ES2258265T3 - Vectores de replicacion con especificidad tisular. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE, EN GENERAL, A TERAPIA GENICA DIRIGIDA, QUE UTILIZA VECTORES RECOMBINANTES Y, ESPECIALMENTE, VECTORES DE ADENOVIRUS. LA INVENCION SE REFIERE ESPECIFICAMENTE, A VECTORES DE REPLICACION CONDICIONAL Y A METODOS DE UTILIZACION DE LOS MISMOS. DICHOS VECTORES, SON CAPACES DE REPLICARSE SELECTIVAMENTE EN UN TEJIDO DIANA, PROPORCIONANDO UN BENEFICIO TERAPEUTICO, POR LA PRESENCIA DEL VECTOR PER SE, O DERIVADA DE PRODUCTOS GENICOS HETEROLOGOS EXPRESADOS POR EL VECTOR Y DISTRIBUIDOS A TRAVES DEL TEJIDO. EN DICHOS VECTORES, SE SITUA UN GEN ESENCIAL PARA LA REPLICACION BAJO EL CONTROL DE UNA SECUENCIA REGULADORA TRANSCRIPCIONAL ESPECIFICA DE UN TEJIDO HETEROLOGO. DE ESTA FORMA, LA REPLICACION SE CONDICIONA A LA PRESENCIA DE UN(OS) FACTOR(ES), QUE INDUCE(N) LA TRANSCRIPCION, O A LA AUSENCIA DE UN(OS) FACTOR(ES), QUE INHIBEN LA TRANSCRIPCION DE DICHO GEN, MEDIANTE LA SECUENCIA REGULADORA TRANSCRIPCIONAL INCORPORADA EN DICHO VECTOR. POR ELLO, SE PUEDE TRATAR UN TEJIDO DIANA DE FORMASELECTIVA.

Description

Vectores de replicación con especificidad tisular.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención se refiere de manera general a la terapia génica dirigida utilizando vectores recombinantes y de manera particular vectores de adenovirus. La invención se refiere de manera específica a los vectores condicionales de la replicación y a los procedimientos para utilizarlos. Dichos vectores son capaces de replicarse de manera selectiva en un tejido diana para proporcionar un beneficio terapéutico procedente de la presencia del vector per se o procedente de los productos de genes heterólogos expresados a partir del vector y distribuidos por todo el tejido. En dichos vectores, se coloca un gen esencial para la replicación bajo el control de una secuencia reguladora transcripcional heteróloga específica del tejido. De esta manera se condiciona la replicación a la presencia de un(os) factor(es) que induce(n) la transcripción o a la ausencia de un(os) factor(es) que inhibe(n) la transcripción del gen por medio de la secuencia regulatoria transcripcional. Con este vector, por tanto, se puede tratar de manera selectiva un tejido diana. La invención se refiere también a los procedimientos de utilización de los vectores para seleccionar un tejido respecto de la presencia o ausencia de las funciones regulatorias transcripcionales que permiten la replicación del vector por medio de la secuencia regulatoria transcripcional. La invención se refiere también a las células que producen los vectores recombinantes condicionales de la replicación útiles para la terapia génica dirigida.

Antecedentes de la técnica Vectores diana

Una de las principales metas de la utilización terapéutica de genes exógenos ha sido el direccionamiento de células con alta especificidad. Las propuestas generales han incluido la introducción sistémica de ADN, complejos ADN-proteína, y liposomas. Se ha utilizado también la administración in situ de retrovirus en células que se replican de manera activa.

Sin embargo, debido a la ausencia, o ser esta significativamente baja, de especificidad celular y transferencia génica ineficiente, la dirección de los genes deseados hacia el blanco en células específicas en un organismo ha sido un obstáculo principal para la terapia basada en genes exógenos. De esta manera, se ha limitado la utilización de dichos genes.

Las células tumorales están entre aquellos tipos de células a los cuales se podría desear proporcionar de manera especial un medio para la dirección de genes exógenos. En una forma de realización de la presente invención, se proporcionan composiciones y procedimientos para liberar genes exógenos en células tumorales de manera segura y eficiente.

Generalidades de los Adenovirus

Los adenovirus son icosaedros regulares sin envoltura. El recubrimiento de proteína (cápsida) está compuesto por 252 capsómeros de los cuales 240 son hexones y 12 son pentones. La mayor parte de los estudios estructurales detallados de los polipéptidos de adenovirus se han hecho para los tipos de adenovirus 2 y 5. El ADN vírico es de 23,85 x 10^{6} daltons para el adenovirus 2, y varía ligeramente en tamaño dependiendo del serotipo. El ADN tiene repeticiones terminales invertidas y la longitud de estas varía con el serotipo.

El ciclo replicativo se divide en las fases temprana (E) y tardía (L). La fase tardía define el comienzo de la replicación del ADN vírico. Las proteínas estructurales del adenovirus se sintetizan generalmente durante la fase tardía. Tras la infección por adenovirus, con la mayoría de serotipos, se inhiben el ADN del huésped y la síntesis de proteína en las células infectadas. El ciclo lítico del adenovirus con adenovirus 2 y adenovirus 5 es muy eficiente y da como resultado aproximadamente 10.000 viriones por célula infectada junto con la síntesis de proteína vírica en exceso y ADN que no se incorpora al virión. La transcripción temprana del adenovirus es una secuencia complicada de episodios bioquímicos interrelacionados, pero que implica de manera esencial la síntesis de ARN vírico antes de la replicación del ADN vírico.

La organización del genoma del adenovirus es similar en todos los grupos de adenovirus y las funciones específicas se sitúan de manera general en localizaciones idénticas para cada serotipo estudiado. El ARN mensajero citoplasmático temprano es complementario para cuatro regiones no contiguas definidas sobre el ADN vírico. Estas regiones se designan (E1-E4). Los trascriptos tempranos se han clasificado en una serie de inmediatos tempranos (E1a), tempranos retardados (E1b, E2a, E2b, E3 y E4), y regiones intermedias (IVa2.IX).

La región E1a se implica en una transactivación transcripcional de los genes víricos y celulares así como en la represión transcripcional de otras secuencias. El gen E1a ejerce una función de control importante sobre el resto de los ARN mensajeros de adenovirus tempranos. En tejidos normales, con el fin de transcribir las regiones E1b, E2a, E2b, E3, o E4, se necesita un producto E1a. Sin embargo, tal como se describe a continuación, se puede derivar la función E1a. Se pueden manipular las células para proporcionar funciones similares a E1a o pueden contener de manera natural dichas funciones. Se puede manipular también el virus para derivar las funciones, tal como se describe a continuación.

Se necesita la región E1b para la progresión normal de los episodios víricos tardíos en la infección. El producto E1b actúa en el núcleo del huésped. Los mutantes generados dentro de las secuencias E1b presentan disminución en la acumulación de ARNm vírico tardío así como deterioro en la inhibición del transporte celular del huésped, observado de manera normal en la infección por adenovirus tardío (Berkner, K. L., Biotechniques 6:616-629 (1988)). Se necesita el E1b para alterar las funciones de la célula huésped de tal manera que se cambian el procesamiento y el transporte a favor de los productos génicos tardíos víricos. A continuación, estos productos dan como resultado un empaquetado vírico y la liberación de los viriones. El E1b produce una proteína de 19 kD que evita la apóptosis. El E1b produce una proteína de 55 kD que enlaza con p53.

Para una revisión completa sobre los adenovirus y su replicación, véase Horwitz, M. S., Virology 2ª ed, Fields, B. N., eds, Raven Press Limited, Nueva Cork (1990), Capítulo 60, pp. 1679-1721.

Adenovirus como vehículo de liberación recombinante

El adenovirus proporciona ventajas como vector para la liberación génica adecuada por las siguientes razones. Es un virus sin envoltura con ADN de doble cadena con tropismo por el sistema respiratorio y el tracto gastrointestinal humano. Produce una enfermedad leve similar a la gripe. Los vectores adenovíricos penetran en las células mediante endocitosis mediada por el receptor. El genoma grande (36 kilobases) permite la eliminación de genes esenciales para la replicación y regiones no esenciales de tal manera que se puede insertar y expresar el ADN anterior a partir del genoma vírico. Los adenovirus infectan una amplia variedad de tipos de células in vivo e in vitro. Se han usado los adenovirus como vectores en terapia génica y para la expresión de genes heterólogos. La expresión de los genes víricos o extraños a partir del genoma del adenovirus no requiere una célula replicante. Los vectores del adenovirus se integran con poca frecuencia en el cromosoma huésped; el genoma del adenovirus permanece como un elemento extracromosómico en el núcleo celular. No existe asociación de malignidad en ser humano con la infección por adenovirus. Se han desarrollado cadenas atenuadas y se han utilizado en seres humanos como vacunas vivas.

Para una descripción más detallada del uso de los vectores de adenovirus para la terapia génica, véase Berkner, K. L., Biotechniques 6:616-629 (1988); Trapnell, B. C., Advanced Drug Delivery Reviews 12:185-199 (1993).

Los vectores del adenovirus se suprimen generalmente en la región E1 del virus. A continuación puede sustituirse la región E1 con las secuencias de ADN de interés. Se apuntó sin embargo en un artículo reciente sobre terapia génica humana que "la principal desventaja en el uso del adenovirus como vector de transferencia génica es que el vector vírico permanece generalmente como episomal y no se replica, de esta manera, la división celular conduce a la pérdida eventual del vector a partir de las células hijas" (Morgan, R. A., y col., Annual Review of Biochemistry 62:191-217 (1993)) (énfasis añadido).

La no replicación del vector conduce no solo a la pérdida eventual del vector sin expresión en la mayor parte o todas las células diana, sino que conduce también a una expresión insuficiente en las células que captan el vector, debido a que las copias del gen cuya expresión se desea son insuficientes para el efecto máximo. La insuficiencia de la expresión del gen es una limitación general de todos los vectores de liberación no replicantes. De esta manera, es deseable introducir un vector que pueda proporcionar copias múltiples de un gen y por lo tanto mayores cantidades del producto de este gen. La presente invención supera las desventajas descritas anteriormente proporcionando un vector de replicación específico de tejido y de manera especial específico de tumores, copias múltiples de ADN, y de esta manera, cantidades aumentadas del producto de gen.

