ES2212815T3

ES2212815T3 - Virus citopaticos para la terapia y profilaxis de neoplasia.

Info

Publication number: ES2212815T3
Application number: ES97951519T
Authority: ES
Inventors: James R. Bischoff; Julie Nye; Ng Lelia; Sharon Horn; Angelica Williams; David Kirn
Original assignee: Onyx Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Onyx Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-12-31
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 2004-08-01
Anticipated expiration: 2017-12-10
Also published as: ATE256195T1; EP0958371B1; AU5514598A; DE69726759D1; JP2001508290A; JP4225577B2; CA2273825C; CA2273825A1; AU723604B2; DE69726759T2; US6080578A; PT958371E; EP0958371A2; WO1998029555A3; DK0958371T3; WO1998029555A2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA TRATAR PATOLOGIAS NEOPLASTICAS MEDIANTE TERAPIA DE BASE VIRAL. SE ADMINISTRAN VIRUS MUTANTES DESPROVISTOS DE PROTEINAS VIRALES, QUE UNEN Y/O INACTIVAN P53 O RB A UN PACIENTE QUE TIENE UN NEOPLASMA QUE COMPRENDE CELULAS EXENTAS DE LA FUNCION P53 Y/O RB. EL VIRUS MUTANTE ES CAPAZ DE PRODUCIR BASICAMENTE UN FENOTIPO DE REPLICACION EN NO REPLICACION, TENIENDO LAS CELULAS NO NEOPLASTICAS UN P53 NORMAL Y/O UNA FUNCION DE RB. LA GENERACION REFERENCIAL DEL FENOTIPO DE REPLICACION EN CELULAS NEOPLASTICAS ACARREA LA DESTRUCCION PREFERENCIAL DE LAS CELULAS NEOPLASTICAS, DIRECTAMENTE O MEDIANTE EXPRESION DE UN GEN CITOTOXICO EN LAS CELULAS QUE EXPRESAN UN FENOTIPO DE REPLICACION VIRAL.

Description

Virus citopáticos para la terapia y profilaxis de neoplasia.

Campo de la técnica

La invención proporciona composiciones de virus citohepáticos recombinantes que pueden ser capaces de replicarse y/o expresar los genes de la región tardía en células de mamífero neoplásicas, pero que en esencia no se replican en células no neoplásicas. La invención también proporciona los procedimientos para la construcción y propagación de dichos virus recombinantes, los procedimientos para tratar la enfermedad neoplásica con dichos virus recombinantes y las composiciones terapéuticas que comprenden tales virus recombinantes.

Antecedentes

La proliferación de las células normales, se sabe que está regulada por proto-oncogenes promotores del crecimiento, cuya acción se ve compensada por los genes supresores de tumores, limitadores del crecimiento. Las mutaciones que potencian las actividades de los proto-oncogenes crean los oncogenes que fuerzan el crecimiento de células neoplásicas. A la inversa, las lesiones genéticas que inactivan los genes supresores de tumores, generalmente a través de mutaciones que conducen a que una célula sea homocigota para el alelo supresor del tumor inactivado, pueden liberar la célula de las constricciones replicativas normales impuestas por estos genes. Generalmente, un gen supresor de tumor (p.ej., p53, RB, DCC, NF-I) en combinación con la formación de un oncogen activado (es decir, un proto-oncogen que contiene una mutación activadora estructural o reguladora) puede producir una célula neoplásica capaz de un crecimiento sin constricciones (es decir, una célula transformada).

La transformación oncogénica de las células conduce a una serie de cambios en el metabolismo, la fisiología y la morfología celular. Una alteración característica de las células transformadas oncogénicamente es una pérdida de respuesta a las limitaciones de la proliferación celular y de la diferenciación, impuestas normalmente por la expresión adecuada de genes reguladores del crecimiento celular.

Mientras que tipos distintos de alteraciones genéticas pueden conducir a una expresión o función alterada de los genes reguladores del crecimiento celular y a un crecimiento anormal, en general, se cree que se necesita más de un suceso para producir la transformación neoplásica de una célula normal a una maligna (Land y col., (1983) Nature, 304:596; Weinberg RA (1989) Cancer Res. 49:3713). Las vías moleculares precisas y los cambios secundarios que conducen a la transformación maligna en la mayoría de tipos celulares no se conocen todavía con claridad. Se han publicado una serie de casos en los que la expresión o la actividad alterada de algunas proteínas con funciones putativas de control del ciclo celular y/o implicadas en la formación de complejos transcripcionales funcionales, como la p53 y el RB, pueden conducir a una pérdida del control de la proliferación celular (Ullrich y col., (1992) J. Biol. Chem. 267:15259; Hollstein y col., (1991) Science 253: 49; Sager R (1992) Curr. Opin. Cell. Biol. 4:155; Levine y col., (1991) Nature 351:453).

Algunos oncogenes han demostrado que poseen mutaciones activadoras características en una fracción significativa en determinados cánceres. Por ejemplo, mutaciones particulares en las regiones codificantes de ras^{H} y ras^{K} (p.ej., el codón 12, codón 61; Parada y col., (1984) Nature, 312:649) y el gen APC (Powell y col., (1992) Nature 359:235) están asociadas con la transformación de células cultivadas y están presentes en un porcentaje sorprendente de cánceres humanos específicos (p.ej. el adenocarcinoma de colon, el carcinoma de vejiga, el carcinoma y adenocarcinoma de pulmón y el hepatocarcinoma). Estos hallazgos han llevado al desarrollo de reactivos diagnósticos y terapéuticos (p.ej, sondas polinucleotídicas y anticuerpos) que reconocen específicamente la forma(s) activada(s) de dichos oncogenes (patentes americanas U.S. 4.798.787 y U.S. 4.762.706).

La expresión excesiva o inadecuada de otros oncogenes, como myc, erbB-2 y pim-1 parece ser capaz de potenciar la transformación oncogénica sin necesitar la presencia de mutaciones activadoras en la región codificante. La sobreexpresión de erbB-2 se halla frecuentemente en adenocarcinomas de mama, estómago y ovario y los niveles de erbB-2 en estos tipos celulares pueden servir como un marcador diagnóstico de la neoplasia y/o pueden correlacionarse con un fenotipo tumoral específico (p.ej, la resistencia a fármacos específicos, la tasa de crecimiento, el estado de diferenciación).

Se han descrito animales transgénicos que portan varios oncogenes (patentes americanas U.S. 4.736.866 y U.S. 5.087.571), o genes supresores de tumor interrumpidos funcionalmente (Donehower y col., (1992) Nature 356:215), para su utilización en ensayos de cribaje de carcinógenos, entre otras utilizaciones potenciales.

A pesar del progreso realizado en el desarrollo de un modelo más definido de los mecanismos moleculares que soportan la transformación fenotípica y la neoplasia, se han obtenido pocos procedimientos terapéuticos significativos aplicables al tratamiento del cáncer, a parte de la quimioterapia convencional. Muchos agentes quimioterapéuticos convencionales tienen un índice terapéutico bajo, con niveles de dosificación terapéutica en o cercanos a los niveles de dosificación que producen toxicidad. Los efectos secundarios de toxicidad de la mayoría de agentes quimioterapéuticos convencionales son desagradables y, entre otros efectos secundarios, conducen a una supresión de la médula ósea que podría constituir un peligro para la vida.

Se han intentado aproximaciones recientes para la realización de la terapia génica con el fin de corregir o complementar los alelos defectuosos causantes de enfermedades congénitas, como la fibrosis quística, aunque con éxitos iniciales limitados. Algunas aproximaciones de terapia génica implican la transducción de una secuencia polinucleotídica capaz de expresar una copia funcional de un alelo defectuoso en una célula in vivo utilizando adenovirus recombinantes deficientes en la replicación (Rosenfeld y col., (1992) Cell 68:143). Algunos de estos procedimientos de terapia génica son eficientes en la transducción de polinucleótidos en células aisladas de un paciente, pero no se ha demostrado que sean altamente eficientes in vivo. Se han descrito aproximaciones terapéuticas contra el cáncer que se basan en la transfección de células tumorales explantadas con polinucleótidos que codifican para el factor de necrosis tumoral (TNF) y la interleucina-2 (Il-2) (Pardoll D (1992) Curr. Opin. Oncol, 4:1124).

Aunque algún día se demuestre que es posible adaptar los procedimientos de terapia génica para corregir alelos defectuosos u oncogenes o genes supresores de tumores en células transformadas in vivo, los procedimientos de terapia génica actuales no son capaces de transducir de forma eficiente y marcar de forma correcta (p.ej., mediante recombinación homóloga) un porcentaje suficiente de células neoplásicas para la práctica de la terapia génica de neoplasias in situ. Dada la naturaleza biológica del cáncer, para obtener un efecto terapéutico efectivo, es necesario eliminar una fracción esencial de células neoplásicas, preferentemente toda la progenie clonal de la célula transformada. Además, los procedimientos actuales de terapia génica son muy caros y requieren el cultivo ex vivo de células explantadas antes de su reintroducción en un paciente. Una aplicación más amplia de dichos procedimientos, incluso si fueran eficaces, sería económicamente prohibitiva.

La patente internacional WO 94/18992 describe la utilización farmacéutica de un virus que es incapaz de inactivar/secuestrar las proteínas de tipo salvaje del huésped debido a una mutación en su genoma y en consecuencia es incapaz de replicarse en dichas células, pero únicamente puede replicarse en las células que tienen defectos en las proteínas normalmente requeridas para ser inactivadas/secuestradas, es decir, las células malignas. Los adenovirus diseñados descritos aquí se denominan ONYX-15.

En consecuencia, existe una necesidad en la materia de procedimientos y composiciones para el diagnóstico y la terapia de enfermedades neoplásicas, especialmente de procedimientos que eliminen selectivamente las células neoplásicas sin producir la muerte indeseable de células no neoplásicas, típico de la quimioterapia antineoplásica convencional. La presente invención satisface éstas y otras necesidades.

