HU226602B1 - Selectively replicating viral vectors, pharmaceutical preparations containing them and process for producing them - Google Patents

Selectively replicating viral vectors, pharmaceutical preparations containing them and process for producing them Download PDF

Info

Publication number
HU226602B1
HU226602B1 HU0104107A HUP0104107A HU226602B1 HU 226602 B1 HU226602 B1 HU 226602B1 HU 0104107 A HU0104107 A HU 0104107A HU P0104107 A HUP0104107 A HU P0104107A HU 226602 B1 HU226602 B1 HU 226602B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
vector
promoter
cell
cells
gene
Prior art date
Application number
HU0104107A
Other languages
English (en)
Inventor
Muralidhara Ramachandra
Paul W Shabram
Original Assignee
Canji
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Canji filed Critical Canji
Publication of HUP0104107A2 publication Critical patent/HUP0104107A2/hu
Publication of HUP0104107A3 publication Critical patent/HUP0104107A3/hu
Publication of HU226602B1 publication Critical patent/HU226602B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4736—Retinoblastoma protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Rekombináns adenovfrusokat jelenleg sokféle terápiás kezelési rendben alkalmaznak terápiás transzgének célba juttatására. Ezen vektorrendszerek széles körű fertőzőképessége azonban aggodalmakat kelt arra vonatkozóan, hogy a vírus expressziója nemtumoros sejtekben kollaterális károsodást okozhat nemneopláziás sejtekben. Ennek következtében sokféle célba juttató rendszert dolgoztak ki transzgén előnyös expresszálására egy adott sejttípusban. Szövetspecifikus és tumorspecifikus promotereket fejlesztettek ki a vektor előnyös replikációjára bizonyos sejttípusokban. Például a PCT/US96/10838 számú szabadalmi bejelentésben (közzétéve 1997. január 16-án, WO 97/01358 számon) leírják olyan vektorok alkalmazását, amelyek specifikus gazdasejtben replikálódnak E1, E2 vagy E4 funkciókat vezérlő prosztataspecifikus promoterelemek alkalmazásával, adott esetben citotoxikus transzgénexpressziós kazettát tartalmaznak. Ebben a közleményben különösen olyan konstrukciót írnak le, amelyben prosztataspecifikus enhanszer szabályoz E1-expressziót, és olyan expressziós kazettát tartalmaz, amely citozin deamináz-gén expresszióját vezérlő CMV-promotert tartalmaz, amelyet az E3-régióba inszertáltunk. Ezek a vektorok replikációkompetensek, és képesek intakt virionokba való csomagolásra egy adott sejttípusban.
Vírusreplikáció vezérlésére szolgáló, tumorspecifikus promotereket alkalmaznak egy párhuzamos megközelítésében, ahol specifikus deléciókat hoznak létre adenovirális, E1b-55K-fehérje kódolószekvenciájában. Az 55K méretű E1b-t kódoló nukleotidszekvenciában defektusokat tartalmazó rekombináns adenovfrusokat leírnak az USP 5,677,178 számú szabadalmi iratban (közzétéve 1997. október 14). Azonban megfigyelték, hogy ezek a szövet- vagy tumorspecifikus szabályozóelemek nem tökéletesek („leaky”), azaz a preferált célsejteken kívül más sejttípusokban is lehetővé tesznek replikációt.
Alternatív módon, az ilyen típusú, szelektíven replikálódó vektorokkal párhuzamosan olyan replikációdeficiens adenovírusvektort is alkalmaznak, amelyben az E1-funkció átfogóan deletálva van. Különösen E1, E2, E3 eliminációját és E4 részleges delécióját tartalmazó vektorokat alkalmaznak exogén transzgének célba juttatására. Ilyen vektorokat alkalmaznak p53-gén célba juttatására célsejtekbe. Kimutatták, hogy exogén beadott, vad típusú p53 expressziója p53-deficiens (p53mutáns vagy p53-nulla) tumorsejtben képes p53-mediált apoptózist indukálni a tumorsejtben. Ilyen, p53 célba juttatására szolgáló vírusvektorokat jelenleg a Schering Corporation és Invitrogen Corporation cégeknél fejlesztenek. Ismételten megemlítjük, hogy kimutatták, hogy ezek a vektorok elfogadható toxikológiai profilt és terápiás hatékonyságot mutatnak humán terápiás alkalmazásokban, és II. fázisú klinikai kísérletek folynak embereken, p53-mal kapcsolatos malignitások kezelésére.
Replikációdeficiens és szelektíven replikálódó vektorok, legalábbis elméletben olyan hátrányokkal rendelkeznek, amelyek aggodalmakat keltenek az orvosokban. Mivel a replikációdeficiens vektorok nem szaporodnak szabályozatlanul a páciensben, elméletileg tetszetősebb biztonsági profillal rendelkeznek. Azonban a hatékony tumoreliminációhoz a tumorsejtek lényegi többségének megfertőzése szükséges, általában lényegi moláris vektorfelesleget alkalmaznak a terápiás hatékonyság biztosításához. Szelektíven replikálódó vektorokat sokkal inkább biztonsági szempontból tekintjük, mivel képesek replikálódni és potenciálisan mutáció mehet végbe bennük teljesen replikációkompetens vektorok kialakulásával a páciensben. Azonban, ha bizonyos körülmények között a vírus szaporodásának természetes képességét fenntartjuk, lehetővé teszi, hogy ezek a vektorok ráterjedjenek a környező tumorsejtekre. Mivel a vektorok maguk képesek replikációra, ilyen vektorokból alacsonyabb kezdődózis szükséges. Ez immunológiai szempontból, valamint gazdaságossági okok miatt kedvező szempont ilyen ágensek előállításakor. Ennélfogva, igény van a szakterületen szelektíven replikálódó vektorra, amely figyelembe veszi az ismert biztonsági problémákat, miközben megnövelt terápiás mutatókkal rendelkezik.
A találmány szerint úgy oldjuk meg ezeket a problémákat, hogy előállítunk olyan szelektíven replikálódó adenovírusvektort, amely egy szintézisutat (pathway) célzó, a virális replikáció egy represszorának expresszióját vezérlő, a szintézisútra reszponzív promotert tartalmaz, így a vektor előnyösen a szintézisút-defektív sejtekben replikálódik. A találmány tárgyát képezik ilyen vektorokat tartalmazó gyógyszerformák, is. A találmány tárgyát képezik eljárások szintézisút-defektív sejtek eliminálására normál sejtek populációjából, ilyen vektorok alkalmazásával.
A találmány tárgyát rekombináns vírusok képezik, amelyek a vírusgenomot szelektíven, a célsejt intracelluláris körülményeire adott válaszként replikálják folyamatsorra reszponzív promoter alkalmazásával, amely vírusreplikáció inhibitorának expresszióját vezérli, amely a gazdasejtben lényegében a fertőzött sejt fenotípusára vagy genotípusára alapozva gátol vírusreplikációt. A célsejtben a szintézisútra reszponzív promoter promotereleme inaktív, és így lehetővé válik, hogy a vírus replikálódjon. Ez azt eredményezi, hogy (1) elpusztulnak a sejtek a vírus litikus természete útján, és/vagy (2) transzgenikus termék (amplifikálódik, replikációlnkompetens vektorokhoz képest) terápiás dózisát biztosítjuk a célsejtben, és (3) előállítjuk a vírus lokalizált koncentrációját, elősegítve környező célsejtek fertőzését a rekombináns vírussal. A találmány tárgyát képezik továbbá terápiás és diagnosztikai eljárások a vektorok alkalmazásával, a vektorokat tartalmazó gyógyszerformák, a vektorok előállítására szolgáló eljárások és a vektorokat tartalmazó transzformált sejtek.
1. ábra: CPE vizsgálati eljárás eredményei TGF-βszintézisútra reszponzív promoter (PAI vagy SRE) vagy p53-szintézisútra reszponzív promoter (RGC vagy p53CON) vezérlete alatt lévő, E2F-Rb fúziót kódoló szekvenciát tartalmazó, rekombináns adenovírusvektorok citopatikus hatásának
HU 226 602 Β1 meghatározása céljából. Továbbá, zölden fluoreszkáló fehérjét kódoló gént is beépítettünk a vektorba riporterként. Az A-panel megfelel MRC-9-sejteknek, a B-panel megfelel Hep3B-sejteknek és C-panel megfelel WIDR-sejteknek. 1. sáv: replikációdeficiens (E1 -deletált) rekombináns adenovírus, amely zölden fluoreszkáló fehérjét (GFP) expresszál; 2. sáv: PAI-Ad; 3. sáv: SRE-Ad; 4. sáv: RGC-Ad; 5. sáv: p53CON-Ad. A részecskekoncentrációk az ábra jobb oldalán vannak jelölve.
2. ábra: Fluoreszcenciamikroszkóp alkalmazásával végzett vizsgálatok eredményei (felső panelek) GFP-expressziót mutatnak folyamatsort célzó vektorok alkalmazásával. Az A-panel megfelel GFCB-kontroll vektornak, B-panel az SRE-Ad-vektornak és a C-panel a p53CON-Ad-vektornak. A fertőzést 5*105 részecske/milliliter dózissal végeztük.
3. ábra: Normál bronchiális epitél sejtek (A-panel) és C33A-sejtek (B-panel) U3EE (négyszögek), TILT (körök) és L9IU (háromszögek) rekombináns adenovírusokkal való fertőzésének eredményei. A függőleges tengelyek megfelelnek a nem fertőzött kontrollokhoz viszonyított százaléknak és a vízszintes tengelyek megfelelnek részecske/ml-ben kifejezett vírusdózisnak. A kísérleteket úgy végeztük, hogy az egyes sejtek tenyészeteit hat különböző koncentrációjú (105 és 109 vírusrészecske/ml között) vírus hatásának tettük ki. A sejteket egy óra hosszáig tettük ki a vírus hatásának, a feleslegben maradt vírust kimostuk, és a fertőzést követő 6. napon meghatároztuk az életképes sejtek százalékos arányát MTS vizsgálati eljárás (Promega, Madison, Wl) alkalmazásával, lényegében a gyártó utasításai szerint. A vízszintes vonal azt a szintet mutatja, ahol a sejtek 50%-a életképes maradt. Az adatok alapján felvett görbék és a vízszintes vonal metszéspontja megadja a vírus ED50-ét.
A találmány tárgyát szelektíven replikálódó rekombináns vírusvektor képezi, amely egy szintézisútra (pathway) reszponzív promotert tartalmaz a vírusreplikáció egy represszorához működőképesen kapcsolva, mimellett a vektor szelektíven replikálódik azon neopláziás sejtekben, amelyek detektívek arra a szintézisútra, amelyre a promoter reszponzív (érzékeny).
A „szelektíven replikálódó kifejezés a leírásban olyan vektorra utal, amely egy bizonyos fenotipikus állapotban lévő sejtben képes előnyben részesíteni replikációt, egy másik fenotipikus állapotban lévő sejthez viszonyítva. Különböző fenotipikus állapot például a p53 szintézisút-defektív állapot a normál sejthez viszonyítva, egy adott sejttípus esetén. Az a vírus, amelyik az egyik fenotipikus állapotot előnyben részesítve replikálódik, legalább ötször gyorsabban replikálódik a célsejttípusban, mint ugyanilyen típusú normál (kontroll-) sejtben egy adott dózismennyiség esetén. Annak meghatározása céljából, hogy a vírus valóban szelektív, számos faktor vonatkozásában elemezni kell a vírus célsejtekben való replikációs képességét, ugyanilyen típusú normál sejtekhez viszonyítva.
Előnyösen összehasonlítjuk egy adott vektor replikációs képességét olyan célsejtben, amely a célzandó állapotban van, és egy ugyanilyen típusú normál sejtben, amely nem ilyen állapotban van. Például az első lépés a vírusfertőzés után a sejt indukálása a sejtciklusba való belépésre, mivel maximális hatékonyságú vírusreplikációhoz szükséges faktorok csak az S-fázisban vannak jelen. Azonban, ha megkísérelnénk elemezni egy vektor szelektivitását tumorsejtekre való szelektivitásra, a replikációs képesség elemzése tumorsejtben egy másik olyan sejthez viszonyítva, amely már belépett a sejtciklusba (például immortalizált vagy transzformált sejtvonal), a vírus szelektivitása tumorsejtekre bizonyos mértékig bizonytalan lenne. Továbbá megfigyelték, hogy különböző sejttípusok jelentősen eltérő fertőzhetőséggel rendelkeztek egy adott vírusra. Bár néhány vírus, például adenovírusok széles spektrumú szövettropizmussal rendelkeznek, más vírusok korlátozottabban fertőznek bizonyos sejttípust. Ha megkíséreljük egy adott vektor hatékonyságát elemezni széles spektrumban fertőzhető sejtekben, nehéz meghatározni, hogy vajon a hatás hiánya a vektor sejtben való hatékonyságának tulajdonítható, vagy egész egyszerűen a vírus egyáltalán nem képes fertőzni a sejteket. A szelektivitás elemzésével adott típushoz tartozó cél- és normál sejtekben minimalizálni lehet ezt a fertőzhetőségi hatást.
A vírus életciklusának időbeli természetét is figyelembe kell venni. Például úgy tűnik, hogy egy vad típusú vektor szelektív tumorsejtekben normál sejtekhez viszonyítva nem sokkal a fertőzés után, mivel a sejt már ciklusban van. Azonban ez a látszólagos szelektivitás idővel megszűnik, ha a vírus stimulálja a sejtciklust. Ennek következtében megfelelően kell megválasztani az időpontot, amelynél a szelektivitást elemezzük a fertőzés után, hogy elkerüljük ezt a kezdeti replikációs lag-fázist normál sejtekben. Bár ez változhat az alkalmazott vírus típusával, ezt a kezdeti iag-fázist szakember könnyen képes meghatározni.
A dózis hatását is figyelembe kell venni annak meghatározása során, hogy egy adott rekombináns adenovírus mutat-e szelektivitást a célsejttípusban. Például, ha tumorsejtek eliminálását tűzzük ki célul, és a hatást citotoxicitás útján mérjük, úgy tűnhet, hogy egy vírus szelektív toxicitást mutat különböző dózisokban. Megfigyelték, hogy elegendően magas dózisban majdnem bármilyen vírus, tekintet nélkül arra, hogy genomja milyen mértékben van módosítva, citotoxikus lehet egyszerűen amiatt, hogy vírusfehérjék (például adenovírusok esetén hexon) vannak jelen, amelyekről ismeretes, hogy citotoxikusak. Ehhez hasonlóan, még ha a szakirodalom „replikációdefektívnek” jelöl is egy vírust (feltételezve, hogy a vírus abszolút nem képes replikáció3
HU 226 602 Β1 ra egy sejtvonal hiányában, amely képes komplementéin! a replikációt), ilyen vírusokat precízebb „replikádéra gyengítettnek” nevezni. Például az egész E1-régió delécióját tartalmazó adenovírusok, amelyeket gyakran „replikációdeficiensnek” vagy „replikációdefektívnek” jelölnek, bizonyos mértékig képesek replikálódni, különösen ciklusban lévő vagy gyorsan osztódó sejtekben. Mulligan megfigyelte [Science 260, 926-932 (1990)], hogy:
Bár az E1-régió expressziójáról kimutatták, hogy hatással van más, replikádéhoz szükséges virális géntermék expressziójára [Horwitz, M., „Virology” című könyvben, szerk. Β. N. Fields, Raven, New York (1990), 60. fejezet], az E1-génexpresszió szükségessége a vírusreplikációhoz nem tűnik abszolútnak. E1-deficiens vírusok korai jellemzésével kimutatták, hogy magas fertőzési egység alkalmazásával az E1-régió nem szükséges a replikációhoz [Jones és Shenk, PNAS (USA) 76 3665-3669 (1979)].
Emiatt a vírusdózis hatását figyelmen kívül lehet hagyni annak meghatározásakor, hogy egy vírus szelektív módon replikálódik-e.
