ES2258265T3 - Vectores de replicacion con especificidad tisular. - Google Patents
Vectores de replicacion con especificidad tisular.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE, EN GENERAL, A TERAPIA GENICA DIRIGIDA, QUE UTILIZA VECTORES RECOMBINANTES Y, ESPECIALMENTE, VECTORES DE ADENOVIRUS. LA INVENCION SE REFIERE ESPECIFICAMENTE, A VECTORES DE REPLICACION CONDICIONAL Y A METODOS DE UTILIZACION DE LOS MISMOS. DICHOS VECTORES, SON CAPACES DE REPLICARSE SELECTIVAMENTE EN UN TEJIDO DIANA, PROPORCIONANDO UN BENEFICIO TERAPEUTICO, POR LA PRESENCIA DEL VECTOR PER SE, O DERIVADA DE PRODUCTOS GENICOS HETEROLOGOS EXPRESADOS POR EL VECTOR Y DISTRIBUIDOS A TRAVES DEL TEJIDO. EN DICHOS VECTORES, SE SITUA UN GEN ESENCIAL PARA LA REPLICACION BAJO EL CONTROL DE UNA SECUENCIA REGULADORA TRANSCRIPCIONAL ESPECIFICA DE UN TEJIDO HETEROLOGO. DE ESTA FORMA, LA REPLICACION SE CONDICIONA A LA PRESENCIA DE UN(OS) FACTOR(ES), QUE INDUCE(N) LA TRANSCRIPCION, O A LA AUSENCIA DE UN(OS) FACTOR(ES), QUE INHIBEN LA TRANSCRIPCION DE DICHO GEN, MEDIANTE LA SECUENCIA REGULADORA TRANSCRIPCIONAL INCORPORADA EN DICHO VECTOR. POR ELLO, SE PUEDE TRATAR UN TEJIDO DIANA DE FORMASELECTIVA.
Description
Vectores de replicación con especificidad
tisular.
La invención se refiere de manera general a la
terapia génica dirigida utilizando vectores recombinantes y de
manera particular vectores de adenovirus. La invención se refiere de
manera específica a los vectores condicionales de la replicación y
a los procedimientos para utilizarlos. Dichos vectores son capaces
de replicarse de manera selectiva en un tejido diana para
proporcionar un beneficio terapéutico procedente de la presencia del
vector per se o procedente de los productos de genes
heterólogos expresados a partir del vector y distribuidos por todo
el tejido. En dichos vectores, se coloca un gen esencial para la
replicación bajo el control de una secuencia reguladora
transcripcional heteróloga específica del tejido. De esta manera se
condiciona la replicación a la presencia de un(os)
factor(es) que induce(n) la transcripción o a la
ausencia de un(os) factor(es) que inhibe(n) la
transcripción del gen por medio de la secuencia regulatoria
transcripcional. Con este vector, por tanto, se puede tratar de
manera selectiva un tejido diana. La invención se refiere también a
los procedimientos de utilización de los vectores para seleccionar
un tejido respecto de la presencia o ausencia de las funciones
regulatorias transcripcionales que permiten la replicación del
vector por medio de la secuencia regulatoria transcripcional. La
invención se refiere también a las células que producen los vectores
recombinantes condicionales de la replicación útiles para la
terapia génica dirigida.
Una de las principales metas de la utilización
terapéutica de genes exógenos ha sido el direccionamiento de
células con alta especificidad. Las propuestas generales han
incluido la introducción sistémica de ADN, complejos
ADN-proteína, y liposomas. Se ha utilizado también
la administración in situ de retrovirus en células que se
replican de manera activa.
Sin embargo, debido a la ausencia, o ser esta
significativamente baja, de especificidad celular y transferencia
génica ineficiente, la dirección de los genes deseados hacia el
blanco en células específicas en un organismo ha sido un obstáculo
principal para la terapia basada en genes exógenos. De esta manera,
se ha limitado la utilización de dichos genes.
Las células tumorales están entre aquellos tipos
de células a los cuales se podría desear proporcionar de manera
especial un medio para la dirección de genes exógenos. En una forma
de realización de la presente invención, se proporcionan
composiciones y procedimientos para liberar genes exógenos en
células tumorales de manera segura y eficiente.
Los adenovirus son icosaedros regulares sin
envoltura. El recubrimiento de proteína (cápsida) está compuesto
por 252 capsómeros de los cuales 240 son hexones y 12 son pentones.
La mayor parte de los estudios estructurales detallados de los
polipéptidos de adenovirus se han hecho para los tipos de adenovirus
2 y 5. El ADN vírico es de 23,85 x 10^{6} daltons para el
adenovirus 2, y varía ligeramente en tamaño dependiendo del
serotipo. El ADN tiene repeticiones terminales invertidas y la
longitud de estas varía con el serotipo.
El ciclo replicativo se divide en las fases
temprana (E) y tardía (L). La fase tardía define el comienzo de la
replicación del ADN vírico. Las proteínas estructurales del
adenovirus se sintetizan generalmente durante la fase tardía. Tras
la infección por adenovirus, con la mayoría de serotipos, se inhiben
el ADN del huésped y la síntesis de proteína en las células
infectadas. El ciclo lítico del adenovirus con adenovirus 2 y
adenovirus 5 es muy eficiente y da como resultado aproximadamente
10.000 viriones por célula infectada junto con la síntesis de
proteína vírica en exceso y ADN que no se incorpora al virión. La
transcripción temprana del adenovirus es una secuencia complicada
de episodios bioquímicos interrelacionados, pero que implica de
manera esencial la síntesis de ARN vírico antes de la replicación
del ADN vírico.
La organización del genoma del adenovirus es
similar en todos los grupos de adenovirus y las funciones
específicas se sitúan de manera general en localizaciones idénticas
para cada serotipo estudiado. El ARN mensajero citoplasmático
temprano es complementario para cuatro regiones no contiguas
definidas sobre el ADN vírico. Estas regiones se designan
(E1-E4). Los trascriptos tempranos se han
clasificado en una serie de inmediatos tempranos (E1a), tempranos
retardados (E1b, E2a, E2b, E3 y E4), y regiones intermedias
(IVa2.IX).
La región E1a se implica en una transactivación
transcripcional de los genes víricos y celulares así como en la
represión transcripcional de otras secuencias. El gen E1a ejerce una
función de control importante sobre el resto de los ARN mensajeros
de adenovirus tempranos. En tejidos normales, con el fin de
transcribir las regiones E1b, E2a, E2b, E3, o E4, se necesita un
producto E1a. Sin embargo, tal como se describe a continuación, se
puede derivar la función E1a. Se pueden manipular las células para
proporcionar funciones similares a E1a o pueden contener de manera
natural dichas funciones. Se puede manipular también el virus para
derivar las funciones, tal como se describe a continuación.
Se necesita la región E1b para la progresión
normal de los episodios víricos tardíos en la infección. El producto
E1b actúa en el núcleo del huésped. Los mutantes generados dentro
de las secuencias E1b presentan disminución en la acumulación de
ARNm vírico tardío así como deterioro en la inhibición del
transporte celular del huésped, observado de manera normal en la
infección por adenovirus tardío (Berkner, K. L.,
Biotechniques 6:616-629 (1988)). Se necesita
el E1b para alterar las funciones de la célula huésped de tal manera
que se cambian el procesamiento y el transporte a favor de los
productos génicos tardíos víricos. A continuación, estos productos
dan como resultado un empaquetado vírico y la liberación de los
viriones. El E1b produce una proteína de 19 kD que evita la
apóptosis. El E1b produce una proteína de 55 kD que enlaza con
p53.
Para una revisión completa sobre los adenovirus y
su replicación, véase Horwitz, M. S., Virology 2ª ed, Fields,
B. N., eds, Raven Press Limited, Nueva Cork (1990), Capítulo 60,
pp. 1679-1721.
El adenovirus proporciona ventajas como vector
para la liberación génica adecuada por las siguientes razones. Es
un virus sin envoltura con ADN de doble cadena con tropismo por el
sistema respiratorio y el tracto gastrointestinal humano. Produce
una enfermedad leve similar a la gripe. Los vectores adenovíricos
penetran en las células mediante endocitosis mediada por el
receptor. El genoma grande (36 kilobases) permite la eliminación de
genes esenciales para la replicación y regiones no esenciales de
tal manera que se puede insertar y expresar el ADN anterior a
partir del genoma vírico. Los adenovirus infectan una amplia
variedad de tipos de células in vivo e in vitro. Se
han usado los adenovirus como vectores en terapia génica y para la
expresión de genes heterólogos. La expresión de los genes víricos o
extraños a partir del genoma del adenovirus no requiere una célula
replicante. Los vectores del adenovirus se integran con poca
frecuencia en el cromosoma huésped; el genoma del adenovirus
permanece como un elemento extracromosómico en el núcleo celular. No
existe asociación de malignidad en ser humano con la infección por
adenovirus. Se han desarrollado cadenas atenuadas y se han
utilizado en seres humanos como vacunas vivas.
Para una descripción más detallada del uso de los
vectores de adenovirus para la terapia génica, véase Berkner, K.
L., Biotechniques 6:616-629 (1988); Trapnell,
B. C., Advanced Drug Delivery Reviews
12:185-199 (1993).
Los vectores del adenovirus se suprimen
generalmente en la región E1 del virus. A continuación puede
sustituirse la región E1 con las secuencias de ADN de interés. Se
apuntó sin embargo en un artículo reciente sobre terapia génica
humana que "la principal desventaja en el uso del adenovirus como
vector de transferencia génica es que el vector vírico permanece
generalmente como episomal y no se replica, de esta manera,
la división celular conduce a la pérdida eventual del vector a
partir de las células hijas" (Morgan, R. A., y col.,
Annual Review of Biochemistry 62:191-217
(1993)) (énfasis añadido).
La no replicación del vector conduce no solo a la
pérdida eventual del vector sin expresión en la mayor parte o todas
las células diana, sino que conduce también a una expresión
insuficiente en las células que captan el vector, debido a que las
copias del gen cuya expresión se desea son insuficientes para el
efecto máximo. La insuficiencia de la expresión del gen es una
limitación general de todos los vectores de liberación no
replicantes. De esta manera, es deseable introducir un vector que
pueda proporcionar copias múltiples de un gen y por lo tanto
mayores cantidades del producto de este gen. La presente invención
supera las desventajas descritas anteriormente proporcionando un
vector de replicación específico de tejido y de manera especial
específico de tumores, copias múltiples de ADN, y de esta manera,
cantidades aumentadas del producto de gen.
Se han producido vectores adenovíricos para la
expresión del gen recombinante en la línea celular de riñón
embriónico 293 (Graham., F. L. y col., J. Gen. Virol.
