CN1333689A - 用腺病毒突变体杀伤肿瘤和肿瘤相关内皮细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于充分且选择性地消灭癌细胞和分裂的内皮细胞而基本上不损伤静止的正常细胞的方法和组合物,其包含在病毒的E1A RB家族成员结合位点区,优选地在E1A－CR2区突变的具有复制能力的腺病毒突变体,与野生型腺病毒相比,这些突变体在多种肿瘤细胞系和增殖的微血管内皮细胞中显示更强的复制和作用。

Description

用腺病毒突变体杀伤肿瘤和肿瘤相关内皮细胞的方法
                    发明领域
此处所述的本发明涉及用与静息细胞相比可在过度增殖的或不受控制的细胞中选择性复制的具有复制能力的腺病毒突变体，对与这些细胞生长有关的疾病优选地癌症的治疗或预防。
                    发明背景
人类癌症的主要特征是不受控制的细胞生长和原发肿瘤的转移。最近的研究表明，不受控制的细胞生长与细胞周期校验点(checkpoint)调节的功能丧失有关。见，Hartwell，L.H.和Kastan，M.B.，科学(Science)266，1821-1828(1994)。例如，成视网膜细胞瘤基因产物(RB)和有关蛋白质在防止正常细胞从G1期进入S期中起重要作用，直到接收到适当的增殖信号为止。相反，RB功能似乎在几乎所有癌细胞中丧失，这是由于RB或p16基因突变/缺失、细胞周期蛋白D扩增/过量表达或cdk4扩增/过量表达的结果。见，Sherr，C.J.，科学274，1672-1677(1996)。因此，RB途径的缺陷不能控制细胞的生长，而使正常细胞表现恶性表型。通常与恶性状态相关的是癌细胞转移的能力。
腺病毒5 E1A基因编码两种沉降值为13S和12S的mRNA，这是由于一种共同前体的不同剪接引起的，并且编码分别含有289个和243个氨基酸的蛋白质。这两种蛋白质之间46个氨基酸的差异是由于13S的种类。据认为E1A是通过结合细胞RB转化细胞，从而消除了其肿瘤抑制功能。
E1A基因显示编码几种不同的生物学活性。在一种情况中，与SV40病毒的中T抗原或活化的H-ras基因产物结合后它能转化细胞。相反，更新的研究表明，它能抑制与某些癌基因相关的致癌表型。见，美国专利号5,651,964。已确定E1A基因的突变影响其抗癌活性，其中某些显示与化疗药物结合后有效。见，PCT/US97/19042。
Frisch证明了腺病毒E1A在人肿瘤细胞中的抗癌作用。见，Frisch，S.，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88卷，9077-9081(1991)。
美国专利号5,516,631描述了用编码具有腺病毒E1A活性的多肽的核酸抑制过度增殖细胞复制的方法。
PCT/US95/11342描述了一种用腺病毒E1A使肿瘤细胞对化疗剂敏感的方法。
美国专利号5,651,964、5,643,567、5,641,484和PCT/US97/03830描述了单独或与SV40大T抗原结合使用腺病毒E1A基因抑制表达neu癌基因的肿瘤的方法。
其他人证明，腺病毒E1A具有体内抗肿瘤作用。见，R.Sanchez-Prieto等人，癌基因(Oncogene)13：1083-92(1996)；和R.Sanchez-Prieto等人，癌症基因治疗(Cancer Gene Therapy)5(4)，215-224(1998)。
血管生成对于肿瘤生长和转移至关重要。血管生成是原发性肿瘤的生长和转移及随后继发肿瘤的转移所必需的。即，肿瘤在没有血液供应来提供养分并除去代谢废物的情况下不能保持持续的生长。因此，新血管的形成，或血管生成，有利于肿瘤细胞生长，使肿瘤细胞得以进入血流并在全身循环。因此，血管生成的抑制或预防预计是一种有效的防止肿瘤生长和转移的方法。
值得注意的是，作为血管生成过程的一部分，肿瘤相关内皮细胞增殖，而与正常组织相关的内皮细胞基本上静止。因此，针对分裂的细胞即癌细胞及其相关微血管内皮细胞的治疗剂比只针对任一细胞型的治疗剂有更强的抗肿瘤作用。显然，具有这种特性的病毒剂，即可在靶细胞中复制从而杀伤靶细胞，并在此过程中释放能扩散并攻击其他靶细胞的新病毒颗粒的病毒剂，将有重要的医学应用。
                    发明概述
根据前述，本发明提供一种方法和具有复制能力的腺病毒突变体，其用于治疗或预防不受控制的、过度增殖的细胞生长的疾病。
本发明的一个方面提供了一种方法和具有复制能力的腺病毒突变体，其用于治疗或预防不受控制的或过度增殖的细胞生长的疾病，优选地那些需要或由血管生成引起的疾病，包括癌症。
在本发明的另一方面中，与野生型腺病毒相比，具有复制能力的腺病毒突变体在分裂的正常细胞或癌细胞中能有增强的复制，其中这些突变体在E1A的RB家族成员结合区中具有突变。
在本发明的又一方面中，与野生型腺病毒相比，具有复制能力的腺病毒突变体在分裂的正常细胞或癌细胞中能有提高的致细胞病变性，其中这些突变体在E1A的RB家族成员结合区中具有突变。
在本发明的另一方面中，与野生型腺病毒相比，在E1A的RB家族成员结合区中，优选地在E1A-CR2区中显示突变的具有复制能力的腺病毒突变体，在分裂的正常细胞或癌细胞中能有增强的复制。
在本发明的再一方面中，与野生型腺病毒相比，在E1A的RB家族成员结合区中，优选地在E1A-CR2区中显示突变的具有复制能力的腺病毒突变体，在分裂的正常细胞或癌细胞中能有提高的致细胞病变性。
在阅读以下说明书中关于本发明不同方面的叙述后，本领域技术人员将理解本发明的这些及其他目的。在附图、详述和以下所述的实施例中更详细地说明了本发明的上述及其他方面。
