ES2279636T3 - Vectores viricos de replicacion selectiva. - Google Patents

Abstract

Un vector vírico recombinante de replicación selectiva que comprende un promotor que responde a una ruta, operativamente ligado a un represor de la replicación vírica, vector que se replica de manera selectiva en células neoplásicas que poseen un defecto en la ruta a la que el promotor responde.

Description

Vectores víricos de replicación selectiva.

Antecedentes de la invención

Los adenovirus recombinantes se utilizan actualmente para la entrega de transgenes terapéuticos en diversos regímenes terapéuticos. Sin embargo, el amplio nivel de infectividad de estos sistemas de vectores ha suscitado la preocupación de que la expresión del virus en células no tumorales pudiera causar daños colaterales a las células no neoplásicas. Por consiguiente, se han elaborado una extensa variedad de sistemas de direccionamiento para expresar preferentemente el transgén en un tipo de célula determinado. Se han utilizado promotores específicos de tejido y promotores específicos de tumor para replicar preferentemente el vector en determinados tipos de células. Por ejemplo, la solicitud de Patente internacional Núm. PCT/US96/10838 publicada el 16 de enero de 1.997 (Publicación internacional Núm. WO97/01358) describe el uso de vectores que se replican en una célula hospedadora específica mediante el uso de elementos de promotor específicos de próstata que dirigen las funciones de E1, E2 o E4, que contienen opcionalmente una casete de expresión de un transgén citotóxico. En particular, esta publicación describe una construcción en la que una secuencia estimuladora de la transcripción, específica de próstata, controla la expresión de E1 y contiene una casete de expresión que comprende el promotor de CMV que dirige la expresión del gen de la citosina-desaminasa que está insertado en la región E3. Estos vectores son competentes en la replicación y pueden ser empaquetados en forma de viriones intactos en un tipo de célula particular.

Una estrategia alternativa al uso de promotores específicos de tumores para dirigir la replicación vírica es emplear deleciones específicas en la secuencia codificadora de la proteína adenovírica E1b55K. Los adenovirus recombinantes que contienen defectos en la secuencia de nucleótidos que codifica E1b55K se encuentran descritos en la Patente de EE. UU. Núm. 5.677.178, expedida el 14 de octubre de 1.997. Sin embargo, se ha observado que estos elementos de control específicos de tejido o específicos de tumor presentan "escapes", es decir, permiten la replicación en tipos de células distintas de las células diana preferidas.

Alternativo a este tipo de vector de replicación selectiva es el empleo de un vector adenovírico deficiente en la replicación y que contiene una eliminación extensa de la función E1. En particular, se han utilizado vectores que contienen la eliminación de E1, E2, E3 y deleciones parciales de E4 para la entrega de transgenes exógenos. Esos vectores se han utilizado para la entrega del gen p53 a células diana. Se ha demostrado que la expresión de un gen p53 de tipo salvaje, administrado de manera exógena, en una célula tumoral deficiente en p53 (p53 mutada o p53 nula) es capaz de inducir una apoptosis mediada por p53 en la célula tumoral. Esos vectores víricos para la entrega de p53, están actualmente en desarrollo por la Schering Corporation y la Introgen Corporation. También estos vectores han presentado perfiles toxicológicos y una eficacia terapéutica aceptables para aplicaciones terapéuticas humanas, y en el hombre están en estudios clínicos de Fase II para el tratamiento de enfermedades malignas relacionadas con p53.

Los vectores deficientes en la replicación y los vectores de replicación selectiva presentan, al menos en teoría, inconvenientes de diseño que son motivo de preocupación para los médicos. Debido a que los vectores deficientes en la replicación no se van a propagar de manera incontrolada en el paciente, teóricamente presentan un perfil de seguridad más deseable. Sin embargo, debido a que la eliminación efectiva de un tumor requiere la infección de la mayoría sustancial de las células tumorales que están siendo infectadas, comúnmente se usa un exceso en moles sustancial del vector para asegurar la eficacia terapéutica. Los vectores de replicación selectiva se contemplan como más que una simple cuestión desde una perspectiva de seguridad debido a la capacidad que tienen para replicarse y para potencialmente mutar en el paciente y formar vectores plenamente competentes en la replicación. Sin embargo, manteniendo la capacidad natural del virus para propagarse en condiciones particulares se permite que estos vectores se extiendan a las células tumorales circundantes. Debido a que estos vectores tiene por sí mismos capacidad para replicarse, se requiere una dosis inicial más baja de esos vectores. Esto es favorable desde una perspectiva inmunológica así como por razones económicas en la fabricación de esos agentes. Por lo tanto en la técnica se necesita un vector de replicación selectiva que afronte a los problemas de seguridad percibidos y que al tiempo que proporcione el aumento del índice terapéutico.

El documento WO 9839464 se refiere a vectores adenovíricos específicos de células diana y a métodos para usar esos virus. La replicación de adenovirus se puede restringir a las células diana por medio de un control transcripcional con elementos reguladores de la transcripción heterólogos, específicos de célula, de manera que los vectores adenovíricos se repliquen en las células diana y proporcionen una citotoxicidad específica del tipo de célula, en particular a células neoplásicas.

El documento WO 9821228 se refiere a proteínas de fusión de un polipéptido E2F con un polipéptido RB, que son eficaces como represores. También se recomienda la expresión específica de tejido de estas construcciones. Se recomienda el uso de adenovirus como sistema vector preferido.

Elsing y col. ((1998) PNAS 95 (17) 10072-10077) describen la observación de que la alteración del ORF 14,5K de adenovirus rescata la expresión de FAS/APO-1 en la superficie de células infectadas con adenovirus.

El documento WO9418992 se refiere a métodos y composiciones para tratar enfermedades neoplásicas mediante una terapia basada en virus. Virus mutantes que carecen de proteínas víricas que se unen o que inactivan a p53 y/o RB se administran a un paciente que presenta una neoplasia que comprende células que carecen de las funciones de p53 y/o RB. Esto tiene como fin generar preferentemente un fenotipo de replicación en las células neoplásicas que da como resultado la destrucción preferencial de las células neoplásicas.

Mori y col. ((1997) Blood 90 (12) 4924-4932) describen que la expresión de determinados genes del virus HTLV-1 es reprimida por proteínas p53 funcionales. En las células en las que la función p53 está suprimida, se observa una expresión alta de genes víricos (regulada por el producto del gen Tax), que da lugar al establecimiento de una infección vírica productiva.

La presente invención soluciona estos problemas proporcionando un vector adenovírico de replicación selectiva que contiene un promotor que responde a una ruta y dirigido a una ruta, que dirige la expresión de un represor de la replicación vírica de manera que el vector se replica preferentemente en células defectivas en esa ruta. La presente invención también proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden esos vectores. La presente invención también proporciona métodos para eliminar células defectivas en una ruta en una población de células normales usando esos vectores.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona virus recombinantes que replican el genoma vírico de manera selectiva en respuesta a las condiciones intracelulares de la célula diana, a través del uso de un promotor que responde a una ruta, que dirige la expresión de un inhibidor de la replicación vírica, que inhibe sustancialmente la replicación vírica en la célula hospedadora de acuerdo con el estado fenotípico o del estado genotípico de la célula infectada. En la célula diana, el elemento del promotor, del promotor que responde a una ruta, está inactivo y por ello se permite al virus que se replique. Esto da como resultado: (1) la muerte de las células producida por la naturaleza lítica natural del virus, y/o (2) proporciona una dosis terapéutica de un producto transgénico (amplificado en comparación con los vectores no competentes en la replicación) a la célula diana, y (3) la producción de una concentración localizada del virus que facilita la infección de las células diana circundantes al virus recombinante. La invención proporciona además métodos terapéuticos y de diagnóstico para usar los vectores, formulaciones farmacéuticas que comprenden estos vectores, métodos para fabricar los vectores y células transformadas que comprenden estos vectores.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Se generaron resultados de un ensayo de CPE para determinar el efecto citopático de vectores adenovíricos recombinantes que codifican una secuencia que codifica la fusión E2F-Rb bajo el control o de un promotor (PAI o SRE) que responde a la ruta del TGF-\beta o de un promotor (RGC o p53CON) que responde a la ruta de p53. Además, el gen que codifica la proteína fluorescente verde se incorporó también en los vectores como gen reportero. En el Recuadro A se representan las células MRC-9, en el Recuadro B se representan células Hep3B y en el Recuadro C se representan las células WIDR. Pista 1: adenovirus recombinantes deficientes en la replicación (E1 delecionado) que expresan la proteína fluorescente verde (GFP) (del inglés, " Green Fluorescent Protein"); Pista 2: PAI-Ad; Pista 3: SRE-Ad; Pista 4: RGC-Ad; Pista 5: p53CON-Ad. Las concentraciones de las partículas son las indicadas a la derecha de la Figura.

Figura 2. Resultados de una microscopia de fluorescencia (recuadros superiores) que ilustran la expresión de GFP con vectores dirigidos a rutas. El Recuadro A representa el vector de control GFCB, el Recuadro B representa el vector SRE-Ad y el Recuadro C representa el vector p53CON-Ad. La infección se realizó con 5 x 10^{5} partículas por mililitro.

Figura 3. Resultados de la infección de células normales del epitelio bronquial (Recuadro A) y de células C33A (Recuadro B) con los virus recombinantes U3EE (cuadrados), T1LT (círculos) y L9IU (triángulos). Los ejes verticales representan el porcentaje de los controles no infectados y los ejes horizontales representan la dosis vírica expresada en partículas por mililitro. Los experimentos se realizaron exponiendo un cultivo de cada uno de los tipos de células a seis concentraciones diferentes de virus desde 10^{5} hasta 10^{9} partículas víricas por mililitro. Las células se expusieron a los virus durante un período de tiempo de una hora, el virus en exceso se lavó y el porcentaje de células viables a los seis días de la infección se determinó con el ensayo de MTS (Promega, Madison WI) en sustancial acuerdo con las instrucciones del fabricante. La línea horizontal representa el nivel al que el 50% de las células siguen siendo viables. La intersección de las curvas generadas con los datos y la línea de puntos horizontal es una medida de la ED_{50} del virus.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un vector vírico recombinante de replicación selectiva que comprende un promotor que responde a una ruta, operativamente ligado a un represor de la replicación vírica, vector se replica de manera selectiva en células neoplásicas que poseen un defecto en la ruta a la que el promotor responde.

La expresión "de replicación selectiva" se refiere a un vector que es capaz de replicarse preferentemente en una célula que está en un estado fenotípico determinado en comparación con cuando esa célula está en otro estado fenotípico. Ejemplos de estados fenotípicos diferentes incluirían la célula defectiva en la ruta de p53 frente a una célula normal de un tipo celular determinado. Por virus que exhibe replicación diferencial se indica que ese virus se replica al menos 5 veces igual de eficientemente en el tipo de la célula diana que en una célula normal (de control) del mismo tipo, a un nivel de dosificación determinado. Con el fin de determinar si un virus es verdaderamente selectivo, es necesario evaluar la capacidad de ese virus para replicarse en las células diana en comparación con la capacidad para replicarse en células normales del mismo tipo celular, teniendo en cuenta varios factores.

Se prefiere comparar la capacidad de un vector determinado para replicarse en una célula diana que tiene la condición de ser la célula a la que el vector va dirigido, con la capacidad para replicarse en una célula normal del mismo tipo que no posee esta condición. Por ejemplo, la primera etapa después de la infección vírica consiste en inducir a la célula a que entre en el ciclo celular porque los factores esenciales para una eficiencia máxima de la replicación vírica se encuentran presentes solamente en la fase S. Sin embargo, cuando se trata de evaluar la selectividad de un vector en relación con una selectividad hacia células tumorales, la evaluación de la capacidad para replicarse en una célula tumoral en comparación con la capacidad para replicarse en otra célula que ya ha entrado en el ciclo celular (tal como una línea de células inmortalizadas o de células transformadas), la selectividad del virus por las células tumorales estará en cierta medida ensombrecida. Además, se ha observado que diferentes tipos de células poseen infectividades que difieren enormemente en relación con un virus determinado. Aunque algunos virus tales como los adenovirus, poseen un amplio tropismo hacia tejidos, otros virus son más restrictivos en cuanto al tipo de células a las que infectan. Al intentar evaluar la eficacia de un vector determinado en células de infectividades muy diferentes, será difícil determinar con certeza si una falta de efecto es debida a la eficacia del vector en esa célula o si es simplemente debida a un fallo del virus para infectar la célula. Evaluando la selectividad en células diana y en células normales de un tipo determinado, se minimiza este efecto de la infectividad.

La naturaleza temporal del ciclo de vida vírico se debe tener también en consideración. Por ejemplo, incluso un vector de tipo salvaje puede parecer que posee selectividad en células tumorales comparándolas con células normales poco después de la infección debido a que la célula ha iniciado ya un ciclo celular. Sin embargo, esta selectividad aparente disminuye a lo largo del tiempo una vez que el virus ha estimulado el ciclo celular. Por consiguiente, el tiempo en el que la selectividad se evalúa después de la infección debe ser suficiente para esquivar este retraso de la replicación inicial en las células normales. Aunque esto variará con el tipo de virus que se esté utilizando, este retraso inicial pude ser determinado con facilidad por un experto en la técnica.

