KR20110112301A - 인간 혈청 알부민 링커 및 그 콘쥬게이트 - Google Patents

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샤롯 맥도너
미첼 펠다우스
알렉산드라 후할로브
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메리맥 파마슈티컬즈, 인크.
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Abstract

인간 혈청 알부민(HSA) 링커 및 이와 콘쥬게이션된 결합, 진단 및 치료제로서의 HSA 링커를 제공한다. 또한 상기 HSA 링커가 첫 번째 및 두 번째 단일-사슬 Fv 분자(scFvs)와 같은 아미노 및 카복시 말단 결합 부분에 공유 결합하는 HSA 링커 콘쥬게이트를 제공한다. 예시된 콘쥬게이트는 예컨대, 치료적 적용 예컨대, 종양 세포 증식을 감소시키는 것에서 유용하다. 또한 HSA 링커 콘쥬게이트의 진단 및 치료 적용을 위한 방법 및 키트를 설명한다.

Description

인간 혈청 알부민 링커 및 그 콘쥬게이트 {HUMAN SERUM ALBUMIN LINKERS AND CONJUGATES THEREOF}
본 발명은 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 링커 콘쥬게이트(conjugates) 및 이와 결합, 진단, 치료적 콘쥬게이트(conjugates)를 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 HSA 링커는 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, HSA 링커 콘쥬게이트는 첫 번째 및 두 번째 단일-사슬 Fv 분자(scFvs)와 같은 아미노 및 카복시 말단 결합 부분(binding moieties)에 공유 결합된다. 예시적인 콘쥬게이트는 예컨대, 치료적 적용을 위한 종양 세포 증식을 감소시키는데 유용하다. 본 발명은 또한 진단 및 치료적 HSA 링커 콘쥬게이트의 제조 및 투여를 위한 방법을 제공한다.
항체-유사 결합 부분들(완전 항체(intact antibodies), 항체 단편, 및 scFvs을 포함함)은 종종 치료적 적용을 위해 사용된다. 항체 단편 및 scFvs는 일반적으로 완전 항체(intact antibodies)에 비해 짧은 혈청 반감기를 갖으며, 몇몇 치료적 적용에서 생체내(in vivo) 반감기를 증가시키는 것이 이러한 단편 및 scFvs의 기능성을 갖는 치료제로 바람직하다.
인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA)은 약 66,500 kD의 단백질이며 적어도 17 이황화결합(disulphide bridges)을 포함하는 585 아미노산으로 구성된다. 많은 알부민 패밀리의 구성원들(members)과 마찬가지로, 인간 혈청 알부민은 인간의 생리기능에서 중요한 역할을 하고 거의 모든 인간 조직 및 신체 분비에서 발견된다. HSA는 다른 순환성 혈장에 불용성인 긴-사슬 지방산을 포함는 순환계를 통해 폭넓은 리간드를 결합 및 수송하는 능력을 갖는다.
혈청 알부민은 알파-페토단백질(alpha-fetoprotein) 및 비타민-D 결합 단백질로 알려진, 인간 군-특이적 성분(human group-specific component)을 포함하는 단백질 패밀리에 속한다. 혈청 알부민은 순환계(circulatory system)의 주요한 가용성 단백질이며 다양한 필수 생리학적 과정에 기여한다. 일반적으로 혈청 알부민은 건중량에 의한 약 50%의 총 혈액성분(total blood component)을 포함한다. 또한 알부민 및 그 관련 혈액 단백질들은 지방산, 아미노산, 스테로이드, 칼슘, 구리 및 아연과 같은 금속, 및 다양한 약제와 같은, 화학적으로 다양한 각종 분자들을 포함하여, 인체에서 다양한 내생적 및 외생적 리간드의 수송(transport), 분포(distribution) 및 대사(metabolism) 중요한 역할을 한다. 알부민 패밀리의 분자들은 일반적으로 간, 장, 신장 및 뇌와 같은, 대다수의 기관-순환 경계면에 걸쳐 이러한 리간드의 수송을 용이하게 하는 것으로 여겨진다. 따라서 알부민은 순환 및 대사 기능에 광범위하게 관련되어 있다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 서열번호 6-15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 링커, 및 항체, 단일쇄 Fv 분자, 이중특이적(bispecific) 단일쇄 Fv ((scFv)2) 분자, 도메인 항체, 디아보디(diabodies), 트리아보디(triabodies), 호르몬, Fab 단편, F(ab)2 분자, 탠덤 scFv (taFv) 단편, 리셉터 (예컨대, 세포 표면 리셉터), 리간드, 앱타머, 및 그들의 생물학적-활성 단편으로 구성된 군에서 선택된 제1 및 제2 결합 부분(moieties)을 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트를 제공한다. 여기서, 상기 제1 결합 부분은 상기 HSA 링커의 아미노 말단에 결합되고, 상기 제2 결합 부분은 상기 HSA 링커의 카르복시 말단에 결합된다. 하나의 구현예에서, 상기 제1 결합 부분은 ErbB3에 특이적으로 결합하고, 상기 제2 결합 부분은 ErbB2에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 상기 HSA 링커는 서열번호 1, 9, 10, 14 또는 15의 아미노산 서열을 포함한다.
두 번째 양태에서, 셋 이상의 결합 부분 (예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)이 상기 약제에 포함될 수 있다; 이러한 추가적인 결합 부분은 상기 약제에, 예컨대 제1 또는 제2 결합 부분과의 텐덤 (예컨대, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 텐덤)으로, 추가될 수 있다.
세 번째 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1의 서열과 적어도 90% 서열 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열, 및 서열번호 1의 위치 34에 세린 잔기 및 위치 503 글루타민 잔기를 갖는 HSA 링커를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 HSA 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, HSA 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
네 번째 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 서열과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 링커, 및 적어도 제1 결합 부분을 함유하는 HSA 링커 콘쥬게이트를 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 상기 제1 결합 부분을 상기 HSA 링커에 결합시키는 제1 펩티드 커넥터(connector)를 포함한다.
다섯 번째 양태에서, 본 발명은 서열번호 11-15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HSA 링커, 또는 이러한 서열들 중 하나의 단편 또는 변이체, 및 적어도 제1 결합 부분을 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트를 특징으로 한다.
본 발명의 네 번째 또는 다섯 번째 양태 중 바람직한 구현예에서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 상기 제1 결합 부분을 상기 HSA 링커의 아미노 또는 카르복시 말단에 결합시키는 제1 펩티드 커넥터 (예컨대, AAS, AAQ 또는 AAAL (SEQ ID NO:5))를 더 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 커넥터는 상기 제1 결합부분을 상기 HSA 링커에 공유결합시킨다.
본 발명의 네 번째 또는 다섯 번째 양태 중 바람직한 구현예에서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 적어도 제2 결합 부분을 더 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 상기 제2 결합 부분을 상기 HSA 링커에 결합시키는 제2 펩티드 커넥터 (예컨대, AAS, AAQ 또는 AAAL (SEQ ID NO:5))를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 제2 커넥터는 상기 제2 결합 부분을 상기 HSA 링커의 아미노 또는 카르복시 말단에 결합시킨다. 또 다른 구현예에서, 상기 제2 커넥터는 상기 제2 결합 부분을 상기 HSA 링커에 공유결합시킨다. 다른 구현예에서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 제1 또는 제2 결합 부분과 텐덤으로 포함되는 셋 이상의 결합 부분을 더 포함하고; 상기 셋 이상의 결합 부분은 상기 셋 이상의 결합 부분을 제1 또는 제2 결합 부분 및 각각에 연결시키는 커넥터 서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 네 번째 또는 다섯 번째 양태 중 바람직한 구현예에서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 제1 결합 부분을 상기 HSA 링커의 아미노 말단에 공유결합시키는 제1 펩티드 커넥터, 및 제2 결합 부분을 상기 HSA 링커의 카르복시 말단에 공유결합시키는 제2 펩티드 커넥터를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 제1 커넥터는 아미노산 서열 AAS 또는 AAQ를 가지고 상기 제2 커넥터는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 네 번째 또는 다섯 번째 양태 중 바람직한 구현예에서, 제1 또는 제2 결합 부분 (또는 제3 이상의 결합 부분)은 항체, 단일쇄 Fv 분자, 이중특이적(bispecific) 단일쇄 Fv ((scFv)2) 분자, 도메인 항체, 디아보디(diabodies), 트리아보디(triabodies), 호르몬, Fab 단편, F(ab)2 분자, 탠덤 scFv (taFv) 단편, 리셉터 (예컨대, 세포 표면 리셉터), 리간드, 앱타머, 또는 그들의 생물학적-활성 단편이다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 제공된 HSA 링커 콘쥬게이트는 이러한 서로 다른 타입의 결합 부분을 포함한다. 하나의 구현예에서, 적어도 제1 또는 제2 결합 부분은 인간 또는 인간화 단일쇄 Fv 분자이다.
본 발명의 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 또는 다섯 번째 양태 중 어느 하나의 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 상기 제3 이상의 결합 부분이 존재하는 경우)은 인슐린-유사 성장인자 1 리셉터 (IGF1R), IGF2R, 인슐린-유사 성장인자 (IGF), 중배엽 상피 전이인자 리셉터 (c-met; 간세포 성장인자 리셉터로도 알려져 있음), 간세포 성장인자 (HGF), 표피 성장인자 리셉터 (EGFR), 표피 성장인자 (EGF), 헤레굴린(heregulin), 섬유아세포 성장인자 리셉터 (FGFR), 혈소판-유래 성장인자 리셉터 (PDGFR), 혈소판-유래 성장인자 (PDGF), 혈관내피 성장인자 리셉터 (VEGFR), 혈관내피 성장인자 (VEGF), 종양괴사인자 리셉터 (TNFR), 종양괴사인자 알파 (TNF-α), TNF-β, 폴레이트 립셉터 (FOLR), 폴레이트(folate), 트랜스페린 리셉터 (TfR), 메조셀린(mesothelin), Fc 리셉터, c-키트 리셉터, c-키트, 인테그린 (예컨대, α4 인테그린 또는 β1 인테그린), P-셀렉틴, 스핑고신-1-포스페이트 리셉터-1 (S1PR), 히알루로네이트 리셉터, 백혈구 기능 항원-1 (LFA-1), CD4, CD11, CD18, CD20, CD25, CD27, CD52, CD70, CD80, CD85, CD95 (Fas 리셉터), CD106 (혈관세포 부착 분자 1 (VCAM1)), CD166 (활성화 백혈구 부착 분자 (ALCAM)), CD178 (Fas 리간드), CD253 (TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL)), ICOS 리간드, CCR2, CXCR3, CCR5, CXCL12 (간질세포-유래 인자 1 (SDF-1)), 인터루킨 1 (IL-1), CTLA-4, MART-1, gp100, MAGE-1, 에프린 (Eph) 리셉터, 점막 어드레신 세포 부착 분자 1 (MAdCAM-1), 암배아 항원 (CEA), 루위스Y (LewisY), MUC-1, 상피세포 부착 분자 (EpCAM), 암 항원 125 (CA125), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), TAG-72 항원, 및 그들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 단백질이거나 이와 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 제3 이상의 결합 부분이 존재하는 경우)은 적아구성 류케미아 바이러스 종양유전자 호모로그 (ErbB) 리셉터 (예컨대, ErbB1 리셉터; ErbB2 리셉터; ErbB3 리셉터; 및 ErbB4 리셉터)이거나 이와 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 제3 이상의 결합 부분 존재이 존재하는 경우)은 알파-페토프로테인 (AFP) 또는 인터페론, 또는 그들의 생물학적-활성 단편이거나 이와 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 제3 이상의 결합 부분 존재이 존재하는 경우)은 나탈리주맵(natalizumab), 인플릭시맵(infliximab), 아달리무맵(adalimumab), 리툭시맵(rituximab), 알렘투주맵(alemtuzumab), 베바시주맵(bevacizumab), 다크리주맵(daclizumab), 에팔리주맵(efalizumab), 골리무맵(golimumab), 세르톨리주맵(certolizumab), 트라스투주맵(trastuzumab), 아바타셉트(abatacept), 에타너셉트(etanercept), 페르투주맵(pertuzumab), 세툭시맵(cetuximab), 파니투무맵(panitumumab) 또는 아나킨라(anakinra)이다.
본 발명의 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 또는 다섯 번째 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 진단, 치료제, 또는 둘 모두와 결합된다. 하나의 구현예에서, 상기 진단제는 방사성, 형광 또는 중금속 라벨과 같은, 검출가능한 라벨이다. 다른 구현예에서, 상기 치료제는 세포독성(cytotoxic), 세포억제성(cytostatic) 또는 면역조절(immunomodulatory) 약제이다. 세포독성 약제는 알킬레이팅제, 항생제, 항종양제, 항증식제, 항대사제, 투불린 저해제, 토포이소머라제 I 또는 II 저해제, 호르몬 작용제 또는 길항제, 면역조절제, DNA 마이너 그루브 결합제 및 방사성제, 또는 종양 세포에 결합하여 사멸시키거나 종양 세포 증식을 억제시킬 수 있는 임의의 약제를 포함한다. 항종양제는 사이클로포프파마이드(cyclophosphamide), 캠프토테신(camptothecin), 호모캠프토테신(homocamptothecin), 콜치신(colchicine), 콤브레스타틴(combrestatin), 콤브레스타틴(combrestatin), 리족신(rhizoxin), 돌리스타틴(dolistatin), 안사미토신(ansamitocin) p3, 마이탄시노이드(maytansinoid), 오리스타틴(auristatin), 칼레아치미신(caleachimicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실 (5-FU), 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 레트로졸(letrozole), 에피루비신(epirubicin), 베바시주맵(bevacizumab), 페루투주맵(pertuzumab), 트라스투주맵(trastuzumab), 및 그들의 유도체를 포함한다.
본 발명의 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 또는 다섯 번째 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합된다. 하나의 구현예에서, 상기 약제는 6시간 내지 7일 사이의 생체내 반감기(half-life)를 나타낸다. 다른 구현예에서, 상기 약제는 8시간보다 더 긴 생채내 반감기를 나타낸다.
여섯 번째 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 HSA 링커 콘쥬게이트 중 하나를 투여함으로써 질환(disease) 또는 질병(disorder)을 갖는 포유동물을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 상기 질환 또는 질병은 세포표면 리셉터를 통한 세포내 신호전달(cellular signaling)과 연관된다. 다른 구현예에서, 상기 포유동물은 인간이다. 또 다른 구현예에서, 상기 질환 또는 질병은 증식성(proliferative) 또는 자가면역(autoimmune) 질환이다. 증식성 질환은 멜라노마(melanoma), 클리어세포 사르코마(clear cell sarcoma), 두부 및 경부 암(head and neck cancer), 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 위암(gastric cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 신장암(renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 타액선암(salivary gland cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer), 피부암(skin cancer) 및 뇌암(brain cancer)을 포함한다. 자가면역 질환은 다발경화증(multiple sclerosis), 건선(psoriasis), 중증근육무력증(myasthenia gravis), 포도막염(uveitis), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus) 및 류마티스관절염(rheumatoid arthritis)과 같은 이러한 암(cancer)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 항종양제와 같은, 하나 이상의 치료제와 조합하여 투여된다.
일곱 번째 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 3 또는 6-15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HSA 링커, 또는 서열번호 1, 3 또는 6-15 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%, 95%, 97% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열의 아미노 말단에 제1 결합 부분을 결합시키고 상기 서열의 카르복시 말단에 제2 결합 부분을 결합시킴으로써 HSA 링커 콘쥬게이트를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 상기 제1 또는 제2 결합 부위는 HSA 링커의 아미노 또는 카르복시 말단에 공유결합시킨다. 다른 구현예에서, 제3 또는 추가적 결합 부분 (예컨대, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 결합 부분)은 상기 제1 또는 제2 결합 부분을 HSA 링커의 아미노 또는 카르복시 말단에 텐덤으로 공유결합시킨다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 제3 이상의 결합 부분이 존재할 경우)은 항체, 단일쇄 Fv 분자, 이중특이적(bispecific) 단일쇄 Fv ((scFv)2) 분자, 도메인 항체, 디아보디(diabodies), 트리아보디(triabodies), 호르몬, Fab 단편, F(ab)2 분자, 탠덤 scFv (taFv) 단편, 리셉터 (예컨대, 세포 표면 리셉터), 리간드 또는 앱타머이다. 다른 구현예에서, 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 제3 이상의 결합 부분이 존재할 경우)은 인간 또는 인간화 단일쇄 Fv 분자이다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 제3 이상의 결합 부분이 존재할 경우)은 인슐린-유사 성장인자 1 리셉터 (IGF1R), IGF2R, 인슐린-유사 성장인자 (IGF), 중배엽 상피 전이인자 리셉터 (c-met; 간세포 성장인자 리셉터로도 알려져 있음), 간세포 성장인자 (HGF), 표피 성장인자 리셉터 (EGFR), 표피 성장인자 (EGF), 헤레굴린(heregulin), 섬유아세포 성장인자 리셉터 (FGFR), 혈소판-유래 성장인자 리셉터 (PDGFR), 혈소판-유래 성장인자 (PDGF), 혈관내피 성장인자 리셉터 (VEGFR), 혈관내피 성장인자 (VEGF), 종양괴사인자 리셉터 (TNFR), 종양괴사인자 알파 (TNF-α), TNF-β, 폴레이트 립셉터 (FOLR), 폴레이트(folate), 트랜스페린 리셉터 (TfR), 메조셀린(mesothelin), Fc 리셉터, c-키트 리셉터, c-키트, 인테그린 (예컨대, α4 인테그린 또는 β1 인테그린), P-셀렉틴, 스핑고신-1-포스페이트 리셉터-1 (S1PR), 히알루로네이트 리셉터, 백혈구 기능 항원-1 (LFA-1), CD4, CD11, CD18, CD20, CD25, CD27, CD52, CD70, CD80, CD85, CD95 (Fas 리셉터), CD106 (혈관세포 부착 분자 1 (VCAM1)), CD166 (활성화 백혈구 부착 분자 (ALCAM)), CD178 (Fas 리간드), CD253 (TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL)), ICOS 리간드, CCR2, CXCR3, CCR5, CXCL12 (간질세포-유래 인자 1 (SDF-1)), 인터루킨 1 (IL-1), CTLA-4, MART-1, gp100, MAGE-1, 에프린 (Eph) 리셉터, 점막 어드레신 세포 부착 분자 1 (MAdCAM-1), 암배아 항원 (CEA), 루위스Y (LewisY), MUC-1, 상피세포 부착 분자 (EpCAM), 암 항원 125 (CA125), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), TAG-72 항원, 및 그들의 단편이거나 이와 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 제3 이상의 결합 부분이 존재하는 경우)은 적아구성 류케미아 바이러스 종양유전자 호모로그 (ErbB) 리셉터 (예컨대, ErbB1 리셉터; ErbB2 리셉터; ErbB3 리셉터; 및 ErbB4 리셉터)이거나 이와 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 제3 이상의 결합 부분 존재이 존재하는 경우)은 알파-페토프로테인 (AFP) 또는 인터페론, 또는 그들의 생물학적-활성 단편이거나 이와 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 제3 이상의 결합 부분 존재이 존재하는 경우)은 나탈리주맵(natalizumab), 인플릭시맵(infliximab), 아달리무맵(adalimumab), 리툭시맵(rituximab), 알렘투주맵(alemtuzumab), 베바시주맵(bevacizumab), 다크리주맵(daclizumab), 에팔리주맵(efalizumab), 골리무맵(golimumab), 세르톨리주맵(certolizumab), 트라스투주맵(trastuzumab), 아바타셉트(abatacept), 에타너셉트(etanercept), 페르투주맵(pertuzumab), 세툭시맵(cetuximab), 파니투무맵(panitumumab) 또는 아나킨라(anakinra)이다. 다른 구현예에서, 상기 약제는 진단 또는 치료제와 결합된다. 하나의 구현예에서, 상기 진단제는 방사성(radioactive), 생체발광(bioluminescent), 형광(fluorescent), 중금속(heavy metal) 또는 에피토프 태그(epitope tag)이다. 다른 구현예에서, 상기 치료제는 세포독성(cytotoxic) 약제, 세포억제성(cytostatic) 또는 면역조절(immunomodulatory) 약제이다. 세포독성 약제는 알킬레이팅제, 항생제, 항종양제, 항증식제, 항대사제, 투불린 저해제, 토포이소머라제 I 또는 II 저해제, 호르몬 작용제 또는 길항제, 면역조절제, DNA 마이너 그루브 결합제 및 방사성제, 또는 종양 세포에 결합하여 사멸시키거나 종양 세포 증식을 억제시킬 수 있는 임의의 약제를 포함한다. 항종양제는 사이클로포프파마이드(cyclophosphamide), 캠프토테신(camptothecin), 호모캠프토테신(homocamptothecin), 콜치신(colchicine), 콤브레스타틴(combrestatin), 콤브레스타틴(combrestatin), 리족신(rhizoxin), 돌리스타틴(dolistatin), 안사미토신(ansamitocin) p3, 마이탄시노이드(maytansinoid), 오리스타틴(auristatin), 칼레아치미신(caleachimicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실 (5-FU), 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 레트로졸(letrozole), 에피루비신(epirubicin), 베바시주맵(bevacizumab), 페루투주맵(pertuzumab), 트라스투주맵(trastuzumab), 및 그들의 유도체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 약제는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합된다.