                    附图简述
图1.腺病毒E1A基因区。显示了负责结合pRB(和p107、p130)的E1A的保守区(CR)。显示了dl922/947和dl1107中存在的特异CR2基因缺失和pm928中的点突变。
图2.E1A-CR2突变体(dl922/947)的复制效率，其为野生型腺病毒复制的百分数。检测了dl922/947和野生型腺病毒在静止或增殖的非无限增殖化人微血管内皮细胞(分别为Q-MVEC和P-MVEC)、C33A子宫颈癌细胞和HLaC喉癌细胞中的复制。以每个细胞10pfu的MOI感染细胞，48小时后利用对HEK 293细胞的噬菌斑测定法测定病毒效价。数据为一式三份进行两次的测定的平均值(±SEM)。
图3.E1A-CR2突变体(dl922/947或dl1107)相对于野生型腺病毒而言提高的对肿瘤细胞的细胞致病变作用。以所示感染复数(MOI)感染细胞，5天后固定并染色细胞单层。H2009非小细胞肺癌细胞(A图)和HLaC喉癌细胞(B图)用结晶紫染色。A549非小细胞癌细胞(C图)和U2OS骨肉瘤细胞(D图)用硫代罗丹明(sulforhodamine)B染色；染色表示为未感染的对照细胞单层的百分数(空心矩形＝野生型腺病毒；实心圆形＝dl1107)。测定至少进行两次。
图4.在裸鼠-人肿瘤异种移植模型中肿瘤内注射E1A-CR2突变体(dl922/947)后提高的存活率。将RKO.RC 7.14人结肠癌细胞(A图)或HLaC人喉癌细胞(B图)皮下注射到nu/nu小鼠胁腹中，当肿瘤达到5-7mm最大直径时，连续5天每天注射载体(空心三角形)或108pfu的dl922/947(实心圆形)或野生型腺病毒(空心矩形)(每组n＝6-13)。每周测定肿瘤两次，直到处死为止；待90天后或当肿瘤生长到直径≥1cm时处死动物。在结肠癌异种移植模型中(A图)，dl922/947注射组的存活率显著高于载体注射组(p＝0.02)或野生型腺病毒注射组(p＝0.04)的存活率。在喉癌异种移植模型中(B图)，dl922/947处理组和野生型腺病毒处理组的存活率都显著高于载体注射组(p≤0.001)。
                    发明详述
全文中提到的所有公开文本，包括专利申请书，均在此引用作为参考，使每一单个公开文本或专利申请书均具体且个别地引用作为参考。
                        定义
除非另外定义，否则此处使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员所通常理解的具有相同含义。通常，此处所用的命名法和以下所述的实验室程序是本领域中众所周知且通常使用的。标准技术用于重组核酸法、多核苷酸合成和微生物培养和转化(例如，电穿孔、脂质体转染)。酶促反应和纯化步骤通常按照使用说明书进行。技术和方法通常按照本领域的常规方法和本文件中提供的多种一般参考文献进行。见，Sambrook等人，《分子克隆：实验室指南》第二版(1989)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约。此处所用的命名法和以下所述的分析化学、有机合成化学和药物配制的实验室方法是本领域中众所周知且通常使用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物配制和施用及患者的治疗。
如在本公开内容中使用的，除非另外指明，否则下列术语可理解为具有下列含义：
术语“腺病毒”是指从人类中分离的超过40种腺病毒亚型，来源于其他哺乳动物和鸟类的有同样数量。见，Strauss，“人类腺病毒传染”，《腺病毒》，Ginsberg编，Plenum出版社，纽约，NY，451-596页(1984)。该术语优选地应用于两种人类血清型-Ad2和Ad5。
“赘生性细胞”或“瘤”是指显示相对自发生长的细胞，因此显示特征在于细胞增殖控制明显丧失的异常生长表型。赘生性细胞包括可活跃复制的或处于暂时性非复制静止期(G1或G0)的细胞；类似地，赘生性细胞可包括具有充分分化表型、较差分化表型的细胞或这两种细胞的混合物。因此，不是所有的赘生性细胞都是必定在特定时间点复制的细胞。定义为赘生性细胞的组群包括良性肿瘤细胞和恶性(或frank)肿瘤细胞。frank赘生性细胞在此通常被称为癌症或癌细胞、肿瘤或肿瘤细胞，如果来源于内胚层或外胚层组织学来源的细胞，一般称为癌，如果来源于中胚层的细胞型，则称为肉瘤。赘生性细胞的定义中包括缺乏p53功能但不是frank瘤的细胞。见，美国专利号5,677,178。后一种细胞的实例是与巴雷特综合征或粘膜白斑病有关的细胞。
“具有复制能力的腺病毒”或“具有复制能力的突变腺病毒”是指在E1A的RB家族成员结合区中(优选地在E1A-CR2区中)具有突变的腺病毒。感染这种病毒的程度高于休眠细胞的分裂细胞显示一种或多种下列表型特征：(1)晚期基因产物如衣壳蛋白(如腺病毒五邻体基本(base)多肽)或起始于病毒晚期基因启动子的RNA转录物的实际表达，(2)病毒基因组的复制或复制中间体的形成，(3)病毒壳体或包装病毒体颗粒的装配，或(4)感染的细胞中细胞致病作用(CPE)的出现，(5)病毒裂解周期的完成。
“生理条件”或“生理溶液”是指具有与完整哺乳动物细胞或活哺乳动物的组织间隙或器官中的条件基本类似的离子强度、pH和温度的水环境。生理条件一般包括含有约150mM NaCl，pH6.5-7.6，温度约22-37℃的水溶液。生理条件通常是适合于生物大分子分子间结合的结合条件。例如，150mM NaCl，pH7.4，37℃的生理条件通常是合适的。
