KR100841815B1

KR100841815B1 - 선택적으로 복제하는 바이러스 벡터

Info

Publication number: KR100841815B1
Application number: KR1020017004690A
Authority: KR
Inventors: 라마칸드라무랄리드하라; 샤브람폴더블유.
Original assignee: 캔지, 인크.
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1999-10-14
Publication date: 2008-06-26
Also published as: IL142337A; CN1325647C; AU6391599A; EP1121441B1; JP4404490B2; JP2009254385A; BR9914527A; CZ20011129A3; PL347898A1; SK4412001A3; WO2000022137A3; NO20011843D0; DE69934421D1; HUP0104107A2; JP2002541761A; NZ528283A; EP1121441A2; HUP0104107A3; CN101092636B; NZ510805A

Abstract

본 발명에서는, 감염된 세포의 표현형 또는 유전자형에 기초하여, 숙주 세포내에서 바이러스 복제를 실질적으로 억제하는 경로-반응성 프로모터를 이용하여 표적 세포의 세포내 조건에 반응하여 바이러스 게놈을 선택적으로 복제하는 재조합 바이러스를 제공한다. 표적 세포내에서는, 상기 경로-반응성 프로모터의 프로모터 성분이 불활성화되어 바이러스 복제가 이루어진다. 이로 인해, (1) 바이러스의 천연 용해 성질로 인해 세포를 살해하고/하거나 (2) 치료학적 투여량의 트랜스 유전자 산물 (복제-불가능한 벡터와 비교하면 증폭된 양)이 제공되며, (3) 재조합 바이러스가 주위 세포에 감염되는 것을 용이하게 할 정도의 국재하된 농도를 갖는 바이러스가 생산된다. 또한, 본 발명에서는, 상기 벡터를 사용하는 치료 및 진단 방법, 상기 벡터를 포함하는 약제학적 제형, 상기 벡터를 제조하는 방법 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다.

재조합 바이러스 벡터, 아데노바이러스, p53, TGF-β, 경로 반응성 프로모터

Description

선택적으로 복제하는 바이러스 벡터 {SELECTIVELY REPLICATING VIRAL VECTORS}

본 발명은 선택적으로 복제하는 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 바이러스 복제에 대한 리프레서(repressor)의 발현을 유도하는 경로 표적된 경로-반응성(pathway-responsive) 프로모터를 함유하여 상기 경로에 결함이 있는 세포내에서 우호적으로 복제하는, 선택적으로 복제하는 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다.

최근, 재조합 아데노바이러스는 다양한 치료 방법에 있어서 치료학적으로 사용되는 트랜스 유전자(transgene)의 전달에 이용되고 있다. 그러나, 이러한 벡터 시스템이 갖는 광범위한 감염성으로 인해, 비-종양 세포에서 상기 바이러스가 발현되어 비-신생물 세포(non-neoplastic cell)에 부수적으로 피해를 입힐 수 있다는 우려를 낳고 있다. 이 결과, 소정의 세포 유형에서 상기한 트랜스유전자(transgene)를 우호적으로(preferentially) 발현시키는 표적화 시스템이 광범위하게 개발되어 왔다. 조직-특이적인 프로모터 및 종양-특이적인 프로모터를 사용하여, 소정의 세포 유형에서 상기 벡터를 우호적으로 복제하였다. 예를 들면, 국제 특허 출원 제PCT/US96/10838호(국제공개공보 제WO 97/01358호, 공보 발행일 1997년 1월 16일)에서는, E1, E2 또는 E4 기능을 유발하는 전립선-특이적인 프로모터 인자 (선택적으로, 세포 독성 트랜스 유전자의 발현 카셋트를 함유)을 사용하여 소정의 숙주 세포내에서 복제하는 벡터의 용도를 기재하고 있다. 특히, 상기 문헌에서는, 전립선-특이적인 인헨서(enhancer)가 E1의 발현을 조절하며, E3 영역내에 삽입되는 시토신 디아미나제 유전자의 발현을 유도하는 CMV-프로모터를 포함하는 발현 카세트를 가지고 있는 작제물을 기재하고 있다. 상기 벡터는, 소정의 세포 유형에서 복제-감응성(replication competent)이 있고, 자연 그대로의 비리온(intact virion)으로 패키징될 수 있다.

바이러스 복제를 유도하기 위해 종양-특이적인 프로모터를 사용하는 대신에 사용하는 다른 방법에서는, 아데노바이러스의 E1b 55K 단백질을 암호화하는 서열 내 특정 결실(deletion)을 일으키는 방법을 이용한다. 미국 특허 제5,677,178호 (특허허여일: 1997년 10월 14일)에서는, E1b 55K를 암호화하는 뉴클레오티드 서열내에 이러한 결함을 가지고 있는 재조합 아데노바이러스를 기재하고 있다. 그러나, 상기한 조직-특이적인 조절 인자 또는 종양-특이적인 조절 인자들은, "결함이 있는(leaky)", 즉 바람직한 표적 세포 이외의 다른 세포 유형에서도 복제가 되는 것으로 관찰되었다.

이러한 유형의 선택적으로 복제하는 상기한 벡터의 대안은, E1 기능이 광범위하게 제거된 복제-결함성(replication deficient) 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이다. 특히, E1, E2, E3가 제거되고 E4가 부분적으로 결실된 벡터는 외인성 트랜스유전자(exogeneous transgene)를 전달하는 데에 사용하여 왔다. 상기 벡터는 p53 유전자를 표적 세포에 전달하는 데에 사용되어 왔다. p53 결함형(p53 돌연변이형 또는 p53 결손형) 종양 세포에 외부에서 투여된 야생형 p53이 발현됨으로써, 상기 종양 세포에서 p53-매개된 세포 자멸사(apoptosis)가 유발될 수 있는 것으로 알려졌다. 현재, p53을 전달하는 상기한 바이러스 벡터는 쉐링 코포레이션(Schering Corporation) 및 인트로젠 코포레이션(Introgen Corporation)에서 개발 중에 있다. 또한, 상기한 벡터는, 사람 치료 용도에 있어서의 독성 및 치료 효능면에 있어서 허용 가능한 것으로 밝혀졌으며, p53-관련 악성 종양의 치료에 있어서 사람에 대한 제2기 임상 시험 중에 있다.

복제-결함성이 있고 선택적으로 복제하는 벡터는, 적어도 이론상으로, 임상의들이 염려하는 설계상의 결점이 존재한다. 복제-결함성이 있는 벡터는 환자 체내에서 통제 불가능하게 증식하지는 않기 때문에, 이론상으로는 보다 안전하다. 하지만, 종양을 효과적으로 제거하기 위해서는 실질적으로 대다수의 감염된 종양 세포를 형질감염시켜야 하므로, 치료 효과를 보장하기 위해 상당한 과량의 벡터를 사용하게 된다. 선택적으로 복제하는 벡터는, 환자 체내에서 복제하여 돌연변이가 가 발생하여 완전한 복제-감응성을 갖는 벡터를 형성할 수 있기 때문에, 안전성에 있어서 보다 문제가 있는 것으로 간주된다. 하지만, 특정 조건하에서는 바이러스가 증식할 수 있는 천연의 능력을 계속 유지하기 때문에, 상기 벡터가 주위에 있는 종양 세포로 확장될 수 있다. 상기 벡터 자체가 복제 가능하기 때문에, 필요한 바이러스의 초기 투여량은 보다 작은 편이다. 이러한 점은, 경제적인 관점 및 면역학적 관점에 있어서 바람직하다. 따라서, 당해 분야에서는, 치료 효과가 크면서 안전성 문제를 해결할 수 있는 선택적으로 복제하는 벡터가 요구되고 있다.

본 발명에서는, 바이러스 복제에 대한 리프레서(repressor)의 발현을 유도하는 소정의 경로-표적된 경로-반응성(pathway-responsive) 프로모터를 함유함으로써 상기 경로에 결함이 있는 세포내에서 우호적으로 복제하도록 하는, 선택적으로 복제하는 아데노바이러스 벡터를 제공함으로써 상기한 문제점을 해결하였다. 또한, 본 발명에서는, 상기한 벡터를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 또한, 본 발명에서는, 상기한 벡터를 사용하여 정상적인 세포 군집으로부터 상기 경로-결함성 세포를 제거하는 방법을 제공한다.

삭제

본 발명에서는, 감염된 숙주 세포의 표현형 또는 유전형에 기초하여, 숙주 세포내에서의 바이러스 복제를 실질적으로 억제하는 바이러스 복제의 억제 인자 (inhibitor)의 발현을 유도하는 경로-반응성 (pathway-responsive) 프로모터를 사용하여 표적 세포의 세포내 조건에 반응하여 선택적으로 바이러스 게놈을 복제하는 재조합 바이러스를 제공한다. 상기한 표적 세포내에서는, 상기한 경로-반응성 프로모터의 프로모터 성분이 불활성이므로, 상기 바이러스는 복제 가능하다. 이로 인해, (1) 바이러스가 본래 가지고 있는 용해성 (lytic nature)에 의해 상기 세포를 살해하고/하거나, (2) 표적 세포에 치료학적 유효량의 트랜스 유전자 생성물 (복제-비감응성 벡터와 비교하여 증폭된 양)을 제공하며, (3) 주위의 표적 세포가 상기 재조합 바이러스에 감염되는 것을 용이하게 할 정도의 바이러스의 국재화된 농도를 제공한다. 또한, 본 발명에서는, 상기 벡터를 이용한 치료 및 진단 방법, 상기 벡터를 포함하는 약제학적 제형, 상기 벡터를 제조하는 방법, 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명에서는, 바이러스 복제를 억제하는 리프레서 (repressor)에 작동가능하게 연결된 경로-반응성 프로모터 (pathway-responsive promoter)를 포함하는, 선택적으로 복제하는 재조합 바이러스를 제공한다.

본원에서의 용어 "선택적으로 복제하는"은, 상이한 표현형 상태에서의 세포와 비교하여 소정의 표현형 상태에서의 세포에서 우호적으로(preferentially) 복제 가능한 벡터를 의미한다. 상이한 표현형 상태의 예로는, 소정의 세포 유형에 있어서 정상적인 세포와 비교하여 p53 경로에 결함이 있는 세포가 포함된다. "우호적으로 복제하는 바이러스"의 의미는, 소정 용량의 바이러스를 투여한 경우, 소정의 세포 유형에 있어서 정상적인 세포 (대조군 세포)에 비해 표적 세포 유형에서 적어도 5배 이상 효과적으로 복제하는 바이러스를 의미한다. 소정의 바이러스가 진정으로 선택적으로 복제하는 바이러스 인지의 여부를 확인하기 위해, 다수의 인자에 대해서, 소정의 세포 유형에 있어서 정상적인 세포와 표적 세포에서 각각 바이러스의 복제 능력을 비교 평가할 필요가 있다.

바람직한 것은, 표적 조건을 갖는 표적 세포 및 이러한 조건을 갖지 않는 동일 유형의 정상 세포에서 각각, 소정 벡터의 복제 능력을 서로 비교하는 것이다. 예를 들면, 최대 바이러스 복제 효율을 얻기 위해 필수적인 인자들이 S기에만 존재하기 때문에, 바이러스를 감염시킨 후 제 1단계에서 감염된 세포가 세포 주기로 진입하도록 유도한다. 종양 세포에서의 벡터의 선택성을 평가하기 위해 벡터의 선택성을 평가하려는 경우에는, 이미 세포 주기로 진입한 다른 세포 (예를 들면, 불멸화된 또는 형질전환된 세포주)에 대비한 종양 세포에서의 복제 능력의 평가, 즉 종양 세포에 대한 바이러스의 선택성의 평가는 어느 정도 힘들 것이다. 또한, 소정의 바이러스에 대한 감염도는 세포 유형에 따라 크게 차이가 난다는 점이 관찰되었다. 아데노바이러스와 같은 몇몇 바이러스들은 광범위한 조직 친화성(tissue tropism)을 갖는 반면, 다른 바이러스의 경우에는 이들이 감염시키는 세포 유형이 매우 한정되어 있다. 매우 상이한 감염성을 갖는 세포내에서 소정의 벡터의 성능을 평가하는 경우, 비효율성의 원인이 감염 세포내에서의 벡터의 성능에 기인한 것인지 또는 바이러스가 세포에 전혀 감염되지 못한 것인지를 구분하는 것은 어렵다. 소정의 세포 유형에 있어서 정상 세포와 표적 세포 각각에서의 선택성을 평가함으로써, 상기한 감염성 효과를 최소화할 수 있다.

또한, 바이러스의 라이프 사이클(life cycle)의 일시적인 성질(temporal nature)을 고려하여야 한다. 예를 들면, 야생형 벡터에서도 감염 후 초기에 정상 세포에 비해 종양 세포에서 선택성을 보유하는 것으로 보이는 데, 그 이유는 세포 주기가 이미 시작되고 있기 때문이다. 그러나, 바이러스가 세포 주기를 자극한 이후에는, 시간이 경과함에 따라 이러한 선택성은 감소하게 된다. 따라서, 감염 후 선택성을 평가하는 시간은, 정상 세포내에서 이러한 초기 복제 지체 (initial replication lag)를 피할 수 있을 정도로 충분해야 한다. 이는 사용되는 바이러스의 유형에 따라 상이하지만, 이러한 초기 지체는 당업자라면 용이하게 측정가능하다.

또한, 소정의 재조합 아데노바이러스가 표적 세포 유형에서 선택적인 효과를 보이는 지 여부를 측정하는 데에 있어서, 투여량 효과도 고려하여야 한다. 예를 들면, 종양 세포의 소멸을 목적으로 하여 세포 독성 효과를 측정하는 경우, 상이한 용량에 따라 바이러스가 선택적인 세포 독성을 가지는 것으로 보이도록 만들어 질 수 있다. 바이러스의 게놈의 변형 정도와는 상관없이, 거의 모든 종류의 바이러스를 충분히 높은 투여량으로 투여한 경우, 세포 독성을 가지는 것으로 알려져 있는 바이러스 단백질 (예를 들면, 아데노바이러스의 경우에는 헥손)의 존재로 인해 세포 독성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 이와 유사하게, 상기 과학 문헌에서 특정의 바이러스를 "복제-결함(replication defective) 바이러스"라고 지칭하는 경우 (이러한 바이러스 결함을 보상할 수 있는 세포주가 존재하지 않는 경우에는, 상기 바이러스는 완전히 복제 불가능하다는 것을 의미)에도, "복제에 대해 약독화된(attenuated replication)"으로 기술하는 것이 보다 정확한 표현이다. 예를 들면, "복제-결손(replication deficient)" 또는 "복제-결함"으로 종종 불리는, E1 전체 영역이 결실된 아데노바이러스는 어느 정도, 특히 세포 주기 중의 세포 또는 급속히 분할되는 세포에서 복제를 한다. Mulligan {참조: 1990, Science 260:926-932}이 관찰한 바는 아래와 같다:

E1 영역의 발현이 복제에 필수적인 기타의 바이러스 유전자 산물의 발현에 영향을 끼치는 것으로 관찰되었으나 {참조: Horwitz, M, in Virology, B. N. Fields Ed. (Raven, New York, 1990) Chapter 60}, 바이러스 복제에 있어서 E1 유전자 발현이 절대적으로 필요한 것으로 보이지는 않는다. E1-결실 바이러스에 대한 초기 특성 평가에서, 복합 감염도(multiplicity of infection)가 큰 경우에는 E1 부위가 복제에 필요하지 않다는 것을 보여주었다 {참조: Jones 및 Shenk, 1979, PNAS (USA) 76(8):3665-3669}.

