CN1242051A - 用于肿瘤治疗和预防的致细胞病变病毒 - Google Patents

Abstract

提供了基于病毒疗法的治疗肿瘤疾病的方法和组合物。缺乏结合和/或灭活p53或RB病毒蛋白质的突变型病毒被施用到肿瘤病人身上,该肿瘤包含缺乏p53和/或RB功能的细胞。该突变型病毒在具有基本正常p53和/或RB功能的非复制、非肿瘤细胞中,能够基本上产生一种复制表型。肿瘤细胞中复制表型的优势产生,导致肿瘤细胞的优选杀伤,其方式或是直接杀伤或是通过在表达病毒复制表型的细胞中细胞毒性基因的表达。

Description

用于肿瘤治疗和预防的致细胞病变病毒

技术领域

本发明提供了重组致细胞病变病毒的组合物，其能够在肿瘤性哺乳动物细胞中复制和/或表达晚期区基因，但在非肿瘤细胞中基本是非复制性的，提供了构建和繁殖这种重组病毒的方法、用这种重组病毒治疗肿瘤疾病的方法，以及包括这种重组病毒的治疗组合物。

背景

正常细胞的增殖被认为由促进生长的原癌基因调节，由限制生长的肿瘤抑制基因抗衡。加强原癌基因活性的突变产生的癌基因促进肿瘤细胞生长。相反，灭活肿瘤抑制基因的遗传病变则能使细胞摆脱这些基因造成的正常复制限制，肿瘤抑制基因的灭活一般是通过导致与失活肿瘤抑制等位基因纯合的细胞的突变。通常，一个灭活的肿瘤抑制基因(如p53、RB、DCC、NF-1)联合一个活化癌基因(即含有活化结构或调节突变的原癌基因)的形成，能产生一个基本上能够不受限制生长的肿瘤细胞(即一个转化细胞)。

细胞的癌基因转化导致细胞代谢、生理和形态上的许多变化。癌基因转化细胞的一个特征性改变是丧失了通过细胞生长调节基因适当表达通常产生的对细胞增殖和分化加以限制的反应性。

尽管不同类型的遗传改变可能都会导致细胞生长调节基因表达或功能的改变，但一般认为，一个正常细胞向恶性细胞的致瘤性转化需要一个以上的事件(Land等人(1983)自然(Nature)304：596；Wenberg RA(1989)癌症研究(Cancer Res)，49：3713)。导致大多数细胞类型恶变的确切分子途径和继发改变尚不清楚。据报道在许多病例中，具有可能细胞周期控制功能和/或参与功能性转录复合物如p53和RB形成的某些蛋白质的表达或活性改变，能导致细胞增殖控制的丧失(Ullrich等人(1992)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267：15259；Hollstein等人(1991)科学(Science)253：49；Sager R(1992)细胞生物学的现代观点(Curr.Opin.Cell.Biol.)4：155；Levine等人(1991)自然351：453)。

已发现在相当多的一部分癌症中，某些癌基因具有特征性活化突变。例如，ras^H和ras^K编码区(例如，密码子12，密码子61；Parada等人(1984)自然312：649)以及APC基因(Powell等人，(1992)自然359：235)的特定突变与培养细胞的癌基因转化有关，而且存在于相当多的特定人类癌症中(例如，结肠腺癌、膀胱癌、肺癌和腺癌、肝癌)。这些研究结果导致开发了诊断和治疗试剂(例如，多核苷酸探针和抗体)，其能特异性地识别这些癌基因的活化型(美国专利4,798,787和美国专利4,762,706)。

其它癌基因，如myc、erb B-2和pim-1的过度或不适当表达，看来能促进癌基因转化，而不必需要编码区中活化突变的存在。erb B-2的过度表达常见于乳腺、胃和卵巢的腺癌，而这些细胞类型中的erb B-2水平可能会作为肿瘤的诊断标志物和/或可能与特定肿瘤表型(例如，特定药物的抗性、生长速率、分化状态)相关联。

含有不同癌基因(美国专利4,736,866和美国专利5,087,571)或功能破裂肿瘤抑制基因(Donehower等人(1992)自然356：215)的转基因动物，已有报道用于癌基因筛查试验，以及其它潜在性用途。

尽管在研制转化表型和肿瘤的更确切的分子机制模型方面取得进展，但却几乎没有产生除常规化疗以外的用于治疗癌症的有意义疗法。许多常规化疗制剂的治疗指数很低，其治疗剂量水平等于或接近产生毒性的剂量水平。大多数常规化疗制剂的毒性副作用令人不能接受，并导致危及生命的骨髓抑制，及其它副作用。

进行基因疗法纠正或补充导致先天性疾病如囊性纤维化之缺损等位基因的最新方法已有尝试，但初始成功的报道有限。某些基因治疗方法包括，应用复制缺陷型重组腺病毒在体内的一种能够表达有功能的缺损型等位基因拷贝的多核苷酸序列转导至细胞中(Rosenfeld等人(1992)细胞(Cell)68：143)。这些治疗方法中，某些在将多核苷酸转导至病人外植的分离细胞方面是有效的，但在体内却未发现较高效验。依赖用编码肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-2(IL-2)的多核苷酸转染外植肿瘤细胞的癌症疗法已有报道描述(Pardoll D(1992)肿瘤学的现代观点(Curr.Opin.Oncol)4：1124)。

尽管有一天也许会证明基因疗法有可能适用于在体内纠正转化细胞中癌基因或肿瘤抑制基因的缺损等位基因，但尚无报道说明目前的基因疗法能够有效地转导并正确地定向于(例如，通过同源重组)足够比例的肿瘤细胞，以在原位对肿瘤进行实际的基因治疗。癌生物学的本质要求，为达到有效的治疗作用，大量的肿瘤细胞、最好是转化细胞的全部克隆后代都应被消除。此外，基因治疗的现行方法非常昂贵，需要离体培养外植细胞，然后重新输入病人体内。这类方法的广泛应用，既使有效，也会因太昂贵而不可行。

因此，在本领域中需要用于肿瘤疾病诊断与治疗的方法和组合物，尤其需要的方法是选择性消除肿瘤细胞，而不伴有常规抗肿瘤化疗特征性的对非肿瘤细胞不必要的杀伤。本发明满足了这些及其它的需要。

在此讨论的参考文献仅由于在本申请递交日之前公开而提供。这些不应视为承认，发明者无权根据先予发明在先公开。

发明概述

本发明提供了几种通过用重组腺病毒感染肿瘤细胞而消除肿瘤细胞的新方法和组合物，这种重组腺病毒在非肿瘤细胞中基本是复制缺陷型的，在肿瘤细胞中至少显示出部分复制表型。本发明的腺病毒构建体在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中复制表型的差异，为基于病毒的癌症疗法提供了生物学基础。腺病毒致细胞病变作用的表达以及一种负选择药物基因(例如，HSVtk)的任选性表达，与用本发明的重组腺病毒构建体感染的肿瘤细胞特征性腺病毒复制表型相关，因此将肿瘤细胞和非肿瘤细胞区分开，对肿瘤细胞产生选择性细胞毒性。尽管详细描述的方法具体针对腺病毒构建体，但该方法被认为可基本上应用于任何病毒类型，其中有效的复制需要一种宿主细胞蛋白质的结合和/或螯合和/或灭活，这种宿主细胞蛋白质存在于非肿瘤细胞，但在肿瘤细胞中是基本上不存在的或非功能性的(例如，p53，RB)。

为了使腺病毒在细胞内有效复制，腺病毒E1b基因产物p55与宿主细胞p53蛋白质形成一种复合物，由此螯合和/或灭活p53，并产生一种p53功能有缺陷的细胞。这种p53功能缺陷细胞能支持腺病毒复制。以这种方式，野生型腺病毒能在含p53的细胞内复制，因为腺病毒p55蛋白质灭活和/或螯合宿主细胞p53蛋白质。在本发明的一个实施方案中，一种重组腺病毒包含一个编码突变型p55蛋白质的E1b基因座，这种突变型p55蛋白质基本上不能与所感染的细胞内的p53蛋白质形成功能性复合物，这种重组腺病毒被施用到一位个体身上或施用到包含一种能被重组腺病毒感染的肿瘤细胞的细胞群体中。该重组腺病毒基本上不能有效地螯合所感染的非肿瘤细胞内的p53蛋白质，这导致导入的重组腺病毒多核苷酸不能在非肿瘤细胞内表达复制表型。相反，缺乏功能性p53蛋白质的肿瘤细胞通过导入的重组腺病毒支持复制表型的表达，导入的重组腺病毒通过腺病毒致细胞病变作用和/或与复制表型关联的负选择基因的表达，导致肿瘤细胞的消除。在这些实施方案的优选变化中，重组腺病毒包含一个编码基本上不能结合p53的突变型p55之E1b基因座，而且也可任选地缺乏一种功能性p19蛋白质(即：在E1a多肽存在时不能抑制腺病毒早期区基因的表达)。本发明的重组腺病毒可进一步包含一个突变型p19基因，其增强致细胞病变作用；本领域中为人熟知的这种变型是p19cyt突变型基因。不过，在某些突变型中保留功能性p19以维持感染过程中病毒DNA的完整性，也可能是优选的。