与“过度增殖”细胞生长有关的疾病是指非癌病症和特征在于不希望的细胞生长如与血管生成有关的内皮细胞生长的再狭窄。与“不受控制的细胞生长”有关的疾病一般分别指良性或转移癌。
“负选择基因或活性剂”是指其蛋白质产物可提高宿主杀伤赘生性细胞的能力的基因。其包括免疫增强剂，或利于前体药物转化为有毒代谢物的酶。
在此根据本领域的常规用法使用化学术语，例如《McGraw-Hill化学术语词典》(Parker，S.编，1985)，McGraw-Hill，San Francisco，在此引用作为参考。
当DNA区功能上彼此相关时称为有效连接。例如，如果一种启动子控制一种编码序列的转录，则其与该序列为有效连接；如果核糖体结合位点允许翻译，则其为与编码序列有效连接。有效连接通常是指邻接的，对于前导序列是指邻接且处于阅读框中的。
复制型腺病毒载体是指能在癌细胞中复制的腺病毒或其突变体。其可包括野生型腺病毒，或，如以下详述的，能在某些类型的癌细胞中，优选地在功能性缺乏一种或多种肿瘤抑制蛋白的癌细胞中选择性复制的腺病毒突变体。
腺病毒中的“E1A RB家族成员结合区”、“RB结合位点突变体”或“RB突变体”是指位于负责结合RB(p105)或其他两种E1A结合蛋白p107和p130的E1A的保守区2(CR2)中的区域。图1显示腺病毒突变体dl922/947、dl1107中存在的特定CR2基因缺失和pm928中的点突变。
在本发明的另一个实施方案中，E1A RB家族成员结合区突变的腺病毒也可表达异源基因产物或负选择剂，它们可能对被感染的细胞有毒。可应用这些活性剂的大量筛选。例如，可将负选择基因掺入所选的腺病毒E1A RB家族成员结合区构件中。一个优选的实施方案是与Ad5 NTdl1110的E2启动子或另一种启动子和/或增强子(例如主要晚期启动子、E1a启动子/增强子、E1b启动子/增强子)有效连接的HSV tk基因盒，其含有一个聚腺苷酸化位点以形成tk表达盒。见，Zjilstra等人(1989)自然342：435；Mansour等人(1988)自然336：348；Johnson等人(1989)科学245：1234；Adair等人(1989)美国国家科学院院刊86：4574；Capecchi，M.(1989)科学244：1288。将tk表达盒(或其他负选择表达盒)插入腺病毒基因组中，例如，代替实际缺失的E3基因。其他负选择基因，包括胞嘧啶脱氨酶，为本领域技术人员所知。见，美国专利号5,358,866。可以认为，与E2启动子有效连接的负选择基因是一个特别优选的实施方案，用于掺入此处公开的E1A RB结合突变体优选地E1A-CR2突变体中。
在另一个实施方案中，其他负选择活性剂包括细胞因子，优选地白细胞介素1-15，更优选地IL-2(美国专利号4,738,927或5,641,665)、白细胞介素7(美国专利号4,965,195或5,328,988)和IL-12(见，PCT/US91/06332或美国专利号5,457,038)，或干扰素，包括γ干扰素(美国专利号4,727,138或4,762,791)。也包括α肿瘤坏死因子(美国专利号4,677,063或5,773,582)或GM-CSF(美国专利号5,393,870或5,391,485)。另外，也能使用免疫调节蛋白，包括巨噬细胞炎性蛋白，包括MIP-3(见，Well，T.N.和Peitsch，MC.，白细胞生物学杂志(J.Leukoc.Biol.)61(5)：545-50页，1997)和细胞自杀，或凋亡诱导蛋白，包括BAD和BAX。见，Yang，E.等人，细胞80，285-291(1995)；和Sandeep，R.等人，细胞91，231-241(1997)。
尽管这些组合物治疗癌症的作用可用一种或多种理论来解释，但应当理解，本发明的腺病毒突变体单独或与化学疗法结合治疗包括癌症在内的过度增殖疾病的机理目前尚不清楚。因此，在讨论或提及这些理论时，应当理解，发明者并不是意图通过权利要求书的这些限制而束缚于这些理论。实际上，重要的是应当指出，本发明的E1A RB家族成员结合区突变腺病毒，尽管其特征在于E1A的RB家族成员结合区中的突变，但其通过目前尚未知的机理发挥生物学活性。
                        腺病毒
值得注意的是，尽管本发明是依照5型腺病毒描述的，但也可用其他类似的腺病毒血清型实施。腺病毒基因组的一般结构在血清型之间是保守的，特定功能的位置相似。此外，腺病毒5基因组登记为Genbank保藏号M73260，该病毒可获自美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，美国，保藏号为VR-5。腺病毒突变体的构建方法在领域中公知。见，Mittal，S.K.，病毒研究(Virus Res.)1993，28，67-90。Hanke，T.等人(1990)病毒学(Virology)177，437-444和Bett，A.J.等人，(1993)病毒学杂志(J.Virol.)67，5911-5921和PCT/CA96/00375中叙述了用来构建腺病毒突变体的某些材料与方法。位于加拿大安大略湖多伦多市Bering大街341号的Microbix Biosystems Inc.出售许多用于构建腺病毒突变体的材料，并提供关于如何制备的产品信息表。E1A RB家族成员结合区中的突变在本领域中周知，易于用包括PCR在内的标准诱变技术产生。
        E1A突变腺病毒的性质-复制与致细胞病变性
DNA肿瘤病毒如腺病毒能感染静息细胞并由于诱导进入S期而在其中复制。从G1期进入S期跟随于早期病毒基因产物对RB和有关细胞蛋白质的抑制性结合之后。见，Whyte，P.，Williamson，N.和Harlow，E.，细胞56，67-75(1989)；Moran，E.，Zerler，B.，Harison，T.和Mathews，M.，分子与细胞生物学(Molecular and Cellular Biology)6，3470-3480(1986)。