35:59-72 (1977)). Esta línea celular,
transformada inicialmente con adenovirus 5 humano, contiene ahora el
extremo izquierdo del genoma del adenovirus 5 y expresa E1. Por
tanto, estas células son permiten el crecimiento de los mutantes del
adenovirus 2 y del adenovirus 5 que carecen de las funciones E1. Se
han utilizado de manera extensiva para el aislamiento y propagación
de los mutantes E1. Por tanto, se han utilizado células 293 para la
clonación y expresión de ayudantes independientes de los vectores
del adenovirus en células de mamífero. Los genes E1 integrados en el
ADN celular de las células 293 se expresan a niveles que permiten
la delección de estos genes a partir del genoma del vector vírico.
La delección proporciona una región no esencial en la que se puede
insertar el ADN. Para una revisión, véase Young, C. S. H., y
col en The Adenoviruses, Ginsberg, H. S., ed., Plenum
Press, Nueva Cork y Londres (1984), pp. 125-172.
Sin embargo, las células 293 están sometidas a
graves limitaciones como células productoras de vectores de
adenovirus. La tasa de crecimiento es baja. Los títulos son
limitados, especialmente cuando el vector produce un producto de
gen heterólogo que resulta tóxico para las células. La recombinación
con la secuencia E1 vírica en el genoma puede conducir a la
contaminación del virus defector recombinante con virus de tipo
salvaje peligrosos. La calidad de algunas preparaciones víricas es
mala con respecto a la relación de las partículas de virus en placa
que forma la unidad. De manera adicional, la línea celular que no
soporta el crecimiento de la mayor parte de mutantes muy suprimidos
debido a la expresión de E1 en combinación con otros genes víricos
en el genoma celular (necesaria para complementar la delección
adicional), tal como E4, es tóxica para las células. Además, la
cantidad de ADN heterólogo que se puede insertar en el genoma vírico
está limitada en estas células. Es deseable, por lo tanto, producir
vectores de adenovirus para la terapia génica en una célula que no
puede producir recombinantes de tipo salvaje y puede producir
valoraciones altas de virus de alta calidad. La presente invención
supera estas limitaciones
En vista de las limitaciones descritas
anteriormente, un objetivo general de la invención es proporcionar
vectores nuevos para la replicación del vector específico del tejido
y la expresión del gen procedente del vector de replicación. De
acuerdo con esto la invención se dirige a un vector de adenovirus
que contiene un gen que es esencial para la replicación, y dicho
gen se enlaza de manera operable con una secuencia reguladora
transcripcional heteróloga, tal que se crea un vector cuya
replicación se condiciona a la presencia de un(os)
factor(es) regulatorios transcripcionales transactuantes que
permiten la transcripción a partir de la secuencia regulatoria
transcripcional, o la ausencia de un(os)
factor(es) regulatorios transcripcionales que evitan de manera normal la transcripción a partir de la secuencia regulatoria transcripcional. De esta manera, estas secuencias regulatorias se activan o desreprimen de manera específica en el tejido diana de tal manera que se produce la replicación del vector en este tejido.
factor(es) regulatorios transcripcionales que evitan de manera normal la transcripción a partir de la secuencia regulatoria transcripcional. De esta manera, estas secuencias regulatorias se activan o desreprimen de manera específica en el tejido diana de tal manera que se produce la replicación del vector en este tejido.
Otro objetivo de la invención es proporcionar
tratamiento específico de un tejido anormal. De esta manera, un
objetivo adicional de la invención es proporcionar un procedimiento
para distribuir de manera selectiva un vector in vivo en un
tejido diana, tal que se trata un número mayor de células del que
podría tratarse con un vector no replicante, y se evita o reduce de
manera significativa el tratamiento en los tejidos no diana. De
acuerdo con esto, se proporciona un procedimiento para distribuir de
manera selectiva un vector en un tejido diana introduciendo el
vector condicional de la replicación de la presente invención en un
tejido diana que contiene un(os) factor(es)
regulador(es) transcripcional(es) que permite la
replicación o es deficiente en el(los) factor(es) que
inhibe(n) la transcripción que evita la replicación del
vector.
Para proporcionar el tratamiento específico del
tejido, otro objetivo de la invención es distribuir de manera
selectiva un polinucleótido en un tejido diana in vivo. De
acuerdo con esto, la invención se dirige a un procedimiento para
distribuir de manera selectiva un polinucleótido en un tejido diana
in vivo introduciendo el vector condicional de la
replicación de la presente invención, que contiene el polinucleótido
en el tejido diana que contiene un factor(es)
regulatorio(s) transcripcional(es) que permite la
replicación del vector o es deficiente en un(os)
factor(s) que inhibe la transcripción que evita la
replicación del vector.
Para proporcionar el tratamiento específico del
tejido, un objetivo adicional de la invención es distribuir de
manera selectiva un producto de gen heterólogo en un tejido diana.
De acuerdo con esto, los vectores condicionales de la replicación
de la presente invención se construyen de tal manera que contienen
una secuencia de ADN heterólogo que codifica un producto de gen que
se expresa en el vector. Cuando el vector se replica en el tejido
diana, se producen también cantidades efectivas del producto de gen
deseado en el tejido diana.
Otro objetivo de la invención es proporcionar un
procedimiento para identificar el tejido anormal que se puede
tratar mediante los vectores de la presente invención. Por tanto, un
objetivo adicional de la invención es identificar un tejido en el
que se puedan replicar los vectores condicionales de la replicación
por medio de la secuencia regulatoria transcripcional contenida en
el vector. De acuerdo con esto, la invención se dirige de manera
adicional a un procedimiento en el que los vectores condicionales de
la replicación de la presente invención se exponen a un tejido
anormal dado. Si este tejido contiene un(os)
factor(es) regulatorio(s) transcripcional(es)
que permita la replicación del vector o es deficiente en
un(os) factor(es) que inhibe(n) la
transcripción que evitan la replicación del vector, se producirá a
continuación la replicación del vector y se puede detectar. Tras la
identificación se dicho tejido, se puede efectuar el tratamiento
dirigido de este tejido mediante la transcripción específica del
tejido y la consiguiente replicación del vector en el tejido in
vivo.
De esta manera, se proporciona un procedimiento
para ensayar la utilidad del vector para el tratamiento del tejido
que comprende las etapas de retirar una biopsia del tejido
procedente de un paciente, explantar la biopsia en el interior del
cultivo celular, introducir un vector condicional de la replicación
en las células de la biopsia y ensayar la replicación del vector en
las células.
Otro objetivo de la invención es proporcionar
líneas celulares productoras para la producción del vector. De
manera preferible, las líneas celulares tienen una o más de las
siguientes características: producción de virus con elevado título,
resistencia a los efectos tóxicos debidos a los productos del
génicos heterólogos expresados en el vector, ausencia de producción
de virus de tipo salvaje que contaminan la preparación del virus y
dan como resultado la recombinación entre las secuencias víricas
integradas y las secuencias del vector, crecimiento con densidad
alta y en suspensión, pasaje potencial ilimitado, velocidad de
crecimiento alta, permitiendo el crecimiento de virus con elevada
delección que se debilitan para las funciones víricas y son capaces
de acomodar grandes piezas de ADN heterólogo.
De acuerdo con esto, en una forma de realización
adicional de la invención, se proporciona una línea celular que
contiene el vector condicional de la replicación de la presente
invención, las células de dicha línea celular contienen
un(os) factor(es) regulador(es) que
permite(n) la replicación del vector o es deficiente en un
factor(es) que inhibe(n) la transcripción que
evita(n) la replicación del vector.
En formas de realización adicionales de la
invención, la línea celular contiene copias del ácido nucleico del
vector replicado.
En formas de realización adicionales, se
proporciona un procedimiento para producir un vector o virión
condicional de la replicación que comprende las etapas de cultivar
la línea celular productora descrita anteriormente y recuperar el
vector o virión a partir de las células. En otras formas de
realización adicionales se proporciona un procedimiento para
producir viriones condicionales de la replicación libres de viriones
de tipo salvaje o vectores víricos libres de vectores de tipo
salvaje, que comprende las etapas de cultivar la línea celular
productora descrita anteriormente y recuperar los viriones o
vectores deficientes de la replicación a partir de las células.
En procedimientos de tratamiento y diagnosis
preferidos, el tejido es anormalmente proliferante, y de manera
especial es tejido tumoral. Sin embargo, los procedimientos se
dirigen también a otros tejidos anormales tal como se describe en
el presente documento.
En una forma de realización más preferida, el
vector es un vector de adenovirus. Sin embargo, se entiende que
potencialmente cualquier fuente de vector es útil si contiene un gen
esencial que puede enlazarse de manera operable con una secuencia
reguladora transcripcional específica del tejido.
En procedimientos adicionales de tratamiento y
diagnosis, se introduce el vector en el tejido mediante la
infección.
En una forma de realización preferida de la
invención, se enlaza un gen de manera operable en la región E1 del
adenovirus con la secuencia reguladora transcripcional específica
del tejido. De manera preferible se enlaza de manera operable el
gen E1a o E1b con la secuencia reguladora transcripcional específica
del tejido.
En otra forma de realización de la invención, el
vector codifica un producto de gen heterólogo. Este producto de gen
heterólogo se expresa a partir del vector replicante en el tejido
diana.
En otra forma de realización adicional de los
procedimientos de tratamiento, el producto de gen heterólogo es
tóxico para el tejido diana.
En otra forma de realización adicional de los
procedimientos, el producto de gen heterólogo actúa sobre un
profármaco no tóxico, convirtiendo el profármaco no tóxico en una
forma que es tóxica para el tejido diana. De manera preferible, la
toxina tiene actividad antitumoral o elimina la proliferación
celular.
En formas de realización preferidas de la
invención, la secuencia reguladora transcripcional es un promotor.
Entre los promotores preferidos se incluyen, pero no se limitan a,
antígeno carcinoembriónico (CEA), DE3,
\alpha-fetoproteína (AFP), Erb-B2,
tensioactivo, y de manera especial tensioactivo de pulmón, y el
promotor de la tirosinasa. Sin embargo, se puede usar cualquier
región con control genético que controla la transcripción del gen
esencial para activar (o desreprimir) el gen. De esta manera, se
pueden usar otros elementos de control genético, tales como
mejoradores, secuencias represibles, y silenciadores, para regular
la replicación del vector en la célula diana. El único
requerimiento es que el elemento genético se active, desreprima,
mejore, o se regule genéticamente de otra manera mediante factores
en la célula huésped, con respecto a los procedimientos de
tratamiento, no en la célula no diana.
Los mejoradores preferidos incluyen el mejorador
específico del cáncer de mama DF3 y los mejoradores procedentes de
virus y la familia del receptor esteroide. Otras secuencias
reguladoras transcripcionales preferidas incluyen NF1, SP1, AP1, y
FOS / JUN.
