JP4225577B2 - 新形成の治療及び予防のための細胞変性ウイルス - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、新生物哺乳動物細胞において後期領域遺伝子の複製及び／又は発現を行うことができるが、非新生物細胞において本質的に複製できない組換え細胞変性ウイルスの組成物、これら組換えウイルスを作製し及び増殖させるための方法、これら組換えウイルスで新生物病を治療するための方法、並びにこれら組換えウイルスを含む治療用組成物を供する。
背景
正常な細胞の増殖は、増殖抑制腫瘍抑制遺伝子と釣り合う増殖促進プロトオンコジーンにより制御されると考えられる。プロトオンコジーンの活性を強化する変異は新生物細胞の増殖を強化するオンコジーンを作り出す。逆に、一般に不活性化腫瘍サプレッサー対立遺伝子についてホモ接合である細胞を導く変異による、腫瘍サプレッサー遺伝子を不活性化する遺伝子障害は、これらの遺伝子により課せられる正常な複製制限から細胞を解放し得る。通常、活性化オンコジーン（即ち活性化構造又は制御変異を含むプロトオンコジーン）の形成と組み合わされた不活性化腫瘍サプレッサー遺伝子（例えばｐ53，RB，DCC，NF-1）は、本質的に非制限性の増殖を行うことができる新生物細胞（即ち形質転換細胞）を作り出し得る。
細胞のオンコジーンの形質転換は、細胞の代謝、生理及び形態にいくつかの変化を導く。オンコジーンを形質転換された細胞の１つの特徴的な変化は細胞増殖制御遺伝子の適切な発現により正常に行われる細胞増殖及び分化への制限に対する応答の喪失である。
遺伝子変化の異なる型の全てが細胞増殖制御遺伝子の発現又は機能を変化させ、異常な増殖を導くが、正常な細胞の悪性のものへの新生物形質転換を導くために１超の出来事が要求される（Landら（1983）Nature 304：596；Weinberg RA（1989）Cancer Res. 49：3713）。ほとんどの細胞型について悪性形質転換を導く正確な分子の経路及び二次的変化は明らかでない。細胞周期制御機能を有するいくつかのタンパク質及び／又は機能的な転写複合体、例えばｐ53及びRBの形成に関連するいくつかのタンパク質の発現又は活性を変えることは、細胞において増殖制御を失わせ得る（Ullrichら（1992）J.Biol.Chem. 267：15259；Hollsteinら（1991）Science 253：49；Sager R（1992）Curr.Opin.Cell.Biol. 4：155；Levineら（1991）Nature 351：453）。
いくつかのオンコジーンが特定の癌の重要な画分において特徴的な活性化変異を有することが見い出されている。例えば、ras H 及びrasKコーディング領域（例えばコドン12、コドン61；Paradaら（1984）Nature 312：649）並びにAPC遺伝子（Powellら（1992）Nature 359：235）における特定の変異は培養細胞のオンコジーンの形質転換に関連し、著しい割合の特定のヒトの癌に存在する（例えば結腸腺癌、膀胱癌、肺癌及び腺癌、肝臓癌）。これらの発見は、このようなオンコジーンの活性化形態を特異的に認識する診断及び治療剤（例えばポリヌクレオチドプローブ及び抗体）の開発を導いた（米国特許4,798,787号及び4,762,706号）。
他のオンコジーン、例えばmyc，erbB-2及びpim-1の過剰な又は不適切な発現は、そのコーディング領域において活性化変異の存在を必ずしも要求することなくオンコジーンの形質転換を強化することができるようである。erbB-2の過剰発現は前胸部、胃、及び卵巣の腺癌において頻繁に見い出され、これらの細胞型におけるerbB-2レベルは新形成のための診断マーカーとして機能し得るであろうし、及び／又は特定の腫瘍表現型（例えば特定の薬剤、増殖率、分化状態）と相関し得るであろう。
種々のオンコジーン（米国特許4,736,866及び米国特許5,087,571）又は機能的に破壊されたサプレッサー遺伝子Donehowerら（1992）Nature 356：215）を有するトランスジェニック動物が、他の潜在的な使用の中でも発癌物質スクリーニングアッセイにおける使用について記載されている。
この形質転換された表現型及び新形成の基となる分子メカニズムのより規定されたモデルを開発することの進行にかかわらず、結果の出る慣用的な化学療法を超える癌を治療するのに適用できる有用な治療方法はほとんどない。多くの慣用的な化学療法剤は、低い治療示数を有し、治療投与レベルは毒性である投与レベルであるか又はそれに近い。ほとんどの慣用的な化学療法剤の毒性の副作用は喜ばしくなく、他の副作用の中でも生命をおびやかす骨髄抑制を導く。
先天性の病気、例えば嚢胞性繊維症を引きおこす欠損対立遺伝子を正す又はそれを補給するために遺伝子療法を行うための現在のアプローチは、限られた最初の成功例の報告と共に試みられてきた。いくつかの遺伝子治療アプローチは、複製欠損組換えアデノウイルスを用いて、欠損対立遺伝子の機能的複製を発現することができるポリヌクレオチド配列を生体内の細胞に形質導入することに関する（Rosenfeldら（1992）Cell 68：143）。これらの遺伝子療法のいくつかはポリヌクレオチドを、患者から外植された単離された細胞に形質導入することにおいて効能があるが、生体内で極めて効能があることが示されていない。腫瘍壊死因子（TNF）及びインターロイキン−２（IL-2）をコードするポリヌクレオチドでの外植された腫瘍細胞の形質導入に依存する癌への治療的試みが記述されている（Pardoll D（1992）Curr.Opin.Oncol. 4：1124）。
遺伝子療法が、生体内の形質転換された細胞においてオンコジーン又は腫瘍サプレッサー遺伝子の欠損対立遺伝子を正すのに適合することが可能であるといつか判明するかもしれないが、現在の遺伝子療法は、その場で新形成の実際の遺伝子療法のための十分な割合の新生物細胞を（例えば相同的組換えにより）有効に形質導入し、及び正確に標的化することができると報告されていない。癌の生物学の性質は、新生物細胞の実質的な画分、好ましくは形質転換された細胞のクローン化子孫の全てが有効な治療効果のために除去されることを要求する。更に、遺伝子療法のための現在の方法は極めて高価であり、患者への再導入の前に外植された細胞の生体外培養を要求する。このような方法の広範囲の適用は、それらが有効であるとしても、禁止的に高価であろう。
これにより、新形成病の診断及び治療のための方法及び組成物、特に慣用的な抗新生物化学療法の典型である非新生物細胞の不必要な殺害なく新生物細胞を選択的に排除する方法についての必要性が当該技術においてある。
本明細書で議論される引例は、もっぱら本出願の出願日前のそれらの開示のために供される。本発明者らが、先行技術の発明に関してそれらの開示に先立つ資格はないという許可として本明細書で解釈されるべきものはない。
発明の概要
本発明は、非新生物細胞において実質的に複製欠損であり、新生物細胞において少くとも部分的に複製表現型を示す組換えアデノウイルスを、新生物細胞に感染させることにより、新生物細胞を排除するためのいくつかの新規な方法及び組成物を供する。新生物及び非新生物細胞における本発明のアデノウイルス構成物の複製表現型の差は、癌のウイルスベースの治療についての生物学的基礎を供する、アデノウイルスの細胞変性効果の発現、及び負−選択性薬剤遺伝子（例えばHSV tk）の任意の発現は、本発明の組換えアデノウイルス構成物が感染した新生物細胞の特徴的なアデノウイルス複製表現型と相関し、これにより新生物細胞と非新生物細胞とを識別し、新生物細胞の選択的な毒性を供する。本方法は特にアデノウイルス構成物について詳述されるが、本方法は、有効な複製が非新生物細胞中に存在するが、新生物細胞中に実質的に欠如し又は非機能的である宿主細胞タンパク質（例えばｐ53，RB）の結合及び／又は隔離及び／又は不活性化を要求する。
アデノウイルスが細胞内で有効に複製するために、アデノウイルスE1b遺伝子産物ｐ55は宿主細胞ｐ53タンパク質との複合体を形成し、それによりｐ53を隔離及び／又は不活性化し、ｐ53機能が欠損した細胞を作り出す。このように作られたｐ53機能が欠損した細胞はアデノウイルスの複製を支持し得る。この方法において、野生型アデノウイルスは、アデノウイルスｐ55タンパク質が宿主細胞ｐ53タンパク質を不活性化及び／又は隔離するので、ｐ53を含む細胞において複製することができる。本発明の一実施形態において、感染した細胞において実質的にｐ53タンパク質との機能的複合体を形成することができない変異ｐ55タンパク質をコードするE1b座を含む組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスによって感染され得る新生物細胞を含む個体又は細胞集団に投与される。組換えアデノウイルスが感染した非新生物細胞においてｐ53タンパク質を実質的に有効に隔離できないことは、形質導入された組換えアデノウイルスポリヌクレオチドが非新生物細胞において複製表現型を発現できないことになる。対照的に、機能的ｐ53タンパク質を欠く新生物細胞は、アデノウイルスの細胞毒性効果及び／又は複製表現型につながる負の選択遺伝子の発現により新生物細胞の除去を導く形質導入された組換えアデノウイルスによる複製表現型の発現を支持する。これらの実施形態の好ましいバリエーションにおいて、組換えアデノウイルスは、実質的にｐ53に結合できない変異ｐ55をコードするE1b座を含み、任意に、（E1aポリペプチドの存在下でアデノウイルス初期領域遺伝子の発現を阻害することができない）機能的なｐ19タンパク質も欠如し得る。本発明の組換えアデノウイルスは、増強された細胞変性効果を作り出す変異ｐ19遺伝子を更に含み得る；当該技術で周知のこのような変異体はp19 cyt変異体遺伝子である。しかしながら、感染の間のウイルスDNAの一体性を維持するためにいくつかの変異体において機能的ｐ19を保持することが好ましい。
他の本発明の実施形態において、感染した細胞においてRBタンパク質との複合体を形成することが実質的にできないE1aタンパク質（例えばp289R又はp243R）をコードするE1a座を含む組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスにより感染され得る新生物細胞を含む個体又は細胞集団に投与される。組換えアデノウイルスが感染した非新生物細胞においてRBタンパク質を実質的に有効に隔離できないことは、形質導入された組換えアデノウイルスポリヌクレオチドが非新生物細胞において複製表現型を発現できないことになる。対照的に、機能的なRBタンパク質を欠如する新生物細胞は、アデノウイルス細胞変性効果及び／又は複製表現型につながった負の選択遺伝子の発現により新生物細胞の排除を導く形質導入された組換えアデノウイルスにより複製表現型の発現を支持する。これらの実施形態の好ましいバリエーションにおいて、組換えアデノウイルスは、RB（及び／又は300kDポリペプチド及び／又は107kDポリペプチド）に結合することができるCR１及び／又はCR２ドメインを欠如するが、アデノウイルス初期遺伝子のトランスアクチベーションを行うことができる機能的CR３ドメインを含む変異E1aタンパク質（例えばp289R）をコードするE1a座を含む。これらの実施形態の更なるバリエーションは、結合してRBを不活性化するタンパク質を実質的に発現することができない非機能的E1a座を含み、そして任意に、（E1a機能の欠如下でアデノウイルス初期領域遺伝子の発現を刺激することができきる）機能的ｐ19タンパク質も含み得る。本発明の組換えアデノウイルスは、増強された細胞変性効果を作り出す変異ｐ19遺伝子を更に含み得；このような当該技術で周知の変異体はp19 cyt変異遺伝子である。
本発明は、非新生物細胞中で複製欠損であるが、機能的ｐ53及び／又はRBを欠く新生物細胞中で複製表現型を発現することができる新規の組換えアデノウイルス構成物を供する。新規な組換えアデノウイルス構成物は、E1a及び／又はE1b遺伝子領域中に、特にE1b p55タンパク質並びにE1a p289R又はp243Rタンパク質のCR１及びCR２ドメインをコードする配列中に、欠失又は点変異のような変異を含む。特定の実施形態において、負の選択遺伝子、例えばHSV tk遺伝子は負の選択遺伝子が複製表現型を発現する感染した細胞（即ち新生物細胞）において優先的に転写されるように、E1a又はE1b変異も含み組換えアデノウイルス構成物において、初期領域（例えばＥ２，E1a，E1b）エンハンサー／プロモーター、後期領域遺伝子エンハンサー／プロモーター（例えば主要後期プロモーター）、又はCMVエンハンサーを伴う初期もしくは後期領域プロモーターに作用可能に連結され、有効量の負の選択剤（例えばガンシクロビル、FIAV）の投与により細胞の負の選択を供する。負の選択遺伝子は、E1a(-)複製欠損変異体、E1b(-)複製欠損変異体、又はE1a／E1b二重変異体を各々同時に形成するために、E1a及び／又はE1b構造配列の場所に挿入され得る。
生体内の新生物細胞集団へのデリバリーのための医薬として許容される形態において上述の組換えアデノウイルスを含む抗新生物組成物も供する。
本発明は、ｐ53及び／又はRBに結合し及び／又はそれらを不活性化するための機能的タンパク質を欠如する組換えパポーバウイルス、例えばヒトパピローマウイルス（HPV）、ポリオーマウイルス（例えばBK，JC）及びSV40も供する。機能的なＥ６タンパク質の発現を欠如するヒトパピローマウイルス変異体は、ｐ53を有効に分解する能力を実質的に欠如し、これによりp53(-)細胞中で複製表現型を示すことができるが、機能的ｐ53の十分なレベルを含む細胞ではそうでないであろう。機能的Ｅ７タンパク質の発現を欠如するヒトパピローマウイルス変異体は、RBに有効に結合する能力を実質的に欠如し、これによりRB (-)細胞中で複製表現型を示すことができるが、機能的RBの十分なレベルを含む細胞内ではそうでないであろう。機能的Ｅ６タンパク質及び機能的Ｅ７タンパク質の両方の発現を欠如するヒトパピローマウイルス変異体は、RB及びｐ53に有効に結合する能力を実質的に欠如し、これにより、p53(-) RB(-)細胞中で複製表現型を示すことができるが機能的RB及び／又はｐ53の十分なレベルを含む細胞ではそうでないであろう。
本発明は、非新生物細胞集団における発現と比べて新生物細胞集団において複製表現型を及び／又は細胞変性効果を優先的に発現することができる組換えウイルスを患者に投与するステップを含む新形成病を治療するための新規方法も供する。
図面の簡単な記載
図１は、アデノウイルスE1a-289Rポリペプチドのドメイン構造及びタンパク質−タンパク質相互作用の概略図を示す。
図２は、プラスミドp019，p020、及びp021の作製を概略図で示す。
定義
他に定義されなければ、本明細書に用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のいずれの方法及び材料も本発明の実施又はテストに用いることができるが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目的のため、次の用語を以下に定義する。
対象に適用する時に本明細書に用いる用語“天然”とは、対象が天然に見い出され得ることをいう。例えば、天然のソースから単離することができる（ウイルスを含む）生物中に存在し、研究室においてヒトにより意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列が天然である。本明細書に用いる場合、用語“組換え体”とは、ポリヌクレオチド構成物（例えばアデノウイルスゲノム）が、部分的にヒトによる意図的な改変により形成されていることを示す。
本明細書に用いる場合、用語“複製欠損ウイルス”とは、ウイルス複製表現型の発現を支持し、非複製非形質転換細胞の特徴的な正常なｐ53及びRB機能を含む細胞において実質的に、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、又は複製表現型を発現できない所定の細胞集団（例えばｐ53及び／又はRB機能を実質的に欠如する細胞）において優先的に、細胞増殖を阻害し又はアポトーシスを誘導するウイルスをいう。典型的には、複製欠損ウイルスは、正常なRB及び／又はｐ53機能を含む細胞へのプラーク効率の実質的な減少を示す。
本明細書に用いる場合、用語“ｐ53機能”とは、ｐ53遺伝子によりコードされるポリペプチドであって、そのｐ53ポリペプチドが野生型アデノウイルス２又は５のE1b p55タンパク質に結合することができるポリペプチドの（同じ組織型の非新生物細胞に対して）本質的に正常なレベルを有する特性をいう。例えば、ｐ53機能は、ｐ53の不活性（即ち変異）形態の生産により又はｐ53ポリペプチドの発現の実質的な減少もしくは完全な損失により失われ得る。また、ｐ53機能は、野生型ｐ53タンパク質をコードするｐ53対立遺伝子を含む新生物細胞において実質的に欠如し得る；例えば、ｐ53の異常な亜細胞プロセッシング又は局在化を生じる変異（例えば核より細胞質において主にｐ53の局在化を生じる変異）のようなｐ53座の外側の遺伝子変異がｐ53機能を失わせ得る。
本明細書に用いる場合、用語“RB機能”とは、RB遺伝子によりコードされるポリペプチドであって、そのRBポリペプチドが野生型アデノウイルス２又は５のE1bタンパク質に結合することができるポリペプチドの（同じ組織型の非新生物細胞に対して）本質的に正常なレベルを有する特性をいう。例えば、RB機能は、RBの不活性（即ち変異）形態の生産により又はRBポリペプチドの発現の実質的な減少もしくは完全な損失により失われ得る。また、RB機能は、野生型RBタンパク質をコードするRB対立遺伝子を含む新生物細胞において実質的に欠如し得る；例えば、RBの異常な亜細胞プロセッシング又は局在化を生じる変異のようなRB座の外側の遺伝子変異がRB機能を失わせ得る。
本明細書に用いる場合、用語“複製表現型”とは、複製欠損アデノウイルスのようなウイルスが感染した細胞の１又は複数の以下の表現型特性をいう：（１）キャプシドタンパク質（例えばアデノウイルスのペントンベースポリペプチド）のような後期遺伝子産物又はウイルスの後期遺伝子プロモーターから開始するRNA転写物の実質的な発現、（２）ウイルスゲノムの複製又は複製中間体の形成、（３）ウィルス粒子又はパッケージングされたビリオン粒子のアセンブリー、（４）感染した細胞における細胞変性効果（CPE）の出現、（５）ウイルス溶解サイクルの完了、及び（６）機能的オンコプロテインをコードする野生型複製コンピテントDNAウイルスが感染した非新生物細胞におけるｐ53又はRB機能の廃止を典型的に条件とする他の表現型変化。複製表現型は、先に列記された表現型特性のうちの少くとも１つ、好ましくは表現型特性の１超を含む。