E1A蛋白保守区2的氨基酸121-127有助于腺病毒对RB(及p107、p130，以下详述)的结合与灭活。见，Moran，E.，Zerler，B.，Harison，T.和Mathews，M.，分子与细胞生物学6，3470-3480(1986)；Whyte，P.，Ruley，H.和Harlow，E.，病毒学杂志62，257-265(1988)。该区域内的突变导致E1A转化的丧失，但不抑制其反式激活功能。见，Moran，E.，Zerler，B.，Harison，T.和Mathews，M.，分子与细胞生物学6，3470-3480(1986)；Whyte，P.，Ruley，H.和Harlow，E.，病毒学杂志62，257-265(1988)；Jelsma，T.等人，病毒学171，120-130(1989)。
在本发明的一个实施方案中，描述了腺病毒E1A RB结合位点突变体，其在静止的正常细胞中的复制能力降低，但在癌细胞和增殖的正常细胞中(重要地包括微血管内皮细胞中)显示有增强的复制。因此，在分裂细胞与静息细胞的混合群体中，病毒复制基本上杀死分裂的细胞而对静息细胞有很小的作用。在实施例所述的实验中，显然，与野生型腺病毒相比，在E1A的RB家族成员结合区中含有突变的病毒在静止的正常细胞中显示显著降低的复制和致细胞病变性。相反，令人惊讶的是，在癌细胞和增殖的正常细胞包括微血管内皮细胞中，E1A RB家族成员结合位点突变病毒的复制和致细胞病变性高于野生型腺病毒。以下所述是关于本发明的腺病毒突变体在分裂的或静止的不同细胞型中的这些性质-复制和致细胞病变性的更详细描述。
在以下特别是在实施例中详述的本发明集中于应用三种腺病毒突变体的实验的结果，这些突变体在病毒的E1A RB家族成员结合区-保守区2(CR2)中具有充分表征的突变。这些病毒被命名为：dl1107、dl922/947和pm928。
野生型腺病毒的CR2区可结合三种细胞蛋白质：p130、p107和p105。p105对应于RB。其他人以前的研究(见，Barbeau，D.等人，癌基因(Oncogene)9，359-373(1994))和我们未发表的发现说明了腺病毒突变体dl1107、dl922/947和pm928的E1A CR2区中的突变对与这些细胞蛋白质结合的影响。dl1107所编码的E1A实际上只与p107结合，而dl922/947和pm928所编码的E1A显示不与这三种细胞蛋白质中的任一种结合，或几乎不结合。因此，以下所示的结果似乎适用于在此处被称为E1A RB结合位点区的区域中至少含有一种突变的腺病毒突变体。相对于野生型的E1A-CR2突变腺病毒体外复制
在本发明的一个实施方案中，在病毒的E1A RB家族成员结合区中，优选地在E1A RB结合保守区2(CR2)中具有充分表征的突变的腺病毒突变体可在多种正常细胞和癌细胞中复制(图2)。更优选地，一种这样的腺病毒E1A-CR2 RB结合位点突变体-dl922/947在静止的非无限增殖化人微血管内皮细胞(MVEC)中不能复制到高于输入效价的效价。相反，如实施例中所详述，这些E1A RB结合位点突变病毒在活跃增殖的MVEC中复制明显好于野生型腺病毒。
此外，测定了这些E1A RB家族成员结合突变腺病毒在具有突变RB表达(C33A，子宫颈)或正常RB表达(HLaC，喉)的人肿瘤细胞中的复制。E1A RB结合位点突变病毒在这两种肿瘤细胞系中的复制好于野生型腺病毒。在具有正常RB表达的A549癌细胞中获得了相似的结果。
            在RB＋细胞系中的细胞致病变作用
在本发明的第二个实施方案中，与野生型腺病毒相比，在病毒的E1ARB家族成员结合区中，优选地在E1A RB结合位点保守区2(CR2)中具有充分表征的突变的腺病毒突变体，显示针对所测全部肿瘤细胞系的更强的致细胞病变性，包括具有正常RB表达的细胞(HLaC、RKO、H1299、U2OS和A549)，和具有异常RB表达的细胞(C33A、H2009)(图3)。野生型腺病毒破坏50％细胞单层所需的病毒剂量可比E1A-CR2RB结合位点突变体dl1107或dl922/947高10倍。类似地，增殖的MVEC、小呼吸道上皮细胞(SAEC)和乳房上皮细胞对E1A-CR2突变体的CPE比对野生型病毒更敏感。野生型RB蛋白的存在似乎影响CPE结果。例如，比野生型腺病毒更高的E1A-CR2 RB家族成员结合突变体的致细胞病变性在具有正常RB表达的细胞中最高。相反，静止的MVEC和乳房上皮细胞(MEC)对E1A RB结合突变病毒比对野生型腺病毒更不敏感。
            E1A突变体显示增强的对肿瘤的体内作用
在本发明的另一个实施方案中，E1A RB家族成员结合位点突变病毒，优选地E1A-CR2 RB突变体，具有比野生型腺病毒可见更高的或相当的体内抗肿瘤活性(图4)。
如实施例所述，用无胸腺小鼠中的人肿瘤异种移植物测定抗肿瘤作用。例如，注射E1A-CR2 RB家族成员结合位点突变病毒的荷结肠癌的动物具有80天的存活中值，而野生型腺病毒处理组为35天，载体对照组为25天。实施例中列出了其他结果。
与野生型病毒相比，E1A突变体在静止的正常细胞中显示降低的体
                内复制和毒性
