CN106913865A - 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法。本公开提供了治疗具有响应于IL‑10的疾病或病症的受试者的方法，包括与其相关的施用方法和给药方案。

Description

使用白细胞介素-10治疗疾病和病症的方法
本申请是申请日为2014年04月15日、中国申请号为201480024021.5、发明名称为“使用白细胞介素-10治疗疾病和病症的方法”的发明申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年4月18日提交的美国临时申请系列第61/813,563号(该申请通过引用整体并入本文)的优先权利益。
发明领域
本申请涉及使用IL-10和相关试剂治疗或预防多种疾病和病症的方法。
引言
细胞因子白细胞介素-10(IL-10)是通过作用于T细胞、B细胞、巨噬细胞和抗原呈递细胞(APC)来调节多个免疫应答的多效性细胞因子。IL-10可通过抑制活化的单核细胞和活化的巨噬细胞的IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF和G-CSF的表达来抑制免疫应答，并且其还抑制NK细胞的IFN-γ产生。虽然IL-10主要在巨噬细胞中表达，但也已在活化的T细胞、B细胞、肥大细胞和单核细胞中检测到表达。除了抑制免疫应答以外，IL-10还展现免疫刺激性质，包括刺激IL-2和IL-4处理的胸腺细胞的增殖，增强B细胞的活力，和刺激MHCII类的表达。
人IL-10是一种同型二聚体，其在两个单体亚单位之间的非共价相互作用受到破坏后变得无生物活性。获自IL-10的公开晶体结构的数据表明功能二聚体展现与IFN-γ的一定相似性(Zdanov等，(1995)Structure(Lond)3:591-601)。
作为其多效性活性的结果，IL-10已与众多种疾病、病症和病状，包括炎性病状、免疫相关病症、纤维化病症和癌症关联。针对许多此类疾病、病症和病状用IL-10进行临床和临床前评估已巩固其治疗潜能。此外，已显示PEG化的IL-10在某些治疗情境中比非PEG化的IL-10更有效。
鉴于IL-10相关疾病、病症和病状的流行性和严重性，使功效、患者耐受性等最优化的新型给药方案和参数在增进IL-10和PEG化的IL-10以及与其相关的试剂的治疗有用性方面将具有巨大价值。
概述
本公开涵盖使用IL-10、经修饰的(例如，PEG化的)IL-10和本文中描述的相关试剂以及其组合物治疗和/或预防各种疾病、病症和病状、和/或其症状的方法。更具体地，本公开涉及在受试者的各种疾病、病症和病状的治疗和/或预防中获得和维持功效，同时使与其相关的不利作用减小至最小的最优化的给药参数。如在下文中详细所示的，此类给药参数的最优化包括例如在考虑施用途径和其它因素的情况下与吸收、分布、代谢和排泄(“ADME”)相关的药代动力学和药效学参数的评估。应理解，除非本文中另外指出，否则与ADME和其它参数相关的术语意欲具有它们在相关科学领域中的普遍可接受的含义。例如，术语“血清半衰期”或是指消除半衰期(即，试剂的血清浓度已达到其初始或最大值一半时的时间)。
根据本文中描述的方法，疾病、病症或病状和/或其症状可以是增殖性病症，诸如癌症或癌症相关病症，或纤维化病症，诸如肝硬化、NASH和NAFLD。虽然不限于特定癌症，但癌症可以是实体瘤，包括与结肠癌、黑色素瘤和磷状细胞癌相关的肿瘤，或其可以是血液病症。
在其它实施方案中，疾病、病症或病状是病毒病症，包括，但不限于人免疫缺陷病毒、乙型或丙型肝炎病毒或巨细胞病毒。在其它实施方案中，疾病、病症或病状是免疫病症或炎性病症，其可以是急性或慢性的。免疫病症和炎性病症的实例包括炎性肠病、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)。
在特定实施方案中，疾病、病症或病状是心血管病症，包括动脉粥样硬化。具有心血管病症的受试者可能具有升高的胆固醇。
在其它实施方案中，疾病、病症或病状是血栓形成或血栓形成病状。
如下文中进一步论述的，人IL-10是同型二聚体并且每一个单体包含178个氨基酸，其前18个氨基酸包含信号肽。本公开的特定实施方案包含缺乏信号肽的成熟人IL-10多肽(参见，例如，美国专利第6,217,857号)，或成熟人PEG-IL-10。在其它具体实施方案中，IL-10剂是成熟人IL-10的变体。该变体可展示低于成熟人IL-10的活性，与其相当或比其大的活性；在某些实施方案中，活性与成熟人IL-10的活性相当或大于其活性。
本公开的某些实施方案涵盖修饰IL-10以增强一个或多个性质(例如，药代动力学参数、功效等)。在特定实施方案中，通过例如PEG化、糖基化、白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA))缀合和羟乙基淀粉化(hesylation)来修饰IL-10。在进一步的实施方案中，IL-10的修饰不导致对免疫原性的治疗相关的有害作用，并且在更进一步的实施方案中，经修饰的IL-10的免疫原性比未修饰的IL-10低。术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“剂”等意欲被广泛地解释，并且包括例如，人和非人IL-10相关多肽，包括其同源物、变体(包括突变蛋白)和片段，以及具有例如前导序列(例如，信号肽)的IL-10多肽，以及前述多肽的经修饰的形式。在其它特定实施方案中，术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“剂”是激动剂。特定实施方案涉及PEG化的IL-10，其在本文中也被称为“PEG-IL-10”。本公开还涵盖编码前述多肽的核酸分子。
本公开的特定实施方案涉及治疗或预防受试者的疾病、病症或病状的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的IL-10剂，其中该量足以获得至少0.1ng/mL的平均IL-10血清谷浓度。治疗或预防的方法可由CD8+ T细胞介导。
其它实施方案涉及治疗或预防受试者(例如，人)的疾病、病症或病状的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的IL-10剂，其中该量足以在一段时间内维持平均IL-10血清谷浓度，其中平均IL-10血清谷浓度为至少0.1ng/mL，并且其中将平均IL-10血清谷浓度维持至少90％的所述一段时间。在本公开的特定实施方案中，平均IL-10血清谷浓度为至少0.2ng/mL、至少0.3ng/mL，和至少0.4ng/mL、至少0.5ng/mL、至少0.6ng/mL、至少0.7ng/mL、至少0.8ng/mL、至少0.9ng/mL、至少1ng/mL、至少1.2ng/mL、至少1.25ng/mL、至少1.3ng/mL、至少1.4ng/mL、至少1.5ng/mL、至少1.6ng/mL、至少1.7ng/mL、至少1.8ng/mL、至少1.85ng/mL、至少1.9ng/mL、至少1.95ng/mL、至少1.97ng/mL和至少1.98ng/mL、至少1.99ng/mL、至少2.0ng/mL或大于2ng/mL。
在进一步的实施方案中，所述一段时间为至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少6周、至少2个月、至少3个月或大于3个月。
在本公开的特定实施方案中，将平均IL-10血清谷浓度维持所述一段时间或至少85％的所述一段时间、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的所述一段时间。
预期足以维持所需稳态血清谷浓度(例如，0.1ng/mL或2ng/mL)的给药方案可导致大于所需稳态血清谷浓度的初始血清谷浓度。由于IL-10在哺乳动物受试者中的药代动力学和药效学特征，初始谷浓度(例如，通过施用一个或多个负荷剂量，随后施用一系列维持剂量获得的)在一段时间内逐渐地不断降低，即使当给药参数(量和频率)保持恒定时亦如此。在该段时间后，逐渐地不断降低停止，且稳态血清谷浓度得到维持。
例如，～0.1mg/kg/日的IL-10剂(例如，mIL-10)至小鼠(例如，C57BL/6小鼠)的肠胃外施用(例如，SC和IV)是维持例如2.0ng/mL的稳态血清谷浓度所需的。然而，直至在以0.1mg/kg/日的初始给药后(以及也在任何初始剂量后)约30天才获得该稳态血清谷浓度。相反地，在已达到初始血清谷浓度(例如，2.5ng/mL)后，该浓度在例如约30天的一段时间中逐渐不断地降低，在该时间后所需的稳态血清谷浓度(例如，2.0ng/mL)得以维持。本领域普通技术人员将能够确定使用例如ADME和患者特异性参数维持所需稳态谷浓度所需的剂量。
本公开涵盖其中IL-10剂可包含至少一个修饰来形成经修饰的IL-10剂的方法，其中该修饰不改变IL-10剂的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的IL-10剂为PEG-IL-10剂。PEG-IL-10剂可包含至少一个共价附接于IL-10的至少一个亚单位的至少一个氨基酸残基的PEG分子，或在其它实施方案中包含单-PEG化与二-PEG化的IL-10的混合物。PEG-IL-10剂的PEG组分可具有大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa或大于约50kDa的分子质量。在一些实施方案中，分子质量为约5kDa至约10kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。
在一些实施方案中，经修饰的IL-10剂包含至少一个Fc融合分子、至少一个血清白蛋白(例如，HSA或BSA)、HSA融合分子或白蛋白缀合物。在另外的实施方案中，经修饰的IL-10剂被糖基化、羟乙基淀粉化或包含至少一个白蛋白结合结构域。一些经修饰的IL-10剂可包含不止一种类型的修饰。在特定实施方案中，修饰是位点特异性的。一些实施方案包含接头。经修饰的IL-10剂在下文中进行了详细论述。
本公开还涵盖结合本文中的教导的基因疗法的用途。关于基因疗法的用途和方法，可用编码本文中所示的IL-10相关多肽的核酸体内转化受试者的细胞。或者，可用转基因或多核苷酸体外转化细胞，随后将该细胞移植进受试者的组织以实现治疗。另外，可用编码IL-10相关多肽的转基因或多核苷酸转化原代细胞分离物或已建立的细胞系，随后任选地将其移植进受试者的组织。
本公开涵盖其中每天至少2次、每天至少1次、每48小时至少1次、每72小时至少1次、每周至少1次、每2周至少1次、每月至少1次、每2月至少1次或每3月至少1次向受试者施用IL-10剂的方法。一些实施方案还包括将IL-10剂与至少一种另外的预防剂或治疗剂一起施用，预防剂或治疗剂的实例示于下文中。
可通过任何有效途径施用IL-10剂。在一些实施方案中，其通过肠胃外注射(包括皮下注射)施用。
本公开的特定实施方案涉及药物组合物，所述药物组合物包含一定量的IL-10剂(例如，治疗有效量)(包括上文中所述的那些试剂)与一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂(例如，等渗注射液)。药物组合物通常是适合用于人施用的药物组合物。此外，在一些实施方案中，药物组合物包含至少一种另外的预防剂或治疗剂。
本公开的某些实施方案涵盖含有上述药物组合物之一和任选地一种或多种另外的组分的无菌容器。例如，但不限于，无菌容器可以是注射器。在其它实施方案中，无菌容器是药盒的一个组件；药盒还可含有例如包含至少一种预防剂或治疗剂的第二无菌容器。
附图简述
图1描绘人和小鼠IL-10的氨基酸序列。
图2A描绘在IL-10的递增浓度下PBMC中的MCP-1的浓度(pg/mL)。在1ng/mL及以上的浓度下，IL-10增加MCP-1的分泌。
图2B描绘在IL-10的递增浓度下利用LPS刺激的PBMC中的MCP-1的浓度(pg/mL)。IL-10为LPS介导的PBMC活化的抑制剂，并且以1ng/mL及以上的浓度添加IL-10显著抑制MCP-1的分泌。
详述
在进一步描述本公开之前，应理解，本公开不限于本文中所示的特定实施方案，并且还要理解，本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制。
当提供值的范围时，应理解，该范围的上限和下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地规定)以及所述范围内的任意其它所述或居间的数值都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小的范围内，并且也包括在本发明中，服从于所述范围内的任何特别排除的限值。当所述范围包括上下限值之一或两者时，排除那些所包括的界限之一或两者的范围也包括在本发明中。除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的意义相同的意义。
必须要指出的是，如本文中和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述/该(the)”包括多个指代物，除非上下文另外清楚地指示。还应指出的是，可撰写权利要求来排除任何可选要素。因此，该陈述意图用作与权利要求要素的描述联合使用此类排他性术语诸如“单独地”、“仅仅”等或使用“否定”限制的在先基础。
本文所论述的出版物仅针对它们在本申请提交日之前的公开而提供。另外，所提供的公开日可能不同于实际的公开日，这可能需要独立地进行确认。
概述
本公开涵盖本文中描述的试剂及其组合物用于治疗和/或预防各种疾病、病症和病状，和/或其症状的用途。在本公开的某些方面，此类治疗或预防通过使用特定给药参数来实现。在一些实施方案中，施用试剂以达到用于治疗如炎性和免疫相关病症、纤维化病症、癌症和癌症相关病症或心血管病症(例如，动脉粥样硬化)的被最优化的血清谷浓度。
在本公开的一些实施方案，以足以获得大于约0.1ng/mL的血清谷浓度的量向具有可利用IL-10剂(例如，IL-10多肽)治疗的疾病或病症或处于发生该疾病或病症的风险中的受试者施用IL-10剂，在某些实施方案中，血清谷浓度大于约1ng/mL，然而在其它实施方案中，血清谷浓度大于约2ng/mL。
应当指出，对与“人”连用的本公开的多肽和核酸分子的任何提及无意对获得多肽或核酸的方式或来源具限制性，而是这样的提及顺序可对应于天然存在的人多肽或核酸分子的序列。除了人多肽和编码它们的核酸分子以外，本公开还涵盖IL-10相关多肽和来自其它种类的对应核酸分子。
定义
除非另外指出，否则下列术语旨在具有下文所示的含义。其它术语在整个说明书的其它地方进行了定义。
术语“患者”或“受试者”可互换地用于指人或非人动物(例如，哺乳动物)。
术语“施用(administration)”、“施用(administer)”等，当它们用于例如受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指例如IL-10或PEG-IL-10、核酸(例如，编码天然人IL-10的核酸)、包含前述物质或诊断试剂的药物组合物与受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。在细胞的背景中，施用包括将试剂与细胞接触(例如，体外或离体)，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。
术语“治疗/处理(treat/treating/treatment)”等是指在疾病、病症或病状或其症状已被诊断、观察等后开始的作用(诸如施用IL-10或包含IL-10的药物组合物)的过程，以暂时或永久性消除、减少、抑制、缓和或改善使受试者受累的疾病、病症或病状的潜在病因的至少一个，或与使受试者受累的疾病、病症或病状相关的症状的至少一个。因此，治疗包括抑制(例如，阻止疾病、病症或病状或与其相关的临床症状的发展或进一步发展)活动性疾病。术语还可用于其它背景中，诸如其中IL-10或PEG-IL-10与例如流动相或胶体相中的IL-10受体接触的情形中。
如本文中所用，术语“需要治疗”是指由医生或其它看护者作出的受试者需要治疗或将从治疗获益的判断。该判断是基于多个因素作出的，所述因素在医生或看护者的专业知识的领域内。
术语“阻止”、“防止”、“预防”等是指以一定的方式(例如，在疾病、病症、病状或其症状发作之前)起始以通常在易患特定疾病、病症或病状的受试者的背景中暂时性或永久性阻止、压制、抑制或减少受试者发生疾病、病症、病状等的风险(如通过例如临床症状的不存在)或延迟其发作的作用(诸如施用IL-10或包含IL-10的药物组合物)的过程。在某些情况下，术语还指减缓疾病、病症或病状的进展或抑制其进展至有害或另外地不期望的状态。
如本文中所述，术语“需要预防”是指由医生或其它看护者作出的受试者需要预防性照料或将从预防性照料受益的判断。该判断是基于多个存在于医生或看护者的专业知识领域内的因素作出的。
短语“治疗有效量”是指以当向受试者施用时能够对疾病、病症或病状的任何症状、方面或特征具有任何可检测的积极作用的量，单独地或作为药物组合物的部分以及以单次剂量或作为一系列剂量的部分向受试者施用试剂。治疗有效量可通过测量相关生理效应来确定，并且可结合给药方案和受试者的病状的诊断分析等来调整其。例如，施用后产生的炎性细胞因子的量的测量可表明是否已使用治疗有效量。
短语“以足以产生变化的量”意指，在施用特定疗法之前(例如，基线水平)与之后测量的指示剂的水平之间存在可检测的差异。指示剂包括任何客观参数(例如，IL-10的血清浓度)或主观参数(例如，受试者的健康幸福感)。
术语“小分子”是指具有小于约10kDa、小于约2kDa或小于约1kDa的分子量的化合物。小分子包括，但不限于无机分子、有机分子、含有无机成分的有机分子、包含放射性原子的分子和合成分子。在治疗上，小分子对细胞可更容易渗透，不易被降解，并且相较于大分子不太可能引发免疫应答。
术语“配体”是指例如可用作受体的激动剂或拮抗剂的肽、多肽、膜缔合或膜结合的分子或其复合物。“配体”包括天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和来源于抗体的结合组合物。“配体”还包括小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。术语还包括既不是激动剂也不是拮抗剂但可结合受体而不显著影响其生物学性质例如信号转导或粘附的试剂。此外，术语包括已例如通过化学或重组方法改变成膜结合配体的可溶性形式的膜结合配体。配体或受体可以是完全细胞内的，即，其可存在于胞质溶胶、细胞核或某些其它细胞内区室中。配体与受体的复合物称为“配体-受体复合物”。
术语“抑制剂”和“拮抗剂”或“激活剂”和“激动剂”分别指例如用于配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的激活的抑制性分子或激活分子。抑制剂是减少、阻断、阻止、延迟激活、灭活、脱敏或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。激活剂是增加、激活、促进、增强激活、敏化或上调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。抑制剂还可被定义为减小、阻断或灭活组成型活性的分子。“激动剂”是与靶标相互作用以引起或促进靶标的激活增强的分子。“拮抗剂”是抵抗激动剂的作用的分子。拮抗剂阻止、减小、抑制或中和激动剂的活性，并且拮抗剂还可阻止、抑制或减小靶标例如靶标受体的组成型活性，即使当不存在鉴定的激动剂时亦如此。
术语“调节”、“调整”等是指分子(例如，激活剂或抑制剂)直接或间接增强或减小IL-10剂(或编码它们的核酸分子)的功能或活性的能力；或增强分子产生与IL-10剂的作用相当的作用的能力。术语“调节剂”广泛地意指可实现上述活性的分子。例如，例如基因、受体、配体或细胞的调节剂是改变基因、受体、配体或细胞的活性的分子，其中活性在其调节性质上可被激活、抑制或改变。调节剂可单独作用，或其可使用辅因子，例如蛋白质、金属离子或小分子。术语“调节剂”包括通过与IL-10起相同作用机制作用的试剂(即，以与其类似的方式调节与IL-10相同的信号转导途径的试剂)并且能够引发与IL-10引起的生物响应相当(或更大)的生物响应。
调节剂的实例包括小分子化合物和其它生物有机分子。许多小分子化合物的文库(例如，组合文库)是商购可得的并且可用作起始点来鉴定调节剂。本领域技术人员能够开发一种或多种测定(例如，基于生物化学或细胞的测定)，其中可筛选此类化合物文库以鉴定一种或多种具有所需性质的化合物；随后，熟练的药物化学家能够通过例如合成和评估其类似物和衍生物来使这样的一种或多种化合物最优化。合成和/或分子建模研究还可用于激活剂的鉴定。
分子的“活性”可描述或是指分子对配体或受体的结合；催化活性；刺激基因表达或细胞信号转导、分化或成熟的能力；抗原性活性；其它分子的活性的调节等。术语还可指调节或维持细胞间相互作用(例如，粘附)的活性，或维持细胞的结构(例如，细胞膜)的活性。“活性”还可指比活性，例如，[催化活性]/[mg蛋白质]，或[免疫活性]/[mg蛋白质]、生物区室中的浓度等。术语“增殖活性”包括促进例如正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育不良、细胞转化、转移和血管生成的或是进行所述生物过程所必需的，或与所述生物过程明确相关的活性。
如本文中所用，“相当的”、“相当的活性”、“与……相当的活性”、“相当的作用”、“与……相当的作用”等是可被定量和/或定性观察的相关术语。术语的含义通常取决于其中使用它们的上下文。例如，都激活受体的两种试剂从定性的角度来看可被视为具有相当的作用，但如果一种试剂仅能够达到另一种试剂的活性的20％(如在本领域接受的测定(例如，剂量-反应测定)中或在本领域接受的动物模型中测定的)时，则从定量的角度来看两种试剂可被视为缺乏相当的作用。当将一个结果与另一个结果比较(例如，一个结果对比参照标准)时，“相当的”通常意指一个结果偏离参照标准少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于7％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％。在特定实施方案中，如果一个结果与参照标准偏离少于15％、少于10％或少于5％，则其与参照标准相当。例如，但不限于，活性或作用可指功效、稳定性、溶解度或免疫原性。