在本发明的一个替代实施方案中，一种重组腺病毒包含一个编码一种E1a蛋白质(例如p289R或p243R)的E1a基因座，E1a蛋白质基本上不能与所感染的细胞内的RB蛋白质形成复合物，这种重组腺病毒被施用到一位个体身上或施用到包含一种能被重组腺病毒感染的肿瘤细胞的细胞群体中。该重组腺病毒基本上不能有效地螯合感染的非肿瘤细胞内的RB蛋白质，这导致导入的重组腺病毒多核苷酸不能在非肿瘤细胞内表达复制表型。相反，缺乏功能性RB蛋白质的肿瘤细胞通过导入的重组腺病毒支持复制表型的表达，导入的重组腺病毒通过腺病毒致细胞病变作用和/或与复制表型关联的负选择基因的表达，导致肿瘤细胞的消除。在这些实施方案的优选变化中，重组腺病毒包含一个编码突变型E1a蛋白质(例如，p289R)的E1a基因座，这种突变型E1a蛋白质缺乏能够结合RB(和/或300KD多肽和/或107KD多肽)的CR1和/或CR2结构域，但包含一个能够反式激活腺病毒早期基因的功能性CR3结构域。这些实施方案的其它变化包括，其中的重组腺病毒包含一个基本上不能表达结合并灭活RB的蛋白质的非功能性E1a基因座，而且可任选地包含一种功能性p19蛋白质(即，在缺乏E1a功能时能够刺激腺病毒早期区基因的表达)。本发明的重组腺病毒可进一步包含一个突变型p19基因，其增强致细胞病变作用；本领域中为人熟知的这种突变型是p19 cyt突变型基因。

本发明提供的新型重组腺病毒构建体，在非肿瘤细胞中是复制缺陷型的，但在缺乏功能性p53和/或RB的肿瘤细胞中能够表达复制表型。这些新的重组腺病毒构建体在E1a和/或E1b基因区、尤其在编码E1bp55蛋白质和Ela p289R或p243R蛋白质的CR1和CR2结构域的序列中，包含一种突变，例如缺失或点突变。在某些实施方案中，一种负选择基因，如HSVtk基因，被有效地连接到一个早期区(例如，E2，E1a，E1b)增强子/启动子上、一个晚期区基因增强子/启动子(例如，主要晚期启动子)上、或一个具有CMV增强子的早期或晚期区启动子上，在一个重组腺病毒构建体中还包含一种E1a或E1b突变，如此，负选择基因在表达复制表型(即，肿瘤细胞)的感染细胞中被优势转录，且通过施用一种有效剂量的负选择剂(例如，9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤，FIAU)，得到这些细胞的负选择。一种负选择基因可被插入到E1a和/或E1b结构序列位置，以分别伴随形成一种E1a^(-)复制缺陷突变型、E1b^(-)复制缺陷突变型、或E1a/E1b双重突变型。

此外还提供了包含这种重组腺病毒的抗肿瘤组合物，其为药学可接受的形式，以用于输运至体内肿瘤细胞群体。

本发明还提供了重组乳多空病毒，如人类乳头瘤病毒(HPV)、多瘤病毒(例如，BK，JC)和SV₄₀，它们都缺乏结合和/或灭活p53和/或RB的功能性蛋白质。缺乏功能性E6蛋白质表达的人类乳头瘤病毒突变型，基本上缺乏有效降解p53的能力，因此能够在p53^(-)细胞中表达复制表型，在包含足够水平的功能性p53的细胞中却不能。缺乏功能性E7蛋白质表达的人类乳头瘤病毒突变型，基本上缺乏有效结合RB的能力，因此能够在RB^(-)细胞中表达复制表型，但在包含足够水平的功能性RB的细胞中却不能。既缺乏功能性E6蛋白质，又缺乏功能性E7蛋白质表达的人类乳头瘤病毒突变型，基本上缺乏有效结合RB和p53的能力，因此能够在p53^(-)RB^(-)细胞中表达复制表型，但在包含足够水平的功能性RB和/或p53的细胞中却不能。

本发明还提供了治疗肿瘤性疾病的新方法，其包括将一种重组病毒施用到一位病人身上，与在非肿瘤细胞群体中相比，该重组病毒能够在肿瘤细胞群体中优势表达重组表型和/或表达致细胞病变效应的步骤。

附图简述

图1显示了腺病毒E1a-289R多肽的结构域结构和蛋白质-蛋白质相互作用的示意图。

图2显示了质粒p019、p020和p021的结构示意图。

                           定义

除非另有不同定义，在此使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域一般技术人员通常所理解的一样。尽管任何与在此描述的相似或相同的任何方法和材料都可用于本发明的实施或试验，但对优选的方法和材料予以描述。为本发明之目的，下文就以下术语予以定义。

“天然存在的”这一术语在此用于一种物体，指这种物体可在自然界中发现的事实。例如，可从自然界某一来源中分离的生物体(包括病毒)中存在的一种多肽或多核苷酸序列，且未经人类在实验室中有意修饰，其就是天然存在的。正如在此使用的那样，“重组”这一术语指一种多核苷酸构建体(例如，一个腺病毒基因组)是部分经人类有意修饰而产生的。

正如在此使用的那样，“复制缺陷病毒”这一术语指一种病毒，它在预定的细胞群体(例如，基本上缺乏p53和/或RB功能的细胞)中优势抑制细胞增殖或诱导编程性细胞死亡，且这种细胞群体支持病毒复制表型的表达，而且在包括以正常p53和RB功能水平为特征的非复制、非转化细胞中基本上不能抑制细胞增殖、诱导编程性细胞死亡、或表达复制表型。一般复制缺陷病毒对包含正常RB和/或p53功能的细胞，显示其噬斑形成效率大大降低。

正如在此使用的那样，“p53功能”这一术语指具有一种基本正常的、由p53基因编码的多肽水平(即，相对于相同组织类型的非肿瘤细胞)的特性，其中p53多肽能够结合野生型腺病毒2或5的E1b p55蛋白质。例如，通过一种灭活(即，突变)型p53的产生、或通过p53多肽表达的大大减少或完全丧失，可丧失p53功能。还有，在包含编码野生型p53蛋白质之p53等位基因的肿瘤细胞中，p53功能也可能基本上缺乏；例如，p53基因座以外的遗传改变，如导致p53亚细胞加工或定位异常的突变(例如，一种导致p53主要定位于细胞浆而不是细胞核的突变)，能导致p53功能丧失。

正如在此使用的那样，“RB功能”这一术语指具有一种基本正常的、由RB基因编码的多肽水平(即，相对于相同组织类型的非肿瘤细胞)的特性，其中RB多肽能够结合野生型腺病毒2或5的E1a蛋白质。例如，通过一种灭活(即，突变)型RB的产生，或通过RB多肽表达的大大减少或完全丧失，可丧失RB功能。还有，在包含编码野生型RB蛋白质的RB等位基因的肿瘤细胞中，RB功能也可能基本上缺乏；例如，RB基因座以外的遗传改变，如导致RB亚细胞加工或定位异常的突变，可导致RB功能丧失。

正如在此使用的那样，“复制表型”这一术语指被一种病毒如复制缺陷腺病毒感染的细胞之以下表型特征中的一个或多个：(1)晚期基因产物的大量表达，如衣壳蛋白(例如，腺病毒五邻体基质多肽)或起始于病毒晚期基因启动子的RNA转录物，(2)病毒基因组的复制或复制中间物的形状，(3)病毒衣壳或包装病毒体颗粒的装配，(4)被感染细胞中致细胞病变效应(CPE)的出现，(5)病毒裂解周期的完成，以及(6)其它表型改变，典型的是依非肿瘤细胞中p53或RB功能的消除而定，这类非肿瘤细胞是由编码功能性癌蛋白质的野生型有复制能力的DNA病毒感染的。一种复制表型至少包括一个所列举的表型特征，优选的是一个以上的表型特征。