用語“抗新生物複製欠損ウイルス”とは、本明細書において、同じ組織的細胞型の感染した非複製非新生物細胞に対する感染した新生物細胞の優先的な細胞殺害により、ヒトにおける新形成の発達又は進行を阻害する機能的特性を有する組換えウイルスをいうのに用いられる。
本明細書に用いる場合、“新生物細胞”及び“新形成”とは、それらが細胞増殖の制御の大きな損失を特徴とする異常な増殖表現型を示すように、比較的自主的な増殖を示す細胞をいう。新生物細胞は、活性的に複製し得る、又は一時的な非複製の休止状態（Ｇ1又はＧ0）にある細胞を含み；同様に、新生物細胞は、十分に分化した表現型、ほとんど分化していない表現型を有する細胞、又は両方の細胞型の混合物を含み得る。これにより、必ずしも全ての新生物細胞が所定の時点で細胞を複製することは必要でない。新生物細胞として定義されるセットは、良性の新生物の細胞及び悪性（又は明らかな）新生物の細胞からなる。明らかな新生物細胞は、頻繁に、癌と呼ばれ、典型的には、内胚葉もしくは外胚葉組織起源の細胞由来なら癌腫、又は中胚葉由来の細胞型起源なら肉腫と呼ばれる。
本明細書に用いる場合、用語“作用可能に連結”とは、機能的関係でのポリヌクレオチド要素の連結をいう。核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係があるように配置されるなら、“作用可能に連結”される。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を与えるなら、コーディング配列に作用可能に連結される。DNA配列が作用可能に連結される手段は、典型的には連続的であり、必要なら、２つのタンパク質コーディング領域を、連続的かつ読み枠内に連結する。しかしながら、エンハンサーは、数キロベース、プロモーターから離れた場合に機能し、イントロン配列は種々の長さであり得るので、特定のポリヌクレオチド要素は連続的でなくとも作用可能に連結され得る。
本明細書に用いる場合、“生理条件”とは、完全な哺乳動物細胞又は生きている哺乳動物の組織空間又は器官における条件と実質的に同様のイオン強度、pH、及び温度を有する水性環境をいう。典型的には、生理条件は、約150mMのNaCl（又は任意にKCl）、pH6.5〜8.1、及び約20〜45℃の温度を有する水溶液を含む。一般に、生理条件は、生物高分子の分子間会合のための適切な結合条件である。例えば、150mM NaCl、pH7.4、37℃の生理条件が一般に適切である。
詳細な記載
一般に、以後用いる命名法及び以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、及び分子ウイルス学における研究手順は公知かつ当該技術に一般に用いられるものである。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、ポリペプチド合成、（複製欠損ウイルスストックをトランスコンプリメンテーション可能な細胞系を含む）ウイルスストックの形成及び増殖、及び細胞培養等のために標準的な技術が用いられる。一般的な酵素反応及びステップは、製造元の説明に従って行われる。それら技術及び手順は、当該技術における慣用的な方法及び本文献全体を通して供される種々の一般的な引用文献（一般に引用により本明細書に組み込まれるSambrookらMolecular Cloning：A Laboratory Manual, 2d ed.（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Virology, Second edition, eds. Fields BN及びKnipe DM,（1990）Raven Press, New York, NYを参照のこと）に従って一般に行われる。それらの手順は当該技術で公知であると思われ、読者の便利さのために供される。ここに含まれる全ての情報は引用により本明細書に組み込まれる。
新形成は、部分的に、変異体遺伝子型及び表現型を有する新生物細胞の形成を特徴とする病理的状態である。特定の腫瘍は、RB機能を欠くがｐ53機能を有する細胞の集団を含み；これら細胞はRB(-)で示される。特定の腫瘍細胞はｐ53機能を欠如し、RB機能を有し得る；このような細胞をp53(-)で示す。特定の腫瘍はｐ53及びRBの両方を欠如する細胞を含み得、これをp53(-) RB(-)で示す。細胞系SAOS2（以下の実験例を参照のこと）は、p53(-) RB(-)である新生物細胞型の例である。また、ｐ53及びRBの本質的に正常なレベルを含む新生物細胞も存在し得る；このような正常なｐ53及び正常なRBの両方を有する細胞は、このような新生物細胞中で複製表現型を優先的に示し得る抗新生物ウイルス構成物のための基礎を供し得る他のオンコプロテイン（例えばｐ53又はRB以外の腫瘍サプレッサー遺伝子産物）を欠如し得る。
本発明の基礎は、哺乳動物細胞に感染するいくつかのDNAウイルス（例えばアデノウイルス；パポーバウイルス、例えばBK及びJC，SV40、及びパピローマウイルス、例えばHPV等）が、ウイルス複製サイクルを通しての有効な進行のために本質的であるウイルスタンパク質をコードし；これらのウイルスタンパク質のうちのいくつかは、有効なウイルス複製のための必要条件として、細胞のタンパク質、例えば転写複合体の細胞サイクル制御及び／又は形成に関連するものを隔離する。ｐ53及びRBのような細胞タンパク質に結合し、それを隔離し、又はそれを分解するウイルスタンパク質の欠如下において、ウイルス複製が実質的に阻害される。ｐ53及び／又はRBを隔離し又は分解する能力を欠如する変異ウイルスが感染した正常な（即ち非新生物）細胞は、一般に変異ウイルスの複製を支持することができず、従ってこのような変異ウイルスは複製欠損であると考えられる。しかしながら、ｐ53又はRBの隔離又は分解は、機能的なｐ53又はRBを欠如する細胞（これらの細胞を各々p53(-)及びRB(-)で示す）におけるウイルス複製のために必要でないので、ｐ53及び／又はRB隔離又は分解について欠損している複製欠損変異ウイルスは、本質的に正常なｐ53及び／又はRB機能を有する細胞におけるよりかなりの程度、これらp53(-)又はRB(-)において複製表現型を発現し得ることが可能である。新生物細胞は、頻繁に、ｐ53機能（p53(-)細胞）、RB機能（RB(-)細胞）、又は両方の機能（p53(-) RB(-)細胞）を欠如する。従って、いくつかの複製欠損ウイルス変異体は、新生物細胞において複製表現型を優先的に示し得る。
機能的なRB不活性化タンパク質（例えばアデノウイルスE1a，HPV E7タンパク質）を発現する能力を欠如するウイルス変異体は、RB(-)細胞及びPB(-) p53(-)細胞において複製表現型を示すであろう。機能的なｐ53不活性化タンパク質（例えばアデノウイルスE1b p55，HPV E6タンパク質）を発現する能力を欠如するウイルス変異体は、p53(-)細胞及びRB(-) p53(-)細胞において複製表現型を示すであろう。機能的なｐ53不活性化タンパク質（例えばアデノウイルスE1b p55，HPV E6タンパク質）及び機能的なRB不活性化タンパク質（例えばアデノウイルスE1a，HPV E7タンパク質）の両方を発現する能力を欠如するウイルス変異体は、RB(-) p53(-)細胞において複製表現型を示すであろう。それゆえ、複製表現型の発現につながる細胞毒性は、PB(-)，p53(-)、又はPB(-) p53(-)表現型を有する新生物細胞を優先的に殺すための基礎として用いることができる。いくつかの複製非新生物細胞は細胞周期を通して進行する間、一時的にRB(-)表現型、p53(-)表現型、又はRB(-) p53(-)表現型を示し得るが、本発明のウイルス変異体は、たとえ新生物細胞の完全な選択的な殺害が必ずしもなくても、単独で又は他の治療のモダリティーと組み合わせて用いるべき有用な抗新形成治療モダリティーを有利に構成するのに用いることができる。HPV E7ポリペプチドの37アミノ末端残基における欠失（又は他の不活性化変異）は、これらの残基はRB結合のために重要であるので、RB(-)細胞への適用のための好ましいHPV変異体である。
以下に供される方法及び組成物は複製欠損アデノウイルス構成物に関する方法について詳しく記載されるが、本発明は、ｐ53タンパク質又はRBタンパク質の分解を隔離し又は増強するオンコプロテインをコードする他のDNAウイルス、例えば各々ｐ53及び／又はRB機能を実質的に廃止するＥ６及び／又はＥ７遺伝子中に変異を含む複製欠損パピローマウイルス種（例えばHPV16，18，33型の変異体）で実施することができる。Adenoviridae科のメンバー（特にMastadenovirus属）に加えて、ｐ53又はRBを隔離及び／又は不活性化するウイルスタンパク質をコードするPapovaviridae科のメンバー、特にパピローマウイルス及びポリオウイルスが本発明の方法に適すると思われる。
アデノウイルス及びパポーバウイルスの生物学の一般的な記載について、引用により本明細書に組み込まれるVirology、第２版、eds. Fields BN and Knipe DM, Vol.2, pp.1651〜1740が導入のために言及され得る。以下の特定の記載は、これらに限らないが、アデノウイルス抗原型５及びアデノウイルス抗原型２に言及する。他のアデノウイルス抗原型を用いることができると思われるが、アデノウイルス５型が、E1aウイルス遺伝子領域のウイルスによりコードされたポリペプチドのウイルスヌクレオチド及びアミノ酸ナンバリングのヌクレオチドナンバリング変換、及び他のウイルス遺伝子のための便利な引用を供する。当業者は、他のアデノウイルス抗原型における対応する位置を直ちに同定するであろう。ヒトパピローマウイルスへの引用は、一般に、新形成に関連する型（例えば16，18又は23型）に言及する。但し、非オンコジーン型も用いることができる。
E1b変異体
細胞ホスホプロテインｐ53の機能は、細胞周期を通じての哺乳動物細胞の進行を阻害することである。野生型アデノウイルスE1b p55タンパク質は、ｐ53を有する感染した細胞内でｐ53に結合し、おそらく不活性形態においてｐ53を隔離することにより、ｐ53機能の実質的不活性化をおこす。機能的E1b p55タンパク質は機能的ｐ53を含む細胞における有効なアデノウイルス複製に本質的である。従って、ｐ53に結合する能力を実質的に欠如するアデノウイルスは機能的ｐ53の正常なレベルを有する非複製非新生物細胞において複製欠損である。
ヒト腫瘍細胞は、頻繁に、変異した（例えば置換、欠失、フレームシフト変異体）ｐ53対立遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合であり、細胞周期の正常な制御のために必要なｐ53機能を欠如する（Hollsteinら（1991）Science 253：49；Levineら（1991）前掲、引用により本明細書に組み込まれる）。これにより、多くの新生物細胞はp53(-)である。なぜならそれらは十分なレベルのｐ53タンパク質を欠如するから及び／又はそれらは、実質的なｐ53機能を行うことができず、（例えば機能的な多量体の形成を阻害することにより）野生型ｐ53が存在し得る場合でさえ実質的にｐ53機能を排除し得るｐ53の変異体形態を発現するからである。いくつかの新生物細胞は本質的に野生型のｐ53タンパク質をコードする対立遺伝子を含み得るが、ｐ53機能を実質的に廃止する第２の部位変異、例えば核でなく細胞質に局在化するｐ53タンパク質を生ずる変異を含み得る；このような第２の部位変異も実質的にｐ53機能を欠如する。
ｐ53と複合体形成する能力を欠如するが、他の本質的なウイルス複製機能を実質的に保持する複製欠損アデノウイルス種は、ｐ53機能を欠損する細胞（例えば、実質的に削除されたｐ53対立遺伝子についてホモ接合である細胞、本質的に非機能性である変異ｐ53タンパク質を含む細胞）中で複製表現型を示すであろうが、非複製非新生物細胞中では複製表現型を示さないであろう。このような複製欠損アデノウイルス種は、本明細書において、E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルスとして便利のため言及される。
ｐ53機能を欠如する新生物細胞の副次集団及び本質的に正常なｐ53機能を発現する非新生物細胞の副次集団を含む細胞集団（例えば細胞培養混合物又はヒト癌患者）は、感染条件（例えば細胞集団のアデノウイルス感染に適した条件、典型的には生理的条件）下で、E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルスの感染投与量を含む組成物と接触させることができる。このような接触は、E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルスの細胞集団への感染を引きおこす。その感染は、ｐ53機能を欠如する新生物細胞の副次集団を含む細胞の重大な画分において複製表現型の優位な発現を引きおこすが、本質的に正常なｐ53機能を有する非新生物細胞の副次集団において複製表現型の実質的な発現を引きおこさない。感染したp53(-)細胞における複製表現型の発現は、例えば細胞変性効果（CPE）、細胞溶解、アポトーシス等により、細胞を殺し、これによりその細胞集団から新生物p53(-)細胞を選択的に排除する。
典型的には、p53(-)新生物細胞の選択的殺害に適したE1b-p53(-)複製欠損アデノウイルス構成物は、E1b p55ポリペプチドがｐ53タンパク質に有効に結合する能力を不活性化する変異（例えば欠失、置換、フレームシフト）を含む。このような不活性化変異は、典型的には、ｐ53に結合するｐ55の領域内でおこる。任意に、変異体E1b領域は、E1b領域の残りによりコードされ、E1aポリペプチドの欠如下でアデノウイルス初期遺伝子のトランスアクチベーションにおいて機能する機能的ｐ19タンパク質をコードし、発現する。
本発明の方法及び組成物に用いるための適切なE1b-p53(-)複製欠損アデノウイルス構成物は、以下の例に限らないが、（１）ｐ55タンパク質の翻訳の開始のために用いたAUGコドンの３アミノ酸下流に停止コドンを作り出すヌクレオチド位置2022におけるＣからＴへの変異並びにヌクレオチド3336に第２の停止コドンを作り出す小さなリンカー挿入で置換されたヌクレオチド2496と3323との間の欠失を含むアデノウイルスタイプ2 dI 1520（p19タンパク質の発現は本質的に影響を受けない）（引用により本明細書に組み込まれるBarker及びBerk（1987）Virology 156：107）、並びに（２）少くとも位置2022の変異及び／又は2496〜3323欠失変異を含むアデノウイルスタイプ2 dI 1520、又はその実質的な部分、並びにp19 cyt変異体を作り出すｐ19における更なる変異を含む複合アデノウイルス構成物（ここで、その複合ウイルス構成物はｐ55を欠如し、p19 cyt変異の増強された細胞変性効果を含む）を含む。Ad2 dI 1520はDr.A.Berk（Vniversity of California at Los Angeles, Los Angeles, CA）から利用でき、引用により本明細書に組み込まれるBarker及びBerk（1987）（Virology 156：107）に記載される。
さもなければE1b-p53(-)変異体の複製を支持するであろう新生物細胞において感染性ビリオンの形成を阻害するために、これらのアデノウイルスに更なる変異を組み込むことが好ましい。このような更なる不活性化変異は、隣接する細胞に広がり及びそれに感染することができる感染性ウイルスを形成する完全なウイルス複製が不要である治療モダリティーに好ましいであろう。これらの十分に不活性化された変異体は、非複製性E1b-p53(-)変異体として言及される。このような非複製性変異体は、p53(-) RB(-)細胞中でさえ感染性ビリオンの形成を防ぐ変異を含み；このような変異は、典型的には、本質的なビリオンタンパク質又はプロテアーゼにおける構造的変異である。
しかしながら、多くのモダリティーにおいて、変異体ウイルスが複製し、他の細胞に広がって感染し得る変異体ウイルスゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、これにより変異体ウイルスの最初の投与の抗新生物作用を増幅させることが要求される。
ｐ53に結合する能力を欠如する更なるE1b(-)変異体は、ｐ55ポリペプチドをコードするE1b遺伝子領域中に変異を形成し、変異体ｐ55ポリペプチドを発現させ、その変異体ｐ55ポリペプチドを水性結合条件下でｐ53又はｐ53の結合フラグメントに接触させ、そして本発明に用いるのに適した候補E1b(-)変異体であるとしてｐ53に特異的に結合しない変異体E1bポリペプチドを同定することにより当業者により作られ得る。
より典型的には、候補E1b(-)変異体を同定するために機能的アッセイが用いられよう。例えば、ｐ53機能の決定のためのFriendアッセイは、本質的に引用により本明細書に組み込まれるFrebourgら（1992）（Cancer Res. 52：6977）に記載されるように行われよう。ｐ53を不活性化する能力を欠如するE1b変異体は、候補E1b(-)複製欠損変異体として同定されよう。
E1a／E1b二重変異体
いくつかのヒト腫瘍細胞は、一方又は両方のタンパク質種の変異による不活性化及び欠失のいずれかにより、ｐ53機能及びRB機能の両方を欠如する。このような細胞はp53(-) RB(-)細胞と呼ぶ。
ｐ53に結合する能力を欠如し、RBに結合する能力も欠如するが、他の本質的なウイルス複製機能を実質的に保持する複製欠損アデノウイルス種はp53(-) RB(-)細胞において複製表現型を優先的に示すであろう。このような複製欠損アデノウイルス種は本明細書において便利のため、E1a-RB(-)／E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルス、又は単純にE1a／E1b二重変異体と呼ぶ。このようなE1a／E1b二重変異体は、E1a領域内の少くとも１のE1a-RB(-)変異及びｐ55をコードするE1b領域内の少くとも１のE1b-p53(-)変異を組み合わせてE1a／E1b二重変異体アデノウイルスを形成することにより当業者により作製され得る。このような複製欠損二重変異体アデノウイルスは、ｐ53及びRB機能の両方に欠損がある細胞において複製表現型を示すであろうが、非複製非形質転換細胞又はｐ53もしくはRB機能に欠損があり両方の機能がない細胞において複製表現型を実質的に示さないであろう。例えば、Ad5 dI 434変異体（Grodzickerら（1980）Cell 21：454、引用により本明細書に組み込まれる）は、E1a座の欠失及びE1b座の部分的欠失を含み、機能的なE1a及びE1b p55タンパク質をコードする能力を実質的に欠如する。