Las referencias que se discuten aquí se proporcionan únicamente por su descripción antes de la fecha de solicitud de la presente. Nada aquí debe interpretarse como un reconocimiento de que los inventores no tengan derecho a antedatar dicha descripción en virtud de la invención anterior.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona procedimientos y composiciones nuevas para la eliminación de células neoplásicas mediante la infección de células neoplásicas con un adenovirus recombinante que es deficiente en la replicación en las células no neoplásicas y que presenta por lo menos un fenotipo de replicación parcial en las células neoplásicas. La diferencia en el fenotipo de replicación de las construcciones de adenovirus de la invención en las células neoplásicas y no-neoplásicas proporciona una base biológica para la terapia viral del cáncer. La expresión de efectos citopáticos adenovirales y, opcionalmente, la expresión de un gen de un fármaco seleccionable negativamente (p.ej., HSV tk), se correlacionan con el fenotipo de replicación adenoviral característico de las células neoplásicas infectadas con las construcciones de adenovirus recombinantes de la invención, discriminando así entre células neoplásicas y no-neoplásicas y proporcionando una citotoxicidad selectiva de las células neoplásicas. Aunque los procedimientos se describen con especial detalle para las construcciones de adenovirus, los procedimientos son aplicables a esencialmente cualquier tipo de virus, en donde una replicación eficiente requiera la unión y/o el secuestro y/o la inactivación de una proteína de la célula huésped que esté presente en las células no neoplásicas, pero que esté esencialmente ausente o no sea funcional en las células neoplásicas (p.ej., p53, RB).

Para que los adenovirus se repliquen de forma eficiente en las células, el producto del gen E1b adenoviral, p55, forma un complejo con la proteína p53 de la célula huésped, con lo que se secuestra y/o inactiva la p53 y se produce una célula que es deficiente en la función de p53. Dicha célula deficiente en la función de p53 puede soportar la replicación del adenovirus. De esta forma, el adenovirus de tipo salvaje es capaz de replicarse en las células que contienen p53, ya que las proteínas adenovirales p55 inactivan y/o secuestran la proteína p53 de la célula huésped. En una realización de la invención, un adenovirus recombinante que comprende un locus E1b que codifica para la proteína mutante p55 y es incapaz de formar un complejo funcional con la proteína p53 en las células infectadas, se administra a una célula individual o población celular que comprende una célula neoplásica capaz de ser infectada por el adenovirus recombinante. La incapacidad esencial del adenovirus recombinante para secuestrar eficazmente la proteína p53 en las células no-neoplásicas infectadas da como resultado que el polinucleótido(s) adenoviral recombinante introducido sea incapaz de expresar un fenotipo de replicación en las células no-neoplásicas. En cambio, las células neoplásicas que carecen de la proteína funcional p53 permiten la expresión de un fenotipo de replicación mediante el adenovirus recombinante introducido, produciéndose la eliminación de la célula neoplásica por una efecto citopático adenoviral y/o a la expresión de un gen de selección negativo unido al fenotipo de replicación. En variaciones preferidas de estas realizaciones, el adenovirus recombinante comprende un locus E1b que codifica para un mutante p55 que es esencialmente incapaz de unirse a p53 y, opcionalmente, puede carecer de una proteína p19 funcional (es decir, incapaz de inhibir la expresión de los genes de la región temprana adenoviral en presencia de polipéptidos E1a). Los adenovirus recombinantes de la invención pueden, además, comprender un gen mutante p19 que produce efectos citopáticos incrementados; como por ejemplo el gen mutante p19 cyt, bien conocido en la materia. Sin embargo, puede ser preferible retener el p19 funcional en algunos mutantes para mantener la integridad del DNA viral durante la infección.

En una realización alternativa de la invención, un adenovirus recombinante que comprende un locus E1a que codifica para una proteína E1a (p.ej., p289R o p243R) y que es incapaz de formar un complejo con la proteína RB en células infectadas, se administra a una célula individual o una población celular que comprende una célula neoplásica capaz de ser infectada por el adenovirus recombinante. La incapacidad del adenovirus recombinante para secuestrar de forma eficaz la proteína RB en las células no-neoplásicas infectadas da como resultado que el polinucleótido(s) adenoviral recombinante introducido sea incapaz de expresar un fenotipo de replicación en las células no-neoplásicas. En cambio, las células neoplásicas que carecen de la proteína funcional RB permiten la expresión de un fenotipo de replicación mediante el adenovirus recombinante introducido, lo que conduce a la eliminación de la célula neoplásica por un efecto citopático adenoviral y/o a la expresión de un gen de selección negativo unido al fenotipo de replicación. En variaciones preferidas de estas realizaciones, el adenovirus recombinante comprende un locus E1a que codifica para una proteína mutante E1a (p.ej., p289R) que carece de un dominio CR1 y/o CR2 capaz de unirse a RB (y/o al polipéptido de 300 KD y/o al polipéptido de 170 KD), pero comprende un dominio CR3 funcional capaz de transactivar los genes tempranos adenovirales. Las variaciones adicionales de estas realizaciones incluyen aquellas en las que el adenovirus recombinante comprende un locus E1a no funcional y es esencialmente incapaz de expresar una proteína que se una a e inactive el RB y, opcionalmente, también puede comprender una proteína p19 funcional (es decir, capaz de estimular la expresión de los genes de la región temprana adenoviral en ausencia de función E1a). Los adenovirus recombinantes de la invención pueden además comprender un gen mutante p19 que produce efectos citopáticos aumentados; un mutante de este tipo conocido en la materia es el gen mutante p19 cyt.

La invención proporciona nuevas construcciones de adenovirus recombinantes que son defectuosos en la replicación en células no neoplásicas, pero capaces de expresar un fenotipo de replicación en células neoplásicas carentes de p53 y/o RB funcional. Las nuevas construcciones adenovirales recombinantes comprenden una mutación, como una deleción o mutación puntual, en las regiones génicas E1a y/o E1b, especialmente en las secuencias que codifican para la proteína E1b p55 y los dominios CR1 Y CR2 de las proteínas E1a p289R o p243R. En algunas realizaciones, un gen seleccionable negativo, como un gen HSV tk, está unido operativamente a una región promotora/secuencia incrementadora de la transcripción temprana (p.ej., E2, E1a, E1b), una región promotora/incrementadora de la transcripción tardía (p.ej., el promotor principal tardío), o un promotor tardío o temprano con una secuencia incrementadora de la transcripción de CMV, en una construcción de adenovirus recombinante que también comprende una mutación E1a o E1b, de modo que el gen seleccionable negativo se transcribe preferentemente en las células infectadas que expresan un fenotipo de replicación (es decir, células neoplásicas), proporcionando así una selección negativa de dichas células mediante la administración de una dosificación eficaz de un agente de selección negativo (p.ej., ganciclovir, FIAU). Un gen seleccionable negativo puede insertarse en lugar de una secuencia estructural E1a y/o E1b para formar, en consecuencia, un mutante deficiente en la replicación E1a(-), mutante deficiente en la replicación E1b(-), o mutante doble E1a/E1b, respectivamente.

También se proporcionan las composiciones neoplásicas que comprenden dichos adenovirus recombinantes en una forma aceptable farmacéuticamente para la liberación a una población de células neoplásicas in vivo.

La invención también proporciona papovirus recombinantes, como el papilomavirus humano (HPV), poliomavirus (p.ej., BK, JC) y el SV40, que carecen de proteínas funcionales para la unión y/o la inactivación de p53 y/o RB. Los mutantes de papilomavirus carentes de la expresión de la proteína E6 funcional carecerán esencialmente de la capacidad para degradar eficazmente p53 y, en consecuencia, serán capaces de manifestar un fenotipo de replicación en células p53(-), pero no en células que contengan un nivel suficiente de p53 funcional. Los mutantes de papilomavirus humanos carentes de la expresión de la proteína funcional E7 carecerán esencialmente de la capacidad para unirse eficazmente a RB y por ello serán capaces de manifestar un fenotipo de replicación en células RB(-), pero no en células que contengan un nivel suficiente de RB funcional. Los mutantes de papilomavirus humanos carentes de la expresión de la proteína E6 funcional y de la proteína E7 funcional carecerán esencialmente de la capacidad de unirse eficazmente a RB y p53, con lo que serán capaces de manifestar un fenotipo de replicación en las células p53(-)RB(-), pero no en las células que contengan un nivel suficiente de RB y/o p53 funcional.

La invención también proporciona nuevos procedimientos para tratar una enfermedad neoplásica que comprenden las etapas de administración a un paciente de un virus recombinante capaz de expresar de forma preferente un fenotipo de replicación y/o de expresar un efecto citopático en una población celular neoplásica, en comparación con la expresión de una población celular no- neoplásica.

Descripción resumida de las figuras

Figura 1 muestra una representación esquemática de la estructura en dominios y de las interacciones proteína-proteína de un polipéptido E1a-289R adenoviral.

Figura 2 muestra de forma esquemática las construcciones de los plásmidos p019, p020 y p021.

Definiciones

Salvo que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos empleados tienen el mismo significado que el normalmente utilizado por los expertos en la materia a quienes se dirige esta invención. Aunque algunos procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí pueden utilizarse en la práctica o el análisis de la presente invención, también se describen los procedimientos y materiales preferidos. Según los objetivos de la presente invención, los términos siguientes se definen a continuación.

El término "que ocurre de forma natural", tal como se utiliza aquí respecto a un objeto, hace referencia al hecho de que puede hallarse en la naturaleza. Por ejemplo, se considera de origen natural un polipéptido o una secuencia polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo los virus), que puede aislarse de una fuente natural y que no se ha modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio. Tal como se utiliza aquí, el término "recombinante" indica que una construcción polinucleotídica (p.ej., un genoma de adenovirus) se ha generado, en parte, mediante modificación intencional realizada por el hombre.

Tal como se utiliza aquí, el término "virus deficiente en la replicación" hace referencia a un virus que inhibe preferentemente la proliferación celular o induce la apoptotosis en una población celular predeterminada (p.ej., células que carecen de la función p53 y/o RB) que soportan la expresión de un fenotipo de replicación viral. Siendo, dicho adenovirus, incapaz de inhibir la proliferación celular, inducir la apoptosis, o expresar un fenotipo de replicación en células con niveles funcionales de p53 y RB característicos de células no-replicantes y no-transformadas. De forma característica, un virus deficiente en la replicación presenta esencialmente una disminución en la eficiencia de calvas víricas en las células que comprenden una función normal de RB y/o p53.