여덟 번째 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 3, 및 6-15 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 하나 이상의 표면-노출된 아미노산 잔기를 진단 또는 치료제의 콘쥬게이션을 허용하는 화학적 변형(chemical modification) 가능한 대체 아미노산으로 치환함으로써 HSA 링커를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 상기 대체 아미노산은 시스테인이고, 상기 표면 노출된 아미노산 잔기는 세린 또는 트레오닌이다. 다른 구현예에서, 상기 화학적 변형은 상기 대체 아미노산과 상기 진단 또는 치료제 사이에 공유결합을 유발한다. 또 다른 구현예에서, 상기 표면-노출된 아미노산 잔기는 위치 496에의 트레오닌, 위치 58에의 세린, 위치 76에의 트레오닌, 위치 79에의 트레오닌, 위치 83에의 트레오닌, 위치 125에의 트레오닌, 위치 236에의 트레오닌, 위치 270에의 세린, 위치 273에의 세린, 위치 304에의 세린, 위치 435에의 세린, 위치 478에의 트레오닌, 위치 506에의 트레오닌, 또는 위치 508에의 트레오닌이다.
아홉 번째 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 3, 및 6-15 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 HSA 약제 내 글리코실화(glycosylation) 부위를 통합하는 것에 의해 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌으로 치환함으로써 HSA 링커를 제조하는 방법을 특징으로 한다.
열 번째 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 3, 및 6-15 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔기를 HSA 약제로부터 글리코실화(glycosylation) 부위를 제거시키는 것에 의해 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 이외의 어떤 아미노산으로 치환함으로써 HSA 링커를 제조하는 방법을 특징으로 한다.
열한 번째 양태에서, 본 발명은 서열번호 16-25의 아미노산 서열 중 어느 하나에 적어도 90% 서열 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 HSA 링커를 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 상기 HSA 링커는 서열번호 16-25의 아미노산 서열 중 어느 하나에 적어도 95% 서열 동일성(identity)을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 HSA 링커는 서열번호 16-25의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 또 다른 구현예에서, HSA 링커는 서열번호 16-25의 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 상기 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트는 진단 또는 치료제와 결합된다. 진단제는 방사성(radioactive), 생체발광(bioluminescent), 형광(fluorescent), 중금속(heavy metal) 라벨 또는 에피토프 태그(epitope tag)와 같은 검출가능한 라벨을 포함한다. 형광 분자는 녹색 형광 단백질 (GFP), 증강된 GFP (eGFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 사이안 형광 단백질 (CFP), 적색 형광 단백질 (RFP) 및 dsRed를 포함하여 검출가능한 라벨로서 제공될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 생체발광 분자는 루시퍼라제(luciferase)이다. 다른 구현예에서, 상기 에피토프 태그는 c-myc, 헤마글루티닌(hemagglutinin) 또는 히스티딘(histidine) 태그이다. 또 다른 구현예에서, 상기 치료제는 사이코크롬(cytochrome) c, 카스페이즈(caspase) 1-10, 그란자임(granzyme) A 또는 B, 종양괴사인자-알파 (TNF-α), TNF-β, Fas, Fas 리간드, Fas-연관 사멸 도메인-유사 IL-1β 전환 효소 (FLICE), TRAIL/APO2L, TWEAK/APO3L, Bax, Bid, Bik, Bad, Bak, RICK, 혈관 아폽토시스 유도 반백질 1 및 2 (VAP1 및 VAP2), 피어리신(pierisin), 아폽토시스-유도 단백질 (AIP), IL-1α 프로피스(propiece) 폴리펩티드, 아폽틴(apoptin), 아폽틴-연관 단백질 1 (AAP-1), 엔토스타틴(endostatin), 안지오스타틴(angiostatin), 및 그들의 생물학적-활성 단편과 같은 세포독성 폴리펩티드이다. HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트는 사이클로포프파마이드(cyclophosphamide), 캠프토테신(camptothecin), 호모캠프토테신(homocamptothecin), 콜치신(colchicine), 콤브레스타틴(combrestatin), 콤브레스타틴(combrestatin), 리족신(rhizoxin), 돌리스타틴(dolistatin), 안사미토신(ansamitocin) p3, 마이탄시노이드(maytansinoid), 오리스타틴(auristatin), 칼레아치미신(caleachimicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실 (5-FU), 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 레트로졸(letrozole), 에피루비신(epirubicin), 베바시주맵(bevacizumab), 페루투주맵(pertuzumab), 트라스투주맵(trastuzumab), 및 그들의 유도체와 같은 하나 이상의 치료제와 조합될 수 있다(예컨대, 약학적 조성물과 조합되거나 혼합된다).
본 명세서에 개시된 임의의 양태의 구현예에서, 제1 및 제2 결합 부분 (및, 하나 이상의 제3 이상의 결합 부분이 존재할 경우)은 동일한 표적(target) 분자에 특이적으로 결합한다. 임의의 양태의 다른 구현예에서, 제1 및 제2 결합 부분 (및, 하나 이상의 제3 이상의 결합 부분이 존재할 경우)은 서로 다른 표적(target) 분자들에 특이적으로 결합한다. 임의의 양태의 또 다른 구현예에서, 제1 및 제2 결합 부분 (및, 하나 이상의 제3 이상의 결합 부분이 존재할 경우)은 동일한 표적(target) 분자 상의 서로 다른 에피토프들에 특이적으로 결합한다.
열두 번째 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 25-44 및 494-513 중 하나 또는 모두를 포함하는 HSA 링커를 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 상기 HSA 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 25-70 및 450-513을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 HSA 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 15-100 및 400-520을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 HSA 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 10-200 및 300-575를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 HSA 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 5-250 및 275-580을 포함한다.
본 발명의 열두 번째 양태에서, 상기 HSA 링커는 HSA 링커 콘쥬게이트 형성을 위해 적어도 제1 결합 부분과 연결된다. 하나의 양태에서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 상기 제1 결합 부분을 상기 HSA 링커의 아미노 또는 카르복시 말단에 결합시키는 적어도 제1 펩티드 커넥터(connector)를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 제1 펩티드 커넥터는 상기 제1 결합 부분을 상기 HSA 링커에 공유결합시킨다. 또 다른 구현예에서, 상기 HSA 링커는 제2 결합 부분을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 HSA 링커는 상기 제2 결합 부분을 상기 HSA 링커에 결합시키는 제2 펩티드 커넥터를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 제2 커넥터는 상기 제2 결합 부분을 상기 HSA 링커의 아미노 또는 카르복시 말단에 결합시킨다. 또 다른 구현예에서, 상기 제2 커넥터는 상기 제2 결합 부분을 상기 HSA 링커에 공유결합시킨다. 다른 구현예에서, 상기 HSA 링커는 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 결합 부분을 포함한다. 하나의 구현예에서, 이러한 추가적인 결합 부분은 제1 또는 제2 결합 부분의 하나 또는 둘 모두와 텐덤으로 존재한다. 또 다른 구현예에서, 펩티드 커넥터 (예컨대, AAS, AAQ 또는 AAAL (SEQ ID NO:5))는 하나 이상의 이러한 추가적인 결합 부분을 제1 또는 제2 결합 부분, 또는 상기 HSA 링커, 각각으로부터 분리한다.
본 발명의 열두 번째 양태에서, 상기 HSA 링커는 제1 결합 부분을 상기 폴리펩티드 링커의 아미노 말단에 공유결합시키는 제1 펩티드 커넥터, 및 제2 결합 부분을 상기 HSA 링커의 카르복시 말단에 공유결합시키는 제2 펩티드 커넥터를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 제1 커넥터는 아미노산 서열 AAS 또는 AAQ를 가지고, 상기 제2 커넥터는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 열두 번째 양태에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 상기 제3 이상의 결합 부분이 존재하는 경우)은 항체, 단일쇄 Fv 분자, 이중특이적(bispecific) 단일쇄 Fv ((scFv)2) 분자, 도메인 항체, 디아보디(diabodies), 트리아보디(triabodies), 호르몬, Fab 단편, F(ab)2 분자, 탠덤 scFv (taFv) 단편, 리셉터 (예컨대, 세포 표면 리셉터), 리간드, 앱타머, 또는 그들의 생물학적-활성 단편이다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 상기 제3 이상의 결합 부분이 존재하는 경우)은 인간 또는 인간화 단일쇄 Fv 분자이다.
본 발명의 열두 번째 양태에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 상기 제3 이상의 결합 부분이 존재하는 경우)은 인슐린-유사 성장인자 1 리셉터 (IGF1R), IGF2R, 인슐린-유사 성장인자 (IGF), 중배엽 상피 전이인자 리셉터 (c-met; 간세포 성장인자 리셉터로도 알려져 있음), 간세포 성장인자 (HGF), 표피 성장인자 리셉터 (EGFR), 표피 성장인자 (EGF), 헤레굴린(heregulin), 섬유아세포 성장인자 리셉터 (FGFR), 혈소판-유래 성장인자 리셉터 (PDGFR), 혈소판-유래 성장인자 (PDGF), 혈관내피 성장인자 리셉터 (VEGFR), 혈관내피 성장인자 (VEGF), 종양괴사인자 리셉터 (TNFR), 종양괴사인자 알파 (TNF-α), TNF-β, 폴레이트 립셉터 (FOLR), 폴레이트(folate), 트랜스페린 리셉터 (TfR), 메조셀린(mesothelin), Fc 리셉터, c-키트 리셉터, c-키트, 인테그린 (예컨대, α4 인테그린 또는 β1 인테그린), P-셀렉틴, 스핑고신-1-포스페이트 리셉터-1 (S1PR), 히알루로네이트 리셉터, 백혈구 기능 항원-1 (LFA-1), CD4, CD11, CD18, CD20, CD25, CD27, CD52, CD70, CD80, CD85, CD95 (Fas 리셉터), CD106 (혈관세포 부착 분자 1 (VCAM1)), CD166 (활성화 백혈구 부착 분자 (ALCAM)), CD178 (Fas 리간드), CD253 (TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL)), ICOS 리간드, CCR2, CXCR3, CCR5, CXCL12 (간질세포-유래 인자 1 (SDF-1)), 인터루킨 1 (IL-1), CTLA-4, MART-1, gp100, MAGE-1, 에프린 (Eph) 리셉터, 점막 어드레신 세포 부착 분자 1 (MAdCAM-1), 암배아 항원 (CEA), 루위스Y (LewisY), MUC-1, 상피세포 부착 분자 (EpCAM), 암 항원 125 (CA125), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), TAG-72 항원, 및 그들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 단백질이거나 이와 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 제1 또는 제2 결합 부분은 적아구성 류케미아 바이러스 종양유전자 호모로그 (ErbB) 리셉터 (예컨대, ErbB1 리셉터; ErbB2 리셉터; ErbB3 리셉터; 및 ErbB4 리셉터)이거나 이와 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 제3 이상의 결합 부분 존재이 존재하는 경우)은 알파-페토프로테인 (AFP) 또는 인터페론, 또는 그들의 생물학적-활성 단편이거나 이와 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 제1 또는 제2 결합 부분 (또는, 제3 이상의 결합 부분 존재이 존재하는 경우)은 나탈리주맵(natalizumab), 인플릭시맵(infliximab), 아달리무맵(adalimumab), 리툭시맵(rituximab), 알렘투주맵(alemtuzumab), 베바시주맵(bevacizumab), 다크리주맵(daclizumab), 에팔리주맵(efalizumab), 골리무맵(golimumab), 세르톨리주맵(certolizumab), 트라스투주맵(trastuzumab), 아바타셉트(abatacept), 에타너셉트(etanercept), 페르투주맵(pertuzumab), 세툭시맵(cetuximab), 파니투무맵(panitumumab) 또는 아나킨라(anakinra)이다.
본 발명의 열두 번째 양태에서, 상기 HSA 링커는 진단제, 치료제 또는 둘 모두와 결합된다. 하나의 구현예에서, 상기 진단제는 방사성, 형광 또는 중금속 라벨과 같은, 검출가능한 라벨이다. 다른 구현예에서, 상기 치료제는 세포독성(cytotoxic) 약제, 세포억제성(cytostatic) 또는 면역조절(immunomodulatory) 약제이다. 세포독성 약제는 알킬레이팅제, 항생제, 항종양제, 항증식제, 항대사제, 투불린 저해제, 토포이소머라제 I 또는 II 저해제, 호르몬 작용제 또는 길항제, 면역조절제, DNA 마이너 그루브 결합제 및 방사성제, 또는 종양 세포에 결합하여 사멸시키거나 종양 세포 증식을 억제시킬 수 있는 임의의 약제를 포함한다. 항종양제는 사이클로포프파마이드(cyclophosphamide), 캠프토테신(camptothecin), 호모캠프토테신(homocamptothecin), 콜치신(colchicine), 콤브레스타틴(combrestatin), 콤브레스타틴(combrestatin), 리족신(rhizoxin), 돌리스타틴(dolistatin), 안사미토신(ansamitocin) p3, 마이탄시노이드(maytansinoid), 오리스타틴(auristatin), 칼레아치미신(caleachimicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실 (5-FU), 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 레트로졸(letrozole), 에피루비신(epirubicin), 베바시주맵(bevacizumab), 페루투주맵(pertuzumab), 트라스투주맵(trastuzumab), 및 그들의 유도체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 연결된 HSA 링커는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합된다. 하나의 구현예에서, 상기 HSA 링커는 6시간 내지 7일 사이의 생체내 반감기(half-life)를 나타낸다. 다른 구현예에서, 상기 HSA 링커는 8시간보다 더 긴 생채내 반감기를 나타낸다.
본 발명의 열세 번째 양태는, 상기 HSA 링커가 서로 다른 폴리펩티드 링커로 대체된, 본 발명의 이전 양태 중 어느 하나 (열두 개 중 하나)의 약제를 특징으로 한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드 링커 서열은 포유동물, 예컨대 소, 쥐, 고양이 및 개 혈청 알부민(BSA) 폴리펩티드 서열과 같은 비-인간 혈청 알부민 폴리펩티드 서열일 수 있다. 다른 구현예에서 이러한 폴리펩티드 링커 서열은 5 내지 1,000 아미노산 서열 길이, 예컨대 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900 아미노산 길이, 또는 이 범위내의 임의의 아미노산 수이다. 다른 구현예에서, 상기 폴리펩티드 링커 서열은 단일 아미노산 (예컨대, 글리신, 알라닌, 세린, 글루타민, 류신 및 발린을 포함하나, 이에 한정되지 않는), 또는 아미노산들의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 HSA 링커는 알파-페토단백질 (AFP) 폴리펩티드, 예컨대, 인간, 쥐, 소 또는 개 AFP 폴리펩티드와 같은, 포유동물 AFP 폴리펩티드로 대체된다. 하나의 구현예에서, AFP 링커는 전장 길이 인간 AFP 폴리펩티드 서열 (a,a. 1-609; 서열번호 58), 아미노산 1-18의 신호서열이 결핍된 성숙 인간 AFP 폴리펩티드 서열 (a.a., 서열번호 58의 19-609), 또는 그들의 단편에 일치한다. 다른 구현예에서, 상기 AFP 폴리펩티드 링커 서열은 서열번호 58의 적어도 5 내지 8 인접한 연결(contiguous) 아미노산, 바람직하게는 적어도 10, 20 또는 50 인접한 연결 아미노산, 더욱 바람직하게는 100 인접한 연결 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 200, 300, 400 또는 그 이상의 인접한 연결 아미노산을 포함하거나, 하나 이상의 이러한 길이를 갖는 서열번호 58의 인접한 연결 폴리펩티드 서열에 적어도 90% 동일성 (예컨대, 적어도 95%, 97%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는다. 예를 들어, 서열번호 58의 아미노산 446-479에 일치하는 34-mer 인간 AFP 펩티드에 90% 서열 동일성을 갖는 AFP 폴리펩티드 링커 서열 (LSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEMTPVNPGV; 서열번호 59)은 서열번호 58의 446-479 단편으로부터 변경된 3 아미노산까지를 포함할 수 있다. 생물학적 활성의 인간 AFP 단편에서 서열 편차(sequence deviation)의 하나의 예는 예컨대, 2 아미노산 잔기 (서열번호 59의 아미노산 9 및 22)에서 유연성(flexibility)이 있는 인간 AFP의 34-아미노산 단편 (서열번호 59)을 설명하는, U.S. Patent No. 5,707,963 (본 명세서에 참조로서 편입됨)에 개시되어 있다. AFP 폴리펩티드 링커 서열의 다른 예들은, 예커대 서열번호 58의 19-198 (인간 AFP 도메인 I), 서열번호 58의 아미노산 217-408 (인간 AFP 도메인 II), 서열번호 58의 아미노산 409-609 (인간 AFP 도메인 III), 서열번호 58의 아미노산 19-408 (인간 AFP 도메인 I+II), 서열번호 58의 아미노산 217-609 (인간 AFP 도메인 II+III), 및 서열번호 58의 아미노산 285-609 (인간 AFP 단편 I)를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 인간 AFP 폴리펩티드 링커 서열은 서열번호 58의 아미노산 489-496 (즉, EMTPVNPG)을 포함하는 8-아미노산 서열이다.
