TWI262948B

TWI262948B - Selectively replicating viral vectors

Info

Publication number: TWI262948B
Application number: TW088117803A
Authority: TW
Inventors: Muralidhara Ramachandra; Paul W Shabram
Original assignee: Canji Inc
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1999-10-14
Publication date: 2006-10-01
Also published as: JP2002541761A; CN1330715A; CZ301506B6; BR9914527A; NO20011843D0; CZ20011129A3; AU758354B2; JP2009254385A; EP1121441A2; CN101092636B; IL142337A; AR020897A1; NZ510805A; WO2000022137A2; IL142337A0; EP1121441B1; NO20011843L; CN101092636A; CN1325647C; WO2000022137A3

Description

1262948 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（1 發明背景·· 目前已經在各種治療攝生法中，使用重組的腺病毒來遞 =轉殖基因/然而，這些病毒載體系統的廣泛感染力，已經與该病毒在非·腫瘤細^ φ 街肥甲的表現，可能引起對非-瞀生細胞的附帶損害發生闕谏。1 /、兔玍關連。因此，已經發展出各種瞄準系統，以便優先在特定的細胞類型中表現轉殖基因。已經使用組織特異性和腫瘤特異性的啓動基因，優先在某些細胞類型中複製載體。例如，1997年1月16日公告之國際專利中4案第PCT/US/96/10838號（國際出版物第 WO97/01358號），描述藉著使用前列腺特異性啓動基因要素，駕馭Ε1、Μ或Μ功能，可視需要含有細胞毒性轉殖基因表現卡匣，使用在特定宿主細胞中複製的載體。特定而S，忒出版物描述的構築體，其中前列腺特異性促進子控制E1的表現，並具有表現卡匣，其包括駕馭插入E3區域之胞喊咬脱氨酶基因的CMV -啓動基因。這些載體是具有複製潛能的，並能夠在特定的細胞類型中，包裝成完整的病毒粒子。另一種使用腫瘤特異性啓動基因來駕馭病毒複製的方法’是在腺病毒Elb 55K蛋白質密碼序列中使用特定的刪除作用。在1997年10月14日建檔之美國專利第5,677,178 號中，描述了在編碼Elb 55K之核苷酸序列中含有缺陷的重組腺病毒。然而，已經觀察到這些組織或腫瘤特異性之控制要素是”有漏洞的”，也就是説，容許其在較佳之標靶細胞以外之的細胞類型中複製。 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅J事項再填寫本頁)

1262948 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（2 ) 另一類選擇性複製的载體，是使用含有廣泛排除£1功能的複製缺陷腺病毒载體。特定而言，已經使用含有E i、 E 2、E 3排除和邵份e 4刪除的載體來遞送外源性轉殖基因。已經使用這類載體將p53基因遞送至標靶細胞中。已經證實在P53缺陷（p53突變的或p53無效的）腫瘤細胞中表現外源性地投予野外型p53，能夠在該腫瘤細胞中謗導p53 調節的細胞程式死亡。目前由Schering c〇rp〇rad〇n and

Introgen Corporation開發遞送p53的這類病毒载體。再度證實這些載體在人類的治療應用上具有可接受的毒性特徵和治療效力，並在第II階段的人體臨床試驗中，用來處理與 P53有關之惡性疾病。至少在理論上，複製缺陷和選擇性複製之載體，具有臨床醫師擔憂的$又计缺點。因爲複製缺陷的载體在患者中將不會無法控制地繁殖，所以其在理論上具有較令人心動的安全特徵。然而，因爲有效的腫瘤排除，需要感染絕大部伤的腫瘤細胞’通常使用相當大莫耳過量的載體來確保治療的效力。更從安全性展望的論點來回顧選擇性複製的載體’因爲它們能夠在患者中複製，並可能突變形成具有完整複製潛能的載體。然而，藉著病毒在特定條件下繁殖的天然说力’而使得這些載體得以散布在腫瘤細胞周圍。因爲載體本身能夠複製，所以需要較低起始劑量的這類载體。這從免疫學的展望來看是有利的，並在這類製劑的製 ^上疋合乎經濟理由的。因此，在此項技藝中需要選擇性複製載體，其提出已察覺之安全性的問題，同時提供增強 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1262948 A7 B7 五、發明說明（3 ) 的治療指數。本發明藉著提供含有駕馭病毒複製阻遏物之表現的瞄準路徑之路徑-反應性啓動基因的選擇性複製腺病毒載體，使得载體優先在該路徑中有缺陷的細胞中複製，而解決了這些問題。本發明亦提供含有這類載體的醫藥調配物。本發明亦提供藉著使用這類載體，從正常細胞的族群中排除在該路徑中有缺陷之細胞的方法。本發明提供重組病毒，其選擇性地經由使用駕馭病毒複製之抑制劑之表現的路徑-反應性啓動基因，反映標靶細胞的細胞内條件來複製該病毒基因組，該病毒複製之抑制劑實質上以被感染細胞之表現型或基因型爲基礎，在宿主細胞中抑制該病毒的複製。在標乾細胞中，該路徑-反應性啓動基因的啓動要素是失活的，並因此容許該病毒複製。其結果爲：（1 )藉著該病毒的天然溶解特性殺死該細胞，並/ 或（2 )對該標靶細胞提供治療劑量的轉殖基因產物（與沒有複製潛能的載體相比較，其經過擴大），並（3)產生病毒的局邵濃度，有助於使周圍的標輕細胞感染該重組病毒。本發明更提供使用該載體之治療和診斷的方法，包含該載體的醫藥調配物，製造該載體的方法，以及包含該載體之轉化細胞。圖片簡述: 圖1 ·定出在TGF - /?路徑-反應性啓動基因（p AI或SRE)或 p53路徑-反應性啓動基因（RGC或p53 CON)的控制之下， -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------^訂h--------^ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1262948 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（4 ) 產生編碼E2F_Rb融合密碼序列之重組腺病毒載體的細胞病變效應之CPE分析結果。此外，以在該載體内亦併入編碼綠螢光蛋白質之基因者做爲報告者。方格A代表MRC - 9細胞’方格B代表Hep3B細胞，且方格C代表WIDR細胞。跑道1 :表現綠螢光蛋白質（GFP)之複製缺陷的（E 1刪除）重組腺病毒；跑道2 : PAI-Ad ;跑道3 : SRE-Ad ;跑道4 : RGC_Ad ;跑道5 : P53 CON-Ad。在圖的右邊指示顆粒濃度。圖2 ·説明利用路徑瞄準載體來表現GFP的螢光顯微鏡結果（上方）。方格A代表GFCB對照組載體，方格B爲SRE-Ad 載體’而方格C爲P53C0N-Ad載體。感染爲每毫升5xl05 個顆粒。圖3·以重組病毒U3EE(四邊形）、TILT(圓形）和L9IU (三角形）感染正常支氣管上皮細胞（方格A)和C33A細胞（方格 B )的結果。縱軸代表未感染對照組的百分比，橫軸代表以每毫升之顆粒數量計的病毒劑量。藉著使每種細胞的培養物與從每耄升1 05到1 〇 9個病毒顆粒之六種不同濃度的病毒接觸，來進行該實驗。使細胞與病毒接觸i小時，沖洗過量的病毒，並在感染之後六天，以MTS分析（promega， Madison, WI)實質上根據製造者的指示，定出存活細胞的百分比。橫線代表有5 〇 %細胞仍存活的含量。藉著資料產生曲線的X叉點’且橫虛線爲病毒E d 5 G的測量値。發明説明：本發明提供選擇性複製重組病毒，其包括路徑_反應性啓 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) imw--------訂"--------線

1262948 智慧財產局員工消費印 A7 五、發明說明（5 動基因’以可操作之方式與病毒複製的阻遏物連接。 "選擇性複製"一詞意指相對於其他的表現型態，能夠優先在-種表現型態的細胞中複製的載體。不同表現型態的實例，包括特定細胞類型之p53路徑缺陷對正常細胞。顯讀先複製的病毒，指出以指定之劑量含量，在標把細胞類型中，相對於相同類型之正常（對照組）細胞，至少更有效5倍。冑了決定病毒是否眞的是選擇性的，需要就許多因素，在標靶細胞和相同細胞類型的正常細胞中進行比較，評估該病毒複製的能力。車乂 4的疋比較特足载體在含有欲瞄準之條件的標把細 ^中，和在相同類型但不具有該條件之正常細胞中複製的月匕力例如在病母感染之後的第一個步驟，是謗導該細胞進入細胞周期，因爲最大病毒複製效率中所需的因素僅出現在S -期。然而，如果企圖就在腫瘤細胞中的選擇性來冲估載m的選擇性，評估其在腫瘤細胞中相對於在其他業已進入細胞周期之細胞（像是永存或經過轉化之細胞）中0複製把力，知要觀察病毒對於腫瘤細胞的選擇性至某種f度另外，已經觀察到不同的細胞類型，對於特定的 :毒具有極大差異的感染力。雖然有些病毒，像是腺病毒，具有廣泛的組織向性，但其他病毒則因其感染之細胞類型而有較多的限制。企圖評估特定載體在具^極大差異之感染力的細胞中的效能，將不易評估缺乏效力到底是因爲該载體在、細胞中的效能，或主要是因爲該病毒無法感染細胞。藉著在特定類型的標靶和正常細胞中評估選擇性， 1____ -8- 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1262948

五、發明說明（6 將感染力的影響減至最少。亦必須考量病毒生活史的暫時性質。例如，即使在感染之後早期’相對於正常細胞，野外型載體顯然在腫瘤細胞中具有選擇性，可能因爲細胞業已進入周期。然而，在病毒已經刺激細胞周期的期間内，減少該顯著的選擇性。因此’在感染之後評估選擇性的時間，必須足以避免在正常細胞中最初的複製遲滯。雖然將依據使用之病毒類型而改變’但熟諳此藝者可輕易地定出最初的遲滯。在k實特足之重組腺病毒在標乾細胞類型中是否有選擇性效力的測定中，必須考量劑量的影響。例如，目標爲減少腫瘤細胞，並測量受到細胞毒性的影響，可藉著不同的劑量使病毒明顯地具有選擇性細胞毒性。已經觀察到足夠咼的劑里’差不多任何病毒，無論其基因組已經修改至何種程度’都將是有細胞毒性的，這是由於出現已知具有細胞毒性之病毒蛋白質（像是在腺病毒的案例中爲六聯體）的單純影響。同樣的，即使科學文獻可將某個病毒稱爲”複製缺陷的”（暗示該病毒絕對無法在缺乏能夠互補該病毒缺陷的細胞株之下複製），但這類病毒被更精確地描述爲”減弱複製作用”。例如，含有完整E1區域之刪除的腺病毒，通常將其稱爲”複製不完全的”或”複製缺陷的”，其將會複製至某種程度，特別是在循環中或快速分裂的細胞中。如同

Mulligan觀察到的（1990, Science 260 : 926-932):

雖然已經顯示E 1 £的表現影響其他複製所必要之病毒基因產物的表現（引用Horwitz，M.，在Vir〇i〇gy B N -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