En formas de realización adicionales, los
promotores no se activan necesariamente mediante factores en el
tejido diana, pero se desreprimen mediante factores presentes en el
tejido diana. De esta manera, en el tejido diana se estimula la
represión.
Entre los factores reguladores transcripcionales
se incluyen, pero no se limitan a, factores transactivantes
producidos por secuencias víricas endógenas tales como a partir de
citomegalovirus (CMV), HIV, virus de Epstein-barr
(EBV), virus de Herpes simplex (HSV), SV40, y otros de dichos
virus que son patogénicos en mamíferos y, de manera particular, en
seres humanos.
Son conocidos los procedimientos para fabricar
dichos vectores por aquellas personas normalmente expertas en la
técnica. La técnica adecuada enseña la construcción de vectores
recombinantes con delecciones o modificaciones en las secuencias de
codificación específicas y enlaces operables con una secuencia
control de transcripción heteróloga tal que la expresión de una
región de codificación deseada está bajo el control de una secuencia
reguladora transcripcional heteróloga. Se han mapeado de manera
adecuada muchas secuencias víricas de tal manera que es rutina
identificar un gen escogido y usar técnicas bien conocidas
apropiadas (tales como la recombinación homóloga del virus con
plásmidos suprimidos o modificados de otra manera) para construir
los vectores para la replicación y expresión específica del
tejido.
\newpage
Figura 1. Clonación de pAVE1a02i: se digirió
pAVSAFP.TK1 con NheI/MunI. Se aisló un fragmento A de 10667 bp. Se
digirió pSE280-E1 con SpE/MunI. Se aisló un
fragmento A de 3397 bp. Se ligaron los fragmentos aislados para
formar pAVE1a02i.
Figura 2A-C. Identificación
mediante PCR del adenovirus recombinante con E1a expresado a partir
del promotor AFP específico del hepatoma. La Figura 2A muestra que
se producen las placas víricas mediante genomas víricos que
contienen el promotor AFP enlazado de manera operativa con E1a. La
Figura 2B muestra que no hubo contaminación con virus de tipo
salvaje. La Figura 2C muestra que no hubo contaminación con ADN de
AV1lacZ.
Figura 3A-F. Adenovirus
específico del tejido con E1a expresado a partir del promotor AFP.
El experimento muestra los efectos citopáticos y la generalización
de muerte celular que sigue a la infección con el virus AVAFPE1a.
Las Figuras 3A-3C muestran controles sin infectar en
células A549.30, A549, y HuH, respectivamente. Las Figuras
3D-3F muestran los resultados con el virus en
células A549.30, A549, y HuH7, respectivamente.
Se pretende que el término "proliferación
anormal" signifique una célula que tiene un índice mitótico mayor
que su contraparte que funciona normalmente, de tal manera que
existe una acumulación anormal de dichas células.
Se pretende que el término "actividad
antitumoral" signifique cualquier actividad que inhibe, evita, o
destruye el crecimiento de un tumor.
Se pretende que el término "distribución"
signifique la propagación de un vector y su gen heterólogo
acompañante (producto) (cuando se presenta sobre el vector) por
todo el tejido diana, y de manera especial por todo el tejido que
prolifera anormalmente (no maligno o maligno). El objetivo de la
distribución es liberar el vector, producto de gen o los efectos
del producto de gen (tal como mediante un efecto testigo, por
ejemplo) en sustancialmente todas o un número significativo de
células del tejido diana, con el fin de tratar sustancialmente el
tejido diana completo.
El término "mejorador" se usa de acuerdo con
su significado reconocido por la técnica. Se pretende que signifique
una secuencia que se encuentra en eucariotas y algunos virus
eucariotas que pueden aumentar la transcripción a partir de un gen
cuando se localiza (en cualquier orientación) hasta en diversas
kilobases del gen que está siendo estudiado. Estas secuencias
actúan usualmente como mejoradores cuando se encuentran en la
posición 5' (corriente arriba) del gen en cuestión. Sin embargo,
algunos mejoradores están activos cuando se colocan en la posición
3' (corriente abajo) del gen. En algunos casos, los elementos
mejoradores pueden activar la transcripción de un gen sin promotor
(conocido).
Se pretende que el término "inactivación
funcional" signifique una lesión genética que evita la actividad
normal del producto de gen. De esta manera, la inactivación
funcional podría dar como resultado una mutación en el gen que
codifica el producto de gen. Dicha lesión incluye inserciones,
delecciones, y cambios de bases. De manera alternativa, se puede
producir la inactivación funcional mediante la interacción anormal
del producto de gen normal con uno o más productos génicos
celulares diferentes que enlazan o evitan de otra manera la
actividad funcional de dicho producto de gen. De esta manera, el
producto de gen puede ser una proteína producida a partir de un gen
normal pero que no puede llevar a cabo su función ordinaria y normal
debido a una interacción con un segundo factor.
El término "gen esencial para la
replicación" se refiere a la secuencia genética cuya
transcripción se requiere por el vector para replicar en la célula
diana.
Se pretende que el término "producto de gen"
signifique ADN, ARN, proteína, péptidos o partículas víricas. De
esta forma, la distribución, a efectos de la invención, es
cualquiera de estos componentes.
El término "heterólogo" significa una
secuencia de ADN no encontrada en el genoma del vector nativo. Con
respecto a la "secuencia reguladora transcripcional
heteróloga", "heterólogo" indica que la secuencia reguladora
transcripcional no está ligada de manera natural con la secuencia
de ADN para el gen esencial para la replicación del vector.
El término "promotor" se usa de acuerdo con
su significado reconocido por la técnica. Se pretende que signifique
la región de ADN, usualmente corriente arriba que codifica la
secuencia de un gen u operón, que enlaza la ARN polimerasa y dirige
el enzima en el emplazamiento de comienzo transcripcional
correcto.
El término "replicación" significa la
duplicación de un vector. Esta duplicación, en el caso de los virus,
se puede producir al nivel del ácido nucleico, o al nivel de la
partícula vírica infecciosa. En los casos de los virus con ADN, la
replicación al nivel del ácido nucleico es la replicación del ADN.
En el caso de los virus con ARN, la replicación del ácido nucleico
es la replicación en la cadena más o menos (o ambas). En el caso de
los retrovirus, la replicación al nivel del ácido nucleico incluye
la producción de ADNc así como la producción adicional de genomas
víricos de ARN. La característica esencial son las copias de ácido
nucleico del vector vírico original. Sin embargo, la replicación
incluye también la formación de ADN infeccioso o partículas víricas
de ARN. Dichas partículas pueden infectar de manera sucesiva células
en un tejido diana dado distribuyendo de esta manera el vector a
través de todo o una porción significativa del tejido diana.
El término "vector condicional de la
replicación" se refiere a un vector que cuando se introduce en un
tejido no se replicará a no ser que se active o desreprima una
secuencia reguladora transcripcional en este tejido. Esto es, la
replicación depende de la transcripción por medio de la secuencia
reguladora transcripcional. Dicho vector es condicional de la
replicación tal como se ha descrito debido a que se ha modificado de
la siguiente manera. Se ha modificado un gen que es esencial para
la replicación reemplazando la secuencia reguladora transcripcional
sobre la cual depende normalmente la transcripción de este gen con
una secuencia reguladora transcripcional heteróloga. Esta secuencia
reguladora transcripcional depende de la presencia de los factores
reguladores transcripcionales o de la ausencia de los inhibidores
reguladores transcripcionales. La presencia de estos factores en un
tejido dado, o la ausencia de dichos inhibidores en un tejido dado
proporciona la condicionalidad de la replicación. De acuerdo con
esto, la secuencia reguladora transcripcional nativa puede
reemplazarse con la secuencia reguladora transcripcional heteróloga.
De manera alternativa, puede inhabilitarse o volverse disfuncional
la secuencia reguladora transcripcional nativa mediante eliminación
parcial (delección) u otra mutación (uno o más cambios de bases,
inserciones, inversiones, etc).
La secuencia génica puede ser una secuencia de
codificación. Puede contener uno o más marcos de lectura abiertos,
así como secuencias intrón. Sin embargo dicha secuencia no se limita
a una secuencia de codificación, sino que incluye secuencias que
son transcritas en ARN, dicho ARN es esencial en sí mismo para la
replicación del vector. La característica esencial es que la
transcripción de las secuencias génicas no depende de las secuencias
reguladoras transcripcionales nativas.
El término "silenciador" usado en el sentido
reconocido por la técnica, significa una secuencia encontrada en
virus eucariotas y eucariotas que puede disminuir o silenciar la
transcripción de un gen cuando se localiza en el interior de
diversas kilobases de este gen.
Se pretende que el término "específico del
tejido" signifique que la secuencia reguladora transcripcional
para la cual el gen esencial para la replicación se enlaza de manera
operable funcione de manera específica en este tejido de tal manera
que la replicación tenga lugar en este tejido. Esto se puede
producir mediante la presencia en este tejido, y no en tejidos no
diana, de factores de transcripción positivos que activan la
secuencia reguladora transcripcional. Esto se puede producir también
por la ausencia de transcripción que inhiba los factores que se
producen normalmente en tejidos no diana y eviten la transcripción
como resultado de la secuencia reguladora transcripcional. De esta
manera, cuando se produce la transcripción, esta procede en el gen
esencial para la replicación de tal manera que en el tejido diana,
se produce la replicación del vector y sus funciones
acompañantes.
Tal como describe el presente documento, la
especificidad del tejido es particularmente relevante en el
tratamiento de la contraparte anormal de un tejido normal. Dichas
contrapartes incluyen, pero no se limitan a, tejido de hígado y
cáncer de hígado, tejido de pecho y cáncer de mama, melanoma y
tejido de piel normal. La especificidad del tejido incluye también
la presencia de un tipo de tejido anormal entremezclado con tejido
normal de un tipo de tejido diferente, como por ejemplo en el caso
de la metástasis del cáncer de cólon, cáncer de mama, y similares,
en un tejido tal como hígado. En este caso, el tejido diana es el
tejido anormal, y la especificidad del tejido refleja la
restricción de la replicación del vector en el tejido anormal
entremezclado en el tejido normal. Se entiende también que la
especificidad del tejido, en el contexto del tratamiento, es
particularmente relevante in vivo. Sin embargo, tal como se
ha descrito en el presente documento, el tratamiento ex vivo
y la sustitución del tejido caen también dentro del concepto de
especificidad del tejido de acuerdo con la presente invención.