본 발명의 열네 번째 양태는 임의의 HSA 링커, HSA 링커 콘쥬게이트, 또는 상기에서 설명한 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 열한 번째, 열두 번째, 및 열세 번째 양태에 개시된 임의의 다른 약제를 포함하는 키트를 특징으로 한다. 상기 키트는 당업자 (예컨대, 의사, 간호사 또는 환자)가 본 명세서에 포함된 상기 조성물 및 약제를 투여하도록 허용하는 설명서를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 키트는 유효한 양의 약제, 예컨대 하나 이상의 결합 부분(예컨대 항체들 또는 항체 단편 (예컨대 scFv)), 진단제 (예컨대, 방사성 핵종(radionuclide) 또는 킬레이트제(chelating agents)), 및/또는 치료제 (예컨대, 세포독성 또는 면역조절 약제)를 포함하는, 예컨대 본 명세서에 개시된 것과 같은 HSA 링커 콘쥬게이트 또는 HSA 링커를 포함하는 단회- 또는 다회-투여용량 약학적 조성물의 다중 패키지를 포함한다. 선택적으로, 약학적 조성물을 투여하는데 필수적인 설명서 또는 기구가 상기 키트에 포함될 수 있다. 예를 들어, 키트는 유효한 양의 HSA 링커 콘쥬게이트 또는 HSA 링커, 또는 이와 결합된 임의의 결합, 진단 및/또는 치료제를 포함하는 하나 이상의 미리-채워진(pre-filled) 주사기를 제공할 수 있다. 또한, 상기 키트는, 예컨대 HSA 링커 콘쥬게이트 또는 HSA 링커, 또는 이와 결합된 임의의 결합, 진단, 및/또는 치료제를 포함하는 약학적 조성물을 사용하기 위하여, 질환 또는 병 (예컨대, 암, 자가면역질환 또는 심혈관 질환)으로부터 고통 받고 있는 환자를 위한 설명서 또는 투여 일정과 같은 추가적인 요소들을 포함할 수 있다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용된 용어 항체(antibody)는, 전 항체(whole antibodies) 또는 면역글로불린 및 임의의 항원-결합 단편 또는 그의 단일쇄를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 항체들(antibodies)은, 포유동물 (예컨대, 인간 또는 마우스), 인간화, 키메라, 재조합, 합성적으로 생산된, 또는 자연적으로 분리될 수 있다. 인간을 포함한, 대부분의 포유동물에서, 전체 항체들은 이황화 결합으로 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 갖는다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)(본 명세서에서 VH로 약기됨) 및 중쇄 불변 영역(heavy chain constant region)로 구성된다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3과, CH1 및 CH2 사이의 힌지 영역(hinge region)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(chain variable region)(본 명세서에서 VL로 약기됨) 및 경쇄 불변 영역(light chain constant region)로 구성된다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. 상기 VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(framework regions, FR)로 불리는 더욱 보존된 영역에 산재되어 있는, 상보성 결정 부위(complementarity determining regions, CDR)로 불리는 초가변성(hypervariability) 영역들로 다시 나뉠 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDRs 및 4개의 FRs로 구성되고, 다음과 같은 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체들의 불변 영역은 면역글로불린이 면역 시스템의 다양한 세포들 (예컨대, 효력세포(effector cells)) 및 고전적인 보체계(classical complement system)의 제1 구성요소(first component, C1q)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자들에의 결합을 조정할 수 있다. 본 발명의 항체들은 모든 알려진 형태의 항체들 및 항체-유사 특성을 갖는 다른 단백질 스캐폴드(protein scaffolds)를 포함한다. 예를 들어, 상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이적(bispecific) 항체, 키메라 항체 또는 피브로넥틴(fibronectin) 또는 안키린리피트(ankyrin repeats)와 같은, 항체-유사 특성을 갖는 단백질 스캐폴드일 수 있다. 상기 항체는 또한 Fab, F(ab)2, scFv, SMIP, 디아보디(diabodies), 나노보디(nanobody), 앱타머 또는 도메인 항체일 수 있다. 상기 항체는 다음의 이소타입 중 임의의 것을 가질 수 있다: IgG (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4), IgM, IgA (e.g., IgA1, IgA2, and IgAsec), IgD 또는 IgE. HSA 링커와 조합하여 본 명세서에 정의된 결합 부분으로 사용될 수 있는 항체들은, 나탈리주맵(natalizumab), 인플릭시맵(infliximab), 아달리무맵(adalimumab), 리툭시맵(rituximab), 알렘투주맵(alemtuzumab), 베바시주맵(bevacizumab), 다크리주맵(daclizumab), 에팔리주맵(efalizumab), 골리무맵(golimumab), 세르톨리주맵(certolizumab), 트라스투주맵(trastuzumab), 아바타셉트(abatacept), 에타너셉트(etanercept), 페르투주맵(pertuzumab), 세툭시맵(cetuximab) 및 파니투무맵(panitumumab)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 항체 단편은 항원 (예컨대, ErbB2)과 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어, 항체의 항원-결합 부위(antigen-binding portion) 내 포함되는 결합 단편의 예들은 다음을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일암(single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 및 VL 도메인을 포함하는 dAB; (vi) VH 도메인으로 구성된, dAb 단편 (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)) (vii) VH 또는 VL 도메인으로 구성되는 dAb; (viii) 분리된 상보성 결정 부위(CDR); 및 (ix) 합성의 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 2 이상의 분리된 CDRs의 조합. 또한, Fv 단편의 2개 도메인, VL 및 VH가 분리된 유전자(separate genes)에 의해 코딩되더라도, VL 및 VH 영역이 1가 분자를 형성하도록 쌍을 이루어 단백질 단일쇄(single protein chain)로 만들 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여, 그들은 결합될 수 있다 (단일쇄로 알려진 Fv (scFv); 예컨대, Bird et al., Science 242:423-426 (1988) 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988) 참조). 이러한 항체 단편들은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 전통적인 기술들을 이용하여 얻을 수 있으며, 상기 단편들은 온전한 항체들로 동일한 방법에 유용하도록 스크리닝된다. 항체 단편들은 재조합 DNA 기술, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
자가면역질환이라 함은 면역 시스템 반응이 자가 에피토프 또는 항원에 대하여 일어나는 질환을 의미한다. 자가면역질환의 예들은, 원형탈모증(alopecia areata), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 항인지질증후군(antiphospholipid syndrome), 자가면역 애디슨병(autoimmune Addisons disease), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 베체트병(Behcets disease), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 심근증(cardiomyopathy), 셀리악 스프루-피부염(celiac Sprue-dermatitis), 만성피로면역이상증후군(chronic fatigue immune dysfunction syndrome, CFIDS), 만성염증성탈수초성다발성신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 척－스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 반흔성유천포창(cicatricial pemphigoid), 크레스트 증후군(CREST syndrome), 저온응집병(cold agglutinin disease), 크론병(Crohns disease), 원판형 루프스(discoid lupus), 본태성 복합 한랭글로불린형증(essential mixed cryoglobulinemia), 섬유성근통-섬유성근염(fibromyalgia-fibromyositis), 그리이브병(Graves disease), 질리안-바레병(Guillain-Barrsyndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimotos thyroiditis), 갑상선기능저하증(hypothyroidism), 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenia purpura, ITP), IgA 신장병(nephropathy), 인슐린 의존성 당뇨병(insulin dependent diabetes), 소아관절염(juvenile arthritis), 편평태선(lichen planus), 루프스(lupus), 메니에르병(Ms disease), 혼합 결합 조직병(mixed connective tissue disease), 다발경화증(multiple sclerosis), 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 악성빈혈(pernicious anemia), 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 다연골염(polychondritis), 다선성 증후군(polyglandular syndromes), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발근육염과 피부근육염(polymyositis and dermatomyositis), 원발성 무감마글로불린혈증(primary agammaglobulinemia), 원발성 답즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 건선(psoriasis), 레이노증후군(Raynauds phenomenon), 레이터증후군(Reiters syndrome), 류미티스열(rheumatic fever), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 유육종증(sarcoidosis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjs syndrome), 스티프맨증후군(Stiff-Man syndrome), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 다카야수혈관염(Takayasu arteritis), 측두동맥염/거대세포동맥염(temporal arteritis/giant cell arteritis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 포도막염(uveitis) (예컨대, 버드샷 레티노코로이도퍼시 포도막염(birdshot retinochoroidopathy uveitis) 및 사르코이드 포도막염(sarcoid uveitis)), 혈관염(vasculitis), 백반증(vitiligo), 베게너 육아종증(Wegeners granulomatosis) 및 중증근육무력증(myasthenia gravis)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
결합 부분(binding moiety)이라 함은 타겟 에피토프, 항원, 리간드 또는 리셉터에 특이적으로 결합하는 임의의 분자를 의미한다. 결합 부분은 항체들 (예컨대, 단클론, 다클론, 재조합, 인간화 및 키메라 항체), 항체 단편 (예컨대, Fab 단편, Fab'2, scFv 항체, SMIP, 도메인 항체, 디아보디(diabodies), 미니보디(minibodies), scFv-Fc, 애피보디(affibodies), 나노보디 및 도메인 항체), 리셉터, 리간드, 앱타머 및 공지의 결합 파트너를 갖는 다른 분자들을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
생물학적-활성이라 함은 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질과 같은, 생물학적 분자들을 포함하는 분자를 의미하고, 그 자체 또는 다른 분자에 대하여 물리적 또는 화학적 활성을 발휘한다. 예를 들어, 생물학적-활성 분자는, 예컨대 효소적 활성, 단백질 결합 활성 (예컨대, 항체 상호작용들), 또는 세포독성 활성이 생물학적-활성을 포함할 수 있다.
용어 키메라 항체는 가변 영역이 제1 종(first species)으로부터 유래하고 불변 영역이 제2 종(second species)으로부터 유래된 면역글로불린 또는 항체를 지칭한다. 키메라 항체는, 예들 들어, 서로 다른 종 (예컨대, 마우스와 인간으로부터)에 속하는 면역글로불린 유전자 단편으로부터, 유전공학에 의해, 제조될 수 있다.
커넥터 또는 펩티드 커넥터라 함은 HSA 링커의 아미노 또는 카르복시 말단의 하나 또는 둘 모두에 공유적으로 부착되거나, HSA 링커의 하나 이상의 잔기 (예컨대, 아미노 및 카르복시 말단 잔기 사이의 잔기)에 공유적으로 부착되는 길이의 2 내지 20 잔기의 아미노산 서열을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 상기 HSA 링커의 아미노 말단에 부착된 펩티드 커넥터는 아미노산 서열 AAS 또는 AAQ를 가지고 상기 카르복시 말단에 부착된 커넥터는 아미노산 서열 AAAL을 가진다 (서열번호 5).
용어 유효한 양 또는 ~에 유효한 양 또는 치료적으로 유효한 양은 원하는 결과를 얻는데, 예를 들어, 암세포를 사멸시키거나, 종양 세포 증식을 감소시키거나, 병에 걸린 조직 또는 기관에서 염증을 감소시키거나, 조직, 기관 또는 생물 (예컨대, 인간)에서 세포의 특이적 개체군을 라벨링 하는데 충분한 약제의 양 (예컨대, 하나 이상의 결합 부분과 결합된 HSA 링커 또는 커넥터 서열이 있거나 없는 진단 또는 치료제)을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 인간 항체는, 예들 들어, Kabat 등 (Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991))에 의해 개시된 바와 같이, 프레임워크 및 CDR 영역 둘 모두가 인간 생식계역(germline) 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체 또는 그 단편을 포함하는 것으로 여겨진다. 또한, 상기 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 상기 불변 영역 또한 인간 생식계역 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 상기 인간 항체들은 인간 생식계열 면역글로불린 서열들에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기들 (예컨대, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이생성 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이들)을 포함할 수 있다. 그러나 본 명세서에 사용된 용어 인간 항체는, 마우스와 같은, 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 융합(grafted)되어 있는 항체 (즉, 인간화 항체 또는 항체 단편)를 포함하는 것으로 여겨지지는 않는다.
용어 인간화 항체는 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 가변 프레임워크 영역을 포함하는 가변 영역 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 영역 (예컨대, 적어도 하나의 CDR)을 결정하는 상보성을 갖는 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 포함하는 임의의 항체 또는 항체 단편을 의미한다.
본 명세서에 사용된, 염증 신호 저해제(inflammatory signaling inhibitor) 또는 ISI는 전-염증성 사이토카인 (예컨대, TNF-alpha, TNF-beta 또는 IL-1) 및 그 리셉터 (예컨대, 각각 TNF 리셉터 1 또는 2, 또는 IL-1 리셉터) 사이의 결합을 감소시키거나; 활성화 분자의 전-염증성 세포 표면 신호 분자들 (예컨대, CD20, CD25, CTLA-4, CD80/CD86 또는 CD28)에 대한 결합을 감소시키거나; 전-염증성 사이토카인의 그들의 리셉터에 대한 결합 또는 활성화 분자의 전-염증성 세포 표면 신호 분자에 대한 결합에 이어 활성화되는 세포내 신호 분자들의 활성 또는 하류(downstream) 활성화를 감소시키는 약제 (예컨대, p38 MAPK 신호전달경로에서 신호 분자들의 활성화 또는 활성을 감소시키는 약제)이다. ISI에 의해 매개된 감소는 상기 전-염증성 사이토카인 및 그 리셉터 사이의 결합에서의 감소, 상기 활성화 분자의 전-염증성 사이토카인 세포 표면 신호 분자에 대한 결합에서의 감소, 또는 전-염증성 사이토카인의 그 리셉터 또는 활성화 분자의 전-염증성 세포 표면 신호 분자의 결합에 이어 발생하는 상기 세포내 신호의 감소이다. 바람직하게는, ISI에 의해 매개된 이러한 감소는 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40% 또는 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% (100% 까지)의 감소이다. ISI는 상기 리셉터와 자유롭게 결합 가능한 전-염증성 사이토카인 (예컨대 TNF-alpha, TNF-beta 또는 IL-1)의 양을 감소시킴으로써 작용할 수 있다. 예를 들어, ISI는 가용성 전-염증성 사이토카인 리셉터 단백질 (예컨대, (ENBREL) 또는 레네셉트(lenercept)와 같은 가용성 TNF 리셉터 융합 단백질), 또는 가용성 전-염증성 세포 표면 신호 분자 (예컨대, 가용성 CTLA-4 (abatacept)), 또는 전-염증성 사이토카인 또는 전-염증성 세포 표면 신호 분자 (예컨대, 아달리무맵(adalimumab), 세르톨리주맵(certolizumab), 인플릭사맵(inflixamab) 또는 골리무맵(golimumab)과 같은, 항-TNF 항체; 리툭시맵(rituximab)과 같은 항-CD20 항체; 또는 TRU-015 (Trubion Pharmaceuticals)에 대하여 지시된 항체일 수 있다. 또한, ISI는 상기 내생적 야생형 전-염증성 사이토카인 또는 상기 전-염증성 세포 표면 신호 분자가 그 리셉터 (예컨대, TNF 리셉터 1 또는 2, IL-1 리셉터- 예컨대, 아나킨라(anakinra) 또는 CD11a- 예컨대, 에팔리주맵(efalizumab) (RAPTIVA, Genentech))에 결합하는 능력을 방해함으로써 작용할 수 있다. TNF-알파 변이체의 예들은 XENP345 (TNF 변이체 A145R/I97T의 pegylated 버전) 및 XproTM1595이고, 또 다른 변이체들은 U.S. Patent Application Publication Nos. 20030166559 및 20050265962에 개시되어 있으며 본 명세서에 참조로서 편입된다. 우성 음성 IL-1 변이체의 예는 아나킨라(anakinra)(KINERET)이고, 이는 세포내 신호전달경로를 활성화하지 않고 IL-1 리셉터에 결합하는 IL-1의 가용성 형태이다. 본 발명에 사용될 수 있는 염증 신호 저해제는, 또한 전-염증성 사이토카인의 신호전달경로 하류 또는 전-염증성 세포 표면 신호 분자를 저해하거나 감소시키는 작은 분자들이다 (예컨대 DE 096). 이러한 종류의 ISIs의 예들은, p38 MAP 키나아제의 저해제, 예컨대 (본 명세서에 편입된, WO 04/089929에 개시된 바와 같은) 5-amino-2-carbonylthiopene 유도체들; ARRY-797; BIRB 796 BS, (1-5-tert-butyl-2-p-tolyl-2H-pyrazol-3-yl)-3-[4-2(morpholin-4-yl-ethoxy)-naphtalen-1-yl]-urea); CHR-3620; CNI-1493; FR-167653 (Fujisawa Pharmaceutical, Osaka, Japan); ISIS 101757 (Isis Pharmaceuticals); ML3404; NPC31145; PD169316; PHZ1112; RJW67657, (4-(4-(4-fluorophenyl)-1-(3-phenylpropyl)-5-(4-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl)-3-butyn-1-ol; SCIO-469; SB202190; SB203580, (4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)1H-imidazole); SB239063, trans-1-(4-hydroxycyclohexyl)-4-(4-fluorophenyl-methoxypyridimidin-4-yl)imidazole; SB242235; SD-282; SKF-86002; TAK 715; VX702; 및 VX745를 포함한다. 또한, ISI는 전-염증성 사이토카인 (예컨대, TNF-alpha 및 TNF-beta)의 막 결합 형태에서 가용성 형태로의 프로세싱(processing)을 방해할 수 있다. TACE의 저해제는 이러한 클래스의 ISIs이다. TACE의 저해제의 예들은 BB-1101, BB-3103, BMS-561392, 부티닐옥시페닐 β-설폰 피페리딘 히드록소메이트(butynyloxyphenyl β-sulfone piperidine hydroxomates), CH4474, DPC333, DPH-067517, GM6001, GW3333, Ro 32-7315, TAPI-1, TAPI-2, 및 TMI 005를 포함한다. ISIs의 추가적인 예들은 병-특이적 면역조절 활성을 위해 가동된 E. coli 열충격단백질(heat shock proteins)로부터 유래된 짧은 펩티드를 포함한다 (예컨대, dnaJP1).