1262948 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（9 ) 表1.病毒之RTI和選擇性指數的概述病毒 RTI(正常細胞） RTI(腫瘤細胞）選擇性指數 L9IU 1.0 1.0 1.0 U3EE 12.5 0.0233 536 TILT 10 0.066 152 如同從提供之資料中所見，U3EE和TILT病毒對於腫瘤細胞具有高選擇性。如同先前的討論，L9IU病毒在開始周期之腫瘤細胞中，相對於靜止的正常細胞，具有微不足道的複製優點。藉著在計算選擇性指數之前，在每種細胞類型中比較ED5〇(病毒）/ED5G(對照組）之比例，將這類變數的影響減至最小。 ’’重組’’ 一詞意指已經經由傳統重組DN A技術來修改的基因組。 ”病毒π —詞意指任何不具有蛋白質-合成或能量-產生機制的必需在細胞内之寄生蟲。病毒的基因組可以是含有脂質膜之蛋白質外殼結構的RNA或DNA。在本發明之實施例中有用的實例包括桿狀病毒、微小病毒、細小核糖核酸病毒、痕療病毒、痘病毒、腺病毒、細小核糖核酸病毒。重組病毒一詞包括嵌合型（或甚至是多價的）病毒，也就是使用互補密碼序列，從一個以上病毒亞型來建構的載體。參見例如Feng等人，Nature Biotechnology 15 : 866-870 〇 π腺病毒’’ 一詞爲’’腺病毒載體”的同義字，並意指腺病毒屬的病毒。腺病毒一詞集體地意指肥胖腺病毒屬的動物腺 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1262948 A7 五、發明說明（10 部智慧員病毒，包括但不限於人類、牛、鳥類、馬、犬、豬、老鼠和猿猴腺病毒亞屬。特定而言，人類腺病毒包括心屬，及其個別的血清型，A_F亞屬包括但不限於毒第卜2、3、4、^5、6^、^^^ 和 Ad11P) 、 12 、 13 、 14 、 15 、 16 、 i7 i8 19 19a、2〇、21、22、23、24、25、26、27、28 29、 3〇、3卜 32、33、34、34a、35、35p、36 3 7 3 8、 39、40、41、42、43、44、45、46、47 48 和91型。牛腺病毒—詞包括但不限於牛腺病毒第1、2、3、4、7和 10型。犬腺病毒一詞包括但不限於犬第丨（品系CLL、 GUxo、RI261、Utrect、T〇r〇nt〇 26 6 1)和2 型馬腺病毒了詞包括但不限於馬第型。豬腺病毒一詞包括但不限於豬第3和4型。在本發明較佳的實施例中，腺病毒係衍生自人類腺病毒血清型第2或5型。路徑-反應性啓動基因”一詞意指與某些蛋白質結合的 DNA序列，並引起附近基因對在正常細胞中的蛋白=合產生轉錄反應。可藉著併入與轉錄因子結合之序列的反應要素，產生這類啓動基因。這類反應通常是可謗導的，雖然有數個案例，其中增加蛋白質含量便降低轉綠作用。路徑-反應性啓動基因可以是天然存在的或合成的。通常參考所瞄準之路徑或功能蛋白質來建構路徑_反應性啓動基因。例如，天然存在的P53路徑·反應性啓動基因，包括藉著功能性p53的出現而激活之轉錄控制要素，像是p32或^狀啓動基因。另外，亦可使用含有在最低需求之啓動基因上游訂線製 13- I紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A^^(21〇 χ 297公釐） A7 1262948 B7__ 五、發明說明（11 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的p53結合位置之合成啓動基因（例如S V40 TATA盒子區），來產生合成的路徑·反應性啓動基因。合成的路徑-反應性啓動基因通常從一或多個與一致結合部份相配之序列的副本來建構。可輕易地定出這類一致DN A結合的特徵。這類一致序列通常按直線或頭-對-尾之重覆排列，並藉著少數的鹼基對分開。將包括頭-對-頭重覆段的要素（例如 AGGTCATGACCT)稱爲迴文或反轉的重覆段，而具有尾一對-尾重覆段的那些則稱爲外翻的重覆段。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在本發明實施例中有用的路徑反應性啓動基因之實例，包括含有一致胰島素結合序列之合成的胰島素路徑-反應性啓動基因（Jacob 等人（1995)，J· Biol· Chem. 270 : 27773-27779)，細胞分裂素路徑-反應性啓動基因，糖皮質激素路徑-反應性啓動基因（Lange等人（1992)厂：6丨〇1.(：1^111.267· 15673-80)，IL1和IL6路徑-反應性啓動基因（Won Κ.-A和 Baumann Η. (1990) Mol. Cell. Biol. 10 : 3965-3978)，T 3 路徑-反應性啓動基因，含有一致特徵：5’AGGTCA3’的甲狀腺荷爾蒙路徑-反應性啓動基因，TPA路徑-反應性啓動基因（TREs)，TGF· 路徑-反應性啓動基因（如同在 Grotendorst 等人（ 1996) Cell Growth and Differentiation 2_ ·· 469-480 )。其他的路徑·反應性啓動基因之實例爲此項技藝中已熟知的，並可經由網際網路，在http : //www. eimb.rssi.ru/TRRD 進入 Transcription Regulatory Regions on Eukaryotic Genomes 的資料庫中確認0 在本發明較佳的實施例中，如同在本文中舉例説明的， -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1262948 A7 B7 五、發明說明（12 ) 包括合成的TGF _/?路徑-反應性啓動基因之載體，其在有功能之TGF _ /?路徑的存在下是有活性的，像是含有SRE和 ΡΑΙ-RE反應要素的啓動基因。ΡΑΙ-RE意指合成的TGF-A 反應要素，其包括對分離自血纖維蛋白溶酶原激活劑-1啓動基因區之TGF- 信號起反應的序列。ΡΑΙ-RE的建構描述在本文的實例3中。PAI-RE路徑-反應性啓動基因，可以749個鹼基對之片段分離自質體p8001uc(如同在 Zonneveld 等人（1988) PNAS 85 : 5525 : 5529 中的描述，並可以登錄編號J03836，購自GenBank)。SRE意指含有四個 Smad-4 DNA結合序列重複段（GTCTAGAC，如同在Zawel 等人（1988) Mol. Cell 1 : 611-617)的合成 TGF- 反應要素。SRE的建構描述在本文的實例3中。可藉著使編碼 Smad-4結合序列之互補寡核苷酸退火，並在質體pGL#3-啓動基因蟲螢光素酶載體（購自ProMeGa)中選殖，產生 SRE反應要素。同樣的，’’p53路徑·反應性啓動基因”意指在有功能之p53 路徑的存在下具有活性的轉錄控制要素。p53路徑-反應性啓動基因可以是天然存在的轉錄控制區，其在有功能之 p53路徑的存在下具有活性，像是p 2 1或mdm2啓動基因。另外，p53路徑-反應性啓動基因亦可以是合成的轉錄控制區，其在有功能之p53路徑的存在下是具有活性的，像是 SRE和ΡΑΙ-RE路徑-反應性啓動基因。p53-CON描述含有合成之p53反應要素之p53路徑反應性啓動基因，其藉著將兩個合成的p53 —致DNA結合序列（如同在Funk等人 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -—------------------訂---------"^一^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1262948 B7_ _ 五、發明說明（13 ) ( 1992) Mol· Cell Biol. jj_: 2866-2871 中的描述）插入 SV4〇 TATA盒子的上游來建構之。p53_c〇N路徑-反應性啓動基因的建構描述在本文的實例3中。RGC意指使用在核糖體基因簇中確認之單一 p53結合功能部位的合成p53路徑-反應性啓動基因。Kern 等人（1991) Science 252 : 1708-1711 和 Park 等人（ 1996) Molecular Carcinogenesis 16 : 101-108。可藉著使互補的寡核甞酸退火來建構p53C〇N和RGC反應要素’並可藉著在質體pGL3 -啓動基因蟲螢光素酶載體（購自 ProMega)中選殖來建構p53反應性啓動基因（更完整地描述在實例3中）。 ”標乾細胞”一詞意指具有特定表現型態的細胞，其想要藉著投予治療性轉殖基因來處理。藉著使用各種路徑反應性啓動基因要素，可使病毒的表現瞄準任何具有完整路徑的特定細胞。例如，可經由使用TGF -卢或p53路徑反應性啓動基因，在贅生的標靶細胞中表現病毒複製的阻遏物。同樣地’可經由炎症反應性啓動基因，其中該載體可視需要編碼I L - 1 〇，在關節炎的標靶細胞中表現病毒複製的阻遏物。 ’’以可操作之方式連接，，一詞意指多核甞酸以功能上的相互關係連接。當核酸序列與其他的核酸序列以功能上的相互關係放置時，其爲”以可操作之方式連接的”。例如’若啓動基因或促進子以可操作之方式與密碼序列連接，則其影響該密碼序列的轉錄。以可操作之方式連接’意指待連接之核苷酸序列通常是相鄰的。然而，當 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —JI——— -!!丨訂-------I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 141262948 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（促進子與啓動基因被數千個 …1 % ’吊w是哥功能的，且插入的序列可具有各種長度，有一些多核嘗酸要素可能是以可操作之万式連接的，但不是直接位在側面，且甚至得自不同對偶基因或染色體的反式亦可能是有功能的。 ”病毒複製的阻遏物”一詞意指一蛋白質，如果在特定的細胞中表現，實質上阻遏了病毒的複製。如同熟諳此藝者已知曉的，病毒複製的阻遏物將依據從其中衍生出= 發明之重組載體的親代腺病毒載體之性質而定。例如在腺病毒載體或其他DNA腫瘤病毒的案例中，可使用在19^ 年12月6曰公告之歐洲專利申請案第941〇8445」號（公告編號0 685 493 A1)中描述的E2F-Rb融合構築體。E2F_Rb融告蛋白質包括與Rb生長抑制功能部位（野外型尺]3蛋白質之^ 基酸379-928)融合的人類E2F轉錄因子蛋白質之dna結告和DP1異種二聚化作用之功能部位（野外型Ε2ρ之胺 95-286)。E2F-Rb融合蛋白質是E2F_依賴性轉綠作用的有效阻遏物，並使細胞停在G1。DNA結合功能部位位在胺基酸128-193處，而二聚化作用功能部位則位在ΐ94·289處: 人類E2F·!蛋白質的序列可以登錄編號M96577購自 GenBank，其於1992年8月1〇日存放。當建構在其他物稽 :使用之載體時，可使用得自其他物種之其他㈣家族成貝的E2F序列。在此種場合中，以與腺有關之病毒騎爲基礎的重組病毒、rep蛋白質及其衍生物，爲在缺乏腺病毒感染之下，病毒複製的有效阻遏物。在其中病毒衍生 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ii 訂---------線· -17