결과적으로, 소정의 바이러스가 선택적으로 복제하는 지 여부를 결정하는 경우, 바이러스 투여량의 효과를 무시할 수 없다.

표적 세포에 대한 소정의 바이러스의 복제 선택성을 평가하는 하나의 방법은, 다음과 같이 바이러스의 "선택성 지수"를 평가하는 것이다. 통상적으로 사용되는 매개변수인 "ED₅₀"(전체 세포 중 50%에서 세포 사멸을 유도하기에 충분한 용량을 의미)는 적합한 비교 기준을 제공해준다. 특정 바이러스의 ED₅₀는 통상적인 시험관 내 투여량 증가 실험(in vitro dose escalation experiment)에 의해 측정될 수 있다. 가장 일정한 비교 기준을 얻기 위해, ED₅₀는 비교되는 세포 유형과 분석 변형(assay variation) 간의 감염성 차이의 효과를 최소화하기 위해 바이러스 대조군과 비교하여 가장 적합하게 표현된 것이다. 따라서, 단위가 없는 비율인 ED₅₀(바이러스)/ED₅₀(대조군 바이러스)를 사용하여, 세포내에서의 바이러스의 상대적인 세포 독성을 표현하며, 이를 "상대적인 독성 지수 (RTI)"로 지칭할 것이다. 소정의 바이러스의 상기한 "선택성 지수"는 비율 "RTI(표적 세포)/RTI(정상 세포)"로 표현된다. 선택적으로 복제하는 벡터는, 선택성 지수가 10 이상 (바람직하게는, 50, 100 또는 그 이상)이다.

예를 들면, 선택적으로 복제하는 아데노바이러스 벡터인 U3EE 및 T1LT는, 선택적으로 복제하여 p53 경로에 결함을 가진 종양 세포를 사멸시킬 수 있도록 제조된 것이다. 벡터 U3EE는 실질적으로 하기 실시예에 기재된 내용에 따라 제조된 것이다. 간단히 설명하면, U3EE 바이러스는, E2F-Rb 융합 단백질의 발현을 유도하는 p53 반응 성분 (p53 CON)을 포함하는 제1 발현 카세트를 함유하고 있다. 상기 E2F-Rb 융합 단백질은 아데노바이러스의 E2 프로모터의 활성을 억제할 수 있는 강력한 억제 인자이며, 세포내에 존재하는 경우에는 바이러스의 복제를 효과적으로 억제한다. 상기 p53 반응 성분은 기능을 발휘하는 p53 경로가 존재하는 경우에 이에 반응하여 활성을 나타낸다. 따라서, p53 경로가 본래의 기능을 나타내는 정상 세포내에서는, U3EE 바이러스가 E2F-Rb 융합 단백질을 발현하게 되어, 바이러스는 복제하지 않게 된다. 하지만, p53 경로에 결함이 있는 세포 (대부분의 종양 세포)에서는, p53CON 반응 성분이 활성을 나타내지 못하여 바이러스 복제가 억제되지 않는다. 또한, U3EE 벡터는, Ad5 E3-10.5K의 전-세포자멸사 유전자(pro-apoptotic gene)의 발현을 유도하는 MLP 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 함유하고 있다. 전-세포자멸사 신호를 활성화하기 이전에 표적 세포내에서 바이러스 DNA의 복제를 용이하게 하고자 하기 때문에, 전-세포자멸사 유전자를 사용하는 경우, 상기한 일시적인 프로모터 (예를 들면, MLP 프로모터)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 MLP 프로모터는, U3EE 게놈이 복제되어 E3-10.5K 단백질의 활성을 유도하는 경우, 감염 시작 (onset) 후 약 7시간 경과후에 활성화된다. 상기 T1LT 벡터가 E1a 영역내에 추가 결실을 함유함으로써 243R 및 289R 아데노바이러스 E1a 단백질의 4 내지 25번 아미노산이 제거되어 있다는 것을 제외하고는, 상기 T1LT 아데노바이러스 벡터는 U3EE 벡터와 기본적으로 동일하다. 이러한 결실은, p300 단백질이 E1a 단백질에 결합하는 능력을 파괴한다.

대조군(control)로서 L9IU 벡터를 사용하여, 정상의 사람 기관지 상피 세포 (NHBE) 및 C33A (p53 경로에 결함이 있는 상피 종양 세포주) 내에서의 상기한 U3EE 및 T1LT 바이러스의 복제 능력 및 사멸 능력을 평가하였다. 평가 결과는 첨부 도면 3에 나타나 있다. 하기 표 1에서는 평가 결과 데이타를 요약한 것이다:

바이러스의 RTI 및 선택성 지수에 대한 요약

바이러스	RTI (정상 세포)	RTI (종양 세포)	선택성 지수
L9IU	1.0	1.0	1.0
U3EE	12.5	0.0233	536
T1LT	10	0.066	152

상기 데이터를 통해 알 수 있는 바와 같이, U3EE 및 T1LT 바이러스는 종양 세포에 대해 높은 선택성을 보유하고 있다. 앞에서 말한 바와 같이, L9IU 바이러스는 휴지기의 정상 세포(quiescent normal cell)와 비교하여 세포 주기-수행중인 종양 세포에서 복제 잇점이 경미하다. 선택성 지수를 계산하기 이전에 각 세포 유형에서의 ED₅₀(바이러스)/ED₅₀(대조군 바이러스)를 비교하여, 상기한 변동(variation) 효과를 최소화한다.

본원에서의 용어 "재조합체"는, 통상적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 변형시킨 게놈(genome)을 의미한다.

본원에서의 용어 "바이러스"는, 단백질 합성 또는 에너지 생성 메카니즘을 가지고 있지 않은 절대적인 세포내 기생 물질(obligate intracellular parasite)을 총칭한다. 바이러스 게놈은 지질막으로 된 단백질 성분의 피복된 구조체내에 함유된 RNA 또는 DNA이다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스의 예로는, 바쿨로비리디아에 (baculoviridiae), 파르보비리디아에 (parvoviridiae), 피코르노비리디아에 (picornoviridiae), 헤레페스비리디아에 (herepesviridiae), 폭스비리디아에 (poxviridiae), 아데노비리디아에 (adenoviridiae), 피코트르나비리디아에 (picotrnaviridiae) 등이 포함된다. 용어 "재조합 바이러스"는, 키메라 바이러스 (또는 다량체 바이러스; multimeric virus), 즉 하나 이상의 바이러스 아형으로부터 유래한 상보적인 암호화 서열을 사용하여 작제된 벡터를 포함한다{참조: 예를 들면, Feng et al., Nature Biotechnology 15:866-870}.

본원에서의 용어 "아데노바이러스"는 "아데노바이러스 벡터"와 동일하게 사용되고 있으며, "아데노비리디아에" 속에 속하는 바이러스를 의미한다. 용어 "아데노비리디아에"는, "마스트아데노바이러스" 속의 동물 아데노바이러스(사람, 소, 양, 말, 개, 돼지, 쥐 및 원숭이 아데노바이러스 아속을 포함하며, 이에 한정되지 않는다)를 총체적으로 일컫는다. 특히, 사람 아데노 바이러스는 A-F 아속 (subgenera) 및 이의 개개의 혈청형을 포함하며, A-F 아속은 사람 아데노 바이러스 제1형, 제2형, 제3형, 제4형, 제4a형, 제5형, 제6형, 제7형, 제8형, 제9형, 제10형, 제11형 (Ad11A 및 Ad11P), 제12형, 제13형, 제14형, 제15형, 제16형, 제17형, 제18형, 제19형, 제19a형, 제20형, 제21형, 제22형, 제23형, 제24형, 제25형, 제26형, 제27형, 제28형, 제29형, 제30형, 제31형, 제32형, 제33형, 제34형, 제34a형, 제35형, 제35p형, 제36형, 제37형, 제38형, 제39형, 제40형, 제41형, 제42형, 제43형, 제44형, 제45형, 제46형, 제47형, 제48형 및 제91형을 포함하며 이에 한정되지는 않는다. 용어 "소 아데노바이러스"에는, 소 아데노바이러스 제1형, 제2형, 제3형, 제4형, 제7형 및 제10형이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다. 용어 "개의 아데노바이러스"에는, 개의 아데노바이러스 제1형 (균주 CLL, Glaxo, RI261, Utrect, Toronto 26-61) 및 제2형이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다. 용어 "말의 아데노바이러스"에는, 말의 아데노바이러스 제1형 및 제2형이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다. 용어 "돼지의 아데노바이러스"에는, 돼지의 아데노바이러스 제3형 및 제4형이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 양태에서의 아데노바이러스는, 사람의 아데노바이러스 제2 또는 제5 혈청형(serotype)에서 유래한 것이다.

용어 "경로-반응성 프로모터(pathway-responsive promoter)"는, 정상 세포에서 소정의 단백질과 결합하여 인근의 유전자가 이러한 단백질과의 결합에 전사적으로 반응하도록 유도하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 프로모터는, 전사 인자가 결합하는 서열인 반응 성분을 혼입하여 제조할 수 있다. 단백질 수준이 증가하면 전사율이 감소하는 몇몇 경우가 있지만, 일반적으로 상기 반응은 유도성(inductive) 반응이다. 경로-반응성 프로모터는 자연발생적 또는 합성된 것일 수 있다. 통상적으로, 경로-반응성 프로모터는 표적으로 하는 경로 또는 기능성 단백질을 기준으로 하여 작제된다. 예를 들면, 자연발생적인 p53 경로-반응성 프로모터는 기능성 p53 (예를 들면, p21 또는 bax 프로모터)의 존재하에 활성화되는 전사 조절 성분을 포함한다. 이와 달리, 최소 프로모터(minimal promoter, 예를 들면 SV40 TATA box 영역)의 상부쪽에 위치한 p53 결합 부위를 함유하는 합성 프로모터를 사용하여 경로-반응성 합성 프로모터를 제조할 수 있다. 일반적으로, 경로-반응성 합성 프로모터는 컨센서스 결합 모티프 (consensus binding motif)와 일치하는 서열의 하나 이상의 카피부터 제조된다. 이러한 컨센서스 DNA 결합 모티프의 측정은 용이하다. 일반적으로, 이러한 컨센서스 서열은 수개의 염기쌍만큼 떨어져 있는 직접 또는 헤드-테일 반복 서열 (head-to-tail repeat) 형태로 배치되어 있다. 헤드-헤드 반복 서열 (예를 들면, AGGTCATGACCT)을 포함하는 성분은 "팰린드롬(palindrome)" 또는 "반전된 반복 서열(inverted repeat)"이라고 부르고, 테일-테일 반복 서열은 "외전된 반복 서열(everted repeat)"이라고 부른다.

본 발명의 실시에 유용한 경로-반응성 프로모터의 예로는, 컨센서스 인슐린 결합 서열을 함유하는 인슐린 경로-반응성 합성 프로모터 {참조: Jacob et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:27773-27779}, 사이토카인 경로-반응성 프로모터, 글루코코르티코이드 경로-반응성 프로모터 {참조: Lange et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:15673-80}, IL-1 및 IL-6 경로-반응성 프로모터 {참조: Won K.-A 및 Baumann H. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3965-3978}, T3 경로-반응성 프로모터, 컨센서스 모티프 (5' AGGTCA 3')를 함유하는 갑상선 호르몬 경로-반응성 프로모터, TPA 경로-반응성 프로모터 (TRE), TGF-β경로-반응성 프로모터 {참조: Grotendorst et al., 1996, Cell Growth and Differentiation 7:469-480}가 포함된다. 기타의 다른 경로-반응성 프로모터는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 인터넷 (http://www.eimb.rssi.ru/TRRD)을 통해 접근 가능한 "진핵 세포 게놈에서의 전사 조절 부위에 대한 데이터베이스"에서 확인할 수 있다.

본원에 예시된 본 발명의 바람직한 양태에서, 벡터는 기능성 TGF-β 경로의 존재하에 활성을 나타내는 TGF-β 경로-반응성 합성 프로모터 (예를 들면, SRE 및 PAI-RE 반응 성분을 함유하는 프로모터)를 포함한다. 용어 "PAI-RE"는, 플라스미노겐 활성 인자-I 프로모터 영역으로부터 분리된 TGF-β 신호에 반응을 보이는 서열을 포함하는 합성 TGF-β 반응 성분을 의미한다. 하기 실시예 3에는 PAI-RE의 작제 방법이 기재되어 있다. 상기한 PAI-RE 경로-반응성 프로모터는, 플라스미드 p800luc {참조: Zonneveld et al., 1988, PNAS 85:5525-5529}로부터 분리가능하고 GenBank (수탁 번호 제J03836호)로부터 입수가능한, 749bp 단편으로 분리될 수 있다. 용어 "SRE"는, Smad-4 DNA 결합 서열의 4개의 반복 서열 (GTCTAGAC) {참조: Zawel et al., (1988), Mol. Cell 1: 611-617}을 포함하는 합성 TGF-β반응 성분을 의미한다. SRE의 작제 방법은 하기 실시예 3에 기재되어 있다. SRE 반응 성분은, Smad-4 결합 서열을 암호화하는 상보성 올리고뉴클레오티드를 어닐링(annealing) 한 후에 플라스미드 pGL#3-프로모터 루시페라제 벡터(ProMega에서 시판)내에 클로닝하여 제조할 수 있다.

이와 유사하게, 용어 "p53 경로-반응성 프로모터"는, 기능성 p53 경로의 존재하에 활성을 나타내는 전사 조절 인자를 의미한다. 상기한 p53 경로-반응성 프로모터는 기능성 p53 경로의 존재하에 활성을 나타내는 천연 전사 조절 영역(예를 들면, p21 또는 mdm2 프로모터)일 수 있다. 또는, p53 경로-반응성 프로모터는 기능성 p53 경로의 존재하에 활성을 나타내는 합성 전사 조절 영역(예를 들면, SRE 및 PAI-RE 경로-반응성 프로모터)일 수 있다. 상기 "p53-CON"은, SV40 TATA box의 상류에 2개의 합성 p53 컨센서스 DNA 결합 서열 {참조: Funk et al., 1992, Mol. Cell Biol. 12:2866-2871}을 삽입하여 작제된 합성 p53 반응 인자를 함유하는 p53 경로-반응성 프로모터를 의미한다. 상기한 p53-CON 경로-반응성 프로모터의 작제방법은 하기 실시예 3에 기재되어 있다. 상기 "RGC"는, 상기 리보좀 유전자 클러스터(cluster)내에서 확인되는 단일 p53 결합 도메인을 사용하는 합성 p53 경로-반응성 프로모터를 의미한다 {참조: Kern et al., 1991, Science 252:1708-1711; 및 Park et al., 1996, Molecular Carcinogenesis 16:101-108}. p53-CON 및 RGC 반응 인자는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 어닐링시킴으로써 작제할 수 있으며, p53 반응성 프로모터는 플라스미드 pGL3-프로모터 루시페라제 벡터 (ProMega에서 시판)내에 클로닝함으로써 작제할 수 있다 {하기 실시예 3에 보다 상세히 기재되어 있음}.