Tal como se utiliza aquí, el término "función de p53" hace referencia a la propiedad de tener un nivel esencialmente normal de un polipéptido codificado por el gen p53 (es decir, relativo a las células no neoplásicas del mismo tipo histológico), en donde el polipéptido es capaz de unirse a la proteína E1b p55 del adenovirus de tipo salvaje 2 ó 5. Por ejemplo, la función p53 puede perderse por la producción de una forma inactiva (es decir, mutante) de p53, o mediante una disminución o pérdida total de la expresión del polipéptido(s) de p53. También, la función de p53 puede estar ausente en las células neoplásicas que contienen alelos p53 que codifican para una proteína p53 de tipo salvaje; por ejemplo, una alteración genética externa del locus de p53, como una mutación que dé como resultado un procesamiento o localización subcelular anómala de la p53 (p.ej., una mutación que produzca una p53 localizada en el citoplasma en lugar del núcleo), puede generar una pérdida de la función de p53.

Tal como se utiliza aquí, el término "función RB" hace referencia a la propiedad de presentar un nivel esencialmente normal de un polipéptido que codifica para el gen RB (es decir, relativo a las células de tipo no neoplásico), en donde el polipéptido RB es capaz de unirse a una proteína E1a de adenovirus de tipo salvaje 2 ó 5. Por ejemplo, la función RB puede perderse por la producción de una forma inactiva (es decir, mutante) de RB, o mediante una disminución importante o una pérdida total de la expresión del polipéptido(s) RB. También, la función RB puede estar esencialmente ausente en las células neoplásicas que contienen alelos RB que codifican una proteína RB de tipo salvaje; por ejemplo, una alteración genética externa del locus RB, como una mutación que resulte en un procesamiento o localización subcelular anómala de RB, puede resultar en una pérdida de la función RB.

Tal como se utiliza aquí, el término "fenotipo de replicación" hace referencia a una o más características fenotípicas de células infectadas con un virus, como por ejemplo un adenovirus deficiente en la replicación: (1) expresión esencial de productos génicos tardíos, como las proteínas de la cápside (p.ej., el polipéptido de base pentona adenoviral) o los transcritos de RNA iniciados a partir del promotor(es) génico tardío viral, (2) replicación de genomas virales o formación de intermediarios replicativos, (3) ensamblaje de las cápsides virales o empaquetamiento de partículas virales, (4) aparición de efectos citopáticos (CPE) en la célula infectada, (5) finalización de un ciclo lítico viral y (6) otras alteraciones fenotípicas que son típicas de la anulación de la función de p53 o RB en las células no-neoplásicas infectadas con un virus de DNA competente en la replicación y de tipo salvaje que codifica para una(s) oncoproteína(s) funcional. Un fenotipo de replicación comprende por lo menos una de las características fenotípicas enumeradas, preferentemente más de una de dichas características.

El término "virus deficiente en la replicación y anti-neoplásico" se utiliza aquí para referirse a un virus recombinante que tiene la propiedad funcional de inhibir el desarrollo de la progresión de un neoplasma en el hombre, preferentemente mediante la muerte celular de las células neoplásicas infectadas en relación con las células no-neoplásicas, no-replicantes e infectadas del mismo tipo histológico.

Tal como se utiliza aquí, los términos "células neoplásicas" y "neoplasia" hacen referencia a células que presentan un crecimiento relativamente autónomo, es decir, que presentan un fenotipo de crecimiento anómalo caracterizado por una pérdida significativa del control de la proliferación celular. Las células neoplásicas comprenden células que pueden replicarse activamente o se hallan en un estado temporal de latencia no-replicativo (G1 o G0); de modo similar, las células neoplásicas pueden comprender células que tienen un fenotipo bien diferenciado, un fenotipo pobremente diferenciado, o una mezcla de ambos tipos de células. Así, no todas las células neoplásicas son necesariamente replicantes en un momento determinado. El conjunto de células neoplásicas comprende las células neoplásicas de tumores benignos y de malignos o francamente neoplasmas. Las células claramente neoplásicas son referidas frecuentemente como un cáncer, denominado de forma más característica carcinoma si se originó a partir de células de origen endodérmico o ectodérmico, o sarcoma si se originó a partir de células derivadas del mesodermo.

Tal como se utiliza aquí, el término "operativamente unido" hace referencia a una unión de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se le coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o una secuencia incrementadora de la transcripción están operativamente unidos a una secuencia codificante si ello afecta a la transcripción de la secuencia codificante. El término "operativamente unido" hace referencia a que las secuencias de DNA que se unen son contiguas y, si es necesario para la unión de dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, ya que las secuencias incrementadoras de la transcripción están generalmente separadas del promotor por varias kilobases y las secuencias intrónicas pueden ser longitud variable, algunos elementos polinucleotídicos pueden estar operativamente unidos pero no ser contiguos. Tal como se utiliza aquí, el término "condiciones fisiológicas" hace referencia a un entorno acuoso que tiene una fuerza iónica, pH y temperatura esencialmente similar a las condiciones que se darían en una célula de mamífero intacta, o un espacio tisular u órgano de mamífero vivo. En general, las condiciones fisiológicas comprenden una solución acuosa que tiene NaCl 150 mM (u opcionalmente KCl), pH 6,5-8,1 y una temperatura de aproximadamente 20-45ºC. En general, las condiciones fisiológicas son condiciones adecuadas para la asociación intermolecular de macromoléculas biológicas. Por ejemplo, son generalmente adecuadas las condiciones fisiológicas de NaCl 150 mM, pH 7,4, a 37ºC.

Descripción detallada

En general, la nomenclatura utilizada aquí y en los procedimientos de laboratorio de cultivo celular, genética molecular y virología molecular descritos más adelante es bien conocida y comúnmente utilizada en la materia. Las técnicas estándares se utilizan para procedimientos de ácidos nucleicos recombinantes, síntesis de polinucleótidos, síntesis polipeptídica, generación y propagación de la reserva de virus (incluyendo las líneas celulares capaces de realizar la trans-complementación de reservas de virus deficientes en replicación), el cultivo celular y similar. En general, las reacciones enzimáticas y las etapas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las técnicas y los procedimientos se realizan por lo general de acuerdo con los procedimientos convencionales de la materia y según varias referencias incluidas (ver, para una revisión general Sambrook y col., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Virology, 2ª edición, eds. Fields BN y Knipe DM, 81990) Raven Press, New York, NY, incorporado aquí como referencia), que se proporcionan a lo largo de este documento. Los procedimientos descritos son bien conocidos en la materia y se proporcionan para facilitar la lectura del documento. Toda la información allí contenida se ha incorporado mediante referencias bibliográficas.

La neoplasia es una condición patológica que se caracteriza, en parte, por la generación de células neoplásicas que tienen genotipos y fenotipos variables. Algunos tumores pueden comprender una población de células carentes de la función RB, pero con la función p53; dichas células se denominan RB(-). Algunas células tumorales pueden carecer de la función de p53 pero tener la función RB; dichas células se denominan p53(-). Algunos tumores pueden comprender células carentes tanto de p53 como de RB y se denominan p53(-)RB(-). La línea celular SAOS2 (ver infra, Ejemplo experimental) es un ejemplo de tipo celular neoplásico p53(-)RB(-). También pueden haber células neoplásicas que presenten esencialmente niveles normales de p53 y RB: dichas células con RB y p53 normales pueden carecer de otras oncoproteínas (p.ej., productos de genes supresores de tumores distintos a p53 y RB), que pueden proporcionar la base para las construcciones víricas anti-neoplásicas y en consecuencia pueden manifestar preferentemente un fenotipo de replicación en dichas células neoplásicas.

Uno de los hechos en los que se basa la presente invención es que algunos virus de DNA que infectan células de mamífero (p.ej., adenovirus; papilomavirus como BK y JC, SV40 y los papilomavirus como el HPV y similares) codifican para proteínas víricas esenciales para una progresión eficiente del ciclo de replicación vírico; algunas de estas proteínas víricas secuestran proteínas celulares, como las implicadas en el control del ciclo celular y/o en la formación de complejos de transcripción, como una condición necesaria para la replicación vírica eficiente. En ausencia de proteínas víricas que se unan, secuestren o degraden dichas proteínas celulares como p53 y RB, la replicación viral se inhibe. Las células normales (es decir, las no-neoplásicas) que se infectan con un virus mutante carente de la capacidad de secuestrar o degradar p53 y/o RB son generalmente incapaces de mantener la replicación de virus mutantes, por lo tanto dichos virus mutantes son considerados como deficientes en la replicación (o defectuosos en la replicación). Sin embargo, ya que el secuestro o la degradación de p53 o RB no es necesario para la replicación viral en células carentes de p53 o RB funcional (dichas células se denominan p53(-) y RB(-), respectivamente), es posible que los virus mutantes deficientes en la replicación que son defectuosos para el secuestro o degradación de p53 y/o RB puedan expresar un fenotipo de replicación en dichas células p53(-) o Rb(-) en mayor magnitud que en las células con una función normal de p53 y/o RB. Las células neoplásicas carecen frecuentemente de función p53 (una célula p53(-)), de función RB (una célula RB(-)), o de ambas funciones (una célula p53(-)RB-)). Por lo tanto, algunos virus mutantes deficientes en la replicación pueden presentar un fenotipo de replicación en las células neoplásicas.

Los virus mutantes que carecen de la capacidad de expresar una proteína inactivadora de RB funcional (p.ej., la proteína E1a de adenovirus, la proteína E7 de HPV) manifestarán un fenotipo de replicación en células RB(-) y
RB(-)p53 (-). Los virus mutantes carentes de la capacidad de expresar una proteína inactivadora p53 funcional (p.ej., la proteína E1b p55 de adenovirus, la proteína E6 de HPV) manifestarán un fenotipo de replicación en células p53(-) y células RB(-)p53(-). Los virus mutantes carentes de la capacidad de expresar tanto una proteína inactivadora de p53 funcional (p,.ej., la E1b p55 de adenovirus, la proteína E6 de HPV) y una proteína inactivadora de RB funcional (p.ej., E1a de adenovirus, protéina E7 de HPV) manifestarán un fenotipo de replicación en las células

\hbox{RB(-)p53(-).}

La citotoxicidad unida a la expresión de un fenotipo replicativo puede, en consecuencia, utilizarse como base para eliminar preferentemente las células neoplásicas con un fenotipo RB(-), p53(-), o RB(-)p53(-). Aunque algunas células no-neoplásicas replicantes pueden presentar transitoriamente un fenotipo RB(-), fenotipo p53(-), o un fenotipo
RB(-)p53(-) durante la progresión del ciclo celular, los virus mutantes de la invención pueden utilizarse de forma preferente, aunque no necesariamente de forma completamente selectiva, para eliminar las células neoplásicas, constituyendo así una modalidad de terapia antineoplásica para utilizar junto o en combinación con otras modalidades de tratamiento. Los mutantes HPV preferidos para la aplicación a células RB(-)son los que presentan deleciones (u otras mutaciones inactivadoras) en los 37 residuos amino-terminales del polipéptido E7 de HPV, ya que estos residuos son importantes para la unión de RB.