例如细胞、组织、器官或生物体的术语“反应”包括生物化学或生理行为，例如，浓度、密度、粘附或生物区室内的迁移、基因表达速率或分化状态的变化，其中所述变化与激活、刺激或处理或与内在机制诸如遗传编程相关。在某些上下文中，术语“激活”、“刺激”等是指如受内部机制以及受外部或环境因素调控的细胞活化；然而术语“抑制”、“下调”等是指相反作用。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指具有任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸，和具有经修饰的多肽主链的多肽。所述术语包括融合蛋白，包括，但不限于，具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列的融合蛋白；具有或不具有N端甲硫氨酸残基的融合蛋白；具有免疫标记的蛋白的融合蛋白等。
应理解，在整个本公开中，参考根据单字母或三字母代码的氨基酸。为读者方便起见，下面提供单字母和三字母氨基酸代码：
如本文中所用，术语“变体”包括天然存在的变体和非天然存在的变体。天然存在的变体包括同源物(在物种间分别在氨基酸或核苷酸序列上不同的多肽和核酸)和等位基因变体(在物种内的个体间分别在氨基酸或核苷酸序列上不同的多肽和核酸)。非天然存在的变体包括分别包含氨基酸或核苷酸序列的变化的多肽和核酸，其中人工地引入序列的变化(例如，突变蛋白)；例如，通过人干预(“人手动”)在实验室中产生变化。因此，在本文中“突变蛋白”广泛地指通常具有单个或多个氨基酸取代并且通常来源于已经历定点或随机诱变的克隆的基因或来自完全合成的基因的突变的重组蛋白。
术语“DNA”、“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换地用于指具有任何长度的核苷酸的多聚体形式(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)。多核苷酸的非限定性实例包括线性和环状核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等。
如本文中所用，在多肽的结构的上下文中，“N端”(或“氨基端”)和“C端”(或“羧基端”)分别指多肽的最末氨基和羧基末端，而术语“N端的”和“C端的”分别指多肽的朝向N端和C端的氨基酸序列中的相对位置，并且可分别包括N端和C端上的残基。“紧邻N端的”或“紧邻C端的”是指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，其中第一和第二氨基酸残基被共价结合以提供连续氨基酸序列。
“来源于”在氨基酸序列或多核苷酸序列的上下文中(例如，“来源于”IL-10多肽的氨基酸序列)意味着表明多肽或核酸具有基于参照多肽或核酸(例如，天然存在的IL-10多肽或编码IL-10的核酸)的序列的序列，并且不意味着对于其中产生蛋白质或核酸的来源或方法是限制性的。例如，术语“来源于”包括参照氨基酸或DNA序列的同源物或变体。
在多肽的上下文中，术语“分离的”是指如果天然存在，则存在于与其中其可天然存在的环境不同的环境中的目标多肽。“分离的”意在包括在针对目标多肽被充分富集的和/或其中目标多肽被部分或基本上纯化的样品内的多肽。当多肽非天然存在时，“分离的”表示多肽已与其中通过合成或重组方法产生其的环境分离。
“富集的”意指样品经非天然地操作(例如，被科学家)，以使得目标多肽a)以比起始样品诸如生物样品(例如，其中多肽天然存在或其中其在施用后存在的样品)中的多肽的浓度高的浓度(例如，至少为3倍多，至少为4倍多，至少为8倍多，至少为64倍多或更多)，或b)以比其中产生多肽的环境(例如，如在细菌细胞中)更高的浓度存在。
“基本上纯的”表示组分(例如，多肽)组成大于约50％的总的组合物含量，通常大于约60％的总的多肽含量。更常见地，“基本上纯的”是指其中至少75％、至少85％、至少90％或更多的总的组合物是目标组分的组合物。在一些情况下，多肽将组成大于约90％，或大于约95％的总的组合物含量。
术语“特异性结合”或“选择性结合”，当指配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，表示决定蛋白质在蛋白质的异源群体和其它生物制品中的存在的结合反应。因此，在指定的条件下，指定的配体结合特定受体并且不以显著量结合存在于样品中的其它蛋白质。涵盖的方法的抗体或来源于抗体的抗原结合位点的结合成分，以为针对任何其它抗体或来源于其的结合成分的亲和力至少2倍多、至少10倍多、至少20倍多或至少100倍多的亲和力结合其抗原或其变体或突变蛋白。在特定实施方案中，抗体将具有大于约109升/mol的亲和力，如通过例如Scatchard分析(Munsen，等1980Analyt.Biochem.107:220-239)测定的。
IL-10和PEG-IL-10
抗炎性细胞因子IL-10，也称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，被分类为2型(类)细胞因子，一组包括IL-19、IL-20、IL-22、IL-24(Mda-7)和IL-26、干扰素(IFN-α、-β、-γ、-δ、-ε、-κ、-Ω和-τ)以及干扰素样分子(limitin、IL-28A、IL-28B和IL-29)的细胞因子。
IL-10为在免疫调节和炎症中具有多效性作用的细胞因子。其由肥大细胞产生，消解这些细胞在过敏反应的部位的炎性效应。虽然其能够抑制促炎性细胞因子诸如IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFα和GM-CSF的合成，但IL-10对某些T细胞和肥大细胞也具有刺激性并且刺激B细胞成熟、增殖和抗体产生。IL-10可阻断NF-κB活性并且参与JAK-STAT信号转导途径的调控。其还诱导CD8+ T细胞的细胞毒性活性和B细胞的抗体产生，并且其抑制巨噬细胞活性和促肿瘤炎症。CD8+ T细胞的调节是剂量依赖性的，其中较高剂量诱导较强的细胞毒性反应。
人IL-10是具有37kDa的分子质量的同型二聚体，其中每一个18.5kDa的单体包含178个氨基酸(其前18个氨基酸包含信号肽)和形成分子内二硫键的两对半胱氨酸残基。IL-10二聚体在两个单体亚单位之间的非共价相互作用被破坏后变得无生物活性。
本公开涵盖人IL-10和鼠IL-10(IL-10展示80％同源性)及其用途。另外，本公开的范围包括来自其它哺乳动物物种的IL-10直系同源物及其修饰形式，所述哺乳动物物种包括大鼠(登录NP_036986.2；GI 148747382)；牛(登录NP_776513.1；GI 41386772)；绵羊(登录NP_001009327.1；GI 57164347)；狗(登录ABY86619.1；GI 166244598)；和兔(登录AAC23839.1；GI 3242896)。
正如上文所暗示，术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“IL-10剂”等旨在被广泛解释，并且包括例如人和非人IL-10相关多肽，包括同源物、变体(包括突变蛋白)及其片段，以及具有例如前导序列(例如，信号肽)的IL-10多肽和前述蛋白的经修饰的形式。在其它特定实施方案中，IL-10、IL-10多肽和IL-10剂是激动剂。
IL-10受体、II型细胞因子受体由α和β亚单位组成，所述亚单位也分别称为R1和R2。受体激活需要结合α和β二者。IL-10多肽的一个同型二聚体结合α并且同一IL-10多肽的另一个同型二聚体结合β。
重组人IL-10的效用通常受其相对短的血清半衰期限制，所述短的血清半衰期可归因于例如肾清除、蛋白水解降解和血流中的单体化。因此，各种方法已被开发来改善IL-10的药代动力学特征而不破坏其二聚体结构(从而不利地影响其活性)。IL-10的PEG化导致某些药代动力学参数(例如，血清半衰期)的改善和/或活性的增强。例如，本公开的特定实施方案包括利用PEG-IL-10使增殖性病症(例如，癌症)的治疗最优化的方法。
如先前指出的，本公开还涵盖结合本文中的教导的基因疗法的用途。基因疗法通过将遗传物质(通常地包装在载体中)递送至受试者内的内源细胞以引入新型基因，引入另外拷贝的先前存在的基因，削弱现有基因的功能，或修复现有的但不起作用的基因来实现。一旦在细胞内，核酸就被细胞机构表达，导致目标蛋白质的产生。在本公开的上下文中，基因疗法被用作递送编码IL-10剂的核酸以用于治疗或预防本文所述的疾病、病症或病状的治疗剂。
正如上文所暗示，对于基因疗法的使用和方法，可用编码本文所示的IL-10相关多肽的核酸体内转化受试者的细胞。另外，用转基因或多核苷酸体外转化细胞，随后将其移植进受试者的组织以实现治疗。另外，可用编码IL-10相关多肽的转基因或多核苷酸转化原代细胞分离物或已建立的细胞系，随后任选地将其移植进受试者的组织。
如本文中所用，术语“PEG化的IL-10”和“PEG-IL-10”是指具有一个或多个共价附接于(通常通过接头，以便附接是稳定的)IL-10蛋白的至少一个氨基酸残基的聚乙二醇分子的IL-10分子。术语“单-PEG化的IL-10”和“单PEG-IL-10”表示一个聚乙二醇分子共价附接于(通常通过接头)IL-10二聚体的一个亚单位上的单个氨基酸残基。在某些实施方案中，本公开中使用的PEG-IL-10是其中1至9个PEG分子通过接头共价附接于IL-10二聚体的一个亚单位的N端处的氨基酸残基的α氨基的单PEG-IL-10。一个IL-10亚单位上的单-PEG化通常因亚单位改组而导致非PEG化、单-PEG化和二-PEG化的IL-10的非均一混合物。此外，允许PEG化反应进行至完成将通常导致非特异性的和多PEG化的IL-10，从而降低其生物活性。因此，本公开的特定实施方案包括施用通过本文所述的方法(例如，实验部分)产生的单和二-PEG化的IL-10的混合物。
在特定实施方案中，PEG部分的平均分子量为约5kDa至约50kDa。虽然PEG至IL-10的附接方法或位点不是至关重要的，但在某些实施方案中，PEG化不改变，或仅最小程度地改变IL-10剂的活性。在某些实施方案中，半衰期的增加大于生物活性的任何减小。PEG-IL-10的生物活性通常通过评估利用细菌抗原(脂多糖(LPS))攻毒并用PEG-IL-10治疗的受试者的血清中的炎性细胞因子(例如，TNF-α或IFN-γ)的水平来测量，如美国专利第7,052,686号中描述的。
可出于考虑的各种目的来制备IL-10变体，包括增加血清半衰期，减小针对IL-10的免疫应答，促进纯化或制备，减少IL-10至其单体亚单位的转化，改善疗效和减轻治疗使用期间的副作用的严重性或发生。氨基酸序列变体通常是自然界未发现的预定变体，尽管一些变体可以是翻译后的变体，例如糖基化变体。可使用IL-10的任何变体，只要其保持适当水平的IL-10活性。在肿瘤背景中，适当的IL-10活性包括例如CD8+ T细胞至肿瘤部位的浸润，炎性细胞因子诸如IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-L从这些浸润细胞的表达，以及生物样品中IFN-γ的升高的水平。
短语“保守氨基酸取代”是指通过用具有相似酸度、碱度、电荷、极性或侧链尺寸的侧链的氨基酸替代蛋白质中的氨基酸来保持蛋白质活性的取代。保守氨基酸取代通常需要下列组内的氨基酸残基的取代：1)L、I、M、V、F；2)R、K；3)F、Y、H、W、R；4)G、A、T、S；5)Q、N；和6)D、E。取代、插入或缺失的指导可基于不同变体蛋白质或来自不同物种的蛋白质的氨基酸序列的比对。因此，除了任何天然存在的IL-10多肽以外，本公开涵盖具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，通常不超过20、10或5个氨基酸取代，其中所述取代通常是保守氨基酸取代。
本公开还涵盖含有来源于成熟IL-10的连续氨基酸残基的成熟IL-10的活性片段(例如，子序列)。肽或多肽子序列的连续氨基酸残基的长度取决于子序列所源自的特定天然存在的氨基酸序列而变化。一般地，肽和多肽可为约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸直至全长肽或多肽。
另外，IL-10多肽可在确定长度的连续氨基酸(例如，“比较窗口”)上具有相较于参照序列的确定的序列同一性。用于比较的序列的比对方法在本领域中是公知的。可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Madison,Wis.)或通过手工比对和目测检查(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，编辑，1995增刊))来进行用于比较的序列的最佳比对。
作为实例，适当的IL-10多肽可包含与约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸直至全长肽或多肽的连续区段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
如下文中进一步论述的，IL-10多肽可从天然来源(例如，除其天然存在的环境外的环境)分离，并且还可被重组产生(例如，在经遗传修饰的宿主细胞诸如细菌、酵母、毕赤酵母、昆虫细胞等中)，其中用包含编码多肽的核苷酸序列的核酸来修饰经遗传修饰的宿主细胞。IL-10多肽也可通过合成产生(例如，通过无细胞化学合成)。
本公开涵盖编码IL-10剂的核酸分子，包括它们的天然存在和非天然存在的同种型、等位基因变体和剪接变体。本公开还包括在一个或多个碱基上与天然存在的DNA序列不同但因遗传密码的简并性而仍然翻译成对应于IL-10多肽的氨基酸序列的核酸序列。
IL-10血清浓度
可以以几种方式表征本文所述的方法中的IL-10的血浆水平，包括：(1)高于某一指定的水平或在一定水平的范围内的平均IL-10血清谷浓度；(2)在一定量的时间内高于某一指定的水平的平均IL-10血清谷浓度；(3)高于或低于某一指定水平或在一定水平的范围内的稳态IL-10血清浓度水平；或(4)高于或低于某一指定水平或在一定的水平范围内的浓度曲线的Cmax。如本文中所示，已发现平均血清谷IL-10浓度在某些适应症中对于功效是特别重要的。
在本公开的一些实施方案中，可产生的血浆水平浓度曲线包括大于约0.1ng/mL、大于约0.15ng/mL、大于约0.2ng/mL、大于约0.25ng/mL、大于约0.3ng/mL、大于约0.35ng/mL、大于约0.4ng/mL、大于约0.45ng/mL、大于约0.5ng/mL、大于约0.55ng/mL、大于约0.6ng/mL、大于约0.65ng/mL、大于约0.7ng/mL、大于约0.75ng/mL、大于约0.8ng/mL、大于约0.85ng/mL、大于约0.9ng/mL、大于约0.95ng/mL、大于约1.0ng/mL、大于约1.1ng/mL、大于约1.2ng/mL、大于约1.3ng/mL、大于约1.4ng/mL、大于约1.5ng/mL、大于约1.6ng/mL、大于约1.7ng/mL、大于约1.8ng/mL、大于约1.9ng/mL、大于约2.0ng/mL、大于约2.1ng/mL、大于约2.2ng/mL、大于约2.3ng/mL、大于约2.4ng/mL、大于约2.5ng/mL、大于约2.75ng/mL或大于约3.0ng/mL的平均IL-10血清谷浓度。
在涉及治疗或预防癌症相关疾病、病症或病状的特定实施方案中，通过获得大于约0.5ng/mL、大于约0.55ng/mL、大于约0.6ng/mL、大于约0.65ng/mL、大于约0.7ng/mL、大于约0.75ng/mL、大于约0.8ng/mL、大于约0.85ng/mL、大于约0.9ng/mL、大于约0.95ng/mL、大于约1.0ng/mL、大于约1.1ng/mL、大于约1.2ng/mL、大于约1.3ng/mL、大于约1.4ng/mL、大于约1.5ng/mL、大于约1.6ng/mL、大于约1.7ng/mL、大于约1.8ng/mL、大于约1.9ng/mL、大于约2.0ng/mL、大于约2.1ng/mL、大于约2.2ng/mL、大于约2.3ng/mL、大于约2.4ng/mL、大于约2.5ng/mL、大于约2.75ng/mL或大于约3.0ng/mL的平均IL-10血清谷浓度来使疗法最优化。
本公开的特定实施方案包含在如下范围内的平均IL-10血清谷浓度：约0.1ng/mL至约1.0ng/mL、约0.1ng/mL至约0.9ng/mL、约0.1ng/mL至约0.8ng/mL、约0.1ng/mL至约0.7ng/mL、约0.1ng/mL至约0.6ng/mL、约of 0.1ng/mL至约0.5ng/mL、约0.2ng/mL至约1.0ng/mL、约0.2ng/mL至约0.9ng/mL、约0.2ng/mL至约0.8ng/mL、约0.2ng/mL至约0.7ng/mL、约0.2ng/mL至约0.6ng/mL、约0.2ng/mL至约0.5ng/mL、约0.3ng/mL至约1.0ng/mL、约0.3ng/mL至约0.9ng/mL、约0.3ng/mL至约0.8ng/mL、约0.3ng/mL至约0.7ng/mL、约0.3ng/mL至约0.6ng/mL、约0.3ng/mL至约0.5ng/mL、约0.3ng/mL至约0.4ng/mL、约0.4ng/mL至约1.0ng/mL、约0.4ng/mL至约0.9ng/mL、约0.4ng/mL至约0.8ng/mL、约0.4ng/mL至约0.7ng/mL、约0.4ng/mL至约0.6ng/mL、约0.4ng/mL至约0.5ng/mL、约0.5ng/mL至约1.0ng/mL、约0.5ng/mL至约0.9ng/mL、约0.5ng/mL至约0.8ng/mL、约0.5ng/mL至约0.7ng/mL、约0.5ng/mL至约0.6ng/mL、约0.7ng/mL至约2.3n/mL、约0.8ng/mL至约2.2ng/mL、约0.9ng/mL至约2.1ng/mL、约1.0ng/mL至约2.1ng/mL、约1.0ng/mL至约2.0ng/mL、约1.0ng/mL至约1.9ng/mL、约1.0ng/mL至约1.8ng/mL、约1.0ng/mL至约1.7ng/mL、约1.0ng/mL至约1.6ng/mL、约1.0ng/mL至约1.5ng/mL、约1.9ng/mL至大于约2.5ng/mL、约1.9ng/mL至约2.5ng/mL、约1.9ng/mL至约2.4ng/mL、约1.9ng/mL至约2.3ng/mL、约1.9ng/mL至约2.2ng/mL或约1.9ng/mL至约2.1ng/mL。
在涉及治疗或预防抗炎性疾病、病症或病状的特定实施方案中，通过获得0.1ng/mL至1.0ng/mL、0.1ng/mL至0.9ng/mL、0.1ng/mL至0.8ng/mL、0.1ng/mL至0.7ng/mL、0.1ng/mL至0.6ng/mL、0.1ng/mL至0.5ng/mL、0.2ng/mL至1.0ng/mL、0.2ng/mL至0.9ng/mL、0.2ng/mL至0.8ng/mL、0.2ng/mL至0.7ng/mL、0.2ng/mL至0.6ng/mL、0.2ng/mL至0.5ng/mL、0.3ng/mL至1.0ng/mL、0.3ng/mL至0.9ng/mL、0.3ng/mL至0.8ng/mL、0.3ng/mL至0.7ng/mL、0.3ng/mL至0.6ng/mL、0.3ng/mL至0.5ng/mL、0.3ng/mL至0.4ng/mL、0.4ng/mL至1.0ng/mL、0.4ng/mL至0.9ng/mL、0.4ng/mL至0.8ng/mL、0.4ng/mL至0.7ng/mL、0.4ng/mL至0.6ng/mL、0.4ng/mL至0.5ng/mL、0.5ng/mL至1.0ng/mL、0.5ng/mL至0.9ng/mL、0.5ng/mL至0.8ng/mL、0.5ng/mL至0.7ng/mL或0.5ng/mL至0.6ng/mL的平均IL-10血清谷浓度来使疗法最优化。
实验部分描述了mIL-10和PEG-mIL-10在PDV6鳞状细胞癌和CT-26结肠癌中的治疗功效的评估，其中mIL-10和mPEG-IL-10给药参数(施用的量和频率)足以实现平均1-2ng/mL的IL-10血清谷浓度。如在实验部分中描述的，PEG-IL-10处理导致完全反应，然而IL-10处理显示抗肿瘤功能但非完全反应。
还可评估丙型肝炎的IL-10治疗的效果。对丙型肝炎病毒易感的具有功能免疫系统的小鼠模型(参见Dorner,M.(2011年6月09日)Nature 474：208–211)可用于评估mIL-10和PEG-mIL-10的药代动力学和药效学作用。使用本文中所示的教导和本领域普通技术人员的知识基础，可评估被施用来获得约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1.0ng/mL、约1.5ng/mL和约2ng/mL的平均IL-10血清谷浓度的mIL-10和PEG-mIL-10的作用。
虽然在大多数患者群体中在治疗剂量上不普遍，但较高剂量的IL-10的施用已在有限数目的受试者中引起不利作用(例如，头痛、贫血和对肝的作用)。幸运地，当在治疗持续过程中维持0.1-2ng/mL的平均IL-10血清浓度时，此类不利作用不普遍。然而，本公开的另一个实施方案提供用于监测接受IL-10疗法的受试者以预测不利作用，从而潜在地避免不利作用的方法，该方法包括：(1)测量受试者的IL-10的峰浓度；(2)测量受试者的IL-10的谷浓度；(3)计算峰-谷波动；和(4)使用计算的峰-谷波动来预测受试者的潜在不利作用。较小的峰-谷波动表明较低的受试者将经历IL-10相关不利作用的可能性。在某些实施方案中，测定使用特定给药参数的特定疾病、病症和病状的治疗的特定峰-谷波动，并且将那些波动用作参照标准。
除了上述IL-10给药相关参数以外，分布容积考虑也是相关的。对于大多数药物，血浆药物浓度以多指数方式下降。在静脉内施用后，药物立即快速地分布在整个初始空间(最低限度地确定为血浆容积)，随后发生较慢的至血管外空间(例如，某些组织)的平衡分布。将静脉内IL-10施用与这样的双房室动力学模型结合(参见Rachmawati,H.等(2004)Pharm.Res.21(11):2072-78)。还已研究了皮下重组hIL-10的药代动力学(Radwanski,E.等(1998)Pharm.Res.15(12):1895-1901)。此外，已引入IL-10修饰以试图将细胞因子靶向特定细胞类型(参见Rachmawati,H.(2007年5月)Drug Met.Dist.35(5):814-21)。
如下文中进一步描述的，在小鼠中观察到的IL-10和PEG-IL-10抗肿瘤功效因在CD8+ T细胞中诱导细胞毒性酶而产生，从而导致肿瘤细胞的杀伤。在周期中施用许多抗癌化合物(包括，但不限于，细胞凋亡诱导剂)。常见地，施用接近最大耐受剂量(MTD)的单次剂量或一系列剂量，包括接近最大耐受剂量(MTD)的单次应用或系列高剂量，随后停止给药(“休药期”)以允许患者的正常生理学恢复。例如，将该给药策略用于细胞毒性化学治疗性抗体疗法，诸如抗VEGF(AVASTIN)，和用于短效生物试剂诸如PROLEUKIN(IL-2)。