“抗肿瘤复制缺陷病毒”这一术语在此用来指一种重组病毒，其相对于相同组织细胞类型的感染的非复制、非肿瘤细胞来说，它具有优势杀伤感染的肿瘤细胞的功能特性。

正如在此使用的那样，“肿瘤细胞”和“肿瘤”是指那些显示相对自主生长的细胞，因此它们显示以细胞增殖控制明显丧失为特征的异常生长表型。肿瘤细胞包括的细胞，可以正在主动复制，或可以处于临时非复制静止状态(G₁或G₀)；同样肿瘤细胞可包括具有充分分化的表型、分化不良表型、或两种类型细胞的混合。因此，在一定的时点，并非所有的肿瘤细胞都一定是复制细胞。所定义的肿瘤细胞由良性肿瘤及恶性(或显性)肿瘤的细胞组成。显性肿瘤细胞常被称作癌(cancer)，通常，如果来自内胚层或外胚层组织来源的细胞，则被称为癌(carcinoma)，或者，如果来自源于中胚层的细胞类型，则被称为肉瘤。

正如在此使用的那样，“有效地连接”这一术语是指多核苷酸元件以功能性关系连接。当一个核酸被放到与另一个核酸序列有功能性关系的位置上时，这个核酸就是“有效地连接”的。例如，一个启动子或增强子如果影响编码序列的转录，它就是有效地连接到这个编码序列的。有效地连接意指，被连接的DNA序列通常是邻接的，以及需要连接两个蛋白质编码区使之连续，而且符合阅读框架。然而，因为一般当与启动子相隔几千个碱基对时，增强子能发挥功能，而且内含子序列可具有不同长度，因此某些核苷酸元件虽不邻接，但可以是有效地连接。

正如在此使用的那样，“生理条件”是指一种液体环境，其具有完整哺乳动物细胞、或组织间隙、或活的哺乳动物的器官内条件基本相似的离子强度、pH和温度。通常，生理条件包括一种水溶液，具有大约150mM NaCl(或任选地KCl)、pH为6.5-8.1，以及温度大约为20-45℃。一般来说，生理条件是结合生物大分子分子间结合的适宜条件。例如，150mM NaCl。pH 7.4、37℃的生理条件一般是适宜的。发明详述

一般来说，此后使用的名称以及下述细胞培养、分子遗传学和分子病毒学的实验室步骤，都是本领域中为人熟知和常用的。标准技术被用于重组核酸方法、多核苷酸合成、多肽合成、病毒原种的生产和增殖(包括能够反式互补重组缺陷病毒原种的细胞系)、细胞培养等。一般来说，酶反应和纯化步骤的进行是根据生产商的说明书。技术和步骤的进行一般根据本领域的常规方法和不同的综合性参考文献(一般参见Sambrook等人)。分子克隆：实验室手册，第二版。(1989)冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；病毒学，第二版，Fields BN与Knipe DM编著，(1990)Raven出版社，纽约。在此引入作为参考)，这些参考文献在本文中予以提供。其中的步骤被认为是本领域中周知的，予以提供以方便读者。其中包含的全部信息在此引入作为参考。

肿瘤是一种病理状态，其部分特征在于具有变异基因型和表型的肿瘤细胞的产生。某些肿瘤可能包含一个缺乏RB功能，但具有正常p53功能的细胞群体；这类细胞被称为RB^(-)。某些肿瘤细胞可能缺乏p53功能、但具有RB功能；这类细胞被称为p53^(-)。某些肿瘤可能包含既缺乏p53又缺乏RB的细胞，被称为p53^(-)RB^(-)。SAOS2细胞系(参见下文，参见实验性实施例)是一个p53^(-)RB^(-)肿瘤细胞类型的例子。还可能有的肿瘤细胞包含基本上正常水平的p53和RB；这类具有正常p53和正常RB的细胞可能缺乏其它癌蛋白质(例如，p53和RB以外的肿瘤抑制基因产物)，这为能在这类肿瘤细胞中优势表现复制表型的抗肿瘤病毒构建体提供了基础。

本发明的一个基础是，几种感染哺乳动物细胞的DNA病毒(例如，腺病毒；乳多空病毒如BK和JC、SV40，和乳头瘤病毒如HPV，等等)编码病毒蛋白质，其在病毒复制周期的有效进程中是必不可少的；这些病毒蛋白质中的某一些螯合细胞蛋白质，如参与细胞周期控制和/或转录复合物形成的蛋白质，以此作为有效病毒复制的必需条件。当结合、螯合或降解这些细胞蛋白质的病毒蛋白质如p53和RB缺乏时，病毒复制被大大抑制。用缺乏螯合或降解p53和/或RB能力的突变型病毒感染的正常(即，非肿瘤)细胞，不能支持突变型病毒的复制，因此这类突变型病毒被认为是复制缺陷的(或复制缺损的)。然而，因为在缺乏功能性p53和RB的细胞(这类细胞被分别称为p53^(-)RB^(-))中，p53或RB的螯合或降解并不是病毒复制所必需的，因此有可能的是，p53和/或RB螯合或降解有缺损的复制缺陷突变型病毒可在这种p53^(-)或RB^(-)细胞中表达复制表型，其程度比在具有基本正常p53和/或RB功能的细胞中要高。肿瘤细胞常常缺乏p53功能(p53^(-)细胞)、RB功能(RB^(-)细胞)、或此两种功能(p53^(-)RB^(-)细胞)。因此，某些复制缺陷病毒突变型可能在肿瘤细胞中优势显示复制表型。

缺乏表达功能性RB灭活蛋白质(例如，腺病毒E1a，HPVE7蛋白质)能力的病毒突变型，将会在p53^(-)细胞和RB^(-)p53^(-)细胞中显示复制表型。缺乏表达功能性p53灭活蛋白质(例如，腺病毒E1bp55，HPVE6蛋白质)能力的病毒突变型，将会在p53^(-)细胞和RB^(-)p53^(-)细胞中显示复制表型。既缺乏表达功能性p53灭活蛋白质(例如，腺病毒E1b p55，HPVE6蛋白质)能力、又缺乏表达功能性RB灭活蛋白质(例如，腺病毒E1a，HPVE7蛋白质)能力的病毒突变型，将会在RB^(-)p53^(-)细胞中显示复制表型。因此，与复制表型之表达相关的细胞毒性，可被用来作为优势杀伤具有RB^(-)、p53^(-)、或RB^(-)p53^(-)表型的肿瘤细胞的基础。尽管某些复制中的非肿瘤细胞在细胞周期的进行期间，可暂时显示RB^(-)表型、p53^(-)表型或RB^(-)p53^(-)表型，本发明的病毒突变型可被用来优选地、尽管不一定是完全选择性地，杀伤肿瘤细胞，由此构成了一种有用的抗肿瘤疗法，其可单独应用，或可与其它疗法联合应用。HPV E7多肽的37氨基端残基的缺失(或其它灭活突变)是优选的应用于RB^(-)细胞的HPV突变型，因为这些残基对于RB结合是重要的。

尽管下面提出的方法和组合物是特别针对与复制缺陷腺病毒构建体有关的方法而描述的，但认为本发明也能与编码螯合或促进p53蛋白质或RB蛋白质降解的癌蛋白质的其它DNA病毒一起应用，例如复制缺陷乳头瘤病毒种类(例如，HPV16、18、23型的突变型)，其含有在E6和/或E7基因的突变，其基本上分别消除p53和/或RB的功能。除腺病毒科的成员(尤其是Mastadenovirus属)外，认为编码螯合和/或灭活p53或RB病毒蛋白质的乳多空病毒科成员，尤其是乳头瘤病毒和多瘤病毒也被认为适合用于本发明的方法中。