Aunque los procedimientos y composiciones presentados más adelante se describen específicamente para los procedimientos relativos a las construcciones de adenovirus deficientes en la replicación, se cree que la invención puede practicarse con otros virus de DNA que codifican para oncoproteínas que secuestran o incrementan la degradación de la proteína p53 o la proteína RB, por ejemplo especies de papilomavirus deficientes en la replicación (mutantes de tipos HPV 16, 18, 33) que contienen mutaciones en los genes E6 y/o E7, que esencialmente anulan la función de p53 y/o RB, respectivamente. Además de los miembros de la familia Adenoviridae (específicamente el género Mastadenovirus), se cree que los miembros de la familia Papovaviridae, y en especial los papilomavirus y los poliomavirus, que codifican las proteínas virales que secuestran y/o inactivan p53 o RB son adecuados para utilizar en los procedimientos de la invención.

Para una descripción general de la biología de adenovirus y papovavirus, ver Virology, 2ª edición, eds. Fields BN y Knipe DM, col. 2, pág. 1651-1740, Raven Press, New York, incorporada aquí mediante referencias bibliográficas, se incluye para ser utilizado como una guía. Las descripciones específicas siguientes hacen referencia a, pero no se limitan a, adenovirus de serotipo 5 y serotipo 2. Aunque se pueden utilizar otros serotipos, los adenovirus de tipo 5 proporcionan un punto de referencia para la numeración convencional de nucleótidos víricos, así como para la numeración convencional polipéptidos víricos codificados por la región vírica E1a y otros genes víricos. El adenovirus de tipo 2 proporciona una referencia conveniente para la numeración convencional de la región de genes virales E1b y otras regiones génicas virales. Se sobreentiende que los expertos en la materia identificarán fácilmente las posiciones correspondientes en otros serotipos adenovirales. Las referencias a los papilomavirus humanos hacen referencia por lo general a un tipo asociado a la neoplasia (p.ej., tipos 16, 18 ó 33), aunque también se pueden utilizar tipos no-oncogénicos.

Mutantes E1b

Una de las funciones de la fosfoproteína celular p53 es inhibir la progresión de células de mamífero a través del ciclo celular. La proteína E1b p55 de adenovirus de tipo salvaje se une a p53 en las células infectadas que contienen p53, produciendo una inactivación de la función de p53, probablemente mediante el secuestro de p53 en una forma inactiva. La proteína E1b p55 es esencial para la replicación eficiente del adenovirus en células que contienen una p53 funcional. Por lo tanto, las variantes de adenovirus que carecen de la capacidad para unirse a p53 son deficientes en la replicación en las células no-neoplásicas y no-replicantes que tienen niveles normales de p53 funcional.

Las células tumorales humanas son frecuentemente homocigotas o heterocigotas para los alelos p53 mutados (p.ej., mutantes de sustitución, deleción, o desplazamiento del marco de lectura) y carecen de la función de p53 necesaria para el control normal del ciclo celular (Hollstein y col., (1991) Science 253:49; Levine y col., (1991) op. cit., incorporadas aquí mediante referencias bibliográficas). En consecuencia, muchas células neoplásicas son p53(-), bien porque carecen de los niveles suficientes de proteína p53 y/o porque expresan formas mutantes de p53 que son incapaces de expresar una p53 funcional, con lo que se reduce la función p53 aún cuando esté presente una p53 de tipo salvaje (p.ej., inhibiendo la formación de multímeros funcionales). Algunas células neoplásicas pueden contener alelos de proteínas p53 de tipo salvaje, pero pueden tener una segunda mutación que anule la función de p53, como, por ejemplo, una mutación que dé como resultado la localización citoplasmática en lugar de nuclear de la proteína p53; dichos mutantes de sitio secundario también carecen de función p53.

Se cree que las especies de adenovirus deficientes en la replicación que carecen de la capacidad para formar un complejo con p53, pero que retienen otras funciones replicativas virales esenciales presentarán un fenotipo de replicación en células deficientes en la función de p53 (p.ej., células que son homocigotas para los alelos de p53 delecionados, células que comprenden proteínas p53 mutantes que no son funcionales), y, en cambio, presentarán un fenotipo replicativo en las células no-neoplásicas y no-replicativas. Dichas especies de adenovirus deficientes en la replicación son referidas aquí por conveniencia como adenovirus deficientes en la replicación, E1b-p53(-).

Una población celular (como un cultivo celular mixto o un paciente de cáncer humano) que comprende una subpoblación de células neoplásicas carentes de la función de p53 y una subpoblación de células no neoplásicas que expresan una función de p53 normal, puede contactarse en condiciones infecciosas (es decir, condiciones adecuadas para la infección adenoviral de la población celular, condiciones fisiológicas típicas) con una composición que comprenda una dosificación infecciosa de un adenovirus deficiente en la replicación E1b-p53 (-). La infección produce una expresión preferencial de un fenotipo de replicación en una fracción significativa de células que comprenden la subpoblación de células neoplásicas carentes de la función de p53, pero que no expresan un fenotipo replicativo en la subpoblación de células no-neoplásicas con una función normal de p53. La expresión de un fenotipo de replicación en una célula p53(-) infectada da como resultado la muerte de la célula, mediante, por ejemplo, un efecto citopático (CPE), la lisis celular, la apoptosis y similares, dando como resultado una eliminación selectiva de células neoplásicas p53(-) de la población celular.

De forma característica, las construcciones de adenovirus deficientes en la replicación adecuadas para la eliminación selectiva de células neoplásicas contienen mutaciones (p.ej., deleciones, sustituciones, desplazamientos del marco de lectura) que inactivan la capacidad del polipéptido E1b p55 para unirse a la proteína p53 de forma eficaz. Dichas mutaciones inactivadoras ocurren en las regiones de p55 que se unen a p53. Opcionalmente, la región mutante E1b puede codificar y expresar una proteína p19 funcional codificada por el resto de la región E1b y que es funcional en la transactivación de genes tempranos adenovirales, en ausencia de polipéptidos E1a.

Las construcciones de adenovirus deficientes en la replicación E1b-p53(-)a utilizar en los procedimientos y composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a los ejemplos siguientes: (1) adenovirus de tipo 2 dl 1520, que contiene una mutación de C a T en la posición nucleotídica 2022 que genera un codón de parada 3 aminoácidos cadena abajo del codón AUG, utilizado para el inicio de la traducción de la proteína p55 y una deleción entre los nucleótidos 2496 y 3323 reemplazada con una inserción de un pequeño engarce que genera un codón de parada en el nucleótido 3336; y en donde la expresión de la proteína p19 no está esencialmente afectada (Barker y Berk (1987) Virology 156:107, incorporado aquí mediante referencias bibliográficas; y (2) una construcción de adenovirus compuesto que comprende un adenovirus de tipo 2 dl 1520, comprendiendo por lo menos la mutación en la posición 2022 y/o la deleción en 2496-3323, o una porción esencial de lo mismo y una mutación adicional en p19 para producir un mutante p19 cyt; la construcción del virus compuesto carece de p55 y comprende el efecto citopático aumentado de la mutación p19 cyt. Ad2 dl 1520 están disponibles por el Dr. A. Berk, University of California en Los Angeles, CA y se describen en la bibliografía, incluyendo Barker y Berk (1987) Virology 156:107, incorporados aquí mediante referencias bibliográficas.

Puede ser preferible incorporar mutaciones adicionales en dichas construcciones de adenovirus para inhibir la formación de viriones infecciosos en células neoplásicas, que de otra manera mantendrían la replicación de los mutantes E1b-p53(-). Dichas mutaciones inactivadoras adicionales son preferibles en las modalidades terapéuticas, en donde no es deseable una replicación viral completa que forme viriones infecciosos capaces de propagarse e infectar las células adyacentes. Estos mutantes completamente inactivados son referidos como mutantes E1b-p53(-)no-replicables. Estos mutantes no-replicables comprenden mutaciones que previenen la formación de viriones infecciosos incluso en las células p53(-)RB(-); dichas mutaciones son generalmente mutaciones estructurales en una proteína o proteasa del virión.

Sin embargo, en muchas modalidades, es deseable que el virus mutante sea replicable y forme viriones infecciosos que contengan el genoma viral mutante, que a su vez puedan propagarse e infectar otras células, amplificando así la acción anti-neoplásica de una dosificación inicial de virus mutantes.

Los mutantes E1b(-) adicionales carentes de la capacidad para unirse a p53 pueden generarse por los expertos en la materia mediante mutaciones generadas en la región del gen E1b que codifica para el polipéptido p55, expresando polipéptidos p55 mutantes, contactando los polipéptidos p55 mutantes con la p53 o con un fragmento de unión de p53 en condiciones de unión acuosa e identificando los polipéptidos E1b mutantes que no se unen específicamente a la p53 como mutantes E1b(-) candidatos adecuados para utilizar en la presente invención.

De manera más característica, se utilizará un ensayo funcional para identificar los mutantes E1b(-) candidatos. Por ejemplo, el ensayo de Friend para la determinación de la función de p53 se realizará esencialmente tal como se describió en Frebourg y col., (1992) Cancer Res. 52:6977, incorporado aquí mediante referencias bibliográficas. Los mutantes E1b que carecen de la capacidad de inactivar la p53 se identificarán como mutantes deficientes en la replicación E1b(-) candidatos.

Mutantes dobles E1a/E1b

Algunas células tumorales humanas carecen de la función de p53 y de RB, bien mediante inactivación mutacional o deleción de una o ambas especies de proteínas. Dichas células se denominan células p53(-) RB(-).