Producción de vectores adenovíricos

Se han producido vectores adenovíricos para la expresión del gen recombinante en la línea celular de riñón embriónico 293 (Graham., F. L. y col., J. Gen. Virol. 35:59-72 (1977)). Esta línea celular, transformada inicialmente con adenovirus 5 humano, contiene ahora el extremo izquierdo del genoma del adenovirus 5 y expresa E1. Por tanto, estas células son permiten el crecimiento de los mutantes del adenovirus 2 y del adenovirus 5 que carecen de las funciones E1. Se han utilizado de manera extensiva para el aislamiento y propagación de los mutantes E1. Por tanto, se han utilizado células 293 para la clonación y expresión de ayudantes independientes de los vectores del adenovirus en células de mamífero. Los genes E1 integrados en el ADN celular de las células 293 se expresan a niveles que permiten la delección de estos genes a partir del genoma del vector vírico. La delección proporciona una región no esencial en la que se puede insertar el ADN. Para una revisión, véase Young, C. S. H., y col en The Adenoviruses, Ginsberg, H. S., ed., Plenum Press, Nueva Cork y Londres (1984), pp. 125-172.

Sin embargo, las células 293 están sometidas a graves limitaciones como células productoras de vectores de adenovirus. La tasa de crecimiento es baja. Los títulos son limitados, especialmente cuando el vector produce un producto de gen heterólogo que resulta tóxico para las células. La recombinación con la secuencia E1 vírica en el genoma puede conducir a la contaminación del virus defector recombinante con virus de tipo salvaje peligrosos. La calidad de algunas preparaciones víricas es mala con respecto a la relación de las partículas de virus en placa que forma la unidad. De manera adicional, la línea celular que no soporta el crecimiento de la mayor parte de mutantes muy suprimidos debido a la expresión de E1 en combinación con otros genes víricos en el genoma celular (necesaria para complementar la delección adicional), tal como E4, es tóxica para las células. Además, la cantidad de ADN heterólogo que se puede insertar en el genoma vírico está limitada en estas células. Es deseable, por lo tanto, producir vectores de adenovirus para la terapia génica en una célula que no puede producir recombinantes de tipo salvaje y puede producir valoraciones altas de virus de alta calidad. La presente invención supera estas limitaciones

Resumen de la invención

En vista de las limitaciones descritas anteriormente, un objetivo general de la invención es proporcionar vectores nuevos para la replicación del vector específico del tejido y la expresión del gen procedente del vector de replicación. De acuerdo con esto la invención se dirige a un vector de adenovirus que contiene un gen que es esencial para la replicación, y dicho gen se enlaza de manera operable con una secuencia reguladora transcripcional heteróloga, tal que se crea un vector cuya replicación se condiciona a la presencia de un(os) factor(es) regulatorios transcripcionales transactuantes que permiten la transcripción a partir de la secuencia regulatoria transcripcional, o la ausencia de un(os)
factor(es) regulatorios transcripcionales que evitan de manera normal la transcripción a partir de la secuencia regulatoria transcripcional. De esta manera, estas secuencias regulatorias se activan o desreprimen de manera específica en el tejido diana de tal manera que se produce la replicación del vector en este tejido.

Otro objetivo de la invención es proporcionar tratamiento específico de un tejido anormal. De esta manera, un objetivo adicional de la invención es proporcionar un procedimiento para distribuir de manera selectiva un vector in vivo en un tejido diana, tal que se trata un número mayor de células del que podría tratarse con un vector no replicante, y se evita o reduce de manera significativa el tratamiento en los tejidos no diana. De acuerdo con esto, se proporciona un procedimiento para distribuir de manera selectiva un vector en un tejido diana introduciendo el vector condicional de la replicación de la presente invención en un tejido diana que contiene un(os) factor(es) regulador(es) transcripcional(es) que permite la replicación o es deficiente en el(los) factor(es) que inhibe(n) la transcripción que evita la replicación del vector.

Para proporcionar el tratamiento específico del tejido, otro objetivo de la invención es distribuir de manera selectiva un polinucleótido en un tejido diana in vivo. De acuerdo con esto, la invención se dirige a un procedimiento para distribuir de manera selectiva un polinucleótido en un tejido diana in vivo introduciendo el vector condicional de la replicación de la presente invención, que contiene el polinucleótido en el tejido diana que contiene un factor(es) regulatorio(s) transcripcional(es) que permite la replicación del vector o es deficiente en un(os) factor(s) que inhibe la transcripción que evita la replicación del vector.

Para proporcionar el tratamiento específico del tejido, un objetivo adicional de la invención es distribuir de manera selectiva un producto de gen heterólogo en un tejido diana. De acuerdo con esto, los vectores condicionales de la replicación de la presente invención se construyen de tal manera que contienen una secuencia de ADN heterólogo que codifica un producto de gen que se expresa en el vector. Cuando el vector se replica en el tejido diana, se producen también cantidades efectivas del producto de gen deseado en el tejido diana.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento para identificar el tejido anormal que se puede tratar mediante los vectores de la presente invención. Por tanto, un objetivo adicional de la invención es identificar un tejido en el que se puedan replicar los vectores condicionales de la replicación por medio de la secuencia regulatoria transcripcional contenida en el vector. De acuerdo con esto, la invención se dirige de manera adicional a un procedimiento en el que los vectores condicionales de la replicación de la presente invención se exponen a un tejido anormal dado. Si este tejido contiene un(os) factor(es) regulatorio(s) transcripcional(es) que permita la replicación del vector o es deficiente en un(os) factor(es) que inhibe(n) la transcripción que evitan la replicación del vector, se producirá a continuación la replicación del vector y se puede detectar. Tras la identificación se dicho tejido, se puede efectuar el tratamiento dirigido de este tejido mediante la transcripción específica del tejido y la consiguiente replicación del vector en el tejido in vivo.

De esta manera, se proporciona un procedimiento para ensayar la utilidad del vector para el tratamiento del tejido que comprende las etapas de retirar una biopsia del tejido procedente de un paciente, explantar la biopsia en el interior del cultivo celular, introducir un vector condicional de la replicación en las células de la biopsia y ensayar la replicación del vector en las células.

Otro objetivo de la invención es proporcionar líneas celulares productoras para la producción del vector. De manera preferible, las líneas celulares tienen una o más de las siguientes características: producción de virus con elevado título, resistencia a los efectos tóxicos debidos a los productos del génicos heterólogos expresados en el vector, ausencia de producción de virus de tipo salvaje que contaminan la preparación del virus y dan como resultado la recombinación entre las secuencias víricas integradas y las secuencias del vector, crecimiento con densidad alta y en suspensión, pasaje potencial ilimitado, velocidad de crecimiento alta, permitiendo el crecimiento de virus con elevada delección que se debilitan para las funciones víricas y son capaces de acomodar grandes piezas de ADN heterólogo.

De acuerdo con esto, en una forma de realización adicional de la invención, se proporciona una línea celular que contiene el vector condicional de la replicación de la presente invención, las células de dicha línea celular contienen un(os) factor(es) regulador(es) que permite(n) la replicación del vector o es deficiente en un factor(es) que inhibe(n) la transcripción que evita(n) la replicación del vector.

En formas de realización adicionales de la invención, la línea celular contiene copias del ácido nucleico del vector replicado.

En formas de realización adicionales, se proporciona un procedimiento para producir un vector o virión condicional de la replicación que comprende las etapas de cultivar la línea celular productora descrita anteriormente y recuperar el vector o virión a partir de las células. En otras formas de realización adicionales se proporciona un procedimiento para producir viriones condicionales de la replicación libres de viriones de tipo salvaje o vectores víricos libres de vectores de tipo salvaje, que comprende las etapas de cultivar la línea celular productora descrita anteriormente y recuperar los viriones o vectores deficientes de la replicación a partir de las células.

En procedimientos de tratamiento y diagnosis preferidos, el tejido es anormalmente proliferante, y de manera especial es tejido tumoral. Sin embargo, los procedimientos se dirigen también a otros tejidos anormales tal como se describe en el presente documento.

En una forma de realización más preferida, el vector es un vector de adenovirus. Sin embargo, se entiende que potencialmente cualquier fuente de vector es útil si contiene un gen esencial que puede enlazarse de manera operable con una secuencia reguladora transcripcional específica del tejido.

En procedimientos adicionales de tratamiento y diagnosis, se introduce el vector en el tejido mediante la infección.

En una forma de realización preferida de la invención, se enlaza un gen de manera operable en la región E1 del adenovirus con la secuencia reguladora transcripcional específica del tejido. De manera preferible se enlaza de manera operable el gen E1a o E1b con la secuencia reguladora transcripcional específica del tejido.

En otra forma de realización de la invención, el vector codifica un producto de gen heterólogo. Este producto de gen heterólogo se expresa a partir del vector replicante en el tejido diana.

En otra forma de realización adicional de los procedimientos de tratamiento, el producto de gen heterólogo es tóxico para el tejido diana.

En otra forma de realización adicional de los procedimientos, el producto de gen heterólogo actúa sobre un profármaco no tóxico, convirtiendo el profármaco no tóxico en una forma que es tóxica para el tejido diana. De manera preferible, la toxina tiene actividad antitumoral o elimina la proliferación celular.

En formas de realización preferidas de la invención, la secuencia reguladora transcripcional es un promotor. Entre los promotores preferidos se incluyen, pero no se limitan a, antígeno carcinoembriónico (CEA), DE3, \alpha-fetoproteína (AFP), Erb-B2, tensioactivo, y de manera especial tensioactivo de pulmón, y el promotor de la tirosinasa. Sin embargo, se puede usar cualquier región con control genético que controla la transcripción del gen esencial para activar (o desreprimir) el gen. De esta manera, se pueden usar otros elementos de control genético, tales como mejoradores, secuencias represibles, y silenciadores, para regular la replicación del vector en la célula diana. El único requerimiento es que el elemento genético se active, desreprima, mejore, o se regule genéticamente de otra manera mediante factores en la célula huésped, con respecto a los procedimientos de tratamiento, no en la célula no diana.

Los mejoradores preferidos incluyen el mejorador específico del cáncer de mama DF3 y los mejoradores procedentes de virus y la familia del receptor esteroide. Otras secuencias reguladoras transcripcionales preferidas incluyen NF1, SP1, AP1, y FOS / JUN.