进行鼠类研究以生成有助于理解IL-10疗法的药代动力学参数和有助于使人的肿瘤治疗方案最优化的数据。如实验部分中所述，虽然在一周过程中接受相同量的以单个剂量或多个剂量施用的药物的小鼠确实具有相似的总暴露，但接受日剂量的小鼠显示最大的肿瘤尺寸的减小(表15)。此外，导致大于约1ng/mL(例如，1.1-2.1ng/mL)的血清谷浓度的维持的治疗方案展现最大的肿瘤尺寸和重量的减小(表16)。
本公开涵盖导致大于约0.1ng/mL(例如，0.1-2ng/mL、0.1-1ng/mL、0.5-1.5ng/mL或1.1-2.1ng/mL)的血清谷浓度的维持的任何剂量的施用。例如，当受试者为人时，可以以大于15μg/kg/日、大于18μg/kg/日、大于20μg/kg/日、大于21μg/kg/日、大于22μg/kg/日、大于23μg/kg/日、大于24μg/kg/日或大于25μg/kg/日的剂量施用非PEG化的hIL-10。当受试者为人时，可以以大于2.0μg/kg/日、大于2.3μg/kg/日、大于2.5μg/kg/日、大于2.6μg/kg/日、大于2.7μg/kg/日、大于2.8μg/kg/日、大于2.9μg/kg/日、大于3.0μg/kg/日、大于3.1μg/kg/日、大于3.2μg/kg/日、大于3.3μg/kg/日、大于3.4μg/kg/日或大于3.5μg/kg/日的剂量施用包含相对小的PEG的PEG-hIL-10(例如，5kDa单-二PEG-hIL10)。
CD8+ T细胞在IL-10功能中的作用
CD8(分化群8)是用作T细胞受体(TCR)的共受体的跨膜糖蛋白。CD8共受体主要在细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的表面表达，但其也在其它细胞类型包括自然杀伤细胞(NK)上被发现。与TCR一样，CD8结合主要组织相容性复合物(MHC)分子，但对于I类MHC蛋白是特异的。
CD8功能需要包含一对CD8链的二聚体的形成。存在CD8的两个同种型α和β，并且CD8的最常见的形式包含CD8-α和CD8-β链，免疫球蛋白超家族的两个成员。CD8-α与I类MHC分子相互作用，并且该相互作用使细胞毒性T细胞的T细胞受体与靶细胞在抗原特异性激活过程中保持紧密结合。具有CD8表面蛋白的细胞毒性T细胞被称为“CD8+ T细胞”。CD8+ T细胞(CTL和NK细胞)识别特定感染的靶细胞的抗原(通常地因细胞内病原体的感染产生的细胞表面肽或蛋白质)，并且如果那些抗原与受试者的正常抗原谱(“自身免疫”)不同，则CD8+T细胞被激活并且诱导靶细胞的细胞凋亡。
存在其中抗原谱不同的几个情形。例如，当病原体(例如，病毒)侵入细胞时，细胞产生“非自身”细胞表面抗原，并且CD8+ T细胞起始免疫应答以试图根除受感染的细胞。另一个情景发生，其中一些细胞的蛋白质因核酸和/或氨基酸水平上的突变而被修饰。癌细胞通常具有许多突变并且被CD8+ T细胞识别为‘不同的’。CD8+ T细胞在人癌症中的存在与更长的存活相关。
在两个上述情景中，激活的CD8+ T细胞产生IFNγ、穿孔蛋白和颗粒酶B。IFNγ对于进一步上调抗原在靶细胞上的“呈递”是非常重要的，该抗原存在于I类MHC蛋白上。穿孔蛋白和颗粒酶B介导靶细胞(例如，病毒和癌症)的杀伤。
穿孔蛋白，一种在CTL和NK的颗粒中发现的溶胞蛋白，在脱粒后将其自身插入靶细胞的质膜中。穿孔蛋白与补体成分9(C9)具有结构和功能相似性，并且与C9一样，穿孔蛋白产生跨膜小管，并且能够非特异性裂解多种靶细胞。穿孔蛋白是用于T细胞和NK细胞介导的细胞裂解的至关重要的效应分子。
正如上文所暗示，颗粒酶B为由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞表达的丝氨酸蛋白酶。CTL和NK细胞识别特定感染的靶细胞群体并且诱导在它们的表面上具有‘非自身’抗原(通常地因细胞内病原体感染产生的肽或蛋白质)的细胞的细胞调亡。颗粒酶B对于在细胞介导的免疫应答中由CTL产生的靶细胞凋亡的快速诱导是至关重要的。
IL-10在CD8+ T细胞的活化中起着多个作用。例如，IL-10在记忆CD8+ T细胞(已在先前的感染或接种疫苗过程中产生)中诱导效应分子(IFNγ、穿孔蛋白和颗粒酶B)。此类记忆CD8+ T细胞是负责提供受试者的长期抗病毒保护作用的细胞。虽然当IL-10不存在时记忆CD8+ T细胞的产生和扩增可发生(Vicari,A.和Trinchieri,G.(2004)Immuno.Rev.202:223–236)，但IL-10直接活化此类细胞的事实提供独特的和备选的治疗方法。虽然已将慢性病毒感染与CD8+ T细胞发生关联(Virgin,H.等(2009)Cell 138，第30页)，但未曾描述过利用非PEG化的IL-10或PEG化的IL-10对受试者(例如，小鼠)的处理。
鉴于上述，本公开的实施方案基于CD8+ T细胞与癌症和病毒感染之间的联系。因此，治疗和/或预防癌症相关疾病、病症和病状的某些方法，诸如维持例如≥0.5ng/mL、≥1ng/mL或≥2ng/mL的平均IL-10血清浓度应当也适用于病毒相关疾病、病症和病状的治疗。
与其它细胞因子相反，IL-10可被认为是高效免疫调节因子和免疫抑制因子。CD8+T细胞在慢性炎症中的作用还未被完全阐明。然而，因为IFNγ在癌症和病毒相关病症中的参与至少部分通过CD8+ T细胞介导，并且因为参与炎症相关病症的控制(通过炎性细胞因子的下调)的IL-10-T细胞途径也牵涉IFNγ，因此CD8+ T细胞也在炎症中起着关键作用。因此，IL-10可被证明是当前稳定的抗炎剂中的重要治疗剂。
IL-10的产生方法
本公开的多肽可通过任何适当的方法，包括非重组(例如，化学合成)和重组方法产生。
A.化学合成
当化学合成多肽时，合成可通过液相或固相进行。固相肽合成(SPPS)允许掺入非天然氨基酸和/或肽/蛋白质主链修饰。SPPS的各种形式，诸如9-芴甲氧基羰基(Fmoc)和叔丁氧基羰基(Boc)可用于合成本公开的多肽。化学合成的详细内容在本领域中是已知的(例如，Ganesan A.(2006)Mini Rev.Med.Chem.6:3-10；和Camarero J.A.等，(2005)ProteinPept Lett.12:723-8)。
固相肽合成可如下文中所述进行。用酸不稳定或碱不稳定基团保护α官能团(Nα)和任何反应性侧链。保护基团在用于连接酰胺键的条件下是稳定的但可被容易地裂解而不损伤已形成的肽链。用于α-氨基官能团的适当的保护基团包括，但不限于下列基团：Boc、苄氧羰基(Z)、O-氯苄氧羰基、二-苯基异丙基氧羰基、叔-戊氧基羰基(Amoc)、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基-苄氧羰基、邻-硝基硫基、2-氰基-叔丁氧-羰基、Fmoc、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己基-1-亚基)乙基(Dde等。
合适的侧链保护基包括，但不限于：乙酰基、烯丙基(All)、烯丙基氧羰基(Alloc)、苄基(Bzl)、苄氧羰基(Z)、叔-丁氧羰基(Boc)、苄氧甲基(Bom)、邻-溴苄氧羰基、叔-丁基(tBu)、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苄基、2-氯苄氧羰基、2,6-二氯苄基、环己基、环戊基、1,1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己基-1-亚基)乙基(Dde)、异丙基、4-甲氧基-2,3-6-三甲基苄基磺酰基(Mtr)、2,3,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、新戊酸基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、2,4,6-三甲氧基苄基、三甲基甲硅烷基和三苯甲基(Trt)。
在固相合成中，将C端氨基酸偶联于适当的载体材料。适当的载体材料是对于用于合成法的逐步缩聚和裂解反应的试剂和反应条件为惰性并且不溶于待使用的反应介质的那些载体材料。商购可得的载体材料的实例包括已用反应性基团和/或聚乙二醇修饰的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；氯甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；羟甲基化或氨甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物等。当期望制备肽酸时，可使用用4-苄基氧苄基-醇(Wang-锚)或2-氯三苯甲基氯衍生的聚苯乙烯(1％)-二乙烯基苯或在肽酰胺的情况下，可使用用5-(4'-氨甲基)-3',5'-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL-锚)或对-(2,4-二甲氧基苯基-氨甲基)-苯氧基(Rink酰胺锚)衍生的聚苯乙烯(1％)二乙烯基苯或
可通过将C端Fmoc保护的氨基酸与载体材料反应(通过在室温或升高的温度(例如，40℃与60℃之间)下在乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮或类似溶剂中添加活化剂和利用例如2至72小时的反应时间)来实现对聚合物载体的键联。
Nα-保护的氨基酸(例如，Fmoc氨基酸)至PAL、Wang或Rink锚的偶联可以例如在1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑存在或不存在的情况下，借助于偶联试剂(诸如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或其它碳二亚胺、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)或其它脲鎓盐、O-酰基-脲、苯并三唑-1-基-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸盐(PyBOP)或其它鏻盐、N-羟基琥珀酰亚胺、其它N-羟基酰亚胺或肟类)来进行，例如在添加HOBt，添加或不添加碱诸如，例如二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺或N-甲基吗啉，例如二异丙基乙胺的情况下借助于TBTU，利用2至72小时的反应时间(例如，在1.5至3倍过量(例如2倍过量)的氨基酸和偶联试剂中，和在约10℃至50℃，例如25℃的温度下，在溶剂诸如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷，例如二甲基甲酰胺中，3小时)来进行。
还可能在上述条件下使用活性酯(例如，五氟苯基、对-硝基苯基等)、Nα-Fmoc-氨基酸的对称酸酐、其酰基氯或酰基氟而非偶联试剂。
可通过添加DIEA和使用10至120分钟，例如20分钟的反应时间(但不限于使用该溶剂和该碱)将Nα-保护的氨基酸(例如，Fmoc氨基酸)偶联于二氯甲烷中的2-氯三苯甲基树脂。
可按照肽合成中的常规方法，通常地在自动化肽合成仪中进行受保护的氨基酸的连续偶联。在通过用例如二甲基甲酰胺中的哌啶(10％至50％)处理5至20分钟，例如利用50％的DMF中的哌啶处理2x2分钟，和利用20％的DMF中的哌啶处理1x15分钟裂解固相上的偶联的氨基酸的Nα-Fmoc保护基团后，在惰性、不含水的极性溶剂诸如二氯甲烷、DMF或两者的混合物中和在约10℃与50℃之间的温度下，例如在25℃下，将3至10倍过量(例如，10倍过量)的下一个受保护的氨基酸偶联至先前的氨基酸。先前提及的用于将第一Nα-Fmoc氨基酸偶联于PAL、Wang或Rink锚的试剂适合用作偶联试剂。受保护的氨基酸的活性酯或其氯化物或氟化物或对称酸酐还可用作替代。
在固相合成结束时，从载体材料裂解肽，同时裂解侧链保护基团。可用三氟乙酸或其它强酸性介质在添加5％-20％V/V的清除剂诸如二甲硫醚、乙基甲硫醚、茴香硫醚、硫甲酚、间-甲酚、苯甲醚、乙二硫醇、苯酚或水，例如，15％v/v二甲硫醚/乙二硫醇/间-甲酚1:1:1的情况下在0.5至3小时(例如2小时)内进行裂解。通过用冰醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷2:2:6裂解2-氯三苯甲基锚来获得具有完全受保护的侧链的肽。可通过在硅胶上进行色谱来纯化受保护的肽。如果肽通过Wang锚连接于固相和如果旨在获得具有C端烷酰化的肽，则可利用烷基胺或氟代烷基胺通过氨解来进行裂解。在约-10℃至50℃(例如，约25℃)的温度下和约12至24小时(例如，约18小时)的反应时间进行氨解。另外，可通过再酯化例如利用甲醇从载体裂解肽。
可将获得的酸性溶液与3至20倍量的冷乙醚或正-己烷，例如10倍过量的二乙醚混合，以沉淀肽，从而分离保留在醚中的清除剂和裂解的保护基团。可通过从冰醋酸再沉淀肽数次来进行进一步纯化。可在水或叔丁醇或两种溶剂的混合，例如叔丁醇/水的1:1混合物中处理获得的沉淀，随后冷冻干燥。
可通过各种色谱法纯化获得的肽，色谱法包括在以醋酸盐形式存在的弱碱性树脂中进行的离子交换、在非衍生聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物(例如，XAD)上进行的疏水吸附色谱、在硅胶上进行的吸附色谱、例如在羧甲基纤维素上进行的离子交换色谱、例如在G-25上进行的分配色谱、逆流分布色谱或高压液相色谱(HPLC)例如在辛基或十八烷基硅烷键合硅(ODS)相上进行的反相HPLC。
B.重组体产生
描述人和小鼠IL-10的制备的方法可见于例如美国专利第5,231,012号中，该专利教导了用于产生具有IL-10活性的蛋白质的方法，包括重组和其它合成技术。IL-10可具有病毒来源，并且来自EB病毒的病毒IL-10(BCRF1蛋白)的克隆和表达公开于Moore等，(1990)Science 248:1230中。使用本领域中已知的标准技术，诸如本文所述的那些技术以多种方式获得IL-10。重组人IL-10也可例如从PeproTech,Inc.,Rocky Hill,N.J商购获得。
当使用重组技术产生多肽时，使用任何适当的构建体和任何适当的宿主细胞将多肽产生为细胞内蛋白质或分泌性蛋白质，宿主细胞可以是原核或真核细胞，诸如分别地细菌(例如，大肠杆菌(E.coli))或酵母宿主细胞。可用作宿主细胞的真核细胞的其它实例包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。当使用哺乳动物宿主细胞时，它们可包括人细胞(例如，HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如，NIH3T3、L细胞和C127细胞)；灵长类动物细胞(例如，Cos 1、Cos 7和CV1)；和仓鼠细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。
可按照本领域中已知的标准方法使用多种适合用于多肽表达的宿主-载体系统。参见，例如，Sambrook等，1989 Current Protocols in Molecular Biology Cold SpringHarbor Press,New York；和Ausubel等1995 Current Protocols in Molecular Biology，Wiley和Sons编。用于将遗传物质引入宿主细胞的方法包括，例如，转化、电穿孔、缀合、磷酸钙法等。可选择用于转移的方法，以提供引入的编码多肽的核酸的稳定表达。可将编码多肽的核酸提供为可遗传的附加型元件(例如，质粒)或可将其整合进基因组中。多种用于目标多肽的产生的适当的载体是商购可得的。
载体可在宿主细胞中提供染色体外维持或可提供至宿主细胞基因组内的整合。表达载体提供转录和翻译调控序列，并且可提供诱导型或组成型表达，其中在转录起始区，以及转录和翻译终止区的转录控制下编码区被可操作地连接。一般地，转录和翻译调控序列可包括，但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。启动子可以是组成型的或诱导型的，并且可以是强组成型启动子(例如，T7)。
表达构建体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以提供编码目标蛋白的核酸序列的插入。在表达宿主中有效的可选择的标记可被提供来帮助选择含有载体的细胞。此外，表达构建体还可包括额外的元件。例如，表达载体可具有一个或两个复制系统，从而允许其维持在生物体中，例如哺乳动物或昆虫细胞中(以进行表达)和原核宿主中(以进行克隆和扩增)。另外，表达构建体可含有可选择的标记基因来允许选择转化的宿主细胞。可选择的基因在本领域中是公知的并且可根据所使用的宿主细胞而变化。
可按照本领域中已知的方法来实现蛋白质的分离和纯化。例如，可通过免疫亲和纯化从经遗传修饰以组成型地和/或在诱导后表达蛋白质的细胞的裂解物，或从合成反应混合物中分离蛋白质，免疫亲和纯化通常包括将样品与抗-蛋白质抗体接触，洗涤以除去非特异性结合的材料，和洗脱特异性结合的蛋白质。分离的蛋白质还通过透析和通常用于蛋白质纯化的其它方法来进一步纯化。在一个实施方案中，使用金属螯合层析法分离蛋白质。蛋白质可含有修饰以促进分离。
可以以基本上纯的或分离的形式(例如，不含其它多肽)来制备多肽。多肽可存在于相对于可存在的其它组分(例如，其它多肽或其它宿主细胞组分)针对多肽富集的组合物中。例如，可提供纯化的多肽以便多肽存在于基本上不含(例如少于约90％、少于约60％、少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％、或少于约1％)其它表达的蛋白质的组合物中。
使用重组技术来操作本领域中已知的不同IL-10相关核酸以提供能够编码IL-10多肽的构建体来产生IL-10多肽。应理解，当提供特定氨基酸序列时，本领域普通技术人员鉴于她在例如分子生物学的背景和经验将认识到多种不同的编码此类氨基酸序列的核酸分子。
酰胺键取代
在一些情况下，IL-10包括一个或多个除肽键外的键联，例如至少2个相邻氨基酸通过除酰胺键外的键联联接。例如，为了减少或消除不期望的蛋白质水解或其它方式的降解，和/或增强血清稳定性，和/或限制或增加构象柔性，IL-10的主链内的一个或多个酰胺键可被取代。
在另一个实例中，可用作为酰胺键联的电子等排体的键联诸如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-或-CH2SO-来替代IL-10中的一个或多个酰胺键(-CO-NH-)。还可用例如还原的电子等排体伪肽键替代IL-10中的一个或多个酰胺键联。参见Couder等(1993)Int.J.Peptide Protein Res.41:181-184。此类替代和如何实现它们对于本领域普通技术人员来说是已知的。
氨基酸取代
可在IL-10多肽中产生一个或多个氨基酸取代。以下是非限定性实例：
a)烷基取代的疏水氨基酸，包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、(S)-2-氨基丁酸、(S)-环己基丙氨酸或被来自C1-C10碳的脂肪族侧链取代(包括支链、环状和直链烷基、烯基或炔基取代)的其它简单α-氨基酸的取代；
b)芳香族-取代的疏水氨基酸，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、磺基酪氨酸、二苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-苯并噻吩基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、组氨酸的取代，包括上文所列的芳香族氨基酸的氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氮杂、卤代(氟、氯、溴或碘)或烷氧基(C1至C4)-取代的形式，其举例说明性实例为2-,3-或4-氨基苯丙氨酸、2-,3-或4-氯苯丙氨酸、2-,3-或4-甲基苯丙氨酸、2-,3-或4-甲氧基苯丙氨酸、5-氨基-,5-氯-,5-甲基-或5-甲氧基色氨酸、2'-,3'-或4'-氨基-、2'-,3'-或4'-氯-、2,3或4-二苯丙氨酸、2'-,3'-,或4'-甲基-、2-,3-或4-二苯丙氨酸、和2-或3-吡啶基丙氨酸；
c)含碱性侧链的氨基酸，包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、高精氨酸的取代，包括先前的氨基酸的烷基、烯基或芳基-取代的(来自C1-C10分枝、线性或环状)衍生物，无论取代基在例如pro-R位置中的杂原子(诸如α氮，或远端一个或多个氮)上还是在α碳上。用作举例说明性实例的化合物包括：N-ε-异丙基-赖氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-甘氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-丙氨酸、N,N-γ,γ'-二乙基-高精氨酸。还包括化合物诸如其中烷基占据α-碳的pro-R位置的α-甲基-精氨酸、α-甲基-2,3-二氨基丙酸、α-甲基-组氨酸、α-甲基-鸟氨酸。还包括的是从烷基、芳香酸、杂芳香酸(其中杂芳基具有一个或多个单个或组合的氮、氧或硫原子)、羧酸或许多公知的活化衍生物诸如酰基氯、活化酯、活化环酰胺和相关衍生物以及赖氨酸、鸟氨酸或2,3-二氨基丙酸的任一种形成的酰胺；
d)酸性氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、酪氨酸，2,4-二氨基丙酸、鸟氨酸或赖氨酸和四唑-取代的烷基氨基酸的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基磺酰胺的取代；
e)侧链酰胺残基，包括天冬酰胺、谷氨酰胺，和天冬酰胺或谷氨酰胺的烷基或芳香族取代的衍生物的取代；和
f)含羟基氨基酸，包括丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、2,3-二氨基丙酸，和丝氨酸或苏氨酸的烷基或芳香族取代的衍生物的取代。
在一些情况下，IL-10包含一种或多种天然存在的非遗传编码的L-氨基酸、合成的L-氨基酸或氨基酸的D-对映异构体。例如，IL-10可只包含D-氨基酸。例如，IL-10多肽可包含以下残基的一种或多种：羟脯氨酸、β-丙氨酸、邻-氨基苯甲酸、间-氨基苯甲酸、对-氨基苯甲酸、间-氨基甲基苯甲酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、叔-丁基丙氨酸、叔-丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2,4-二氨基丁酸、rho-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、ε-氨基己酸、ω-氨基己酸、ω-氨基庚酸、ω-氨基辛酸、ω-氨基癸酸、ω-氨基四癸酸、环己基丙氨酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、δ-氨基戊酸和2,3-二氨基丁酸。