용어 "표적 세포"는, 치료학적 트랜스유전자(therapeutic transgene)를 투여하여 치료하고자 하는 소정의 표현형을 갖는 세포를 의미한다. 다양한 경로-반응성 프로모터 성분을 사용하여, 자연 그대로의 경로를 갖는 소정의 세포에 대해 바이러스의 발현을 표적화할 수 있다. 예를 들면, TGF-β 또는 p53 경로-반응성 프로모터를 이용하여, 표적으로 하는 종양 세포내에서 바이러스 복제를 억제하는 리프레서를 발현시킬 수 있다. 이와 유사하게, 염증 반응성 프로모터를 이용하여, 표적으로 하는 관절염 세포내에서 바이러스 복제를 억제하는 리프레서를 발현시킬 수 있다 (여기서, 벡터는 임의로 IL-10을 암호화한다).

용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은, 폴리뉴클레오티드 성분간의 결합이 기능적으로 연관되어 있는 것을 의미한다. 소정의 핵산 서열이 "작동가능하게 연결되어 있는 경우"는, 소정의 핵산 서열이 다른 핵산 서열과 기능적으로 관련성을 가지도록 위치해 있는 경우이다. 예를 들면, 소정의 프로모터 또는 인헨서가 소정의 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 상기 프로모터 또는 인헨서는 상기 암호화 서열과 작동가능하게 연결되어 있다고 말한다. 통상적으로, "작동가능하게 연결된"은, 연결된 상기한 뉴클레오티드 서열들이 서로 인접해 있음을 의미한다. 하지만, 일반적으로 인헨서는 프로모터로부터 수 kb 정도 떨어져서 작동하고 인트론 서열의 길이는 변동이 클 수 있기 때문에, 몇몇 폴리뉴클레오티드 성분들은 바로 인접하여 위치하지 않는 경우에도 작동가능하게 연결되어 있을 수 있으며 상이한 대립 유전자 또는 염색체와 트랜스(in trans) 작용을 할 수도 있다.

용어 "바이러스 복제를 억제하는 리프레서 (repressor)"는, 소정의 세포내에서 발현되는 경우, 바이러스 복제를 실질적으로 억제하는 단백질을 의미한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 바이러스 복제를 억제하는 리프레서는, 본 발명의 재조합 벡터가 유래하는 모 아데노바이러스 벡터의 성질에 의존한다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터 또는 기타의 다른 DNA 종양 바이러스의 경우, E2F-Rb 융합 작제물 {참조: 유럽특허출원 제94108445.1호, 1995년 12월 6일 공개(공보 번호: 제0 685 493 A1)}을 사용할 수 있다. 상기한 E2F-Rb 융합 단백질의 구성은, 사람 E2F 전사 인자 단백질의 DNA 결합 도메인 및 DP1 이종이량체화(heterodimerization) 도메인 (야생형 E2F의 아미노산 95-286) 과 Rb 성장 억제 도메인 (야생형 Rb 단백질의 아미노산 379-928)의 결합으로 이루어져 있다. 상기한 E2F-Rb 융합 단백질은 E2F-의존성 전사를 억제하는 강력한 리프레서이며, 해당 세포가 세포 주기 중 G1에 머물러 있도록 한다. 상기한 DNA 결합 도메인은 아미노산 128-193에 위치해 있고, 상기한 이량체화 도메인은 아미노산 194-289에 위치해 있다. 상기한 사람 E2F-1 단백질의 서열은 GenBank (수탁번호: 제M96577호, 수탁일: 1992년 8월 10일)에서 입수가능하다. 기타의 다른 종에서 유래한 E2F의 다른 E2F 구성원으로부터의 E2F 서열을 사용하여 다른 종에서 사용할 벡터를 작제할 수 있다. 상기한 재조합 바이러스가 아데노-관련된 바이러스 (AAV)에 기초하는 경우, 상기한 리프레서 단백질 및 이의 유도체는, 아데노바이러스에 의한 감염이 없는 경우에 바이러스 복제를 효율적으로 억제하는 리프레서이다. 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus)에서 유래한 경우, 이미디어트 얼리 단백질(immediate early protein) ICPO의 결실된 형태인 ICPO-NX 단백질 {참조: Liun et al., 1998, J. Virol. 72: 7785-7795}이 효과적인 바이러스 복제의 리프레서로 사용될 수 있다. 이와 유사하게, 네가티브 활성이 우세한 어떠한 단백질도 바이러스 복제의 리프레서로 사용될 수 있다.

TGF-β 및 이와 관련성을 갖는 단백질 (액티빈, 인히빈 및 BMP 등)은 증식을 억제하는 강력한 천연 억제제이며, 종양 형성(tumorigencity) 억제에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어 진다. 생물활성 형태의 TGF-β는, 25kDa의 디설파이드-연결된 단독이량체(homodimer)이며, 실제로 모든 사람 조직 세포에서 발현된다. 흥미롭게도, 많은 악성 세포 유형들은 정상 세포에서 관찰되는 발현 패턴을 그대로 유지한다. TGF-β는 제1형 및 제2형 세린/트레오닌 카이네이즈 수용체로 이루어진 이종이량체 수용체 복합체를 통해 신호를 전달한다. 상기한 2가지의 수용체 카이네이즈 중에서 제2형 수용체는, 고유의 카이네이즈 활성을 보유하며, TGF-β 리간드에 결합하게 되면 제1형 수용체와 이종이량체를 형성하여 제1형 수용체를 트랜스포스포릴화(transphosphorylation)시킨다. 제1형 수용체를 포스포릴화시키면, 제1형 수용체의 카이네이즈 작용을 활성화시키게 되고, 이렇게 활성화된 제1형 수용체가 세포내 효능 인자 (effector)인 Smad를 포스포릴화시킨다. 이렇게 포스포릴화된 제1형 수용체가 상기 신호를 세포 내부로 전달함으로 인해, 성장 억제와 같은 세포 반응을 유발하게 된다. 일단 세포핵 내부로 진입한 후에는, Smad 복합체는 전사 인자로 작용하는 자신에 의해 또는 기타의 다른 전사 인자의 활성을 조절함으로써 표적 유전자의 전사를 활성화하는 것으로 알려져 있다. TGF-β 신호에 의해 조절되는 것으로 생각되는 전사 인자의 예로는, CTF/NF-1, FAST-1, Sp1, Jun, SRF/TRF, Oct 및 CREB가 포함된다. 이들의 상호 작용 결과, TGF-β의 다양한 공지 효과가 발생하게 된다.

TGF-β 및 이와 관련성을 갖는 단백질은 여러 세포 유형에 있어서 강력한 억제 인자로서 작용한다. 상피 및 조혈 세포에서 기원하는 몇몇 종양이 악성으로 발전하는 것은, TGF-β가 증식 억제 및 침투 억제 활성을 상실하는 것과 상호 관련성이 있다. TGF-β 시그날 전달이 되지 않는 것은, 시그날 전달 경로에 관여하는 수용체 및/또는 세포내 효능 인자의 돌연변이, 결실 또는 발현 부족과 관련된 것으로 관찰되었다. 또한, TGF-β에 저항성을 보이는 많은 악성 종양들은, 기타의 다른 종양 억제 유전자에 있어서도 복합적으로 결함을 가지고 있어서, 효과적인 치료를 위해 종양 억제 유전자 대체 방법을 사용하는 데에 한계가 있다.

TGF-β 경로-반응성 프로모터는, 플라스미노겐 활성화 억제제-1에서 유래하는 서열 (PAI-프로모터) 또는 Smad4/DPC4 (SRE-프로모터)에 대한 결합 부위를 SV40 TATA box 상류쪽에 혼입시켜 작제되었다. 상기 프로모터의 활성 평가는, 리포터(reporter)로 루시페라제를 사용하는 일시적인 형질감염 방법을 사용하여 평가하였다. 평가 결과는 하기 표 2에 기재된 바와 같다:

상대적인 루시페라제 활성^* (fold)

세포주	TGF-β경로	PAI 프로모터 - TGF-β	PAI 프로모터 + TGF-β	SRE 프로모터 - TGF-β	SRE 프로모터 + TGF-β
Hep3B	정상	68.82	128.42	105.02	86.47
293	정상	51.62	88.78	9.40	46.94
A549	정상	33.26	56.76	2.87	17.93
Panc1	정상	15.36	141.80	1.14	29.03
U87	정상	110.40	73.88	7.42	7.85
MCF-7	결함	18.93	10.72	1.28	1.22
WIDR	결함	10.66	4.41	1.24	1.57
MDA-MB468	결함	2.28	1.10	1.33	0.62
AsPC-1	결함	6.56	1.24	1.79	0.76
Caco2	결함	13.01	13.8	1.18	0.96
MicaPaca	결함	14.08	1.81	0.79	26.34

{* 루시페라제의 활성은 프로모터를 가지지 않은 작제물에서 얻은 활성과 비교한 상대적인 값}

상기 결과는, 상기 2가지 프로모터 모두가 TGF-β 시그날 전달이 작동하는 세포내에서만 활성을 나타낸다. TGF-β 경로에 결함이 있는 세포주{예를 들면, Smad4/DPC4가 동형 접합 결실 (homozygous deletion)되어 TGF-β 시그날 전달에 결함이 있는 MDA-MB468}에서는, 루시페라제에 작동가능하게 연결된 PAI-프로모터 또는 SRE-프로모터의 형질 감염 및 Smad4를 암호화하는 재조합 아데노바이러스를 이용한 형질감염으로 인해 상기한 반응 성분 둘 다의 활성이 모두 회복되었으며, 하기 표 3에 기재된 데이터를 통해 입증되는 바와 같이, TGF-β 경로에 대한 상기 반응 성분-함유 프로모터의 특이성을 확인할 수 있었다.

Smad4/DPC4를 암호화하는 재조합 아데노바이러스를 이용하여 형질감염시킨 후, MDA-MB468 세포에서의 TGF-β 반응성 프로모터의 활성 회복 (상대적인 루시페라제 활성^* (fold))

바이러스	투여량	PAI 프로모터 - TGF-β	PAI 프로모터 + TGF-β	SRE 프로모터 - TGF-β	SRE 프로모터 + TGF-β
BGCA	1×10⁸	1.0	1.53	1.00	1.00
BGCA	1×10⁹	0.86	1.06	0.33	0.77
DCCA	1×10⁸	1.13	4.86	8.50	139.17
DCCA	1×10⁹	1.93	31.60	22.00	370.84

{* 루시페라제의 활성은 TGF-β가 첨가되지 않은 BGCA를 갖는 작제물에서 얻은 활성과 비교한 상대적인 값이다. BGCA는 β-gal 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스이다. DCCA는 Smad4/DPC4를 암호화하는 재조합 아데노바이러스이다}

그리고 나서, E2F-Rb에 작동가능하게 연결된 PAI-프로모터를 함유하는 플라스미드를 작제한 후, 완전한 TGF-β 경로를 갖는 세포내에서 선택적으로 E2 프로모터를 억제할 수 있는 능력이 있는 지 여부를 시험하였다. 일시적인 형질감염 분석에서, 루시페라제에 연결된 E2 프로모터 및 E2F-Rb에 작동가능하게 연결된 PAI-프로모터를 함께 형질감염시킨 경우, 상기 293 세포 (정상적인 TGF-β 경로를 보유)에서는 E2F-Rb가 선택적으로 발현되기 때문에 상기 293 세포에서는 E2 프로모터의 활성을 선택적으로 억제한 반면에 MDA-MB468 세포 (결함을 가진 TGF-β경로를 보유)에서는 그러하지 않았다 (하기 표 4 참조). 예상한 바와 같이, 상기 2가지의 세포주 모두에서 E2F-Rb를 발현하는 CMV-E2F-Rb를 사용하여 함께 형질 감염시킨 경우, 상기 세포주 모두에서 E2 프로모터의 활성이 억제되었다.

293 세포 및 MDA-MB-468 세포에서 PAI-E2F-Rb에 의한 E2 프로모터 활성의 선택적인 억제 (상대적인 루시페라제 활성^* (%))

리프레서	MDA-MB-468 세포	293 세포
무	100	100
CMV-E2F-Rb	9.38	10.53
PAI-E2F-Rb	124.02	17.38

{* 루시페라제의 활성은 프로모터를 가지지 않은 작제물에서 얻은 활성과 비교한 %상대값}

리보좀 유전자 클러스터로부터 유래하는 공지의 p53 결합 부위 (RGC-프로모터) 또는 고친화성 p53 결합 부위 (p53CON-프로모터)를 혼입하여, p53 경로-반응성 프로모터를 작제하였다. 상기 프로모터의 활성 평가는, 리포터로서 루시페라제를 사용하는 일시적인 형질감염 분석 방법으로 수행하였다. 분석 결과는 하기 표 5에 나타나 있다:

다양한 세포주에서의 p53 반응성 프로모터의 활성 (상대적인 루시페라제 활성^*)

세포주	p53 상태	p53CON 프로모터	RGC-프로모터
U87	야생형	3,921.12	112.33
A549	야생형	647.30	16.36
MCF-7	야생형	445.25	12.26
293	야생형;불활성	13.03	0.62
Hep3B	무(null)	4.62	1.22
NCI-H358	무	0.35	0.56
Panc1	돌연변이형	1.56	1.02
WIDR	돌연변이형	16.17	1.07
MDA-Mb-468	돌연변이형	4.88	0.87
AsPC-1	돌연변이형	0.54	1.08
Caco-2	돌연변이형	14.59	1.13
MicaPaca2	미지	28.43	1.24

상기 분석 결과를 보면, 상기한 2가지의 반응 성분 모두가 기능성 p53을 가진 세포내에서는 활성을 보였다. 상기한 p53 반응성 프로모터의 활성이 기능성 p53에 기인한 것인지 여부를 확인하기 위해, 상기 2가지의 세포주 (WIDR 및 U87)을, 루시페라제 유전자의 발현을 유도하는 RGC 프로모터 및 비어있는 카세트(empty cassette) 대조군 아데노바이러스 벡터 (ZZCB) 또는 CMV 프로모터 (FTCB)의 조절하에서 p53을 지속적으로 생성하는 재조합 아데노바이러스로 함께 형질감염시켰다. 이에 대한 결과는 하기 표 6에 나타나 있다:

WIDR 및 U87 세포에서, p53을 암호화하는 재조합 아데노바이러스를 감염시킨 후의 p53 반응성 프로모터 활성의 회복/증진 (상대적인 루시페라제 활성^*)

바이러스	투여량	WIDR	U87
ZZCB	1×10⁸	1.0	1.0
ZZCB	1×10⁹	1.25	0.67
FTCB	1×10⁸	4.71	20.30
FTCB	1×10⁹	29.00	109.95

{* 루시페라제의 활성은 ZZCB 감염으로 얻은 활성에 대한 상대적인 값}

TGF-β 경로-반응성 프로모터 (PAI 또는 SRE) 또는 p53 경로-반응성 프로모터 (RGC 또는 p53CON)의 통제하에 있는 E2F-Rb 융합 단백질 암호화 서열을 암호화하는 재조합 아데노 바이러스 벡터를 제조하였다. 또한, 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 리포터로서 상기 벡터에 혼입시켰다. 세포변성 효과 (CPE) 분석에서, 이렇게 수득한 바이러스의 선택적인 복제 능력 및 TGF-β 또는 p53 경로에 결함이 있는 세포에 대한 사멸 능력을 시험하였다. 이에 대한 결과는 도 1에 나타나 있다. MRC9 (p53 경로 포지티브 또는 TGF-β 경로 포지티브)에서, 야생형의 아데노 바이러스는 복제 가능하며 낮은 농도(1×10⁶입자/ml)에서도 CPE를 유도할 수 있는 반면, TGF-β 또는 p53 경로-표적 벡터는 상기 농도에서 CPE를 유도하지 못했다. 시험한 것 중에서 가장 높은 투여량 (1×10⁸입자/ml)에서만, 경로-표적 벡터가 어느 정도의 CPE를 보였다. 대조적으로 WIDR (p53 및 TGF-β 경로 둘 다에 결함이 있는 경우) 및 Hep3B (p53에는 없고, 외인성 TGF-β가 부재하는 경우 TGF-β 경로에 결함이 있는 경우)와 같은 세포주에서, 경로-표적된 벡터는 낮은 농도(1×10⁶입자/ml)에서도 야생형의 바이러스와 유사하게 CPE 유도에 효과적이었다. 경로-표적 벡터 (SRE-Ad 및 p53CON-Ad)로 감염된 Hep3B 세포를 형광 현미경 분석 결과, 낮은 입자 농도 (2시간 동안 1×10⁵입자/ml에 노출시켰음)로 감염시킨 경우에도 트랜스 유전자가 고농도로 발현되었으며 바이러스가 배양물내에 확산되었다. 이와 달리, 상기와 동일한 농도 (1×10⁵입자/ml)에서 아데노바이러스를 암호화하는 복제-결함성 (E1A-결실된) GFP (GFCB)로 감염된 Hep3B 세포에서는 GFP가 발현되지 않았다.