Se cree que las especies de adenovirus deficientes en la replicación que carecen de la capacidad de unirse a p53 y que también carecen de la capacidad de unirse a RB, pero que retienen otra funciones víricas esenciales presentarán preferentemente un fenotipo de replicación en las células p53(-) RB(-). Dichas especies de adenovirus deficientes en la replicación son referidas aquí, por conveniencia, como adenovirus deficientes en la replicación E1a-RB(-)/E1b-p53 (-), o simplemente mutantes dobles E1a/E1b. Dichos mutantes dobles E1a/E1b pueden construirse por los expertos en la materia combinando por lo menos una mutación doble E1a RB(-) en la región E1a y por lo menos una mutación E1b-p53(-) en la región E1b que codifica para la p55, con el fin de formar un adenovirus mutante doble E1a/E1b. Un tal adenovirus mutante doble deficiente en la replicación presentará un fenotipo de replicación en células que son deficientes en las funciones de p53 y RB, pero no presentará el fenotipo de replicación en las células no transformadas y no-replicativas, ni en las células que son deficientes en la función de p53 o de RB, pero no en ambas. Por ejemplo, el mutante Ad5 dl 434 (Grodzicker y col., (1980) Cell 21:454, incorporado aquí como referencia) comprende una deleción del locus E1a y una deleción parcial del locus E1b, y carece esencialmente de la capacidad para codificar proteínas E1a y E1b p55 funcionales.

Una población celular (como un cultivo celular mixto o un cáncer humano) que comprenda una subpoblación de células neoplásicas carentes de las funciones p53 y RB y una subpoblación de células no-neoplásicas que expresen la función normal de p53 y/o la función de RB pueden contactarse en condiciones infectivas (es decir, en condiciones adecuadas para la infección viral de la población celular, típicamente condiciones fisiológicas) con una composición que comprenda una dosificación infecciosa de un adenovirus mutante doble E1a/E1b deficiente en la replicación. Dichos contactos dan como resultado la infección de la población celular con el adenovirus mutante doble E1a/E1b deficiente en la replicación. La infección produce la expresión preferencial de un fenotipo de replicación en una fracción significativa de células que comprende la subpoblación de células neoplásicas carentes de la función de p53 y de RB, en cambio no se produce la expresión de un fenotipo replicativo en la subpoblación de células no-neoplásicas que tienen una función normal de p53 y/o de RB. La expresión de un fenotipo de replicación en una célula p53(-)
RB(-) infectada da como resultado la muerte de dicha célula mediante un efecto citopático (CPE), lisis celular y similar, dando como resultado una eliminación selectiva de células neoplásicas p53(-)RB(-) de la población celular.

Puede ser preferible incorporar mutaciones adicionales en dichas construcciones adenovirales para inhibir la formación de viriones infecciosos en células neoplásicas, que de otra manera mantendrían la replicación de un mutante doble E1a/E1b. Dichas mutaciones inactivadoras adicionales son preferibles en modalidades terapéuticas en donde no es deseable una replicación viral completa, formadora de viriones infecciosos y capaz de propagar e infectar células adyacentes. Estos mutantes completamente inactivados son referidos como mutantes dobles E1a/E1b no-replicables. Dichos mutantes no-replicables comprenden mutaciones que previenen la formación de viriones infecciosos incluso en células p53(-)RB(-); dichas mutaciones son en general mutaciones estructurales en una proteína o proteasa vírica.

Sin embargo, en muchas modalidades es deseable que el virus mutante sea replicable y forme viriones infecciosos que contengan el genoma viral mutante para que puedan propagarse e infectar otras células, amplificando así la acción anti-neoplásica de una dosificación inicial de virus mutante.

Construcciones virales de selección negativa

Aunque la expresión de un fenotipo de replicación adenoviral en una célula infectada se correlaciona con la citotoxicidad viral inducida, generalmente mediante lisis celular, efecto citopático (CPE), apoptosis, u otros mecanismos de muerte celular. A menudo, puede ser preferible aumentar la citotoxicidad de un adenovirus recombinante que se ha de utilizar para la terapia antineoplásica. Dicha argumentación puede incluir un gen de selección negativa en el adenovirus recombinante, por lo general operativamente unido a un promotor adenoviral que presenta modulación transcripcional positiva en las células que expresan un fenotipo replicable. Por ejemplo, una caja génica HSV tk puede estar operativamente unida inmediatamente cadena debajo de un promotor E3 de un adenovirus deficiente en la replicación, como el Ad5 NT dl 1110. Frecuentemente, es deseable delecionar una porción no esencial (es decir, no esencial para la replicación y empaquetamiento viral) del genoma de adenovirus con el fin de acomodar la caja de selección negativa; en consecuencia puede delecionarse una porción esencial de la región del gen E3 y reemplazarse con una caja de selección negativa como el gen HSV tk unido operativamente a un promotor E2 (y una secuencia incrementadora de la transcripción) u otro promotor/incrementador. Alternativamente, un gen de selección negativa puede estar unido operativamente a un promotor de la región tardía del adenovirus para proporcionar una expresión eficaz del producto del gen de selección negativa en las células que expresan un fenotipo de replicación que se caracteriza por la transcripción de promotores de genes tardíos.

Para realizaciones en las que la replicación viral formadora de viriones infecciosos in vivo es indeseable, se utilizan construcciones de adenovirus deficientes en la replicación que no sean replicables. Dichos mutantes no replicables comprenden una mutación E1a(-) y/o E1b(-) y comprende todas las funciones genéticas necesarias para generar un fenotipo de replicación en una célula neoplásica adecuada (p.ej., una célula p53(-), una célula RB(-), o una célula p53(-)
RB(-), pero en los que se ha delecionado por lo menos una función génica necesaria para la formación de viriones infecciosos, como las proteínas estructurales de la cubierta, las proteasas y similares. Alternativamente, una respuesta inmune provocada por el virus puede neutralizar los viriones infecciosos y moderar la propagación de la infección viral. Los mutantes no-replicables carentes de una función de acción en trans además de la mutación E1a y/o E1b, pueden propagarse junto con un virus auxiliar o una línea celular capaz de proporcionar la función (o funciones) de acción en trans delecionada. Por ejemplo, la línea celular 293 (ATCC # CRL 1573:Grahma y col., (1977) J. Gen. Virol. 36:59, incorporado aquí mediante referencias bibliográficas) que proporciona funciones E1a y E1b en trans, puede modificarse para proporcionar funciones adicionales en trans, como un virión, una proteína de la cubierta del virión o similar y para permitir, así, la propagación de mutantes "no-replicables" para el desarrollo de reservas víricas.

La expresión del gen HSV tk en una célula no es directamente tóxica para la célula, salvo que la célula sea expuesta a un agente de selección negativa como el ganciclovir o el FIAU. En las células infectadas que expresan un fenotipo de replicación y también en donde se expresa un gen de selección negativa, no se produce una citotoxicidad adicional hasta que no se administre el agente de selección negativa (p.ej., ganciclovir) a una dosificación selectiva y eficaz, en cuyo caso, las células infectadas que expresan el gen tk se eliminarán selectivamente; en consecuencia, la selección negativa puede utilizarse para incrementar la eliminación citopática y/o para frustrar la replicación viral posterior al eliminar las células que presentan un fenotipo replicativo. Además, ajustando el programa de dosificación y/o administración del agente de selección negativa, es posible producir sólo una eliminación parcial de la población de células infectadas que expresan el gen de selección negativa. En general, la dosificación de ganciclovir se calibra mediante la generación de una curva de dosis-respuesta estándar y la determinación del nivel de dosificación al que se observa un nivel deseado de eliminación de células neoplásicas infectadas. La información concerniente a la administración de ganciclovir (GANG) a animales está disponible en varias fuentes en la materia, incluyendo las direcciones de prescripción en humanos de las especificaciones del medicamento. Cuando se utiliza un cultivo celular, una concentración selectiva de ganciclovir típica se halla en el intervalo de 0,05 mM a 50 mM, generalmente a aproximadamente 1 mM, utilizándose 0,2 mM para aplicaciones in vitro y 1-5 mM para aplicaciones in vivo (administrado generalmente en 24 horas mediante infusión continua a partir de una bomba osmótica cargada con 125 mg/ml de ganciclovir en solución acuosa). Un esquema de dosificación para la administración in vivo puede comprender ganciclovir a una dosificación de 5 mg/Kg de peso corporal B.I.D., administrada intravenosamente durante 7 días.

Los genes de selección negativa pueden incorporarse en las construcciones de adenovirus deficientes en la replicación E1a-RB(-), las construcciones de adenovirus deficientes en la replicación E1ba-p53(-) y las construcciones virales deficientes en la replicación dobles mutantes E1a/E1b, o similares. Una realización preferida es una caja del gen HSV tk (Zjilstra y col., (1989) Nature 342:435; Mansour y col., (1988) Nature 336:348; Johnson y col., (1989) Science 245:1234; Adair y col., (1989) Proc. Natl. Acad.Sci. (USA) 86:4574; Capecchi; M. (1989) Science 244:1288, incorporado aquí mediante referencia) operativamente unido al promotor E2 de Ad5 Nt dl111o o un promotor alternativo y/o una secuencia intensificadora de la transcripción (p.ej., el promotor tardío principal, promotor E1a/intensificador, promotor E1b/intensificador) con un sitio de poliadenilación para formar una caja de expresión de tk. La caja de expresión tk (u otra caja de expresión de selección negativa) se inserta en el genoma adenoviral, por ejemplo, para sustituir una deleción del gen E3. Otros genes de selección negativa y construcciones de adenovirus deficientes en la replicación serán evidentes a los expertos en la materia. Se estima que un gen de selección negativa unido operativamente al promotor E2 es una realización preferida para la incorporación en mutantes adenovirus deficientes en la replicación E1a(-), dado que el promotor de E2 contiene múltiples sitios E2F, mientras que RB(-) y p53(-)RB(-) carecen de la función RB y presuntamente presentarán una mayor transcripción eficiente a partir del promotor E2.

Utilizaciones diagnósticas e in vitro

Los adenovirus deficientes en la replicación de la invención pueden utilizarse para detectar la presencia de células que carecen de la función de p53 y/o RB. Por ejemplo, puede infectarse una muestra celular que comprenda una subpoblación de células neoplásicas carentes de p53 y/o RB con especies de adenovirus deficientes en la replicación. Al cabo de un período de tiempo adecuado, las células en la muestra celular que expresen un fenotipo de replicación (p.ej., pérdida de capacidad para expulsar el Trypan Blue, la formación de viriones, la incorporación de timidina-H3 en el DNA viral) puede cuantificarse para proporcionar una cuantificación del número o proporción de células replicativas y/o neoplásicas en la muestra celular. Dichos procedimientos pueden utilizarse para diagnosticar neoplasmas y/o evaluar la carga de células tumorales después de quimioterapia en un paciente, basándose en una muestra de células explantadas (p.ej., una muestra de linfocitos de un paciente que recibe quimioterapia para una leucemia linfocítica).