另外的修饰
可将半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物引入IL-10多肽以提供通过二硫键联的与另一个肽的键联或提供IL-10多肽的环化。引入半胱氨酸或半胱氨酸类似物的方法在本领域中是已知的；参见，例如，美国专利第8,067,532号。
可环化IL-10多肽。可将一个或多个半胱氨酸或半胱氨酸类似物引入IL-10多肽，其中引入的半胱氨酸或半胱氨酸类似物可与又一个引入的半胱氨酸或半胱氨酸类似物形成二硫键。环化的其它方法包括肟接头或羊毛硫氨酸接头的引入；参见，例如，美国专利第8,044,175号。可使用和/或引入可形成环化键的任何氨基酸(或非氨基酸部分)的组合。环化键可利用氨基酸(或利用氨基酸和-(CH2)n-CO-或-(CH2)n-C6H4-CO-)与允许引入桥的官能团的任何组合来产生。一些实例为二硫化物、二硫化物部分诸如-(CH2)n-碳酰基桥(carba bridge)、硫缩醛、硫醚桥(胱硫醚或羊毛硫氨酸)以及含桥酯类和醚类。在这些实例中，n可以是任意整数，但通常小于10。
其它修饰包括，例如，N-烷基(或芳基)取代(ψ[CONR])，或构建内酰胺和其它环状结构的主链交联。其它衍生物包括C端羟甲基衍生物、邻-修饰的衍生物(例如，C-端羟甲基苄醚)、N端修饰的衍生物，包括取代的酰胺诸如烷基酰胺和酰肼类。
在一些情况下，IL-10多肽中的一个或多个L-氨基酸被一个或多个D-氨基酸替代。
在一些情况下，IL-10多肽是逆倒转(retroinverso)类似物(参见，例如，Sela和Zisman(1997)FASEB J.11:449)。逆倒转肽类似物是线性多肽的异构体，其中氨基酸序列的方向被反转(逆转)并且其中的一个或多个氨基酸的手性D或L型被反转(变型)，例如，使用D-氨基酸而非L-氨基酸。[参见，例如，Jameson等(1994)Nature 368:744；和Brady等(1994)Nature 368:692]。
IL-10多肽可包括“蛋白质转导结构域”(PTD)，其是指促进穿过脂双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或小囊泡膜的多肽、多核苷酸、糖类或有机或无机分子。附接于另一个分子的PTD促进分子穿过膜，例如从细胞外空间进入细胞内空间或从胞质溶胶进入细胞器内。在一些实施方案中，PTD共价连接于IL-10多肽的氨基端，然而在其它实施方案中，PTD共价连接于IL-10多肽的羧基端。示例性的蛋白质转导结构域包括，但不限于，最小十一肽蛋白质转导结构域(根据包含YGRKKRRQRRR的HIV-1TAT的残基47-57；SEQ ID NO://)；包含足以指导进入细胞的许多精氨酸残基(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)的多聚精氨酸序列；VP22结构域(Zender等(2002)Cancer Gene Ther.9(6):489-96)；果蝇触角蛋白质转导结构域(Noguchi等(2003)Diabetes 52(7):1732-1737)；截短的人降钙素肽(Trehin等(2004)Pharm.Research 21:1248-1256)；多聚赖氨酸(Wender等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13003-13008)；RRQRRTSKLMKR(SEQ ID NO:/)；转运肽(Transportan)GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:/)；KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(SEQ ID NO:/)；和RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ IDNO:/)。示例性PTD包括，但不限于，YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:/)、RKKRRQRRR(SEQ ID NO:/)；3个精氨酸残基至50个精氨酸残基的精氨酸均聚物；示例性PTD结构域氨基酸序列包括，但不限于，下列序列的任一个：YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO://)；RKKRRQRR(SEQ ID NO://)；YARAAARQARA(SEQ ID NO://)；THRLPRRRRRR(SEQ ID NO://)和GGRRARRRRRR(SEQ IDNO://)。
IL-10多肽的C端上的氨基酸的羧基COR3可以以游离形式(R3＝OH)或以生理耐受的碱金属盐或碱土金属盐诸如钠盐、钾盐或钙盐的形式存在。羧基还可用伯醇、仲醇或叔醇诸如例如甲醇、分枝或未分枝的C1-C6-烷醇，例如乙醇或叔丁醇来酯化。羧基还可用伯胺或仲胺诸如氨、分枝的或未分枝的C1-C6-烷基胺或C1-C6二-烷基胺例如甲胺或二甲胺来酰胺化。
IL-10多肽的N端上的氨基酸NR1R2的氨基可以以游离形式(R1＝H和R2＝H)或以生理耐受的盐诸如，例如，氯化物或醋酸盐的形式存在。氨基还可用酸来乙酰化，以便R1＝H并且R2＝乙酰基、三氟乙酰基或金刚烷基。氨基可以以在肽化学中常规使用的氨基保护基团，诸如上述氨基保护基团(例如，Fmoc、苯甲氧基-羰基(Z)、Boc和Alloc)保护的形式存在。氨基可以是N-烷基化的，其中R1和/或R2＝C1-C6烷基或C2-C8烯基或C7-C9芳烷基。烷基残基可以是直链的、支链的或环状的(例如，分别为乙基、异丙基和环己基)。
增强和/或模拟IL-10功能的特定修饰
改善本文中公开的治疗形式(例如，IL-10)的多个物理性质之一和/或它们的施用方式通常是有益的，并且有时是迫切需要的。物理性质的改善包括，例如，调节免疫原性；增加水溶性、生物利用度、血清半衰期和/或治疗半衰期的方法；和/或调节生物活性。某些修饰也可用于，例如，提高用于检测测定的抗体(例如，表位标签)和方便蛋白质纯化。一般必须赋予此类改善而非不利地影响治疗方式的生物活性和/或增加其免疫原性。
IL-10的PEG化是本公开涵盖的一个具体修饰，然而其它修饰包括，但不限于，糖基化(N-和O-连接的)；多聚唾液酸化；包含血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)、食蟹猴(cyno)血清白蛋白或牛血清白蛋白(BSA))的白蛋白融合分子；通过例如缀合的脂肪酸链(酰化)的白蛋白结合；和Fc融合蛋白。
PEG化：蛋白质治疗剂的临床功效通常受到短的血浆半衰期和对蛋白酶降解的易感性限制。各种治疗性蛋白(例如，非格司亭)的研究已显示此类困难可通过各种修饰来克服，包括将多肽序列缀合或连接于多种非蛋白质性质的聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯的任一种。这通常通过连接部分共价结合于蛋白质和非蛋白质性质的多聚体例如PEG来实现。已显示此类PEG缀合的生物分子具有临床上有用的性质，包括更好的物理和热稳定性、抗对酶促降解的易感性的保护作用、增加的溶解度、较长的体内循环半衰期和减小的清除率、减弱的免疫原性和抗原性，以及减小的毒性。
除了PEG化对药代动力学参数的有益作用以外，PEG化本身可增强活性。例如，已显示PEG-IL-10比未PEG化的IL-10更有效地抗某些癌症(参见，例如，EP 206636A2)。
适合缀合于多肽序列的PEG通常在室温下可溶于水，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R为氢或保护基团诸如烷基或烷醇基，并且n为1至1000的整数。当R是保护基团时，其通常具有1至8个碳。缀合于多肽序列的PEG可以是线性的或分枝的。本公开涵盖分枝的PEG衍生物、“星形-PEG”和多臂PEG。本公开中使用的PEG的分子量不限于任何特定范围，并且实例示于本文中其它地方；例如，某些实施方案具有5kDa至20kDa的分子量，然而其它实施方案具有4kDa至10kDa的分子量。
本公开还涵盖其中PEG具有不同n值，从而各种不同的PEG以特定比率存在的缀合物的组合物。例如，一些组合物包含缀合物的混合物，其中n＝1、2、3和4。在一些组合物中，其中n＝1的缀合物的百分比为18-25％，其中n＝2的缀合物的百分比为50-66％，其中n＝3的缀合物的百分比为12-16％，以及其中n＝4的缀合物的百分比达到5％。此类组合物可利用本领域中已知的反应条件和纯化方法来产生。示例性反应条件描述于整个说明书。可将阳离子交换色谱用于分离缀合物，随后鉴定含有纯化的(不含未修饰的蛋白质序列和具有其它数目的附接的PEG的缀合物)具有例如所需数目的附接的PEG的缀合物的级分。
PEG化最常见地在多肽的N端上的α氨基、赖氨酸残基的侧链上的ε氨基以及组氨酸残基的侧链上的咪唑基团上发生。由于大多数重组多肽具有单个α以及多个ε氨基和咪唑基团，因此取决于接头化学可产生许多位置异构体。本领域已知的一般PEG化策略可用于本文中。可通过介导多肽序列的一个或多个的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间的键的端反应基团(“间隔子")将PEG结合于本公开的多肽。具有可结合于游离氨基的间隔子的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇，其可通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。可结合于游离氨基的另一种活化的聚乙二醇为2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可通过将聚乙二醇单甲醚与氰尿酰氯反应来制备。结合于游离羧基的活化的聚乙二醇包括聚氧乙二胺。
本公开的多肽序列的一个或多个对具有间隔子的PEG的缀合可通过各种常规方法来进行。例如，可在4℃至室温的温度下，在5至10的pH下于溶液中，使用4:1至30:1的试剂对蛋白质的摩尔比进行缀合反应，持续30分钟至20小时。可选择反应条件以指导朝向主要产生所需程度的取代的反应。一般地，低温、低pH(例如，pH＝5)和短的反应时间倾向于减少附接的PEG的数目，然而高温、中性至高pH(例如，pH≥7)和更长的反应时间倾向于增加附接的PEG数目。本领域中已知的各种方法可用于终止反应。在一些实施方案中，通过使反应混合物酸化和在例如-20℃下冷冻来终止反应。在例如美国专利第5,252,714、5,643,575、5,919,455、5,932,462和5,985,263号中论述了各种分子的PEG化。在例如美国专利第7,052,686号中描述了PEG-IL-10。涵盖用于本文中的特定反应条件示于实验部分。
本公开还涵盖PEG模拟物的用途。已开发了保留PEG的属性(例如，延长的血清半衰期)同时赋予几个另外的有利性质的重组PEG模拟物。例如，可重组地产生已融合于目标肽或蛋白质药物(例如，Amunix的XTEN技术；Mountain View,CA)的能够形成与PEG相似的延长的构象的简单多肽链(包含，例如，Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr)。这排除了在制造过程中对另外的缀合步骤的需要。此外，已建立的分子生物学技术使得能够控制多肽链的侧链组成，从而允许使免疫原性和制造性能最优化。
糖基化：出于本公开的目的，“糖基化”意在广泛地指将聚糖附接于蛋白质、脂质或其它有机分子的酶促过程。结合本公开的术语“糖基化”的使用通常旨在指添加或消除一个或多个糖部分(通过除去潜在的糖基化位点或通过利用化学和/或酶促方法删除糖基化)，和/或添加可存在于或可不存在于天然序列中的一个或多个糖基化位点。另外，短语包括天然蛋白质的糖基化的定性变化，包括存在的各种糖部分的性质和比例的变化。
糖基化可显著影响多肽诸如IL-10的物理性质(例如，溶解度)并且在蛋白质稳定性、分泌和亚细胞定位中也可以是重要的。糖基化多肽还可展现增强的稳定性或可改善一个或多个药代动力学性质，诸如半衰期。另外，溶解度的改善可以例如使得能够产生比包含非糖基化的多肽的制剂更适合药物施用的制剂。
适当的糖基化可以是生物活性所必需的。事实上，来自真核生物的一些基因，当在缺乏用于糖基化蛋白的细胞过程的细菌(例如大肠杆菌)中表达时，产生因它们缺乏糖基化而几乎无活性或无活性的回收的蛋白质。
糖基化位点的添加可通过改变氨基酸序列来实现。对多肽的改变可以例如通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(对于N-连接的糖基化位点)或被所述一个或多个氨基酸残基取代来产生。每一个类型中发现的N-连接或O-连接的寡糖和糖残基的结构可以是不同的。通常在两者中发现的一种类型的糖是N-乙酰基神经氨酸(在下文中称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接的和O-连接的寡糖的端残基，并且因其负电荷，可赋予糖蛋白酸性性质。本公开的特定实施方案包括N-糖基化变体的产生和用途。
本公开的多肽序列可任选地通过核酸水平上的改变，特别地通过在预先选定的碱基上使编码多肽的核酸突变(以便产生将翻译成所需氨基酸的密码子)来改变。增加多肽上的糖部分的数目的另一种方法是通过将糖苷与多肽化学或酶促偶联。糖类的除去可通过化学或酶促方式，或通过取代编码被糖基化的氨基酸残基的密码子来实现。化学去糖基化技术是已知的，并且多肽上的糖部分的酶促裂解可通过使用多种内切或外切糖苷酶来实现。
二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是用于产生重组糖蛋白的常用宿主细胞。这些细胞不表达酶β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶，从而不将呈α-2,6键联形式的唾液酸添加至在这些细胞中产生的糖蛋白的N-连接的寡糖。
聚唾液酸化：本公开还涵盖聚唾液酸化的用途，多肽至天然存在的可生物降解的α-(2→8)连接的聚唾液酸(“PSA”)的缀合，以改善多肽的稳定性和体内药代动力学。PSA是可生物降解的，无毒的高度亲水的天然聚合物，鉴于其在血液中的高表观分子量，这延长其血清半衰期。另外，许多肽和蛋白质治疗剂的聚唾液酸化已导致显著减少的蛋白水解，体内活性的保留以及免疫原性和抗原性的减弱(参见，例如，G.Gregoriadis等，Int.J.Pharmaceutics 300(1-2):125-30)。与利用其它缀合物(例如，PEG)的修饰一样，用于位点特异性聚唾液酸化的各种技术是可获得的(参见，例如，T.Lindhout等，(2011)PNAS108(18)7397-7402)。
白蛋白融合：用于缀合的另外的适当的组分和分子包括白蛋白诸如人血清白蛋白(HSA)、食蟹猴血清白蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。
成熟HSA(具有～20天的血清半衰期的585个氨基酸的多肽(～67kDa))主要负责胶体渗透血压、血液pH以及许多内源和外源配体的运输和分布的维持。该蛋白具有3个结构上的同源结构域(结构域I、II和III)，几乎完全以α-螺旋构象存在，并且借助17个二硫桥高度稳定。白蛋白的3个主要药物结合区位于子域内的3个结构域IB、IIA和IIIA的每一个上。
白蛋白合成在肝中发生，肝产生短暂的初级产物前清蛋白原。因此，全长HSA具有18个氨基酸的信号肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS；SEQ ID NO://)，后接6个氨基酸的前结构域(RGVFRR；SEQ ID NO://)；这24个氨基酸残基的肽可被称为前原结构域。可使用其内源信号肽作为前原结构域来表达和分泌HSA。或者，可使用融合于成熟构建体的IgK信号肽来表达和分泌HSA。前清蛋白原在内质网腔中在其氨基端被迅速共翻译地裂解，以产生稳定的609个氨基酸的前体多肽，前清蛋白。前清蛋白随后通过高尔基体，在高尔基体中其通过弗林蛋白酶依赖性的氨基端裂解被转化成585个氨基酸的成熟白蛋白。
白蛋白的一级氨基酸序列、结构和功能在物种间是高度保守的，白蛋白合成和分泌的过程在物种间同样是高度保守。与HSA相比较的白蛋白血清蛋白存在于例如食蟹猴、牛、狗、兔和大鼠中。在非人物种中，牛血清白蛋白(BSA)与HSA结构最相似(参见，例如，Kosa等，2007年11月J Pharm Sci.96(11):3117-24)。本公开涵盖来自非人物种的白蛋白，包括，但不限于上文中所示的那些白蛋白在例如药物开发过程的用途。
根据本公开，可将白蛋白在羧基端、氨基端、羧基端和氨基端以及在内部缀合于药物分子(例如，本文所述的多肽)(参见，例如，USP 5,876,969和USP 7,056,701)。
在由本公开涵盖的HSA-药物分子缀合物中，可使用白蛋白的各种形式，诸如白蛋白分泌前序列及其变体、其片段和变体以及HSA变体。此类形式通常具有一个或多个所需的白蛋白活性。在另外的实施方案中，本公开包括包含直接或间接地与白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等融合的多肽药物分子的融合蛋白，其中融合蛋白具有比未融合的药物分子更高的血浆稳定性和/或融合蛋白保留未融合的药物分子的治疗活性。在一些实施方案中，间接融合通过接头，诸如肽接头或其经修饰的形式来实现。
细胞内裂解可通过例如弗林蛋白酶或胱天蛋白酶来酶促进行。细胞表达低水平的这些内源酶，内源酶能够分子内裂解融合分子的部分；因此，一些多肽从细胞分泌而未缀合于HSA，然而一些多肽以包含HSA的融合分子形式分泌。本公开的实施方案涵盖各种弗林蛋白酶融合构建体的用途。例如，可设计包含序列RGRR、RKRKKR、RKKR或RRRKKR的构建体。
本公开还涵盖籍以将融合分子从细胞分泌，经历纯化，随后裂解的细胞外裂解(即，离体裂解)。应理解，切除可将完整的HSA-接头复合物或不太完整的HSA-接头复合物与成熟IL-10分离。
正如上文所暗示，白蛋白与本公开的一种或多种多肽的融合可以例如通过基因操作(以便将编码HSA或其片段的核酸联接于编码一个或多个多肽序列的核酸)来实现。随后，用融合的核苷酸序列以例如适当的质粒的形式转化或转染适当的宿主，以表达融合多肽。可在体外从例如原核或真核细胞，或在体内从例如转基因生物体实现表达。在本公开的一些实施方案中，在哺乳动物细胞系例如CHO细胞系中进行融合蛋白的表达。转化在本文中被广泛地用于指因通过细胞膜的直接吸收、外源遗传物质(外源核酸)的整合和表达而产生的细胞的遗传改变。转化在细菌的一些种中天然发生，但其还可通过人工方法在其它细胞中实现。
此外，白蛋白本身可被修饰来延长其循环半衰期。经修饰的白蛋白与IL-10的融合可通过上述基因操作技术或通过化学缀合来实现；所得的融合分子具有超过与未修饰的白蛋白的融合物的半衰期的半衰期(参见WO2011/051489)。
替代的白蛋白结合策略：几个白蛋白结合策略已被开发来作为对直接融合的替代方案，包括通过缀合的脂肪酸链(酰化)的白蛋白结合。因为血清白蛋白是脂肪酸的运输蛋白，因此这些具有白蛋白结合活性的天然配体已被用于小蛋白质治疗剂的半衰期延长。例如，地特胰岛素(insulin determir)(LEVEMIR)，一种用于糖尿病的批准产品，包含缀合于经遗传修饰的胰岛素的肉豆蔻基链，从而产生长效胰岛素类似物。
本公开还涵盖包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和本文中描述的多肽的一个或多个的序列的融合蛋白。文献中描述的任何ABD多肽序列可以是融合蛋白的组分。可任选地通过接头诸如本文所述的那些接头共价键合融合蛋白的组分。在本公开的一些实施方案中，融合蛋白包含ABD多肽序列作为N端部分以及本文所述的多肽作为C端部分。
本公开还涵盖包含白蛋白结合多肽的片段的融合蛋白，该片段基本上保留白蛋白结合；或包含至少两个白蛋白结合多肽或它们的片段(作为单体单位)的白蛋白结合多肽或它们的片段的多聚体。关于ABD及相关技术的一般论述，参见WO 2012/050923、WO 2012/050930、WO 2012/004384和WO 2009/016043。
与其它分子的缀合：用于缀合的另外的适当的组分和分子包括，例如，甲状腺球蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；聚氨基酸诸如聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸)；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血凝素、流感病毒核蛋白；匙孔血蓝蛋白(KLH)；和乙型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或前述分子的任意组合。
因此，本公开涵盖一种或多种另外的组分或分子在多肽序列诸如另一种多肽(例如，具有与主题多肽异源的氨基酸序列的多肽)或载体分子的N和/或C端上的缀合。因此，可将示例性多肽序列提供为与另一种组分或分子的缀合物。
缀合物修饰可导致保留活性，具有来源于又一个分子的另外的或互补的功能或活性的多肽序列。例如，可将多肽序列缀合于分子，例如以增加溶解度、贮藏、体内或货架半衰期或稳定性、免疫原性的减弱、延缓或受控的体内释放等。其它功能或活性包括相对于未缀合的多肽序列减弱毒性的缀合物、比未缀合的多肽序列更高效地靶向一种类型的细胞或器官的缀合物，或进一步抵消与如本文中所示的疾病、病症或病状(例如，癌症)相关的病因或作用的药物。
还可将IL-10多肽缀合于大的缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质；多糖诸如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素或纤维素珠；聚合氨基酸诸如聚谷氨酸，或多聚赖氨酸；氨基酸共聚物；灭活的病毒颗粒；灭活的细菌毒素诸如来自白喉、破伤风、霍乱的类毒素或白细胞毒素分子；灭活的细菌；和树突细胞。如果需要，此类缀合形式可用于产生针对本公开的多肽的抗体。