Ha egy vírus replikációs szelektivitását elemezzük a célsejtekre nézve, a vírus „szelektivitási indexét” az alábbiak szerint értékeljük. Általánosan alkalmazott paraméter az ED50 (amelyet úgy definiálunk, mint elegendő dózist ahhoz, hogy a sejtek 50%-ának pusztulását indukálja), amely megfelelő összehasonlítási alapot biztosít. A vírus ED50-ét szakember könnyen képes meghatározni tipikus, in vitro dóziskiterjesztési („eszkalációs”) kísérletekben. A legkövetkezetesebb összehasonlítási alap biztosítása céljából az ED50-et legmegfelelőbben egy virális kontrolihoz viszonyítva fejezzük ki, hogy minimalizáljuk az összehasonlítandó sejttípusok közötti fertőzhetőség variációit, valamint bármilyen, vizsgálati eljárásból származó variációt. Ennek következtében az ED50 (vírus)/ED50 (kontroll) egység nélküli arányt alkalmazzuk a vírus sejtben való relatív toxicitásának kifejezésére, és „relatív toxicitási indexnek” vagy „RTI”-nek jelöljük. Egy adott vírus „szelektivitási indexét” az alábbi aránnyal fejezzük ki: RTI(célsejtek)/RTI(normál sejtek). Szelektíven replikálódó vektorok legalább 10, de előnyösen 50, 100 vagy nagyobb szelektivitási indexszel rendelkeznek.
Például az U3EE és TILT szelektíven replikálódó adenovírusvektorokat úgy tervezzük, hogy p53-folyamatsorra nézve defektussal rendelkező tumorsejtekben érjenek el szelektív replikációt és elpusztítsák azokat. Az U3EE-t lényegében a leírásban található 1. példa kitanítása szerint állítunk elő. Röviden összefoglalva, az U3EE-vírus tartalmaz egy első expressziós kazettát, amelyben p53-reszponzív elem (p53 CON) vezérli az E2F-Rb fúziós fehérje expresszióját. Az E2F-Rb fúziós fehérje potenciális inhibitora az adenoviráiis E2-promoter-aktivitásnak, és a sejtben való jelenléte hatékonyan szuppresszálja a virális replikációt. A p53-reszponzív elem funkcionális p53-folyamatsor jelenlétére adott válaszként aktív. Ennek következtében normál sejtekben, ahol az p53-folyamatsor intakt, az U3EE-vírus expresszálja az E2F-Rb fúziós fehérjét, és a vírus nem replikálódik. Azonban olyan sejtekben, amelyekben a p53-folyamatsornak defektusa van (a tumorsejtek többségében), a p53CON-reszponzív elem nem aktív, és így vírusreplikáció nem represszálódik. Az U3EE-vektor olyan expressziós kazettát is tartalmaz, amelyben Ad5-eredetű E3-10.5K proapoptotikus gén expresszióját MLP-promoter vezérli. Időleges promoterek (például az MLP-promoter) alkalmazása akkor előnyös, ha proapoptotikus géneket alkalmazunk, mivel virális DNS replikációját a célsejtben a proapoptotikus szignál aktiválása előtt kívánjuk elősegíteni. Az MLP-promoter a fertőzés után körülbelül hét órával aktiválódik az U3EE-genom replikációjának beindulását követően, így indukálja az E3-10.5K-fehérje aktivitását. A TILT adenovírusvektor lényegében ugyanaz, mint az U3EE-vektor, kivéve azt, hogy további deléciót tartalmaz az E1a-régióban, amely eltávolítja a 243R és 289R adenovirális E1a-fehérjék 4-25. aminosavait. Ez a deléció megszünteti a p300-fehérje kötődési képességét ezekhez az E1a-fehérjékhez.
U3EE- és TILT-vírusokat elemeztük arra vonatkozóan, hogy milyen mértékben képesek replikálódni és normál humán bronchiális epitól sejteket (NHBE) és C33A-sejteket (detektív p53-folyamatsorral rendelkező, epitél tumorsejtvonal) elpusztítani, kontrollként L9IUvektort alkalmazva. A kísérlet eredményeit bemutatjuk a csatolt ábrák közül a 3. ábrán. Az alábbi táblázatban összesítjük az adatokat:
1. táblázat
Vírusokhoz tartozó RTI-k és szelektivitási indexek összefoglalása
Vírus RTI (normál sejtek) RTI (tumorsejtek) Szelektívitási index
L9IU 1,0 1,0 1,0
U3EE 12,5 0,0233 536
TILT 10 0,066 152
A bemutatott adatok alapján látható, hogy az U3EE- és T1 LT-vírusok nagymértékű szelektivitást mutatnak tumorsejtekre. A fentebb tárgyaltak szerint, az L9IU-vírus kismértékű replikációs előnnyel rendelkezik ciklusban lévő tumorsejtekben nyugvó normál sejtekhez viszonyítva. Az ED50 (vírus)/ED50 (kontroll) arányok összehasonlítása az egyes sejttípusok esetén a szelektivitási index kiszámítása előtt minimalizálja az ilyen variációk hatásait.
A „rekombináns” kifejezésen a leírásban olyan genomot értünk, amely szokásos rekombináns DNS-technikákkal lett módosítva.
A „vírus kifejezésen a leírásban bármilyen obiigát intracelluláris parazitát értünk, amely nem rendelkezik fehérjeszintetizáló vagy energiageneráló mechanizmussal. A virális genom tartalmazhat RNS-t vagy DNS-t, lipidmembrán burkoló fehérjestruktúrájával. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható vírusok lehetnek például baculoviridiae, parvoviridiae, picornoviridiae, herpesviridiae, poxviridiae, adenoviri4
HU 226 602 Β1 diae, picornaviridiae nemzetségekhez tartozó vírusok. A rekombináns vírusok kifejezésen értünk kiméra (sőt multiméra) vírusokat, azaz olyan vektorokat, amelyeket egynél több virális altípusból származó, komplementer kódolószekvencia alkalmazásával állítottunk elő. Lásd például Feng és munkatársai, Natúré Biotechnology 15, 866-870.
Az „adenovírus” kifejezés a leírásban szinonimája az „adenovírusvektor kifejezésnek, és adenoviridiae nemzetséghez tartozó vírusokra utal. Az „adenoviridiae” kifejezés kollektiven vonatkozik a mastadenovírusok nemzetségének állati eredetű adenovírusaira, például a humán, marhaeredetű, juheredetű, lóeredetű, kutyaeredetű, sertéseredetű, rágcsálóeredetű és majomeredetű adenovírus-alnemzetségre. A humán adenovírusokhoz különösen az A-F alnemzetség, valamint ezek egyedi szerotípusai tartoznak. Az egyedi szerotípusokhoz és az A-F alnemzetséghez tartoznak például 1., 2., 3., 4., 4.a, 5., 6., 7., 8., 9., 10., 11. (Ad11A és Ad11P), 12., 13., 14., 15., 16., 17., 18., 19., 19.a, 20., 21., 22., 23., 24., 25., 26., 27., 28., 29., 30.,
31., 32., 33., 34., 34.a, 35., 35.p, 36., 37., 38., 39., 40.,
41., 42., 43., 44., 45., 46., 47., 48. és 91. típusú humán adenovírusok. A „marhaeredetű adenovírusok” kifejezésen értjük például a 1., 2., 3., 4., 7. és 10. típusú marhaerdetű adenovírust. A „kutyaeredetű adenovírusok kifejezésen értjük például az 1. (CLL-törzsek, Glaxo, RI261, Utrecht, Toronto 26-61) és 2. típusú kutyaeredetű vírust. A „lóeredetű adenovírusok” kifejezésen értjük például a 1. és 2. típusú lóeredetű adenovírust. A „sertéseredetű adenovírusok” kifejezésen értjük például a 3. és 4. típusú sertéseredetű adenovírust. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint az adenovírus 2. vagy 5. szerotípusú, humán adenovírusból származik.
A „szintézisútra reszponzív (válaszoló) promoter” kifejezésen olyan DNS-szekvenciát értünk, amely képes megkötni egy bizonyos fehérjét, és ezáltal a szomszédosán elhelyezkedő gének transzkripciós választ adnak a fehérje kötődésére normál sejtekben. Ilyen promotereket elő lehet állítani olyan válaszelemek beépítésével, amelyek olyan szekvenciák, amelyhez transzkripciós faktorok képesek kötődni. Az ilyen válaszelemek általában induktívak, bár előfordul néhány eset, ahol növekvő fehérjemennyiség csökkenti a transzkripció mértékét. Szintézisút reszponzív promoterek lehetnek természetesen előfordulóak vagy szintetikusak. Szintézisút-reszponzív promotereket tipikusan a szintézisút vagy a megcélzott funkcionális fehérje vonatkozásában állítunk elő. Például természetesen előforduló p53-szintézisútra reszponzív promoter tartalmazhat transzkripciós szabályozóelemeket, amelyek funkcionális p53 jelenlétével aktiválódnak, például p21vagy bax-promotert. Más módszerben, egy minimális promotertől (például SV40-TATA-box régiótól) szintézisiránnyal szemben p53-kötőhelyeket tartalmazó, szintetikus promotereket lehet alkalmazni szintetikus, szintézisútra reszponzív promoter előállítása céljából. Szintetikus, szintézisútra reszponzív promotereket általában olyan szekvencia egy vagy több kópiájából állítjuk elő, amelyek megegyeznek egy konszenzus kötőmotívummal. Ilyen konszenzus DNS-kötőmotívumokat könnyen meg lehet határozni. Ilyen konszenzus szekvenciák általában közvetlen vagy fej-farok illeszkedésű, ismétlődő szekvenciaként rendeződnek, melyeket néhány bázispár választ el. Fej-fej illeszkedésű ismétlődő szekvenciákat tartalmazó elemeket (például AGGTCATGACCT) palindromoknak vagy fordított ismétlődő szekvenciáknak nevezünk, és azokat, amelyek farok-farok illeszkedésűek, kifordított ismétlődő szekvenciának nevezzük.
A találmány szerinti megoldásban hasznos, szintézisút-reszponzív promoterek például a szintetikus, inzulin-szintézisútra reszponzív promoterek, amelyek konszenzus inzulinkötő szekvenciát tartalmaznak [Jacob et al., J. Bioi. Chem. 270, 27 773-27 779 (1995)], citokinreszponzív promoter, glükokortikoid-folyamatsorra reszponzív promoter [Lángé et al., J. Bioi. Chem. 267, 15673-80 (1992)], IL1- és IL6-szintézisútra reszponzív promoterek [Won K. A. és Baumann H., Mól. Cell. Bioi. 10, 3965-3978 (1990)], T3-szintézisútra reszponzív promoterek, tiroid-hormonszintézisútra reszponzív promoterek, amelyek az alábbi konszenzus motívumot tartalmazzák: 5’-AGGTCA-3’, a TPA-szintézisútra reszponzív promoterek (TRE-ek), TGF-f$-szintézisútra reszponzív promoterek [Grotendorst és munkatársai által leírtak szerint, Cell Growth and Differentiation 7, 469-480 (1996)]. Más, szintézisút-reszponzív promoterek szakember számára jól ismertek, azonosítani lehet ilyeneket a „Database of Transcription Regulatory Regins on Eukaryotic Genomes”-ban, amelynek internet-megközelítési lehetősége http://www.eimb.rssi.ru/TRRD.
A találmány példákban bemutatott, előnyös megvalósítási módja szerint a vektor szintetikus TGF-P-szintézisútra reszponzív promotert tartalmaz, amely funkcionális TGF-p-szintézisút jelenlétében aktív, az ilyen promoter például SRE és PAI-RE válaszelemeket tartalmaz. PAI-RE szintetikus TGF-ji-reszponzív elemet jelent, amely plazminogén aktivátor-l promoterrégiójából izolált, TGF-|i-szignálra válaszoló szekvenciákat tartalmaz. A PAIRE-konstrukciót a 3. példában írjuk le. A PAI-RE-szintézisútra reszponzív promotert 749 bázispár méretű fragmentumként lehet izolálni p800lucplazmidból [Zonneveld és munkatársai által leírtak szerint, PNAS 85, 5525-5529 (1988), és rendelkezésre áll a GenBank-ban, J03836. nyilvántartási számon], SRE szintetikus TGF-p-reszponzív elemet jelent, amely 4, ismétlődő Smad-4 DNS-kötőszekvenciát [GTCTAGAC, Zawel és munkatársai leírása szerint, Mól. Cell 1, 611-617 (1988)] tartalmaz. Az SRE-konstrukciót a 3. példában írjuk le. Az SRE-reszponzív elemet Smad-4kötőszekvenciát kódoló, komplementer oligonukleotidok összehibridizálásával lehet előállítani, és klónozni lehet a pGL#3-plazmid/luciferáz-promoter vektorba (kereskedelemben rendelkezésre áll a ProMega cégnél).
Ehhez hasonlóan, „p53-szintézisútra reszponzív promoter kifejezésen olyan transzkripciós szabályozóelemet értünk, amely funkcionális p53-szintézisút jelenlétében aktív. A p53-szintézisútra reszponzív promoter lehet természetesen előforduló transzkripciós szabá5
HU 226 602 Β1 lyozó régió, amely funkcionális p53-szintézlsút jelenlétében aktív, például p21- vagy mdm2-promoter. Más módszerben, a p53-szintézisútra reszponzív promoter lehet szintetikus transzkripciós szabályozó régió, amely funkcionális p53-szintézisút jelenlétében aktív, például SRE és PAI-RE szintézisútra reszponzív promoterek. p53-CON olyan p53-szintézisútra reszponzív promotert ír le, amely szintetikus p53-válasz elemet tartalmaz, melyet két szintetikus p53 konszenzus, DNS-kötőszekvencia inszerciójával lehet előállítani [Fűnk és munkatársai által leírtak szerint, Mól. Cell Bioi. 12, 2866-2871 (1992)] az SV40-TATA-boxtól szintézisiránnyal szemben. A p53-CON szintézisútra reszponzív promoter előállítását leírjuk a 3. példában. RGC jelentése szintetikus p53-szintézisútra reszponzív promoter, amelyben a riboszomális génklaszterben azonosított, egyetlen p53-kötődomént [Kern et al., Science 252, 1708-1711 (1991); és Park et al., Molecular Carcinogenesis 16, 101-108 (1996)] alkalmazzuk. p53CON és RGC válasz elemeket komplementer oligonukleotidok összehibridizálásával lehet előállítani, és p53-reszponzív promotereket klónozással lehet előállítani (a 3. példában részletesen leírtak szerint) a pGL#3-plazmid/luciferáz-promoter vektorba (kereskedelemben rendelkezésre áll a ProMega cégnél).
A „célsejt kifejezés a leírásban egy adott fenotipikus állapotban lévő sejtet jelent, amelyet terápiás transzgén beadásával kívánunk kezelni. Különböző szintézisút-reszponzív promoterelemek alkalmazásával a vírusexpressziót célzottan lehet irányítani intakt szintézisúttal rendelkező, bármilyen adott sejtre. Például vírusrepllkáció represszorát lehet expresszálni neopláziás (daganatos) célsejtben, TGF-béta- vagy pSS-szintézisútra reszponzív promoterek alkalmazásán keresztül. Ehhez hasonlóan, vírusrepllkáció represszorát lehet expresszálni artrítiszes célsejtben gyulladásra reszponzív promoter alkalmazásán keresztül, amelyben a vektor adott esetben IL-10-et kódol.
A „működőképesen kapcsolt” kifejezés polinukleotidelemek funkcionális viszonyban lévő kapcsolatát jelenti. Egy nukleinsavszekvencia „működőképesen kapcsolt”, ha funkcionális viszonyba van helyezve egy másik nukleinsavszekvenciával. Például egy promoter vagy enhanszer működőképesen kapcsolt egy kódolószekvenciával, ha az befolyásolni képes a kódolószekvencia transzkripcióját. A „működőképesen kapcsolt azt jelenti, hogy a nukleotidszekvenciák tipikusan folyamatosan összefüggően vannak egymáshoz kapcsolva. Azonban, mivel az enhanszerek általában akkor működnek, ha a promotertől néhány kilobázis elválasztja azokat, és az intronszekvenciák változó hosszúságúak lehetnek, bizonyos polinukleotidelemek működőképesen lehetnek kapcsolva, de nincsenek közvetlenül érintkezésben, sőt „in trans” működhetnek eltérő alléiról vagy kromoszómáról.