También se debe tener en cuenta el efecto de la dosificación en la determinación de si un adenovirus recombinante determinado demuestra un efecto selectivo en el tipo de célula diana. Por ejemplo, si se tiene como objetivo la eliminación de células tumorales y la medida de este efecto mediante medida de la citotoxicidad, se puede preparar un virus que parezca tener una citotoxicidad selectiva, en dosificaciones diferentes. Se ha observado que a una dosis suficientemente alta, casi todos los virus, independientemente del grado en el que su genoma se haya modificado, serán citotóxicos debido simplemente a los efectos de la presencia de las proteínas víricas (tales como la proteína hexón en el caso de adenovirus) que se sabe que son citotóxicas. Del mismo modo, aunque la literatura científica puede hacer referencia a un virus como "defectivo en la replicación" (lo que sugiere que ese virus es totalmente incapaz de replicarse en ausencia de una línea celular capaz de complementar el defecto vírico), esos virus se describen de manera más precisa como virus "atenuados en la replicación". Por ejemplo, los adenovirus que contienen una deleción de la región E1 completa, a los que frecuentemente se les denomina virus "deficientes en la replicación" o "defectivos en la replicación", se replicarán en la misma medida, en particular en células que están en el ciclo de división celular o en células que se dividen de manera rápida. Según lo observado por Mulligan (1990, Science 260: 926-932):

Aunque se ha observado que la expresión de la región E1 afecta a la expresión de otros productos de genes víricos necesarios para la replicación (citando a Horwitz, M. en Virology, B.N. Fields Ed. (Raven, Nueva York, 1990) Capítulo 60)), la necesidad de la expresión del gen E1 para la replicación vírica no parece que sea absoluta. La caracterización temprana de virus deficientes en E1 muestra que a valores altos de multiplicidad de infección, se podía prescindir de la región E1 para la replicación (citando a Jones y Shenk (1979) PNAS (EE. UU.) 76(8): 3665-3669).

Por consiguiente, el efecto de la dosis vírica no puede ser ignorado cuando se determina si un virus se está o no se está replicando de manera selectiva.

Uno de los medios para evaluar la selectividad de replicación de un virus en relación con las células diana es evaluar el "índice de selectividad" del virus de la siguiente manera. El parámetro ED_{50} comúnmente utilizado (que se define como la dosis suficiente para inducir la muerte celular en el 50% de las células) proporciona una base apropiada para la comparación. El ED_{50} de un virus se puede determinar fácilmente mediante experimentos típicos de escalado de la dosis in vitro. Con el fin de asegurar la base más consistente para la comparación, el ED_{50} se expresa más apropiadamente en relación con un control vírico para minimizar los efectos de las variaciones de infectividad entre los tipos de células que se están comparando y las variaciones de los análisis. Por consiguiente, el cociente sin unidad: ED_{50} (virus)/ED_{50} (control) se usa para expresar la toxicidad relativa del virus en la célula y se le denominará "índice de toxicidad relativo" o "RTI". El "índice de selectividad" de un virus determinado se expresa por medio del cociente: RTI (células diana)/RTI (células normales). Los vectores de replicación selectiva poseerán un índice de selectividad de al menos 10, pero preferiblemente de 50, 100 o mayor.

Por ejemplo, los vectores adenovíricos U3EE y T1LT de replicación selectiva están diseñados para obtener una replicación selectiva y para destruir las células tumorales que presentan defectos en la ruta de p53. El vector U3EE se prepara en acuerdo sustancial con las enseñanzas de los ejemplos que aquí se incluyen. Brevemente expuesto, el virus U3EE contiene una primera casete de expresión que comprende un elemento que responde a p53 (p53CON) que dirige la expresión de la proteína de fusión E2F-Rb. La proteína de fusión E2F-Rb es un potente inhibidor de la actividad del promotor adenovírico de E2 y su presencia en la célula suprimirá eficazmente la replicación vírica. El elemento que responde a p53 está activo en respuesta a la presencia de una ruta de p53 funcional. Por consiguiente, en células normales en las que la ruta de p53 está intacta, el virus U3EE expresará la proteína de fusión E2F-Rb y el virus no se replicará. Sin embargo, en las células que presentan un defecto en la ruta de p53 (la mayoría de las células tumorales) el elemento de respuesta p53CON no está activo y por lo tanto no hay represión de la replicación vírica. El vector U3EE contiene también una casete de expresión que comprende el promotor MLP que dirige la expresión del gen pro-apoptósico de E3-10,5K de Ad5. Se prefiere el uso de los promotores temporales (tales como el promotor MLP) cuando se van a utilizar genes pro-apoptósicos, debido a que lo que se quiere es facilitar la replicación del DNA vírico dentro de la célula diana antes de activar la señal pro-apoptósica. El promotor MLP se activa aproximadamente a las siete horas de la infección, después del comienzo de la replicación del genoma de U3EE, induciendo así la actividad de la proteína E3-10,5K. El vector adenovírico T1LT es esencialmente el mismo que el vector U3EE excepto porque contiene una deleción adicional en la región E1a para eliminar los aminoácidos 4-25 de las proteínas E1a adenovíricas 243R y 289R. Esta deleción destruye la capacidad de la proteína p300 para unirse a estas proteínas E1a.

Los virus U3EE y T1LT se evaluaron con respecto a su capacidad para replicarse en, y para destruir, células normales del epitelio bronquial humano (NHBE) y células C33A (línea de células epiteliales tumorales que presentan una ruta de p53 defectiva) usando el vector L9IU como control. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Figura 3 de los dibujos que se adjuntan. La siguiente tabla resume los datos presentados:

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Como puede observarse a partir de los datos presentados, los virus U3EE y T1LT poseen una selectividad alta por las células tumorales. Como se ha comentado previamente, el virus L9IU posee una ligera ventaja en la replicación en las células tumorales que están en ciclo de división celular con respecto a las células normales quiescentes. Al comparar los cocientes ED_{50} (virus)/ED_{50} (control) de cada uno de los tipos de células antes de calcular el índice de selectividad, los efectos de estas variaciones se minimizan.

El término "recombinante" se refiere a un genoma que ha sido modificado a través de técnicas convencionales de DNA recombinante.

El término "virus" se refiere a cualquiera de los parásitos intracelulares obligados que carecen de un mecanismo para sintetizar proteínas o para generar energía. El genoma vírico puede ser RNA o DNA contenido en una estructura recubierta de proteína de una membrana lipídica. Ejemplos de virus útiles en la práctica de la presente invención incluyen baculoviridiae, parvoviridiae, picornaviridiae, herpesviridiae, poxiviridiae, adenoviridiae, picomaviridiae. La expresión virus recombinante incluye virus quiméricos (o incluso multiméricos) es decir, vectores construidos usando secuencias codificadoras complementarias, procedentes de más de un único subtipo vírico. Véase, p. ej., Feng y col. Nature Biotechnology 15: 866-870.

El término "adenovirus" es sinónimo a la expresión "vector adenovírico" y se refiere a los virus del género de los adenovirus (familia adenoviridiae). El término adenoviridiae se refiere de manera colectiva a adenovirus animales del género mastadenovirus, que incluyen pero que no se limitan a ellos, subgéneros de adenovirus humanos, bovinos, ovinos, equinos, caninos, porcinos, murinos y de simios. En particular, la expresión adenovirus humanos incluye los subgéneros A-F así como sus serotipos individuales y los subgéneros A-F que incluyen, pero que no se limitan a ellos, los tipos de adenovirus humanos 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, (Ad11A y Ad11P), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 91. La expresión adenovirus bovinos incluye, pero no se limita a ellos, los tipos de adenovirus bovinos 1, 2, 3, 4, 7 y 10. La expresión adenovirus caninos incluye, pero no se limita a ellos, los tipos caninos 1 (cepas CLL, Glaxo, RI261, Utrect, Toronto 26-61) y 2. La expresión adenovirus equinos incluye, pero no se limita a ellos, los tipos equinos 1 y 2. La expresión adenovirus porcinos incluye, pero no se limita a ellos, los tipos porcinos 3 y 4. En la práctica preferida de esta invención, el adenovirus deriva de los serotipos 2 ó 5 de adenovirus humanos.

La expresión "promotor que responde a una ruta" se refiere a secuencias de DNA a las que se une una determinada proteína y que hacen que genes cercanos den una respuesta transcripcional a la unión de esa proteína en células normales. Esos promotores se pueden generar incorporando elementos de respuesta que son secuencias a las que se unen factores de la transcripción. Estas respuestas son generalmente inductivas, aunque hay algunos casos en los que al aumentar los niveles de la proteína disminuyen la transcripción. Los promotores que responden a una ruta pueden ser promotores presentes en la naturaleza o promotores sintéticos. Los promotores que responden a una ruta se construyen típicamente tomando como referencia esa ruta o a una proteína funcional a la que se dirigen dirigida. Por ejemplo, un promotor presente en la naturaleza que responde a la ruta de p53, incluiría elementos de control transcripcional que se activan por la presencia de una p53 funcional, tales como el promotor de p21 o el promotor de bax. Como alternativa, se pueden emplear promotores sintéticos que contienen sitios de unión a p53 en dirección aguas arriba de un promotor mínimo (p. ej., la región de la caja TATA de SV40) para crear un promotor sintético que responde a una ruta. Los promotores sintéticos que responden a una ruta generalmente se construyen a partir de una o más copias de una secuencia que se aparea con un motivo consenso de unión. Estos motivos consenso de unión de un DNA son fáciles de determinar. Estas secuencias consenso están generalmente ordenadas en forma de una repetición directa o repetición cabeza-cola separada por unos cuantos pares de bases. Los elementos que incluyen repeticiones cabeza-cabeza, (p. ej., AGGTCATGACCT) se denominan palíndromes o repeticiones inversas y los elementos que incluyen repeticiones cola-cola se denominan repeticiones evertidas.

Ejemplos de promotores que responden a rutas, útiles en la práctica de la presente invención, incluyen promotores sintéticos que responden a la ruta de la insulina y que contienen la secuencia consenso de unión a insulina (Jacob y col. (1995) J. Biol. Chem. 270: 27773-27779), el promotor que responde a la ruta de las citoquinas, el promotor que responde a la ruta de los glucocorticoides (Lange y col. (1992) J. Biol. Chem. 267:15673-15680), los promotores que responden a las rutas de IL-1 e IL-6 (Won K.-A. y Baumann H. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3965-3978), promotores que responden a la ruta de T3, promotores que responden a la ruta de la hormona tiroidea y que contienen el motivo consenso: 5'AGGTCA 3', promotores que responden a la ruta de TPA (TRE), promotores que responden a la ruta del TGF-\beta (según se describen en Grotendorst y col. (1996) Cell Growth and Differentiation 7: 469-480). Ejemplos de otros promotores que responden a rutas son muy conocidos en la técnica y pueden ser identificados en la Base de Datos de Regiones Reguladoras de la Transcripción en genomas eucariotas, accesibles a través de internet en la dirección http://www.eimb.rssi.ru/TRRD.

En la práctica preferida de la invención según aquí se ilustra con ejemplos, el vector comprende un promotor sintético que responde a la ruta de TGF-\beta, activo en presencia de una ruta de TGF-\beta funcional, tal como el promotor que contiene elementos de respuesta SRE y PAI-RE. PAI-RE se refiere a un elemento sintético de respuesta a TGF-\beta, que comprende secuencias que responden a la señal TGF-\beta aislada de la región del promotor del activador I del plasminógeno. La construcción de PAI-RE se describe en el Ejemplo 3 aquí incluido. El promotor que responde a la ruta de PAI-RE se puede aislar en forma de un fragmento de 749 pares de bases, aislable procedente del plásmido p800luc (según se describe en Zonneveld y col. (1988) PNAS 85: 5525-5529 y disponible procedente de GenBank con el número de registro J03836). SRE se refiere a un elemento sintético de respuesta a TGF-\beta, que comprende una repetición de 4 de las secuencias de unión a DNA de Smad-4 (GTCTAGAC según se describe en Zawel y col. (1988) Mol. Cell 1: 611-617). La construcción de SRE se describe en el Ejemplo 3 aquí incluido. El elemento de respuesta SRE se puede generar hibridando oligonucleótidos complementarios que codifican las secuencias de unión a Smad-4 y clonándolos en el vector formado por plásmido pGL3-promotor de la luciferasa (comercialmente disponible procedente de Promega).

De manera similar, un "promotor que responde a la ruta de p53" se refiere a un elemento de control transcripcional activo en presencia de una ruta de p53 funcional. El promotor que responde a la ruta de p53 puede ser una región de control transcripcional presente en la naturaleza, activa en presencia de una ruta de p53 funcional, tal como el promotor de p21 o de mdm2. Como alternativa, el promotor de respuesta a una ruta de p53 puede ser una región sintética de control transcripcional, activa en presencia de una ruta de p53 funcional, tal como los promotores que responden a rutas SRE y PAI-RE. p53-CON describe un promotor que responde a la ruta de p53 y que contiene un elemento sintético de respuesta a p53, construido mediante inserción de dos secuencias consenso sintéticas de p53, de unión a DNA (según se describe en Funk y col., (1992) Mol. Cell Biol. 12: 2866-2871) en dirección aguas arriba de la caja TATA de SV40. La construcción del promotor p53-CON que responde a una ruta se describe en el Ejemplo 3 aquí incluido. RGC (del inglés, " Ribosomal Gene Cluster") se refiere a un promotor sintético que responde a la ruta de p53, que usa un dominio único de unión a p53 identificado en la agrupación de genes ribosomales. Kern y col., (1991) Science 252: 1708-1711 y Park y col. (1996) Molecular Carcinigenesis 16: 101-108. Los elementos de respuesta p53CON y a RGC se pueden construir hibridando oligonucleótidos complementarios y los promotores que responden a p53 se pueden construir (según se describe de manera más completa en el Ejemplo 3) clonándolos en el vector formado por plásmido pGL3-promotor de la luciferasa (comercialmente disponible procedente de Promega).

