente U.S. 5 087 571) ou genes supressores de tumores funcionalmente corrompidos (Donehower et al. (1992) Nature 356: 215) foram referidos para uso em ensaios de pesquisa de carcinogénios entre outros usos potenciais.

Apesar deste progresso no desenvolvimento de um modelo mais definido dos mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo transformado e à neoplasia, poucos métodos terapêuticos significativos aplicáveis para tratar o cancro resultaram além da quimioterapia convencional. Muitos agentes quimioterapêuticos convencionais têm um índice terapêutico baixo, com níveis de dosagem terapêuticos que estão aos, ou próximos dos, níveis de dosagem que produzem toxicidade. Os efeitos tóxicos subsidiários da maioria dos agentes quimioterapêuticos convencionais são desagradáveis e levam à supressão da medula óssea com risco de vida, entre outros efeitos secundários.

Recentes abordagens para realizar a terapia génica para corrigir ou suplementar alelos defeituosos que causam doenças congénitas, tais como a fibrose cística, têm sido efectuadas com relatórios de sucesso inicial limitado. Algumas abordagens à terapia génica envolvem a transdução de uma sequência polinucleotídica capaz de expressar uma cópia funcional de um alelo defeituoso numa célula in vivo usando um adenovírus recombinante deficiente na replicação (Rosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143). Alguns destes métodos de terapia génica são eficientes na transdução de polinucleótidos para células isoladas explantadas de um paciente, mas não se mostrou serem altamente eficientes in vivo. Foram descritas abordagens terapêuticas para o cancro que se baseiam na transfecção de células de tumor explantadas, com polinucleótidos que codificam o factor de necrose tumoral (TNF) e interleucina'2 (IL-2) (Pardoll D (1 992) Curr. Qpin. Oncol. 4: 1124).

Embora algum dia se possa provar ser possível que os métodos de terapia génica sejam adaptados para corrigir alelos defeituosos de oncogenes ou genes supressores de tumores em célula transformadas in vivo, os métodos actuais de terapia génica não demonstraram ser capazes de transduzir eficientemente e atingir correctamente (por exemplo, por recombinação homóloga) uma percentagem suficiente de células neoplásicas para se ter uma terapia génica prática da neoplasia in situ. A natureza da biologia do cancro obriga a que uma 4 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ fracção substancial das células neoplásicas, preferivelmente todas as da progénie clonal da célula transformada, sejam removidas para um efeito terapêutico eficaz. Além disso, os métodos actuais de terapia génica são muito caros, exigindo a cultura ex-vivo de células explantadas antes da sua reintrodução num paciente. A aplicação generalizada destes métodos, mesmo se fossem eficazes, seria proibitivamente cara.

Portanto existe a necessidade na arte de métodos e composições para diagnóstico e terapia de doenças neoplásicas, especialmente de métodos que removam selectivamente as células neoplásicas sem a indesejável matança de células não neoplásicas como é típico na quimioterapia antineoplásica convencional. O presente invento satisfaz estas e outras necessidades.

As referências aqui discutidas são proporcionadas exclusivamente quanto à sua revelação antes da data de apresentação do presente pedido.

Sumário do Invento O presente invento proporciona diversos métodos e composições novos para a ablação de células neoplásicas através da infecção das células neoplásicas com um adenovírus recombinante que é substancialmente deficiente na replicação em células não neoplásicas e que exibe pelo menos um fenótipo de replicação parcial em células neoplásicas. A diferença do fenótipo de replicação das construções de adenovírus do invento em células neoplásicas e não neoplásicas proporciona uma base biológica para uma terapia de base virai do cancro. A expressão de efeitos citopáticos adenovirais e, opcionalmente, a expressão de um gene de uma droga seleccionável negativamente (por exemplo, tk de HSV) estão correlacionadas com o fenótipo de replicação adenoviral característico de células neoplásicas infectadas com as construções de adenovírus recombinantes do invento, distinguindo assim entre células neoplásicas e não neoplásicas e proporcionando a citotoxicidade selectiva das células neoplásicas. Embora os métodos sejam descritos em detalhe específicamente para construções de adenovírus, crê-se que os métodos são aplicáveis essencialmente a qualquer tipo de vírus em que a replicação eficiente exige a ligação e/ou o sequestro e/ou a inactivação de uma proteína da célula hospedeira que está presente em células não neoplásicas mas está 5

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EP 0 931 830/PT substancialmente ausente ou não funcional em células neoplásicas (por exemplo, p53, RB).

Numa concretização do invento, um adenovírus recombinante que inclui um Jocus E1a que codifica uma proteína E1a (por exemplo, p289R ou p243R) que é substancialmente incapaz de formar um complexo com a proteína RB em células infectadas é administrado a um indivíduo ou população de células que inclui uma célula neoplásica capaz de ser infectada pelo adenovírus recombinante. A incapacidade substancial do adenovírus recombinante para sequestrar eficazmente a proteína RB em células não neoplásicas infectadas tem como resultado o, ou os polinucleótidos adenovirais recombinantes introduzidos deixarem de expressar um fenótipo de replicação nas células não neoplásicas. Pelo contrário, as células neoplásicas destituídas de uma proteína RB funcional suportam a expressão de um fenótipo de replicação pelo adenovírus recombinante introduzido o que leva à ablação da célula neoplásica por um efeito citopático adenoviral e/ou à expressão de um gene de selecção negativa ligado ao fenótipo de replicaçião. Em variantes preferidas destas concretizações, o adenovírus recombinante inclui um locus E1a que codifica uma proteína E1a mutante (por exemplo, p289R) que é destituído de um domínio CRI e/ou CR2 capaz de ligar RB (e/ou o polipéptido de 300kD e/ou o polipéptido de 107kD) mas inclui um domínio funcional CR3 capaz da trans-activação de genes virais precoces. Variantes adicionais destas concretizações incluem aquelas onde o adenovírus recombinante compreende um locus E1a não funcional que é substancialmente incapaz de expressar uma proteína que se liga e inactiva RB e pode também opcionalmente compreender uma proteína p19 funcional (isto é, capaz de estimular a expressão de genes da região precoce adenoviral na ausência da função E1a). Os adenovírus recombinantes do invento podem ainda compreender um gene ρΊ9 mutante que produz efeitos citopáticos intensificados; um tal mutante conhecido na arte é o gene mutante p19 cyt. 0 invento proporciona novas construções de adenovírus recombinante que são deficientes na replicação em células não neoplásicas mas são capazes de expressar um fenótipo de replicação em células neoplásicas destituídas de RB funcional. As novas construções de adenovírus recombinante compreendem uma mutação, tal como uma deleção ou uma mutação pontual, nas regiões do gene E1a e/ou E1b, especialmente nas sequências codificantes da proteína E1b p55 e nos domínios CR1 e CR2 das proteínas E1a p289R ou p243R. Nalgumas 6 RB 4?fi EP 0 931 830/PT concretizações, um gene seleccionável negativamente, tal como um gene tk de HSV, está operativamente ligado a uma região precoce (por exemplo, E2, E1a, E1b) intensificadora/promotora, uma região tardia intensificadora/promotora do gene (por exemplo, um promotor tardio principal) ou um promotor de região precoce ou tardia com um intensificador de CMV, numa construção de adenovírus recombinante que também compreende uma mutação E1a ou E1b, de modo que o gene seleccionável negativamente é transcrito preferencialmente em células infectadas que expressam um fenótipo de replicação (isto é, células neoplásicas) e proporciona a selecção negativa destas células por meio da administração de uma dose eficaz de um agente de selecção negativa (por exemplo, glanciclovir, FIAU). Um gene seleccionável negativamente pode ser inserido em vez de uma sequência estrutural de E1a e/ou EI b para formar concomitantemente um mutante deficiente na replicação Ela1'1, um mutante deficiente na replicação Elb''1 ou um mutante duplo E1a/E1b, respectivamente.