ｐ53及びRB機能を欠如する新生物細胞の副次集団及び本質的に正常なｐ53機能及び／又はRB機能を発現する非新生物細胞の副次集団を含む細胞集団（例えば細胞培養混合物又はヒト癌患者）は、感染条件（例えば細胞集団のアデノウイルス感染に適した条件、典型的には生理的条件）下で、複製欠損E1a／E1b二重変異体アデノウイルスの感染投与量を含む組成物と接触させることができる。このような接触は、E1a／E1b二重変異体複製欠損アデノウイルスの細胞集団への感染を引きおこす。その感染は、ｐ53機能及びRB機能を欠如する新生物細胞の副次集団を含む細胞の重大な画分において複製表現型の優位な発現を引きおこすが、本質的に正常なｐ53機能及び／又はRB機能を有する非新生物細胞の副次集団において複製表現型の実質的な発現を引きおこさない。感染したp53(-) RB(-)細胞における複製表現型の発現は、例えば細胞変性効果（CPE）、細胞溶解等により、細胞を殺し、これによりその細胞集団から新生物p53(-) RB(-)細胞を選択的に排除する。
さもなければE1a／E1b二重変異体の複製を支持するであろう新生物細胞において感染性ビリオンの形成を阻害するために、これらのアデノウイルスに更なる変異を組み込むことが好ましい。このような更なる不活性化変異は、隣接する細胞に広がり及びそれに感染することができる感染性ウイルスを形成する完全なウイルス複製が不要である治療モダリティーに好ましいであろう。これらの十分に不活性化された変異体は、非複製性E1a／E1b二重変異体として言及される。このような非複製性変異体は、p53(-) RB(-)細胞中でさえ感染性ビリオンの形成を防ぐ変異を含み；このような変異は、典型的には、本質的なビリオンタンパク質又はプロテアーゼにおける構造的変異である。
しかしながら、多くのモダリティーにおいて、変異体ウイルスが複製し、他の細胞に広がって感染し得る変異体ウイルスゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、これにより変異体ウイルスの最初の投与の抗新生物作用を増幅させることが要求される。
負の選択のウイルス構成物
感染した細胞におけるアデノウイルス複製表現型の発現は、一般に細胞溶解、細胞変性効果（CPE）、アポトーシス、又は他の細胞死のメカニズムによりウイルス誘導性の細胞毒性と相関するが、しばしば、抗新生物治療のために用いるべき組換えアデノウイルスの細胞毒性を増加させることが好まれる。このような増強は、典型的には複製表現型を発現する細胞中で正の転写調節を示すアデノウイルスプロモーターに作用可能に連結された。組換えアデノウイルス中の負の選択遺伝子を含む形態をとり得る。例えば、HSV tk遺伝子カセットは、Ad5 NT dI 1110のような複製欠損アデノウイルスのＥ３プロモーターの直下に作用可能に連結され得る。頻繁に、負の選択カセットを適合させるためにアデノウイルスゲノムの（例えばウイルス複製及びパッケージングのための）非本質的部分を削除することが要求され；これによりＥ３遺伝子領域の実質的な部分が削除され、Ｅ２プロモーター（及びエンハンサー）又は他の適切なプロモーター／エンハンサーに作用可能に連結されたHSV tk遺伝子のような負の選択カセットで置換され得る。あるいは、負の選択遺伝子は、後期遺伝子プロモーターからの転写を特徴とする複製表現型を発現する細胞において負の選択遺伝子産物の有効な発現を許容するためにアデノウイルス後期領域プロモーターに作用可能に連結され得る。
生体内で感染性ビリオンを形成するウイルス複製が不要である実施形態のために、非複製性であるアデノウイルス複製欠損構成物が用いられる。このような非複製性変異体は、E1a(-)及び／又はE1b(-)変異を含み、適切な新生物細胞（例えばp53(-)細胞、PB(-)細胞、又はp53(-) PB(-)細胞）において複製表現型を作り出すのに必要な全ての遺伝子機能を含むが、構造的コートタンパク質等のような感染性ビリオンの形成に必要な少くとも１の本質的な遺伝子機能を欠失している。あるいは、ウイルスにより誘発された顕在化された免疫応答は、感染性ビリオンを中和し、ウイルス感染の広がりを調節することができる。E1a及び／又はE1b変異に加えて補足性のトランス作用機能を欠如する非複製性変異体は、欠失したトランス作用機能を供することができる補足性ヘルパーウイルス又はヘルパー細胞系と合わせて増殖させることができる。例えば、トランスにおいてE1a及びE1b機能を供する293細胞系（ATCC # CRL1573；Grahamら（1977）J.Gen.Virol. 36：59、引用により本明細書に組み込まれる）は、ウイルスストックを発達させるための“非複製性”変異体の増殖を許容するために、ビリオンコートタンパク質等のようなトランスにおいて更なる機能を供するように改変され得る。
細胞におけるHSV tk遺伝子の発現は、その細胞がガンシクロビル又はFIAVのような負の選択剤に露出されなければ、その細胞に対して直接、毒性ではない。負の選択遺伝子が実質的に発現される複製表現型を発現する感染した細胞は、tk遺伝子を発現する感染した細胞が選択的に排除される時に、負の選択剤（例えばガンシクロビル）が有効な選択的投与量で投与されるまで、本質的に更なる毒性を作り出さない；これにより、負の選択は、細胞変性での殺害のため、及び／又は複製表現型を示す細胞を殺すことにより更なるウイルス複製を減衰させるために用いることができる。更に、負の選択剤の投与量及び／又は投与スケジュールを調節することにより、負の選択遺伝子を発現する感染した細胞集団の部分的排除のみを行うことが可能である。一般に、ガンシクロビルの投与量は、標準投与量−応答曲線を作り、感染した新生物細胞の要求されるレベルが観察される投与レベルを決定することにより較正される。ガンシクロビル（GANC）の動物への投与に関する情報は、パッケージ挿入物からヒトが指示する説明書を含む当該技術における種々のソースにおいて利用できる。細胞培養に用いる場合、ガンシクロビルの選択的濃度は、典型的には、0.05mM〜50mMの範囲、典型的には１mMであり、試験管内適用のために約0.2mMが用いられ、生体内適用のために約１〜５mMが投与される（典型的には、水溶液中125mg／mlのガンシクロビルが充填された浸透ポンプからの連続注入により約24時間にわたって投与される）。生体内投与のための投与スケジュールは、７日間、静脈内への５mg／kg体重B.I.D.の投与量のガンシクロビルを含み得る。
負の選択遺伝子は、E1a-RB(-)複製欠損アデノウイルス構成物、E1ba-p53(-)複製欠損アデノウイルス構成物、E1a／E1b二重変異体複製欠損ウイルス構成物等に組み込むことができる。好ましい実施形態は、tk発現カセットを形成するためにポリアデニル化部位と共にAd5 NT dI 1110のＥ２プロモーターもしくは他のプロモーター及び／又はエンハンサー（例えば主要後期プロモーター、E1aプロモーター／エンハンサー、E1bプロモーター／エンハンサー）に作用可能に連結したHSV tk遺伝子カセット（引用により本明細書に組み込まれる（Zjilstraら（1989）Nature 342：435；Mansourら（1988）Nature 336：348；Johnsonら（1989）Science 245：1234：Adairら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci（U.S.A.）86：4574；Capecchi, M.（1989）Science 244：1288）。tk発現カセット（又は他の負の選択発現カセット）は、例えばＥ３遺伝子の実質的欠失のための置換として、アデノウイルスゲノムに挿入される。他の負の選択遺伝子及び複製欠損アデノウイルス構成物は当業者に明らかであろう。Ｅ２プロモーターに作用可能に連結された負の選択遺伝子は、Ｅ２プロモーターが多重のE2F部位を含むので、E1a(-)複製欠損アデノウイルス変異体への組込みのための特に好ましい実施形態であり、RB機能を欠如するRB(-)及びp53(-) RB(-)は、おそらく、Ｅ２プロモーターからのより有効な転写を示すであろう。
診断及び試験管内での使用
本発明の複製欠損アデノウイルスは、ｐ53及び／又はRB機能を欠如する細胞の存在を検出するのに用いることができる。例えば、ｐ53及び／又はRBを欠損する新生物細胞の副次集団を含む細胞サンプルは、適切な複製欠損アデノウイルス種が感染し得る。適切なインキュベーション期間の後、複製表現型（例えばトリプトファン・ブルーを排除する能力の喪失、ビリオン形成、ウイルスDNAへの1Ｈ−チミジン組込み）を発現する細胞サンプル中の細胞は、その細胞サンプル中の複製性及び／又は新生物細胞の数又は集団の基準を供するために定量することができる。このような方法は、外植された細胞サンプル（例えばリンパ球の白血病のための化学療法の基礎となる患者からのリンパ球サンプル）に基づいて患者における化学療法に従い、新生物を診断し、及び／又は腫瘍細胞量を評価するために用いることができる。
他の診断的使用及びバリエーションは明らかである；例えばリポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）は、複製欠損アデノウイルスにおいて負の選択遺伝子のかわりに置換することができ；形質転換された細胞は、細胞においてｐ53及び／又はRBの欠如を示す複製表現型の発現と相関するリポーター遺伝子の発現により、（細胞サンプル又は形質転換アッセイのように）評価することができる。
治療方法
新生物病の治療は、E1a-RB(-)複製欠損アデノウイルス、E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルス、E1a／E1b二重変異体、及び負の選択遺伝子を更に含む複製欠損アデノウイルスを含む、本発明の複製欠損アデノウイルスを含む組成物を患者に投与することにより供され得る。
ｐ53及び／又はRB機能を欠如する細胞を含む種々のヒト新生物は、複製欠損アデノウイルスで処理することができる。例えばこれらに限らないが、気管支癌、鼻咽腔癌、喉頭癌、小細胞及び非小細胞肺癌、肺腺癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、乳癌、頸部癌、卵巣癌、又はリンパ性白血病を有するヒト患者又は非ヒト哺乳動物は、適切な複製欠損アデノウイルスの有効な抗新生物投与量を投与することにより治療することができる。感染性アデノウイルス粒子の懸濁液は、静脈内、腹腔内、筋内、皮下及び局所を含む種々の経路により新生物組織に適用することができる。１ml当り約103〜1012又はそれ超のビリオン粒子は、（例えば気管支癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、又は喉頭癌を治療するための肺デリバリーのために）霧として吸入しても、腫瘍（例えば気管支癌、鼻咽腔癌、喉頭癌、頸部癌）を治療するために腫瘍部位に直接ぬってもよく、又は（例えば卵巣癌を治療するために腹腔内に、肝臓癌又は他の非肝臓一次腫瘍からの肝臓転移を治療するため門脈に）注入又は他の適切な経路、例えば腫瘍塊（例えば乳腫瘍）、洗腸（例えば直腸癌）、又はカテーテル（例えば膀胱癌）により投与してもよい。
候補の抗新生物アデノウイルス変異体は、新生物細胞の等価の移植を有する未処理のマウスと比べて、ｐ53及び／又はRB機能を欠如する新生物細胞の移植を有するnu／nuマウスにおいて腫瘍形成又は新生物細胞荷を減少させる能力により更に評価することができる。
抗新生物複製欠損アデノウイルス変異体は、新生物病を有する患者への治療及び診断的投与のために製剤化され得る。
治療又は予防的使用のために、１又は複数の種の抗新生物複製欠損アデノウイルス変異体の医薬的に有効な投与量を含む滅菌組成物は、新生物状態の治療のためにヒト患者又は獣医学的非ヒト被検体に投与される。一般に、本組成物は、水性懸濁液中に約103〜1015又はそれ超のアデノウイルス粒子を含むであろう。医薬として許容される担体又は賦形剤は、しばしばこのような滅菌組成物に用いられる。種々の水溶液、例えば水、緩衝水、0.4％塩類溶液、0.3％グリシン等を用いることができる。これらの溶液は滅菌状態であり、一般に要求されるアデノウイルスビリオン以外の粒状物を含まない。本組成物は、適切な生理条件に必要とされる医薬として許容される補助物質、例えばpH調節及び緩衝剤、毒性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含み得る。アデノウイルスによる細胞の感染を増強する賦形剤が含まれ得る。
複製欠損ウイルスは、リポソーム又はイムノリポソームにより新生物細胞にデリバリーしてもよい：このようなデリバリーは、新生物細胞上に存在する細胞毒面特性（例えばイムノリポソーム内のイムノグロブリンに結合する細胞表面タンパク質の存在）に基づいて新生物細胞を選択的に標的にすることができる。典型的には、ビリオンを含む水性懸濁液は、リポソーム又はイムノリポソームにカプセル化される。例えば、複製欠損アデノウイルスビリオンの懸濁液は、慣用的な方法（引用により本明細書に組み込まれる米国特許5,043,164、米国特許4,957,735、米国特許4,925,661；Connor及びHuang（1985）J.Cell Biol. 101：582；Lasic DD（1992）Nature 355：279；Novel Drug Delivery（eds. Prescott LF and Nimmo WS：Wiley, New York, 1989）；Reddyら（1992）J.Immunol. 148：1585）によりイムノリポソームを形成するようにミセル内にカプセル化することができる。個体の癌細胞上に存在する癌抗原（例えばCALLA，CEA）に特異的に結合する抗体を含むイムノリポソームは、ビリオンをこれらの細胞に標的化するのに用いることができる。
本抗新生物複製欠損アデノウイルス又はその混合物を含む組成物は、新生物病の予防及び／又は治療への適用のために投与することができる。治療への適用のために、組成物は、その条件及びその合併症を治癒し又は少くとも部分的に制限するのに十分の量で、特定の新生物病に既にかかっている患者に投与される。これを達成するのに適した量は、“治療して有効な投与量”又は“有効な投与量”として定義される。この使用のために有効な量は、その状態の激しさ、患者の一般的状態、及び投与の経路によるであろう。
予防への適用において、抗新生物複製欠損アデノウイルス又はそれらの混合物を含む組成物は、新生物の再発に対する患者の耐性を増強するため又は寛解時間を長くするために新生物病状態にない患者に投与される。このような量は、“予防に有効な量”として定義される。この使用においても、正確な量は、患者の健康状態及び免疫の全般的なレベルによる。
本組成物の一回の又は複数の投与は、治療する医師が投与レベル及びパターンを選択して行うことができる。いずれの場合でも、医薬製剤は、患者を有効に治療するのに十分な量の本発明の抗新生物複製欠損アデノウイルスを供するであろう。
本発明の抗新生物複製欠損アデノウイルス治療は、他の抗新生物プロトコル、例えば慣用的な化学療法及び／又は免疫抑制法と組み合わせることができる。免疫抑制のための手順は、WO 96／12406に本質的に記載されるものからなるであろう。一般に、複製欠損アデノウイルスは、単独で、又は免疫抑制剤との混合物で投与されるであろう。好ましい免疫抑制化合物の例は、シクロホスホアミド、シクロスポリン、又はデキサメタゾンである。要求される免疫抑制のレベルを実現するためのこれらの化合物の投与量は、当該技術で周知である。例えば、シクロホスホアミドは、好ましくは、100〜300mg／kgで投与され、デキサメタゾンは、好ましくは、約２〜６mg／kgで投与される。
変異体アデノウイルスの増殖
本発明のアデノウイルス変異体（例えばE1a-RB(-)複製欠損アデノウイルス、E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルス、及びE1a／E1b二重変異体）は、典型的には、感染性変異体ウイルスの複製及び形成を支持するために、トランスにおいて、各々E1a機能、E1b機能、又はE1a及びE1b機能の両方を供し得る細胞系（例えば、293細胞系ATCC # CRL157）、American Type Culture Collection, Rockville, MD；Grahamら（1977）J.Gen.Virol. 36：59）においてウイルスストックとして増殖される。
以下の実施例は、例として供され、限定を意図したものではない。バリエーション及びかわりの実施形態は当業者に明らかであろう。
実験例
複製欠損組換えアデノウイルスの、ｐ53及び／又はRbを欠如する新生物細胞への効果
以下の実験例は、ｐ53及び／又はRb機能を欠如する新生物細胞への複製欠損組換えアデノウイルス調製物の投与が、新生物細胞を有効に殺すことができることを証明する。その例は、ｐ53及びRb機能を含む非新生物細胞が、複製欠損組換えアデノウイルス調製物による殺害に対して比較的耐性であることも示す。それゆえ、以下に供するデータは、複製欠損組換えアデノウイルスの投与が新生物細胞を選択的に殺すのに用いることができることの実験的確認を供する。その選択的殺害は、変異体アデノウイルスが新生物細胞において複製表現型を誘導するが、非新生物細胞においては複製表現型（又は関連する細胞変性効果）を実質的に誘導しない異なる能力を利用することにより供される。
対照非新生物細胞及び種々の新生物細胞型を示す細胞系を10％胎児ウシ血清を含むDMEM（高グルコース量）中で集落になるまで又はその近くまで６ウエル培養皿中にプレートし、標準培養条件下で37℃、５％CO2でインキュベートした。細胞を５×105細胞／ウエルの密度でプレートしてスクリーニングした。テストした新生物細胞系は、ヒト一次骨原肉腫由来のSAOS-2（ATCC HTB85）；ヒト骨原肉腫由来のU-20S（ATCC HTB96）；膵臓又は腸起源のヒト転移性腺癌由来のHS700T（ATCC HTB147）；形質転換したヒト胎芽性腎臓である293（ATCC CRL1573）；及びヒト直腸腺癌由来のDLD-1（ATCC CCL221）であった。それら各々の細胞系は、American Type Culture Collection, Rockville, MDから利用できる。対照非新生物細胞はIMR90（ATCC CCL186）及びWI-38（ATCC CCL75）（両方とも二倍体ヒト肺繊維芽細胞系である）であった。