La expresión "célula diana" se refiere a una célula de un estado fenotípico determinado a la que se quiere tratar mediante la administración de un transgén terapéutico. Con el uso de diferentes elementos de promotores que responden a rutas, se puede dirigir la expresión del virus hacia una célula determinada que posea una ruta intacta. Por ejemplo, se puede hacer que el represor de la replicación vírica se exprese en una célula diana neoplásica a través del uso de promotores que responden a la ruta de TGF-\beta o p53. Del mismo modo, se puede hacer que el represor de la replicación vírica se exprese en una célula diana afectada por artritis a través de un promotor que responde a la inflamación, en cuyo caso el vector codifica opcionalmente IL-10.

La expresión "operativamente ligado" se refiere a una unión de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Una secuencia de ácido nucleico está "operativamente ligada" cuando está situada guardando una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o una secuencia estimuladora de la transcripción se encuentra operativamente ligado a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de esa secuencia codificadora. Operativamente ligado significa que las secuencias de nucleótidos que están ligadas, están típicamente situadas de manera contigua. Sin embargo, debido a que las secuencias estimuladoras de la transcripción generalmente actúan cuando están separadas del promotor por varias kilobases y a que las secuencias intrónicas pueden tener longitudes variables, algunos elementos polinucleotídicos pueden estar operativamente ligados pero no estar directamente al lado y pueden incluso actuar en trans desde un alelo diferente o un cromosoma diferente.

La expresión "represor de la replicación vírica" se refiere a una proteína que cuando se expresa en una célula determinada, reprime sustancialmente la replicación vírica. Como los expertos en la técnica apreciarán, el represor de la replicación vírica dependerá de la naturaleza del vector adenovírico parental del que deriva el vector recombinante de la presente invención. Por ejemplo, en el caso de los vectores adenovíricos o de otros virus tumorales con DNA, se puede utilizar la construcción de la fusión E2F-Rb según se describe en la solicitud de Patente europea Núm. 94108445.1, publicada el 6 de diciembre de 1.995 (Número de la publicación: 0 685 493 A1). La proteína de fusión E2F-Rb consiste en el dominio de unión a DNA y el dominio de heterodimerización de DP1 de la proteína del factor de transcripción E2F humano (aminoácidos 95-286 de la E2F de tipo salvaje) fusionados con el dominio de supresión del crecimiento de Rb (aminoácidos 379-928 de la proteína Rb de tipo salvaje). La proteína de fusión E2F-Rb es un potente represor de la transcripción dependiente de E2F y detiene las células en G1. El dominio de unión a DNA está localizado en los aminoácidos 128-193 y el dominio de dimerización está localizado en los aminoácidos 194-289. La secuencia de la proteína E2F-1 humana se encuentra disponible procedente de GenBank con el número de registro M96577 y fue depositada el 10 de agosto de 1.992. Las secuencias de E2F procedentes de otros miembros de la familia de E2F, de E2F de otras especies, se puede emplear cuando se construye un vector para usarlo en otras especies. En la circunstancia de que el virus recombinante esté basado en virus adenoasociados (AAV), la proteína rep y sus derivados constituyen un represor eficaz de la replicación vírica en ausencia de una infección con adenovirus. En la circunstancia de que el virus derive del virus del herpes simple, la proteína ICPO-NX, una forma delecionada de la proteína temprana inmediata ICPO (Liun y col., (1998) J. Virol. 72: 7785-7795), se puede usar como represor eficaz de la replicación vírica. Del mismo modo, cualquier proteína con actividad dominante negativa se puede usar como represor de la replicación vírica.

El TGF-\beta y proteínas relacionadas que incluyen activina, inhibinas y BMP son potentes agentes antiproliferativos naturales y se piensa que desempeñan funciones importantes en la supresión de la tumorigenicidad. En su forma bioactiva, el TGF-\beta es un homodímero de 25 kDa unido por un enlace disulfuro y se expresa en prácticamente todos los tejidos humanos. Curiosamente, muchos tipos de células malignas han conservado los patrones de expresión que se observan en las células normales. TGF-\beta produce señales a través de complejos de receptores heteroméricos de receptores con actividad de serina/treonina-quinasa de tipo I y de tipo II. Entre estas dos quinasas asociadas a receptores, el receptor de tipo II posee una actividad de quinasa intrínseca y después de unirse al ligando TGF-\beta, el receptor de tipo II heteromeriza con un receptor de tipo I y lo transfosforila. La fosforilación del receptor de tipo I activa su actividad de quinasa, que a su vez produce la fosforilación de las Smda que son efectores intracelulares. El receptor de tipo I fosforilado transmite las señales al interior de la célula que dan lugar a una respuesta celular tal como la inhibición del crecimiento. Una vez en el interior del núcleo, se sabe que los complejos de Smad activan la transcripción de genes diana ya sea por su propia actuación como factores de transcripción o ya sea regulando la actividad de otros factores de transcripción. Los factores de transcripción que se piensa que están regulados por la señal producida por TGF-\beta incluyen CTF/NF-1, FAST-1, Sp-1, Jun, SRF/TRF, Oct y CREB. Los resultados netos de estas interacciones conducen a los distintos efectos pleiotrópicos conocidos del TGF-\beta.

El factor \beta de crecimiento transformante (TGF-\beta) y proteínas relacionadas son potentes inhibidores de la proliferación de muchos tipos de células. La progresión maligna de algunos tumores de origen epitelial y hematopoyético está relacionada con la pérdida de acción antiproliferativa y anti-invasiva del TGF-\beta. Un fallo sistema de señales producidas por TGF-\beta se ha demostrado que conlleva mutaciones o deleciones o la falta de expresión de los receptores y/o de los efectores intracelulares de la ruta de transducción de señales. Muchos tumores malignos que son resistentes a TGF-\beta son también multidefectivos con respecto a otros genes supresores de tumor, limitando así la utilidad de la sustitución de genes supresores de tumor por una terapia eficaz.

Se construyeron promotores que responden a la ruta de TGF-\beta incorporando secuencias procedentes del inhibidor 1 del activador del plasminógeno (promotor-PAI) o sitios de unión a Smad4/DPC4 (promotor-SRE) en dirección aguas arriba de la caja TATA de SV40. Las actividades de estos promotores se evaluaron en ensayos de transfección transitoria usando luciferasa como gen reportero. Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 2:

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Estos resultados demuestran que estos dos promotores son activos solamente en células que poseen una transducción de señales por TGF-\beta funcional. En una línea celular defectiva en la ruta de TGF-\beta, tal como la línea MDA-MB468, que es defectiva con respecto en la transducción de señales por TGF-\beta debido a una deleción homocigótica de Smad4/DPC4, la transfección del promotor-PAI o del promotor-SRE operativamente ligado a luciferasa y la infección con un adenovirus recombinante que codifica Smad4, restableció la actividad de los dos elementos de respuesta anteriores, confirmando además la especificidad de estos promotores que contienen elementos de respuesta por la ruta de TGF-\beta como se demuestra con los datos presentados a continuación en la Tabla 3.

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Se construyó después un plásmido que contenía el promotor-PAI operativamente ligado a E2F-Rb y se ensayó con respecto a su capacidad para reprimir selectivamente al promotor de E2 en las células que posee la ruta de TGF-\beta intacta. En ensayos de transfección transitoria, la cotransfección del promotor de E2 unido a luciferasa, con el promotor-PAI operativamente ligado a E2F-Rb, mostró una represión selectiva de la actividad del promotor de E2 en células 293 (que poseían una ruta de TGF-\beta normal) y no en células MDA-MB-468 (que poseían una ruta defectiva en TGF-\beta) como se muestra en la Tabla 4, debido a la expresión selectiva de E2F-Rb en las células 293. Como era de esperar, la cotransfeción con CMV-E2F-Rb, que expresa E2F-Rb en estas dos líneas celulares, inhibió la actividad del promotor de E2 en ambas líneas celulares.

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Se construyeron promotores que responden a la ruta de p53 incorporando sitios conocidos de unión a p53 procedentes o de la agrupación de genes ribosomales (promotor-RGC) o de sitios de unión a p53 de alta afinidad (promotor-p53CON). Las actividades de estos promotores se evaluaron en ensayos de transfección transitoria usando luciferasa como gen reportero. Los resultados de estos experimentos se presentan a continuación en la Tabla 5.

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Los resultados indicaron que estos dos elementos de repuesta son activos en células que poseen p53 funcional. Con el fin de confirmar que la actividad del promotor que responde a p53 es debida a una p53 funcional, se cotransfectaron dos líneas celulares, WIDR y U87, con el promotor-RCG que dirige la expresión del gen de la luciferasa y con, o un vector adenovírico de control que porta la casete vacía (ZZCB), o un adenovirus recombinante que produce constitutivamente p53 bajo el control del promotor de CMV (FTCB). Los resultados de estos experimentos se presentan en la Tabla 6.

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Como puede observarse a partir de los datos presentados, la actividad del promotor que responde a p53 aumenta de una manera dependiente de la dosis al aumentar la actividad de p53.

Se generaron vectores adenovíricos recombinantes que codifican una secuencia codificadora de la fusión E2F-Rb bajo el control o de un promotor (PAI o SRE) que responde a la ruta de TGF-\beta o de un promotor (RGC o p53CON) que responde a la ruta de p53. Además, el gen que codifica la proteína fluorescente verde se incorporó también en los vectores como gen reportero. Los virus resultantes se ensayaron con respecto a su capacidad para replicarse de manera selectiva y destruir células que poseían defectos en la ruta de TGF-\beta o en la ruta de p53 en ensayos del efecto citopático (CPE). Los resultados se muestran en la Figura 1 de los dibujos que se adjuntan. En MRC9 (positivas con respecto a la ruta de p53 y positivas con respecto a la ruta de TGF-\beta) el adenovirus de tipo salvaje fue capaz de replicarse y de inducir un CPE incluso a concentraciones bajas (1 x 10^{6} partículas/ml), mientras que los vectores dirigidos a la ruta de TGF-\beta o a la ruta de p53 no fueron capaces de inducir un CPE a esa concentración. Solamente a la dosis más alta de las ensayadas (1 x 10^{8} partículas /ml), los vectores dirigidos a una ruta mostraron cierto CPE. Por el contrario, en una línea celular tal como WIDR (defectiva en ambas rutas de p53 y de TGF-\beta) y tal como Hp3b (nula con respecto a p53 y defectiva en THF-\beta en ausencia de TGF-\beta exógeno) los vectores dirigidos a una ruta fueron eficaces para inducir un CPE similar al inducido por el virus del tipo salvaje incluso a concentraciones bajas (1 x 10^{6} partículas/ml). La microscopía de fluorescencia de células Hp3b infectadas con vectores dirigidos a una ruta (SRE-Ad y p53CON-Ad) revelaron un nivel de expresión alto del transgén y la propagación del virus en el cultivo, incluso cuando el virus se había infectado a una concentración baja de partícula (1 x 10^{5} partículas/ml expuestas durante dos horas). En cambio, las células Hep3b infectadas con el adenovirus (GFCB) que codifica la GFP y es defectivo en replicación (delecionado en E1A), a la misma concentración (1 x 10^{5} partículas/ml), mostraron la ausencia de expresión de GFP.

Como se ha indicado previamente, los vectores de la presente invención están capacitados para realizar una replicación selectiva y para lisar la célula diana en condiciones selectivas. Sin embargo, esto no significa que implique que no se puedan construir niveles adicionales de selectividad o toxicidad en estos vectores. La presente invención también proporciona adenovirus recombinantes que contienen modificaciones adicionales en el genoma vírico, tales como modificaciones para el direccionamiento, casetes de expresión de un transgén o modificaciones en el genoma vírico que facilitan la replicación selectiva en un tipo de célula determinado o en un estado fenotípico determinado.

La expresión "modificación para el direccionamiento" se refiere a las modificaciones hechas en el genoma vírico, diseñadas para que produzcan la infectividad preferencial de un tipo de célula particular. La especificidad para un tipo de célula o el direccionamiento hacia un tipo de célula también se puede obtener en vectores derivados de virus que tienen por naturaleza infectividades amplias, tales como los adenovirus, mediante la modificación de las proteínas de la envoltura vírica. Por ejemplo, se ha conseguido realizar un direccionamiento celular con vectores adenovíricos mediante la modificación selectiva de las secuencias que codifican el pentón y la fibra del genoma vírico, para conseguir la expresión de los dominios del pentón y de la fibra modificados que presentan una interacción específica con receptores únicos de superficie celular. Ejemplos de estas modificaciones se encuentran descritos en Wickham y col., (1997) J. Virol. 71(11): 8221-8229 (incorporación de péptidos RGD en proteínas de la fibra adenovírica); Arnberg y col. (1997) Virology 227: 239-244 (modificación de genes de la fibra adenovírica para obtener un tropismo hacia el ojo y el aparato genital); Harris y Lemoine (1996) TIG 12(10): 400-405; Stevenson y col. (1997) J. Virol. 71(6): 4782-4790; Michael y col. (1995) Gene Therapy 2: 660-668 (incorporación de un fragmento peptídico liberador de gastrina en la proteína de la fibra adenovírica); y Ohno y col. (1997) Nature Biotechnology 15: 763-767 (incorporación de Proteína A-dominio de unión a IgG en el virus Sindbis). Otros métodos de direccionamiento específico de célula se han obtenido mediante la conjugación de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos con las proteínas de la envoltura (véase, p. ej., Michael y col. (1993) J. Biol. Chem. 268: 6866-6869, Watkins y col., (1997) Gene Therapy 4: 1004-1012; Douglas y col., (1996) Nature Biotechnology 14: 1574-1578. Como alternativa, se pueden conjugar restos particulares con la superficie vírica para obtener el direccionamiento. (Véase p. ej., Nilson y col. (1996) Gene Therapy 3: 280-286 (conjugación de EGF con proteínas retrovíricas). Estos vectores modificados mediante técnicas recombinantes se pueden producir de acuerdo con la práctica de la presente invención.