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五、發明說明（15 ) 单純癌療病毒的場合中、ICPO_NX，速發早期蛋白質ICPO 的删除形式（Liun等人（1998) J vir〇1 72 : 7785-7795)，可使用該蛋白質做爲病毒複製的有效阻遏物。同樣地，可使用任何具有顯性陰性活性之蛋白質做爲病毒複製的阻遏物。 TGF_々和相關蛋白質，包括激活素（activin)、抑制素 (inhibit!)和BMP，是有效的天然抗-增殖劑，並相信其在腫瘤生成性的抑制作用中扮演著重要的角色。TGF - A具有生物活性的形式，爲25-kDa之二硫-連接的同二聚體，並在幾乎所有的人類組織中表現。令人感興趣的是，許多惡性細胞類型仍保留了在正常細胞中所看到的表現形式。認爲 TGF - A信號是第ϊ型和第〗〗型絲胺酸/蘇胺酸激酶受體的異種聚合之（heteromeric)受體複合物。在這兩個受體激酶之中’第11型受體具有内在的激酶活性，並與TGF -卢配位體結合，第II型受體與轉磷酸酶第I型受體進行異種聚合作用。第I型受體的磷酸化作用激活其激酶活性，其轉而產生 Smads的轉酸化作用，該Smads爲細胞内的效應物。瑪酸化的第I型受體在細胞内部傳達信號，導致細胞的反應類似生長抑制。一旦在核的内部，已知Slnad複合物藉著本身做爲轉錄因子，或藉著調節其他轉錄因子的活性，來激活標乾基因的轉錄。咸相信藉著TGF - 信號來調節轉錄因子，包括 CTF/NF-1、FAST-1、Spl、Jun、SRF/TRF、〇ct 和 CREB。這些交互作用的淨結果導致各種已知的tgf - 多效效應。 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1262948 B7_ 五、發明說明（16 ) 轉化生長因子 /? ( TGF - /?)和相關蛋白質是許多細胞類型增殖的有效抑制劑。數個上皮和造血來源之腫瘤的惡性發展，與喪失TGF _/?的抗-增殖和抗-侵襲作用有關。已經顯示TGF - /?發送信號的失敗，涉及信號傳導路徑之受體及 /或細胞内效應物的突變或刪除或缺乏表現。許多對TGF -yS有抵抗力的惡性腫瘤，對於其他腫瘤抑制劑基因亦具有多重缺陷，因此限制了替換腫瘤抑制劑基因之有效治療的效用。藉著將得自血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑-1的序列 (PAI-啓動基因），或Smad4/DPC4的結合位置（SRE-啓動基因）併入SV40 TATA盒子的上游，來建構TGF - yS路徑反應性啓動基因。在暫時轉移感染分析中，使用蟲螢光素酶做爲報告者，來評估這些啓動基因的活性。在下文表2中提供該結果：表2.相對的蟲螢光素酶活性*(倍）細胞株 TGF_/?路徑 PAI啓動基因-TGF-卢 PAI啓動基因+TGF-/? SRE啓動基因-TGF·/? SRE啓動基因+TGF-/? Hep3B 正常的 68.82 128.42 105.02 86.47 293 正常的 51.62 88.78 9.40 46.94 A549 正常的 33.26 56.76 2.87 17.93 Panel 正常的 15.36 141.80 1.14 29.03 U87 正常的 110.40 73.88 7.42 7.85 MCF-7 有缺陷的 18.93 10.72 1.28 1.22 WIDR 有缺陷的 10.66 4.41 1.24 1.57 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------- I 訂---------*5^ . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1262948 A7 ____ B7 五、發明說明（17 ) MDA-MB468 有缺陷的 2.28 1.10 1.33 0.62 AsPC-1 有缺陷的 6.56 1.24 1.79 0.76 Caco2 有缺陷的 13.01 13.8 1.18 0.96 MicaPaca2 有缺陷的 14.08 1.81 0.79 26.34 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *以相對於在無啓動基因之構築體中獲得的活性來表示螢光素酶活性這些結果證實這兩個啓動基因僅在具有有功能之TGF - 信號轉導的細胞中是有活性的。TGF - /?路徑缺陷之細胞株中，像是MDA-MB468，其具有TGF - 信號轉導之缺陷，因爲Smad4/DPC4之同種接合子的刪除，以可操作之方式與蟲螢光素酶連接的PAI -啓動基因或SRE -啓動基因之轉移感染，以及利用編碼Smad4之重組腺病毒的感染，恢復了上文兩個反應要素的活性，進一步藉著在下文表3中提供之資料，證實了含有這些反應要素的啓動基因對於TGF-/? 路徑的特異性。表3 .在以編碼Smad4/DPC4之重組腺病毒感染的MDA-Μ B - 468細胞中恢復TGF - 反應性啓動基因之活性（相對於蟲螢光素酶之活性* (倍））病毒劑量 PAI啓動基 PAI啓動基 SRE啓動基 SRE啓動基因-TGF-0 因+TGF-/? 因 _TGF-y5 因+TGF-/5 BGCA lxlO8 1.0 1.53 1.00 1.00 BGCA lxlO9 0.86 1.06 0.33 0.77 DCCA lxlO8 1.13 4.86 8.50 139.17 DCCA lxlO9 1.93 31.60 22.0 370.84 *以相對於在帶有BGCA、缺乏TGF-yS加入之構築體中所獲得的活性來表示蟲螢光素酶活性。BGCA爲表現/?_ gal基因之重組腺病毒。DCCA爲編碼Smad4/DPC4之重組腺病毒。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1262948 A7 B7 五、發明說明（18 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 然後建構含有以可操作之方式與E2F-Rb連接之PAI-啓動基因的質體，並測試其在具有完整TGF - A路徑的細胞中選擇性壓抑E 2啓動基因的能力。在暫時轉移感染的分析中，如同表4中所示，與蟲螢光素酶連接之E2啓動基因，與以可操作之方式連接E2F-Rb的PAI-啓動基因的共同轉移感染，顯示在293細胞（具有正常TGF ·/?路徑）中選擇性壓抑 E2啓動基因活性，但不在MDA· MB 468細胞（具有有缺陷的TGF -卢路徑）中壓抑，因爲E2F-Rb在293細胞中選擇性表現。如同預期的，在這些細胞株中，與表現E2F_Rb之 CMV-E2F-Rb的共同轉移感染，抑制了 E2啓動基因在兩種細胞株中的活性。表4.在293細胞對MDJ 壓抑E2啓動基因的活4 V-MB-468細胞中，藉著PAI-E2F-Rb選擇性〖生（相對的蟲螢光素酶活性*(%)) 阻遏物 MDA-MB-468 細胞 293細胞無 100 100 CMV-E2F-Rb 9.38 10.53 PAI-E2F-Rb 124.02 17.38 *以相對於在無啓動基因之構築體中獲得的活性來表示蟲螢光素酶活性。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製藉著併入得自核糖體基因簇之已知的p53結合位置 (RGC -啓動基因）或高親和力之p53結合位置（p53 con -啓動基因），建構p53路徑反應性啓動基因。在暫時轉移感染的分析中’使用蟲螢光素酶作爲報告者，來評估這些啓動 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格匕10 X 297公t )--- 1262948 A7 Β 五、發明說明（19) 基因的活性。在下文的表5中提供這些實驗的結果。表5.p53反應性啟動基因在各種細胞株中的活性（相對的蟲螢光素酶活性* ) 細胞株 p53狀態 p53CON啟動基因 RGC-啟動基因 U87 野外型 3,921.12 112.33 A549 野外型 647.30 16.36 MCF-7 野外型 445.25 12.26 293 野外型；失活的 13.03 0.62 Hep3B 無效的 4.62 1.22 NCI-H358 無效的 0.35 0.56 Panel 突變種 1.56 1.02 WIDR 突變種 16.17 1.07 MDA-MB-468 突變種 4.88 0.87 AsPC-1 突變種 0.54 1.08 Caco-2 突變種 14.59 1.13 MicaPaca2 未知的 28.43 1.24 *以相對於在無啟動基因之構築體中獲得的活性來表示蟲螢光素酶活性。 -—------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製結果顯示這兩種反應要素在具有ρ 5 3功能的細胞中是有活性的。為了證實p53反應性啟動基因的活性是因為有功能的p53，以駕馭蟲螢光素酶基因表現之RGC啟動基因和空卡匣之對照組腺病毒載體（ZZCB)，或在組成上在CM V啟 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1262948 Α7 _Β7 五、發明說明（2Q ) 動基因之控制下產生p53的重組腺病毒（FTCB)，共同轉移感染兩個細胞株WIDR和U 8 7。在表6中提供這些實驗的結果。表6.在利用編碼p53之重組腺病毒感染的WIDR和U87細胞中， p53反應性啓動基因之活性的恢復/促進（相對於蟲螢光素酶活性*). 病毒劑量 WIDR U87 ZZCB lxlO8 1.0 1.0 ZZCB lxlO9 1.25 0.67 FTCB lxlO8 4.71 20.30 FTCB lxlO9 29.00 109.95 *以相對於利用ZZCB感染而獲得的活性來表示蟲螢光素酶活性。如同從所提供之資料中所見，p53 -反應性啓動基因以劑量_ 依賴性之方式隨著p53活性的增加而增加。產生在TGF- 路徑反應性啓動基因（P AI或SRE)或p53 路徑反應性啓動基因（RGC或p53CON)的控制之下，編碼 E2F_Rb融合密碼序歹丨J的重組腺病毒載體。此外，亦在該載體中併入編碼綠螢光蛋白質的基因，做爲報告者。在細胞病變效應（CPE )分析中，測試所得的病毒在具有TGF - /?或 p53路徑缺陷之細胞中選擇性複製並殺死該細胞的能力。在附錄的圖1中出示其結果。在MRC9(p53路徑陽性和 TGF - /?路徑陽性）中，野外型腺病毒能夠複製並謗導 CPE，即使是在低濃度（1 X 1 0 6個顆粒/毫升）下，而瞄準 TGF·/?或p53路徑之載體以該濃度無法謗導CP£。僅在最 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---r-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1262948 A7 B7 五、發明說明（21 ) 高的受試劑量（1X 1 0 8個顆粒/毫升）下，瞄準路徑之載體顯 (請先閱讀背面之注音3事項再填寫本頁) 不出一些CPE。相反的，在諸如WIDR(在p53和TGF- 路徑中有缺陷）和Hep3B (在缺乏外源性TGF - /?時，爲p53無政的並具有TGF _ A路徑缺陷）之類的細胞株中，瞄準路徑之载體有效地謗導CPE，類似野外型病毒，即使是在低濃度（lxlO6個顆粒/毫升）下。以瞄準路徑之載體（SRE_Ad 和p53Con-Ad)感染之Hep3B細胞的螢光顯微鏡分析中，顯示轉殖基因的南量表現’且病毒散布在培養物内，即使是以低顆粒濃度（i x i 〇 5個顆粒/毫升接觸2小時）來感染。相反地’以相同濃度（lxl〇5個顆粒/毫升）複製缺陷（E1A_ 刪除）的編碼GFP之腺病毒（GFCB)感染Hep3B細胞，顯示無G F P的表現。如同先則所指出的，本發明之載體能夠在選定的條件下，選擇性地複製並溶解該標靶細胞。然而，並不表示其他層、’及的選擇性或毒性不能被設計成這些載體。本發明亦提仪口有對病母基因組之額外修改的重組腺病毒，像是瞄準的修改、轉殖基因的表現卡E，或修改病毒的基因組，以便促進在特定細胞類型或表現狀態中的選擇性複製。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製晦準修改一凋意指有計劃地修改病毒基因組，導致對 =&:胞類型有優先的感染力。亦可藉著修改病毒的被膜 a :貝纟何生自具有廣泛感染力之特徵的病毒，像是腺病母的載體中，達到細胞類型的特異性或得以瞒準某些細 :土你J如’已經藉著選擇性修改病毒基因組的把手和碼序列，相使、㈣修改之把手和纖維功能部位表 I - 24 - t m ^m\cNS)A4wT(210 X 297 7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1262948 A7 B7 五、發明說明（22 ) 現，而與獨特之細胞表面受體具有特異性交互作用的目的，完成利用腺病毒來瞄準細胞。在Wickham等人（ 1997) J. Virol 71(1 1) : 8221·8229(將RGD肽併入腺病毒的纖維蛋白質中）；Amberg 等人（ 1997) Virology 227 : 239-244(修改腺病毒的纖維基因，獲得對眼睛和生殖道的向性）；Harris和 Lemoine (1996) TIG 12(10) : 400-405 ; Stevenson 等人（ 1997) J. Virol. 71(6) : 4782-4790 ; Michael 等人（1995) genetherapy 2 : 660-668 (將促胃酸激素釋放肽片段合併到腺病毒纖維蛋白質内）；和Ohno等人（I"7) Nature Biotechnology 15 : 763-767 (將蛋白質A_IgG結合功能部位合併到Sindbis病毒内）中描述了這類修改的實例。其他特異地瞄準細胞的方法，已經藉著使抗體或抗體片段與被膜蛋白質結合來完成（參見例如Michael等人（1993) J. Biol. Chem. 268 : 6866-6869，Watkins 等人（ 1997) Gene Therapy 4 : 1004-1012 ; Douglas 等人（ 1996) Nature Biotechnology 14 : 1574-1578)。另外，亦可使特定的部份與病毒表面結合來完成聪準（參見例如Nilson等人（1996) Gene Therapy 1: 280-286(使EGF與反轉錄病毒蛋白質結合）。可根據本發明之實施例，來產製這些以重組方式修改的載體。 ”轉殖基因表現卡匣” 一詞意指在標輕細胞中有功能的啓動基因，以可操作之方式與治療性轉殖基因連接。啓動基因一詞意指影響其他核苷酸序列之轉錄的核苷酸序列。啓動基因的實例包括弱的組成啓動基因、暫時性病毒啓動基因，或可調節的啓動基因。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -I1111111 ^ 11111111 · A7 1262948 B7 五、發明說明（23 ) ’’暫時性啓動基因”一詞意指相對於控制路徑-反應性啓動基因之表現的啓動基因，在病毒周期之後的瞬間，駕馭轉錄或治療性轉殖基因的啓動基因。這類暫時性調節的啓動基因之實例，包括腺病毒主要晚期啓動基因（MLP)、其他的晚期啓動基因，如E 3。在本發明較佳的實施例中，使用 M L P啓動基因。至於單純疱疹病毒，可使用潛伏激活的啓動基因。 ”可調節之啓動基因，，一詞意指可謗導的啓動基因，組織特異性或腫瘤特異性之啓動基因。”可謗導之啓動基因”一詞，意指在某些條件下，及/或對外在的化學物質或其他刺激起反應’有助於治療性轉殖基因之優先（或單獨）轉錄。可謗導之啓動基因的實例，在科學文獻中是已知的（參見，例如 Yoshida和 Hamada(1997) Biochem. Biophys. Res· Comm· 230 : 426-430 ; Iida 等人（ 1996) J. Virol. 70(9) : 6054· 6059 ; Hwang 等人（ 1997) j virol 71(9) : 7128_713i ; Lee 等人（1997) Mol. Cell Biol. 17(9) ·· 5097-5105 ;以及 Dreher 等人（ 1997) J. Biol. Chem. 272 (46) : 29364-29371。放射性诱導之啓動基因的實例描述在Manome等人（1998) Human Gene Therapy 9 : 1409-1417)中。可經由使用組織特異性或腫瘤特異性之啓動基因，賦與額外程度的選擇性。組織特異性和腫瘤特異性的啓動基因是此項技藝中已熟知的，並包括優先在平滑肌中具有活性的啓動基因（α -肌動蛋白啓動基因）、胰臟特異性的啓動基因（palmiter等人（1987) Cell 50 : 435)、肝臟特異性的啓動基因（R〇vet等人（1992) j -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1262948 A7 ____ B7 五、發明說明（24 )