Também são proporcionadas composições antineoplásicas que incluem estes adenovírus recombinantes numa forma farmaceuticamente aceitável para entrega a uma população de células neoplásicas in vivo. O invento também proporciona papovavírus recombinantes tais o papilomavírus humano (HPV), os poliomavírus (por exemplo, BK, JC) e o SV40, que são destituídos de proteínas funcionais para ligar e/ou inactivar RB. Os mutantes de papilomavírus humano destituídos de expressão da proteína E7 funcional serão substancialmente destituídos da capacidade de ligar eficazmente RB e portanto serão capazes de manifestar um fenótipo de replicação nas células RB11 mas não em células que contêm um nível suficiente de RB funcional. Os mutantes de papilomavírus humano destituídos de expressão tanto da proteína E6 funcional como da proteína E7 funcional serão substancialmente destituídos da capacidade de ligarem eficazmente RB e p53 e portanto serão capazes de manifestar um fenótipo de replicação em células p53(lRBH mas não em células que contêm um nível suficiente de RB e/ou p53 funcionais. O invento também proporciona novos métodos para tratar uma doença neoplásica que incluem os passos de administrar a um paciente um vírus recombinante capaz de expressar preferencialmente um fenótipo de replicação e/ou de expressar um efeito citopálico numa população de células neoplásicas 7 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ quando comparado com a expressão numa população de células não neoplásicas.

Os adenovírus recombinantes deficientes na replicação podem ser escolhidos entre Ad5 NT dl1110, Ad5 d!1312, e Ad2 dl1520.

Breve Descricão dos Desenhos A Fig. 1 mostra uma representação esquemática da estrutura do domínio e interacções proteína-proteína de um polipéptido E1a-289R de adenovírus. A Fig. 2(a-i) mostra a infecção de linhas de células humanas normais e transformadas neoplasicamente com adenovírus de tipo selvagem e mutantes de adenovírus recombinantes deficientes na recombinação. Cada linha de células indicada estava pseudo-infectada, Fig. 2(a); ou infectada a uma MOI de 1,0 com adenovírus de tipo selvagem 2, Fig. 2(b-c); derivado mutante dl1010, Fig. 2(d-e); derivado mutante dl1520, Fig. 2(f-g); derivado mutante dl434, Fig. 2(h-i). A Fig. 2(a) mostra os resultados 9 dias depois da pseudo-infecção. Os restantes painéis mostram os resultados nos seguintes períodos após infecção: Fig. 2(b), 4 dias; Fig. 2(c), 7 dias; Fig. 2(d), 8 dias; Fig. 2(e), 12 dias; Fig. 2(f), 14 dias; Fig. 2(g), 20 dias; Fig. 2{h), 6 dias; Fig. 2(i), 14 dias. Nos vários dias após infecção (acima mencionados) as células foram lavadas com PBS para remover as células mortas e as células restantes foram coradas com violeta de cristal. Cada linha celular pseudo-infectada com apenas PBS foi incluída como um controlo para a viabilidade. A Fig. 3 (a-c) mostra a infecção da linha de células normais de fibroblasto diplóide do pulmão humano IMR90 (ATCC CCL 186) com adenovírus de tipo selvagem e mutantes. As células IMR90 foram infectadas com o vírus indicado a MOI correspondentes a 0,1, 1,0, 10 e 100. Nos dias após infecção indicados, as células foram lavadas com PBS e coradas com violeta de cristal. Um poço em cada placa de 6 poços foi semeada com células 293 para servir de controlo positivo da infecção virai. A Fig. 3(a) mostra células infectadas com Ad2 de tipo selvagem, 9 dias após a infecção. A Fig. 3(b) mostra células infectadas com dl 1010, 9 dias após a infecção. A Fig. 3(c) mostra células infectadas com dl 1 520, 9 dias após a infecção. 8 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ

Definições

Excepto quando definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que é vulgarmente entendido por um indivíduo com habilitação comum na arte a que este invento pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou em ensaios do presente invento, são descritos os métodos e materiais preferidos. Para as finalidades do presente invento, são abaixo definidos os termos e expressões seguintes. A expressão "de ocorrência natural" tal como aqui é usada quando aplicada a um objecto refere-se ao facto de que um objecto, pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, um polipéptido ou sequência polinucleotídica que está presente num organismo (incluindo os vírus) que podem ser isolados de uma fonte na natureza e que não foram modificados intencionalmente pelo homem no laboratório, e de ocorrência natural. Tal como aqui é usado o termo "recombinante" indica que uma construção polinucleotídica (por exemplo, um genoma de adenovírus) foi gerado, em parte, por modificação intencional feita pelo homem.

Tal como aqui é usada, a expressão "vírus deficiente na replicação", refere-se a um vírus que inibe preferencialmente a proliferação celular ou induz apoptose numa população de células predeterminada (por exemplo, células substancialmente destituídas da função p53 e/ou RB) que suporta a expressão de um fenótipo de replicação de vírus e que é substancialmente incapaz de inibir a proliferação celular, induz a apoptose ou expressa um fenótipo de replicação em células que compreendem níveis normais de função de p53 e RB característicos de células não replicantes, não transformadas. Tipicamente, um vírus deficiente na replicação apresenta uma diminuição substancial da eficiência de formação de placas em células que compreendem uma função de RB e/ou p53 normais.

Tal como aqui é usada, a expressão "função de RB" refere-se à propriedade de ter um nível essencialmente normal de um polipéptido codificado pelo gene RB (isto é, em relação a células não neoplásicas do mesmo tipo histológico) onde o polipéptido RB é capaz de se ligar a uma proteína E1a de adenovírus de tipo selvagem 2 ou b. Por exemplo, a função de RB pode ser 9 OG 426 EP Ο 931 830/PT perdida devido à produção de uma forma inactiva (isto é, mutante) de RB ou a uma diminuição substancial ou perda total de expressão de polipéptido(s) RB. Também, a função de RB pode estar substancialmente ausente em células neoplásicas que compreendem alelos RB que codificam uma proteína RB de tipo selvagem; por exemplo, uma alteração genética fora do Jocus RB, tal como uma mutação de que resulte um processamento ou localização subcelulares aberrantes de RB, pode ter como resultado a perda da função de RB.

Tal como aqui é usada, a expressão "fenótipo de replicação" refere-se a uma ou mais das seguintes características fenotípicas de células infectadas com um vírus tal como um adenovírus deficiente na replicação: (1) expressão substancial de produtos de genes tardios, tais como proteínas da cápside (por exemplo, polipéptido de base "pennon" adenoviral) ou transcritos de ARN iniciados a partir de promotor(es) de genes tardios virais; (2) replicação de genomas virais ou formação de intermediários replicantes, (3) montagem de cápsides virais ou partículas de virião empacotadas; (4) aparecimento de efeito citopático (CPE) na célula infectada; (5) conclusão de um ciclo lítico virai e (6) outras alterações fenotípicas que são tipicamente contingentes por anulação da função de p53 ou RB em células não neoplásicas infectadas com um vírus de ADN competente na replicação, de tipo selvagem, que codifica uma ou mais oncoproteínas funcionais. Um fenótipo de replicação inclui pelo menos uma das características fenotípicas referidas, preferivelmente mais de uma das características fenotípicas. A expressão "vírus deficiente na replicação antineoplásica" é aqui usada para referir um vírus recombinante que tem a propriedade funcional de inibir o desenvolvimento ou a progressão de uma neoplasia num ser humano, por meio de morte celular preferencial de células neoplásicas infectadas em relação a células infectadas não replicantes e não neoplásicas, do mesmo tipo celular histológico.

Tal como aqui se utilizam, "células neoplásicas" e "neoplasia" referem-se a células que apresentam um crescimento reiativamente autónomo, de modo que apresentam um fenótipo de crescimento aberrante caracterizado por uma perda significativa do controlo da proliferação celular. As células neoplásicas incluem células que podem ser activamente replicantes ou estar num estado de repouso temporário não replicante (G, ou G0); analogamente, as células 10 8G 420 ΕΡ 0 931 830/ΡΤ neoplásicas podem compreender células que têm um fenótipo bem diferenciado, um fenótipo mal diferenciado ou uma mistura de ambos os tipos de células. Portanto, nam todas as células neoplásicas são necessariamente células replicantes num dado momento. O conjunto definido como células neoplásicas é constituído por células em neoplasias benignas e células em neoplasias malignas (ou francas). As células de neoplasias francas são frequentemente referidas como cancro, tipicamente denominado carcinoma se originário de células de origem histológica endodérmica ou ectodérmica, ou sarcoma se originário de tipos de células derivados da mesoderme.