En formas de realización adicionales, los promotores no se activan necesariamente mediante factores en el tejido diana, pero se desreprimen mediante factores presentes en el tejido diana. De esta manera, en el tejido diana se estimula la represión.

Entre los factores reguladores transcripcionales se incluyen, pero no se limitan a, factores transactivantes producidos por secuencias víricas endógenas tales como a partir de citomegalovirus (CMV), HIV, virus de Epstein-barr (EBV), virus de Herpes simplex (HSV), SV40, y otros de dichos virus que son patogénicos en mamíferos y, de manera particular, en seres humanos.

Son conocidos los procedimientos para fabricar dichos vectores por aquellas personas normalmente expertas en la técnica. La técnica adecuada enseña la construcción de vectores recombinantes con delecciones o modificaciones en las secuencias de codificación específicas y enlaces operables con una secuencia control de transcripción heteróloga tal que la expresión de una región de codificación deseada está bajo el control de una secuencia reguladora transcripcional heteróloga. Se han mapeado de manera adecuada muchas secuencias víricas de tal manera que es rutina identificar un gen escogido y usar técnicas bien conocidas apropiadas (tales como la recombinación homóloga del virus con plásmidos suprimidos o modificados de otra manera) para construir los vectores para la replicación y expresión específica del tejido.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1. Clonación de pAVE1a02i: se digirió pAVSAFP.TK1 con NheI/MunI. Se aisló un fragmento A de 10667 bp. Se digirió pSE280-E1 con SpE/MunI. Se aisló un fragmento A de 3397 bp. Se ligaron los fragmentos aislados para formar pAVE1a02i.

Figura 2A-C. Identificación mediante PCR del adenovirus recombinante con E1a expresado a partir del promotor AFP específico del hepatoma. La Figura 2A muestra que se producen las placas víricas mediante genomas víricos que contienen el promotor AFP enlazado de manera operativa con E1a. La Figura 2B muestra que no hubo contaminación con virus de tipo salvaje. La Figura 2C muestra que no hubo contaminación con ADN de AV1lacZ.

Figura 3A-F. Adenovirus específico del tejido con E1a expresado a partir del promotor AFP. El experimento muestra los efectos citopáticos y la generalización de muerte celular que sigue a la infección con el virus AVAFPE1a. Las Figuras 3A-3C muestran controles sin infectar en células A549.30, A549, y HuH, respectivamente. Las Figuras 3D-3F muestran los resultados con el virus en células A549.30, A549, y HuH7, respectivamente.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas Definiciones

Se pretende que el término "proliferación anormal" signifique una célula que tiene un índice mitótico mayor que su contraparte que funciona normalmente, de tal manera que existe una acumulación anormal de dichas células.

Se pretende que el término "actividad antitumoral" signifique cualquier actividad que inhibe, evita, o destruye el crecimiento de un tumor.

Se pretende que el término "distribución" signifique la propagación de un vector y su gen heterólogo acompañante (producto) (cuando se presenta sobre el vector) por todo el tejido diana, y de manera especial por todo el tejido que prolifera anormalmente (no maligno o maligno). El objetivo de la distribución es liberar el vector, producto de gen o los efectos del producto de gen (tal como mediante un efecto testigo, por ejemplo) en sustancialmente todas o un número significativo de células del tejido diana, con el fin de tratar sustancialmente el tejido diana completo.

El término "mejorador" se usa de acuerdo con su significado reconocido por la técnica. Se pretende que signifique una secuencia que se encuentra en eucariotas y algunos virus eucariotas que pueden aumentar la transcripción a partir de un gen cuando se localiza (en cualquier orientación) hasta en diversas kilobases del gen que está siendo estudiado. Estas secuencias actúan usualmente como mejoradores cuando se encuentran en la posición 5' (corriente arriba) del gen en cuestión. Sin embargo, algunos mejoradores están activos cuando se colocan en la posición 3' (corriente abajo) del gen. En algunos casos, los elementos mejoradores pueden activar la transcripción de un gen sin promotor (conocido).

Se pretende que el término "inactivación funcional" signifique una lesión genética que evita la actividad normal del producto de gen. De esta manera, la inactivación funcional podría dar como resultado una mutación en el gen que codifica el producto de gen. Dicha lesión incluye inserciones, delecciones, y cambios de bases. De manera alternativa, se puede producir la inactivación funcional mediante la interacción anormal del producto de gen normal con uno o más productos génicos celulares diferentes que enlazan o evitan de otra manera la actividad funcional de dicho producto de gen. De esta manera, el producto de gen puede ser una proteína producida a partir de un gen normal pero que no puede llevar a cabo su función ordinaria y normal debido a una interacción con un segundo factor.

El término "gen esencial para la replicación" se refiere a la secuencia genética cuya transcripción se requiere por el vector para replicar en la célula diana.

Se pretende que el término "producto de gen" signifique ADN, ARN, proteína, péptidos o partículas víricas. De esta forma, la distribución, a efectos de la invención, es cualquiera de estos componentes.

El término "heterólogo" significa una secuencia de ADN no encontrada en el genoma del vector nativo. Con respecto a la "secuencia reguladora transcripcional heteróloga", "heterólogo" indica que la secuencia reguladora transcripcional no está ligada de manera natural con la secuencia de ADN para el gen esencial para la replicación del vector.

El término "promotor" se usa de acuerdo con su significado reconocido por la técnica. Se pretende que signifique la región de ADN, usualmente corriente arriba que codifica la secuencia de un gen u operón, que enlaza la ARN polimerasa y dirige el enzima en el emplazamiento de comienzo transcripcional correcto.

El término "replicación" significa la duplicación de un vector. Esta duplicación, en el caso de los virus, se puede producir al nivel del ácido nucleico, o al nivel de la partícula vírica infecciosa. En los casos de los virus con ADN, la replicación al nivel del ácido nucleico es la replicación del ADN. En el caso de los virus con ARN, la replicación del ácido nucleico es la replicación en la cadena más o menos (o ambas). En el caso de los retrovirus, la replicación al nivel del ácido nucleico incluye la producción de ADNc así como la producción adicional de genomas víricos de ARN. La característica esencial son las copias de ácido nucleico del vector vírico original. Sin embargo, la replicación incluye también la formación de ADN infeccioso o partículas víricas de ARN. Dichas partículas pueden infectar de manera sucesiva células en un tejido diana dado distribuyendo de esta manera el vector a través de todo o una porción significativa del tejido diana.

El término "vector condicional de la replicación" se refiere a un vector que cuando se introduce en un tejido no se replicará a no ser que se active o desreprima una secuencia reguladora transcripcional en este tejido. Esto es, la replicación depende de la transcripción por medio de la secuencia reguladora transcripcional. Dicho vector es condicional de la replicación tal como se ha descrito debido a que se ha modificado de la siguiente manera. Se ha modificado un gen que es esencial para la replicación reemplazando la secuencia reguladora transcripcional sobre la cual depende normalmente la transcripción de este gen con una secuencia reguladora transcripcional heteróloga. Esta secuencia reguladora transcripcional depende de la presencia de los factores reguladores transcripcionales o de la ausencia de los inhibidores reguladores transcripcionales. La presencia de estos factores en un tejido dado, o la ausencia de dichos inhibidores en un tejido dado proporciona la condicionalidad de la replicación. De acuerdo con esto, la secuencia reguladora transcripcional nativa puede reemplazarse con la secuencia reguladora transcripcional heteróloga. De manera alternativa, puede inhabilitarse o volverse disfuncional la secuencia reguladora transcripcional nativa mediante eliminación parcial (delección) u otra mutación (uno o más cambios de bases, inserciones, inversiones, etc).

La secuencia génica puede ser una secuencia de codificación. Puede contener uno o más marcos de lectura abiertos, así como secuencias intrón. Sin embargo dicha secuencia no se limita a una secuencia de codificación, sino que incluye secuencias que son transcritas en ARN, dicho ARN es esencial en sí mismo para la replicación del vector. La característica esencial es que la transcripción de las secuencias génicas no depende de las secuencias reguladoras transcripcionales nativas.

El término "silenciador" usado en el sentido reconocido por la técnica, significa una secuencia encontrada en virus eucariotas y eucariotas que puede disminuir o silenciar la transcripción de un gen cuando se localiza en el interior de diversas kilobases de este gen.

Se pretende que el término "específico del tejido" signifique que la secuencia reguladora transcripcional para la cual el gen esencial para la replicación se enlaza de manera operable funcione de manera específica en este tejido de tal manera que la replicación tenga lugar en este tejido. Esto se puede producir mediante la presencia en este tejido, y no en tejidos no diana, de factores de transcripción positivos que activan la secuencia reguladora transcripcional. Esto se puede producir también por la ausencia de transcripción que inhiba los factores que se producen normalmente en tejidos no diana y eviten la transcripción como resultado de la secuencia reguladora transcripcional. De esta manera, cuando se produce la transcripción, esta procede en el gen esencial para la replicación de tal manera que en el tejido diana, se produce la replicación del vector y sus funciones acompañantes.

Tal como describe el presente documento, la especificidad del tejido es particularmente relevante en el tratamiento de la contraparte anormal de un tejido normal. Dichas contrapartes incluyen, pero no se limitan a, tejido de hígado y cáncer de hígado, tejido de pecho y cáncer de mama, melanoma y tejido de piel normal. La especificidad del tejido incluye también la presencia de un tipo de tejido anormal entremezclado con tejido normal de un tipo de tejido diferente, como por ejemplo en el caso de la metástasis del cáncer de cólon, cáncer de mama, y similares, en un tejido tal como hígado. En este caso, el tejido diana es el tejido anormal, y la especificidad del tejido refleja la restricción de la replicación del vector en el tejido anormal entremezclado en el tejido normal. Se entiende también que la especificidad del tejido, en el contexto del tratamiento, es particularmente relevante in vivo. Sin embargo, tal como se ha descrito en el presente documento, el tratamiento ex vivo y la sustitución del tejido caen también dentro del concepto de especificidad del tejido de acuerdo con la presente invención.

Se pretende que el término "función reguladora transcripcional" o "factor regulador transcripcional" signifique cualquier función celular cuya presencia activa la secuencia reguladora transcripcional heteróloga descrita en el presente documento o cuya ausencia permita la transcripción como resultado de las secuencias reguladoras transcripcionales descritas en el presente documento. Se entiende que en un tejido diana dado, un tejido que "carece de factor regulador transcripcional" o es "deficiente" en el factor regulador transcripcional se referiría a cualquier ausencia del factor o la inactivación funcional del factor en el tejido diana.

