JP2002514074A

JP2002514074A - 異種転写調節エレメントを含有するアデノウイルスベクターおよびその使用方法

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Publication number: JP2002514074A
Application number: JP53867498A
Authority: JP
Inventors: アール．ヘンダーソン，ダニエル; ユ，デ−チャオ; ジー．ランパルスキ，ヘンリー
Original assignee: セルジェネシス，インコーポレイティド
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-03-03
Publication date: 2002-05-14
Also published as: WO1998039464A2; WO1998039464A3; EP1007715A2; AU6345098A; WO1998039464A8; AU744725B2; CA2283231A1; CA2283231C

Abstract

(57)【要約】標的細胞に特異的な複製コンピテントアデノウイルスベクター、およびこのようなウイルスの使用方法が提供される。これらのアデノウイルスは、細胞特異的な異種（すなわち、非アデノウイルス）転写調節エレメント（TRE）の制御下の第１のアデノウイルス遺伝子、および第２の異種TREの制御下の少なくとも１つの第２の遺伝子を含み、ここで、該異種TREは、ポリヌクレオチド配列が相互に異なるが、同じ細胞において機能的である。このアデノウイルス遺伝子は、例えば、アデノウイルス複製に必要な遺伝子であり得る。第２の遺伝子は、例えば，第２のアデノウイルス遺伝子またはトランスジーン（例えば，標的細胞における細胞傷害性に寄与し得る遺伝子）であり得る。アデノウイルス複製は、異種TREが機能的である標的細胞に制限され得、従って、アデノウイルスベクターは、標的細胞、特に新生物性細胞に対する選択的細胞傷害性を提供し得る。

Description

【発明の詳細な説明】異種転写調節エレメントを含有するアデノウイルスベクターおよびその使用方法関連出願に対する相互参照本願は、1997年３月３日に出願された米国特許出願番号第60/039,762号、1997 年３月３日に出願された米国特許出願番号第60/039,763号、および1997年８月８日に出願された米国特許出願番号第60/054,523号の利益を請求する。連邦政府主催研究の下でなされた本発明に対する権利の声明（適用なし）技術分野本発明は、アデノウイルスベクターを用いた細胞トランスフェクションに関連し、複製コンピテントアデノウイルスベクターおよびその使用方法を提供する。より詳細には、本発明は、細胞特異的、非アデノウイルス転写調節エレメントの使用による、細胞における細胞特異的アデノウイルス複製に関する。発明の背景医学的研究における多くの進歩にかかわらず、ガンは米国における第２の主な死亡原因のままである。工業国において、およそ５人に１人はガンで死亡する。伝統的様式の臨床医療（例えば、外科的切除、放射線治療および化学療法）は、特に固形腫瘍において、有意に失敗する割合を有する。良性腫瘍を生じる新形成は、通常固まりを外科的に除去することにより完全に治療し得る。周囲の組織への浸潤により明らかとなるように、腫瘍が悪性になる場合、根絶は非常により困難になる。いったん悪性腫瘍が転移すると、根絶の可能性はかなり低くなる。基底細胞ガンを除き、米国のみでも毎年100万を越える新症例があり、同国において、ガンは毎年50万を越える死亡の原因となる。世界全体において、５つの最も一般的なガンは、肺ガン、胃ガン、乳ガン、結腸／直腸ガン、および子宮ガンであり、これらの毎年の新症例の総数は600万を越える。肺ガンは、最も難治性の固形腫瘍の１つである。なぜなら手術不能の症例は60 %におよび、そして5年での生存者は13%のみである。特に、全ての肺ガン症例の約半数を構成する腺ガンは、ほとんど、化学−放射線耐性である。胃ガンは、日本および韓国を含む東アジアにおいて、最も流行するガンの形態の１つである。広範な外科手術が化学療法および免疫療法を組み合わせられているが、ガン性腹膜炎および進行段階における肝臓転移に起因して、胃ガンの死亡率は依然高い。結腸直腸ガンは３番目に最も一般的なガンであり、ガン死亡の第２の主な原因である。膵臓ガンは、実質的に常に致死的である。従って、これらのガンを伴う多くの患者にとって、現在の処置の見通しは、不満足であり、そして予後は不十分である。肝細胞ガン（HCCまたは悪性肝ガン）は、世界で最も一般的なガンの１つであり、そして特にアジアで問題である。肝細胞ガンを伴う患者の処置の見通しはかすかである。治療の進歩および肝臓移植の利用可能性を伴ってさえも、少数の患者のみが切除または移植による腫瘍の除去により治癒する。多くの患者について、現在の処置は不満足のままであり、そして予後は不十分である。乳ガンは、米国で最も一般的なガンの１つであり、毎年約182,000の新症例が発生し、そしておよそ50,000が死亡する。工業国において、約８人の女性中１人が乳ガンを発生すると予想され得る。乳ガンの死亡率は1930年より変わらぬままである。毎年平均0.2%増加するが、65才未満の女性においては、毎年平均0.3%減少する。例えば、Marchant(1994)Contemporary Management of Breast Disease II：Breast Cancer,：Obstetrics and Gynecology Clinics of North America 2 1:555-560；およびColditz(1993)Cancer Suppl．71:1480〜1489を参照のこと。疾患の理解の改善の前進にもかかわらず、乳ガンは医学的介入に耐性のままである。ほとんどの臨床な第１歩は、初期診断に集中し、従来の介入形態、特に手術および化学療法が続く。このような介入の成功は、特に腫瘍が転移を経た患者において限られている。侵襲性のより少ない方法で、より正確でそしてより効果的な処置の提供に利用可能な治療の集積の進歩が緊急に必要である。前立腺ガンは男性において最も速く成長する新生物であり、1995年米国で推定で244,000の新症例が診断され、そのうち約44,000の死亡が生じるであろう。前立腺ガンは、現在、男性において最も頻繁に診断されるガンである。前立腺ガンは潜伏性である；多くの男性は疾患の明らかな徴候なしに、前立腺ガン細胞を保有する。前立腺ガンは、高い罹患率と関連する。骨へのガン転移（後期段階）は、一般的であり、そしてほとんど常に致命的である。現在の処置は、過激な前立腺切除、放射線治療、ホルモン療法および化学療法を含む。不運にも、症例の約80%において、前立腺ガンの診断は疾患が既に骨に転移した場合に確立される。従って、外科的処置の効果は限定されている。ホルモン治療は、時間に伴い、ホルモン耐性腫瘍細胞の発達に伴い、頻繁に失敗する。化学治療剤は、前立腺ガンの処置において用いられてきたが、単独で対応物に対し優位性を示す薬剤は存在せず、そして薬物の組み合わせも特に効果的であるようには思われない。ほとんどの前立腺ガンの一般的に薬剤耐性で、遅い成長をする性質は、標準的な化学療法に対して、前立腺ガンを特に非応答性にする。ガン治療の主な（実に圧倒的な）障害は、選択性；すなわち、腫瘍細胞の増殖を阻害するが、一方、正常細胞の機能に影響を及ぼさないままにする能力の問題である。例えば、前立腺ガンの治療において、治療の比率、すなわち伝統的な腫瘍化学療法の腫瘍細胞殺傷と正常細胞殺傷との比は、1.5:1でしかない。従って、新形成の治療法および予防法のための、より効果的な処置方法および薬学的組成物が必要である。ガン治療（特に成功した処置が困難であるガンについて）のより特異的な標的化された形態の開発が、特に重要である。比較的非特異的で、そしてしばしば重篤な毒性をもたらす、従来のガン治療とは対照的に、より特異的な処置様式は、悪性細胞を選択的に阻害または殺傷するが、一方、健常細胞をインタクトにしておくことを試みている。これらのガンの多くための１つの可能な処置アプローチは遺伝子治療であり、これにより目的の遺伝子が悪性細胞に導入される。前立腺ガンの遺伝子治療については、Boulikas(1997)Anticancer Res.17:1471-1505を参照のこと。目的の遺伝子は、別の化台物を用いた処置の際に毒性物質に変換するタンパク質、またはプロドラックを薬物に変換する酵素をコードし得る。例えば、チミジンキナーゼをコードする単純ヘルペス遺伝子(HSV-tk)の導入は、細胞をガンシクロビルに条件的感受性にする。Zjilstraら(1989)Nature 342:435；Mansourら(1988)Nature 336:348；Johnsonら(1989)Science 245:1234；Adairら(1989)Proc.Natl.Acad.Sc i.USA 86:4574；およびCapecchi(1989)Science 244:1288。あるいは、目的の遺伝子は、直接的に毒性である化合物（例えば、ジフテリア毒素）をコードし得る。ガン細胞に対して特異性にされるこれらの処置について、目的の遺伝子は、ガン細胞において特異的に（すなわち、優先的に）活性化される転写調節エレメント（TRE）の制御下にあり得る。細胞特異的発現または組織特異的発現は、細胞特異的エンハンサーおよび／またはプロモーターとともにTREを使用することにより達成され得る。一般的に、Huberら(1995)Adv.Drug Delivery Reviews17:279 -292を参照のこと。種々のウイルスおよび非ウイルス（例えば、リポソーム）のビヒクル、またはベクターがこれらの遺伝子を移入するために開発された。遺伝子移入のために提案されるウイルスのうち、アデノウイルスは、最も容易に生成および精製されるウイルスの１つである。アデノウイルスはまた、高い形質導入効率を果たすという利点を有し、そして効率的な細胞形質導入のための細胞増殖を必要としない。さらに、アデノウイルスは、インビトロおよびインビボにおいて、広範な種々の細胞に感染し得る。アデノウイルスおよびアデノウイルスベクター系の開発に関する一般的な背景参考文献については、Grahamら(1973)Virology 52:456-467；T akiffら(1981)Lancet 11:832-834；Berknerら(1983)Nucleic Acid Research 11: 6003-6020；Graham(1984)EMBO J 3:2917-2922；Bettら(1993)J.Virology 67:591 1-5921；およびBettら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8802-8806を参照のこと。遺伝子移入ビヒクルとして使用される場合、アデノウイルスベクターは、しばしば、複製欠損であるように設計され、従って、目的の標的細胞において複製しないように意図的に操作される。これらのビヒクルにおいて、初期アデノウイルス遺伝子産物E1Aおよび／またはE1Bは欠失され、そしてパッケージング細胞株29 3によりトランスに提供される。Grahamら(1987)J.Gen.Virol.36:59-72；Graham (1977)J.Genetic Virology 68:937-940。形質導入される遺伝子は、一般的に、ウイルスゲノムのE1AおよびE1B領域においてアデノウイルスに挿入される。Bett ら（1994）。遺伝子の効率的な形質導入のためのビヒクルとしての複製欠損アデノウイルスベクターは、とりわけ、Stratford-Perricaudet(1990)Human Gene Th erapy 1:241-256；Rosenfeld(1991)Science 252:431-434；Wangら(1991)Adv.Exp .Med.Biol.309:61-66；Jaffeら(1992)Nat.Gen.1:372-378；Quantinら(1992)Proc .Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584；Rosenfeldら(1992)Cell 68.143-155；Strat ford-Perricaudetら(1992)J.Clin.Invest.90:626-630；Le Gal Le Salleら(1993 )Science 259:988-990；Mastrangeliら(1993)J.Clin.Invest.91:225-234；Ragot ら(1993)Nature 361:647-650；Hayaskiら(1994)J.Biol.Chem.269:23872-23875；およびBettら(1994)により記載されている。遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの開発における実質的に唯一の焦点は、それ自体でのエフェクターとしてではなく、単に、目的の遺伝子を導入するためのビヒクルとしてのアデノウイルスの使用である。アデノウイルス複製は、主として宿主免疫応答のために、所望されない結果として見られている。複製欠損アデノウイルスによるガン処置において、宿主免疫応答は、２つのレベルで反復用量の持続時間を制限する。第１に、アデノウイルス送達ビヒクル自体のキャプシドタンパク質が免疫原性である。第２に、ウイルス後期遺伝子は形質導入細胞において頻繁に発現され、細胞性免疫を誘発する。従って、サイトカイン、腫瘍抑制遺伝子、リボザイム、自殺遺伝子、またはプロドラックを活性薬物に変換する遺伝子を繰り返して投与する能力は、遺伝子移入ビヒクルおよび移入ビヒクルのウイルス遺伝子産物の両方の免疫原性、ならびに遺伝子発現の一過性性質により制限された。アデノウイルスは一般的に、宿主細胞への感染に続く効果的な溶解性複製サイクルを行う。感染された細胞を溶解するのに加え、アデノウイルスの複製プロセスは宿主細胞mRNAの輸送および翻訳をブロックし、従って感染された細胞のタンパク質合成を阻害する。アデノウイルスおよびアデノウイルス複製の総説は、Sh enk，T.およびHorwitz,M.S.（Virology、第３版、Fields,B.N.ら編、Raven Pres s Limited，New York(1996)、第67および68章）をそれぞれ参照のこと。アデノウイルス複製に関連した細胞傷害性効果を利用し、複製コンピテントアデノウイルスベクターは、選択的細胞増殖阻害をもたらすための薬剤として、最近記載された。Hendersonら、（米国特許第5,698,443号）；Hallenbeckら、（WO 96/17053）を参照のこと。このような系において、細胞特異的転写調節エレメント（TRE）はウイルス複製に必須な遺伝子の発現を制御し、従って、ウイルス複製は、TREが機能的である細胞集団に限られる。例えば、弱毒化、複製コンピテントアデノウイルス（CN706）は、前立腺特異的抗原（PSA）プロモーターおよび E1A転写単位の上流のエンハンサー（PSE-TRE）を、アデノウイルス血清型5(Ad5) に挿入することにより生成された。CN706は、PSA発現細胞に対し、インビボおよびインビトロで選択的細胞傷害性を示す。Rodriguezら、（(1997)Cancer Res．5 7:2559-2563）要約すれば、最小数の投与により、ベクターに対する特定の免疫応答の前に本質的に全ガン細胞を除去し得、さらなる処置を防ぐベクター構築物が必要である。特に、細胞特異的複製がさらに増大し、その一方、非標的（すなわち非ガン細胞）における複製の程度を最小化し得る改善された複製コンピテントアデノウイルスについての継続する重大な必要がある。本発明は、これらの文脈において使用され得る、選択的に複製するアデノウイルスベクターを提供する。発明の要旨本発明は、第１の異種転写調節エレメント（TRE）の転写制御下の第１のアデノウイルス遺伝子、および第２の異種TREの転写制御下の少なくとも第２の遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供し、ここで第１の異種TREは細胞特異的であり、第１の異種TREは第２の異種TREと異なり、そして異種TREは同一の細胞で機能的である。１つの局面において、本発明は細胞特異的異種TREがアデノウイルス複製に必須の遺伝子の転写を制御するアデノウイルスベクターを提供する。別の局面において、本発明は第２の異種TREがトランスジーンの転写を制御するアデノウイルスベクターを提供する。いくつかの実施態様において、本発明はマスク（mask）したアデノウイルスを作製するための親水性ポリマー（「マスキング剤」）と複合体化したアデノウイルスベクターを提供する。親水性ポリマーは、アデノウイルスのキャプシドタンパク質（特にヘキソンおよび線維タンパク質）に結合（共有結合的にまたは非共有結合的に）する。好ましい実施態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、マスク化アデノウイルスベクターを作製するためにマスキング剤と複合体化される。さらに好ましい実施態様において、マスキング剤は、本発明のアデノウイルスベクターと共有結合的に連結したポリエチレングリコール（PEG）である。本発明はさらに、本発明のアデノウイルスベクターを含有する宿主細胞を提供する。さらに本発明のアデノウイルスベクターを用いる方法も提供される。１つの局面において、方法は、本明細書に記載された、これらのベクターの細胞への導入を伴うアデノウイルスベクターの使用を提供する。別の局面において、異種TREが機能するのを可能にする細胞に選択的細胞傷害性を与え、細胞を本明細書中に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程を包含する方法が提供され、ここでアデノウイルスは細胞中に侵入する。別の局面において、アデノウイルスベクターが細胞内へ侵入するように、標的細胞を本明細書中に記載のアデノウイルスと接触させる工程を包含する、腫瘍増殖を抑制するための方法が、提供される。別の局面において、細胞を本明細書中に記載のアデノウイルスと接触させる工程を包含する、ここでアデノウイルスベクターが細胞内へ侵入する、標的細胞の遺伝子型を改変するための方法が、提供される。さらに別の局面において、アデノウイルスベクターが細胞内に侵入し、そして増殖するように、アデノウイルスベクターを異種TREが機能するのを可能にする細胞とアデノウイルスベクターとを組み合わせる工程を包含し、本発明のアデノウイルスベクターを増殖するための方法が提供される。図面の簡単な説明図１は、種々の遺伝子が種々の異種TRE転写制御下にあるアデノウイルスベクターの例の模式図を示す。アデノウイルスベクターに含有される異種TREはお互いに異なり、そして内因性アデノウイルスTREと異なる。アデノウイルスベクターの全ての異種TREは、同一の細胞において機能的であり、そして少なくとも１つのTREは細胞特異的である。図2(A)〜(C)は、E1AおよびE1B遺伝子が前立腺細胞特異的異種TREの転写制御下にあるアデノウイルスベクターの例の模式図である。CN702は、野生型アデノウイルス５型の例であり、CN706は、１つの前立腺細胞特異的TRE（PSA遺伝子由来）の制御下の１つの遺伝子（E1A）を含有する。図３は、CN702およびCN764の、ヒト微小血管内皮細胞上の種々の感染多重度での細胞変性効果を示す。図４は、LNCaP細胞（斜線付き棒）またはHMVEC細胞（四角パターン付き棒）のいずれかが、アデノウイルスベクターCN739、CN764、CN765、またはCN770で感染された場合に得られるプラーク形成単位を、野生型アデノウイルスを用い得られるプラークのパーセントで表した、プラーク形成単位数を示す棒グラフである。図５は、アデノウイルスCN739の一段階増殖曲線を示す折れ線グラフである。ここで、複数のアデノウイルス初期遺伝子は、前立腺細胞（LNCaP）および非前立腺細胞（HMVEC）中で、前立腺細胞特異的異種TREの制御下に置かれる。図６は、アデノウイルスCN739でのマウスの前立腺ガン腫瘍の処置における有効性を示す折れ線グラフである。ここで、複数のアデノウイルス初期遺伝子は、前立腺細胞特異的異種TRE制御下に置かれる。図７は、アデノウイルスCN739で処置したマウスにおける血清PSAレベルを示す折れ線グラフである。ここで、複数のアデノウイルス初期遺伝子は、前立腺細胞特異的異種TRE制御下に置かれる。図8(A)〜(B)は、E1AおよびE1B遺伝子が細胞特異的異種TREの転写制御下にあるアデノウイルスベクターの例の模式図である。各アデノウイルスベクターは、少なくとも２つの異なる異種TREを含み、その両方は同一細胞内で機能的である。図９は、E1A、E1BおよびE4遺伝子が細胞特異的異種TREの転写制御下にあるアデノウイルスベクターの例の模式図を示す。各アデノウイルスベクターは、３つの異なる異種TREを含み、そのすべては同一細胞内で機能的である。図10は、コントロールCN702（黒丸）、Rec 700（黒三角）、および偽感染（Xs ）と比較して、アデノウイルス死タンパク質（ADP）、CN751（黒四角）のコード配列を含むアデノウイルスベクターの細胞傷害性を示すグラフである。図11は、CN751（黒四角）およびCN702（黒丸）の細胞外ウイルス産生を比較するグラフである。図12は、CN751（「H」）、CN702（「J」）、または緩衝液（「B」）でチャレンジした、LNCaP腫瘍異種移植片を有するマウスにおける肺瘍体積を比較するグラフである。図13は、アデノウイルスの共有結合的PEG化（pegylation）方法の模式図である。この方法において、スクシンイミジルスクシンイミドはアデノウイルスヘメトキシ-PEGを共有結合的に結合するために使用される。PEG化されたアデノウイルスは、イオン交換クロマトグラフィーによって反応成分から分離される。図14は、PEG化されたアデノウイルスタンパク質の、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲル（移動シフト）のハーフトーン再生を示す。レーン１および２は非PEG化CN706（コントロール）であり、レーン３〜６は、種々のpHおよび温度条件下でのPEG化CN706である（レーン３、pH7. 6、室温（RT）；レーン４、pH7.6、４℃；レーン5、pH8.2、RT；レーン６、pH8. 2、４℃）。図15は、コントロールアデノウイルスCN706と混合された、PEG化されたアデノウイルス（PEG-706）のイオン交換クロマトグラフィー分析のクロマトグラフである。発明を実施するための様式本発明者らは、異種細胞特異的転写調節エレメント（TRE）を含む複製コンピテントアデノウイルスベクターを発見し、そして構築した。このアデノウイルスベクターは、このTREの機能が許容される細胞中で優先的に複製し得、そしてこれらのアデノウイルスベクターを使用する方法を開発した。本発明のアデノウイルスベクターは、細胞特異的異種TREの転写制御下の第１のアデノウイルス遺伝子、および少なくとも他の１つの遺伝子（例えば、第１のTREとは異なる別の異種TRE制御下のアデノウイルス遺伝子またはトランスジーン）を含む。ここで、異種TREは同一の細胞内で機能的であるが、ポリヌクレオチド配列は、同一ではない（すなわち、異なるポリヌクレオチド配列を有する）。好ましくは、アデノウイルスベクター中の少なくとも２つの異種TREは、同一細胞について細胞特異的である。好ましくは、アデノウイルス遺伝子は、細胞死を増強し、より好ましくは、アデノウイルス複製に必須である遺伝子である。好ましくは、細胞複製に必要なアデノウイルス遺伝子の少なくとも１つは初期遺伝子である。好ましくは、異種TREの転写制御下の遺伝子は複製に必要である。複数の異種TREの使用による細胞特異的転写の提供により、本発明は選択的複製に起因する細胞特異的細胞傷害性効果のために使用され得るアデノウイルスベクターを提供する。本発明のアデノウイルスベクターは、優先的にTRE機能性細胞において複製する（すなわち、TRE非機能性細胞よりも高い収量）。この複製優先性は、TREが活性である細胞中の複製のレベル（すなわち力価）とTREが活性でない細胞中の複製のレベルを比較することにより示される。本発明のアデノウイルスベクターが実際に野生型ウイルスに比べTRE非機能性細胞において有意に低い速度で複製する場合、複製優先性はさらにより有意である。TRE活性細胞のアデノウイルス力価と、TRE不活性細胞のアデノウイルス力価の比較は、TRE活性細胞における複製およびTRE不活性細胞における減少した複製に起因して全体的な複製優先性が増強するという重要な指示を提供する。これは、特にガンの状況において有用であり、ここで標的細胞の死滅が所望される。本発明のアデノウイルスベクターは、少なくとも２つの異なる異種TREの封入を伴い、より安定であり、そして上記に記載したアデノウイルスベクターよりも、複製に関していっそうの細胞特異性を提供する。E1AおよびE1B遺伝子の各々が２つの異なる異種TRE（例えば、PSA遺伝子からのTRE（PSE-TRE）およびプロバシン（probasin）遺伝子からのTRE（PB-TRE）、ならびにPSA遺伝子からのTREおよびhKLK2遺伝子からのTRE（hKLK2-TRE））の転写制御下に置かれた、アデノウイルスベクターが構築される。本発明者らは、例えば、PSE-TREおよびPB-TREを含むアデノウイルス、ならびにPSE-TREおよびhKLK2-TREを含むアデノウイルスは、安定したゲノムを有するようであり、E1A遺伝子を制御するPSE-TREを有するアデノウイルスであるCN706よりも、複製に関して高いレベルの細胞特異性を示すようであり、そして前立腺細胞においてCN706と同様の効率で複製を行うようであることを見出した。本明細書に示すように、インビトロおよびインビボの結果は、CN739（E1A遺伝子を制御するPB-TREおよびE1B遺伝子を制御するPSE-TREを有するアデノウイルス、以下に記載）およびCN764（E1A遺伝子を制御するPSE-TREおよびE1B遺伝子を制御するhK LK2-TREを有するアデノウイルス、以下に記載）が、同様の前立腺腫瘍殺傷能力を保持したままで、CN706よりも、複製における10〜100倍高い細胞特異性を有することを示す。従って、本発明は、２つの異なる異種の細胞特異的TREで複製遺伝子を制御することによって、なおより弱毒化した複製コンピテントウイルスさえ提供する。２つのアデノウイルスベクター遺伝子の転写を制御する、同じ異種TREを有するアデノウイルスベクターの構築を通してこのレベルの特異性を達成する以前の試みは、不安定なゲノムおよび所望でないポリヌクレオチド配列の再編成を生じたようである。制限酵素消化およびサザンブロット分析のような技術を用いた、そのようなアデノウイルスの試験は、ウイルス複製後のアデノウイルスポリヌクレオチドフラグメントのサイズにおける変化を明らかにした。理論に縛られることを望まないが、このようなゲノムの不安定性は、重複したTRE配列を通しての相同組換えの結果であり得る。本発明によって提供され、２つの異なる異種TREが複製制御のために使われるアデノウイルスベクターは、ウイルスゲノムの安定性、および以前に記載されたアデノウイルスよりもなお高いレベルの標的細胞特異性を達成する。本発明は、アデノウイルスベクターの望ましくない面と考えられてきたこと、すなわち、それらの複製およびあり得る付随する免疫原性を使用および利用する。ランナウェイ（runaway）感染は、ウイルス複製に対する細胞特異的要求性に起因して妨害される。いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、発明者らは、アデノウイルスタンパク質の産生が、一般的にか、または特異的にかのいずれかで、アデノウイルスタンパク質を産生する標的細胞に対して、免疫系を活性化および／または刺激するために作用し得ることに注目する。このことは、患者がしばしば中程度から重篤に免疫無防御状態にあるガンの場面において、重要な考慮となり得る。一般技術本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当業者の内にある。このような技術は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 」、第２版（Sambrookら、1989）；「0ligonucleotide Synthesis」(M.J．Gait 編、1984);「Animal Cell Culture」（R．I．Freshney編、1987）；「Methods i n Enzymology」（Academic Press，Inc.）；「Handbook of Experimental Immun ology」（D．M．Weir & C．C．Blackwell編）；「Gene Transfer Vectors for M ammalian Cells」（J.M．Miller & M.P．Calos編、1987）；「Current Protocol s in Molecular Biology」（F.M．Ausubelら編、1987）；「PCR:The Polymerase Chain Reaction」（Mullisら編、1994）；および「Current Protocols in Immu nology」（J.E．Coliganら編、1991）のような文献において十分に説明される。アデノウイルスに関連した技術については、特に、FelgnerおよびRingold（19 89）Nature 337:387-388；BerknerおよびSharp（1983）Nucl．Acids Res．11:60 03-6020;Graham（1984）EMBO J．3:2917-2922;Bettら(1993)J．Virology 67:591 1-5921;およびBettら（1994）Proc．Natl．Acad．Scl．USA 91:8802-8806を参照のこと。定義本明細書で使用される、「アデノウイルス」は、ウイルスそれ自身またはその誘導体をいう。この用語は、別に示す場合を除いて、すべての血清型およびサブタイプ、ならびに天然由来および組換えの両方の形態を包含する。用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用するように、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドをいう。従って、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは三本鎖のDN Ａ、および一本鎖もしくは二本鎖のRNA、RNA-DNAハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（代表的にはRNA またはDNAにおいて見い出され得るような）、あるいは修飾または置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミデートのような合成サブユニットのポリマーを含み得、従ってオリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（P-NH₂）または混合型ホスホルアミデート- ホスホジエステルオリゴマーであり得る。Peyrottesら（1996）Nucleic Acids R es．24:1841-8；Chaturvediら（1996）Nucleic Acids Res．24:2318-23；Schult zら（1996）Nucleic Acids Res．24:2966-73。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の代わりに使用され得る。Braunら（1988）J．Immunol．141:2 084-9；Latimerら（1995）Mol．Immunol．32:1057-1064。好ましくは、ポリヌクレオチドはDNAである。本明細書で使用するように、「DNA」は、塩基A、T、C、およびGを含むだけではなく、任意のそれらのアナログ、またはメチル化されたヌクレオチドのような、これらの塩基の修飾された形態、非荷電連結およびチオエートのようなヌクレオチド間の修飾、糖アナログの使用、ならびに修飾された骨格構造、および／またはポリアミドのような、別の骨格構造もまた含む。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から、相補鎖の合成および適切な条件下でのこの鎖のアニーリングによって、または適切なプライマーとともにDNAポリメラーゼを使用する新規な相補鎖の合成のいずれかによって、得られ得る。用語「遺伝子」は、当該分野で十分に理解されており、そしてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。ポリペプチドコード領域に加えて、遺伝子は、イントロン、転写されるが翻訳されないセグメント、およびコードセグメントの上流および下流の調節エレメントを含むがこれらに限定されない、非コード領域を含む。本明細書で使用されるように、「転写調節エレメント」または「TRE」は、RNA ポリメラーゼによる、RNAを形成するための、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を調節（すなわち、制御）する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。本明細書で使用されるように、TREは、TREが機能可能である宿主細胞中で、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加させる。TREは、エンハンサーエレメントおよび／またはプロモーターエレメントを含み、それらは同じ遺伝子由来であり得るし、またはそうでなくともよい。TR Eのプロモーターおよびエンハンサー成分は、所望の転写活性が得られる限り、任意の方向にあり得、そして／または目的のコード配列から離れ得、そして前記のマルチマーを含み得る。本明細書で議論するように、TREはサイレンサーエレメントを欠き得るか、または欠かなくともよい。「エンハンサー」は、当該分野において十分に理解されている用語であり、作動可能に遺伝子に連結させた場合に、プロモーターそれ自体によりもたらされる転写活性化よりも大きい程度に、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を増加させる（すなわち、プロモーターからの転写を増加させる）遺伝子由来のポリヌクレオチド配列である。「エンハンサー活性」を有するとは、当該分野において十分に理解されている用語であり、述べられていることを意味する。すなわち、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を、遺伝子に作動可能に連結された場合に、プロモーター自体によってもたらされる転写の増加よりも大きい程度に増加させる（すなわち、プロモーターからの転写を増加させる）ことを意味する。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域は、特定の割合（例えば、80% 、85%、90%、または95%）の「配列同一性」を、別の配列に対して有する。このことは、整列させた場合、その割合の塩基が２つの配列の比較において同一であることを意味する。この整列および相同性％、または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウエアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Bio logy（F.M．Ausubelら編、1987）補遺30、7.7.18節、表7.7.1に記載されるプログラムを使用して決定され得る。好ましい整列プログラムは、ALIGN Plus（Scie ntific and Educational Software，Pennsylvania）である。アデノウイルスベクターの文脈において、２つの異種TRE間のポリヌクレオチド配列同一性が約95％未満、好ましくは約90％未満、好ましくは約85％未満、好ましくは約75％未満の場合、第１の異種TREは第２（または別の）異種TREとは「異なる」。一般的に、「異なるTRE」は、異なる遺伝子の転写調節領域由来である。「異なるTRE」はまた、それらの間の配列同一性が上記に列挙した値未満（すなわち、約95％未満、好ましくは約90％未満、好ましくは約85％未満、好ましくは約75％未満）である限り、同じ遺伝子の転写調節領域由来であり得る。２つの異なるTREはポリヌクレオチド配列において同一でないが、それらは同じ細胞中で機能的であり得、そしてまた、同じ細胞特異性を有し得る。本明細書で使用するように、特定の遺伝子由来のTREは、それが由来する遺伝子によって呼ばれ、そしてその遺伝子が発現される宿主細胞中で、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列である。例えば、本明細書で使用するように、「ヒト腺性カリクレイン転写調節エレメント」または「hKLK2-TRE」は、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。それは、hKLK2-TREを機能させ得る、アンドロゲンレセプターを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞）のような、宿主細胞中で、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加させる。従って、hKLK2-TREはアンドロゲンレセプターの結合に対して応答性であり、そしてh KLK2プロモーターおよび／またはhKLK2エンハンサーの少なくとも一部（すなわち、AREまたはアンドロゲンレセプター結合部位）を含む。本明細書で使用するように、「プロバシン（PB）転写制御エレメント」または「PB-TRE」は、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。これは、hKL K2-TREが機能するのを可能にする、アンドロゲンレセプターを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞）のような宿主細胞中で、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増加させる。従って、PB-TREはアンドロゲンレセプターの結合を担い、そして少なくともPBプロモーターおよび／またはPBエンハンサーの一部（すなわち、AREまたはアンドロゲンレセプター結合部位）を含む。本明細書で使用するように、「前立腺特異的抗原（PSA）転写制御エレメント」または「PSA-TRE」または「PSE-TRE」は、ポリヌクレオチド配列、好ましくは DNA配列である。これは、PSA-TREが機能するのを可能にする、アンドロゲンレセプターを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞）のような宿主細胞中で、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増加させる。従って、PSA-TREはアンドロゲンレセプターの結合を担い、そして少なくともPSAプロモーターおよび／またはPSAエンハンサーの一部（すなわち、AREまたはアンドロゲンレセプター結合部位）を含む。本明細書で使用するように、「癌胎児性（CEA）転写制御エレメント」または「CEA-TRE」は、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。これは、CE A-TREが機能するのを可能にする、CEAを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞）のような宿主細胞中で、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増加させる。CEA-TREはCEA産生細胞に関連する転写因子および／または補因子を担い、そして少なくともCEAプロモーターおよび／またはCEAエンハンサーの一部を含む。本明細書で使用するように、「α-フェトプロテイン（AFP）転写制御エレメント」または「AFP-TRE」は、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。これは、AFP-TREが機能するのを可能にする、AFPを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞）のような宿主細胞中で、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増加させる。AFP-TREはAFP 産生細胞に関連する転写因子および／または補因子を担い、そして少なくともAF Pプロモーターおよび／またはエンハンサーの一部を含む。本明細書で使用するように、「ムチン遺伝子（MUC）転写制御エレメント」または「MUC1-TRE」は、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。それは、MUC1-TREが機能するのを可能にする、MUC1を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞）のような宿主細胞中で、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増加させる。MUC1-TREはアンドロゲンレセプターの結合を担い、そして少なくともMUC1プロモーターおよび／またはエンハンサーの一部を含む。「細胞特異的TRE」は、他の型の細胞の異なる機能と比較して、特異的な型の細胞における優先的な機能である。細胞特異的TREは、腫瘍細胞特異的であり得るか、そうでなくてもよい。本明細書中に使用されるように、用語「標的細胞特異的」とは、アデノウイルスベクターの複製に必須である遺伝子に作動可能に連結されているTRE配列、またはトランスジーンに作動可能に連結されているTRE配列が、標的細胞中で特異的に機能し、その結果、標的細胞中で複製が進行する、またはトランスジーンポリヌクレオチドが標的細胞中で発現されることを意味する。これは、標的細胞中において、作動可能に連結された転写制御配列によって駆動される転写を活性化する転写因子の存在の長所によって生じ、そして非標的細胞中においては生じない。それはまた、通常は非標的細胞中では生じ、そして作動可能に連結された転写制御配列によって駆動される転写を阻害する、転写阻害因子が存在しない長所によってもまた生じる。本明細書中で使用される場合、用語「標的細胞特異的」とは、細胞型特異性、組織特異性、および所定の標的細胞の癌性状態特異性を意図する。後者の場合、正常細胞の癌性状態に対する特異性は、正常な非癌性対応物と比較される。 TREの活性化は、一般的に転写調節因子の存在および／または転写調節インヒビターの非存在に依存する。転写活性化は、当該分野で公知の（そして以下により詳細に記載する）多数の様式で測定され得るが、一般には、mRNA、またはTRE の制御下の（すなわち、作動可能に連結された）コード配列のタンパク質産物の検出および/または定量によって測定される。本明細書中に記載される場合、TRE は多様な長さであり得、そして多様な配列組成であり得る。転写活性化によって、転写は、上記の基底レベルよりも、標的細胞中で、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍増加することが意図される。より好ましくは少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約100倍、さらにより好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400〜約500倍、さらにより好ましくは、少なくとも約1000倍。一般的には、基底レベルは、もしあれば、非標的細胞における活性レベルであるか、または標的細胞タイプにおいて試験した場合、目的のTREを欠損するレポーター構築物の活性レベル（もしあれば）である。 TREの「機能的に保存された」改変体は、別のTREとは異なるが、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写、特に細胞特異的転写活性を増加させる能力を保持したままのTREである。TREにおける差異は、例えば、単一または複数塩基変異、塩基の付加、欠失、挿入および/または改変から生じる線状配列における差異に起因し得る。この差異はまた、糖、および/またはTREの塩基間の連結における差異から生じ得る。 TREの配列中の特定の点変異は、転写因子の結合および遺伝子活性化を減少させることが示されている。当業者は、既知の転写因子結合部位中および周辺の塩基のいくつかの変化が、遺伝子活性化および細胞特異性に否定的な影響を与える可能性が高く、一方転写因子結合に関与しない塩基における変化は、おそらくそのような効果がないことを認識する。特定の変異はまた、TRE活性を上昇させ得る。変化した塩基の効果の試験は、インビボまたはインビトロで、移動度シフトアッセイ、またはTREが機能的である細胞およびTREが機能的でない細胞における、これらの変化を含むベクターのトランスフェクトのような、当該分野で公知の任意の方法によって行われ得る。さらに、当業者は、点変異および欠失が、転写を調節する配列の能力を変えることなく、TRE配列を作製し得ることを認識する。「転写制御下にある」は、当該分野でよく理解されている用語であり、そしてポリヌクレオチド配列、通常はDNA配列の転写が、その配列が転写の調節、促進または阻害のいずれかに寄与するエレメントに対して作動可能に（作動的に）連結していることに依存することを示す。用語「作動可能に連結される」は、機能的な関係にあるポリヌクレオチドエレメントの方向をいう。TREは、TREがコード配列の転写を促進する場合に、コードセグメントに作動可能に連結される。作動可能に連結されるとは、連結されたDN A配列が、一般的に連続し、そしてそこでは２つのタンパク質コード領域が連続し、そして同じリーディングフレームに結合される必要があることを意味する。しかし、エンハンサーは一般的に、プロモーターから数kb離れている場合に機能し、そしてイントロン配列は様々な長さであり得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは連続することなく、作動可能に連結され得る。本明細書で使用される「TREが機能するのを可能にする細胞」、TREの機能が「十分に保存されている」細胞、または「PB-TREが機能的である細胞」は、TREが、プロモーター（TREに含まれていない場合）およびレポーター遺伝子に作動可能に連結された場合、TREに作動可能に連結されていない場合の同じプロモーターおよびレポーター遺伝子の発現と比較した場合に、レポーター遺伝子の発現を少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約２００倍、さらにより好ましくは少なくとも約４００倍〜５００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍増加させる細胞である。発現のレベル（相対的であれ絶対的であれ）を測定する方法は、当該分野で公知であり、そして本明細書に記載される。「標的細胞」は、異種TREが機能することを可能にする任意の細胞である。好ましくは、標的細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。本明細書で使用される「新生物細胞」、「新生物形成」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「ガン」、および「ガン細胞」（交換可能に使用される）は、比較的自律的な増殖を示し、その結果、細胞増殖の制御の顕著な喪失により特徴付けられる、異常な増殖表現型を示す細胞をいう。新生物細胞は、良性または悪性であり得る。本明細書で使用する「アンドロゲンレセプター」（またはAR）は、その機能がアンドロゲンと特異的に結合することであり、そして特異的な結合の結果として、アンドロゲン応答性エレメント（ARE）を認識し、かつそれに結合し、続いてA Rが転写活性を調節可能である、タンパク質をいう。ARは、活性化された場合、細胞アンドロゲン応答性エレメントに結合する核レセプターである。正常細胞において、ARはアンドロゲンによって活性化されるが、非正常細胞（悪性細胞を含む）においては、ARは、アンドロゲン以外のホルモンを含む非アンドロゲン因子によって活性化され得る。用語「アンドロゲンレセプター」は、機能が十分に保存される限りにおいては、アンドロゲンレセプターの変異体形態を包含する。変異体は、機能が十分に保存される限りにおいては、アミノ酸付加、挿入、切断、および欠失を有するアンドロゲンレセプターを包含する。この文脈において、機能的なアンドロゲンレセプターは、アンドロゲンと、そしてアンドロゲンと結合するAREとの両方に結合するものである。「アデノウイルスベクター」または「アデノウイルス性ベクター」（交換可能に使用される）は、当該分野でよく理解されている用語であり、そして一般的に、アデノウイルスゲノムのすべてまたは一部を含むポリヌクレオチド（本明細書で定義する）を含む。本発明の目的のために、アデノウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種TREを含む。この作動可能に連結されたポリヌクレオチドは、アデノウイルス性または異種性であり得る。アデノウイルスの例として、Ad2、Ad5、Ad12、およびAd40が挙げられるが、これらに限定されない。用語「ベクター」「ポリヌクレオチドベクター」「構築物」「ポリヌクレオチド構築物」および「ベクター構築物」は、本明細書で交換可能に使用される。本発明のアデノウイルスベクターは、いくつかの形態のいずれかであり得る。この形態には、裸のDNA、アデノウイルスコート中にカプセル化されたDNA、別のウイルスもしくはウイルス様形態（例えば、単純ヘルペスウイルスおよびAAV ）にパッケージングされたDNA、リポソームにカプセル化されたDNA、ポリリジンと複合体形成したDNA、合成ポリカチオン分子と複合体形成したDNA、トランスフェリンと結合したDNA、免疫学的に分子を「マスク」するため、および／もしくは半減期を増加させるためにPEGのような化合物で複合体形成したDNA、または非ウイルスタンパク質と結合したDNAが含まれるがこれらに限定されない。本発明の目的のために、アデノウイルスベクターは標的細胞内において複製コンピテントである。「異種」は、それが比べられる、残りの実体から遺伝形質的に区別できる実体に由来することを意味する。「異種」TREは、野生型アデノウイルスに関連しない、または野生型アデノウイルスに由来しないものである。異種TREの例は、アルブミンプロモーターまたはエンハンサーならびに、SV40のような、他のウイルスのプロモーターおよびエンハンサーである。好ましい異種TREの例は、本明細書に提供される。「異種遺伝子」または「トランスジーン」は、野生型アデノウイルスに存在しない任意の遺伝子である。好ましくは、トランスジーンはまた、アデノウイルスベクターによる導入前に標的細胞で発現されないか、または存在しない。好ましいトランスジーンの例を、以下に提供する。「内因性」プロモーター、エンハンサー、またはTREは、アデノウイルスにネイティブか、またはアデノウイルス由来である。「複製」および「増殖」は、交換可能に用いられ、そして本発明のアデノウイルスベクターが再生または増殖する能力をいう。この用語は当該分野でよく理解されている。本発明の目的のために、複製はアデノウイルスタンパク質の生成を含み、そして一般的にアデノウイルスの再生を含む。複製は、バーストアッセイまたはプラークアッセイのような、当該分野における、および本明細書に記載される標準的なアッセイを使用して測定され得る。「複製」および「増殖」は、ウイルス製造のプロセスに直接的または間接的に関与する任意の活性（ウイルス遺伝子発現；ウイルスタンパク質、核酸または他の成分の生成；ウイルス成分の完全ウイルスへのパッケージング；および細胞溶解を含むが、これらに限定されない）を含む。「複製に必須な遺伝子」は、その転写が細胞内でベクターの複製に必要とされる遺伝子である。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを言及するために交換可能に用いられる。これらの用語はまた、グルコシル化、アセチル化、およびリン酸化を含む反応を介して翻訳後修飾されるタンパク質を含む。「宿主細胞」は、本発明のアデノウイルスベクターのレシピエントであり得るか、レシピエントであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、そしてその子孫は、由来する親の細胞と、自然に、偶然に、または故意の変異および／または変化によって、必ずしも完全に同一（形態学的にまたは全DNA相補性において）でなくてもよい。宿主細胞は、インビボにおいて、本発明のアデノウイルスベクターによってトランスフェクトまたは感染された細胞を含む。本明細書で使用される「細胞傷害性」は、当該分野に十分理解されている用語であり、そして１つ以上の細胞の通常の生化学的または生物学的機能が異常にさらされる状態（すなわち、阻害されるかまたは上昇する）ことをいう。これらの活性は、代謝、細胞複製、DNA複製、転写、翻訳、および分子の取り込みを含むがこれらに限定されない。「細胞傷害性」は、細胞死および／または細胞溶解を含む。例えば、色素排除、³Hチミジン取り込み、およびプラークアッセイ示すアッセイは当該分野で公知である。本明細書で使用される用語「選択的細胞傷害性」は、TREが機能することを可能にしない細胞または同じTREが機能することにより許容的でない細胞に対して本発明のアデノウイルスベクターによって与えられる細胞傷害性と比較した場合に、本発明のアデノウイルスベクターによってTRE が機能することを可能にする細胞に与えられる細胞傷害性をいう。このような細胞傷害性は、例えば、プラークアッセイ、標的細胞を含む腫瘍のサイズの減少または安定化、あるいは腫瘍細胞に特徴的なマーカーまたは組織特異的なマーカー、例えば前立腺特異的抗原のような、癌マーカーの血清レベルの減少または安定化によって測定され得る。本明細書中で用いられる場合、「細胞傷害性」遺伝子は、細胞におけるその発現が、この遺伝子単独またはアデノウイルス複製と組み合わせてかのいずれかで、細胞における細胞傷害性および/または細胞溶解性活性の程度および/または割合を増強させる遺伝子である。「治療的」遺伝子は、細胞におけるその発現が、所望の結果に関連する遺伝子である。癌の状況では、この所望の結果は、例えば、細胞傷害性、細胞増殖の抑制または遅延、および/または細胞死であり得る。