关于腺病毒和乳多空病毒生物学的综合性描述，在此引入作为参考的病毒学，第二版，Fields BN与Knipe DM编著，第二卷1651-1740页，Raven出版社，纽约，纽约，可予以参考指导。以下特定描述是指但并不限于，腺病毒血清型5和腺病毒血清型2。尽管认为其它腺病毒血清型也可应用，但腺病毒5型为病毒多核苷酸的核苷酸编号常规以及E1a病毒基因区和其它病毒基因病毒编码多肽的氨基酸编号提供了常用的参照点。腺病毒2型为E1b病毒基因区及其它病毒基因区的编号常规提供了方便的参照。认为本领域的技术人员将会很容易地识别其它腺病毒血清型的相应位置。人类乳头瘤病毒的参照一般指与肿瘤相关的型(例如，16、18或33型)，尽管非致癌型也可应用。

                          E1b突变型

细胞磷蛋白p53的一个功能是抑制哺动物细胞之细胞周期的进展。野生型腺病毒E1b p55蛋白质与具有p53的经感染的细胞中的p53结合，导致p53功能的基本灭活，这可能是通过以灭活形式螯合p53。功能性E1b p55蛋白质是含有功能性p53的细胞内腺病毒有效复制所必需的。因此，基本上缺乏结合p53能力的腺病毒变异株在具有正常功能性p53水平的非复制、非肿瘤细胞中是复制缺陷的。

人类肿瘤细胞对突变的(例如，替换、缺失、移码突变)p53等位基因常常是纯合的或杂合的，而且缺乏细胞周期的正常控制所必需的p53功能(Hollstein等人，(1991)科学253：49；Levine等人(1991)参见前述书中，在此引入作为参考)。因此，许多肿瘤是p53^(-)，或是因为它们缺乏足够水平的p53蛋白质和/或是因为它们表达了不能发挥基本p53功能的p53突变型，而且，既使在野生型p53可能存在时，它们也可大大消弱p53功能(例如，通过抑制功能性多聚体的形成)。某些肿瘤细胞可能包含基本上编码野生型p53蛋白质的等位基因，但可包含大大消除p53功能的第二个位点突变，例如导致p53蛋白质定位于细胞浆而不是细胞核的突变；这种第二位点突变型基本上也缺乏p53功能。

缺乏复合p53的能力、但基本上保留其它基本病毒复制功能的复制缺陷腺病毒种，被认为会在p53功能有缺陷的细胞(例如，基本上缺失p53等位基因的纯合细胞，包含基本上无功能的突变型p53蛋白质的细胞)中显示复制表型，但在非复制、非肿瘤细胞中，将基本上不会显示复制表型。在此为了方便，将这些复制缺陷腺病毒种称为E1b-p53^(-)复制缺陷腺病毒。

包含缺乏p53功能的肿瘤细胞亚群以及包含表达基本正常p53功能的非肿瘤细胞亚群的一种细胞群体(例如，混合细胞培养物或一例人类癌症病人)，在感染条件(即，适合细胞群体腺病毒感染的条件，通常为生理条件)下，可与一种包含感染剂量的E1b-p53^(-)复制缺陷腺病毒的组合物接触。这种接触导致该细胞群体被E1b-p53^(-)复制缺陷腺病毒感染。在包含缺乏p53功能的肿瘤细胞亚群的大部分细胞中，这种感染引起复制表型的优势表达，但在具有基本正常p53功能的非肿瘤细胞中，却不引起复制表型的大量表达。在一个被感染的p53^(-)细胞中，复制表型的表达导致细胞死亡，如通过致细胞病变效应(CPE)、细胞裂解、编程性细胞死亡等等，导致该细胞群体中肿瘤p53^(-)细胞的选择性消除。

一般地，适用于p53^(-)肿瘤细胞选择性杀伤的E1b-p53^(-)复制缺陷腺病毒构建体包括有效灭活E1b p55多肽结合p53蛋白质能力的突变(例如，缺失、替换、移码)。这种灭活性突变通常发生在p55中结合p53的区域。任选地，突变型E1b区可编码并表达一种由E1b区残基编码的功能性p19蛋白质，在缺乏E1a多肽时，其在腺病毒早期基因的反式激活中是有功能的。

适用于本发明的方法和组合物的E1b-p53^(-)复制缺陷腺病毒构建体包括但并不限于以下实例：(1)腺病毒2型dl1520，它包括在核苷酸位置2022的C变为T突变，其在用于起始p55蛋白质翻译的AUG密码子的3个氨基酸下游产生一个终止密码子，以及包括核苷酸2496与3323之间被一个小的接头插入取代的缺失，其在核苷酸3336处产生第二个终止密码子；p19蛋白质的表达基本上不受影响(Barker与Berk(1987)病毒学156：107，在此引入作为参考)，以及(2)一种复合腺病毒构建体，包括腺病毒2型dl 1520，后者至少包括位置2022突变和/或2496-3323或其中的一大部分缺失突变，以及p19的额外突变，产生一个p19 cyt突变型；该复合病毒构建体缺乏p55，且包含p19cyt突变的加强的致细胞病变效应。Ad2 dl 1520可从加利福尼亚州洛杉矶市加利福尼亚大学洛杉矶分校A.Berk博士处获得，而且在文献中有描述，包括Barker与Berk(1987)病毒学156：107，在此引入作为参考。

优选的将另外的突变掺入到这类腺病毒构建体中，以抑制肿瘤细胞中感染性病毒体的形成，否则这些肿瘤细胞可能会支持E1b-p53^(-)突变型的复制。在一些治疗方法中这种额外的失活突变型是优选的，其中完整的病毒复制形成能够传播并感染邻近细胞的感染性病毒体是不受欢迎的。这些完全灭活的突变型被称为不能复制的E1b-p53^(-)突变型。这些不能复制的突变型包括防止感染性病毒体形成的突变，既使在p53^(-)RB^(-)细胞内；这些突变典型的是在一种必需病毒体蛋白质或蛋白酶上的结构突变。

不过，在许多疗法中，也需要突变病毒能够复制并形成含有突变病毒基因组的感染性病毒体，其可能会传播并感染其它细胞，由此扩大初始剂量突变病毒的抗肿瘤作用。

缺乏结合p53能力的另外的E1b^(-)突变型可由本领域熟练的技术人员制备，其方式通过在编码p55多肽的E1b基因区产生突变，表达突变型p55多肽，在液体结合条件下使突变型p55多肽接触p53或p53的结合片段，以及鉴定不能特异结合p53的突变型E1b多肽，作为适用于本发明的候选E1b^(-)突变型。

更典型的是，一种功能性试验被用来鉴定候选E1b^(-)突变型。例如，测定p53功能的Friend试验将基本按照Frebourg等人(1992)癌症研究(Cancer Res.)52：6977上的描述进行，在此引入作为参考。缺乏灭活p53能力的E1b突变型将被鉴定为候选E1b^(-)复制缺陷突变型。

                      E1a/E1b双重突变型

某些人类肿瘤细胞既缺乏p53功能又缺乏RB功能，这或是由于突变灭活，或是由于一种或两种蛋白质种类的缺失。这类细胞被称为p53^(-)RB^(-)细胞。

缺乏结合p53的能力、也缺乏结合RB的能力、但基本上保留其它基本病毒复制功能的复制缺陷腺病毒种，被认为会优势在p53^(-)RB^(-)细胞中显示一种复制表型。在此为了方便，将这种复制缺陷腺病毒种称为E1a-RB^(-)/E1b-p53^(-)复制缺陷腺病毒，或简称为E1a/E1b双重突变型。这些E1a/E1b双重突变型可由本领域熟练的技术人员构建，其方法是结合至少一种在E1a区的E1a-RB^(-)突变和至少一种在编码p55E1b区中的E1b-p53^(-)突变，以构成一种E1a/E1b双重突变腺病毒。这种复制缺陷双重突变腺病毒将在p53和RB功能均有缺陷的细胞中显示复制表型，但在非复制、非转化细胞，或在p53和RB功能两者之一有缺陷、而不是两者都有缺陷的细胞中，将基本上不会显示复制表型。例如，Ad5 dl 434突变型(Grodzicker等人，(1980)细胞21：454，在此引入作为参考)包括一个E1a基因座的缺失以及E1b基因座的部分缺失，基本上缺乏编码功能性E1a和E1b p55蛋白质的能力。