앞에서 말한 바와 같이, 본 발명의 벡터는 선택적인 조건하에서 선택적으로 복제 가능하며 표적 세포를 선택적으로 용해시킬 수 있다. 그러나, 선택성 또는 독성을 가지는 추가의 층을 상기 벡터에 혼입시켜 제작할 수 없다는 것을 의미하지는 않는다. 또한, 본 발명에서는, 상기 바이러스 게놈내에 추가의 변형 (예를 들면, 표적 변형, 트랜스유전자 발현 카세트 또는 소정의 세포 유형 또는 표현형 상태에서 용이하게 선택적으로 복제할 수 있도록 하기 위한 바이러스 게놈에 대한 변형)을 함유하는 재조합 아데노 바이러스를 제공한다.

용어 "표적 변형 (targeting modification)"은, 소정의 세포 유형이 우호적인 감염성을 나타내도록 설계된 바이러스 게놈에 대한 변형을 의미한다. 또한, 세포 유형에 대한 선택성 또는 세포 유형에 대한 표적화는, 특히 광범위한 감염성을 가지는 바이러스 (예를 들면, 아데노바이러스)에서 유래하는 벡터에서 바이러스의 엔벨로프 단백질(envelope protein)을 변형시킴으로써 가능하다. 예를 들면, 세포 표적화 (cell targeting)는, 바이러스 게놈 구상소체 (knob) 및 섬유 암호화 서열을 선택적으로 변형시켜 특정 세포 표면 수용체와 특이적으로 상호 작용하는 변형된 구상소체 및 섬유 도메인을 발현시킴으로써 가능하다. 상기한 변형을 예로 들면, 아데노바이러스 섬유 단백질내로 RGD 펩티드의 혼입{참조: Wickham et al., J. Virol 71(11): 8221-8229, 1997}, 눈 및 생식관에 대해 친화성을 갖는 아데노바이러스 섬유 유전자의 변형 {참조: Arnberg et al., Virology 227:239-244, 1997}, 아데노바이러스 섬유 단백질내로 가스트린-방출 펩티드 단편의 혼입{참조: Harris and Lemoine, TIG 12(10):400-405, 1996; Stevenson et al., J. Virol. 71(6): 4782-4790, 1997; Michael et al., gene therapy 2: 660-668, 1995}, 신드비스 바이러스 (Sindbis virus)내로 단백질 A-IgG 결합 도메인의 혼입{참조: Ohno et al., Nature Biotechnology 15: 763-767, 1997} 등이 있다. 기타의 다른 세포-특이적 표적화 방법은, 항체 또는 항체 단편을 상기 엔벨로프 단백질에 접합시킴으로써 달성할 수 있다 {참조: Michael et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:6866-6869; Watkins et al., 1997, Gene Therapy 4: 1004-1012; Douglas et al., 1996, Nature Biotechnology 14:1574-1578}. 또는, 특정 잔기를 바이러스 표면에 접합시켜 세포 표적화를 수행할 수 있다 {참조: Nilson et al., 1996, Gene Therapy 3:280-286 (레트로바이러스 단백질에 대한 EGF의 접합)}. 이렇게 재조합 방법을 사용하여 변형시킨 벡터들은 본 발명의 실시에 의해 제조될 수 있다.

용어 "트랜스유전자 발현 카세트 (transgene expression cassette)"는, 치료학적 트랜스유전자에 작동가능하게 연결된 표적 세포내에서 작동하는 프로모터를 의미한다. 상기에서 "프로모터"는, 다른 뉴클레오티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 프로모터의 예로는, 약한 구성(constitutive) 프로모터, 일시적인 바이러스 프로모터 또는 조절가능한 프로모터 등이 있다.

용어 "일시적인 프로모터(temporal promoter)"는, 상기한 경로-반응성 프로모터의 발현을 통제하는 프로모터와 관련된, 바이러스 주기 중 후반부의 소정의 시점에서 치료학적 트랜스유전자의 전사를 유도하는 프로모터를 의미한다. 이러한 일시적으로 조절되는 프로모터의 예로는, 아데노바이러스 주요 후발 프로모터 (MLP, adenovirus major late promoter) 및 기타의 프로모터 (예를 들면, E3) 등이 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, MLP 프로모터가 사용된다. 헤르페스 심플렉스 바이러스의 경우, 상기한 래이턴트-활성화 프로모터 (Lantent Activated Promoter)가 사용될 수 있다.

용어 "조절가능한 프로모터(regulatable promoter)"는, 유도가능한 프로모터, 조직-특이적인 프로모터 또는 종양-특이적인 프로모터를 의미한다. 용어 "유도가능한 프로모터(inducible promoter)"는, 소정의 조건 및/또는 외부의 화학 자극 또는 기타의 자극에 반응하여 우호적으로 (또는 유일하게) 치료학적 트랜스 유전자의 전사를 용이하게 하는 프로모터를 의미한다. 상기한 유도가능한 프로모터의 예는 과학 문헌에 공지되어 있다 {예를 들면, Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; Iida et al., (1996) J. Virol. 70(9): 6054-6059; Hwang et al., (1997) J. Virol 71(9): 7128-7131; Lee et al., (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9): 5097-5105; 및 Dreher et al., (1997) J. Biol. Chem. 272(46): 29364-29371}. 방사선 유도 프로모터의 예는 Manome 등의 문헌 {참조: Human Gene Therapy 9:1409-1417 (1998)}에 기재되어 있다. 추가 수준의 선택성은 조직-특이적인 프로모터 또는 종양-특이적인 프로모터를 사용하여, 부여할 수 있다. 조직-특이적인 프로모터 및 종양-특이적인 프로모터는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 평활근에서 우호적으로 활성을 나타내는 프로모터 (α-액틴 프로모터), 췌장-특이적인 프로모터 {참조: Palmiter et al., 1987, Cell 50:435}, 간-특이적인 프로모터 {참조: Rovet et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:20765; Lemaigne et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:19896; 및 Nitsch et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13:4494}, 위-특이적인 프로모터 {참조: Kovarik et al., 1993, J. Biol. Chem.268:9917}, 뇌하수체-특이적인 프로모터 {참조: Rhodes et al., 1993, Genes Dev.7:913}, 전립선-특이적인 프로모터 등이 있다.

용어 "치료학적 트랜스유전자"는, 표적 세포내에서 발현되어 치료학적 효과를 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 종양 억제 인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 전구 약물 활성 유전자, 세포자멸사 유전자, 약제학적 유전자 또는 항-혈관활성 유전자 등이 포함되며 이에 한정되는 것은 아니다. 일렬(tandem) 방식으로 IRES 성분을 사용하거나 독립적으로 조절되는 프로모터를 사용하여, 본 발명의 벡터를 사용을 통해 하나 이상의 치료학적 트랜스유전자를 제조할 수 있다.

용어 "종양 억제 인자 유전자(tumor suppressor gene)"는, 표적 세포내에서 발현되어 신생물 표현형을 억제할 수 있고/있거나 세포자멸사를 유도할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 본 발명의 실시에 유용한 종양 억제 인자 유전자의 예에는, p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자 {참조: Lee et al., 1987, Nature 329:642}, MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 콜리 단백질 (adenomatous polyposis coil protein) {참조: Albertsen et al., 미국 특허 제5,783,666호 (특허허여일: 1998년 7월 21일)}, 결실된 결장 암종 (DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 암종 억제인자 유전자 {참조: Cheng et al., 1998, Proc. Nat. Acad. Sci. 95:3042-3047}, MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자 및 VHL 유전자가 포함된다.

용어 "항원성 유전자 (antigenic gene)"는, 표적 세포내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예로는, 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 p53 {Levine, A., PCT 국제특허출원공보 제WO94/02167호에 기재}이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기 위해, 상기 항원성 유전자를 MHC 제I형 항원에 융합시킬 수 있다.

용어 "세포독성 유전자 (cytotoxic gene)"는, 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 세포 독성 유전자의 예로는, 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 포함된다.

용어 "세포증식 억제 유전자 (cytostatic gene)"는, 세포내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예로는, p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-의존성 카이네이즈 억제인자를 암호화하는 유전자 (예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이적인 호메오박스 (growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자 {참조: Branellec 등의 PCT 공보 WO97/16459 (공보 발행일: 1997년 5월 9일) 및 PCT 공보 WO96/30385 (공보 발행일: 1996년 10월 3일)}가 포함된다.

용어 "사이토카인 유전자(cytokine gene)"는, 세포내에서 발현되어 사이토카인을 생성하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기한 사이토카인의 예로는, GM-CSF, 인터류킨 (특히, IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20), 인터페론 α, β, γ(특히, 인터페론 α-2b) 및 인터페론 α-2α-1과 같은 융합체 등이 포함된다.

용어 "케모카인 유전자 (chemokine gene)"는, 세포 내에서 발현되어 사이토카인을 생성하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 용어 "케모카인"은, 분열 촉진 활성, 화학 주성 활성 또는 염증 활성을 갖는, 세포에서 분비되는 구조적으로 관련성이 있는 저분자량의 사이토카인 그룹을 의미한다. 주로, 이들은 4개의 보존된 시스테인 잔기를 공유하는 70 내지 100개의 아미노산 잔기로 이루어진 양이온성 단백질이다. 이들 단백질들은, 2개의 아미노 말단 시스테인의 간격을 기준으로 하여 2개의 그룹으로 구분할 수 있다. 첫째 그룹에서는, 상기한 2개의 시스테인 잔기가 1개의 잔기 (C-x-C)만큼 떨어져 있고, 두번째 그룹에서는 바로 인접해있다(C-C). "C-x-C 케모카인" 그룹에 속하는 단백질을 예로 들면, 혈소판 인자 4 (PF4), 혈소판 기본 단백질 (PBP), 인터류킨-8 (IL-8), 흑색종 성장 자극 활성 단백질 (MGSA), 대식구 염증성 단백질 2 (MIP-2), 마우스의 Mig (m119), 닭의 9E3 ( 또는 pCEF-4), 돼지의 폐포 대식구 화학주성 인자 I 및 II (AMCF-I 및 -II), 전구 B 세포 성장 촉진 인자 (PBSF) 및 IP10 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. "C-C 케모카인" 그룹에 속하는 단백질을 예로 들면, 단핵구 화학주성 단백질 1 (MCP-1), 단핵구 화학주성 단백질 2 (MCP-2), 단핵구 화학주성 단백질 3 (MCP-3), 단핵구 화학 주성 단백질 4 (MCP-4), 대식구 염증성 단백질 1α(MIP-1α), 대식구 염증성 단백질 1β(MIP-1β), 대식구 염증성 단백질 1γ(MIP-1γ), 대식구 염증성 단백질 3α(MIP-3α), 대식구 염증성 단백질 3β(MIP-3β), 케모카인 (ELC), 대식구 염증성 단백질 4 (MIP-4), 대식구 염증성 단백질 5 (MIP-5), LD78β, RANTES, SIS-엡실론 (p500), 흉선 활성화-조절되는 케모카인 (TARC), 에오탁신, I-309, 사람 단백질 HCC-1/NCC-2, 사람 단백질 HCC-3, 마우스 단백질 C10 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

용어 "약제학적 단백질 유전자"는, 단백질로 발현되어 표적 세포내에서 약제학적 효과를 발휘하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 약리학적 유전자의 예로는, 프로인슐린 (proinsulin) 유전자 및 이의 유사체 (PCT 국제특허출원 공보 제WO98/31397호에 기재), 성장 호르몬 유전자, 도파민, 세로토닌, 상피세포 성장 인자, GABA, ACTH, NGF, VEGF {표적 조직내로의 혈액 관류를 증가시켜 혈관형성 유도, PCT 국제특허출원 공보 제WO98/32859호(공보 발행일: 1998년 7월 30일)}, 트롬보스폰딘 등이 포함된다.

용어 "친-세포자멸사 유전자 (pro-apoptotic gene)"는, 발현되어 프로그램된 세포 사멸을 유도하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포자멸사 유전자의 예로는, p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4orf4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 암호화하는 유전자가 포함된다.

용어 "전구 약물 활성화 유전자 (pro-drug activating gene)"는, 비-치료학적 화합물을 해당 세포가 외부 인자에 의해 사멸될 수 있도록 하거나, 또는 해당 세포 내에서 독성 조건을 유발하는 치료학적 화합물로 전환시킬 수 있는 단백질로 발현되는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 전구 약물 활성화 유전자의 예로는 시토신 디아미나제 유전자가 있다. 시토신 디아미나제는, 5-플루오로시토신 (5-FC)을 강력한 항종양제인 5-플루오로우라실 (5-FU)로 변환시킨다. 종양 세포를 용해시키면, 종양의 국부에서 5-FC를 5-FU로 변환시킬 수 있는 시토신 디아미나제가 국부적으로 방출되어 주위의 많은 종양 세포를 사멸시키게 된다. 이와 같이, 아데노 바이러스를 이용하여 종양 세포를 감염시킬 필요없이, 많은 수의 종양 세포가 사멸된다 (소위 "방관자 효과 (bystander effect)"). 또한, 티미딘 카이네이즈 (TK) 유전자 {참조: Woo et al., 미국 특허 제5,631,236호 (특허허여일: 1997년 5월 20일); Freeman et al., 미국 특허 제5,601,818호 (특허허여일: 1997년 2월 11일)}를 사용할 수 있는 데, TK 유전자 산물을 발현하는 세포는 갠시클로비르(gancyclovir)를 투여하여 선택적으로 살해시킬 수 있다.