Tal como aqui é usada, a expressão "operativamente ligado" refere-se a uma ligação de elementos polinucleotídicos numa relação funcional. Um ácido nucleico está "operativamente ligado" quando está colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou intensificador está operativamente ligado a uma sequência codificante se afecta a transcrição da sequência codificante. Operativamente ligado significa que as sequências de ADN que estão ligadas são tipicamente contíguas e, quando necessário para unir duas regiões codificantes de proteínas, contíguas e num enquadramento de leitura. Contudo, como os intensificadores funcionam geralmente quando separados do promotor por várias quilobases e as sequências intrónicas podem ter comprimentos variáveis, alguns elementos polinucleotídicos podem estar operativamente ligados mas não serem contíguos.

Tal como aqui é usado, "condições fisiológicas" refere-se a um ambiente aquoso que tem uma força iónica, um pH, e uma temperatura substancialmente semelhantes às condições numa célula intacta de mamífero ou num espaço de tecido ou órgão de um mamífero vivo. Tipicamente, as condições fisiológicas compreendem uma solução aquosa que tem cerca de 150 mM de NaCI (ou opcionalmente KCI), pH 6,5-8,1 e uma temperatura de aproximadamente 20-45°C. Geralmente, as condições fisiológicas são condições apropriadas de ligação para a associação intermolecular de macromoléculas biológicas. Por exemplo, as condições fisiológicas de 150 mM de NaCI, pH 7,4 e 37°C são geralmente apropriadas. 11 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ

Descricão Detalhada

De um modo geral, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos laboratoriais em cultura de células, genética molecular e virologia molecular descritos no seguimento são os bem conhecidos e empregues correntemente na arte. As técnicas Standard são usadas para métodos de ácido nucleico recombinante, síntese de polinucleótidos, síntese de polipéptidos, geração e propagação de reservas de vírus (incluindo linhas de células capazes de trans-complementação de reservas de vírus deficientes na replicação), cultura de células e análogos. De um modo geral, as reacções enzimáticas e os passos de purificação são realizados segundo as especificações dos fabricantes. As técnicas e procedimentos são de um modo geral realizados de acordo com os métodos convencionais da arte e várias referências gerais (ver, em geral. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edi. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Virologv. Segunda edição, eds. Fields BN e Knipe DM, (1990) Raven Press, New York, NY que são proporcionadas através deste documento. Julga-se que os procedimentos neles contidos são bem conhecidos na arte e são proporcionados para comodidade do leitor. A neoplasia é uma condição patológica que é caracterizada, em parte, pela geração de células neoplásicas que têm genótipos e fenótipos variáveis. Alguns tumores podem incluir uma população de células destituídas de função de RB mas que têm função de p53; estas células são designadas por RB1'1. Algumas células de tumor podem ser destituídas de função de p53 mas terem função de RB; estas células são designadas por p53H. Alguns tumores podem ter células destituídas tanto de p53 como de RB e são designadas por põS^RB1'1. A linha de células SAOS2 (no seguimento, ver Exemplo Experimental) é um exemplo de um tipo de células neoplásicas que é p53(,RB,). Também podem haver células neoplásicas que compreendem níveis essencialmente normais de p35 e RB; estas células que têm tanto p53 normal como RB normal podem ser destituídas de outras oncoproteínas (por exemplo, produtos de genes supressores tumorais diferentes de p53 ou RB) que podem proporcionar a base para construções virais antineoplásicas que podem manifestar preferivelmente um fenótipo de replicação nestas células neoplásicas. 12 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ

Uma base do presente invento é que diversos vírus de ADN que infectam células de mamífero (por exemplo, adenovírus; papovavírus tais como BK e JC, SV40, θ papilomavírus tais como o HPV, e análogos) codificam proteínas virais que são essenciais para uma progressão eficiente através do ciclo de replicação virai; algumas destas proteínas virais sequestram proteínas celulares, como as envolvidas no controlo do ciclo celular e/ou na formação de complexos de transcrição, como uma condição necessária para replicação virai eficiente. Na ausência das proteínas virais que ligam, sequestram ou degradam proteínas celulares como p53 e RB, a replicação virai é inibida. As células normais (isto é, não neoplásicas) que são infectadas com um vírus mutante destituído da capacidade de sequestrar ou degradar p53 e/ou RB, são geralmente incapazes de suportar a replicação do vírus mutante, e por isso estes vírus mutantes são considerados como sendo deficientes na replicação (defeituosos na replicação). Contudo, como o sequestro ou a degradação de p53 ou RB não são necessários para a replicação virai em células que são destituídas de p53 ou RB funcionais (estas células são designadas por p53(l e RB1'1, respectivamente) é possível que os vírus mutantes deficientes na replicação que são defeituosos para o sequestro ou degradação de p53 e/ou RB, possam expressar um fenótipo de replicação nestas células p53('* ou RB1'1 em maior grau do que em células que têm uma função de p53 e/ou RB essencialmente normais. As células neoplásicas são frequentemente destituídas de função de p53 (células p53(t), função de RB (células RB(1) ou de ambas as funções (células põS^RB1'1). Por isso, alguns mutantes virais deficientes na replicação podem preferivelmente apresentar um fenótipo de replicação em células neoplásicas.

Os mutantes virais destituídos da capacidade de expressar uma proteína inactivadora RB funcional (por exemplo, proteína E1a de adenovírus, E7 de HPV) manifestarão um fenótipo de replicação em células RB1'1 e células RBllp53('1. Os mutantes virais destituídos da capacidade de expressar uma proteína inactivadora p53 funcional (por exemplo, proteína E1b p55 de adenovírus, E6 de HPV) manifestarão um fenótipo de replicação em células p53H e células RB<_ ’p53(l. Os mutantes virais destituídos da capacidade de expressar tanto uma proteína inactivadora p53 funcional (por exemplo, proteína E1b p55 de adenovírus, E6 de HPV) como uma proteína inactivadora RB funcional (por exemplo, adenovírus Ela, proteína HVP E7) manifestarão um fenótipo de replicação em células RB(,p53H. A citotoxicidade ligada à expressão de um fenótipo de replicação pode portanto ser usada como uma base para matar 13 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ preferencialmente células neoplásicas que tenham um fenótipo RB1-1, p53('’ ou RB^põS1'1. Embora algumas células não neoplásicas replicantes possam apresentar transitoriamente um fenótipo RB(I, um fenótipo p53H ou um fenótipo RB^põS1'1 durante a progressão através do ciclo celular, os mutantes virais do invento podem ser usados para a morte preferencial, embora não necessariamente completamente selectiva, de células neoplásicas, constituindo assim uma modalidade útil de terapia antineoplásica a ser usada isoladamente ou em combinação com outras modalidades de tratamento. Deleções (ou outras mutações inactivadoras) nos 37 resíduos do terminal amino do polipéptido E7 de HPV são os mutantes de HPV preferidos para aplicação a células RBH visto que estes resíduos são importantes para a ligação de RB.

Embora os métodos e as composições abaixo apresentados sejam descritos especificamente para métodos referentes a construções adenovirais deficientes na replicação, crê-se que o invento pode ser posto em prática com outros vírus de ADN que codificam oncoproteínas que sequestram ou intensificam a degradação da proteína p53 ou da proteína RB, por exemplo, espécies de papilomavírus deficientes na replicação (por exemplo, mutantes de HPV dos tipos 16, 18, 33) que contêm mutações nos genes E6 e/ou E7, as quais anulam substancialmente a função de p53 e/ou RB, respectivamente. Em adição aos membros da família Adenoviridae (especificamente o género Mastadenovirus) crê-se que membros da família Papovaviridae, especialmente o papilomavírus e o poliomavírus, que codificam proteínas virais que sequestram e/ou inactivam p53 ou RB são apropriados para serem usados nos métodos do invento.

Para uma descrição geral da biologia de adenovírus e papovavírus pode ser mencionado como guia Viroloqy, Segunda edição, eds. Fields BN e Knipe DM, Vol. 2, págs. 1651-1740, Raven Press, New York, NY. As seguintes descrições específicas referem-se, mas não se lhes limitam, ao serótipo 5 de adenovírus e ao serótipo 2 de adenovírus. Embora se creia que podem ser usados outros serótipos adenovirais, o adenovírus do tipo 5 proporciona um ponto de referência comum para a convenção de numeração nucleotídica de polinucleótidos virais e numeração dos aminoácidos dos polipéptidos virais codificados da região do gene virai E1a e de outros genes virais. O adenovírus do tipo 2 proporciona uma referência conveniente para a convenção de numeração da região do gene virai Elb e de outras regiões de genes virais. 14 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ

Crê-se que os peritos na arte identificarão facilmente as posições correspondentes noutros serótipos adenovirais. As referências a papilomavírus humanos referem-se de um modo geral a um tipo associado a neoplasia (por exemplo, tipos 16, 18 ou 33) embora também possam ser usados tipos não oncogénicos.