Se pretende que el término "función reguladora
transcripcional" o "factor regulador transcripcional"
signifique cualquier función celular cuya presencia activa la
secuencia reguladora transcripcional heteróloga descrita en el
presente documento o cuya ausencia permita la transcripción como
resultado de las secuencias reguladoras transcripcionales descritas
en el presente documento. Se entiende que en un tejido diana dado,
un tejido que "carece de factor regulador transcripcional" o
es "deficiente" en el factor regulador transcripcional se
referiría a cualquier ausencia del factor o la inactivación
funcional del factor en el tejido diana.
El término "secuencia reguladora
trasnscripcional" se usa de acuerdo con su significado reconocido
en la técnica. Se pretende que signifique cualquier secuencia de
ADN que puede, en virtud de su secuencia, producir el gen enlazado
ya sea sobre o infra regulado en una célula particular. En
una forma de realización de la presente invención, la secuencia
reguladora transcripcional nativa se suprime de manera completa del
vector y se sustituye con una secuencia reguladora transcripcional
heteróloga. La secuencia reguladora transcripcional puede ser
adyacente a la región de codificación del gen que es esencial para
la replicación, o puede eliminarse de este. De acuerdo con ello, en
el caso de un promotor, el promotor estará generalmente adyacente a
la región de codificación. En el caso de un mejorador, sin embargo,
se puede encontrar un mejorador a alguna distancia de la región de
codificación tal que exista una secuencia de ADN intermedia entre el
mejorador y la secuencia de codificación. En algunos casos, la
secuencia reguladora transcripcional nativa permanece en el vector
pero no es funcional con respecto a la transcripción del gen
esencial para la
replicación.
replicación.
Se pueden incluir en un vector diversas
combinaciones de secuencias reguladoras transcripcionales. Una o más
pueden ser heterólogas. De manera adicional, una o más pueden tener
especificidad del tejido. Por ejemplo, se podría usar una secuencia
reguladora transcripcional única para impulsar la replicación
mediante más de un gen esencial para la replicación. Este es el
caso, por ejemplo, cuando el producto de gen de uno de los genes
impulsa la transcripción del(os)
gene(es) adicional(es). Un ejemplo es un promotor heterólogo enlazado con un cassette que contiene una secuencia que codifica E1a (promotor E1a suprimido) y el gen E1b completo. En dicha cascada, únicamente una secuencia reguladora transcripcional heteróloga puede ser necesaria. Cuando los genes se controlan de manera individual (separadamente), sin embargo, se puede usar más de una secuencia reguladora transcripcional si se desea más de un gen dicho para controlar la replicación.
gene(es) adicional(es). Un ejemplo es un promotor heterólogo enlazado con un cassette que contiene una secuencia que codifica E1a (promotor E1a suprimido) y el gen E1b completo. En dicha cascada, únicamente una secuencia reguladora transcripcional heteróloga puede ser necesaria. Cuando los genes se controlan de manera individual (separadamente), sin embargo, se puede usar más de una secuencia reguladora transcripcional si se desea más de un gen dicho para controlar la replicación.
Por tanto, los vectores de la presente invención
incluyen también combinaciones de secuencias reguladoras
transcripcionales en las que existe más de una secuencia reguladora
transcripcional heteróloga, pero en la que una o más de estas no
son específicas del tejido. Por ejemplo, una secuencia reguladora
transcripcional puede ser un nivel basal constitutivo de la
secuencia reguladora transcripcional. Por ejemplo, un mejorador
específico del tejido puede combinarse con un nivel basal
constitutivo del promotor.
Los vectores preferidos de la presente invención
son vectores adenovíricos. En una forma de realización preferida de
la invención, un vector de adenovirus contiene una secuencia
reguladora transcripcional específica del tejido enlazada con un
gen en la región E1.
En una forma de realización alternativa, solo E1a
está enlazado; E1b permanece intacto.
La invención abarca de manera adicional el uso de
plásmidos y vectores que tienen únicamente las regiones esenciales
de adenovirus necesarias para la replicación con cualquier E1a, gen
E1b 19kDa, o gen E1b 55kDa, o alguna combinación de los mismos,
modificados. Dicho plásmido, que carece de cualquier gen
estructural, sería capaz de experimentar la replicación del ADN. De
acuerdo con esto, los vectores de la invención pueden estar
constituidos esencialmente por la secuencia reguladora
transcripcional y uno o más genes esenciales para la replicación
del vector. En el caso de vectores víricos, los vectores pueden
estar constituidos por la secuencia reguladora transcripcional y el
gen o genes esenciales para la replicación o funciones del ciclo
vital de los virus. Se entiende también que estos vectores pueden
estar constituidos esencialmente de manera adicional por una
secuencia de ADN que codifica uno o más productos génicos
heterólogos tóxicos cuando se pretende que dichos vectores sean
vectores de expresión para el tratamiento.
Los virus alternativos se seleccionan de manera
preferible entre cualquier grupo de virus en que los genes
esenciales para la replicación del virus se puede colocar bajo el
control de una secuencia reguladora transcripcional específica del
tejido. Se incluyen todos los serotipos de adenovirus. La única
propiedad común de dichos virus, por tanto, es que son
transducibles en el tejido diana, son genéticamente manipulables, y
no son tóxicos cuando no se replican.
Los vectores descritos en el presente documento
se pueden construir usando técnicas biológicas moleculares
estándar. Las técnicas estándar para la construcción de dichos
vectores son bien conocidas por aquellos normalmente expertos en la
técnica, y se pueden encontrar en referencias tales como Sambrook
y col., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), o cualquiera de la miriada de
manuales de laboratorio sobre tecnología de ADN recombinante que
están ampliamente disponibles. Están disponibles una variedad de
estrategias para el ligamiento de los fragmentos de ADN, la
selección de la cual depende de la naturaleza del término de los
fragmentos de ADN y se puede determinar fácilmente por el técnico
experto.
Un vector de adenovirus, en una forma de
realización preferida, se construye en primer lugar construyendo,
de acuerdo con técnicas estándar, un plásmido lanzadera que
contiene, comenzando en el extremo 5', los "elementos críticos
del extremo izquierdo" que incluyen, un ITR 5' adenovírico, una
señal de encapsidación adenovírica, y una secuencia mejoradora E1a;
un promotor (que puede ser un promotor adenovírico o un promotor
anterior); una secuencia líder tripartita, un emplazamiento de
clonación múltiple (que puede ser tal como se describe en el
presente documento); una señal poli A; y un segmento de ADN que
corresponde con un segmento del genoma adenovírico. Dicho segmento
de ADN sirve como sustrato para la recombinación homóloga con un
adenovirus modificado o mutado. El plásmido puede incluir también
un marcador seleccionable y un origen de replicación. El origen de
la replicación puede ser un origen bacteriano de la replicación. Los
ejemplos representativos de dichos plásmidos lanzadera incluyen
pAVS6, tal como se ha descrito en el presente documento y véase
Trapnell, B. y col., Adv. Drug Deliv. Rev
12:185-189 (1994). Una secuencia de ADN deseada
contiene un gen heterólogo que puede insertarse a continuación en
un emplazamiento de clonación múltiple para producir un vector
plásmido.
A continuación, este constructo se usa para
producir un vector adenovírico. A continuación se efectúa la
recombinación homóloga con un adenovirus modificado o mutado en el
que se han suprimido una o más de las secuencias reguladoras
transcripcionales nativas y reemplazado con la secuencia reguladora
transcripcional deseada. Dicha recombinación homóloga se puede
efectuar a través de una cotransfección del vector plásmido y el
adenovirus modificado en una línea celular ayudante mediante
precipitación con CaPO_{4}.
A través de dicha recombinación homóloga, se
forma un vector que incluye ADN adenovírico libre de una o más
secuencias reguladoras transcripcionales nativas. Este vector puede
a continuación transfectarse en una línea celular ayudante para la
replicación vírica y generar partículas víricas infecciosas. Las
transfecciones pueden tener lugar mediante electroporación,
precipitación con fosfato de calcio, microinyección o a través de
proteoliposomas.
El vector puede incluir un emplazamiento de
clonación múltiple para facilitar la inserción de la
secuencia(s) de ADN que contienen el gen heterólogo en el
vector de clonación. De manera general, el emplazamiento de
clonación múltiple incluye emplazamientos para enzimas de
restricción "raros", es decir, emplazamientos que se encuentran
en genes eucariotas a una frecuencia de entre aproximadamente uno
en cada 10.000 a aproximadamente uno en cada 100.000 pares de
bases. Un vector apropiado es el formado de esta manera cortando el
vector de clonación mediante técnicas estándar en emplazamientos de
restricción apropiados en el emplazamiento de clonación múltiple, y
a continuación ligar la secuencia de ADN que contiene el gen
heterólogo en el vector de clonación.
La secuencia de ADN que codifica el producto de
gen heterólogo está bajo el control de un promotor adecuado. Los
promotores adecuados que se pueden emplear incluyen, pero no se
limitan a, promotores adenovíricos, tales como el promotor tardío
mayor adenovírico; o los promotores heterólogos, tales como el
promotor del citomegalovirus; el promotor del virus del sarcoma de
Rous; los promotores inducibles, tales como el promotor del virus
del tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor de la
metalotioneína; los promotores del shock térmico; el promotor de la
albúmina; el promotor ApoE; y el promotor Apoya. Se entiende, sin
embargo que, el alcance de la presente invención no se limita a los
genes o promotores anteriores específicos.
En una forma de realización, se puede construir
el adenovirus usando un cromosoma artificial de levadura que
contiene un genoma adenovírico de acuerdo con el procedimiento
descrito en Ketner y col., Proc. Nat. Acad. Sci.
91:6186-6190 (1994), en conjunción con las
enseñanzas contenidas en el presente documento. En esta forma de
realización, el cromosoma artificial del adenovirus de levadura se
produce mediante la recombinación homóloga in vivo entre el
ADN adenovírico y los vectores del plasmado del cromosoma artificial
de levadura que transportan los segmentos de los términos genómicos
izquierdo y derecho adenovíricos. Se puede clonar a continuación una
secuencia de ADN que contiene el gen heterólogo en el ADN
adenovírico. A continuación se escinde el genoma adenovírico
modificado a partir del cromosoma artificial del adenovirus de
levadura con el fin de usarse para generar partículas adenovíricas
infecciosas.
Las partículas víricas infecciosas puede a
continuación administrarse in vivo a un huésped. El huésped
puede ser un animal huésped, que incluye un mamífero, un primate no
humano y huéspedes humanos.
Se pueden administrar las partículas víricas en
combinación con vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable para
la administración a un paciente. El vehículo puede ser un vehículo
líquido (por ejemplo, una solución salina), o un vehículo sólido,
tal como, por ejemplo, perlas de microvehículo.