용어 "항-혈관형성 유전자 (anti-angiogenic gene)"는, 발현되어 항-혈관형성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 항-혈관형성 인자에는, 안지오스타틴, Tie 2 {참조: PNAS (USA)(1998) 95:8795-8800}와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.

당업자들에게는 명백한 바와 같이, 상기한 유전자를 변형 및/또는 결실시켜 야생형 단백질의 기능을 가지는 아-단편(subfragment)을 암호화하게 함으로써 본 발명의 실시에 사용될 수 있도록 용이하게 조정할 수 있다. 예를 들면, p53 유전자를 지칭하는 경우, 야생형의 p53 단백질 뿐만 아니라 변형된 p53 단백질도 포함한다. 상기한 변형된 p53 단백질의 예에는, 핵 잔류 (nuclear retention)를 증가시키기 위한 p53의 변형, 칼파인 (calpain) 컨센서스(consensus) 절단 부위를 제거하기 위한 △13-19 아미노산과 같은 결실, 올리고머화 도메인의 변형 {참조: Bracco et al., PCT 국제특허출원 공보 제WO97/0492호 또는 미국 특허 제5,573,925호} 등이 포함된다.

상기한 치료학적 유전자는, 배지내에 방출시키거나, 시그날 펩티드 또는 핵 국재화 시그날 (nuclear localization signal: NLS)과 같은 표적 잔기를 포함시켜 세포내의 특정 부위에 국재화시킬 수 있다. 또한, 상기 용어 "치료학적 트랜스유전자"의 정의에는, 제1형 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV-1)의 구조 단백질 VP22와 치료학적 트랜스유전자의 융합 단백질이 포함된다. 감염된 세포내에서 합성되는 경우, VP22 시그날을 함유하는 융합 단백질은 감염된 세포밖으로 방출되고, 약 16개의 세포 크기 직경의 주위에 있는 감염되지 않은 세포내로 효과적으로 침입한다. 특히, 상기 융합 단백질이 주위 세포의 핵으로 효과적으로 전송될 수 있으므로, 이러한 시스템은 융합 단백질로서 전사적으로 활성을 갖는 단백질 (예를 들면, p53)과 함께 유용하게 사용할 수 있다 {참조: Elliott, G. & O'Hare, P. Cell 88:223-233:1997; Marshall, A. & Castellino, A. Research News Briefs. Nature Biotechnology. 15:205:1997; O'Hare et al., PCT 공보 WO97/05265 (공보발행일: 1997년 2월 13일)}. 또한, HIV Tat 단백질로부터 유래한 상기와 유사한 표적 잔기는 바이브스(Vives) 등의 문헌 {참조: J. Biol. Chem 272:16010-16017, 1997}에 기재되어 있다.

이외에, 본 발명의 벡터의 효능을 증가시키기 위한 변형으로는, E1 내의 변형, E4 내에 돌연변이를 유도하여 세포독성을 증가시킨 것 {참조: Muller et al., 1992, J. Virol. 66:5867-5878}, E4orf4 또는 E3 11.6K 단백질 등의 바이러스 사멸 단백질의 상향 조절(up-regulation) 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에 예시된 본 발명의 바람직한 실시예에서 본 발명의 벡터는, E2F-Rb 융합 단백질의 발현을 유도하는 p53 또는 TGF-β 경로-반응성 프로모터를 함유하는, 조건에 따라 복제하는 아데노바이러스를 포함하며, 일시적인 E3 프로모터의 통제하에 있는 시토신 디아미나제 유전자를 추가로 포함한다. 상기의 경우, 시토신 디아미나제는 바이러스 복제 이후에 종양 세포에서만 생성된다. 본 발명의 바람직한 실시에서는, 전구약물 전환 유전자가 상대적으로 약한 프로모터, 조직-특이적인 프로모터 또는 종양-특이적인 프로모터의 통제하에 있다.

본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 벡터는, E2F-Rb 융합 단백질의 발현을 유도하는 p53 또는 TGF-β경로-반응성 프로모터; 및 시토신 디아미나제만을 발현하거나 시토신 디아미나제, IRES 성분 및 MIP-3α 단백질을 함유하는 바이-시스트론성(bi-cistronic) 발현 카세트내에서 발현하는 트랜스 유전자 발현 카세트를 갖는, 재조합 아데노바이러스를 포함한다. 시토신 디아미나제가 발현되기 때문에, 5-플루오로시토신 등의 전구약물을 투여하면 종양 세포가 살해된다. MIP-3α가 낮은 수준으로 발현되는 경우, 항-종양 면역성을 발달시키는 데에 도움이 된다.

본원에서 복합 수준(multi-level), 복합 기능(multi-functional) 또는 복합 경로-반응성 (multi pathway-responsive)의 여러 순차적 단계들은, 동시에 하나 이상의 경로가 검출될 수 있는 경우에 치료 효과를 나타낼 수 있도록 경로-반응성 인자가 작제된 것을 의미하는 것으로 사용된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 상기한 벡터 조절 성분들을 결합하여 본 발명의 벡터에 복합층의 선택성을 제공한다. 복합 수준의 조절을 예로 들면, 복제되어 Rb, TGF-β 또는 p53 경로에 결함이 있는 세포를 살해할 수 있는, 소정의 조건하에서 복제하는 아데노바이러스를 설계할 수 있다. 상기 벡터는, 주요 조절 수준으로서 p53-반응성 프로모터에 의해 조절되는 바이러스 복제에 대한 우성 네가티브 억제 인자를 발현시킨다. 이 결과, 기능을 나타내는 p53을 갖는 모든 세포 (예를 들면, 모든 정상 세포) 내에서 (p53이 불활성인 세포는 제외), 우성의 네가티브 억제 인자가 발현되어 바이러스 복제가 억제된다. 하지만, 상기 벡터는, 기타의 다른 경로 (예를 들면, TGF-β 및 Rb 경로)에는 결함이 있으나 기능성 p53을 갖는 종양 세포내에서는 복제될 수 있다. 따라서, 기타의 다른 경로에 결함이 있는 경우에 복제 가능케 하는, 종양 세포내에 기능성 p53을 반드시 불활성화시킬 수 있는 추가의 조절 수준을 삽입시킬 수 있다.

제2 조절 수준으로서, 상기 벡터는, TGF-β 경로에 결함이 있는 세포에서만 활성을 나타내는 프로모터의 통제하에 p53을 기능적으로 불활성화시킬 수 있는 아데노바이러스 E1B-55K 단백질을 함유하는 발현 카세트로 이루어져 있다. TGF-β경로에 결함이 있는 세포에서만 활성을 나타내는 프로모터는, 프로모터내에 리프레서-결합 부위를 삽입시킴으로써, 벡터상의 TGF-β 반응성 프로모터를 이용하여 상기 리프레서를 발현시켜, 완전한 TGF-β 시그날 전달을 하는 세포내에서 상기 프로모터 활성을 억제할 수 있도록 작제할 수 있다. 반면에, TGF-β 경로에 결함이 있는 세포의 경우, 상기한 리프레서가 합성되지 않아서 상기 프로모터가 활성을 나타낸다. TGF-β 경로에 결함이 있는 세포에서만 활성을 나타내는 프로모터로부터 E1B-55K가 발현되기 때문에, 내인성 p53은 불활성화된다. 이와 달리, TGF-β 시그날 전달에 의해 하향 조절(down-regulation)되는 모든 천연 프로모터가 사용가능하다. 상기한 2가지의 발현 카세트를 혼입하게 되면, p53 및 TGF-β경로 둘 다가 정상인 경우 (바이러스 복제가 억제됨)에만 상기한 우성 네가티브 억제 인자가 발현되고, 둘 중의 하나 또는 둘다 결함이 있는 경우 (바이러스가 복제됨)에는 발현되지 않는다.

제3 조절 수준으로서, 상기 벡터내에서, E2F 반응성 프로모터에 의해 조절되는 TGF-β 경로를 불활성화할 수 있는 Smad7 또는 기타의 다른 우성 네가티브 형태의 Smad와 같은 단백질을 발현시킬 수 있다 {참조: Nakao et al., Nature (1997년 10월 9일) 389 (6651):631-635}. E2F-반응성 프로모터 (예를 들면, SV40 TATA box와 같은 최소 프로모터의 상류쪽에 여러 개의 E2F-결합 부위를 갖는 E2F1 프로모터, E2 프로모터 또는 합성 프로모터)는, Rb 경로에 결함이 있는 경우에 활성을 나타낸다. 이러한 제3의 조절 수준으로 인해, Rb 경로에 결함이 있는 세포에서는 Smad7이 발현되어, 이것이 Smad4를 불활성화시키고 TGF-β 시그날 전달을 차단시킨다. 따라서, E1B-55K가 만들어 지고 p53이 불활성화되어, 상기한 우성 네가티브 억제 인자의 발현이 결여된다. 따라서, 바이러스 복제는 방해되지 않고 진행될 수 있다. 반면에, Rb 경로가 정상인 경우, Smad7이 합성되지 않아서 TGF-β 시그날 전달이 정상적으로 이루어진다. 따라서, E1B-55K가 만들어 지지 않고 p53이 기능을 나타냄으로써, 상기한 우성 네가티브 억제 인자가 발현되어 바이러스 복제를 차단한다.

상기한 3가지의 조절 수준으로, 상기한 3가지의 경로 (Rb, TGF-β 및 p53) 중 어느 하나 이상에 결함이 있는 경우, 최종적으로는 바이러스 복제 및 세포 용해가 발생한다. 상기한 3가지 경로 모두가 정상 세포에서와 같이 기능을 하는 경우에만 바이러스 복제가 일어나지 않는다.

당업자에게는 명백한 바와 같이, 본 발명의 벡터는, 다양한 경로-반응성 프로모터를 사용하여 광범위한 경로 결함 여부의 측정 및 치료에 여러 가지로 변형하여 사용가능하다. 하지만, 본원에 예시된 본 발명의 바람직한 실시예에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 "아데노비리디아에(adenoviridiae) 속"에서 유래한 것이다. 특히, 바람직한 바이러스는 사람 아데노바이러스 제2형 또는 제5형에서 유래한 것이다. 아데노바이러스 벡터를 모 벡터 (parent vector)로 사용하는 경우, 바람직한 바이러스 복제의 억제 인자는 E2R-RB 융합 단백질이다.

통제되지 않은 세포 증식과 관련된 질환을 치료하는 데에 본 발명의 바람직한 벡터를 사용하는 경우의 본 발명의 바람직한 실시에서, E1A 부위에 특정의 결실을 함유하여 E1a 유전자 산물이 p300 및 Rb 단백질에 결합할 수 있는 능력을 제거하는 반면에 E1a CR3 도메인의 트랜스활성화(transactivation) 기능은 보유하는 아데노바이러스 벡터가 바람직하다. 본 발명의 벡터는, 13S 암호화 서열내에 p300 및 p105-Rb 결합 부위를 제거하기 위해 E1a 암호화 서열내에 결실을 함유한다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, p300 결합 부위의 결실은 4 내지 25번 또는 36 내지 49번 아미노산의 결실을 갖는다.

p300 및 pRb 결합의 제거를 위해 필수적인 E1a 289R 암호화 서열에서의 결실은, E1a 289R 단백질의 2차 및 3차 구조를 크게 해체하지 않을 정도로 가능한 한 최소로 하는 것이 바람직하다. p300 결합을 제거하기 위해, 289R의 p300 결합 도메인을 암호화하는 DNA 서열에 돌연변이를 일으키는 것이 바람직하다. 변형의 정도는 작게 하는 것이 바람직하지만, p300 결합을 제거하기 위해 C 말단 영역내의 약 30개 미만의 아미노산을 결실시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 4 내지 25번 아미노산의 결실 (dl1101), 약 30 내지 49번 아미노산의 결실 (dl1103), 보다 상세하게는 36 내지 49번 아미노산의 결실로 p300 결합을 제거하는 것도 바람직하다. 특히, p300의 결합을 파괴시키기에 충분한 점 돌연변이가 특히 바람직하다. 예를 들면, 상기 289R 단백질내에서 제2 아미노산을 아르기닌에서 글리신으로의 점 돌연변이(Arg2 →Gly2)시킨 경우, p300 결합이 파괴됨이 입증되었다 {참조: pm563, Whyte et al., (1989) Cell 56:67-75}. 이와 유사하게, pRb105 결합을 제거하는 것과 관련하여, 변형 정도는 최소인 것이 바람직하다. 111 내지 123번 아미노산의 제거 (dl1107) 및 124 내지 127번의 제거 (dl1108)와 같은 상기 pRb105 결합 도메인의 선택적인 아미노산을 제거하는 것이 바람직하다. 상기 289R 단백질의 p107 결합 활성을 유지한다는 점에 있어서, 111 내지 123번 아미노산의 결실(dl1107)이 특히 바람직하다.

또한, E1a289R 단백질의 219 내지 289번 아미노산 및 E1A 243R 단백질의 173 내지 243번 아미노산을 제거할 수 있다. 예를 들면, 사람의 Ad5 게놈의 1131 위치에 상응하는 위치에 점 돌연변이 (즉, 시토신¹¹³¹을 구아닌으로 변경)를 일으켜 정지 코돈(stop codon)을 생성시킨다. 이러한 돌연변이로 인해, E1a289R 단백질의 219 내지 289번 아미노산 및 E1A 243R 단백질의 173 내지 243번 아미노산이 제거된다. 임의적으로는, 상기 돌연변이는, 상기한 Rb 및 p300 결합 도메인에서의 결실에 추가하여 수행된다. 상기 모 벡터의 다른 예들은, 함께 계류중인 미국 특허출원번호 제60/104,317호 및 제08/09/172,684호 (출원일: 1998년 10월 15일)에 기재되어 있다.

본원에 예시되어 있는 본 발명의 바람직한 양태에서는, 바람직한 p53 경로-반응성 프로모터가 p53-CON 및 RGC이다. 바람직하게는, TGF-β 경로-반응성 프로모터는 PAI-RE 및 SRE로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 치료학적 유전자가 전구 약물-활성화 유전자 (예를 들면, 시토신 디아미나제)이다. 항-종양 면역성을 유도하기 위한 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 본 발명의 벡터가 MIP-3α를 암호화한다.

치료학적 유전자를 발현하는 데에 바람직한 프로모터는 일시적인 프로모터 (예를 들면, MLP 및 E3)이다.

아데노바이러스 작제물의 경우, 복제될 때까지 아데노바이러스에 의해 유도되는 세포 용해를 최소화하기 위해 Ad E3-11.6K 단백질 활성을 제거 또는 지연시킨다. 특히, 자연 그대로의 E3-11.6K/10.5K 유전자를 제거하는 것이 바람직하다. 이로 인해, 최초로 국재화된 확산이 발생한 후까지는 면역 반응이 최소화된다. 추후에, 처음에 감염된 세포가 세포자멸사(apoptosis)되고 바이러스가 국재적으로 확산되면, 상기 면역 반응이 유용하게 된다. 상기 11.6K 단백질 (또는 이에 상응하는 Ad5의 E3-10.5K 단백질)은 전-세포자멸사(pro-apoptotic) 유전자이고, 종양 세포내에서 세포 살해를 위해 사용될 수 있다. 하지만, 바이러스 복제를 최대화하기 위해 표적 세포의 초기 용해를 지연시키고자 하는 경우, 상기 11.6k/10.5K 유전자를 일시적인 프로모터 (예를 들면, MLP 프로모터)의 통제하에 둠으로써 세포 자멸사 효과 발생을 지연시키는 것이 바람직하다.