Biol. Chem. 267 : 20765 ; Lemaigne 等人（ 1993) J. Biol. Chem· 268 : 19896 ; Nitsch 等人（ 1993) Mol. Cell. Biol. 13 : 4494)、胃特異性的啓動基因（K〇varik等人（1993) j Biol· Chem. 268 : 9917)、腦下垂體特異性的啓動基因 (Rhodes 等人（1993) Genes Dev· 7 : 913 )、前列腺特異性的啓動基因等等。治療性轉殖基因”一詞意指其在標歡細胞中表現，產生治療效力的核答酸。治療性轉殖基因一詞包括但不限於腫瘤抑制者基因、抗原性基因、細胞毒性基因、細胞靜止基因、前·藥激活基因、細胞程式死亡基因、藥學基因或抗-血管生成基因。可使用本發明之載體，經由使用IRES要素以縱列之形式，或是經由獨立調節的啓動基因，產生一或多個治療性轉殖基因。 ”腫瘤抑制者基因”一詞意指其在標靶細胞中的表現，能夠壓抑贅生的表現型，並/或謗導細胞程式死亡的核甞酸序列。在本發明實施例中使用之腫瘤抑制者基因的實例，包括 p53 基因、APC 基因、DPC-4/Smad4 基因、BRCA-1 基因、BRCA-2基因、WT-1基因、網膜胚細胞瘤基因（Lee等人（ 1987) Nature 329 : 642)、MMAC-1 基因、腺瘤的大腸息肉蛋白質（Albertsen等人，1998年7月21曰建樓之美國專利第5,783,666號）；在結腸癌（DCC)基因中的刪除， MMSC-2基因、NF-1基因、鼻咽癌腫瘤抑制者基因，其作圖於染色體 3Ρ21·3 處（Cheng 等人，1998, Proc. Nat Acad.

Sci. 95 : 3042-3047)、MTS1 基因、CDK4 基因、NF1 基 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ Aw--------訂---------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1262948 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（25 ) 因、NF2基因和VHL基因。 ”抗原性基因”一詞意指其在標靶細胞中的表現，導致產生能夠由免疫系統辨認之細胞表面抗原性蛋白質的核苷酸序列。抗原性基因的實例包括癌胚抗原（CEAy、p53 (如同在Levine，Α·於1994年2月3日公告之PCT國際出版物第WO 94/02167號中的描述）。爲了有助於免疫辨認，可使抗原性基因與MHC第I級抗原融合。 ’’細胞毒性基因’’ 一詞意指其在細胞中的表現，可產生毒性影響的核甞酸序列。這類細胞毒性基因的實例包括編碼假單胞菌外毒素、蓖麻蛋白、白喉毒素及其類似物的核苷酸序列。 ”細胞靜止基因，’ 一詞意指其在細胞中的表現，產生細胞周期停止的核苷酸序列。這類細胞靜止基因的實例包括 p 2 1、網膜胚細胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白質基因、編碼環素（cyclin)依賴性激酶抑制劑的基因，像是pi 6、p 1 5、 p 1 8和p 1 9，使生長停止之特異性同源異形盒（GΑχ)基因，如同在Branellec等人（在1997年5月9日公告之PCT出版物WO 97/16459，以及在1996年1 0月3日公告之PCT出版物 WO 96/30385)。 ”細胞分裂素基因” 一詞意指其在細胞中的表現，產生細胞分裂素的核甞酸序列。這類細胞分裂素的實例包括G Μ -CSF、介白素，特別是11^1、11^2、11^4、11^12、1]^ 10、IL-19、IL_20、α、/?和；r亞型的干擾素，特別是干擾素a-2b ’以及諸如干擾素α-2α-1之類的融合。 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ' ban ·1 ϋ ·_1 ϋ 11 ϋ ·ϋ 1^·· J 、I ·ϋ mmmag 1 an ϋ I (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 1262948 A7 B7 五、發明說明（26 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ”化學激動素基因” 一詞意指其在細胞中的表現，產生化學激動素之核甞酸序列。化學激動素一詞意指一群在結構上與低分子量之細胞分裂素有關，並由細胞分泌的因子，其在結構上具有與有絲分裂、趨化性或炎症性有關的活性。它們主要是陽離子性的蛋白質，具有7 0至100個胺基酸殘基，分享四個保留的半胱胺酸殘基。以兩個胺基-終端之半胱胺酸的間隔爲基礎，可將這些蛋白質分成兩組。在第一組中，藉著單一的殘基分開兩個半胱胺酸（c_x_c)，而在第二組中，它們是相鄰的（C _ C )。，C _ χ - C，化學激素之成員的實例包括但不限於血小板因子4 ( P F 4 )、血小板基礎蛋白質（ΡΒΡ)、介白素-8(IL_8)、黑色素瘤生長刺激活性蛋白質（MGSA)、巨噬細胞炎症蛋白質2(mip-2)、老鼠 Mig(mll9)、難9E3(或PCEF-4)、豬肺泡巨噬細胞趨化性因子I和II(AMCF-I和-II)、前_B細胞生長刺激因子（PBSF) 和IP 1 0、’ C - C ’組之成員的實例包括但不限於單核球趨化性蛋白質l(MCP-l)、單核球趨化性蛋白質2(MCp_2)、單核球趨化性蛋白質3(MCP_3)、單核球趨化性蛋白質 4(MCP-4)、巨噬細胞炎症性蛋白質、巨經濟部智慧財產局員工消費合作社印製噬細胞炎症性蛋白質、巨噬細胞炎症性蛋白質1 r (MIP-1· r )、巨噬細胞炎症性蛋白質3 “（Μιρ· 、巨噬細胞炎症性蛋白質、化學激動素（ELC)、巨噬細胞炎症性蛋白質4(乂1?_4)、巨噬細胞炎症性蛋白質 5(MIP_5)、LD78y5、RANTES、ε (p500)、胸腺和調節激活作用的細胞激動素（tarc)、優 -29 本紙張尺度_巾_家標準（U似A4規格（210 X 297公 A7 1262948 B7__ 五、發明說明（28 ) (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 外，亦可使用胸腺核苷激酶（TK)基因（參見例如Woo等人，1997年5月20日建檔之美國專利第5,631,236號，和 Freeman等人，1997年2月1 1日建檔之美國專利第5,601,818 號），其中表現T K基因產物的細胞，易選擇性地藉著投予更昔洛章（gancyclovir )將其殺死。 ”抗-血管生成之”基因一詞意指該核苷酸序列的表現，導致抗血管生成因子的細胞外分泌。抗血管生成因子包括血管生長抑素（angiostatin)、血管内皮生長因子的抑制劑 (VEGF)，如 Tie2(如同在 PNAS(USA)(1998)95 : 8795-8800 中的描述）、内抑素（end〇statin)。熟諳此藝者將輕易地知曉上文提及之基因的修改及/或刪除，可輕易地使其般碼之野外型蛋白質的功能亞片段適應本發明之實施例中的用途。例如，在提及p53基因時不僅包括野外型蛋白質，還包括經過修改的P53蛋白質。這類經過修改之P53蛋白質的實例包括修&p53，以便增加核的保留，刪除諸如^:13^9胺基酸，以便排除卡爾平（calpain) 一致之切開位置，修改低聚作用功能部位（如同在汾⑼⑶等人，PCT公告的申請案WO 97/0492或美國專利第5,573,925 號中的描述）。 ’ ’ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製熟諳此藝者將輕易地知曉可將上文的治療性基因分泌至培養基中，<藉著包含在標把部份中，像是信號肽或核之局邵信號（NLS)，而位在特定的細胞内處所。在治療性轉殖基因的定義中，亦包括治療性轉殖基因和單純痕療病毒弟1型（HSV-i)結構蛋白質，vp22的融合蛋白質。融合蛋 -31 - 1262948 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（29 ) 白質含有VP22信號，當在感染細胞中合成時，從感染細胞中輸出，並有效地進入直徑大約1 6個細胞寬的周圍未感染之細胞中。該系統與具有轉錄活性之蛋白質（例如p53 ) — 起是特別有用的，因爲融合蛋白質被有效地運送至周圍細胞的核内。參見例如 Elliott，G. & 0，Hare，P. Cell. 88 : 223-233 ； 1997 ; Marshall, A. & Castellino, A. Research News

Briefs. Nature Biotechnology. 15 ： 205 ； 1997 ; O’Hare 等人，1997年2月13日出版之PCT出版物WO 97/05265。衍生自HIV Tat蛋白質之類似的瞄準部份，亦描述在Vives等人 (1997) J· Biol· Chem. 272 : 16010-16017 中。其他增加本發明載體之效力的修改，包括但不限於與在 E 1中的修改交替，將突變導入E 4中，以便增加細胞毒性 (Muller 等人（ 1992) J. Virol. 66 : 5867-5878)，向上調節病毒死亡蛋白質，像是E4orf4或E3.11.6K蛋白質。在本發明較佳的實施例中，像是在本文舉例説明的，本發明之載體包括含有駕馭E2F-Rb融合蛋白質表現之p53或 TGF - /?路徑反應性啓動基因，並額外包括由暫時性E 3啓動基因控制之胞嘧啶脱氨酶基因的有條件複製之腺病毒。在這類案例中，僅在病毒複製後的腫瘤細胞中產生胞嘧啶脱氨酶。在本發明較佳的實施例中，前藥轉變基因是受相對上較弱的，或組織特異性或腫瘤特異性之啓動基因控制。在本發明其他的具體實施例中，載體包括帶有駕馭E2F-Rb融合蛋白質表現之p53或TGF- 路徑-反應性啓動基因 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1262948