A „vírusrepllkáció represszora kifejezésen egy fehérjét értünk, amelynek egy adott sejttípusban való expresszálása lényegében represszálja a vírusreplikációt. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a vírusreplikáció represszora függ azon szülői adenovírusvektor természetétől, amelyből a találmány szerinti rekombináns vektor származik. Például adenovírusvektorok vagy más DNS-tumorvírusok esetén, az E2F-Rb fúziós konstrukciót lehet alkalmazni, melyet az EP 94108445.1 számú szabadalmi iratban (közzétéve 1995. december 6., közzétételi szám: 0 685 493 A1) írtak le. Az E2F-Rb fúziós fehérje E2F transzkripciós faktor fehérjéből származó, DNS-kötő és DP1 heterodimerizációs doménekből (a vad típusú E2F-ben a 95-286. aminosavak) áll, Rb növekedési szuppressziós doménhez (a vad típusú Rb-fehérjében a 379-928. aminosavak) fuzionálva. Az E2F-Rb fúziós fehérje potenciális represszora az E2F-függő transzkripciónak és leblokkolja a sejteket G1-ben. A DNS-kötő dómén a 128-193. aminosavaknál helyezkedik el, és a dimerizációs dómén a 194-289. aminosavaknál helyezkedik el. A humán E2F-1-fehérje szekvenciája rendelkezésre áll a GenBankban, M96577. nyilvántartási számon, deponálva 1992. augusztus 10-én. E2F-szekvenciaként más fajban előforduló, az E2F-család más tagjaiból származó E2F-szekvenciákat is alkalmazhatunk, ha az előállítandó vektort más fajban kívánjuk alkalmazni. Azokban a szituációkban, ahol a rekombináns vírus adenoasszociált vírusra (AAV) épül, a repfehérje és származékai hatékony represszorai a vírusreplikációnak adenovírusfertőzés hiányában. Azokban a szituációkban, ahol a vírus herpes simplex vírusból származik, az ICPO-NX-fehérjét [ICPO azonnali korai fehérje deletált formája; Liun et al., J. Virol. 72, 7785-7795 (1998)] alkalmazhatjuk a vírusrepllkáció hatékony represszoraként. Ehhez hasonlóan, domináns negatív aktivitással rendelkező, bármilyen fehérjét alkalmazhatunk vírusrepllkáció represszoraként.
TGF-β és hasonló szerkezetű fehérjék, beleértve aktividin, inhibinek és BMP potenciális, természetes antiproliferatív ágensek lehetnek, és feltételezzük, hogy fontos szerepet játszanak tumorgenitás szuppresszálásában. Biológiailag aktív formáiban a TGF-β 25 kDa méretű, diszulfidkötésekkel összekapcsolt homodimer, és látszólag valamennyi humán szövetben expresszálódik. Érdekes módon sok malignus sejttípus megtartotta expressziós mintázatát, amelyet normál sejtekben lehet látni. A TGF-β I. típusú és II. típusú, szerin/treonin kináz-receptorok heteromer receptorkomplexein keresztül továbbít jelet. A két receptor kinéz közül a II. típusú receptor belső kináz aktivitással rendelkezik, és TGF^Iigandumhoz való kötődés esetén a II. típusú receptor heteromerizálódik az I. típusú receptorral, és transzfoszforilálja azt. Az I. típusú receptor foszforilációja aktiválja kináz-aktivitását, amely viszont Smad-ok foszforilációját eredményezi, amelyek intracelluláris effektorok. A foszforiiált I. típusú receptor a sejt belsejébe továbbítja a jeleket, amely celluláris választ eredményez, például növekedési gátlást. Ismereteink szerint, a sejtmagon belül a Smad-komplexek célgének transzkripcióját aktiválják, akár maguk hatnak transzkripciós faktorként, vagy más transzkripciós faktorok aktivitását szabályozzák. Transzkripciós faktorok, amelyekről feltételezzük, hogy TGF^-szignál útján szabályozódnak, például: CTF/NF-1, FAST-1, Sp1,
HU 226 602 Β1
Jun, SRF/TRF, Oct és CREB. Ezen kölcsönhatások nettó eredménye vezet a TGF-β különböző, ismert pleiotróp hatásaihoz.
Transzformáló növekedési faktor-β (TGF-β) és rokon szerkezetű fehérjék sok sejttípusban potenciális in- 5 hibitorai a proliferációnak. Számos epitél és hematopoetikus eredetű tumor malignus progressziója összhangban van TGF-β antiproliferatív és antiinváziós hatásának megszűnésével. Kimutatták, hogy a TGF^-jeltovábbitás megszűnésében mutációknak vagy délé- 10 cióknak van szerepük, vagy a szignáltranszdukciós folyamatsor receptorai és/vagy intracelluláris effektorai nem expresszálódnak. Sok malignus tumor, amely rezisztens TGF^-ra, szintén többszörösen detektív más tumorszuppresszor génekre, ezáltal tumorszuppresszor gének helyettesítése korlátozottan alkalmazható hatékony terápia céljára.
TGF^-szintézisútra reszponzív promotereket úgy állítottunk elő, hogy beépítettünk plazminogén-aktivátor inhibitor-1-ből (PAI-promoter) vagy Smad4/DPC4kötőhelyből (SRE-promoter) származó szekvenciákat az SV40-TATA-boxtól szintézisiránnyal szemben. Ezen promoterek aktivitásait tranziens transzfekciós vizsgálati eljárásokban értékeltük ki, riporterként luciferázt alkalmazva. Az eredményeket az alábbi 2. táblázatban mutatjuk be:
2. táblázat
Relatív luciferázaktivitás*
Sejtvonal TGF-β szintézisút PAI promoter -TGF-β PAI promoter + TGF-β SRE promoter - TGF-β SRE promoter + TGF-β
Hep3B normál 68,82 128,42 105,02 86,47
293 normál 51,62 88,78 9,40 46,94
A549 normál 33,26 56,76 2,87 17,93
Panel normál 15,36 141,80 1,14 29,03
U87 normál 110,40 73,88 7,42 7,85
MCF-7 detektív 18,93 10,72 1,28 1,22
WIDR detektív 10,66 4,41 1,24 1,57
MDA-MB468 detektív 2,28 1,10 1,33 0,62
AsPC-1 detektív 6,56 1,24 1,79 0,76
Caco2 detektív 13,01 13,8 1,18 0,96
MicaPaca detektív 14,08 1,81 0,79 26,34
* A luciferázaktivitást ahhoz az aktivitáshoz viszonyítva fejezzük ki, amelyet promoter nélküli konstrukcióval kaptunk (annak hányszorosa).
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy mindkét promoter csak olyan sejtekben aktív, amelyekben fűnk- 40 cionális TGF^-szignáltranszdukció van. TGF^-szintézisútra detektív sejtvonalban, például MDA-MB468ban, amely Smad4/DPC4 homozigóta deléciója miatt detektív TGF^-szignáltranszdukcióra, luciferázhoz működőképesen kapcsolt PAI-promoter vagy SRE-promoter transzfekciója, és Smad4-et kódoló rekombináns adenovírussal való fertőzés visszaállította mindkét fenti válaszelem aktivitását, továbbá igazolta ezen válaszelemeket tartalmazó promoterek specifitását TGF-β-ίοlyamatsorra, amint az alábbi 3. táblázatban bemutatjuk.
3. táblázat
TGF^-reszponzív promoter aktivitásának helyreállítása MDA-MB-468-sejtekben Smad4/DPC4-et kódoló rekombináns adenovírussal való fertőzéssel (relatív luciferázaktivitás*)
Vírus Dózis PAI promoter -TGF-β PAI promoter + TGF-β SRE promoter -TGF-β SRE promoter + TGF-β
BGCA 1x108 1,0 1,53 1,00 1,00
BGCA 1*109 0,86 1,06 0,33 0,77
DCCA 1x108 1,13 4,86 8,50 139,17
DCCA 1*109 1,93 31,60 22,00 370,84
* A luciferázaktivitást ahhoz az aktivitáshoz viszonyítva fejezzük ki, amelyet BGCA-t tartalmazó konstrukcióval kaptunk TGF-β hozzáadása nélkül (annak hányszorosa). BGCA egy rekombináns adenovírus, amely β-gal-gént képes expresszálni. DCCA egy Smad4/DPC4-et kódoló rekombináns adenovírus.
HU 226 602 Β1
Azután előállítottunk E2F-Rb-hez működőképesen kapcsolt PAI-promotert tartalmazó plazmidot, és arra vonatkozóan teszteltük, hogy milyen mértékben képes szelektíven represszálni E2-promotert olyan sejtekben, amelyek intakt TGF-p-folyamatsorral rendelkeznek. Tranziens transzfekciós vizsgálati eljárásokban luciferázhoz kapcsolt E2-promoter kotranszfekciója E2F-Rbhez működőképesen kapcsolt PAI-promoterrel az E2-promoter aktivitásának szelektív represszióját eredményezte 293-sejtekben (normál TGF-p-folyamatsorral rendelkezett), és ezt nem eredményezte MDA-MB468-sejtekben (detektív TGF-P-folyamatsorral rendelkezett), E2F-Rb 293-sejtekben való szelektív expressziója miatt, a 4. táblázatban bemutatottak szerint. A várakozásnak megfelelően, kotranszfekció CMVE2F-Rb-vel (amely E2F-Rb-t expresszál mindkét sejtvonalban) gátolta E2-promoter aktivitását mindkét sejtvonalban.
4. táblázat
E2-promoter-aktivitás szelektív repressziója PAIE2FRb-vel 293-sejtekben és MDA-MB-468-sejtekben (relatív luclferázaktivitás*)
Represszor MDA-MB- 468-sejtek 293-sejtek
Nincs 100 100
CMV-E2F-Rb 9,38 10,53
PAI-E2F-Rb 124,02 17,38
* A luciferázaktivitást ahhoz az aktivitáshoz viszonyítva fejezzük ki, amelyet promoter nélküli konstrukcióval kaptunk.
Előállítottunk p53-szintézisútra reszponzív promotereket úgy, hogy beépítettünk riboszóma-génklaszterből (RGC-promoter) vagy nagy affinitású p53-kötőhelyekből (p53CON-promoter) származó, ismert p53-kötőhelyeket. Ezen promoterek aktivitásait tranziens transzfekciós vizsgálati eljárásokban értékeltük ki, riporterként luciferázt alkalmazva. A kísérletek eredményeit az alábbi 5. táblázatban mutatjuk be:
5. táblázat p53-reszponzív promoterek aktivitásai különböző sejtvonalakban (relatív luclferázaktivitás*)
Sejtvonal p53-helyzet P53-CON- promoter RGC-pro- moter
U87 vad típus 3921,12 112,33
A549 vad típus 647,30 16,36
MCF-7 vad típus 445,25 12,26
293 vad típus inaktív 13,03 0,62
Hep3B nulla 4,62 1,22
NCI-H358 nulla 0,35 0,56
Panel mutáns 1,56 1,02
WIDR mutáns 16,17 1,07
Sejtvonal p53-helyzet P53-CON- promoter RGC-pro- moter
MDA-Mb- 468 mutáns 4,88 0,87
AsPC-1 mutáns 0,54 1,08
Caco-2 mutáns 14,59 1,13
MicaPaca2 ismeretlen 28,43 1,24
* A luciferázaktivitást ahhoz az aktivitáshoz viszonyítva fejezzük ki, amelyet promoter nélküli konstrukcióval kaptunk.
Az eredmények azt mutatják, hogy mindkét válaszelem aktív funkcionális p53-at tartalmazó sejtekben. Annak igazolása céljából, hogy a p53-reszponzív promoter-aktivitás funkcionális p53 miatt van, két sejtvonalat, WIDR- és U87-sejtvonalat kotranszfektáltunk luciferáz-génexpressziót vezérlő RGC-promoterrel, valamint üres kazettát tartalmazó adenovírusvektorral (ZZCB) vagy p53-at CMV-promoter vezérlete alatt konstitutíven termelő rekombináns adenovírussal (FTCB). Ezen kísértetek eredményeit bemutatjuk a 6. táblázatban.
6. táblázat p53-reszponzív promoter-aktivitás helyreáll ítása/fokozása WIDR- és U87-sejtekben p53-at kódoló rekombináns adenovírussal való fertőzéssel (relatív luclferázaktivitás*)
Vírus Dózis WIDR U87
ZZCB 1x108 1,0 1,0
ZZCB 1x10» 1,25 0,67
FTCB 1x10» 4,71 20,30
FTCB 1x109 29,00 109,95
* A luciferázaktivitást ahhoz az aktivitáshoz viszonyítva fejezzük ki, amelyet ZZCB-fertőzéssel kaptunk.
A bemutatott adatokból látható, hogy p53-reszponzív promoter aktivitása dózisfüggő módon növekszik a p53-aktivitás növekedésével.
Előállítottunk TGF-p-szintézisútra reszponzív promoter (PAI vagy SRE) vagy p53-szintézisútra reszponzív promoter (RGC vagy p53CON) vezérlete alatt lévő, E2F-Rb-fúziót kódoló szekvenciát tartalmazó, rekombináns adenovírusvektorokat. Továbbá, zölden fluoreszkáló fehérjét kódoló gént is beépítettünk a vektorba riporterként. Az eredményül kapott vírusokat arra teszteltük, hogy milyen mértékben képesek szelektíven replikálódni és TGF-β- vagy p53-folyamatsorra detektív sejteket elpusztítani citopatikus hatást (CPE) vizsgáló eljárásokban. Az eredményeket bemutatjuk a csatolt ábrák közül az 1. ábrán. MRC9-ben (p53-szintézisútra pozitív és TGF^-szintézisútra pozitív) a vad típusú adenovírus képes replikálódni és CPE-t indukálni még alacsony koncentrációban is (1χ106 részecske/ml), míg a TGF-β- vagy p53-szintézisutat megcélzó vekto8
HU 226 602 Β1 rok nem indukálnak CPE-t ebben a koncentrációban. Csak a legmagasabb tesztelt koncentrációban (1x10® részecske/ml) mutatnak a szintézisutat célzó vektorok bizonyos mértékű CPE-t. Ezzel ellentétben, például WIDR-sejtvonalban (p53- és TGF-p-szintézisútban egyaránt detektív) és Hep3B-sejtvonalban (p53-nulla és TGF-p-szintézisútra detektív exogén TGF-β hiányában) folyamatsort célzó vektorok hatékonyan indukáltak CPE-t, a vad típusú vírushoz hasonlóan még alacsony koncentrációkban is (1*10® részecske/ml). Szintézisutat célzó vektorokkal (SRE-Ad és p53Con-Ad) fertőzött Hep3B-sejtek fluoreszcenciamikroszkópos vizsgálata kiderítette, hogy a transzgén nagymértékben expresszálódott, és a vírus elterjedt a tenyészetben, még akkor is, amikor alacsony részecskekoncentrációban (1*105 részecske/ml, két óra hosszáig) fertőztünk. Ezzel ellentétben, replikációdefektív (E1A deletált), GFP-t kódoló adenovírussal (GFCB) fertőzött Hep3B-sejtek ugyanebben a koncentrációban (1*10® részecske/ml) nem mutattak GFP-expressziót.
Fentebb jeleztük, hogy a találmány szerinti vektorok szelektív replikációra és a célsejt lízisére képesek szelektív körülmények között. Azonban ez nem jelenti azt, hogy további szelektivitási vagy toxicitási szinteket nem lehet tervezni ezekbe a vektorokban. A találmány tárgyát képezik rekombináns adenovírusok is, amelyek a vírusgenomban további módosításokat tartalmaznak, például célzott módosításokat, transzgént tartalmazó expressziós kazettákat vagy olyan módosításokat a vírusgenomban, amelyek elősegítenek szelektív replikációt egy adott sejttípusban vagy fenotipikus állapotban.