Mutantes E1a A perda de função génica do gene supressor de tumores retinoblastoma (RB) foi associada com a etiologia de vários tipos de tumores. O produto deste gene supressor de tumores, um polipéptido de 105 quilodalton denominado pRB ou p105, é uma proteína reguladora do ciclo celular. 0 polipéptido pRB inibe a proliferação celular detendo células na fase G, do ciclo celular. A proteína pRB é também um alvo principal de várias oncoproteínas de vírus de ADN, incluindo E1a de adenovírus, grande T Ag de SV40, e E7 de papilomavírus. Estas proteínas virais ligam e inactivam pRB, e a função de inactivação de pRB é importante para facilitar a replicação virai. A proteína pRB interactua com o factor de transcrição E2F que está envolvido na expressão do gene E2 de adenovírus e diversos genes celulares, e inibe a actividade deste factor de transcrição (Bagchi et al. (1991) Cell 65: 1063; Bandara et al. (1991) Nature 351: 494; Chellappan et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 89; 4549). As oncoproteínas virais, tais como o E1a de adenovírus, destroem o complexo pRB/E2F do que resulta a activação de E2F. Contudo, as células destituídas de pRB funcional suficiente para complexar E2F não precisarão da presença de uma oncoproteína funcional, tal como a E1a, para possuírem E2F transcricionalmente activo. Portanto, crê-se que as espécies de adenovírus deficientes na replicação que são destituídas da capacidade de complexar RB mas que retêm substancialmente outras funções replicativas essenciais apresentarão um fenótipo de replicação em células que são deficientes na função de RB (por exemplo, células que são homozigotas ou heterozigotas para alelos de RB substancialmente delecionados, células que compreendem alelos de RB que codificam proteínas RB mutantes que são essencialmente não funcionais, células que compreendem mutações que resultam numa falta de função de uma proteína RB) mas não apresentarão substancialmente um fenótipo de replicação em células não neoplásicas, não replicantes. Estas espécies de adenovírus deficientes na replicação são aqui, por comodidade, referidas como adenovírus deficientes na replicação E1a-KBH. 15 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ

Uma população de células (tal como uma cultura mista de células de um paciento humano de cancro) que compreende uma subpopulação de células neoplásicas destituídas de função de RB e uma subpopulação de células não neoplásicas que expressam uma função de RB essencialmente normal, pode ser posta em contacto sob condições infecciosas (isto é, condições apropriadas para a infecção adenoviral da população de células, tipicamente condições fisiológicas) com uma composição que compreende uma dosagem infecciosa de um adenovírus deficiente na replicação, Ela-RB1'1. Deste contacto resulta a infecção da população de células com o adenovírus deficiente na replicação E1a-RBH. A infecção produz a expressão preferencial de um fenótipo de replicação numa fraeção significativa das células que constituem a subpopulação de células neoplásicas destituídas de função de RB mas não produz uma expressão substancial de um fenótipo de replicação na subpopulação de células não neoplásicas que têm função de RB essencialmente normal. A expressão de um fenótipo de replicação numa célula RB1'1 infectada resulta na morte da célula por efeito citopático (CPE), lise da célula, apoptose e análogos, do que resulta uma ablação selectiva das células neoplásicas RB1'1 da população de células.

Tipicamente, as construções de adenovírus deficientes na replicação E1a-RB*'1 apropriadas para matar selectivamente células neoplásicas RBH incluem mutações (por exemplo, deleções, substituições, desvios de enquadramento) que inactivam a capacidade do polipéptido E1a para ligar eficazmente a proteína RB. Estas mutações inactivadoras ocorrem tipicamente no domínio E1aCR1 (aminoácidos 30-85 em Ad5; posições de nucleótidos 697-790) e/ou no domínio CR2 (aminoácidos 120-139 em Ad5; posições de nucleótidos 920-967) que estão envolvidos na ligação da proteína p105 RB e da proteína p107. Preferivelmente, o domínio CR3 (aminoácidos na região 150-186) permanece e é expresso como um polipéptido p289R truncado, sendo funcional na trans-activação de genes precoces adenovirais. A Fig. 1 retracta esquematicamente a estrutura do domínio do polipéptido E1 a-289R.

As construções de adenovírus E1a-RBW deficientes na replicação apropriadas para serem usadas nos métodos e composições do invento incluem, mas não se lhes limitam, os exemplos seguintes: (1) serótipo de adenovírus 5NT dl 1010, que codifica uma proteína Ela destituída dos domínios CRI e CR2 16 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ (deleção dos aminoácidos 2 a 150; nucleótidos 560-1009) necessários para a ligação eficiente de RB, mas retendo substancialmente o domínio CR3 (Whyte et al. (1989) Cell 56: 67) e (2) o serótipo de adenovírus 5 dl 312, que compreende um genoma virai delecionado destituído da região de nucleótidos 448-1349 que codifica toda a região E1a em adenovírus de tipo selvagem (Jones N e Shenk T (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 76: 3665). O Ad5 NT dl 1010 é um adenovírus deficiente na replicação, E1a-RB() preferido e pode ser obtido do Dr. E. Harlow, Massachusetts General Hospital, Boston, MA.

Pode ser preferível incorporar mutações adicionais nestas construções de adenovírus para inibir a formação de viriões infecciosos em células neoplásicas que de outro modo suportariam a replicação dos mutantes E1a-RBH. Estas mutações inactivadoras adicionais seriam preferidas em modalidades terapêuticas onde a replicação virai completa que forma viriões infecciosos capazes de se espalharem e infectarem células adjacentes, é indesejável. Estes mutantes totalmente inactivados são referidos como mutantes Ela-RB1'1 não replicáveis. Estes mutantes não replicáveis compreendem mutações que impedem a formação de viriões infecciosos mesmo em células p53wRBH; estas mutações são tipicamente mutações estruturais numa proteína ou protease essencial de virião.

Contudo, em muitas modalidades é desejável que os vírus mutantes sejam replicáveis e formem viriões infecciosos contendo o genoma virai mutante que possam espalhar-se e infectar outras células, ampliando assim a acção antineoplásica de uma dosagem inicial de vírus mutante.

Podem ser gerados pelos peritos na arte mutantes E1aw destituídos da capacidade de ligar RB, gerando mutações na região do gene E1a que codifica polipéptidos E1a, tipicamente nos domínios CR1 e/ou CR2, expressando o polipéptido E1a mutante, pondo em contacto os polipéptidos E1a mutantes com p105 ou um fragmento de ligação a RB sob condições aquosas de ligação, e identificando os polipéptidos E1a mutantes que não ligam especificamente RB como sendo mutantes E1aH candidatos apropriados para uso no invento. Ensaios alternativos incluem pôr os polipéptidos E1a mutantes em contacto com a proteína de 300kD e/ou a proteína p107 ou o seu fragmento de ligação sob condições aquosas de ligação e identificar os polipéptidos E1a mutantes que não se ligam especificamente aos polipéptidos de 300kD e/ou p107 como 17

8G 42G EPO 931 830/PT sendo mutantes E1aH candidatos apropriados para uso no invento. Ensaios de ligação alternativos incluem determinar a incapacidade da proteína mutante Ela*'1 (ou ausência de proteína E1a) para formar complexos com o factor de transcrição E2F e/ou a falta de capacidade para dissociar a proteína RB de complexos RB:E2F sob condições fisiológicas (Chellappan et al. (1991) op.cit.).

Serão usados ensaios funcionais alternativos para determinar mutantes destituídos da função de E1a, tais como a perda de trans-activação por E1a da transcrição de vários polipéptidos repórter ligados a uma sequência reguladora da transcrição dependente de Ela, e análogos.

Algumas células tumorais humanas são destituídas tanto de função de p53 como de função de RB, devido a inactivação por mutação ou por deleção de uma ou ambas as espécies de proteínas. Estas células são denominadas células p53(‘íRBw.