인테그린 길항제(integrin antagonist)라 함은 인테그린 분자의 α4 서브유닛과 같은, 인테그린 분자의 생물학적 활성을 감소시키거나 저해시키는 임의의 약제를 의미한다 (예컨대, 인테그린 길항제 부재시 생물학적 활성과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상의 감소 또는 저해). 상기 약제는 α4 서브유닛의 활성 또는 발현을 저해함으로써 α4 인테그린 서브유닛 (NCBI Accession No. P13612; Takada et al., EMBO J. 8:1361-1368 (1989))에 직접 또는 간접적으로 작용하거나, α4 서브유닛을 포함하는 온전한 인테그린이 결합하는 타겟에 작용할 수 있다. 예들 들어, α4β1 인테그린의 VCAM-1에의 결합을 방해하는, 혈관 세포 부착 분자-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)에 결합하는 항체 또는 블로킹 펩티드(blocking peptide)는 본 발명의 목적을 위한 인테그린 길항제로 간주된다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 비-제한적 대표적 인테그린 길항제는 단백질, 블로킹 펩티드, 나탈리주맵(natalizumab) (TYSABRI)와 같은 항체, 및 작은 분자 저해제를 포함한다. α4 인테그린 길항제의 예들은, 나탈리주맵(natalizumab) (Elan/Biogen Idec; 예컨대, U.S. Patent Nos. 5,840,299; 6,033,665; 6,602,503; 5,168,062; 5,385,839; 및 5,730,978 참조; 본 명세서에 참조로서 편입됨), oMEPUPA-V (Biogen; U.S. Patent No. 6,495,525; 본 명세서에 참조로서 편입됨), 알레파셉트(alefacept), CDP-323 (Celltech); 피라테그라스트(firategrast)(SB-68399; GlaxoSmithKline); TR-9109 (Pfizer); ISIS-107248 (Antisense Therapeutics); R-1295 (Roche); 및 TBC-4746 (Schering-Plough)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. α4 인테그린 길항제의 추가적인 비-제한적 예들은 다음에 개시된 작은 분자들을 포함한다. U.S. Patent Nos. 5,821,231; 5,869,448; 5,936,065; 6,265,572; 6,288,267; 6,365,619; 6,423,728; 6,426,348; 6,458,844; 6.479,666; 6,482,849; 6,596,752; 6,667,331; 6,668,527; 6,685,617; 6,903,128; 및 7,015,216 (각각은 본 명세서에 참조로서 편입됨); U.S. Patent Application Publication Nos. 2002/0049236; 2003/0004196; 2003/0018016; 2003/0078249; 2003/0083267; 2003/0100585; 2004/0039040; 2004/0053907; 2004/0087574; 2004/0102496; 2004/0132809; 2004/0229858; 2006/0014966; 2006/0030553; 2006/0166866; 2006/0166961; 2006/0241132; 2007/0054909; 및 2007/0232601 (각각은 본 명세서에 참조로서 편입됨); European Patent Nos. EP 0842943; EP 0842944; EP 0842945; EP 0903353; 및 EP 0918059; 및 PCT Publication Nos. WO 95/15973; WO 96/06108; WO 96/40781; WO 98/04247; WO 98/04913; WO 98/42656; WO 98/53814; WO 98/53817; WO 98/53818; WO 98/54207; WO 98/58902; WO 99/06390; WO 99/06431; WO 99/06432; WO 99/06433; WO 99/06434; WO 99/06435; WO 99/06436; WO 99/06437; WO 99/10312; WO 99/10313; WO 99/20272; WO 99/23063; WO 99/24398; WO 99/25685; WO 99/26615; WO 99/26921; WO 99/26922; WO 99/26923; WO 99/35163; WO 99/36393; WO 99/37605; WO 99/37618; WO 99/43642; WO 01/42215; 및 WO 02/28830; 이 모두는 본 명세서에 참조로서 편입된다. α4 인테그린 길항제의 추가적인 예들은 다음에 개시된 페닐알라닌 유도체들을 포함한다: U.S. Patent Nos. 6,197,794; 6,229,011; 6,329,372; 6,388,084; 6,348,463; 6,362,204; 6,380,387; 6,445,550; 6,806,365; 6,835,738; 6,855,706; 6,872,719; 6,878,718; 6,911,451; 6,916,933; 7,105,520; 7,153,963; 7,160,874; 7,193,108; 7,250,516; 및 7,291,645 (각각은 본 명세서에 참조로서 편입됨). α4 인테그린 길항제인 추가적인 아미노산 유도체들은 다음에 개시된 것들 포함한다. 예컨대, U.S. Patent Application Publication Nos. 2004/0229859 및 2006/0211630 (각각은 본 명세서에 참조로서 편입됨), 및 PCT Publication Nos. WO 01/36376; WO 01/47868; 및 WO 01/70670; 이 모두는 본 명세서에 참조로서 편입된다. α4 길항제의 다른 예들은 다음에 개시된 상기 펩티드, 및 상기 펩티드 및 세미-펩티드 화합물을 포함한다. 예컨대, PCT Publication Nos. WO 94/15958; WO 95/15973; WO 96/00581; WO 96/06108; WO 96/22966 (Leu-Asp-Val tripeptide; Biogen, Inc.); WO 97/02289; WO 97/03094; 및 WO 97/49731. α4 인테그린 길항제의 추가적인 예는 U.S. Patent Application Publication No. 2007/066533 (본 명세서에 참조로서 편입됨)에 개시된 페글레이트(pegylated)된 분자들이다. α4 인테그린 길항제인 항체의 예들은, 예컨대 PCT Publication Nos. WO 93/13798; WO 93/15764; WO 94/16094; 및 WO 95/19790에 개시된 것들을 포함한다. α4 인테그린 길항제의 추가적인 예들은 본 명세서에 개시되어 있다.
인터페론이라 함은 포유동물 (예컨대, 인간) 인터페론-알파, -베타, -감마 또는 -타우(tau) 폴리펩티드, 또는 그의 생물학적-활성 단편, 예컨대, IFN-α (예컨대, IFN-α-1a; U.S. Patent Application No. 20070274950 참조, 본 명세서에 참조로서 편입됨), IFN-α-1b, IFN-α-2a (PCT Application No. WO 07/044083 참조, 본 명세서에 참조로서 편입됨) 및 IFN-α-2b), IFN-β (예컨대, U.S. Patent No. 7,238,344에 개시됨, 본 명세서에 참조로서 편입됨; IFN-b-1a (AVONEXand REBIF), U.S. Patent No. 6,962,978에 개시된 것, 본 명세서에 참조로서 편입됨; 및 IFN-β-1b (BETASERON, U.S. Patent Nos. 4,588,585; 4,959,314; 4,737,462; 및 4,450,103에 개시된 것, 전체로서 본 명세서에 참조로서 편입됨), IFN-g, 및 IFN-t (U.S. Patent No. 5,738,845 및 U.S. Patent Application Publication Nos. 20040247565 및 20070243163에 개시된 것; 본 명세서에 참조로서 편입됨)을 의미한다.
HSA 링커 콘쥬게이트라 함은 하나 이상의 결합 부분, 펩티드 커넥터, 진단제 또는 치료제와 조합하여(바람직하게 공유 결합하여) 인간 혈청 알부민(HSA) 링커를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 단클론 항체는 실질적으로 동종의 항체들의 개체로부터 얻은 항체를 의미한다. 즉, 상기 개체를 포함하는 상기 개별 항체는 소량으로(in minor amounts) 존재할 수 있는 자연적으로 발생하는 돌연변이 가능성을 제외하고는 동일하다. 단글론 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 부위에 대하여 유도된다. 또한, 서로 다른 결정기 (에피토프)에 대하여 유도된 서로 다른 항체를 전형적으로 포함하는 전통적인 (다클론) 항체 특성과 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 상기 항원에 대한 단일 결정기에 대하여 유도된다. 단클론 항체는 당업계에 공지된 임의의 기술 및 본 명세서에 개시된 것, 예들 들어, Kohler et al., Nature 256:495 (1975)에 개시된 하이브리도마 방법, 유전자 이식 동물 (예컨대, Lonberg et al., Nature 368(6474):856-859 (1994)), 재조합 DNA 방법 (예컨대, U.S. Pat. No. 4,816,567), 또는 예들 들어, Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 개시된 기술을 이용한 파지, 효모를 이용하거나, 합성 스캐폴드 항원 라이브러리을 이용하여 제조될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체라 함은 그것이 투여되면서 상기 화합물의 치료적 특성을 유지한 채 처치되는 포유동물에 생리학적으로 허용가능한 담체를 의미한다. 하나의 대표적인 약학적으로 허용가능한 담체는 생리식염수이다. 다른 생리학적으로 허용가능한 담체 및 그들의 제형은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, Remingtons Pharmaceutical Sciences, (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA에 개시되어 있다.
증식성 질환(proliferative disease) 또는 암(cancer)은 비정상 또는 조절되지 않는 세포 성장에 의해 특징되는 임의의 병을 의미한다. 증식성 질환의 예들은, 예들 들어, 사르코마(sarcomas) (예컨대, 클리어세포 사르코마(clear cell sarcoma)), 암종(carcinomas) (예컨대, 신세포암(renal cell carcinoma)), 및 림프종(lymphomas); 유방(breast), 결장(colon), 직장(rectum), 폐(lung), 구강인두(oropharynx), 하인두(hypopharynx), 식도(esophagus), 위(stomach), 췌장(pancreas), 간(liver), 담즙낭(bilecyst), 담관(bile duct), 소장(small intestine), 비뇨기관(urinary system) (신장, 방광 및 요로의 상피를 포함), 여성생식기관(female genital system) (자궁경부, 자궁, 난소, 융모종 및 임신성 융모를 포함), 남성생식기관(male genital system) (전립선, 저정낭 및 고환을 포함), 내분비선(endocrine glands) (갑상선, 부신 및 뇌하수체를 포함), 피부 (안지오마(angioma), 멜라노마, 뼈 또는 연조직에서 기원한 사르코마, 및 카포시 사르코마를 포함), 뇌 및 뇌수막(brain and meninges) (성상세포종(astrocytoma), 신경성상교종(neuroastrocytoma), 해면아종(spongioblastoma), 망막아세포종(retinoblastoma), 신경종(neuroma), 신경아세포종(neuroblastoma), 신경초종(neurinoma) 및 신경아세포종(neuroblastoma)을 포함), 신경(nerves), 눈(eyes), 조혈계(hemopoietic system) (녹색백혈병(chloroleukemia), 형질세포종(plasmacytoma) 및 피부 T 림프종/백혈병을 포함), 및 면역시스템 (림프종, 예컨대 Hodgkins 림프종 및 non-Hodgkins 림프종을 포함)의 종양과 같은: 고형암을 포함한다. 비-고형암 증식성 질환의 예는 백혈병 (예컨대, 급성 림프구성 백혈병)이다.
용어 재조합 항체는 (a) 면역글로불린 유전자 (예컨대, 인간 면역글로불린 유전자들)가 트랜스제닉(transgenic) 또는 트랜스염색체(transchromosomal)된 포유동물 (예컨대, 마우스) 또는 그들로부터 제조된 하이브리도마로부터 분리된 항체, (b) 항체를 발현하는 형질전환된 숙주세포 (예컨대, 트랜스펙토마(transfectoma))로부터 분리된 항체, (c) 파지, 효모 또는 합성 스캐폴드 디스플레이(synthetic scaffold display)를 이용한 재조합, 조합의 항체 라이브러리 (예컨대, 인간 항체 서열을 포함)로부터 분리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 면역글로불린 유전자 서열을 삽입(splicing)하는 것을 포함하는 임의의 다른 방법들에 의해 제조, 발현, 창조 또는 분리된 항원과 같은, 재조합 방법들에 의해 제조, 발현, 창조 또는 분리된 항원을 의미한다.
특이적으로 결합이라 함은 타겟 분자가 결핍된 비-타겟 세포 또는 조직에 대한 결합이 아닌, 타겟 분자 (예컨대, 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 리셉터 또는 리간드와 같은 분비된 타겟 분자) 또는 타겟 분자를 지지하는 세포 또는 조직 (예컨대, 리셉터 또는 리간드와 같은, 세포 표면 항원)에 대한 결합 부분 (예컨대, 항체, 항체 단편, 리셉터, 리간드 또는 본 명세서에 개시된 것과 같은 약제의 작은 분자 일부)의 선택적인 결합을 의미한다. 비-특이적 상호작용의 특정 정도는 결합 부분과 (세포 또는 조직 단독 또는 조합하여 존재하는) 비-타겟 분자 사이에 발생할 수 있는 것으로 여겨진다. 그럼에도 불구하고, 특이적 결합은 타겟 분자의 특이적 인식을 통해 조절됨으로서 구별될 수 있다. 특이적 결합은 결합 부분과 예컨대, 타겟 분자가 결핍된 세포 사이에서 보다 결합 부분 (예컨대, 항원)과 타겟 분자 (예컨대, 항원)를 지지하는 세포 사이에서 더 강한 결합을 유도한다. 특이적 결합은 예컨대, 타겟 분자 또는 마커가 결핍된 세포 또는 조직과 비교하여 타겟 분자 또는 마커를 지지하는 세포 또는 조직에 결합된 결합 부분 (유닛 시간당) 양의 증가를, 대체로 2배 더 크게, 바람직하게는 5배 더 크게, 더욱 바람직하게는 10배 더 크게, 가장 바람직하게는 100배 더 크게 유도한다. 결합 부분은 예컨대, 10-6M 보다 적은, 더욱 바람직하게는 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M 또는 10-12M 보다 적은, 가장 바람직하게는 10-13M, 10-14M 또는 10-15M 보다 적은 해리상수(dissociation constant)를 갖는 상기 타겟 분자 또는 마커와 결합한다. 이러한 조건하에서 단백질에 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 그것의 특이성을 위해 선택된 결합 부분을 필요로 한다. 다양한 분석 포맷들이 특정 타겟 분자에 특이적으로 결합가능한 결합 부분 (예컨대, 항체)을 선택하는데 적당하다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석법(solid-phase ELISA immunoassays)이 단백질과 특이적으로 면역반응하는 단클론 항체를 선택하는데 관례적으로 사용될 수 있다. 특이적 면역반응성을 결정하는데 사용될 수 잇는 면역분석 포맷 및 조건들의 개시에 대해서는, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)를 참조.
서열 동일성은 (참조 서열(reference sequence)과 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 비교하는 관점에서 사용될 경우) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 참조 서열과 같은 동일하거나, 2개의 서열들이 선택적으로 배열될 때 참조 서열 내 대응하는 위치에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 지정된 퍼센트를 갖는 것을 의미한다.
표면-노출된 아미노산 잔기 또는 표면-노출된이라 함은 HSA 폴리펩티드의 폴딩(folded)되고 형태적으로-교정된(conformationally-correct) 3차 구조의 외부 표면 상에 존재하는 아미노산 잔기를 의미한다. 이러한 잔기들은, 진단 또는 치료제의 부위-특이적 콘쥬게이션이 허용되도록 예컨대 다른, 화학적-반응성, 아미노산들 (예컨대, 시스테인)로 치환될 수 있다. 추가적으로, 표면-노출된 아미노산 잔기들은 글리코실화를 (예컨대, 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴 잔기 또는 글리코실화 모티프(glycosylation motifs)의 추가에 의해) 허용하거나 (예컨대, 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴 잔기 또는 글리코실화 모티프(glycosylation motifs)의 제거에 의해) 방지하도록 치환될 수 있다. 표면-노출된 아미노산 잔기들은, 위치 496에의 트레오닌, 위치 58에의 세린, 위치 76에의 트레오닌, 위치 79에의 트레오닌, 위치 83에의 트레오닌, 위치 125에의 트레오닌, 위치 236에의 트레오닌, 위치 270에의 세린, 위치 273에의 세린, 위치 304에의 세린, 위치 435에의 세린, 위치 478에의 트레오닌, 위치 506에의 트레오닌, 및 위치 508에의 트레오닌을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다 (아미노산 번호는 서열번호 1의 HSA 링커의 서열에 대응한다). 다른 표면-노출된 잔기들은 상기 HSA 결정구조를 이용하여 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 동정될 수 있다 (Sugio et al., Crystal structure of human serum albumin at 2.5 A resolution, Protein Eng. 12:439-446 (1999)). “개체(subject)”는 인간 환자 또는 인간 종양 세포를 포함하는 누드 마우스 이종 이식 모델을 참조한다.
타겟 분자 또는 타겟 세포는 결합 부분 (예컨대, 항체), 또는 하나 이상의 결합 부분 (예컨대, 하나 이상의 항체 또는 항체 단편에 결합된 HSA 링커)을 포함하는 HSA 콘쥬게이트가 특이적으로 결합할 수 있는 분자 (예컨대, 단백질, 에피토프, 항원, 리셉터 또는 리간드) 또는 세포를 의미한다. 상기 언급된 분자는 타겟 세포의 외부 (예컨대, 세포-표면 또는 분비된 단백질)에 노출되지만, 타켓 분자는 타겟 세포의 내부에 존재하거나 대체할 수 있다.
바람직하게 “치료”는 인간 질환 또는 질병의 진행 또는 심각성에서, 또는 개체에서 인간 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상의 진행, 심각성 또는 빈도에서의 감소 (예컨대, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%까지)를 제공한다.
본 발명은, HSA 링커와 결합 부분 같은 하나 이상의 추가 부분을 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 (예컨대, 결합, 진단 또는 치료제)와 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 링커를 제공한다. 이러한 HSA 링커 콘쥬게이트는 바람직한 특성 예를 들어, 포유동물 (예컨대, 인간)에 생체내로 투여될 때 6시간 내지 7일 사이의 생체내 반감기(half-life)의 증가를 나타내지만 현저한 체액성 또는 세포-매개성 면역 반응을 유도하지 않는 것과 같은 특성을 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명은 2개의 특정된 아미노산 치환 (즉, 서열번호 1의 C34S 및 N503Q)을 갖는 돌연변이된 HSA 링커를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물 (예컨대, 인간)에서 생체내 진단 또는 치료 적용을 위해 또는 시험과내에서 포유동물 세포, 조직 또는 기관과 연결에 사용하기 위해 하나 이상의 결합 부분 (예컨대, 항체, 항체 단편, 리셉터/리간드, 또는 작은 분자)에 결합된 HSA 링커를 제공한다. 또 다른 양태에서, 상기 HSA 링커는 포유동물에서 (또는 포유동물 세포, 조직 또는 기관과 연결에서) 진단 또는 치료 적용을 위해 하나 이상의 면역조절제, 세포독성 또는 세포억제성 약제, 검출가능한 라벨, 또는 방사성 약제와 쌍을 이룰 수 있다. 상기 링커를 포함하는, HSA 링커 콘쥬게이트 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 선택적으로 조합될 수 있고 정맥내(intravenously), 근육내(intramuscularly), 경구(orally), by 흡입(inhalation), 장관외(parenterally), 복막내(intraperitoneally), 동맥내(intraarterially), 경피(transdermally), 혀밑(sublingually), 비강(nasally), 좌약(suppositories)의 사용을 통해, 구강(transbuccally), 리포솜(liposomally), 지방(adiposally), 눈(opthalmically), 안구내(intraocularly), 피하(subcutaneously), 척추강내(intrathecally), 국소적(topically) 또는 지방적(locally)으로 투여되기 위해 제형화될 수 있다. 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 하나 이상의 생물학적-활성 약제 (예컨대, 화학치료제 및 항종양제와 같은, 생물학적 또는 화학적 약제)조합되거나 공동투여될 수 있지만, 필요하지는 않다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 HSA 링커에, 결합 부분 (예컨대, 항체, 항체 단편, 리셉터 또는 리간드), 면역조절제, 세포독성 또는 세포억제성 약제, 검출가능한 라벨, 또는 방사성 약제의 콘쥬게이션(conjugation)을 위한, 설명서가 있는, 키트를 제공하여 진단 또는 치료 적용에 사용될 수 있는 HSA 링커 콘쥬게이트를 제조한다.