「生物学的サンプル」は、個体から得られる種々のサンプル型を包含し、そして診断的またはモニタリングアッセイにおいて使用され得る。この定義は、血液および他の生物学的起源の液体サンプル、生検検体、または組織培養物のような固形組織サンプルもしくはそれに由来する細胞、およびその子孫を包含する。この定義はまた、試薬による処理、可溶化、またはタンパク質またはポリヌクレオチドのような特定の成分を用いた処置などによるそれらの調達の後に、任意の方法で操作したサンプルを含む。用語「生物学的サンプル」は、臨床サンプルを含み、また、培養中の細胞、細胞懸濁液、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的体液、および組織サンプルを含む。「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、家畜、競技用動物、およびペットを含むが、これらに限定されない。「有効量」は、有益なまたは所望の臨床的結果をもたらすに十分な量である。有効量は、１回以上の投与において投与され得る。本発明の目的のために、アデノウイルスベクターの有効量は、疾患状態の緩和、寛解、安定、回復、進行の遅鈍または遅延するのに十分な量である。本明細書で使用される、「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果は、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状熊の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患の伝播（すなわち、転移）の妨害、疾患の進行の遅延または遅鈍、疾患状態の寛解または緩和、および緩解（部分的または全体的のいずれか）、検出可能かまたは検出不可能かのいずれかを含むがこれに限定されない。「処置」はまた、処置を受けなかった場合に予測される生存と比較した、延長された生存を意味し得る。「マスクされたアデノウイルス」は、親水性ポリマー（「マスキング剤」）で複合体化されたアデノウイルスである。アデノウイルスは、天然に存在するアデノウイルスの単離物、または本特許出願に開示されるような、操作されたアデノウイルスベクターを含む任意のアデノウイルスであり得る。マスキング剤は、好ましくは低免疫原性である。受容可能な親水性ポリマーの例には：ポリエチレン／ポリプロピレンコポリマー、ポリアクリル酸アナログ、セルロースのような糖ポリマー、ポリホルムアルデヒド、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリエチレングリコール（PEG）などが挙げられる。親水性ポリマーは、ウイルスのキャプシドタンパク質、特にヘキソンおよびファイバーキャプシドタンパク質と共有結合的、または非共有結合的に複合化し得る。好ましい親水性ポリマーはPEGであり、そして好ましいマスクされたアデノウイルスは、アデノウイルスに共有結合した PEGである（共有結合でPEG化されたアデノウイルス）。疾患を「緩和する」とは、本発明のアデノウイルスベクターを投与していない場合と比較して、疾患状態の程度および／または所望でない臨床的な徴候が低減されるか、および／または進行の経過が遅延するか、または長くなることを意味する。異種TREを含むアデノウイルスベクター本発明は、異種(すなわち、アデノウイルスではない)TREの転写制御下にある第１のアデノウイルス遺伝子、および少なくとも第２の異種TREの転写制御下にある第２の遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。ここで、この２つの異種TREは、(ヌクレオチド配列において)互いに異なっているが、同じ細胞において機能的である。さらに、少なくとも第１の異種TREは、細胞特異的である。好ましくは、アデノウイルス遺伝子は、細胞傷害性(直接的および/または間接的のいずれかで)寄与し、より好ましくは、細胞死に寄与するおよび/または引き起こし、そしてさらにより好ましくは、第１のアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルス複製に必須である遺伝子である。細胞傷害性に寄与するアデノウイルス遺伝子の例として、アデノウイルス死滅タンパク質遺伝子が挙げられるがこれに限定されない。図表例については、図１を参照のこと。アデノウイルスベクターは、異種TREが機能するのを可能にする標的細胞の増殖について選択的に(すなわち、優先的に)複製コンピテントであり、これらの細胞は、アデノウイルス増殖の細胞傷害性効果および/または細胞溶解効果を優先的に受けやすい。好ましくは、標的細胞は、新生物細胞であるが、この細胞傷害性活性を維持することが所望されるおよび/またはこれが認容される任意の細胞が標的細胞であり得る。インビトロまたはインビボで、アデノウイルスベクターを、標的細胞と非標的細胞との混合物と合わせることによって、アデノウイルスベクターは、標的細胞中で優先的に複製する。一旦標的細胞が、選択的な細胞傷害性複製および/または細胞溶解性複製に起因して破壊されると、アデノウイルスベクター複製は、有意に減少し、温度感受性感染(runaway infection)および所望でないバイスタンダー効果(bystander effect)を減少させる。インビトロ培養は、標的細胞(例えば、細胞特異的TREが機能している癌細胞)の出現(すなわち、存在)および/または再発について混合物(例えば、生検または他の適切な生物学的サンプルのような)を連続的にモニターするために維持し得る。さらに細胞傷害性を確実にするために、細胞傷害性効果を有する１つ以上のトランスジーンがまた存在し、そして異種TREの選択的転写制御下にあり得る。さらに、またはあるいは、細胞傷害性および/または細胞死(例えば、アデノウイルス死滅タンパク質(ADP)遺伝子)に寄与するアデノウイルス遺伝子は、異種TREの選択的転写制御下にないか、またはその制御下にあるかのいずれかでアデノウイルスベクターに含まれ得る。これらの実施態様において、標的細胞を破壊するより高い確信を提供し得る。１つの実施態様において、本発明は、異種の細胞特異的TREの転写制御下の複製に必須のアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。ここで、TREは、標的細胞におけるこの遺伝子の発現を選択的に調節する。さらに、このアデノウイルスベクターは、第２の異種TREの転写制御下にある第２の遺伝子を含み、ここで、この第１および第２の異種TREは、同じ細胞において機能的であり、そしてこのTREは、互いに異なっている。細胞、または組織特異的な転写調節エレメントは、当該分野で周知である。TR Eは、単一の遺伝子または異なる遺伝子の転写調節配列に由来し、そして機能的T REを産生するために組み合わされ得る。細胞特異的TREは、限定された細胞集団( または型)、例えば、前立腺細胞または肝臓細胞において優先的に機能的である。当該分野で公知のように、TREの活性は、誘導性であり得る。誘導性TREは、一般的に、誘導因子の非存在下で低い活性を示し、そして誘導因子の存在下ではアップレギュレートされる。誘導性TREは、発現が特定の時間でまたは特定の位置でのみ所望される場合、または誘導薬剤を用いて発現のレベルを力価測定することが所望される場合、好ましくあり得る。例えば、PSE-TRE、PB-TREおよびhKLK2 -TRE由来の転写活性は、本明細書中に記載されるように、アンドロゲンによって誘導可能である。従って、１つの実施態様において、アデノウイルスベクターの異種TREは、誘導性である。記載のように、TREはまたマルチマーを含み得る。例えば、TREは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの一連のタンデムなプロモーターフラグメントを含み得る。あるいは、TREは、１つ以上のエンハンサー領域とともに１つ以上のプロモーター領域を有し得る。これらのマルチマーはまた、異なる遺伝子由来のプロモーター配列および/またはエンハンサー配列を含み得る。さらに、TREのプロモーターおよびエンハンサー成分は、所望の細胞特異的転写活性が得られる限り、目的のコード領域配列から任意の方向および/ または距離にあり得る。本発明に用いられるTREは、サイレンサーを欠失していてもよいし、欠失していなくともよい。サイレンサーの存在(すなわち、当該分野で公知のネガティブ調節エレメント)は、非許容的な細胞における転写(従って、複製)の停止を補助し得る。従って、サイレンサーの存在は、非標的細胞におけるアデノウイルスベクター複製をより効率的に妨げることによって細胞特異的複製の増強を付与し得る。あるいは、サイレンサーの欠失は、標的細胞における複製を行うことを補助し得る。従って、標的細胞におけるより効率的な複製に起因する細胞特異的複製の増加を付与し得る。本発明のアデノウイルスベクターにおける使用の場合、異種TREは、互いに異なるポリヌクレオチド配列を有する。従って、所定のアデノウイルスベクターにおいて、２つの異種TREの間の配列同一性は、約95％より小さく、好ましくは約9 0％より小さく、より好ましくは約85％より小さく、より好ましくは80％より小さく、さらにより好ましくは約75％より小さい。配列同一性が異なるにもかかわらず、所定のアデノウイルスベクターの異種TREは、同じ細胞において機能的である。この差異は、例えば、単一の遺伝子に由来するTREの配列の変化から生じ得る。当該分野で標準的な方法を用い、および/または増殖の過程の間に配列を変化させてこのようなTREを生成することが可能である。差異はまた、異なる遺伝子に由来するTREから生じ得る。当業者によって容易に理解されるように、TREは、ポリヌクレオチド配列であり、そして種々の配列置換にかかわらず機能を示し得るようなポリヌクレオチド配列である。ヌクレオチド置換、付加、および欠失の方法は、当該分野で公知であり、そして容易に利用間能な機能的アッセイ(例えば、CATアッセイまたはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ)は、当業者によって、配列改変体が、必須の細胞特異的転写機能を示すか否かを決定することを可能にする。それゆえ、TREの機能的に保存された改変体もまた用いられ得、これは、核酸の置換、付加、および/または欠失を含む。従って、TREの改変体は、標的細胞における機能を維持していなければならないが、最大の機能である必要はない。特定の塩基修飾は、発現レベルおよび/または細胞特異性の増強を生じる可能性がある。TRE内の核酸配列欠失または付加は、当該分野で公知のように、それらが転写調節タンパク質結合部位を近接させすぎるかまたは遠くにしすぎるか、またはそれらを、それらがDNAらせんの反対側にあるように回転させ得る場合、転写を減少もしく増加させ得る。従って、本発明者らは、１つの理論に束縛されることは望まないが、特定の修飾は、得られる発現レベルの調節を生じ得、これは、細胞特異的発現レベルの増加を含む。増加した発現レベルの達成は、新生物増殖のより攻撃的な形態の場合に特に所望され得るか、またはより迅速なおよび /または攻撃的な細胞殺傷のパターンが保証される場合(例えば、個体の免疫無防備状態に起因する)に所望される。転写活性(減少または増強を含む)は、当該分野で公知の多くの方法(以下で、より詳細に記載される)で測定され得るが、一般的には、mRNAもしくはTREの制御下(すなわち、作動可能に連結された)にあるコード配列のタンパク質産物の検出および/または定量によって測定される。本明細書中で議論されるように、TREは、種々の長さおよび種々の配列組成であり得る。転写活性によって、エンハンサーの存在に起因する転写は、標的細胞における基礎レベル(すなわち、プロモーター単独；エンハンサーを欠く)を、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約100倍、より好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400倍〜500倍、さらにより好ましくは少なくとも約1000倍を超えて増加されることが意図される。基礎レベルは、一般的に非標的細胞(もしあれば)における活性のレベルであり、または非標的細胞で試験されたようにTREを欠くレポーター構築物(もしあれば) の活性レベルである。 TREの最大の転写活性化活性は、所望の結果を達成するために常に必要とされ得るわけではない。TREのフラグメントによって与えられた誘導レベルは、所望の結果を達成するための特定の適用において十分であり得る。例えば、疾患状態の処置または緩和のために使用される場合、最大未満の応答性は、例えば、標的細胞が特に病原性ではないか、および/または疾患の程度が比較的限定されている場合に、所望の結果に十分であり得る。異種TREのサイズは、アデノウイルスベクターの能力によって部分的に決定され、これは、次いで、ベクターの意図された形態に依存する（下記を参照のこと）。一般的に最小のサイズが好ましい。なぜなら、これは、トランスジーン(下記で議論される)または他のさらなる調節配列のような所望され得る他の配列の挿入のための潜在的な空間を提供するからである。しかし、さらなる配列が意図される場合、または例えば、任意のウイルスパッケージ束縛を含まないアデノウイルスベクターが維持されて送達される場合、より大きなDNA配列が、得られるアデノウイルスベクターが、複製コンピテントである限り用いられ得る。アデノウイルス配列が欠失しない場合、アデノウイルスベクターは、ゲノムサイズの約５％まで、または約1.8kbの余分な配列とともにパッケージングされ得る。必須ではない配列がアデノウイルスゲノムから除去された場合、さらなる4. 6kbのインサートが許容され得る(すなわち、約1.8kbおよび約4.6kbの合計であり、これは約6.4kbである)。欠失され得る必須ではないアデノウイルス配列の例は、E3およびE4(E4のORF6が維持される限り)である。非特異的複製を最小にするために、内因性(すなわち、アデノウイルス)TREは、好ましくは除去されるべきである。これはまた、アデノウイルスベクターにおけるインサートのためのより多くの空間を提供し得る。これは、アデノウイルスベクターがウイルスとしてパッケージングされた場合、特に重要である(下記を参照のこと)。さらにより重要なことには、内因性TREの欠失によって、組換え事象の可能性が妨げられ、これによって異種TREが欠失し、そして内因性TREによって、その個々のアデノウイルスコード配列の制御下の転写制御となる(従って非特異的複製を可能にする)。１つの実施態様において、本発明のアデノウイルスベクターが構築されて、その結果、アデノウイルス遺伝子の内因性転写制御配列が欠失され、そして異種TREで置換される。しかし、内因性TREは、十分な細胞特異的複製優先が保存されるという条件で、アデノウイルスベクター中で維持され得る。これらの実施態様は、内因性TREと複製遺伝子コードセグメントとの間に介在する異種TREを提供することによって構築され得る。必須の細胞特異的複製優先は、異種TREが機能するのを可能にする細胞におけるアデノウイルスベクターの複製を、異種TREを機能させない細胞におけるアデノウイルスベクターの複製と比較するアッセイを行うことによって示される。一般的に、複製は、標的細胞における基礎レベルを、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約10 0倍、より好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約40 0〜約500倍、さらにより好ましくは少なくとも約1000倍超えて増加され得る。受容可能な差異は、経験的に(例えば、ノーザンアッセイまたは当該分野で公知の他の方法を用いて)決定され得、そしてアデノウイルスベクターの予測される使用および/または所望の結果に依存する。（ａ）例示的な異種TRE 細胞または組織特異的な転写調節エレメントは、当該分野で周知である。このようなエレメントを同定する方法もまた、当該分野で周知である。以下に提供されるこの細胞特異的TREは、例示であり、本発明発明を限定することを意図しない。１つの実施態様において、本発明は、異種TREが前立腺細胞特異的であるアデノウイルスベクターを含む。例えば、前立腺細胞で優先的に機能しかつ前立腺新生物に対するアデノウイルス複製を標的にするために本発明において使用され得るTREは、前立腺特異的抗原遺伝子(PSA-TRE)、腺性カリクレイン-1遺伝子(ヒト遺伝子であるhKLK2-TRE由来)、およびプロバシン遺伝子（PB-TRE）に由来するTR Eが挙げられるがこれらに限定されない。これらの遺伝子３つ全ては、前立腺細胞で優先的に発現され、そしてこの発現はアンドロゲン誘導性である。一般的に、アンドロゲン誘導に応答する遺伝子の発現は、アンドロゲンレセプター(AR)の存在を必要とする。 PSAは、正常、肥大、および悪性前立腺上皮により排他的に合成される；従って、その組織特異的発現は、それを良性の前立腺過形成(BPH)および前立腺癌腫( CaP)のための優れた生物マーカーにする。正常なPSAの血清レベルは、代表的には、5ng/ml未満であり、上昇したレベルは、BPHまたはCaPの指標である。Lundwa llら(1987)、FEBS Lett．214:317；Lundwall(1989)Blochem．Biophys．Res．Com m．161:l151；およびRiegmannら(1991)Molec．Endocrin．5:1921。アンドロゲン依存性の細胞特異性を提供するために用いられるPSA遺伝子の領域は、とくに前立腺細胞において、約6.0キロベースを含む。Schuurら(1996)J． Biol．Chem．271:7043-7051。ヒトにおける約1.5kbのエンハンサー領域は、PSA 遺伝子の転写開始部位に対して、nt-5322からnt-3739の間に位置する。PSAプロモーターは、転写開始部位に対して、約nt-540からnt+8までの配列からなる。これらの２つの遺伝子エレメントに並置して、十分に機能的な、最小の前立腺特異的エンハンサー/プロモーター(PSE)TREを生じる。PSA遺伝子の約6.0kb領域の他の部分は、必須の機能が維持されている限り、本発明において用いられ得る。 (配列番号１)に示したPSEおよびPSA TREは、GenBank受託番号第U37672号に与えられたものと同じであり、そして公開されている。Schuurら(1996)。改変体PS A-TREヌクレオチド配列は、（配列番号２）に示される。これは、CN706クローン 35.190.13.内に含まれるPSA-TREである。CN706は、Ad5中のE1A遺伝子が、PSA-TR Eの転写制御下にあるアデノウイルスベクターである。CN706は、PSA発現細胞に対してインビトロおよびインビボで、選択的細胞傷害性を示す。Rodriguezら(19 97)。CN706は、293細胞およびLNCaP細胞を介して継代させた。35.190.13と称されたクローンが単離された。このクローンの構築は、PCR、制限エンドヌクレアーゼ消化、およびサザンブロッティングによって確認された。CN706クローン35. 190.13の両方のDNA鎖は、１位および3537位の間で配列決定された。７固の単一の塩基対変化が、Schuurら(1996)によって報告される配列と比較して、PSEにおいて見出された。これらの点変異は、ARE中にはなく、従って、エンハンサーの機能に影響しないようである。１つの変異が、PSAプロモーター領域中で見出されたが、このプロモーターからの遺伝子発現に影響しないようである。これらの変異に加えて、ミスセンス変異は、E1Aの第１のエキソンで見出された。3032位でのこのＣからＧへの転移が、E1Aタンパク質配列におけるGluからArgへの変化を生じる。この変異は、E1A機能を減少させないようである。ヒト腺カリクレイン(hKLK2、hK2タンパク質をコードする)は、前立腺において排他的に発現され、そしてその発現は、主に転写活性化によってアンドロゲンによりアップレギュレートされる。Wolfら(1992)Molec．Endocrinol．6:753-762。 Morris(1989)Clin．Exp．Pharm．Physiol．16:345-351；Quiら(1990)J．Urol． 144:1550-1556;Youngら(1992)Biochem．31:818-824。種々の腫瘍および前立腺癌を有する患者の血清で見出されるhK2のレベルは、PSAのレベルとは実質的に異なっており、そしてhK2抗原は、前立腺癌の有意なマーカーであり得ることを示す。PSAに対して異なる相対的割合の循環性hK2が、前立腺癌を有する患者の血清で検出された。Charlesworthら(1997)Urology 49.487-493。hK2の発現は、257例の根本的に前立腺切除した、分析された検体の各々において検出された。Darsonら (1997)Urology 49:857-862。hK2発現の強度および程度は、特異的抗体を用いて検出され、良性の上皮細胞から高度な前立腺上皮内(intraepithelial)細胞(PIN) および腺癌まで増加した。それに対して、PSAおよび前立腺酸性ホスファターゼは、逆パターンの免疫反応性を提示した。Darsonら(1997)。事実、特定の割合の PSAネガティブ腫瘍が検出可能なhK2を有することが報告されている。Tremblayら (1997)Am．J．Pathol．150.455-459。 hKLK2 5'プロモーターの活性は、以前に記載され、そして転写開始部位に対して-2256位までの領域は、以前に開示されていた。Schedilchら(1987)DNA 6:429- 437。hKLK2プロモーターは、アンドロゲン応答性であり、そしてこのプロモーターが単独でレポーター遺伝子の発現を制御するプラスミド構築物では、このレポーター遺伝子の発現は、アンドロゲンの存在下で約10倍増加される。Murthaら（ 1993）Biochem．32:6459-6464。hKLK2エンハンサー活性は、転写開始部位(配列番号３に示される)に対してポリヌクレオチド配列の約nt-12,014〜nt-2257内に見出される。そしてこの配列が、hKLK2プロモーターおよびレポーター遺伝子に作動可能に連結される場合、前立腺細胞において作動可能に連結された配列の転写は、アンドロゲンの非存在下の転写レベルを超えて約30〜約100倍のレベルでアンドロゲンの存在下で増加する。この誘導は、一般的に、配向非依存性でかつ位置非依存性である。エンハンサー活性はまた、以下の領域(全て転写開始部位に対する)において実証された：約nt-3993〜約nt-3643(配列番号３のnt8021〜83 71)、約nt-4814〜約nt-3643(配列番号３のnt7200〜8371)、約nt-5155〜約nt-338 7(配列番号３のnt6859〜8627)、約nt-6083〜約nt-2394(配列番号３のnt5976〜96 20)。従って、hKLK2エンハンサーは、hKLK2転写調節エレメント(hKLK2-TRE)を形成するために、hKLK2プロモーターまたは異種プロモーターに作動可能に連結され得る。次いで、hKLK2-TREは、連結した遺伝子にhKLK2-TRE特異的転写調節を与え、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結され得、従ってその発現を増加する。ラットプロバシン（PB）遺伝子は、核および分泌タンパク質、プロバシン(これは背外側前立腺においてのみ発現される)をコードする。Doddら(1983)J.Blol. Chem.258:10731-10737;Matusikら(1986)Biochem.Cell.Biol.64:601-607;およびS weetlandら（1988）Mol.Cell.Biochem.84:3-15。マウス前立腺の背外側葉は、ヒト前立腺の末梢領域に最も相同であると考えられ、およそヒト前立腺癌の６８％が起こると考えられる。 PB-TREは、(配列番号４)に記載した転写開始部位と比較してヌクレオチドの約 -426位〜約+28位のプロバシンコード配列の上流の配列のおよそ０．５kbフラグメントに示されている。PB遺伝子由来のこの最短プロモーター配列は、トランスジェニックマウスにおいて前立腺に特異的に作動可能に連結された異種遺伝子の発生およびホルモン調節発現を指向する十分な情報を提供するようである。Gree nbergら(1994)Mol.Endocrinol.8:230-239。従って、本明細書に記載したものを含むが、限定されない前立腺細胞特異的TR E由来のTREは、ARを発現する細胞、特に前立腺新生物由来細胞のようなTREが機能的である細胞において、優先的に複製する安定なアデノウイルスベクターを生産するために、本発明において使用され得る。従って、および例示の目的で、本発明は、上述したように、第１の異種TREがPSA-TRE(例えばPSE-TRE)でありかつ第２の異種TREがPB-TREであり、第１の異種TREがPB-TREでありかつ第２の異種TR EがPSA-TRE(例えばPSE-TRE)であり、第１の異種TREがhKLK2-TREでありかつ第２の異種TREがPSA-TRE(例えばPSE-TRE)であり、第１の異種TREがPSA-TRE(例えばPS E-TRE)でありかつ第２の異種TREがhKLK2-TREであり、第１の異種TREがhKLK2-TRE でありかつ第２の異種TREがPB-TREであり、第１の異種TREがPB-TREでありかつ第２の異種TREがhKLK2-TREであるアデノウイルスベクターを含む。実施例1-4、図２を参照のこと。本発明において、特定の標的細胞に指向された複製-コンピテントアデノウイルスベクターはまた、標的腫瘍細胞において、優先的に機能的なTREを使用して産生され得る。脛瘍細胞特異的異種TREに限定しない例、およびそれぞれの潜在的な標的細胞に限定しない例は、以下の遺伝子由来のTREを含む：α-フェトプロテイン(AFP)(肝癌)、ムチン様糖タンパク質DF3(MUC1)(乳癌)、癌胎児性抗原(CEA )(結腸直腸、胃、膵臓、乳房、および肺癌)、プラスミノーゲン活性化因子ウロキナーゼ(uPA)およびそのレセプター遺伝子(乳房、大腸、および肝癌)、E2F1(細胞周期S-期特異的プロモーター)(分裂網膜芽細胞腫遺伝子機能を伴う腫瘍)、HER -2/neu(c-erbB2/neu)(乳房、卵巣、胃、および肺癌)。本発明において、肺瘍特異的TREは、以下の模範的な遺伝子(TREが特異的に機能的である組織は、括弧内にある)由来の組織特異的TREとの結合に使用され得る：低酸素応答エレメント、血管内皮成長因子レセプター(内皮細胞)、アルブミン (肝臓)、第７因子(肝臓)、脂肪酸シンターゼ(肝臓),Von Willebrand因子(脳内皮細胞)、α-アクチンおよびミオシン重鎖(平滑筋において両方)、synthetast I( 小腸)、Na-K-Clトランスポーター(腎臓)。さらなる組織特異的TREは、当該分野において公知である。従って、１つの実施態様において、細胞特異的な異種TREは、腫瘍細胞特異的である。好ましくは、異種TREの両方は、同じ細胞において腫瘍細胞特異的であり、および機能的である。別の実施態様において、第１の異種TREの１つは、腫瘍細胞特異的であり、および第２の異種TREは、組織特異的であり、それによってTREの両方は、同じ細胞において機能的である。 