棉鼠是人腺病毒的一种允许的宿主(见，Ginsberg，H.S.等人，美国国家科学院院刊86，3823-3827(1989))，其肺是研究腺病毒体内复制和病理学的一种确定的模型。见，Prince，G.A.等人，病毒学杂志67，101-111(1993)；Ginsberg，H.S.和Prince，GA.，传染物与疾病(Infectagents Dis)3，1-8(1994)。因此，在棉鼠中进行实验，以证实静止的正常细胞对E1A RB家族成员结合位点突变病毒相对于野生型腺病毒的实际抗性。感染E1A RB结合位点突变病毒的肺的原位杂交证明，在一例中没有复制，在其他动物中只有低水平复制。相反，感染野生型腺病毒的肺的原位杂交证明在所有动物中均有较高水平的复制。野生型腺病毒在整个细支气管上皮和肺实质中广泛感染细胞，而E1A RB家族成员突变病毒复制只限于分离的细支气管上皮细胞。实施例中详细列出了这些结果。
因此，总之，本发明优选的实施方案是腺病毒E1A RB家族成员结合突变体，更优选的是腺病毒E1A-CR2 RB家族成员突变体，其在E1A的RB家族成员结合区中突变。这些病毒在静止的正常细胞中显示降低的复制，而在癌细胞和增殖的内皮细胞中复制和致细胞病变性高于野生型腺病毒。
相对于野生型腺病毒，E1A-CR2 RB结合位点突变体在增殖细胞中提高的复制和致细胞病变性是出人意料的。实际上，已知几种腺病毒和疱疹病毒突变体已被遗传学减毒以实现在肿瘤细胞中的选择性复制。见，Heise，C.等人，自然杂志医药分册(Nat.Med.)3，639-645(1997)；BischoffJ.R.等人，科学274，373-376(1996)；Martuza，R.L.等人，科学252，854-856(1991)；Mineta，T.，自然杂志医药分册1，938-943(1995)。甚至在肿瘤细胞中这些减毒病毒的每一种均比其野生型亲代病毒复制效率更低。见，Bischoff，J.R.等人，科学274，373-376(1996)；Martuza，R.L.等人，科学252，854-856(1991)；Kirn，D.H.，试验药物专家观点(ExpertOpinion on Investigational Drugs)5，753-762(1996)。在某些情况中，复制可能比野生型病毒降低10-100倍。见，Martuza，R.L.等人，科学252，854-856(1991)。这可能是由于可增强复制的重要病毒功能的丧失。E1A-CR2 RB结合突变体相对于野生型腺病毒增强的复制的原因未知。
本领域技术人员应当明白，此处公开的E1A RB结合位点突变体，优选地E1A-CR2 RB结合位点突变体，在分裂细胞和休眠细胞之间，或更具体而言，在肿瘤细胞和增殖的微血管内皮细胞与静止的微血管内皮细胞之间具有较高的疗效指数。
因此可进一步理解，本发明的这一优选实施方案能有利地用于直接通过此处的腺病毒复制和细胞致病作用充分且选择性地杀伤分裂的肿瘤细胞。用腺病毒E1A RB结合位点突变体消除形成的血管可增强该作用。两种抗肿瘤作用都伴随有对正常静息细胞的最小杀伤。
                    制剂/施用
此处所述的腺病毒突变体可为了向患者治疗和诊断施用而配制。对于治疗或预防应用，向病人或兽医非人类患者施用含有药理有效剂量的腺病毒的无菌组合物，例如用于肿瘤疾病的治疗。该组合物通常在水悬液中含有约103-1015个或更多的腺病毒颗粒。在这种无菌组合物中常使用药学可接受的载体或赋形剂。也能使用多种水溶液，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的，且除需要的腺病毒载体外通常不含颗粒性物质。这些组合物可含有为接近生理条件所需的药学可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。也可包含增强腺病毒感染细胞的赋形剂，优选的是聚阳离子。
也可通过脂质体或免疫脂质体递送向赘生性细胞递送本发明的腺病毒或其中所含的DNA，这种递送可根据赘生性细胞群中存在的细胞表面性质(例如，在免疫脂质体中存在可结合免疫球蛋白的细胞表面蛋白)选择性定向赘生性细胞。含有病毒体的水悬液一般包封于脂质体或免疫脂质体中。例如，腺病毒病毒体的悬液能通过常规方法包封于微团中形成免疫脂质体(美国专利5,043,164、美国专利4,957,735、美国专利4,925,661；Connor和Huang(1985)细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)101：582；Lasic DD(1992)自然355：279；《新型药物施用》(Prescott LF和Nimmo WS编，Wiley，纽约，1989)；Reddy等人(1992)免疫学杂志(J.Immunol.)148：1585)。含有一种可特异结合个体癌细胞上存在的癌细胞抗原(例如CALLA、CEA)的抗体的免疫脂质体可用于将病毒体或病毒体DNA导向这些细胞。
能为了肿瘤病的预防和/或治疗施用含有这些腺病毒或其混合物(cocktail)的组合物。在治疗应用中，以足以治愈或至少部分缓解病情及其并发症的量，对已患有特定肿瘤病的患者施用这些组合物。足以实现这一点的量被称为“治疗有效剂量”或“有效剂量”。对该应用有效的量取决于病情的严重程度、患者的综合状况和施用途径。能以治疗医生选择的剂量水平和方式进行组合物的单次或多次施用。在任何情况下，药物制剂都应提供足以有效治疗患者的量的本发明的E1A RB家族成员结合突变腺病毒。
在预防应用中，向尚未处于肿瘤病状态的患者施用含有本发明的腺病毒或其混合物的组合物，以提高患者对癌症复发的抵抗力或延长缓解时间。这一量被称为“预防有效剂量”。在该应用中，精确的量也取决于患者的健康状况和总体免疫水平。