En formas de realización preferidas, los
procedimientos se dirigen de manera específica a la introducción en
un tejido diana de un vector adenovírico condicional de la
replicación. Este vector se replica de manera selectiva en las
células del tejido diana. Esta replicación se condiciona tras la
función de una secuencia reguladora transcripcional con la cual se
enlaza de manera operable un gen vírico, cuyo gen es necesario para
la replicación del vector. De esta manera, se puede producir la
replicación en el tejido diana debido a una función celular en el
tejido diana que permite la transcripción. La presencia o ausencia
de dichas funciones proporciona la selectividad que permite el
tratamiento de un tejido específico con efecto mínimo sobre el
tejido(s) que lo rodea(n).
La presente invención proporciona de esta manera
procedimientos para distribuir de manera selectiva un polinucleótido
en un tejido dado in vivo, reduciendo o evitando de manera
significativa la distribución en un tejido no diana. Se proporciona
el polinucleótido en el vector condicional de la replicación que se
distribuye de manera selectiva en el tejido dado.
La presente invención proporciona también
procedimientos para expresar de manera selectiva un producto de gen
en un tejido dado, evitando o reduciendo de manera significativa la
expresión en un tejido no diana o no tumoral. La invención
proporciona procedimientos para la distribución de lo anteriormente
mencionado en un número mayor de células diana que podrían ponerse
en contacto usando un vector no replicante. La infección sucesiva
proporciona un "efecto dominó" de tal manera que se ponen en
contactos todas o sustancialmente todas las células en el tejido
diana. La s células de manera adicional a lo ya expuesto para el
polinucleótido, vector o producto de gen, se ponen en contacto de
manera potencial mediante los procedimientos.
Dicho tratamiento es particularmente necesario en
los casos en que no es factible la intervención quirúrgica. Por
ejemplo, en pacientes con tejido anormal asociado de manera íntima
con tejido neural, la cirugía puede ser imposible o muy peligrosa.
De manera ocasional, en el caso de metástasis múltiple o metástasis
microscópica, no es factible la cirugía.
En el tejido diana, sólo se puede producir la
replicación del ADN. También se puede producir funciones víricas
tardías que dan como resultado el empaquetamiento del vector de ADN
en viriones.
El vector se puede introducir en el tejido diana
como ADN desnudo o por medio de la encapsidación (como una
partícula de virus infeccioso o como virión). En el último caso, la
distribución se lleva a cabo mediante infecciones sucesivas de
células en el tejido mediante el virus de tal manera que se infectan
sustancialmente todas o un número significativo de células
hijas.
La especificidad del tejido es particularmente
relevante con respecto al direccionamiento en una contraparte
anormal de un tipo de tejido particular evitando a la vez la
contraparte normal del tejido, o evitando el tejido que lo rodea,
de un tipo diferente que el tejido anormal, tratando a la vez el
tejido anormal. Por ejemplo, los vectores de la presente invención
son útiles para tratar metástasis en el hígado. Un ejemplo
específico es el cáncer de cólon, que metastatiza a menudo en el
hígado, el promotor CEA es activo en las células de la metástasis
pero no en las células normales de hígado. De acuerdo con esto, el
hígado de un adulto humano normal no soportaría la replicación de
un virus que tiene genes víricos esenciales para enlazar la
replicación con el promotor específico CEA del cáncer de cólon. Se
debería producir la replicación en las células de cáncer primarias.
Otro ejemplo es el cáncer de mama, que también metastatiza en el
hígado. En este caso, el mejorador de la mucina DF3 se enlaza con
un gen esencial para la replicación tal como E1a. Se debería
producir la replicación en el cáncer de mama pero no en el hígado
normal. Un ejemplo adicional es el promotor de la
\alpha-fetoproteína que es activo en el carcinoma
hepatocelular. El promotor se enlaza con un gen esencial para la
replicación. Se ha encontrado que el promotor es activo únicamente
en el carcinoma hepatocelular. Un ejemplo adicional es el promotor
de la tirosinasa. Este promotor se enlaza con un gen esencial para
la replicación. Se debería producir la replicación en el melanoma y
no en la piel normal. En cada caso, se espera la replicación en las
células anormales pero no en las normales.
En una forma de realización adicional de la
invención, el vector codifica un producto de gen heterólogo que se
expresa a partir del vector en las células del tejido. El producto
de gen heterólogo puede ser tóxico para las células en el tejido
dirigido o confiere otra propiedad deseada.
Se puede distribuir un producto de gen producido
por el vector por todo el tejido, debido a que el vector por sí
mismo se distribuye por todo el tejido. De manera alternativa,
aunque la expresión del producto de gen puede ser localizada, su
efecto puede ser más a largo plazo debido al efecto testigo o la
producción de moléculas que tienen efectos de amplio espectro tales
como las quimioquinas. El producto de gen puede ser ARN, tal como
un ARN antisentido o una ribozima, o la proteína. Los ejemplos de
productos tóxicos incluyen, pero no se limitan a, timidina quinasa
en conjunción con ganciclovir.
Es posible un amplio intervalo de efectos
tóxicos. Los efectos tóxicos pueden ser directos o indirectos.
Pueden resultar efectos indirectos a partir de la conversión de un
profármaco en un fármaco tóxico directamente. Por ejemplo, la
timidina quinasa del virus Herpes simplex fosforila el
ganciclovir para producir la toxina del nucleótido ganciclovir
fosfato. Este compuesto funciona como un terminador de cadena y un
inhibidor de la ADN polimerasa, evita la síntesis del ADN, y de
esta manera, es citotóxico. Otro ejemplo es el uso de la citosina
desaminasa para convertir 5'-fluorocitosina en el
profármaco anticanceroso 5' fluoracilo. Para una descripción de
dichos genes "suicidas", véase Blaese, R. M. y col.,
Eur. J. Cancer 30A: 1190-1193 (1994).
Las toxinas directas incluyen, pero no se limitan
a, toxina de la difteria (Brietman y col., Mol. Cell Biol.
10: 474-479 (1990)), toxina de pseudomonas, ARN
antisentido de citoquinas (Blankenstein, T., y col., J. Exp. Med
173: 1047-1052 (1991), Colombo, M. P., y
col., J. Exp. Med. 173: 889-897 (1991),
Leone, A., y col., Cell 65: 25-35
(1991)), y ribozimas (Zaia, J. A. y col., Ann N. Y. Acad.
Sci. 660: 95-106 (1992)), genes de vacunación
del tumor, y ADN que codifica ribozimas.
De acuerdo con la presente invención, el agente
que es capaz de conseguir la inhibición, prevención o destrucción
del crecimiento del tejido diana de las células tumorales tras la
expresión de dicho agente puede ser un marcador selectivo negativo;
es decir, un material que en combinación con un agente
quimioterapéutico o de interacción inhibe, evita o destruye el
crecimiento de las células diana.
De esta manera, tras la introducción en las
células del marcador selectivo negativo, se administra un agente de
interacción en el huésped. El agente de interacción interactúa con
el marcador selectivo negativo para evitar, inhibir o destruir el
crecimiento de las células diana.
Los marcadores selectivos negativos que se pueden
usar incluyen, pero no se limitan a, timidina quinasa y citosina
desaminasa. En una forma de realización, el marcador selectivo
negativo es una timidina quinasa vírica seleccionada entre el grupo
constituido por timidina quinasa del virus del Herpes
simplex, timidina quinasa del citomegalovirus y timidina
quinasa del virus de varicela-zoster. Cuando se
emplean timidinas quinasas víricas, la interacción o el agente
quimioterapéutico de manera preferible es un análogo de nucleósido,
por ejemplo, uno seleccionado entre el grupo constituido por
ganciclovir, acilovir, y
1-2-desoxi-2-fluoro-\beta-D-arabinofuranosil-5-yodouracilo
(FIAU). Dichos agentes de interacción se utilizan de manera
eficiente con las timidina quinasas víricas como sustratos, y dichos
agentes de interacción se incorporan de esta manera letalmente en el
ADN de las células tumorales que expresan las timidina quinasas
víricas, dando como resultado por tanto, la muerte de las células
diana.
Cuando la citosina desaminasa es el marcador
selectivo negativo, un agente de interacción preferido es
5-fluorocitosina. La citosina desaminasa convierte
la 5-fluorocitosina en
5-fluorouracilo, que es altamente tóxico. De esta
manera, las células diana que expresan el gen de la citosina
desaminasa convierten la 5-fluorocitosina en
5-fluorouracilo y son muertas.
El agente de interacción se administra en una
cantidad efectiva para inhibir, evitar, o destruir el crecimiento
de las células diana. Por ejemplo, el agente de interacción se
administra en una cantidad en función del peso corporal y sobre la
toxicidad global en un paciente. El agente de interacción se
administra de manera preferible sistémicamente, tal como, por
ejemplo, mediante administración intravenosa, mediante
administración parenteral, mediante administración intraperitoneal,
o mediante administración intramuscular.
Cuando los vectores de la presente invención
inducen un marcador selectivo negativo y se administran en un
tejido o tumor in vivo, puede darse como resultado un
"efecto testigo", es decir, células que no se traducen de
manera original con la secuencia de ácido nucleico que codifica el
marcador selectivo negativo pueden ser muertas tras la
administración del agente de interacción. Aunque no se pretende que
el alcance de la presente invención se limite a ningún razonamiento
teórico, se pueden producir en forma difusible las células
transducidas del marcador selectivo negativo que, o bien actúan
extracelularmente tras el agente de interacción, o son capturadas
por las células no diana adyacentes, que a continuación llegan a ser
susceptibles a la acción del agente de interacción. Es posible
también que uno o ambos del marcador selectivo negativo y el agente
de interacción se comuniquen entre las células diana.
En una forma de realización, el agente que
comunica la inhibición, prevención, o destrucción del crecimiento
de las células tumorales es una citoquina. En una forma de
realización, la citoquina es una interleuquina. Otras citoquinas
que se pueden emplear incluyen interferones y factores estimuladores
de la colonia, tales como GM-CSF. Las
interleuquinas incluyen, pero no se limitan a, interleuquina -1,
interleuquina-1\beta, e
interleuquinas-2-15. En una forma de
realización, la interleuquina es interleuquina -2.
En una forma de realización preferida de la
invención, el tejido diana prolifera de manera anormal, y de forma
preferible es un tumor. El vector o virus se distribuye por todo el
tejido o masa de tumor.
Todos los tumores son potencialmente susceptibles
al tratamiento con los procedimientos de la invención. Los tipos de
tumor incluyen, pero no se limitan a, hematopoiético, pancreático,
neurológico, hepático, del tracto gastrointestinal, endocrino, del
tracto biliar, sino-pulmonar, de cabeza y garganta,
sarcoma y carcinoma del tejido blando, dermatológico, del tracto
reproductivo, y similares. Los tumores preferidos para el
tratamiento son aquellos con un índice mitótico alto en relación
con el tejido normal. Los tumores preferidos son tumores sólidos, y
de manera especial, tumores del cerebro, de manera preferible el
glioma.