AFPは、その発現レベルが、組織および発生段階に依存して大きく変化するが、その発現が最初に内皮性起源（卵黄嚢、胎児肝臓、および腸）の発達中の組織を制限する癌胎児性のタンパク質である。AFPは、高レベルのAFPが進行した疾患を有する患者において見られる肝癌患者の多数においてAFPの血清濃度が上昇するので臨床目的のためである。患者における血清AFPレベルは、肝細胞癌においてはAFP発現によって制御されるようであるが、正常肝臓周囲では調節されないようである。従って、AFP遺伝子は、肝癌の細胞特異的発現を調節するようである。 AFP遺伝子由来の細胞特異的TREは、同定されている。例えば、ヒトAFP特異的エンハンサー活性のクローニングおよび特徴付けは、Watanabeら、(1987)J.Biol .Chem.262:4812-4818に記載される。全体5’AFP隣接領域(プロモーター、推定サイレンサー、およびエンハンサーエレメントを含む)は、転写開始部位（配列番号５）よりおよそ5kb上流中に含まれる。ヒトのAFPエンハンサー領域は、AFP遺伝子の転写開始部位に関連して、ヌクレオチド約-3954位および約-3335位との間に位置する。ヒトAFPプロモーターは、ヌクレオチドの約-174位〜約+29位の領域を含む。配列番号６に示したように、これらの２つの遺伝学的エレメントが近位にあると、十分に機能的なAFP-TREが得られる。Idoら(1995)は、HCCにおいて特異的である259bpプロモーターフラグメント（ヌクレオチド-230位〜+29位）を記載する。Cancer Res.55:3105-3109。 AFPエンハンサーは、転写開始位置に関連して、AおよびBを示す２つの領域を含み、ヌクレオチド-3954位および-3335位の間に位置する。プロモーター領域は、典型的なTATAボックスおよびCAATボックスを含む。好ましくは、AFP-TREは、少なくとも１つのエンハンサー領域を含む。より好ましくは、AFP-TREは、両方のエンハンサー領域を含む。 AFP-TREを含むアデノウイルスベクターに適切な標的細胞は、AFP-TREが機能することを可能にする任意の細胞型である。好ましくは、AFPを発現するか、または産生する細胞であり、AFPを発現する腫瘍細胞を含むがそれには限定されない。このような細胞の例は、肝癌細胞、生殖腺および他の生殖細胞腫瘍（特に内皮洞腫瘍）、脳肺瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓の腺房細胞癌（Kawamotoら、(1992) Hepatogastroenterology 39:282-286）、原発性胆汁膀胱腫瘍（Katsuragiら、(1 989)Rinsko Hoshasen 34:371-374）、子宮内膜腺癌細胞（Koyamaら、(1996)Jpn. J.Cancer Res.87:612-617）、および前述の任意の転移（肺、副腎、骨髄、および／または脾臓に生じ得る）である。ある場合において、特定の膵臓および胃癌から肝臓への転移性の疾患は、AFPを産生する。特に好ましくは、肝癌細胞および任意のそれらの転移したものである。AFP産生は、AFPタンパク質産生レベルを測定するRIA、ELISAまたはウェスタンブロット（イムノアッセイ）またはAFP mR NA産生レベルを測定するノーザンブロットのような当該分野で標準のアッセイを使用して測定され得る。あるいは、このような細胞は、転写的にAFP-TREを活性化する能力（すなわち、AFP-TREが機能することを可能にする）によって同定し、および／または特徴付けられ得る。タンパク質ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターは（uPA）およびその細胞表面レセプター、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター(uPAR)は、多くの最も頻繁に生じる新生物において発現され、および癌転移において重要なタンパク質を示すようである。両タンパク質は、乳房、大腸、前立腺、肝臓、腎臓、肺および卵巣癌に関係する。uPAおよびuPAR転写を調節する転写調節エレメントは、広く研究されている。Riccioら、(1985)Nucleic Acids Re s.13:2759-2771;Cannloら、(1991)Nucleic Acids Res.19:2303-2308。従って、本明細書に記載したものに含まれるが、それには限定されない細胞特異的TREは、本発明において肝臓新生物由来の細胞のようなTREが機能的である細胞において優先的に複製する安定なアデノウイルスベクターを産生するために使用され得る。１つの実施態様において、本発明は、少なくとも１つの異種TREが肝臓細胞特異的であるアデノウイルスベクターを含む。従って、そして例示の目的で、本発明は、上述したように、第１の異種TREがAFP-TREでありかつ第２の異種TREがuPA-TREであり、第１の異種TREがuPA-TREでありかつ第２の異種TREがAFP -TREであり、第１の異種TREがAFP-TREでありかつ第２の異種TREがアルブミン-TR Eであり、第１の異種TREがアルブミン-TREでありかつ第２の異種TREがAFP-TREであるアデノウイルスベクターを含む。 CEAは、直腸結腸、胃部（胃）および膵臓癌のような消化管の内皮由来の新生物、ならびに乳房および肺癌のような他の腺癌に存在する180,000ダルトンの糖タンパク質腫瘍関連抗原である。CEAは、循環するCEAが、CEA陽性腫瘍を有する患者の大多数において検出され得るので臨床目的のためである。肺癌において、全症例の約50％はCEAが循環し、しばしば腺癌において検出される、高濃度のCEA (20ng/mlより多く)を伴う。胃癌を有する患者の約50％は、CEAについて血清学的に陽性である。 CEA遺伝子の5'上流隣接配列は、細胞特異的活性を与えることが示されている。CEAプロモーター領域(遺伝子の5'隣接領域の翻訳開始部位の最初の約424ヌクレオチド上流)は、領域が非産生HeLa細胞におけるプロモーター活性よりも高いプロモーター活性をCEA産生細胞において提供する場合、細胞特異的活性を与えることが示された。Schreweら（1990）Mol．Cell．Biol．10:2738-2748。さらに、細胞特異的エンハンサー領域が見出されている。WO/95/14100。全5'CEA隣接領域 (プロモーター、推定サイレンサー、およびエンハンサーエレメントを含む)は、転写開始部位から約14.5kb上流内に含まれると思われる。Richardsら(1995);WO 95/14100。Richardsら(1995)によるCEA遺伝子の5'隣接領域のさらなる特徴付けは、CEA産生LoVoおよびSW1463細胞でのレポーター構築物の高レベルおよび選択的発現を生じるマルチマー化プロモーターに連結された場合、２つの上流領域(- 13.6〜-10.7kbまたは-6.1〜-4.0kb)を示した。Richardら(1995)はまた、発現に必須である領域ヌクレオチド-41位〜ヌクレオチド-18位を有するプロモーター領域を転写開始部位に関連して、ヌクレオチド-90位およびヌクレオチド+69位に局在化した。WO95/1400は、一連の5'隣接CEAフラグメントを記載し、これは細胞特異的活性を与え、例えば、ヌクレオチド-299位〜約ヌクレオチド+69位；約ヌクレオチド-90位〜約ヌクレオチド+69位；ヌクレオチド-14,500位〜ヌクレオチド- 10,600位；ヌクレオチド-13,600位〜ヌクレオチド-10,600位、ヌクレオチド-610 0位〜ヌクレオチド-3800位である。さらに、細胞特異的転写活性は、(配列番号７)に示されたヌクレオチド-402位からヌクレオチド+69位までのCEAフラグメントにより動作可能に連結された遺伝子に与えられる。本発明で用いられる任意の CEA-TREは哺乳動物細胞由来であり、ヒト細胞を含むがこれに限定されない。従って、任意のCEA-TREが、必須の所望される機能性がアデノウイルスベクターで示される限りは、本発明で用いられ得る。CEA配列のクローニングおよび特徴付けは文献に記載されており、従って、本発明の実行のために利用可能であり、そして本明細書中で詳細を記載する必要はない。 MUC1遺伝子のタンパク質産物(ムチンもしくはMUC1タンパク質；エピシアリン( episialin)；多型上皮ムチンもしくはPEM；EMA；DF3抗原；NPGP；PAS-O；または CA15.3抗原として公知である)は、通常、胃、膵臓、肺、気管、腎臓、子宮、唾液腺、および乳腺の腺または管で裏打ちされた上皮細胞の頂端表面において主に発現される。Zotterら(1988)Cancer Rev．11-12:55-101；およびGirlingら（198 9）Int．J．Cancer 43：1072-1076。しかし、ムチンは75〜90%のヒト乳癌において過剰発現される。Kufeら（1984）Hybridoma 3:223-232。総説については、Hil kens（1988）Cancer Rev．11-12:25-54；およびTaylor-Papadimitriou ら（1990）J．Nucl．Med．Allied Sci．34:144-150を参照のこと。ムチンタンパク質発現は、乳癌分化の程度と相関する。Lundyら（1985）Breast Cancer Res． Treat．5:269-276。この過剰発現は、転写レベルで制御されると思われる。ヒト乳癌細胞MCF-7およびZR-75-1におけるMUC1遺伝子の過剰発現は、転写レベルで調節されると思われる。Kufeら(1984);Kovarik（1993）J．Biol．Chem．268 :9917-9926；およびAbeら（1990）J．Cell．Physiol．143．226-231。MUC1遺伝子の調節配列は、クローニングされており、これは転写開始部位の約0.9kb上流を含み、この転写開始部位は細胞特異的転写に関与すると思われるTREを含み、この配列は配列番号８に示される。Abeら（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:282-286；Kovarikら(1993)；およびKovarikら（1996）J．Biol．Chem．271:1 8140-18147。本発明で用いられる任意のMUC1-TREは哺乳動物細胞由来であり、これはヒト細胞を含むがこれに限定されない。好ましくは、MUC1-TREはヒトである。１つの実施態様において、MUC1-TREは、全0.9kbのMUC1遺伝子の5'隣接配列を含み得る。他の実施態様において、MUC1-TREは(MUC1遺伝子の転写開始部位に関連して)以下の配列を含む：約ヌクレオチド-725位〜約ヌクレオチド+31位、ヌクレオチド-74 3位〜約ヌクレオチド+33位、ヌクレオチド-750位〜約ヌクレオチド+33位、およびヌクレオチド-598位〜約ヌクレオチド+485位（プロモーターに動作可能に連結される）。 c-erbB2/neu遺伝子（HER-2/neuまたはHER）は、形質転換遺伝子であり、185kD の上皮成長因子レセプター関連膜貫通糖タンパク質をコードする。ヒトでは、c- erbB2/neuタンパク質は胎児発育の間に発現されるが、大人では、このタンパク質は多くの正常組織の上皮において、(免疫組織化学によって)微弱に検出可能である。c-erbB2/neu遺伝子の増幅および/または過剰発現は、多くのヒトの癌(乳癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌および肺癌を含む)と関連づけられている。c-erbB2/neuタンパク質過剰発現の臨床的重要性は、乳癌および卵巣癌において研究されている。c-erbB2/neuタンパク質過剰発現は、乳房の管内癌の20〜40 ％および卵巣癌の30％に発生し、そして両方の疾患のサブカテゴリーにおける予後不良に関連づけられる。ヒト、ラットおよびマウスのc-erbB2/neuTREは同定され、そしてc-erbB2/neu発現細胞特異的活性を与えることが示されている。Talら（19 87）Mol．Cell．Biol．7.2597-2601；Hudsonら（1990）J．Biol．Chem．265:438 9-4393；Grooteclaesら（1994）Cnacer Res．54:4193-4199；Ishiiら（1987）Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 84:4374-4378；Scottら（1994）J．Biol．Chem．269 :19848-19858。従って、乳房細胞特異的TREに由来するTRE(本明細書中に記載の物を含むがこれに限定されない)は、細胞において優先的に複製する安定なアデノウイルスベクターを産生するために、本発明において用いられ得、この細胞においてTREは機能性であり、特に乳房新生物形成に由来する細胞である。１つの実施態様において、本発明は、異種TREが乳房細胞特異的であるアデノウイルスベクターを包含する。従って、および例示の目的で、本発明はアデノウイルスベクターを包含し、上記のように、ここで第１の異種TREがCEA-TREでありかつ第２の異種TREがM UC1-TREであり、ここで第１の異種TREがMUC1-TREでありかつ第２の異種TREがCEA -TREであり、ここで第１の異種TREがMUC1-TREでありかつ第２の異種TREがHER-TR Eであり、ここで第１の異種TREがHER-TREでありかつ第２の異種TREがMUC1-TREであり、ここで第１の異種TREがMUC1-TREでありかつ第２の異種TREがuPA-TREであり、ここで第１の異種TREがuPA-TREでありかつ第２の異種TREがMUC1-TREであり、ここで第１の異種TREがuPA-TREでありかつ第２の異種TREがHER-TREであり、ここで第１の異種TREがHER-TREでありかつ第２の異種TREがuPA-TREである。従って、結腸細胞特異的TRE由来のTRE(本明細書中に記載されるものを含むがこれらに限定されない)は、細胞において優先的に複製する安定なアデノウイルスベクターを産生するために本発明において用いられ得、この細胞においてTRE は機能性であり、特に結腸新生物形成由来の細胞である。１つの実施態様において、本発明は異種TREが結腸細胞特異的であるアデノウイルスベクターを包含する。従って、および例示の目的で、本発明はアデノウイルスベクターを包含し、上記のように、ここで第１の異種TREがCEA-TREでありかつ第２の異種TREがuPA-T REであり、ここで第１の異種TREがuPA-TREでありかつ第２の異種TREがCEA-TREである。上記のように、いくつかの例示的なTREは、１種より多くの細胞型に特異的であり、従って、１種より多くの型の新生物形成に特異的である。従って、上記で例示したような本発明のアデノウイルスベクターは、本明細書中で提供される情報によって決定され得るので、１種より多くの型の新生物の処置において有用であり得る。上に列挙されたTREは、本発明において機能するTREの非制限的例として提供される。これは疑わしいTREの細胞特異性を同定しそして試験するための方法として、さらなる細胞特異的TREは当該分野で公知である。さらに、そして上記のように、本発明はTREが異なる遺伝子に由来することを必要としない。TRE配列が十分に異なり、かつ必須の機能性が提示される限り、異なるTREは同じ遺伝子に由来し得る。例えば、TRE活性は以下のように決定され得る。TREポリヌクレオチド配列またはこのような配列のセットが当該分野で公知の方法(例えば、化学合成、部位特異的変異誘発、PCR、および/または組換え法)を用いて産生され得る。試験されるべき配列は、プロモーターを含むベクター(プロモーターエレメントがTREに存在しない場合)およびレポータータンパク質(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β-ガラクトシダーゼ(lacZ遺伝子によりコードされる)、ルシフェラーゼ(luc遺伝子によりコードされる)、アルカリホスファターゼ、グリーン蛍光タンパク質、および西洋ワサビペルオキシダーゼを含むが、これらに限定されない)をコードする適切なレポーター遺伝子に挿入され得る。このようなベクターおよびアッセイは、とりわけ商業的供給源から容易に入手可能である。このように構築されたプラスミドは、当該分野で公知のトランスフェクション法(例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、リポソーム(リポフェクション)およびDEAEデキストラン)を用いて、推定TREによって制御されるようなレポーター遺伝子の発現についての試験に適した宿主細胞内にトランスフェクトされる。適切な条件下でのTREレポーター遺伝子構築物の宿主細胞への導入の後、TRE活性は、レポーター遺伝子由来mRNAまたはタンパク質産物の検出および/または定量によって測定され得る。レポーター遺伝子タンパク質は、直接的に(例えば、免疫化学的に)、またはその酵素活性を介して、たとえあるとしても、適切な基質を用いて検出され得る。一般的に、TREの細胞特異的活性を決定するために、T REレポーター遺伝子構築物は、様々な細胞型に導入される。TRE活性量は、各細胞型において決定され、そしてTREを含まないレポーター遺伝子構築物の活性量と比較される。TREが異なる細胞型を超えて特異的細胞型において優先的に機能性である場合、TREは細胞特異的である。例えば、アンドロゲンレセプター(AR)を発現する前立腺細胞についてのPB-TRE 活性の特異性は、以下のように示された。内因性プロモーター配列を含むPB5'隣接DNAの領域(ヌクレオチド-426位〜ヌクレオチド+28位)(配列番号４)は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入されて、キメラPB-TRE-lucプラスミドを産生した。LNCaP(PSA産生およびAR産生前立腺癌細胞)およびPC-3(PSA欠損およびAR欠損前立腺癌細胞)細胞の陽イオン媒介一過性トランスフェクションが、行われた。結果は、PB-TRE-lucでトランスフェクトされたLNCaP細胞が、未トランスフェクト細胞より約400倍高い活性を有することを示し、これはPB-TREがインタクトであることを示した。さらに、トランスフェクトLNCaP細胞の細胞性抽出物において回復した全体のルシフェラーゼ活性は、トランスフェクトPC-3細胞の細胞性抽出物において測定されたものよりも、約30〜40倍高かった。従って、この結果は、PB-TRE発現がPSA欠損、AR欠損前立腺癌細胞に比較して、PSA産生、AR産生前立腺癌細胞において、優先的に機能性であること、およびPB-TREがアンドロゲンレセプターを産生する細胞での特異的発現を媒介し得ることを示す。（ｂ）異種TREの転写制御下での例示的な遺伝子任意の様々な血清型のアデノウイルス(例えば、Ad2、Ad5、Ad12、およびAd40) が使用され得る。例示の目的のために、アデノウイルス５血清型(Ad5)が本明細書中で例示される。いくつかの実施態様において、細胞特異的異種TREがアデノウイルス遺伝子の転写を制御するために用いられ、そして第１の異種TREとは異なる(すなわち、同様ではない)第２の異種TREが第２の遺伝子の転写を制御するために用いられて、複製能力が細胞特異的TREの機能を許容する標的細胞において優先的に達成可能であるようなアデノウイルスベクターを提供する。さらに、２つの異種TREは標的細胞において機能性である。好ましくは、第１のアデノウイルス遺伝子はアデノウイルス複製に必須であり、なおより好ましくは、両方の遺伝子がアデノウイルス複製に必須である。好ましくは、少なくとも１つの遺伝子が初期遺伝子(例えば、E1A、E1B、E2、またはE4)である。（E3はウイルス複製に必須でない。）好ましくは、異種TREの制御下の両方の遺伝子は初期遺伝子である。より好ましくは、細胞特異的TRE制御下の初期遺伝子は、E1Aおよび/またはE1Bである。実施例１、２および５は、このような構築物のより詳細な説明を提供する。 E1A遺伝子は、ウイルス感染の直後(０〜２時間)および任意の他のウイルス遺伝子の前に発現される。E1Aタンパク質は、トランス作用性ポジティブ作用性転写調節因子として作用し、そして他の初期ウイルス遺伝子E1B、E2、E3、E4、およびプロモーター近位主要後期遺伝子の発現に必要である。命名法にかかわらず、主要後期プロモーターにより駆動されるプロモーター近位遺伝子は、Ad5感染後初期の間に発現される。Flint（1982）Biochem．Biophys．Acta 651:175-208 ；Flint（1986）Advances Virus Research 31:169-228；Grand（1987）Biochem ．J．241:25-38。機能性E1A遺伝子の非存在下では、ウイルス感染は進行しない。なぜなら、ウイルスDNA複製に必要な遺伝子産物が産生されないからである。N evins（1989）Adv．Virus Res．31:35-81。ウイルスゲノムにおいて、Ad5 E1Aの転写開始部位はヌクレオチド498位であり、そしてE1Aタンパク質のATG開始部位はヌクレオチド560位である。 E1Bタンパク質はイントランスで機能し、そして核から細胞質への後期mRNAの輸送に必要である。E1B発現における欠損は、後期ウイルスタンパク質の発現を乏しくし、そして宿主細胞タンパク質合成を止めることを不能にする。E1Bプロモーターは、Ad40〜Ad5の宿主範囲での差異を定義するエレメントとして関係している：臨床的には、Ad40はエンテロウイルスであり、一方、Ad5は急性結膜炎を生じる。Baileyら（1993）Virology 193:631；Baileyら（1994）Virology 202 :695-706。Ad5のE1Bプロモータは、Splについての単一の高親和性認識部位およびTATAボックスからなる。従って、１つの実施態様において、アデノウイルスE1A遺伝子は、細胞特異的異種TREの転写制御下にある。別の実施態様において、アデノウイルスE1B遺伝子は、細胞特異的異種TREの転写制御下にある。別の実施態様において、アデノウイルスE1AおよびE1B遺伝子の両方は、２つの異なる異種TREの転写制御下にあり、好ましくは両方のTREは、細胞特異的である。アデノウイルスのE2領域は、アデノウイルスゲノムの複製に関連するタンパク質（72kD DNA結合タンパク質、80kD前駆体末端（precursor terminal）タンパク質、およびウイルスDNAポリメラーゼを含む）をコードする。Ad5のE2領域は、右方向に２つのプロモーター（E2初期およびE2後期と呼ばれ、それぞれ、76.0および72.0マップ単位にマッピングされる）から転写される。E2後期プロモーターは、感染の後期の間に一過的に活性であり、そしてE1Aトランスアクチベータータンパク質とは独立であり、E2初期プロモーターは、ウイルス複製の初期相の間に重要である。 E2初期プロモーター（Ad5の27050〜27150にマッピングされる）は、主要およびマイナーな（minor）転写開始部位（後者はE2転写物の約５％を占める）、２つの非カノニカルTATAボックス、２つのE2F転写因子結合部位、およびATF転写因子結合部位からなる。E2プロモーター構成の詳細な概説については、Swaminatha nら、Curr．Topics in Micro．and Imm．（1995）199第三部:177-194を参照のこと。 E2後期プロモーターは、対向鎖（counterstrand）によってコードされる遺伝子のコード配列と重複し、それゆえ、遺伝子操作には従わない。しかし、E2初期プロモーターは、対向鎖の33kDタンパク質をコードする配列と数塩基対のみ重複する。注目すべきことに、SpeI制限部位（Ad5の27082位）は、上記の33kDタンパク質の終止コドンの一部であり、都合良く主要E2初期転写開始部位およびTATA結合タンパク質部位を、上流の転写因子結合部位E2FおよびATFから分離する。それゆえ、SpeI末端を有する異種TREのプラス鎖のSpeI部位への挿入は、Ad5の内因性 E2初期プロモーターを破壊し、そしてE2転写物のTRE調節発現を可能にするはずである。 E4遺伝子は、多くの転写産物を有する。E4領域は、ウイルスゲノムDNA複製を刺激することおよび後期遺伝子発現を刺激することを担う２つのポリペプチドをコードする。オープンリーディングフレーム(ORF)３および６の両方のタンパク質産物は、これらの機能を、E1B由来の55kDタンパク質とE2F-1およびDP-1のヘテロダイマーとを結合することによって行い得る。ORF6タンパク質は、活性のためにはE1B 55kDタンパク質との相互作用を必要とするが、ORF3タンパク質は、それを必要としない。ORF3およびORF6由来の機能性タンパク質の非存在下で、プラークは、野生型ウイルスの効率の10^-6未満の効率で産生される。さらに、ウイルス複製を標的細胞に制限するために、E4 ORF 1〜3は、欠損し得、ウイルスDNA複製および後期遺伝子合成をE4 ORF6タンパク質に依存的にさせる。このような変異体をE1B領域が標的細胞特異的TREによって調節される配列と組み合わせることによって、E1B機能およびE4機能の両方が、標的細胞特異的TRE駆動E1Bに依存的であるウイルスが得られ得る。本発明に関連する主要後期遺伝子は、L1、L2、およびL3であり、これらはAd5 ウイルスビリオンのタンパク質をコードする。これらの遺伝子の全て（代表的には、構造タンパク質をコードする）は、おそらくアデノウイルス複製に必要とされる。後期遺伝子は、すべて主要後期プロモーター（MLP）の制御下にあり、これは、Ad5の+5986〜+6048に位置する。１つの実施態様において、アデノウイルスE4遺伝子は、細胞特異的異種TREの転写制御下にある。別の実施態様において、アデノウイルス後期遺伝子は、細胞特異的な異種TREの転写制御下にある。別の実施態様において、１つの初期遺伝子および１つの後期遺伝子は、異なる異種TREの転写制御下にある。異種TREの機能を可能にする細胞における優先的な複製コンピテンスによって、選択的な細胞傷害性および/または細胞溶解性活性を与えるのに加えて、本発明のアデノウイルスベクターは、異種TREの制御下で、異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）をさらに含み得る。このようにして、種々の遺伝的能力は、標的細胞中に導入され得る。例えば、特定の場合に、例えば、標的細胞の比較的抵抗性の性質または特定の病原力に起因して、細胞傷害性活性の程度および/または割合を増強することが望ましくあり得る。これは、細胞特異的複製細胞傷害性活性を、例えば、細胞が5-フルオロシトシン（5-FC）を化学療法剤5-フルオロウラシル（5-FU）に代謝することができるようにする、HSV-tkおよび/またはシトシンデアミナーゼ（cd）の細胞特異的発現とカップリングすることによって達成され得る。これらのタイプのトランスジーンを使用することによってもまた、傍観者（bystander）効果を与え得る。アデノウイルスベクターによって導入され得る他の所望のトランスジーンは、細胞傷害性タンパク質（例えば、ジフテリア毒素のＡ鎖、リシン、またはアブリン（Palmiterら（1987）Cell 50:435,Maxwellら、（1987）Mol．Cell．Blol．7: 1576;Behringerら(1988)Genes Dev．2:453;Messingら（1992）Neuron 8:507;Pia takら(1988)J.Biol．