La expresión "casete de expresión de un transgén" se refiere a un promotor funcional en la célula diana, operativamente ligado a un transgén terapéutico. El término promotor se refiere a secuencias de nucleótidos que afectan a la transcripción de otra secuencia de nucleótidos. Ejemplos de promotores incluyen promotores constitutivos débiles, promotores víricos temporales o promotores regulables.

La expresión "promotores temporales" se refiere a promotores que dirigen la transcripción del transgén terapéutico hasta un punto más tardío del ciclo vírico en relación con el promotor que controla la expresión del promotor que responde a una ruta. Ejemplos de estos promotores de regulación temporal incluyen el promotor principal tardío de adenovirus (MLP) (del inglés " Major Late Promoter") y otros promotores como E3. En la práctica preferida de esta invención, se utiliza el promotor MLP. En el caso de los virus del herpes simple, se podrían utilizar Promotores Latentes Activados.

La expresión "promotores regulables" se refiere a promotores inducible, promotores específicos de tejido o promotores específicos de tumor. La expresión "promotor inducible" se refiere a promotores que facilitan la transcripción del transgén terapéutico, preferiblemente (o solamente) en determinadas condiciones y/o en respuesta a estímulos químicos externos u otros estímulos. Se conocen ejemplos de promotores inducibles en la literatura científica. (Véanse p. ej., Yoshida y Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 230: 426-430; Iida y col. (1996) J. Virol. 70(9): 6054-6059; Hwang y col. (1997) J. Virol. 71(9): 7128-7131; Lee y col., (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9): 5097-5105; y Dreher y col. (1997) J. Biol. Chem. 272(46): 29364-29371. Ejemplos de promotores inducibles por radiación se encuentran descritos en Manome y col. (1998) Human Gene Therapy 9: 1409-1417). Se puede impartir un nivel adicional de selectividad a través del uso de promotores específicos de tejido o promotores específicos de tumor. Los promotores específicos de tejido y los promotores específicos de tumor se conocen bien en la técnica e incluyen promotores activos preferentemente en músculo liso (promotor de \alpha-actina), promotores específicos de páncreas (Palmiter y col. (1987) Cell 50: 435), promotores específicos de hígado (Rovet y col. (1992) J. Biol. Chem. 267: 20765; Lemaigne y col. (1993) J. Biol. Chem. 268: 19896; Nitsch y col., (1993) Mol. Cell. Biol. 13: 4494), promotores específicos de estómago (Kovaric y col. (1993) J. Biol. Chem. 268: 9917), promotores específicos de hipófisis (Rhodes y col. (1993) Genes Dev. 7: 913), promotores específicos de próstata, etc.

La expresión "transgén terapéutico" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en la célula diana produce un efecto terapéutico. La expresión transgén terapéutico incluye, pero no se limita a ellos, genes supresores de tumores, genes antigénicos, genes citotóxicos, genes citostáticos, genes activadores de profármacos, genes apoptósicos, genes farmacéuticos o genes anti-angiogénicos. Los vectores de la presente invención se pueden usar para producir uno o más transgenes terapéuticos, ya sea en tándem a través del uso de elementos IRES o ya sea a través de promotores regulados de manera independiente.

La expresión "gen supresor de tumor" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en la célula diana es capaz de suprimir el fenotipo neoplásico y/o de inducir apoptosis. Ejemplos de genes supresores de tumor, útiles en la práctica de la presente invención, incluyen el gen p53, gen APC, gen DPC-4/Smad4, gen BRCA-1, gen BRCA-2, gen WT-1, gen de retinoblastoma (Lee y col. (1987) Nature 329: 642), gen MMAC-1, el gen de la proteína de la polipósis adenomatosa de colon (Alberstent y col. Patente de EE. UU. 5.783.666, expedida el 21 de julio de 1.988), el gen delecionado en el carcinoma de colon (DCC), el gen MMSC-2, gen NF-1, gen supresor de tumor del carcinoma nasofaríngeo que mapea en el cromosoma 3p21.3 (Cheng y col. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 3042-3047), gen MTS1, gen CDK4, gen NF-1, gen NF-2 y gen VHL.

La expresión "genes antigénicos" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en las células diana da como resultado la producción de una proteína antigénica de superficie celular capaz de ser reconocida por el sistema inmunitario. Ejemplos de genes antigénicos incluyen el antígeno carcinoembrionario (CEA), p53 (según se describe en Levine A. Publicación de PCT internacional Núm. WO94/02167 publicada el 3 de febrero de 1.994). Con el fin de facilitar el reconocimiento inmunológico, el gen antigénico se puede fusionar con el antígeno del MHC de clase I.

La expresión "gen citotóxico" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en una célula produce un efecto tóxico. Ejemplos de estos genes citotóxicos incluyen secuencias de nucleótidos que codifican la exotoxina de pseudomonas, la toxina ricina, la toxina diftérica y toxinas similares.

La expresión "gen citostático" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en una célula produce la detención del ciclo celular. Ejemplos de estos genes citostáticos incluyen p21, el gen de retinoblastoma, el gen de la proteína de fusión E2F-Rb, genes que codifican inhibidores de las quinasas dependientes de ciclinas tales como p16, p15, p18 y p19, el gen de la homeobox (GAX) específico de la detención del crecimiento celular, según se describe en Branellec y col. (Publicación PCT WO97/16459, publicada el 9 de mayo de 1.997 y Publicación PCT WO96/30385 publicada el 3 de octubre de 1.996).

La expresión "gen de citoquina" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en una célula produce una citoquina. Ejemplos de estas citoquinas incluyen GM-CSF, las interleuquinas en especial IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20, interferones de los subtipos \alpha, \beta y \gamma, en especial el interferón \alpha-2b, y fusiones tales como el interferón \alpha-2 \alpha-1.

La expresión "gen de quimioquina" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en una célula produce una quimioquina. El término quimioquina se refiere a un grupo de factores estructuralmente relacionados con las citoquinas de bajo peso molecular, secretados por las células, que están estructuralmente relacionados y presentan actividades mitogénicas, quimiotácticas o inflamatorias. Son principalmente proteínas catiónicas de 70 a 100 residuos de aminoácidos que comparten cuatro residuos de cisteína conservados. Estas proteínas se pueden clasificar en dos grupos tomando como base la separación entre las dos cisteínas amino-terminales. En el primer grupo, las dos cisteínas están separadas por un solo residuo (C-x-C), mientras que en el segundo grupo las dos cisteínas están una al lado de otra (C-C). Ejemplos de miembros de las quimioquinas "C-x-C" incluyen, pero no se limitan a ellos, el factor plaquetario 4, la proteína plaquetaria básica (PBP), interleuquina 8 (IL-8), proteína con actividad estimuladora del crecimiento del melanoma (MGSA) (del inglés " Melanoma Growth Stimulatory Activity protein"), proteína inflamatoria de macrófagos 2 (MIP-2), Mig de ratón (m119), 9E3 de pollo (o pCEF-4), factores quimiotácticos I y II de macrófagos alveolares de cerdo (AMCF-I y II) (del inglés, "pig Alveolar Macrophage Chemotactic Factors I and II"), factor estimulador del crecimiento de células pre-B (PBSF) (del inglés, " Pre-B cell growth Stimulating Factor") e IP10. Ejemplos de miembros del grupo "C-C" incluyen, pero no se limitan a ellos, la proteína quimiotáctica 1 de monocitos (MCP-1) (del inglés, " Monocyte Chemotactic Protein 1"), proteína quimiotáctica 2 de monocitos (MCP-2), proteína quimiotáctica 3 de monocitos (MCP-3), proteína quimiotáctica 4 de monocitos (MCP-4), proteína 1\alpha inflamatoria de macrófagos (MIP-1-\alpha), proteína inflamatoria 1\beta de macrófagos (MIP-1-\beta), proteína inflamatoria 1\gamma de macrófagos (MIP-1-\gamma), proteína inflamatoria 3\alpha de macrófagos (MIP-3-\alpha), proteína inflamatoria 3\beta de macrófagos (MIP-3-\beta), quimioquina (ELC), proteína inflamatoria 4 de macrófagos (MIP-4), proteína inflamatoria 5 de macrófagos (MIP-5), LD78\beta, RANTES, SIS-épsilon (p500), quimioquina regulada por el timo y la activación (TARC) (del inglés, " Thymus and Activation-Regulated Chemokine"), eotaxina, I-309, proteína HCC-1/NCC-2 humana, proteína HCC-3 humana, proteína C10 de ratón.

La expresión "gen de una proteína farmacéutica" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión da como resultado la producción de una proteína que tiene un efecto farmacéutico en la célula diana. Ejemplos de esos genes farmacéuticos incluyen el gen de la proinsulina y sus análogos (según se describen en la solicitud de Patente internacional PCT Núm. WO98/31397), gen de la hormona de crecimiento, los genes de dopamina, serotonina, factor de crecimiento epidérmico, GABA, ACTH, NGF, VEGF (para aumentar la perfusión de la sangre a un tejido diana, para inducir angiogénesis, publicación de PCT WO98/32859, publicada el 30 de julio de 1.998), trombospondina, etc.

La expresión "gen pro-apoptósico" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión produce la muerte celular programada de las células. Ejemplos de genes pro-apoptósicos incluyen el gen p53, gen E3-11,6K de adenovirus (derivado de Ad2) o gen E3-10,5K de adenovirus (derivado de Ad), gen E4orf4 de adenovirus, genes de la ruta de p53 y genes que codifican las caspasas.

La expresión "genes activadores de profármacos" se refieren a secuencias de nucleótidos cuya expresión da como resultado la producción de una proteína capaz de convertir un compuesto no terapéutico en un compuesto terapéutico, que hace que la célula sea susceptible a ser destruida por factores externos o que produce un estado tóxico en la célula. Un ejemplo de gen activador de un profármaco es el gen de la citosina-desaminasa. La citosina-desaminasa convierte la 5-fluorocisteína (5-FC) en 5-fluorouracilo (5-FU), un potente agente antitumoral. La lisis de la célula tumoral proporciona una irrupción localizada de la citosina-desaminasa capaz de convertir 5-FC en 5-FU en ese punto localizado del tumor dando como resultado la muerte de muchas células tumorales circundantes. Esto produce la muerte de gran número de células tumorales sin necesidad de infectar estas células con un adenovirus (el denominado "efecto espectador", (del inglés, "bystander effect")). Además, se puede utilizar el gen de la timidina-quinasa (TK) (del inglés, " Thymidine Kinase") (véanse, p. ej., Woo y col. Patente de EE. UU. Núm. 5.631.236, expedida el 20 de mayo de 1.997, y Freeman y col., Patente de EE. UU. Núm. 5.601.818, expedida el 11 de febrero de 1.997) y en ese caso las células que expresan el producto del gen de TK son susceptibles de ser destruidas de manera selectiva mediante la administración de ganciclovir.

La expresión genes "anti-angiogénicos" se refiere a una secuencia de nucleótidos, cuya expresión produce la secreción extracelular de factores anti-angiogénicos. Los factores anti-angiogénicos incluyen angiotensina, inhibidores del factor de crecimiento del endotelio vascular (VAGF) (del inglés, " Vascular Endothelial Growth Factor") tal como Tie2 (según se describe en PNAS (Patente de EE.UU. Núm.) (1.998) 95: 8795-8800), endostatina.

Resultará claramente evidente a los expertos en la técnica que las modificaciones y/o deleciones hechas en los genes anteriormente mencionados para que codifiquen subfragmentos funcionales de la proteína de tipo salvaje, pueden adaptarse fácilmente para su uso en la práctica de la presente invención. Por ejemplo, la referencia que se hace al gen p53 incluye no sólo la proteína de tipo salvaje sino también proteínas p53 modificadas. Ejemplos de esas proteínas p53 modificadas incluyen modificaciones hechas en p53 para aumentar la retención nuclear, deleciones tales como la de los aminoácidos \Delta13-19 para eliminar el sitio consenso de escisión por calpaína, modificaciones en los dominios de oligomerización (según se describen en Bracco y col., solicitud de PCT publicada WO 97/0492 o en la Patente de EE. UU. Núm. 5.573.925).

Resultará claramente evidente a los expertos en la técnica que los genes terapéuticos anteriormente mencionados pueden ser secretados en el medio o pueden ser colocados en localizaciones intracelulares particulares por medio de la inclusión de un resto de direccionamiento tal como un péptido señal o una señal de localización nuclear (NLS). También incluidas en la definición de transgén terapéutico están las proteínas de fusión del transgén terapéutico con la proteína estructural VP22 del virus del herpes simple de tipo 1 (HSV-1). Las proteínas de fusión que contienen la señal de VP22, cuando se sintetizan en una célula infectada, se exportan hacia el exterior de la célula infectada y entran eficientemente en las células no infectadas circundantes en un diámetro de acción de aproximadamente 16 células. Este sistema es particularmente útil usado en conjunción con proteínas transcripcionalmente activas (p, ej., p53) ya que las proteínas de fusión se transportan eficientemente hacia los núcleos de las células circundantes. Véanse, p. ej., Elliot, G. y O'Hare, P. Cell 88: 223-233, 1997; Marshall, A. y Castellino, A. Research News Briefs. Nature Biotechnology. 15: 205, 1997; O'Hare y col., publicación de PCT, documento WO97/05265, publicada el 13 de febrero de 1.997. Un resto de direccionamiento similar derivado de la proteína Tat de HIV se encuentra también descrito en Vives y col. (1997) J. Biol. Chem. 272: 16010-16017).