Se pueden usar también los procedimientos con
otras células diana anormales, por ejemplo, cualesquiera células
que sean dañinas o no deseadas de otra manera in vivo.
Ejemplos amplios incluyen células que producen la enfermedad
autoinmune, restenosis, y la formación del tejido de cicatriz.
De manera adicional, el tratamiento puede ser
ex vivo. La transducción ex vivo de las células
tumorales superaría muchos de los problemas de los sistemas de
liberación vírica actuales. Se cosecha el tejido bajo condiciones
estériles, se disocia mecánicamente y/o enzimáticamente y se cultiva
bajo condiciones estériles en un medio apropiado. Las preparaciones
del vector que demuestran estar libres de endotoxinas y
contaminación bacteriana se usan para transducir células bajo
condiciones estériles in vitro usando protocolos estándar.
La accesibilidad del virus a las células en el cultivo es
actualmente superior a la inyección in vivo y permite la
introducción de las secuencias víricas del vector en esencialmente
todas las células. Siguiendo a la eliminación del medio que
contiene el virus, las células vuelven inmediatamente al paciente o
se mantienen durante algunos días en cultivo ensayando a la vez
para que se lleve a cabo la función o la esterilidad.
Por ejemplo, se han tratados de manera
satisfactoria pacientes con hipercolesterolemia eliminando porciones
del hígado, explantando los hepatocitos en el cultivo,
modificándolos genéticamente mediante exposición al retrovirus, y
reinfusionando las células corregidas en el hígado (Grossman y col.,
1994).
La transducción vírica tiene también aplicaciones
potenciales en el área de la medicina experimental. Se ha propuesto
la expresión no estacionaria de los modificadores biológicos de la
función del sistema inmune tales como IL-2,
IFN-\gamma, GM-CSF o la proteína
coestimuladora B7 como un medio potencial de inducir respuestas
antitumorales en pacientes con cáncer.
Es importante conocer si los vectores de la
invención se replicarán en un tejido específico de un paciente. Si
se encuentra que la replicación del vector es beneficiosa para la
terapia se proporciona a continuación una selección para aquellos
pacientes que mejor responden a la terapia descrita en el presente
documento. Si se encuentra que es perjudicial, a continuación
existe una selección para la prevención del tratamiento de los
pacientes que tendrían una respuesta adversa al tratamiento.
Actualmente, los únicos ensayos no biológicos que se utiliza
comúnmente son la selección de la expresión, el PCR, y el
secuenciamiento. Estos dan a menudo resultados como falsos
negativos, consumen tiempo, son caros, y en el mejor de los casos
dan como resultado solo información aproximada del estado de los
genes y no de su función biológica.
De acuerdo con esto se proporciona un
procedimiento para identificar un tejido anormal, las células del
cual contienen un factor de transcripción que permite la
replicación de un vector condicional de la replicación, o son
deficientes para un factor inhibitorio para la transcripción.
En este procedimiento se explanta una biopsia del
tejido, se introduce un vector condicional de la replicación en las
células de la biopsia, y se cuantifica la replicación del ADN del
vector en las células. De acuerdo con esto se proporciona un
procedimiento para seleccionar el tejido para la presencia de
factores que permitan la replicación del vector, o para una
deficiencia de un factor que inhibe la transcripción. Dicha
selección es útil, entre otras cosas, para identificar el tejido,
antes del tratamiento, que será susceptible al tratamiento con un
vector particular que se va a replicar en el tejido.
Por tanto, se proporciona un procedimiento para
evaluar la utilidad del vector para el tratamiento retirando una
biopsia de tejido del paciente, explantando la biopsia en el cultivo
del tejido, introduciendo el vector condicional de la replicación
en la biopsia, y ensayando la replicación del vector en las células
de la biopsia.
El ensayo o selección de los tejidos incluye un
ensayo para la replicación del vector de ácido nucleico o para la
replicación del virus, cuando el vector es capaz de formar viriones
infecciosos.
De esta manera, la invención proporciona u
procedimiento para seleccionar un tumor para las funciones
reguladoras de la transcripción que permiten la replicación del
vector o para la ausencia de estas funciones que evitarían
normalmente la replicación de un vector del virus.
Sin embargo, se puede seleccionar cualquier
tejido anormal para las funciones descritas anteriormente mediante
un ensayo para la replicación del ácido nucleico o el virus.
En una forma de realización adicional de la
invención, se proporciona una célula que contiene un virión
producido en la célula mediante replicación en la célula de los
vectores condicionales de la replicación de la presente invención.
De esta manera, la invención proporciona "células productoras"
para la producción eficiente y segura de vectores condicionales de
la replicación recombinantes para uso adicional para terapia génica
dirigida in vivo.
Uno de los problemas principales con las células
productoras disponibles actualmente es que dichas células
contienen, en el genoma, secuencias víricas que comunica secuencias
complementarias para el vector de replicación. Debido a que las
células contienen dichas secuencias, puede producirse la
recombinación homóloga entre la secuencia vírica en el genoma y las
secuencias del vector víricas. Dicha recombinación puede regenerar
virus de tipo salvaje recombinantes que contaminan el vector o la
preparación de virus producida en la célula productora. Dicha
contaminación es indeseable, tal como los virus o vectores de tipo
salvaje que se pueden replicar a continuación en un tejido no diana
y desequilibrar o matar por tanto células no diana. Por tanto, una
de las ventajas principales de las células productoras de la
presente invención es que no contienen secuencias víricas endógenas
homólogas de las secuencias encontradas en el vector que se va a
replicar en las células. La ausencia de dichas secuencias evita la
recombinación homóloga y la producción de recombinantes víricos de
tipo salvaje que pueden afectar los tejidos no diana.
De acuerdo con esto, la invención comprende
procedimientos para construir y producir viriones condicionales de
la replicación en una célula que comprende introducir el vector
condicional de la replicación de la presente invención en la célula
en la que el genoma de la célula está desprovisto de secuencias del
vector, replicando el vector en la célula formando el virión, y
purificando el virión a partir de la célula. Los vectores preferidos
son vectores víricos de ADN, que incluyen pero no se limitan a
vectores de herpesvirus, papilomavirus, virus de la hepatitis, y
papovavirus. En formas de realización preferidas de la invención, el
virión es un virión adenovírico y el vector es un vector
adenovírico. En formas de realización adicionales de la invención,
la célula es una célula tumoral.
En una forma de realización preferida adicional,
el vector codifica un producto de gen heterólogo, tal que el virión
codifica también el producto de gen, y cuando el vector o virión se
usan para la terapia génica, la terapia se facilita mediante la
expresión del producto de gen heterólogo. De manera alternativa, se
puede usar la célula productora para la producción de un producto
de gen heterólogo per se codificado por el vector. Cuando se
replica el vector en la célula productora, el producto de gen se
expresa a partir de múltiples copias del gen que codifica el
producto de gen. Tras la expresión, se puede purificar el producto
de gen a partir de las células productoras mediante los
procedimientos de lisis convencional, o secretarse a partir de la
célula productora mediante las señales de secreción apropiadas
enlazadas con el gen heterólogo mediante procedimientos conocidos.
Se ha descrito la transducción de células mediante vectores
adenovíricos. Se ha descrito la transfección de ADN del plásmido en
células mediante fosfato de calcio (Hanahan, D., J. Mol. Biol.
166: 577 (1983)), lipofección (Feigner y col., PNAS 84: 7413
(1987)), o electroporación (Seed, B., Nature 329: 840). Se
describen el ADN, ARN y los procedimientos de purificación del virus
(Graham y col., J. Gen. Virol. 36: 59-72
(1977).
Los huéspedes preferidos para las líneas
celulares productoras incluyen pero no se limitan a HuH7, SW480,
BIGF10, HepG2, MCF-7, y SK-MEL2. Los
tumores principales a partir de los cuales pueden derivarse líneas
celulares, o líneas celulares existentes, pueden ensayarse para la
capacidad de permitir la replicación por medio de la secuencia
reguladora transcripcional específica del tejido. Se podría
explantar cualquier tumor principal y desarrollarse en células
productoras para los vectores de la presente invención. Siempre que
las células no contengan vectores endógenos o secuencias víricas
que podrían recombinar con el vector o virus para producir vectores
o virus de tipo salvaje, la célula es potencialmente útil como
huésped. Se entiende que cualquier célula es potencialmente útil,
no solo las células tumorales.
El último objetivo de una línea celular
productora, y de manera particular una línea productora adenovírica,
el producir el rendimiento más alto del vector con la menor
posibilidad de contaminación por el vector de tipo salvaje. El
rendimiento depende del número de células infectadas. De esta manera
es posible general la mayor parte de virus que sea posible para
crecer e infectar, la mayor parte de células. De acuerdo con esto,
las células candidatas tendrían una velocidad de crecimiento alta y
crecerían con una densidad alta. Las células deberían tener una
cantidad alta de receptor vírico de tal manera que el virus pueda
infectar fácilmente la célula. Otra característica es la calidad
del vector producido (es decir, la preparación no debería incluir
una cantidad elevada de partículas víricas no infecciosas). De
acuerdo con esto, las células productoras candidatas tendrían una
baja relación de partícula a placa formando la unidad. De esta
manera, estas células son un tipo de célula preferido para derivar
una línea celular productora. Se pueden usar explantes principales o
líneas celulares conocidas.
De esta manera, dichas células obtenibles puede
servir como células productoras para vectores condicionales de la
replicación, virus y productos de gen.
Se han desarrollado una variedad de vías para
introducir vectores en células en el cultivo, y en las células y
tejidos de un animal o paciente humano. Los procedimientos para
introducir vectores en mamíferos y otras células animales incluyen
la transfección mediante fosfato de calcio, la técnica
DEAE-dextrano, la microinyección, las técnicas
mediadas por liposomas, las técnicas basadas en lípidos catiónicos,
la transfección usando polibreno, las técnicas de fusión del
protoplasto, la electroporación y otras. Estas técnicas son bien
conocidas por aquellos expertos en la técnica, se describen en
muchas publicaciones fácilmente disponibles y se han revisado de
manera extensiva. Algunas de las técnicas se revisan en
Transcription and Translation, A Practical Approach, Hames,
B. D. y Higgins, S. J., eds., IRL Press, Oxford (1984), incorporado
como referencia en el presente documento en su totalidad, y
Molecular Cloning, Segunda Edición, Maniatis y col.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York
(1989), incorporado como referencia en el presente documento en su
totalidad.
Se han usado algunas de estas técnicas para
introducir vectores en tejidos y células en paciente animales y
humanos. Principales entre estas han sido la administración
sistémica y la inyección directa en emplazamientos in situ.