A „célzott módosítás” kifejezés a leírásban a vírusgenom olyan módosításait jelenti, amely egy adott sejttípusban kedvező fertőzőképességet eredményez. Sejttípus-specifitást vagy sejttipuscélzást el lehet érni olyan vírusokból származó vektorokban is, amelyek jellemzően széles spektrumú fertőzőképességgel rendelkeznek, például adenovírusokban, a virális csomagoló fehérjék módosításával. Sejtcélzást elértek például olyan adenovirusvektorokkal, amelyekben a vírusgenom „knob” és fíber kódolószekvenciáit szelektíven módosították, így elérték módosított „knob és fíber domének expresszióját, amelyek specifikus kölcsönhatást létesítettek egyedi sejtfelszíni receptorokkal. Ilyen módosításokat leírtak például Wickham és munkatársai, J. Virol. 71, 8221-8229 (1997) (RGD-peptidek beépítése adenovirális fíber fehérjékbe); Arnberg és munkatársai, Virology 227, 239-244 (1997) (adenovirális fíber gének módosítása, amellyel elértek tropizmust a szemre és a genitális traktusra); Harris és Lemoine, TIG 12, 400-405 (1996); Stevenson és munkatársai, J. Virol. 71, 4782-4790 (1997); Michael és munkatársai, Gene Therapy 2, 660-668 (1995) (gasztrint felszabadító peptidfragmentum beépítése adenovírusból származó fíber fehérjébe); és Ohno és munkatársai, Natúré Biotechnology 15, 763-767 (1997) (Protein-A IgG-kötő doménjének beépítése Sindbis vírusba). Más módszereket is kidolgoztak sejtspecifikus megcélzásra antitestek vagy antitest-fragmentumok csomagoló fehérjékhez való konjugálásával [lásd például Michael et al., J.
Bioi. Chem. 268, 6866-6869 (1993); Watkins et al., Gene Therapy 4, 1004-1012 (1997); Douglas et al., Natúré Biotechnology 14, 1574-1578 (1996)]. Más módszerben konkrét csoportokat lehet konjugálni a vírusfelszínhez a megcélzás biztosítása céljából [lásd például Nilson et al., Gene Therapy 3, 280-286 (1996) (EGF konjugálása retrovirális fehérjékhez)]. Ezeket a rekombinánsan módosított vektorokat elő lehet állítani a találmány szerinti megoldás alkalmazásával.
A „transzgén expressziós kazetta kifejezés a célsejtben funkcionális promoterre utal, működőképesen kapcsolva terápiás transzgénhez. A „promoter kifejezés olyan nukleotidszekvenciát jelent, amely egy másik nukleotidszekvencia transzkripciójára képes hatást kifejteni. Promoterek például gyenge konstitutív promoterek, időbeli virális promoterek vagy szabályozható promoterek.
Az „időleges promoterek kifejezésen olyan promotereket értünk, amelyek a terápiás transzgén expresszióját a virális ciklus későbbi pontján vezérlik a szintézisútra reszponzív promoter által vezérelt expresszióhoz viszonyítva. Ilyen időben szabályozott promoterek például adenovírus fő kései promoter (MLP), más promoterek, például E3. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, MLP-promotert alkalmazunk. Herpes simplex vírusok esetén „latens aktivált promotereket” lehet alkalmazni.
A „szabályozható promoterek” kifejezésen indukálható promotereket, szövetspecifikus promotereket vagy tumorspecifikus promotereket értünk. Az „indukálható promoter” kifejezésen olyan promotereket értünk, amelyek a terápiás transzgén expresszióját előnyösen (vagy kizárólag) bizonyos körülmények között és/vagy külső kémiai vagy más stimulusokra adott válaszként segítik elő. Indukálható promoterek például ismertek a szakirodalomban [lásd például Yoshida és Hamada, Biochem. Biophys. Rés. Comm. 230, 426-430 (1997); lida et al., J. Virol. 70, 6054-6059 (1996); Hwang et al., J. Virol. 71, 7128-7131 (1997); Lee et al., Mól. Cell. Bioi. 17, 5097-5105 (1997); és Dreher et al., J. Bioi. Chem. 272, 29 364-29 371 (1997)]. Sugárzással indukálható promotereket például Manómé és munkatársai írtak le [Humán Gene Therapy 9, 1409-1417 (1998)]. További szelektivitási szintet lehet meghatározni szövetspecifikus vagy tumorspecifikus promoterek alkalmazásával. Szövetspecifikus és tumorspecifikus promoterek jól ismertek szakember számára, és lehetnek olyan promoterek, amelyek előnyösen simaizomban (α-aktin-promoter) aktívak, hasnyálmirigy-specifikusak [Palmiter et al., Cell 50, 435 (1987)], májspecifikusak [Rovet et al., J. Bioi. Chem. 267, 20765 (1992); Lemaigne et al., J. Bioi. Chem. 268, 19896 (1993); Nitsch et al., Mól. Cell. Bioi. 13, 4494 (1993)], gyomorspecifikusak [Kovarik et al., J. Bioi. Chem. 268, 9917 (1993)], agyalapi mirigyre specifikusak [Rhodes et al., Genes Dev. 7, 913 (1993)], prosztataspecifikusak stb.
A „terápiás transzgén” kifejezésen olyan nukleotidszekvenciát értünk, amelynek expressziója a célsejtben terápiás idéz elő. „Terápiás transzgén” kifejezés értünk tumorszuppresszor géneket, antigenikus géneket, cito9
HU 226 602 Β1 toxikus géneket, citosztatikus géneket, prodrogaktiváló géneket, apoptotikus géneket, gyógyászati hatású anyagot kódoló géneket vagy anti-antigenikus géneket. A találmány szerinti vektorokat egy vagy több terápiás hatású transzgén előállítására lehet alkalmazni, akár tandem IRES-elemek alkalmazásán keresztül, vagy függetlenül szabályozható promotereken keresztül.
A „tumorszuppresszor gén” kifejezésen olyan nukleotidszekvenciát értünk, amelynek expressziója a célsejtben neopláziás fenotípust képes szuppresszálni és/vagy apoptózist képes indukálni. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható tumorszuppresszor gének például p53-gén, APC-gén, DPC-4/Smad4-gén, BRCA-1-gén, BRCA-2-gén, WT-1-gén, retinoblasztóma-gén [Lee et al., Natúré 329, 642 (1987)], MMAC-1gén, adenomás polyposis coli fehérjét kódoló gén (Albertsen et al., USP 5.783.666 számú szabadalmi irat, megadva 1998. július 21.), deleiéit vastagbélkarcinóma-gén (DCC), MMSC-2-gén, NF1-gén, nasopharyngealis karcinóma tumorszuppresszor gén, amelyet a 3p21.3. kromoszómánál térképeztek [Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 3042-3047 (1998)], MTS1gén, CDK4-gén, NF1-gén, NF2-gén és VHL-gén.
Az „antigenikus gének” kifejezésen olyan nukleotidszekvenciákat értünk, amelyek expressziója a célsejtben olyan sejtfelszíni antigenikus fehérje termelődését eredményezi, melyet az immunrendszer képes felismerni. Antigenikus gének például karcinoembrionális antigén (CEA), p53 (Levine, A. által leírtak szerint, WO 94/02167 számú PCT szabadalmi irat szerint, közzétéve 1994. február 3.). Az immunológiai felismerés elősegítése céljából, az antigenikus gént I. osztályú MHC-antigénhez lehet fuzionálni.
A „citotoxikus gén” kifejezésen olyan nukleotidszekvenciát értünk, amelynek expressziója a célsejtben toxikus hatást idéz elő. Ilyen citotoxikus gének például olyan nukleotidszekvenciák, amelyek pseudomonasból származó exotoxint, ricin-toxint, diftéria-toxint és hasonlókat kódolnak.
A „citosztatikus gén” kifejezésen olyan nukleotidszekvenciát értünk, amelynek expressziója a célsejtben blokkolást idéz elő a sejtciklusban. Ilyen citosztatikus gén például p21, retinoblasztóma-gén, E2F-Rb fúziós fehérjét kódoló gén, ciklinfüggő kináz-inhibitorokat kódoló gének, például p16, p15, p18 és p19, a növekedést megállító specifikus homeobox-gén (GAX), Branellec és munkatársai által leírtak szerint (WO 97/16459 számú szabadalmi irat szerint, közzétéve 1997. május 9.; és WO 96/30385 számú szabadalmi irat szerint, közzétéve 1996. október 3.).
A „citokin gén kifejezésen olyan nukleotidszekvenciát értünk, amelynek expressziója a célsejtben citokin termelődését eredményezi. Ilyen citokinek lehetnek például GM-CSF, interleukinok, különösen IL—1, IL—2, IL—4, IL—12, IL—10, IL—19, IL—20, α-, β- és γ-altípusú interferonok, különösen az interferon-a-2b és fúziók, például interferon-a-2a-1.
A „kemokin gén kifejezésen olyan nukleotidszekvenciát értünk, amelynek expressziója a célsejtben citokin termelődését eredményezi. A „kemokin” kifejezés szerkezetileg hasonló, alacsony molekulatömegű, sejt által szekretált, citokin-faktorok csoportjára utal, amelyek mltogén, kemotaktikus vagy gyulladást okozó aktivitásokkal rendelkeznek. Ezek elsősorban 70-100 aminosavból álló, kationos fehérjék, amely általánosan négy konzervatív ciszteint tartalmaznak. Ezeket a fehérjéket két csoportra lehet osztani a két, amino-terminális cisztein közötti távolság alapján. Az első csoportba a két ciszteint egyetlen aminosav választja el (C-x-C), míg a második csoportban azok szomszédosak (C-C). A „C-x-C” kemokinok csoportjának tagjai például vérlemezke faktor-4 (PF4), vérlemezke bázikus fehérje (PBP), interleukin-8 (IL—8), melanóma növekedését stimuláló aktivitással rendelkező fehérje (MGSA), makrofág gyulladást okozó fehéije-2 (MIP-2), egéreredetű Míg (m119), csirkeerdetű 9E3 (vagy pCEF-4), sertésből származó alveoláris makrofág kemotaktikus faktor-l és -II (AMCF-I és -II), pre-B-sejt növekedését stimuláló faktor (PBSF) és IP10. A „C-C”csoport tagjai például monocita kemotaktikus fehérje-1 (MCP-1), monocita kemotaktikus fehérje-2 (MCP-2), monocita kemotaktikus fehérje-3 (MCP-3), monocita kemotaktikus fehérje-4 (MCP-4), makrofág gyulladást okozó fehérje-1-(MIP-1-), makrofág gyulladást okozó fehérje-1-(MIP-1-), makrofág gyulladást okozó fehérje1-γ (ΜΙΡ-1-γ), makrofág gyulladást okozó fehéije-3-α (ΜΙΡ-3-α), makrofág gyulladást okozó fehérje-3-β (ΜΙΡ-3-β), kemokin (ELC), makrofág gyulladást okozó fehérje-4 (MIP-4), makrofág gyulladást okozó fehérje-5 (MIP-5), ίϋ78-β, RANTES, SIS-epszilon (p500), csecsemőmirigy aktivációszabályozott kemokin (TARC), eotaxin, I-309, HCC-1/NCC-2 humán fehérje, HCC-3 humán fehérje, egéreredetű C10-fehérje.
A „gyógyászati hatású fehérjét kódoló gén kifejezésen olyan nukleotidszekvenciát értünk, amelynek expressziója a célsejtben gyógyászati hatású fehérje termelődését eredményezi. Ilyen gyógyászati hatású fehérjét kódoló gén például a proinzulin-gén és analógjai (WO 98/31397 számú PCT szabadalmi iratban leírtak szerint), növekedési hormon génje, dopamin, szerotonin, epidermális növekedési faktor, GABA, ACTH, NGF, VEGF (célszövethez való vérperfúzió fokozása céljából, beleértve az angiogenezist, WO 98/32859 számú szabadalmi irat, közzétéve 1998. július 30.), trombospondin génjei stb.
A „proapoptotikus gén” kifejezésen olyan nukleotidszekvenciát értünk, amelynek expressziója a célsejtben a sejt programozott sejtpusztulást idézi elő. Proapoptotikus gén például p53, adenovirális E3-11.6K (Ad2-ből származik) vagy adenovirális E3-10.5K (Adből származik), adenovirális E4orf4-gén, p53-folyamatsor génjei és kaszpázokat kódoló gének.
A „prodrog aktiváló gének” kifejezésen olyan nukleotidszekvenciákat értünk, amelyek expressziója a célsejtben olyan fehérje termelődését eredményezi, amely nem terápiás hatású vegyületet képes átalakítani terápiás hatású vegyületté, amely a sejtet érzékennyé teszi külső faktorok általi elpusztításra vagy toxikus körülményeket hoz létre a sejtben. Prodrog aktiváló gén például a citozin deamináz-gén. A citozin de10
HU 226 602 Β1 amináz 5-fluor-citozint (5-FC) konvertál 5-fluor-uracillá (5-FU), amely potenciális antitumor ágens. Tumorsejtek lízise jelentős mennyiségű, lokalizált citozin deaminázt biztosít, amely képes 5FC-t 5FU-vá alakítani a tumor lokalizált pontján, sok környező tumorsejt elpusztítását eredményezve. Ez nagyszámú tumorsejt elpusztítását eredményezi anélkül, hogy szükség lenne sejtek megfertőzésére adenovírussal (úgynevezett „bystander” hatás). Továbbá ilyen a timidin kinázgén [lásd például Woo et al., USP 5,631,236 számú szabadalmi irat, megadva 1997. május 20., és Freeman et al., USP 5,601,818 számú szabadalmi irat, megadva 1997. február 11.], TK-génterméket expresszáló sejt érzékennyé válik gancyclovir beadásával végzett, szelektív pusztításra.
Az „antiangiogenikus” gének kifejezésen olyan nukleotidszekvenciákat értünk, amelyek expressziója a célsejtben antiangiogén faktorok extracelluláris szekrécióját eredményezi. Antiangiogenezis faktorok például angiosztatin, vaszkuláris endotél növekedési faktor (VEGF) inhibitorai, például Tie-2 [leírását lásd PNAS(USA) 95, 8795-8800 (1998)], endosztatin.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fentebb említett génekben létrehozott olyan módosítások és/vagy deléciók, amelyek a vad típusú fehérje funkcionális szubfragmentumait kódolják, könnyen adaptálhatók a találmány szerinti megoldásban való alkalmazásra. Például a p53-génen nemcsak a vad típusú fehérjét értjük, hanem módosított p53-fehérjéket is. Ilyen módosított p53-fehérjék közé tartoznak például a p53 módosításai nukleáris retenció fokozása céljából, deléciók, például a Δ13-19. aminosavak deléciója, amely eliminálja a konszenzus kalpain-hasítóhelyet, módosítások az oligomerizációs doménekben (Bracco és munkatársai által leírtak szerint, WO 97/0492 számú szabadalmi irat, vagy USP 5,573,925 számú szabadalmi irat).
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fentebb leírt terápiás géneket a tápközegbe lehet szekretálni, vagy adott intracelluláris helyekre lehet azokat lokalizálni célba juttató csoport, például szignálpeptid vagy nukleáris lokalizációs szignál (NLS) beépítésével. A terápiás transzgén definíciójába tartoznak a terápiás transzgének fúziós fehérjéi is 1. típusú herpes simplex vírusból (HSV-1) származó, VP22-jelű strukturális fehérjével. Ha VP22-szignált tartalmazó fúziós fehérjék a fertőzött sejtben szintetizálódnak, kiszállítódnak a fertőzött sejtből, és hatékonyan képesek belépni a környező, körülbelül 16 sejt szélességű átmérőben elhelyezkedő, nem fertőzött sejtekbe. Ez a rendszer különösen hasznos transzkripciósán aktív fehérjékkel (pl. p53-mal) együtt, mivel a fúziós fehérjék hatékonyan képesek szállítódni a környező sejtek sejtmagjaiba [lásd például Elliott, G. és O’Hare P„ Cell 88, 223-233 (1997); Marshall, A. és Castellino, A., Research News Briefs. Natúré Biotechnology 15, 205 (1997); O’Hare et al., WO 97/05265 számú szabadalmi irat, közzétéve 1997. február 13.]. Hasonló célba juttató csoport származtatható a HIV-Tat-fehérjéből, melyet Vives és munkatársai írtak le [J. Bioi. Chem. 272, 16 010-16 017 (1997)]A találmány szerinti vektorok hatékonyságának fokozására szolgáló, további módosításokat is lehet végezni, például változtatásokat E1-ben, mutációk bevitelét E4-be citotoxicitás fokozása céljából [Muller et al., J. Virol. 66, 5867-5878 (1992)], virális „halál-fehérjék, például E4orf4 vagy E3 11.6K felszabályozását.