Crê-se que as espécies de adenovírus deficientes na replicação que são destituídas da capacidade de ligar p53 e que também são destituídas da capacidade de ligar RB mas que retêm substancialmente outras funções replicativas virais essenciais apresentarão preferivelmente um fenótipo de replicação em células p53HRBH. Estas espécies de adenovírus deficientes na replicação são aqui referidas, por comodidade, como adenovírus deficientes na replicação E1a-RB()/E1 b-P53l) ou simplesmente mutantes duplos E1a/E1b. Estes mutantes duplos E1a/E1b podem ser construídos pelos peritos na arte combinando pelo menos uma mutação Ela-RB" na região E1a e pelo menos uma mutação E1b-p53H na região E1b que codifica p53 para formar um adenovírus mutante duplo E1a/E1b. Este adenovírus mutante duplo deficiente na replicação apresentará um fenótipo de replicação em células que são deficientes em ambas as funções de p53 e RB mas substancialmente não apresentam um fenótipo de replicação em células não transformadas e não replicantes ou em células que são deficientes na função de p53 ou RB mas não em ambas as funções. Por exemplo, o mutante Ad5 dl 434 (Grodzicker et a|_, (1980) Cell 21: 454), compreende uma deleção do locus E1a e uma deleção parcial do locus E1b e é substancialmente destituído da capacidade de codificar proteínas E1a e E1 b p55 funcionais. 18 86 4.26 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ

Uma população de células (tal como uma cultura mista de células de um paciente de cancro humano) que compreende uma subpopulação de células neoplásicas destituídas de funções de p53 e RR e uma subpopulação de células não neoplásicas que expressam função de p53 e/ou função de RB essencialmente normais, podem ser postas em contacto, sob condições infecciosas (isto é, condições apropriadas para infecção adenoviral da população de células, tipicamente condições fisiológicas), com uma composição que compreende uma dosagem infecciosa de um adenovírus mutante duplo E1a/E1b deficiente na replicação. Deste contacto resulta a infecção da população de células com o adenovírus mutante duplo E1a/E1b deficiente na replicação. A infecção produz a expressão preferencial de um fenótipo de replicação numa fracção significativa das células que incluem a subpopulação de células neoplásicas destituídas tanto de função de p53 como de função de RB mas não produz uma expressão substancial de um fenótipo replicativo na subpopulação de células não neoplásicas que têm função de p53 e/ou função de RB essencialmente normais. A expressão de um fenótipo de replicação numa célula p53('lRBH infectada resulta na morte da célula, por efeito citopático (CPE), lise da célula e análogos, do que resulta uma ablação selectiva das células p53wRBH neoplásicas da população de células.

Pode ser preferível incorporar mutações adicionais nestas construções de adenovírus para inibir a formação de viriões infecciosos em células neoplásicas que de outro modo suportariam a replicação de um mutante duplo E1a/E1b. Estas mutações inactivadoras adicionais seriam preferidas em modalidades terapêuticas em que a replicação virai completa que forma viriões infecciosos capazes de se espalhar e infectar células adjacentes é indesejável. Estes mutantes completamente inactivados são referidos como mutantes duplos E1a/E1b não replicáveis. Estes mutantes não replicáveis compreendem mutações que impedem a formação de viriões infecciosos mesmo em células põS^RB11; tipicamente estas mutações são mutações estruturais numa proteína ou protease de virião essencial.

Contudo, em muitas modalidades é desejável que o vírus mutante seja replicável e forme viriões infecciosos que contenham o genoma virai mutante que se pode espalhar e infectar outras células, ampliando assim a acção antineoplásica de uma dosagem inicial do vírus mutante.

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Construções Virais de Seleccão Negativa

Embora a expressão de um fenótipo de replicação adenoviral numa célula infectada esteja correlacionada com citotoxicidade induzida por vírus, geralmente por Use da célula, efeito citopático (CPE), apoptose ou outros mecanismos de morte celular, muitas vezes pode ser preferível aumentar a citotoxicidade de um adenovírus recombinante que se destina a ser usado em terapia antineoplásica. Este aumento pode assumir a forma de incluir um gene de selecção negativa no adenovírus recombinante, tipicamente operativamente ligado a um promotor adenoviral que apresenta modulação de transcrição positiva em células que expressam um fenótipo de replicação. Por exemplo, uma cassete de gene tk de HSV pode ser ligada operativamente, imediatamente a jusante de um promotor de E3 de um adenovírus deficiente na replicação tal como Ad5 NT dl 1110. Frequentemente é desejável delecionar uma porção não essencial (isto é, para replicação e empacotamento virai) do genoma adenoviral, para acomodar a cassete de selecção negativa; assim uma porção substancial da região do gene E3 pode ser delecionada e substituída por uma cassete de selecção negativa tal como um gene tk de HSV operativamente ligado a um promotor de E2 (e intensificador) ou outro promotor/intensificador apropriado. Alternativamente, um gene de selecção negativa pode ser operativamente ligado a um promotor da região tardia do adenovírus para originar a expressão eficiente do produto do gene de selecção negativa em células que expressam um fenótipo de replicação caracterizado pela transcrição de promotores de genes tardios.

Para concretizações em que a replicação virai que forma viriões infecciosos jn vivo é indesejável, são usadas construções de adenovírus deficientes na replicação que são não replicáveis. Estes mutantes não replicáveis compreendem uma mutação E1aH elou E1bH e compreendem todas as funções genéticas necessárias para gerar um fenótipo de replicação numa célula neoplásica apropriada (por exemplo, uma célula p53w, uma célula RBH ou uma célula põS^RB1'*) mas têm delecionada pelo menos uma função do gene essencial necessária para formação de viriões infecciosos, tais como proteínas estruturais de revestimento, proteases e análogos. Alternativamente, uma resposta imunitária eliciada, evocada pelo vírus, pode neutralizar viriões infecciosos e moderar a disseminação da infecção virai. Mutantes não replicáveis destituídos de uma função trans-actuante complementável em adição 06 426 ΕΡ 0 931 830/ΡΤ 20

a uma mutação E1a e/ou E1b podem ser propagados em conjunto com um vírus auxiliar complementar ou uma linha de células auxiliar capaz de proporcionar a função ou as funções trans-actuantes delecionadas. Por exemplo, a linha de células 293 (ATCC # CRL 1573; Graham et al. (1977) J, Gen. Virol. 36: 59) que proporciona funções de Ela e E1b em trans pode ser modificada para proporcionar funções adicionais em trans, tais como uma proteína de revestimento de virião ou análogos, para permitir a propagação dos mutantes "não replicáveis" para desenvolver reservas de vírus. A expressão do gene tk de HSV numa célula não é directamente tóxica para a célula excepto se a célula é exposta a um agente de selecção negativa tal como ganciclovir ou FIAU. As células infectadas que expressem um fenótipo de replicação em que um gene de selecção negativa é expresso substancialmente, podem não produzir essencialmente citotoxicidade adicional até que o agente de selecção negativa (por exemplo, o ganciclovir) seja administrado numa dosagem selectiva eficaz, momento em que as células infectadas que expressam o gene tk serão abladas selectivamente; portanto, a selecção negativa pode ser usada para a morte citopática intensificada e/ou para amortecer mais replicação virai matando as células que apresentam um fenótipo de replicação. Ainda ajustando as dosagens e/ou o programa de administração do agente de selecção negativa, é possível produzir apenas uma ablação parcial da população de células infectadas que expressa o gene de selecção negativa. Geralmente a dosagem de ganciclovir é calibrada criando uma curva padrão de dose-resposta e determinando o nível de dosagem a que é observado um nível desejado de ablação das células neoplásicas infectadas. A informação referente à administração de ganciclovir (GANC) a animais pode ser obtida de várias fontes na arte, incluindo orientações de prescrição a humanos em bulas de embalagens. Quando usado em cultura de células, a concentração selectiva de ganciclovir está tipicamente na gama de 0,05 μΜ a 50 μΜ, tipicamente cerca de 1 μΜ, sendo usados cerca de 0,2 μΜ para aplicações in vitro e sendo administrados cerca de 1-5 μΜ para aplicações in vivo (administrados tipicamente ao longo de 24 horas por infusão contínua a partir de uma bomba osmótica carregada com 125 mg/ml de ganciclovir em solução aquosa). Um programa de dosagem para administração in vivo pode incluir ganciclovir numa dosagem de 5 mg/kg de peso corporal B.I.D., dado intravenosamente durante sete dias. 21 86 426