發明說明（3() 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製的重组腺病毒，以及表現胞嘧啶IRES要素和ΜΙΡ-3 - α蛋白質的轉殖基因表現卡Ε。因爲表現胞_脱氨酶，在投予諸如5-氟胞嘴啶之類的前藥時，便可殺死腫瘤細胞。 MIP-3-α的低里表現將有助於抗腫瘤免疫力的發展。在本文中可交替使用多重_標準、多_功能或多重路徑反應性連續事件，意指路徑反應性要素的結構，而得以產生治療效果，丨中可能同時探查一種以上的路徑。熟諳此蔹者將知曉可混合上述的載體控制要素，以便對本發明之載體提供多層面的選擇性。如同多重控制標準的實例，將有可能設計出有條件複製的腺病4，其可在具有Rb、TGF_ Θ或p53路徑缺陷之細胞中複製並將其殺死。這類載體將包括由p53反應性啓動基因㈣之病毒複製之陰性支配抑制劑的表現，做爲主要的控制標準。結果，在任何具有 P53功能的細胞中（像是所有的正常細胞），但不會在^有失活（p53的細胞中，表j見陰性A配的抑制劑，並阻斷病毒的複製。然而，該載體可在具有p53功能，但在諸如 TGF-^RW徑之類的其他路徑上有缺陷的腫瘤細胞中複製。因此，可插入其他的控制標準，當其他路徑有缺陷時，其在腫瘤細胞中將使有功能之p53失活，藉此容許病毒的複製。做爲第二個控制標準，相同的載體亦將包括含有腺病毒 E1B-5 5K蛋白質的表現卡g，其具有使p53失活的功能，在啓動基因的控制之下，其僅在TGF1路徑有缺陷之細胞中是有活性的。可藉著在該啓動基因中插入阻遏物結合位 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）一—„---------am__w--------訂---------線 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 1262948 A7 B7 五、發明說明（31 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 置，像是使用在該载體中其他地方的TGF_々反應性啓動基因表現I阻遏物，將導致在能夠發送完整TGF _ 0信號的細胞中，阻斷該啓動基因之活性，而建構僅在TGF_ 0路徑有缺陷之細胞中爲具有活性的啓動基因。另一方面，在tgf_ 々路徑有缺陷之細胞中，不合成阻遏物，因此啓動基因將疋有活性的。因爲從啓動基因中表現E〖Β _ 5 5 κ，僅在 TGF- yS路徑有缺陷的細胞中是有活性的，所以内源性p53 是失活的。另外，任何天然的啓動基因均是向下調節的，因爲可使用TGF - 發送信號。包含上文的兩個表現卡匣，將確保僅在p53和TGF-y5路徑兩者皆爲正常時，才表現該陰性支配抑制劑（導致複製的阻斷），但在其中一或兩個有缺陷時則否（導致病毒複製）。做爲第二個控制標準，在相同的載體中完成由E 2 F -反應性啓動基因控制之蛋白質的表現，像是Smad7或Smad任何其他的陰性支配形式，其能夠使TGF - /3路徑失活（Naka〇等人，Nature 1997 年 10 月 9 日·，389(6651) ·· 631-635)。當 Rb 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製路徑有缺陷時，E 2 F -反應性啓動基因（像是E 2 F丄啓動基因、E2啓動基因’或疋合成的啓動基因，在最小啓動基因，像是SV40 TATA盒子之上游，具有多個E2F•結合位置）是有活性的。因爲這第三個控制標準，在具有路徑缺陷的細胞中，表現Smad7，其轉而使smad4失活並阻斷TGF-信號的轉導。因此，製造E 1 B _ 5 5 K並使p53失活，導致缺乏陰性支配抑制劑的表現。因此，可進行病毒的複製而不受妨礙。另一方面，如果Rb路徑是正常的，不合成 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1262948 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（32 ) ，因此正常地進行TGF-石的信號轉導。因此，不製 k E 1 B - 5 5 K，導致有功能的p53，而能夠表現陰性支配抑制劑’阻斷了病毒的複製。利用上文二個控制標準，在三個路徑（Rb、_冷和 p^53 )中任何一或兩個全部有缺陷時，最後終將導致病毒的複衣和細胞/谷解。僅在這三個路徑均是有功能的，如同在正常細胞中時，將不發生病毒的複製。熟諳此藝者將知曉，為了使用各種路徑-反應性啟動基因來私/4和處理各式各樣的路徑缺陷，可以許多變化方式來使用本發明之載體。然而，在本發明較佳的實施例中，如 =在本又中舉例說明的，該重組腺病毒載體係衍生自腺病母屬。、特佳的病毒係衍生自人類腺病毒第2或第5型。當使泉病母載心做為親代載體時，較佳的病毒複製抑制劑為 E2F-Rb.融合蛋白質。在本發明較佳的實施射，當使用本發明之載體來處理與不❹制之細胞^殖有關的疾病日寺，最好是使用在E1 A 區或口有特疋刪除之腺病毒載體，以便排除E丨&基因產物人卩3 00和Rb蛋白質結合的能力，並保留以& CR3功能部位 :轉激活功能。在E 1 a密碼序列中含有刪除之本發明載 ^排除了在1 3 S密碼序列中的P300和pl〇5-Rb結合位置。明較佳的實施例巾，藉著刪除從大約4到大約^，或疋從大約3 6到大約49的胺基酸，來表示⑻結合的刪除。冗成排除P300和pRb結合所需的Eu 28呢密碼序列中 :297公釐）之 -—\-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1262948