A találmány példákban bemutatott, előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti vektor feltételesen replikálódó adenovírust tartalmaz, amelyben p53- vagy TGF-P-folyamatsorra reszponzív promoter E2F-Rb fúziós fehérje expresszióját vezérli, és amely továbbá citozin deamináz-gént tartalmaz időbeli E3-promoter vezérlete alatt. Ilyen esetekben a citozin deamináz csak tumorsejtekben termelődik vírusreplikációt követően. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a prodrogkonvertáló gén viszonylag gyenge vagy szövetspecifikus vagy tumorspecifikus promoter vezérlete alatt van.
A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint, a vektor rekombináns adenovírust tartalmaz p53- vagy TGF-p-szintézisútra reszponzív promoter vezérletével expresszálódó E2F-Rb fúziós fehérjével és transzgént tartalmazó expressziós kazettával, amely citozin deaminázt képes expresszálni egymagában, vagy citozin deaminázt és IRES-elemet és MIP-3alfa-fehérjét kódoló bi-cisztronos expressziós kazettában. Mivel citozin deamináz expresszálódik, tumorsejtek pusztulását prodrog, például 5-fluor-citozin beadásával el lehet érni. ΜΙΡ-3-alfa kismértékű expressziója elősegíti az antitumor immunitás kifejlődését.
Többszintes, többfunkcionális vagy több folyamatsorra reszponzív kaszkád fogalmak a leírásban egymással felcserélhető kifejezések, amelyek a szintézisútra reszponzív elemekből álló konstrukcióra utalnak, ezáltal terápiás hatást képesek létrehozni, amelyben egynél több szintézisutat lehet egyidejűleg próbaként alkalmazni. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fentebb leírt, szabályozó vektorelemeket kombinálni lehet a találmány szerinti vektorokhoz, többszintű szelektivitás biztosítása céljából. Többszintes szabályozásra szolgálhat példaként az a rendszer, amelybe feltételesen replikálódó adenovírust tervezünk, amely akkor képes replikálódni és sejteket elpusztítani, ha azokban defektus van az Rb-, TGF-β- vagy p53-szintézisút bármelyikében. Ilyen vektor vírusreplikáció domináns negatív inhibitorát tartalmazza, amely p53-reszponzív promoter vezérlete alatt van a szabályozás első szintjeként. Ennek eredményeként, funkcionális p53-mal rendelkező bármilyen sejtben (például normál sejtekben) expresszálódik a domináns negatív inhibitor, és a vírusreplikáció blokkolódik. Ez a vektor viszont funkcionális p53-mal rendelkező, de más folyamatsorokra, például TGF-β- és Rb-szintézisutakra detektív tumorsejtekben replikálódhat. Ezért további szabályozási szinteket lehet inszertálni, amely lényegében inaktiválja a funkcionális p53-at tumorsejtekben, így lehetővé téve vírusreplikációt, ha más folyamatsorok detektívek.
A szabályozás második szintjeként, ugyanez a vektor szintén adenovírusból származó E1B-55K-fehérjét tartalmazó expressziós kazettából áll, amely funkcioná11
HU 226 602 Β1 lisan inaktiválni képes p53-at, olyan promoter vezérlete alatt, amely csak TGF-6-szintézisútra detektív sejtekben aktív. Kizárólag TGF-p-szintézisútra detektív sejtekben aktív promotert úgy lehet előállítani, hogy represszor-kötőhelyeket inszertálunk egy promoterbe, így a represszor expressziója TGF-p-reszponzív promoter alkalmazásával máshol a vektorban a promoteraktivitás blokkolásához vezet intakt TGF-β-jeltovábbítással rendelkező sejtekben. Másrészt, olyan sejtekben, ahol a TGF-p-folyamatsor detektív, a represszor nem szintetizálódik, így a promoter aktív lesz. E1B-55K ezen promoterből (amely csak TGF-p-folyamatsorban detektív sejtekben aktív) kiinduló expressziója miatt az endogén p53 inaktiválódik. Ezzel párhuzamosan, bármilyen természetes promotert alkalmazhatunk, amely leszabályozódik TGF-p-jeltovábbítás következtében. A fenti két expressziós kazetta beépítése biztosítja, hogy a nyugvó domináns negatív inhibitor csak akkor expresszálódik, ha mind a p53-, mind a TGF-p-szintézisút normális (replikáció blokkolásához vezet), de akkor nem, ha a kettő közül az egyik vagy mindkettő defektív (vírusreplikációhoz vezet).
A szabályozás harmadik szintjeként, ugyanebben a vektorban elérhető olyan fehérje, például Smad7 vagy Smad bármilyen más, domináns negatív formájának expressziója E2F-reszponzív promoter vezérletével, amely képes TGF-p-szintézisutat inaktiválni [Nakao et al., Natúré 389, 631-635 (1997)]. E2F-reszponzív promoter (például E2F1-promoter, E2-promoter vagy szintetikus promoter többszörös E2F-kötőhelyekkel egy minimális promotertől, például SV40-TATA-boxtól szintézisiránnyal szemben) akkor aktív, ha az Rb-folyamatsor detektív. A szabályozás ezen harmadik szintje miatt, olyan sejtekben, amelyekben detektív Rb-folyamatsor van, Smad7 expresszálódik, amely viszont inaktiválja Smad4-et és blokkolja a TGF-p-szignáltranszdukciót. Ennélfogva E1B-55K keletkezik és p53 inaktiválódik, amely a domináns negatív inhibitor expressziójának hiányához vezet. Ennélfogva a vírusreplikáció akadálytalanul folyhat. Másrészt, ha az Rb-folyamatsor normális, Smad7 nem szintetizálódik, így a TGF-p-szignáltranszdukció normálisan működik. Ennélfogva E1B-55K nem keletkezik, funkcionális p53-at eredményezve, amelynek következtében domináns negatív inhibitor expresszálódhat a vírusreplikáció blokkolására.
A fenti három szabályozási szinttel, a három folyamatsor (Rb, TGF-β és p53) közül bármelyik vagy bármely kettő vagy mindhárom defektusa végül vírusreplikációhoz és sejtlízishez vezet. Vírusreplikáció csak akkor nem történik, ha mindhárom folyamatsor funkcionális, mint a normál sejtekben.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti vektorokat sokféle variációban lehet alkalmazni igen különféle szintézisút-defektus detektálására és kezelésére, sokféle szintézisútra reszponzív promoter alkalmazásával. Azonban a találmány példákban bemutatott előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns adenovírusvektor az adenoviridiae nemzetségből származik. Különösen előnyös vírusok 2. vagy 5. típusú humán adenovírusból származnak. Ha egy adenovírusvektort szülői vektorként alkalmazunk, a vírusreplikáció előnyös inhibitora az E2F-RB fúziós fehérje.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, ha a találmány szerinti vektorokat szabályozatlan celluláris proliferációval társult betegségek kezelésére alkalmazzuk, az alkalmazott adenovírusvektor előnyösen specifikus deléciókat tartalmaz az E1A-régióban, így az E1a-géntermék nem képes kötődni p300- és Rb-fehérjéhez, miközben megmarad az E1a-CR3-domén transzaktiváló funkciója. A találmány szerinti vektorok deléciót tartalmaznak az E1a kódolószekvenciában, a 13S kódolószekvenciában lévő, p300- és p105Rb-kötőhelyek eliminálása céljából. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a p300-kötés delécióinak a körülbelül 4-25. és körülbelül 36-49. aminosavdeléciók felelnek meg.
Az E1a-289R kódolószekvenciában, a p300- és pRb-kötés eliminálásához szükséges deléciók előnyösen olyan minimálisak, amennyire csak lehetséges, hogy megelőzzük az E1a-289R-fehérje másodlagos és harmadlagos struktúrájában kialakuló, jelentősebb károsodást. A p300-kötés eliminálása céljából előnyösen a 289R-ben lévő, p300-kötődoméneket kódoló DNSszekvenciába viszünk be mutációt. A C-terminális régióban körülbelül 30 aminosavnál kisebb deléciókat részesítünk előnyben a p300-kötés eliminálására, bár kisebb módosítások is előnyösek. Például a 4-25. aminosavak deléciója (dl1101), körülbelül a 30-49. aminosavak (dl 1103) és különösen a 36-49. aminosavak deléciója alternatív módon előnyös a p300-kötés eliminálására. A p300-kötés megszüntetéséhez elegendő pontmutációk különösen előnyösek. Például kimutatták, hogy a 298R-fehérjében a második aminosav pontmutációja argininról glicinre (Arg2->Gly2) megszünteti a p300-kötést [lásd például pm563, Whyte et al., Cell 56, 67-75 (1989)]. Ehhez hasonlóan, a pRB105-kötés eliminálása céljából minimális módosítások előnyösek. Szelektív aminosavak eliminálása előnyös a pRB105-kötődoménben, például a 111-123. aminosavaké (dl1107) és 124-127. aminosavaké (dl1108). A 111-123. aminosavak (dl1107) deléciója különösen előnyös annyiban, hogy a 289R-fehérje megtartja p107-kötőaktivitását.
Továbbá, az E1a-289R-fehérjében, körülbelül a 219-289. aminosavakat és az E1A-243R-fehérjében a 173-243. aminosavakat elimináltuk. Például pontmutáció (azaz citozin1131 cseréje guaninra) bevitele a humán Ad5-genom 1131. helyzetének megfelelő pozícióba stop-kodont hoz létre. Ez a mutáció az E1a-289Rfehérje 219-289. aminosavainak és az E1A-243R-fehérje 173-243. aminosavainak eliminációját eredményezi. Ezt a mutációt csak adott esetben végezzük el, az Rb- és p300-kötés fentebb leírt delécióin kívül. Ilyen szülői vektorokra további példák ismertetése található a WO 00/22136 sz. közzétételi iratban (benyújtva 1998. október 15.).
A találmány példákban bemutatott, előnyös megvalósítási módja szerint, előnyös p53-folyamatsorra reszponzív promoterek: p53-CON és RGC. Előnyös TGF-βfolyamatsorra reszponzív promoterek: PAI-RE és SRE.
HU 226 602 Β1
A találmány szerinti megoldásban a terápiás génként prodrogaktiváló gént, például citozin deaminázt alkalmazunk. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint antitumor immunitás indukálása céljából, a találmány szerinti vektor ΜΙΡ-3-alfát kódol.
A terápiás gén expresszálására szolgáló, előnyös promoterek időbeli promoterek, például MLP vagy E3.
Az adenovirális konstrukciókban, az AdE3-11.6Kfehérje működését elimináljuk vagy késleltetjük az adenovírus által indukált sejtlízis minimalizálása céljából. Különösen a natív E3-11.6K/10.K-gén eliminálása előnyös. Ez minimalizálja az immunválasz kialakulását, amíg az első ciklus lokalizált vírusterjedés lejátszódik. Ebben a későbbi időpontban, ha az elsőként megfertőzött sejtek apoptózisa bekövetkezik, és lehetővé válik a vírus terjedése, az immunválasz előnyös. A 11,6K-fehérjét (vagy az Ad5-ben lévő, megfelelő E3-10.5K-fehérjét) egy proapoptotikus gén kódolja, és tumorsejtek elpusztítására lehet alkalmazni. Azonban ha késleltetni kívánjuk a célsejt korai llzisét a vírusreplikáció maximalizálása céljából, a 11.6K/10.5K-gént előnyösen időbeli promoter, például MLP-promoter vezérlete alá helyezzük, hogy késleltessük apoptotikus hatásának beindulását.
Gyógyszerformák
A találmány tárgya továbbá rekombináns vírusok gyógyászatilag elfogadható formája, hordozóval kombinációban. A találmány szerinti vektorokat a gyakorlatban dózisokban beadható formára hozzuk, a szokásos gyógyszerformákkal összhangban, hordozók és segédanyagok hozzáadásával. A dózisokba kiszerelt formák alkalmasak lehetnek intravénás, intratumorális, intramuszkuláris, intraperitoneális, topikális, mátrix vagy aeroszolos beadásra.
A „hordozó” kifejezés olyan vegyületekre utal, amelyeket általánosan alkalmaznak gyógyszerkészítmények kiszerelésére, stabilitás, sterilitás és a terápiás vegyület célba juttathatóságának fokozása céljából. Ha a vírust oldat vagy szuszpenzió formájára hozzuk, a célba juttató rendszer egy elfogadható hordozó, előnyösen vizes hordozó. Különféle vizes hordozókat lehet alkalmazni, például vizet, pufferolt vizet, 0,8% nátrium-kloridot, 0,3% glicint, hialuronsavat és hasonlókat. Ezeket a készítményeket szokásos, jól ismert sterilizációs technikákkal lehet sterilizálni, vagy sterilre lehet szűrni. Az eredményül kapott vizes oldatokat ebben az állapotban csomagolni lehet, vagy liofilizálni lehet azokat, a liofilizált preparátumot steril oldószerrel kombináljuk beadás előtt. A készítmények tartalmazhatnak gyógyászatilag elfogadható segédanyagokat, amelyek szükségesek fiziológiás állapotok közelítésére, például pH-állító és pufferelő ágenseket, ionerősséget beállító ágenseket, nedvesítőszereket és hasonlókat, például nátrium-acetátot, nátrium-laktátot, nátrium-kloridot, kálium-kloridot, kalcium-kloridot, nátrium-monolaurátot, trietanol-amin-oleátot stb.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti vírusok gyógyszerformái hordozóval és célba juttatást fokozó ágens(ekk)el. A „célba juttatást fokozó anyag (enhanszer)” vagy „célba juttatást fokozó ágens egymással felcserélhető kifejezések, és egy vagy több olyan ágenst értünk rajta, amely elősegíti a vírus célsejt általi felvételét. Célba juttatást fokozó ágensekre példákat ismertetnek az alábbi, USA-beli szabadalmi iratokban US 2001/006946 A1 (benyújtva 1998. július 8.), és US 6,312,681 B1 (benyújtva 1997. szeptember 26-án). Ilyen célba juttatást fokozó ágensek lehetnek például detergensek, alkoholok, glikolok, felületaktív anyagok, epesavak sói, heparinantagonisták, ciklooxigenázinhibitorok, hipertóniás sóoldatok és acetátok. Alkoholok lehetnek például alifás alkoholok, például etanol, N-propanol, izopropanol, butilalkohol, acetil-alkohol. Glikolok lehetnek glicerin, propilénglikol, polietilénglikol és más, alacsony molekulatömegű glikol, például glicerin és tioglicerin. Célba juttatást fokozó ágensek továbbá például acetátot, például ecetsav, glükonsav és nátrium-acetát. Célba juttatást fokozó ágensek például a hipertóniás sóoldatok is, mint például az 1 M NaCI. Felületaktív anyagok például nátrium-dodecilszulfát (SDS) és lizolecitin, polysorbate 80, nonil-fenoxi-poli(oxi-etilén), lizofoszfatidil-kolin, polietilénglikol 400, polysorbate 80, poli(oxi-etilén)-éterek, poliglikoléter felületaktív anyagok és DMSO. Epesavak sóit, például taurokolátot, nátrium-taurodezoxikolátot, dezoxikolátot, keno-dezoxikolátot, glikokólsavat, glikokenodezoxikólsavat és más asztrigenst, például ezüst-nitrátot lehet alkalmazni. Heparinantagonistákat, például kvaterner aminokat, például protamin-szulfátot is lehet alkalmazni. Ciklooxigenáz-inhibitorokat, például nátrium-szalicilátot, szalicilsavat és nemszteroid gyulladásgátló drogot (NSAIDS), például indometacint, naproxént, diclofenacot lehet alkalmazni.