用于缀合的另外的候选组分和分子包括适合用于分离或纯化的那些组分和分子。特定非限定性实例包括结合分子，诸如生物素(生物素-亲和素蛋白特异性结合对)、抗体、受体、配体、外源凝集素或包含固体载体的分子，包括，例如，塑料或聚苯乙烯珠粒、平板或珠粒、磁珠、测试条和膜。
纯化方法诸如阳离子交换色谱可用于通过电荷差异分离缀合物，该方法有效地将缀合物分离成它们的各种分子量。例如，可加载阳离子交换柱，随后用可～20mM醋酸钠pH～4洗涤，随后用在pH约3至5.5，例如在pH～4.5缓冲的线性(0M至0.5M)NaCl梯度洗脱。通过阳离子交换色谱获得的级分的含量可使用常规方法(例如，质谱、SDS-PAGE或用于根据分子量分离分子实体的其它已知方法)通过分子量来鉴定。
Fc-融合分子：在某些实施方案中，可将本公开的多肽序列的氨基或羧基端与免疫球蛋白Fc区(例如，人Fc)融合以形成融合缀合物(或融合分子)。已显示Fc融合缀合物增加生物药剂的全身性半衰期，因此生物药剂产品可以需要较低频率的施用。Fc在沿血管排列的内皮细胞中结合新生Fc受体(FcRn)，并且在结合后，Fc融合分子被保护而免受降解，并被再释放至循环中，从而使分子在循环中保持更长时间。该Fc结合据信是内源IgG籍以保持其长血浆半衰期的机制。最近，Fc-融合技术将单拷贝的生物药剂与抗体的Fc区连接，以相较于传统Fc-融合缀合物使生物药剂的药代动力学和药效学性质最优化。适合与本文中公开的多肽一起使用的其它Fc相关技术的实例描述于WO 2013/113008中。
其它修饰：本公开涵盖对IL-10使用目前已知的或将来开发的其它修饰，以改善一个或多个性质。用于延长本公开的多肽的循环半衰期、增强其稳定性、减小其清除率或改变其免疫原性或变应原性的一个这样的方法包括通过羟乙基淀粉化修饰多肽序列，该修饰使用连接于其它分子的羟乙基淀粉衍生物以修饰多肽序列的特征。羟乙基淀粉化的各个方面描述于例如美国专利申请第2007/0134197和2006/0258607号。
本公开还涵盖包含SUMO(作为融合标签)(LifeSensors,Inc.；Malvern,PA)的融合分子。本文所述的多肽与SUMO的融合可表现出几个有益效应，包括表达的增加、溶解度的改善和/或纯化法的开发的辅助作用。SUMO蛋白酶识别SUMO的三级结构，并在SUMO的C端裂解融合蛋白，从而释放本文所述的具有所需N端氨基酸的多肽。
接头：已在上文中描述了接头和它们的用途。用于修饰本公开的多肽序列的任何前述组分和分子可任选地通过接头缀合。适当的接头包括“柔性接头”，其通常具有足够的长度来允许经修饰的多肽序列与连接的组分和分子之间存在一定的活动。接头分子的长度通常为约6-50个原子。接头分子还可以是例如芳基乙炔、含有2-10个单体单位的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。适当的接头可被容易地选择，并且可具有任何适当的长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或超过50个氨基酸。
示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如，(GS)n、GSGGSn、GGGSn、(GmSo)n、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n、(GSGGSm)n、(GSGSmG)n和(GGGSm)n及其组合，其中m以及以及o各自独立地选自至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对地是无结构的，从而可用作组分之间的中性系链。示例性柔性接头包括，但不限于GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG、GGGSG和GSSSG。
治疗性和预防性用途
本公开涵盖本文所述的IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)在治疗或预防广泛的疾病、病症或病状和/或其症状中的用途。事实上，本公开的教导意欲用于对于其获得或维持上述IL-10平均血清谷浓度参数可以是有益的任何疾病、病症或病状。虽然在下文中详细地描述了特定用途，但应理解，本公开不受这样的限制。此外，虽然在下文中显示了特定疾病、病症和病状的一般分类，但一些疾病、病症和病状可以是不止一个分类(例如，癌症相关病症和纤维化相关病症)的成员，并且其它疾病可以不是任何公开的分类的成员。
纤维化病症和癌症。根据本公开，可将IL-10(例如，PEG-IL-10)用于治疗或预防增殖性病状或病症，包括癌症(例如，子宫、宫颈、乳腺、前列腺、睾丸、胃肠道(例如，食道、口咽、胃、小肠或大肠、结肠或直肠的癌症)、肾、肾细胞、膀胱、骨、骨髓、皮肤、头或颈、皮肤、肝脏、胆囊、心脏、肺、胰腺、唾液腺、肾上腺、甲状腺、脑(例如，神经胶质瘤)、神经节、中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)的癌症，以及造血系统和免疫系统(例如，脾或胸腺)的癌症)。本公开还提供了治疗或预防其它癌症相关疾病、病症或病状的方法，所述疾病包括，例如，免疫原性肿瘤、非免疫原性肿瘤、休眠肿瘤、病毒诱导的癌症(例如，上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌和乳头瘤病毒)、腺癌、淋巴瘤、癌、黑色素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎瘤、化学诱导的癌症、转移和血管生成。本公开涵盖例如，通过调节调节性T细胞和/或CD8+T细胞的活性来降低对肿瘤细胞或癌细胞抗原的耐受性(参见，例如，Ramirez-Montagut，等(2003)Oncogene22:3180-3187；和Sawaya，等(2003)New Engl.J.Med.349:1501-1509)。在特定实施方案中，肿瘤或癌症是结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、胶质母细胞瘤或白血病。术语癌症相关的疾病、病症和病状的使用旨在广义地指与癌症直接或间接相关的病状，并包括例如血管生成和癌前病状诸如发育不良。
在一些实施方案中，本公开提供了利用IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)和至少一种另外的治疗剂或诊断剂(其实例示于本文中的其它地方)治疗增殖性病状、癌症、肿瘤或癌变前病状的方法。
本公开还提供了治疗或预防纤维化疾病、病症和病状的方法。如本文中所用，短语“纤维化疾病、病症和病状”和类似术语(例如，“纤维化病症”)和短语，将被广泛解释，以便其包括可导致纤维化组织或瘢痕组织的形成(例如，一个或多个组织中的纤维化)的任何病状。例如，可产生瘢痕组织的损伤(例如，创伤)包括对皮肤、眼、肺、肾、肝、中枢神经系统和心血管系统的创伤。短语还包括因中风而导致的瘢痕组织形成和例如作为损伤或手术的结果的组织粘连。
如本文中所用，术语“纤维化”是指作为修复或反应过程而非作为器官或组织的正常成分的纤维组织的形成。纤维化的特征在于任何特定组织中的成纤维细胞的积累和超过正常沉积的胶原沉积。
纤维化病症包括，但不限于，从伤口愈合产生的纤维化、全身性和局部硬皮病、动脉粥样硬化、再狭窄、肺的炎症和纤维变性、特发性肺纤维化、间质性肺病、肝硬化、因慢性乙型或丙型肝炎病毒感染、肾病(例如，肾小球肾炎)而导致的纤维化、因瘢痕组织而导致的心脏疾病、瘢痕疙瘩和肥大性疤痕和眼病诸如黄斑变性以及视网膜和玻璃体视网膜病变。其它纤维化疾病包括化疗药物引起的纤维化、辐射诱发的纤维化以及损伤和烧伤。
纤维化病症通常是肝相关的，且在此类病症与肝细胞内的肝脏胆固醇和甘油三酯的不恰当积累之间频繁地存在联系。这种积累似乎造成导致肝纤维化和肝硬化的促炎性反应。具有纤维化成分的肝病症包括非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
心血管疾病。本公开还涵盖本文所述的IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)用于治疗和/或预防某些心血管相关疾病和或相关的代谢相关疾病、病症和病状以及与其相关的病症的用途。
如本文中所用，术语“心血管疾病”、“心脏病”等是指影响心血管系统的任何疾病，主要地心脏病、脑和肾的血管疾病和外周动脉病。心血管疾病是包括冠心病(即，缺血性心脏病或冠状动脉疾病)、动脉粥样硬化、心肌病、高血压、高血压性心脏疾病、肺心病、心脏节律紊乱、心内膜炎，脑血管疾病和外周动脉疾病的一系列疾病。心血管疾病是世界上死亡的主要原因，虽然其通常影响老年人，但心血管疾病的前因，尤其是动脉粥样硬化，始于生命早期。
本公开的特定实施方案涉及IL-10多肽用于治疗和/或预防动脉粥样硬化(其中作为脂肪物质诸如胆固醇和甘油三酯的积累的结果，动脉壁变厚以形成斑块的一种慢性病状)的用途。动脉粥样硬化通常包括动脉壁中的慢性炎性反应，该炎性反应主要由巨噬细胞的积累引起和由低密度脂蛋白(LDL)促进(未能通过功能性高密度脂蛋白从巨噬细胞充分除去脂肪和胆固醇)。慢性扩大的动脉粥样硬化病变可引起管腔的完全封闭，这可仅当管腔狭窄如此严重以至于对下游组织的血液供应不足，从而导致局部缺血时表现出来。
IL-10多肽在胆固醇相关病症的治疗和/或预防中可以是特别有利的，该多肽可与例如心血管疾病(例如动脉粥样硬化)、脑血管疾病(例如，中风)和外周血管疾病相关联。例如，但不限于，IL-10多肽可用于降低受试者的血液胆固醇水平。在确定受试者是否具有高胆固醇血症中，正常与异常胆固醇水平之间不存在明确界限，并且需要作出与其它健康状况和风险因子相关的值的解释。虽然如此，但在美国通常使用下列指导方针：总胆固醇<200mg/dL是期望的，200-239mg/dL是临界高的，且≥240mg/dL是高的。较高的总胆固醇水平增加患心血管疾病的风险，并且LDL或非-HDL胆固醇的水平都预示将来的冠心病。当评估高胆固醇血症时，通常有用地测量所有脂蛋白亚级分(VLDL、IDL、LDL和HDL)。具体治疗目标是减少LDL同时维持或增加HDL。
血栓形成和血栓形成病状。
血栓形成，导致血液通过循环系统的流动的阻塞的血栓(血块)在血管内的形成，可因下列方面(菲尔绍三要素(Virchow's triad))的一个或多个方面的异常造成：高凝性或增加的血液凝固、血管内皮细胞损伤或扰乱的血流(淤滞、湍流)。
血栓形成通常被分类为静脉或动脉血栓形成，其每一种可呈现几个亚型。静脉血栓形成包括深静脉血栓形成(DVT)、门静脉血栓形成、肾静脉血栓形成、颈内静脉血栓形成、布加综合征(Budd-Chiari syndrome)，佩吉特施罗特疾病(Paget-Schroetter disease)和脑静脉窦血栓形成。动脉血栓形成包括中风和心肌梗死。
本公开涵盖其它疾病、病症和病状，包括心房血栓形成和真性红细胞增多症(也称为红斑、原发性红细胞增多症和真性红细胞增多症)，其中骨髓产生太多RBC、WBC和/或血小板的骨髓增殖性血液病症。
免疫病症和炎性病状。如本文中所用，术语诸如“免疫疾病”、“免疫病状”、“免疫病症”、“炎性疾病”、“炎性病状”、“炎性病症”等意在广义地包括任何免疫或炎性相关病状(例如，病理性炎症和自身免疫性疾病)。此类病状通常不可避免地与其它疾病，病症和病状交织在一起。例如，“免疫病状”可指增殖性病状，诸如癌症、肿瘤和血管生成，包括感染(急性和慢性)、肿瘤和抵抗被免疫系统根除的癌症。
可以例如由炎性细胞因子引起的免疫和炎性相关疾病、病症和病状的非限制性列表包括关节炎、肾功能衰竭、狼疮、哮喘、银屑病、结肠炎、胰腺炎、过敏、纤维化、手术并发症(例如，其中炎性细胞因子阻止愈合)、贫血和纤维肌痛。可与慢性炎症相关的其它疾病和病症包括阿尔茨海默病、充血性心脏衰竭、中风、主动脉瓣狭窄、动脉粥样硬化、骨质疏松症、帕金森氏病(Parkinson's disease)、感染、炎性肠病(例如，克罗恩病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎)，过敏性接触性皮炎和其它湿疹、系统性硬化、移植和多发性硬化。
IL-10(例如，PEG-IL-10)对于其可以是特别有效(归因于例如目前的疗法的限制)的上述疾病、病症和病状的一些在下文中进行了更详细描述。
本公开的IL-10多肽在治疗和预防炎性肠病(IBD)中可以是特别有效的。IBD包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，这两者都是可影响胃肠道的任何部分，并与许多不良反应相关联的慢性特发性疾病，并且具有长期UC的患者处于增加的发展结肠癌的风险中。当前的IBD治疗旨在控制炎性症状，虽然某些药剂(例如，皮质类固醇、氨基水杨酸盐和标准免疫抑制剂(例如，环孢菌素、硫唑嘌呤和甲氨蝶呤))已获得了有限的成功，但长期治疗可能引起肝损害(例如，纤维化或肝硬化)和骨髓抑制，而且患者常常变得不顺从此类治疗。
银屑病(一系列常见的免疫介导的慢性皮肤病)在美国影响超过450万人，其中150万人被认为具有该疾病的中度至严重形式。此外，超过10％的银屑病患者发展银屑病关节炎，该疾病损害骨和关节周围的结缔组织。银屑病的潜在生理学的改善的理解已导致药剂的引入，所述药剂例如靶向负责该疾病的炎性性质的T淋巴细胞和细胞因子的活性。此类药剂包括TNF-α抑制剂(也用于类风湿性关节炎(RA)的治疗中)，包括ENBREL(依那西普)、REMICADE(英夫利昔单抗)和HUMIRA(阿达木单抗))，和T-细胞抑制剂诸如AMEVIVE(阿法赛特(alefacept))和RAPTIVA(依法利珠单抗)。虽然这些药剂中的几种在某些患者人群中在一定程度上是有效的，但未显示有效地治疗所有患者。
类风湿关节炎(RA)，其特征通常在于关节的膜衬里(滑膜)的慢性炎症，影响约1％的美国人口，或美国的210万人口。对细胞因子包括TNF-α和IL-1在炎性过程中的作用的进一步认识已使得能够开发和引入一类新的改变病情的抗风湿药(DMARD)。药剂(其中一些与RA的治疗方式重叠)包括ENBREL(依那西普)、REMICADE(英夫利昔单抗)、HUMIRA(阿达木单抗)和KINERET(阿那白滞素)。尽管这些药剂中的一些缓解症状，抑制结构损伤的进展，和改善特定患者群的身体功能，仍然需要具有改善的功效、互补作用机制和更少/较少严重不利作用的替代药剂。
患有多发性硬化(MS)(在脑和脊髓中包含多个区域的炎症和髓鞘瘢痕的严重衰弱性自身免疫性疾病)的受试者可特别地借助本文所述的IL-10多肽来帮助，因为目前的治疗仅缓解症状或延迟失能的进展。
类似地，IL-10多肽对于患有神经变性病症的受试者是特别有利的，神经变性病症是诸如阿尔茨海默病(AD)、严重地损害了患者的思想、记忆和语言处理的大脑病症和帕金森氏病(PD)(一种特征在于例如，异常运动、僵硬和震颤的CNS的进行性病症)。这些病症是进行性的和使人虚弱的，并且没有治疗药物可用。
病毒性疾病。人们日益对IL-10在病毒性疾病中的作用感兴趣。已假定IL-10，取决其受体结合活性，产生刺激和抑制作用。
例如，已考虑抑制IL-10功能以增强抗病毒免疫和疫苗功效的效果(见Wilson,E.,(2011)Curr Top Microbiol Immunol.350:39–65)。此外，已对IL-10在人免疫缺陷病毒(HIV)功能中的作用进行了研究。除了人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)复制的抑制以外，IL-10还可通过效应子免疫机制的失活来促进病毒保持(Naicker,D.,等，(2009)J InfectDis.200(3):448-452)。另一研究已鉴定了一个亚组的能够在慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染中调节T细胞免疫的IL-10生成性B细胞。
虽然上述的研究表明，IL-10抑制可以是有益的，包含CD8+ T细胞组分的特定病毒感染可以是通过施用IL-10来治疗和/或预防的候选者。这受到IL-10通过调节性T细胞和/或CD8+ T细胞的调节在某些癌症中起的积极作用的支持。
本公开涵盖IL-10多肽在治疗和/或预防对于其利用IL-10的治疗可以是有益的任何病毒性疾病、病症或病状中的用途。所涵盖的病毒性疾病、病症和病状的实例包括乙型肝炎、丙型肝炎、HIV、疱疹病毒和巨细胞病毒(CMV)。
药物组合物
本公开的IL-10多肽可呈适于向受试者施用的组合物的形式。一般地，此类组合物是包含IL-10和一种或多种药学上可接受的或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的“药物组合物”。在某些实施方案中，IL-10多肽以治疗可接受的量存在。药物组合物可用于本公开的方法中；因此，例如，可向受试者离体或体内施用药物组合物以实践本文所述的治疗性和预防性方法以及用途。
本公开的药物组合物可被配制以与期望的施用方法或途径相容；本文中显示了示例性施用途径。此外，可将该药物组合物与本文所述的其它治疗活性剂或化合物组合使用，以治疗或预防如本公开涵盖的疾病、病症和病状。
药物组合物通常包含治疗有效量的本公开所涵盖的IL-10多肽和一种或多种药学上和生理学上可接受的配制剂。合适的药学上可接受的或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括，但不限于，抗氧化剂(例如，抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如，苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填料、增量剂、去垢剂、缓冲剂、媒介物、稀释剂和/或佐剂。例如，合适的媒介物可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，可能补充有在用于肠胃外施用的药物组合物中常见的其它材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。本领域普通技术人员将容易认识可用于本文中所涵盖的药物组合物和剂型的多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括，但不限于，药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。作为实例，缓冲组分可以是水溶性物质，诸如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸及其盐。可接受的缓冲剂包括，例如，Tris缓冲剂、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。
在药物组合物已被配制后，可将其作为溶液剂、混悬剂、凝胶、乳剂、固体或脱水或冻干的粉末贮存在无菌小瓶中。可将此类制剂以随时可用的形式、需要在使用前复溶的冻干形式、需要在使用前稀释的液体形式或其它可接受的形式贮存。在一些实施方案中，在一次性使用的容器(例如，一次性使用的小瓶、安瓿、注射器或自动注射器(类似地，例如，))中提供药物组合物，而在其它实施方案中提供多次使用的容器(例如，多次使用的小瓶)。任何药物递送装置可用于递送IL-10，包括植入物(例如，可植入的泵)和导管系统、缓慢注射泵和设备，对于本领域普通技术人员而言所有这些装置都是公知的。通常被皮下或肌内施用的储库注射剂也可用于在一段确定的时间释放本文中公开的多肽。储库注射剂通常是固基或油基的，并且通常包含本文中所示的制剂组分中的至少一种组分。本领域普通技术人员是熟悉储库注射剂的可能制剂和使用。
药物组合物可呈无菌注射水性或油性混悬剂形式。可使用那些适当的分散或湿润剂以及本文中提及的助悬剂按照已知的技术配制该混悬剂。无菌可注射制剂还可以是无毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬剂，如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水、林格氏溶液(Ringer's solution)、等渗氯化钠溶液、聚氧乙稀蓖麻油(Cremophor ELTM)(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物。另外，无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸诸如油酸可用于可注射制剂。特定的可注射制剂的延长吸收可通过包含延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝或明胶)来实现。
含有活性成分的药物组合物可呈适合于口服使用的形式，例如作为片剂、胶囊、糖锭、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散粉末或粒剂、乳剂、硬或软胶囊或糖浆剂、溶液剂、微珠或酏剂。意欲用于口服使用的药物组合物可以根据本领域已知的用于药物组合物的制备的任何方法来制备，并且此类组合物可含有一种或多种试剂，诸如，例如，甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂以提供药学上美观和可口的制剂。片剂、胶囊等含有与适于片剂生产的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是，例如，稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化剂和崩解剂，例如，玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉，明胶或阿拉伯胶，和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
可以通过已知技术对适合于口服施用的片剂、胶囊等进行不包衣或包衣以在胃肠道中延迟崩解和吸收，从而提供持续作用。例如，延时物质诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯均可被采用。还可通过本领域中已知的技术对它们进行包衣以形成用于控释的渗透性治疗片剂。另外的试剂包括可生物降解的或生物相容性颗粒或聚合物物质，诸如聚酯、聚胺酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物，以控制所施用的组合物的递送。例如，可通过分别使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，将口服剂封装在通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，或封装在胶体药物递送系统中。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球体、微珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用于制备上述制剂的方法对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