인간 혈청 알부민(BSA) 링커
HSA 링커는 서열번호 3의 야생형 HSA 아미노산 서열을 포함한다. 다른방법으로서(Alternatively), HSA 링커는 변형된 또는 돌연변이된 서열을 포함한다. 돌연변이된 하나의 HSA 링커는 서열번호 3의 야생형 HSA 아미노산 서열에 비교하여 위치 34 및 503에서 2개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 위치 34 (즉, C34)에서 시스테인 잔기는 시스테인 이외에 다른 임의의 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다 (예컨대, 세린, 트레오닌 또는 알라닌). 마찬가지로, 위치 503 (즉, N503)에서 아스파라긴 잔기는 아스파라긴 이외에 다른 임의의 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다 (예컨대, 글루타민, 세린, 히드티딘 또는 알라닌). 하나의 구현예에서, 상기 HSA 링커는 각각 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열에 해당하는 아미노산을 갖는다. 이러한 돌연변이된 HSA 링커는 2개의 아미노산 치환 (즉, 아미노산 잔기 34에서 시스테인을 세린으로(C34S), 아미노산 잔기 503에서 아스파라긴을 글루타민으로(N503Q))을 포함한다. 상기 링커는, 하나 이상의 결합 부분 (예컨대, 항체, 항체 단편 (예컨대, 단일쇄 항체), 또는 다른 타겟팅 또는 생물학적 활성 약제 (예컨대, 리셉터 및 리간드))과 결합될 때, 상기 HSA 링커의 부재시 이러한 약제의 약학적 특성과 비교하여 결합된 그들의 콘쥬게이트 및 추가적인 진단 또는 치료제 (예커대, 면역조절제, 세포독성 또는 세포억제성 약재, 검출가능한 라벨 또는 방사성 약제))에 여러 가지 유익한 약학적 특성을 부여한다. 이러한 이점(benefits)은 포유동물 (예컨대, 인간)에 투여될 때 감소된 면역원성 (예컨대, 링커-항체 콘쥬게이트의 감소된 숙주 항체 중화), HSA 링커 콘쥬게이트의 증가된 검출 (예컨대, 질량분석기에 의해) 및 증가된 약학적 반감기 (예컨대, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 이상의 반감기)를 포함할 수 있다. 특히, 상기 아미노산 잔기 34에서 시스테인의 세린으로의 치환은 상기 HSA 링커의 감소된 산화 및 단백질 이질성(heterogeneity)을 유도한다. 야생형 HSA에서, 상기 아미노산 잔기 503에서의 아스파라긴은 탈아민화(deamination)에 민감해서, 쉽게 감소된 약학적 반감기를 초래한다. 상기 아미노산 잔기 503에서 아스파라긴의 글루타민으로의 치환은 포유동물 (예컨대, 인간) 또는 그들의 세포, 조직, 또는 기관에 투여될 때 상기 HSA 링커, 및 그에 상응하는, 상기 HSA 링커를 포함하는 콘쥬게이트 약제의 증가된 약학적 반감기를 유도한다.
다른 구현예에서, 상기 돌연변이된 HSA 링커는 HSA의 도메인 I (서열번호 53; 서열번호 1의 1-197 잔기), HSA 도메인 III (서열번호 55; 서열번호 1의 381-585 잔기), HSA의 도메인 I과 III의 조합, 또는 HSA의 도메인 I 또는 III과 HSA의 도메인 II의 조합 (서열번호 54; 서열번호 1의 189-385 잔기)을 포함한다. 예들 들어, 상기 HSA 링커는 도메인 I과 II, I과 III, 또는 II와 III를 포함한다. 또한, 도메인 I (서열번호 53)의 위치 34 (즉, C34)에서 시스테인 잔기는 시스테인 이외에 다른 임의의 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다 (예컨대, 세린, 트레오닌 또는 알라닌). 마찬가지로, 도메인 III (서열번호 55)의 위치 503 (즉, N503)에서 아스파라긴 잔기는 아스파라긴 이외에 다른 임의의 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다 (예컨대, 글루타민, 세린, 히드티딘 또는 알라닌). 이러한 HSA 링커는 HSA 링커 콘쥬게이트로 도입될 수 있고, 이는 하나 이상의 펩티드 커넥터, 결합 부분, 및 진단 또는 치료제를 포함하며, 이들 각각은 이하 상세히 설명되어 있다.
펩티드 커넥터
본 명세서에 정의된 바와 같이, 상기 HSA 링커와 결합 부분의 콘쥬게이션을 용이하게 하기 위하여, 짧은 (예컨대, 2-20 아미노산 길이) 펩티드 커넥터는 상기 HSA 링커의 아미노 또는 카르복시 말단에 (예컨대, 공유결합 (예컨대, 펩티드 결합), 이온결합 또는 소수성 결합, 또는 고-친화성 단백질-단백질 결합 상호작용 (예컨대, 바이오틴과 아비딘)으로) 결합될 수 있다. 이러한 커넥터는 본 명세서에 개시된 상기 결합 부분이 부착될 수 있는 임의의 유연한 테더(flexible tether)를 제공한다. 펩티드 커넥터는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 커넥터는, 예컨대, 글리신, 알라닌, 세린, 글루타민, 류신 또는 발린 잔기의 서열이다. 본 명세서에 일일이 나열하지는 않지만, 상기 커넥터는 글리신, 알라닌, 세린, 글루타민, 류신 또는 발린 잔기 단독일 수 있거나, 약 20 아미노산 길이까지의 이러한 잔기의 임의의 조합일 수 있다. 바람직한 구현예에서, HSA 링커의 아미노 말단에 부착되는 상기 커넥터는 아미노산 서열 AAS 또는 AAQ를 가지고 상기 카르복시 말단에 부착되는 커넥터는 아미노산 서열 AAAL을 가진다 (서열번호 5). 상기 커넥터는 상기 HSA 링커의 아미노 또는 카르복시 말단 잔기, 상기 HSA 링커 내 아미노산 잔기와 공유결합될 수 있거나, 존재하는 경우, 하나 이상의 결합 부분들 사이에 포함될 수 있다.
HSA 링커 제조
상기 개시된 하나 이상의 펩티드 커넥터를 갖거나 갖지 않는 상기 HSA 링커, 이하 개시된 하나 이상의 결합 부분, 폴리펩티드-기반 검출가능한 라벨, 및 다른 폴리펩티드-기반 치료제는, 재조합으로 생산될 수 있다. 예들 들어, 상기 HSA 링커 (및 하나 이상의 선택적 성분들)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 (예컨대, 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 트랜스제닉으로) 박테리아 (예컨대, E. coli), 곤충(insect), 효모 또는 포유동물 세포 (예컨대, CHO 세포), 또는 포유동물 조직, 기관, 또는 생물 (예컨대, 트랜스제닉 설치동물, 유제동물 (예컨대, 염소), 또는 비-인간 영장류)에서 발현될 수 있다. 상기 숙주 세포, 조직 또는 기관에서 상기 HSA 링커의 발현 후, 당업자는 표준 단백질 정제 방법 (예컨대, FPLC 또는 친화도 크로마토그래피)을 이용하여 상기 HSA 링커를 분리 및 정제할 수 있다. 2개의 결합 부분으로 조합하여 HSA 링커의 생산을 위한 재조합 발현 시스템은 도 1에 설명되어 있다.
다른방법으로서(Alternatively), 상기 개시된 하나 이상의 선택적 성분들을 갖거나 갖지 않는 상기 HSA 링커는, 합성으로 생산될 수 있다. 예들 들어, 상기 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트는 고체상 접근과 같은, 펩티드 합성 분야에 공지된 일반적인 기술들에 의해 제조될 수 있다. 고체상 합성은 폴리스티렌과 같은, 불용성 지지체 또는 매트릭스에 연결된 성장하는 펩티드 체인에 아미노산 잔기의 순차적 추가를 포함한다. 상기 펩티드의 C-말단 잔기는 t-부틸옥시카르보닐(t-butyloxycarbonyl group, tBoc) 또는 플루오레닐메톡시카르보닐(fluorenylmethoxycarbonyl, FMOC)기와 같은 N-보호제로 보호된 그것의 아미노산기로 상업적으로 입수가능한 지지체에 먼저 고정된다. 상기 아미노-보호기는 tBOC의 경우 TFA 또는 FMOC용 피페리딘(piperidine)과 같은 적당한 탈보호제로 제거되고 이어 잔기 (N-보호된 형태)가 디사이클로카르보디이민(dicyclocarbodiimide, DCC)과 같은 커플링제로 추가된다. 펩티드 결합의 형성에 따라, 상기 시약들(reagents)은 지지체로부터 세척된다. 마지막 잔기의 추가 후, 상기 약제는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) 또는 플루오르화수소(hydrogen fluoride, HF)와 같은, 적당한 시약으로 지지체로부터 떼어낸다. 원한다면, 상기 개시된 하나 이상의 선택적 성분들을 갖거나 갖지 않는 상기 HSA 링커는, 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 조각(segments)으로 제조될 수 있으며, 그 후 이를 붙여서(ligated) 전체 HSA 링커 구성물(construct)을 형성할 수 있다.
결합 부분
HSA 링커 콘쥬게이트는 상기 HSA 링커 콘쥬게이트가 타겟 세포, 조직 또는 기관에 선택적 및 특이적 결합을 허용하는 항체, 항체 단편 (본 명세서에 정의된 바와 같은, 예컨대, 단일쇄 Fv (scFv)) 또는 리셉터/리간드 (즉, 단백질 또는 당단백질 리간드 또는 리셉터)와 같은, 하나 이상의 결합 부분을 포함할 수 있다. 상기 결합 부분은 상기 HSA 링커와 (예컨대, 공유결합 (예컨대, 펩티드 결합), 이온결합 또는 소수성 결합을 통해, 또는 고-친화성 단백질-단백질 결합 상호작용 (예컨대, 바이오틴과 아비딘)을 통해) 결합될 수 있다.
하나 이상의 결합 부분은 HSA 링커에 결합될 수 있다. 하나의 구현예에서, 둘 이상의 동일한 결합 부분 (즉, 동일한 구조 및 결합 친화도를 갖는 부분)은 HSA 링커, 상기 아미노 및 카르복시 말단에서 하나 이상의 (예컨대, 텐덤으로) 각각에 결합되어 있고, 그에 따라 상기 HSA 링커는 그들의 타겟 항원에 대한 결합 부분의 향상된 결합활성(avidity)를 부여한다. 다른 방법으로서, 둘 이상의 서로 다른 결합 부분 (예컨대, 둘 이상의 서로 다른 타겟 분자에 대한 결합 친화도를 가진 scFv, 또는 동일한 타겟 분자에서 둘 이상의 서로 다른 에피토프에 대한 결합 친화도를 가진 scFv와 같은, 항체)은 HSA 링커에 결합될 수 있어서 (예컨대, 이중특이적 HSA 링커 콘쥬게이트), 다중 타겟 항원 또는 에피토프가 상기 HSA 링커 콘쥬게이트에 결합되는 것을 허용한다. 다른 구현예에서, 결합 부분의 서로 다른 종(species)이, 예들 들어, 상기 링커 콘쥬게이트에 대하여 둘 이상의 서로 다른 결합 특이성 또는 작용적/길항적 생물학적 특성을 부여하기 위해 HSA 링커에 결합될 수도 있다. 상기 이중특이적 HSA 링커 콘쥬게이트의 제조에 사용하기 위한 결합 부분 쌍의 유용한 조합은, 예컨대 본 명세서에 참조로서 편입된, International Patent Application Publications WO 2006/091209 및 WO 2005/117973에 개시되어 있다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 결합 부분 (예컨대, 동일 또는 서로 다른 결합 부분)이 HSA 링커에 결합되어 HSA 링커 콘쥬게이트를 형성할 수 있다.
본 발명은 적어도 제1 및 제2 결합 부분을 갖는 HSA 링커 콘쥬게이트를 특징으로 한다. 이들 각각은 상기 HSA 링커의 아미노 또는 카르복시 말단 중 하나에서 결합되거나, 본 명세서에 정의된, 둘 중 하나 또는 둘 모두의 말단에 존재하는, 펩티드 커넥터와 될 수 있다. 도 1은 2개의 결합 부분 (arm 1 및 arm 2)이 상기 아미노 말단의 펩티드 커넥터 AAS 및 카르복시 말단의 펩티드 커넥터 AAAL (서열번호 5)에 의해 돌연변이된 HSA 링커와 결합되어 있는 대표적인 돌연변이된 HSA 링커를 설명한다. 결합 부분 (예컨대, 항체 또는 scFv)은 다른 유전자 위치(loci)에 (예컨대, 상기 HSA 링커의 내부 아미노산 잔기), 예들 들어, 공유결합 또는 이온결합으로, 예컨대 바이오틴-아비딘 상호작용을 이용하여 결합될 수도 있다. 아민 (예컨대, 리신 잔기) 및 설프히드릴(sulfhydryl) (예컨대, 시스테인 잔기) 아미노산 측쇄의 바이오틴화(Biotinylation)는 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있으며 상기 HSA 링커에 결합 부분을 부착하는데 사용될 수 있다.
HSA 링커 콘쥬게이트에 포함될 수 있는 결합 부분은 항체, 항체 단편, 리셉터 및 리간드를 포함한다. HSA 링커에 결합되는 결합 부분은 재조합 (예컨대, 인간, 쥐, 키메라 또는 인간화), 합성 또는 자연적일 수 있다. 대표적인 결합 부분은 예를 들어, 완전한 항체 도메인 항체, 디아보디, 트리아디보, 이중특이적 항체, 항체 단편, Fab 단편, F(ab)2 분자, 단일쇄 Fv (scFv) 분자, 이중특이적 단일쇄 Fv ((scFv')2) 분자, 텐덤 scFv 단편, 항체 융합 단백질, 호르몬, 리셉터, 리간드, 및 앱타머, 및 그것의 생물학적-활성 단편을 포함한다.
항체
항체는 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 이소타입을 포함한다. 본 명세서에 사용된, 항체 또는 그것의 항체 단편은, 타겟 세포의 외부 또는 내부에 존재하는 타겟 단백질, 당단백질 또는 에피토프와 결합하는 하나 이상의 상보성 결정 부위 (complementarity determining regions, CDR) 또는 결합 펩티드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 다수의 항체, 또는 그 단편은 결합 특이성 또는 효력 기능(effector functions)의 손실, 또는 결합 친화도의 수용불가한 감소 (예컨대, 약 10-7 M) 없이 가변 및 불변 영역 둘 모두에서 비결정적 아미노산 치환, 추가 또는 삭제가 일어날 수 있다. 일반적으로, 이러한 변경이 도입된 항체 또는 항체 단편은 그것이 유래된 참조 항체(reference antibody) 또는 항체 단편에 대하여 실질적으로 서열 동일성을 나타낸다. 때때로, 동일한 특이성 및 증가된 친화도를 갖는 돌연변이된 항체 또는 항체 단편은 그것이 유래되었던 참조 항체 또는 항체 단편과 비교하여 선별될 수 있다. 파지-디스플레이 기술(Phage-display technology)은 이러한 항체를 선별하는 강력한 기법을 제공한다. 예컨대, 본 명세서에 참조로서 편입된, Dower et al., WO 91/17271 McCafferty et al., WO 92/01047; 및 Huse, WO 92/06204 참조.
상기 HSA 링커는 또한 타겟 항원과 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편과 결합될 수 있다. 항체 단편은 분리된 가변 중쇄, 가변 경쇄, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc 및 scFv를 포함한다. 단편은 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 생산될 수 있다. 예들 들어, F(ab')2 단편은 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pubs., N.Y. (1988)에 개시된 바와 같은 표준 방법을 이용하여 pH 3.0-3.5에서 펩신으로 단백질 분해(proteolytic digestion)에 의해 IgG 분자로부터 얻을 수 있다. Fab 단편은 제한적 환원(limited reduction)에 의해 F(ab')2 단편으로부터, 또는 환원제(reducing agents) 존재 하에 파파인(papain)으로 소화(digestion)시켜 전체 항체로부터 얻을 수 있다. 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수도 있다. 선택된 단편을 코딩하는 핵산의 조각(segments)은 제한 효소로 전장 코딩 서열의 소화에 의해 생산된다. 종종 단편들은 파지-코트(phage-coat) 융합 단백질의 형태로 발현된다. 발현의 이러한 방법은 항체의 친화도-샤프닝(affinity-sharpening)에 이점이 있다.
인간화 항체
인간화 항체는 또한 상기 HSA 링커와 조합하여 사용될 수 있으며, 이는 하나 이상의 항체 CDRs가 비-인간 항체 서열에서 유래되고, 바람직하게는 전부가 아닌, 하나 이상의 상기 CDRs는 항원 (예컨대, 단백질, 당단백질 또는 다른 적당한 에피토프)와 특이적으로 결합한다.
인간화 항체는 실질적으로 (수용자 항체(acceptor antibody)로 불리는) 인간 항체로부터 유래된 불변의 프레임워크 영역, 뿐만 아니라 일부의 경우에서, 인간 항체로부터 유래된 대부분의 가변 영역을 포함한다. 하나 이상의 CDRs (그들의 모든 부분 또는 일부, 뿐만 아니라 하나 이상의 CDRs를 둘러싸고 있는 분리된 아미노산들)는 마우스 항체와 같은, 비-인간 항체로부터 제공된다. 상기 항체의 불변 영역은 있거나 없을 수 있다.
상기 인간 가변 도메인 프레임워크에서 하나 이상의 마우스 CDRs의 치환은, 상기 인간 가변 도메인 프레임워크가 CDRs의 기원인 마우스 가변 프레임워크로서 동일 또는 유사한 구조(conformation)를 받아들이게 된다면, 그들의 정확한 공간정위(spatial orientation)를 유지하게 할 가능성이 크다. 이는 인간 항체 유래 인간 가변 도메인을 얻음으로써 달성되는데, 그들의 프레임워크 서열은 CDRs가 유래되었던 쥐 가변 프레임워크 도메인과 높은 정도의 서열 및 구조적 동일성을 나타낸다. 상기 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일 또는 서로 다른 인간 항체 서열에서 유래될 수 있다. 상기 인간 항체 서열은 인간 항체를 자연적으로 발생시키는 서열, 여러 인간 항체의 공통 서열(consensus sequence)일 수 있거나, 인간 생식계열 가변 도메인 서열일 수 있다. 예컨대, Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993) 참조.