本发明的腺病毒治疗可与其他抗肿瘤方法如常规化学疗法或与其他病毒结合。见，1997年10月14日颁布的美国专利号5,677,178。可用技术人员周知的方法施行化学治疗，包括系统地向癌中直接注射，或通过将希望的化疗剂与适当的缓释材料相结合定位于癌症部位，或动脉内灌注肿瘤。优选的化疗剂是顺铂，优选的剂量可由医生根据所治疗的癌症的情况及在施用顺铂中常需考虑的其他因素选择。优选地，顺铂将以50-120mg/m2的剂量静脉内施用超过3-6小时。更优选地，以80mg/m2的剂量静脉内施用超过4小时。第二种化疗剂是5-氟尿嘧啶，其优选地与顺铂一起施用。5-氟尿嘧啶的优选的剂量是每天800-1200mg/m2，连续5天。
利用本发明的腺病毒的腺病毒治疗可与其他抗肿瘤方法如基因治疗结合。见，美国专利号5,648,478。如上所述，本发明中使用的腺病毒构件显示特异的癌细胞杀伤，优选地是由于组织特异性启动子引导的前体药物激活基因的表达。见，美国专利号5,631,236。
另外，如果本发明的腺病毒突变体引发可削弱其在宿主动物中作用的免疫应答，它们能与适当的免疫抑制药物一起施用来使其作用达到最大。另外，有多种方法能修饰腺病毒的蛋白质外壳，产生免疫原性更低的病毒。见，PCT/US98/05033。据显示，能遗传改造腺病毒外壳的主要免疫原性成分-六邻体蛋白，使其免疫原性降低。实现方法是通过用六邻体蛋白中通常不存在的氨基酸序列替换正常的病毒六邻体蛋白表位而产生嵌合六邻体蛋白。这些腺病毒构件比野生型病毒免疫原性更低。
为了提高本发明的腺病毒E1A突变构件的效能，可修饰它们使之显示提高的对特定肿瘤细胞型的趋向性。例如，如PCT/US98/04964所示，可修饰腺病毒外壳上的一种蛋白质，使之展现一种化学剂，优选地一种多肽，其以高于正常细胞的程度与肿瘤细胞上存在的受体结合。参见，美国专利号5,770,442和美国专利号5,712,136。此多肽可以是抗体，优选地是单链抗体。
                腺病毒突变体的纯化
腺病毒用多种技术常规纯化，包括使用超速离心的氯化铯显带。但是，对于腺病毒的大规模生产，比氯化铯超速离心有更高产量的方法是希望的，且包括一个或多个层析步骤。优选的方法利用离子交换层析。见，例如，PCR/US97/21504；和Huyghe等人，人类基因治疗(Human GeneTherapy)6：1403-1416(1996)。
下列实施例可认为是本发明的实例，但本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下可对这些实施方案进行许多修改和改变。
                    实施例1
    腺病毒E1A-CR2 RB家族成员结合突变体的致细胞病变性
用三种突变体检测腺病毒E1A-CR2 RB家族成员结合突变体的致细胞病变性。dl922/947具有氨基酸122-129的缺失{见，Whyte，P.，Ruley，H.和Harlow，E.，病毒学杂志62，257-265(1988))，而dl1107具有氨基酸111-123的缺失{见，Jelsma，T.等人，病毒学171，120-130(1989)}。pm928具有可使氨基酸124由半胱氨酸转变为甘氨酸的点突变。见，Moran，E.等人，分子与细胞生物学6，3470-3480(1986)。dl922/947和pm928都有转化缺陷，尽管有正常的E1A表达水平。Ad5和野生型D用作野生型腺病毒对照；这些病毒除了野生型D的E3区的缺失外几乎相同。见，Barker，D.D.等人，病毒学156，107-121(1987)。
为了用增殖的细胞测定，使细胞生长至70％汇合(2％FBS)，此时以0.001-10的感染复数(MOI)感染细胞。测定进行5天。此时平板a)用结晶紫染色并照相，或b)用硫代罗丹明B(SRB)染色并用比色测定法检测。SRB测定法以前已有描述。见，Skehan，P.等人，美国癌症研究协会学报(Proc Am Assoc Cancer Res)30，2436(1989)。简言之，将细胞一式四份接种于96孔板中，使之粘附6小时。向测试孔中加入系列连续稀释的病毒，并在5％CO2的湿润培养箱中37℃温育这些平板。在感染后适当的一天，通过加入三氯乙酸至终浓度为10％，并在4℃下保持最少1小时，来终止试验。然后用去离子水洗涤平板，并使之风干。平板上残留的细胞用0.2％的SRB 1％乙酸溶液在室温下染色20分钟，用1％乙酸洗涤，并风干。在摇床上用10mM无缓冲的Tris碱溶解结合的染料5-10分钟。在读板机上读取515nm处的吸光度。以测试孔的光密度(O.D.)除以模拟对照的O.D.计算百分对照值，并对病毒的感染复数(MOI)作图。待生长至完全汇合并随后在0.2％FBS中生长后使正常细胞静止。在每次测定前通过细胞周期分析和细胞计数证实静止。
在致细胞病变性测定中使用下列肿瘤细胞型，它们从ATCC获得：非小细胞肺癌(A549，H2009，H1299)、结肠癌(RKO)、子宫颈癌(C33A)和喉癌(HLaC)。细胞如前所述培养。见，Bischoff，J.R.等人，科学274，373-376(1996)。表达人乳头瘤病毒E7基因的RKO人结肠癌细胞(RKO-RC7.14)从John’s Hopkins大学的Kathy Cho博士处获得。
结果表明，与野生型腺病毒相比，dl922/947和dl1107都能引起对所测所有肿瘤细胞系提高的致细胞病变性，包括具有正常RB表达的细胞(HLaC、RKO、H1299、U2OS和A549)，和具有异常RB表达的细胞(C33A、H2009)(图3)。利用定量硫代罗丹明B测定(SRB)，野生型腺病毒破坏50％单层所需的病毒剂量可比dl1107高10倍。类似地，增殖的MVEC、小呼吸道上皮细胞(SAEC)和MEC(可从Clonetics，SanDiego，CA获得)对E1A-CR2结合位点突变体的CPE比对野生型病毒更敏感。点突变体pm928的CPE诱导率居于两种E1A-CR2 RB结合位点缺失突变体和野生型腺病毒之间。有趣的是，野生型RB蛋白的存在似乎影响CPE结果；比野生型腺病毒更高的E1A-CR2 RB结合位点突变体的致细胞病变性在具有正常RB表达的细胞中最高。相反，静止的MVEC和MEC对E1A突变病毒比对野生型腺病毒更不敏感。