口服使用的制剂还可呈现为硬明胶胶囊，其中将活性成分与惰性固体稀释剂例如，碳酸钙、磷酸钙、高岭土或微晶纤维素混合，或呈现为软明胶胶囊，其中将活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
水性混悬剂含有与适于其制造的赋形剂混合的活性物质。此类赋形剂可以是助悬剂，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，或烯烃氧化物与脂肪酸(例如，聚氧-乙烯硬脂酸酯)的缩合产物，或环氧乙烷与长链脂族醇(例如，对于十七亚乙基氧基鲸蜡醇)的缩合产物，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯(例如，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)的缩合产物，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯(例如，聚山梨糖醇单油酸酯)的缩合产物。水性混悬剂还可含有一种或多种防腐剂
油性混悬剂可通过将活性成分悬浮在植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中来配制，或矿物油诸如液体石蜡中来配制。油性混悬剂可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可添加甜味剂(诸如上文所示的那些甜味剂)和调味剂以提供可口的口服制剂。
适合于通过添加水来制备水性混悬剂的分散粉末和颗粒提供与分散剂或润湿剂、助悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。本文中举例说明了适当的分散剂或润湿剂和助悬剂。
公开的药物组合物还可呈水包油乳剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡，或这些油类的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如，阿拉伯树胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如，大豆，卵磷脂和酯或衍生自脂肪酸的偏酯；己糖醇酐，例如，山梨醇单油酸酯；和偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯。
制剂还可包括载体以保护组合物免于快速降解或从体内消除，诸如控释制剂，包括植入物、脂质体、水凝胶、前药和微胶囊递送系统。例如，可使用单独的或与蜡组合的延时物质诸如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
本公开涵盖以栓剂形式用于直肠施用的IL-10多肽的施用。栓剂可通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，并因此将在直肠中融化以释放药物。此类物质包括，但不限于，可可脂和聚乙二醇。
本公开涵盖的IL-10多肽呈目前已知的或将来开发的任何其它合适的药物组合物的形式(例如，用于经鼻或吸入使用的喷雾剂)。
多肽或其片段在制剂中的浓度可广泛变化(例如，按重量计从小于约0.1％，通常为约2％或至少约2％至高达20％至50％或更多)，并且通常按照例如选定的具体施用模式，主要基于流体体积、粘度和基于主题的因素来选择。
施用途径
本公开涵盖IL-10及其组合物以任何适当的方式进行的施用。适当的施用途径包括肠胃外(例如，肌内，静脉内，皮下(例如，注射或植入)，腹膜内，脑池内，关节内，腹膜内，脑内(实质内)和脑室内)，口服，鼻，阴道，舌下，眼，直肠，局部(例如，经皮)，舌下和吸入。通常皮下或肌内施用的储库注射剂也可用于在一段确定的时间内释放本文中公开的IL-10多肽。
本公开的特定实施方案涵盖肠胃外施用，并且在其它特定实施方案中，肠胃外施用是皮下施用。
联合治疗
本公开涵盖与一种或多种活性治疗剂(例如，细胞因子)或其它预防或治疗方式(例如，辐照)组合的IL-10(例如，PEG-IL-10)的用途。在此类联合治疗中，各种活性剂通常具有不同作用机制。此类联合治疗可以是特别有利的，因为其允许一种或多种药剂的剂量减少，从而减少或消除了与一种或多种药剂相关的不利影响；此外，此类联合治疗可对潜在疾病、病症或病状具有协同治疗或预防效果。
如本文中所用，“组合”意在包括可被单独施用的，例如，被分别配制用于单独施用的(例如，如可在药盒中提供的)的疗法，以及可在单一制剂(即，“共制剂”)中被一起施用的疗法。
在某些实施方案中，相继施用或应用IL-10多肽，例如，其中在一种或多种其它药剂之前施用一种药剂。在其它实施方案中，同时施用IL-10多肽，例如，其中在相同时间或大致相同时间施用两种或更多种药剂；两种或更多种药剂可以存在于两个或更多个单独的制剂中或被组合成单一制剂(即，共制剂)。无论两种或更多种药剂被相继施用还是被同时施用，出于本公开的目的，它们都被认为是组合施用。
可在环境下以任何适当的方式将本公开的IL-10多肽与一种或多种其它(活性)剂组合使用。在一个实施方案中，将利用本公开的至少一种活性剂和至少一种IL-10多肽的治疗维持一段时间。在另一个实施方案中，减少或中断利用至少一种活性剂的治疗(例如，当受试者稳定时)，同时以恒定给药方案维持利用本公开的IL-10多肽的治疗。在进一步的实施方案中，减少或中断利用至少一种活性剂的治疗(例如，当受试者稳定时)，同时减少利用本公开的IL-10多肽的治疗(例如，较低剂量、较低频率的给药或较短的治疗方案)。在另一个实施方案中，减少或中断利用至少一种活性剂的治疗(例如，当受试者稳定时)中，并增加利用本公开的IL-10多肽的治疗(例如，更高剂量，更频繁的给药或更长的治疗方案)。在另一个实施方案中，维持利用至少一种活性剂的治疗并且减少或中断利用本公开的IL-10多肽的治疗(例如，较低剂量，较低频率的给药或较短的治疗方案)。在另一个实施方案中，减少或中断利用至少一种活性剂的治疗和利用本公开的IL-10多肽的治疗(例如，较低剂量，较低频率的给药或更短的治疗方案)。
纤维化病症和癌症。本公开提供了利用IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)和至少一种另外的治疗剂或诊断剂治疗和/或预防增殖性病状、癌症、肿瘤或癌变前疾病、病症或病状的方法。
化学治疗剂的实例包括，但不限于，烷化剂诸如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶诸如苯佐替派、卡波醌、美妥替派和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲基密胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基密胺；氮芥，诸如丁酸氮芥、萘氮芥、氯代环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，诸如阿克法拉霉素、放线菌素、安曲霉素、氮杂丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，诸如鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；百托布(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)、得福安(defofamine)；脱碳秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌；艾福敏(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖(nitracrine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；雷佐生；西佐喃；螺环锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶(gacytosine)；阿糖胞苷(Ara-C)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类、例如紫杉醇和多西紫杉醇；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂和铂配合物诸如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸钠；CPT11；拓扑异构酶抑制剂；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨；和上述任何药物的药学上可接受的盐，酸或衍生物。
化学治疗剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素剂，包括例如，三苯氧胺、雷洛昔芬、芳香化酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬、奥那司酮和托瑞米芬；以及抗雄激素剂，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，联合治疗包括激素或相关的激素剂的施用。
可与IL-10多肽组合使用的另外的治疗方式包括细胞因子或细胞因子拮抗剂诸如IL-12、INFα或抗-表皮生长因子受体、放射疗法、针对另一种肿瘤抗原的单克隆抗体、单克隆抗体与毒素的复合物、T细胞佐剂、骨髓移植或抗原呈递细胞(例如，树突细胞疗法)。本文中还提供了疫苗(例如，以可溶性蛋白的形式或以编码蛋白的核酸的形式)。
心血管疾病。本公开提供了利用IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)和至少一种另外的治疗剂或诊断剂治疗和/或预防某些心血管和/或代谢相关疾病、病症和病状以及与其相关的病症的方法。
在用于高胆固醇血症(和从而常见地动脉粥样硬化)的治疗的联合治疗中有用的治疗剂的实例包括抑制酶促合成胆固醇的他汀类(例如，CRESTOR、LESCOL、LIPITOR、MEVACOR、PRAVACOL和ZOCOR)；隔离胆固醇并阻止其吸收的胆汁酸树脂(例如，COLESTID、LO-CHOLEST、PREVALITE、QUESTRAN和WELCHOL)；阻断胆固醇吸收的依泽替米贝(ZETIA)；降低甘油三酯并且可稍微增加HDL的纤维酸(例如，TRICOR)；适度降低LDL胆固醇和甘油三酯的烟酸(例如，NIACOR)；和/或上述的组合(例如，VYTORIN(依泽替米贝与辛伐他汀)。可以是用于与本文所述的IL-10多肽组合使用的候选者的替代胆固醇治疗包括各种补充剂和草药(例如，大蒜、甘蔗原素(policosanol)和穆库尔没药(guggul))。本公开包括上述任何药剂的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
免疫病症和炎性病症。本公开提供了用于利用IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)和至少一种另外的治疗剂或诊断剂治疗和/或预防免疫和/或炎性相关疾病、病症和病状以及与其相关的病症的方法。
用于联合治疗的治疗剂的实例包括，但不限于下列药剂：非类固醇抗炎药(NSAID)诸如阿司匹林，布洛芬和其它丙酸衍生物(阿明洛芬、苯恶洛芬、布氯酸、卡洛芬、芬布芬、非诺洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、吲哚洛芬、酮洛芬、咪洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡洛芬、普拉洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸和硫恶洛芬(tioxaprofen))、乙酸衍生物(吲哚美辛、阿西美辛、阿氯芬酸、环氯茚酸、双氯芬酸、芬氯酸、芬克洛酸、芬替、呋洛芬酸、异丁苯乙酸、伊索克酸、欧比那酸(oxpinac)、舒林酸、硫平酸、托美丁、齐多美辛、和佐美酸)、芬那酸衍生物(氟芬那酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟酸和托芬那酸)、联苯羧酸衍生物(二氟尼柳和氟苯)、昔康类(伊索昔康、吡罗昔康、舒多昔康和替诺昔康)、水杨酸类(乙酰水杨酸、柳氮磺吡啶)和吡唑啉酮类(阿扎丙宗、贝比派瑞(bezpiperylon)、非普拉宗、莫非布宗、羟布宗、保泰松)。其它组合包括环氧合酶-2(COX-2)抑制剂。
用于组合的其它活性剂包括类固醇诸如泼尼松龙、泼尼松、甲泼尼龙、倍他米松、地塞米松或氢化可的松。此类组合可以是特别有利的，因为当与本发明的IL-10多肽组合治疗患者时，类固醇的一个或多个副作用可通过逐渐减少所需的类固醇剂量而得以减小或甚至消除。
用于联合治疗例如类风湿性关节炎的活性剂的另外的实例包括细胞因子抑制性抗炎药(CSAID)；针对其它人细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1β.、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF的抗体或拮抗剂。
活性剂的特定组合可在自身免疫和后续炎性级联中的不同点进行干扰，并且包括TNF拮抗剂如嵌合、人源化或人TNF抗体、REMICADE、抗TNF抗体片段(例如，CDP870)和可溶性p55或p75TNF受体、其衍生物、p75TNFRIgG(ENBREL)或p55TNFR1gG(LENERCEPT)、可溶性IL-13受体(sIL-13)，以及还有TNFα转化酶(TACE)抑制剂；类似地，IL-1抑制剂(例如，白细胞介素-1转换酶抑制剂)可以是有效的。其它组合包括白细胞介素11，抗P7和p-选择素糖蛋白配体(PSGL)。用于与本文所述的IL-10多肽组合的药剂的其它实例包括干扰素β1a(AVONEX)；干扰素β1b(BETASERON)；克帕松；高压氧；静脉内注射免疫球蛋白；克拉屈滨(clabribine)；和针对其它人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂(例如，针对CD40配体和CD80的抗体)。
本公开包括任何上述药剂的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
病毒性疾病。本公开提供用于利用IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)与至少一种另外的治疗剂或诊断剂(例如，一种或多种其它抗病毒剂和/或一种或多种其它非病毒药剂)治疗和/或预防病毒性疾病、病症和病状以及与其相关的病症的方法。
此类联合治疗包括靶向各种病毒生命周期阶段并且具有不同作用机制的抗病毒剂，包括，但不限于下列药剂：病毒脱壳的抑制剂(例如，金刚烷胺和金刚乙胺)；逆转录酶抑制剂(例如，阿昔洛韦、齐多夫定和拉米夫定)；靶向整合酶的药剂；阻止转录因子至病毒DNA的附着的药剂；影响翻译的药剂(例如，反义分子)(例如，福米韦生)；调节翻译/核酶功能的药剂；蛋白酶抑制剂；病毒组装调节剂(例如，利福平)；和阻止病毒颗粒释放的药剂(例如，扎那米韦和奥司他韦)。某些病毒感染(例如，HIV)的治疗和/或预防通常需要一组(“混合物(cocktail)”)抗病毒剂。
设想与IL-10多肽组合使用的其它抗病毒剂包括，但不限于，下列药剂：阿巴卡韦、阿德福韦、金刚胺、安普那韦、安普利近、阿比朵尔、阿扎那韦、立普妥(atripla)、boceprevirertet、西多福韦、可比韦(combivir)、达芦那韦、地拉韦啶、去羟肌苷、二十二醇、依度尿苷、依非韦伦、恩曲他滨、恩夫韦地、恩替卡韦、泛昔洛韦、福沙那韦、膦甲酸钠、膦乙酸钠(fosfonet)、更昔洛韦、伊巴他滨、异丙肌苷(imunovir)、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、各种干扰素(例如、聚乙二醇干扰素α-2a)、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗、吗啉胍、美替沙腙、奈非那韦、奈韦拉平、蕾莎瓦(nexavir)、喷昔洛韦、帕拉米韦、普来康那利、鬼臼毒素、雷特格韦、利巴韦林、利托那韦、嘧啶、沙奎那韦、司他夫定、特拉匹韦、替诺福韦、替拉那韦、三氟尿苷(trifluridine)、三协唯(trizivir)、醋胺金刚烷、特鲁瓦达、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、维克韦罗(vicriviroc)、阿糖腺苷、塔利韦林(viramidine)和扎西他滨。
本公开包括上述药剂的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
给药
可以以一定量向受试者施用本公开的IL-10多肽，施用量取决于例如施用目的(例如，所需的消退的程度)；将对其施用制剂的受试者的年龄、体重、性别和健康及身体状况；施用途径；和疾病、病症、病状或其症状的性质。给药方案可能还要考虑与待施用的药剂相关的任何不利作用的存在、性质和程度。有效剂量的量和剂量方案可从例如安全性和剂量-递增试验、体内研究(例如，动物模型)以及本领域普通技术人员已知的其它方法来容易地确定。
本公开涵盖施用IL-10以获得一定血清谷浓度和/或维持一定平均血清谷浓度。对于IL-10特异的方法描述于本文中的其它地方和下文的该部分中。
一般地，给药参数规定剂量的量少于可对受试者具有不可逆的毒性的量(即，最大耐受剂量，“MTD”)并且不少于对受试者产生可测量的作用所需的量。此类量由例如与ADME相关的药代动力学和药效学参数，通过考虑施用途径和其它因素来决定。
有效剂量(ED)是在一部分服用其的受试者中产生治疗反应或所需疗效的药剂的剂量或量。药剂的“半数有效剂量”或ED50是在50％的向其施用了该药剂的群体中产生治疗反应或所需疗效的药剂的剂量或量。虽然ED50通常用作药剂疗效的合理期望的量度，但其不一定是临床医生在考虑所有相关因素的情况下可能认为是适当的剂量。因此，在一些情况下，有效量高于计算的ED50，在其它情况下有效量低于计算的ED50，并且在其它情况下有效量与计算的ED50相同。
另外，本公开的IL-10多肽的有效剂量可以是当以一个或多个剂量向受试者施用时，产生相对于健康受试者的所需结果的量。例如，对于正在经历特定病症的受试者，有效剂量可以是使该病症的诊断参数、量度标准、标志物等改善至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％的剂量，其中100％被定义为由正常受试者展现的诊断参数、量度标准、标志物等。
治疗本文中描述的疾病、病症或病状所必需的PEG-IL-10的量基于缀合的蛋白的IL-10活性，其可通过本领域已知的IL-10活性测定来测定。例如，在肿瘤背景中，适当的IL-10活性包括例如CD8+ T细胞至肿瘤部位的浸润、炎性细胞因子诸如IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-L从这些浸润细胞的表达，以及生物样品中升高的IFN-γ的水平。
IL-10剂的治疗有效量可在约0.01至约100μg蛋白质/kg体重/日、约0.1至20μg蛋白质/kg体重/日、约0.5至10μg蛋白质/kg体重/日或约1至4μg蛋白质/kg体重/日的范围内。在一些实施方案中，通过连续输注施用IL-10剂以递送约50至800μg蛋白质/kg体重/日(例如，约1至16μg蛋白质/kg体重/日的IL-10剂)。输注速率可根据例如不利作用和血细胞计数的评估而变化。
对于口服剂的施用，可以以含有1.0至1000毫克的活性成分，具体地1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克的活性成分的片剂、胶囊等形式提供组合物。
IL-10多肽的具体给药方案(例如，给药频率)描述于本文中的其它地方。
在某些实施方案中，将公开的IL-10多肽的剂量包含于“单位剂型”中。短语“单位剂型”是指物理离散单位，每一个单位含有足以产生所需疗效的预定量的单独的或与一种或多种另外的药剂组合的本公开的IL-10多肽。应理解，单位剂型的参数将取决于特定药剂和待实现的疗效。
药盒
本公开还涵盖包含IL-10及其药物组合物的药盒。药盒通常呈如下文中所述的装有各种组分的物理结构的形式，并且可用于例如实践上述方法(例如，IL-10多肽至需要恢复胆固醇动态平衡的受试者的施用)。
药盒可包括本文中公开的IL-10多肽的一种或多种(在例如无菌容器中提供)，所述多肽可呈适合向受试者施用的药物组合物的形式。IL-10多肽可以以随时可用的形式或以需要例如在施用之前复溶或稀释的形式提供。当IL-10多肽呈需要由用户复溶的形式时，药盒还可包括与IL-10多肽包装在一起或与其分开包装的缓冲剂、药学上可接受的赋形剂等。当涵盖联合治疗时，药盒可以单独地包含几种药剂或可以已将它们组合在药盒中。可将药盒的每一种组分封装在单个容器内，并且所有的各种容器可以在单个包装内。本公开的药盒可被设计用于正确维持其中装有的组分所必需的条件(例如，冷藏或冷冻)。
药盒可含有标签或包装插页，包括关于其中的组分的辨识信息和它们的使用说明书(例如，活性成分的剂量参数、临床药理学，包括作用机制、药代动力学和药效学、不利作用、禁忌症等)。标签或插页可包括制造商信息诸如批号和失效期。可将标签或包装插页例如整合在装有组分的物理结构内，分别包含在物理结构内，或贴在药盒的组件(例如，安瓿，管或小瓶)上。
标签或插页可还包括或被整合在计算机可读介质诸如磁盘(例如，硬盘、卡、内存盘)、光盘诸如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带或电存储介质诸如RAM和ROM，或这些介质的混杂物诸如磁/光存储介质、FLASH介质或内存类型卡中。在一些实施方案中，实际的说明书不存在于药盒中，但提供用于例如通过互联网从远程来源获得说明书的工具。
实施例
提出以下实施例是为了向本领域一般技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，而非意图限制本发明人视为其发明的范围，也非意图表示以下实验是可被进行的全部或仅有的实验。应理解，不一定进行以现在时书写的示例性描述，相反地可进行该描述以产生本文所述的数据等。已经做出努力以确保关于使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但是应该解释一些实验错误和偏差。