Modificaciones adicionales para aumentar la potencia de los vectores de la presente invención incluyen, pero no se limitan a ellas, alteraciones en E1, introducciones de mutaciones en E4 para aumentar la citotoxicidad (Muller y col. (1992) J. Virol. 66:5867-5878), la regulación por aumento de proteínas de muerte vírica tales como las proteínas E4orf4 o E311,6K.

En la práctica preferida de la invención según aquí se ilustra, el vector de la presente invención comprende un adenovirus de replicación condicionada, que contiene un promotor que responde a la ruta de p53 o a la ruta de TGF-\beta, que dirige la expresión de la proteína de fusión E2F-Rb, y que comprende además la expresión del gen de la citosina-desaminasa que está bajo el control del promotor temporal de E3. En estas circunstancias, la citosina-desaminasa se produce únicamente en las células tumorales después de la replicación vírica. En la práctica preferida de la invención, el gen que convierte el profármaco está bajo el control de un promotor relativamente débil o de un promotor específico de tejidos o específico de tumores.

En otra realización de la invención, el vector comprende un adenovirus recombinante que contiene un promotor que responde a la ruta de p53 o a la ruta de TGF-\beta, que dirige la expresión de la proteína de fusión E2F-Rb, y una casete de expresión de un transgén que expresa citosina-desaminasa sola, o una casete de expresión bicistrónica que contiene citosina-desaminasa y un elemento IRES y la proteína MIP-3-alfa. Debido a que la citosina-desaminasa se expresa, la destrucción de las células tumorales se obtiene con la administración de un profármaco tal como la 5-fluorocitosina. Un nivel bajo de expresión de la MIP-3-alfa ayudará en el desarrollo de la inmunidad antitumoral.

La expresión cascada de muchos niveles, multifuncional o múltiple que responde a rutas se usa aquí indistintamente para hacer referencia a la construcción de elementos que responden a rutas de manera que se produce un efecto terapéutico cuando se puede investigar simultáneamente más de una sola ruta. Resultará evidente a los expertos en la técnica que se pueden combinar elementos de control del vector como los anteriormente descritos para proporcionar múltiples niveles de selectividad a los vectores de la presente invención. Como ejemplo de control de muchos niveles, sería posible diseñar un adenovirus de replicación condicionada, que fuera capaz de replicarse y de destruir células que presentan defectos en la ruta de Rb o en la ruta de TGF-\beta o en la ruta de p53. Un vector de ese tipo incluiría la expresión de un inhibidor dominante negativo de la replicación vírica, controlado por un promotor que responde a p53 como primer nivel de control. Como resultado, en cualquier tipo de célula (tal como en todas las células normales) que tenga p53 funcional, pero no en una célula que tenga p53 inactivo, el inhibidor dominante negativo se expresa y la replicación vírica se bloquea. Sin embargo, este vector se puede replicar en células tumorales que poseen p53 funcional pero que presentan defectos en otras rutas tales como la ruta de TGF-\beta y la ruta de Rb. Por lo tanto, se pueden insertar niveles de control adicionales que fundamentalmente inactivarían p53 funcional en células tumorales, permitiendo así la replicación vírica cuando otras rutas son defectivas.

Como segundo nivel de control, el mismo vector consistiría también en una casete de expresión que contendría la proteína E1B-55K de adenovirus, que es capaz de inactivar funcionalmente a p53, bajo el control de un promotor que es activo solamente en células defectivas en la ruta de TGF-\beta. Un promotor que es activo solamente en células defectivas en la ruta de TGF-\beta se puede construir insertando en el promotor sitios de unión a un represor, de manera que la expresión de ese represor usando un promotor que responde a TGF-\beta en otro lugar del vector dará lugar al bloqueo de la actividad del promotor en las células que poseen intacta la señalización producida por TGF-\beta. En cambio, en células en las que la ruta de TGF-\beta es defectiva, el represor no se sintetiza y el promotor estará activo. Debido a la expresión de E1B-55K desde el promotor que está activo solamente en las células en las que la ruta de TGF-\beta es defectiva, la p53 endógena se inactiva. Como alternativa, se puede usar cualquier promotor natural que esté regulado por disminución a causa de la señalización producida por TGF-\beta. La inclusión de las dos casetes de expresión anteriormente mencionadas, asegurará que el inhibidor dominante negativo se exprese solamente cuando ambas rutas de p53 y de TGF-\beta sean normales (y se produce el bloqueo de la replicación), pero no cuando una de ellas o las dos rutas sean defectivas (y se produce la replicación vírica).

Como tercer nivel de control, la expresión de una proteína tal como Smad7 o alguna otra forma dominante negativa de Smad, que es capaz de inactivar la ruta de TGF-\beta (Nakao y col. Nature 1997, 9 de octubre; 389(6651): 631-635), controlada por un promotor que responde a E2F, se realiza en el mismo vector. Un promotor que responde a E2F (tal como el promotor E2F1, el promotor E2 o un promotor sintético con múltiples sitios de unión a E2F en dirección aguas arriba de un promotor mínimo tal como la caja TATA de SV40) es activo cuando la ruta de Rb es defectiva. Debido a este tercer nivel de control, en células que tienen la ruta de Rb defectiva, se expresa Smad7 y a su vez inactiva a Smad4 y bloquea la transducción de señales de TGF-\beta. Por lo tanto, se produce E1B-55K y p53 se inactiva, lo que da lugar a la falta de expresión del inhibidor dominante negativo. Por lo tanto, la replicación vírica puede transcurrir sin obstáculos. En cambio, si la ruta de Rb es normal, Smad7 no se sintetiza, y por lo tanto la transducción de la señal de TGF-\beta transcurre con normalidad. Por lo tanto, E1B-55K no se produce y esto da como resultado una p53 funcional capaz de expresar el inhibidor dominante negativo para bloquear la replicación vírica.

Con los tres niveles de control anteriormente mencionados, un defecto en una cualquiera de las rutas (de Rb, de TGF-\beta y de p53) o en dos de ellas o en las tres conduciría finalmente a la replicación vírica y a la lisis celular. La replicación vírica no tendrá lugar solamente cuando las tres rutas sean funcionales como sucede en las células normales.

Como los expertos en la técnica pueden apreciar, los vectores de la presente invención se pueden usar con muchas variaciones para la detección y el tratamiento de una amplia variedad de defectos de rutas, usando diversos promotores que responden a rutas. Sin embargo, en la práctica preferida de la invención según aquí se ilustra, el vector adenovírico recombinante deriva del género de los adenovirus. En particular los virus preferidos derivan del adenovirus humano del tipo 2 o de tipo 5. Cuando un vector adenovírico se usa como vector parental, el inhibidor de la replicación vírica preferido es la proteína de fusión E2F-RB.

En la práctica preferida de la invención cuando se usan los vectores de la presente invención para tratar enfermedades asociadas con una proliferación celular incontrolada, se prefiere el empleo de un vector adenovírico que contenga deleciones específicas en la región de E1A de manera que se elimine la capacidad del producto del gen E1a para unirse a las proteínas p300 y Rb al mismo tiempo que se conserva la función de transactivación del dominio E1aCR3. Los vectores de la presente invención contienen deleciones en la secuencia que codifica E1a para eliminar los sitios de unión a p300 y a p105-Rb en la secuencia codificadora de 13S. En la práctica preferida de la invención, las deleciones de la unión a p300 están representadas por las deleciones de los aminoácidos desde aproximadamente el 4 hasta aproximadamente el 25 o desde aproximadamente el 36 hasta aproximadamente el 49.

Las deleciones en la secuencia que codifica E1a289R, necesaria para obtener la eliminación de la unión a p300 y a pRb, son preferiblemente lo más pequeñas posible para evitar una alteración grande de la estructura secundaria y de la estructura terciaria de la proteína E1a289R. Con el fin de eliminar la unión a p300, se prefiere introducir una mutación en la secuencia de DNA que codifica los dominios de unión a p300 de la proteína 289R. Se prefieren las deleciones de menos de aproximadamente 30 aminoácidos en la región C-terminal para eliminar la unión a p300, aunque se prefieren modificaciones más pequeñas. Por ejemplo, una deleción de los aminoácidos del 4 al 25 (dl1101), desde aproximadamente el aminoácido 30 hasta el aminoácido 49 (dl1103), y más en particular desde el 36 al 49, se prefieren como alternativa para eliminar la unión a p300. Las mutaciones puntuales suficientes para romper la unión a p300, son particularmente preferidas. Por ejemplo, se ha demostrado que una mutación puntual del aminoácido segundo, de arginina a glicina (Arg2 \rightarrow Gly2) en la proteína 289R, rompe la unión a p300. (Véase p. ej., pm563, Whyte y col. (1989) Cell 56: 67-75). De manera similar, en relación con la eliminación de la unión a pRb105, se prefieren las modificaciones mínimas. Se prefiere la eliminación de aminoácidos selectivos en el dominio de unión a pRb105, tal como la de los aminoácidos 111-123 (del1107) y la eliminación de los aminoácidos 124-127 (dl1108). La deleción de los aminoácidos 111-123 (dl1107) es particularmente preferida porque conserva la actividad de unión a p107 de la proteína 289R.

De manera adicional, se puede introducir la eliminación de los aminoácidos desde aproximadamente el 219 hasta el 289 de la proteína E1a289R y de los aminoácidos desde el 173 hasta el 243 de la proteína E1A243R. Por ejemplo, introduciendo una mutación puntual en la posición que corresponde a la posición 1131 del genoma del Ad5 humano (es decir, cambiando la citosina^{1131} por una guanina) se crea un codón de terminación. Esta mutación produce la eliminación de los aminoácidos del 219 al 289 de la proteína E1a289R y de los aminoácidos del 173 al 243 de la proteína E1A243R. Esta mutación se hace de manera opcional además de las deleciones en la unión a Rb y en la unión a p300 anteriormente descritas. Ejemplos adicionales de estos vectores parentales se encuentran descritos en las solicitudes de Patentes de EE.UU., en tramitación junto con la presente, Números de serie 60/104.317 y 08/09/172.684, presentadas el 15 de octubre de 1.998.

En la práctica preferida de la invención, el gen terapéutico es un gen activador de un profármaco, p. ej., el gen de la citosina-desaminasa. En la práctica preferida de la invención para inducir inmunidad antitumoral, el vector de la presente invención codifica MIP-3-alfa.

Los promotores preferidos para la expresión del gen terapéutico son los promotores temporales tales como MLP y E3.

En las construcciones adenovíricas, se realiza la eliminación, o el retardo en la acción, de la proteína AdE3-11,6K para minimizar la lisis celular inducida por el adenovirus hasta la replicación. En particular, sería preferible realizar la eliminación del gen E3-11,6K/10,5K natural. Esto minimizaría la respuesta inmunitaria hasta después de haberse producido la ronda inicial de propagación localizada. En este momento posterior, una vez obtenida la apoptosis de las células inicialmente infectadas y se permite que tenga lugar la propagación localizada del virus, la respuesta inmunitaria sería ventajosa. La proteína 11,6K (o la correspondiente proteína E3-10,5K de Ad5) está codificada por un gen pro-apoptósico y este gen se puede usar para obtener la muerte celular de las células tumorales. Sin embargo, ya que lo que se desea es retrasar la lisis temprana de la célula diana para maximizar la replicación vírica, se prefiere que el gen 11,6K/10,5K esté situado bajo el control de un promotor temporal tal como el promotor MLP, para retrasar el inicio de su efecto apoptósico.

Formulaciones farmacéuticas

La presente invención proporciona también una formulación farmacéuticamente aceptable de los virus recombinantes en combinación con un vehículo. Los vectores de la presente invención se pueden formular en la práctica para la administración de las dosis de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional, con la adición de vehículos y excipientes. Las formulaciones de las dosificaciones pueden incluir la administración intravenosa, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, tópica, por medio de matrices o aerosoles.

El término "vehículo" se refiere a compuestos comúnmente usados en la formulación de compuestos farmacéuticos, usados para mejorar la estabilidad, esterilidad y capacidad de entrega del compuesto terapéutico. Cuando el virus se formula en forma de disolución o suspensión, el sistema de entrega es un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Se pueden usar diversos vehículos acuosos, agua, agua tamponada, disolución salina al 0,8%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y vehículos similares. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales muy conocidas, o se pueden esterilizar por filtración. Las disoluciones acuosas resultantes se pueden envasar para su uso tal como están, o se pueden liofilizar, mezclándose la preparación liofilizada con una disolución esterilizada antes de su administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requieran para una aproximación a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y agentes tamponantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y agentes similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.

La presente invención proporciona también formulaciones farmacéuticas de los virus de la presente invención con un vehículo y con un agente(s) de mejora de la entrega. Las expresiones "mejoradores de la entrega" o "agentes de mejora de la entrega" se usan aquí indistintamente e incluyen uno o más agentes que facilitan la incorporación del virus en la células diana. Ejemplos de mejoradores de la entrega se describen en las solicitudes de Patentes de EE.UU., en tramitación junto con la presente, Números de serie 09/112.074, presentada el 8 de julio de 1.998, y 08/938.089, presentada el 26 de septiembre de 1.997. Ejemplos de esos agentes de mejora de la entrega incluyen detergentes, alcoholes, glicoles, tensioactivos, sales biliares, antagonistas de la heparina, inhibidores de la ciclooxigenasa, disoluciones salinas hipertónicas y acetatos. Los alcoholes incluyen por ejemplo, alcoholes alifáticos tales como etanol, n-propanol, isopropanol, alcohol butílico, alcohol acetílico. Los glicoles incluyen glicerina, propilenglicol, polietilenglicol y otros glicoles de bajo peso molecular tales como glicerol y tioglicerol. Los acetatos tales como el ácido acético, ácido glucónico y acetato sódico son otros ejemplos de agentes de mejora de la entrega. Las disoluciones salinas hipertónicas como NaCl 1 M son también ejemplos de agentes de mejora de la entrega. Ejemplos de tensioactivos son dodecilsulfato sódico (SDS) y lisolecitina, polisorbato 80, nonilfenoxipolioxietileno, lisofosfatidilcolina, polietilenglicol 400, polisorbato 80, polioxietilén-éteres, poliglicol-éter, tensioactivos y DMSO. Se pueden usar sales biliares tales como taurcolato, tauro-desoxicolato de sodio, desoxicolato, quenodesoxicolato, ácido glicocólico, ácido glicoquenodesoxicólico y otros astringentes tales como nitrato de plata. También se pueden usar antagonistas de la heparina como las aminas cuaternarias, tales como sulfato de protamina. Se pueden usar inhibidores de la ciclooxigenasa tales como salicilato sódico, ácido salicílico y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDS) (del inglés, " Non-Steroidal Antiinflammatory Drug") como la indometacina, naproxeno, diclofenaco.