약제학적 제형

또한, 본 발명에서는 상기한 재조합 벡터 및 담체를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 제형을 제공한다. 본 발명의 벡터는, 통상 사용되는 약제와 약제학적 담체 및 부형제를 첨가하여 투여용 조성물로 제형화할 수 있다. 용량 제형으로는, 정맥내 투여용, 종양내 투여용, 근육내 투여용, 복강내 투여용, 국소 투여용, 매트릭스 또는 에어로졸 전달용 제형이 포함된다.

용어 "담체"는, 약제학적 화합물의 안정성, 멸균성 및 전달성을 증진시키기 위해 사용되는 약제학적 화합물의 제형시에 통상적으로 사용되는 화합물을 의미한다. 상기 바이러스를 액제 또는 현탁제로 제형화하는 경우, 전달 시스템은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체이다. 다양한 종류의 수성 담체가 사용될 수 있는 데, 예를 들면, 물, 완충수, 0.8% 염수, 0.3% 글리신, 하이알루론산 등이 있다. 이러한 조성물은, 통상적으로 잘 알려져 있는 멸균 처리방법으로 멸균시키거나 멸균 여과시킬 수 있다. 이렇게 수득한 수용액을 그대로 포장하여 사용할 수도 있고, 동결 건조시켜 사용할 수도 있으며, 동결 건조된 제제의 경우에는 투여하기 이전에 멸균 용액과 배합하여 사용한다. 상기 조성물은, 생리학적 조건에 근접하게 하는 약제학적으로 허용가능한 보조 물질 (예를 들면, pH 조절제 및 완충제), 강직 조절제, 흡습제 (예를 들면, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 흡착 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등) 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명에서는, 본 발명의 바이러스와 담체 및 전달 증진제를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 용어 "전달 증진 물질 (delivery enhancer)" 또는 "전달 증진제 (delivery enhancing agent)"는 본원에서 상호교환적으로 사용하고 있으며, 바이러스가 표적 세포내로 용이하게 침입할 수 있도록 해주는 하나 이상의 제제를 포함한다. 전달 증진 물질의 예는, 미국 특허출원 제09/112,074호 (출원일: 1998년 7월 8일) 및 제08/938,089호 (출원일: 1997년 9월 26일)에 기재되어 있다. 상기한 전달 증진제의 예로는, 세척제, 알콜, 글리콜, 표면활성제, 담즙염, 헤파린 길항제, 사이클로옥시게나제 억제제, 고장염 용액(hypertonic salt solution) 및 아세테이트가 포함된다. 알콜에는, 예를 들면, 에탄올, N-프로판올, 이소프로판올, 부틸 알콜, 아세틸 알콜과 같은 지방족 알콜이 포함된다. 글리콜에는, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 및 기타의 저분자량의 글리콜 (예를 들면, 글리세롤 및 티오글리세롤)이 포함된다. 또한, 아세트산, 글루콘산 및 아세트산나트륨과 같은 아세테이트가 전달 증진제로서 사용될 수 있다. 또한, 1M NaCl과 같은 고장염 용액(hypertonic salt solution)이 전달 증진제로서 사용될 수 있다. 표면활성제의 예로는, 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 라이소레시틴, 폴리소르베이트 80, 노닐페녹시폴리옥시에틸렌, 라이소포스파티딜콜린, 폴리에틸렌글리콜 400, 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리글리콜 에테르 표면활성제 및 DMSO가 포함된다. 담즙염(bile salt)의 예로는, 타우로콜레이트, 나트륨 타우로-데옥시콜레이트, 데옥시콜레이트, 케노데옥시콜레이트, 글리코콜산, 글리코케노데옥시콜산 및 기타의 수렴 제제 (예를 들면, 질산은)가 포함된다. 프로타민 설페이트와 같은 4급 아민과 같은 헤파린-길항제가 또한 사용될 수 있다. 나트륨 살리실레이트, 살리실산 및 비-스테로이드계 소염제 (NSAIDS) (예를 들면, 인도메타신, 나프록센, 디클로페낙)과 같은 사이클로옥시게나제 억제제가 사용될 수 있다. 전달 증진제에는 하기 화학식 I의 화합물

{여기에서, X1 및 X2는 콜산(cholic acid), 데옥스콜산 및 당으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; m은 2 내지 8의 정수 (바람직하게는, 2 또는 3)이며; n은 2 내지 8의 정수 (바람직하게는, 2 또는 3)이고; R은 양이온 그룹, 당 그룹 또는 -CO-X3 (여기서, X3는 당 그룹)이다}이 포함된다. 상기 화합물에서, 당 그룹은 펜토스 단당류, 헥소스 단당류, 펜토스-펜토스 이당류, 헥소스-헥소스 이당류, 펜토스-헥소스 이당류 및 헥소스-펜토스 이당류로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.

용어 "세척제(detergent)"에는, 음이온성, 양이온성, 양쪽성 및 비-이온성 세척제가 포함된다. 세척제의 예로는, 타우로콜레이트, 데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트, 세틸피리디움, 벤알코늄 클로라이드, 쯔비터젠트(Zwittergent) 3-14 세척제, CHAPS (3-[3-콜아미도프로필)디메틸암모니올]-1-프로판설포네이트 하이드레이트), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, 트리톤-X-100 세척제, C12E8, 옥틸-B-D-글루코피라노시드, PLURONIC-F68 세척제, 트윈 20 세척제 및 트윈 80 세척제 (CalBiochem Biochemicals)가 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 단위 용량 제형은, 하기 청구범위 제1항의 재조합 바이러스를 함유하는 동결 건조 형태의 생성물 킷트 및 동결 건조된 생성물을 재구성(reconstitution)하기 위한 용액내에 포함될 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스는 통상의 공정을 사용하여 동결건조 시킨 후에 재구성할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 칼파인 억제제 (calpain inhibitor)와 함께 투여할 수 있다. "칼파인 억제제" ("CI")는, 칼파인-I (예를 들면, μ-칼파인)의 단백질 분해 작용을 억제하는 화합물을 의미한다. 본원에서의 용어 "칼파인 억제제"에는, 기타의 다른 생물학적 활성과 더불어 또는 이와 독립적으로 칼파인 I 억제 활성을 갖는 화합물이 포함된다. 다양한 종류의 화합물들이 칼파인의 단백질 분해 활성을 억제하는 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 실시에 유용한 칼파인 억제제의 예에는, "칼파인 억제제 I"로도 알려져 있는 N-아세틸-leu-leu-norleucinal이 포함된다. 칼파인 억제제는, 바이러스 벡터에 대해 세포의 감염성을 증가시키고, NF-kappaB 및 AP-1 전사 인자의 수준을 상승시켜 프로모터로부터 전사를 향상시키고, 아데노바이러스 벡터에 대한 CTL 반응을 감소시키는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 제형 및 방법은, 임의적으로, 칼파인 억제제를 포함할 수 있다. 칼파인 억제제 및 이의 사용은 아텐키오(Atencio) 등의 특허출원 {미국 특허출원 제60/104,321호 및 제09/073,076호 (출원일: 1998년 10월 15일)}에 기재되어 있다.

사용 방법

본 발명에서는, 선택적으로 복제하는 본 발명의 벡터를 표적 세포에 접촉시켜 조절 경로에 결함이 있는 세포를 살해하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 본 발명의 바람직한 한 양태에서는, 경로-결함을 갖는 세포가 신생물 세포이다. 용어 "신생물 세포 (neoplastic cell)"는, 정상적인 세포 성장 조절과는 무관하게 독립성을 갖는, 비정상적인 성장 표현형을 보이는 세포를 의미한다. 용어 "신생물 세포"라는 것이 항상 어떠한 때라도 복제한다는 것을 의미하는 것은 아니며, 활발하게 복제하거나 일시적으로 비-복제 휴지기 (G1 또는 G0)에 있는 세포를 포함한다. 신생물 세포의 국재화된 군체(localized population)를 "신생물(neoplasm)"이라고 한다. "신생물"은 악성 또는 양성일 수 있다. 악성 신생물은 암(cancer)이라고도 불린다. 용어 "암"은 용어 "종양(tumor)"과 같은 의미로 함께 사용된다. 신생물 전환(neoplastic transformation)은, 정상 세포가 신생물 세포 (종종, 종양 세포)로 변환되는 것을 의미한다.

본 발명에서는, 본 발명의 재조합 아데노 바이러스를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 제형을 투여하여, 포유 동물의 신생물 세포를 생체내에서 제거(ablating)하는 방법을 제공한다. 용어 "제거 (ablating)"는, 생존 가능한 신생물 세포 군체를 실질적으로 감소시켜 신생물 세포가 존재함으로 인한 생리적인 질환을 완화시키는 것을 의미한다. 용어 "실질적으로(substantially)"는, 포유 동물에서의 생존 가능한 신생물 세포 군체가 치료전에 비해 약 20% 이상 감소하는 것을 의미한다. 용어 "생존가능한 (viable)"은, 신생물 세포의 통제되지 않은 성장 및 세포 주기 조절 특성을 의미한다. 본원에서의 용어 "생존가능한 신생물 세포"는, 더 이상 복제가 불가능한 신생물 세포와 구별하기 위해 사용되고 있다. 예를 들면, 종양괴(tumor mass)는 치료이후에도 유지될 수 있으나, 이러한 종양괴를 함유하는 세포 군체(population)는 사멸할 수 있다. 몇몇 종양괴는 유지될 수 있으나, 상기한 바와 같이 사멸된 세포는 제거되고 복제 능력이 떨어지게 된다.

용어 "포유 동물"에는 사람, 돼지, 말, 소, 개, 고양이가 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료할 포유 동물 유형에 대해 내인성인 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 치료할 종에서 유래한 바이러스를 사용하는 것이 일반적으로 바람직하지만, 소정의 경우에는, 다른 종에서 유래한 것이나 병리적인 특성이 우호적인 벡터를 사용하는 것이 유리할 수도 있다. 예를 들면, 양의 아데노바이러스 벡터를 사람의 유전자 치료법에 사용하여, 사람의 아데노바이러스 벡터의 면역 반응 특성을 최소화시킬 수 있는 것으로 보고되어 있다 {참조: 제WO97/06826호(공보발행일: 1997년 4월 10일)}. 면역 반응을 최소화시킴으로써, 벡터가 전신에 걸쳐 신속하게 청소되는 것을 방지하여 벡터의 작용 지속 기간이 보다 길어진다.

특히, 본 발명의 벡터는, TGF-β 항-증식 작용의 결여와 관련된 종양 (예를 들면, 유방암종, 간종양, 위종양, 결장 종양, 피부 종양, B 림프종 및 T 림프종을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아님)의 치료에 사용할 수 있다 {참조: Markowitz and Roberts, 1996}. 제2형 TGF-β 수용체의 돌연변이가 결장암, 위암, 뇌암 및 경부 판상암종에서 확인되었다. 또한, 제1형 TGF-β 수용체의 돌연변이가 카포시 육종, 유방 종양, 난소 종양 및 결장직장 종양에서 발견되었다. TGF-β 시그날 전달의 세포내 효능 인자인 Smad 중에서, Smad4/DPC4가 췌장암 중 거의 50%에서 변형을 보이는 종양 억제 유전자의 후보물로 확인되었다. 비록 낮은 빈도로 나타나지만, 결장 종양, 유방 종양 및 난소 종양에서 DPC4 유전자의 변형이 관찰되었다. 특히, 본 발명의 벡터는 췌장암과 같은 TGF-β에 반응을 보이지 않는 종양의 치료에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 p53 경로에 결함이 있는 종양 세포를 치료하는 데에 사용할 수 있다. 이러한 종양에는, p53, mdm2 및 p14/p19ARF (INK4a 유전자)이 변형된 종양이 포함된다. 또한, 본 발명의 벡터는 Rb 경로에 결함이 있는 암 세포를 치료하는 데에 유용하다. Rb 경로의 결함은 Rb, 사이클린 D, 사이클린-의존성 카이네이즈 (예를 들면, CDK4) 및 p16 (INK4a 유전자)의 변형에 기인한다.

본 발명에서 재조합 아데노바이러스만을 이용하는 방법을 제공하고 있으나, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 및 이의 제형은 통상의 화학 치료제 또는 치료 방법과 함께 사용할 수 있다. 상기한 화학 치료제의 예로는, 퓨린 합성 억제제 (예를 들면, 펜토스타틴, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 메토트렉세이트) 또는 피리미딘 합성 억제제 (예를 들면, 팔라, 아자르빈), 리보뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드로 전환되는 것을 억제하는 억제제 (예를 들면, 하이드록시우레아), dTMP 합성 억제제 (5-플루오로우라실), DNA 손상제 (예를 들면, 방사선, 블레오마이신, 에토포시드, 테니포시드, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 미토크산트론, 알킬화제, 미토마이신, 시스플라틴, 프로카바진) 및 미세소관 기능 억제제 (예를 들면, 빈카 알칼로이드 및 콜키친)가 포함된다. 화학 치료제를 이용한 치료 방법은, 신생물 세포를 제거하도록 설계된 비-화학적 과정 (예를 들면, 방사선 치료)을 주로 의미한다. 상기한 치료학적 유전자가 p53인 경우, 복합 치료법의 예는 닐센(Nielsen) 등의 특허출원{참조: 제WO/9835554A2호(공보 발행일: 1998년 8월 20일)}에 기재되어 있다.

상기한 면역 반응은 바이러스 벡터를 생체내에 반복적으로 투여하는 경우에 중요하다. 따라서, 본 발명의 벡터는 면역 억제제와 함께 투여될 수 있다. 면역 억제제의 예로는, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드, 림프구 면역 글로불린, CD3 복합체에 대한 항체, 아드레노코르티코스테로이드, 설파살자인, FK-506, 메톡살렌 및 탈리도미드가 포함된다.

또한, 본 발명에서는, 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 신생물 세포에 의해 오염된 정상 세포군에 투여하여 세포외에서(ex vivo) 정상 세포군내의 신생물 세포를 제거하는 방법을 제공한다. 상기 방법을 사용한 예를 보면, 통상적으로 골수 퍼징 (bone marrow purging)으로 알려져 있는 자가-유래 간세포 (autologous stem cell) 생성물을 제거하는 것과 같은 세포외 용도에 최근에 이용되고 있다. 용어 "간세포 생성물"은, 근육 제거 치료 (myoablative therapy)를 받은 환자의 장기간 조혈 기능을 재개시킬 수 있는 조혈성 전구 세포(progenitor) 군 및 간세포 군을 의미한다. 간세포 생성물은 통상적으로 분리 반출(apheresis)이나, 또는 동원된(mobilized) 또는 비-동원된 말초 혈액에 의해 수득된다. 통상적으로, 분리 반출은, 시판되고 있는 분리 반출 장치 (예를 들면, COBE 스펙트라 분리 반출 시스템, 코넥티컷 레이크우드 오크 스트리트 1185 소재의 COBE 인터네셔날에서 시판)를 사용하여 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 치료 조건을 최적화하여, 바람직하게는 "3-로그 퍼지(log purge) (즉, 간세포 생성물로부터 종양 세포의 약 99.9%를 제거)"를 얻고, 가장 바람직하게는 "5-로그 퍼지 (즉, 간세포 생성물로부터 종양 세포의 약 99.999%를 제거)"를 얻는다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 100ml의 간세포 생성물을 37℃에서 약 4시간 동안 본 발명의 벡터 약 2×10¹¹의 핵화된 세포 비율에 대한 입자수로 처리한다.