除非另外指出，否则份数是按重量计的份数，分子量是重均分子量，温度以摄氏度(℃)表示，并且压力为大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括下列缩写：bp＝碱基对；kb＝千碱基；pl＝皮升；s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；aa＝氨基酸；kb＝千碱基；nt＝核苷酸；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dL＝分升；μl或μL＝微升；ml或mL＝毫升；l或L＝升；μM＝微摩尔；mM＝毫摩尔；M＝摩尔；kDa＝千道尔顿；i.m.＝肌内(地)；i.p.＝腹膜内(地)；i.v.或IV＝静脉内(地)；s.c或SC＝皮下(地)；QD＝每日一次；BID＝每日两次；QW＝每周一次；QM＝每月一次；HPLC＝高效液相色谱；BW＝体重；U＝单位；ns＝无统计学显著性；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；PCR＝聚合酶链式反应；NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺；DMEM＝达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbeco's Modification of Eagle's Medium)；GC＝基因组拷贝；EDTA＝乙二胺四乙酸。
材料和方法
下面一般材料和方法可用于下文中的实施例：
描述了分子生物学中的标准方法(参见，例如，Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.；和Ausubel，等(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第1-4卷，John Wiley和Sons,Inc.New York,N.Y.，其描述了在细菌细胞中进行的克隆和DNA诱变(第1卷)，在哺乳动物细胞和酵母中进行的克隆(第2卷)，糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷))。
科学文献描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶、以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生和蛋白质的糖基化(参见，例如，Coligan，等(2000)Current Protocols in Protein Science，第1-2卷，John Wiley和Sons,Inc.,NY)。
描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(例如，Harlow和Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)；用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可获得的(参见，例如，Coligan等(2001)Current Protocols in Immunology，第4卷，John Wiley,Inc.,NY)；用于流式细胞术的方法，包括荧光激活细胞分选术(FACS)是可获得的(参见，例如，Shapiro(2003)PracticalFlow Cytometry,John Wiley和Sons,Hoboken,NJ)；以及适合用于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体(以用作例如诊断试剂)的荧光试剂是可获得的(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR.；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO.)。
描述了免疫系统的组织学的标准方法(参见，例如，Louis等(2002)BasicHistology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
免疫细胞(CD4+和CD8+T细胞)的耗竭可受到抗体介导的消除的影响。例如，每周注射250μg的CD4-或CD8-特异性抗体，并使用FACS和IHC分析验证细胞的耗竭。
用于测定例如抗原性片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可获得的(参见，例如，GCG Wisconsin软件包(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；和DeCypherTM(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,NV)。
免疫活性Balb/C或B细胞缺乏的Balb/C小鼠获自The Jackson Lab.,Bar Harbor,ME，并且按照标准方法(参见，例如，Martin等(2001)Infect.Immun.,69(11):7067-73和Compton等(2004)Comp.Med.54(6):681-89)来使用。适合用于本公开涵盖的实验工作的其它小鼠品系对于本领域普通技术人员来说是已知的并通常可获自The Jackson Lab。
除非另外指出，否则在本文所述的实验中使用皮肤的PDV6鳞状细胞癌(参见，例如，Langowski等(2006)Nature 442:461-465)。可使用其它肿瘤学相关模型和细胞系，诸如Ep2乳房癌、CT26结肠癌和4T1乳腺癌模型(参见，例如，Langowski等(2006)Nature442:461-465)，并且所述模型和细胞系对于领域普通技术人员来说是已知的。还可使用非肿瘤学相关模型和细胞系(例如，炎症的模型)，并且所述模型和细胞系对于领域普通技术人员来说是已知的。
血清IL-10浓度水平和暴露水平可通过本领域中使用的标准方法来测定。例如，可通过将来自小鼠尾剪断物的全血(～50μl/小鼠)收集至扁平毛细管中，通过离心分离血清与血细胞，并通过标准ELISA药盒和技术来测定IL-10暴露水平。下文中描述了测定IL-10血清浓度的另外方法。
PEG化的IL-10的产生
本公开涵盖通过本领域普通技术人员已知的任何方法合成PEG化的IL-10。用于产生单PEG-IL-10和单/二PEG-IL-10的混合物的几个替代合成方案的随后描述意在仅是说明性的。虽然单PEG-IL-10和单/二PEG-IL-10的混合物都具有许多相当的性质，但选择性PEG化的单和二-PEG-IL-10的混合物提高最终PEG化的产物的产率(参见，例如，美国专利美国专利第7,052,686号和美国专利公布第2011/0250163号)。
除了利用她自已的技能生产和使用适合用于实践本公开的PEG(和其它药物递送技术)以外，本领域普通技术人员还熟悉PEG相关技术(和其它药物递送技术)的许多商业供应商。例如，NOF America Corp(Irvine,CA)提供单功能线性PEG、双功能PEG、多臂PES、分枝PEG、异功能PEG、分叉PEG和可释放的PEG；并且Parchem(New Rochelle,NY)是PEG产品和其它专业原材料的全球经销商。
示例性PEG-IL-10合成方案第1号。可将IL-10在pH 7.0,100mM NaCl下针对10mM磷酸钠进行透析。随后可使用透析缓冲液将透析的IL-10稀释3.2倍至4mg/mL的浓度。在添加接头SC-PEG-12K(Delmar Scientific Labs；Maywood,IL)之前，可将1倍体积的pH 9.1的100mM四硼酸钠添加至9倍体积的稀释的IL-10中，以将IL-10溶液的pH升至8.6。可将SC-PEG-12K接头溶解在透析缓冲液中，并可将适当体积的接头溶液(1.8至3.6摩尔的接头/摩尔的IL-10)添加至稀释的IL-10溶液，以起始PEG化反应。可在5℃进行反应以控制反应速率。可在PEG化反应过程中温和地搅拌反应溶液。当单PEG-IL-10产率(如通过尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)测定的)接近40％时，通过添加1M甘氨酸溶液至30mM的终浓度来终止反应。使用HCl溶液将反应溶液的pH缓慢地调整至7.0，随后使用0.2微米过滤器过滤反应溶液，并将其于-80℃贮存。
示例性PEG-IL-10合成方案第2号。使用甲氧基-PEG-醛(PALD-PEG)作为接头(Inhale Therapeutic Systems Inc.,Huntsville,AL；也可从NOF America Corp(Irvine,CA)获得))制备单PEG-IL-10。PALD-PEG可具有5KDa、12KDa或20KDa的分子量。将IL-10进行透析，并且除反应缓冲液的pH为6.3至7.5外，如上所述进行稀释。将活化的PALD-PEG接头以1:1的摩尔比添加至反应缓冲液。将含水氰基硼氢化物添加至反应混合物中以达到0.5至0.75mM的终浓度。在室温(18-25℃)下通过温和搅拌进行反应，持续15-20小时。利用1M甘氨酸淬灭反应。利用SE-HPLC分析产率。通过凝胶过滤层析将单PEG-IL-10与未反应的IL-10、PEG接头和二PEG-IL-10分离，并通过RP-HPLC和生物测定(例如，IL-10-反应性细胞或细胞系的刺激)进行表征。
示例性PEG-IL-10合成方案第3号。将IL-10(例如，啮齿类动物或灵长类动物)针对50mM磷酸钠，100mM氯化钠(pH在5-7.4的范围内)进行透析。在0.75-30mM氰基硼氢化钠存在下，将1:1-1:7摩尔比的5K PEG-丙醛与浓度为1-12mg/mL的IL-10反应。或者，可以以类似的方式用甲基吡啶硼烷活化反应。将反应在5-30℃孵育3-24小时。
将PEG化反应的pH调整至6.3，将7.5mg/mL的hIL-10与PEG反应以使得IL-10与PEG接头的比率为1:3.5。氰基硼氢化物的终浓度为～25mM，并将反应在15℃进行12-15小时。单和二-PEG IL-10是最多的反应产物，结束时每一种的浓度为～45-50％。可使用氨基酸诸如甘氨酸或赖氨酸或可选地Tris缓冲液来淬灭反应。可使用多种纯化方法，诸如凝胶过滤、阴离子和阳离子交换色谱和尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)来分离所需的PEG化的IL-10分子。
示例性PEG-IL-10合成方案第4号。将IL-10针对10mM磷酸钠pH 7.0、100mM NaCl进行透析。使用透析缓冲液将经透析的IL-10稀释3.2倍至约0.5至12mg/mL的浓度。在添加接头SC-PEG-12K(Delmar Scientific Laboratories,Maywood,Ill.)之前，将1倍体积的pH9.1的100mM四硼酸钠添加至9倍体积的稀释的IL-10中，以使IL-10溶液的pH升至8.6。将SC-PEG-12K接头溶解在透析缓冲液中，并将适当体积的接头溶液(1.8至3.6摩尔的接头/摩尔的IL-10)添加至稀释的IL-10溶液，以起始PEG化反应。在5℃进行反应以控制反应速率，并且温和地搅拌反应溶液。当单PEG-IL-10产率(如通过尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)测定的)接近40％时，通过添加1M甘氨酸溶液至30mM的终浓度来终止反应。使用HCl溶液将反应溶液的pH缓慢地调整至7.0，并使用0.2微米过滤器过滤反应物，并将其于-80℃贮存。
下文中所示的材料，包括表15和其描述在内，基本上是从美国专利公布第2011/00911419号(美国专利公布第2011/00911419号的共同发明人也是本申请的发明人)摘取的，并且其中的教导及其变化具有广泛的适用性，并且可用于多个不同的背景和/或在所述背景中被修改。类似地，相关领域和/或技术领域中的其它出版物的教导(参见，例如，USP第6,387,364和7,052,684号，和PCT公布第WO 2006/075138号)以及本领域普通技术人员的一般知识一起可形成另外的实验工作的基础。
肿瘤模型和肿瘤分析
任何领域接受的肿瘤模型、测定等可用于评估IL-10和PEG-IL-10对各种肿瘤的作用。下文描述的肿瘤模型和肿瘤分析代表那些可以被利用的模型和分析，并且将它们用于生成和评估表1-15中所示的数据。
以104、105或106个细胞/肿瘤接种皮下或皮内注射同系小鼠的肿瘤细胞。可使用Ep2乳房癌、CT26结肠癌、皮肤的PDV6鳞状细胞癌和4T1乳腺癌模型(参见，例如，Langowski等(2006)Nature442:461-465)。可使用免疫活性Balb/C或B细胞缺陷型Balb/C小鼠。可向免疫活性小鼠施用PEG-mIL-10，然而PEG-hIL-10处理可用于B细胞缺陷型小鼠。使肿瘤达到100-250mm3的尺寸，随后开始处理。在远离肿瘤植入的部位皮下施用IL-10、PEG-mIL-10、PEG-hIL-10或缓冲液对照。通常使用电子卡尺每周2次监测肿瘤生长。
在不同终点收获肿瘤组织和淋巴器官以测量许多炎性标志物的mRNA表达，并进行几个炎性细胞标记物的免疫组织化学。将组织在液氮中快速冷冻并于-80℃下贮存。通常使用电子卡尺每周2次监测原发性肿瘤生长。可使用公式(宽2x长/2)计算肿瘤体积，其中长度是较长的维度。使肿瘤达到90-250mm3的尺寸，随后开始处理。
IL-10和/或PEG-IL-10的施用
上述肿瘤模型和肿瘤分析方法用来生成下文中所示的数据。然而，如上文所暗示，这些相同的模型和方法学可用于其它实验设置中。
向免疫活性小鼠施用鼠IL-10(mIL-10)或PEG-mIL-10，然而将PEG-hIL-10处理用于B细胞缺陷型小鼠。在远离肿瘤植入的部位皮下施用鼠IL-10、PEG-mIL-10、PEG-hIL-10或媒介物对照。用SC-PEG-12K接头制备这些研究中使用的PEG-mIL-10。通过应用利用MC/9(一个表达内源mIL-10受体(R1和R2)的小鼠肥大细胞系)的短期增殖生物测定来评估mIL-10和PEG-m IL-10的生物活性。MC/9细胞响应于利用mIL-4及mIL-10的共同刺激而增殖(仅使用mIL-4或mIL-10，MC/9细胞不增殖)。使用阿尔玛蓝(Alamar Blue)，通过比色法来测量增殖，阿尔玛蓝是一种基于代谢活性检测的生长指示剂染料。重组体或PEG-mIL-10的生物活性通过EC50值，或在剂量-反应曲线中观察到半数最大刺激时的蛋白质的浓度来评估(表1)。
表1
如表1中指示，基于MC/9生物测定，用于实验的PEG-mIL-10的比活性约为mIL-10的活性的1/7。
还可隔日向Ep2乳腺癌荷瘤小鼠施用PEG-mIL-10。处理在减小肿瘤尺寸和诱导肿瘤排斥中是有效的。
表2
用PEG-mIL-10处理在减小PDV6、CT-26和4T1同系免疫活性小鼠肿瘤模型的肿瘤尺寸中也是有效的(参见表3、4和5)。
表3
表4
表5
剂量滴定研究
在剂量滴定研究中，在对应于预期的峰和谷剂量水平的时间上从每一个组的代表性小鼠收集尾静脉取血。使用基于多阵列技术的Meso Scale Discovery平台(电化学发光检测和图案化阵列的组合)测定收获的血清的mIL-10浓度。将双尾未配对学生t检验用于比较按照血清mIL-10浓度分组的mIL-10或PEG-mIL-10处理的小鼠的平均肿瘤体积与它们的对应媒介物对照组的平均肿瘤体积。当两个组具有不等方差时使用Welch校正(p<0.05的t检验)。
具有4T1乳腺癌的小鼠中的PEG-mIL-10和mIL-10的剂量滴定显示，原发性肿瘤和肺转移灶的控制是可用mIL-10和PEG-mIL-10二者进行剂量滴定的。如表6中所示，在任何给定的剂量上，PEG-mIL-10比mIL-10更有效。在植入后第17天开始每日两次的处理，此时平均肿瘤体积为84-90mm3。处理组由每组14只小鼠组成，而对照组每组具有8只小鼠。Tris和Hepes缓冲液分别是针对mIL-10和PEG mIL-10的对照。
表6
具有PDV6鳞状细胞癌的小鼠的PEG-mIL-10和mIL-10的剂量滴定表明，原发性肿瘤的控制是可用mIL-10和PEG-mIL-10二者进行剂量滴定的，虽然在任何给定的剂量上，PEG-MIL-10比mIL-10更有效(表7)。高剂量的PEG-mIL-10处理导致接近100％的肿瘤消退和随后对再攻毒的抗性(表8)。在植入后第23天开始每日2次的处理，此时平均肿瘤体积为107-109mm3并且对于所有mIL10处理组和0.01mg/kg PEG mIL-10处理组持续至第55天。在第48天终止0.1mg/kg PEG-mIL-10处理，此时看到100％的肿瘤消退，然而处理剩余组直至第51天。处理组由每组10只小鼠组成，而每一个媒介物对照含有6只小鼠。Tris缓冲液和Hepes缓冲液分别为针对mIL-10和PEG mIL-10的媒介物对照。在初始植入后85天和最后一次PEG-mIL10处理后4周进行重新植入。每组10只小鼠。
表7
表8
肺转移研究
在肺切除术后(表9)通过肉眼检查或在如Current Protocols in Immunology(第20.2.4节)John Wiley和Sons,Inc.,New York；Harlow和Lane(1999)中所述在培养后(表10)通过计数肺转移性集落来定量4T1乳腺癌模型中的肺转移灶。简言之，将从4T1荷瘤小鼠收获的肺切碎并用胶原酶/弹性蛋白酶消化，随后在有限稀释测定中培养在含有6-硫鸟嘌呤的培养基中。仅4T1细胞具有6-硫鸟嘌呤抗性，并且可通过在10-14天的培养后计数集落数来定量。在植入后第17天开始每日两次的处理，此时平均肿瘤体积为84-90mm3。Tris和Hepes缓冲液分别为针对mIL-10和PEGmIL-10的对照。肺转移灶被测量为每个肺培养的转移性集落数。
表9
表10
向具有4T1乳腺癌的小鼠施用PEG-mIL-10或IL-10减少转移的比率，并增加CD8+ T细胞浸润以及免疫刺激性细胞因子的表达，如通过定量RT-PCR测量的(表11和12)。从通过免疫组织化学针对CD8表面标志物染色的并通过用抗-CD3和抗-TCRαβ抗体染色验证的几个肿瘤的代表性切片计数浸润CD8+ T细胞的数目。
表11
PEG-mIL-10在炎性细胞因子的诱导中比IL-10更有效。从均浆的肿瘤样品提取总RNA，并如先前所述(参见，例如，Homey,等(2000)J.Immunol.164:3465-3470)进行逆转录。通过荧光生成5'-核酸酶PCR测定(参见，例如，Holland，等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88:7276-7280)就细胞因子的表达定量分析互补DNA。通过ABI PRISM 7700序列检测系统(Applied Biosystems)在40个循环中连续测量特定PCR产物。将值针对泛素蛋白标准化。将对数转换的数据经历Kruskal-Wallis统计分析(中值法)。表达水平(对数转换的)对应于肿瘤样品中表达的炎性细胞因子的量，以便表达水平(对数转换的)越高，肿瘤样品中表达的炎性细胞因子的量越大。
表12
免疫细胞的耗竭
通过抗体介导的消除来耗竭CD4+和CD8+ T细胞。出于该目的每周注射250μg CD4-或CD8-特异性抗体。使用FACS和IHC分析验证细胞耗竭。
利用CD4抗体来耗竭B细胞缺陷型BALB/c小鼠(C.129-Igh-6tmlCgn)中的CD4+ T细胞抑制PEG-hIL-10对肿瘤的功能(表13)。
表13
CD8+ T细胞的耗竭完全抑制PEG mIL-10对同系肿瘤生长的作用(表14)。
表14
IL-10的给药频率和血清谷浓度
设计和进行鼠研究，以增进对IL-10疗法的药代动力学参数的理解，和在小鼠中生成用于使人受试者的重组人IL-10(rhIL-10)的肿瘤治疗方案最优化的数据。
利用PDV6肿瘤细胞接种小鼠，并使肿瘤生长2.5周以达到100mm3。随后用相同的周剂量(0.7mg/kg/周)处理成组的荷瘤小鼠(n＝10/组)，以a)每周一次一个大剂量(bolus)SC注射，或b)在整个一周中以分份剂量数次SC注射(包括每周2次(0.35mg/kg)，隔日(～0.25mg/kg，以便总的周剂量＝0.7mg/kg)和每日(0.1mg/kg/日))的方式施用5kDa单-二PEGmIL-10。当所有小鼠在一周的过程中接受相同量的药物时，观察到相似的总暴露(曲线下面积，AUC)。峰暴露在每周一次给药的小鼠中是最高的，然而最小药物暴露(谷)在接受较小日剂量的小鼠中是最高的。令人惊讶地，如表15中所指示的，每日给药的小鼠展现最高抗肿瘤功效，这表明血清谷暴露对于抗肿瘤功能是非常重要的，然而峰暴露对抗肿瘤功能的影响不是决定性的。
表15
给药方案
对照 813.9522
每日 43.196
隔日 170.186
每2周 347.315
每周 425.572
在两个肿瘤模型：C57BL/6小鼠中的PDV6肿瘤和Balb/C小鼠中的CT26结肠癌细胞中进一步探测所需的血清谷浓度。使用标准方法，使小鼠生长至100mm3，随后通过施用5kDa单-二PEGmIL-10开始处理，进行4周。随后，测量接受不同处理方案的荷瘤小鼠的IL-10的血清谷浓度。随后使IL-10血清谷浓度与所得的肿瘤尺寸相关联。如表16中指示的，具有高于1ng/mL的血清谷IL-10的小鼠具有持续小的肿瘤并且排斥它们的肿瘤。
表16
为了确认人细胞中的至关重要的谷浓度，以递增浓度将hIL-10添加至人外周血单核细胞(PBMC)的培养物。不处理PBMC培养物或用脂多糖(LPS)刺激培养物。已知IL-10抑制LPS介导的PBMC活化。将活性测量为趋化因子MCP-1的分泌。LPS和IL-10都诱导MCP-1的分泌，但抑制彼此的诱导趋化因子的活性。在1ng/mL和以上的浓度下，IL-10在LPS不存在的情况下增加MCP-1的分泌(图2A)。相反地，在用LPS刺激的PBMC中，以1ng/mL的浓度添加IL-10显著抑制MCP-1的分泌(图2B)。这确认了IL-10的诱导和抑制各自生物过程的生物活性。
IL-10在人受试者中对细胞因子和胆固醇的作用