Chem．263:4937;Lambら(1985)Eur．J．Biochem．148:265;F rankelら(1989)Mol．Cell．Biol．9:415)をコードする遺伝子、アポトーシスを開始し得る因子をコードする遺伝子、他の能力のうち、増殖に必須なタンパク質（例えば、構造タンパク質または転写因子）をコードするmRNAに指向し得るアンチセンス転写物またはリボザイムをコードする配列；ウイルスまたは他の病原性タンパク質（ここで、病原が細胞内で増殖する）、ヌクレアーゼ（例えば、RNas eA）またはプロテアーゼ（例えば、アウシン(awsin)、パパイン、プロテイナーゼＫ、カルボキシペプチダーゼなど）、の操作された細胞質改変体をコードする遺伝子またはFas遺伝子をコードする遺伝子などを含む。他の目的の遺伝子には、サイトカイン、抗原、膜貫通タンパク質などのような潜在的な治療遺伝子（例えば、IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN -γ、TNF-α、TNF-β、TGF-α、TGF-β、NGFなど）が含まれる。陽性エフェクター遺伝子は、初期相において、続いて複製による細胞傷害性活性において使用され得る。いくつかの実施態様において、E3領域内にコードされるアデノウイルス死タンパク質(adenovirus death protein)(ADP)が、アデノウイルスベクター中に維持（すなわち、含有）される。主要後期プロモーター（MLP）の制御下にあるADP遺伝子は、宿主細胞溶解を促進するのに重要であるタンパク質（ADP）をコードするようである。Tollefsonら（1996）J．Virol．70(4):2296;Tollefesonら(1992) J．Virol．66(6):3633。従って、ADP遺伝子を含有するアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターをより強力にし得、効果的な処置および/または低い必要投薬量を可能にする。従って、本発明は、第一のアデノウイルス遺伝子が第一の異種細胞特異的TRE の転写制御下にあり、そしてADPをコードするポリヌクレオチド配列が、第二の異種TREの制御下にあり、これは第一のTREとは異なるが、第一のTREと同じ細胞内で機能し、好ましくは、第一のアデノウイルス遺伝子は、複製について本質的である、アデノウイルスベクターを提供する。ADPをコードするDNA配列およびAD Pのアミノ酸配列は、配列番号９および配列番号10にそれぞれ示される。簡単には、ADPコード配列は、好ましくはAd2から当該分野で公知の技術（例えば、PCR ）を使用して得られる（これが、ADPがより十分に特徴づけられている株であるため）。好ましくは、Yリーダー（後期遺伝子の正確な発現について重要な配列である）はまた得られ、そしてADPコード配列に連結される。次いで、ADPコード配列（Yリーダー配列とともに、またはなしで）は、アデノウイルスゲノム中（例えば、E3領域(ここで、ADPコード配列は、MLPによって駆動される)）に導入され得る。ADPコード配列はまた、アデノウイルスゲノムの他の位置（例えば、E4 領域）に挿入され得る。あるいは、ADPコード配列は、異種TRE（別のウイルスTR E、組織特異的TRE（例えば、AFP、CEA、hKLK2、MUCl、PSE、およびPBのTRE）を含むが、これらに限定されない）に作動可能に連結され得る。本発明は、異種TREの制御下にあるさらなる遺伝子を含有するアデノウイルスベクターを排除しないことが理解される。従って、本発明は、異種TREの全てがポリヌクレオチド配列において互いに異なるが、全てが同じ細胞内で機能する、第三の異種TREの転写制御下にある第三の遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。好ましくは、第三の遺伝子は、（直接および/または間接のいずれであろうと）細胞傷害性に寄与する遺伝子であり、より好ましくは、細胞死に寄与および/またはそれを促進する遺伝子であり、さらにより好ましくは、第三の遺伝子は、アデノウイルス複製に必須である。好ましくは、第三の異種TREは、標的細胞特異的である。例えば、アデノウイルスベクターは、PB-TRE、PSE-TRE 、およびhKLK2-TREを含有し、各々は前立腺細胞特異的であり、そして各々は異なる遺伝子の転写を制御する。当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載されるように、エンハンサーの、作動可能に連結した遺伝子の転写を増大する能力は、遺伝子に対するその方向および距離には依存しない。従って、本発明は、第二の異種TREの転写制御下にある（第一のおよび第二の遺伝子の他に）少なくともさらなる遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。好ましくは、さらなる遺伝子は、（直接および/または間接のいずれであろうと）細胞傷害性に寄与する遺伝子であり、より好ましくは細胞死を促進する遺伝子であり、そしてさらにより好ましくは、第三の遺伝子は、アデノウイルス複製に必須である。（ｃ）アデノウイルスベクターの細胞への送達アデノウイルスベクターは、以下を含むがこれらに限定されない種々の形態で使用され得る：裸のポリヌクレオチド（通常はDNA）構築物；細胞への侵入を促進する薬剤（例えば、カチオン性リポソームまたはポリリジンのような他の化合物）と複合体化されたポリヌクレオチド構築物；感染性アデノウイルス粒子（アデノウイルスベクターにより、より免疫原性を付与し得る）に封入されたポリヌクレオチド構築物；HSVまたはAAVのような他の粒子状ウイルス形態に封入されたポリヌクレオチド構築物；免疫応答を増強するかまたは鈍らせる薬剤と複合体化されたポリヌクレオチド構築物；インビボでトランスフェクションを促進する薬剤（例えば、DOTMA^TM、DOTAP^TM、およびポリアミン）と複合体化されたポリヌクレオチド構築物。アデノウイルスベクターが、アデノウイルスに封入される場合、アデノウイルス自身は、標的化をさらに増強するために選択され得る。例えば、アデノウイルス線維は、向性を補助する細胞レセプターとの一次接触を媒介する。例えば、Am bergら（1997）Viorl.227:239-244を参照のこと。アデノウイルス抗原型の特定の亜目が、標的細胞型についての向性を提示し、そして／または非標的細胞型についての親和性を減少させた場合、このような亜属は、細胞傷害性および／または細胞溶解性の細胞特異性をさらに増加するために使用され得る。アデノウイルスベクターは、当該分野で周知の一般的なリポソームトランスフェクション方法（例えば、カルシウム沈殿およびエレクトロポレーション）、ならびに直接注射、および静脈内注入を含む種々の方法で、標的細胞に送達され得る。送達手段は、特定のアデノウイルスベクター(その形態を含む)ならびに標的細胞の型および位置（すなわち、細胞がインビトロまたはインビボであるかどうか）に、大部分依存する。封入されたアデノウイルスにおいて使用される場合、アデノウイルスベクターは、適切な生理学的に受容可能なキャリアで、約10⁴〜約10¹⁴の用量にて投与され得る。感染多重度は、一般的に、約0.001〜100の範囲である。ポリヌクレオチド構築物（すなわち、ウイルスとして封入されていない）として投与される場合、約0.001μg〜1000μgのアデノウイルスベクターが投与され得る。アデノウイルスベクターは、意図される使用および宿主の免疫応答潜在性に依存して、一回以上投与され得るか、または複数の連続注射として投与され得る。免疫応答が所望されない場合、この免疫応答は、種々の免疫抑制剤を使用することによって投与され得、強力な免疫応答を伴わずに反復投与を可能にする。別のウイルス形態（例えば、HSV）として封入される場合、投与される量は、その特定のウイルスについての標準的な知見（これは、例えば、刊行された文献から容易に入手可能である）に基づき、そして経験的に決定され得る。いくつかの実施態様において、アデノウイルスベクターは、親水性ポリマーと複合体化されて、マスクされたアデノウイルスが生成される。親水性ポリマーは、アデノウイルスのキャプシドタンパク質、特にヘキソンおよび線維タンパク質に（共有結合的または非共有結合的に）結合される。好ましい実施態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、マスキング剤と複合体化して、マスクされたアデノウィルスベクターを生成した。マスクされたアデノウイルスは、（a ）循環しているアデノウイルス中和抗体またはオプシニン（opsinin）へのアデノウイルス表面のマスキング、および（ｂ）体内の非特異的クリアランス機構（すなわち、マクロファージなど）の減少に起因するアデノウイルス粒子の全身循環時間の増加に起因して有利である。インビボの状況において、マスクされたアデノウイルスの全身性送達は、ウイルス粒子のより長い循環、低い免疫原性、および肝臓および膵臓によるクリアランスの減少を伴う増加した体内分布を生じる。広範囲な研究が、タンパク質および脂質の親水性ポリマー（特にPEG）での修飾において行われているが、その発明者らは、アデノウイルスまたはアデノウイルス構築物と組み合わせて、マスキング剤の任意の他の使用に気づいていない。従って、本発明は、マスキング剤と複合体化されたアデノウイルスを提供する。好ましくは、マスキング剤はPEGである。マスクされたアデノウイルスを作製する方法の模式図は、図13に示される（実施例７もまた参照のこと）。好ましい実施態様は、本明細書中に記載されるアデノウイルスベクターを含むマスクされたアデノウイルスであり、より好ましい実施態様は、本明細書中に記載されるアデノウイルスを含むPEG化された（pegylated）アデノウイルスを含む。本発明はまた、これらのマスクされたアデノウイルスを作製および使用する方法を提供し、これは本明細書中の記載から明らかである。マスキング剤は、所望の複合体および必須の機能性が得られる限りは、種々の分子量であり得る。市販から得られるほとんどのマスキング剤は、明白に規定された分子量に関係して、正常に多分散である（すなわち、マスキング剤は、見かけの分子量周囲の分子量分布で供給される）。本発明に従うマスキングアデノウイルスに有用なマスキング剤は、以下の見かけ重量を有し得る：約2000〜約50,0 00；好ましくは約2500〜約30,000；好ましくは約3000〜約25,000；より好ましくは約5000から約20,000。好ましくは、見かけの分子量は、約20,000未満であり、より好ましくは約10,000未満、より好ましくは約7500未満、より好ましくは約50 00未満である。好ましくは、マスキング剤は、約5000Da未満の見かけの分子量を有するPEGである。異なる重量のマスキング剤の混合物もまた意図される。マスキングは、共有結合または非共有結合であり得る。非共有結合の場合、結合は、静電気的、疎水的、または親和性相互作用を介してであり得る。非共有結合に使用される結合は、修飾されたマスキング剤であり得る（すなわち、マスキング剤は、マスキング剤において正常には見出されない特定の化学部分を含むように合成または修飾される）。アデノウイルスベクターへの静電気的結合に有用なマスキング剤は、静電気的相互作用によってアデノウイルス表面に結合する荷電部分を含むか、または含むように修飾もしくは合成されているマスキング剤である。負に荷電したマスキング剤として、リン酸基、硫酸基、カルボキシル基などを含むマスキング剤が挙げられる。四級アミン基は、アデノウイルスに対するマスキング剤の静電的非共有結合のための正に荷電した部分として有用である。脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミンなど)のような親水性基および他の親水性基（例えば、フェニル基またはアルキル長鎖）を含むか、または含むように修飾もしくは合成されたマスキング剤は、ウイルスにおける安定な親水性領域との相互作用によって、アデノウイルスベクターに複合体化され得る。親和性マスキング剤は、アデノウイルスに結合する任意の小分子、ペプチド、またはタンパク質を用いて作製され得る。親和性部分および親水性部分は、当該分野で公知の任意の方法によって、好ましくは化学架橋剤の化学架橋によってマスキング剤に結合され得る。マスキング剤が共有結合される場合、好ましくはアデノウイルスにマスキング剤を共有結合するために化学架橋剤が使用される。架橋剤は、マスキング剤とアデノウイルスとの間の共有結合または架橋を生成し得る任意の架橋材であり得る。アデノウイルス、マスキング剤、および別の架橋分子が反応される、直接的架橋は、マスキング剤とタンパク質の間で架橋を生成する当該分野で公知の任意の化学架橋剤を用いて、共有結合的にマスクされたアデノウイルスを生成するために使用される。マスキング剤またはアデノウイルスのいずれかが、架橋反応の前に修飾され、その結果、化学架橋剤は２つの分子と反応する（例えば、マスキング剤は、アミン基を付加するように修飾され、アミンと反応する架橋剤によってアデノウイルスと架橋されることを可能にする）。好ましくは、マスキング剤またはアデノウイルスのいずれかが、架橋剤との反応によって最初に活性化される。次いで、未反応の架橋剤は、マスキング剤またはアデノウイルスから除去される。活性化反応は、好ましくは、マスキング剤１分子あたり１分子または２分子の架橋剤、より好ましくは、マスキング剤１分子あたり１分子の架橋剤を生じる。次いで、活性化マスキング剤またはアデノウイルスは、マスクされたアデノウイルスを形成するのに適切な条件下で、アデノウイルス（マスキング剤が活性化される場合）またはマスキング剤（アデノウイルスが活性化される場合）と混合される。好ましくは、マスキング剤が活性化され、次いでアデノウイルスと反応される。好ましいマスキング剤は、PEGである。好ましい活性化PSEGとしては、以下を含むがこれらに限定されない：末端アミンPEG、PEGアミノ酸エステル、PEGヒドラジン塩酸塩、チオールPEGなどのような求核性架橋PEG；PEGスクシネート、カルボキシルメチル化PEG、PEG−プロピオン酸、およびPEGアミノ酸を含むカルボキシルPEG；PEGマレイミド、PEGオルトピリジルジスルフィドなどのようなスルヒドリル選択性PEG；アミンおよび酸PEG、NHSマレイミドPEG、およびNHSビニルスルホンPEGを含むヘテロ官能基PEG；PEGシラン；ビオチンPEG；アリルPEG、PEGアクリレート、PEGメタクリレートなどのようなPEGのビニル誘導体；ならびにPEG スクシンイミジル（succinimidyl）スクシネート、PEGスクシンイミジルスクシンアミド、PEGスクシンイミジルプロピオネート、カルボキシル化PEGのスクシンイミジルエステル、PEG2-NHS、アミノ酸PEGのスクシンイミジルエステル、ペンダント（pendant）修飾化PEGNHSエステル（例えば、Innophase，Inc．から入手可能なもの）、PEGグリシジル（glycidyl）エステル（エポキシド）、PEGオキシカルボニルイミダゾール、PEGニトロフェニルカーボネート、PEGトリクロロフェニルカーボネート、PEGトレスレート（treslate）、PEGアルデヒド、PEGイソシアネート、PEGアリルエーテルおよび無水マレイン酸のコポリマー、PEGビニルスルホン、および他の活性化PEGを含む求電子活性化PEG、ならびに当業者に明らかなもの。活性化PEGは、好ましくは、PEG-N-ヒドロキシスクシンイミジルスクシンアミドまたはPEGスクシンイミジルスクシネートであり、より好ましくは、PEG -N-ヒドロキシスクシンイミジルスクシンアミドである。宿主細胞本発明はまた、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターを含む（すなわち、それで形質転換された）宿主細胞を提供する。原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞の両方が、その宿主において維持のための必須の配列（例えば、適切な複製起点）が存在する限りは使用され得る。便宜上、選択マーカーもまた提供される。原核生物宿主としては、例えば、E.collおよびマイコバクテリアのような細菌細胞が挙げられる。真核生物宿主細胞には、酵母、昆虫、鳥類、両生類、植物、および哺乳動物宿主細胞がある。宿主系は当該分野で公知であり、そして本明細書中に詳細に記載される必要はない。適切な宿主細胞としてはまた、タンパク質、または異種TREの制御下で遺伝子の発現に必要な他の因子を産生する任意の細胞が挙げられ、このような因子は、上記の発現が天然または組換え的に産生されるのに必要である。アデノウイルスに適切な宿主細胞としては、異種TREの機能を可能にする任意の真核生物細胞型が挙げられ、好ましくは、哺乳動物である。例えば、使用される異種TREが、前立腺細胞特異的である場合、この細胞は好ましくは前立腺細胞であり、例えば、LNCaP細胞である。使用される前立腺細胞は、アンドロゲンレセプターを産生してもしなくてもよく、これは、使用されるプロモーターがアンドロゲン誘導性かどうかに依存する。アンドロゲン誘導性プロモーターが使用される場合、非アンドロゲンレセプター産生細胞(例えば、HLF、HLE、および3T3) ならびに非AR-産生前立腺ガン細胞PC3およびDU145が使用され得るが、ただしアンドロゲンレセプターコード発現ベクターは、アデノウイルスとともに細胞に導入される。使用される異種TREがAFP遺伝子に由来する場合、例えば、適切な宿主細胞は、AFPを産生する任意の細胞型（Hep3B、HepG2、HｕH7、HuH1/C12を含むがこれらに限定されない）を含む。所定の細胞における所定のTREの活性は、標準的なアッセイを用いて、作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現のレベルを測定することによって評価され得る。TREは機能的であると予測される細胞とコントロール細胞との間の間の発現の比較は、転写増強の存在または非存在を示す。種々のTRE間の比較は、単一の細胞株内の発現のレベルを測定および比較することによって評価され得る。TREの完全な転写活性は、標的細胞の性質、TREの送達様式および形態、ならびに選択的に転写活性化されるコード配列のようないくつかの要因に依存することが理解される。使用される種々のプラスミドサイズを補正するために、活性は、トランスフェクトされたプラスミド１モルあたりの相対活性としての活性として示され得る。あるいは、転写のレベル(すなわち、mRN A)は、標準的なノーザン分析およびハイブリダイゼーション技術を用いて測定され得る。トランスフェクションのレベル（すなわち、トランスフェクション効率）は、異なるTRE（例えば、CMV前初期プロモーター）の制御下で、異なるレポーター遺伝子をコードするプラスミドを同時トランスフェクトすることによって測定される。この分析はまた、ネガティブ調節領域（すなわち、サイレンサー）を示し得る。組成物本発明はまた、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物を含む組成物を含む。このような組成物は、例えば、個体における細胞殺傷の形質導入および/または効果の程度を測定する場合、インビボでの投与に有用である。好ましくは、これらの組成物はさらに、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。これらの組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤中に有効量の本発明のアデノウイルスベクターを含み得、単位投薬形態、滅菌非経口溶液または懸濁液、滅菌経口溶液（non-parenteral solution）すなわち経口溶液（oral solution）もしくは懸濁物、水中油または油中水エマルジョンなどで、個体への全身投与に適切である。非経口および経口薬物送達のための処方物は当該分野で公知であり、そしてRemington's Pharmaceutical Sciences,第18版、Mack Publishing(1990)に示される。組成物としてはまた、本発明のアデノウイルスベクター（アデノウイルスのようなウイルスとして封入されたものを含む）の凍結乾燥形態および／または再構成形態が挙げられる。キット本発明はまた、本発明のアデノウイルスベクターを含むキットを包含する。これらのキットは、診断用目的および／またはモニタリング用目的、好ましくはモニタリングに使用され得る。これらのキットを使用する手順は、臨床研究室、実験研究室、医療開業医、または一私人によって実施され得る。本発明によって具体化されるキットにより、だれでも、適切な生物学的サンプル（例えば、生検標本）中の標的細胞の存在を検出し得る。本発明のキットは、適切なパッケージング中に本明細書中に記載されるアデノウイルスベクターを含む。キットは、必要に応じて、手順に有用なさらなる成分を提供する、これは、緩衝液、発色試薬、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、説明書、および解析のための情報を含むがこれらに限定されない。本発明のアデノウイルスベクターの調製本発明のアデノウイルスベクターは、当該分野で標準の組換え技術を使用して調製され得る。一般的には、異種TREは目的のアデノウイルス遺伝子、好ましくは１つ以上の初期遺伝子（後期遺伝子も使用され得るが）の5'に挿入される。異種TREは、オリゴヌクレオチド合成（配列が公知であれば）または組換え法（例えば、PCRおよび／または制限酵素）を使用して調製され得る。天然のアデノDNA 配列またはPCRもしくは部位特異的変異誘発のような方法によって導入されたかのいずれかによる都合よい制限部位は、異種TREに対して挿入部位を提供する。従って、異種TREをアニーリング（すなわち、挿入）するための都合のよい制限酵素部位は、PCRのような標準的な組換え法を使用して異種TREの5'および3'末端上に操作され得る。本発明のアデノウイルスベクターを作製するために使用されるポリヌクレオチドは、化学合成組換え法のような当該分野で標準的な方法を使用して得られ得るか、および/または生物学的供給源から得られ得る。すべての複製必須エレメントを含むアデノウイルスベクター（異種TREの制御下で所望のエレメント（例えば、E1A）を有する）は、２つのプラスミド（一方はアデノウイルスの左側部分を提供し、他方は右側部分を提供する）の相同組換えまたはインビトロ連結によって都合よく調製される。得られるアデノウイルスベクターは、少なくとも２つの異なる異種TREを含み、この異種TREの少なくとも 1つは細胞特異性であり、そして第１異種TREの制御下に１つのアデノウイルス遺伝子があり、ならびに第２異種TREの制御下に第２遺伝子がある。相同組換えを使用する場合、２つのプラスミドは少なくとも約500bpの配列重複を共有するべきである。各プラスミドは、所望である場合、独立して操作され得、続いてコンピテント宿主へ同時トランスフェクトされ得、適切であれば補充的遺伝子、またはアデノウイルスの増殖のための異種TREからの転写開始のための適切な転写因子を提供する。プラスミドは一般に、カチオン性リポソームのような適切な形質導入手段を使用して、293細胞のような適切な宿主細胞に導入される。あるいは、アデノウイルスゲノムの右側部分または左側部分のインビトロ連結を使用し、アデノウイルスゲノムの全ての複製必須部分を含む組換えアデノウイルス誘導体を構築し得る。Berknerら、（1983）Nucleic Acid Research 11:6003-6020；Bri dgeら、（1989）J．Virol．63:631-638。便宜上、アデノウイルスの必須部分を提供するプラスミドは入手可能である。プラスミドpXC.1(McKinnon（1982）Gene 19:33-42)は、Ad5の野生型左側末端、A denovirus 5 nt22位〜5790位を含む。pBHG10(Bettら、（1994）Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 91:8802-8806;Microbix Biosystems Inc.，Toronto）は、E3に欠失を有するAd5の右側末端を提供する。E3における欠失は、ウイルスに、内因性エンハンサー-プロモーターを欠失することなく3-kb TRE配列またはトランスジーン配列を挿入する場所を提供する。E3の遺伝子は、E4から反対の鎖（r鎖）に位置する。pBHG11[Bettら、(1994)]は、さらにより長いE3欠失（さらに0.3kbが欠失されている）を提供する。初期遺伝子の操作のために、ウイルスゲノムにおいて、Ad5 E1Aの転写開始部位はnt498位であり、そしてこの遺伝子のコードセグメントのATG開始部位はnt56 0位である。この領域は異種TREの挿入に使用され得る。制限部位は、PCRを使用することによって導入され得、使用されるプライマーは、Ad5ゲノムに制限され得るか、またはAd5ゲノムDNAを保有するプラスミドの部分を含み得る。例えば、 pBR322が使用される場合、プライマーはpBR322骨格中のEcoRI部位を、およびAd5 のnt1339位のXbaI部位を使用し得る。領域の中心での重複プライマーが、独特な制限部位を生じる30配列の変化を導入する場合、PCRを２工程で実施することによって、その部位に異種TREの挿入を提供し得る。類似のストラテジーが、E1Bを調節するための異種TREの挿入のために使用され得る。Ad5のE1Bプロモーターは、Splの単一な高親和性認識部位およびTATAボックスからなる。この領域は、Ad5 nt1636位〜1701位に及ぶ。この領域における細胞特異的異種TREの挿入によって、E1B遺伝子の細胞特異的転写を提供し得る。E1 Aを調節する細胞特異的TREで改変された左側領域を、E1Bを調節するための第２の異なる細胞特異的TREを導入するためのテンプレートとして使用することによって、得られたアデノウイルスベクターは、E1AおよびE1Bの両方の発現のための細胞特異的転写因子に依存する。実施例１、２および５は、このような構築物が調製され得る方法のより詳細な説明を提供する。同様に、異種TREはE2遺伝子の上流に挿入され、その発現を細胞特異的にさせ得る。E2初期プロモーターは、Ad5の27050-27150にマッピングし、主要および少数の転写開始部位（後者はE2転写物の約５％を占める）、２つの正規でないTATA ボックス、２つのE2F転写因子結合部位、およびATF転写因子結合部位からなる（ E2プロモーター構造の詳細な概説については、Swaminathanら、Curr．Topics in Microbiol．and Immunol．（1995）199パート3:177-194を参照のこと）。 E2後期プロモーターは、対向鎖（counterstrand）によってコードされる遺伝子のコード配列と重複し、それゆえ、遺伝子操作の影響を受けない。しかし、E2 h初期プロモーターは、対向鎖における33kDaタンパク質をコードする配列と数塩基対のみ重複する。特に、SpeI制限部位（Ad5 27082位）は、上記の33kDタンパク質の終止コドンの部分であり、そして上流の転写因子結合部位E2FおよびATFから、主要なE2初期転写開始部位およびTATA結合タンパク質部位を都合よく分離する。それゆえ、SpeI末端を有する異種TREの、＋鎖におけるSpeI部位への挿入は、Ad5の内因性E2初期プロモーターを破壊し、そしてE2転写物のTRE調節された発現を可能にするべきである。 