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（33 ) 刪除’取好是儘可能地減至最少，以避免瓦解大部份E i a 289R蛋白質的二級和三級結構。爲了排除p3〇〇結合，最好是將突變導入編碼289R之P300結合功能部位的DNA序列中。在C -終端區刪除大約3 〇個以下的胺基酸，排除p3〇〇結合疋#父佳的，雖然最好是更小的修改。例如，胺基酸4至 2 5的刪除（dl 11 〇 1 )、從大約胺基酸3 〇到胺基酸4 9的刪除 (dill 03 )，更特定而言，3 6至49之刪除是另一種排除p3 〇〇結合作用的較佳方法。足以瓦解結合p3〇〇的點突變是特佳的。例如，已經證實在289R蛋白質中，從精胺酸到甘胺酸 (Arg2 —Gly2)之二級胺基酸的點突變，瓦解7p3〇〇的結合 (參見例如，pm563, Whyte 等人（ 1989) Cell 56 : 67-75)。同樣的，關於排除pRb 105的結合，最好是最少的修改。較佳的是在pRbl05結合功能部位中，排除選出的胺基酸，像是胺基酸 lll-123(dlll07)和胺基酸 124-127 (dlll08)。胺基酸 111-123的刪除（dll 107)是特佳的，其中它保留了 289R蛋白質之pl07的結合活性。另外’可導入Ela 289R蛋白質之從大約2ΐ9-289 *Ε1Α 243R蛋白質之173至243的胺基酸排除。例如，藉著在相當於人類Ad5基因組之位置1131處的位置導入點突變（也就是將胞嘧淀1 131改爲鳥嘌呤），而產生終止密碼子。該突變導致Ela 289R蛋白質之胺基酸219至289和E1A 243R蛋白質之 173 土 243的排除。除了删除上述的和p3⑼結合之外，可視需要進行該突變。這類親代載體的其他實例，描述於同在申請中，在D98年10月15曰建檔之美國專利申請案連續 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) ：-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1262948 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（34 第 60/1〇4,317 號和〇8/09/172,684 號中。在本發明較佳的實施例中，如同在本文中舉例説明的，較佳的P53路徑·反應性啓動基因爲p53_c〇N*RGc。較佳的TGF-々路徑_反應性啓動基因係選自包括pAi_RE和 SRE。在本發明較佳的實施例中，治療性基因爲前藥激活基因，例如胞嘧啶脱氨酶。在本發明較佳的實施例中，爲了謗發抗·腫瘤的免疫力，本發明之載體編碼M j p _ 3 _ “。表現治療基因之較佳啓動基因，爲暫時性啓動基因，像是MLP和Ε3。在腺病毒構築體中，排除或延遲Ad Ε3 -11.6 Κ蛋白質的作用，以便將由腺病毒謗發之細胞溶解減至最少，直到完成複製爲止。特別是排除天然的E3-11.6K/10.5K基因，將是較佳的。這將減少免疫反應，直到發生局部散布的最初猶環之後爲止。之後，一旦達到最初感染細胞的細胞程式死亡’並容許局部的病毒散布，免疫反應將是有利的。ll6K 蛋白質（或相對應之Ad5的Ε3-10.5Κ)是前-細胞程式死亡的基因，並可用來在腫瘤細胞中殺死細胞。然而，希望延遲標靶細胞的早期溶解，以便使病毒的複製達到最高。最好是在暫時性啓動基因的控制下安置11.6K/10.5K基因，像是MLP啓動基因，以便延遲其細胞程式死亡之影響的發生。醫藥調配物本發明更提供與載劑混合之重組病毒在藥學上可接受的 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ,---:--------- --Φ,------- 丨訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁} 1262948 A7 B7 五、發明說明（35 物了根據傳統的藥物學，並添加載體和賦形劑，實際將本發明之載劑調配成投藥劑量。投藥調配物可包括靜脈内、腫瘤内、肌肉内、腹腔内、局部、基質或氣溶膠之遞送形式。載劑” 一詞意指在醫藥化合物的調配中，用來促進治療性化合物之穩定性、無菌和可遞送性的常用化合物。當以各液或懸浮液之形式調配病毒時，遞送系統爲可接受之载劑’較佳的是含水載劑。可使用各種含水載劑，例如水、緩衝的水、0·8%生理鹽水、〇 3%甘胺酸、透明質酸及其類似物。可藉著傳統的、已知的滅菌技術，或可經滅菌過濾’將吳些組合物滅菌。可按照用途將所得的水溶液包裝，或冷凍乾燥，在投藥前將冷凍乾燥的製品與滅菌的溶液混合。該組合物可按照適當生理學條件的需求，含有在蕖子上可接受的輔助物質，像是調節pH値和緩衝劑、張力凋節劑、濕潤劑及其類似物，例如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鋼氣化神、氣化鈣、吸附單月桂酸鹽、油酸三乙醇胺等等。本發明更提供帶有載劑和促進遞送製劑（們）之本發明病毒的醫藥調配物。”遞送促進劑”或，，促進遞送之製劑，，一㈣’在本文中可交替使用，並包括一或多個有助於將該病毒攝入標乾細胞中的製劑。遞送促進劑之實例，描述在 1998年7月8曰建檔之同在申請中的美國專利申請案第〇9/112,〇74號，和1997年9月26日建檔之〇8/938 〇89號中。這類促進遞送之製劑的實例包括清潔劑、醇類、二元醇、 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁} -—----訂--------^線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1262948 五、發明說明（37 ) 8之整數，且較佳的是2或3，且R爲陽離子基團，醣類基團或結構-CO-X3，其中X3爲醣類基團。醣類基團可選自包括戊糖單醣基團、己糖單醣基團、戊糖-戊糖雙醣基團、己糖-己糖雙醣基團、戊糖-己糖雙醣基團、以及乙糖-戊糖雙酿基團。 ”清潔劑”一詞包括陰離子性、陽離子性、兩性離子和非離子性的清潔劑。代表性的清潔劑包括但不限於牛績膽酸、脱氧膽酸鹽、牛磺脱氧膽酸鹽、十六烷基吡錠、氯化苯甲烴銨、兩性清潔劑3 _ 1 4清潔劑、CHAPS ( 3 ·[( 3 膽胺丙基）二甲基氨醇（ammonioi)]]•丙烷磺酸鹽水合物）、Big CHAP、脱氧Big CHAP、三通-χ·100清潔劑、C12E8、辛基-B _ D -吡喃葡糖苷、普羅尼克（pLUR〇NIC卜F 6 g清潔劑、吐溫20清潔劑和吐溫8〇清潔劑（CalBiochem Biochemicals ) 〇在產物之工具組中可包含本發明之單位劑量調配物，其線含有冷凍乾燥形式之申請專利範園第丨項的重組病毒，二及重建該冷凍乾燥產物之溶液。可藉著傳統的程燥本發明之重組病毒並重建之。序7東乾本發明之載體亦可與卡爾平抑制劑混合投藥。制劑縮寫爲”CT”）意指抑制卡 f Η抑仆人鉍m j 1硐十1 <蛋白水解作用的化泛物，例如卡爾平。當在本文詞時，包括除了它其他的生物活有十了制劑- 活性的那些化合物。已經證實各種化i物且有相平1抑制之蛋白水解作用的活性。可在本發==制卡爾平 <只施例中使用的卡 I - t ® ®ii?FNS)A4 ^ (210 -40- 1262948 A7 B7 五、發明說明（38 爾平抑制劑之實例，包括N_乙醯基_亮胺醯基-亮胺醯基_ 正亮胺醛（norleucinal)，亦稱爲，，卡爾平抑制劑】，，。已經觀察到卡爾平抑制劑增加了有關於病毒載體之細胞的感染力，從啓動基因中藉著增加NF-卡巴B*Ap_1轉錄因子的含量來促進轉錄作用，並減少對腺病毒載體的CTL反應。因此，本發明之調配物和方法，可視需要包括卡爾平抑制劑。卡爾平抑制劑及其應用，描述在Atenci〇等人，於Μ% 年10月15曰建檔之同在申請中的美國專利申請案連續第 60/104,321 號和〇9/073,076 號。使用的方法本發明藉著使標靶細胞與本發明之選擇性複製载體接觸，來殺死具有調節路徑缺陷之細胞的方法。在本發ζ的一個具體實施例中，如同在本文中舉例説明的，含有路徑缺陷的細胞爲贅生細胞。”贅生細胞，，一詞爲展現出畸型生長之表現型的細胞，其特徵爲正常細胞生長控制的獨立性。因爲贅生細胞不一定在任何特定的時間點複製，贅生細胞一詞包括可主動複製，或是在暫時未-複製之靜止期 (G1或G0)的細胞。贅生細胞的局部族群亦稱爲贅生物。贅生物可能是惡性或良性的。惡性贅生物亦可稱爲癌。癌一詞在本文中可與腫瘤一詞交替使用。贅生物的轉化作用意指正常細胞轉變爲贅生細胞，通常是腫瘤細胞。本發明藉著投予本發明之重組腺病毒在藥學上可接受的調配物，提供在哺乳動物生物中，在活體内除去贅生細胞的方法。”除去”一詞意指實質上減少可生存之贅生細胞的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A__w -1------訂·--------線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -41 - 1262948 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製發明說明（39 族群，而得以減緩該贅生細胞存在的生理疾病。，，眚質上” 一詞意指在哺乳動物生物中減少可4在 > 散I ^ 下X y J玍孖又贅生細胞的族群，超過大約20%處理之前的族群。"可生存的”―詞音指其具有贅生細胞之未經控制的生長和細胞周期調節特: 在本文中使用"可生存的贅生細胞"一詞，用來區別不再能夠複製的細胞與贅生細胞。例如，可在治療之後仍維持腫瘤團塊’然而構成違腫瘤團塊的細胞族群可能已於死亡。這些死亡的細胞已經除去，並缺乏複製的能力，=使=保留一些腫瘤團塊。 ”哺乳動物生物” 一詞，包括但不限於人類、豬、馬、牛、狗、貓。最好是使用與待處理之哺乳動物類型同源的腺病毒載體。雖然通常較有利的是使用得自待處理之物種的病毒，但在一些案例中，使用衍生自不同物種的載體可能是有利的’其具有有利的病原性特徵。例如，報告（丨997 年4月10日公告之WO 97/06826)可在人類的基因治療中使用鳥類的腺病毒載體，以便將人類腺病毒載體特徵性的免疫反應減至最低。藉著降低免疫反應，避免快速全身性地清除載體，導致該載體有更長的作用期間。本發明之載體特別適用於處理與缺乏TGF - /?抗增殖作用有關之腫瘤’包括但不限於乳癌、肝癌、胃癌、結腸鹽和皮膚腫瘤，以及B和T細胞淋巴瘤（Mark〇whz和R〇berts， 1996)。已經在結腸癌、胃癌、頭和頸部的鱗狀細胞癌中確認出第II型TGF- yS受體的突變。亦已經在Kaposi，s肉瘤、乳癌、卵巢腫瘤和結直腸腫瘤中發現第j型受體的突變 -42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---Γ-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1262948 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（4C)) 或刪除。在發送TGF - 信號的細胞内效應物中。已經確認 Smads Smad4/DPC4爲腫瘤抑制劑基因的候選者，其在幾乎 5 0 %的騰臟癌中有所改變。另外，亦已經在結腸、乳房和卵巢腫瘤中發現DPC4基因，雖然只有極低的頻率。本發明之載體特別適用於處理TGF - 無感覺的腫瘤，像是胰臟癌。本發明之載體亦適用於處理含有p53 -路徑缺陷的腫瘤細胞。這些腫瘤包括在p53、mdm2和pl4/pl9ARF(INK4a基因）中具有改變的那些。本發明之載體亦可用來處理具有Rb路徑缺陷的癌症細胞。Rb路徑的缺陷起因於Rb、環素D、環素依賴性激酶（像是CDK4)和p 1 6 (INK4a基因）中的改變。同時本發明提供單獨使用重組腺病毒的方法，本發明之重組腺病毒及其調配物，亦可與傳統的化學治療劑或治療攝生法混合使用。這類化學治療劑的實例包括嘌呤合成的抑制劑（例如噴司他丁（pentostatin)、6 -鲮基臂呤、6 -硫代鳥漂呤、胺甲碟呤）或嘧啶合成的抑制劑（例如Pala、阿拉拜（azarbine))，將核糖核甞酸轉變爲去氧核糖核甞酸的抑制劑（例如羥基脲），dTMP合成的抑制劑（5_氟尿嘧啶）、損害DNA之製劑（例如放射性、博菜黴素、依托泊苷 (etoposide)、替尼泊苷（teniposide)、放線菌素D、道諾紅菌素、阿黴素、米托蒽醌（mitoxantr〇ne )、烷基化試劑、絲裂黴素、順氯氨鉑、丙卡巴胼（pr〇carbazlne))，以及微管功能的抑制劑（例如長春花生物鹼和秋水仙素）。化學治療 I處理攝生法王要意指設計用來除去贅生細胞之非·化學的 -----------0--------訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -43 1262948 A7 B7 五、發明說明（41 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 程序，像是放射性治療。當治療性基因爲p53時，在 Nielsen等人，在1998年8月20日公告之WO/9835554A2 中，描述了混合治療的實例。對於重覆在活體内投予病毒載體，免疫學反應是很重要的。因此，本發明之載體可與免疫抑制劑混合投予。免疫抑制劑之實例包括環孢靈、硝基脒唑硫嘌呤、胺甲碟呤、環磷醯胺、淋巴細胞免疫球蛋白、抗C D 3複合物的抗體、腎上腺皮質類固醇、柳氮磺胺吡啶（sulfasalzaine )、F K · 506 、甲氧補骨脂素（methoxsalen)和沙利度胺 (thalidomide) 〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明亦提供在活體外，在被贅生細胞污染的正常細胞族群中，藉著對該族群投予本發明之重組腺病毒，來除去該贅生細胞的方法。目前在活體外應用中，使用這類之應用實例，像是洗除自體的幹細胞產物，通常已知的是骨髓洗除。”幹細胞產物”一詞意指能夠再組成接受骨髓除去治療之患者長期造血功能的造血之祖先和幹細胞族群。幹細胞產物在傳統上藉著可移動或不可移動之周圍血液的分離性輸血（apheresis)而獲得。在傳統上經由使用已知的技術，使用可購得之分離性輸血的裝置，像是COBE Spectra Apheresis System，可購自 COBE International，1185 Oak Street, Lakewood，CO，來完成分離性輸血。較佳的是，使處理條件到達3 _對數洗除（也就是從幹細胞產物中移除大約99·9 %腫瘤細胞），且最佳的是達到5 ·對數洗除（從幹細胞產物中移除大約99.999 %腫瘤細胞）。在本發明較佳的實 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1262948 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（42 ) 施例中，在3 7 °C下，以大吟2 X 1 0 1 1 /田士& … 以大、、02x10個本發明重組腺病毒的顆粒數目對有核細胞的比例，來處理1〇〇毫升體積的幹細胞產物大約4小時。診斷應用除了上述的治療應用之外，本發明之載體亦可用於診斷目的。❹，本發明之載體可併入在病毒感染或複製時表現出的報告者基因。”報告者基因”一詞意指其產物能夠單獨或其他要素混合，而產生可檢測之信號的基恩。報告者基因的實例包括卢-半乳糖甞酶基因、蟲螢光素酶基因、綠榮光蛋白質基因、、編碼可由影像系、统，像是χ_光或磁場影像系統（MRI)檢測之蛋白質的核苷酸序列。這類載體將可用來檢測有功能之路徑的存在（例如ρ53或TGF-；5路徑）。另外亦可使用這類載體來表現能夠由諸如螢光標示抗體之類結合分子辨認的細胞表面蛋白質。另外，對於其中去掉路徑·反應性啓動基因的診斷應用，亦可使用其中用來駕馭病毒複製之阻遏物（例如E2F-Rb )晚期病毒啓動基因（例如由E2F-Rb關掉的E 2或任何其他具有阻遏物結合位置的啓動基因’例如E 2 F結合位置）的路徑-反應性啓動基因來駕驭報口者基因。爲了在活體内或在活體外的診斷目的，可使用這些診斷構築體。在活體内的應用實例包括影像應用，像是X -光、CT掃瞄或磁共振呈像（MRI)。製備載體的方法本發明更提供產製上述之重組病毒的方法，該方法包括下列步驟： -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐"7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) § 1262948 A7 B7 五、發明說明（43 ) a 以重組病毒感染生產細胞， b ·在容终该病毒基因組在該生產細胞中複製的條件下择養該經過感染的生產細胞， c · 收獲該生產細胞，並 d · 純化重組的病毒。 ”感染” 一詞意指使該重組病毒與生產細胞在有助於以该重組病毒感染該生產細胞的條件下接觸。在已經被特定病毒之多重副本感染的細胞中，病毒複製所需的活性和病毒粒子的包裝是共同操作的。因此，最好是調整該條件，使得以病毒多重感染生產細胞有較大的可能性。促進病毒在生產細胞中產生之條件的實例，爲在感染期中增加病毒的濃度。然而’每個生產細胞之病毒感染總數可能是太過誇張，導致對細胞之毒性亦是有可能的。因此，應該儘量將感染病毒的濃度維持在每毫升1X106到iXiOlo個病毒粒子的範圍内，較佳的是大約1X1 〇9。亦可使用化學製劑來增加生產細胞株的感染力。例如，本發明藉著包含（卡爾平）抑制劑，提供增加生產細胞株被病毒感染之感染力的方法。在本發明之實施例中有用的卡爾平抑制劑之實例，包括卡爾平抑制劑1 (亦稱爲N-乙醯基-亮胺醯基-亮胺醯基_ 正亮胺酸（norleucinal)，可購自 Boehringer Mannheim)。已經觀察到卡爾平抑制劑1增加了生產細胞株對重組腺病毒的感染力。 ’’生產細胞”一詞意指能夠有助於待產製之重組腺病毒之病毒基因組複製的細胞。公開地使用各種哺乳動物細胞株 •46- Ϊ紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製訂---------線 ----------—.— A7 1262948 B7___ 五、發明說明（44 ) 來培養重組的腺病毒。例如，已經將293細胞株（Graham和