진단 용도

상기한 치료 용도에 더불어, 본 발명의 벡터는 진단용으로도 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 벡터는 바이러스 감염 또는 복제시에 발현되는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 용어 "리포터 유전자 (reporter gene)"는, 검출가능한 시그날만을 발생시키거나 기타의 다른 인자와 함께 발생시킬 수 있는 산물의 유전자이다. 리포터 유전자의 예로는, β-갈락토시데이즈 유전자, 루시페라제 유전자, 녹색 형광 단백질 유전자, 영상 시스템 {예를 들면, X선 또는 자기장 영상 시스템(MRI)}에 의해 검출가능한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 상기 벡터는 기능성 경로 (예를 들면, p53 또는 TGF-β 경로)의 존재 여부를 검출하는 데에 유용하다. 또는, 상기 벡터는, 결합 분자 (예를 들면, 형광-표지된 항체)에 의해 인식될 수 있는 세포 표면 단백질을 발현시키는 데에 사용될 수 있다. 또는, 상기한 경로-반응성 프로모터를 사용하여 바이러스 복제를 억제하는 리프레서 (예를 들면, E2F-Rb)를 유도하는 경우, 레이트(late) 바이러스 프로모터 (예를 들면, E2F-Rb에 의해 작동 중지되는 E2, 또는 E2F 결합 부위와 같이 리프레서-결합 부위를 갖는 기타의 다른 프로모터)를 사용하여 경로-반응성 프로모터가 작동하지 않는 경우에 진단용 리포터 유전자를 유도할 수 있다. 상기한 진단용 작제물은 생체내 또는 시험관내 진단용으로 사용할 수 있다. 생체내 용도의 예로는, X선, CT 스캐닝 또는 자기 공명 영상 (MRI)과 같은 영상 용도가 포함된다.

본 발명의 벡터의 제조 방법

또한, 본 발명에서는, 하기의 단계를 포함하여 상기 재조합 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다:

a. 생산 세포 (producer cell)를 재조합 벡터로 감염시키는 단계;

b. 상기 감염된 생산 세포내에서 바이러스 게놈이 복제할 수 있는 조건하에서, 상기 감염된 생산 세포를 배양하는 단계;

c. 생산 세포를 수집하는 단계; 및

d. 재조합 바이러스를 정제하는 단계.

용어 "감염"은, 상기 생산 세포를 상기 재조합 아데노바이러스로 용이하게 감염시킬 수 있는 조건하에서, 상기 재조합 바이러스를 상기 생산 세포와 접촉시키는 것을 의미한다. 여러 카피(copy)의 소정의 바이러스에 감염된 세포내에서, 바이러스 복제 및 비리온 패키징(packaging)에 필수적인 활성은 서로 협동적이다. 따라서, 상기 생산 세포가 상기 바이러스에 중복 감염될 가능성이 크도록 감염 조건을 조정하는 것이 바람직하다. 상기 생산 세포내에서 바이러스의 생산을 증가시키는 조건의 예로는, 감염기에 있는 바이러스의 농도를 증가시키는 것이다. 하지만, 생산 세포당 바이러스 감염 총수가 과다하여 생산 세포에 독성을 나타낼 수도 있다. 따라서, 바이러스 농도를 1×10⁶ 내지 1×10¹⁰비리온/ml, 바람직하게는 1×10⁹비리온/ml로 감염 조건을 유지하도록 해야 한다. 또한, 화학제를 사용하여 상기 생산 세포주의 감염도를 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서는, 칼파인 억제제를 포함함으로써 생산 세포주의 바이러스 감염도를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시에 유용한 칼파인 억제제의 예로는, 칼파인 억제제 I ("N-아세틸-류실-류실-노르류시날"로도 알려져 있음, 베링거 만하임에서 시판)이 포함된다. 칼파인 억제제 I은, 생산 세포주의 재조합 아데노바이러스에 의한 감염도를 증가시키는 것으로 관찰되었다.

용어 "생산 세포(producer cell)"는, 생산될 재조합 아데노바이러스의 바이러스 게놈의 복제를 용이하게 할 수 있는 세포를 의미한다. 다양한 포유 동물의 세포주가 재조합 아데노바이러스의 배양에 유용한 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, 293 세포주 {참조: Graham and Smiley (1977) J. Gen, Virol. 36:59-72}는 E1 기능의 결함을 보충하도록 조작된 것으로서, 본 발명의 벡터를 생성하는 데에 바람직한 세포주이다. 기타의 다른 생산 세포의 예로는, HeLa 세포 및 PERC.6 세포가 포함된다 {참조: WO97/00326, 출원번호 PCT/NL96/00244에 기재}.

용어 "바이러스 게놈이 복제될 수 있는 조건하에서의 배양"은, 감염된 생산 세포내에서 바이러스가 증식할 수 있는 조건을 유지하는 것을 의미한다. 각 세포에 의해 생산되는 바이러스 입자수를 최대화하도록 조건을 조절하는 것이 바람직하다. 따라서, 온도, 용존 산소, pH와 같은 반응 조건을 모니터링하고 통제할 필요가 있다. 셀리젠 플러스 바이로리엑터[CelliGen Plus Bioreactor(뉴저지 에디슨 탈마지 로드 44에 소재하는 뉴 브룬스윅 사이언티픽, 인코포레이티드(New Brunswick Scientific, Inc.)에서 시판]와 같이 시판되고 있는 생물반응기는, 상기한 파라미터를 모니터링하고 유지하는 수단을 가지고 있다. 감염 및 배양 조건의 최적화 조건은 어느 정도 변할 수 있으나, 효과적인 바이러스 복제 및 생산 조건은 생산 세포주의 공지된 특성, 바이러스의 공지된 특성, 생물 반응기의 유형 등을 고려한다면 당업자라면 알 수 있는 정도이다. 293 세포를 생산 세포주로 사용하는 경우, 산소 농도는 용존 산소 약 50% 내지 약 120%로 유지하는 것이 바람직하고, 용존 산소 약 100%가 더욱 바람직하다. 바이러스 입자의 농도 (Resource Q 칼럼을 사용하는 HPLC와 같은 통상의 방법으로 측정)가 평탄기(plateau)에 접어들면, 상기 반응기에서 수거한다.

용어 "수거(harvesting)"는, 재조합 아데노바이러스를 함유하는 세포를 배지로부터 수집하는 것을 의미한다. 이는 통상의 방법 (예를 들면, 원심분리 또는 크로마토그래피 수단)을 사용하여 수행할 수 있다. 이 단계에서, 수거된 세포는 저장되거나, 또는 추가로 세포 용해(lysis) 처리하여 재조합 바이러스를 정제 분리할 수 있다. 저장하는 동안, 수거된 세포는 생리적 pH 또는 그 부근에서 완충시켜야 하며, -70℃에서 냉동시켜야 한다.

용어 "세포 용해 (lysis)"는 상기 생산 세포를 파괴하는 것을 의미한다. 이러한 세포 용해는, 당해 분야에 잘 알려져 있는 여러 방법을 사용하여 수행가능하 다. 상기 생산 세포로부터 바이러스 입자를 분리할 필요가 있을 때에, 당해 분야에 잘 알려져 있는 여러 방법을 사용하여 상기 생산 세포를 용해시킨다. 예를 들면, 포유동물 세포는 낮은 압력 조건 (100 내지 200psi 차등 압력) 하에서 또는 통상의 동결-해빙 방법을 사용하여 용해될 수 있다. DNAse/RNAse를 사용하여 분해시킴으로써, 외인성-자유 DNA/RNA는 제거된다.

용어 "정제(purifying)"는, 용해된 생산 세포로부터 실질적으로 순수한 재조합 바이러스 입자 군체를 분리하는 것을 의미한다. 크로마토그래피 또는 차등적 밀도 구배 원심분리와 같은 통상의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시에서, 바이러스는 선행 문헌에 기재된 공정에 따라 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제된다 {참조: Huyghe et al., (1995) Human Gene Therapy 6:1403-1416, 미국 특허출원번호 제08/400,793호 (출원일: 1995년 3월 7일)에 기재}.

본 발명의 재조합 아데노바이러스의 생산을 최적화하는 다른 방법 및 과정은, 발명의 명칭이 "바이러스 생산 방법"인 미국 특허출원 번호 제09/073,076호 (출원일: 1998년 5월 4일)에 기재되어 있다.

도 1은, TGF-β 경로-반응성 프로모터 (PAI 또는 SRE) 또는 p53 경로-반응성 프로모터 (RGC 또는 p53CON)의 통제하에 E2F-Rb 융합 암호화 서열을 암호화하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 세포 변성 효과 (cytopathic effect)를 측정한 CPE 분석 결과도이다. 또한, 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 리포터 (reporter)로서 벡터내에 혼입시켰다. 패널 A는 MRC-9 세포를 나타내고, 패널 B는 Hep3B 세포를 나타내며, 패널 C는 WIDR 세포를 나타낸다. 제1열은 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 복제-결함성 (E1 결실) 재조합 아데노바이러스; 제2열은 PAI-Ad; 제3열은 SRE-Ad; 제4열은 RGC-Ad; 제5열은 p53CON-Ad이다. 입자 농도는 도 1의 오른쪽에 표시되어 있다.

도 2는, 경로 표적화된 벡터를 사용하여 GFP 발현을 보여주는 형광 현미경 분석 결과도 (상부 패널)이다. 패널 A는 GFCB 대조군(control) 벡터를 나타내고, 패널 B는 SRE-Ad 벡터를 나타내며, 패널 C는 p53CON-Ad 벡터를 나타낸다. 감염량은 5×10⁵ 입자/ml이다.

도 3은, 재조합 바이러스 U3EE(□), T1LT(○) 및 L9IU(△)을 이용한, 정상적인 기관지 상피 세포 (패널 A) 및 C33A 세포 (패널 B)에서의 감염 결과도이다. 수직축은 감염되지 않은 대조군의 비율을 나타내고, 수평축은 1ml당 입자 형태의 바이러스 투여량을 나타낸다. 본 실험은, 각 세포 배양물을 6가지의 상이한 바이러스 농도 (10⁵ 내지 10⁹ 바이러스 입자/ml)에 노출시켜서 수행되었다. 상기한 세포를 1시간 동안 바이러스에 노출시킨 후, 과량의 바이러스를 세척하고 나서, 감염 후 6일째에 생존한 세포의 비율을 MTS 검정(Promega, 위스콘신 메디슨 소재)을 통해 측정하였다 (실질적으로 제조업자의 지시에 따라 수행하였음). 수평선은 세포중 50%가 생존한 수준을 나타낸다. 데이터 및 수평 점선에 의해 생긴 곡선의 교차점은 바이러스의 ED₅₀ 측정치를 나타낸다.

하기 실시예는, 특정 재조합 아데노바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터를 작제하는 것을 보여주는 방법론 및 실험 결과를 기재한 것이다. 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자들에게 명백한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 취지 또는 필수적인 특성을 벗어남이 없이, 하기 실시예에 기재된 특정 양태 이외의 양태를 포함한다. 따라서, 하기의 본 발명의 특정 양태들은 본 발명을 예시하기 위한 것이며 이에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에서, "g"는 그램, "ml"는 밀리리터, "mol"은 몰, "℃"는 섭씨온도, "min."은 분, "FBS"는 소 태아 혈청, "PN"은 재조합 바이러스 입자수를 의미한다.

실시예 1: 플라스미드의 작제

800bp PAI 프로모터의 통제하에 있는 루시페라제를 암호화하는 플라스미드 p800luc는 대이비드 루스쿠토프(David Luskutoff) 박사 (캘리포니아 라욜라 소재, Scripps Institute)로부터 입수하였다. E2F-RB 융합 단백질의 암호화 서열의 상부에 CMV 프로모터, 아데노바이러스-5 트리파르타이트 리더 서열 (tripartite leader sequence) 및 SV40 인핸서를 함유하는, 플라스미드 pCTMIE-E2F-Rb는 도우그 안텔만(Doug Antelman)(Canji)으로부터 입수하였다.

실시예 2: TGF-β 반응성 프로모터를 갖는 루시페라제 플라스미드의 작제

A. PAI-루시페라제 플라스미드

모든 단편의 서열은 5'에서 3'쪽으로 기재되어 있다. 5' 말단 및 3' 말단 각각에서 SacI 부위 및 XhoI 부위에 인접해 있고 프로모터내에 자연 그대로의 TATA box 대신에 SV40 TATA box를 갖는 A 749bp 단편은, p800luc를 주형으로 사용하고 프라이머 AGT CGA GCT CCA ACC TCA GCC AGA 및 GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC (SV40 TATA box를 함유)를 사용하여 PCR 방법으로 증폭시켰다. 이렇게 수득한 PCR 생성물을 SacI 및 XhoI로 절단(digest)하고나서, PGL3-염기(basic)로 절단한 후에 수득되는 단편인, 프로모터를 함유하지 않은 루시페라제 작제물 (Promega)에 연결(ligation)시켜, PAI-루시페라제를 수득하였다.

B. SRE-루시페라제 플라스미드

다음의 올리고뉴클레오티드 GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGC CCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC 및 GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC를 서로 어닐링시켰다. 이렇게 어닐링된 생성물을 XhoI로 절단한 후, MluI로 절단된 PGL3-염기에 연결시키고나서, 클레노우 (Klenow)로 평활 말단(blunt end)을 만든 후, XhoI로 절단하여, pSVT-luc (SV40 TATA box를 갖는 루시페라제 작제물)를 수득하였다. Smad4/DPC4 결합 부위를 갖는 올리고뉴클레오티드 CGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC 및 AGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC를 어닐링시킨 후, KpnI로 절단된 pSVT-루시페라제에 연결시켜, SRE-루시페라제 플라스미드를 수득하였다.

실시예 3: p53 반응성 프로모터를 갖는 루시페라제 플라스미드의 작제

A. RGC-루시페라제 플라스미드:

리보좀 유전자 클러스터로부터 2개의 상보적인, p53 결합 부위를 갖는 5'-포스포릴화된 올리고뉴클레오티드 AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AAC TCG TGG TAC 및 CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTG CCT TTT CTG TAC를 서로 어닐링시켰다. 이렇게 어닐링된 단편을 KpnI로 절단된 pSVT-루시페라제에 연결시켜, RGC-루시페라제 플라스미드를 수득하였다.