Son evidentes las utilizaciones y variaciones diagnósticas alternativas; por ejemplo, puede sustituirse un gen reportero (p.ej., una luciferasa, la beta- galactosidasa) por un gen de selección negativa en un adenovirus deficiente en la replicación; las células transformadas pueden evaluarse (por ejemplo en una muestra celular o en un ensayo de transformación) mediante la expresión del gen reportero que se correlaciona con la expresión de un fenotipo de replicación indicativo de una carencia de p53 y/o RB en una célula.

Procedimientos terapéuticos

La terapia de enfermedades neoplásicas puede lograrse administrando al paciente una composición que comprenda los adenovirus defectuosos en la replicación de la invención, incluyendo: adenovirus deficientes en la replicación E1a-Rb(-), adenovirus deficientes en la replicación E1b-p53(-), mutantes dobles E1a/E1b y adenovirus deficientes en la replicación que comprenden además un gen de selección negativa.

Diversos neoplasmas humanos que comprenden células que carecen de las funciones p53 y/o RB pueden tratarse con las construcciones adenovirales deficientes. Como ejemplo, pero sin ser una limitación, un paciente humano o un mamífero no humano con un carcinoma broncogénico, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma laríngeo, carcinoma de pulmón de células pequeñas y de células no-pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, hepatocarcinoma, carcinoma pancreático, carcinoma de vejiga, carcinoma de colon, carcinoma de mama, carcinoma cervical, carcinoma ovárico, leucemias orlinfocíticas, puede tratarse mediante la administración de una dosificación antineoplásica eficaz de un adenovirus deficiente en la replicación. Las suspensiones de partículas adenovíricas infecciosas pueden aplicarse al tejido neoplásico mediante diversas vías, incluyendo la intravenosa, la intraperitoneal, la intramuscular, la subdermal y la tópica. Una suspensión de adenovirus que contenga 10^{13} a 10^{12} o más partículas víricas por mol puede inhalarse como un nebulizador (p.ej., para la liberación pulmonar en el tratamiento del carcinoma broncogénico, el carcinoma de pulmón de células pequeñas, el carcinoma de pulmón de células no pequeñas, el adenocarcinoma de pulmón o el cáncer de laringe), o aplicarse por impregnación directa sobre el sitio del tumor para su tratamiento (p.ej., carcinoma broncogénico, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de laringe, carcinoma cervical), o puede administrarse mediante infusión (p.ej., en la cavidad peritoneal para tratar el cáncer de ovario, en la vena porta para tratar el hepatocarcinoma o las metástasis de hígado de otros tumores primarios no-hepáticos) u otras rutas adecuadas, incluyendo la inyección directa en una masa tumoral (p.ej., el tumor de mama), el enema (p.ej., el cáncer de colon), o el catéter (p.ej, cáncer de vejiga).

Los adenovirus mutantes y antineoplásicos candidatos pueden además evaluarse por su capacidad para reducir la tumorigénesis o la carga de células neoplásicas en ratones nu/nu que portan un trasplante de células carentes de la función p53 y/o RB, comparado con los ratones no tratados que portan un trasplante equivalente de las células neoplásicas.

Los adenovirus mutantes deficientes en la replicación y antineoplásicos pueden formularse para la administración terapéutica y diagnóstica a un paciente con una enfermedad neoplásica.

Para utilizaciones terapéuticas o profilácticas, una composición estéril que contenga una dosificación farmacológicamente eficaz de una o más especies de adenovirus deficientes en la replicación, se administra a un paciente humano o animal no-humano para el tratamiento de una condición neoplásica. En general, la composición comprenderá aproximadamente 10^{3} a 10^{15} o más partículas adenovíricas en una suspensión acuosa. En dichas composiciones estériles, a menudo se utiliza un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Se pueden utilizar diversas composiciones acuosas, p.ej., agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de otras partículas que no sean los viriones adenovíricos deseados. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares y farmacéuticamente aceptables para reproducir unas condiciones fisiológicas aproximadas añadiendo agentes de ajuste de pH y tamponantes, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo el acetato sódico, el cloruro sódico, el cloruro potásico, el cloruro cálcico, el lactato sódico, etc. Pueden incluirse los excipientes con una infección aumentada de células con adenovirus.

Los virus deficientes en la replicación pueden ser librados a las células neoplásicas mediante liposomas o inmunoliposomas; dicha entrega puede dirigirse de forma selectiva a las células neoplásicas gracias a una propiedad de superficie celular presente en la población de células neoplásicas (p.ej., la presencia de una proteína de superficie celular que se una a una inmunoglobulina en un inmunoliposoma). De forma general, una suspensión acuosa que contenga los viriones se encapsula en liposomas o inmunoliposomas. Por ejemplo, una suspensión de viriones de adenovirus deficientes en la replicación puede encapsularse en micelas para formar inmunoliposomas mediante procedimientos convencionales (patentes americanas U.S. 5.043.164, U.S. 4.957.735, U.S. 4.925.661; Connor y Huang (1985) J. Cell Biol. 101:582; Lasic DD (1992) Nature 355:379; Novel Drug Delivery (eds. Prescott LF y Nimmo WS: Wiley, New York, 1989); Reddy y col., (1992) J. Immunol. 148:1585; incorporados aquí en las referencias bibliográficas). Los inmunoliposomas que comprenden un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de célula cancerosa (p.ej., CALLA, CEA) y está presente en las células cancerosas del individuo puede utilizarse para dirigir los viriones a estas células.

Las composiciones que contienen los presentes adenovirus deficientes en la replicación antineoplásica o cócteles de lo mismo pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos de enfermedades neoplásicas. En la aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un paciente afectado por la enfermedad neoplásica en particular, en una cantidad suficiente para sanar o por lo menos parar parcialmente la condición y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograrlo se define como una "dosis terapéuticamente efectiva" o "dosis eficaz". Las cantidades efectivas para esta utilización dependerán de la gravedad de la condición, del estado general del paciente y de la ruta de administración.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen adenovirus deficientes en la replicación antineoplásicos o cócteles de lo mismo, se administran a un paciente que no presenta en la actualidad un estado de enfermedad neoplásica para incrementar su resistencia a la recurrencia de un neoplasma o para prolongar el período de remisión. Una tal cantidad se define como "dosis efectiva profilácticamente". En esta utilización, las cantidades precisas dependen de nuevo de la salud y del nivel general de inmunidad del paciente.

Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones pueden llevarse a cabo con un nivel de dosis y un patrón de dosificación seleccionados por el médico. En cualquier caso, las formulaciones farmacéuticas deberían proporcionar una cantidad de adenovirus deficientes en la replicación y antineoplásicos de la presente invención, suficiente para tratar al paciente de forma eficaz.

La terapia de adenovirus deficientes en la replicación y antineoplásicos de la presente invención puede combinarse con otros protocolos antineoplásicos, como la quimioterapia y/o inmunosupresión convencional. Los procedimientos para la inmunosupresión consistirían de los descritos en la patente internacional WO 96/12406. En general, un adenovirus deficiente en la replicación se administra sólo o junto con un agente inmunosupresor. Ejemplos de compuestos inmunosupresores preferidos incluyen la ciclofosfamida, la ciclosporina o la dexametasona. Las dosificaciones de estos compuestos para realizar una inmunosupresión de nivel deseado son conocidos en la materia. Por ejemplo, la ciclofosfamida se administra preferentemente a 100-300 mg/Kg, mientras que la dexametasona se administra preferentemente a aproximadamente 2-6 mg/Kg.

Propagación de adenovirus mutantes

Los adenovirus mutantes de la invención (p.ej., adenovirus deficientes en la replicación E1a-RB(-), adenovirus deficientes en la replicación E1b-p53(-) y mutantes dobles E1a/E1b) se propagan de forma característica como reservas virales en una línea celular (p.ej., la línea celular ATCC#CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, MD; Graham y col., (1977) J. Gen. Virol. 36:59), la cual puede proporcionar una función E1a, E1b o ambas funciones, respectivamente, en trans para mantener la replicación y la formación de viriones mutantes infecciosos.

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Los ejemplos siguientes se ofrecen como ilustración y sin ánimo de limitación. Para aquellos expertos en la materia serán evidentes variaciones y realizaciones alternativas.

Ejemplos experimentales Efecto de adenovirus recombinantes y deficientes en la replicación en las células neoplásicas carentes de p53 y/o Rb

El ejemplo experimental siguiente demuestra que la administración de una preparación de adenovirus recombinantes y deficientes en la replicación a células neoplásicas carentes de la función de p53 y/o RB puede eliminar eficazmente las células neoplásicas. El ejemplo también muestra que las células neoplásicas que contienen una función p53 y RB son relativamente resistentes a ser eliminadas por la preparación de adenovirus recombinantes y deficientes en la replicación. En consecuencia, los resultados presentados más adelante proporcionan una verificación experimental de que la administración de adenovirus recombinantes y deficientes en la replicación pueda utilizarse para eliminar células neoplásicas. Se proporciona una eliminación selectiva al aprovechar la capacidad diferencial de los adenovirus mutantes para inducir un fenotipo de replicación en células neoplásicas, pero esencialmente incapaces de inducir un fenotipo de replicación (o un efecto citopático asociado) en células no-neoplásicas.

Células no-neoplásicas controles representando diversos tipos neoplásicos se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos a, o casi confluencia en medio DMEM (alto en glucosa) con suero bovino fetal al 10% y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% en condiciones de cultivo estándares. Las células se plaquearon para ser cribadas a una densidad de 5x10^{5} células/pocillo. Las líneas celulares neoplásicas analizadas fueron: SAOS-2 (ATCC HTB85), derivadas de un sarcoma humano osteogénico y primario; U-2OS (ATCC HTB96), derivadas de un sarcoma osteogénico humano; HS700T (ATCC HTB147), derivadas de un adenocarcinoma metastático humano originado en el páncreas o intestinos; 293 (ATCC CRL 1573), línea celular de riñón embrional humano transformada; y DLD-1 (ATCC CCL221), derivado de un adenocarcinoma de colon humano. Cada una de las líneas celulares está disponible a partir del American Type Culture Collection, Rockville, MD. El control de células no-neoplásicas fueron las IMR90 (ATCC CCL 186) y WI-38 (ATCC CCL 75), ambas son líneas de fibroblastos de pulmón humano y diploides.