A „detergens” kifejezésen értünk anionos, kationos, zwitterionos és nemionos detergenseket. Detergens lehet például taurokolát, dezoxikolát, tauro-dezoxikolát, cetil-piridium, benzalkónium-klorid, ZWITTERGENT® 3-14 detergens, CHAPS (3-[3-kolamido-propil]-dimetilammoniol-1-propánszulfonát-hidrát, Aldrich), Big CHAP, dezoxi-Big CHAP, TRITON®-X-100 detergens, C12E8, oktil-B-D-glikopiranozid, PLURONIC®-F68 detergens, TWEEN®-20 detergens és TWEEN®-80 detergens (CALBIOCHEM® Biochemicals).
A találmány szerinti dózisegységformák benne lehetnek termékeket tartalmazó reagenskészletben, amely 1. igénypont szerinti rekombináns vírust liofilizált formában és oldószert tartalmaz a liofilizált termék feloldására. A találmány szerinti rekombináns vírusokat szokásos eljárások szerint lehet liofilizálni és feloldani.
A találmány szerinti vektorokat be lehet adni kalpaininhibitorokkal kombinációban is. A „kalpaininhibitor” (rövidítve „Cl”) kifejezésen olyan vegyületet értünk, amely gátolni képes a kalpain-i, például μ-kalpainok proteolitikus működését. A leírásban alkalmazott „kalpaininhibitorok kifejezésen értünk olyan vegyületeket, amelyek kalpain-l-inhibitor-aktivitással rendelkeznek más biológiai aktivitásaikon kívül vagy azoktól függetlenül. Széles körből származó vegyületekről kimutatták, hogy aktívak kalpainok proteolitikus működésének gátlásában. A találmány szerinti megoldásban alkalmaz13
HU 226 602 Β1 ható kalpaininhibitorok például N-acetil-leucil-leucilnorleucinal, amely „kalpaininhibitor-1-ként is ismeretes. Megfigyelték, hogy a kalpaininhibitorok fokozzák sejtek fertőzhetőségét vírusvektorok vonatkozásában, fokozzák a promoterekből kiinduló transzkripciót NF-kappaB és AP-1 transzkripciós faktorok mennyiségének növekedésével, és megszüntetik az adenovírusvektorokra adott CTL-válaszokat. Ennek következtében, a találmány szerinti formák és eljárások adott esetben tartalmazhatnak kalpaininhibitorokat. Kalpaininhibitorokat és alkalmazásukat leírták Atencio és munkatársai az US 7,001,770 sz. és WO 00/21575 sz. szabadalmi iratokban.
Alkalmazási módszerek
A találmány tárgya eljárás sejt elpusztítására szintézisút defektus általi szabályozással úgy, hogy a célsejtet ex vivő érintkeztetjük a találmány szerinti, szelektíven replikálódó vektorral. A találmány egy előnyös, példákban bemutatott megvalósítási módja szerint, a szintézisút-defektust tartalmazó sejt neopláziás sejt. A „neopláziás vagy daganatos sejt” kifejezésen olyan sejtet értünk, amely olyan aberráns növekedési fenotípussal rendelkezik, melyet a normál celluláris növekedési szabályozásoktól való függetlenség jellemez. Mivel nem szükségszerű, hogy neopláziás sejtek bármikor replikálódjanak, neopláziás sejteken értünk olyan sejteket, amelyek aktívan replikálódnak vagy átmenetileg nem replikálódó, nyugvó állapotban vannak (Gl vagy G0). Neopláziás sejtek lokalizált populációit neoplazmáknak nevezzük. A neoplazmák lehetnek malignusak vagy jóindulatúak. Malignus neoplazmákat rákoknak is nevezzük. A „rák” kifejezést a leírásban felcserélhető módon alkalmazzuk a „tumor kifejezéssel. A „neopláziás transzformáció kifejezés azt jelenti, hogy normál sejtek neopláziás sejtté, gyakran tumorsejtté konvertálódnak.
A találmány tárgya eljárás neopláziás sejtek eltávolítására emlős szervezetben in vivő, a találmány szerinti rekombináns adenovírus gyógyászatilag elfogadható formájának beadásával. Az „eltávolítás” kifejezés azt jelenti, hogy életképes neopláziás sejtek populációját lényegileg lecsökkentjük úgy, hogy a neopláziás sejtek jelenlétére visszavezethető fiziológiás megbetegedés mértéke csökkenjen. A „lényegi kifejezés kezelés előtti életképes neopláziás populációjának körülbelül 20%nál nagyobb mértékű csökkenését jelenti emlősszervezetben. Az „életképes” kifejezés azt jelenti, hogy neopláziás sejtek szabályozatlan növekedési és sejtciklusszabályozási tulajdonságokkal rendelkeznek. Az „életképes neopláziás sejt” kifejezést a leírásban a szóban forgó sejtek olyan sejtektől való megkülönböztetésére használjuk, amelyek többé már nem képesek replikációra. Például tumormassza maradhat a kezelés után, azonban a tumormasszában lévő sejtek populációja valószínűleg elpusztult. Ezeket az elpusztult sejteket eltávolítjuk, és nem képesek replikálódni, még ha bizonyos mennyiségű tumormassza maradna is.
Az „emlősszervezet” kifejezésen értünk embereket, sertéseket, lovakat, marhákat, kutyákat, macskákat.
Előnyösen olyan adenovírusvektort alkalmazunk, amely endogén a kezelendő emlősszervezet típusára. Bár általában olyan vírus alkalmazását részesítjük előnyben, amely a kezelendő fajból származik, bizonyos esetekben előnyös lehet eltérő fajból származó vektorokat alkalmazni, amelyek kedvező patogén tulajdonságokkal rendelkeznek. Például leírták (WO 97/06826 számú szabadalmi iratban, közzétéve 1997. április 10.), hogyjuhból származó adenovírusvektorokat lehet alkalmazni humán génterápiában a humán adenovírusvektorokra jellemző immunválasz minimalizálása céljából. Az immunválasz minimalizálásával elkerülhető a vektor gyors szisztémás kiürülése, amely a vektor tartósabb működését eredményezi.
A találmány szerinti vektorok különösen TGF-β antiproliferatív működésének hiányával asszociált tumorok, például mellkarcinómák, hepatómák, gyomor-, vastagbél- és bőrtumorok, valamint B- és T-sejtes limfómák kezelésére alkalmasak [Markowitz és Roberts, (1996)]. II. típusú TGF-p-receptor mutánsait azonosították vastagbélben, gyomorban, fejben és méhnyakban előforduló pikkelysejtes karcínómákban. I. típusú receptorok mutánsait és azok deléciókat tartalmazó formáit szintén megtalálták Kaposi-szarkómában, mell-, petefészek- és kolorektális tumorokban. A TGFβ-jeltovábbítás intracelluláris effektorai közül a Smadokat, Smad4/DPC4-et azonosították szóba jöhető tumorszuppresszor génként, amely a hasnyálmirigyrákok megközelítőleg 50%-ában megváltozott formában volt. A DPC4-gén megváltozott formáját is megtalálták vastagbélben, mellben és petefészekben előforduló tumorokban, bár kisebb gyakorisággal fordult elő. A találmány szerinti vektorok különösen TGF^-ra nem érzékeny tumorok, például hasnyálmirigyrák kezelésére alkalmasak.
A találmány szerinti vektorok p53-folyamatsorban defektusokkal rendelkező tumorsejtek kezelésére is alkalmasak. Ilyen tumorok lehetnek például olyanok, amelyekben p53, mdm2 és p14/p19ARF (INK4a-gén) megváltozott. A találmány szerinti vektorok szintén alkalmasak Rb-folyamatsorban defektusokkal rendelkező ráksejtek kezelésére. Rb-folyamatsor defektusai Rb, ciklin-D, ciklinfüggő kináz (például CDK4) és p16 megváltozásából származnak.
Míg a találmány tárgyát képező eljárás szerint a rekombináns adenovírusokat egyedül alkalmazzuk, a találmány szerinti rekombináns adenovírusokat és azok gyógyszerformáit szokásos kemoterápiás ágensekkel és kezelési rendekkel kombinációban is lehet alkalmazni. Ilyen kemoterápiás ágensek lehetnek purinszintézis inhibitorai (például pentosztatin, 6-merkapto-purin, 6-tioguanin, metotrexát) vagy a pirimidinszintézis inhibitorai (például Pala, azarbin), ribonukleotidok konverziója dezoxiribonukleotidokká (például hidroxi-karbamid), dTMP-szintézis inhibitorai (5-fluor-uracil), DNS-t károsító ágensek (például sugárzás, bleomicinek, etopozid, tenipozid, daktinomicin, daunorubicin, doxorubicin, mitoxantron, alkiláló ágensek, mitomicin, ciszplatin, prokarbazin), valamint mikrotubulusfunkció inhibitorai (például vinka alkaloidok és kolchicin). Ke14
HU 226 602 Β1 moterápiás kezelési rendeken olyan nemkémiai eljárásokat értünk, amelyek neopláziás sejtek elpusztítására vannak tervezve, például sugárzási terápia. Egy példaként szolgáló kombinációs terápiában p53-at alkalmaznak terápiás génként (Nielsen et al., WO98/35554 számú szabadalmi irat, közzétéve 1998. augusztus 20.).
Az immunológiai válasz szignifikáns lesz vírusvektorok ismételt in vivő beadására. Ezért a találmány szerinti vektorokat immunszuppresszív ágensekkel kombinációban lehet beadni. Immunszuppresszív ágensek például ciklosporin, azatioprin, metotrexát, ciklofoszfamid, limfocita immunoglobulin, CD3-komplex ellen termeltetett antitestek, adrenokortikoszteroidok, szulfasalzain, FK-506, methoxsalen és thalidomid.
Szintén a találmány tárgyát képezi eljárás neopláziás sejtek ex vivő eltávolítására olyan normál sejtek populációjából, amely az említett neopláziás sejtekkel szennyezett, amely eljárásban a találmány szerinti rekombináns adenovírust hozzáadjuk a populációhoz. Ilyen eljárás alkalmazása például azok a jelenleg alkalmazott, ex vivő alkalmazások, amelyek szerint autológ őssejttermékeket tisztítanak, és amelyek általánosan csontvelőtisztításként is ismeretesek. Az „őssejttermékek kifejezésen hematopoetikus, progenitor és őssejtek olyan populációját értjük, amely hosszú távú hematopoetikus funkciót képes létrehozni egy páciensben, amely mioablatív terápiát kapott, őssejttermékekhez általánosan elterjedt módszerek szerint, mobilizált vagy nemmobilizált, perifériás vér aferézisével juthatunk. Az aferézist általában ismert eljárások alkalmazásával végzik, kereskedelemben rendelkezésre álló aferézis-készülék, például „COBE Spectra Apheresis System” (kereskedelemben rendelkezésre áll a COBE International cégnél, 1185 Oak Street, Lakewood, CO) alkalmazásával. A kezelési körülményeket előnyösen úgy optimalizálják, hogy „3-log purge” tisztaságot érjenek el (azaz a tumorsejtek körülbelül 99,9%-át eltávolítják az őssejttermékből), és legelőnyösebben „5-log purge” tisztaságot érnek el (a tumorsejtek körülbelül 99,999%-át eltávolítják az őssejttermékből). A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, 100 ml térfogatú őssejttermék kezelhető körülbelül 2*1011 találmány szerinti vektor részecskeszáma/sejtmag aránynál, körülbelül 4 óra hosszáig, 37 °C-on.
Diagnosztikai alkalmazások
A fentebb leírt terápiás alkalmazásokon kívül, a találmány szerinti vektorok diagnosztikai célokra is alkalmasak. A találmány szerinti vektorok például tartalmazhatnak riportergént, amely vírusfertőzés vagy replikáció esetén expresszálódik. A „riportergén” kifejezés olyan gént jelent, amelynek terméke detektálható jelet képes előállítani egymagában vagy további elemekkel kombinációban. Riportergének például: β-galaktozidáz-gén, luciferáz-gén, zölden fluoreszkáló fehérje génje, leképezési rendszerekkel, például röntgensugárzással vagy mágneses mezőt leképezni képes rendszerekkel (MRI) detektálható fehérjéket kódoló nukleotidszekvenciák. Ilyen vektorok funkcionális folyamatsor (például p53 vagy TGF-béta-folyamatsor) detektálására is hasznosak. Más módszerben ilyen vektorokat lehet alkalmazni olyan sejtfelszíni fehérje expresszálására is, amelyeket kötőmolekulák, például fluoreszcensen jelölt antitest útján lehet felismerni. Más módszerben, ahol folyamatsorra reszponzív promotert alkalmazunk vírusreplikáció represszorának (például E2F-Rb) vezérlésére, késői virális promotert (például E2, amelyet E2F-Rb vagy bármilyen más, represszorkötőhelyekkel, például E2F-kötőhelyekkel rendelkező promoter kapcsol ki) lehet alkalmazni a riportergén vezérlésére diagnosztikai alkalmazásokban, ahol a folyamatsorra reszponzív promoter ki van kapcsolva. Ezeket a diagnosztikai konstrukciókat in vivő vagy in vitro diagnosztikai célokra lehet alkalmazni. In vivő alkalmazások lehetnek például leképezésekben való alkalmazások, például röntgensugárzás, CT-szkennelés vagy mágneses rezonancia leképezés (MRI) esetén.
Módszerek vektorok preparálására
A találmány tárgya továbbá eljárás a fentebb leírt rekombináns vírusok előállítására, amely eljárásban:
a) termelő sejteket megfertőzünk rekombináns vírussal
b) olyan körülmények között tenyésztjük a megfertőzött, termelő sejteket, hogy az lehetővé tegye a vírusgenom replikációját a termelő sejtekben,
c) elkülönítjük a termelő sejteket, és
d) tisztítjuk a rekombináns vírust.
A „fertőzés” kifejezés a leírásban azt jelenti, hogy a termelő sejteket a rekombináns vírus hatásának tesszük ki olyan körülmények között, amely elősegíti a termelő sejtek megfertőzését a rekombináns vírussal. Több kópia, adott vírussal fertőzött sejtekben a vírusreplikációhoz és virion-csomagoláshoz szükséges aktivitások kooperatívak. Tehát előnyös, hogy a körülmények úgy legyenek beállítva, hogy szignifikáns valószínűsége legyen annak, hogy a termelő sejtek többszörösen fertőződjenek a vírussal. Olyan körülmény, amely fokozza a vírustermelést a termelő sejtben, például a fertőző fázisban lévő vírus koncentrációjának növelése. Azonban lehetséges, hogy a termelő sejtenként számított összes vírusfertőzés száma túlzottan nagy, amely toxikus hatásokat eredményez a sejtben. Ennek következtében arra kell törekedni, hogy a fertőzésekben a víruskoncentrációt 1*10® és 1*101° között, előnyösen körülbelül 1*109 virion/ml-en tartsuk. Kémiai ágenseket is alkalmazhatunk a termelő sejtvonal fertőzhetőségének fokozására. Például a találmány tárgyát képezi eljárás termelő sejtvonal fertőzhetőségének növelésére vírusfertőzéshez, kalpaininhibitor bevonásával. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható kalpaininhibitorok például kalpaininhibitor-1 (amely N-acetil-leucil-leucil-norleucinalként is ismeretes, kereskedelemben rendelkezésre áll a Boehringer Mannheim cégnél). Megfigyelték, hogy a kalpaininhibitor-1 fokozza termelő sejtvonalak rekombináns adenovírussal való fertőzhetőségét.
A „termelő sejt kifejezésen olyan sejtet értünk, amely képes termelendő rekombináns adenovírus vírusgenomjának replikációját elősegíteni. Sokféle em15
HU 226 602 Β1 lőssejtvonal áll nyilvánosan rendelkezésre rekombináns adenovírusok tenyésztésére. Például a 293-sejtvonalat [Graham és Smiley, J. Gén. Virol. 36, 59-72 (1977)] úgy alakították ki, hogy El-funkcióban lévő deficienciákat komplementáljon, és előnyös sejtvonal a szóban forgó vektorok termelésére. Más termelő sejtvonalak például HeLa-sejtek, PERC.6-sejtek (a W097/00326 számú szabadalmi iratban leírtak szerint, melynek bejelentés sorszáma PCT/NL96/00244).