次にこれらの細胞培養物に、平行して、野生型アデノウイルスタイプ２、及び複製欠損組換えアデノウイルス変異体dI 1010，dI 434及びdI 1520を感染させた。余分な培養皿を、計数目的のためにプレートした。これらの細胞はウイルス感染のために用いた同じ細胞の懸濁液からのものであった。要求される感染の多重度（MOI）のために細胞培養物に加えるためにウイルスのプラーク形成単位（PFU）の数を決定するために細胞を計数した。野生型アデノウイルスタイプ２及び変異体アデノウイルスを、0.1，1.0，10、及び100のMOIで平行の細胞培養物に加えた。PBSに懸濁したウイルスを、１mlの容量で細胞ウエルに加えた。その接種した皿を、接種及び37℃、５％CO2で約１時間の吸着時間の中間点後すぐにＸ−及びＹ−軸の両方に振動させた。１時間の吸着期間後、高グルコース及び２％胎児ウシ血清を含むDMEM ２mlを加え、その培養物を標準培養条件下で37℃、５％CO2でインキュベートした。感染後種々の時間で、ウイルス調製物による細胞殺害の効能を決定するため、細胞培養物を、20％メタノール中0.5％クリスタル・バイオレットで染色した。死んだ細胞を引き離し、ウエルからそそぎ出し、生きている細胞をウエルに残して染料で染色した。その結果は、複製欠損組換えアデノウイルス調製物は、非新生物細胞と比べて新生物細胞を優先的に殺したのに対し、野生型アデノウイルスタイプ２は新生物細胞及び非新生物細胞の両方をほぼ等しく十分に殺したことを証明する。より詳しくは、その結果は、dI 1010変異体は新生物細胞を殺すことにおいて特に有効であり、dI 1520変異体及びdI 434変異体も有効であることを示した。野生型アデノウイルス２は、各々のウエルの少くともいくつかの細胞染色において種々の効能及び不完全性であったが、感染後４〜７日に培養ウエルの各々において細胞を殺すことができた。WI-38及びSAOS-2系はアデノウイルス感染のための優れた宿主でなく、以下に議論されるように、IMR90はヒト二倍体繊維芽細胞のためのかわりの対照細胞として機能することに注意せよ。dI 1010変異体は、８〜12日にわたり、感染耐性SAOS-2を除いて新生物細胞系の全てを有効に殺すことができた。DI 1010は、感染後12日までに、293，U20S，HS700T、及びDLD-1系を殺し、二倍体ヒト肺繊維芽細胞（WI-38）を殺さなかった。dI 1520変異体は、感染後14〜20日までに、５の新生物細胞系のうち３つ（293，HS700T及びDLD-1）を有効に殺すことができ、二倍体ヒト肺繊維芽細胞（WI-38）を実質的に殺さなかった。dI 1520はE1B(-)変異体であり、細胞系U20SはこのようなE1B(-)変異体ウイルスが複製するのを許容せず、このことは予想されるように、変異体組換え欠損アデノウイルスによる感染のための異なる形質転換された細胞系の特異性を示す。dI 434変異体（二重変異体：E1A(-) E1B(-)）は、感染後14〜20日までに、５の新生物細胞系のうち３つ（293，HS700T及びDLD-1）を有効に殺すことができ、二倍体ヒト肺繊維芽細胞（WI-38）を実質的に殺さなかった。DLD-1及びU20S系は、dI 434の複製について部分的な耐性表現型を示した。各々の細胞系に、生存能についての対照として、PBSのみを偽感染させた。
以下の実験も、IMR90細胞（ATCC CCL186）並びに野生型及び変異体アデノウイルスを用いて行った。IMR90細胞に、0.1，1.0，10、及び100に対応するMOIで、示されるウイルスを感染させた。感染後９日目に、細胞をPBSで洗い、クリスタル・バイオレットで染色した。ウイルス感染についての陽性対照として供するため、各々の６ウエル皿中の１つのウエルに293細胞を種つけした。その結果は、IMR90ヒト二倍体肺繊維芽細胞が、野生型、Ad２，dI 1010、及びdI 1520により差別的に殺されることを示した。野生型Ad2は10又は100のMOIでIMR90細胞を有効に殺した。DI 1010は、上述のように、新生物細胞系293，U20S，HS700T、及びDLD-1を殺したのにかかわらず、テストした最も高いMOIでもIMR90細胞内で複製できなかった。DI 1520ウイルスは、100のMOIでのみ有効にIMR90細胞を殺すことができ；この高いウイルスの投与量において、複製でなくウイルスのオーバーロードの結果として細胞が死んだ可能性は除外することができない。
これにより、データは、複製欠損組換えアデノウイルス変異体は、予測される通り、ｐ53及び／又はRb機能を欠如する新生物細胞を選択的に殺すのに用いることができることを示す。
複製欠損組換えアデノウイルスの作製
以下の段落は、ｐ53欠損細胞中で選択的に複製するE1B 55kDにおいて欠損を有する改良されたアデノウイルス株であるONYX-019，ONYX-020、及びONYX-021の形成及びテストを記述する。これらの株をdI 1520（以後、ONYX-015と呼ぶ）と比較した。これらの株は、ウイルスCPEアッセイにおいてONYX-015を超える大きな改良を示す。
本発明のこの態様の実施は、他に示さない限り、当該技術の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えDNA操作及び生産、並びに免疫学の慣用的な技術を用いるであろう。このような技術は、文献に十分に説明される。例えば、Sambrook, Molecular Cloning；A Laboratory Manual, Second Edition（1989）；DNA Cloning, Volumes I and II（D.N.Glover, Ed. 1985）；Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait, Ed. 1984）；Nucleic Acid Hybridization（B.D.Hames and S.J.Higgins, Eds. 1984）；Transcription and Translation（B.D.Hames and S.J.Higgins, Eds. 1984）；Animal Cell Culture（R.I.Freshney, Ed. 1986）；Immobilized Cells and Enzymes（IRL Press, 1986）；B.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning（1984）；the series, Methods in Enzymology（Academic Press, Inc.）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell（J.H.Miller and M.P.Calos, Eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory）, Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155（各々Wu and Grossman, and Wu, Eds.）, （Mayer and Walker, Eds.）（1987）；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology（Academic Press, London）,Scopes,（1987）；Protein Purification：Principles and Practice, Second Edition（Springer-Verlag, N.Y.）；並びにHandbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV（D.M.Weir and C.C.Blackwell,Eds 1986）を参照のこと。上述され及び後述される本明細書に言及される全ての特許、特許出願及び出版物は、引用により本明細書に組み込まれる。
DNA構成物：Microbix Biosystemsから得たAd5 pXC1プラスミドから、Xba Ｉ及びBgl2制限酵素を用いて、ヌクレオチド1339〜3328を切り出した。pXC1は塩基対22〜5790からのAd５配列を含む。ヌクレオチド1339〜3328は、E1B 55kD遺伝子のほとんどを含み；それは最後のＣ末端178塩基対を含まない。そのゲル精製したDNAフラグメントをHindIII部位をBgl2で置換した改良Bluescript（Stratagene Corporation）ベクター（pBS Bg1 ΔHin）にクローン化した。
1339〜3328フラグメントの両端及び内部にオリゴヌクレオチドを作った（図２を参照のこと）。それらオリゴは次の通りである。
これらのオリゴをPCRのために用いて、Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤで示す異なるフラグメントを作った。
次のフラグメントの対：Ａ及びＢ、Ａ及びＣ、Ａ及びＤを、各々ゲル精製したpXC1のBgl2／Xba1 7.9kbフラグメントに連結した。DH５α細胞への形質転換の後、陽性を探すためオリゴ：A5XBAT及びA5BGLBを用いてPCRによりスクリーニングした。米国特許5,008,182及びHedrum（PCR Methods and Applications 2：167〜71（1992）を参照のこと）。
これらの構成物は、E1B 55kD遺伝子内に以下のアミノ酸の欠失をコードするDNA配列を含む。
p019（pXC1-AB） フラグメントＡ及びＢから作ったもの AA 218-275の欠失
p020（pXC1-AC） フラグメントＡ及びＣから作ったもの AA 218-300の欠失
p021（pXC1-AD） フラグメントＡ及びＤから作ったもの AA 218-354の欠失
図２は、上述のフラグメントを示す。
各々の構成物の１つの陽性物に基づいてDNAmaxi prep（Qiagen）を行った。そのDNAを配列決定して欠失を確認した。プラスミドp019，p020及びp021は大腸菌に入れ、American Type Culture Collectionに寄託し、各々JN019，JN020、及びJN021で示す。American Type Culture Collection受託番号は、JN019についてATCC No.98286；JN020についてATCC No.98287；及びJN021についてATCC No.98288である。
ウイルス構成物：HEK293細胞に、Microbixから得たpBHGE3プラスミド、並びにプラスミドp019，p020及びp021の各々を同時トランスフェクトした。pBHGE3プラスミドは、塩基対188〜1339からのAd5 E1配列の欠失を含み、初期領域１内に挿入又は変異を有するAd5ベクターを作製するのに用いる。プラークを取り、部分的に欠失したE1B 55kD遺伝子の存在を確認するためにオリゴA5XBAT及びA5BGLBを用いて第１のプラグに基づいてPCR分析を行った。PCR法は、標的遺伝子材料を増幅するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブの使用を示すことが当該技術で公知である。例えば、米国特許4,683,202；4,683,195；5,091,310；5,008,182及び5,168,039を参照のこと。プラークを広げて、Qiagen QIAamp Bloodを用いてウイルスDNAを作った。欠失を確認するためにその欠失の上流及び下流でDNAを配列決定した。
免疫沈降データ：溶解したC33A細胞からのウイルスを用いる免疫沈降データは、（先のp019，p020及びp021に対応する）ウイルスONYX-019，ONYX-020及びONYX-021が、（ａ）Oncogene Sciencesからの抗19kD抗体を用いて、ONYX-015よりやや多くの19kDタンパク質を作るようであり；（ｂ）Oncogene Sciencesからの抗55kD抗体を用いて野生型55kDより低い分子量である55kD抗体を作り出し（ONYX-015は検出可能な55kDを作らないことに注意のこと）；及び（ｃ）abV Immune Responseからの抗アデノウイルス抗体を用いて、アデノウイルスに対する抗体と予想通り反応することを示した。
CPEデータ：ONYX-015をONYX-019，ONYX-020及びONYX-021と比較するC33Aを用いるCPEアッセイからのデータは、それら新しい株が、等価のCPE効果を得るのに必要なMOIにより測定して、ONYX-015より約２〜10倍大きい能力を有することを示した。
これらの実験は上述の通り行った。要約すると、野生型アデノウイルスタイプ２及び変異アデノウイルスONYX-015からONYX-019，ONYX-020及びONYX-021を、0.1，1.0，10、及び100のMOIで平行細胞培養物に加えた。PBSに懸濁したウイルスを１mlの容量で細胞ウエルに加えた。その接種した培養皿を、接種及び37℃、５％CO2で約１時間の吸着時間の中間点の直接にＸ−及びＹ軸の両方で振動させた。１時間の吸着時間の後、高グルコース及び２％胎児ウシ血清を含むDMEM ２mlを加え、その培養物を標準培養条件下で37℃、５％CO2でインキュベートした。感染後７日に、細胞培養物を、そのウイルス調製物による細胞殺害の効能を決定するために、20％メタノール中０．５％クリスタル・バイオレットで染色した。死んだ細胞を引き離し、ウエルからそそぎ出し、生きている細胞をウエル内に残し、染料で染色した。結果は、複製欠損組換えアデノウイルス調製物OXYX-015，ONYX-019，ONYX-020及びONYX-021が、非新生物細胞と比べて新生物細胞を優先的に殺すことができること、並びに野生型アデノウイルスタイプ２が、新生物及び非新生物細胞の両方をほぼ等しく十分に殺したことを示した。
その結果は、更に、ONYX-019，ONYX-020及びONYX-021が、等価のCPE効果を作り出すために必要とされるMOIにより測定して、ONYX-015よりC33A細胞を殺す能力が２〜10倍大きいことを示した。10，1.0，0.1及び0.01のMOI域にわたって実験を行い、ONYX-019，ONYX-020及びONYX-021は、0.1〜0.01のMOIにおいて増強された殺害を示した。
腫瘍細胞殺害への複製欠損組換えアデノウイルス及び化学療法の効果
我々は、次に、単独で、及び化学療法と組み合わせて、静脈内（IV）投与したONYX-015（dI 1521）の効能を研究した。ヒト腫瘍異種移植片（結腸、頸部）を、５〜７mmの大きさまで、ヌードマウスの皮下で増殖させ、この時に109の総pfuを投与を分割してIV注入した（１〜５日）。化学療法グループのマウスに、５日目に腹腔内（IP）注入で、最大許容投与量を５FU又はシスプラチヌムを与えた。対照には、同一の様式でIV及びIPビヒクル注入した。IV投与後の腫瘍内ウイルス複製に注目した。シスプラチヌム及び5-FUは生存率を大きく改善せず、又は腫瘍増殖を阻害しなかったが、ONYX-015単独では腫瘍増殖を大きく阻害し（40％〜60％）、生存率を改善した（ｐ＝0.05）。ONYX-015及び5-FU又はシスプラチヌムのいずれかでの組合せ療法は、いずれの単独の剤よりも生存率を大きく改善させた。これにより、ONYX-015は、化学療法で改善され得る、IV投与した時に選択的抗腫瘍活性を有する。
本発明は、理解を明快にする目的のために実例によりいくらか詳細に記述されるが、本請求の範囲内で特定の変換及び改良を実施することができることが明らかであろう。
本発明は、新生物哺乳動物細胞において後期領域遺伝子の複製及び／又は発現を行うことができるが、非新生物細胞において本質的に複製できない組換え細胞変性ウイルスの組成物、これら組換えウイルスを作製し及び増殖させるための方法、これら組換えウイルスで新生物病を治療するための方法、並びにこれら組換えウイルスを含む治療用組成物を供する。
背景
正常な細胞の増殖は、増殖抑制腫瘍抑制遺伝子と釣り合う増殖促進プロトオンコジーンにより制御されると考えられる。プロトオンコジーンの活性を強化する変異は新生物細胞の増殖を強化するオンコジーンを作り出す。逆に、一般に不活性化腫瘍サプレッサー対立遺伝子についてホモ接合である細胞を導く変異による、腫瘍サプレッサー遺伝子を不活性化する遺伝子障害は、これらの遺伝子により課せられる正常な複製制限から細胞を解放し得る。通常、活性化オンコジーン（即ち活性化構造又は制御変異を含むプロトオンコジーン）の形成と組み合わされた不活性化腫瘍サプレッサー遺伝子（例えばｐ53，RB，DCC，NF-1）は、本質的に非制限性の増殖を行うことができる新生物細胞（即ち形質転換細胞）を作り出し得る。
細胞のオンコジーンの形質転換は、細胞の代謝、生理及び形態にいくつかの変化を導く。オンコジーンを形質転換された細胞の１つの特徴的な変化は細胞増殖制御遺伝子の適切な発現により正常に行われる細胞増殖及び分化への制限に対する応答の喪失である。
遺伝子変化の異なる型の全てが細胞増殖制御遺伝子の発現又は機能を変化させ、異常な増殖を導くが、正常な細胞の悪性のものへの新生物形質転換を導くために１超の出来事が要求される（Landら（1983）Nature 304：596；Weinberg RA（1989）Cancer Res. 49：3713）。ほとんどの細胞型について悪性形質転換を導く正確な分子の経路及び二次的変化は明らかでない。細胞周期制御機能を有するいくつかのタンパク質及び／又は機能的な転写複合体、例えばｐ53及びRBの形成に関連するいくつかのタンパク質の発現又は活性を変えることは、細胞において増殖制御を失わせ得る（Ullrichら（1992）J.Biol.Chem. 267：15259；Hollsteinら（1991）Science 253：49；Sager R（1992）Curr.Opin.Cell.Biol. 4：155；Levineら（1991）Nature 351：453）。
いくつかのオンコジーンが特定の癌の重要な画分において特徴的な活性化変異を有することが見い出されている。例えば、ras H 及びrasKコーディング領域（例えばコドン12、コドン61；Paradaら（1984）Nature 312：649）並びにAPC遺伝子（Powellら（1992）Nature 359：235）における特定の変異は培養細胞のオンコジーンの形質転換に関連し、著しい割合の特定のヒトの癌に存在する（例えば結腸腺癌、膀胱癌、肺癌及び腺癌、肝臓癌）。これらの発見は、このようなオンコジーンの活性化形態を特異的に認識する診断及び治療剤（例えばポリヌクレオチドプローブ及び抗体）の開発を導いた（米国特許4,798,787号及び4,762,706号）。