人受试者中的血清IL-10浓度的测定。向人志愿者施用所需量的rhIL-10SC或IV，在期望的施用后时间上将全血样品抽入含肝素抗凝剂的管中。使用标准夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)药盒测定血清rhIL-10或PEG-rhIL-10浓度。通常地，ELISA测定在0.1至10ng/mL的浓度范围内被测定为是选择性的、线性的并且是可重现的，并且定量界限(LOO)为0.1ng/mL。还通过ELISA分析血清样品的结合hIL-10的抗体的存在。另外，使用验证的生物测定(包含小鼠肥大细胞系MC9)来分析选定的血清样品；该细胞系响应于IL-10而增殖。该生物测定用于测定GMP生产的rHuIL-10和PEG-rHuIL-10的生物活性和测定患者血清中的IL-10的生物活性。通常地，IL-10浓度和活性的ELISA和生物测定法测定显示对应的值。
人受试者中的TNFα和IL-1β浓度的测定。IL-10在患有慢性炎性疾病的患者中具有抗炎功能，并且TNFα和IL-1β代表在此类疾病中释放的关键性的炎性细胞因子。测定获自人受试者的血液样品中的TNFα和IL-1β浓度。通常地，在即将SC或IV施用rhIL-10(0小时)时和在给药后0.5、2、3、4、6、8、12、16、24、48、72和96小时无菌收集3mL的静脉血。在LPS和抗凝剂存在下，将样品经历全血细胞因子释放测定，并且利用ELISA测定来测量TNFα和IL-1β浓度。LPS刺激TNFα和IL-1β从血细胞的释放。
在于用rHuIL-10对个体IV给药后0.5-12小时收集的样品中，抑制TNFα和IL-1β的释放。在从用rHuIL-10SC给药的个体收集的样品中，从0.5小时至24小时抑制TNFα和IL-1β的释放。通过ELISA测定这些人受试者中的rHuIL-10的血清浓度。TNFα和IL-1β的抑制与rHuIL-10的血清浓度相关。rHuIL-10的血清浓度在给药后增加并且保持升高48小时。然而，TNFα和IL-1β的释放只有在rHuIL-10的浓度为0.2ng/mL或高于0.2ng/mL时才被抑制；当浓度低于0.1ng/mL时，TNFα和IL-1β的释放不被抑制。在rHuIL-10的IV给药后12小时和SC给药后24小时后，血清浓度下降至低于0.2ng/mL，并且观察到TNFα和IL-1β的释放。这些数据表明，为了在患有慢性炎性疾病的患者中观察到抗炎功能，必须达到0.2ng/mL或高于0.2ng/mL的IL-10血清谷浓度。
人癌症患者中PEG-IL-10对INFγ和胆固醇的调节的测定。IL-10在CD8+T细胞中诱导IFNγ，并且IFNγ诱导对于小鼠中的IL-10介导的肿瘤排斥是必需的。当以诱导对照小鼠的肿瘤消退的浓度用PEG-rmIL-10处理时，IFNγ缺陷型小鼠不能排斥它们的肿瘤(数据未显示)。从而测量用PEG-rhIL-10处理的患者血清中的IFNγ。
在关于适当的施用技术的教育后，癌症患者每天自已SC注射不同剂量的PEG-rhIL-10。如先前所述，使用夹心ELISA测定血清IL-10浓度。使用Luminex珠粒测定(LuminexCorp.；Austin,TX)测量在第一次给药前或28天的给药后获取的血清样品的IFNγ。
如表17中所指示的，接受1μg/kg PEG-IL-10的患者具有～0.4至～1.1ng/mL IL-10的血清谷水平，然而接受2.5μg/kg PEG-IL-10剂量的患者具有～0.4至～2.6ng/mL的IL-10的血清谷水平。
IFNγ主要通过Jak-Stat途径发出信号。Jak-Stat信号转导包括一连串受体招募以及Janus激酶家族(Jak：Jak 1–3和Tyk2)和Stat激酶家族(Stat 1-6，包括Stat5a和Stat5b)的成员的活化来通过特定应答元件控制靶标基因的转录。因为该信号转导机制是细胞因子受体超家族的许多成员的特征，所以IFNγ诱导的Jak-Stat信号转导是当前的II类细胞因子受体信号转导的范例。如表17中所指示的，具有1ng/mL或更大的血清谷水平的患者显示血清中的IFNγ的诱导，然而具有低于1ng/mL的血清谷水平的患者未能显示IFNγ的诱导。参考表17，IFNγ诱导被定义为大于1的值。
表17
这些数据表明为了在癌症/肿瘤环境中观察到疗效，必须获得1ng/mL或高于1ng/mL的IL-10血清谷浓度。重要地，血清谷浓度而非剂量水平是IFNγ诱导的决定因素。
在施用PEG-rhIL-10之前或在1周的每日SC给药(1μg/kg；2.5μg/kg；或5μg/kg；n＝3-4个患者/剂量)后测量从癌症患者抽取的血清样品中的胆固醇。参考表18，接受1μg/kg的患者获得0.4ng/mL的平均日血清胆固醇浓度并且具有7.8％的胆固醇的减少；接受2.5μg/kg的患者获得1ng/mL的平均日血清胆固醇浓度并且具有19％的胆固醇的减少；以及接受5μg/kg的患者获得2ng/mL的平均血清胆固醇谷浓度并且具有38％的胆固醇的减少。因此，每一个给药方案导致血清胆固醇的治疗相关减少，这表明约0.2ng/mL至0.4ng/mL的平均IL-10血清谷浓度是有效的。
表18
剂量 1ug/kg 2.5 5
n 4 4 3
平均血清谷(第15天) 0.4 1.8 3.6
平均胆固醇减少(1周) 7.8％ 20％ 37％
在本文中描述了本发明的特定实施方案，包括本发明人已知的用于进行本发明的最好模式。在阅读前述内容、描述后，公开的实施方案的变型对于本领域工作个体将变得显而易见，并且预期本领域普通技术人员可酌情利用此类改变。因此，期望另外地实施本发明而不是按照本文中明确描述的，以及本发明包括如适用法律所许可的所附权利要求所列举的对象的所有修改和等效物。此外，在其所有可能的改变中上述组分的任何组合涵盖于本发明中，除非本文另外说明或上下文中明显矛盾。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请、登录号和其它参考资料通过引用并入本文，就如同特定地及个别地表明每个出版物或专利申请通过引用并入一样。
本申请涉及下述实施方案。
1.一种治疗或预防受试者的疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的IL-10剂，其中所述量足以获得至少0.1ng/mL的平均IL-10血清谷浓度。
2.一种治疗或预防受试者的疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的IL-10剂，其中所述量足以在一段时间内维持平均IL-10血清谷浓度；
其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少0.1ng/mL，并且
其中将所述平均IL-10血清谷浓度维持至少90％的所述一段时间。
3.根据实施方案2所述的方法，其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少1.5ng/mL。
4.根据实施方案2所述的方法，其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少1.85ng/mL。
5.根据实施方案2所述的方法，其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少2.0ng/mL。
6.根据实施方案2-5或69-75中任一项所述的方法，其中所述一段时间为至少12小时。
7.根据实施方案6所述的方法，其中所述一段时间为至少24小时。
8.根据实施方案7所述的方法，其中所述一段时间为至少48小时。
9.根据实施方案8所述的方法，其中所述一段时间为至少72小时。
10.根据实施方案9所述的方法，其中所述一段时间为至少1周。
11.根据实施方案10所述的方法，其中所述一段时间为至少2周。
12.根据实施方案11所述的方法，其中所述一段时间为至少1个月。
13.根据实施方案2-12或69-75中任一项所述的方法，其中将所述平均IL-10血清谷浓度维持至少95％的所述一段时间。
14.根据实施方案13所述的方法，其中将所述平均IL-10血清谷浓度维持至少98％的所述一段时间。
15.根据实施方案14所述的方法，其中将所述平均IL-10血清谷浓度维持100％的所述一段时间。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述IL-10剂为成熟人IL-10。
17.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述IL-10剂为成熟人IL-10的变体，并且其中所述变体展现与成熟人IL-10的活性相当的活性。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病状为增殖性病症。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述增殖性病症是癌症。
20.根据实施方案19所述的方法，其中所述癌症是实体瘤或血液病症。
21.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是免疫病症或炎性病症。
22.根据实施方案21所述的方法，其中免疫病症或炎性病症选自由以下组成的组：炎性肠病、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化和阿尔茨海默病。
23.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病状为血栓形成或血栓形成病状。
24.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是纤维化病症。
25.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是病毒性病症。
26.根据实施方案25所述的方法，其中所述病毒性病症选自由以下组成的组：人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和巨细胞病毒。
27.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是心血管病症。
28.根据实施方案27所述的方法，其中所述心血管病症是动脉粥样硬化。
29.根据实施方案27或28所述的方法，其中所述受试者具有升高的胆固醇。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的方法，其中所述IL-10剂包含至少一个修饰以形成经修饰的IL-10剂，其中所述修饰不改变所述IL-10剂的氨基酸序列。
31.根据实施方案30所述的方法，其中所述经修饰的IL-10剂为PEG-IL-10剂。
32.根据实施方案31所述的方法，其中所述PEG-IL-10剂包含至少一个共价连接于IL-10的至少一个亚单位的至少一个氨基酸残基的PEG分子。
33.根据实施方案31或32所述的方法，其中所述PEG-IL-10剂包含单-PEG化和二-PEG化的IL-10的混合物。
34.根据实施方案31-33中任一项所述的方法，其中所述PEG-IL-10剂的PEG组分具有约5kDa至约20kDa的分子质量。
35.根据实施方案31-33中任一项所述的方法，其中所述PEG-IL-10剂的PEG组分具有大于约20kDa的分子质量。
36.根据实施方案31-33中任一项所述的方法，其中所述PEG-IL-10剂的PEG组分具有至少约30kD的分子质量。
37.根据实施方案30所述的方法，其中所述经修饰的IL-10剂为Fc融合分子。
38.根据实施方案30所述的方法，其中所述经修饰的IL-10剂包含血清白蛋白。
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述血清白蛋白为人血清白蛋白(HSA)。
40.根据实施方案39所述的方法，其中所述经修饰的IL-10剂为HSA融合分子或白蛋白缀合物。
41.根据实施方案30所述的方法，其中将所述经修饰的IL-10剂糖基化。
42.根据实施方案30所述的方法，其中将所述经修饰的IL-10剂羟乙基淀粉化。
43.根据实施方案30所述的方法，其中所述经修饰的IL-10剂包含白蛋白结合结构域(ABD)。
44.根据实施方案30-43中任一项所述的方法，其中所述修饰是位点特异性的。
45.根据实施方案30-36、38和39中任一项所述的方法，其中所述修饰包含接头。
46.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中至少每天两次向所述受试者施用所述IL-10剂。
47.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中至少每天一次向所述受试者施用所述IL-10剂。
48.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中至少每72小时一次向所述受试者施用所述IL-10剂。
49.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中至少每周一次向所述受试者施用所述IL-10剂。
50.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中至少每2周一次向所述受试者施用所述IL-10剂。
51.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中至少每月一次向所述受试者施用所述IL-10剂。
52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其还包括施用至少一种另外的预防剂或治疗剂。
53.根据实施方案1-52中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
54.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述施用是通过肠胃外注射。
55.根据实施方案54所述的方法，其中所述肠胃外注射是皮下注射。
56.根据实施方案1-55中任一项所述的方法，其中所述治疗或预防由CD8+ T细胞介导。
57.一种药物组合物，其包含一定量的实施方案1-56中任一项的IL-10剂以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
58.根据实施方案57所述的药物组合物，其中所述赋形剂是等渗注射液。
59.根据实施方案57所述的药物组合物，其中所述组合物适合用于人施用。
60.根据实施方案57-59中任一项所述的药物组合物，其还包含至少一种另外的预防剂或治疗剂。
61.一种无菌容器，其包含实施方案57-60中任一项的药物组合物。
62.根据实施方案61所述的无菌容器，其中所述无菌容器是注射器。
63.一种药盒，其包括实施方案61或实施方案62的无菌容器。
64.根据实施方案63所述的药盒，其还包括包含至少一种另外的预防剂或治疗剂的第二无菌容器。
65.根据实施方案1所述的方法，其中所述量足以获得至少0.5ng/mL的平均IL-10血清谷浓度。
66.根据实施方案1所述的方法，其中所述量足以获得至少1.0ng/mL的平均IL-10血清谷浓度。
67.根据实施方案1所述的方法，其中所述量足以获得至少1.5ng/mL的平均IL-10血清谷浓度。
68.根据实施方案1所述的方法，其中所述量足以获得至少2.0ng/mL的平均IL-10血清谷浓度。
69.根据实施方案2所述的方法，其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少0.2ng/mL。
70.根据实施方案2所述的方法，其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少0.4ng/mL。
71.根据实施方案2所述的方法，其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少0.6ng/mL。
72.根据实施方案2所述的方法，其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少0.8ng/mL。
73.根据实施方案2所述的方法，其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少1.0ng/mL。
74.根据实施方案2所述的方法，其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少1.25ng/mL。
75.根据实施方案2所述的方法，其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少1.75ng/mL。
本申请还涉及下述实施方案。
1.一种供治疗人受试者中的癌症的方法使用的组合物，其中所述方法包括通过注射向所述人受试者施用治疗有效量的PEG-IL-10剂，其中所述量足以在至少24小时的一段时间内维持所述人受试者中的IL-10血清谷浓度处于或高于0.2ng/mL，其中还用至少一种治疗剂治疗所述人受试者。
2.根据实施方案1所述使用的组合物，其中所述至少一种治疗剂包含5-氟尿嘧啶(5-FU)。
3.根据实施方案1所述使用的组合物，其中所述至少一种治疗剂包含铂配合物。
4.根据实施方案1所述使用的组合物，其中所述至少一种治疗剂包含叶酸类似物。
5.根据实施方案4所述使用的组合物，其中所述至少一种治疗剂进一步包含铂配合物。
6.根据实施方案5所述使用的组合物，其中所述至少一种治疗剂进一步包含5-氟尿嘧啶(5-FU)。
7.根据实施方案1-6任一项所述使用的组合物，其中施用所述PEG-IL-10剂以在至少2周的一段时间内维持IL-10血清谷浓度处于或高于0.2ng/mL。
8.根据实施方案1-6任一项所述使用的组合物，其中施用所述PEG-IL-10剂以在至少1个月的一段时间内维持IL-10血清谷浓度处于或高于0.2ng/mL。
9.根据实施方案1-6任一项所述使用的组合物，其中所述PEG-IL-10剂包含成熟人IL-10。
10.根据实施方案1-6任一项所述使用的组合物，其中所述PEG-IL-10剂包含成熟人IL-10的变体，并且其中所述变体展现与成熟人IL-10的活性相当的活性。
11.根据实施方案1-6中任一项所述使用的组合物，其中所述PEG-IL-10剂包含至少一个共价连接于成熟人IL-10的至少一个亚单位的至少一个氨基酸残基的PEG分子。
12.根据实施方案11所述使用的组合物，其中所述PEG-IL-10剂包含单-PEG化和二-PEG化的IL-10的混合物。
13.根据实施方案12所述使用的组合物，其中所述PEG-IL-10剂的PEG组分具有约5kDa至约20kDa的分子质量。
14.根据实施方案13所述使用的组合物，其中所述PEG-IL-10剂的PEG组分具有约5kDa至约10kDa的分子质量。
15.根据实施方案13所述使用的组合物，其中所述PEG-IL-10剂的PEG组分具有约5kDa的分子质量。
16.根据实施方案1-6任一项所述使用的组合物，其中每天一次向所述受试者施用所述PEG-IL-10剂。
17.根据实施方案16所述使用的组合物，其中所述施用是通过皮下注射的。
18.根据实施方案1-17任一项所述使用的组合物，其中所述癌症是胰腺、肾细胞、或结肠的癌症。
19.PEG-IL-10剂在制备供治疗人受试者中的癌症的方法使用的药物中的用途，其中所述方法包括向所述人受试者施用治疗有效量的PEG-IL-10剂，其中所述量足以在至少24小时的一段时间内维持所述人受试者中的IL-10血清谷浓度处于或高于0.2ng/mL，其中还用至少一种治疗剂治疗所述人受试者。
20.根据实施方案19所述的用途，其中所述至少一种治疗剂包含5-氟尿嘧啶(5-FU)。
21.根据实施方案19所述的用途，其中所述至少一种治疗剂包含铂配合物。
22.根据实施方案19所述的用途，其中所述至少一种治疗剂包含叶酸类似物。
23.根据实施方案22所述的用途，其中所述至少一种治疗剂进一步包含5-氟尿嘧啶(5-FU)。
24.根据实施方案23所述的用途，其中所述至少一种治疗剂进一步包含铂配合物。
25.根据实施方案19所述的用途，其中施用所述PEG-IL-10剂以在至少2周的一段时间内维持IL-10血清谷浓度处于或高于0.2ng/mL。
26.根据实施方案19所述的用途，其中施用所述PEG-IL-10剂以在至少1个月的一段时间内维持IL-10血清谷浓度处于或高于0.2ng/mL。
27.根据实施方案19所述的用途，其中所述PEG-IL-10剂包含成熟人IL-10。
28.根据实施方案19所述的用途，其中所述PEG-IL-10剂包含成熟人IL-10的变体，并且其中所述变体展现与成熟人IL-10的活性相当的活性。
29.根据实施方案19-28中任一项所述的用途，其中所述PEG-IL-10剂包含至少一个共价连接于成熟人IL-10的至少一个亚单位的至少一个氨基酸残基的PEG分子。
30.根据实施方案29所述的用途，其中所述PEG-IL-10剂包含单-PEG化和二-PEG化的IL-10的混合物。
31.根据实施方案30所述的用途，其中所述PEG-IL-10剂的PEG组分具有约5kDa至约20kDa的分子质量。
32.根据实施方案30所述的用途，其中所述PEG-IL-10剂的PEG组分具有约5kDa至约10kDa的分子质量。
33.根据实施方案30所述的用途，其中所述PEG-IL-10剂的PEG组分具有约5kDa的分子质量。
34.根据实施方案30所述的用途，其中每天一次向所述受试者施用所述PEG-IL-10剂。
35.根据实施方案34所述的用途，其中所述施用是通过皮下注射的。
36.根据实施方案19-35任一项所述的用途，其中所述癌症是胰腺、肾细胞、或结肠的癌症。

Claims (8)

1.一种治疗或预防受试者的疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的IL-10剂，其中所述量足以获得至少0.1ng/mL的平均IL-10血清谷浓度。
2.一种治疗或预防受试者的疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的IL-10剂，其中所述量足以在一段时间内维持平均IL-10血清谷浓度；
其中所述平均IL-10血清谷浓度为至少0.1ng/mL，并且
其中将所述平均IL-10血清谷浓度维持至少90％的所述一段时间。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括施用至少一种另外的预防剂或治疗剂。
4.一种药物组合物，其包含一定量的权利要求1-3中任一项的IL-10剂以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其还包含至少一种另外的预防剂或治疗剂。
6.一种无菌容器，其包含权利要求4或5的药物组合物。
7.一种药盒，其包括权利要求6的无菌容器。
8.根据权利要求7所述的药盒，其还包括包含至少一种另外的预防剂或治疗剂的第二无菌容器。
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