적절한 인간 항체 서열은 공지의 인간 항체의 서열과 마우스 가변 영역의 아미노산 서열의 정렬(alignments)에 의해 확인될 수 있다. 상기 비교는 중쇄 및 경쇄에 대하여 각각 수행되지만 원리는 각각 유사하다.
키메라 및 인간화 항체 및 항체 단편을 제조하는 방법들은, 예컨대 U.S. Patent Nos. 4,816,567, 5,530,101, 5,622,701, 5,800,815, 5,874,540, 5,914,110, 5,928,904, 6,210,670, 6,677,436, 및 7,067,313 및 U.S. Patent Application Nos. 2002/0031508, 2004/0265311, 및 2005/0226876에 개시되어 있다. 항체 또는 그들의 단편의 제조는 또한 예컨대, U.S. Patent Nos. 6,331,415, 6,818,216 및 7,067,313에 개시되어 있다.
리셉터 및 리간드
특정 HSA 링커 콘쥬게이트에 있어서 단백질 또는 당단백질 리셉터 또는 리간드는 HSA 링커에 결합된다. 리셉터 또는 리간드와 결합되는 HSA 링커는, 예들 들어, 분비된 단백질, 세포 (예컨대, 암세포), 조직 또는 기관을 특이적으로 타겟팅하는데 사용될 수 있다. 또한, 동종의 타겟 리셉터 또는 리간드에 대한 HSA 링커-리셉터 또는 -리간드 콘쥬게이트의 특이적 결합은 세포내 또는 세포내 신호전달경로에서 작용적 또는 길항적 생물학적 활성을 유발할 수 있다. 본 명세서에 개시된 다른 결합 부분과 같이, 리셉터 및 리간드, 또는 그들의 단편은, HSA 링커의 아미노 및/또는 카르복시 말단, HSA 링커에 연결된 펩티드 커넥터, 또는 상기 HSA 링커 내 아미노산 잔기들에 연결될 수 있다.
HSA 링커에 연결될 수 있는 대표적인 리셉터 및 리간드는, 인슐린-유사 성장인자 1 리셉터 (IGF1R), IGF2R, 인슐린-유사 성장인자 (IGF), 중배엽 상피 전이인자 리셉터 (c-met; 간세포 성장인자 리셉터로도 알려져 있음), 간세포 성장인자 (HGF), 표피 성장인자 리셉터 (EGFR), 표피 성장인자 (EGF), 헤레굴린(heregulin), 섬유아세포 성장인자 리셉터 (FGFR), 혈소판-유래 성장인자 리셉터 (PDGFR), 혈소판-유래 성장인자 (PDGF), 혈관내피 성장인자 리셉터 (VEGFR), 혈관내피 성장인자 (VEGF), 종양괴사인자 리셉터 (TNFR), 종양괴사인자 알파 (TNF-α), TNF-β, 폴레이트 립셉터 (FOLR), 폴레이트(folate), 트랜스페린 리셉터 (TfR), 메조셀린(mesothelin), Fc 리셉터, c-키트 리셉터, c-키트, 인테그린 (예컨대, α4 인테그린 또는 β1 인테그린), P-셀렉틴, 스핑고신-1-포스페이트 리셉터-1 (S1PR), 히알루로네이트 리셉터, 백혈구 기능 항원-1 (LFA-1), CD4, CD11, CD18, CD20, CD25, CD27, CD52, CD70, CD80, CD85, CD95 (Fas 리셉터), CD106 (혈관세포 부착 분자 1 (VCAM1)), CD166 (활성화 백혈구 부착 분자 (ALCAM)), CD178 (Fas 리간드), CD253 (TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL)), ICOS 리간드, CCR2, CXCR3, CCR5, CXCL12 (간질세포-유래 인자 1 (SDF-1)), 인터루킨 1 (IL-1), CTLA-4, MART-1, gp100, MAGE-1, 에프린 (Eph) 리셉터, 점막 어드레신 세포 부착 분자 1 (MAdCAM-1), 암배아 항원 (CEA), 루위스Y (LewisY), MUC-1, 상피세포 부착 분자 (EpCAM), 암 항원 125 (CA125), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), TAG-72 항원, 및 그들의 생물학적-활성 단편을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
리셉터 및 리간드는 상기 문헌(supra)에 개시된 임의의 방법들을 이용하여 HSA 링커와 발현, 분리 또는 연결될 수 있다.
진단제
HSA 링커, 또는 이와 결합되는 임의의 결합 부분 (예컨대, 항체, 항체 단편, 리셉터 또는 리간드)은, 킬레이트제 또는 검출가능한 라벨과 쌍을 이루어 진단제를 형성할 수 있다. 또한 본 명세서에 개시된, 검출가능한 라벨, 뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 치료제 또는 결합 부분을 포함하는 것으로 HSA 링커 콘쥬게이트가 간주된다.
상기 HSA 링커(또는 HSA 링커 콘쥬게이트) 및 킬레이터(chelator) 화합물은 쌍을 이루어 카르복시기 또는 활성화된 에스테르와 같은, 킬레이터의 적절한 작용기(functional group)와 상기 HSA 링커(또는 HSA 링커 콘쥬게이트)의 트레오닌 잔기의 유리 아미노산기를 반응시킴으로써 형성할 수 있다. 예들 들어, 이러한 커플링은 배위화학(coordination chemistry) 분야에서 통상적인, 킬레이터 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)을 도입함으로써 획득할 수 있고, 이때 에틸렌 체인(ethylene chain) 상에서 카르복실 치환기(carboxyl substituent)로 작용할 수 있다. 이러한 타입의 EDTA 유도체의 합성은 Arya et al. (Bioconjugate Chemistry 2:323 (1991))에 보고되어 있고, 이는 4개의 동등한 카르복실기 각각을 t-부틸기(t-butyl group)로 블로킹하는 반면 상기 에틸렌 체인 상의 카르복실 치환기는 약제의 펩티드 일부의 아미노기와 반응하는 것이 자유로움을 설명한다.
HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트는 펩티드성(peptidic), 즉 고체상 펩티드 합성으로 융화될 수 있는, 금속 킬레이터 화합물을 도입할 수 있다. 이 경우에서, 상기 킬레이터는 상기 개시된 EDTA와 같은 동일한 방법으로 쌍을 이룰 수 있다. 더욱 편리하게는, 상기 킬레이터 및 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트는 상기 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트의 C-말단 잔기에서 시작하여 상기 킬레이터의 N-말단 잔기로 끝냄으로써 완전히 합성된다.
HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트는 HSA 링커가 상기 킬레이터와 쌍을 이루게 하는 반면 상기 HSA 링커의 생물학적 특성, 즉 상기 HSA 링커 콘쥬게이트의 결합 부분 일부의 타겟팅 기능(targeting function), 또는 킬레이터의 금속 결합 기능에 부정적인 영향을 미치지 못하는 연결기 성분(linking group component)을 더 도입할 수 있다. 적절한 연결기는 상기 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트와 상기 킬레이터가 쌍을 이루기 위한 반응기(reactive groups)로 기능화된 아미노산 체인 및 알킬 체인을 포함한다. 아미노산 체인은 상기 킬레이터가 펩티드성이어서 상기 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트가 고체상 기술에 의해 완전하게 합성될 수 있는 경우 바람직한 연결기이다. 알킬 체인-연결기는 카르복실기 또는 활성화된 에스테르와 같은, 알킬 체인 상의 제1 작용기(a first functional group)로 HSA 링커의 펩티드 일부의 트레오닌 잔기의 아미노기를 반응시킴으로써 상기 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트에 도입될 수 있다. 다음으로, 상기 킬레이터는 알킬 체인에 부착되어 킬레이터 상의 적절한 작용기로 알킬 체인 상의 제2 작용기(a second functional group)를 반응시킴으로써 상기 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트의 형성을 완료한다. 상기 알킬 체인 상의 제2 작용기는 상기 킬레이터 상의 작용기와 반응하는 반면 상기 돌연변이된 HSA 링커의 트레오닌 잔기와는 반응하지 않는 치환기로부터 선택된다. 예들 들어, 상기 킬레이터가 카르복실기 또는 활성화된 에스테르와 같은 작용기를 도입할 때, 상기 알킬 체인-연결기의 제2 작용기는 아미노기일 수 있다. 상기 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트의 형성은 원하지 않는 생산물의 형성을 피하기 위하여 존재하는 상기 작용기의 보호(protection) 및 탈보호(deprotection)를 필요함이 인정될 것이다. 보호 및 탈보호는 유기 합성 분야에서 통상적인 보호기, 시약 및 프로토콜을 이용하여 이루어진다. 특히, 상기 개시된 고체상 펩티드 합성에 채용된 보호 및 탈보호 기술이 사용될 수 있다.
알킬 체인에 대한 다른 방법의 화학적 연결기는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)이다. 이는 상기 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트에서 도입을 위해 상기 개시된 알킬 체인과 같은 동일한 방법으로 작용된다. 연결기는 상기 킬레이터와 다른 방법으로 먼저 쌍을 이룬 다음 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트와 쌍을 이룰 수 있음이 인정될 것이다.
하나의 양태에서, HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트는 복합체를 형성할 수 있는 진단상의 유용한 금속과 쌍을 이룬다. 적절한 금속은, 예컨대 테크네튬(technetium) 및 레늄(rhenium)과 같은 그들의 다양한 형태 (예컨대, 99mTcO3+, 99mTcO2 +, ReO3+, and ReO2 +)로서, 방사성핵종(radionuclides)을 포함한다. 상기 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트 내로 상기 금속의 도입은 배위화학 분야에서 통상적인 다양한 방법들에 의해 이루어질 수 있다. 상기 금속이 테크네튬-99m일 때, 다음의 일반적인 과정이 사용되어 테크네튬 복합체를 형성할 수 있다. HSA 링커-킬레이터 콘쥬게이트 용액은 에탄올과 같은 수용성 알코올에 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트를 용해시킴으로써 처음 형성될 수 있다. 다음으로 상기 용액은 산소를 제거하기 위해 가스를 제거하고 이어 티올 보호기(thiol protecting groups)가 적당한 시약으로, 예를 들어, 수산화나트륨(sodium hydroxide)으로 제거되고, 그 후 아세트산 (pH 6.0-6.5)과 같은 유기산으로 중화된다. 라벨링 단계에서, 몰리브데넘 생성기(molybdenum generator)로부터 얻은, 화학양론적 과량(stoichiometric excess)의 과테크네튬산나트륨(sodium pertechnetate)이, 염화제일주석(stannous chloride)과 같은 테크네튬을 환원시키는데 충분한 환원제의 양과 함께 상기 콘쥬게이트의 용액에 첨가된 후 가열된다. 상기 라벨링된 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트는 오염물(contaminants)인 99mTcO4 - 및 콜로이드성 99mTcO2로부터 크로마토그래프를 이용하여, 예들 들어 C-18 Sep Pak 카트리지로 분리될 수 있다.
다른 방법에서, HSA 링커의 라벨링은 트랜스킬레이트화(transchelation) 반응에 의해 이루어질 수 있다. 상기 테크네튬 소스는 선택된 킬레이터로 리간드 교환을 용이하게 하는 불안정한 리간드로 복합체를 형성한 테크네튬의 용액이다. 트랜스킬레이트화에 적절한 리간드는 타르타레이트(tartarate), 시트레이트(citrate) 및 헵타글루코네이트(heptagluconate)를 포함한다. 이 경우에 상기 바람직한 환원제는 디티온산나트륨(sodium dithionite)이다. 상기 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트는 상기 개시된 기술들을 이용하여 라벨링되거나, 상기 킬레이터 그 자체가 라벨링된 후 이어 HSA 링커와 쌍을 이루어 HSA 링커-킬레이터 콘쥬게이트를 형성할 수 있음이 인정될 것이다; 라벨링전 리간드 (prelabeled ligand) 방법에 따른 과정을 참조.
HSA 링커를 라벨링하는 다른 접근, 또는 그와 결합되는 임의의 약제는, 금속 킬레이트화에 따라 쪼개진 연결을 통해 고체상 지지체에 고정화한 상기 HSA 링커-킬레이터 콘쥬게이트를 포함한다. 이는 사익 킬레이터가 복합체를 형성한 원자들의 하나에 의해 지지체의 작용기와 쌍을 이룰 때 달성된다. 바람직하게는, 복합체를 형성한 황 원자는 말레이미드(maleimide)와 같은 황 보호기로 작용하는 지지체와 쌍을 이룬다.
진단상의 유용한 금속으로 라벨링될 때, HSA 링커-킬레이터 콘쥬게이트를 포함하는 약제는 진단 이미징 분야에 공지된 방법에 의해 암 (예컨대, 폐암, 유방암, 결장암 및 전립선암), 노인성질환(age-related disease) (예컨대, 심혈관질환, 뇌혈관질환, 알츠하이머병), 흡연-관련 질환 (예컨대, 폐기종(emphysema), 대동맥류(aortic aneurysms), 식도암(esophageal cancer) 또는 머리와 목의 편평세포암(squamous cell cancer)으로 발전할 위험에 있는 조직을 검출하는데 사용될 수 있다. 테크네튬-99m과 같은, 방사성핵종 금속으로 라벨링된 HSA 링커를 도입하는 약제는, 등장성 식염수(isotonic saline)와 같은, 약학적으로 허용가능한 용액으로 정맥 주사로, 또는 본 명세서에 개시된 다른 방법으로 포유동물 (예컨대, 인간)에 투여될 수 있다. 투여에 적절한 라벨링된 약제의 양은 빠르게 클리어된(cleared) HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트를 도입한 본 발명의 약제가 덜 빠르게 클리어된 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트를 도입한 약제 보다 높은 투여 용량으로 투여될 수 있다는 점에서 선택된 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이션의 분포 프로파일(distribution profile)에 따른다. 조직을 이미징하는데 허용가능한 단위 투여용량은 70 kg 개체 당 약 5-40 mCi 범위이다. 라벨링된 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트를 도입한 약제의 생체내 분포(distribution) 및 위치인식(localization)은 투여 후에 적절한 시간에서, 비-타겟 조직에서 선명비(rate of clearance)에 대한 타겟 부위에서 축적 비에 따라 일반적으로 30분 내지 180분 사이 및 약 5일까지, 본 명세서에 개시된 표준 기술에 의해 추적(tracking)될 수 있다.
HSA 링커, 또는 임의의 분자 또는 그와 결합된 부분은, 또한 변형되거나 라벨링되어 진단 또는 치료 용도를 용이하게 할 수 있다. 방사성, 형광, 중금속 또는 다른 분자들과 같은 검출가능한 라벨은 임의의 약제와 결합될 수 있다. 약제의 단일, 이중 또는 다중 라벨링은 이점이 있을 수 있다. 예들 들어, 추가적인 쌍, 예들 들어, 킬레이팅기(chelating group)를 통해 아민-포함 사이드(side) 또는 반응기와 90Y로 결합된 하나 이상의 잔기의 방사성 요오드화(iodination)로 이중 라벨링(dual labeling)은, 조합 라벨링을 허용한다. 이는 넓게 분산된 작은 종양 세포 집단(cell mass)의 확인과 같은 특성화된 진단 요구에 유용할 수 있다.
HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)은, 또한 예들 들어, 상기 펩티드 성분의 트레오닌 잔기의 할로겐화(halogenation)에 의해 변형될 수 있다. 할로겐은 플루오린(fluorine), 염소(chlorine), 브롬(bromine), 요오드(iodine) 및 아스타틴(astatine)을 포함한다. 이러한 할로겐화된 약제는, 예컨대 상기 할로겐이 방사성동위원소, 예들 들어, 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I 또는 211At라면 검출가능하게 라벨링될 수 있다. 할로겐화된 약제는 적어도 하나의 아미노산 및 바람직하게는 각각의 약제 분자의 D-Try 잔기와 공유적으로 결합된 할로겐을 포함한다. 다른 적절한 검출가능한 변형은 약제, 또는 유사물(analog), 특히 리신을 포함하는 링커를 갖는 약제 또는 유사물의 리신(lysine) 잔기와 다른 화합물 (예컨대, 플루오레세인과 같은 형광색소)의 결합을 포함한다.
HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)을 방사성 라벨링하는 방사성동위원소는, 약제 또는 그의 유사물의 펩티드 성분의 잔기와 공유적으로 결합될 수 있는 임의의 방사성동위원소를 포함한다. 상기 방사성동위원소는 또한 베타 또는 감마 방사선을 방출하는 방사성동위원소들로부터 선택될 수 있고, 또는 다른 방법으로서, 임의의 약제는, 예들 들어, 상기 HSA 링커 또는 그와 결합된 임의의 펩티드성 약제의 리신 잔기와 공유적으로 결합될 수 있는, 킬레이팅기를 포함하기 위해 변형될 수 있다. 다음으로 상기 킬레이팅기는 갈륨(gallium), 인듐(indium), 테크네튬(technetium), 이테르븀(ytterbium), 레늄(rhenium) 또는 탈륨(thallium)과 같은 (예컨대, 125I, 67Ga, 111In, 99mTc, 169Yb, 186Re), 임의의 다양한 방사성동위원소를 포함하기 위해 변형될 수 있다.
HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)은, 방사성동위원소의 부착에 의해 변형될 수 있다. 바람직한 방사성동위원소들은 상기 사용된 HSA 콘쥬게이트의 생물학적 반감기에 상응하거나, 더 긴, 방사성 반감기를 갖는 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 방사성동위원소는 할로겐 원자 (예컨대, 플루오린(fluorine), 염소(chlorine), 브롬(bromine), 요오드(iodine) 및 아스타틴(astatine)의 방사성동위원소)의 방사성동위원소, 더욱 바람직하게는 75Br, 77Br, 76Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I 또는 211At이다.
HSA 링커 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)을 도입한 약제는, 방사성 금속과 쌍을 이루어 방사선촬영 이미지 또는 방사선치료에 사용될 수 있다. 또한 바람직한 방사성동위원소는 99mTc, 51Cr, 67Ga, 68Ga, 111In, 168Yb, 140La, 90Y, 88Y, 153Sm, 156Ho, 165Dy, 64Cu, 97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi 및 214Bi를 포함한다. 금속의 선택은 원하는 치료 또는 진단 적용에 기초하여 결정된다.
HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)은, 금속 성분과 쌍을 이루어, 진단 또는 치료제를 제조할 수 있다. 검출가능한 라벨은 Gd3+, Fe3+, Mn3+ 또는 Cr2+와 같은, 중원소(heavy elements) 또는 희토류이온(rare earth ion)에서 얻은 금속 이온일 수 있다. 파라마그네틱(paramagnetic) 또는 이와 결합된 슈퍼파라마그네틱(superparamagnetic) 금속을 갖는 HSA 링커를 도입한 약제들은 MRI 이미징 적용의 진단제로서 유용하다. 파라마그네틱 금속은, 크롬(chromium) (III), 망간(manganese) (II), 철(iron) (II), 철(iron) (III), 코발트(cobalt) (II), 니켈(nickel) (II), 구리(copper) (II), 프라세오디뮴(praseodymium) (III), 네오디뮴(neodymium) (III), 사마륨(samarium) (III), 가돌리늄(gadolinium) (III), 테르븀(terbium) (III), 디스프로슘(dysprosium) (III), 홀뮴(holmium) (III), 에르븀(erbium) (III) 및 이테르븀(ytterbium) (III)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
킬레이트화기(chelating groups)는 검출가능한 라벨 또는 다른 분자들을 HSA 링커 또는 그와 결합된 약제와 간접적으로 쌍을 이루는데 사용될 수 있다. 킬레이트화기는 약제를 두 기능을 가진 안정한 킬레이터와 같은 방사성라벨과 결합시키거나, 하나 이상의 말단 또는 내부 아미노 반응기와 결합시킬 수 있다. HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moeity)는, 에드먼 분해(Edman degradation)를 방지하는 이소티오시아네이트(isothiocyanate) β-Ala 또는 적절한 non-α-아미노산 링커를 통해 결합될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 킬레이터의 예들은, 예들 들어, 이니노카르복실릭(ininocarboxylic) 및 폴리아미노폴리카르복실릭(polyaminopolycarboxylic) 반응기, 이니노카르복실릭(ininocarboxylic) 및 폴리아미노폴리카르복실릭(polyaminopolycarboxylic) 반응기, 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA) 및 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸(tetraazacyclododecane)-1,4,7,10-테트라아세트산(tetraacetic acid)(DOTA)을 포함한다.
HSA 링커는, 재조합으로 발현될 때, 펩티드성 검출가능한 라벨 또는 진단제와 결합될 수 있다. HSA 링커와 함께 검출가능한 라벨로서 사용될 수 있는 펩티드 및 단백질은, 형광단백질(fluorescent proteins), 생물발광 단백질(bioluminescent proteins) 및 에피토프 태그(epitope tags)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 이들 각각은 이하 상세히 설명된다. 또한 하나 이상의 이러한 검출가능한 라벨은 치료, 세포독성 또는 세포억제성 약제도 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트에 도입될 수 있다.
녹색 형광단백질(green fluorescent protein, GFP; 서열번호 47)과 같은 형광단백질 또는 형광색소, 증강된 GFP (eGFP), 노란 형광단백질 (yellow fluorescent protein, 서열번호 48; YFP), 청록 형광단백질(cyan fluorescent protein, 서열번호 49; CFP), 및 적색 형광단백질(red fluorescent protein, 서열번호 50; RFP 또는 DsRed)은, HSA 링커와 결합된 검출가능한 라벨로서 사용될 수 있다. 형광단백질은 형광단백질의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 발현 벡터로 세포를 트랜스펙션 또는 트랜스덕션 한 후 세포 (예컨대, 림프구와 같은 혈액 세포)에서 재조합으로 발현될 수 있다. 자극하는 빛의 주파수에 형광단백질의 노출에 따라, 상기 형광단백질은 현미경 하에서 눈으로 또는 광학 이미지 장치로 관찰될 수 있는 낮고, 중간 또는 높은 강도에서 빛을 방출할 것이다. 약제에 진단 서열로서 사용하기에 적절한 대표적인 형광단백질은 U.S. Patent Nos. 7,417,131 및 7,413,874에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조로서 편입된다.
또한 생체발광 단백질은 HSA 링커에 도입된 검출가능한 라벨로서 사용될 수 있다. 루시퍼라제(luciferase) (예컨대, 반딧불이 (서열번호 51), 레닐라(Renilla) (서열번호 52) 및 옴파로투스(Omphalotus) 루시퍼라제), 및 애쿼린(aequorin)과 같은 생체발광 단백질은, 기질과 화학적 반응의 일부로서 빛을 방출한다 (예컨대, 루시페린(luciferin) 및 코엘레테라진(coelenterazine)). 하나의 구현예에서, 루시퍼라제 유전자를 코딩하는 벡터는 본 명세서에 개시된 것과 같은 표준 방법에 따라 트랜스덕션 또는 트랜스펙션된 세포 (예컨대, 림프구와 같은 혈액 세포)의 생체내, 시험관내, 또는 생체외 검출을 제공한다. 진단 서열로서 사용하는데 적절한 대표적인 생체발광 단백질 및 그들의 사용 방법은, 예컨대 U.S. Patent Nos. 5,292,658, 5,670,356, 6,171,809, 및 7,183,092에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조로서 편입된다.
에피토프 태그는 짧은 아미노산 서열, 예컨대 5-20 아미노산 잔기 길이이다. 이는 검출가능한 라벨로서 HSA 링커 콘쥬게이트에 도입되어 세포에서 발현되거나, 세포로부터 분비되거나, 또는 타겟 세포와 결합되어 한번에 검출을 용이하게 한다. 진단 서열로서 에피토프 태그를 도입한 약제는 항체, 항체 단편, 또는 상기 에피토프 태그에 특이적인 다른 결합 분자와 그것의 상호작용의 능력(virtue)에 의해 검출될 수 있다. 상기 에피토프 태그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 자연 유전자의 적절한 일부를 클로닝하거나 상기 에피토프 태그를 코딩하는 뉴클레오티드를 합성하는 것 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 항체, 항체 단편, 또는 에피토프 태그와 결합하는 다른 결합 분자는 검출가능한 라벨을 직접적으로 도입할 수 있거나 2차 항체, 항체 단편, 또는 이러한 라벨을 도입하는 다른 결합 분자에 대한 타겟으로서 그 자체로 제공된다. 진단 서열로 사용될 수 있는 대표적인 에피토프 태그는 c-myc (서열번호 33), 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA; 서열번호 34), 및 히스티딘(histidine) 태그 (His6; 서열번호 35)를 포함한다. 또한, 형광 (예컨대, GFP) 및 생체발광 단백질도 에피토프 태그로 제공할 수 있고, 항체 및 항체 단편 및 다른 결합분자는 이러한 단백질의 검출을 위해 상업적으로 입수가능하다.
진단 서열 (예컨대, 형광단백질, 생체발광 단백질 또는 에피토프 태그)을 도입한 HSA 링커 콘쥬게이트 또는 그를 발현하거나 결합하는 임의의 세포의 상기 생체내, 시험관내 또는 생체외 검출, 이미징 또는 트래킹(tracking)은, 현미경, 유세포분석기, 발광측정기(luminometer) 또는 IVIS Imaging System (Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA)과 같은 다른 광학 이미징 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 HSA 링커와 쌍을 이룬 치료 또는 세포독성 약제
HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)은, 임의의 공지된 세포독성 또는 치료 부분(moiety)과 쌍을 이루어 질환 (예컨대, 암, 자가면역질환 또는 심혈관질환) 또는 하나 이상의 질환의 증상을 치료, 저해, 감소 또는 개선하기 위해 투여될 수 있는 약제 (HSA 링커 콘쥬게이트)를 형성할 수 있다. 예들은 다음과 같은 항종양제를 포함하나 이에 한정되지는 않는다: 아시비신(acivicin); 아클라루비신(aclarubicin); 아코다졸 히드로클로라이드(acodazole hydrochloride); 아크로닌(acronine); 아도젤레신(adozelesin); 아드리아마이신(adriamycin); 알데스류킨(aldesleukin); 알트레타민(altretamine); 암보마이신(ambomycin); A. 메탄트론 아세테이트(metantrone acetate); 아미노글루테티마이드(aminoglutethimide); 아사크린(amsacrine); 아나스트로졸(anastrozole); 안트라마이신(anthramycin); 아스파라기나제(asparaginase); 아스레핀(asperlin); 아자시티딘(azacitidine); 아제테파(azetepa); 아조토마이신(azotomycin); 바티마스타트(batimastat); 벤조데파(benzodepa); 비칼루타마이드(bicalutamide); 비산트렌 히드로클로라이드(bisantrene hydrochloride); 비스나파이드 디메실레이트(bisnafide dimesylate); 비젤레신(bizelesin); 블레오마이신 설페이트(bleomycin Sulfate); 브레퀴나 소듐(brequinar sodium); 브로피리민(bropirimine); 부설판(busulfan); 카크티노마이신(cactinomycin); 칼루스테론(calusterone); 캠토테신(camptothecin); 카라세마이신(caracemide); 카르베티머(carbetimer); 카르보플라틴(carboplatin); 카르무스틴(carmustine); 카루비신 이드로클로라이드(carubicin hydrochloride); 카르젤레신(carzelesin); 세데핑골(cedefingol); 클로람부실(chlorambucil); 시롤레마이신(cirolemycin); 시스프라틴(cisplatin); 클라드리빈(cladribine); 콤브레테스타틴(combretestatin) a-4; 크리스나톨 메실레이트(crisnatol mesylate); 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide); 시타라빈(cytarabine); 다카르바진(dacarbazine); daca (N-[2-(dimethyl-amino)ethyl] acridine-4-carboxamide); 닥티노마이신(dactinomycin); 다우노루비신 히드로클로라이드(daunorubicin hydrochloride); 다우노마이신(daunomycin); 데시타빈(decitabine); 덱소르마플라틴(dexormaplatin); 데자구아닌(dezaguanine); 데자구아닌 메실레이트(dezaguanine mesylate); 디아지쿠온(diaziquone); 도세탁셀(docetaxel); 돌라사틴(dolasatins); 독소루비신(doxorubicin); 독소루비신 히드로클로라이드(doxorubicin hydrochloride); 드롤록시펜(droloxifene); 드롤록시펜 시트레이트(droloxifene citrate); 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate); 두아조마이신(duazomycin); 에다트렉세이트(edatrexate); 에플로니틴 히드로클로라이드(eflornithine hydrochloride); 엘리프티신(ellipticine); 엘사미트루신(elsamitrucin); 엔로플라틴(enloplatin); 엔프로메이트(enpromate); 에피프로피다인(epipropidine); 에피루비신 하이드로클로라이드(epirubicin hydrochloride); 에르볼로졸(erbulozole); 에소루비신 하이드로클로라이드(esorubicin hydrochloride); 에트스가머스타인(estramustine); 에스트라머스타인 포스페이트 소듐(estramustine phosphate sodium); 에타니다졸(etanidazole); 에씨오다이즈드 오일 i 131(ethiodized oil i 131); 에토포사이드(etoposide); 에토포사이드 포스페이트(etoposide phosphate); 에토프린(etoprine); 파드로졸 하이드로클로라이드(fadrozole hydrochloride); 파자라바인(fazarabine); 펜레티나이드(fenretinide); 플로써리다인(floxuridine); 플러다라바인 포스페이트(fludarabine phosphate); 플루로울라씰(fluorouracil); 5-에프디유엠피(5-fdump); 플루로시토바인(flurocitabine); 포스쿼돈(fosquidone); 포스트리에씬 소듐(fostriecin sodium); 젬시타파인(gemcitabine); 젬씨타바인 하이드로 클로라이드(gemcitabine hydrochloride); 금 198(gold au 198); 호모캠프토쎄씬(homocamptothecin); 하이드로자이우리(hydroxyurea); 아이다루비씬 하이드로클로라이드(idarubicin hydrochloride); 아이포스파마이드(ifosfamide); 아일모포신(ilmofosine); 인터페론 알파-2에이(interferon alfa-2a); 인터페론 알파 2비(interferon alfa-2b); 인터페론 알파-엔1(interferon alfa-nl); 인터페론 알파-n3(interferon alfa-n3); 인터페론 베타-아이 에이(interferon beta-i a); 인터페론 감마-아이 비(interferon gamma-i b); 아이프로플라틴(iproplatin); 아이리노테칸 하이드로클로라이드(irinotecan hydrochloride); 란레오타이드 아세테이트(lanreotide acetate); 레트로졸(letrozole); 레우프로라이드 아세테이트(leuprolide acetate); 라이아로졸 하이드클로라이드(liarozole hydrochloride); 로메트렉솔 소듐(lometrexol sodium); 루머스타인(lomustine); 로소잔트론 하이드로클로라이드(losoxantrone hydrochloride); 마스프로콜(masoprocol); 메이탄신(maytansine); 메클로레타민 하이드로클로라이드(mechlorethamine hydrochloride); 메제스트롤 아세테이트(megestrol acetate); 메렌제스트롤 아세테이트(melengestrol acetate); 멜파란(melphalan); 메노가릴(menogaril); 멀캡토퓨린(mercaptopurine); 메소트렉세이트(methotrexate); 메토트렉세이트 소듐(methotrexate sodium); 메트로프린(metoprine); 메튜레데파(meturedepa); 미틴도마이드(mitindomide); 미토카르신(mitocarcin); 미토크로민(mitocromin); 미토질린(mitogillin); 미토말신(mitomalcin); 미토미신(mitomycin); 미토스퍼(mitosper); 미토테인(mitotane); 미톡잔트론 하이드로클로라이드(mitoxantrone hydrochloride); 미우페놀릭 에씨드(mycophenolic acid); 노코아졸(nocodazole); 노갈라미신(nogalamycin); 오르메플라틴(ormaplatin); 옥시수란(oxisuran); 파클리탁셀(paclitaxel); 페가스파게이즈(pegaspargase); 펠리오미신(peliomycin); 펜타머스타인(pentamustine); 페플로이신설페이트(peploycinsulfate); 퍼포스파마이드(perfosfamide); 파이포브로만(pipobroman); 파이포설판(piposulfan); 파이로잔트론 하이드로클로라이드(piroxantrone hydrochloride); 플리카미신(plicamycin); 플로메스테인(plomestane); 포피머 소듐(porfimer sodium); 폴피로미신(porfiromycin); 프리드니머스타인(prednimustine); 프로카바자인 하이드로클로라이드(procarbazine hydrochloride); 퓨로미신(puromycin); 퓨로미신 하이드로클로라이드(puromycin hydrochloride); 파이라코퓨린(pyrazofurin); 리조신(rhizoxin); 리조신 디(rhizoxin d); 리보프린(riboprine); 로글레티마이드(rogletimide); 사핀졸(safingol); 사핀졸 하이드로클로라이드(safingol hydrochloride); 세머스타인(semustine); 심트라진(simtrazene); 스파포세이트 소듐(sparfosate sodium); 스파소미신(sparsomycin); 스피로제마니윰 하이드로클로라이드(spirogermanium hydrochloride); 스피로머스타인(spiromustine); 스피로플라틴(spiroplatin); 스트레프토니그린(streptonigrin); 스트레프토조신(streptozocin); 스트론튬 클로라이드 에스알 89(strontium chloride sr 89); 서로페널(sulofenur); 탈리소미신(talisomycin); 택사인(taxane); 택소이드(taxoid); 테코갈란 소듐(tecogalan sodium); 테카퍼르(tegafur); 테로잔스트론 하이드로클로라이드(teloxantrone hydrochloride); 테모포핀(temoporfin); 페니포사이드(teniposide); 테록시론(teroxirone); 테스토락톤(testolactone); 시아미프린(thiamiprine); 시오구아닌(thioguanine); 시오테파(thiotepa); 사이미택(thymitaq); 티아조퓨린(tiazofurin); 티라파자민(tirapazamine); 토뮤덱스(tomudex); 티오피53(top53); 토포테칸 하이드로클로라이드(topotecan hydrochloride); 토레미핀 사이트레이트(toremifene citrate); 트레스톨론 아세테이트(trestolone acetate); 트리시리빈 포스페이트(triciribine phosphate); 트리메트렉세이트(trimetrexate); 트리멕세이트 글루커로네이트(trimetrexate glucuronate); 트리프톨레린(triptorelin); 투불로졸 하이드로클로라이드(tubulozole hydrochloride); 유라실 머스타드(uracil mustard); 유레데파(uredepa); 베이프레오타이드(vapreotide); 버테포핀(verteporfin); 빈블라스타인(vinblastine); 빈블라스타인 설페이트(vinblastine sulfate); 빈크라이스틴(vincristine); 빈크라이스틴 설페이트(vincristine sulfate); 빈데신(vindesine); 빈데신 설페이트(vindesine sulfate); 베네피딘 설페이트(vinepidine sulfate); 빈글리시네이트 설페이트(vinglycinate sulfate); 빈레우로신 설페이트(vinleurosine sulfate); 비노레바인 타트레이트(vinorelbine tartrate); 빈로시딘 설페이트(vinrosidine sulfate); 빈졸리딘 설페이트(vinzolidine sulfate); 보로졸(vorozole); 제니플라틴(zeniplatin); 지노스타틴(zinostatin); 조루비신 하이드로클로라이드(zorubicin hydrochloride); 2-클로로데오사이아데노신(2-chlorodeoxyadenosine); 2' 데옥시포마이신(2' deoxyformycin); 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin); 랄티트렉스트(raltitrexed); 엔-프로파질 5,8-다이데자폴릭 에시드(N-propargyl-5,8-dideazafolic acid); 2클로로-2'-아라비노-플루오로-2'-데오자야데노신(2chloro-2'-arabino-fluoro-2'-deoxyadenosine); 2-클로로-2'-데오자야데노신(2-chloro-2'-deoxyadenosine); 아니소미신(anisomycin); 트리코스타틴 A(trichostatin A); hPRL-G129R; CEP-751; 리노마이드(linomide); 서퍼 머스타드(sulfur mustard); 니트로젠 머스타드(메클로 에타민)(nitrogen mustard (mechlor ethamine)); 싸이클로포스파마이드(cyclophosphamide); 멜파란(melphalan); 클로람부실(chlorambucil); 아이포스파마이드(ifosfamide); 부설판(busulfan); N-메틸-니트로소리(N-methyl-Nnitrosourea (MNU)); N, N'-비스(2-클로로틸)-N-니트로소리(N, N'-Bis (2-chloroethyl)-N-nitrosourea (BCNU)); N-(2-클로로틸)-N' 사이클로헥실-N-니트로소리(N- (2-chloroethyl)-N' cyclohexyl-N-nitrosourea (CCNU)); N-(2-클로로에틸-N'-(트랜스-4-메틸사이클로헥실-N-니트로소리(N- (2-chloroethyl)-N'- (trans-4-methylcyclohexyl-N-nitrosourea (MeCCNU))); N-(2-클로로에틸)-N'-(디에틸) 에실포스포네이트-N-니트로소리(포테머스타인)(N- (2-chloroethyl)-N'- (diethyl) ethylphosphonate-N-nitrosourea (fotemustine)); 스트레프토코토신(streptozotocin); 다이아카바자인(diacarbazine (DTIC)); 미토콜로마이드(mitozolomide); 테모콜로마이드(temozolomide); 티오테파(thiotepa); 미토미신 C(mitomycin C); AZQ; 아도젤레신(adozelesin); 시스플라틴(cisplatin); 칼보플라틴(carboplatin); 오르마플라틴(ormaplatin); 옥잘리플라틴(oxaliplatin); C1-973; DWA 2114R; JM216; JM335; 비스 (플라티넘)(Bis (platinum)); 토무덱스(tomudex); 아작시티다인(azacitidine); 사이타라빈(cytarabine); 젬시타빈(gemcitabine); 6-메르캡토퓨린(6-mercaptopurine); 6-티오구라닌(6-thioguanine); 하이포잔틴(hypoxanthine); 테니포사이드 9-아미노 캠프토테신(teniposide 9-amino camptothecin); 토포테칸(topotecan); CPT-11; 토조루비신(Doxorubicin); 다우노미신(Daunomycin); 에피루비신(Epirubicin); 다루비신(darubicin); 미톡잔트론(mitoxantrone); 로속잔트론(losoxantrone); 닥티노미신(액티노미신 D)(Dactinomycin (Actinomycin D)); 아사크린(amsacrine); 피라졸로마크리딘(pyrazoloacridine); 올-트랜스 레티놀(all-trans retinol); 14-하이드록시-레트로-레티놀(14-hydroxy-retro-retinol); 올-트랜스 레트노익 에시드(all-trans retinoic acid); N-(4-하이드록시페닐) 레티나마이드(N- (4- hydroxyphenyl) retinamide); 13-cis 레티노익 에시드(13-cis retinoic acid); 3-메틸 티티엔이비(3-methyl TTNEB); 9-cis 레티노익 에시드(9-cis retinoic acid); 플루다라바인(fludarabine (2-F-ara-AMP)); 또는 2-클로로데옥쟈데노신(2-chlorodeoxyadenosine (2-Cda)).