El término "secuencia reguladora trasnscripcional" se usa de acuerdo con su significado reconocido en la técnica. Se pretende que signifique cualquier secuencia de ADN que puede, en virtud de su secuencia, producir el gen enlazado ya sea sobre o infra regulado en una célula particular. En una forma de realización de la presente invención, la secuencia reguladora transcripcional nativa se suprime de manera completa del vector y se sustituye con una secuencia reguladora transcripcional heteróloga. La secuencia reguladora transcripcional puede ser adyacente a la región de codificación del gen que es esencial para la replicación, o puede eliminarse de este. De acuerdo con ello, en el caso de un promotor, el promotor estará generalmente adyacente a la región de codificación. En el caso de un mejorador, sin embargo, se puede encontrar un mejorador a alguna distancia de la región de codificación tal que exista una secuencia de ADN intermedia entre el mejorador y la secuencia de codificación. En algunos casos, la secuencia reguladora transcripcional nativa permanece en el vector pero no es funcional con respecto a la transcripción del gen esencial para la
replicación.

Se pueden incluir en un vector diversas combinaciones de secuencias reguladoras transcripcionales. Una o más pueden ser heterólogas. De manera adicional, una o más pueden tener especificidad del tejido. Por ejemplo, se podría usar una secuencia reguladora transcripcional única para impulsar la replicación mediante más de un gen esencial para la replicación. Este es el caso, por ejemplo, cuando el producto de gen de uno de los genes impulsa la transcripción del(os)
gene(es) adicional(es). Un ejemplo es un promotor heterólogo enlazado con un cassette que contiene una secuencia que codifica E1a (promotor E1a suprimido) y el gen E1b completo. En dicha cascada, únicamente una secuencia reguladora transcripcional heteróloga puede ser necesaria. Cuando los genes se controlan de manera individual (separadamente), sin embargo, se puede usar más de una secuencia reguladora transcripcional si se desea más de un gen dicho para controlar la replicación.

Por tanto, los vectores de la presente invención incluyen también combinaciones de secuencias reguladoras transcripcionales en las que existe más de una secuencia reguladora transcripcional heteróloga, pero en la que una o más de estas no son específicas del tejido. Por ejemplo, una secuencia reguladora transcripcional puede ser un nivel basal constitutivo de la secuencia reguladora transcripcional. Por ejemplo, un mejorador específico del tejido puede combinarse con un nivel basal constitutivo del promotor.

Vectores

Los vectores preferidos de la presente invención son vectores adenovíricos. En una forma de realización preferida de la invención, un vector de adenovirus contiene una secuencia reguladora transcripcional específica del tejido enlazada con un gen en la región E1.

En una forma de realización alternativa, solo E1a está enlazado; E1b permanece intacto.

La invención abarca de manera adicional el uso de plásmidos y vectores que tienen únicamente las regiones esenciales de adenovirus necesarias para la replicación con cualquier E1a, gen E1b 19kDa, o gen E1b 55kDa, o alguna combinación de los mismos, modificados. Dicho plásmido, que carece de cualquier gen estructural, sería capaz de experimentar la replicación del ADN. De acuerdo con esto, los vectores de la invención pueden estar constituidos esencialmente por la secuencia reguladora transcripcional y uno o más genes esenciales para la replicación del vector. En el caso de vectores víricos, los vectores pueden estar constituidos por la secuencia reguladora transcripcional y el gen o genes esenciales para la replicación o funciones del ciclo vital de los virus. Se entiende también que estos vectores pueden estar constituidos esencialmente de manera adicional por una secuencia de ADN que codifica uno o más productos génicos heterólogos tóxicos cuando se pretende que dichos vectores sean vectores de expresión para el tratamiento.

Los virus alternativos se seleccionan de manera preferible entre cualquier grupo de virus en que los genes esenciales para la replicación del virus se puede colocar bajo el control de una secuencia reguladora transcripcional específica del tejido. Se incluyen todos los serotipos de adenovirus. La única propiedad común de dichos virus, por tanto, es que son transducibles en el tejido diana, son genéticamente manipulables, y no son tóxicos cuando no se replican.

Los vectores descritos en el presente documento se pueden construir usando técnicas biológicas moleculares estándar. Las técnicas estándar para la construcción de dichos vectores son bien conocidas por aquellos normalmente expertos en la técnica, y se pueden encontrar en referencias tales como Sambrook y col., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), o cualquiera de la miriada de manuales de laboratorio sobre tecnología de ADN recombinante que están ampliamente disponibles. Están disponibles una variedad de estrategias para el ligamiento de los fragmentos de ADN, la selección de la cual depende de la naturaleza del término de los fragmentos de ADN y se puede determinar fácilmente por el técnico experto.

Un vector de adenovirus, en una forma de realización preferida, se construye en primer lugar construyendo, de acuerdo con técnicas estándar, un plásmido lanzadera que contiene, comenzando en el extremo 5', los "elementos críticos del extremo izquierdo" que incluyen, un ITR 5' adenovírico, una señal de encapsidación adenovírica, y una secuencia mejoradora E1a; un promotor (que puede ser un promotor adenovírico o un promotor anterior); una secuencia líder tripartita, un emplazamiento de clonación múltiple (que puede ser tal como se describe en el presente documento); una señal poli A; y un segmento de ADN que corresponde con un segmento del genoma adenovírico. Dicho segmento de ADN sirve como sustrato para la recombinación homóloga con un adenovirus modificado o mutado. El plásmido puede incluir también un marcador seleccionable y un origen de replicación. El origen de la replicación puede ser un origen bacteriano de la replicación. Los ejemplos representativos de dichos plásmidos lanzadera incluyen pAVS6, tal como se ha descrito en el presente documento y véase Trapnell, B. y col., Adv. Drug Deliv. Rev 12:185-189 (1994). Una secuencia de ADN deseada contiene un gen heterólogo que puede insertarse a continuación en un emplazamiento de clonación múltiple para producir un vector plásmido.

A continuación, este constructo se usa para producir un vector adenovírico. A continuación se efectúa la recombinación homóloga con un adenovirus modificado o mutado en el que se han suprimido una o más de las secuencias reguladoras transcripcionales nativas y reemplazado con la secuencia reguladora transcripcional deseada. Dicha recombinación homóloga se puede efectuar a través de una cotransfección del vector plásmido y el adenovirus modificado en una línea celular ayudante mediante precipitación con CaPO_{4}.

A través de dicha recombinación homóloga, se forma un vector que incluye ADN adenovírico libre de una o más secuencias reguladoras transcripcionales nativas. Este vector puede a continuación transfectarse en una línea celular ayudante para la replicación vírica y generar partículas víricas infecciosas. Las transfecciones pueden tener lugar mediante electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección o a través de proteoliposomas.

El vector puede incluir un emplazamiento de clonación múltiple para facilitar la inserción de la secuencia(s) de ADN que contienen el gen heterólogo en el vector de clonación. De manera general, el emplazamiento de clonación múltiple incluye emplazamientos para enzimas de restricción "raros", es decir, emplazamientos que se encuentran en genes eucariotas a una frecuencia de entre aproximadamente uno en cada 10.000 a aproximadamente uno en cada 100.000 pares de bases. Un vector apropiado es el formado de esta manera cortando el vector de clonación mediante técnicas estándar en emplazamientos de restricción apropiados en el emplazamiento de clonación múltiple, y a continuación ligar la secuencia de ADN que contiene el gen heterólogo en el vector de clonación.

La secuencia de ADN que codifica el producto de gen heterólogo está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a, promotores adenovíricos, tales como el promotor tardío mayor adenovírico; o los promotores heterólogos, tales como el promotor del citomegalovirus; el promotor del virus del sarcoma de Rous; los promotores inducibles, tales como el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor de la metalotioneína; los promotores del shock térmico; el promotor de la albúmina; el promotor ApoE; y el promotor Apoya. Se entiende, sin embargo que, el alcance de la presente invención no se limita a los genes o promotores anteriores específicos.

En una forma de realización, se puede construir el adenovirus usando un cromosoma artificial de levadura que contiene un genoma adenovírico de acuerdo con el procedimiento descrito en Ketner y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 91:6186-6190 (1994), en conjunción con las enseñanzas contenidas en el presente documento. En esta forma de realización, el cromosoma artificial del adenovirus de levadura se produce mediante la recombinación homóloga in vivo entre el ADN adenovírico y los vectores del plasmado del cromosoma artificial de levadura que transportan los segmentos de los términos genómicos izquierdo y derecho adenovíricos. Se puede clonar a continuación una secuencia de ADN que contiene el gen heterólogo en el ADN adenovírico. A continuación se escinde el genoma adenovírico modificado a partir del cromosoma artificial del adenovirus de levadura con el fin de usarse para generar partículas adenovíricas infecciosas.

Las partículas víricas infecciosas puede a continuación administrarse in vivo a un huésped. El huésped puede ser un animal huésped, que incluye un mamífero, un primate no humano y huéspedes humanos.

Se pueden administrar las partículas víricas en combinación con vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable para la administración a un paciente. El vehículo puede ser un vehículo líquido (por ejemplo, una solución salina), o un vehículo sólido, tal como, por ejemplo, perlas de microvehículo.

Tratamiento

En formas de realización preferidas, los procedimientos se dirigen de manera específica a la introducción en un tejido diana de un vector adenovírico condicional de la replicación. Este vector se replica de manera selectiva en las células del tejido diana. Esta replicación se condiciona tras la función de una secuencia reguladora transcripcional con la cual se enlaza de manera operable un gen vírico, cuyo gen es necesario para la replicación del vector. De esta manera, se puede producir la replicación en el tejido diana debido a una función celular en el tejido diana que permite la transcripción. La presencia o ausencia de dichas funciones proporciona la selectividad que permite el tratamiento de un tejido específico con efecto mínimo sobre el tejido(s) que lo rodea(n).

La presente invención proporciona de esta manera procedimientos para distribuir de manera selectiva un polinucleótido en un tejido dado in vivo, reduciendo o evitando de manera significativa la distribución en un tejido no diana. Se proporciona el polinucleótido en el vector condicional de la replicación que se distribuye de manera selectiva en el tejido dado.