包含缺乏p53和RB功能的肿瘤细胞亚群以及包含表达基本正常p53功能和/或RB功能的非肿瘤细胞亚群的一个细胞群体(例如，混合细胞培养物或一例人类癌症病人)，在感染条件(即适合细胞群体腺病毒感染的条件，通常为生理条件)下，可与一种包含感染剂量的复制缺陷E1a/E1b双重突变腺病毒的组合物接触。这种接触导致该细胞群体被E1a/E1b双重突变复制缺陷腺病毒感染。在包含既缺乏p53功能又缺乏RB功能的肿瘤细胞亚群的大部分细胞中，这种感染引起复制表型的优势表达，但在具有基本正常p53的功能和/或RB功能的非肿瘤细胞中，却不引起复制表型的大量表达在一个被感染的p53^(-)RB^(-)细胞中，复制表型的表达导致细胞死亡，如通过致细胞病变效应(CPE)、细胞裂解等等，导致该细胞群体中肿瘤性p53^(-)RB^(-)细胞的选择性消除。

将另外的突变掺入到这类腺病毒构建体中以抑制肿瘤细胞中感染性病毒体的形成，也许是优选的，否则这些肿瘤细胞可能会支持E1a/E1b双重突变型的复制。在一些治疗方法中，完整的病毒复制形成能够传播并感染邻近细胞的感染性病毒体是不期望的，在这些疗法中，优选的是这些另外的灭活突变型。这些完全灭活的突变型被称为不能复制的E1a/E1b双重突变型。这些不能复制的突变型包括防止感染性病毒体形成的突变，既使在p53^(-)RB^(-)细胞内；这些突变一般是在一种必需病毒体蛋白质或蛋白酶上的结构突变。

不过，在许多疗法中也需要突变病毒能够复制并形成含有突变病毒基因组的感染性病毒体，其可能会传播并感染其它细胞，由此扩大初始剂量突变病毒的抗肿瘤作用。

                        负选择病毒构建体

尽管腺病毒复制表型在感染细胞内的表达一般可通过细胞裂解、致细胞病变效应(CPE)、编程性细胞死亡或其它细胞死亡机制而与病毒诱导的细胞毒性相关，但增强将用于抗肿瘤疗法的重组腺病毒的细胞毒性，可能常常是优选的。这种增强可采取在重组腺病毒内包含一个负选择范围的形式，典型的是将其有效地连接到一个腺病毒启动子上，该启动子在表达复制表型的细胞中显示阳性转录调节。例如，一个HSVtk基因盒可被有效地连接到紧接一种复制缺陷腺病毒如Ad5 NT dl 1110的E3启动子的下游。常常需要的是，去掉腺病毒基因组的一个非必需部分(即，用于病毒复制和包装)以容纳该负选择基因盒；由此，E3基因区很大的一部分可能被去掉，并代之以一个负选择基因盒如一个HSVtk基因，其被有效地连接到一个E2启动子(和增强子)或其它适当的启动子/增强子上。另外的选择是，可将一个负选择基因有效地连接到一个腺病毒晚期区启动子上，以使得该负选择基因产物在以晚期基因启动子转录为特征的、表达复制表型的细胞中有效表达。

在一些实施方案中，当病毒复制在体内形成感染性病毒体是不期望的时，可应用不能复制的腺病毒复制缺陷构建体。这种不能复制的突变型包含Ela^(-)和/或E1b^(-)突变，而且包含在适当肿瘤细胞(例如p53^(-)细胞、RB^(-)细胞、或p53^(-)RB^(-)细胞)中产生复制表型所需要的全部遗传功能，但已缺失形成感染性病毒体所需要的至少一种必需基因功能，如结构性包膜蛋白质、蛋白酶等等。另外的选择是，病毒诱发的免疫反应可中和感染性病毒体，而限制病毒感染的扩散。除E1a和/或E1b突变外缺乏一种可互补性反式作用功能的不能复制的突变型，其在一种互补性辅助病毒或一种能够提供缺失的反式作用功能的辅助细胞系的协同下，可得以增殖。例如，提供反式E1a和E1b功能的293细胞系(ATCC#CRL 1573；Graham等人(1997)普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)36：59，在此引入作为参考)可被修饰，以提供附加的反式功能-如病毒体包膜蛋白质或诸如此类，使得“不能复制的”突变型能够增殖，以制备病毒原种。

HSVtk基因在细胞内的表达对细胞没有直接毒性，除非该细胞接触到一种负选择制剂，如9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤或FIAU。表达复制表型的感染细胞(其中一个负选择基因被大量表达)可能基本上不会产生附加的细胞毒性，直到应用有效选择剂量的负选择制剂(如9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤)以后，此时表达tk基因的感染细胞将被选择性消除；因而，负选择可被用于增强致细胞病变杀伤和/或通过杀伤具有复制表型的细胞而抑制进一步的病毒复制。此外，通过调整负选择制剂的剂量和/或应用方案，有可能使表达负选择基因的感染细胞群体中仅一部分被消除。通常，通过产生标准剂量-反应曲线来标定9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤的剂量，且确定可观察到感染肿瘤细胞的消除达到所需的水平的剂量水平。有关9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(GANC)应用于动物的资料，可从本领域中各种不同的来源获得，包括包装插入的人类详细说明。当用于细胞培养物时，9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤的选择性浓度通常在0.05mM～50mM的范围，通常约为1mM，其中大约0.2mM用于体外应用，大约1～5mM用于体内应用(通常为，将9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤125mg/ml水溶液装到渗透泵中，持续输注约24小时以上)。体内应用的一个剂量方案可包括9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤的剂量为5mg/kg体重，每日两次，静脉给予，共7天。

负选择基因可被插入到E1a-RB(-)复制缺陷腺病毒构建体，E1ba-p53^(-)复制缺陷腺病毒构建体、E1a/E1b双重突变复制缺陷病毒构建体或类似构建体中。一个优选的实施方案是，将一种HSVtk基因盒(Zjistra等人(1980)自然342：435；Mansour等人(1988)自然336：348；Johnson等人(1989)科学245：1234；Adair等人(1989)美国国家科学院院报(Proc.NaH.Acad.Sci.U.SA)86：4574；Capecchi，M.(1989)科学244：1288，在此引入作为参考)有效地连接到Ad5 NT Dl 1110的E2启动子或一种选择性启动子和/或增强子上(例如，主要晚期启动子、E1a启动子/增强子、E1b启动子/增强子)，带有多腺苷酸化位点形成一个tk表达盒。该tk表达盒(或其它负选择表达盒)被插入到腺病毒基因组中，例如，作为E3基因大量缺失的置换。其它负选择基因和复制缺陷腺病毒构建体对本领域的技术人员来说是显而易见的。一个负选择基因被有效地连接到E2启动子上被认为是一个特别优选的方案，用于将其结合到E1a^(-)复制缺陷腺病毒突变型中，因为E2启动子包含多个E2F位点，而RB^(-)和p53^(-)RB^(-)缺乏RB功能，推测将会显示更为有效的E2启动子转录。

                        诊断及体外应用

本发明的复制缺陷腺病毒可被用于检测缺乏p53和/或RB功能的细胞。例如，包含缺乏p53和/或RB功能的肿瘤细胞亚群的一种细胞样本能被适当的复制缺陷腺病毒种感染。经过适当的孵育期后，细胞样本中表达复制表型(例如，排除台盼蓝能力的丧失、病毒体形成、³H-胸苷掺入病毒DNA的细胞可被定量，以测量细胞样本中复制和/或肿瘤细胞的数目或比例。这类方法可用于诊断肿瘤和/或在外植细胞样本(例如，因淋巴细胞白血病接受化疗的病人淋巴细胞样本)的基础上评价病人在化疗后的肿瘤细胞负荷。

其它诊断性应用和变化是显而易见的；例如，一个报道基因(例如，萤光素酶β-半乳糖苷酶)可用来代替复制缺陷腺病毒中的负选择基因；通过报道基因的表达，可对转化细胞进行计数，(例如在一个细胞样本或转化试验中)，报道基因的表达与提示细胞中缺乏p53和或RB的复制表型的表达相关联。

                   治疗方法

通过给病人施用一种包含本发明的复制缺陷腺病毒的组合物，可提供肿瘤疾病的疗法，复制缺陷腺病毒包括：Ela-RB^(-)复制缺陷腺病毒、Elb-p53^(-)复制缺陷腺病毒、Ela/Elb双重突变型，以及进一步包含一种负选择基因的复制缺陷腺病毒。