El término "detergente" incluye detergentes aniónicos, catiónicos, zwiteriónicos y no iónicos. Ejemplos de detergentes incluye, pero no se limitan a ellos, taurocolato, desoxicolato, taurodesoxicolato, cetilpiridio, cloruro de benzalconio, detergente Zwittergent 3-14, CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato, forma hidrato), Big CHAP, Desoxi Big CHAP, detergente Tritón-X-100, C12E8, Octil-B-D-Glucopiranósido, detergente PLURONIC F-68, detergente Tween 20 y detergente TWEEN 80 (CalBiochem Biochemicals).

Las formulaciones de dosificaciones unitarias de la presente invención pueden estar incluidas en un kit de productos que contienen el virus recombinante de la reivindicación 1 en forma liofilizada y una disolución para la reconstitución del producto liofilizado. Los virus recombinantes de la presente invención se pueden liofilizar mediante procedimientos convencionales y se pueden reconstituir.

Los vectores de la presente invención se pueden también administrar en combinación con inhibidores de calpaínas. La expresión inhibidor de calpaínas (abreviada "CI") se refiere a un compuesto que inhibe la acción proteolítica de la calpaína-I, p. ej., \mu-calpaína. La expresión inhibidores de calpaínas, según aquí se utiliza, incluye los compuestos que poseen una actividad inhibidora de calpaína I además de, o independientemente de, sus otras actividades biológicas. Una amplia variedad de compuestos han demostrado poseer actividad inhibidora de la acción proteolítica de las calpaínas. Ejemplos de inhibidores de calpaínas que son útiles en la práctica de la presente invención incluyen N-acetil-leu-leu-norleucinal, también conocido como "inhibidor 1 de calpaínas". Se ha observado que los inhibidores de calpaínas aumentan la infectividad de las células con respecto a los vectores víricos, mejoran la transcripción desde los promotores incrementando los niveles de los factores de transcripción NF-kappaB y AP-1 y disminuyen la respuesta CTL frente a los vectores adenovíricos. Por consiguiente, las formulaciones y los métodos de la presente invención pueden incluir opcionalmente inhibidores de calpaínas. Inhibidores de calpaínas y sus aplicaciones se describen en Atencio y col., solicitudes de Patentes de EE.UU., en tramitación junto con la presente, Números de serie 60/104-321 y 09/073.076, presentadas el 15 de octubre de 1.998.

Métodos de uso

La presente invención proporciona un método para destruir una célula que presenta un defecto en una ruta reguladora, poniendo en contacto esa célula diana con un vector de replicación selectiva de la presente invención. En una de las realizaciones de la invención, según aquí se ilustra, la célula que contiene un defecto en una ruta es una célula neoplásica. La expresión "célula neoplásica" se refiere a una célula que presenta un fenotipo de crecimiento aberrante, caracterizado por la independencia de los controles normales del crecimiento celular. Ya que las células neoplásicas no están necesariamente en replicación en un momento determinado, la expresión células neoplásicas comprende células que pueden estar en replicación activa o que pueden estar en un estado de reposo temporal no replicativo (G1 o G0). Las poblaciones localizadas de células neoplásicas se denominan neoplasias. Las neoplasias pueden ser malignas o benignas. Las neoplasias malignas también se denominan cánceres. El término cáncer se usa aquí indistintamente con el término tumor. Transformación neoplásica se refiere a la conversión de una célula normal en una célula neoplásica, con frecuencia en una célula tumoral.

La presente invención proporciona un método de ablación de células neoplásicas en el organismo de un mamífero in vivo mediante la administración de una formulación farmacéuticamente aceptable del adenovirus recombinante de la presente invención. El término "ablación" significa la reducción sustancial de la población de células neoplásicas viables de manera que se alivien las alteraciones fisiológicas debidas a la presencia de las células neoplásicas. El término "sustancial" significa una disminución en la población de células neoplásicas viables presentes en un mamífero, en más de aproximadamente el 20% de la población en pretratamiento. El término "viable" significa que tiene las características de crecimiento incontrolado y las características reguladoras del ciclo celular de una célula neoplásica. La expresión "célula neoplásica viable" se usa aquí para distinguir dichas células de las células neoplásicas que ya no son capaces de replicarse. Por ejemplo, una masa tumoral puede persistir después de un tratamiento aunque la población de células que forman esa masa tumoral esté muerta. Estas células muertas han experimentado ablación y carecen de la capacidad para replicarse, aunque puede persistir algo de masa tumoral.

El término "mamífero" incluye, pero no se limita a ellos, seres humanos, cerdos, caballos, ganado vacuno, perros, gatos. Preferiblemente se emplea un vector adenovírico endógeno con respecto al tipo de mamífero que está siendo tratado. Aunque generalmente es ventajoso utilizar un virus procedente de la especie que va a ser tratada, en algunos casos puede ser ventajoso usar vectores derivados de otras especies diferentes que poseen características patogénicas favorables. Por ejemplo, se ha informado (documento WO97/06826, publicado el 10 de abril de 1.997) que se pueden usar vectores adenovíricos ovinos en la terapia génica de seres humanos para minimizar la respuesta inmunitaria característica de los vectores adenovíricos humanos. Al minimizar la respuesta inmunitaria, se evita un aclaramiento sistémico rápido del vector y se obtiene como resultado una duración mayor de la acción del vector.

Los vectores de la presente invención se pueden aplicar de manera particular al tratamiento de tumores asociados con una falta de acción antiproliferativa de TGF-\beta que incluyen, pero no se limitan a ellos, carcinomas de mama, hepatomas, tumores gástricos, de colón y de piel, así como linfomas B y T (Markowitz y Roberts, 1.996). Se han identificado mutaciones del receptor de tipo II para TGF-\beta en carcinoma de colon, carcinoma gástrico y carcinoma escamoso de cabeza y cuello. También se han encontrado mutaciones o deleciones de receptores de tipo I en el sarcoma de Kaposi, tumores de mama, de ovario y tumores colorrectales. Entre los efectores intracelulares de la señalización producida por TGF-\beta, se han identificado los genes Smad y Smad4/DPC4 se identificó como un gen supresor de tumor candidato que estaba alterado en cerca del 50% de los cánceres pancreáticos. La alteración del gen DPC4 se ha encontrado también en tumores de colón, de mama y de ovario, aunque con una frecuencia mucho menor. Los vectores de la presente invención se pueden aplicar de manera particular al tratamiento de tumores no sensibles a TGF-\beta tales como el cáncer pancreático.

Los vectores de la presente invención se pueden también aplicar al tratamiento de células tumorales que contienen defectos en la ruta de p53. Estos tumores incluyen los tumores que poseen alteraciones en p53, mdm2 y p14/p19ARF(gen INK4a). Los vectores de la presente invención son también útiles para tratar células cancerosas que poseen defectos en la ruta de Rb. Los defectos en la ruta de Rb provienen de alteraciones en Rb, ciclina D, quinasa dependiente de ciclinas (tal como la CDK4) y p16(gen INK4a).

Aunque la presente invención proporciona un método de uso del adenovirus recombinante en solitario, los adenovirus recombinantes de la presente invención y sus formulaciones se pueden emplear en combinación con agentes quimioterapéuticos o con pautas terapéuticas convencionales. Ejemplos de estos agentes quimioterapéuticos incluyen inhibidores de la síntesis de purinas (p. ej., pentostatina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, metotrexato) o inhibidores de la síntesis de pirimidinas (p. ej., Pala, azarbina), inhibidores de la conversión de ribonucleótidos en desoxirribonucleótidos (p. ej., hidroxiurea), inhibidores de la síntesis de dTMP (5-fluorouracilo), agentes causantes de daño en el DNA (p. ej., radiación, bleomicinas, etopósido, tenipósido, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitoxantrona, agentes alquilantes, mitomicina, cisplatino, procarbazina) así como inhibidores de la función de los microtúbulos (p. ej., alcaloides de la vinca y colchicina). La expresión pautas quimioterapéuticas se refiere sobre todo a procedimientos no químicos diseñados para la ablación de células neoplásicas, tales como la radioterapia. Ejemplos de terapia combinada cuando el gen terapéutico es p53 se encuentran descritos en Nielsen y col., documento WO/9835554A2, publicado el 4 de agosto de 1.998.

La respuesta inmunológica es significativa frente a la administración repetida in vivo de vectores víricos. Por consiguiente, los vectores de la presente invención se pueden administrar en combinación con agentes inmunosupresores. Ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen ciclosporina, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, inmunoglobulina linfocítica, anticuerpos contra el complejo CD3, adrenocorticoesteroides, sulfasalazina, FK-506, metoxaleno y talidomida.

La presente invención también proporciona un método de ablación de células neoplásicas en una población de células normales contaminadas con dichas células neoplásicas ex vivo, mediante la administración a dicha población de un adenovirus recombinante de la presente invención. Un ejemplo de la aplicación de este método se emplea actualmente en aplicaciones ex vivo tales como el purgado de productos que contienen células troncales autólogas, comúnmente conocido como purgado de médula ósea. La expresión "producto que contiene células troncales" se refiere a una población de células hematopoyéticas, progenitoras y troncales, capaces de reconstituir la función hematopoyética estable de un paciente que ha recibido un tratamiento de mieloablación. Los productos que contienen células troncales se obtienen convencionalmente mediante aféresis de sangre periférica movilizada o inmovilizada. La aféresis se realiza convencionalmente mediante el uso de procedimientos conocidos, usando aparatos de aféresis comercialmente disponibles tales como el COBE Spectra Apheresis System, comercialmente disponible procedente de COBE International, 1185 Oak Street, Lakewood, CO. Se prefiere que las condiciones del tratamiento estén optimizadas para obtener una "purga 3-log" (es decir, la eliminación de aproximadamente el 99,9% de las células tumorales del producto que contiene células troncales) y más preferiblemente una "purga 5-log" (la eliminación de aproximadamente el 99,999% de las células tumorales del producto que contiene células troncales). En la práctica preferida de la invención, un producto que contiene células troncales que tenga un volumen de 100 ml, se trataría en una proporción de número de partículas respecto a células nucleadas de aproximadamente 2 x 10^{11} partículas de los vectores de la presente invención, durante un período de tiempo de aproximadamente 4 horas, a 37ºC.

Aplicaciones diagnósticas

Además de las aplicaciones terapéuticas anteriormente descritas, los vectores de la presente invención son también útiles con fines diagnósticos. Por ejemplo, los vectores de la presente invención pueden incorporar un gen reportero que se expresa después de la infección vírica o de la replicación. La expresión "gen reportero" se refiere a un gen cuyo producto es capaz de producir una señal detectable, solo o en combinación con elementos adicionales. Ejemplos de genes reporteros incluyen el gen de la \beta-galactosidasa, gen de la luciferasa, gen de la proteína fluorescente verde, secuencias de nucleótidos que codifican proteínas detectables mediante sistemas de formación de imágenes tales como los sistemas de formación de imágenes por rayos X o los sistemas de formación de imágenes en un campo magnético (MRI). Estos vectores serían útiles para detectar la presencia de una ruta funcional (p. ej., una ruta de p53 o una ruta de TGF-beta). Como alternativa, esos vectores también se pueden utilizar para expresar una proteína de superficie celular, capaz de ser reconocida por una molécula de unión tal como un anticuerpo marcados por fluorescencia. Como alternativa, en los casos en los que se usa un promotor que responde a una ruta para dirigir a un represor de promotores víricos tardíos (p. ej., E2F-Rb) de la replicación vírica (por ejemplo, E2 que es apagado por E2F-Rb o por cualquier otro promotor que contienen sitios de unión al represor, por ejemplo sitios de unión a E2F) se podría usar para dirigir al gen reportero en aplicaciones diagnósticas cuando el promotor que responde a una ruta está apagado. Estas construcciones diagnósticas se pueden usar con fines diagnósticos in vivo o in vitro. Ejemplos de las aplicaciones in vivo incluyen aplicaciones en técnicas de formación de imágenes tales como rayos X, escáneres de CT o formación de imágenes por resonancia magnética (MRI).

Métodos para preparar los vectores

La presente invención proporciona además un método para producir los virus recombinantes anteriormente descritos, comprendiendo dicho método las etapas de:

a. infectar una célula productora con un virus recombinante,

b. cultivar dicha célula productora en condiciones tales que se permite la replicación del genoma vírico en la célula productora,

c. recolectar las células productoras y

d. purificar el virus recombinante.