他のオンコジーン、例えばmyc，erbB-2及びpim-1の過剰な又は不適切な発現は、そのコーディング領域において活性化変異の存在を必ずしも要求することなくオンコジーンの形質転換を強化することができるようである。erbB-2の過剰発現は前胸部、胃、及び卵巣の腺癌において頻繁に見い出され、これらの細胞型におけるerbB-2レベルは新形成のための診断マーカーとして機能し得るであろうし、及び／又は特定の腫瘍表現型（例えば特定の薬剤、増殖率、分化状態）と相関し得るであろう。
種々のオンコジーン（米国特許4,736,866及び米国特許5,087,571）又は機能的に破壊されたサプレッサー遺伝子Donehowerら（1992）Nature 356：215）を有するトランスジェニック動物が、他の潜在的な使用の中でも発癌物質スクリーニングアッセイにおける使用について記載されている。
この形質転換された表現型及び新形成の基となる分子メカニズムのより規定されたモデルを開発することの進行にかかわらず、結果の出る慣用的な化学療法を超える癌を治療するのに適用できる有用な治療方法はほとんどない。多くの慣用的な化学療法剤は、低い治療示数を有し、治療投与レベルは毒性である投与レベルであるか又はそれに近い。ほとんどの慣用的な化学療法剤の毒性の副作用は喜ばしくなく、他の副作用の中でも生命をおびやかす骨髄抑制を導く。
先天性の病気、例えば嚢胞性繊維症を引きおこす欠損対立遺伝子を正す又はそれを補給するために遺伝子療法を行うための現在のアプローチは、限られた最初の成功例の報告と共に試みられてきた。いくつかの遺伝子治療アプローチは、複製欠損組換えアデノウイルスを用いて、欠損対立遺伝子の機能的複製を発現することができるポリヌクレオチド配列を生体内の細胞に形質導入することに関する（Rosenfeldら（1992）Cell 68：143）。これらの遺伝子療法のいくつかはポリヌクレオチドを、患者から外植された単離された細胞に形質導入することにおいて効能があるが、生体内で極めて効能があることが示されていない。腫瘍壊死因子（TNF）及びインターロイキン−２（IL-2）をコードするポリヌクレオチドでの外植された腫瘍細胞の形質導入に依存する癌への治療的試みが記述されている（Pardoll D（1992）Curr.Opin.Oncol. 4：1124）。
遺伝子療法が、生体内の形質転換された細胞においてオンコジーン又は腫瘍サプレッサー遺伝子の欠損対立遺伝子を正すのに適合することが可能であるといつか判明するかもしれないが、現在の遺伝子療法は、その場で新形成の実際の遺伝子療法のための十分な割合の新生物細胞を（例えば相同的組換えにより）有効に形質導入し、及び正確に標的化することができると報告されていない。癌の生物学の性質は、新生物細胞の実質的な画分、好ましくは形質転換された細胞のクローン化子孫の全てが有効な治療効果のために除去されることを要求する。更に、遺伝子療法のための現在の方法は極めて高価であり、患者への再導入の前に外植された細胞の生体外培養を要求する。このような方法の広範囲の適用は、それらが有効であるとしても、禁止的に高価であろう。
これにより、新形成病の診断及び治療のための方法及び組成物、特に慣用的な抗新生物化学療法の典型である非新生物細胞の不必要な殺害なく新生物細胞を選択的に排除する方法についての必要性が当該技術においてある。
本明細書で議論される引例は、もっぱら本出願の出願日前のそれらの開示のために供される。本発明者らが、先行技術の発明に関してそれらの開示に先立つ資格はないという許可として本明細書で解釈されるべきものはない。
発明の概要
本発明は、非新生物細胞において実質的に複製欠損であり、新生物細胞において少くとも部分的に複製表現型を示す組換えアデノウイルスを、新生物細胞に感染させることにより、新生物細胞を排除するためのいくつかの新規な方法及び組成物を供する。新生物及び非新生物細胞における本発明のアデノウイルス構成物の複製表現型の差は、癌のウイルスベースの治療についての生物学的基礎を供する、アデノウイルスの細胞変性効果の発現、及び負−選択性薬剤遺伝子（例えばHSV tk）の任意の発現は、本発明の組換えアデノウイルス構成物が感染した新生物細胞の特徴的なアデノウイルス複製表現型と相関し、これにより新生物細胞と非新生物細胞とを識別し、新生物細胞の選択的な毒性を供する。本方法は特にアデノウイルス構成物について詳述されるが、本方法は、有効な複製が非新生物細胞中に存在するが、新生物細胞中に実質的に欠如し又は非機能的である宿主細胞タンパク質（例えばｐ53，RB）の結合及び／又は隔離及び／又は不活性化を要求する。
アデノウイルスが細胞内で有効に複製するために、アデノウイルスE1b遺伝子産物ｐ55は宿主細胞ｐ53タンパク質との複合体を形成し、それによりｐ53を隔離及び／又は不活性化し、ｐ53機能が欠損した細胞を作り出す。このように作られたｐ53機能が欠損した細胞はアデノウイルスの複製を支持し得る。この方法において、野生型アデノウイルスは、アデノウイルスｐ55タンパク質が宿主細胞ｐ53タンパク質を不活性化及び／又は隔離するので、ｐ53を含む細胞において複製することができる。本発明の一実施形態において、感染した細胞において実質的にｐ53タンパク質との機能的複合体を形成することができない変異ｐ55タンパク質をコードするE1b座を含む組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスによって感染され得る新生物細胞を含む個体又は細胞集団に投与される。組換えアデノウイルスが感染した非新生物細胞においてｐ53タンパク質を実質的に有効に隔離できないことは、形質導入された組換えアデノウイルスポリヌクレオチドが非新生物細胞において複製表現型を発現できないことになる。対照的に、機能的ｐ53タンパク質を欠く新生物細胞は、アデノウイルスの細胞毒性効果及び／又は複製表現型につながる負の選択遺伝子の発現により新生物細胞の除去を導く形質導入された組換えアデノウイルスによる複製表現型の発現を支持する。これらの実施形態の好ましいバリエーションにおいて、組換えアデノウイルスは、実質的にｐ53に結合できない変異ｐ55をコードするE1b座を含み、任意に、（E1aポリペプチドの存在下でアデノウイルス初期領域遺伝子の発現を阻害することができない）機能的なｐ19タンパク質も欠如し得る。本発明の組換えアデノウイルスは、増強された細胞変性効果を作り出す変異ｐ19遺伝子を更に含み得る；当該技術で周知のこのような変異体はp19 cyt変異体遺伝子である。しかしながら、感染の間のウイルスDNAの一体性を維持するためにいくつかの変異体において機能的ｐ19を保持することが好ましい。
他の本発明の実施形態において、感染した細胞においてRBタンパク質との複合体を形成することが実質的にできないE1aタンパク質（例えばp289R又はp243R）をコードするE1a座を含む組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスにより感染され得る新生物細胞を含む個体又は細胞集団に投与される。組換えアデノウイルスが感染した非新生物細胞においてRBタンパク質を実質的に有効に隔離できないことは、形質導入された組換えアデノウイルスポリヌクレオチドが非新生物細胞において複製表現型を発現できないことになる。対照的に、機能的なRBタンパク質を欠如する新生物細胞は、アデノウイルス細胞変性効果及び／又は複製表現型につながった負の選択遺伝子の発現により新生物細胞の排除を導く形質導入された組換えアデノウイルスにより複製表現型の発現を支持する。これらの実施形態の好ましいバリエーションにおいて、組換えアデノウイルスは、RB（及び／又は300kDポリペプチド及び／又は107kDポリペプチド）に結合することができるCR１及び／又はCR２ドメインを欠如するが、アデノウイルス初期遺伝子のトランスアクチベーションを行うことができる機能的CR３ドメインを含む変異E1aタンパク質（例えばp289R）をコードするE1a座を含む。これらの実施形態の更なるバリエーションは、結合してRBを不活性化するタンパク質を実質的に発現することができない非機能的E1a座を含み、そして任意に、（E1a機能の欠如下でアデノウイルス初期領域遺伝子の発現を刺激することができきる）機能的ｐ19タンパク質も含み得る。本発明の組換えアデノウイルスは、増強された細胞変性効果を作り出す変異ｐ19遺伝子を更に含み得；このような当該技術で周知の変異体はp19 cyt変異遺伝子である。
本発明は、非新生物細胞中で複製欠損であるが、機能的ｐ53及び／又はRBを欠く新生物細胞中で複製表現型を発現することができる新規の組換えアデノウイルス構成物を供する。新規な組換えアデノウイルス構成物は、E1a及び／又はE1b遺伝子領域中に、特にE1b p55タンパク質並びにE1a p289R又はp243Rタンパク質のCR１及びCR２ドメインをコードする配列中に、欠失又は点変異のような変異を含む。特定の実施形態において、負の選択遺伝子、例えばHSV tk遺伝子は負の選択遺伝子が複製表現型を発現する感染した細胞（即ち新生物細胞）において優先的に転写されるように、E1a又はE1b変異も含み組換えアデノウイルス構成物において、初期領域（例えばＥ２，E1a，E1b）エンハンサー／プロモーター、後期領域遺伝子エンハンサー／プロモーター（例えば主要後期プロモーター）、又はCMVエンハンサーを伴う初期もしくは後期領域プロモーターに作用可能に連結され、有効量の負の選択剤（例えばガンシクロビル、FIAV）の投与により細胞の負の選択を供する。負の選択遺伝子は、E1a(-)複製欠損変異体、E1b(-)複製欠損変異体、又はE1a／E1b二重変異体を各々同時に形成するために、E1a及び／又はE1b構造配列の場所に挿入され得る。
生体内の新生物細胞集団へのデリバリーのための医薬として許容される形態において上述の組換えアデノウイルスを含む抗新生物組成物も供する。
本発明は、ｐ53及び／又はRBに結合し及び／又はそれらを不活性化するための機能的タンパク質を欠如する組換えパポーバウイルス、例えばヒトパピローマウイルス（HPV）、ポリオーマウイルス（例えばBK，JC）及びSV40も供する。機能的なＥ６タンパク質の発現を欠如するヒトパピローマウイルス変異体は、ｐ53を有効に分解する能力を実質的に欠如し、これによりp53(-)細胞中で複製表現型を示すことができるが、機能的ｐ53の十分なレベルを含む細胞ではそうでないであろう。機能的Ｅ７タンパク質の発現を欠如するヒトパピローマウイルス変異体は、RBに有効に結合する能力を実質的に欠如し、これによりRB (-)細胞中で複製表現型を示すことができるが、機能的RBの十分なレベルを含む細胞内ではそうでないであろう。機能的Ｅ６タンパク質及び機能的Ｅ７タンパク質の両方の発現を欠如するヒトパピローマウイルス変異体は、RB及びｐ53に有効に結合する能力を実質的に欠如し、これにより、p53(-) RB(-)細胞中で複製表現型を示すことができるが機能的RB及び／又はｐ53の十分なレベルを含む細胞ではそうでないであろう。
本発明は、非新生物細胞集団における発現と比べて新生物細胞集団において複製表現型を及び／又は細胞変性効果を優先的に発現することができる組換えウイルスを患者に投与するステップを含む新形成病を治療するための新規方法も供する。
図面の簡単な記載
図１は、アデノウイルスE1a-289Rポリペプチドのドメイン構造及びタンパク質−タンパク質相互作用の概略図を示す。
図２は、プラスミドp019，p020、及びp021の作製を概略図で示す。
定義
他に定義されなければ、本明細書に用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のいずれの方法及び材料も本発明の実施又はテストに用いることができるが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目的のため、次の用語を以下に定義する。
対象に適用する時に本明細書に用いる用語“天然”とは、対象が天然に見い出され得ることをいう。例えば、天然のソースから単離することができる（ウイルスを含む）生物中に存在し、研究室においてヒトにより意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列が天然である。本明細書に用いる場合、用語“組換え体”とは、ポリヌクレオチド構成物（例えばアデノウイルスゲノム）が、部分的にヒトによる意図的な改変により形成されていることを示す。
本明細書に用いる場合、用語“複製欠損ウイルス”とは、ウイルス複製表現型の発現を支持し、非複製非形質転換細胞の特徴的な正常なｐ53及びRB機能を含む細胞において実質的に、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、又は複製表現型を発現できない所定の細胞集団（例えばｐ53及び／又はRB機能を実質的に欠如する細胞）において優先的に、細胞増殖を阻害し又はアポトーシスを誘導するウイルスをいう。典型的には、複製欠損ウイルスは、正常なRB及び／又はｐ53機能を含む細胞へのプラーク効率の実質的な減少を示す。
本明細書に用いる場合、用語“ｐ53機能”とは、ｐ53遺伝子によりコードされるポリペプチドであって、そのｐ53ポリペプチドが野生型アデノウイルス２又は５のE1b p55タンパク質に結合することができるポリペプチドの（同じ組織型の非新生物細胞に対して）本質的に正常なレベルを有する特性をいう。例えば、ｐ53機能は、ｐ53の不活性（即ち変異）形態の生産により又はｐ53ポリペプチドの発現の実質的な減少もしくは完全な損失により失われ得る。また、ｐ53機能は、野生型ｐ53タンパク質をコードするｐ53対立遺伝子を含む新生物細胞において実質的に欠如し得る；例えば、ｐ53の異常な亜細胞プロセッシング又は局在化を生じる変異（例えば核より細胞質において主にｐ53の局在化を生じる変異）のようなｐ53座の外側の遺伝子変異がｐ53機能を失わせ得る。
本明細書に用いる場合、用語“RB機能”とは、RB遺伝子によりコードされるポリペプチドであって、そのRBポリペプチドが野生型アデノウイルス２又は５のE1bタンパク質に結合することができるポリペプチドの（同じ組織型の非新生物細胞に対して）本質的に正常なレベルを有する特性をいう。例えば、RB機能は、RBの不活性（即ち変異）形態の生産により又はRBポリペプチドの発現の実質的な減少もしくは完全な損失により失われ得る。また、RB機能は、野生型RBタンパク質をコードするRB対立遺伝子を含む新生物細胞において実質的に欠如し得る；例えば、RBの異常な亜細胞プロセッシング又は局在化を生じる変異のようなRB座の外側の遺伝子変異がRB機能を失わせ得る。
本明細書に用いる場合、用語“複製表現型”とは、複製欠損アデノウイルスのようなウイルスが感染した細胞の１又は複数の以下の表現型特性をいう：（１）キャプシドタンパク質（例えばアデノウイルスのペントンベースポリペプチド）のような後期遺伝子産物又はウイルスの後期遺伝子プロモーターから開始するRNA転写物の実質的な発現、（２）ウイルスゲノムの複製又は複製中間体の形成、（３）ウィルス粒子又はパッケージングされたビリオン粒子のアセンブリー、（４）感染した細胞における細胞変性効果（CPE）の出現、（５）ウイルス溶解サイクルの完了、及び（６）機能的オンコプロテインをコードする野生型複製コンピテントDNAウイルスが感染した非新生物細胞におけるｐ53又はRB機能の廃止を典型的に条件とする他の表現型変化。複製表現型は、先に列記された表現型特性のうちの少くとも１つ、好ましくは表現型特性の１超を含む。
用語“抗新生物複製欠損ウイルス”とは、本明細書において、同じ組織的細胞型の感染した非複製非新生物細胞に対する感染した新生物細胞の優先的な細胞殺害により、ヒトにおける新形成の発達又は進行を阻害する機能的特性を有する組換えウイルスをいうのに用いられる。
本明細書に用いる場合、“新生物細胞”及び“新形成”とは、それらが細胞増殖の制御の大きな損失を特徴とする異常な増殖表現型を示すように、比較的自主的な増殖を示す細胞をいう。新生物細胞は、活性的に複製し得る、又は一時的な非複製の休止状態（Ｇ1又はＧ0）にある細胞を含み；同様に、新生物細胞は、十分に分化した表現型、ほとんど分化していない表現型を有する細胞、又は両方の細胞型の混合物を含み得る。これにより、必ずしも全ての新生物細胞が所定の時点で細胞を複製することは必要でない。新生物細胞として定義されるセットは、良性の新生物の細胞及び悪性（又は明らかな）新生物の細胞からなる。明らかな新生物細胞は、頻繁に、癌と呼ばれ、典型的には、内胚葉もしくは外胚葉組織起源の細胞由来なら癌腫、又は中胚葉由来の細胞型起源なら肉腫と呼ばれる。
本明細書に用いる場合、用語“作用可能に連結”とは、機能的関係でのポリヌクレオチド要素の連結をいう。核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係があるように配置されるなら、“作用可能に連結”される。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を与えるなら、コーディング配列に作用可能に連結される。DNA配列が作用可能に連結される手段は、典型的には連続的であり、必要なら、２つのタンパク質コーディング領域を、連続的かつ読み枠内に連結する。しかしながら、エンハンサーは、数キロベース、プロモーターから離れた場合に機能し、イントロン配列は種々の長さであり得るので、特定のポリヌクレオチド要素は連続的でなくとも作用可能に連結され得る。
本明細書に用いる場合、“生理条件”とは、完全な哺乳動物細胞又は生きている哺乳動物の組織空間又は器官における条件と実質的に同様のイオン強度、pH、及び温度を有する水性環境をいう。典型的には、生理条件は、約150mMのNaCl（又は任意にKCl）、pH6.5〜8.1、及び約20〜45℃の温度を有する水溶液を含む。一般に、生理条件は、生物高分子の分子間会合のための適切な結合条件である。例えば、150mM NaCl、pH7.4、37℃の生理条件が一般に適切である。
詳細な記載
一般に、以後用いる命名法及び以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、及び分子ウイルス学における研究手順は公知かつ当該技術に一般に用いられるものである。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、ポリペプチド合成、（複製欠損ウイルスストックをトランスコンプリメンテーション可能な細胞系を含む）ウイルスストックの形成及び増殖、及び細胞培養等のために標準的な技術が用いられる。一般的な酵素反応及びステップは、製造元の説明に従って行われる。それら技術及び手順は、当該技術における慣用的な方法及び本文献全体を通して供される種々の一般的な引用文献（一般に引用により本明細書に組み込まれるSambrookらMolecular Cloning：A Laboratory Manual, 2d ed.（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Virology, Second edition, eds. Fields BN及びKnipe DM,（1990）Raven Press, New York, NYを参照のこと）に従って一般に行われる。それらの手順は当該技術で公知であると思われ、読者の便利さのために供される。ここに含まれる全ての情報は引用により本明細書に組み込まれる。