包含缺乏p53和/或RB功能细胞的多种人类肿瘤可应用复制缺陷腺病毒构建体治疗。例如但不限于，患有支气管癌、鼻咽癌、喉癌、小细胞与非小细胞肺癌、肺腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、或淋巴细胞白血病的病人或非人类哺乳动物，可通过施用有效抗肿瘤剂量的一种适当的复制缺陷腺病毒来治疗。感染性腺病毒颗粒的混悬液可通过多种途径应用到肿瘤组织中，包括静脉内、腹腔内、肌肉、皮下及局部应用。每毫升含有大约10³～10¹²或更多病毒体颗粒腺病毒混悬物可作为一种气雾剂吸入(例如，作为肺输运以治疗支气管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、或喉癌)、或用药签将其直接敷到肿瘤部位以治疗肿瘤(例如，支气管癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌)、或者可以输注应用(例如，输注到腹腔以治疗卵巢癌、输注到门静脉以治疗肝癌或其它非肝脏原发肿瘤的肝转移)、或者可通过其它适当途径，包括直接注射到瘤块中(例如，乳腺肿瘤)、灌肠(例如，结肠癌)、或导管(例如，膀胱癌)。

侯选抗肿瘤腺病毒突变型的进一步评估，可通过其在含有缺乏p53和/或RB功能的肿瘤细胞移植物的nu/nu小鼠中减少肿瘤生成或肿癌细胞负荷的能力，并将其与含有等同肿瘤细胞移植物的非治疗小鼠作比较。

可配制抗肿瘤复制缺陷腺病毒突变型用于肿瘤疾病患者的治疗和诊断。

作为治疗或预防应用，一种含有药学有效剂量的一种或多种抗肿瘤复制缺陷腺病毒突变型的无菌组合物被施用到人类病人或兽医非人类病例身上，以治疗肿瘤疾病。通常，该组合物包含水性混悬液中大约10³～10¹⁵或更多的腺病毒颗粒。在这种无菌组合物中常常应用一种药学上可接受的载体或赋形剂。可应用多种水溶液，例如，水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等等。这些溶液是无菌的，而且一般不含除所需腺病毒病毒体以外的颗粒物质。组合物可包含需用来接近生理条件的药学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等等，例如，醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、等等。促进细胞被腺病毒感染的赋形剂可包括在内。

复制缺陷腺病毒可由脂质体或免疫脂质体输运到肿瘤细胞中；根据存在于肿瘤细胞群体的细胞表面特性(例如，结合免疫脂质体中免疫球蛋白的细胞表面蛋白质的存在)，这种输运可以选择性地定向于肿瘤细胞。一般，一种包含病毒体的水性混悬液被包裹在脂质体或免疫脂质体中。例如，一种复制缺陷腺病毒病毒体的混悬液可被包裹在微胶粒中，以通过常规方法形成免疫脂质体(美国专利5,043,164，美国专利4,957,735，美国专利4,925,661；Connor与Huang(1985)细胞生物学杂志(J.Cell Biol)，101：582；Lasic DD(1992)自然355：299；新型药物输运(Novel Drug Delivery(编著PrescottLF与Nimmo WB：Wiley，纽约1989；(Reddy等人(1992)免疫学杂志(J.Immunol).148：1585；在此引入作为参考)。包含一种特异性结合个体癌细胞上癌细胞抗原(例如，CALLA，CEA)的抗体的免疫脂质体，可被用来将病毒体定向导入那些细胞中。

施用包含本抗肿瘤复制缺陷腺病毒或其混合物的组合物，可用于肿瘤疾病的预防和/或治疗。在治疗应用中，组合物被用到已患特定肿瘤疾病的病人身上，其剂量足以治愈或至少部分抑制该病及其并发症。足以达到这一目的的剂量被被为“治疗有效剂量”或“效验剂量”。这种应用的有效剂量将取决于疾病严重度、病人一般状况及用药途径。

在预防性应用中，包含抗肿瘤复制缺陷腺病毒或其混合物的组合物，被应用到目前并不处于肿瘤疾病状态的病人身上，以增强病人对肿瘤复发的抵抗力，或延长缓解时间。这样的剂量被称为“预防有效剂量”。在这方面应用的准确剂量也取决于病人的健康状况和总体免疫水平。

以施治医生选择剂量水平及方式可单次或多次应用该组合物。无论如何，药物处方应提供足量的本发明的抗肿瘤复制缺陷腺病毒，以有效地治疗病人。

本发明的抗肿瘤复制缺陷腺病毒疗法可联合其他抗肿瘤方案，如常规化疗和/或免疫抑制。免疫抑制的步骤将由在WO96/12406中基本上描述的步骤组成。通常，一种复制缺陷腺病毒将会单独应用，或与一种免疫抑制剂混合应用，优选的免疫抑制化合物的实例包括环磷酰胺、环孢菌素或地塞米松。这些化合物达到所需水平的免疫抑制的剂量在本领域是公知的。例如，环磷酰胺的优选应用剂量为100～300mg/kg，而地塞米松的优选应用剂量约为2～6mg/kg。

                        突变腺病毒的增殖

本发明的腺病毒突变型(例如，E1a-RB^(-)复制缺陷腺病毒、E1b-p53^(-)复制缺陷腺病毒、以及E1a-E1b双重突变型)通常是在一种细胞系(例如，293细胞系ATCC # CRL 1573，美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD；Gracham等人(1977)普通病毒学杂志36：59)内以病毒原种增殖的，该细胞系能分别提供反式E1a功能、E1b功能，或E1a和E1b两种功能，以支持感染性突变病毒体复制和形成。

以下实施例是通过举例方式提供的，但并不限于此。变化以及其它实施方案对本领域的技术人员来说是显而易见的。

                  实验实施例

复制缺陷重组腺病毒对缺乏p53和/或RB细胞的作用

以下实验实施例证实，将复制缺陷重组腺病毒制剂施用到缺乏p53和/或Rb功能的肿瘤细胞上，能有效地杀死肿瘤细胞。该实施例还显示，含有p53和Rb功能的非肿瘤细胞对复制缺陷重组腺病毒制剂的杀伤具有一定的抗性。因此，以下描述的资料提供了实验证据表明，复制缺陷重组腺病毒的应用可用来选择性地杀伤肿瘤细胞。选择性杀伤是通过利用突变腺病毒在肿瘤细胞中诱导复制表型但其在非肿瘤细胞中却基本上不诱导复制表型(或相关的致细胞病变效应)的不同能力来实现的。

对照非肿瘤细胞以及代表多种肿瘤细胞类型的细胞系，接种在加DMEM(高葡萄糖)和10％胎牛血清的6孔培养皿中长至铺成连片或接近连片，在标准培养条件下，37℃，5％CO₂孵育。在密度为5×10⁵细胞/孔下筛查细胞。被测试的肿瘤细胞有：SAOS-2(ATCCHTB85)，来源于人类原发性骨肉瘤；U-20S(ATCC HTB96)，来源于人类肉瘤；HS700T(ATCC HTB 147)，来源于源自胰腺或肠道的人类转移性腺癌；293(ATCC CRL 1573)，转化的人胚肾；以及DLD-1(ATCC CCL 221)，来源于人类结肠腺癌。每种细胞系均可从美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD获得。对照非肿瘤细胞系为IMR 90(ATCC CCL 186)和WI-38(ATCC CCL 75)，两者都是二倍体人肺成纤维细胞系。