El término "infectar" significa exponer el virus recombinante a la célula productora en condiciones tales que se facilita la infección de la célula productora con el adenovirus recombinante. En células que han sido infectadas con múltiples copias de un virus determinado, las actividades necesarias para la replicación vírica y el empaquetamiento de los viriones son cooperativas. Por lo tanto, es preferible ajustar las condiciones de manera que exista una probabilidad significativa de que las células productoras se multiinfecten con el virus. Un ejemplo de una circunstancia que aumenta la producción de virus en la célula productora es el uso de una concentración incrementada de virus en la fase de infección. Sin embargo, es posible que el número total de infecciones víricas por células productora pueda sobrepasarse, produciendo efectos tóxicos en la célula. Por consiguiente, se debe procurar mantener las infecciones en la concentración de virus que está en el intervalo desde 1 x 10^{6} hasta 1 x 10^{10}, preferiblemente en una concentración de virus de aproximadamente 1 x 10^{9} viriones por ml. También se pueden utilizar agentes químicos para aumentar la infectividad de la línea de células productoras. Por ejemplo, la presente invención proporciona un método para aumentar la infectividad de líneas de células productoras en el caso de una infectividad vírica, mediante la inclusión de un inhibidor de calpaínas. Ejemplos de inhibidores de calpaínas, útiles en la práctica de la presente invención, incluyen el inhibidor 1 de calpaínas (también conocido como N-acetil-leucil-leucil-norleucinal, comercialmente disponible procedente de Boehringer Mannheim). Se ha observado que el inhibidor 1 de calpaínas aumenta la infectividad de las líneas de células productoras por adenovirus recombinantes.

La expresión "célula productora" significa una célula capaz de facilitar la replicación del genoma vírico del adenovirus recombinante que se ha de producir. Diversas líneas celulares de mamífero se encuentran a disposición pública para el cultivo de adenovirus recombinantes. Por ejemplo, la línea de células 293 (Graham y Smiley (1977) J. Gen. Virol. 36: 59-72) ha sido construida por ingeniería genética para complementar las deficiencias en la función de E1 y es una línea celular preferida para la producción de los presentes vectores. Ejemplos de otras células productoras incluyen células HeLa, células PERC.6 (según se describen en el documento WO/97/00326, Número de serie de la solicitud PCT/NL96/00244.

La expresión "cultivar en condiciones que permiten la replicación del genoma vírico" significa mantener esas condiciones de la célula productora infectada de manera que se permite que el virus se propague en la célula productora. Es conveniente controlar las condiciones de manera que se maximice el número de partículas víricas producidas por cada una de las células. Por consiguiente será necesario vigilar y controlar las condiciones de reacción tales como temperatura, oxígeno disuelto, pH, etc. Biorreactores comercialmente disponibles tales como el CelliGen Plus Bioreactor (comercialmente disponible procedente de New Brunswick Scientific, Inc., 44 Talmadge Road, Edison, NJ) cuentan con mecanismos para la vigilancia y el mantenimiento de esos parámetros. La optimización de las condiciones de infección y cultivo variará en cierta medida, aunque sin embargo, los expertos en la técnica pueden conseguir las condiciones requeridas para la replicación y la producción eficientes de los virus tomando en consideración las propiedades que se conozcan de la línea de células productoras, las propiedades del virus, el tipo de biorreactor, etc. Cuando se utilizan células 293 como línea de células productoras, la concentración de oxígeno se mantiene preferiblemente desde aproximadamente el 50% hasta aproximadamente el 120% de oxígeno disuelto, preferiblemente la concentración de oxígeno se mantiene en el 100% de oxígeno disuelto. Cuando la concentración de las partículas víricas (determinada mediante métodos convencionales tales como HPLC usando una columna Resource Q) inicia la fase de meseta, se realiza la recolección del reactor.

El término "recolectar" significa efectuar la recogida de las células que contienen el adenovirus recombinante procedentes del medio. Esto se puede realizar mediante métodos convencionales tales como la centrifugación diferencial o mediante medios cromatográficos. En esta etapa, las células recolectadas se pueden almacenar o se pueden procesar más mediante lisis y purificación para aislar el virus recombinante. Para su almacenaje, las células recolectadas deben estar tamponadas a pH fisiológico o a un pH aproximado al fisiológico y se deben congelar a -70ºC.

El término "lisis" se refiere a la ruptura de las células productoras. La lisis se puede realizar mediante diversos medios muy conocidos en la técnica. Cuando se desea aislar las partículas víricas a partir de las células productoras, las células se lisan usando diversos medios muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células de mamífero se pueden lisar en condiciones de baja presión (presión diferencial de 100-200 psi) o mediante métodos convencionales de congelación-descongelación. El DNA/RNA exógeno libre se elimina mediante degradación con DNasa/RNasa.

El término "purificar" significa aislar una población sustancialmente pura de partículas del virus recombinante a partir de las células productoras lisadas. Se pueden utilizar técnicas de purificación convencionales tales como métodos cromatográficos o métodos de centrifugación diferencial en un gradiente de densidad. En la práctica preferida de la invención, el virus se purifica mediante cromatografía en columna en acuerdo sustancial con el procedimiento de Huyghe y col. (1995) Human Gen Therapy 6: 1403-1416 según se describe en la solicitud de Patente de EE.UU., en tramitación junto con la presente, Números de serie 08/400.793, presentada el 7 de marzo de 1.995.

Métodos y procedimientos adicionales para optimizar la producción de los adenovirus recombinantes de la presente invención se encuentran descritos en la solicitud de Patente de EE.UU., en tramitación junto con la presente, Número de serie 09/073.076, presentada el 4 de mayo de 1.998 y titulada Viral Production Process.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos proporcionan la metodología y los resultados de experimentos que muestran la construcción de vectores adenovíricos y plasmídicos recombinantes particulares. Resultará evidente a los expertos en la técnica a la que esta invención pertenece, que la presente invención puede ser realizada de otras formas diferentes de las que se describen específicamente en estos ejemplos, sin apartarse del espíritu o de las características esenciales de la invención. Las realizaciones particulares de la invención que se describen a continuación se han de considerar por lo tanto como ilustrativas y no como restrictivas. En los siguientes ejemplos, "g" significa gramos, "ml" significa mililitros, "moles" significa moles, "ºC" significa grados centígrados, "min" significa minutos, "FBS" significa suero bovino fetal y "PN" significa número de partículas de virus recombinantes.

Ejemplo 1 Construcciones de los plásmidos

El p800luc, un plásmido que codifica luciferasa bajo el control de un promotor de PAI de 800 pb, se obtuvo procedente del Dr. David Lukskotoff (Scripps Institute, LaJolla, California). El plásmido pCTMIE-E2F-Rb que contiene un promotor de CMV seguido por una secuencia conductora tripartita del adenovidus 5 y una secuencia estimuladora de la transcripción de SV40 en dirección aguas arriba de la secuencia codificadora de la proteína de fusión E2F-RB, fue proporcionado por Doug Antelman (Canji).

Ejemplo 2 Construcción de plásmidos que codifican luciferasa con promotores que responden a TGF-\beta A. Plásmido que porta PAI-luciferasa

Las secuencias de todos los fragmentos se muestran en dirección 5' - 3'. Un fragmento de 749 pb flanqueado por los sitios SacI y XhoI en sus extremos 5' y 3' respectivamente, y con la caja TATA de SV40 en lugar de la caja TATA natural incluida en el promotor, se amplificó por PCR usando como molde p800luc y como cebadores AGT CGA GCT CCA ACC TCA GCC AGA y GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC (que contiene la caja TATA de SV40). El producto resultante de la PCR se digirió con SacI y XhoI y se ligó a un fragmento obtenido después de digerir PGL3-básico, construcción que codifica luciferasa y que carece de promotor (Promega), para obtener PAI-luciferasa.

B. Plásmido que porta SER-luciferasa

Los siguientes oligonucleótidos, GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGC CCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC y GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC se hibridaron. El producto hibridado se digirió con XhoI y se ligó a PGL3-básico digerido con MluI, se hizo de extremos romos con Klenow y se digirió con XhoI para obtener el pSVT-luc (una construcción que codifica luciferasa y que contiene la caja TATA de SV40). Oligonucleótidos que contienen sitios de unión a Smad4/DPC4, CGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC y AGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC se hibridaron y se ligaron a pSVT-luciferasa digerido con KpnI para obtener el plásmido que porta SRE-luciferasa.

Ejemplo 3 Construcción de plásmidos que codifican luciferasa con promotores que responden a p53 A. Plásmido que porta RGC-luciferasa

Se hibridaron dos oligonucleótidos complementarios fosforilados en 5', que contienen sitios de unión a p53 procedentes de la agrupación de genes ribosomales, AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AAC TCG TGG TAC y CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTG CCT TTT CTG TAC. Los fragmentos hibridados se ligaron a pSVT-luciferasa digerido con KpnI para obtener un plásmido que porta RGC-luciferasa.

B. Plásmido que porta p53CON-luciferasa

Se hibridaron dos oligonucleótidos complementarios fosforilados en 5', que contienen sitios consenso de unión a p53 (p53CON), CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC y AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC. Los fragmentos hibridados se ligaron a pSVT-luciferasa digerido con KpnI para obtener un plásmido que porta p53CON-luciferasa.

C. Plásmido que porta PAI-E2F-Rb

La secuencia que contiene el promotor de CMV seguido de la secuencia conductora tripartita del adenovirus-5 y de la secuencia estimuladora de la transcripción de SV40 en dirección aguas arriba de la secuencia que codifica la proteína de fusión E2F-RB en el plásmido pCTMIE-E2F-Rb se cortó mediante digestión con BglI y XbaI y el fragmento resultante se ligó para obtener el plásmido E2F-RB que carece de promotor. Un fragmento que contiene el promotor PAI modificado se cortó procedente del plásmido que porta PAI-luciferasa mediante digestión con SacI y XhoI, y se hizo de extremos romos tratándolo con Klenow. Este fragmento se ligó al plásmido E2F-RB que carece de promotor, que se digirió con EcoRI y se trató con el fragmento de Klenow de la DNA-polimerasa I para obtener el plásmido que porta PAI-E2F-RB.

Ejemplo 4 Generación de adenovirus recombinantes

Se construyó un plásmido de transferencia que contiene una secuencia del Ad5 con una deleción de 3 kb en la región de E3, el pNEB\DeltaE3, clonando un fragmento SnaBI de 7,4 kb, procedente del pBHG11 (de 26.676 a 34.140), en pNEB193 (plásmido derivado de NEB) tratado con BamHI, AccI y Klenow. Un sitio de clonación múltiple se introdujo en el plásmido anteriormente mencionado hibridándolo con oligonucleótidos fosforilados en 5', AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCC GCT CGC GAG GAT CCT TAA T y TAA GGA TCC TCG CGA GCG GCC GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T, e introduciendo el fragmento hibridado ligándolo al pNEB\DeltaE3 digerido con PacI para obtener el plásmido pNEB\DeltaE3(MCS).

Un plásmido de transferencia encargado de generar un adenovirus recombinante que codifica E2F-Rb bajo el control del promotor de PAI y que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) estimulada en la transcripción, bajo el control del promotor de CMV, se construyó de la siguiente manera. Se preparó un vector intermediario, pABS.4-E2F-Rb, ligando un fragmento que contiene el promotor de PAI y la secuencia codificadora de E2F-Rb preparada digiriendo PAI-E2F-Rb con NacI y XbaI y ligándolo a un fragmento del plásmido pABS.4 (Microbix) preparado mediante digestión con KpnI, tratamiento con Klenow y una nueva digestión con XbaI. Un fragmento que contiene el promotor de PAI, la secuencia que codifica E2F-Rb y el gen de la kanamicina, se escindió luego del plásmido PABS.4-E2F-Rb digiriéndolo con PacI, se trató con Klenow y se ligó a un fragmento del plásmido obtenido mediante digestión del plásmido pNEB\DeltaE3 con PacI y tratamiento con Klenow para obtener el plásmido pNEB\DeltaE3-PAI-E2F-Rb, que carece de sitio PacI. El gen de la kanamicina presente en este plásmido se reemplazó con el promotor de CMV operativamente ligado al gen de la proteína fluorescente verde (GFP) mediante digestión de pNEB\DeltaE3-PAI-E2F-Rb con SawI y ligándolo al fragmento aislado procedente de pEGFP-N (Clontech) mediante digestión con AflII y SspI y tratamiento con Klenow, para obtener el plásmido p\DeltaE3-PAI-E2F-Rb-GFP.

Los plásmidos de transferencia encargados de generar adenovirus recombinantes que codifican E2F-Rb bajo el control de un promotor que responde a TGF-\beta, con SRE y proteína fluorescente verde (GFP) estimulada en la transcripción bajo el control del promotor de CMV, se construyeron de la siguiente manera. La secuencia codificadora de E2F-Rb se introdujo en el plásmido pNEB\DeltaE3(MCS) para obtener el plásmido pNEB\DeltaE3-E2F-Rb ligando un fragmento aislado mediante digestión de pNEB\DeltaE3(MCS) con XbaI y NruI, y un fragmento generado mediante digestión de pCTMIE-E2F-Rb con XbaI y NaeI. Un promotor que responde a TGF-\beta y que contiene SRE se introdujo en el plásmido anteriormente mencionado amplificando esta secuencia por PCR, usando como molde SER-luciferasa y usando los cebadores fosforilados GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C y GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTC GGC CAC T. El producto resultante de la PCR se digirió con SpeI y se ligó en el pNEB\DeltaE3-E2F-Rb digerido con SnaBI y XbaI para obtener p\DeltaE3-DPC-E2F-Rb.