因此，这些数据显然支持腺病毒E1A-CR2 RB家族成员结合位点突变体直接杀伤肿瘤细胞，或通过破坏其下的血管营养内皮细胞支持结构杀伤肿瘤细胞的应用。
                    实施例2
    腺病毒E1A-CR2RB家族成员结合位点突变体的复制
病毒复制试验如前所述进行。见，Bischoff，J.R.等人，科学274，373-376(1996)。简言之，如实施例1中对于细胞致病作用测定所述培养细胞，并以10的MOI用每种病毒感染。48小时后，收集细胞和上清液进行病毒滴定分析。细胞裂解物进行3个循环的冻融，随后在超声波水浴中30秒脉冲。对HEK293细胞(表达Ad2的E1区的人胚胎肾细胞)滴定连续稀释的上清液和裂解物。
dl922/947在静止的非无限增殖化人微血管内皮细胞(MVEC)中不能复制到高于输入效价的效价(图2)。相反，两种E1A突变病毒-dl922/947和pm928在活跃增殖的MVEC中复制明显好于野生型腺病毒。用静止的和增殖的人乳房上皮细胞获得类似的结果(数据未显示)。dl922/947的复制在增殖的内皮细胞中比在不增殖的内皮细胞中提高接近25倍(7×107比2.6×106pfu/ml)，对于野生型腺病毒为2倍差异(4×107比2×107pfu/ml)。
我们然后检测了这些病毒在具有突变RB表达(C33A，子宫颈)或正常RB表达(HLaC，喉)的人肿瘤细胞中的复制。三种E1A RB结合突变病毒在这两种肿瘤细胞系中复制好于野生型腺病毒。在A549癌细胞(正常RB表达)中获得相似的结果。
                    实施例3腺病毒E1A-CR2RB家族成员结合位点突变体在裸鼠-人肿瘤异种移植模
              型中显示增强的作用
我们检测了dl922/947、pm928和野生型腺病毒对无胸腺小鼠中人肿瘤异种移植物的抗肿瘤作用。4-6周龄的雌性无胸腺小鼠(Hsd：无胸腺裸鼠-nu)从Harlan Sprague-Dawley公司获得，并在研究前隔离至少两周。在6-8周龄小鼠的胁腹中皮下注射RKO-RC 7.14或HLaC人癌细胞(2×106个细胞)。当肿瘤生长至最大直径为5-7mm时，如下进行直接肿瘤内施用。
连续5天每天向肿瘤直接注射悬浮于60μl PBS中的108pfu的病毒(每组n＝6-13)。载体处理的对照肿瘤以相同方式只接受PBS。每周两次测定肿瘤大小，直到动物被处死(肿瘤体积＞1cm3或处理后90天)。向肿瘤细胞注射E1A-CR2 RB结合位点突变体(pm928或dl922/947)、野生型腺病毒或载体。注射dl922/947的荷结肠瘤动物具有80天的存活中值，而野生型腺病毒处理组为35天，载体对照组为25天(dl922/947对野生型，p＝0.04)(图4，A图)。用dl922/947或野生型腺病毒处理的荷HLaC瘤动物的存活中值未达到处理后90天(分别有80％和70％仍存活)；载体对照组的存活中值为30天(图4，B图)。在12个用dl922/947处理的HLaC肿瘤的8个中，13个用pm928处理的5个中，7个用野生型腺病毒处理的3个中发生完全的肿瘤消退，而在8个注射载体的肿瘤中未有发生。完全肿瘤消退的小鼠在研究结束时(90天)未证实有肿瘤复发。在用E1A-CR2RB家族成员结合位点突变体处理70天后收获的肿瘤中含有具活跃复制的病毒的细胞，这可用对于腺病毒DNA的原位杂交检测。在C33A肿瘤异种移植物中也有相似的存活和反应数据(数据未显示)。
对福尔马林固定、石蜡包埋的组织进行原位杂交，并切成5μm的切片。将载玻片在二甲苯中脱蜡，用乙醇水合，用蛋白酶K消化，并在4％低聚甲醛中后固定。用0.5μg/ml生物素化的腺病毒DNA探针(EnzoDiagnostics，Inc.Farmingdale，NY)在37℃下杂交过夜。在55℃下用1×SSC连续洗涤3次后，加入碱性磷酸酶偶联的抗生物素抗体(VectorLaboratories)。NBT/BCIP用作发色团，载玻片用核坚牢红复染。
                    实施例4与野生型病毒相比，E1A-CR2RB家族成员突变体在静止的棉鼠肺细胞
            中显示降低的复制和毒性
棉鼠是人腺病毒的一种允许的宿主。见，Ginsberg，H.S.等人，美国国家科学院院刊86，3823-3827(1989)。其肺是研究腺病毒体内复制和病理学的一种确定的模型。见，Prince，G.A.等人，病毒学杂志67，101-111(1993)；Ginsberg，H.S.和Prince，GA.，传染物与疾病3，1-8(1994)。对棉鼠鼻内接种dl922/947或野生型腺病毒，并在3天或14天后处死(n＝5每组/时点)。在该模型中证实了静止的正常细胞对dl922/947相对于野生型腺病毒而言的相对抗性。
感染dl922/947的肺的原位杂交(如实施例3所述进行)证明在感染后第3天，有一例没有复制，在其他动物中只有低水平复制。相反，感染野生型腺病毒的肺的原位杂交证明在所有动物中均有较高水平的复制。野生型腺病毒在整个细支气管上皮和肺实质中广泛感染细胞，而dl922/947的复制只限于分离的细支气管上皮细胞。在感染3天后和14天后，与野生型感染的肺相比，dl922/947感染的肺中肺泡组织病理学也降低。