新形成は、部分的に、変異体遺伝子型及び表現型を有する新生物細胞の形成を特徴とする病理的状態である。特定の腫瘍は、RB機能を欠くがｐ53機能を有する細胞の集団を含み；これら細胞はRB(-)で示される。特定の腫瘍細胞はｐ53機能を欠如し、RB機能を有し得る；このような細胞をp53(-)で示す。特定の腫瘍はｐ53及びRBの両方を欠如する細胞を含み得、これをp53(-) RB(-)で示す。細胞系SAOS2（以下の実験例を参照のこと）は、p53(-) RB(-)である新生物細胞型の例である。また、ｐ53及びRBの本質的に正常なレベルを含む新生物細胞も存在し得る；このような正常なｐ53及び正常なRBの両方を有する細胞は、このような新生物細胞中で複製表現型を優先的に示し得る抗新生物ウイルス構成物のための基礎を供し得る他のオンコプロテイン（例えばｐ53又はRB以外の腫瘍サプレッサー遺伝子産物）を欠如し得る。
本発明の基礎は、哺乳動物細胞に感染するいくつかのDNAウイルス（例えばアデノウイルス；パポーバウイルス、例えばBK及びJC，SV40、及びパピローマウイルス、例えばHPV等）が、ウイルス複製サイクルを通しての有効な進行のために本質的であるウイルスタンパク質をコードし；これらのウイルスタンパク質のうちのいくつかは、有効なウイルス複製のための必要条件として、細胞のタンパク質、例えば転写複合体の細胞サイクル制御及び／又は形成に関連するものを隔離する。ｐ53及びRBのような細胞タンパク質に結合し、それを隔離し、又はそれを分解するウイルスタンパク質の欠如下において、ウイルス複製が実質的に阻害される。ｐ53及び／又はRBを隔離し又は分解する能力を欠如する変異ウイルスが感染した正常な（即ち非新生物）細胞は、一般に変異ウイルスの複製を支持することができず、従ってこのような変異ウイルスは複製欠損であると考えられる。しかしながら、ｐ53又はRBの隔離又は分解は、機能的なｐ53又はRBを欠如する細胞（これらの細胞を各々p53(-)及びRB(-)で示す）におけるウイルス複製のために必要でないので、ｐ53及び／又はRB隔離又は分解について欠損している複製欠損変異ウイルスは、本質的に正常なｐ53及び／又はRB機能を有する細胞におけるよりかなりの程度、これらp53(-)又はRB(-)において複製表現型を発現し得ることが可能である。新生物細胞は、頻繁に、ｐ53機能（p53(-)細胞）、RB機能（RB(-)細胞）、又は両方の機能（p53(-) RB(-)細胞）を欠如する。従って、いくつかの複製欠損ウイルス変異体は、新生物細胞において複製表現型を優先的に示し得る。
機能的なRB不活性化タンパク質（例えばアデノウイルスE1a，HPV E7タンパク質）を発現する能力を欠如するウイルス変異体は、RB(-)細胞及びPB(-) p53(-)細胞において複製表現型を示すであろう。機能的なｐ53不活性化タンパク質（例えばアデノウイルスE1b p55，HPV E6タンパク質）を発現する能力を欠如するウイルス変異体は、p53(-)細胞及びRB(-) p53(-)細胞において複製表現型を示すであろう。機能的なｐ53不活性化タンパク質（例えばアデノウイルスE1b p55，HPV E6タンパク質）及び機能的なRB不活性化タンパク質（例えばアデノウイルスE1a，HPV E7タンパク質）の両方を発現する能力を欠如するウイルス変異体は、RB(-) p53(-)細胞において複製表現型を示すであろう。それゆえ、複製表現型の発現につながる細胞毒性は、PB(-)，p53(-)、又はPB(-) p53(-)表現型を有する新生物細胞を優先的に殺すための基礎として用いることができる。いくつかの複製非新生物細胞は細胞周期を通して進行する間、一時的にRB(-)表現型、p53(-)表現型、又はRB(-) p53(-)表現型を示し得るが、本発明のウイルス変異体は、たとえ新生物細胞の完全な選択的な殺害が必ずしもなくても、単独で又は他の治療のモダリティーと組み合わせて用いるべき有用な抗新形成治療モダリティーを有利に構成するのに用いることができる。HPV E7ポリペプチドの37アミノ末端残基における欠失（又は他の不活性化変異）は、これらの残基はRB結合のために重要であるので、RB(-)細胞への適用のための好ましいHPV変異体である。
以下に供される方法及び組成物は複製欠損アデノウイルス構成物に関する方法について詳しく記載されるが、本発明は、ｐ53タンパク質又はRBタンパク質の分解を隔離し又は増強するオンコプロテインをコードする他のDNAウイルス、例えば各々ｐ53及び／又はRB機能を実質的に廃止するＥ６及び／又はＥ７遺伝子中に変異を含む複製欠損パピローマウイルス種（例えばHPV16，18，33型の変異体）で実施することができる。Adenoviridae科のメンバー（特にMastadenovirus属）に加えて、ｐ53又はRBを隔離及び／又は不活性化するウイルスタンパク質をコードするPapovaviridae科のメンバー、特にパピローマウイルス及びポリオウイルスが本発明の方法に適すると思われる。
アデノウイルス及びパポーバウイルスの生物学の一般的な記載について、引用により本明細書に組み込まれるVirology、第２版、eds. Fields BN and Knipe DM, Vol.2, pp.1651〜1740が導入のために言及され得る。以下の特定の記載は、これらに限らないが、アデノウイルス抗原型５及びアデノウイルス抗原型２に言及する。他のアデノウイルス抗原型を用いることができると思われるが、アデノウイルス５型が、E1aウイルス遺伝子領域のウイルスによりコードされたポリペプチドのウイルスヌクレオチド及びアミノ酸ナンバリングのヌクレオチドナンバリング変換、及び他のウイルス遺伝子のための便利な引用を供する。当業者は、他のアデノウイルス抗原型における対応する位置を直ちに同定するであろう。ヒトパピローマウイルスへの引用は、一般に、新形成に関連する型（例えば16，18又は23型）に言及する。但し、非オンコジーン型も用いることができる。
E1b変異体
細胞ホスホプロテインｐ53の機能は、細胞周期を通じての哺乳動物細胞の進行を阻害することである。野生型アデノウイルスE1b p55タンパク質は、ｐ53を有する感染した細胞内でｐ53に結合し、おそらく不活性形態においてｐ53を隔離することにより、ｐ53機能の実質的不活性化をおこす。機能的E1b p55タンパク質は機能的ｐ53を含む細胞における有効なアデノウイルス複製に本質的である。従って、ｐ53に結合する能力を実質的に欠如するアデノウイルスは機能的ｐ53の正常なレベルを有する非複製非新生物細胞において複製欠損である。
ヒト腫瘍細胞は、頻繁に、変異した（例えば置換、欠失、フレームシフト変異体）ｐ53対立遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合であり、細胞周期の正常な制御のために必要なｐ53機能を欠如する（Hollsteinら（1991）Science 253：49；Levineら（1991）前掲、引用により本明細書に組み込まれる）。これにより、多くの新生物細胞はp53(-)である。なぜならそれらは十分なレベルのｐ53タンパク質を欠如するから及び／又はそれらは、実質的なｐ53機能を行うことができず、（例えば機能的な多量体の形成を阻害することにより）野生型ｐ53が存在し得る場合でさえ実質的にｐ53機能を排除し得るｐ53の変異体形態を発現するからである。いくつかの新生物細胞は本質的に野生型のｐ53タンパク質をコードする対立遺伝子を含み得るが、ｐ53機能を実質的に廃止する第２の部位変異、例えば核でなく細胞質に局在化するｐ53タンパク質を生ずる変異を含み得る；このような第２の部位変異も実質的にｐ53機能を欠如する。
ｐ53と複合体形成する能力を欠如するが、他の本質的なウイルス複製機能を実質的に保持する複製欠損アデノウイルス種は、ｐ53機能を欠損する細胞（例えば、実質的に削除されたｐ53対立遺伝子についてホモ接合である細胞、本質的に非機能性である変異ｐ53タンパク質を含む細胞）中で複製表現型を示すであろうが、非複製非新生物細胞中では複製表現型を示さないであろう。このような複製欠損アデノウイルス種は、本明細書において、E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルスとして便利のため言及される。
ｐ53機能を欠如する新生物細胞の副次集団及び本質的に正常なｐ53機能を発現する非新生物細胞の副次集団を含む細胞集団（例えば細胞培養混合物又はヒト癌患者）は、感染条件（例えば細胞集団のアデノウイルス感染に適した条件、典型的には生理的条件）下で、E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルスの感染投与量を含む組成物と接触させることができる。このような接触は、E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルスの細胞集団への感染を引きおこす。その感染は、ｐ53機能を欠如する新生物細胞の副次集団を含む細胞の重大な画分において複製表現型の優位な発現を引きおこすが、本質的に正常なｐ53機能を有する非新生物細胞の副次集団において複製表現型の実質的な発現を引きおこさない。感染したp53(-)細胞における複製表現型の発現は、例えば細胞変性効果（CPE）、細胞溶解、アポトーシス等により、細胞を殺し、これによりその細胞集団から新生物p53(-)細胞を選択的に排除する。
典型的には、p53(-)新生物細胞の選択的殺害に適したE1b-p53(-)複製欠損アデノウイルス構成物は、E1b p55ポリペプチドがｐ53タンパク質に有効に結合する能力を不活性化する変異（例えば欠失、置換、フレームシフト）を含む。このような不活性化変異は、典型的には、ｐ53に結合するｐ55の領域内でおこる。任意に、変異体E1b領域は、E1b領域の残りによりコードされ、E1aポリペプチドの欠如下でアデノウイルス初期遺伝子のトランスアクチベーションにおいて機能する機能的ｐ19タンパク質をコードし、発現する。
本発明の方法及び組成物に用いるための適切なE1b-p53(-)複製欠損アデノウイルス構成物は、以下の例に限らないが、（１）ｐ55タンパク質の翻訳の開始のために用いたAUGコドンの３アミノ酸下流に停止コドンを作り出すヌクレオチド位置2022におけるＣからＴへの変異並びにヌクレオチド3336に第２の停止コドンを作り出す小さなリンカー挿入で置換されたヌクレオチド2496と3323との間の欠失を含むアデノウイルスタイプ2 dI 1520（p19タンパク質の発現は本質的に影響を受けない）（引用により本明細書に組み込まれるBarker及びBerk（1987）Virology 156：107）、並びに（２）少くとも位置2022の変異及び／又は2496〜3323欠失変異を含むアデノウイルスタイプ2 dI 1520、又はその実質的な部分、並びにp19 cyt変異体を作り出すｐ19における更なる変異を含む複合アデノウイルス構成物（ここで、その複合ウイルス構成物はｐ55を欠如し、p19 cyt変異の増強された細胞変性効果を含む）を含む。Ad2 dI 1520はDr.A.Berk（Vniversity of California at Los Angeles, Los Angeles, CA）から利用でき、引用により本明細書に組み込まれるBarker及びBerk（1987）（Virology 156：107）に記載される。
さもなければE1b-p53(-)変異体の複製を支持するであろう新生物細胞において感染性ビリオンの形成を阻害するために、これらのアデノウイルスに更なる変異を組み込むことが好ましい。このような更なる不活性化変異は、隣接する細胞に広がり及びそれに感染することができる感染性ウイルスを形成する完全なウイルス複製が不要である治療モダリティーに好ましいであろう。これらの十分に不活性化された変異体は、非複製性E1b-p53(-)変異体として言及される。このような非複製性変異体は、p53(-) RB(-)細胞中でさえ感染性ビリオンの形成を防ぐ変異を含み；このような変異は、典型的には、本質的なビリオンタンパク質又はプロテアーゼにおける構造的変異である。
しかしながら、多くのモダリティーにおいて、変異体ウイルスが複製し、他の細胞に広がって感染し得る変異体ウイルスゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、これにより変異体ウイルスの最初の投与の抗新生物作用を増幅させることが要求される。
ｐ53に結合する能力を欠如する更なるE1b(-)変異体は、ｐ55ポリペプチドをコードするE1b遺伝子領域中に変異を形成し、変異体ｐ55ポリペプチドを発現させ、その変異体ｐ55ポリペプチドを水性結合条件下でｐ53又はｐ53の結合フラグメントに接触させ、そして本発明に用いるのに適した候補E1b(-)変異体であるとしてｐ53に特異的に結合しない変異体E1bポリペプチドを同定することにより当業者により作られ得る。
より典型的には、候補E1b(-)変異体を同定するために機能的アッセイが用いられよう。例えば、ｐ53機能の決定のためのFriendアッセイは、本質的に引用により本明細書に組み込まれるFrebourgら（1992）（Cancer Res. 52：6977）に記載されるように行われよう。ｐ53を不活性化する能力を欠如するE1b変異体は、候補E1b(-)複製欠損変異体として同定されよう。
E1a／E1b二重変異体
いくつかのヒト腫瘍細胞は、一方又は両方のタンパク質種の変異による不活性化及び欠失のいずれかにより、ｐ53機能及びRB機能の両方を欠如する。このような細胞はp53(-) RB(-)細胞と呼ぶ。
ｐ53に結合する能力を欠如し、RBに結合する能力も欠如するが、他の本質的なウイルス複製機能を実質的に保持する複製欠損アデノウイルス種はp53(-) RB(-)細胞において複製表現型を優先的に示すであろう。このような複製欠損アデノウイルス種は本明細書において便利のため、E1a-RB(-)／E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルス、又は単純にE1a／E1b二重変異体と呼ぶ。このようなE1a／E1b二重変異体は、E1a領域内の少くとも１のE1a-RB(-)変異及びｐ55をコードするE1b領域内の少くとも１のE1b-p53(-)変異を組み合わせてE1a／E1b二重変異体アデノウイルスを形成することにより当業者により作製され得る。このような複製欠損二重変異体アデノウイルスは、ｐ53及びRB機能の両方に欠損がある細胞において複製表現型を示すであろうが、非複製非形質転換細胞又はｐ53もしくはRB機能に欠損があり両方の機能がない細胞において複製表現型を実質的に示さないであろう。例えば、Ad5 dI 434変異体（Grodzickerら（1980）Cell 21：454、引用により本明細書に組み込まれる）は、E1a座の欠失及びE1b座の部分的欠失を含み、機能的なE1a及びE1b p55タンパク質をコードする能力を実質的に欠如する。
ｐ53及びRB機能を欠如する新生物細胞の副次集団及び本質的に正常なｐ53機能及び／又はRB機能を発現する非新生物細胞の副次集団を含む細胞集団（例えば細胞培養混合物又はヒト癌患者）は、感染条件（例えば細胞集団のアデノウイルス感染に適した条件、典型的には生理的条件）下で、複製欠損E1a／E1b二重変異体アデノウイルスの感染投与量を含む組成物と接触させることができる。このような接触は、E1a／E1b二重変異体複製欠損アデノウイルスの細胞集団への感染を引きおこす。その感染は、ｐ53機能及びRB機能を欠如する新生物細胞の副次集団を含む細胞の重大な画分において複製表現型の優位な発現を引きおこすが、本質的に正常なｐ53機能及び／又はRB機能を有する非新生物細胞の副次集団において複製表現型の実質的な発現を引きおこさない。感染したp53(-) RB(-)細胞における複製表現型の発現は、例えば細胞変性効果（CPE）、細胞溶解等により、細胞を殺し、これによりその細胞集団から新生物p53(-) RB(-)細胞を選択的に排除する。
さもなければE1a／E1b二重変異体の複製を支持するであろう新生物細胞において感染性ビリオンの形成を阻害するために、これらのアデノウイルスに更なる変異を組み込むことが好ましい。このような更なる不活性化変異は、隣接する細胞に広がり及びそれに感染することができる感染性ウイルスを形成する完全なウイルス複製が不要である治療モダリティーに好ましいであろう。これらの十分に不活性化された変異体は、非複製性E1a／E1b二重変異体として言及される。このような非複製性変異体は、p53(-) RB(-)細胞中でさえ感染性ビリオンの形成を防ぐ変異を含み；このような変異は、典型的には、本質的なビリオンタンパク質又はプロテアーゼにおける構造的変異である。
しかしながら、多くのモダリティーにおいて、変異体ウイルスが複製し、他の細胞に広がって感染し得る変異体ウイルスゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、これにより変異体ウイルスの最初の投与の抗新生物作用を増幅させることが要求される。
負の選択のウイルス構成物
感染した細胞におけるアデノウイルス複製表現型の発現は、一般に細胞溶解、細胞変性効果（CPE）、アポトーシス、又は他の細胞死のメカニズムによりウイルス誘導性の細胞毒性と相関するが、しばしば、抗新生物治療のために用いるべき組換えアデノウイルスの細胞毒性を増加させることが好まれる。このような増強は、典型的には複製表現型を発現する細胞中で正の転写調節を示すアデノウイルスプロモーターに作用可能に連結された。組換えアデノウイルス中の負の選択遺伝子を含む形態をとり得る。例えば、HSV tk遺伝子カセットは、Ad5 NT dI 1110のような複製欠損アデノウイルスのＥ３プロモーターの直下に作用可能に連結され得る。頻繁に、負の選択カセットを適合させるためにアデノウイルスゲノムの（例えばウイルス複製及びパッケージングのための）非本質的部分を削除することが要求され；これによりＥ３遺伝子領域の実質的な部分が削除され、Ｅ２プロモーター（及びエンハンサー）又は他の適切なプロモーター／エンハンサーに作用可能に連結されたHSV tk遺伝子のような負の選択カセットで置換され得る。あるいは、負の選択遺伝子は、後期遺伝子プロモーターからの転写を特徴とする複製表現型を発現する細胞において負の選択遺伝子産物の有効な発現を許容するためにアデノウイルス後期領域プロモーターに作用可能に連結され得る。