B. p53CON-루시페라제 플라스미드:

2개의 상보적인, 컨센서스 p53 결합 부위(p53CON)를 갖는 5'-포스포릴화된 올리고뉴클레오티드 CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC 및 AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC를 서로 어닐링시켰다. 이렇게 어닐링된 단편을 KpnI로 절단된 pSVT-루시페라제에 연결시켜, p53CON-루시페라제 플라스미드를 수득하였다.

C. PAI-E2F-Rb 플라스미드:

플라스미드 pCTMIE-E2F-Rb 내에 E2F-RB 융합 단백질을 암호화하는 서열의 상류에 CMV 프로모터, 아데노바이러스-5 트리파르타이트 리더 서열 및 SV40 인핸서를 함유하는 서열을, Bg1I 및 XbaI로 절단한 후, 이렇게 수득한 단편을 연결시켜 프로모터-부재 (promoter-less) E2F-RB 플라스미드를 수득하였다. 플라스미드 PAI-루시페라제로부터 SacI 및 XhoI로 절단하여 변형된 PAI 프로모터를 갖는 단편을 절단한 후, Klenow로 처리하여 말단을 평활말단화 하였다. 이 단편을, EcoRI으로 절단하고 나서 DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편으로 처리한 상기 프로모터-부재 E2F-RB 플라스미드에 연결시켜, PAI-E2F-RB 플라스미드를 수득하였다.

실시예 4: 재조합 아데노바이러스의 제조

pBHG11에서 유래한 7.4kb SnaBI 단편 (26676 내지 34140)을 BamHI, AccI 및 Klenow로 처리한 pNEB193 (NEB로부터 유래한 플라스미드)에 클로닝하여, E3 부위에 3kb가 결실된 Ad5 서열을 갖는 트랜스퍼 플라스미드(transfer plasmid), pNEB△E3를 작제하였다. 5-포스포릴화 올리고뉴클레오티드 AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCC GCT CGC GAG GAT CCT TAA T 및 TAA GGA TCC TCG CGA GCG GCC GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T를 어닐링시키고, PacI-절단된 pNEB△E3에 연결시켜 이렇게 어닐링된 단편을 도입하여 pNEB△E3(MCS) 플라스미드를 수득함으로써, 다수 클로닝 부위 (multiple cloning site)를 상기 플라스미드에 도입하였다.

PAI 프로모터의 조절하에 있는 E2F-Rb 및 CMV 프로모터의 조절하에 있는 강화된 (enhanced) 녹색 형광 단백질 (GFP)을 암호화하는 재조합 아데노바이러스를 생산하는 트랜스퍼 플라스미드를 제조하는 방법은 다음과 같다. PAI-E2F-Rb를 NacI 및 XbaI로 절단하여 만든 PAI 프로모터 및 E2F-Rb 암호화 서열을 함유하는 단편을 연결시키고, KpnI로 절단하고 Klenow로 처리하고나서 XbaI로 재절단하여 만든 pABS.4 플라스미드 (Microbix) 단편에 연결시켜, 중간 벡터 (intermediate vector) pABS.4-E2F-Rb를 작제하였다. PAI 프로모터, E2F-Rb 암호화 서열 및 카나마이신 (Kanamycin)을 포함하는 단편을 PacI를 사용하여 플라스미드 pABS.4-E2F-Rb로부터 잘라내고, Klenow로 처리하고 나서, PacI으로 pNEB△E3를 절단하고 Klenow로 처리하여 수득한 플라스미드 단편에 연결시켜, PacI 부위가 없는 플라스미드 pNEB△E3-PAI-E2F-Rb를 수득하였다. SwaI를 사용하여 pNEB△E3-PAI-E2F-Rb를 절단하고나서, Af1II 및 SspI로 절단한 후에 Klenow로 처리하여 pEGFP-N (Clontech)으로부터 분리한 단편에 연결시켜, 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자에 작동가능하게 연결된 CMV 프로모터로 상기한 플라스미드내 카나마이신 유전자를 대치하여, 플라스미드 p△E3-PAI-E2F-Rb-GFP를 수득하였다.

TGF-β 반응성 프로모터의 조절하에 있는 E2F-Rb와 CMV 프로모터의 조절하에 있는 SRE 및 강화된 녹색 형광 단백질 (GFP)을 암호화하는 재조합 아데노바이러스를 생산하는 트랜스퍼 플라스미드를 작제하는 방법은 다음과 같다. XbaI 및 NruI로 pNEB△E3(MCS)를 절단하여 분리한 단편과 XbaI 및 NaeI로 pCTMIE-E2F-Rb를 절단하여 만든 단편을 연결시켜, E2F-Rb 암호화 서열을 플라스미드 pNEB△E3(MCS)에 도입하여 플라스미드 pNEB△E3-E2F-Rb를 수득하였다. SRE-루시페라제를 주형으로 사용하고 포스포릴화된 프라이머 GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C 및 GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTG GGC CAC T를 사용하여 PCR 방법으로 상기 서열을 증폭시킴으로써, SRE를 함유하는 TGF-β 반응성 프로모터를 상기 플라스미드에 도입하였다. 수득되는 PCR 생성물을 SpeI으로 절단하고 SnaBI 및 XbaI으로 절단시킨 pNEB△E3-E2F-Rb에 연결시켜 p△E3-DPC-E2F-Rb를 수득하였다.

p53 반응성 프로모터의 조절하에 있는 E2F-Rb와 CMV 프로모터의 조절하에 있는 강화된 녹색 형광 단백질 (GFP)를 암호화하는 재조합 아데노바이러스를 생산하는 트랜스퍼 플라스미드를 작제하는 방법은 다음과 같다. RGC-루시페라제 또는 p53CON-루시페라제를 주형으로 사용하고 포스포릴화된 프라이머 GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C 및 GAT ATC TAG ACG TCC TCT GTG GGC CAC T 를 사용하여 PCR 방법으로 상기 프로모터 서열을 증폭시킴으로써, 리보좀 유전자군으로부터 p53-결합 부위 또는 p53 컨센서스 부위 (p53CON)를 갖는 p53 반응성 프로모터를 플라스미드 pNEB△E3-E2F-Rb에 도입하였다. 이렇게 수득한 PCR 생성물을 XbaI으로 절단한 후, SnaBI 및 XbaI로 절단된 pNEB△E3-E2F-Rb에 연결시켜, p△E3-RGC-E2F-Rb 및 p△E3-PCON-E2F-Rb를 수득하였다.

실시예 5: 재조합 아데노바이러스를 생산하는 동종 재조합 (homologous recombination)

문헌 {참조: Chartier et al., (1996) J. Virol. 70:4805-4810}에 기재된 바와 같이 세균 내에서 동종 재조합 방법을 사용하여, 재조합 아데노바이러스 PAI-Ad, SRE-Ad, RGC-Ad 및 CON-Ad를 제조하였다. 상기 트랜스퍼 플라스미드를 AscI로 절단하여, Ad5 서열에 인접해 있는 경로-반응성 프로모터의 조절하에 있는 E2F-Rb 및 CMV 프로모터의 조절하에 있는 GFP를 함유하는 단편을 수득하였다. 이렇게 수득한 단편을, BstBI 및 SpeI로 PTG4609 {참조: Chartier et al., (1996) J. Virol. 70:4805-4810에 기재되어 있음, Transgene, Inc.에서 시판}를 절단하여 수득한 단편을 갖는 BJ5183 세균 균주내로 함께 형질전환시켰다. 이렇게 수득한 세균 콜로니를 스크리닝하여, 목적하는 재조합 Ad5 감염성 플라스미드, pPAI-GFP-Ad, pSRE-GFP-Ad, pRGC-GFP-Ad 및 pCON-GFP-Ad를 수집하였다. 그리고 나서, 이러한 감염성 플라스미드를 PacI로 절단하여 선형화한 후, 페놀-클로로포름 추출물 및 에탄올 침전물로 정제하여 293 세포의 형질감염에 사용하였다.

형질감염은, 제조자의 지시내용에 따라 Superfect (Qiagen)를 사용하여 수행하였다. 선형화된 플라스미드 2.5㎍을 사용하여, 12㎕ Superfect/웰을 갖는 6-웰 플레이트에서 성장시킨 250,000 세포를 형질감염시켰다. 8일 경과후, 바이러스 생산에 따른 세포 변성 효과가 관찰되었다. 배양 상층액 및 세포를 수집한 후, 3회에 걸쳐 동결-해빙 주기를 거치게 하였다. 이렇게 수득한 용해물내의 재조합 바이러스를 293 세포에 재감염시켜 증폭시켰다.

실시예 6: 세포주

본 실시예에서 사용된 모든 세포주는, ATCC (Rockville, MD)에서 입수하여 CO₂ 인큐베이터내에서 37℃에서 단층 배양물로 성장시킨 것이다. 293, Hep3B, MRC9, A549, PancI, U87, Caco2, MCF-7 및 WIDR을, 10% 소 태아 혈청을 보충한 Dulbecco사의 변형된 Eagle 배지내에 두었다. MDA-MB 468 세포는 10% 소 태아 혈청을 보충한 Ham 배지에서 배양시킨 반면, MiaPaca-2 세포는 10% 소 태아 혈청 및 2.5% 말 혈청을 보충한 DMEM 배지에서 배양시켰다.

실시예 7: 형질감염

세포를 6-웰 플레이트 (250,000 세포/웰) 또는 24-웰 플레이트 (62,500 세포/웰)에 위치시킨 후, 밤새 부착될 수 있도록 두었다. 그리고 나서, 칼슘 포스페이트를 사용하여 상기한 방법과 같이 293 세포를 형질감염시켰고, 기타의 다른 세포들은 Superfect (Qiagen)을 사용하여 제조자의 지시내용에 따라 형질감염시켰다.

실시예 8: 리포터/루시페라제 분석

리포터 플라스미드 1.5㎍ 및 억제제 1.0㎍을 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간이 경과한 후, 1X 리포터 용해 완충액(Promega)를 첨가하여 실온에서 10분간 배양시켜 용해물(lysate)을 수득하였다. 루시페라제의 활성은, Top Count (Packard) 및 분석 킷트 (Packard)를 사용하여 제조업자(Packard)의 지시에 따라 측정하였다.

실시예 9: 바이러스-매개 세포변성 효과의 측정 분석

상기한 재조합 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스를 사용하여 세포를 형질감염시킨 후, 6일 경과한 후에 20% 에탄올 중의 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 상기 공정은 문헌에 기재된 바와 같다 {참조: Bischoff, et al., (1996) Science 274:373-376}.

실시예 10: cU3EE 및 cT1LT 바이러스의 작제

프라이머 GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCT AGG GC 및 GAT CTT AAT TAA ATG GCA GTG ACC CGG AAG와 플라스미드 pFG140 (Microbix)에서와 같이 Ad5 DNA를 주형으로 사용하여 PCR 방법을 통해, MLP 프로모터 서열을 증폭시켰다. MLP PCR 생성물을 플라스미드 p△E3-PCON-E2F-Rb의 PacI 부위에 클로닝하여, p△E3-PCON-E2F-Rb-MLP를 수득하였다. 프라이머 GCG ACC CAC CCT AAC AGA 및 GAT CGG ATC CAA AGC GCA ACA AGG GTC A를 사용하여 PCR 방법으로 아데노바이러스 E3 10.5K 단백질을 암호화하는 서열을 증폭시킨 후, PCR 생성물을 플라스미드 pCDNA 3.1 (Invitrogen)의 XhoI 부위에 클로닝하여 플라스미드 pCDNA3-10.5를 수득하였다. 그리고 나서, DraIII 및 XbaI를 사용하여 절단하고나서 Klenow로 처리하여 아데노바이러스 E3 10.5K 단백질을 암호화하는 서열을 pCDNA3-10.5로부터 절단하고 나서, PacI 및 Klenow로 처리한 p△E3-PCON-E2F-Rb-MLP에 연결시켜, 플라스미드 p△E3-PCON-E2F-Rb-MLP-10.5K 를 수득하였다.

문헌 {참조: Chartier et al., 1996, J. Virol. 70:4805-4810}에 기재된 바대로, 세균 내에서 동종 재조합 방법을 수행하여, 재조합체 아데노바이러스 cU3EE 및 cT1LT를 제조하였다. 상기 트랜스퍼 플라스미드를 AscI로 절단하여, Ad5 서열에 인접하여 MLP 프로모터의 조절하에 있는 E310.5K 및 p53CON 서열의 조절하에 있는 E2F-Rb를 함유하는 단편을 수득하였다. 이렇게 수득한 단편과 BstBI 및 SpeI로 PTG4609 (Transgene)를 절단하여 수득한 단편으로, BJ 5283 세균 균주를 함께 형질전환시켰다. 이렇게 수득한 세균 콜로니를 스크리닝하여, 목적하는 재조합 Ad5 감염성 플라스미드 pCEMD의 존재 여부를 확인하였다. 유사한 프로토콜을 사용하지만, 야생형 E1A 서열 대신에 01 돌연변이를 갖는 E1A를 함유하는 서열로 대치된 PTG4609 유도체 (Transgene)를 사용하여, Ad5 감염성 플라스미드 P01/CEMD를 수득하였다. 그리고 나서, 이러한 감염성 플라스미드는 PacI로 절단하여 선형화한 후, 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하여, 293 세포의 형질감염에 사용하였다.

제조업자의 지시에 따라, Superfect (Qiagen)을 사용하여, 플라스미드 pCEMD 및 p01/CEMD를 형질감염시켜 재조합 바이러스 cU3EE 및 cT1LT를 각각 생산하였다. 선형화된 플라스미드 2.5㎍을 사용하여, 12㎕ Superfect/웰을 갖는 6-웰 플레이트에서 성장시킨 500,000 세포를 형질감염시켰다. 8일 경과한 후, 바이러스 생산에 의해 세포 변성이 관찰되었다. 세포 및 배양 상층액을 수거하여, 3회에 걸쳐 동결-해빙 주기를 수행했다. 이렇게 수득된 용해물내의 재조합 바이러스를 293 세포에 재감염시켜 증폭시켰다.

Claims

바이러스 복제를 억제하는 리프레서(repressor)에 작동가능하게 연결되고, p53 경로-반응성 프로모터(pathway-responsive promoter) 및 TGF-β 경로-반응성 프로모터로 이루어진 그룹 중에서 선택된 경로-반응성 프로모터를 포함하는, 상기 프로모터가 반응성인 경로에 결함을 지닌 신생물 세포에서 선택적으로 복제하는 재조합 바이러스 벡터.
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제1항에 있어서, 트랜스유전자 발현 카세트(transgene expression cassette)를 추가로 포함하는 벡터.
제3항에 있어서, 상기 트랜스유전자 발현 카세트가 프로모터에 작동가능하게 연결된 전-세포자멸사 유전자(pro-apoptotic gene)를 포함하는 벡터.
제4항에 있어서, 상기 프로모터가 아데노바이러스 주요 후발 프로모터(adenovirus major late promoter: MLP)인 벡터.
제1항에 있어서, p300 결합을 제거하기 위해 아데노바이러스 E1a 암호화 영역내 E1a 289R 및 243R 단백질의 4 내지 25번 아미노산의 결실을 추가로 포함하는 벡터.
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활성 성분으로서 제1항 또는 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 청구된 선택적으로 복제하는 재조합 바이러스 벡터와 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 치료용 약제학적 제형.
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