La presente invención proporciona también procedimientos para expresar de manera selectiva un producto de gen en un tejido dado, evitando o reduciendo de manera significativa la expresión en un tejido no diana o no tumoral. La invención proporciona procedimientos para la distribución de lo anteriormente mencionado en un número mayor de células diana que podrían ponerse en contacto usando un vector no replicante. La infección sucesiva proporciona un "efecto dominó" de tal manera que se ponen en contactos todas o sustancialmente todas las células en el tejido diana. La s células de manera adicional a lo ya expuesto para el polinucleótido, vector o producto de gen, se ponen en contacto de manera potencial mediante los procedimientos.

Dicho tratamiento es particularmente necesario en los casos en que no es factible la intervención quirúrgica. Por ejemplo, en pacientes con tejido anormal asociado de manera íntima con tejido neural, la cirugía puede ser imposible o muy peligrosa. De manera ocasional, en el caso de metástasis múltiple o metástasis microscópica, no es factible la cirugía.

En el tejido diana, sólo se puede producir la replicación del ADN. También se puede producir funciones víricas tardías que dan como resultado el empaquetamiento del vector de ADN en viriones.

El vector se puede introducir en el tejido diana como ADN desnudo o por medio de la encapsidación (como una partícula de virus infeccioso o como virión). En el último caso, la distribución se lleva a cabo mediante infecciones sucesivas de células en el tejido mediante el virus de tal manera que se infectan sustancialmente todas o un número significativo de células hijas.

La especificidad del tejido es particularmente relevante con respecto al direccionamiento en una contraparte anormal de un tipo de tejido particular evitando a la vez la contraparte normal del tejido, o evitando el tejido que lo rodea, de un tipo diferente que el tejido anormal, tratando a la vez el tejido anormal. Por ejemplo, los vectores de la presente invención son útiles para tratar metástasis en el hígado. Un ejemplo específico es el cáncer de cólon, que metastatiza a menudo en el hígado, el promotor CEA es activo en las células de la metástasis pero no en las células normales de hígado. De acuerdo con esto, el hígado de un adulto humano normal no soportaría la replicación de un virus que tiene genes víricos esenciales para enlazar la replicación con el promotor específico CEA del cáncer de cólon. Se debería producir la replicación en las células de cáncer primarias. Otro ejemplo es el cáncer de mama, que también metastatiza en el hígado. En este caso, el mejorador de la mucina DF3 se enlaza con un gen esencial para la replicación tal como E1a. Se debería producir la replicación en el cáncer de mama pero no en el hígado normal. Un ejemplo adicional es el promotor de la \alpha-fetoproteína que es activo en el carcinoma hepatocelular. El promotor se enlaza con un gen esencial para la replicación. Se ha encontrado que el promotor es activo únicamente en el carcinoma hepatocelular. Un ejemplo adicional es el promotor de la tirosinasa. Este promotor se enlaza con un gen esencial para la replicación. Se debería producir la replicación en el melanoma y no en la piel normal. En cada caso, se espera la replicación en las células anormales pero no en las normales.

En una forma de realización adicional de la invención, el vector codifica un producto de gen heterólogo que se expresa a partir del vector en las células del tejido. El producto de gen heterólogo puede ser tóxico para las células en el tejido dirigido o confiere otra propiedad deseada.

Se puede distribuir un producto de gen producido por el vector por todo el tejido, debido a que el vector por sí mismo se distribuye por todo el tejido. De manera alternativa, aunque la expresión del producto de gen puede ser localizada, su efecto puede ser más a largo plazo debido al efecto testigo o la producción de moléculas que tienen efectos de amplio espectro tales como las quimioquinas. El producto de gen puede ser ARN, tal como un ARN antisentido o una ribozima, o la proteína. Los ejemplos de productos tóxicos incluyen, pero no se limitan a, timidina quinasa en conjunción con ganciclovir.

Es posible un amplio intervalo de efectos tóxicos. Los efectos tóxicos pueden ser directos o indirectos. Pueden resultar efectos indirectos a partir de la conversión de un profármaco en un fármaco tóxico directamente. Por ejemplo, la timidina quinasa del virus Herpes simplex fosforila el ganciclovir para producir la toxina del nucleótido ganciclovir fosfato. Este compuesto funciona como un terminador de cadena y un inhibidor de la ADN polimerasa, evita la síntesis del ADN, y de esta manera, es citotóxico. Otro ejemplo es el uso de la citosina desaminasa para convertir 5'-fluorocitosina en el profármaco anticanceroso 5' fluoracilo. Para una descripción de dichos genes "suicidas", véase Blaese, R. M. y col., Eur. J. Cancer 30A: 1190-1193 (1994).

Las toxinas directas incluyen, pero no se limitan a, toxina de la difteria (Brietman y col., Mol. Cell Biol. 10: 474-479 (1990)), toxina de pseudomonas, ARN antisentido de citoquinas (Blankenstein, T., y col., J. Exp. Med 173: 1047-1052 (1991), Colombo, M. P., y col., J. Exp. Med. 173: 889-897 (1991), Leone, A., y col., Cell 65: 25-35 (1991)), y ribozimas (Zaia, J. A. y col., Ann N. Y. Acad. Sci. 660: 95-106 (1992)), genes de vacunación del tumor, y ADN que codifica ribozimas.

De acuerdo con la presente invención, el agente que es capaz de conseguir la inhibición, prevención o destrucción del crecimiento del tejido diana de las células tumorales tras la expresión de dicho agente puede ser un marcador selectivo negativo; es decir, un material que en combinación con un agente quimioterapéutico o de interacción inhibe, evita o destruye el crecimiento de las células diana.

De esta manera, tras la introducción en las células del marcador selectivo negativo, se administra un agente de interacción en el huésped. El agente de interacción interactúa con el marcador selectivo negativo para evitar, inhibir o destruir el crecimiento de las células diana.

Los marcadores selectivos negativos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, timidina quinasa y citosina desaminasa. En una forma de realización, el marcador selectivo negativo es una timidina quinasa vírica seleccionada entre el grupo constituido por timidina quinasa del virus del Herpes simplex, timidina quinasa del citomegalovirus y timidina quinasa del virus de varicela-zoster. Cuando se emplean timidinas quinasas víricas, la interacción o el agente quimioterapéutico de manera preferible es un análogo de nucleósido, por ejemplo, uno seleccionado entre el grupo constituido por ganciclovir, acilovir, y 1-2-desoxi-2-fluoro-\beta-D-arabinofuranosil-5-yodouracilo (FIAU). Dichos agentes de interacción se utilizan de manera eficiente con las timidina quinasas víricas como sustratos, y dichos agentes de interacción se incorporan de esta manera letalmente en el ADN de las células tumorales que expresan las timidina quinasas víricas, dando como resultado por tanto, la muerte de las células diana.

Cuando la citosina desaminasa es el marcador selectivo negativo, un agente de interacción preferido es 5-fluorocitosina. La citosina desaminasa convierte la 5-fluorocitosina en 5-fluorouracilo, que es altamente tóxico. De esta manera, las células diana que expresan el gen de la citosina desaminasa convierten la 5-fluorocitosina en 5-fluorouracilo y son muertas.

El agente de interacción se administra en una cantidad efectiva para inhibir, evitar, o destruir el crecimiento de las células diana. Por ejemplo, el agente de interacción se administra en una cantidad en función del peso corporal y sobre la toxicidad global en un paciente. El agente de interacción se administra de manera preferible sistémicamente, tal como, por ejemplo, mediante administración intravenosa, mediante administración parenteral, mediante administración intraperitoneal, o mediante administración intramuscular.

Cuando los vectores de la presente invención inducen un marcador selectivo negativo y se administran en un tejido o tumor in vivo, puede darse como resultado un "efecto testigo", es decir, células que no se traducen de manera original con la secuencia de ácido nucleico que codifica el marcador selectivo negativo pueden ser muertas tras la administración del agente de interacción. Aunque no se pretende que el alcance de la presente invención se limite a ningún razonamiento teórico, se pueden producir en forma difusible las células transducidas del marcador selectivo negativo que, o bien actúan extracelularmente tras el agente de interacción, o son capturadas por las células no diana adyacentes, que a continuación llegan a ser susceptibles a la acción del agente de interacción. Es posible también que uno o ambos del marcador selectivo negativo y el agente de interacción se comuniquen entre las células diana.

En una forma de realización, el agente que comunica la inhibición, prevención, o destrucción del crecimiento de las células tumorales es una citoquina. En una forma de realización, la citoquina es una interleuquina. Otras citoquinas que se pueden emplear incluyen interferones y factores estimuladores de la colonia, tales como GM-CSF. Las interleuquinas incluyen, pero no se limitan a, interleuquina -1, interleuquina-1\beta, e interleuquinas-2-15. En una forma de realización, la interleuquina es interleuquina -2.

En una forma de realización preferida de la invención, el tejido diana prolifera de manera anormal, y de forma preferible es un tumor. El vector o virus se distribuye por todo el tejido o masa de tumor.

Todos los tumores son potencialmente susceptibles al tratamiento con los procedimientos de la invención. Los tipos de tumor incluyen, pero no se limitan a, hematopoiético, pancreático, neurológico, hepático, del tracto gastrointestinal, endocrino, del tracto biliar, sino-pulmonar, de cabeza y garganta, sarcoma y carcinoma del tejido blando, dermatológico, del tracto reproductivo, y similares. Los tumores preferidos para el tratamiento son aquellos con un índice mitótico alto en relación con el tejido normal. Los tumores preferidos son tumores sólidos, y de manera especial, tumores del cerebro, de manera preferible el glioma.

Se pueden usar también los procedimientos con otras células diana anormales, por ejemplo, cualesquiera células que sean dañinas o no deseadas de otra manera in vivo. Ejemplos amplios incluyen células que producen la enfermedad autoinmune, restenosis, y la formación del tejido de cicatriz.