如前所述通过鼻内接种用腺病毒感染棉鼠(Sigmodon hispidus)。见，Ginsberg，H.S.等人，美国国家科学院院刊86，3823-3827(1989)；Prince，G.A.等人，病毒学杂志67，101-111(1993)；Ginsberg，H.S.和Prince，G.A.，传染物与疾病3，1-8(1994)。简言之，动物以109pfu鼻内接种(每个处理组n＝5)，并在3天后处死；以前的实验显示，在该动物模型中这是腺病毒复制的高峰期。如上关于原位杂交所述处理肺并切片。
                    实施例6与野生型腺病毒相比，RB结合位点突变体在静止的正常细胞中的S期诱
                导和病毒DNA合成降低
将RB结合位点突变腺病毒dl922/947和dl1107在不增殖的正常细胞中诱导S期的能力与野生型腺病毒对比。在基线时只有10％的非无限增殖化小呼吸道上皮细胞处于S期。用野生型腺病毒感染24小时后(m.o.i.为10)，61％的细胞处于S期；dl1107感染使40％的这些细胞进入S期。然而，dl922/947在诱导S期方面明显效果较差；在24小时后只有26％的细胞处于S期。24小时后在相同试验中通过斑点印迹分析估计病毒DNA的复制。尽管野生型腺病毒和dl1107的病毒DNA产量大致相当，但dl922/947证明的病毒DNA复制显著降低(约为野生型水平的30％；p＜0.05)。
根据以上叙述，本领域的技术人员能容易地认清本发明的基本特征，并能在不背离其精神与范围的情况下，对本发明进行多种改变和修改，使之适用于不同的用途和条件。更具体而言，应当理解，在 中所述的某些试剂和条件可被替换或改变，而产生与所申请专利的相同或相似的结果。所有这些类似的替换或改变被认为属于附加的 书的精神和范围之内。

Claims (28)

1.在含有分裂细胞和静息细胞的细胞群体中，一种充分且选择性地杀伤所述分裂细胞的方法，该方法包括在感染性条件下使该细胞群体接触一种在腺病毒的E1A RB家族成员结合区中含有突变的具有复制能力的腺病毒，并使该腺病毒感染该细胞群体足够的时间。
2.如权利要求1所述的方法，其中该分裂细胞是癌细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中该分裂细胞是内皮细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中该静息细胞是内皮细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中在病毒E1A RB家族成员结合区中的该腺病毒突变位于E1A-CR2区中。
6.如权利要求5所述的方法，其中E1A-CR2区中的突变包括氨基酸122至129中一个或多个的缺失或替换。
7.如权利要求5所述的方法，其中E1A-CR2区中的突变包括氨基酸111至123中一个或多个的缺失或替换。
8.如权利要求5所述的方法，其中该腺病毒是dl922/947。
9.如权利要求5所述的方法，其中该腺病毒是dl1107。
10.如权利要求5所述的方法，其中该腺病毒是pm928。
11.在含有分裂细胞和静息细胞的细胞群体中，一种杀伤所述分裂内皮细胞而基本上不杀伤静息内皮细胞的方法，该方法包括在感染性条件下使该细胞群体接触一种具有复制能力的腺病毒，所述腺病毒在该腺病毒的E1A CR2 RB家族成员结合区中含有突变，并使该突变腺病毒感染该细胞群体足够的时间，其中该突变腺病毒在所述分裂细胞中复制到比野生型腺病毒更高的效价。
12.与含有下列三种细胞型的细胞群体中的静息内皮细胞相比，可充分且选择性地杀伤分裂的内皮细胞和癌细胞的方法，该方法包括在感染性条件下使该细胞群体接触一种具有复制能力的腺病毒，所述腺病毒在该腺病毒的E1A RB家族成员结合区中含有突变，并使该突变腺病毒感染该细胞群体足够的时间。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述分裂的内皮细胞是微血管内皮细胞。
14.如权利要求13所述的方法，其中该腺病毒突变包含E1A-CR2区中的突变。
15.一种通过杀伤分裂的微血管内皮细胞控制动物中血管生成的方法，其包括对需要这种控制的动物施用一种具有复制能力的腺病毒，所述腺病毒在该腺病毒的E1A RB家族成员结合区中含有突变，并使该突变腺病毒感染该内皮细胞足够的时间。
16.如权利要求15所述的方法，其中该腺病毒的E1A RB家族成员结合区位于E1A-CR2区中。
17.如权利要求16所述的方法，其中E1A-CR2区中的突变包括氨基酸122至129中一个或多个的缺失或替换。
18.如权利要求16所述的方法，其中E1A-CR2区中的突变包括氨基酸111至123中一个或多个的缺失或替换。
19.如权利要求16所述的方法，其中该腺病毒是dl922/947。
20.如权利要求16所述的方法，其中该腺病毒是dl1107。
21.一种药用组合物，其含有溶于生理溶液的Rb结合位点腺病毒突变体。
22.如权利要求21所述的药用组合物，其中该腺病毒突变体是dl922/947。
23.如权利要求21所述的药用组合物，其中该腺病毒突变体是dl1107。
24.如权利要求21所述的药用组合物，其中该腺病毒突变体是pm928。
25.一种含有Rb结合位点腺病毒突变体的组合物，所述突变体带有与启动子有效连接的负选择活性剂。
26.如权利要求25所述的组合物，其中该突变体是dl922/947。
27.如权利要求25所述的组合物，其中该突变体是dl1107。
28.如权利要求25所述的组合物，其中该突变体是pm928。
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