生体内で感染性ビリオンを形成するウイルス複製が不要である実施形態のために、非複製性であるアデノウイルス複製欠損構成物が用いられる。このような非複製性変異体は、E1a(-)及び／又はE1b(-)変異を含み、適切な新生物細胞（例えばp53(-)細胞、PB(-)細胞、又はp53(-) PB(-)細胞）において複製表現型を作り出すのに必要な全ての遺伝子機能を含むが、構造的コートタンパク質等のような感染性ビリオンの形成に必要な少くとも１の本質的な遺伝子機能を欠失している。あるいは、ウイルスにより誘発された顕在化された免疫応答は、感染性ビリオンを中和し、ウイルス感染の広がりを調節することができる。E1a及び／又はE1b変異に加えて補足性のトランス作用機能を欠如する非複製性変異体は、欠失したトランス作用機能を供することができる補足性ヘルパーウイルス又はヘルパー細胞系と合わせて増殖させることができる。例えば、トランスにおいてE1a及びE1b機能を供する293細胞系（ATCC # CRL1573；Grahamら（1977）J.Gen.Virol. 36：59、引用により本明細書に組み込まれる）は、ウイルスストックを発達させるための“非複製性”変異体の増殖を許容するために、ビリオンコートタンパク質等のようなトランスにおいて更なる機能を供するように改変され得る。
細胞におけるHSV tk遺伝子の発現は、その細胞がガンシクロビル又はFIAVのような負の選択剤に露出されなければ、その細胞に対して直接、毒性ではない。負の選択遺伝子が実質的に発現される複製表現型を発現する感染した細胞は、tk遺伝子を発現する感染した細胞が選択的に排除される時に、負の選択剤（例えばガンシクロビル）が有効な選択的投与量で投与されるまで、本質的に更なる毒性を作り出さない；これにより、負の選択は、細胞変性での殺害のため、及び／又は複製表現型を示す細胞を殺すことにより更なるウイルス複製を減衰させるために用いることができる。更に、負の選択剤の投与量及び／又は投与スケジュールを調節することにより、負の選択遺伝子を発現する感染した細胞集団の部分的排除のみを行うことが可能である。一般に、ガンシクロビルの投与量は、標準投与量−応答曲線を作り、感染した新生物細胞の要求されるレベルが観察される投与レベルを決定することにより較正される。ガンシクロビル（GANC）の動物への投与に関する情報は、パッケージ挿入物からヒトが指示する説明書を含む当該技術における種々のソースにおいて利用できる。細胞培養に用いる場合、ガンシクロビルの選択的濃度は、典型的には、0.05mM〜50mMの範囲、典型的には１mMであり、試験管内適用のために約0.2mMが用いられ、生体内適用のために約１〜５mMが投与される（典型的には、水溶液中125mg／mlのガンシクロビルが充填された浸透ポンプからの連続注入により約24時間にわたって投与される）。生体内投与のための投与スケジュールは、７日間、静脈内への５mg／kg体重B.I.D.の投与量のガンシクロビルを含み得る。
負の選択遺伝子は、E1a-RB(-)複製欠損アデノウイルス構成物、E1ba-p53(-)複製欠損アデノウイルス構成物、E1a／E1b二重変異体複製欠損ウイルス構成物等に組み込むことができる。好ましい実施形態は、tk発現カセットを形成するためにポリアデニル化部位と共にAd5 NT dI 1110のＥ２プロモーターもしくは他のプロモーター及び／又はエンハンサー（例えば主要後期プロモーター、E1aプロモーター／エンハンサー、E1bプロモーター／エンハンサー）に作用可能に連結したHSV tk遺伝子カセット（引用により本明細書に組み込まれる（Zjilstraら（1989）Nature 342：435；Mansourら（1988）Nature 336：348；Johnsonら（1989）Science 245：1234：Adairら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci（U.S.A.）86：4574；Capecchi, M.（1989）Science 244：1288）。tk発現カセット（又は他の負の選択発現カセット）は、例えばＥ３遺伝子の実質的欠失のための置換として、アデノウイルスゲノムに挿入される。他の負の選択遺伝子及び複製欠損アデノウイルス構成物は当業者に明らかであろう。Ｅ２プロモーターに作用可能に連結された負の選択遺伝子は、Ｅ２プロモーターが多重のE2F部位を含むので、E1a(-)複製欠損アデノウイルス変異体への組込みのための特に好ましい実施形態であり、RB機能を欠如するRB(-)及びp53(-) RB(-)は、おそらく、Ｅ２プロモーターからのより有効な転写を示すであろう。
診断及び試験管内での使用
本発明の複製欠損アデノウイルスは、ｐ53及び／又はRB機能を欠如する細胞の存在を検出するのに用いることができる。例えば、ｐ53及び／又はRBを欠損する新生物細胞の副次集団を含む細胞サンプルは、適切な複製欠損アデノウイルス種が感染し得る。適切なインキュベーション期間の後、複製表現型（例えばトリプトファン・ブルーを排除する能力の喪失、ビリオン形成、ウイルスDNAへの1Ｈ−チミジン組込み）を発現する細胞サンプル中の細胞は、その細胞サンプル中の複製性及び／又は新生物細胞の数又は集団の基準を供するために定量することができる。このような方法は、外植された細胞サンプル（例えばリンパ球の白血病のための化学療法の基礎となる患者からのリンパ球サンプル）に基づいて患者における化学療法に従い、新生物を診断し、及び／又は腫瘍細胞量を評価するために用いることができる。
他の診断的使用及びバリエーションは明らかである；例えばリポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）は、複製欠損アデノウイルスにおいて負の選択遺伝子のかわりに置換することができ；形質転換された細胞は、細胞においてｐ53及び／又はRBの欠如を示す複製表現型の発現と相関するリポーター遺伝子の発現により、（細胞サンプル又は形質転換アッセイのように）評価することができる。
治療方法
新生物病の治療は、E1a-RB(-)複製欠損アデノウイルス、E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルス、E1a／E1b二重変異体、及び負の選択遺伝子を更に含む複製欠損アデノウイルスを含む、本発明の複製欠損アデノウイルスを含む組成物を患者に投与することにより供され得る。
ｐ53及び／又はRB機能を欠如する細胞を含む種々のヒト新生物は、複製欠損アデノウイルスで処理することができる。例えばこれらに限らないが、気管支癌、鼻咽腔癌、喉頭癌、小細胞及び非小細胞肺癌、肺腺癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、乳癌、頸部癌、卵巣癌、又はリンパ性白血病を有するヒト患者又は非ヒト哺乳動物は、適切な複製欠損アデノウイルスの有効な抗新生物投与量を投与することにより治療することができる。感染性アデノウイルス粒子の懸濁液は、静脈内、腹腔内、筋内、皮下及び局所を含む種々の経路により新生物組織に適用することができる。１ml当り約103〜1012又はそれ超のビリオン粒子は、（例えば気管支癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、又は喉頭癌を治療するための肺デリバリーのために）霧として吸入しても、腫瘍（例えば気管支癌、鼻咽腔癌、喉頭癌、頸部癌）を治療するために腫瘍部位に直接ぬってもよく、又は（例えば卵巣癌を治療するために腹腔内に、肝臓癌又は他の非肝臓一次腫瘍からの肝臓転移を治療するため門脈に）注入又は他の適切な経路、例えば腫瘍塊（例えば乳腫瘍）、洗腸（例えば直腸癌）、又はカテーテル（例えば膀胱癌）により投与してもよい。
候補の抗新生物アデノウイルス変異体は、新生物細胞の等価の移植を有する未処理のマウスと比べて、ｐ53及び／又はRB機能を欠如する新生物細胞の移植を有するnu／nuマウスにおいて腫瘍形成又は新生物細胞荷を減少させる能力により更に評価することができる。
抗新生物複製欠損アデノウイルス変異体は、新生物病を有する患者への治療及び診断的投与のために製剤化され得る。
治療又は予防的使用のために、１又は複数の種の抗新生物複製欠損アデノウイルス変異体の医薬的に有効な投与量を含む滅菌組成物は、新生物状態の治療のためにヒト患者又は獣医学的非ヒト被検体に投与される。一般に、本組成物は、水性懸濁液中に約103〜1015又はそれ超のアデノウイルス粒子を含むであろう。医薬として許容される担体又は賦形剤は、しばしばこのような滅菌組成物に用いられる。種々の水溶液、例えば水、緩衝水、0.4％塩類溶液、0.3％グリシン等を用いることができる。これらの溶液は滅菌状態であり、一般に要求されるアデノウイルスビリオン以外の粒状物を含まない。本組成物は、適切な生理条件に必要とされる医薬として許容される補助物質、例えばpH調節及び緩衝剤、毒性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含み得る。アデノウイルスによる細胞の感染を増強する賦形剤が含まれ得る。
複製欠損ウイルスは、リポソーム又はイムノリポソームにより新生物細胞にデリバリーしてもよい：このようなデリバリーは、新生物細胞上に存在する細胞毒面特性（例えばイムノリポソーム内のイムノグロブリンに結合する細胞表面タンパク質の存在）に基づいて新生物細胞を選択的に標的にすることができる。典型的には、ビリオンを含む水性懸濁液は、リポソーム又はイムノリポソームにカプセル化される。例えば、複製欠損アデノウイルスビリオンの懸濁液は、慣用的な方法（引用により本明細書に組み込まれる米国特許5,043,164、米国特許4,957,735、米国特許4,925,661；Connor及びHuang（1985）J.Cell Biol. 101：582；Lasic DD（1992）Nature 355：279；Novel Drug Delivery（eds. Prescott LF and Nimmo WS：Wiley, New York, 1989）；Reddyら（1992）J.Immunol. 148：1585）によりイムノリポソームを形成するようにミセル内にカプセル化することができる。個体の癌細胞上に存在する癌抗原（例えばCALLA，CEA）に特異的に結合する抗体を含むイムノリポソームは、ビリオンをこれらの細胞に標的化するのに用いることができる。
本抗新生物複製欠損アデノウイルス又はその混合物を含む組成物は、新生物病の予防及び／又は治療への適用のために投与することができる。治療への適用のために、組成物は、その条件及びその合併症を治癒し又は少くとも部分的に制限するのに十分の量で、特定の新生物病に既にかかっている患者に投与される。これを達成するのに適した量は、“治療して有効な投与量”又は“有効な投与量”として定義される。この使用のために有効な量は、その状態の激しさ、患者の一般的状態、及び投与の経路によるであろう。
予防への適用において、抗新生物複製欠損アデノウイルス又はそれらの混合物を含む組成物は、新生物の再発に対する患者の耐性を増強するため又は寛解時間を長くするために新生物病状態にない患者に投与される。このような量は、“予防に有効な量”として定義される。この使用においても、正確な量は、患者の健康状態及び免疫の全般的なレベルによる。
本組成物の一回の又は複数の投与は、治療する医師が投与レベル及びパターンを選択して行うことができる。いずれの場合でも、医薬製剤は、患者を有効に治療するのに十分な量の本発明の抗新生物複製欠損アデノウイルスを供するであろう。
本発明の抗新生物複製欠損アデノウイルス治療は、他の抗新生物プロトコル、例えば慣用的な化学療法及び／又は免疫抑制法と組み合わせることができる。免疫抑制のための手順は、WO 96／12406に本質的に記載されるものからなるであろう。一般に、複製欠損アデノウイルスは、単独で、又は免疫抑制剤との混合物で投与されるであろう。好ましい免疫抑制化合物の例は、シクロホスホアミド、シクロスポリン、又はデキサメタゾンである。要求される免疫抑制のレベルを実現するためのこれらの化合物の投与量は、当該技術で周知である。例えば、シクロホスホアミドは、好ましくは、100〜300mg／kgで投与され、デキサメタゾンは、好ましくは、約２〜６mg／kgで投与される。
変異体アデノウイルスの増殖
本発明のアデノウイルス変異体（例えばE1a-RB(-)複製欠損アデノウイルス、E1b-p53(-)複製欠損アデノウイルス、及びE1a／E1b二重変異体）は、典型的には、感染性変異体ウイルスの複製及び形成を支持するために、トランスにおいて、各々E1a機能、E1b機能、又はE1a及びE1b機能の両方を供し得る細胞系（例えば、293細胞系ATCC # CRL157）、American Type Culture Collection, Rockville, MD；Grahamら（1977）J.Gen.Virol. 36：59）においてウイルスストックとして増殖される。
以下の実施例は、例として供され、限定を意図したものではない。バリエーション及びかわりの実施形態は当業者に明らかであろう。
実験例
複製欠損組換えアデノウイルスの、ｐ53及び／又はRbを欠如する新生物細胞への効果
以下の実験例は、ｐ53及び／又はRb機能を欠如する新生物細胞への複製欠損組換えアデノウイルス調製物の投与が、新生物細胞を有効に殺すことができることを証明する。その例は、ｐ53及びRb機能を含む非新生物細胞が、複製欠損組換えアデノウイルス調製物による殺害に対して比較的耐性であることも示す。それゆえ、以下に供するデータは、複製欠損組換えアデノウイルスの投与が新生物細胞を選択的に殺すのに用いることができることの実験的確認を供する。その選択的殺害は、変異体アデノウイルスが新生物細胞において複製表現型を誘導するが、非新生物細胞においては複製表現型（又は関連する細胞変性効果）を実質的に誘導しない異なる能力を利用することにより供される。
対照非新生物細胞及び種々の新生物細胞型を示す細胞系を10％胎児ウシ血清を含むDMEM（高グルコース量）中で集落になるまで又はその近くまで６ウエル培養皿中にプレートし、標準培養条件下で37℃、５％CO2でインキュベートした。細胞を５×105細胞／ウエルの密度でプレートしてスクリーニングした。テストした新生物細胞系は、ヒト一次骨原肉腫由来のSAOS-2（ATCC HTB85）；ヒト骨原肉腫由来のU-20S（ATCC HTB96）；膵臓又は腸起源のヒト転移性腺癌由来のHS700T（ATCC HTB147）；形質転換したヒト胎芽性腎臓である293（ATCC CRL1573）；及びヒト直腸腺癌由来のDLD-1（ATCC CCL221）であった。それら各々の細胞系は、American Type Culture Collection, Rockville, MDから利用できる。対照非新生物細胞はIMR90（ATCC CCL186）及びWI-38（ATCC CCL75）（両方とも二倍体ヒト肺繊維芽細胞系である）であった。
次にこれらの細胞培養物に、平行して、野生型アデノウイルスタイプ２、及び複製欠損組換えアデノウイルス変異体dI 1010，dI 434及びdI 1520を感染させた。余分な培養皿を、計数目的のためにプレートした。これらの細胞はウイルス感染のために用いた同じ細胞の懸濁液からのものであった。要求される感染の多重度（MOI）のために細胞培養物に加えるためにウイルスのプラーク形成単位（PFU）の数を決定するために細胞を計数した。野生型アデノウイルスタイプ２及び変異体アデノウイルスを、0.1，1.0，10、及び100のMOIで平行の細胞培養物に加えた。PBSに懸濁したウイルスを、１mlの容量で細胞ウエルに加えた。その接種した皿を、接種及び37℃、５％CO2で約１時間の吸着時間の中間点後すぐにＸ−及びＹ−軸の両方に振動させた。１時間の吸着期間後、高グルコース及び２％胎児ウシ血清を含むDMEM ２mlを加え、その培養物を標準培養条件下で37℃、５％CO2でインキュベートした。感染後種々の時間で、ウイルス調製物による細胞殺害の効能を決定するため、細胞培養物を、20％メタノール中0.5％クリスタル・バイオレットで染色した。死んだ細胞を引き離し、ウエルからそそぎ出し、生きている細胞をウエルに残して染料で染色した。その結果は、複製欠損組換えアデノウイルス調製物は、非新生物細胞と比べて新生物細胞を優先的に殺したのに対し、野生型アデノウイルスタイプ２は新生物細胞及び非新生物細胞の両方をほぼ等しく十分に殺したことを証明する。より詳しくは、その結果は、dI 1010変異体は新生物細胞を殺すことにおいて特に有効であり、dI 1520変異体及びdI 434変異体も有効であることを示した。野生型アデノウイルス２は、各々のウエルの少くともいくつかの細胞染色において種々の効能及び不完全性であったが、感染後４〜７日に培養ウエルの各々において細胞を殺すことができた。WI-38及びSAOS-2系はアデノウイルス感染のための優れた宿主でなく、以下に議論されるように、IMR90はヒト二倍体繊維芽細胞のためのかわりの対照細胞として機能することに注意せよ。dI 1010変異体は、８〜12日にわたり、感染耐性SAOS-2を除いて新生物細胞系の全てを有効に殺すことができた。DI 1010は、感染後12日までに、293，U20S，HS700T、及びDLD-1系を殺し、二倍体ヒト肺繊維芽細胞（WI-38）を殺さなかった。dI 1520変異体は、感染後14〜20日までに、５の新生物細胞系のうち３つ（293，HS700T及びDLD-1）を有効に殺すことができ、二倍体ヒト肺繊維芽細胞（WI-38）を実質的に殺さなかった。dI 1520はE1B(-)変異体であり、細胞系U20SはこのようなE1B(-)変異体ウイルスが複製するのを許容せず、このことは予想されるように、変異体組換え欠損アデノウイルスによる感染のための異なる形質転換された細胞系の特異性を示す。dI 434変異体（二重変異体：E1A(-) E1B(-)）は、感染後14〜20日までに、５の新生物細胞系のうち３つ（293，HS700T及びDLD-1）を有効に殺すことができ、二倍体ヒト肺繊維芽細胞（WI-38）を実質的に殺さなかった。DLD-1及びU20S系は、dI 434の複製について部分的な耐性表現型を示した。各々の細胞系に、生存能についての対照として、PBSのみを偽感染させた。