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Os genes de selecção negativa podem ser incorporados em construções de adenovírus deficiente na replicação E1a-RBl), construções adenovirais deficientes na replicação E1ba-p53t_l, construções virais deficientes na replicação mutantes duplos E1a/E1b ou análogos. Uma concretização preferida é uma cassete do gene tk de HSV (Zjilstra et al. (1989) Nature 342: 435; Mansour et al. (1988) Nature 336: 348; Johnson et al. (1989) Science 245: 1234: Adair et al. (1989) Proc, Natl. Acad. Sei (U.S.A.) 86: 4574; Capecchi, M. (1989) Science 244: 1288) operativamente ligada ao promotor E2 de Ad5 NT dl 1110 ou um promotor e/ou intensificador alternativo (por exemplo, promotor tardio principal, promotor/intensificador E1a, promotor/intensificador E1b) com um local de poliadenilação para formar uma cassete de expressão de tk. A cassete de expressão de tk (ou outra cassete de expressão de selecção negativa) é inserida no genoma adenoviral, por exemplo, como uma substituição de uma deleção substancial do gene E3. Outros genes de selecção negativa e construções de adenovírus deficientes na replicação serão evidentes para os peritos na arte. Crê-se que um gene de selecção negativa operativamente ligado ao promotor E2 constitui uma concretização especialmente preferida para incorporação em mutantes de adenovírus deficientes na replicação E1aH, visto que o promotor E2 contém múltiplos locais E2F, ao passo que RBW e pSS^RB1'1 são destituídos de função de RB e presumivelmente apresentarão uma transcrição mais eficiente a partir do promotor E2.

Utilizações em Diagnóstico e In Vitro

Os adenovírus deficientes na replicação do invento podem ser usados para detectar a presença de células destituídas de função de p53 e/ou de RB. Por exemplo, uma amostra de células que inclui uma subpopulação de células neoplásicas destituídas de p53 e/ou RB pode ser infectada com uma espécie adequada de adenovírus deficiente na replicação. Após um período apropriado de incubação, as células na amostra de células que expressam um fenótipo de replicação (por exemplo, perda da capacidade de excluir o azul de tripano, formação de viriões, incorporação de 3H-timidina no ADN virai) podem ser quantificadas para proporcionar uma medida do número ou da proporção de células replicantes e/ou neoplásicas na amostra de células. Estes métodos podem ser usados para diagnosticar neoplasmas e/ou avaliar a carga de células tumorais a seguir à quimioterapia num paciente, com base numa amostra de 22 86 426

EPO 931 830/PT células explantadas (por exemplo, uma amostra de linfócitos de um paciente submetido a quimioterapia devido a uma leucemia linfocítica).

Utilizações e variantes alternativas em diagnóstico são evidentes; por exemplo, um gene repórter (por exemplo, luciferase, β-galactosidade) pode ser substituído por um gene de selecção negativa num adenovírus deficiente na replicação; as células transformadas podem ser classificadas (numa amostra celular ou num ensaio de transformação) pela expressão do gene repórter, a qual está correlacionada com a expressão de um fenótipo de replicação que indica uma falta de p53 e/ou RB numa célula. Métodos Terapêuticos A terapia da doença neoplásica pode ser conseguida administrando a um paciente uma composição que inclui os adenovírus deficientes na replicação do invento, incluindo: adenovírus deficientes na replicação E1a-RB(1, adenovírus deficientes na replicação E1b-p53H, mutantes duplos E1a/E1b e adenovírus deficientes na replicação que compreendem ainda um gene de selecção negativa. Várias neoplasias humanas que compreendem células destituídas das funções de p53 e/ou RB podem ser tratadas com construções adenovirais deficientes na replicação. Por exemplo, mas não como limitação, um paciente humano ou mamífero que não humano, que tenha um carcinoma broncogénico, um carcinoma nasofaríngico, um carcinoma laríngico, um carcinoma do pulmão de células pequenas ou de células não pequenas, um adenocarcinoma do pulmão, um carcinoma hepático, um carcinoma do pâncreas, um carcinoma da bexiga, um carcinoma do cólon, um carcinoma da mama, um carcinoma cervical, um carcinoma do ovário ou leucemias linfocíticas, pode ser tratado por administração de uma dosagem antíneoplásica eficaz de um adenovírus deficiente na replicação apropriado. Suspensões de partículas de adenovírus infecciosns podem ser aplicadas ao tecido neoplásico por várias vias, incluindo a intravenosa, a intraperitoneal, a intramuscular, a subdérmica e a tópica. Uma suspensão de adenovírus contendo cerca de 103 a 1012 ou mais partículas de virião por ml, pode ser inalada como aerossol (por exemplo, para administração pulmonar para tratar o carcinoma broncogénico, o carcinoma do pulmão de células pequenas, o carcinoma do pulmão de células não pequenas, o 23 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ adenocarcinoma do pulmão ou o cancro da laringe) ou esfregada directamente no local de um tumor para tratar o tumor (por exemplo, carcinoma broncogónico, carcinoma nasofaríngico, carcinoma da laringe, carcinoma cervical) ou pode ser administrada por infusão (por exemplo, na cavidade peritoneal para tratar o cancro do ovário, na veia porta para tratar o carcinoma hepático ou metástases no fígado provenientes de outros tumores primários não hepáticos) ou outra via apropriada, incluindo a injecção directa na massa do tumor (por exemplo, um tumor da mama) enema (por exemplo, cancro do cólon) ou cateter (por exemplo, cancro da bexiga).

Mutantes de adenovírus antineoplásicos candidatos podem ainda ser avaliados através da sua capacidade para reduzir a tumorigénese ou a carga de células neoplásicas em ratinhos nu/nu portadores de um transplante de células neoplásicas destituídas de função de RB, em comparação com ratinhos não tratados portadores de um transplante equivalente de células neoplásicas.

Os mutantes antineoplásicos de adenovírus deficientes na replicação podem ser formulados para administração terapêutica ou de diagnóstico a um paciente que tenha uma doença neoplásica. Para usos terapêuticos ou profiláticos, uma composição estéril contendo uma dosagem farmaceuticamente eficaz de uma ou mais espécies de mutante antineoplásico de adenovírus deficiente na replicação é administrada a um paciente humano ou a um paciente não humano veterinário para o tratamento de uma condição neoplásica. Geralmente a composição compreenderá cerca de 103 a 1015 ou mais partículas de adenovírus numa suspensão aquosa. É muitas vezes empregue um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável nestas composições estéreis. Pode ser usada uma diversidade de soluções aquosas, por exemplo, água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3% e análogos. Estas soluções são estéreis e geralmente isentas de matéria em partículas que não os desejados viriões adenovirais. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme sejam necessárias para aproximar as mesmas das condições fisiológicas tais como agentes reguladores do pH e de tamponamento, agentes reguladores da toxicidade e análogos, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. Podem ser incluídos excipientes que intensifiquem a infecção de células pelos adenovírus.

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Os vírus deficientes na replicação podem ser entregues nas células neoplásicas por administração de lipossomas ou imunolipossomas; esta entrega pode oer direccionada selactivamente para as células neoplásicas com base numa propriedade da superfície celular presente na população de células neoplásicas (por exemplo, a presença de uma proteína de superfície celular que liga uma imunoglobulina num imunolipossoma). Tipicamente, uma suspensão aquosa contendo os viriões é encapsulada em lipossomas ou imunolipossomas. Por exemplo, uma suspensão de viriões de adenovírus deficiente na replicação pode ser encapsulada em micelas para formar imunolipossomas por meio de métodos convencionais (patente U.S. 5 043 164, patente U.S. 4 957 735, patente U.S. 4 925 661; Connor e Huang (1 985) vT Cell. Biol. 101: 582; Lasic DD (1992) Nature 355: 279; Novel Druq Deliverv (eds. Prescott LF e Nimmo WS: Wiley, New York, 1989); Reddy et al. (1992) J. Immunol. 148: 1585. Podem ser usados imunolipossomas que incluem um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio de células de cancro (por exemplo, CALLA, CEA) presente nas células de cancro do indivíduo, para direcci9onar os viriões para essas células.