E4について、アデノウイルスゲノムの右側部分を使用しなければならない。E4 転写開始部位は、nt35609位で優先的であり、TATAボックスはnt35638位であり、そしてORF1の第１のAUG/CUGはnt35532位である。Virtanenら、（1984）J．Virol ．51:822-831。他の遺伝子について任意の上記のストラテジーを使用して、異種 TREは、転写開始部位より上流に導入され得る。E4領域における変異体の構築物について、同時トランスフェクションおよび相同組換えは、これらのタンパク質の合成における欠損を補充するためにE4タンパク質をイントランスで提供するW1 62細胞において行う（Welnbergら、（1983）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:53 83-5386）。アデノウイルスポリヌクレオチドをアデノウイルス粒子にパッケージングする方法は当該分野で公知であり、そして実施例に記載される。マスクされたアデノウイルスの調製方法は、マスキング剤および結合（共有または非共有）様式に従って変化する。非共有結合的に結合したマスキング剤を用いてマスクされたアデノウイルスは、アデノウイルスおよびマスキング剤を徹底的および完全に混合することによって調製される。共有結合による架橋は、架橋試薬に適切な条件下で反応成分を混合することによって達成される。化学的架橋プロトコールは当該分野で周知である。任意の所定の化学架橋剤に的確な反応条件は、架橋物の化学的性質ならびにPEGおよびアデノウイルスに対する変更（あるとすれば）に従って、当業者に明らかなように、変更される。マスキング剤が PEGである場合、アデノウイルスとPEGとのモル比は、好ましくは１：1×10⁶と１：1×10⁷との間、より好ましくは約１：４×10⁶である。好ましい活性化PEGであるPEG-NHS-スクシンアミドについては、活性化PEGは、好ましくは架橋反応においては0.5〜５mMの間、より好ましくは約２mMである。好ましくは架橋反応中のアデノウイルスは、10⁶と10¹²との間であり、より好ましくは約５×10⁹である。好ましい活性化PEGの使用には、架橋反応のpHは好ましくは約７と９との間、より好ましくは約7.5と８との間であり、そして反応は好ましくは10〜30分間、約４℃〜室温（約20℃）の範囲の温度で行われる。架橋反応に続いて、マスクされたアデノウイルスは反応成分から分離される。分離は当業者に公知の任意の方法によって達成され得、これには、クロマトグラフィー法（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーもしくは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、電気泳動法、またはろ過法（例えば、透析、ダイアフィルトレーション、もしくは限外濾過）が含まれる。本発明のアデノウイルスベクターを使用する方法本発明のベクターは、種々の広範な目的のために使用され得、これは所望または意図される結果に伴って変更される。従って、本発明は、上記のアデノウイルスベクターを使用する方法を包含する。１つの実施態様において、アデノウイルスベクターを使用するための方法は、アデノウイルスベクターを細胞、好ましくは真核生物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞に導入する工程を包含する。１つの実施態様において、アデノウイルスベクターを使用するための方法は、アデノウイルスベクターを、標的細胞、好ましくは新生物細胞に導入する工程を包含する。別の実施態様において、アデノウイルスベクターを使用するための方法は、アデノウイルスベクターを前立腺細胞に導入する工程を包含する。別の実施態様において、アデノウイルスベクターを使用するための方法は、アデノウイルスベクターを肝臓細胞に導入する工程を包含する。別の実施態様において、アデノウイルスベクターを使用するための方法は、アデノウイルスベクターを乳ガン細胞に導入する工程を包含する。別の実施態様において、アデノウイルスベクターを使用するための方法は、アデノウイルスベクターを結腸ガン細胞に導入する工程を包含する。１つの実施態様において、標的細胞特異的TREが機能するのを可能にする細胞において選択的な細胞傷害性を与えるための方法が提供され、この方法は、細胞を、アデノウイルスベクターが侵入する（すなわち、細胞を形質導入する）ように本明細書中に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程を包含する。細胞傷害性は、当該分野における標準アッセイ（例えば、色素排除、³H-チミジン取込み、および/または溶解）を使用して測定され得る。実施例３、図３を参照のこと。別の実施態様において、異種TREが機能するのを可能にする細胞、好ましくは真核生物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞に特異的なアデノウイルスを増殖するための方法が提供される。これらの方法は、アデノウイルスベクターを、異種 TREが機能するのを可能にする哺乳動物細胞と組み合わせる工程（それによってアデノウイルスは増殖する）を必要とする。別の実施態様は、異種TREが機能するのを可能にする細胞を殺傷する方法を提供し、これは、細胞混合物を本発明のアデノウイルスベクターと組合わせる工程を包含する。細胞混合物は、一般には、異種TREが機能的であるガン細胞と正常細胞との混合物であり、そしてインビボ混合物またはインビトロ混合物であり得る。本発明はまた、異種TREが機能的である細胞を生物学的サンプルから検出するための方法を含む。これらの方法は、実験または臨床のいずれかの設定において、個体（すなわち、哺乳動物）の臨床的および/または生理学的状態のモニタリングに特に有用である。これらの方法のために、生物学的サンプルの細胞はアデノウイルスベクターと接触され、そしてアデノウイルスベクターの複製が検出される。適切な生物学的サンプルは、標的細胞が存在し得るかまたは存在すると予測されるものである。一般には、哺乳動物において、適切な臨床サンプルは、標的ガン細胞が存在すると予測されるサンプルである。このような細胞は、例えば、針生検または他の外科的手順によって得られ得る。接触されるべき細胞は、選択的富化および/または可溶化のようなアッセイ条件を促進するために処理され得る。これらの方法において、標的細胞は、当該分野において標準的である、増殖を検出するインビトロアッセイを使用して検出され得る。このような標準アッセイの例には、破裂（burst）アッセイ（これはウイルス産生を測定する）およびプラークアッセイ（これは細胞当たりの感染性粒子を測定する）が含まれるが、これらに限定されない。また、増殖は、特異的なアデノウイルスDNA複製を測定することによって検出され得、これもまた、標準アッセイである。本発明はまた、標的細胞の遺伝子型を改変する方法を提供し、これは、標的細胞を本明細書中に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程（ここで、アデノウイルスベクターは細胞に侵入する）を包含する。本発明はさらに、腫瘍細胞増殖を抑制する方法を提供し、これは、腫瘍細胞を本発明のアデノウイルスベクターと接触させ、その結果、アデノウイルスベクターは細胞に侵入し、そして腫瘍細胞に対する選択的細胞傷害性を示す工程を包含する。本明細書中で使用される場合、「腫瘍細胞」および「肺瘍」は、比較的自律増殖を示し、その結果、細胞増殖の制御の有意な欠如によって特徴付けられる異常増殖表現型を示す細胞をいう。腫瘍細胞増殖は、当該分野で公知の任意の手段によって評価され得、これは、腫瘍サイズを測定する工程、³H-チミジン取込みアッセイを使用して腫瘍細胞が増殖するか否かを決定する工程、または腫瘍細胞を計数する工程を包含するが、これらに限定されない。腫瘍細胞増殖を「抑制する」は、任意のまたは全ての以下の状況を意味する：遅鈍した肺瘍増殖、遅延した腫瘍増殖、および停止した腫瘍増殖、ならびに腫瘍萎縮。腫瘍増殖を「抑制する」は、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターとの接触（すなわち、アデノウイルスベクターによるトランスフェクション）なしの増殖と比較した場合、短縮した（curtail）増殖状態を示す。実施例４、図６を参照のこと。本発明はまた、個体における腫瘍細胞マーカーのレベルを低下させる方法を提供し、これは、本発明のアデノウイルスベクターを個体に投与する工程を包含する。ここで、アデノウイルスベクターは、腫瘍細胞マーカーを産生する細胞に対して選択的に細胞傷害性である。腫瘍細胞マーカーは、PSA、ガン胎児性抗原、およびhK2を含むが、これらに限定されない。腫瘍細胞マーカーのレベルを測定する方法は当業者に公知であり、そして酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）のような、腫瘍細胞マーカーに特異的な抗体を使用する免疫学的アッセイを含むが、これに限定されない。一般には、生物学的サンプルは試験される個体から得られ、そしてELISAのような適切なアッセイが生物学的サンプルに対して行われる。実施例４、図７を参照のこと。本発明はまた、有効量の本明細書中に記載のアデノウイルスベクターが個体に投与される処置方法を提供する。例えば、少なくとも１つの異種TREが前立腺細胞に特異的である（例えば、PSE-TRE、PB-TRE、および／またはhKLK2-TRE）アデノウイルスベクターを使用する処置は、上記のような前立腺関連疾患（例えば、肥大およびガン）を有する個体において示される。この例において、切除された疾患を有する個体および前立腺関連疾患の家族歴を有する個体のような、前立腺関連疾患を発症する危険性があると考えられる個体もまた示される。本発明のアデノウイルスベクターの投与の適合性の決定は、とりわけ、血清学的示唆および組織生検の歴史的試験のような評価可能な臨床パラメーターに依存する。一般には、アデノウイルスベクターを含む薬学的組成物が投与される。薬学的な組成物は、上に記載される。投与されるべきアデノウイルスベクターの量は、投与経路、個体の状態、疾患の攻撃性、使用される特定の異種TRE、および特定のベクター構築物（すなわち、アデノウイルス遺伝子が異種TREの制御下である）のようないくつかの因子に依存する。パッケージングされたアデノウイルスとして投与される場合、約10⁴〜約10¹⁴ 、好ましくは約10⁴〜約10¹²、より好ましくは約10⁴〜約10¹⁰である。ポリヌクレオチド構築物（すなわち、ウイルスとしてパッケージングされていない）として投与される場合、約0.01μg〜約100μg、好ましくは0.1μg〜約500μg、より好ましくは約0.5μg〜約200μgが投与され得る。１つより多いアデノウイルスベクターは、同時または連続的のいずれかで投与され得る。投与は代表的には、任意の応答をモニタリングしながら定期的に行う。投与は、例えば、腫瘍内、血管内、または腹腔内で与えられ得る。本発明のアデノウイルスベクターは、単独または所望の目的を促進する他の活性薬剤（例えば、化学療法）と組合わせて、使用され得る。以下の実施例は、例示の目的に提示されるが、本発明を制限するために提供されるのではない。実施例実施例１第１アデノウイルス遺伝子がhKLK2-TREの転写制御下にあり、そして第２アデノウイルス遺伝子がPSE-TREの転写制御下にある、アデノウイルスベクター構築物の産生 1.1 １つのアデノウイルス遺伝子の発現がhKLK2-TREによって制御されるアデノウイルス構築物の構築 hKLK2-TREアデノウイルス構築物を生成するために、少なくともhKLK2最小プロモーターを含む４つのhKLK2-TREフラグメントを、hKLK2の第１エキソンの上流に位置する約12,000bpからのDNA配列（配列番号３）および以下に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。４つの構築物を、これらのフラグメントをpG EM-Tベクターに連結することによって生成した。・CN294は、hKLK2全長プロモーターを含むpGEM-Tベクター誘導体である。フラグメントを、オリゴヌクレオチド42.100.1：5'-GAT CAC CGG TGT CCA CGG CCA G GT GGT GC-3'（配列番号11）（PinAI部位に下線を付した）(これは、hKLK2の第１エキソンの5'非翻訳領域（UTR）に相補的である)を、42.100.2（5'-GAT CAC C GG T GC TCA CGC CTG TAA TCT CAT CAC-3'；配列番号12；PinAI部位に下線を付した）と組み合わせて用いて、PCRによって増幅した。42.100.2は、hKLK2プロモーターの上流領域に対応する。・CN296はnt-2247〜nt+33のhKLK2フラグメントを含むpGEM-Tベクター誘導体であり、これはオリゴヌクレオチド42.100.1および42.100.3（5'-GAT CAC CGG TGG TTT GGG ATG GCA TGG CTT TGG-3'；配列番号13；PinAI部位に下線を付した）を用いて、PCRによって増幅した。42.100.3は、hKLK2の上流約2300bp領域に対応する。・CN3l7は、hKLK2最小プロモーターを含むpGEM-T誘導体である。nt-323〜nt+3 3のhKLK2 5'-UTRに対応するPCRフラグメントを、２つの合成オリゴヌクレオチド；42.100.1および43.121.3（5'-GAT CAC CGG TAA AGA ATC AGT GAT CAT CCC AAC -3'；配列番号14、PinAI部位に下線を付した）を用いて増幅した。・CN310は、hKLK2全長プロモーターを含むpGEM-Tベクター誘導体であり、そして挿入部分に隣接するEagI部位を除いてCN294と同一である。フラグメントを、オリゴヌクレオチド42.174.1（5'-GAT CCG GCC GTG GTG CTC ACG CCT GTA ATC-3 '；配列番号15、EagI部位に下線を付した）を42.174.2（5'-GAT CCG GCC GTG TC C ACG GCC AGG TGG TGC AG-3'；配列番号16；EagI部位に下線を付した）と組み合わせて用いて、PCRによって増幅した。 hKLK2プロモーター駆動E1A Ad5プラスミドCN303 CN303を、以下のようにpXC-1（Ad5ゲノムの左側末端を含むプラスミド）の誘導体におけるE1Aコードセグメントのちようど上流のhKLK2プロモーターを挿入することによって生成した。・CN124は、Ad5の野生型左側末端を含む構築物pXC-1の誘導体であり、これは、E1AおよびE1Bの両方を含む（McKinnon（1982）Gene 19:33-42）。CN124もまた、他の改変の中でもとりわけ、Ad5 nt547で人工PinAI部位（nt560のE1A転写開始のちょうど上流、および610でATGでのE1Aコードセグメントの始まり）を有する。CN124を、PinAIで線状化し、そしてウシ腸アルカリホスファターゼ（New Engl and Biolabs）で脱リン酸化した。・CN294を、PinAIで消化して、hKLK2プロモーターを遊離させた。次いで、hKL K2プロモーターを、PinAI線状化CN124に連結して、CN303を生成した。CN304は、 hKLK2プロモーターフラグメントが逆配向にあること以外は、CN303と類似する。従って、構築物CN303は、アデノウイルス５ゲノムのE1Aコードセグメントの上流に挿入されそして作動可能に連結された、hKLK2プロモーターを含む。 hKLK2プロモーター駆動E1B Ad5プラスミドCN316 CN316を、以下のようにpXC-1（Ad5ゲノムの左側末端を含むプラスミド）の誘導体におけるE1Bコードセグメントのちょうど上流のhKLKプロモーターを挿入することによって生成する。・CN124（上記）はまた、Ad5 nt1682（E1Bコードセグメントのちょうど上流）で人工EgaI部位を含む。hKLK2プロモーターを、EgaIでCN310から切除し、そして EagIで消化したCN124に挿入して、CN316を生成した。CN316は、E1Bコードセグメントのすぐ上流、および作動可能に連結されたhKLK2プロモーターを含む。 1.2 あるアデノウイルス複製遺伝子の発現がhKLK2-TREによって制御され、そして別のアデノウイルス複製遺伝子がPSE-TREによって制御される、アデノウイルス構築物の構築 hKLK2-TRE駆動性E1AおよびPSE-TRE駆動性E1Bを含むAd5構築物（CN301） CN301を、CN125から、以下のようにE1A遺伝子の上流にhKLK2プロモーターを挿入することによって作製した。・CN125は、E1B遺伝子の発現がPSEによって駆動されるPXC-1誘導体である。PinA I部位は、E1A遺伝子の上流に存在し、その発現は、その野生型プロモーターによって駆動される。CN125を、構築物CN105由来のEagIフラグメントとしてのPSEをC N124におけるE1B遺伝子のすぐ上流のEagI部位へと挿入することによって作製した。CN105は、PSE転写開始部位と比較して-5322から-3875までのPSE領域を含む。・hKLK2-TREフラグメントを、CN294からPinAI消化によって遊離させ、そしてPin AI消化したCN125に連結してCN301を作製した。 CN301構築物は、E1A遺伝子のすぐ上流にかつそれに作動可能に連結されたhKLK 2プロモーター、およびE1B遺伝子のすぐ上流にかつそれに作動可能に連結された PSE-TREを含む。 PSE-TRE駆動性E1A遺伝子およびhKLK2プロモーター駆動性E1B遺伝子を含むAd構築物（CN323） CN323を以下のように作製し、その結果、E1Aの発現がPSE-TREに媒介され、そしてE1Bの発現がhKLK2プロモーターによって媒介される。・CN314は、pGEM-Tベクター中にPSE-TREフラグメントを含むプラスミドである。このPSEフラグメントを、CN706（これは、PSE-TRE（配列番号２）がAd5において E1A転写単位の発現を駆動する、アデノウイルス構築物）から、２つの以下の合成オリゴヌクレオチドを使用して増幅した：・PSE-TREフラグメントを、CN314をPinAIで消化することによって単離し、そしてPinAI消化したCN316（上記に記載される）に連結した。 CN323構築物は、E1A遺伝子のすぐ上流にかつそれに作動可能に連結されたPSE- TRE、およびE1B遺伝子のすぐ上流にかつそれに作動可能に連結されたhKLK2プロモーターを含むプラスミドである。 1.3 hKLK2-TREの転写制御下の第一のアデノウイルス遺伝子およびPSE-TREの転写制御下の第二のアデノウイルス遺伝子を含むさらなるアデノウイルス構築物の構築・CN306を、CN124から、内因性の64ヌクレオチドのE1Aプロモーターを除去することによって誘導体化させた。・CN421を、hKLK2-TRE（hKLK2遺伝子転写開始部位に対してヌクレオチド-5155から-3387までのhKLK2エンハンサーを含む）（配列番号３のヌクレオチド6859から 8627）およびhKLK2ミニマルプロモーターを、CN379におけるように、CN306へと挿入することによって構築した。hKLK2-TREフラグメントを、CN379からPCRによって増幅し、PinAIで消化し、そして同様に切断したCN306に連結してCN421を作製した。・CN438を、hKLK2-TRE（hKLK2遺伝子転写開始部位に対してヌクレオチド-4814から-3643までのhKLK2エンハンサーを含む）（配列番号３のヌクレオチド7200から 8371）およびミニマルhKLK2プロモーターを、CN390におけるように、CN306へと挿入することによって構築した。エンハンサーフラグメントを、CN390からPCRによって増幅し、PinAIで消化し、そして同様に切断したCN306に連結してCN438を作製した。・CN321を、CN306から、CN96から増幅した大きなPSE-TREを挿入することによって作製した（米国特許第5,698,443号；Rodrlguezら（1997）を参照のこと）。・CN416を、hKLK2-TRE（hKLK2遺伝子転写開始部位に対してヌクレオチド-5155から-3387までのhKLK2エンハンサーを含む）（配列番号３のヌクレオチド6859から 8627）およびhKLK2ミニマルプロモーターを、CN379におけるように、CN321へと挿入することによって構築した。エンハンサーフラグメントを、CN379からPCRによって増幅し、EagIで消化し、そして同様に切断したCN321に連結してCN416を作製した。・CN422を、hKLK2-TRE（hKLK2遺伝子転写開始部位に対してヌクレオチド-5155から-3387までのhKLK2エンハンサーを含む）（配列番号３のヌクレオチド6859から 8627）およびhKLK2ミニマルプロモーターを、CN379におけるように、CN369へと挿入することによって構築した。CN369は、内因性E1Bプロモーターが除去されているCN306の誘導体である。hKLK2-TREを、CN379から増幅し、EagIで消化し、そして同様に切断したCN369に連結してCN422を作製した。・CN444を、CN442のhKLK2-TREを、hKLK2-TRE（hKLK2転写開始部位に対してヌクレオチド-4814から-3643までのhKLK2エンハンサーを含む）（配列番号３のヌクレオチド7200から8371）およびhKLK2ミニマルプロモーターと、CN390におけるように、置換することによって構築した。hKLK2-TREを、CN390から増幅し、EagIで消化し、そして同様に切断したCN369に連結してCN444を作製した。・CN446は、内在性E1Bプロモーターが除去されていなかったことを除いてCN444 に同様にする。hKLK2-TREを、CN390から増幅し、EagIで消化し、そして同様に切断したCN321に連結してCN446を作製した。・CN459およびCN460は、各々が、hKLK2転写開始部位に対してヌクレオチド-3993 から-3643までのhKLK2エンハンサーを含むhKLK2-TREおよびhKLK2ミニマルプロモーターを、CN396におけるように含むことを除いて、CN444に同様にする。・CN463を、hKLK2-TRE（hKLK2遺伝子転写開始部位に対してヌクレオチド-4814から-3643までのhKLK2エンハンサーを含む）およびミニマルhKLK2プロモーターを、CN390におけるように、CN251へと挿入することによって構築した。hKLK2-TRE を、CN446からEagIで切り出し、そして同様に切断したCN251に連結してCN463を作製した。 1.4 組換えアデノウイルスの作製 hKLK2-TREを含むアデノウイルスを、293細胞における相同組換えによって作製した。手短には、CN301を、BHG10（これは、アデノウイルスゲノムの右側末端を含む）で293細胞に同時トランスフェクトした。細胞に、培地を重層し、そしてインビトロ組換えによって生成された感染ウイルスを、細胞変性効果によって検出し、そして単離した。CN747と称するアデノウイルスベクターのプラーク精製したストックを樹立した。この組換えウイルスの構造を、PCR、制限エンドヌクレアーゼ消化、およびサザンブロットによって特徴付けした。CN747は、hKLK2プロモーターがE1Aの発現を駆動し、そしてPSE-TREがE1Bの発現を駆動する全長Ad5 である。ウイルスCN754を、CN301プラスミドがCN323と置換されたことを除いて同様のアプローチを用いて作製した。CN754は、そのE1AおよびE1Bが、それぞれ、PSE-T REおよびhKLK2-TREの制御下にあるウイルスである。ウイルスCN753、CN755、CN759、CN761、CN763、CN764、CN765、CN767、CN768 、CN769、CN770、CN772、およびCN773を、それぞれ、親プラスミドCN326、CN328 、CN398、CN316、CN421、CN416、CN422、CN436、CN438、CN444、CN456、CN459、 CN460、およびCN463から、上記に記載されるとおりの方法を用いて作製した。これらのウイルス構築物を、図２Ａ、２Ｂ、および２Ｂに模式的に示す。実施例２あるウイルス複製遺伝子の発現がPSE-TREの制御下にあり、そして別のウイルス複製遺伝子の発現がPB-TREの制御下にあるアデノウイルスベクターの構築 2.1 １つのアデノウイルス遺伝子の発現がPB-TREによって制御されるアデノウイルス構築物の作製２つのアンドロゲン応答エレメント（ARE部位）およびプロモーターエレメント（配列番号４）を含む、ラットPB-TREの454ヌクレオチドフラグメント（nt約- 426から約+28）を、ラットゲノムDNAをテンプレートとして、および以下のオリゴヌクレオチドプライマー：を用いたPCRによって、増幅した。オリゴヌクレオチドは、特有のPinAI（AgeI）部位（A/CCGGT）またはEagI（C/ GGCCG）をPCRフラグメントの両端に作製した。PCRフラグメントを、pGEM-Tベクター（Promega）に連結して、プラスミドCN249およびCN250を作製した。同様に、CN256を、同様の戦略を使用して作製したが、PB-TREフラグメントをpCRTベクター（Invitrogen）に連結した；CN271は、HindIII部位を５’末端に有することを除いてCN250と同一である。これらのプラスミドは、下記に報告される構築物のためのPB-TRE DNAフラグメントを提供する。下記に記載されるアデノウイルスのいくつかにおいて、内因性（アデノウイルス）TREは、欠失されておらず；むしろ、各々の構築物において、PB-TREが内因性TRE（例えば、E1 ATRE）とそのそれぞれのコードセグメント（例えば、E1Aコードセグメント）との間に挿入されていた。他のベクターにおいて、内因性（Ad5）プロモーター−エンハンサーは欠失されており、そして前立腺特異的プロモーター−エンハンサーが初期遺伝子のすぐ上流に配置されていた。 PB-TRE駆動性E1A Ad5プラスミド（CN251）初期遺伝子E1Aの発現がPB-TREの転写制御下にあるアデノウイルスベクターを以下のように作製した。 CN124を、PinAIで線状化し、そして仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（New En gland Biolabs）で脱リン酸化した。CN249をPinAIで消化して、PB-TREフラグメントを遊離させた。次いで、PB-TREフラグメントをPinAI線状化CN124に連結して、CN251を作製した。CN253は、PB-TREが反対方向にある以外はCN251と同様である。従って、構築物CN251は、アデノウイルス５ゲノムにおいてE1Aコードセグメントのすぐ上流に挿入されかつそれに作動可能に連結されたPB-TREを含む。ベクターCN253は、PB-TREが反対方向にある以外は、同様である。 PB-TRE駆動性E1B Ad5プラスミド（CN254）初期遺伝子E1Bの発現がPB-TREの転写制御下にあるアデノウイルス誘導体を以下のように作製した。上記のように、Ad5の左端を有するCN124はまた、人工のEagI部位を、Ad5 nt 1 682、すなわちE1Bコードセグメントのすぐ上流に含む。