Az „olyan körülmények között tenyésztjük, amely lehetővé teszi a vírusgenom replikációját” kifejezés azt jelenti, hogy olyan körülményeket tartunk fent a fertőzendő termelő sejtnél, amely lehetővé teszi, hogy a vírus szaporodjon a termelő sejtben. Kívánatos úgy szabályozni a körülményeket, hogy maximalizálva legyen az egyes sejt által termelt vírusrészecskék száma. Ennek következtében szükség van a reakciókörülmények, például a hőmérséklet, oldott oxigén, pH stb. követésére és szabályozására. A kereskedelemben rendelkezésre álló bioreaktorokon, például a CelliGen Plus bioreaktoron (kereskedelemben rendelkezésre áll a New Brunswick Scientific, Inc. cégnél, 44 Talmadge Road, Edison, NJ) van lehetőség ilyen paraméterek követésére és fenntartására. Az optimális fertőzési és tenyésztési körülmények bizonyos mértékig eltérőek lehetnek, azonban a vírus hatékony replikációjához és termeléséhez szükséges körülményeket szakember képes elérni, figyelembe véve a termelő sejtvonal tulajdonságait, a vírus tulajdonságait, a bioreaktor típusát stb. Ha „ 293-sejteket alkalmazunk termelő sejtvonalként, az oldottoxigén-koncentrációt előnyösen körülbelül 50% és körülbelül 120% között, előnyösen 100%-on tartjuk. Ha a vírusrészecskék koncentrációja (szokásos eljárásokkal meghatározva, például HPLC-vel Resource-Q-oszlop alkalmazásával) telítést ér el, a reaktorban lévő anyagot elkülönítjük.
Az „elkülönítés kifejezés a leírásban a rekombináns adenovírust tartalmazó sejtek begyűjtését jelenti a tápközegből. Ezt elérhetjük hagyományos módszerekkel, például differenciális centrifugálással vagy kromatográfiás módszerekkel. Ebben a fázisban az elkülönített sejteket tárolni lehet, vagy további lehet azokat feldolgozni lízissel és tisztítással, a rekombínáns vírus izolálása céljából. Tároláshoz az elkülönített sejteket pufferolni kell fiziológiás pH-η vagy annak közelében, és fagyasztani kell -70 °C-on.
A „lízis” kifejezésen a termelő sejtek szétroncsolását értjük. A lízist szakember által jól ismert, sokféle eszközzel elérhetjük. Ha vírusrészecskéket kívánunk izolálni a termelő sejtekből, a sejtek lízisét szakember által jól ismert, sokféle módszer alkalmazásával elvégezhetjük. Például emlőssejtek lízisét alacsony nyomású (689,47-1398,94 kPa=100-200 psi differenciális nyomáson) körülmények között vagy hagyományos fagyasztás/felolvasztási módszerekkel végezhetjük. Exogén, szabad DNS-t/RNS-t DNáz/RNáz alkalmazásával végzett lebontással távolítjuk el.
A „tisztítás” kifejezés a leírásban rekombínáns vírusrészecskék lényegében tiszta populációjának izolálását jelenti a lizált termelő sejtekből. Szokásos tisztítási technikákat, például kromatográfiás vagy differenciális gradienscentrifugálási módszereket lehet alkalmazni. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a vírust oszlopkromatográfiával tisztítjuk, lényegében Huyghe és munkatársai által leírt eljárás szerint [Humán Gene Therapy 6, 1403-1416 (1995)], valamint az US 08/400,793 bejelentési számú (benyújtva 1995. március 7-én) szabadalmi iratban leírtak szerint.
A találmány szerinti rekombínáns adenovírusok termelésének optimalizálására szolgáló, további módszerek és eljárások vannak leírva az US 5,994,134 B1 számú USA-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1998. május 4-én), „Viral Production Process címen.
Példák
Az alábbi példákban leírjuk a kísérletekben alkalmazott módszereket és azok eredményeit, szemléltetve a konkrét rekombínáns adenovirális és plazmidvektorok előállítását. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldásnak más megvalósítási módjai is lehetnek, mint amelyeket a példákban bemutatunk, anélkül, hogy az eltérne a találmányi gondolattól vagy lényegi jellemzőitől. Ezért a találmány lentebb leírt, konkrét megvalósítási módjait szemléltetésnek tekintjük, nem pedig korlátozásnak. Az alábbi példákban „g” jelentése gramm, „ml jelentése milliliter, „mól jelentése mól, „°C” jelentése Celsius-fok, „min” jelentése perc, „FBS” jelentése magzati marhaszérum és „PN rekombínáns vírusrészecskék számára utal.
1. példa
Plazmidkonstrukciók
Luciferázt 800 bp méretű PAI-promoter vezérlete alatt kódoló, p800luc-plazmidot Dr. Dávid Luskutofftól (Scripps Institute, LaJolla, California) kaptunk. A pCTMIE-E2F-Rb-plazmidot, amely CMV-promotert, azt követően adenovírus-5-ből származó, háromrészes vezetőszekvenciát és E2F-RB-fúziós fehérjét kódoló szekvenciától szintézisiránnyal szemben SV40-enhanszert tartalmaz, Doug Antelmantól (Canji) kaptuk.
2. példa
TGF-fi-ra reszponzív promotereket tartalmazó luciferáz-plazmidok előállítása A. PAI-luciferáz-plazmid
Valamennyi fragmentum szekvenciáit 5’-3'-irányban mutatjuk be. Egy 749 bp méretű, 5'- és 3’-végénél Sacl- és Xhol-hasítóhelyekkel (sorrendben) szegélyezett, és a promoterben natív TATA-box helyett SV40TATA-boxot tartalmazó fragmentumot PCR-amplifikáltunk, templátként p800luc-ot, és primerként AGT CGA GCT CCA ACC TCA GCC AGA és GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC (SV40-TATA-boxot tartalmaz) alkalmaztunk. Az eredményül kapott PCR-terméket Sacl- és Xhol-enzimekkel emésztettük, és olyan fragmentumhoz ligáltuk, amelyhez PGL3-alap (luciferázt tartalmazó konstrukció promoter nélkül, Promerga) emésztésével jutottunk, így előállítottuk a PAI-luciferázt.
HU 226 602 Β1
B. SRE-luciferáz-plazmid
Az alábbi oligonukleotidokat összehibridizáltuk: GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGC CCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC és GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC. Az összehibridizált terméket Xhol-enzimmel emésztettük, és Mlul-enzimmel emésztett PGL3-alaphoz ligáltuk, Klenow-val tompa végűvé alakítottuk, és Xhol-enzimmel emésztettük pSVT-luc (luciferázt tartalmazó konstrukció SV40-TATA-box-al) előállítása céljából. Smad4/DPC4-kötőhelyeket tartalmazó oligonukleotidokat CGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC és AGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC összehibridizáltunk, és Kpnl-enzimmel emésztett pSVT-luciferázhoz ligáltuk, így jutottunk az SRE-luciferáz-plazmidhoz.
3. példa p53-ra reszponzlv promotereket tartalmazó lucifaráz-plazmidok előállítása
A. RGC-luciferáz-plazmid
Két komplementer, 5’-foszforilált, riboszomális génklaszterből származó p53-kötőhelyet tartalmazó oligonukleotidot AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AAC TCG TGG TAC és CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTG CCT TTT CTG TAC összehibridizáltunk. Az összehibridizált fragmentumot Kpnl-enzimmel emésztett pSVT-luciferázhoz ligáltuk, így jutottunk az RGC-luciferáz-plazmidhoz.
B. p53CON-luciferáz-plazmid
Két komplementer, 5’-foszforilált, konszenzus p53-kötőhelyet (p53CON) tartalmazó oligonukleotidot CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC és AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC összehibridizáltunk. Az összehibridizált fragmentumot Kpnl-enzimmel emésztett pSVT-luciferázhoz ligáltuk, így jutottunk az p53CON-luciferáz-plazmidhoz.
C. PAI-E2F-Rb-plazmid
A pCTMIE-E2F-Rb-plazmidban lévő, CMV-promotert, azt követően adenovírus-5-ből származó, háromrészes vezetőszekvenciát és E2FRB-fúziós fehérjét kódoló szekvenciától szintézisiránnyal szemben SV40enhanszert tartalmazó szekvenciát kihasítottuk BglII/Xbal-enzimes emésztéssel, és az eredményül kapott fragmentumot ligáltuk promotermentes E2F-RBplazmid előállítása céljából. Módosított PAI-promotert tartalmazó fragmentumot Sacl/Xhol-enzimes emésztéssel kivágtunk a PAI-luciferáz-plazmidból, és Klenow-kezeléssel tompa végűvé alakítottuk. Ezt a fragmentumot ligáltuk a promotermentes E2F-RB-plazmidhoz, amelyet EcoRI-enzimmel emésztettünk, és DNSpolimeráz-l Klenow-fragmentumával kezeltük, így jutottunk a PAI-E2F-RB-plazmidhoz.
4. példa
Rekombináns adenovírusok előállítása
Előállítottunk Ad5-szekvenciát az E3-régióban 3 kb méretű delécióval tartalmazó, pNEB E3-transzferplazmidot úgy, hogy pBHG11-ből származó, 7,4 kb méretű SnaBI-fragmentumot (26 676-34 140) klónoztunk BamHI/Accl-enzimekkel emésztett és Klenow-kezelt pNEB193-hoz (plazmid NEB-től). A fenti plazmidba bevittünk többszörös klónozóhelyet úgy, hogy összehibridizáltunk 5’-foszforilált AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCC GCT CGC GAG GAT CCT TAA T és TAA GGA TCC TCG CGA GCG GCC GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T oligonukleotidokat, és az összehibridizált fragmentumot ligálással bevittük Pacienzimmel emésztett pNEBAE3-ba, így jutottunk a pNEBÁE3(MCS)-plazmidhoz.
PAI-promoter vezérlete alatt lévő E2F-Rb-t és CMV-promoter vezérlete alatt lévő, fokozottan („enhanced”) zölden fluoreszkáló fehérjét (GFP) kódoló, rekombináns adenovírus előállítására szolgáló transzferplazmidot az alábbiak szerint állítottunk elő. Előállítottunk egy intermedier pABS.4-E2F-Rb-vektort PAIpromotert és E2F-Rb-kódolószekvenciát tartalmazó fragmentum ligálásával, melyet úgy preparáltunk, hogy PAI-E2F-Rb-t Nacl/Xbal-enzimekkel emésztettünk és pABS.4-plazmid (Microbix) fragmentumához ligáltunk, melyet Kpnl-enzimes emésztéssel, Klenow-kezeléssel és Xbal-enzimes újraemésztéssel preparáltunk. PAIpromotert, E2F-Rb kódolószekvenciát és kanamicingént tartalmazó fragmentumot azután kivágtuk a PABS. 4-E2F-Rb-plazmidból Paci-enzimes emésztéssel, Klenow-val kezeltük, és egy olyan plazmidfragmentumhoz ligáltuk, melyet a pNEBÁE3-plazmid Pacienzimmel való emésztésével és Klenow-kezelésével állítottunk elő, így jutottunk a pNEBAE3-PAI-E2F-Rbplazmidhoz, amely nem tartalmazott Pacl-hasítóhelyet. Ebben a plazmidban a kanamicin-gént zölden fluoreszkáló fehérjéhez (GFP) működőképesen kapcsolt CMVpromoterrel helyettesítettük úgy, hogy a ρΝΕΒΔΕ3PAI-E2F-Rb-t Swal-enzimmel emésztettük, és olyan fragmentumhoz ligáltuk, amelyet pEGFP-N-ből (Clontech) izoláltunk AflII/Sspl-enzimekkel való emésztéssel és Klenow-kezeléssel, így jutottunk a pAE3-PAI-E2FRb-GFP-plazmidhoz.
TGF-reszponzív promoter (SRE-vel) vezérlete alatt lévő E2F-Rb-t és CMV-promoter vezérlete alatt lévő fokozottan („enhanced”) zölden fluoreszkáló fehérjét (GFP) kódoló, rekombináns adenovírusok előállítására szolgáló transzferplazmidot az alábbiak szerint állítottunk elő. E2F-Rb kódolószekvenciát bevittük a pNEB E3(MCS)plazmidba a pNEBAE3-E2F-Rb-plazmid előállítása céljából úgy, hogy ligáltunk egy olyan fragmentumot, amelyet pNEBAE3(MCS) Xbal/Nrul-enzimekkel való emésztésével izoláltunk, és egy olyan fragmentumot, amelyet pCTMIE-E2F-Rb Xbal/Nael-enzimekkel való emésztésével állítottunk elő. SRE-t tartalmazó TGF-fl-reszponzív promotert bevittünk a fenti plazmidba úgy, hogy ezt a szekvenciát PCR-amplifikáltuk, templátként SRE-luciferázt és foszforilált primereket alkalmaztunk: GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C és
HU 226 602 Β1
GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTG GGC CAC T. Az eredményül kapott PCR-terméket Spel-enzimmel emésztettük, és SnaBI/Xbal-enzimekkel emésztett pNEBAE3-E2F-Rb-hez ligáltuk, így jutottunk a ρΔΕ3DPC-E2F-Rb-hez.
p53-reszponzív promoter vezérlete alatt lévő E2FRb-t és CMV-promoter vezérlete alatt lévő fokozottan („enhanced”) zölden fluoreszkáló fehérjét (GFP) kódoló, rekombináns adenovírusok előállítására szolgáló transzferplazmidot az alábbiak szerint állítottunk elő. Riboszomális génklaszterből származó p53-kötőhelyeket vagy p53 konszenzus helyet (p53CON) tartalmazó p53-reszponzív promotert bevittünk a pNEBÁE3-E2F-Rb-plazmidba úgy, hogy a promoterszekvenciát PCR-amplifikáltuk, templátként RGC-luciferázt vagy p53CON-luciferázt és foszforilált primereket alkalmaztunk: GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C és GAT ATC TAG ACG TCC TCT GTG GGC CAC T. Az eredményül kapott PCR-terméket Xbal-enzimmel emésztettük, és SnaBI/Xbal-enzimekkel emésztett ρΝΕΒΔ E3-E2F-Rb-hez ligáltuk, így jutottunk a ρΔΕ3RGC-E2F-Rb-hez vagy pdelataE3-PCON-E2F-Rbhez.
5. példa
Homológ rekombináció rekombináns adenovírusok előállítására
PAI-Ad, SRE-Ad, RGC-Ad és CON-Ad rekombináns adenovírusokat homológ rekombinációval állítottuk elő baktériumokban, leírt módszer szerint [Chartier et al., J. Virol. 70, 4805-4810 (1996)]. A transzferplazmidot Ascl-enzimmel emésztettük, így olyan fragmentumhoz jutottunk, amely egyrészt E2F-Rb-t tartalmazott folyamatsorra reszponzív promoter vezérlete alatt, másrészt GFP-t CMV-promoter vezérlete alatt, Ad5-szekvenciákkal szegélyezve. Az eredményül kapott fragmentumot BJ5283-baktériumtörzsbe kotranszformáltuk egy olyan fragmentummal, amelyhez PTG4609 [Transgene cégnél áll rendelkezésre, leírását lásd Chartier et al., J. Virol. 70, 4805-4810 (1996)] BstBI/Spel-enzimekkel való emésztésével jutottunk. Az eredményül kapott baktérium-kolóniákat a kívánt rekombináns Ad5-fertőző, pPAI-GFP-Ad-, pSRE-GFP-Ad-, pRGC-GFP-Ad- és pCON-GFP-Adplazmidok jelenlétére szűrtük. Ezeket a fertőző plazmidokat azután Paci-enzimes emésztéssel linearizáltuk, fenol-kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk, és 293-sejtek transzfekciójára alkalmaztuk.
A transzfekciókat Superfect (Qiagen) alkalmazásával végeztük, a gyártó utasításai szerint. 2,5 gg linearizált plazmidot alkalmaztunk 6 tenyésztőhelyet tartalmazó tálcákban növesztett, 250 000 sejt transzfekciójára, 12 μΙ Superfectet alkalmazva tenyésztőhelyenként. 8 nap múlva megfigyeltünk vírustermelésnek tulajdonítható citopatikus hatást. A sejteket elkülönítettük a tenyészet felülúszóival, és három fagyasztás/felolvasztás ciklusnak vetettük alá. Az eredményül kapott lizátumokban lévő rekombináns vírusokat 293-sejtekbe való visszafertőzéssel amplifikáltuk.