As composições contendo os presentes adenovírus antineoplásicos deficientes na replicação ou cocktails dos mesmos podem ser administradas para os tratamentos profilático e/ou terapêutico da doença neoplásica. Na aplicação terapêutica, as composições são administradas a um paciente já afectado por uma doença neoplásica particular, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos travar parcialmente a condição e as suas complicações. Uma quantidade adequada para conseguir isto é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz" ou "dose eficaz". As quantidades efectivas para esta utilização dependerão da gravidade da condição, do estado geral do paciente e da via de administração.

Nas aplicações profiláticas, são aplicadas composições contendo os adenovírus antineoplásicos deficientes na replicação ou cocktails dos mesmos a um paciente que não está presentemente num estado de doença neoplásica a fim de melhorar a resistência do paciente à recorrência de uma neoplasia ou para prolongar o tempo de remissão. Tal quantidade é definida como uma "dose profilacticamente eficaz". Nesta utilização, as quantidades exactas dependem novamente do estado de saúde do paciente e do nível geral de imunidade. 25 06 426 ΕΡ 0 931 830/ΡΤ

Pode ser realizada uma única administração ou múltiplas administrações das composições, sendo os níveis e o padrão das doses escolhidos pelo médico assistente. Em qualquer caso, as formulações farmacêuticas devem proporcionar uma quantidade dos adenovírus antineoplásicos deficientes na replicação deste invento suficiente para tratar eficazmente o paciente. A terapia antineoplásica com adenovírus deficientes na replicação do presente invento pode ser combinada com outros protocolos antineoplásicos como a quimioterapia convencional.

Propagação do Adenovírus Mutante

Os mutantes adenovirais do invento (por exemplo, os adenovírus deficientes na replicação Ela-RB1'1 e os mutantes duplos E1a/E1b) tipicamente são propagados como reservas virais numa linha de células (por exemplo, a linha de células 293, ATCC # CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, MD; Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36: 59) que pode proporcionar a função de E1a, a função de Elb, ou ambas as funções E1a e E1b, respectivamente, em trans, para suportar a replicação e a formação de viriões mutantes infecciosos.

Os exemplos seguintes são dados a título de exemplo e não de limitação. Variantes e concretizações alternativas serão evidentes para os peritos na arte.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 0 seguinte exemplo experimental demonstra que a administração de uma preparação de adenovírus recombinante deficiente na replicação a células neoplásicas destituídas das funções de p53 e/ou RB pode matar eficazmente as células neoplásicas. 0 exemplo também mostra que as células não neoplásicas contendo a função p53 e RB são relativamente resistentes à morte pela preparação de adenovírus recombinante deficiente na replicação. Portanto, os dados apresentados no seguimento proporcionam uma verificação experimental de que a administração de adenovírus recombinante deficiente na replicação pode ser usada para matar selectivamente células neoplásicas. A morte selectiva é proporcionada explorando a capacidade diferencial dos adenovírus mutantes para induzir um fenótípo de replicação em células neoplásicas mas não 26 06 426 ΕΡ 0 931 830/ΡΤ induzir substancialmente um fenótipo de replicação (ou o efeito citopático associado) em células não neoplásicas. Células não neoplásicas de controlo e linhas de células que representam uma variedade de tipos de células neoplásicas foram plaqueadas em placas de cultura de 6 poços em, ou próximo da confluência, em DMEM (alto teor de glucose) com 10% de soro fetal bovino e incubadas a 37°C, 5% de C02 em condições de cultura Standard. Estas células foram plaqueadas para serem pesquisadas a uma densidade de 5x105 células/poço. As linhas de células neoplásicas testadas eram: a SAOS-2 (ATCC HTB85), derivada de um osteossarcoma primário humano; a U-20S (ATCC HTB96), derivada de um osteossarcoma humano; a HS700T (ATCC HTB147) derivado de metástases de adenocarcinoma humano com origem no pâncreas ou nos intestinos; a 293 (ATCC CRL1573) de rim embrionário humano transformada; e a DLD-1 (ATCC CCL221) derivada do adenocarcinoma do cólon humano. Cada uma das linhas de células está disponível de American Tipe Culture Collection, Rockville, MD. As células não neoplásicas de controlo eram a IMR90 (ATCC CCL186) e WI-38 (ATCC CCL75) ambas linhas de fibroblastos pulmonares humanos diplóides.

Estas culturas de células foram subsequentemente infectadas, em paralelo, com adenovírus de tipo selvagem Tipo 2 e mutantes de adenovírus recombinante deficiente na replicação dl 11010, dl 434 e dl 1520. Uma placa de cultura extra foi plaqueada tendo em vista a contagem de células. Estas células vinham da mesma suspensão de células usada para as infecções virais. As células foram contadas a fim de se determinar o número de unidades formadoras de placa virai (PFU) a adicionar às culturas de células para uma desejada multiplicidade de infecção (ΜΟΙ). O adenovírus de tipo selvagem Tipo 2 e os adenovírus mutantes foram adicionados a culturas paralelas de células a MOI de 0,1, 1,0, 10 e 100. O vírus suspenso em PBS foi adicionado aos poços com as células num volume de 1 ml. As placas de cultura inoculadas foram submetidas a rotação segundo ambos os eixos X e Y, imediatamente depois da inoculação, e metade do tempo de adsorção de aproximadamente uma hora a 37°C, 5% de C02. Depois do período de uma hora de adsorção foram adicionados 2 ml de DMEM com alto teor de glucose e 2% de soro fetal bovino e as culturas foram incubadas a 37°C, 5% de C02 sob as condições de cultura Standard.

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Após diversos tempos depois da infecção, ver Fig. 2(a-i) as culturas de células foram coradas com violeta de cristal a 0,5% em metanol a 20% a fim de se determinar a eficácia da morte das células pelas preparações de vírus. As células mortas foram destacadas e lavadas para fora dos poços ao passo que as células vivas permaneciam no poço e eram coradas com o corante. Os resultados demonstram que as preparações de adenovírus recombinante deficiente na replicação foram capazes de matar preferencialmente as células neoplásicas quando comparadas com as células não neoplásicas, e que o adenovírus de tipo selvagem Tipo 2 matava ambas as células neoplásicas e não neoplásicas com boa eficácia aproximadamente igual. Os resultados demonstram que o mutante dl 11010 era particularmente eficaz a matar células neoplásicas, sendo o mutante dl 1 520 e o mutante dl 434 também eficazes. Um exemplo dos resultados está representado nas Figs. 2a-i que são fotografias de poços com células coradas obtidas vários tempos após a infecção com adenovírus de tipo selvagem 2, os mutantes: dl 1010 (E1AH), dl 1520 (E1BI>) ou dl 434. A Fig. 2a mostra que na ausência de vírus, cada uma das culturas de células cresceram até à confluência e ficaram presas aos poços de cultura. As Figs. 2b-c mostram que o adenovírus de tipo selvagem 2 foi capaz de matar células em cada um dos poços de cultura embora com eficácia variável e não completamente, com pelo menos algumas células a corarem em cada poço. É de notar que as linhas WI-38 e SAOS-2 não são bons hospedeiros para as infecções de adenovírus e que a IMR90 (Figs. 3a-c) serve como uma linha de células de controlo alternativa para os fibroblastos diplóides humanos. As Figs. 2d-e mostram que o mutante dl 1010 foi capaz de matar eficazmente todas as linhas de células neoplásicas excepto a SAOS-2 resistente à infecção. 0 dl 1010 matou as linhas 293, U20S, FIS700T, e DLD-1 aos 12 dias depois da infecção e não matou substancialmente os fibroblastos pulmonares humanos diplóides (WI-38). As Figs. 2f-g mostram que o mutante dl 1520 foi capaz de matar eficazmente 3 das 5 linhas de células neoplásicas (293, FIS700T, e DLD-1) aos 14-20 dias após a infecção e não matou substancialmente os fibroblastos pulmonares humanos diplóides (WI-38). dl 1520 é um mutante E1BC). A linha de células U20S não permite a um vírus mutante E1BH replicar, indicando a especificidade das diferentes linhas de células transformadas para a infecção pelos adenovírus mutantes deficientes em recombinação, conforme previsto. As Figs. 2h-i mostram que o mutante dl 434 (um mutante duplo: Ε1 Α'Έ1 Bw) foi capaz de matar eficazmente 3 das 5 linhas de células neoplásicas (293, FIS700T e DLD-1) aos 14-20 dias após a infecção e não 28 86 420 ΕΡ 0 931 830/ΡΤ matou substancialmente os fibroblastos pulmonares humanos diplóides (WI-38). As linhas DLD-1 e U20S apresentaram um fenótipo para replicação parcialmente resistente de dl 434.