以下の実験も、IMR90細胞（ATCC CCL186）並びに野生型及び変異体アデノウイルスを用いて行った。IMR90細胞に、0.1，1.0，10、及び100に対応するMOIで、示されるウイルスを感染させた。感染後９日目に、細胞をPBSで洗い、クリスタル・バイオレットで染色した。ウイルス感染についての陽性対照として供するため、各々の６ウエル皿中の１つのウエルに293細胞を種つけした。その結果は、IMR90ヒト二倍体肺繊維芽細胞が、野生型、Ad２，dI 1010、及びdI 1520により差別的に殺されることを示した。野生型Ad2は10又は100のMOIでIMR90細胞を有効に殺した。DI 1010は、上述のように、新生物細胞系293，U20S，HS700T、及びDLD-1を殺したのにかかわらず、テストした最も高いMOIでもIMR90細胞内で複製できなかった。DI 1520ウイルスは、100のMOIでのみ有効にIMR90細胞を殺すことができ；この高いウイルスの投与量において、複製でなくウイルスのオーバーロードの結果として細胞が死んだ可能性は除外することができない。
これにより、データは、複製欠損組換えアデノウイルス変異体は、予測される通り、ｐ53及び／又はRb機能を欠如する新生物細胞を選択的に殺すのに用いることができることを示す。
複製欠損組換えアデノウイルスの作製
以下の段落は、ｐ53欠損細胞中で選択的に複製するE1B 55kDにおいて欠損を有する改良されたアデノウイルス株であるONYX-019，ONYX-020、及びONYX-021の形成及びテストを記述する。これらの株をdI 1520（以後、ONYX-015と呼ぶ）と比較した。これらの株は、ウイルスCPEアッセイにおいてONYX-015を超える大きな改良を示す。
本発明のこの態様の実施は、他に示さない限り、当該技術の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えDNA操作及び生産、並びに免疫学の慣用的な技術を用いるであろう。このような技術は、文献に十分に説明される。例えば、Sambrook, Molecular Cloning；A Laboratory Manual, Second Edition（1989）；DNA Cloning, Volumes I and II（D.N.Glover, Ed. 1985）；Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait, Ed. 1984）；Nucleic Acid Hybridization（B.D.Hames and S.J.Higgins, Eds. 1984）；Transcription and Translation（B.D.Hames and S.J.Higgins, Eds. 1984）；Animal Cell Culture（R.I.Freshney, Ed. 1986）；Immobilized Cells and Enzymes（IRL Press, 1986）；B.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning（1984）；the series, Methods in Enzymology（Academic Press, Inc.）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell（J.H.Miller and M.P.Calos, Eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory）, Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155（各々Wu and Grossman, and Wu, Eds.）, （Mayer and Walker, Eds.）（1987）；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology（Academic Press, London）,Scopes,（1987）；Protein Purification：Principles and Practice, Second Edition（Springer-Verlag, N.Y.）；並びにHandbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV（D.M.Weir and C.C.Blackwell,Eds 1986）を参照のこと。上述され及び後述される本明細書に言及される全ての特許、特許出願及び出版物は、引用により本明細書に組み込まれる。
DNA構成物：Microbix Biosystemsから得たAd5 pXC1プラスミドから、Xba Ｉ及びBgl2制限酵素を用いて、ヌクレオチド1339〜3328を切り出した。pXC1は塩基対22〜5790からのAd５配列を含む。ヌクレオチド1339〜3328は、E1B 55kD遺伝子のほとんどを含み；それは最後のＣ末端178塩基対を含まない。そのゲル精製したDNAフラグメントをHindIII部位をBgl2で置換した改良Bluescript（Stratagene Corporation）ベクター（pBS Bg1 ΔHin）にクローン化した。
1339〜3328フラグメントの両端及び内部にオリゴヌクレオチドを作った（図２を参照のこと）。それらオリゴは次の通りである。
次のフラグメントの対：Ａ及びＢ、Ａ及びＣ、Ａ及びＤを、各々ゲル精製したpXC1のBgl2／Xba1 7.9kbフラグメントに連結した。DH５α細胞への形質転換の後、陽性を探すためオリゴ：A5XBAT及びA5BGLBを用いてPCRによりスクリーニングした。米国特許5,008,182及びHedrum（PCR Methods and Applications 2：167〜71（1992）を参照のこと）。
これらの構成物は、E1B 55kD遺伝子内に以下のアミノ酸の欠失をコードするDNA配列を含む。
p019（pXC1-AB） フラグメントＡ及びＢから作ったもの AA 218-275の欠失
p020（pXC1-AC） フラグメントＡ及びＣから作ったもの AA 218-300の欠失
p021（pXC1-AD） フラグメントＡ及びＤから作ったもの AA 218-354の欠失
図２は、上述のフラグメントを示す。
各々の構成物の１つの陽性物に基づいてDNAmaxi prep（Qiagen）を行った。そのDNAを配列決定して欠失を確認した。プラスミドp019，p020及びp021は大腸菌に入れ、American Type Culture Collectionに寄託し、各々JN019，JN020、及びJN021で示す。American Type Culture Collection受託番号は、JN019についてATCC No.98286；JN020についてATCC No.98287；及びJN021についてATCC No.98288である。
ウイルス構成物：HEK293細胞に、Microbixから得たpBHGE3プラスミド、並びにプラスミドp019，p020及びp021の各々を同時トランスフェクトした。pBHGE3プラスミドは、塩基対188〜1339からのAd5 E1配列の欠失を含み、初期領域１内に挿入又は変異を有するAd5ベクターを作製するのに用いる。プラークを取り、部分的に欠失したE1B 55kD遺伝子の存在を確認するためにオリゴA5XBAT及びA5BGLBを用いて第１のプラグに基づいてPCR分析を行った。PCR法は、標的遺伝子材料を増幅するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブの使用を示すことが当該技術で公知である。例えば、米国特許4,683,202；4,683,195；5,091,310；5,008,182及び5,168,039を参照のこと。プラークを広げて、Qiagen QIAamp Bloodを用いてウイルスDNAを作った。欠失を確認するためにその欠失の上流及び下流でDNAを配列決定した。
免疫沈降データ：溶解したC33A細胞からのウイルスを用いる免疫沈降データは、（先のp019，p020及びp021に対応する）ウイルスONYX-019，ONYX-020及びONYX-021が、（ａ）Oncogene Sciencesからの抗19kD抗体を用いて、ONYX-015よりやや多くの19kDタンパク質を作るようであり；（ｂ）Oncogene Sciencesからの抗55kD抗体を用いて野生型55kDより低い分子量である55kD抗体を作り出し（ONYX-015は検出可能な55kDを作らないことに注意のこと）；及び（ｃ）abV Immune Responseからの抗アデノウイルス抗体を用いて、アデノウイルスに対する抗体と予想通り反応することを示した。
CPEデータ：ONYX-015をONYX-019，ONYX-020及びONYX-021と比較するC33Aを用いるCPEアッセイからのデータは、それら新しい株が、等価のCPE効果を得るのに必要なMOIにより測定して、ONYX-015より約２〜10倍大きい能力を有することを示した。
これらの実験は上述の通り行った。要約すると、野生型アデノウイルスタイプ２及び変異アデノウイルスONYX-015からONYX-019，ONYX-020及びONYX-021を、0.1，1.0，10、及び100のMOIで平行細胞培養物に加えた。PBSに懸濁したウイルスを１mlの容量で細胞ウエルに加えた。その接種した培養皿を、接種及び37℃、５％CO2で約１時間の吸着時間の中間点の直接にＸ−及びＹ軸の両方で振動させた。１時間の吸着時間の後、高グルコース及び２％胎児ウシ血清を含むDMEM ２mlを加え、その培養物を標準培養条件下で37℃、５％CO2でインキュベートした。感染後７日に、細胞培養物を、そのウイルス調製物による細胞殺害の効能を決定するために、20％メタノール中０．５％クリスタル・バイオレットで染色した。死んだ細胞を引き離し、ウエルからそそぎ出し、生きている細胞をウエル内に残し、染料で染色した。結果は、複製欠損組換えアデノウイルス調製物OXYX-015，ONYX-019，ONYX-020及びONYX-021が、非新生物細胞と比べて新生物細胞を優先的に殺すことができること、並びに野生型アデノウイルスタイプ２が、新生物及び非新生物細胞の両方をほぼ等しく十分に殺したことを示した。
その結果は、更に、ONYX-019，ONYX-020及びONYX-021が、等価のCPE効果を作り出すために必要とされるMOIにより測定して、ONYX-015よりC33A細胞を殺す能力が２〜10倍大きいことを示した。10，1.0，0.1及び0.01のMOI域にわたって実験を行い、ONYX-019，ONYX-020及びONYX-021は、0.1〜0.01のMOIにおいて増強された殺害を示した。
腫瘍細胞殺害への複製欠損組換えアデノウイルス及び化学療法の効果
我々は、次に、単独で、及び化学療法と組み合わせて、静脈内（IV）投与したONYX-015（dI 1521）の効能を研究した。ヒト腫瘍異種移植片（結腸、頸部）を、５〜７mmの大きさまで、ヌードマウスの皮下で増殖させ、この時に109の総pfuを投与を分割してIV注入した（１〜５日）。化学療法グループのマウスに、５日目に腹腔内（IP）注入で、最大許容投与量を５FU又はシスプラチヌムを与えた。対照には、同一の様式でIV及びIPビヒクル注入した。IV投与後の腫瘍内ウイルス複製に注目した。シスプラチヌム及び5-FUは生存率を大きく改善せず、又は腫瘍増殖を阻害しなかったが、ONYX-015単独では腫瘍増殖を大きく阻害し（40％〜60％）、生存率を改善した（ｐ＝0.05）。ONYX-015及び5-FU又はシスプラチヌムのいずれかでの組合せ療法は、いずれの単独の剤よりも生存率を大きく改善させた。これにより、ONYX-015は、化学療法で改善され得る、IV投与した時に選択的抗腫瘍活性を有する。
本発明は、理解を明快にする目的のために実例によりいくらか詳細に記述されるが、本請求の範囲内で特定の変換及び改良を実施することができることが明らかであろう。
Claims (32)
- 細胞集団内の新生物細胞を除去するための組成物であって、
（１）機能的な腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合することができる発現されたウイルスオンコプロテインを欠如する組換え複製欠損アデノウイルスであって、該アデノウイルスは、それぞれＡＴＣＣ受託番号９９２８６，９９２８７、または９９２８８で寄託した組み換えプラスミドＪＮ０１９，ＪＮ０２０またはＪＮ０２１を含み、該アデノウイルスは、感染条件下において接触されるように処方されるアデノウイルスを、（２）ウイルスオンコプロテインと結合した複合体を形成することができる前記機能的な腫瘍サプレッサー遺伝子産物を含む非新生物細胞、及び該機能的な腫瘍サプレッサー遺伝子産物を欠如する新生物細胞に接触させ、それにより感染した細胞集団を作り出すことを含む、組成物。 - 前記ウイルスオンコプロテインがアデノウイルスＥ１ｂポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記腫瘍サプレッサー遺伝子産物がｐ５３であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記新生物細胞がｐ５３(-)であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記組換え複製欠損アデノウイルスが、ｐ５３と結合することができるＥ１ｂｐ５５ポリペプチドをコードしないことを特徴とする請求項４に記載の組成物。
- 前記新生物細胞及び非新生物細胞を含む細胞集団が、哺乳動物中に存在し、前記接触させるステップが、前記組換え複製欠損アデノウイルスを個体に投与することにより生体内で行われることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
- 前記組換え複製欠損アデノウイルスが、ｐ５３機能を欠如する新生物細胞内で複製して感染性ビリオンを形成することができることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
- 前記新生物細胞内で形成された感染性ビリオンが、広がって、被検体内で生体内の隣接細胞に感染することができることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
- 前記組換え複製欠損アデノウイルスが、ヒト患者の新生物細胞内で感染性ビリオンを形成することについて非複製性であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記組換え複製欠損アデノウイルスが、腫瘍サプレッサーＲｂへの結合を防ぐＥ１ａ内の遺伝子改変を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 機能的な腫瘍サプレッサー遺伝子産物を欠如する新生物細胞を含む新形成を有するヒトにおける新生物状態を処置するための組成物であって、それぞれＡＴＣＣ受託番号９９２８６，９９２８７、または９９２８８で寄託した組み換えプラスミドＪＮ０１９，ＪＮ０２０またはＪＮ０２１を含む組換え複製欠損アデノウイルスの治療に有効な量を含む、組成物。
- 前記腫瘍サプレッサー遺伝子産物がｐ５３であることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
- 前記組換え複製欠損アデノウイルスを含む組成物が、前記複製欠損アデノウイルスのＥ１ａ領域への遺伝子改変を更に含むことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
- 前記複製欠損アデノウイルスのＥ１ａ領域への遺伝子改変が、ＲＢ腫瘍サプレッサー遺伝子産物への結合を実質的に防ぐことを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
- 前記新生物が、腫瘍サプレッサーＲｂもしくは腫瘍サプレッサーｐ５３のいずれか又は両方の腫瘍サプレッサーを欠如する新生物細胞を含むことを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
- 前記組換え複製欠損アデノウイルスを含む組成物が、作用可能に連結した負の選択遺伝子を更に含むことを特徴とする請求項１２又は１４に記載の組成物。
- 新生物病の治療のための抗新生物組成物であって、医薬として送達可能な形態において、それぞれＡＴＣＣ受託番号９９２８６，９９２８７、または９９２８８で寄託した組み換えプラスミドＪＮ０１９，ＪＮ０２０またはＪＮ０２１を含む組換え複製欠損アデノウイルスの治療に有効な量を含む抗新生物組成物。
- ＡＴＣＣ受託番号９８２８６で寄託した組換えプラスミドＪＮ０１９。
- ＡＴＣＣ受託番号９８２８７で寄託した組換えプラスミドＪＮ０２０。
- ＡＴＣＣ受託番号９８２８８で寄託した組換えプラスミドＪＮ０２１。
- それぞれＡＴＣＣ受託番号９９２８６，９９２８７、または９９２８８で寄託した組み換えプラスミドＪＮ０１９，ＪＮ０２０またはＪＮ０２１を含む複製欠損アデノウイルス。
- ＡＴＣＣ受託番号９８２８６で寄託した組み換えプラスミドＪＮ０１９を含む複製欠損アデノウイルス。
- ＡＴＣＣ受託番号９８２８７で寄託した組み換えプラスミドＪＮ０２０を含む複製欠損アデノウイルス。
- ＡＴＣＣ受託番号９８２８８で寄託した組み換えプラスミドＪＮ０２１を含む単離された核酸からなる複製欠損アデノウイルス。
- ＡＴＣＣに受託番号９８２８６で寄託した組換えプラスミドＪＮ０１９の核酸配列からなる単離された核酸であって、該核酸配列が、アデノウイルスのＥ１Ｂ領域内に欠失を含み、該欠失がアミノ酸２１８〜２７５をコードすることを特徴とする核酸。
- ＡＴＣＣに受託番号９８２８７で寄託した組換えプラスミドＪＮ０２０の核酸配列からなる単離された核酸であって、該核酸配列が、アデノウイルスのＥ１Ｂ領域内に欠失を含み、該欠失がアミノ酸２１８〜３００をコードすることを特徴とする核酸。
- ＡＴＣＣに受託番号９８２８８で寄託した組換えプラスミドＪＮ０２１の核酸配列からなる単離された核酸であって、該核酸配列が、アデノウイルスのＥ１Ｂ領域内に欠失を含み、該欠失がアミノ酸２１８〜３５４をコードすることを特徴とする核酸。
- 免疫抑制又は化学療法化合物を更に含む請求項１又は１２に記載の組成物。
- それぞれＡＴＣＣ受託番号９９２８６，９９２８７、または９９２８８で寄託した組み換えプラスミドＪＮ０１９，ＪＮ０２０またはＪＮ０２１を含む組換え複製欠損アデノウイルスと、化学療法化合物と、を含む組成物。
- それぞれＡＴＣＣ受託番号９９２８６，９９２８７、または９９２８８で寄託した組み換えプラスミドＪＮ０１９，ＪＮ０２０またはＪＮ０２１を含む組換え複製欠損アデノウイルスと、免疫抑制化合物と、を含む組成物。
- それぞれＡＴＣＣ受託番号９９２８６，９９２８７、または９９２８８で寄託したＪＮ０１９，ＪＮ０２０、及びＪＮ０２１からなる群から選択されるプラスミドを含む宿主細胞。
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