PB-TREフラグメントを、 CN250からEagIを用いて切り出し、そしてEagIで消化したCN124に挿入した。これは、E1Bコードセグメントのすぐ上流にありかつ作動可能に連結されるPB-TREを含むCN254を生成した。 CN255は、CN254と同一であるが、PB-TREインサートの方向が逆である。CN275 は、HindIII部位を5’末端に有することを除いてCN254と同じである。 2.2 あるアデノウイルス複製遺伝子の発現がPB-TREによって制御されており、そしてべつのアデノウイルス遺伝子の発現がPSE-TREによって制御されている、アデノウイルス構築物の生成 PB-TRE駆動性E1AおよびPSE-TRE駆動性E1Bを含むアデノウイルスベクター（CN257 ） E1A遺伝子の発現がPB-TREの制御下にあり、そしてE1B遺伝子の発現が前立腺特異的抗原転写調節エレメント（PSE-TRE）の制御下にあるアデノウイルスベクターを以下のように構築した。PSE-TRE領域は、とりわけ、米国特許第5,648,478号、および同5,698,443号；Lundwall（1989）Biochim.Biophys.Res.Commun.161:11 51-1159；およびZhangら（1997）Nucleic Acids Res.25：3143-50に詳述されている。 PinAI PB-TREフラグメントを、PinAI（これは、E1Aのすぐ上流を切断する）で消化したCN125に挿入して、構築物CN257を作製した。これは、E1A遺伝子に作動可能に連結されたPB-TREおよびE1B遺伝子に作動可能に連結されたPSE-TREを含むプラスミドである。CN258は、PB-TREフラグメントが反対方向であることを除いてCN257と同様である。 PSE-TRE駆動性E1AおよびPB-TRE駆動性E1Bを含むAd5プラスミドー（CN273） E1Aの発現がPSE-TREによって媒介され、そしてE1Bの発現がPB-TREによって媒介されるアデノウイルスベクターを構築した。 CN143は、PSE-TREフラグメントを含むpBluescript（Stratagene,La Jolla,Cal ifornia）誘導体である。このフラグメントを、PinAIを用いて切り出し、そして PinAI消化したCN254に連結した。最終構築物は、E1A遺伝子に作動可能に連結されたPSE-TREおよびE1B遺伝子に作動可能に連結されたPB-TREを含むプラスミドである。CN274は、PB-TREが反対方向であることを除いてCN273と同様である。 CN306を、CN124から、64ntのE1A内因性プロモーターを除去することによって誘導体化した。CN321を、CN306から、CN96から増幅した大きなPSEフラグメントを挿入することによって作製した。 CN326を、CN321から、PB-TREをEagI部位に挿入することによって誘導体化した。CN321は、PSE（CN96由来）をCN306のPinAI部位に含むプラスミドである。 2.3 あるアデノウイルス複製遺伝子の発現がhKLK2-TREによって制御されており、そしてべつのアデノウイルス複製遺伝子の発現がPB-TREによって制御されている、アデノウイルス構築物の構築 CN463を、CN251から、hKLK2-TREをEagI部位に挿入することによって作製した。hKLK2-TREを、プラスミドCN446からEagIを用いて切り出し、同様に切断したCN 251に連結して、CN463を作製した。CN463構築物は、E1A遺伝子のすぐ上流にかつそれに作動可能に連結されたPB-TRE、およびE1B遺伝子のすぐ上流にかつそれに作動可能に連結されたhKLK2-TRE（hKLK2転写開始部位に対してヌクレオチド-481 4から-3643のhKLK2エンハンサーおよびミニマルhKLK2プロモーターを含む）を含むプラスミドである。 2.4 ２つの異種TREを含むアデノウイルスの作製２つの異種TREを含むアデノウイルスを、293細胞における相同組換えによって作製した。手短には、５μgのCN257および５μgのBHG10（これは、Ad5の右側末端を含む）を293細胞に同時トランスフェクトした。細胞に培地を重層し、そして感染ウイルス（インビボ組換えで作製した）を、細胞変性によって検出し、そして単離した。CN739と称するアデノウイルスベクターのプラーク精製したストックを樹立した。組換えウイルスの構造を、PCR、制限エンドヌクレアーゼ分析、およびサザンブロットによって特徴付けた。CN739のウイルスゲノムは、Ad55 のE1A転写単位をPB-TREの制御下に有するが、E1Bは、PSE-TREの制御下にある。図２に示すように、それぞれ、CN273、CN326、CN416、CN436、CN446、CN459、 CN463と置換したことを除いて、同じアプローチを用いて、アデノウイルスCN750 、CN753、CN764、CN767、CN770、CN772、CN774を、CN257を作製した。実施例３前立腺細胞特異的異種TREの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルス構築物のインビトロ特徴付けプラークアッセイ実施例１および２に記載されるアデノウイルス構築物が前立腺細胞において優先的に複製されるか否かを決定するために、プラークアッセイを行った。プラークアッセイは、特定のウイルスがどれだけ効率よく細胞において感染を引き起こすかを定量する感染定量アッセイである。プラーク効率を、以下の細胞型において評価した：前立腺腫瘍細胞株（LNCaP、PC-3）、乳房正常細胞株（HBL-100）、乳ガン細胞株（MCF-7）、卵巣腫瘍細胞株（OVCAR-3，SK-OV-3）、肝ガン細胞株（HepG2、SK-Hep-1）、およびヒト胚腎臓細胞（293）。LNCaP細胞は、アンドロゲンレセプターおよびPSAの両方を発現するが，一方、試験した他の細胞株は発現しない。293細胞は、プラーク形成効率のポジティブコントロールとして役立つ。なぜなら、この細胞株は、Ad5 E1AおよびE1Bタンパク質を発現するからである。プラークアッセイを以下のように行った。コンフルエントな細胞単層を６ウェルのディッシュに、感染18時間前に播種した。単層に10倍連続希釈の各ウイルスを感染させた。単層を4時間無血清培地（MEM）中で感染させた後、培地を除去し、そして0.75％低融点アガロースおよび組織培養培地の溶液に置換した。プラークを感染後２週間で評価した。CN702は、E1領域に改変を有さず、そして野生型コントロールとして用いる。異種TREを有するアデノウイルスのプラークアッセイデータ（野生型アデノウイルス（PFU/ml）の％）異種TREを有するアデノウイルスのプラークアッセイデータ（野生型アデノウイルス（PFU/ml）の％）異種TREを有するアデノウイルスのプラークアッセイデータ（野生型アデノウイルス（PFU/ml）の％）異種TREを有するアデノウイルスのプラークアッセイデータ（野生型アデノウイルス（PFU/ml）の％）異種TREを有するアデノウイルスのプラークアッセイデータ（野生型アデノウイルス（PFU/ml）の％）異種TREを有するアデノウイルスのプラークアッセイデータ（野生型アデノウイルス（PFU/ml）の％）異種TREを有するアデノウイルスのプラークアッセイデータ（野生型アデノウイルス（PFU/ml）の％）表１〜７は、実施例１および２に記載のアデノウイルスベクターを用いて行ったプラークアッセイの結果を示す。結果を、1mlあたりの野生型アデノウイルスのプラーク形成単位（PFU）の％として表す。表は、試験したウイルスについての二連のサンプルの平均力価を示す。全ての細胞株における特定のウイルスについての力価を、293細胞での力価に対して正規化した。一旦、ある細胞型についての力価が、293細胞に対して正規化されると、正規化された数の組換えウイルスが、CN702に対して比較される。100未満の比は、試験したウイルスが、CN702 よりも低い効率でプラーク形成することを示唆する。逆に、100より大きな比は、ウイルスがCN702よりも高い効率でプラーク形成することを示唆する。以下の観察を行った。第１に、hKLK2-TRE、PSE-TREおよびPB-TREで操作したアデノウイルスは、前立腺腫瘍細胞において優先的な複製を実証した。このガンはアンドロゲンレセプターを発現するので、アデノウイルスベクター中に含まれた PSE、hKLK2およびPBのTREは、アデノウイルス初期遺伝子の転写を促進する際に活性であるはずである。表１〜７に示したデータは、異種TRE含有アデノウイルスベクターが、前立腺腫瘍細胞において、野生型アデノウイルスよりもわずかに低い効率で細胞変性効果を誘導することを示唆する。第２に、hKLK2-TRE、PSE-T REおよびPB-TREを含有するアデノウイルスは、野生型と比較した場合に、非前立腺腫瘍細胞において劇的に低いプラーク形成効率を示す。例えば、卵巣ガン細胞株OVCAR-3、CN764およびCN739は、それぞれ、野生型Ad5よりも3,000〜10,000倍低いプラークを生成した。結果は、HBL-100細胞においてこれらの２つのウイルスについて類似し、ここでウイルス複製はまた、激しく損なわれる。第３に、２つの前立腺細胞特異的な異種TREを含有するアデノウイルスベクターは、２つの型のアデノウイルスベクターの力価がLNCaP細胞において類似するにもかかわらず、非前立腺細胞において、単一の異種前立腺細胞特異的TREを含有するアデノウイルスベクターよりも、10〜100倍（以上）低いプラークを与える。例えば、P SE-TREおよびhKLK2-TRE（CN764）またはPSE-TREおよびPB-TRE（CN739）アデノウイルスベクターは、それらの力価がLNCaP細胞においてCN706に類似するにもかかわらず、HBL-100およびOVCAR-3細胞において、CN706よりも10〜100倍低いプラークを与える。従って、２つの異なる前立腺細胞特異的TREを用いて操作されたアデノウイルスは、非前立腺細胞において野生型アデノウイルスおよびCN706に対して有意に弱毒化されたが、これらはLNCaPにおいてCN706に類似の活性を示した。上記のように、２つの異種TREを含有するアデノウイルスは、野生型アデノウイルスおよびCN706（PSE-TREがE1Aを制御する）と比較した場合、前立腺腫瘍細胞において予想外に高い優先的な複製を実証した。この特異性の増加は、第２の前立腺特異的TREを挿入するという相加効果を超える。 CN739およびCN764は、最も特異的なウイルスであるようであるので、これらを、以下の実験においてさらに特徴付けた。細胞変性効果差示的ウイルス複製および細胞変性効果（CPE）を特徴付けるために、CPEアッセイを以下の様に実施した。細胞を、漸増する感染多重度(MOI)にてウイルスに感染させ、そして細胞変性効果についてモニターした。単層の完全な細胞溶解が野生型アデノウイルスを用いて0.01のMOIで観察された場合にアッセイを終了した。１つの初代非不死化ヒト微小血管内皮細胞株（hMVEC）を、インビトロでのC N764および野生型アデノウイルス(CN702)感染に対する感受性を試験するために選択した。図３に示すように、CN702は、0.01程度の低いMOIで10日以内に、hMVE Cの完全な単層細胞溶解を生じた。対照的に、CN764感染hMVEC単層は、10、1.0、 0.1および0.01のMOIを用いて同時点において顕著な細胞変性効果を示さなかった。野生型アデノウイルスを用いて見られる細胞溶解と等価であるhMVECの細胞溶解は、100〜1000倍高いMOI（MOI＞10）においてのみ立証された。 CPEアッセイをCN739を用いて行った場合、CN739で感染させたhMVEC単層は、10 、1.0、0.1、および0.01のMOIを用いて同時点において顕著な細胞変性効果を示さなかったので、結果は、CN764の結果と類似した。従って、CN764およびCN739媒介性細胞溶解は、初代ヒト正常細胞において野生型アデノウイルスに対して顕著に弱毒化される。差示的ウイルス複製ウイルス複製のレベルが、前立腺腫瘍細胞またはヒト正常細胞においてCN739 の細胞変性効果と相関するか否かを決定するために、本発明者らは、PSA産生前立腺腫瘍細胞(LNCaP)および初代ヒト微小血管内皮細胞(hMVEC)におけるウイルス複製力価測定を行った。細胞を70〜90%コンフルエンスまで増殖させ、そして10 のMOIで90分間、野生型アデノウイルス(CN702)またはCN739、CN764、CN765、CN7 70のいずれかで感染させた。感染55時間後、ウイルスを３回の凍結/解凍サイクルにより細胞から遊離させて、得られた上清を293細胞で力価測定した。感染56 時間後に生成されたCN739の量を、同じ期間中に同一細胞株内に生成された野生型ウイルスの量に対して正規化した。図４に示すデータは、２つの異なる前立腺細胞特異的TREを含有するアデノウイルスベクターの力価は、LNCaPにおけるCN70 2の力価の30％であるが、正常細胞においては野生型ウイルスの100分の１未満まで低下されたことを示す。これらのデータは、CN764様ウイルスが初代正常ヒト細胞ではほとんど複製せず、そして前立腺ガン細胞においてはいくらか弱毒化されることを示唆する。一段階増殖曲線 LNCaPおよびhMVECにおける一段階増殖曲線アッセイを用いて、CN739、CN706、およびCN702の複製の効率および速度論を測定した。LNCaPおよびhMVECの複製単層を、全ての細胞の同調感染を得るために10のMOIで感染させた。二連の培養物を、感染後の種々の時点で収集した。感染性ウイルスの数を、293細胞におけるプラークアッセイにより決定した（図５）。CN739およびCN706はLNCaPにおいては同様な効率で増殖した。しかし、同一条件下で、CN739はhMVECではほとんど増殖せず、CN706および野生型アデノウイルスよりも、それぞれ約10,000倍〜80,00 0倍少ない感染性ウイルスを産生した。従って、一段階増殖曲線は、２つの異なる前立腺細胞特異的TREを含有するアデノウイルス（各々が異なるアデノウイルス遺伝子の制御下にある）は、前立腺腫瘍細胞で十分増殖するが、非前立腺内皮細胞では極めて増殖が悪く、明確に増強された、標的細胞に対する特異性を示すことを実証した。２つの異なる異種TREを含有するアデノウイルスの安定性アデノウイルスベクターにおける２つの異なる異種TREの使用は、アデノウイルス複製の間にゲノムに安定性を提供するようである。CN739およびCN764を、３回プラーク精製し、そしてそれらのDNAをPCRおよびサザンブロット分析により試験した。この分析により、ウイルスゲノムは、配列の再配列または喪失を受けなかったようである。なぜなら、フラグメントが予想されたサイズのフラグメントであったからである。結果は、２つの異なる異種TREを含有するアデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムが安定であることを示す。実施例４腫瘍異種移殖片へのアデノウイルスベクターの細胞傷害能力の試験標的細胞特異的アデノウイルスベクターの開発における特に有用な目的は、標的細胞を含む新形成を有する患者を処置することである。例えば、上記の前立腺細胞特異的アデノウイルスベクターは、前立腺ガンを有する患者を処置するために有用であり得る。可能性の最初の指標は、当該分野で公知の技術を用いてベクターを試験すること、例えば、ベクターを新生物性細胞（例えば、前立腺ガン、 Balb/c nu/nuマウスにおいて皮下で増殖させた異種移植片）に対する細胞傷害性について試験することである。インビボにおけるCN739の治療効力を試験するために、LNCaP腫瘍異種移植片を無胸腺マウス内で増殖させた。腫瘍細胞を、各マウスの各側腹部の皮下に注射し、そして触知可能な腫瘍（平均腫瘍体積300mm³）の確立後、2.5×10⁸粒子/mm³のCsCl精製CN739、またはコントロールとして10%グリセロール（ビヒクル）を含むPBSを、直接腫瘍に注射した。次いで、腫瘍増殖を６週間追跡し、その時点で各群の平均腫瘍体積を測定し、そして血清サンプルを、０日およびその後１週間毎にPSA分析のために収集した。図６に示すデータは、28日目には、CN739でのLNCaP腫瘍の処置は、平均腫瘍体積を80%減少させたが、一方、ビヒクル処置をしたＩ群の平均腫瘍体積は開始時体積の400%まで増加したことを示す。CN739処置したII群において、７匹のうちの４匹(57%)の動物では、42日目には触知可能な腫瘍がなかった。この研究は、腫瘍あたり２つの異なる前立腺細胞特異的TRE（各々が、２つの異なるアデノウイルス遺伝子に作動可能に連結される）を含有するアデノウイルス（CN739）の固定された単回用量が、インビボにおけるLNCaP異種移植片に対して効力があることを実証する。血溝PSALレベルに対する効果血清PSAレベルは、前立腺ガンの診断および管理のために広く使用されているマーカーである。LNCaP細胞は、培養培地中および循環内に高レベルのPSAを発現および分泌する。LNCaP腫瘍異種移植片を有するマウスの血清PSA濃度に対するCN 739を用いた処置の効果を試験するために実験を設計した。処置後、Ｉ群（ビヒクルのみ）の平均血清PSAレベルは、28日目までに開始時の値の約800%まで増加したのに対し、II群（CN706処置）およびIII群(CN739処置 )における平均PSAレベルは21日目を過ぎても本質的には一定のままであり、35日目までに開始時の値の10%まで減少した（図７）。I群とII群との間には14日目以降において、統計学的有意差（ｐ＜0.001；Ｔ検定）が存在した。これらの結果は、成果が肺瘍増殖または血清PSA濃度の減少のいずれかにより測定される場合、LNCaP異種移植片モデルにおいて、CN739処置は効力があることを実証する。インビトロでのデータを総合すると、２つの異なる前立腺細胞特異的TREを有するアデノウイルス（CN739）は、単一の前立腺細胞特異的TREを有するアデノウイルスCN706の治療効力と類似の治療効力をインビボで有するが、さらに、CN706よりも高い細胞特異性を有することを示唆する。本明細書に記載のウイルスに基づく治療は病変内に与えられる（すなわち、直接注射）ようであるが、ウイルスの静脈内（IV）投与が腫瘍増殖に影響を与え得るか否かを決定することもまた所望される。その場合、ウイルスを用いて、直接注射では接近しにくい転移性腫瘍沈着物を処置することが考えられ得る。この実験のために、前立腺ガン腫瘍を保有する５匹のマウスの群に、10⁸pfuの本発明のアデノウイルスベクターを尾静脈注射により、またはウイルスの非特異的毒性効果のコントロールのための10⁸pfuの複製欠損アデノウイルス（CMV-LacZ）を、またはウイルスを運ぶために用いた緩衝液を用いて接種する。肺瘍のサイズに対するアデノウイルスベクターのIV注射の効果は、偽処置に匹敵した。実施例５細胞特異的異種TREの制御下の第１のアデノウイルス遺伝子および第２の異種TRE の制御下の少なくとも１つの第２の遺伝子を含む他のアデノウイルス構築物の構築、ここで、両方の異種TREは、同じ細胞において機能的である。異種TREを含有するアデノウイルスベクターを、種々の新形成に対してアデノウイルス複製を標的化するために生成し得る。以下は、非標的細胞と比較して、標的細胞において優先的にアデノウイルスベクターの複製を導くように、アデノウイルス遺伝子の発現を制御するために用いられ得る細胞特異的（いくつかの場合には、肺瘍細胞特異的）TREの実施例を記載する。細胞特異的アデノウイルスベクターは、ベクターが処置を提供し得るある型の新形成の下で記載される。いくつかのアデノウイルスベクターは、１より多くの型の新形成の処置に有用であり得る。なぜなら、TREは、本明細書中に記載のように、１より多くの型の腫瘍細胞において機能性であるからである。例示的なアデノウイルスベクターの模式図を図8(A)〜(B)に示す。肝臓新形成特異的アデノウイルスベクターの生成。上記のように、AFP遺伝子由来のTREは、肝臓新形成において特異的に活性であることが示されている。ヒトAFPエンハンサードメインＡおよびＢ（AFPキャップ部位に対して、領域-3954bp〜-3335bpに含まれる）を、ヒトゲノムDNAから以下のプライマーを用いてPCR増幅した： AFPプロモーターを、-163〜+34を以下のプライマーを用いて増幅した：エンハンサーセグメントおよびプロモーターセグメントをアニーリングし、そして融合構築物を、プライマー39.055Bおよび39.055Jを用いる重複PCRを用いて生成した。この最小のエンハンサー/プロモーターフラグメントを、PinA1を用いて消化し、そしてE1Aキャップ部位の5'側の操作されたAgeI部位を用いてCN124と連結し、CN219を生じた。CN219では、AFP-TREは、E1Aコード配列のすぐ上流であり、そしてE1Aコード配列に作動可能に連結されている。上記のAFP-TREを、以下のプライマー（EagI部位に下線を付した）を用いて増幅した： PCR産物を、EagIを用いて消化し、そしてCN124におけるE1B遺伝子のすぐ上流のEagI部位に連結して、CN234を生成した。CN234ではAFP-TREは、E1Bコード配列のすぐ上流であり、そしてE1Bコード配列に作動可能に連結されている。 uPAプロモーターおよび他の転写応答エレメント（Riccioら（1985）Nucleic A cids Res．13:2759-2771;Cannioら（1991）Nucleic Acids Res．19:2303-2308）を、末端のEagI部位を用いてPCRにより増幅し、そしてEagIで消化したCN219に連結してCN479を生じた。CN479は、E1Aに作動可能に連結されたAFP-TREおよびE1B に作動可能に連結されたuPA-TREを有する構築物である。同様に、uPA-TREを、Pi nAI部位でCN234中に操作してCN480を生成する。CN480は、E1AがuPA-TREの転写制御下にあり、そしてE1BはAFP-TREの転写制御下にある構築物である。乳ガン細胞特異的アデノウイルスベクターの生成上記のように、MUC1遺伝子由来のTREは、乳がん細胞において特異的に活性であることが同定された。E1A遺伝子の発現がMUC1-TREの制御下にあるアデノウイルスベクターを以下の通りに構築した。配列番号29のMUC1-TRE領域を、以下のプライマー対を用いるPCRによりヒトゲノムDNAから増幅した：プライマーを、BspEI末端（これは、CN124中のAgeI部位と適合性である）を用いて構築した。本明細書中に記載のように、CN124は、Ad5のnt547（nt498でのE1 A転写開始および610でのATGで始まるE1Aコードセグメントのすぐ上流）にAgeI部位を、そしてAd5のnt1682またはE1Bコードセグメントのすぐ下流にEagI部位を有する。MUC1-TRE PCR産物をBspIを用いて消化し、そしてCN124のAgeI部位に連結してCN226を作製した。CN226では、MUC1-TREは、E1Aコード配列のすぐ上流であり、そしてE1Aコード配列に作動可能に連結される。 MUC1-TREを、EagI末端を含ませるために、以下のプライマー対を用いてCN226 から増幅した： MUC1-TRE PCR産物を、EagIを用いて消化し、そしてCN124のEagI部位に連結してCN292を作製した。CN292では、MUC1-TREは、E1B遺伝子のすぐ上流であり、そしてE1B遺伝子に作動可能に連結される。ヒトHER-2/neu（HER）-TRE（Talら(1987)Mol．Cell．Biol．7:2597-2601;Huds onら(1990)J．Biol．Chem．265:4389-4393;Grooteclaesら（1994）Cancer Res． 54:4193-4199;IShiiら(1987)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:4374-4378;Scott ら(1994)J．Blol．Chem．269:19848-19858）を、末端のEagI部位を用いてヒトゲノムDNAから増幅し、EagI切断CN226に連結してCN481を生成する。CN481は、MUC1 -TREが、E1A遺伝子に作動可能に連結され、そしてHER-TREがE1B遺伝子に作動可能に連結されている構築物である。同様に、HER-TREを、末端にPinAI部位を有するPCRによりCN481から増幅し、そして同様に切断したCN292に連結してCN482を生成する。CN482は、HER-TREが、E1A遺伝子に作動可能に連結され、そしてMUC1-TR EがE1B遺伝子に作動可能に連結されている構築物である。別のセットの乳ガン細胞特異的アデノウイルスベクターを、uPA-TREがEagIを用いてCN485から遊離され、そして同様に切断されたCN481に連結される場合にCN 487が生成される。CN487は、MUC1-TREがE1A遺伝子に作動可能に連結され、そしてuPA-TREがE1B遺伝子に作動可能に連結されている構築物である。CN488は、２つの異種TREの位置が交換されること以外はCN487と同じである。CN488は、uPA-T REがE1A遺伝子に作動可能に連結され、そしてMUC1-TREがE1B遺伝子に作動可能に連結されている構築物である。別のセットの乳ガン細胞特異的アデノウイルスベクターを、CEA-TREがEagIを用いてCN484から遊離され、そして同様に切断されたCN487に連結されてCN489が生成される場合に生成する。CN489は、MUCI-TREがE1A遺伝子に作動可能に連結され、そしてCEA-TREがE1B遺伝子に作動可能に連結されている構築物である。CN49 0は、２つの異種TREの位置が交換されていることを除いてCN489と同じである。C N490は、CEA-TREがE1A遺伝子に作動可能に連結され、そしてMUC1-TREがE1B遺伝子に作動可能に連結されている構築物である。結腸ガン細胞特異的アデノウイルスベクターの生成。上記のように、CEA遺伝子由来のTREは、結腸ガンを含む多くの新形成において特異的に活性であることが同定されている。E1A遺伝子の発現がCEA-TREの制御下にあるアデノウイルスベクターを、以下の通りに構築した。ガン胎児性抗原（CEA-TRE）のTRE（転写開始に対する約-402〜約+69bp）（配列番号７）を、以下のプライマー（これは、末端にAgeI部位を導入する）を用いてヒトゲノムDNAからPCRにより増幅した： CEA-TRE PCRフラグメントを、EcoRVを用いて線状化したpGEM-Tベクターに連結し、そしてCN265と命名した。CEA-TREを、PinAIを用いる消化によりCN265から切り出し、そして同様に消化したCN124に連結してCN266を生成した。CN266は、構築物266は、CEA-TREがE1A遺伝子に作動可能に連結されている構築物である。 CEA-TREを、以下のプライマーを用いるPCRによりCN266から増幅した：独特の制限部位EagIを、プライマー対によりPCR増幅産物の末端に導入した。P CR産物を、pGEM-Tベクター（Promega）に連結し、そして得られたプラスミドをC N284と命名した。Eagl CEA-TREフラグメントを、CN284から切り出し、ゲル電気泳動により分離し、そしてEagIで切断したCN124に連結してCN290を作製した。CN 290は、CEA-TREが、E1B遺伝子のすぐ上流であり、そしてE1B遺伝子に作動可能に連結されている構築物である。 