As Figs. 3(a-c) mostram que os fibroblastos pulmonares diplóides humanos IMR90 foram mortos diferencialmente pelos Ad2, dl 1010 e dl 1520 de tipo selvagem. A linha de células 293 serve de controlo positivo. A Fig. 3(a) mostra que o Ad2 de tipo selvagem matou eficazmente as células IMR90 a uma MOI de 10 ou 100. A Fig. 3(b) mostra que o dl 1010 foi incapaz de replicar em células IMR90 à MOI mais elevada ensaiada, mesmo apesar do dl 1010 matar as linhas de células neoplásicas 293, U20S, HS700T e DLD-1 como mostram as Figs. 2(d-e). A Fig. 3(c) mostra que o vírus dl 1520 foi capaz de matar as células IMR90 eficazmente apenas com uma MOI de 100; com esta elevada dosagem de vírus não pode ser desprezada a hipótese de que as células morram em consequência da sobrecarga de vírus em vez da replicação.

Assim os dados apresentados nas Figs. 2<a-i) e 3(a-c) indicam que os mutantes de adenovírus recombinantes deficientes na replicação podem ser usados para matar selectivamente células neoplásicas destituídas de função de p53 e/ou RB, como previsto.

Lisboa, li. m d»t

Por ONYX PHARMACEUTICALS, INC.

- O

Claims (14)

1. 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1 - Vírus recombinante deficiente na replicação destituído de uma oncoproteína virai expressa capaz de ligar um produto de gene supressor de tumor RB funcional, para uso num método de tratamento ou de terapia de um mamífero; compreendendo o referido tratamento ou a referida terapia a ablação das células neoplásicas numa população de células que compreende as referidas células neoplásicas e células não neoplásicas; contendo as referidas células não neoplásicas um produto de gene supressor de tumores RB funcional capaz de formar um complexo ligado com a referida oncoproteína virai e sendo as referidas células neoplásicas destituídas do referido produto de gene supressor de tumores RB funcional. 2 - Vírus recombinante deficiente na replicação para uso de acordo com a reivindicação 1, que é um adenovírus ou um papilomavírus. 3 - Vírus recombinante deficiente na replicação para uso de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que as células neoplásicas são põS^RB1'1. 4 - Vírus recombinante deficiente na replicação para uso de acordo com a reivindicação 1, que é um adenovírus destituído de uma oncoproteína E1a virai expressa capaz de ligar um produto de gene supressor de tumor funcional. 5 - Vírus recombinante deficiente na replicação para uso de acordo com a reivindicação 4, em que a oncoproteína E1a virai tem uma mutação inactivante no domínio CR1 nos aminoácidos 30-85 em Ad5, posições dos nucleótidos 697-790 e/ou no domínio CR2 nos aminoácidos 120-139 em Ad5, posições dos nucleótidos 920-967. 6 - Vírus recombinante deficiente na replicação para uso de acordo com as reivindicações 4 ou 5, em que o referido vírus é adenovírus tipo 5 dl 312 ou adenovírus tipo 5 NT dl 1010. 8G 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ 2/4 7 - Vírus recombinante deficiente na replicação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o mamífero é um ser humano. 8 - Vírus recombinante deficiente na replicação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o adenovírus é capaz de formar viriões infecciosos na célula neoplásica, os quais são capazes de se espalhar e infectar células adjacentes in vivo num paciente. 9 - Vírus recombinante deficiente na replicação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, o qual é não replicável para formar viriões infecciosos em células não neoplásicas de um paciente humano. 10 - Vírus recombinante deficiente na replicação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que compreende também um gene de selecção negativa operativamente ligado a um promotor virai.
2. 11 - Composição farmacêutica que compreende um vírus recombinante deficiente na replicação tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
3. 12 - Composição de acordo com a reivindicação 11, que compreende ainda um agente quimioterapêutico.
4. 13 - Utilização de um vírus recombinante deficiente na replicação destituído de uma oncoproteína virai expressa capaz de ligar um produto de gene supressor de tumores RB funcional, para o fabrico de um medicamento para a ablação de células neoplásicas numa população de células que compreende as referidas células neoplásicas e células não neoplásicas; contendo as referidas células não neoplásicas um produto de gene supressor de tumores RB funcional capaz de formar um complexo ligado com a referida oncoproteína virai e sendo as referidas células neoplásicas destituídas do referido produto supressor de tumores RB funcional. 86 426 ΕΡ Ο 931 830/ΡΤ 3/4
5. 14 - Utilização de acordo com a reivindicação 13, na qual o referido vírus recombinante deficiente na replicação é definido como em qualquer uma das reivindicações 2 a 10.
6. 15 - Utilização de acordo com a reivindicação 1 3 ou a reivindicação 14, em que o referido medicamento compreende ainda um agente quimioterapêutico.
7. 6 - Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, para o tratamento de um cancro RB negativo escolhido entre um carcinoma broncogénico, um carcinoma nasofaríngico, um carcinoma da laringe, um carcinoma do pulmão de células pequenas e de células não pequenas, um adenocarcinoma do pulmão, um carcinoma hepático, um carcinoma do pâncreas, um carcinoma da bexiga, um carcinoma do cólon, um carcinoma da mama, um carcinoma cervical, um carcinoma do ovário ou uma leucemia linfocítica.
8. 7 - Método in vitro para a ablação de células neoplásicas destituídas de um produto de gene supressor de tumores RB funcional numa população de células com células neoplásicas e células não neoplásicas que têm uma função supressora de tumor RB, compreendendo o referido método: pôr em contacto, sob condições infecciosas, (1) um vírus recombinante deficiente na replicação destituído de uma oncoproteína virai expressa capaz de ligar um produto de gene supressor de tumor RB funcional, com (2) uma população de células que compreende as referidas células neoplásicas e células não neoplásicas, criando assim uma população de células infectadas tal que ocorre a ablação das referidas células neoplásicas.
9. 18 - Método de acordo com a reivindicação 17, em que o referido vírus é como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
10. 19 - Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que a referida célula neoplásica destituída de função supressora de RB é uma célula de cancro proveniente de um carcinoma broncogénico, um carcinoma nasofaríngico, um carcinoma da laringe, um carcinoma do pulmão de células pequenas e de células não pequenas, um adenocarcinoma do pulmão, um carcinoma hepático, um 86 420 ΕΡ 0 931 830/ΡΤ 4/4 carcinoma do pâncreas, um carcinoma da bexiga, um carcinoma do cólon, um carcinoma da mama, um carcinoma cervical, um carcinoma do ovário ou uma leucemia linfocítica.
11. 20 - Método in vitro para detectar a ausência de actividade supressora de tumores funcional numa população de células, que compreende: pôr em contacto a referida população de células com um adenovírus recombinante deficiente na replicação destituído de uma oncoproteína virai expressa capaz de ligar um produto de gene supressor de tumores RB funcional, sob condições infecciosas, e determinar o número ou a proporção de células da referida população com um fenótipo de replicação.
12. 21 - Método de acordo com a reivindicação 20, em que a referida determinação compreende a medição da capacidade das células para excluir corante, incorporar um nucleótido marcado no ADN virai ou formar viriões.
13. 22 - Método para produzir adenovírus que é incapaz de codificar uma oncoproteína funcional que se liga a uma proteína supressora de tumor RB, que compreende pôr em contacto células que são substancialmente destituídas da referida proteína supressora de tumor com o referido adenovírus, infectando assim as referidas células, e conceder tempo suficiente para que os referidos viriões repliquem nas referidas células.
14. 23 - Método de acordo com a reivindicação 22, em que o referido adenovírus é incapaz de codificar uma oncoproteína funcional que é codificada por uma região E1a de adenovírus. Lisboa, 2I. MAI 2001 Por ONYX PHARMACEUTICALS, INC. - O AGENTE OFICIAL - OADjyblTO

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