De manera adicional, el tratamiento puede ser ex vivo. La transducción ex vivo de las células tumorales superaría muchos de los problemas de los sistemas de liberación vírica actuales. Se cosecha el tejido bajo condiciones estériles, se disocia mecánicamente y/o enzimáticamente y se cultiva bajo condiciones estériles en un medio apropiado. Las preparaciones del vector que demuestran estar libres de endotoxinas y contaminación bacteriana se usan para transducir células bajo condiciones estériles in vitro usando protocolos estándar. La accesibilidad del virus a las células en el cultivo es actualmente superior a la inyección in vivo y permite la introducción de las secuencias víricas del vector en esencialmente todas las células. Siguiendo a la eliminación del medio que contiene el virus, las células vuelven inmediatamente al paciente o se mantienen durante algunos días en cultivo ensayando a la vez para que se lleve a cabo la función o la esterilidad.

Por ejemplo, se han tratados de manera satisfactoria pacientes con hipercolesterolemia eliminando porciones del hígado, explantando los hepatocitos en el cultivo, modificándolos genéticamente mediante exposición al retrovirus, y reinfusionando las células corregidas en el hígado (Grossman y col., 1994).

La transducción vírica tiene también aplicaciones potenciales en el área de la medicina experimental. Se ha propuesto la expresión no estacionaria de los modificadores biológicos de la función del sistema inmune tales como IL-2, IFN-\gamma, GM-CSF o la proteína coestimuladora B7 como un medio potencial de inducir respuestas antitumorales en pacientes con cáncer.

Diagnóstico

Es importante conocer si los vectores de la invención se replicarán en un tejido específico de un paciente. Si se encuentra que la replicación del vector es beneficiosa para la terapia se proporciona a continuación una selección para aquellos pacientes que mejor responden a la terapia descrita en el presente documento. Si se encuentra que es perjudicial, a continuación existe una selección para la prevención del tratamiento de los pacientes que tendrían una respuesta adversa al tratamiento. Actualmente, los únicos ensayos no biológicos que se utiliza comúnmente son la selección de la expresión, el PCR, y el secuenciamiento. Estos dan a menudo resultados como falsos negativos, consumen tiempo, son caros, y en el mejor de los casos dan como resultado solo información aproximada del estado de los genes y no de su función biológica.

De acuerdo con esto se proporciona un procedimiento para identificar un tejido anormal, las células del cual contienen un factor de transcripción que permite la replicación de un vector condicional de la replicación, o son deficientes para un factor inhibitorio para la transcripción.

En este procedimiento se explanta una biopsia del tejido, se introduce un vector condicional de la replicación en las células de la biopsia, y se cuantifica la replicación del ADN del vector en las células. De acuerdo con esto se proporciona un procedimiento para seleccionar el tejido para la presencia de factores que permitan la replicación del vector, o para una deficiencia de un factor que inhibe la transcripción. Dicha selección es útil, entre otras cosas, para identificar el tejido, antes del tratamiento, que será susceptible al tratamiento con un vector particular que se va a replicar en el tejido.

Por tanto, se proporciona un procedimiento para evaluar la utilidad del vector para el tratamiento retirando una biopsia de tejido del paciente, explantando la biopsia en el cultivo del tejido, introduciendo el vector condicional de la replicación en la biopsia, y ensayando la replicación del vector en las células de la biopsia.

El ensayo o selección de los tejidos incluye un ensayo para la replicación del vector de ácido nucleico o para la replicación del virus, cuando el vector es capaz de formar viriones infecciosos.

De esta manera, la invención proporciona u procedimiento para seleccionar un tumor para las funciones reguladoras de la transcripción que permiten la replicación del vector o para la ausencia de estas funciones que evitarían normalmente la replicación de un vector del virus.

Sin embargo, se puede seleccionar cualquier tejido anormal para las funciones descritas anteriormente mediante un ensayo para la replicación del ácido nucleico o el virus.

Células productoras

En una forma de realización adicional de la invención, se proporciona una célula que contiene un virión producido en la célula mediante replicación en la célula de los vectores condicionales de la replicación de la presente invención. De esta manera, la invención proporciona "células productoras" para la producción eficiente y segura de vectores condicionales de la replicación recombinantes para uso adicional para terapia génica dirigida in vivo.

Uno de los problemas principales con las células productoras disponibles actualmente es que dichas células contienen, en el genoma, secuencias víricas que comunica secuencias complementarias para el vector de replicación. Debido a que las células contienen dichas secuencias, puede producirse la recombinación homóloga entre la secuencia vírica en el genoma y las secuencias del vector víricas. Dicha recombinación puede regenerar virus de tipo salvaje recombinantes que contaminan el vector o la preparación de virus producida en la célula productora. Dicha contaminación es indeseable, tal como los virus o vectores de tipo salvaje que se pueden replicar a continuación en un tejido no diana y desequilibrar o matar por tanto células no diana. Por tanto, una de las ventajas principales de las células productoras de la presente invención es que no contienen secuencias víricas endógenas homólogas de las secuencias encontradas en el vector que se va a replicar en las células. La ausencia de dichas secuencias evita la recombinación homóloga y la producción de recombinantes víricos de tipo salvaje que pueden afectar los tejidos no diana.

De acuerdo con esto, la invención comprende procedimientos para construir y producir viriones condicionales de la replicación en una célula que comprende introducir el vector condicional de la replicación de la presente invención en la célula en la que el genoma de la célula está desprovisto de secuencias del vector, replicando el vector en la célula formando el virión, y purificando el virión a partir de la célula. Los vectores preferidos son vectores víricos de ADN, que incluyen pero no se limitan a vectores de herpesvirus, papilomavirus, virus de la hepatitis, y papovavirus. En formas de realización preferidas de la invención, el virión es un virión adenovírico y el vector es un vector adenovírico. En formas de realización adicionales de la invención, la célula es una célula tumoral.

En una forma de realización preferida adicional, el vector codifica un producto de gen heterólogo, tal que el virión codifica también el producto de gen, y cuando el vector o virión se usan para la terapia génica, la terapia se facilita mediante la expresión del producto de gen heterólogo. De manera alternativa, se puede usar la célula productora para la producción de un producto de gen heterólogo per se codificado por el vector. Cuando se replica el vector en la célula productora, el producto de gen se expresa a partir de múltiples copias del gen que codifica el producto de gen. Tras la expresión, se puede purificar el producto de gen a partir de las células productoras mediante los procedimientos de lisis convencional, o secretarse a partir de la célula productora mediante las señales de secreción apropiadas enlazadas con el gen heterólogo mediante procedimientos conocidos. Se ha descrito la transducción de células mediante vectores adenovíricos. Se ha descrito la transfección de ADN del plásmido en células mediante fosfato de calcio (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166: 577 (1983)), lipofección (Feigner y col., PNAS 84: 7413 (1987)), o electroporación (Seed, B., Nature 329: 840). Se describen el ADN, ARN y los procedimientos de purificación del virus (Graham y col., J. Gen. Virol. 36: 59-72 (1977).

Los huéspedes preferidos para las líneas celulares productoras incluyen pero no se limitan a HuH7, SW480, BIGF10, HepG2, MCF-7, y SK-MEL2. Los tumores principales a partir de los cuales pueden derivarse líneas celulares, o líneas celulares existentes, pueden ensayarse para la capacidad de permitir la replicación por medio de la secuencia reguladora transcripcional específica del tejido. Se podría explantar cualquier tumor principal y desarrollarse en células productoras para los vectores de la presente invención. Siempre que las células no contengan vectores endógenos o secuencias víricas que podrían recombinar con el vector o virus para producir vectores o virus de tipo salvaje, la célula es potencialmente útil como huésped. Se entiende que cualquier célula es potencialmente útil, no solo las células tumorales.

El último objetivo de una línea celular productora, y de manera particular una línea productora adenovírica, el producir el rendimiento más alto del vector con la menor posibilidad de contaminación por el vector de tipo salvaje. El rendimiento depende del número de células infectadas. De esta manera es posible general la mayor parte de virus que sea posible para crecer e infectar, la mayor parte de células. De acuerdo con esto, las células candidatas tendrían una velocidad de crecimiento alta y crecerían con una densidad alta. Las células deberían tener una cantidad alta de receptor vírico de tal manera que el virus pueda infectar fácilmente la célula. Otra característica es la calidad del vector producido (es decir, la preparación no debería incluir una cantidad elevada de partículas víricas no infecciosas). De acuerdo con esto, las células productoras candidatas tendrían una baja relación de partícula a placa formando la unidad. De esta manera, estas células son un tipo de célula preferido para derivar una línea celular productora. Se pueden usar explantes principales o líneas celulares conocidas.

De esta manera, dichas células obtenibles puede servir como células productoras para vectores condicionales de la replicación, virus y productos de gen.

Introducción de vectores en células

Se han desarrollado una variedad de vías para introducir vectores en células en el cultivo, y en las células y tejidos de un animal o paciente humano. Los procedimientos para introducir vectores en mamíferos y otras células animales incluyen la transfección mediante fosfato de calcio, la técnica DEAE-dextrano, la microinyección, las técnicas mediadas por liposomas, las técnicas basadas en lípidos catiónicos, la transfección usando polibreno, las técnicas de fusión del protoplasto, la electroporación y otras. Estas técnicas son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, se describen en muchas publicaciones fácilmente disponibles y se han revisado de manera extensiva. Algunas de las técnicas se revisan en Transcription and Translation, A Practical Approach, Hames, B. D. y Higgins, S. J., eds., IRL Press, Oxford (1984), incorporado como referencia en el presente documento en su totalidad, y Molecular Cloning, Segunda Edición, Maniatis y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), incorporado como referencia en el presente documento en su totalidad.

Se han usado algunas de estas técnicas para introducir vectores en tejidos y células en paciente animales y humanos. Principales entre estas han sido la administración sistémica y la inyección directa en emplazamientos in situ. Dependiendo de la ruta de administración y el vector, se han usado las técnicas para introducir ADN desnudo, ADN complejado con lípido catiónico, vectores víricos y líneas celulares productoras de vectores en células y tejidos normales y anormales, generalmente mediante inyección directa en un emplazamiento dirigido.

Se puede usar las técnicas anteriormente mencionadas para introducir polinucleótidos víricos y otros vectores en células en cultivo, en animales y en pacientes, para desarrollar, ensayar y producir, así como usar vectores de acuerdo con la invención. Por ejemplo, se pueden usar células que contienen un vector introducido mediante estos procedimientos para producir el vector. De manera adicional, se pueden usar células que contienen un vector como células productoras e introducir en células o tejidos de un animal para producir el vector in situ.