uPA-TREは、EagIを用いてCN479から遊離され、そして同様に切断したCN266に連結されてCN483を生成する。CN483は、CEA-TREがE1A遺伝子に作動可能に連結され、そしてuPA-TREがE1B遺伝子に作動可能に連結されている構築物である。同様に、CN484は、uPA-TREがE1A遺伝子に作動可能に連結され、そしてCEA-TREがE1B 遺伝子に作動可能に連結されている構築物である。結腸ガン細胞特異的アデノウイルスベクターの生成。 CN485は、HER-TREが、E1A遺伝子に作動可能に連結し、そしてuPA-TREがE1B遺伝子に作動可能に連結している構築物である。uPA-TREは、EagIを用いてCN479から遊離され、そして同様に切断したCN482に連結されてCN485を生成する。 CN486は、２つの異種TREの位置が交換されていることを除いて、CN485と同じである。CN486は、uPA-TREがE1A遺伝子に作動可能に連結され、そしてHER-TREが E1B遺伝子に作動可能に連結されている構築物である。複数の異種TREを含むさらなるアデノウイルスベクターの生成本発明は、異種TREの転写制御下のさらなる遺伝子を排除しない。従って、第３の遺伝子が第３の異種TREの転写制御下にあるアデノウイルスベクターが生成され得、ここですべてのTREは互いに異なり、そしてすべては同じ細胞において機能的である。アデノウイルスベクターは、３つの遺伝子（例えば、E1A、E1B、およびE4遺伝子）と作動可能な連結での、PB-TRE、PSE-TRE、およびhKLK2-TREの挿入を介して生成される。これらの前立腺細胞特異的TREを上記のように増幅し、そして本明細書中に記載されるようにアデノウイルスベクターに挿入する。図９は、そのようなアデノウイルス構築物の例を示す。３つの遺伝子が上記の３つの他の細胞特異的TREによって制御される構築物の例もまた、図９に示す。アデノウイルス構築物CN781は、例えば、HER-TREが機能的である肝臓新形成を標的化するために有用であり得る。複数の異種TREを含むアデノウイルスを、上記のように293細胞における相同組換えによって生成する。実施例６アデノウイルス死タンパク質遺伝子を含むE3欠失アデノウイルスCN751の特徴付けアデノウイルス死タンパク質変異体CN751を、そのような構築物が細胞傷害性についてより効果的であり得るか否かを試験するために構築した。アデノウイルス死タンパク質（ADP、感染の後期に高レベルで発現される11.6kDのAsnグリコシル化内在性膜ペプチド）は、感染した細胞の核膜に移動し、そして宿主の効率的な溶解に影響を及ぼす。アデノウイルス5(Ad5)E3領域は、adp遺伝子を発現する。 CN751の構築 CN751を、２つの部分に分けて構築した。第一に、21562bpのBamHI部位から3' 側にAd5配列を含むE3欠失プラットフォームプラスミドを生成した。CN252を生成するために、このプラスミドのE3領域の残りの部分中にAd2 adpを操作した。ADP カセットを、オーバーラップPCRを用いて構築する。Yリーダー（いくつかの後期遺伝子の正確な発現のために重要な配列）を、以下のプライマーを用いてPCR増幅する： ADPコード領域を、以下のプライマーを用いてPCR増幅する：２つのフラグメントをアニーリングし、そしてオーバーラップ産物を、プライマー37.124.1および37.124.4を用いてPCR増幅した。産物の末端を、クレノウフラグメントで平滑化し、そしてBamHI切断したpGEM-72(+)(CN241；Promega，Madi son，WI)に連結した。ADPカセットを、Pac 1制限エンドヌクレアーゼでCN241を消化することによって切り出し、そして２つのベクター(CN247およびCN248)と連結し、それぞれプラスミドCN252およびCN270を生成した。CN247は、E3領域中に特有のPacI部位を含み、そして以下のように構築された。全長Ad5ゲノムTG3602 を含むプラスミド（Transgene，France）をBqamHIで消化し、そして再連結してC N221を生成した。このプラスミドの（Ad5配列の外側の）骨格は、さらなる操作を可能にするために取り出されることが必要なPacI部位を含んだ。これを、CN22 1をPacIで消化し、そしてT4 DNAポリメラーゼで末端を平滑化することによってもたらし、CN246を生成した。CN246を、AscIおよびAvrIIを（インタクトなE3領域を取り出すために）消化した。このフラグメントを、BHG11に由来する同様に切断したフラグメントで置換した。得られたプラスミドCN247は、欠失したE3領域、およびADPカセットフラグメントの挿入に適切なPacI部位(上記)を含んだ。C N247のADPカセットとの連結によってCN252が生成された。第二の部分を構築するために、CN751に必要な5'Ad5配列を、精製したCN702 DN AをEcoRIで消化する工程、およびゲル抽出によって左手のフラグメントを単離する工程により得た。CN252をEcoRIで消化した後、CN702およびCN252の左手のフラグメントを連結した。293細胞を、Calydon，Inc.にて開発された標準的なリポフェクショントランスフェクションプロトコルを用いることによってこの連結混合物でトランスフェクトし、そして37℃でインキュベートした。10日後、細胞を収集し、凍結融解を３回繰り返し、そして上清を293単層上にプラークした。個々のプラークを拾い上げ、そして293細胞の単層を感染させ、試験するに十分なウイルスを増殖させるために使用した。数日後、候補ウイルスを検出するために、プレート溶解物をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくアッセイを使用してスクリーニングした。陽性を示すプラークのうちの一つを、CN751と命名した。 CN751の構造的特徴付け CN751の構造を、２つの方法により確認した。第一に、プライマー37.124.1、および37.124.4を、adpカセットの存在を検出するために、PCRにより候補ウイルスをスクリーニングするために使用した。CN751は、予測した生成物(1065bp)と一致する伸長フラグメントを生成した。第二に、CN751をサザンブロットにより分析した。ウイルスDNAを精製し、PacI、SacIおよびAccI/XhoIで消化し、そして ADPコード領域に相同な配列でプローブした。CN751の構造は予測したパターンと合致した。 CN751のインビトロ特徴付け CN751の細胞傷害性およびウイルス収量を試験するために２つの実験を実施した。第一の研究において、数日にわたり上清中のサイトゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の蓄積を測定することにより、LNCaP細胞におけるCN751の細胞傷害性を評価した。細胞外LDHのレベルは、細胞溶解の程度と相関する。健常な細胞は、（もしあれば）ほとんど酵素を放出しないが、死細胞は大量に放出する。LDHは、単純なプロトコルによって容易に検出され得る安定なタンパク質であるために、マーカーとして選択された。CN751の細胞死を引き起こす能力を、A DP遺伝子欠損ベクターであるCN702、およびADP遺伝子を含むベクターであるRec7 00の能力と比較した。 LNCaP細胞の単層を、１の感染多重度で、CN702、Rec700、またはCN751のいずれかを感染させ、次いで96ウェル皿に播種した。サンプルを感染後１日目から感染後５日目まで、１日に１度収集し、そしてPromegaのCytotox96キットを使用してスコア付けした。このアッセイは、テトラゾリウム塩を、490nmでプレートリーダー内で決定され得る赤色のホルマザン産物に変換する共役酵素反応を使用する。サンプルの吸光度が、感染細胞から放出されるLDHのレベルに対応するために、サンプルの吸光度が時間とともにどのように変化するかのプロットは、試験したウイルスが、細胞溶解をどれほど効率的に誘導するかを説明する（図10）。各データ点は、16の別々のサンプルの平均を示す。結果は、CN751が、adp-コントロールCN702よりも高い効率で、そしてadp＋コントロールRec700と同様に細胞を殺傷することを示唆する。CN751で感染したウェル中において、上清中のLDHの濃度は、２日目から急激に増加し、そして４日目に最大に達する。対照的に、CN70 2感染細胞の上清中のLDH濃度は、２日目にゆるやかに上昇し始め、そして実験終了まで継続する。有意には、３日目でのCN751感染細胞から放出されるLDHの量は、CN702感染細胞から放出される量の２倍である。データは、adp遺伝子を有するアデノウイルスベクターが、adp遺伝子を欠くアデノウイルスベクターより効率的に細胞を殺傷することを証明する。アデノウイルスベクターが細胞を効率よく殺傷することが重要であるだけではなく、アデノウイルスベクターはまた、他の標的細胞に感染し得る子孫を散布(s hed)し得なくてはならない。大量のウイルスを散布し得るウイルスベクターは、少量のみを散布するものより優れた治療剤であり得る。CN751が感染細胞からの子孫の効率的放出を誘導し得るか否かを評価するために、ウイルス収量アッセイを行った。A549細胞を５のMOIで感染させた。感染後の種々の時間に上清を収集し、そしてウイルス収量を決定するために、293細胞上で力価測定を行った(図11 )。データは、CN751で感染した細胞がCN702で感染した細胞より高い効率でウイルスを散布することを示唆する。感染の48時間後、CN751感染細胞は、CN702感染細胞より10倍多いウイルスを放出した。感染の72時間後では、CN751感染細胞は、40倍のウイルスを放出した。要約すると、ウイルス収量データは、adp遺伝子を有するアデノウイルスベクターがより多くのウイルスを放出することを証明する。 CN751のインビボ特徴付け LNCaPヌードマウス異種移植片を、ADP遺伝子を含むベクターであるCN751、またはこの遺伝子を欠損するベクターであるCN702のいずれかの、単一の腫瘍内投与（１×10⁴粒子/mm³腫瘍）でチャレンジした。腫瘍の第三の群を、緩衝液のみで処理した。肺瘍を６週間、週毎にモニターし、そしてその相対体積を時間に対してグラフ化した。結果を図12に示す。誤差のバーは、各サンプル群の標準誤差を示す。CN751処理動物（ｎ＝14）についての開始時平均腫瘍体積は、CN702処理（ｎ＝14）について320mm³であり、そして緩衝液処理（ｎ＝８）については343m m³であった。データは、CN751がCN702より効果的に腫瘍細胞を殺傷することを示唆する。平均的に、CN751でチャレンジされた腫瘍は、実験過程を通して同じサイズのままであったが、14腫瘍内の９(64％)が収縮した。CN702処理した腫瘍はサイズが２倍になった。緩衝液処理腫瘍は、開始時体積の約５倍に増殖した。スチューデントT-検定は、CN751とCN702処理腫瘍との間の腫瘍サイズの差異が、７日目（ｐ＝0.016）から実験終了（ｐ＝0.003）までで、統計的に有意であったことを示す。実施例７共有結合的にPEG化したアデノウイルスの調製 PEGでアデノウイルスを複合体化することにより、アデノウイルスの表面キャプシドを改変するために一連の実験を行った。アデノウイルス表面をマスクする PEG複合体化の目的は以下である：1）循環内のアデノウイルス中和抗体またはオプシニン(opsinin)、および2)体内の非特異的クリアランス機構（すなわち、マクロファージ等）の減少によるアデノウイルス粒子の全身循環時間の増加。野生型アデノウイルスCN706の表面キャプシドを、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジルスクシンアミド(NHS)を使用して、ヘキソンおよび線維タンパク質へのPEGの共有結合的結合を介して改変した。PEG（Shearwater Polymers，Inc.）は、5000 Daの名目上の分子量を有した。活性化PEG（約２mM）を、tris-HCl緩衝液中で５ ×10⁹粒子/mlアデノウイルスと反応させた（ウイルス粒子のPEGに対するおよそのモル比は、1:4×10⁶であった）。pH、温度、および反応時間の種々の組み合わせを使用した。反応後、未反応の活性化PEG、未反応のアデノウイルス、およびP EG化(pegylated)アデノウイルスを、50mM tris、pH8.0中で０から1.5MのNaCl勾配をかけて、Q Sepharose XL(Pharmacla)での陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離した。勾配を、10カラム容量にわたってかけた。 PEG-CN706の特徴付け CN706のPEG化をSDS-PAGEにより検証した。図14は、CN706のPEG化およびPEG化タンパク質の移動度のシフトを図示する。レーン１および２は、非PEG化CN706（コントロール）であり、レーン３〜６はいくつかのpHおよび温度条件下でのPEG 化CN706である。レーン３〜６は、CN706のヘキソンタンパク質の上部の第二バンドの出現（おそらくPEG化ヘキソン）、および線維タンパク質バンドの欠失を示す。PEG-ヘキソンタンパク質に対応するものを除いてはウイルスと関連するさらなるバンドは存在しないため、PEG化線維タンパク質は、SDSゲル上の非PEG化タンパク質の内の一つの下にあると想定される。図15は、CN706の表面特性における変化を示すイオン交換クロマトグラムである。CN706のPEG化は、ウイルスを捕獲するために使用されるQ Sepharose樹脂からのより早い溶出を生じる。この結果は、PEGがウイルスのより多い電荷を見かけ上中性にし、従ってイオン交換マトリクスに対する結合電位を低下することに起因すると最も思われる。CN706のPEG化が異なる割合まで起こるために、ウイルスのクロマトグラムの広幅化が予測される。 PEG化CN706の感染能を、293細胞上のインビトロプラークアッセイにおいて評価した。表８は、CN706と比較した場合、PEG-CN706のプラーク形成効率が５分の1〜10分の１に低下することを示す。これは、PEG化がウイルス細胞をマスクし、ウイルス粒子の認識およびエンドサイトーシスを減少させることに起因すると最も思われる。本明細書中で記述されるすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、参考として援用されることが詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に、本明細書中において参考として援用される。前述の発明は、理解を明確にする目的で例示および実施例によりいくぶん詳細に説明されたが、特定の変更および改変が実施され得ることは当業者に明らかである。従って、説明および実施例は、添付の請求の範囲により記載される本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １０５Ａ６１Ｐ 43/00 １１１１１１Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 7/00 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号６０／０５４，５２３ (32)優先日平成９年８月４日(1997．8．4) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／０３３，５５６ (32)優先日平成10年３月２日(1998．3．2) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ランパルスキ，ヘンリージー. アメリカ合衆国カリフォルニア 94402, サンマテオ，サウスエルドラド 422

Claims

【特許請求の範囲】１．第１の異種転写調節エレメント（TRE）の転写制御下の第１のアデノウイルス遺伝子、および第２の異種TREの転写制御下の少なくとも１つの第２の遺伝子を含むアデノウイルスベクターであって、ここで、該第１の異種TREが細胞特異的であり、該第１の異種TREが該第２の異種TREとは異なり、そして該異種TREが同じ細胞において機能的である、アデノウイルスベクター。２．前記第１のアデノウイルス遺伝子がアデノウイルス複製に必須である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。３．前記複製に必須な遺伝子がアデノウイルス初期遺伝子である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。４．前記複製に必須な遺伝子がアデノウイルスE1A遺伝子である、請求項３に記載のアデノウイルスベクター。５．前記複製に必須な遺伝子がアデノウイルスE1B遺伝子である、請求項３に記載のアデノウイルスベクター。６．前記複製に必須な遺伝子がアデノウイルスE4遺伝子である、請求項３に記載のアデノウイルスベクター。７．前記複製に必須な遺伝子がアデノウイルス後期遺伝子である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。８．前記第１および第２の遺伝子がアデノウイルス複製に必須である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。９．前記第１および第２の遺伝子がアデノウイルス初期遺伝子である、請求項８に記載のアデノウイルスベクター。１０．複製に必須な１つの遺伝子がアデノウイルス初期遺伝子であり、そして複製に必須な１つの遺伝子がアデノウイルス後期遺伝子である、請求項８に記載のアデノウイルスベクター。１１．前記第２の遺伝子がトランスジーンである、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１２．前記トランスジーンが細胞傷害性遺伝子である、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。１３．前記アデノウイルス遺伝子がアデノウイルス死タンパク質遺伝子である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１４．前記第２の遺伝子がトランスジーンである、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。１５．前記トランスジーンが細胞傷害性遺伝子である、請求項１４に記載のアデノウイルスベクター。１６．前記第２のアデノウイルス遺伝子がアデノウイルス死タンパク質遺伝子である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。１７．前記第１および第２の異種TREが細胞特異的であり、そして同じ細胞において機能する、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１８．第３の遺伝子が第３の異種TREの転写制御下にあり、そして該第３の異種T REが前記第１および第２の異種TREとは異なる、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１９．さらなる遺伝子が前記第２の異種TREの転写制御下にある、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。２０．前記第１の異種TREが前立腺細胞特異的である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。２１．前記第１の異種TREがPSE-TREである、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。２２．前記第１の異種TREがPB-TREである、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。２３．前記第１の異種TREがhKLK2-TREである、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。２４．前記第１の異種TREが肝細胞特異的である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。２５．前記第１の異種TREがAFP-TREである、請求項２４に記載のアデノウイルスベクター。２６．前記第１の異種TREが乳ガン細胞特異的である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。２７．前記第１の異種TREがMUC1-TREである、請求項２６に記載のアデノウイルスベクター。２８．前記第１の異種TREがCEA-TREである、請求項２６に記載のアデノウイルスベクター。２９．前記第１の異種TREが結腸ガン細胞特異的である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。３０．前記第１の異種TREがCEA-TREである、請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。３１．請求項１に記載のアデノウイルスベクターを含む、宿主細胞。３２．請求項１に記載のアデノウイルスベクターを含む、組成物。３３．請求項１に記載のアデノウイルスベクターを用いる方法であって、該ベクターを細胞中に導入する工程を包含する、方法。３４．前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３３に記載の方法。３５．前記哺乳動物細胞が前立腺細胞である、請求項３４に記載の方法。３６．前記哺乳動物細胞が肝細胞である、請求項３４に記載の方法。３７．前記哺乳動物細胞が乳ガン細胞である、請求項３４に記載の方法。３８．前記哺乳動物細胞が結腸ガン細胞である、請求項３４に記載の方法。３９．選択的細胞傷害性を、異種TREが機能するのを可能にする細胞に与えるための方法であって、該細胞を、請求項１に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程を包含し、ここで該アデノウイルスベクターが該細胞に侵入する、方法。４０．前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３９に記載の方法。４１．前記哺乳動物細胞が前立腺細胞である、請求項４０に記載の方法。４２．前記哺乳動物細胞が肝細胞である、請求項４０に記載の方法。４３．前記哺乳動物細胞が乳ガン細胞である、請求項４０に記載の方法。４４．前記哺乳動物細胞が結腸ガン細胞である、請求項４０に記載の方法。４５．請求項１に記載のアデノウイルスベクターを増殖する方法であって、該方法は、請求項１に記載のアデノウイルスベクターを、前記第１の異種TREが機能するのを可能にする細胞と合わせ、それにより該アデノウイルスが増殖される工程を包含する、方法。４６．前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項４５に記載の方法。４７．腫瘍増殖を抑制する方法であって、標的細胞を請求項１に記載のアデノウイルスベクターと接触させ、その結果、該アデノウイルスベクターが、該標的細胞に導入される工程を包含する、方法。４８．前記標的細胞が哺乳動物細胞である、請求項４７に記載の方法。４９．前記哺乳動物細胞が前立腺細胞である、請求項４８に記載の方法。５０．前記哺乳動物細胞が肝細胞である、請求項４８に記載の方法。５１．前記哺乳動物細胞が乳ガン細胞である、請求項４８に記載の方法。５２．前記哺乳動物細胞が結腸ガン細胞である、請求項４８に記載の方法。５３．標的細胞の遺伝子型を改変するための方法であって、該標的細胞を請求項１に記載のアデノウイルスベクターと接触させ、その結果、該アデノウイルスベクターが該標的細胞内へ導入される工程を包含する、方法。５４．請求項１に記載のアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスであって、ここで該アデノウイルスはマスキング剤と複合体化される、アデノウイルス。５５．前記マスキング剤がポリエチレングリコール（PEG）である、請求項５４に記載のアデノウイルス。５６．前記PEGが約2500〜約30,000の間の分子量のPEGである、請求項５５に記載のアデノウイルス。５７．前記PEGが約3000〜約20,000の間の分子量のPEGである、請求項５６に記載のアデノウイルス。５８．前記PEGが約5000〜約10,000の間の分子量のPEGである、請求項５７に記載のアデノウイルス。５９．前記PEGが前記アデノウイルスに共有結合的に結合する、請求項５５に記載のアデノウイルス。６０．前記PEGが前記アデノウイルスに非共有結合的に結合する、請求項５５に記載のアデノウイルス。６１．前記PEGが、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルを使用することにより共有結合的に結合する、請求項５９に記載のアデノウイルス。６２．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルが、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルスクシンアミド、およびスクシンイミジルプロピオネートからなる群より選択される、請求項６１に記載のアデノウイルス。６３．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルがスクシンイミジルスクシネートである、請求項６２に記載のアデノウイルス。６４．マスクされたアデノウイルスを作製する方法であって、マスキング剤をアデノウイルスに共有結合的に結合させ、ここで該マスキング剤は約2500〜約20,0 00の間の分子量を有し、それによりマスクされたアデノウイルスを生成する工程を包含する、方法。６５．前記マスキング剤がポリエチレングリコール（PEG）である、請求項６４に記載の方法。６６．マスキング剤と複合体化されたアデノウイルス。６７．前記マスキング剤がポリエチレングリコール（PEG）である、請求項６６に記載のアデノウイルス。６８．前記PEGが約2500〜約30,000の間の分子量のPEGである、請求項６７に記載のアデノウイルス。６９．前記PEGが約3000〜約20,000の間の分子量のPEGである、請求項６８に記載のアデノウイルス。７０．前記PEGが約5000〜約10,000の間の分子量のPEGである、請求項６９に記載のアデノウイルス。７１．前記PEGが前記アデノウイルスに共有結合的に結合する、請求項６７に記載のアデノウイルス。７２．前記PEGが前記アデノウイルスに非共有結合的に結合する、請求項６７に記載のアデノウイルス。７３．前記PEGが、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルを使用することにより共有結合的に結合される、請求項７１に記載のアデノウイルス。７４．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルが、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルスクシンアミド、およびスクシンイミジルプロピオネートからなる群より選択される、請求項73に記載のアデノウイルス。７５．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルがスクシンイミジルスクシネートである、請求項７４に記載のアデノウイルス。