Estos cultivos celulares se infectaron a continuación, en paralelo, con adenovirus de tipo salvaje Tipo 2 y con mutantes de adenovirus deficientes en la replicación y recombinantes dl 1010, dl 434 y dl 1520. Un frasco de cultivo extra se plaqueó con el propósito de contar células. Estas células provenían de las mismas suspensiones de células utilizadas para las infecciones virales. Se contaron las células para determinar el número de unidades formadoras de calvas virales (pfu) que se habían de añadir a los cultivos celulares para una multiplicidad de infección deseada (MOI). Se añadió el adenovirus de tipo salvaje Tipo 2 y los mutantes adenovirus a los cultivos paralelos a MOIs de 0,1, 1,0, 10 y 100. Los virus resuspendidos en PBS se añadieron a las paredes celulares en un volumen de 1 ml. Las placas de cultivo inoculadas se agitaron en ambas direcciones correspondientes con sus ejes X e Y, inmediatamente después y a medio camino de la adsorción de aproximadamente 1 hora a 37ºC, 5% de CO_{2}. Después del período de adsorción de una hora, se añadieron 2 ml de DMEM con alta concentración de glucosa y suero bovino fetal al 2% y el cultivo se dejó incubar a 37ºC, 5% de CO_{2} en condiciones de cultivo estándares. A diferentes tiempos después de la infección, los cultivos celulares se tiñeron con cristal violeta al 0,5% en metanol al 20% con el fin de determinar la eficacia de la destrucción de células de la preparación de virus. Las células muertas se desengancharon de los pocillos y se eliminaron tras sucesivos lavados, mientras que las células vivas permanecieron en el pocillo y se tiñeron con el colorante. Los resultados demostraron que las preparaciones de adenovirus recombinantes y deficientes en la replicación eran capaces de eliminar de modo preferencial las células neoplásicas respecto a las células no-neoplásicas y que el adenovirus de tipo salvaje Tipo 2 destruyó tanto las células neoplásicas como las no-neoplásicas aproximadamente de igual manera. En particular, los resultados demostraron que los mutantes dl 1010 eran especialmente eficaces para destruir las células neoplásicas, siendo también eficaces los mutantes dl 1520 y dl 434. El adenovirus-2 de tipo salvaje, después de 4-7 días después de la infección, fue capaz de destruir las células en cada uno de los pocillos de cultivo, aunque con eficacia variable y de forma incompleta, con por lo menos algunas células teñidas en cada pocillo. Se ha de remarcar que las líneas WI-38 y SAOS-2 no son buenos huéspedes para la infección por adenovirus y, tal como se discute más adelante, IMR90, sirve como una línea celular control alternativa para fibroblastos diploides humanos. El mutante dl 1010, a los 8-12 días fue capaz de destruir eficazmente todas las líneas celulares excepto la línea resistente a la infección, SAOS-2. El mutante dl 1010 destruyó las líneas 293, U2OS, HS700T y DLD-1 a los 12 días después de la infección y no eliminó los fibroblastos de pulmón humano diploides (WI-38). El mutante dl 1520 fue capaz de destruir eficazmente 3 de las 5 líneas celulares neoplásicas (293, HS700T y DLD-1) a los 14-20 días después de la infección y no destruyó los fibroblastos de pulmón humanos diploides (WI-38). dl1520 es un mutante de E1B(-) y la línea celular U2OS no permite que un virus mutante E1B(-) se replique, lo que indica una especificidad de las diferentes líneas celulares transformadas para ser infectadas por adenovirus defectuosos en la recombinación y mutantes, tal como se predijo. El mutante dl 434 (un mutante doble:E1A(-)E1B(-) fue capaz de destruir eficazmente 3 de las 5 líneas neoplásicas (293, HS700T y DLD-1) a los 14-20 días después de la infección y no destruyó los fibroblastos de pulmón humanos diploides (WI-38). Las líneas DLD-1 y U2OS expresaron un fenotipo parcialmente resistente para la replicación de dl 434. Cada línea celular fue falsamente infectada con sólo PBS como control de viabilidad.

Los experimentos siguientes también se condujeron utilizando células IMR90 (ATCC CCL 186) y adenovirus de tipo salvaje y mutantes. Las células IMR90 se infectaron con el virus indicado a MOIs correspondientes a 0,1, 1,0, 10 y 100. A los 9 días después de la infección, las células se lavaron con PBS y se tiñeron con cristal violeta. Un pocillo de cada 6 se sembró con células 293 para servir como control positivo de la infección del virus. Los resultados mostraron que los fibroblastos de pulmón diploides humanos IMR90 fueron destruidos diferencialmente por el Ad2 de tipo salvaje, dl 1010 y dl 1520. El Ad2 de tipo salvaje destruyó las células IMR90 de forma eficaz a una MOI de 10 ó 100. El dl 1010 fue incapaz de replicarse en las células IMR90 a la mayor MOI probada, aún cuando el dl 1010 destruyó las líneas celulares 293, U2OS, HS700T y DLD-1, tal como se mostró anteriormente. Los virus dl 1520 fueron capaces de destruir las células IMR90 de forma eficaz a una MOI de 100; a esta dosis viral alta, no puede descartarse la posibilidad de que las células mueran como resultado de la sobrecarga viral en lugar de la replicación.

En consecuencia, los resultados muestran que los mutantes adenovirus recombinantes deficientes en la replicación pueden utilizarse para destruir de forma selectiva las células neoplásicas carentes de la función p53 y/o RB, tal como se pronosticó.

Construcción de adenovirus recombinantes deficientes en la replicación

Los siguientes párrafos describen la generación y análisis de cepas de adenovirus mejoradas ONYX-019, ONYX-020 y ONYX-021 con deleciones en E1B 55KD que se replican selectivamente en las células deficientes en p53. Estas cepas se han comparado con el 1520 (denominado aquí ONYX-015) y muestran una mejoría significativa sobre ONYX-015 en los ensayos de CPE viral.

La práctica de este aspecto de la invención utilizará, salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, manipulación y producción del DNA recombinante e inmunología, que forman parte del conocimiento de la materia. Dichas técnicas se explican ampliamente en la literatura, ver por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); DNA Cloning, volúmenes I y II (D.N. Glover, Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. GAit, Ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins, Eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames y S.J. Higgins, Eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Fresheny, Ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); las series, Methods in Enzymology (Academic Presss, Inc); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos, Eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology, volúmenes 154 y 155 (Wu y Grossman, y Wu, Eds., respectivamente), (Mayer y Walker, Eds.) (1987); Immunochemical Methods in Cell Molecular Biologgy (Academic Press, London), Scopes, (1987); Protein Purification:Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.); y Handbook of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, Eds. 1986). Todas las patentes, las solicitudes de patentes y las publicaciones mencionadas aquí, tanto supra como infra, se han incorporado como referencias bibliográficas.

Las construcciones de DNA: los nucleótidos 1339-3328 se obtuvieron mediante corte del plásmido Ad5 pXC1 de Microbix Biosystems, Inc. Toronto, Ontario. Canada, utilizando las enzimas de restricción XbaI y Bgl2. El plásmido pXC1 contiene las secuencias Ad5 desde el par de bases 22 al 5790. Los nucleótidos 1339-3328 abarcan la mayor parte del gen E1B 55KD, pero no incluyen las últimas 178 pb del extremo C-terminal. El fragmento de DNA purificado se clonó en un vector Bluscript modificado (Stratagene Corporation) (pBS Bgl \DeltaHin); con la diana HindIII sustituida por una Bgl2.

Se generaron oligonucleótidos en ambos extremos del fragmento 1339-3328, así como internamente (ver Figura 2). Los oligos son los siguientes:

1

Estos oligos se utilizaron en la PCR para generar fragmentos distintos A, B, C y D. Los fragmentos se purificaron en gel.

Los siguientes pares de fragmentos: A y B, A y C y A y D se ligaron en el fragmento de 7,9 Kb Bgl2/Xba1 de pXC1 purificado por gel. Después de la transformación en células DH5-\alpha, se rastrearon las colonias mediante PCR utilizando los oligos A5XBAT y A5BGLB para buscar positivos. Ver la patente americana U.S. 5.008.182 y Hedrun, PCR Methods and Applications 2:167-71 (1992).

Estas construcciones contienen secuencias de DNA que codifican para deleciones de los siguientes aminoácidos en el gen E1B 55KD:

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p019(pXC1-AB)	Realizado a partir	Deleción de aa
	de fragmentos A y B	218-275
p020(pXC1-AC)	Realizado a partir	Deleción de aa
	de fragmentos A y C	218-300
p021(pXC1-AD)	Realizado a partir	Deleción de aa
	de fragmentos A y D	218-354

La figura 2 muestra los fragmentos descritos anteriormente.

Se realizaron DNA maxi-preps (Quiagen) en un positivo de cada construcción. El DNA se secuenció para confirmar las deleciones. Los plásmidos p019, p020 y p021 en E. coli se han depositado en el American Type Culture Collection, denominándose a continuación JN 019, JN 020 y JN 021, respectivamente. Los números de acceso del American Type Collection son ATCC 98286 para JN 019, ATC 98287 para JN 020 y ATC 98288 para JN 021.

Construcciones víricas: las células HEK293 se co-transfectaron con el plásmido pBHGE3 obtenido de Microbix y con cada uno de los plásmidos p019, p020 y p021. El plásmido pBHGE3 contiene una deleción de secuencias Ad5E1 desde el par de bases 188 al 1339 y se utilizó para construir los vectores Ad5 con inserciones o mutaciones en la región temprana 1. Se picaron las calvas y se realizó un análisis por PCR con la primera solución obtenida remojando los bastoncillos y utilizando los oligonucleótidos A5XBAT y A5BGLB para confirmar la presencia del gen E1B 55KD parcialmente delecionado. Los procedimientos de PCR son bien conocidos en la materia como una demostración de la utilización de sondas en la hibridación de ácidos nucleicos para amplificar el material genético diana. Ver por ejemplo, las patentes americanas U.S. 4.683.202; 4.683.195; 5.091.310; 5.008.182 y 5.168.039. Se crecieron en cultivo los virus de las calvas y el DNA viral se obtuvo utilizando el equipo Quiagen Amp Blood. A continuación, se secuenció el DNA cadena arriba y cadena debajo de las deleciones para confirmar las deleciones.