Smiley (1997) J. Gen· Virol. 36 : 59_72)設計成與E la功能的缺陷互補，並爲產製本載體的優良細胞株。其他生產細胞的實例包括HeLa細胞、pERC.6細胞（如同在出版物 WO/97/00326，申請案連續第PCT/NL96/〇〇244號中描述的）。 ”在答許病毒基因組複製的條件下培養”一詞意指將被感染的生產細胞維持在容許病毒在該生產細胞中繁殖的條件下。想要控制該條件，使得由每個細胞產生最大數量的病毒顆粒。因此將需要監視和控制反應條件，像是溫度、溶氧量、pH値等等。可購得的生物反應器，如cemGenplus Bi〇reactor(購自 New Brunswick 以⑽收，—44 以脱邮 Road，Ed1S〇n，NJ)，爲這類參數做好了監視和維持之準備。感染和培養的最佳條件將略微有改變，然而，可藉著由熟諳此藝者考量已知之生產細胞株的特性、病毒的特性、生物反應器的類型等$，達到病#之有效複製和產生的條件㈤使用293細胞做爲生產細胞株時，氧氣濃度最好是維持在約50%到約12〇%的溶氧量，車交佳的是1〇〇%的落氧量。當病毒顆粒的濃度（藉著傳統的方法，像是使用

Resource Q管柱的Ηριχ來決定）開始到達停滯期時，便收獲反應物。收獲：竭意指從培養基中收集含有重組腺病毒的細月。迳可藉著傳統方法，像是差示離心或層析法來完成。在本階段，可儲藏收獲的細胞，或進一步藉著溶解和純化 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) t 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

一，eJ11111111 I — — — — — — — — I I I ϋ- I I I -47- 1262948 A7 B7 五、發明說明（ 45 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製處理，分離出重組的病毒。關於儲藏，應在大約生理學之 PH値下緩衝該收獲細胞，並冷凍於_7(rc下。 "溶解”-詞意指打破生產細胞。可藉著各㈣藝中已熟知的方法來完成溶解作用。當想要從生產細胞中分離病毒顆粒時’使用此項技藝巾已熟知的各種方法來溶解細胞。例如，可在低壓（100_200镑/平方英寸之差示壓力）的條件下，或傳統的冷康融解法，將哺乳動物細胞溶解。藉著利用DNA酶/RNA酶的降解作用，移除外源性自由的 DNA/RNA。 ’’純化”一詞意指從已經溶解的生產細胞中分離出實質上純的重組病毒顆粒之族群。可使用傳統的純化技術，像是層析或差示密度梯度離心法。在本發明較佳的實施例中，藉著管柱層析法，實質上根據Huyghe等人（1995) Gene Therapy 6: 1403-1416 ;如同同在申請中，在 1995 年3 月7日建檔之美國專利申請案連續第〇8M〇〇,793號中描述的方法來純化病毒。其他最適切之產製本發明之重組腺病毒的方法和程序，描述在同在申請中，1998年5月4曰建檔之美國專利申請案連續第 09/073,076 號標題爲 Viral Pr〇ducti〇I1 Proeess 中。衣實例下列的實例提供方法學，以及證實特定重組之腺病毒和質體載體之構築體的實驗結果。熟諳此藝者將知曉本發明的相關事項，可以與在這些實例中特別揭示的那些不同形式的具體實施例來説明本發明，只要其不達背本發明之精 48· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) f ^ ---------I — — — — — — — — J I — I.--- 1262948 A7 B7 五、發明說明（46) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 神或必要的特徵即可。因此，在下述之本發明的特定具體實施例，應將其視為說明而非限制之意。在下列的實例中，”g”意指克，nml"意指毫升，”mol”意指莫耳，”°C’f 意指攝氏度，’’ min ”意指分鐘，” FBS π意指胎牛血清，且 "ΡΝ”意指重組病毒的顆粒數目。會例1 .質體的建構從 David Luskutoff 博士（Scripps Institute，LaJolla， California)處獲得p8001uc，在800 bp PAI啟動基因的控制之下編碼蟲螢光素酶的質體。由Doug Antelman (Canji)提供質體pCTMIE_E2F_Rb，其含有CMV啟動基因，接著是 E2F_Rb融合蛋白質之腺病毒-5引導序列和SV40促進子上游。實例2 .建構帶有TGF _冷反應性啟動基因之蟲螢光素酶質藍 A. PAI-蟲螢光素酶質體經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣所有片段的序列均以5 ’ - 3 ’方向顯示，749 bp片段在5 ’和 3 ’末端分別在侧面具有SacI和Xhol位置，且SV40 TATA盒子代替在啟動基因内的天然TATA盒子，並藉著PCR擴大，使用p8001uc做為模板，以及引子AGT CGA GCT CCA ACC TCA GCC AGA 和 GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC(含有 SV40 TATA 盒子）◦ 以SacI和Xhol消化所得的PCR產物，並在消化以PGL3 -為基礎，不含啟動基因（Promega)的蟲勞光素酶之後，連接所得的片段，得到P AI ·蟲螢光素酶。 ____-49-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1262948 7 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（47 ) B. SRE-蟲螢光素酶質體使下列的寡核甞酸退火GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGC CCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC 和 GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA ΤΑΑ ΑΤΑ CC。以Xhol消化已經退火的產物，並將其與以PGL3 -爲基礎、以Mlul消化過、以Klenow將末端弄鈍，並以Xhol消化而獲得的pSVT-luc(帶有SV40 TATA盒子的蟲螢光素酶構築體）連接。寡核甞酸含有Smad4/DPC4結合位置。將CGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC 和 AGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC退火，並與以Kpnl消化過的pSVT _蟲螢光素酶連接，得到SRE-蟲螢光素酶質體。實例3.建構帶有p53-反應性啓動基因的蟲螢光素酶質體 A. RGC-蟲螢光素酶質體將兩個互補的5 ’ -磷酸化的寡核甞酸，含有得自核糖體基因叢之 p53 結合位置，AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AAC TCG TGG TAC 和 CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTG CCT TTT CTG TAC 退火。將已經退火之片段連接至以Kpnl消化過之pSVT -蟲螢光素酶，獲得RGC_蟲螢光素酶質體。 B· P53CON-蟲螢光素酶質體將兩個互補的5 ’ -磷酸化的寡核嘗酸，含有一致p53結合位置（p53CON)CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC 和 AG -50- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-II I 费 .線♦ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1262948 A7 B7 五、發明說明（48 ) GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC退火。將已經退火的片段與以ΚρηΙ消化過的pSVT -蟲螢光素酶連接，獲得 p53 CON-蟲螢光素酶質體。 C. PAI-E2F-Rb 質體藉著以Bgll和Xbal消化，切除在質體pCTMIE-E2F-Rb中含有CMV啓動基因的序列，後面是腺病毒-5三份引導子序列，以及在E2F-RB融合蛋白質之密碼上游的S V40促進子，連接所得的片段，得到無啓動基因的E2F-RB質體。藉著以SacI和Xhol消化，從質體PAI _蟲螢光素酶中切除含有經過修改之P AI啓動基因的片段，並藉著以Klenow處理弄鈍末端。將該片段連接到以EcoRI消化過的無啓動基因之 E2F-RB質體中，並以DNA聚合酶I之Klenow片段處理，獲得 PAI-E2F-RB 質體。實例4 .重組腺病毒的產製藉著將得自 pBHGll(26676 至 34140)之 7.4 kb SnaBI 片段選殖到以BamHI、AccI和Klenow處理的pNEB193(得自NEB 之質體）中，來建構含有在E3區域中帶有3-kb刪除之Ad5 序列的轉移質體，pNEBz\E3。藉著使5-磷酸化的寡核甞酸 AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCC GCT CGC GAG GAT CCT TAA T 和 TAA GGA TCC TCG CGA GCG GCC GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T 退火，將多重選殖位置導入上述的質體中，並藉著連接至以PacI消化過的pNEB △ E3，導入已經退火的片段，並獲得pNEB △ 51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 訂---------線ΙΦ----------Ί .1 I丨I丨經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1262948 A7 B7 五、發明說明（49 ) E3(MCS)質體。如下建構在P AI -啓動基因的控制之下，產生編碼E2F-Rb 的重組腺病毒，並在C Μ V啓動基因的控制之下促進綠營光蛋白質（GFP )的轉移質體。藉著將含有ρ ΑΙ啓動基因的片段和藉著以NacI和Xbal消化PAI-E2F-Rb來製備的E2F_Rb密碼序列連接’再連接至藉著以ΚρηΙ消化、以Klenow處理，再以Xbal消化而製備之PABS.4質體（Microbix)片段中，來製備中間載體pABS.4-E2F-Rb。然後藉著以PacI消化，從質體 pABS.4-E2F_Rb中切開含有PAI啓動基因、E2F-Rb融合密碼序列和康黴素基因的片段，以Klenow處理，並連接至藉著以PacI消化pNEB △ E3質體而獲得的質體片段中，並以 Klenow 處理，獲得質體 pNEBAE3_PAI-E2F_Rb，無 pacl 位置。藉著以SwaI消化pNEB△E3-PAI_E2F-Rb，並將其連接至藉著以Aflll和SspI消化而分離自pEGFP-N(Clontech)的片段，利用以可操作之方式與綠螢光蛋白質（GFP)基因連接的C Μ V啓動基因來代替在該質體中的康黴素基因，並以 Klenow 處理，獲得 pZ\E3-PAI-E2F-Rb_GFP 質體。如下建構在帶有SRE之TGF - yS反應性啓動基因的控制之下，產生編碼E2F-Rb之重組腺病毒，並在CMV啓動基因的控制之下，促進綠螢光蛋白質（GFP)的轉移質體。藉著將以Xbal和Nrul消化ρΝΕΒΛΕ3 (MCS)而分離出的片段，與藉著以Xbal和Nael消化pCVMIE-E2F-Rb而產生的片段連接，將E2F-Rb密碼序列導入質體pNEBAE3(MCS)中，獲得質體pNEBAE3_E2F_Rb。將含有SRE之TGF- 反應性啓動 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）一 "" (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 訂---------線 ΙΦ------------I J--- 1262948 A7 B7 五、發明說明（5Q ) 基因導入上述的質體中，係藉著以PCR擴大該序列，使用 SRE -蟲螢光素酶做爲模板，以及嶙酸化的引子GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C 和 GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTG GGC CAC T。以Spel消化所得的PCR產物，並與 SnaBI和Xbal消化過的pNEB △ E3 - E2F_Rb連接，獲得p △ E3-DPC-E2F-Rb。如下建構在p53反應性啓動基因的控制之下，產生編碼 E2F_Rb之重組腺病毒，並在C Μ V啓動基因的控制之下，促進綠螢光蛋白質（GFP)的轉移質體。將含有得自核糖體基因簇之ρ53-結合位置或ρ53 —致位置（p53CON)的ρ53-反應性啓動基因，導入質體pNEBAE3-2F_Rb中，係藉著以 PCR擴大該啓動基因序列，使用RGC -蟲螢光素酶或 p53 CON -蟲螢光素酶做爲模板，以及磷酸化的引子GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C 和 GAT ATC TAG ACG TCC TCT GTG GGC CAC T。以 Xbal 消化所得的 PCR產物，並與SnaBI和Xbal消化過的pNEBAE3-E2F-Rb連接，獲得p △ E3 -RGC-E2F-Rb 和 pdelataE3 -PCON-E2F-Rb。實例5 ·產生重組腺病毒的同源重組作用藉著在細菌中，按照（Chartier等人（1996) J. Virol. 70 : 4805-4810)的描述完成同源重組作用，產生重組的腺病毒 PAI-Ad、SRE-Ad、RGC-Ad和 CON_Ad。以 AscI 消化轉移質體，獲得含有在路徑-反應性啓動基因控制之下的E2F_ Rb，以及在C Μ V啓動基因控制之下，並位在Ad5序列側面之GFP的片段。將所得的片段與藉著以BstBI和Spel消化 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 0--------訂---------線---------— ΙΊ丨丨 1262948 Λ7 B7 五、發明說明（51 ) PTG4609(獲自 Transgene，Inc·，並描述在 Chartier 等人 ( 1996) J· Virol· 70 : 4805-4810中）而獲得的片段，共同轉化至BJ5 183細菌品系内。就想要之重組A d 5傳染性質體 pPAI_GFP-Ad、pSRE-GFP-Ad、pRGC-GFP-Ad 和 pCON- GFP-Ad的出現與否，來篩選所得的細菌菌落。然後藉著以PacI消化將這些有傳染性的質體弄直，並藉著酚-氯仿萃取和乙醇沉澱法純化，並用來轉移感染293細胞。使用Superfect (Qiagen)，根據製造者的指示完成轉移感染作用。使用2.5微克弄直的質體來轉移感染生長在6-孔培養盤上，帶有12微升Superfect/孔的250,000個細胞。在8 天之後，觀察到因爲病毒產生而引起之細胞病變效應。連同培養物上清液一起收獲細胞，並使其接受三次冷凍-融解的循環。藉著再度感染293細胞，擴大在所得之溶胞產物中的重組病毒。實例6.細胞株在本研究中使用的所有細胞株均獲自ATCC (Rockville， MD)，並生長成單層培養物，維持在3 7 °C的C Ο 2恆溫箱中。將 293、Hep3B、MRC3、A549、Panel、U87、 Caco2、MCF-7和WIDR維持在補充有1 0%胎牛血清之杜貝可氏（Dulbecco’s)經過修改的鷹式培養基中。MDA-MB 468細胞培養在補充有10%胎牛血清之漢氏（Ham’s)培養基中，而“丨&-?&〇&_2細胞生長在補充有1〇%胎牛血清和2.5% 馬血清之DMEM中。實例7.轉移感染 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公髮） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -春--------訂---------線如----------1! 1262948 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（52 ) 將細胞平舖在6-孔培養盤（250,000個細胞/孔）或2 4-孔培養盤（62,5〇〇個細胞/孔）中，並容許附接過夜。然後使用磷酸鈣，按照説明完成對293細胞的轉移感染，並根據製造者的指示，以Superfect(Qiagen)轉移感染其他細胞。實例報告者/蟲螢光素酶分析以1 · 5微克報告者質體和1 · 〇微克抑制劑轉移感染細胞。在轉移感染之後48小時，藉著加入IX報告者溶解緩衝溶液 (Promega)並在室溫下培養1〇分鐘，製備溶胞產物。使用 Top Count (Packard)和得自Packarg之分析工具組，根據得自Packard的指示，來測定蟲螢光素酶活性。實例9 ·分析測得的病毒-調節之細胞病變效應實質上根據在 Bischoff 等人（1996) Science 274 ·· 373-376 中描述的程序，以指定的重組物或野外型腺病毒感染細胞，並在感染之後6天，以在2 0 %乙醇中製備之0.5 %結晶紫染色。實例10.建構CU3EE和cTILT病毒