Dependiendo de la ruta de administración y el vector, se han usado
las técnicas para introducir ADN desnudo, ADN complejado con lípido
catiónico, vectores víricos y líneas celulares productoras de
vectores en células y tejidos normales y anormales, generalmente
mediante inyección directa en un emplazamiento dirigido.
Se puede usar las técnicas anteriormente
mencionadas para introducir polinucleótidos víricos y otros vectores
en células en cultivo, en animales y en pacientes, para
desarrollar, ensayar y producir, así como usar vectores de acuerdo
con la invención. Por ejemplo, se pueden usar células que contienen
un vector introducido mediante estos procedimientos para producir
el vector. De manera adicional, se pueden usar células que contienen
un vector como células productoras e introducir en células o
tejidos de un animal para producir el vector in situ.
Se puede ensayar la replicación de un
polinucleótido vírico u otro vector mediante técnicas bien
conocidas. Los ensayos para la replicación de un vector en una
célula implican de manera general detectar un polinucleótido o
virus infectivo. Una variedad de procedimientos bien conocidos que
se pueden usar para este objetivo implican determinar la cantidad
de sustrato marcado incorporado e un polinucleótido durante un
período dado en una célula.
Cuando la replicación implica un polinucleótido
de ADN, se utiliza a menudo ^{3}H-timidina como
sustrato marcado. En este caso, se determina la cantidad de
replicación separando el ADN del vector del volumen del ADN celular
y midiendo la cantidad de tritio incorporada de manera específica en
el ADN del vector.
Se puede detectar también, la replicación de un
vector de polinucleótido lisando o permeando células para liberar
el polinucleótido, aislando a continuación el polinucleótido y
cuantificando de manera directa el ADN o ARN que se recupera. Se
puede detectar también la replicación del polinucleótido mediante
PCR cuantitativo usando cebadores que son específicos para el
polinucleótido de ensayo. Se pueden emplear también cualquiera de
estas técnicas bien conocidas, entre otras, para el ensayo de
replicación de un vector en una célula o tejido de acuerdo con la
invención. Se apreciará que las diferentes técnicas serán más
adecuadas para algunos vectores que otros y algunas células o
tejidos que otros.
Teniendo de esta manera descrita en el presente
documento la invención en términos generales, se presentan los
siguientes ejemplos para ilustrar la invención. Los ejemplos
1-4 muestran la sustitución del promotor EIA
constitutivo sobre un vector adenovírico con un promotor específico
de tumor. Los constructos fabricados por esta vía tienen la
proteína E1a expresada únicamente en las células del tumor y por
tanto, se replicarán únicamente en las células del tumor.
Se ha mostrado anteriormente el promotor de la
\alpha-fetoproteína por ser muy activo en las
células de hepatoma y silencioso en los hepatocitos adultos y otros
tejidos adultos. Se usó un promotor de
\alpha-fetoproteína de 4,9 kb que contenía el
constructo para derivar el promotor. De manera alternativa, se
podría fabricar también el promotor en función de las referencias
disponibles.
Se fabricó el plásmido lanzadera del adenovirus
pAVS21.TK1 (Figura 1), que tiene el gen TK bajo el control del
promotor de \alpha-fetoproteína de 4,9 kb, tal
como se describe en las Figuras 11 y 12 de la Solicitud de Patente
de los Estados Unidos de Chiang y col para la "Gene Therapy
of Hepatocellular Carcinoma Through Cancer-Specific
Gene Expresión", publicada el 18 de Mayo de 1995, que se
incorpora en el presente documento como referencia por su enseñanza
relevante. Se clonó pAVE1a02i (Figura 1), que coloca los genes
E1a/E1b bajo el control del promotor de la
\alpha-fetoproteína en un plásmido lanzadera de
adenovirus, purificando un fragmento de restricción que contenía la
región que codifica E1a únicamente y todo el gen E1b rompiendo el
plásmido pSE280-E1 (figura 1) con SpeI y MunI y
ligando este al pAVS21.TK1 roto con MunI y NheI. Se construyó el
plásmido SE280-E1, que contiene el E1A ORF y todo
E1b, tal como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados
Unidos Nº 08/458.403 de Kadan y col para las "Improved
Adenoviral vectors and Producer Cells", publicada el 2 de Junio
de 1995, que se incorpora en el presente documento como referencia
por su enseñanza relevante. Se cotransfectó pAVE1a02i con el
fragmento CLAI más grande de Addl327 mediante procedimientos
estándar en células 293 para generar el virus recombinante.
Se construyó el adenovirus AVE1a04i mediante la
precombinación homóloga del plásmido lanzadera, pAVE1a04i (véase
Figura 2) con el fragmento (Cla1) más grande del ADN AV1lacZ4 en
células 293. Se ha descrito anteriormente la construcción del
plásmido pAVE1a02i. La construcción de pAVEa04i es al menos idéntica
a la de pAVE1a02i. pAVE1a02i contiene el promotor AFP completo.
PAVE1a04i utiliza un derivado de este promotor, que tiene seis
elementos silenciadores y una región mejoradora duplicada.
Se construyó el plásmido
pAF(AB)_{2}(S_{d})_{6}-CAT
colocando seis copias del silenciador distal inmediatamente
corriente arriba de los 200 pares de bases basales del promotor AFP.
Se colocaron dos copias de la región AB del mejorador, con
orientación opuesta, inmediatamente corriente arriba de los
elementos del silenciador. Se utilizó este promotor extendiendo a
partir del elemento mejorador a través del promotor del AFP basal,
para fabricar el virus E1a con AV/AFP corto con el plásmido
lanzadera descrito en el presente documento. El elemento
silenciador distal, el promotor basal, y los elementos mejoradores
son tal como se describe en Nakabayashi y col. (Molec.
& Cell. Biol. 11: 5885-5893
(1991)).
Se hizo crecer el plásmido pAVE1a04i en células
STBL2 y se purificó mediante procedimientos de bandeado de cesio
estándar antes del uso en la transfección. Se aisló el ADN genómico
AV1lacZ4 a través del virus purificado mediante gradiente de cesio
(descrito en el presente documento). Se digirió el virus purificado
AV1lacZ4 con proteinaza K y se aisló el ADN mediante extracción con
fenol / cloroformo. Se digirió el ADN purificado con Cla1 y se
aisló el fragmento más grande mediante electroforesis en gel y se
cuantificó. Se cotransfectaron 5 \mug del plásmido pAVE1a04i y
2,5 \mug del fragmento Cla1 más grande de AV1lacZ4 en células 293
usando un procedimiento de transfección mediado con fosfato de
calcio (Promega, kit E1200). Se superpuso la placa de transfección
con agarosa al 1% superpuesta y se incubó hasta que se formaron las
placas. Una vez que se hubieron formado las placas, se cogieron y
se liberó el virus en 500 \mul de medio IMEM mediante ciclos
alternados de congelamiento y descongelamiento (5x).se
reamplificaron las placas víricas eluidas en células A30 durante 48
horas y a continuación se lisaron las células para uso en la
selección mediante PCR.
Se utilizaron cebadores específicos para el
promotor AFP corto (sAFP) en el plásmido pAVE1a04i para identificar
las placas posibles. La Figura 2A muestra que las placas víricas
contienen una banda sAFP-específica del peso
molecular predicho y específica para los cebadores sAFP. Para
confirmar que este virus recombinante no estaba contaminado con
Ad5dl327 (tipo salvaje), se utilizaron cebadores e1a. La Figura 2B
demuestra que estaban presentes virus de tipo salvaje y que las
secuencias del plásmido pAVE1a04i estuvieron presentes en el virus
recombinante. La Figura 2C demuestra que AV1lacZ4 estaba poco o
nada presente. Los datos indican la construcción de un virus con
E1a bajo control de un promotor específico del tejido y que el virus
es capaz de la replicación en células A30.
Se hicieron crecer placas individuales en células
A30 y se analizaron mediante PCR para la presencia del promotor AFP
(Figura 2). La flecha indica la banda específica de AFP generada a
partir de PCR. La figura muestra que la banda está presente en cada
uno de los virus en las placas seleccionadas (L6, L10, L11, M1 y
M2). El control en el experimento fue en el lisado de células A30,
no se esperaba que contuviera la banda. El experimento incluyó
también la reacción PCR con el plásmido pAVE1a04i (el plásmido
lanzadera a partir del cual se fabricó el virus y que por tanto
produciría el fragmento específico de AFP). De esta manera, la
Figura 2A confirma la presencia de un virus recombinante que
contiene el promotor AFP. Las Figuras 2B y 2C confirman que estos
resultados no son el resultado de contaminación en las placas
individuales. La Figura 2B usa cebadores específicos de E1a para
detectar la presencia de cualquier contaminación por virus de tipo
salvaje. La flecha muestra la banda producida con cebadores
específicos de E1a. La figura muestra que ninguno de los virus
recombinantes produce la banda relevante. La figura 2C confirma que
no existe contaminación de Av1.lacZ en las placas víricas (debido a
que los virus se fabricaron utilizando ADN de AV1.lacZ). La figura
indica que únicamente la ruta que contenía ADN de AV1.lacZ produce
la banda.
Se diluyó en serie el lisado vírico citopático de
este virus ("AVAFPE1a") en logs de 10 sobre células a549.30,
células A549, y células HuH 7. Las células A549.30 expresan el E1a a
partir del promotor del elemento receptor glucocorticoide (GRE) en
presencia de dexametasona debido a que este constructo se integra en
el genoma de esta línea celular. De esta manera, ningún virus E1a
suprimido o ningún virus que no exprese E1a deberían ser capaces de
replicarse en esta línea celular. Esto se ha mostrado anteriormente
para vectores E1 suprimidos (comunicación sin publicar). Tal como
se ha visto a partir de las Figuras 3A y 3D, el vector AVAFPE1 se
replica en las células infectadas tal como se indicó mediante los
efectos citopáticos característicos y extendiendo la muerte
celular. Las células A549 no expresan AFP y no deberían ser capaces
de transactivar el promotor AFP. De manera adicional, las células
A549 no expresan E1a. De esta manera, AVAFPE1a no debería ser capaz
de replicarse en esta línea celular. Tal como se ha visto a partir
de las Figuras 3B y 3E, ambos pocillos sin infectar e infectados
deberían parecer idénticos sin efectos citopáticos característicos o
la extensión observada en todas las diluciones ensayadas. Las
células HuH 7 expresan AFP, deberían transactivar el promotor AFP,
y deberían fabricar E1a con la replicación subsiguiente. Tal como se
muestra en las Figuras 3C y 3F, AVAFPE1a se replica claramente, tal
como se indicó mediante los efectos citopáticos. De manera
adicional, en diversos pocillos de células HuH 7 infectadas, la
replicación comienza con una placa única que se extiende a lo largo
del resto de pocillo durante una semana. Se ensayaron todos los
pocillos HuH 7 que muestran efectos citopáticos mediante PCR y se
demostró que estaban libres de virus de tipo salvaje y virus
AV1LacZ4, y contienen un promotor AFP intacto. Estos datos indican
claramente que se ha construido un virus que es capaz de replicarse
de manera específica en las células del tumor que expresan AFP.