6. példa
Sejtvonalak
A kísérletekben alkalmazott valamennyi sejtvonalat az ATCC-től (Rockville, MD) szereztük be, és egyrétegű tenyészetként tartottuk fent 37 ’C-on, CO2-inkubátorban. 293, Hep3B, MRC9, A549, Panel, U87, Caco2, MCF-7 és WIDR sejtvonalakat 10% magzati borjúszérummal kiegészített, Dulbecco-módosított Eagle-féle tápközegben tartottuk fent. MDA-MB-468-sejteket 10% magzati borjúszérummal kiegészített Ham-féle tápközegben, míg MiaPaca-2-sejtekét 10% magzati borjúszérummal és 2,5% lószérummal kiegészített DMEMben növesztettünk.
7. példa
Transzfekció
A sejteket 6 tenyésztőhelyet tartalmazó (250 000 sejt/tenyésztőhely) vagy 24 tenyésztőhelyet tartalmazó (62 500 sejt/tenyésztőhely) tálcákra szélesztettünk, és egy éjszakán át hagytuk letapadni. A transzfekciókat 293-sejtek esetén kalcium-foszfát alkalmazásával végeztük, leírt módszer szerint, és a többi sejt esetén Superfect (Qiagen) alkalmazásával végeztük a gyártó utasításai szerint.
8. példa
Riporter/luciferáz vizsgálati eljárások
A sejteket 1,5 gg riporterplazmiddal és 1,0 gg inhibitorral transzfektáltuk. A transzfekció után 48 órával előállítottunk lizátumokat 1x riporter-lízispuffer (Promega) hozzáadásával, és 10 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Luciferázaktivitást Top Count (Packard) és Packard cégtől származó vizsgálati reagenskészlet alkalmazásával határoztunk meg, a Packard cégtől származó utasítások szerint.
9. példa
Vlrusmedlált citopatikus hatás mérésére szolgáló vizsgálati eljárás
Sejteket megfertőztünk a jelölt rekombináns vagy vad típusú adenovírussal, és a fertőzés után 6 nappal megfestettük 20% etanolban preparált 0,5% kristályibolyával, lényegében Bischoff és munkatársai által leírt eljárás szerint [Science 274, 373-376 (1996)].
10. példa
CU3EE- és cT1LT-vlrusok előállítása
Az MLP-promoterszekvenciát PCR-rel amplifikáltuk, primerként GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCT AGG GC és GAT CTT AAT TAA ATG GCA GTG ACC CGG AAG, és templátként Ad5-DNS alkalmazásával, például a pFG140-plazmidban (Microbix) lévőt. Az MLP-PCR-terméket azután a pdelaE3-PCONE2F-Rb-plazmid Pacl-hasítóhelyébe klónoztuk, így jutottunk a pdelaE3-PCON-E2F-Rb-MLP-hez. Adenovírus-E3-ból származó, 10,5 K méretű fehérje kódolószekvenciáját PCR-rel amplifikáltuk, GCG ACC CAC CCT AAC AGA és GAT CGG ATC CAA AGC GCA ACA AGG GTC A primerek alkalmazásával, és az eredményül kapott PCR-terméket a pCDNA3.1-plazmid
HU 226 602 Β1 (Invitrogen) Xhol-hasítóhelyébe klónoztuk, így jutottunk a pCDNA3-10.5-plazmidhoz. Adenovírus-E3-ból származó, 10,5 K méretű fehéije kódolószekvenciáját azután kihasítottuk a pCDNA3-10.5-ből Dralll/Xbal-enzimes emésztéssel, majd Klenow-kezelés következett, és Paci-enzimmel és Klenow-val kezelt pdelataE3PCON-E2F-Rb-MLP-hez ligáltuk, így jutottunk a pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP-10.5K-plazmidhoz.
cU3EE és cT1LT rekombináns adenovírusokat homológ rekombinációval állítottuk elő baktériumokban, leírt módszer szerint [Chartier et al., J. Virol. 70, 4805-4810 (1996)]. A transzferplazmidot Ascl-enzimmel emésztettük, így olyan fragmentumhoz jutottunk, amely egyrészt E2F-Rb-t tartalmazott p53CON-szekvencia vezérlete alatt, másrészt E310.5K-t tartalmazott MLP-promoter vezérlete alatt, Ad5-szekvenciákkal szegélyezve. Az eredményül kapott fragmentumot BJ5283-baktériumtörzsbe kotranszformáltuk egy olyan fragmentummal, amelyhez PTG4609 (Transgene) BstBI/Spel-enzimekkel való emésztésével jutottunk. Az eredményül kapott baktériumkolóniákat a kívánt rekombináns Ad5-fertőző, pCEMD-plazmid jelenlétére szűrtük. A p01/CEMD-jelű Ad5-fertőző plazmidot az alábbi hasonló eljárás szerint állítottuk elő, azonban PTG4609-származékot (Transgene) alkalmaztunk, amelyben a vad típusú E1A-szekvenciát 01-mutációt tartalmazó E1A-t tartalmazó szekvenciára cseréltük. Ezeket a fertőző plazmidokat azután Paci-enzimes emésztéssel linearizáltuk, fenol-kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk, és 293sejtek transzfekciójára alkalmaztuk.
pCEMD- és p01/CEMD-plazmidok transzfekciójával előállítottunk cU3EE, illetve cT1LT rekombináns vírusokat, Superfect (Qiagen) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint. 2,5 gg linearizált plazmidot alkalmaztunk 6 tenyésztöhelyet tartalmazó tálcákban növesztett, 500 000 sejt transzfekciójára, 12 μί Superfectet alkalmazva tenyésztőhelyenként. 8 nap múlva megfigyeltünk vírustermelésnek tulajdonítható citopatikus hatást. A sejteket elkülönítettük a tenyészet felülúszóival, és három fagyasztás/felolvasztás ciklusnak vetettük alá. Az eredményül kapott lizátumokban lévő rekombináns vírusokat 293-sejtekbe való visszafertőzéssel amplifikáltuk.

Claims (20)

1. Szelektíven replikálódó rekombináns vírusvektor, amely tartalmaz egy szintézisútra (pathway) reszponzív promotert működőképesen kapcsolva a vírusreplikáció egy represszorához, mimellett a vektor szelektíven replikálódik olyan neopláziás sejtekben, amelyek egy defektussal rendelkeznek abban a szintézisútban, amelyre a promoter reszponzív.
2. Az 1. igénypont szerinti vektor, ahol a neopláziás sejtek tumorsejtek.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vektor, amelyben a szintézisútra reszponzív promoter egy p53-szintézisútra reszponzív promoter, egy Rb-szintézisútra reszponzív promoter és egy TGF-béta-szintézisútra reszponzív promoter közül kerül kiválasztásra.
4. A 3. igénypont szerinti vektor, amelyben a vírus az adenoviridiae nemzetségből származik.
5. A 4. igénypont szerinti vektor, amelyben a virális replikáció represszora az E2F-RB.
6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vektor, amely tartalmaz továbbá egy transzgén expressziós kazettát.
7. A 6. igénypont szerinti vektor, amelyben a transzgén expressziós kazetta egy proapoptotikus gént tartalmaz működőképesen kapcsolva egy promoterhez.
8. A 7. igénypont szerinti vektor, amelyben a proapoptotikus gén az Ad5 E3-10.5K.
9. A 8. igénypont szerinti vektor, amelyben a szintézisútra reszponzív promoter egy p53-szintézisútra reszponzív promoter.
10. A 9. igénypont szerinti vektor, amelyben a p53szintézisútra reszponzív promoter a p53CON, amely a következő szekvenciával rendelkezik: CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC vagy AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC.
11. A 10. igénypont szerinti vektor, amelyben a transzgén expressziós kazetta promoter komponense egy időleges promoter.
12. A 11. igénypont szerinti vektor, amelyben az időleges promoter a fő kései promoter (MLP).
13. A 12. igénypont szerinti vektor, amely tartalmaz továbbá egy deléciót az adenovirális E1a kódoló régióban a p300-kötés eliminálására.
14. A 13. igénypont szerinti vektor, amelyben az adenovirális E1a kódoló régióban lévő deléció az E1a 289R fehérje 4-25. aminosavainak a deléciója.
15. Gyógyszerforma, amely hatóanyagként egy 1-14. igénypontok bármelyike szerinti, szelektíven replikálódó rekombináns vektort tartalmaz, egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt.
16. Eljárás egy szintézisútban defektussal rendelkező sejt elpusztítására, azzal jellemezve, hogy az említett sejtet ex vivő érintkeztetjük egy 1-14. igénypontok bármelyike szerinti szelektíven replikálódó rekombináns vírussal.
17. Egy 1-14. igénypontok bármelyike szerinti, szelektíven replikálódó vírusvektor alkalmazása egy szintézisútban defektussal rendelkező sejt elpusztítására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
18. A 17. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a gyógyszerkészítmény rák kezelésére szolgál.
19. Egy izolált sejt, amely transzformálva van egy szelektíven replikálódó rekombináns vírussal, amely tartalmaz egy szintézisútra reszponzív promotert működőképesen kapcsolva a vírusreplikáció egy represszorához.
20. Eljárás egy 1-14. igénypontok bármelyike szerinti, szelektíven replikálódó vírus vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy termelő sejtek populációját megfertőzzük az említett vektor egy mintájával, a termelő sejtvonalat olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik a vektor replikációját az említett termelő sejtekben, és a vektort a termelő sejtekből izoláljuk.
HU0104107A 1998-10-15 1999-10-14 Selectively replicating viral vectors, pharmaceutical preparations containing them and process for producing them HU226602B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17268698A 1998-10-15 1998-10-15
PCT/US1999/021452 WO2000022137A2 (en) 1998-10-15 1999-10-14 Selectively replicating viral vectors

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0104107A2 HUP0104107A2 (hu) 2002-03-28
HUP0104107A3 HUP0104107A3 (en) 2003-09-29
HU226602B1 true HU226602B1 (en) 2009-04-28

Family

ID=22628758

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0104107A HU226602B1 (en) 1998-10-15 1999-10-14 Selectively replicating viral vectors, pharmaceutical preparations containing them and process for producing them

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP1121441B1 (hu)
JP (2) JP4404490B2 (hu)
KR (1) KR100841815B1 (hu)
CN (2) CN101092636B (hu)
AR (1) AR020897A1 (hu)
AT (1) ATE348169T1 (hu)
AU (1) AU758354B2 (hu)
BR (1) BR9914527A (hu)
CA (1) CA2345900A1 (hu)
CZ (1) CZ301506B6 (hu)
DE (1) DE69934421T2 (hu)
ES (1) ES2279636T3 (hu)
HK (1) HK1040529B (hu)
HU (1) HU226602B1 (hu)
IL (2) IL142337A0 (hu)
NO (1) NO330666B1 (hu)
NZ (2) NZ528283A (hu)
PL (1) PL347898A1 (hu)
SK (1) SK4412001A3 (hu)
TW (1) TWI262948B (hu)
WO (1) WO2000022137A2 (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU758354B2 (en) * 1998-10-15 2003-03-20 Canji, Inc. Selectively replicating viral vectors
KR100492017B1 (ko) * 2002-06-24 2005-05-30 학교법인고려중앙학원 인간 간엽줄기 세포를 이용한 항암치료방법
GB0416487D0 (en) 2004-07-23 2004-08-25 Isis Innovation Modified virus
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
WO2013138650A1 (en) * 2012-03-14 2013-09-19 Salk Institute For Biological Studies Adenoviral tumor diagnostics
WO2014153204A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
EP2986306A4 (en) 2013-04-18 2016-12-07 Armo Biosciences Inc METHOD FOR USE OF INTERLEUKIN-10 FOR THE TREATMENT OF ILLNESSES AND SUFFERING
AU2016312510A1 (en) 2015-08-25 2018-03-08 Armo Biosciences, Inc. Methods of using Interleukin-10 for treating diseases and disorders
JP7054527B2 (ja) 2016-02-23 2022-04-14 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルスの複製動態を測定するための高スループットアッセイ
JP7015551B2 (ja) 2016-02-23 2022-02-15 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ ウイルス動態への影響を最小限にするための治療用アデノウイルスにおける外因性遺伝子発現
WO2018111767A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
WO2019020992A1 (en) * 2017-07-25 2019-01-31 Oxford Genetics Limited ADENOVIRAL VECTOR
US11485957B2 (en) * 2017-10-10 2022-11-01 Nantbio, Inc. Modified EC7 cells having low toxicity to viral production payloads

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE178490T1 (de) * 1993-02-16 1999-04-15 Onyx Pharmaceuticals Cytopathische viren zur therapie und prophylaxe der neoplasie
WO1998013508A1 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Dana-Farber Cancer Institute Method of targeting malignant cells using an e2f responsive promoter
IL129922A0 (en) * 1996-11-15 2000-02-29 Canji Inc Tissue specific expression of retinoblastoma protein
AU744725B2 (en) * 1997-03-03 2002-02-28 Cold Genesys, Inc. Adenovirus vectors containing heterologous transcription regulatory elements and methods of using same
AU758354B2 (en) * 1998-10-15 2003-03-20 Canji, Inc. Selectively replicating viral vectors

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0104107A3 (en) 2003-09-29
NO20011843D0 (no) 2001-04-10
DE69934421T2 (de) 2007-10-11
NO330666B1 (no) 2011-06-06
IL142337A (en) 2009-05-04
JP2009254385A (ja) 2009-11-05
IL142337A0 (en) 2002-03-10
HK1040529B (zh) 2007-02-09
KR20020013472A (ko) 2002-02-20
AR020897A1 (es) 2002-06-05
CN1330715A (zh) 2002-01-09
JP2002541761A (ja) 2002-12-10
EP1121441A2 (en) 2001-08-08
AU6391599A (en) 2000-05-01
PL347898A1 (en) 2002-04-22
WO2000022137A3 (en) 2000-08-03
HK1040529A1 (en) 2002-06-14
EP1121441B1 (en) 2006-12-13
TWI262948B (en) 2006-10-01
KR100841815B1 (ko) 2008-06-26
CZ301506B6 (cs) 2010-03-31
ES2279636T3 (es) 2007-08-16
CZ20011129A3 (cs) 2002-01-16
BR9914527A (pt) 2001-06-26
CA2345900A1 (en) 2000-04-20
NO20011843L (no) 2001-06-14
ATE348169T1 (de) 2007-01-15
SK4412001A3 (en) 2001-12-03
JP4404490B2 (ja) 2010-01-27
DE69934421D1 (de) 2007-01-25
CN101092636B (zh) 2012-08-08
CN101092636A (zh) 2007-12-26
CN1325647C (zh) 2007-07-11
NZ510805A (en) 2003-12-19
HUP0104107A2 (hu) 2002-03-28
AU758354B2 (en) 2003-03-20
WO2000022137A2 (en) 2000-04-20
NZ528283A (en) 2005-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8133481B2 (en) Selectively replicating viral vectors
JP4334174B2 (ja) 腫瘍崩壊性アデノウイルス
JP4051416B2 (ja) 遺伝子治療に使用されるヒト組換えアデノウイルス用のパッケージングシステム
US6551587B2 (en) Vectors for tissue-specific replication
ES2258265T3 (es) Vectores de replicacion con especificidad tisular.
JP2009254385A (ja) 選択的に複製するウイルスベクター
JPH08501703A (ja) 欠陥組換えアデノウイルスベクター及び遺伝子治療での使用
US6649158B1 (en) Methods and compositions to induce antitumor response
JP2002530085A (ja) 後期導入遺伝子の発現を有するウイルスベクター
WO2001053504A1 (en) Replication deficient adenovirus vectors
JP2002527455A (ja) 組換え欠失アデノウイルスベクター
MXPA01003840A (en) Selectively replicating viral vectors
MXPA01004989A (en) Viral vectors with late transgene expression