藉著PCR擴大MLP啓動基因序列，使用引子GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCT AGG GC 和 GAT CTT AAT TAA ATG GCA GTG ACC CGG AAG，使用 Ad5 DNA，在質體pFG140(Microbix)中做爲模板。然後將MLP PCR產物在PacI位置處選殖到質體pdelataE3-PCON-E2F_Rb 中，獲得pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP。藉著PCR擴大腺病毒E3 10.5K蛋白質密碼序列，使用引子GCG ACC CAC CCT AAC AGA 和 GAT CGG ATC CAA AGC GCA ACA AGG -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) #--------訂---------線·,---------.！經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1262948 A7 B7 五、發明說明（53 ) GTC A，並將所得的PCR產物在Xhol位置處選殖到質體 pCDNA3.1(Invitrogen)中，獲得pCDNA3-10.5 質體。藉著以Drain和Xbal消化，從pCDNA3-10.5中切開腺病毒E3 10.5K蛋白質密碼序列，藉著以Klenow處理，並連接至 PacI，再以 Klenow 處理 pdelataE3-PCON_E2F-Rb-MLP，獲得 pdelataE3-PCON_E2F-Rb-MLP-10.5K 質體。藉著在細菌中，按照（Chartier等人（ 1996) J. Virol. 7〇 : 4805-4810)的描述完成同源重組作用，產生重組的腺病毒 cUEE和cTILT。以AscI消化轉移質體，獲得含有在 p53CON序列控制之下的E2F-Rb，以及在MLP啓動基因控制之下，並位在Ad5序列側面之E3 10.5K的片段。將所得的片段與藉著以BstBI和Spel消化PTG46〇9 ( Transgene )而獲得的片段，共同轉化至BJ5283細菌品系内。就想要之重組 A d 5傳染性質體pCEMD的出現與否，來篩選所得的細菌菌落。獲得Ad5傳染性質體p〇l/CEMD，接著進行類似的草案，但使用PTG4609的衍生物（Transgene )，其中以含有具有0 1突變之E 1 A的序列來代替野外型E 1 A序列。然後藉著以PacI消化將這些有傳染性的質體弄直，並藉著酚-氯仿萃取和乙醇沉澱法純化，並用來轉移感染293細胞。使用 Superfect(Qiagen)，根據製造者的指示，完成質體 pCEMD和pOl/CEMD的轉移感染，分別產生重組的病毒 CU3EE和cTILT。使用2.5微克弄直的質體來轉移感染生長在6_孔培養盤上，帶有12微升Sup erfect/孔的500,000個細胞。在8天之後’觀察到因爲病毒產生而引起之細胞病變 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁} I t§ ϋ I I ·1 n ϋ I I I— I ί ϋ ϋ 1262948 A7 五、發明說明（54 )效應。連同培養物上清液一起收獲細胞，並使其接受三次冷凍-融解的循環。藉著再度感染M3細胞，擴大在所得之溶胞產物中的重組病毒。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製参--------訂---------線 I#"---------.11! 57 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

Ι26284«8ι π8〇3號專利申請案中文申請專利範圍替換本(95年5月） A8 B8 C8 D8

申請專利範圍阵年··月 L· ΦI ’補充丨 1. 一種選擇性複製重組腺病毒載體，其包括以可操作之方式與病毒複製之阻遏物連接的路徑-反應性啟動基因，其中該啟動基因係選自由p53路徑-反應性啟動基因、Rb路徑-反應性啟動基因和TGF -石路徑-反應性啟動基因所組成之群組，且該阻遏物為E2F-Rb。 2·根據申請專利範圍第1項之載體，其另包括轉殖基因表現卡匣，該轉殖基因卡匣係表現治療性轉殖基因。 3·根據申請專利範圍第2項之載體，其中該治療性轉殖基因係促細胞)周亡基因。 4·根據申請專利範圍第3項之載體，其中該促細胞凋亡基因係 Ad5 E3-10.5K。 5·根據申請專利範圍第4項之載體，其另包括在e 1功能部位之刪除以排除p3〇〇的結合作用。 6 .根據申請專利範圍第1項之重組腺病毒載體，其含有多重路徑反應性啟動基因，使得該病毒能夠選擇性地在具有多重路徑缺陷的細胞中複製。 7· —種殺叱具有路經缺陷之細胞的醫藥調配物，其包括根據申請專利範圍第1項之選擇性複製重組腺病毒載體，以及在藥學上可接受的載劑。 8·根據申請專利範圍第7項之調配物，其中該載體另包括轉殖基因表現卡匣’其中該轉殖基因表現卡匣係治療性轉殖基因。 9·根據申請專利範圍第8項之調配物，其中該治療性轉殖基因係促細胞凋亡基因。本紙張尺度適財關家標準(CNS) A4規格(21G X 297公釐) 1262948 A BCD a、申請專利範圍〇.根據申請專利範圍第9項之調配物’其中該促細胞凋亡基因係 Ad5 E3-10.5K。 1 L根據申請專利範圍第1 〇項之調配物，其中該載體另包括在E 1功能處之刪除以排除p3〇〇的結合作用。 12·根據申請專利範圍第7項之調配物，其另包括促進遞送之製劑。 13. —種活體外殺死具有路徑缺陷之細胞的方法，藉著使標革巴細胞與根據申請專利範圍第1項之選擇性複製重組腺病毒載體接觸。 14·根據申請專利範圍第丨3項之方法，其係自幹細胞產物中移除標乾細胞，其中該標乾細胞係腫瘤細胞。 15· —種根據申請專利範圍第1項之選擇性複製重組腺病毒載月豆之用途’其係用於製備殺死具有路徑缺陷之細胞的藥物。 16. 根據申請專利範圍第1 5項之用途，其中該藥物係藉由腹腔内、靜脈内或腫瘤内注射來投予。 17. —種以根據申請專利範圍第1項之選擇性複製重組腺病毒載體轉化的細胞。 18. —種沴斷工具組’其一部份含有根據申請專利範圍第1項之選擇性複製重組腺病毒載體，其另包括含有報告者基因之轉殖基因表現卡匣及適當的使用指示。 19. 種製匕根據申請專利範圍第1項之選擇性複製重組腺病毒載體的方法，該方法包括下列步驟： (a)以重組病毒感染生產細胞， -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1262948 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 (b)在條件下培養該被感染的生產細胞以容許該病毒在該生產細胞中複製其基因組， (c )收獲該生產細胞，並 (d)純化該重組病毒。 20. —種選擇性複製重組腺病毒載體，其包括以可操作之方式與病毒複製之阻遏物連接的路徑-反應性啟動基因，其中該載體在具有對啟動基因反應路徑有缺陷的腫瘤細胞中選擇性地進行複製。 21·根據申請專利範圍第20項之載體，其另包括轉殖基因表現卡匣，該轉殖基因卡匣係表現治療性轉殖基因。 22·根據申請專利範圍第2 1項之載體，其中該治療性轉殖基因係促細胞》周亡基因。 23·根據申請專利範圍第2 2項之載體，其中該促細胞凋亡基因係 Ad5 E3-10.5K。 24·根據申請專利範圍第23項之載體，其另包括在Ei功能部位之刪除以排除P300的結合作用。 25· 一種殺死細胞之醫藥調配物，其包括根據申請專利範圍第20項之選擇性複製重組腺病毒載體，以及在藥學上可接雙的載劑。 26’根據申請專利範圍第2 5項之調配物，其中該載體另包括轉殖基因表現卡匣，其中該轉殖基因表現卡匣係治療性轉殖基因。 27.根據申請專利範圍第2 6項之調配物，其中該治療性轉殖基因係促細胞凋亡基因。 -3 A4規格(21Gx297公釐)

1262948 穴、申請專利範圍 28.根據申請專利範圍第2 7項之調配物，其中該促細胞〉周^ 基因係 Ad5 E3-10.5K。 29·根據申請專利範圍第2 8項之調配物，其中該載體另包括在E 1功能處之刪除以排除p3〇〇的結合作用。 30.根據申請專利範圍第2 5項之調配物，其另包括促進遞送之製劑。 31· —種活體外殺死具有路徑缺陷之細胞的方法，藉著使標靶細胞與根據申請專利範圍第2 0項之選擇性複製重組病毒載體接觸。 32· —種根據申請專利範圍第2 0項之選擇性複製重組腺病毒載體於製備殺死細胞之藥物的用途。 33.根據申請專利範圍第3 2項之用途，其中該載體係藉由腹腔内、靜脈内或腫瘤内注射來投予。 34·根據申請專利範圍第3 1項之方法，其係自幹細胞產物中移除標靶細胞，其中該標靶細胞係腫瘤細胞。 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(cns) A4規格(210 x 297公爱)