El antígeno asociado con el carcinoma de mama DF3
(MUC1) se sobreexpresa mucho en carcinomas de mama humanos. La
expresión del gen se regula al nivel transcripcional. La secuencia
de ADN entre -485 - 588 es necesaria y suficiente para conferir un
incremento mayor de 10 veces en la transcripción del gen indicador
CAT cuando se coloca inmediatamente corriente arriba de un promotor
basal derivado del promotor TK del Herpesvirus en los
ensayos de transfección no estacionaria llevados a cabo en la línea
celular del cáncer de mama humano MCF-7. Se ha
encontrado un factor de transcripción específico que enlaza con esta
región del ADN dentro de células derivadas de la línea celular del
cáncer de mama MCF-7 pero no de la línea celular del
cáncer no de mama HL-60. Se ha encontrado que la
misma región de ADN promueve la expresión específica del cáncer del
gen TK en el contexto de un constructo retrovírico o un constructo
adenovírico. Se sintetizó el mejorador DF3 entre -598 y -485
(obtenido del GenBank) construyendo cuatro oligonucleótidos
sintetizados de esta manera que se superpondrían y se fundirían. En
la tabla 1 se muestran los oligonucleótidos. Se añadieron
emplazamientos de restricción adicionales sobre ambos extremos para
futura facilidad de clonación. Se mantuvo un extremo romo para
permitir la clonación en el emplazamiento SmaI del vector
pTK-Luc. Este vector contiene el promotor basal del
gen TK del Herpesvirus que proporciona un nivel de actividad
basal bajo en una variedad de células. Este se usó como fuente de
este promotor basal. El otro extremo tenía un emplazamiento BgIII de
superposición para facilitar la clonación en e emplazamiento BgIII
de pTK-Luc. Se fundieron 1.000 ng de cada
oligonucleótido en Tris 0,017 M, pH 8,0, NaCl 0,16 M en un volumen
total de 26,5 \mul calentando a 95ºC durante dos minutos y
dejando enfriar a temperatura ambiente tras algunas horas.
Finalmente, se ligó 1 \mul de esta mezcla con 100 ng del vector
SmaI/BgIII anteriormente purificado - y vidrio opalino (BIO 101)-
mediante condiciones estándar. Tras la transformación en células
DH5\alpha (GIBCO), se seleccionaron las colonias para la presencia
del inserto mediante digestión con restricción estándar. Se rompió
a continuación el ADN derivado de este vector con HindIII y se
enromó mediante Klenow. Este se rompió mediante AscI. Este
fragmento, que contiene el mejorador DF3 recubierto con el promotor
TK basal, se purificó a continuación mediante electroforesis en gel
de agarosa y vidrio opalino y se ligó con el plásmido pAVE1a02i se
rompió con Spe I y se enromó con AscI y se purificó tal como
anteriormente. El plásmido resultante tiene el producto de gen E1A
bajo el control del mejorador DF3 y el promotor TK basal y está en
un plásmido lanzadera adenovírico. Se cotransfectaron 5 \mug de
este plásmido, pAVE1a03i, con 5 \mug del fragmento del brazo CLAI
derecho, derivado de Addl327, en células 293. Se seleccionaron las
placas para el virus recombinante esperado mediante procedimientos
estándar.
Se utilizó un lisado de virus crudo para infectar
MCF-7 en un MOI de 10. Se confirmaron los stocks de
virus para replicarse de manera específica en células de cáncer de
mama mediante procedimientos estándar. Se amplificó el virus en
células MCF-7 y/o 293 células tal como se ha
descrito para la amplificación y purificación en las 293 células.
Se ensayaron los stocks de virus para la replicación in vivo
utilizando un modelo en modo ratón de MCF-7 y, como
control negativo, se utilizó un tumor derivado cáncer cervical
(Hela). Se ensayó el virus para un episodio recombinacional en
células 293 que generarían un virus de tipo salvaje mediante el
ensayo del promotor E1A original que estaría sólo en un virus de
tipo salvaje. Se ensayaron también una variedad de diferentes
líneas celulares de cáncer de mama en rata y ser humano y líneas
celulares no relacionadas. Se puede insertar el gen TK en la región
E3 y haber manejado TK bien mediante el promotor dependiente de E1A
presente o bajo el control del promotor RSV o CMV.
Se usaron PCR y cebadores PCR para clonar un
fragmento de ADN de 800 bp corriente arriba del gen de la tirosinasa
de ADN genómico de ratón utilizando PFU y los cebadores descritos
tal como se han descrito por Stratogene. El fragmento PCR
resultante se clonó en pCRSCRIPT y a continuación se volvió a clonar
en pAVE1a02i digiriendo el nuevo plásmido con AscI/SpeI y pAVE1a01i
con AscI/SpeI y ligando los dos conjuntamente. Se utilizó el
plásmido lanzadera final, pAVE1a04i, que tiene E1a/E1b bajo el
control del promotor de la tirosinasa, para fabricar un virus
recombinante de manera idéntica a como se ha descrito
anteriormente.
Se clonó el promotor CEA a partir de ADN genómico
humano tal como se ha descrito anteriormente y se clonó de una
manera similar en el plásmido pAVE1a01i usando los cebadores que se
muestran en la Tabla 1. Se utilizó el plásmido lanzadera final,
pAVE1a05i para generar el virus recombinante tal como se ha descrito
anteriormente.
Los constructos fabricados tal como anteriormente
tendrían la proteína E2a (esencial para la replicación vírica
expresada sólo en células tumorales). Por tanto, la replicación del
vector se produce sólo en células tumorales. Se usaron cuatro de
estos promotores muy específicos (en los ejemplos anteriores) para
colocar la región que codifica e2a obtenida a partir de
pSE280-E2a (véase la Solicitud de Patente de los
Estados Unidos de Kayden y col., "Improved adenoviral vectors and
producer cells" publicada el 2 de Junio de 1995) bajo el control
de este promotor específico del tumor. Se recombinó el plásmido
resultante con Addl327, utilizando procedimientos estándar de
recombinación homóloga. Se hizo crecer el virus final en las líneas
celulares descritas en la solicitud de patente anteriormente
mencionada o en las líneas celulares específicas del tumor. La
proteína e2a, debido a que se necesita en cantidades
estequiométricas, tiene la capacidad de regular el grado de
replicación sobre un amplio intervalo. Esto es deseable para la
terapia. Los procedimientos usados son los mismos descritos a los
de e1a. La diferencia es que se usa el plásmido lanzadera que coloca
E2a bajo el control del promotor específico del tumor y retorna
este al esqueleto del virus (mediante recombinación homóloga) que
tiene los genes E2a y E3 suprimidos.
Se pueden colocar genes como TK, citoquinas, o
cualquier gen terapéutico en la región E3 del esqueleto del vector
mediante la construcción del plásmido estándar y la recombinación
homóloga. Se pueden colocar aquellos genes bajo el control de un
promotor dependiente de E1a, o un promotor constitutivo tal como RSV
o CMV.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Genetic Therapy, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vectores para replicación con especificidad celular
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Sterne, Kessler, Goldstein & Fox P.L.L.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1100 New York Avenue NW
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: D.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 20005-3934
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release#1.0, Version #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: (a determinar))
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-NOV-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/487,992
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-JUN-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- FECHA DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/348,258
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-NOV-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ABOGADO/ REPRESENTANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Goldstein, Jorge A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 29.021
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/ NÚMERO DE EXPEDIENTE: 1136.002PC02
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (202) 371-2600
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (202) 371-2540
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 248636 SSK
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC. ID. Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACCCGGGCG CGCCGGAGCA GTGCTATTCA AACCATCCAG
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGATCTAC TAGTTCTGCA CCAATAGGTT AATGAGTGTC
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACCCGGGCG CGCCTCTGTC ACCTTCCTGT TGG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGATCTAC TAGTTCTCTG CTGTCTGCTC TGTC
\hfill34
Claims (13)
1. Un vector adenovírico capaz de la replicación
específica del tejido que comprende una secuencia reguladora
transcripcional específica del tejido enlazada de manera operativa
con la región de codificación del gen E1a de dicho vector.
2. El vector de la reivindicación 1, en el que la
secuencia reguladora transcripcional se selecciona entre el grupo
constituido por promotores y mejoradores.
3. El vector de la reivindicación 2, en el que
dicho promotor se selecciona entre el grupo constituido por
\alpha-fetoproteína, DF3, tirosinasa, CEA,
tensioactivo, y ErbB2.
4. El vector de la reivindicación 1, en el que
dicho vector contiene una secuencia de codificación heteróloga que
es capaz de ser expresada a partir de dicho vector.
5. El uso del vector adenovírico condicional de
la replicación que contiene un polinucleótido, en el que el gen E1a
se enlaza de manera operativa con la secuencia reguladora
transcripcional que funciona de manera específica en un tejido de
tal manera que se produce la replicación del vector en dicho tejido
y no en un tejido en el que no funciona dicha secuencia reguladora
transcripcional, en la fabricación de un agente para el tratamiento
de un tumor.
6. el uso de la reivindicación 5, en el que la
secuencia reguladora transcripcional se selecciona entre el grupo
constituido por promotores y mejoradores.
7. el uso de la reivindicación 6, en el que el
promotor se selecciona entre el grupo constituido por
\alpha-fetoproteína, DF3, tirosinasa, CEA,
tensioactivo y erbB2.
8. El uso de la reivindicación 5, en el que dicho
tejido es un tejido tumoral.
9. El uso de la reivindicación 5, en el que dicho
vector codifica un producto de gen heterólogo, y en el que dicho
vector expresa dicho producto de gen heterólogo en las células de
dicho tejido.
10. El uso de la reivindicación 9, en el que
dicho producto de gen heterólogo proporciona actividad antitumoral
en las células de dicho tejido.
11. Una célula que contiene un vector adenovírico
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-4 capaz de la replicación específica del tejido,
comprendiendo dicho vector una secuencia reguladora transcripcional
específica del tejido enlazada de manera operativa con la región de
codificación del gen E1a de dicho vector, en el que dicha secuencia
reguladora transcripcional funciona en dicha célula de tal manera
que se produce la replicación del vector en dicha célula.
12. Un procedimiento de producir un vector capaz
de la replicación específica del tejido de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1-4, que comprende cultivar
la célula de la reivindicación 11 y recuperar dicho vector a partir
de dicha célula.
13. Una composición farmacéutica que comprende el
vector de una cualquiera de las reivindicaciones
1-4 en combinación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
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