Ensayo del ADN y Replicación vírica

Se puede ensayar la replicación de un polinucleótido vírico u otro vector mediante técnicas bien conocidas. Los ensayos para la replicación de un vector en una célula implican de manera general detectar un polinucleótido o virus infectivo. Una variedad de procedimientos bien conocidos que se pueden usar para este objetivo implican determinar la cantidad de sustrato marcado incorporado e un polinucleótido durante un período dado en una célula.

Cuando la replicación implica un polinucleótido de ADN, se utiliza a menudo ^{3}H-timidina como sustrato marcado. En este caso, se determina la cantidad de replicación separando el ADN del vector del volumen del ADN celular y midiendo la cantidad de tritio incorporada de manera específica en el ADN del vector.

Se puede detectar también, la replicación de un vector de polinucleótido lisando o permeando células para liberar el polinucleótido, aislando a continuación el polinucleótido y cuantificando de manera directa el ADN o ARN que se recupera. Se puede detectar también la replicación del polinucleótido mediante PCR cuantitativo usando cebadores que son específicos para el polinucleótido de ensayo. Se pueden emplear también cualquiera de estas técnicas bien conocidas, entre otras, para el ensayo de replicación de un vector en una célula o tejido de acuerdo con la invención. Se apreciará que las diferentes técnicas serán más adecuadas para algunos vectores que otros y algunas células o tejidos que otros.

Teniendo de esta manera descrita en el presente documento la invención en términos generales, se presentan los siguientes ejemplos para ilustrar la invención. Los ejemplos 1-4 muestran la sustitución del promotor EIA constitutivo sobre un vector adenovírico con un promotor específico de tumor. Los constructos fabricados por esta vía tienen la proteína E1a expresada únicamente en las células del tumor y por tanto, se replicarán únicamente en las células del tumor.

Ejemplo 1 El promotor específico de hepatoma, el promotor de la \alpha-fetoproteína, enlazados con E1a

Se ha mostrado anteriormente el promotor de la \alpha-fetoproteína por ser muy activo en las células de hepatoma y silencioso en los hepatocitos adultos y otros tejidos adultos. Se usó un promotor de \alpha-fetoproteína de 4,9 kb que contenía el constructo para derivar el promotor. De manera alternativa, se podría fabricar también el promotor en función de las referencias disponibles.

Se fabricó el plásmido lanzadera del adenovirus pAVS21.TK1 (Figura 1), que tiene el gen TK bajo el control del promotor de \alpha-fetoproteína de 4,9 kb, tal como se describe en las Figuras 11 y 12 de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Chiang y col para la "Gene Therapy of Hepatocellular Carcinoma Through Cancer-Specific Gene Expresión", publicada el 18 de Mayo de 1995, que se incorpora en el presente documento como referencia por su enseñanza relevante. Se clonó pAVE1a02i (Figura 1), que coloca los genes E1a/E1b bajo el control del promotor de la \alpha-fetoproteína en un plásmido lanzadera de adenovirus, purificando un fragmento de restricción que contenía la región que codifica E1a únicamente y todo el gen E1b rompiendo el plásmido pSE280-E1 (figura 1) con SpeI y MunI y ligando este al pAVS21.TK1 roto con MunI y NheI. Se construyó el plásmido SE280-E1, que contiene el E1A ORF y todo E1b, tal como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nº 08/458.403 de Kadan y col para las "Improved Adenoviral vectors and Producer Cells", publicada el 2 de Junio de 1995, que se incorpora en el presente documento como referencia por su enseñanza relevante. Se cotransfectó pAVE1a02i con el fragmento CLAI más grande de Addl327 mediante procedimientos estándar en células 293 para generar el virus recombinante.

Construcción de un virus con el promotor AFP específico de hepatoma enlazado de manera operativa con el gen E1a

Se construyó el adenovirus AVE1a04i mediante la precombinación homóloga del plásmido lanzadera, pAVE1a04i (véase Figura 2) con el fragmento (Cla1) más grande del ADN AV1lacZ4 en células 293. Se ha descrito anteriormente la construcción del plásmido pAVE1a02i. La construcción de pAVEa04i es al menos idéntica a la de pAVE1a02i. pAVE1a02i contiene el promotor AFP completo. PAVE1a04i utiliza un derivado de este promotor, que tiene seis elementos silenciadores y una región mejoradora duplicada.

Se construyó el plásmido pAF(AB)_{2}(S_{d})_{6}-CAT colocando seis copias del silenciador distal inmediatamente corriente arriba de los 200 pares de bases basales del promotor AFP. Se colocaron dos copias de la región AB del mejorador, con orientación opuesta, inmediatamente corriente arriba de los elementos del silenciador. Se utilizó este promotor extendiendo a partir del elemento mejorador a través del promotor del AFP basal, para fabricar el virus E1a con AV/AFP corto con el plásmido lanzadera descrito en el presente documento. El elemento silenciador distal, el promotor basal, y los elementos mejoradores son tal como se describe en Nakabayashi y col. (Molec. & Cell. Biol. 11: 5885-5893 (1991)).

Se hizo crecer el plásmido pAVE1a04i en células STBL2 y se purificó mediante procedimientos de bandeado de cesio estándar antes del uso en la transfección. Se aisló el ADN genómico AV1lacZ4 a través del virus purificado mediante gradiente de cesio (descrito en el presente documento). Se digirió el virus purificado AV1lacZ4 con proteinaza K y se aisló el ADN mediante extracción con fenol / cloroformo. Se digirió el ADN purificado con Cla1 y se aisló el fragmento más grande mediante electroforesis en gel y se cuantificó. Se cotransfectaron 5 \mug del plásmido pAVE1a04i y 2,5 \mug del fragmento Cla1 más grande de AV1lacZ4 en células 293 usando un procedimiento de transfección mediado con fosfato de calcio (Promega, kit E1200). Se superpuso la placa de transfección con agarosa al 1% superpuesta y se incubó hasta que se formaron las placas. Una vez que se hubieron formado las placas, se cogieron y se liberó el virus en 500 \mul de medio IMEM mediante ciclos alternados de congelamiento y descongelamiento (5x).se reamplificaron las placas víricas eluidas en células A30 durante 48 horas y a continuación se lisaron las células para uso en la selección mediante PCR.

Se utilizaron cebadores específicos para el promotor AFP corto (sAFP) en el plásmido pAVE1a04i para identificar las placas posibles. La Figura 2A muestra que las placas víricas contienen una banda sAFP-específica del peso molecular predicho y específica para los cebadores sAFP. Para confirmar que este virus recombinante no estaba contaminado con Ad5dl327 (tipo salvaje), se utilizaron cebadores e1a. La Figura 2B demuestra que estaban presentes virus de tipo salvaje y que las secuencias del plásmido pAVE1a04i estuvieron presentes en el virus recombinante. La Figura 2C demuestra que AV1lacZ4 estaba poco o nada presente. Los datos indican la construcción de un virus con E1a bajo control de un promotor específico del tejido y que el virus es capaz de la replicación en células A30.

Se hicieron crecer placas individuales en células A30 y se analizaron mediante PCR para la presencia del promotor AFP (Figura 2). La flecha indica la banda específica de AFP generada a partir de PCR. La figura muestra que la banda está presente en cada uno de los virus en las placas seleccionadas (L6, L10, L11, M1 y M2). El control en el experimento fue en el lisado de células A30, no se esperaba que contuviera la banda. El experimento incluyó también la reacción PCR con el plásmido pAVE1a04i (el plásmido lanzadera a partir del cual se fabricó el virus y que por tanto produciría el fragmento específico de AFP). De esta manera, la Figura 2A confirma la presencia de un virus recombinante que contiene el promotor AFP. Las Figuras 2B y 2C confirman que estos resultados no son el resultado de contaminación en las placas individuales. La Figura 2B usa cebadores específicos de E1a para detectar la presencia de cualquier contaminación por virus de tipo salvaje. La flecha muestra la banda producida con cebadores específicos de E1a. La figura muestra que ninguno de los virus recombinantes produce la banda relevante. La figura 2C confirma que no existe contaminación de Av1.lacZ en las placas víricas (debido a que los virus se fabricaron utilizando ADN de AV1.lacZ). La figura indica que únicamente la ruta que contenía ADN de AV1.lacZ produce la banda.

Replicación vírica específica del tejido

Se diluyó en serie el lisado vírico citopático de este virus ("AVAFPE1a") en logs de 10 sobre células a549.30, células A549, y células HuH 7. Las células A549.30 expresan el E1a a partir del promotor del elemento receptor glucocorticoide (GRE) en presencia de dexametasona debido a que este constructo se integra en el genoma de esta línea celular. De esta manera, ningún virus E1a suprimido o ningún virus que no exprese E1a deberían ser capaces de replicarse en esta línea celular. Esto se ha mostrado anteriormente para vectores E1 suprimidos (comunicación sin publicar). Tal como se ha visto a partir de las Figuras 3A y 3D, el vector AVAFPE1 se replica en las células infectadas tal como se indicó mediante los efectos citopáticos característicos y extendiendo la muerte celular. Las células A549 no expresan AFP y no deberían ser capaces de transactivar el promotor AFP. De manera adicional, las células A549 no expresan E1a. De esta manera, AVAFPE1a no debería ser capaz de replicarse en esta línea celular. Tal como se ha visto a partir de las Figuras 3B y 3E, ambos pocillos sin infectar e infectados deberían parecer idénticos sin efectos citopáticos característicos o la extensión observada en todas las diluciones ensayadas. Las células HuH 7 expresan AFP, deberían transactivar el promotor AFP, y deberían fabricar E1a con la replicación subsiguiente. Tal como se muestra en las Figuras 3C y 3F, AVAFPE1a se replica claramente, tal como se indicó mediante los efectos citopáticos. De manera adicional, en diversos pocillos de células HuH 7 infectadas, la replicación comienza con una placa única que se extiende a lo largo del resto de pocillo durante una semana. Se ensayaron todos los pocillos HuH 7 que muestran efectos citopáticos mediante PCR y se demostró que estaban libres de virus de tipo salvaje y virus AV1LacZ4, y contienen un promotor AFP intacto. Estos datos indican claramente que se ha construido un virus que es capaz de replicarse de manera específica en las células del tumor que expresan AFP.