这些细胞培养物随之用野生型腺病毒2型、以及复制缺陷重组腺病毒突变型dl 1010、dl434、和dl 1520平行感染。另外一个培养皿中接种用于计数的细胞。这些细胞与用于病毒感染的细胞来自相同的细胞混悬液。计数细胞以确定病毒蚀斑形成单位(PFU)的数目，加入细胞培养物以得到所需的感染复数(MOI)。野生型腺病毒2型与突变腺病毒被加到平行的细胞培养物中，其MOI为0.1、1.0、10和100。悬浮于PBS中的病毒被加到细胞培养孔中，体积为1ml。在接种后即刻、以及在大约1小时的吸附期中间，将接种的培养皿在37℃，5％CO₂下，以X和Y轴方向震摇。1小时的吸附期过后，加入2ml加含高葡萄糖以及2％胎牛血清的DMEM，将培养物在标准培养条件下，37℃、5％CO₂孵育。在感染后不同时间，用溶在20％甲醇中的0.5％结晶紫给细胞培养物染色，以测定病毒制剂杀伤细胞的功效，将死亡细胞从培养孔中洗脱分离下来，而活细胞仍保留在培养孔中，且被染料着色。结果显示，与非肿瘤细胞相比，复制缺陷重组腺病毒制剂能够优势地杀死肿瘤细胞，而野生型腺病毒2型能大约同等程度地杀死肿瘤细胞和非肿瘤细胞。更为特别的是，结果显示dl 1010突变型杀伤肿瘤细胞特别有效，dl 1520突变型和dl 434突变型也有效。在感染后4-7天，野生型腺病毒2型能够杀死每个培养孔中的细胞，尽管功效不等且不完全，每个孔中至少有某些细胞着色。注意WI-38和SAOS-2细胞系并不是腺病毒感染的良好宿主，而且正如以下讨论的那样，IMR 90作为人二倍体成纤维细胞的另一个对照细胞系。8-12天后，dl 1010突变型能够有效地杀死除感染抵抗型SAOS-2以外的全部肿瘤细胞系。感染后12天，Dl 1010杀死293、UZOS、HS 700T和DLD-1细胞系，但基本上不杀伤二倍体人肺成纤维细胞(WI-38)。感染后14-20，dl 1520突变型能够有效地杀死5个肿瘤细胞系中的3个(293，HS 700T和DLD-1)，但基本上不杀伤二倍体人肺成纤维细胞(WI-38)。dl 1520是一种E1B^(-)突变型，USOS细胞系不允许这种E1B^(-)突变病毒复制，提示了不同的转化细胞系对突变型重组缺损腺病毒感染的特异性，这与所预料是一样的。感染后14-20天，dl 434突变型(一种双重突变型：EIA^(-)E1B^(-))能够有效地杀死5个肿瘤细胞系中的3个(293，HS 700T和DLD-1)，但基本上不杀伤二倍体人肺成纤维细胞(WI-38)。DLD-1和UZOS细胞系对dl 434的复制显示出部分抵抗表型。每种细胞系都单独用PBS模拟感染，以作为存活对照。

也应用IMR 90细胞(ATCC CCL 186)和野生型及突变型腺病毒进行以下实验。IMR 90细胞用所示病毒感染，相应的MOI为0.1、1.0、10和100。感染后第9天，用PBS冲洗细胞，用结晶紫染色。每个6孔培养皿的一个孔中接种293细胞，以作为病毒感染的阳性对照。结果显示，IMR 90人二倍体肺成纤维细胞分别被野生型Ad2、dl1010、和dl 1520不同程度的杀伤。野生型Ad2在MOI为10或100时有效地杀死IMR 90细胞。Dl 1010在所测试的最高MOI时也不能在IMR 90细胞中复制，尽管在上面的实验中dl 1010能杀死293、UZOS、HS700T和DLD-1肿瘤细胞系。Dl 1520病毒只在MOI为100时能够有效地杀死IMR 90细胞；在这么大的病毒剂量时，不能排除细胞死于病毒负荷过重而不是病毒复制的可能性。

因此，正如所预料的那样，这些资料显示复制缺陷重组腺病毒突变型能被用来选择性地杀伤缺乏p53和/Rb功能的肿瘤细胞。

         复制缺陷重组腺病毒的构建

下文描述了ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021的产生与测试，它们是E1B 55KD带有缺失的改进的腺病毒株，其能选择性地在p53缺陷细胞中复制。这些病毒株与dl 1520(此后称为ONYX-015)作了比较，显示在病毒CPE试验中较ONYX-015有显著改进。

除非另外说明，本发明在这方面的实施，将应用分子生物学、微生物学、重组DNA操作和生产、以及免疫学的常规技术，这是本领域内的技术。这些技术在文献中有充分解释。参见，例如，Sambrook，分子克隆；实验室手册，第二版(1989)；DNA克隆，第I和第II卷(DN.Glover，编著1985)；寡核苷酸合成(M.J.Gait，编著1984)；核酸杂交(B.D.Hames与S.J.Higgins，编著1984)；转录与翻译(B.D.Hames与S.J.Higgins，编著，1984)；动物细胞培养(R.I.Freshney，编著1986)；固定化细胞与酶(IRL Press，1986)；B.Perbal，分子克隆实用指南(1984)；丛书，酶学方法(Academic Press，Inc)；哺乳动物细胞的基因转移载体(J.H.Miller与M.P.Calos，编著，1987，冷泉港实验室)，酶学方法，154和155卷(Wu与Grossman，及Wu，分别编著)，(Mayer与Walker，编著)(1987)；细胞和分子生物学的免疫组织化学方法(Academic Press，London)，Scopes，(1987)；蛋白质纯化：原理与实践，第二版(Springer-Verlag，N.Y.)；以及实验免疫学手册，I-IV卷(D.M.Weir与C.C.Blackwell，编著1986)。在此上下方提到的所有专利、专利申请和公开文本，均在此引入作为参考。

DNA构建体：核苷酸1339-3328是应用XbaI和BglII限制酶从Ad5 pXC1质粒上切割下来的，该质粒获自加拿大安大略省多伦多市的Microbix Biosystems，Inc。pXC1含有从碱基对22～5790的Ad5序列。核苷酸1339-3328包含E1B 55KD基因的大部分；它不包括最后的C-末端178个碱基对。凝胶纯化的DNA片段被克隆到一个修饰的Bluscript(Stratagene公司)载体(pBS Bg1 ΔHin)上；其中以Bg1II替换了Hind III位点。

自1339-3328片段的两端以及内部构建寡核苷酸(见图2)。寡核苷酸如下：

A5XBAT＝5’-CCGCTCTAGAGAATGCAATAGTAGTAC-3’           Ad5：1339-1361nt

A5BGLB＝5’-CTCCAGATCTTCATGGTCATGTC-3’               Ad5：3315-3328nt

E1B217B＝5’-GGGGAATTCAAAGGCCACCCTATCCTCCGTATC-3’    Ad5：2646-2669nt

E1B275T＝5’-GGGAATTCACCGATGTAAGGGTTCGGGGCTGTG-3’    Ad5：2844-2868nt

E1B300T＝5’-GGGAATTCTCAATTAAGAAATGCCTCTTTGAAAG-3’   Ad5：2919-2944nt

E1B354T＝5’-GGGAATTCGCCTCTCAGATGCTGACCTGCTCG-3’     Ad5：3081-3104nt

这些寡核苷酸用于PCR以产生不同的片段，命名为A、B、C和D。用凝胶纯化这些片段。

以下片段对：A和B、A和C、A和D分别连接到凝胶纯化的pXC1的Bg1II/XbaI7.9kb片段上。在转化入DH5α细胞后，应用寡核苷酸A5XBAT和A5BGLB通过PCR对菌落进行筛选，寻找阳性菌落。参见，美国专利5,008,182号，以及Hedrum，PCR方法和应用2：167-71(1992)。

这些构建体含有编码E1B 55KD基因中以下氨基酸缺失的DNA序列：

p019(pXC1-AB)由片段A和B构建氨基酸218-275缺失

p020(pXC1-AC)由片段A和B构建氨基酸218-300缺失

p021(pXC1-AD)由片段A和B构建氨基酸218-354缺失图2显示了上述片段

对每个构建体的一个阳性进行DNA maxi preps(Qiagen)。对DNA进行序列分析以证实缺失。质粒p019、p020和p021存在于大肠杆菌中，保藏在美国典型培养物保藏中心，在此它们被分别称为JN 019，JN020和JN 021。美国典型培养物保藏中心的保藏号：JN 019为ATCC98286号；JN 020为ATCC 98287号；JN 021为ATCC 98288号。

病毒构建体：每次用获自Microbix的pBHGE 3质粒和p019、p020及p021质粒中的一个质粒共转染HEK 293细胞。pBHGE 3质粒含有Ad5E1序列188-1339碱基对的缺失，被构建带有早期区1中的插入或突变的Ad5载体。挑选噬斑，应用寡核苷酸A5XBAT和A5BGLB对第一批噬斑进行PCR分析，以证实部分缺失的E1B 55KD基因的存在。PCR方法在本领域公知。其在核酸杂交试验中应用探针扩增靶遗传材料。参见，例如，美国专利号4,683,202；4,683,195；5,091,310；5,008,182和5,168,039。扩展噬斑，应用Qiagen QIAamp Blood制备病毒DNA。对缺失的上游和下游进行DNA序列分析以证实缺失。