Los plásmidos de transferencia encargados de generar adenovirus recombinantes que codifican E2F-Rb bajo el control de promotores que responden a p53 y que codifican proteína fluorescente verde (GFP) estimulada en la transcripción bajo el control del promotor de CMV, se construyeron de la siguiente manera. Un promotor que responde a p53 y que contiene sitios de unión a p53 procedentes de la agrupación de genes ribosomales o de un sitio consenso de p53 (p53CON), se introdujo en el plásmido pNEB\DeltaE3-E2F-Rb mediante amplificación de la secuencia del promotor por PCR, usando como molde RGC-luciferasa o p53CON luciferasa y usando los cebadores fosforilados GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C y GAT ATC TAG ACG TCC TCT GTG GGC CAC T. Los productos resultantes de la PCR se digirieron con XbaI y se ligaron en el pNEB\DeltaE3-E2F-Rb digerido con SnaBI y XbaI para obtener p\DeltaE3-RGC-E2F-Rb y pdelataE3-PCON-E2F-Rb.

Ejemplo 5 Recombinación homóloga para generar adenovirus recombinantes

Los adenovirus recombinantes PAI-Ad, SRE-Ad, RGC-Ad y CON-Ad se generaron llevando a cabo una recombinación homóloga en bacterias según se encuentra descrito (Chartier y col. (1996) J. Virol. 70: 4805-4810). Los plásmidos de transferencia se digirieron con AscI para obtener los fragmentos que contienen E2F-Rb bajo el control de un promotor que responde a una ruta, y que contienen GFP bajo el control del promotor de CMV flanqueado por secuencias de Ad5. El fragmento resultante se utilizó para la cotransformación de la cepa bacteriana BJ5183 junto con un fragmento obtenido digiriendo PTG4609 (disponible procedente de Transgene, Inc. y descrito en Chartier y col., (1996) J. Virol. 70: 4805-4810) con BstBI y SpeI. Las colonias bacterianas resultantes se sometieron a escrutinio con respecto a la presencia de los plásmidos recombinantes deseados, portadores de la infección con Ad5, pPAI-GFP-Ad, pSRE-GFP-Ad, pRGC-GFP-Ad y pCON-GFP-Ad. Estos plásmidos infecciosos se linearizaron después mediante digestión con PacI y se purificaron mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol y se usaron para transfectar células 293.

La transfección se realizó usando Superfect (Qiagen) conforme a las instrucciones del fabricante. Se usaron 2,5 \mug de los plásmidos linearizados para transfectar 250.000 células cultivadas en placas de 6 pocillos con 12 \mul de Superfect/pocillo. A los 8 días se observó el efecto citopático debido a la producción de los virus. Las células se recolectaron junto con los sobrenadantes de los cultivos y se sometieron a tres rondas de ciclos de congelación-descongelación. Los virus recombinantes presentes en los lisados resultantes se amplificaron reinfectando células 293.

Ejemplo 6 Líneas celulares

Todas las líneas celulares usadas en este estudio se obtuvieron procedentes de la ATCC (Rockville, MD) y se cultivaron en forma de cultivos en monocapa, mantenidos a 37ºC en un incubador con CO_{2}. Las células 293, Hep3B, MRC9, A549, Panc1, U87, Caco2, MCF-7 y WIDR se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10%. Las células MDA-MB468 se cultivaron en medio de Ham complementado con suero bovino fetal al 10%, mientras que las células MiaPaca-2 se cultivaron en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10% y suero de caballo al 2,5%.

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Ejemplo 7 Transfección

Las células se sembraron en placas, en placas de 6 pocillos (250.000 células/pocillo) o en placas de 24 pocillos (62.500 células/pocillo) y se dejaron adherir toda la noche. Las transfecciones se llevaron luego a cabo usando fosfato cálcico en el caso de las células 293, según se encuentra descrito, y con Superfect (Qiagen) en el caso de las demás células, conforme a las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 8 Ensayos del gen reportero/luciferasa

Las células se transfectaron con 1,5 \mug de un plásmido reportero y 1,0 \mug de inhibidores. A las 48 h de la transfección, se prepararon los lisados añadiendo ... e incubando a temperatura ambiente durante 10 min en tampón de lisis 1X de reporte (Promega). La actividad de luciferasa se determinó usando un Top Count (Packard) y un kit analítico procedente de Packard, conforme a las instrucciones de Packard.

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Ejemplo 9 Ensayos para medir el efecto citopático mediado por virus

Las células se infectaron con los adenovirus recombinantes y de tipo salvaje indicados y se tiñeron con cristal violeta al 0,5%, preparado en etanol al 20%, 6 días después de la infección, en sustancial acuerdo con el procedimiento descrito en Bischoff y col., (1996) Science 274: 373-376.

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Ejemplo 10 Construcción de los virus cU3EE y cT1LT

La secuencia del promotor MLP se amplificó por PCR usando los cebadores GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCT AGG GC y GAT CTT AAT TAA ATG GCA GTG ACC CGG AAG y usando como molde DNA de Ad5 tal como el contenido en el plásmido pFG140 (Microbix). El producto del MLP resultante de la PCR se clonó luego en el sitio PacI del plásmido pdelataE3-PCON-E2F-Rb para obtener pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP. La secuencia que codifica la proteína E3-10,5K de adenovirus se amplificó por PCR usando los cebadores GCG ACC CAC CCT AAC AGA y GAT CGG ATC CAA AGC GCA ACA AGG GTC A y el producto resultante de la PCR se clonó en el sitio XhoI del plásmido pCDNA3,1 (Invitrogen) para obtener el plásmido pCDNA3-10,5. La secuencia que codifica la proteína E3-10,5K de adenovirus se escindió luego de pCDNA3-10,5 mediante digestión con DraIII y XbaI, seguida de tratamiento con Klenow, y se ligó en el pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP tratado con PacI y Klenow, para obtener el plásmido pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP-10,5K.

Los adenovirus recombinantes cU3EE y cT1LT se generaron llevando a cabo una recombinación homóloga en bacterias según se encuentra descrito (Chartier y col. (1996) J. Virol. 70: 4805-4810). El plásmido de transferencia se digirió con AscI para obtener los fragmentos que contienen E2F-Rb, bajo el control de la secuencia de p53CON, y E3-10,5K, bajo el control del promotor MLP flanqueado por secuencias de Ad5. El fragmento resultante se utilizó para la cotransformación de la cepa bacteriana BJ5283 junto con un fragmento obtenido digiriendo PTG4609 (Transgene) con BstBI y SpeI. Las colonias bacterianas resultantes se sometieron a escrutinio con respecto a la presencia del plásmido recombinante deseado, portador de la infección con Ad5, pCEMD. El plásmido portador de la infección con Ad5, p01/CEMD, se obtuvo siguiendo un protocolo similar pero usando un derivado de PTG4609 (Transgene) en el que la secuencia E1A de tipo salvaje se había sustituido por una secuencia que contenía E1A con la mutación 01. Estos plásmidos infecciosos se linearizaron después mediante digestión con PacI, se purificaron mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol y se usaron para transfectar células 293.

La transfección de los plásmidos pCEMD y p01/CEMD se realizó para generar los virus recombinante cU3EE y cT1LT respectivamente usando Superfect (Qiagen) conforme a las instrucciones del fabricante. Se usaron 2,5 \mug de los plásmidos linearizados para transfectar 500.000 células cultivadas en placas de 6 pocillos con 12 \mul de Superfect/pocillo. A los 8 días se observó el efecto citopático debido a la producción de los virus. Las células se recolectaron junto con los sobrenadantes de los cultivos y se sometieron a tres rondas de ciclos de congelación-descongelación. Los virus recombinantes presentes en los lisados resultantes se amplificaron reinfectando células 293.

<110> Canji, Inc.

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<120> Vectores víricos de replicación selectiva

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<130> CJ-0926 K Seq PCT

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<140> PCT/EE. UU. 99/21452

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<141> 14-10-1.999

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<160> 18

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<170> PatentIn Version 2.1

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<210> 1

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de PCR

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<400> 1

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agtcgagctc caacctcagg caga

\hfill

24

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<210> 2

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<211> 42

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de PCR

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<400> 2

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gatccgcgag ctccgctgtg ggccactgcc tcctcataaa ta

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42

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<210> 3

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<211> 44

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Adaptador para insertar la caja TATA de SV-40

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<400> 3

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ggtatttatg aggaggcagt ggcccacaga ggagctcgag gatc

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44

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<210> 4

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<211> 44

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Adaptador para insertar la caja TATA de SV-40

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<400> 4

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gatcctcgag ctcctctgtg ggccactgcc tcctcataaa tacc

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44

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<210> 5

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<211> 38

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebadores de PCR correspondientes a sitios de unión a SMDA4/DPC4

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<400> 5

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cgtctagacg tctagacgtc tagacgtcta gactgtac

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38

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<210> 6

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<211> 38

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebadores de PCR correspondientes a sitios de unión a SMDA4/DPC4

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<400> 6

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agtctagacg tctagacttc tagacgtcta gacggtac

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38

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<210> 7

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<211> 41

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sitios de unión a p53 procedentes de la agrupación de genes ribosomales

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<400> 7

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agaaaaggca aggccaggca agtccaggca cctcgtggta c

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41

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<210> 8

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<211> 41

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sitios de unión a p53 procedentes de la agrupación de genes ribosomales

\newpage

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<400> 8

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cacgagttgc ctggacttgc ctggccttgc cttttctgta c

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41

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<210> 9

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<211> 56

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sitios de unión correspondientes a dominios de unión a p53

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgacggac atgcccgggc atgtcctcga cggacatgcc cgggcatgtc ctgtac

\hfill

56

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 56

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sitios de unión correspondientes a dominios de unión a p53

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

aggacatgcc cgggcatgtc cgtcgaggac atgcccgggc atgtcggtcg aggtac

\hfill

56

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<210> 11

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<211> 46

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sitio de clonación múltiple

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<400> 11

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aaatacgtaa tgcattctag agcggccgct cgcgaggatc cttaat

\hfill

46

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<210> 12

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<211> 46

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sitio de clonación múltiple

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

taaggatcct cgcgagcggc cgctctagaa tgcattacgt atttat

\hfill

46

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<210> 13

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<211> 22

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebadores de PCR

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtaaggtgcc agaacatttc tc

\hfill

22

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<210> 14

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebadores de PCR

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatacctagt gctcctctgt gggccact

\hfill

28

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 35

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebadores de PCR correspondientes al promotor MLP

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<400> 15

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gatccgatcg atagcgcgta atatttgtct agggc

\hfill

35

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<210> 16

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebadores de PCR correspondientes al promotor MLP

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<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatcttaatt aaatggcagt gacccggaag

\hfill

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de PCR correspondiente a la proteína E3-10,5K de adenovirus

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<400> 17

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gcgacccacc ctaacaga

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18

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<210> 18

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de PCR correspondiente a la proteína E3-10,5K de adenovirus

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<400> 18

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gatcggatcc aaagcgcaac aagggtca

\hfill

28

Claims (20)

1. Un vector vírico recombinante de replicación selectiva que comprende un promotor que responde a una ruta, operativamente ligado a un represor de la replicación vírica, vector que se replica de manera selectiva en células neoplásicas que poseen un defecto en la ruta a la que el promotor responde.

2. El vector de la reivindicación 1, en la que las células neoplásicas son células tumorales.

3. El vector de las reivindicaciones 1 - 2, en el que el promotor que responde a una ruta se selecciona entre el grupo que consiste en un promotor que responde a la ruta de p53, un promotor que responde a la ruta de Rb y un promotor que responde a la ruta de TGF-beta.

4. El vector de la reivindicación 3, en el que el virus deriva del género de los adenovirus.

5. El vector de la reivindicación 4, en el que el represor de la replicación vírica es E2F-RB.

6. El vector de las reivindicaciones 1 - 2, que además comprende una casete de expresión de un transgén.

7. El vector de la reivindicación 6, en el que la casete de expresión de un transgén comprende un gen pro-apoptósico operativamente ligado a un promotor.

8. El vector de la reivindicación 7, en el que el gen pro-apoptósico es E3-10,5K de Ad5.

9. El vector de la reivindicación 8, en el que el promotor que responde a una ruta es un promotor que responde a la ruta de p53.

10. El vector de la reivindicación 9, en el que el vector que responde a la ruta de p53 es p53CON que tiene la secuencia:

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7

11. El vector de la reivindicación 10, en el que el componente promotor de la casete de expresión de un transgén es un promotor temporal.

12. El vector de la reivindicación 11, en el que el promotor temporal es el promotor principal tardío (MLP).

13. El vector de la reivindicación 12, que además comprende una deleción en la región que codifica la E1a adenovírica de manera que se elimina la unión a p300.

14. El vector de la reivindicación 13, en el que la deleción en la región que codifica la E1a adenovírica comprende una deleción de los aminoácidos 4 - 25 de la proteína E1a289R.

15. Una formulación farmacéutica que comprende como componente activo un vector recombinante de replicación selectiva según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, asociado con uno o más de sus vehículos farmacéuticamente aceptables.

16. Un método para destruir una célula que posee un defecto en una ruta, poniendo en contacto dicha célula ex vivo con un virus recombinante de replicación selectiva según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14.

17. Uso de un vector vírico de replicación selectiva según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, para la preparación de una composición farmacéutica para destruir una célula que posee un defecto en una ruta.

18. Uso según la reivindicación 17, en el que la composición farmacéutica se usa para tratar un cáncer.

19. Una célula aislada transformada con un virus recombinante de replicación selectiva que comprende un promotor que responde a una ruta, operativamente ligado a un represor de la replicación vírica.

20. Un procedimiento para producir un vector de replicación selectiva según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, procedimiento que comprende infectar una población de células productoras con una muestra de dicho vector, cultivar dicha línea de células productoras en condiciones que permiten la replicación de dicho vector en dichas células productoras y aislar el vector a partir de las células productoras.