Resultados de la inmunoprecipitación: los resultados de la inmunoprecipitación utilizando virus de células C33A lisadas mostraron que los virus ONYX-019, ONYX-020 y ONYX-021 (que correspondían con los plásmidos p019, p020 y p021 anteriores): (a) aparentemente producen algo más de proteína 19KD que el ONYX-015 según los resultados obtenidos con el anticuerpo anti-19KD de Oncogene Sciences; (b) producen una versión de la proteína de 55KD que tiene un peso molecular inferior que la de 55KD de tipo salvaje, según el resultado obtenido con el anticuerpo anti-55KD de Oncogene Sciences; a tener en cuenta que ONYX-015 no produce proteína 55KD detectable; y (c)reacciona como esperado con el anticuerpo contra el adenovirus utilizando un anticuerpo anti-adenovirus de abV Immune Response.

Resultados de CPE: los resultados de los ensayos CPE utilizando el C33A y comparando ONYX-015 con ONYX-020 y ONYX-021 mostraron que las nuevas cepas fueron aproximadamente 2 a 10 veces más potentes que el ONYX-015, tal como se cuantificó por la MOI requerida para producir un efecto CPE equivalente.

Estos experimentos se realizaron tal como se describió anteriormente. En resumen, el adenovirus Tipo 2 de tipo salvaje y los adenovirus mutantes, ONYX- 015 a ONYX-019, ONYX-020 y ONYX-021, se añadieron a los cultivos paralelos de células a unas MOIs de 0,1, 1,0 10 y 100. Los virus resuspendidos en PBS se añadieron a las células en un volumen de 1 ml. Los frascos de cultivo inoculados se agitaron en las direcciones de los ejes X e Y inmediatamente después de la inoculación y en mitad del período de adsorción de aproximadamente 1 hora a 37ºC, con 5% de CO_{2}. Después del período de adsorción de 1 hora, se añadieron 2 ml de DMEM con alta concentración de glucosa y suero fetal bovino al 2% y los cultivos se incubaron a 37ºC y 5% de CO_{2} en condiciones estándares de cultivo. Al cabo de 7 días después de la infección, se tiñeron los cultivos celulares con cristal violeta al 0,5% en metanol al 20% con el fin de determinar la eficacia de las preparaciones virales para destruir las células. Las células muertas se desengancharon de los pocillos y se eliminaron mediante lavados, mientras que las células vivas permanecieron en los pocillos y se tiñeron con el colorante. Los resultados demostraron que las preparaciones de adenovirus recombinantes ONYX-015, ONYX-019, ONYX-020 y ONYX-021 fueron capaces de destruir preferentemente las células neoplásicas en comparación con las células no-neoplásicas y que el adenovirus de tipo salvaje Tipo 2 destruyó aproximadamente por igual las células neoplásicas como las no-neoplásicas.

Los resultados demostraron además que ONYX-019, ONYX-020 y ONYX-021 fueron 2-10 veces más potentes en la destrucción de células C33A que ONYX-015, según se cuantificó por una MOI requerida para producir un efecto CPE equivalente. El experimento se realizó en un intervalo de MOI de 10, 1,0, 0,1 y 0,01 y ONYX-019, ONYX-020 y ONYX-021 produjeron la mayor muerte celular a una MOI de 0,1-0,01.

Efecto de los adenovirus recombinantes y deficientes en la replicación y la quimioterapia sobre la eliminación de células tumorales

A continuación se estudió la eficacia de ONYX-015 (d11520) administrado intravenosamente (iv) solo y en combinación con quimioterapia. Xenoinjertos de tumores humanos (colon, cérvix) se crecieron subcutáneamente en ratones "nude" hasta alcanzar un tamaño de 5-7 mm en cuyo momento, 10^{9} pfu totales se inyectaron iv en dosis divididas (días 1-5). Los ratones en grupos de quimioterapia recibieron 5FU o cisplatino a dosis máximas toleradas vía intraperitoneal (IP) el día 5. Los controles recibieron inyecciones de vehículo iv. e ip. de idéntica manera. Se observó replicación viral intratumoral después de la administración iv. Mientras que el cisplatino y el 5-FU no mejoraron de forma significativa la supervivencia ni inhibieron el crecimiento tumoral, el ONYX-015 en solitario inhibió el crecimiento tumoral de forma significativa (40-60%) y mejoró la supervivencia (p=0,05). La terapia de combinación con ONYX-015 y 5-FU o cisplatino condujo a una supervivencia significativamente mejorada respecto a cualquier agente en solitario. En consecuencia, el ONYX-015 presentó una actividad antitumoral selectiva cuando se administró iv, lo que puede mejorarse con la quimioterapia.

Claims

1. Utilización de un adenovirus recombinante deficiente en la replicación carente de la expresión de un polipéptido E1b adenovírico capaz de unirse a un producto funcional de un gen supresor tumoral (p53) teniendo dicho adenovirus la secuencia de ácido nucleico aislada que está presente en un plásmido recombinante JN019, JN020 o JN021, depositados con los números de acceso ATCC 98286, 98287 y 98288, respectivamente en la preparación de un medicamento para eliminar células neoplásticas en una población celular, dicho adenovirus recombinante deficiente en la replicación en donde se pone en contacto en condiciones infectivas con una población celular que comprende células no-neoplásicas que contienen dicho producto funcional de un gen supresor tumoral leve, un complejo unido a una oncoproteína vírica y células neoplásicas carentes de dicho producto funcional de un gen supresor tumoral, generándose, de esta manera, una población de células infectadas.

2. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células neoplásicas son p53(-).

3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el adenovirus recombinante deficiente en la replicación no codifica para un polipéptido E1b p55 capaz de unirse a p53.

4. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha población celular que comprende células neoplásicas y células no-neoplásicas está presente en un mamífero y dicha etapa de contacto se realiza in vivo mediante administración del adenovirus recombinante deficiente en la replicación a un individuo.

5. Utilización de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el mamífero es un humano.

6. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el adenovirus recombinante deficiente en la replicación puede replicarse para formar viriones infecciosos en una célula neoplásica carente de la función de p53.

7. Utilización de acuerdo con la reivindicación 6, en donde los viriones infecciosos formados en la célula neoplásica son capaces de propagarse e infectar células adyacentes in vivo en un paciente.

8. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el adenovirus recombinante deficiente en la replicación no se replica para formar viriones infecciosos en las células neoplásicas de un paciente humano.

9. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el adenovirus recombinante deficiente en la replicación incluye además una alteración genética en E1a que previene la unión con el supresor de tumor Rb.

10. Utilización de una dosificación terapéuticamente efectiva de adenovirus recombinante deficientes en la replicación, teniendo dicho adenovirus la secuencia de ácido nucleico aislado, que está presente en un plásmido recombinante JN019, JN020 o JN021, depositado con los números de acceso ATCC 98286, 98287 y 98288, respectivamente, en la preparación de un medicamento para utilizar en el tratamiento de una condición neoplásica en un paciente humano que tiene un neoplasma que comprenda células neoplásicas carentes de un producto funcional de gen supresor de tumor (p53).

11. Utilización de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el adenovirus recombinante deficiente en la replicación incluye además una alteración genética en la región E1a.

12 Utilización de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la alteración genética en la región E1a de dicho adenovirus deficiente en la replicación previene de manera sustancial la unión con un producto de un gen supresor de tumor RB.

13. Utilización de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho neoplasma comprende células neoplásicas que carecen del supresor de tumor Rb o del supresor de tumor p53, o de ambos supresores tumorales.

14. Utilización de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13, en donde el medicamento que comprende un adenovirus recombinante deficiente en la replicación que además comprende un gen de selección negativa operativamente unido.

15. Composición antineoplásica para la terapia de la enfermedad neoplásica, que comprende una dosificación terapéuticamente efectiva de un adenovirus recombinante deficiente en la replicación, teniendo dicho adenovirus la secuencia de ácido nucleico aislada que está presente en un plásmido recombinante JN019, JN020 o JN02 y depositados con los números de acceso ATCC 98286, 98287 y 98288, respectivamente, en una forma de liberación
farmacéutica.

16. Plásmido recombinante JN019, depositado en el American Type Culture Collection con el número de acceso 98286, que comprende una secuencia de DNA que codifica para una deleción de los aminoácidos 218-275 en el gen E1b 55KD.

17. Plásmido recombinante JN020, depositada en el American Type Culture Collection con el número de acceso 98287, que comprende una secuencia de DNA que codifica para una deleción de los aminoácidos 218-300 en el gen E1b 55KD.

18. Plásmido recombinante JN021, depositado en el American Type Culture Collection con el número de acceso 98288, que comprende una secuencia de DNA que codifica para una deleción de los aminoácidos 218-354 en el gen E1b 55KD.

19. Secuencia de ácido nucleico aislada presente en un plásmido recombinante, JN019, dicho plásmido en depósito con el número de acceso ATCC 98286, comprendiendo dicha secuencia de ácido nucleico una deleción en la región E1b del adenovirus, dicha deleción codificando para los aminoácidos 218-275.

20. Secuencia de ácido nucleico aislada presente en un plásmido recombinante, JN020, dicho plásmido en depósito con el número de acceso ATCC 98287, comprendiendo dicha secuencia de ácido nucleico una deleción en la región E1b del adenovirus, dicha deleción codificando para los aminoácidos 218-300.

21. Secuencia de ácido nucleico aislada presente en un plásmido recombinante, JN021, dicho plásmido en depósito con el número de acceso ATCC 98288, comprendiendo dicha secuencia de ácido nucleico una deleción en la región E1b del adenovirus, dicha deleción codificando para los aminoácidos 218-354.

22. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1 ó 11 que comprende además poner en contacto dichas células neoplásicas con un compuesto inmunosupresor o quimioterapéutico.

23. Composición que comprende un adenovirus recombinante deficiente en la replicación teniendo dicho adenovirus la secuencia de ácido nucleico aislada que está presente en un plásmido recombinante JN019, JN020 o JN021 depositados con los números de acceso ATCC 98286, 98287 y 98288, respectivamente, y un compuesto quimioterapéutico o inmunosupresor.

24. Célula hospedadora que comprende un plásmido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 16-18.