免疫沉淀资料：应用来自裂解C33A细胞的病毒的免疫沉淀资料显示，ONYX-019、ONYX-020与ONYX-021病毒(对应于上述p019、p020与p021)(a)看来比ONYX-015能产生稍多一些的19KD蛋白质，使用的抗-19KD单克隆抗体获自Oncogene Sciences；(b)产生一种55 KD蛋白质的变体，其分子量低于野生型55KD，应用的抗-55KD抗体获自Oncogene Sciences；注意ONYX-015不产生可检测得到的55KD；以及(c)正如所预料的那样，与腺病毒抗体起反应，应用的抗腺病毒抗体获自abV Immune Response。

CPE资料：应用C33A的CPE试验的资料将ONYX-015至ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021进行了比较，资料显示，通过产生同等CPE效应所需的MOI进行测定，新病毒株的效力比ONYX-015大约强2-10倍。

这些实验按以上所述进行。简言之，将野生型腺病毒2型及突变腺病毒ONYX-015至ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021加入平行的细胞培养物中，MOI分别是0.1、1.0、10和100。将悬浮在pBS中的病毒加入细胞培养孔中，体积为1ml。在接种后即刻，以及在大约1小时的吸附期中间，将接种的培养皿在37℃，5％CO₂，以X和Y轴方向震摇。1小时的吸附期过后，加入2ml含高葡萄糖以及2％胎牛血清的DMEM，将培养物在标准培养条件下，37℃5％CO₂孵育。在感染后7天，为测定病毒制剂杀伤细胞功效用溶在20％甲醇中的0.5％结晶紫给细胞培养物染色，死亡细胞从培养孔中洗脱分离下来，而活细胞仍保留在培养孔中，且被染料着色。结果显示，与非肿瘤细胞相比，复制缺陷重组腺病毒制剂ONYX-015、ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021能够优势地杀死肿瘤细胞，而野生型腺病毒2型能大约以同等程度杀死肿瘤细胞和非肿瘤细胞。

结果进一步证实，通过产生同等CPE效应所需的MOI进行测定，在杀伤C33A细胞方面，ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021的效力比ONYX-015约强2-10倍。实验中MOI的范围是10、1.0、0.1和0.01，ONYX-019、ONYX-020和ONYX-021在MOI为0.1-0.01时显示增强的杀伤作用。

复制缺陷重组腺病毒和化学疗法对肿瘤细胞杀伤的作用

然后我们研究了ONYX-015(dl1520)静脉(IV)单独应用及联合应用化学疗法的功效。将人类肿瘤异种移植物(结肠、宫颈)植于裸鼠皮下，生长到5-7mm大小时，将10⁹总pfu分次剂量(1-5天)IV注射。化学疗法组的小鼠在第5天经腹腔(IP)注射接受最大可耐受剂量的5-Fu或顺铂。对照组以同样方式接受IV和IP载体注射。IV注射后观察到肿瘤内病毒复制。顺铂和5Fu没有显著改善存活或者抑制肿瘤生长，而单独用ONYX-015即显著抑制肿瘤生长(40％-60％)，并改善存活(p＝0.05)。用ONYX-015和5-Fu(或顺铂)的联合疗法与任一单独的制剂相比均显著改善存活。因此，ONYX-015当IV施用时具有选择性抗肿瘤活性，化学疗法能提高这种活性。

尽管本发明为了便于明确理解而通过举例方式在某些方面做了详细描述，但显然，在权利要求的范围内进行一定变化和修饰是可行的。

Claims (36)

1.一种消除细胞群体中的肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：

(1)一种缺乏能够结合功能性肿瘤抑制基因产物的表达病毒癌蛋白质的重组复制缺陷腺病毒，该腺病毒具有一种选自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒的特性，在感染条件下使这种腺病毒接触(2)一种细胞群体，其包含有能与病毒癌蛋白质形成结合复合物的功能性肿瘤抑制基因产物的非肿瘤细胞，以及缺乏该功能性肿瘤抑制基因产物的肿瘤细胞，籍此产生一种感染的细胞群体。

2.根据权利要求1的方法，其中病毒癌蛋白质是一种腺病毒E1b多肽。

3.根据权利要求1的方法，其中肿瘤抑制基因产物是p53。

4.根据权利要求1的方法，其中肿瘤细胞是p53^(-)。

5.根据权利要求4的方法，其中重组复制缺陷腺病毒不编码能够结合p53的E1bp55多肽。

6.根据权利要求1的方法，其中重组复制缺陷腺病毒选自ONYX019、ONYX020或ONYX021。

7.根据权利要求1的方法，其中所述的包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞的细胞群体存在于一种哺乳动物中，且所述的接触步骤是通过将重组复制缺陷腺病毒施用到个体而在体内进行的。

8.根据权利要求7的方法，其中哺乳动物是人。

9.根据权利要求1的方法，其中重组复制缺陷腺病毒能在缺乏p53功能的肿瘤细胞中复制以形成感染性病毒体。

10.根据权利要求9的方法，其中在肿瘤细胞中形成的感染性病毒体能够在病人体内播散并感染邻近细胞。

11.根据权利要求1的方法，其中重组复制缺陷腺病毒在人类患者的肿瘤细胞中不能复制形成感染性病毒体。

12.根据权利要求1的方法，其中重组复制缺陷腺病毒进一步包括一种E1a中的遗传改变，其阻止与肿瘤抑制物Rb的结合。

13.一种治疗人类肿瘤疾病的方法，其包括将一种组合物应用到患有包含缺乏功能性肿瘤抑制基因产物的肿瘤细胞的人类肿瘤患者身上，该组合物中包含一种治疗有效剂量的重组复制缺陷腺病毒，其具有选自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒之特性。

14.根据权利要求13的方法，其中肿瘤抑制基因产物是p53。

15.根据权利要求13的方法，其中包含重组复制缺陷腺病毒的组合物还包括该复制缺陷腺病毒E1a区的遗传改变。

16.根据权利要求15的方法，其中该复制缺陷腺病毒E1a区的遗传改变基本上阻止与RB肿瘤抑制基因产物的结合。

17.根据权利要求16的方法，其中该肿瘤包含缺乏肿瘤抑制物RB、或缺乏肿瘤抑制物p53，或这两种肿瘤抑制物都缺乏的肿瘤细胞。

18.根据权利要求13或15的方法，其中包含重组复制缺陷腺病毒的组合物还包括一种有效地连接的负选择基因。

19.根据权利要求18的方法，其中该病毒选自Onyx019、Onyx020或Onyx021。

20.一种用于肿瘤疾病治疗的抗肿瘤组合物，其包含一种药学上可输运形式的、治疗有效剂量的重组复制缺陷腺病毒，其具有选自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒之特性。

21.一种重组质粒JN019，其保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为98286。

22.一种重组质粒JN020，其保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为98287。

23.一种重组质料JN021，其保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为98288。

24.一种复制缺陷腺病毒，其具有选自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒之特性。

25.一种复制缺陷腺病毒Onyx019。

26.一种复制缺陷腺病毒Onyx020。

27.一种复制缺陷腺病毒Onyx021。

28.一种存在于重组质粒JN019的经分离的核酸序列，该质粒保藏在ATCC，保藏号为98286，该核酸序列包含腺病毒E1B区的缺失，该缺失编码氨基酸218-275。

29.一种存在于重组质粒JN020的经分离的核酸序列，该质粒保藏在ATCC，保藏号为98287，该核酸序列包含腺病毒E1B区的缺失，该缺失编码氨基酸218-300。

30.一种存在于重组质粒JN021的经分离的核酸序列，该质粒保藏在ATCC，保藏号为98288，该核酸序列包含腺病毒E1B区的缺失，该缺失编码氨基酸218-354。

31.根据权利要求1或12的方法，其还包括将该肿瘤细胞接触一种免疫抑制或化学治疗化合物。

32.一种组合物，其包括一种选自Onyx019、Onyx020或Onyx021的重组复制缺陷腺病毒，以及一种化学治疗化合物。

33.一种组合物，它包括一种具有选自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒之特性的重组复制缺陷腺病毒以及一种化学治疗化合物。

34.一种组合物，它包括一种选自Onyx019、Onyx020或Onyx021的重组复制缺陷腺病毒，以及一种免疫抑制化合物。

35.一种组合物，它包括一种具有选自Onyx019、Onyx020或Onyx021的腺病毒之特性的重组复制缺陷腺病毒以及一种免疫抑制化合物。

36.一种宿主细胞，它包含一种选自JN019、JN020和JN021的质粒。

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