Ejemplo 2 Mejorador DF3-Mucina específico del cáncer de mama

El antígeno asociado con el carcinoma de mama DF3 (MUC1) se sobreexpresa mucho en carcinomas de mama humanos. La expresión del gen se regula al nivel transcripcional. La secuencia de ADN entre -485 - 588 es necesaria y suficiente para conferir un incremento mayor de 10 veces en la transcripción del gen indicador CAT cuando se coloca inmediatamente corriente arriba de un promotor basal derivado del promotor TK del Herpesvirus en los ensayos de transfección no estacionaria llevados a cabo en la línea celular del cáncer de mama humano MCF-7. Se ha encontrado un factor de transcripción específico que enlaza con esta región del ADN dentro de células derivadas de la línea celular del cáncer de mama MCF-7 pero no de la línea celular del cáncer no de mama HL-60. Se ha encontrado que la misma región de ADN promueve la expresión específica del cáncer del gen TK en el contexto de un constructo retrovírico o un constructo adenovírico. Se sintetizó el mejorador DF3 entre -598 y -485 (obtenido del GenBank) construyendo cuatro oligonucleótidos sintetizados de esta manera que se superpondrían y se fundirían. En la tabla 1 se muestran los oligonucleótidos. Se añadieron emplazamientos de restricción adicionales sobre ambos extremos para futura facilidad de clonación. Se mantuvo un extremo romo para permitir la clonación en el emplazamiento SmaI del vector pTK-Luc. Este vector contiene el promotor basal del gen TK del Herpesvirus que proporciona un nivel de actividad basal bajo en una variedad de células. Este se usó como fuente de este promotor basal. El otro extremo tenía un emplazamiento BgIII de superposición para facilitar la clonación en e emplazamiento BgIII de pTK-Luc. Se fundieron 1.000 ng de cada oligonucleótido en Tris 0,017 M, pH 8,0, NaCl 0,16 M en un volumen total de 26,5 \mul calentando a 95ºC durante dos minutos y dejando enfriar a temperatura ambiente tras algunas horas. Finalmente, se ligó 1 \mul de esta mezcla con 100 ng del vector SmaI/BgIII anteriormente purificado - y vidrio opalino (BIO 101)- mediante condiciones estándar. Tras la transformación en células DH5\alpha (GIBCO), se seleccionaron las colonias para la presencia del inserto mediante digestión con restricción estándar. Se rompió a continuación el ADN derivado de este vector con HindIII y se enromó mediante Klenow. Este se rompió mediante AscI. Este fragmento, que contiene el mejorador DF3 recubierto con el promotor TK basal, se purificó a continuación mediante electroforesis en gel de agarosa y vidrio opalino y se ligó con el plásmido pAVE1a02i se rompió con Spe I y se enromó con AscI y se purificó tal como anteriormente. El plásmido resultante tiene el producto de gen E1A bajo el control del mejorador DF3 y el promotor TK basal y está en un plásmido lanzadera adenovírico. Se cotransfectaron 5 \mug de este plásmido, pAVE1a03i, con 5 \mug del fragmento del brazo CLAI derecho, derivado de Addl327, en células 293. Se seleccionaron las placas para el virus recombinante esperado mediante procedimientos estándar.

Se utilizó un lisado de virus crudo para infectar MCF-7 en un MOI de 10. Se confirmaron los stocks de virus para replicarse de manera específica en células de cáncer de mama mediante procedimientos estándar. Se amplificó el virus en células MCF-7 y/o 293 células tal como se ha descrito para la amplificación y purificación en las 293 células. Se ensayaron los stocks de virus para la replicación in vivo utilizando un modelo en modo ratón de MCF-7 y, como control negativo, se utilizó un tumor derivado cáncer cervical (Hela). Se ensayó el virus para un episodio recombinacional en células 293 que generarían un virus de tipo salvaje mediante el ensayo del promotor E1A original que estaría sólo en un virus de tipo salvaje. Se ensayaron también una variedad de diferentes líneas celulares de cáncer de mama en rata y ser humano y líneas celulares no relacionadas. Se puede insertar el gen TK en la región E3 y haber manejado TK bien mediante el promotor dependiente de E1A presente o bajo el control del promotor RSV o CMV.

Ejemplo 3 Promotor de la tirosinasa específico del melanoma

Se usaron PCR y cebadores PCR para clonar un fragmento de ADN de 800 bp corriente arriba del gen de la tirosinasa de ADN genómico de ratón utilizando PFU y los cebadores descritos tal como se han descrito por Stratogene. El fragmento PCR resultante se clonó en pCRSCRIPT y a continuación se volvió a clonar en pAVE1a02i digiriendo el nuevo plásmido con AscI/SpeI y pAVE1a01i con AscI/SpeI y ligando los dos conjuntamente. Se utilizó el plásmido lanzadera final, pAVE1a04i, que tiene E1a/E1b bajo el control del promotor de la tirosinasa, para fabricar un virus recombinante de manera idéntica a como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 4 Promotor CEA específico del cáncer de cólon

Se clonó el promotor CEA a partir de ADN genómico humano tal como se ha descrito anteriormente y se clonó de una manera similar en el plásmido pAVE1a01i usando los cebadores que se muestran en la Tabla 1. Se utilizó el plásmido lanzadera final, pAVE1a05i para generar el virus recombinante tal como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 5 A. Sustitución del promotor de E2a en un vector adenovírico con un promotor específico del tumor

Los constructos fabricados tal como anteriormente tendrían la proteína E2a (esencial para la replicación vírica expresada sólo en células tumorales). Por tanto, la replicación del vector se produce sólo en células tumorales. Se usaron cuatro de estos promotores muy específicos (en los ejemplos anteriores) para colocar la región que codifica e2a obtenida a partir de pSE280-E2a (véase la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Kayden y col., "Improved adenoviral vectors and producer cells" publicada el 2 de Junio de 1995) bajo el control de este promotor específico del tumor. Se recombinó el plásmido resultante con Addl327, utilizando procedimientos estándar de recombinación homóloga. Se hizo crecer el virus final en las líneas celulares descritas en la solicitud de patente anteriormente mencionada o en las líneas celulares específicas del tumor. La proteína e2a, debido a que se necesita en cantidades estequiométricas, tiene la capacidad de regular el grado de replicación sobre un amplio intervalo. Esto es deseable para la terapia. Los procedimientos usados son los mismos descritos a los de e1a. La diferencia es que se usa el plásmido lanzadera que coloca E2a bajo el control del promotor específico del tumor y retorna este al esqueleto del virus (mediante recombinación homóloga) que tiene los genes E2a y E3 suprimidos.

B. Sustitución de diferentes genes tóxicos terapéuticos en vectores competentes de la replicación específicos del tumor

Se pueden colocar genes como TK, citoquinas, o cualquier gen terapéutico en la región E3 del esqueleto del vector mediante la construcción del plásmido estándar y la recombinación homóloga. Se pueden colocar aquellos genes bajo el control de un promotor dependiente de E1a, o un promotor constitutivo tal como RSV o CMV.

TABLA 1 Cebadores de oligonucleótido para construir promotores específicos de tejidos

1

100

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Genetic Therapy, Inc.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vectores para replicación con especificidad celular

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Sterne, Kessler, Goldstein & Fox P.L.L.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1100 New York Avenue NW

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Washington

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: D.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 20005-3934

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release#1.0, Version #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: (a determinar))

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-NOV-1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FECHA DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/487,992

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-JUN-1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

FECHA DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/348,258

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-NOV-1994

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

ABOGADO/ REPRESENTANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Goldstein, Jorge A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 29.021

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/ NÚMERO DE EXPEDIENTE: 1136.002PC02

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (202) 371-2600

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (202) 371-2540

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 248636 SSK

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 66 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:1:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC. ID. Nº:2:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 63 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:3:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:4:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCCGGGCG CGCCGGAGCA GTGCTATTCA AACCATCCAG

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGATCTAC TAGTTCTGCA CCAATAGGTT AATGAGTGTC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCCGGGCG CGCCTCTGTC ACCTTCCTGT TGG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGATCTAC TAGTTCTCTG CTGTCTGCTC TGTC

\hfill

34

Claims (13)

1. Un vector adenovírico capaz de la replicación específica del tejido que comprende una secuencia reguladora transcripcional específica del tejido enlazada de manera operativa con la región de codificación del gen E1a de dicho vector.

2. El vector de la reivindicación 1, en el que la secuencia reguladora transcripcional se selecciona entre el grupo constituido por promotores y mejoradores.

3. El vector de la reivindicación 2, en el que dicho promotor se selecciona entre el grupo constituido por \alpha-fetoproteína, DF3, tirosinasa, CEA, tensioactivo, y ErbB2.

4. El vector de la reivindicación 1, en el que dicho vector contiene una secuencia de codificación heteróloga que es capaz de ser expresada a partir de dicho vector.

5. El uso del vector adenovírico condicional de la replicación que contiene un polinucleótido, en el que el gen E1a se enlaza de manera operativa con la secuencia reguladora transcripcional que funciona de manera específica en un tejido de tal manera que se produce la replicación del vector en dicho tejido y no en un tejido en el que no funciona dicha secuencia reguladora transcripcional, en la fabricación de un agente para el tratamiento de un tumor.

6. el uso de la reivindicación 5, en el que la secuencia reguladora transcripcional se selecciona entre el grupo constituido por promotores y mejoradores.

7. el uso de la reivindicación 6, en el que el promotor se selecciona entre el grupo constituido por \alpha-fetoproteína, DF3, tirosinasa, CEA, tensioactivo y erbB2.

8. El uso de la reivindicación 5, en el que dicho tejido es un tejido tumoral.

9. El uso de la reivindicación 5, en el que dicho vector codifica un producto de gen heterólogo, y en el que dicho vector expresa dicho producto de gen heterólogo en las células de dicho tejido.

10. El uso de la reivindicación 9, en el que dicho producto de gen heterólogo proporciona actividad antitumoral en las células de dicho tejido.

11. Una célula que contiene un vector adenovírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 capaz de la replicación específica del tejido, comprendiendo dicho vector una secuencia reguladora transcripcional específica del tejido enlazada de manera operativa con la región de codificación del gen E1a de dicho vector, en el que dicha secuencia reguladora transcripcional funciona en dicha célula de tal manera que se produce la replicación del vector en dicha célula.

12. Un procedimiento de producir un vector capaz de la replicación específica del tejido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 11 y recuperar dicho vector a partir de dicha célula.

13. Una composición farmacéutica que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.