다른 치료 화합물은, 20-pi-1,25 디히드록시비타민(dihydroxyvitamin) D3; 5-에티닐부라실(ethynyluracil); 아비라테론(abiraterone); 아클라루비신(aclarubicin); 액실풀빈(acylfulvene); 아데사이페놀(adecypenol); 아도젤레신(adozelesin); 알데스렉킨(aldesleukin); 올-티케이 안타고니스트(ALL-TK antagonists); 알트레타민(altretamine); 암바머스틴(ambamustine); 아미독스(amidox); 아미포스틴(amifostine); 아미놀레벌리닉 에시드(aminolevulinic acid); 암루비신(amrubicin); 암사크린(amsacrine); 아나크렐라이드(anagrelide); 아나스트로졸(anastrozole); 안드로그라폴라이드(andrographolide); 안지오젠시스 인히비톨(angiogenesis inhibitors); 안타고니스트 D(antagonist D); 안타고니스트 G(antagonist G); 안타렐릭스(antarelix); 안티-도잘리징 모포제네틱 프로테인-1(anti-dorsalizing morphogenetic protein-1); 안티안드로젠(antiandrogen), 프로스타틱 카르시노마(prostatic carcinoma); 안티에tm트로젠(antiestrogen); 안티네오플라스톤(antineoplaston); 안티신 올리조누클레오타이드(antisense oligonucleotides); 알피다이콜린 글리시네이트(aphidicolin glycinate); 아포프포시스 유전자 모듈레이톨(apoptosis gene modulators); 아포토시스 레귤레이톨(apoptosis regulators); 아퓨리신 에시드(apurinic acid); ara-CDP-DL-PTBA; 알기니네디미네이즈(argininedeaminase); 아술라크린(asulacrine); 아타메스테인(atamestane); 아트리머스틴(atrimustine); 액시네스테틴 1(axinastatin 1); 액시네스테틴 2(axinastatin 2); 액시네스테틴3(axinastatin 3); 아자세트론(azasetron); 아자톡신(azatoxin); 아자티로신(azatyrosine); 바카틴 III 유도체(baccatin III derivatives); 바라놀(balanol); 바티매스타트(batimastat); BCR/ABL 길항제(antagonists); 벤조클로린스(benzochlorins); 벤조일스타우로스포린(benzoylstaurosporine); 베타 락탐 유도체(beta lactam derivatives); 베타-알레틴(beta-alethine); 베타클라마이신 B(betaclamycin B); 베튜리닉 에시드(betulinic acid); bFGF 억제제(bFGF inhibitor); 비칼루타마이드(bicalutamide); 비스안트렌(bisantrene); 비스아지리디닐스페르민(bisaziridinylspermine); 비스나파이드(bisnafide); 비스트라테인 A(bistratene A); 비즈레신(bizelesin); 브리플레이트(breflate); 블레오마이신 A2(bleomycin A2); 블레오마이신 B2(bleomycin B2); 브로피리민(bropirimine); 부도티테인(budotitane); 부티오닌 설폭시민(buthionine sulfoximine); 칼시포트리올(calcipotriol); 칼포스틴 C(calphostin C); 캄포테신 유도체(camptothecin derivatives) (예컨대, 10-하이드록시-캄포테신(10-hydroxy-camptothecin)); 카나리폭스 IL-2(canarypox IL-2); 카페시타빈(capecitabine); 카르복스아마이드-아미노-트리아졸(carboxamide-amino-triazole); 카르복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole); 카레스트 M3(CaRest M3); CARN 700; 연골 유래 억제제(cartilage derived inhibitor); 카르제레신(carzelesin); 카세인 키나제 억제제(casein kinase inhibitors; ICOS); 카스타노스페르민(castanospermine); 세크로핀 B(cecropin B); 세트로렐릭스(cetrorelix); 클로린tm(chlorins); 클로로퀴노살린 설폰아마이드(chloroquinoxaline sulfonamide); 시카프로스트(cicaprost); 시스-포르피린(cis-porphyrin); 클라드리빈(cladribine); 클로미펜 유사물(clomifene analogues); 클로트리마졸(clotrimazole); 콜리스마이신 A(collismycin A); 콜리스마이신 B(collismycin B); 콤브레타스타틴 A4(combretastatin A4); 콤브레타스타틴 유사물(combretastatin analogue); 코나제닌(conagenin); 크램베스시딘 816(crambescidin 816); 크리스나톨(crisnatol); 크립토피신 8(cryptophycin 8); 크립토피신 A 유도체(cryptophycin A derivatives); 쿠라신 A(curacin A); 사이클로펜타안트라퀴논(cyclopentanthraquinones); 사이클로플라탐(cycloplatam); 사이페마이신(cypemycin); 사이타라빈 옥포스페이트(cytarabine ocfosfate); 사이토리틱 인자(cytolytic factor); 사이토스타틴(cytostatin); 다클리시맵(dacliximab); 데시타빈(decitabine); 디하이드로디뎀닌 B(dehydrodidemnin B); 2'데옥시코포르마이신(2'deoxycoformycin; DCF); 데스로렐린(deslorelin); 덱시포스파마이드(dexifosfamide); 덱스라조산(dexrazoxane); 덱스베라파밀(dexverapamil); 디아지퀀(diaziquone); 디뎀닌 B(didemnin B); 디독스(didox); 디에틸노르스페르민(diethylnorspermine); 디하이드로-5-아자사이티딘(dihydro-5-azacytidine); 디하이드로탁솔(dihydrotaxol), 9-; 디옥사마이신(dioxamycin); 디페닐 스피로머스틴(diphenyl spiromustine); 디스코덜모라이드(discodermolide); 도코사놀(docosanol); 도라세트론(dolasetron); 독시플루리딘(doxifluridine); 드로록시펜(droloxifene); 드로나비놀(dronabinol); 듀오카르마이신 SA(duocarmycin SA); 엡셀렌(ebselen); 에코머스틴(ecomustine); 에델포신(edelfosine); 에드레콜로맵(edrecolomab); 에플로르니틴(eflornithine); 엘레멘(elemene); 에미테퍼르(emitefur); 에피루비신(epirubicin); 에포틸론(epothilones) (A, R = H; B, R = Me); 에피틸론(epithilones); 에프리스테라이드(epristeride); 에스트라머스틴 유사물(estramustine analogue); 에스트로젠 작용제(estrogen agonists); 에스트로젠 길항제(estrogen antagonists); 에타니다졸(etanidazole); 에토포사이드(etoposide); 에토포사이드 4'-포스페이트(etoposide 4'-phosphate; 에토포포스(etopofos); 엑세메스탄(exemestane); 패드로졸(fadrozole); 파자라빈(fazarabine); 펜레티나이드(fenretinide); 필그라스팀(filgrastim); 피나스테라이드(finasteride); 플라보피리돌(flavopiridol); 플레제라스틴(flezelastine); 플루아스테론(fluasterone); 플루다라빈(fludarabine); 플루오로다우노루니신 하이드로클로라이드(fluorodaunorunicin hydrochloride); 포르페니멕스(forfenimex); 포르메스테인(formestane); 포스트리에신(fostriecin); 포테머스틴(fotemustine); 가돌리늄 텍사피린(gadolinium texaphyrin); 갈륨 나이트레이트(gallium nitrate); 갈로시타빈(galocitabine); 가니레릭스(ganirelix); 젤라티나제 억제제(gelatinase inhibitors); 젬시타빈(gemcitabine); 글루타티온 억제제(glutathione inhibitors); 헵설팜(hepsulfam); 헤레굴린(heregulin); 헥사메틸렌 비스아세트아마이드(hexamethylene bisacetamide); 호모해링토닌(homoharringtonine; HHT); 하이퍼리신(hypericin); 이반드로닉 에시드(ibandronic acid); 이다루비신(idarubicin); 이독시펜(idoxifene); 이드라맨톤(idramantone); 일모포신(ilmofosine); 일로마스타트(ilomastat); 이미다조아크리돈(imidazoacridones); 이미퀴모드(imiquimod); 면역자극 펩티드(immunostimulant peptides); 인슐린-유사 성장인자-1 리셉터 저해제(insulin-like growth factor-1 receptor inhibitor); 인터페론 작용제(interferon agonists); 인터페론(interferons); 인터루킨(interleukins); 아이오벤구안(iobenguane); 아이오도독소루비신(iododoxorubicin); 이포메아놀(ipomeanol), 4- ; 이리노테칸(irinotecan); 이로플락트(iroplact); 이르소글라딘(irsogladine); 이소벤가졸(isobengazole); 이소호모할리콘드린 B(isohomohalicondrin B); 이타세트론(itasetron); 자스플라키노라이드(jasplakinolide); 카할라리드 F(kahalalide F); 라멜라린-N 트리아세테이트(lamellarin-N triacetate); 란레오타이드(lanreotide); 레이나마이신(leinamycin); 레노그라스팀(lenograstim); 레티난 설페이트(lentinan sulfate); 렙톨스타틴(leptolstatin); 레트로졸(letrozole); 류케미아 억제 인자(leukemia inhibiting factor); 류코사이트 알파 인터페론(leukocyte alpha interferon); 류프롤리드 + 에스트로겐 + 프로게스테론(leuprolide + estrogen + progesterone); 류프로레린(leuprorelin); 레바미솔(levamisole); 리아로졸(liarozole); 선형 폴리아민 유사물(linear polyamine analogue); 친유성 디사카라이드 펩티드(lipophilic disaccharide peptide); 친유성 플래티늄 화합물(lipophilic platinum compounds); 리스소클린아마이드 7(lissoclinamide 7); 로바플라틴(lobaplatin); 롬브리신(lombricine); 로메트렉솔(lometrexol); 로니다민(lonidamine); 로소잔트론(losoxantrone); 로바스타틴(lovastatin); 록소리빈(loxoribine); 루르토테칸(lurtotecan); 루테튬 텍사피린(lutetium texaphyrin); 라이소필린(lysofylline); 리틱 펩티드(lytic peptides); 메이탄신(maytansine); 만노스타틴 A(mannostatin A); 마리마스타트(marimastat); 마소프로콜(masoprocol); 매스핀(maspin); 매트리라이신 억제제(matrilysin inhibitors); 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제(matrix metalloproteinase inhibitors); 메노가릴(menogaril); 멜바론(merbarone); 메테레린(meterelin); 메티오니나제(methioninase); 메토클로프라마이드(metoclopramide); MIF 억제제(MIF inhibitor); 이페프리스톤(ifepristone); 밀테포신(miltefosine); 미리모스팀(mirimostim); 미스매치불일치된 이중 가닥 RNA (mismatched double stranded RNA); 미트라신(mithracin); 미토구아존(mitoguazone); 미토락톨(mitolactol); 미토마이신 유사물(mitomycin analogues); 미토나파이드(mitonafide); 미토톡신 섬유아세포 성장 인자-사포린(mitotoxin fibroblast growth factor-saporin); 미토잔트론(mitoxantrone); 모파로텐(mofarotene); 몰그라모스팀(molgramostim); 단일클론 항체(monoclonal antibody), 인간 융모성 고나도트로핀(human chorionic gonadotrophin); 모노포스포릴 지질 A + 미오박테리움 세포벽 sk(monophosphoryl lipid A + myobacterium cell wall sk); 모피다몰(mopidamol); 다중 약물 저항 유전자 억제제(multiple drug resistance gene inhibitor); 다중 종양 억제제 1-기반의 치료(multiple tumor suppressor 1-based therapy); 머스타드 항암 약제(mustard anticancer agent); 마이카페록사이드 B(mycaperoxide B); 마이코박테리아 세포벽 추출물(mycobacterial cell wall extract); 마이리아포론(myriaporone); N-아세틸디날린(N-acetyldinaline); N-치환된 벤즈아마이드(N-substituted benzamides); 나파레린(nafarelin); 나그레스팁(nagrestip); 날록손 + 펜타조신(naloxone + pentazocine); 나파빈(napavin); 나프테르핀(naphterpin); 나르토그라스팀(nartograstim); 네다플라틴(nedaplatin); 네모루비신(nemorubicin); 네리드로닉 에시드(neridronic acid); 중성 엔도펩티다제(neutral endopeptidase); 닐루타마이드(nilutamide); 니사마이신(nisamycin); 니트릭 옥사이드 모듈레이톨(nitric oxide modulators); 니트록시드 항산화제(nitroxide antioxidant); 니트룰린(nitrullyn); 06-벤질구아닌(06-benzylguanine); 옥트레오타이드(octreotide); 오키세논(okicenone); 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides); 오나프리스톤(onapristone); 온단세트론(ondansetron); 온단세트론(ondansetron); 오라신(oracin); 경구 사이토카인 유도제(oral cytokine inducer); 오르매플라틴(ormaplatin); 오사테론(osaterone); 옥살리플라틴(oxaliplatin); 옥사우노마이신(oxaunomycin); 파클리탁셀 유사물(paclitaxel analogues); 파클리탁셀 유도체(paclitaxel derivatives); 팔라우아민(palauamine); 팔미토일리조신(palmitoylrhizoxin); 팔미드론산(pamidronic acid); 파낙시트리올(panaxytriol); 파노미펜(panomifene); 파라박틴(parabactin); 파젤립틴(pazelliptine); 페가스파르가제(pegaspargase); 펠데신(peldesine); 펜토산 폴리설페이트 소듐(pentosan polysulfate sodium); 펜토스타틴(pentostatin); 펜트로졸(pentrozole); 퍼플루브론(perflubron); 페르포스파민(perfosfamide); 페릴릴 알코올(perillyl alcohol); 페나지노마이신(phenazinomycin); 페닐아세테이트(phenylacetate); 포스페이트 저해제(phosphatase inhibitors); 피시바닐(picibanil); 필로카르핀 히드로클로라이드(pilocarpine hydrochloride); 피라루비신(pirarubicin); 피리트렉심(piritrexim); 플라세틴(placetin) A; 플라세틴(placetin) B; 플라미노겐 활성인자 저해제(plasminogen activator inhibitor); 플라티늄 복합체(platinum complex); 플라티늄 화합물(platinum compounds); 플라티늄-트리아민 복합체(platinum-triamine complex); 포도필로톡신(podophyllotoxin); 포르피머 소듐(porfimer sodium); 포르피로마이신(porfiromycin); 프로필 비스-아크리돈(propyl bis-acridone); 프로스타글라딘(prostaglandin) J2; 프로테아좀 저해제(proteasome inhibitors); 단배질 A-기반 면역 조절제(protein A-based immune modulator); 단백질 키나아제 C 저해제(protein kinase C inhibitor); 단백질 키나아제 C 저해제(protein kinase C inhibitors), 미크로알갈(microalgal); 단백질 티로신 포스페이트 저해제(protein tyrosine phosphatase inhibitors); 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 저해제(purine nucleoside phosphorylase inhibitors); 퍼퓨린(purpurins); 피라졸로아크리딘(pyrazoloacridine); 피리독실레이트 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 콘쥬게이트(pyridoxylated hemoglobin polyoxyethylene conjugate); 라프 길항제(raf antagonists); 랄티트렉시드(raltitrexed); 라모세트론(ramosetron); 라스 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 저해제(ras farnesyl protein transferase inhibitors); 라스 저해제(ras inhibitors); 라스-GAP 저해제(ras-GAP inhibitor); 레텔립틴 디메틸레이티드(retelliptine demethylated); 레늄(rhenium) Re 186 에티드로네이트(etidronate); 리족신(rhizoxin); 리보짐(ribozymes); RII 레티나미드(retinamide); 로글레티미드(rogletimide); 로히투킨(rohitukine); 로뮤티드(romurtide); 로퀴니멕스(roquinimex_; 루비기논(rubiginone) B 1; 루복실(ruboxyl); 사핀골(safingol); 사인토핀(saintopin); SarCNU; 사르코피톨(sarcophytol) A; 사르그라모스팀(sargramostim); Sdi 1 미메틱(mimetics); 세무스틴(semustine); 시네센스 유래 저해제(senescence derived inhibitor) 1; 센스 올리고뉴클레오티드(sense oligonucleotides); 신호전달저해제(signal transduction inhibitors); 신호전달조절제(signal transduction modulators); 단일쇄 항원 결합단백질(single chain antigen binding protein); 시조피란(sizofiran); 소부족산(sobuzoxane); 소듐 보로캅테이트(sodium borocaptate); 소듐 페닐아세테이트(sodium phenylacetate); 솔베롤(solverol); 소마토메딘 결합 단백질(somatomedin binding protein); 소네르민(sonermin); 스파르포스산(sparfosic acid); 스피카마이신(spicamycin) D; 스피로무스틴(spiromustine); 스플레노펜틴(splenopentin); 스폰지스타틴(spongistatin) 1; 스퀄라민(squalamine); 줄기세포 저해제(stem cell inhibitor); 줄기세포 분열 저해제(stem-cell division inhibitors); 스티피아민(stipiamide); 스트로멜리신 저해제(stromelysin inhibitors); 설피노신(sulfinosine); 수퍼액티브 바소액티브 인테스티널 펩티드 길항제(superactive vasoactive intestinal peptide antagonist); 수라디스타(suradista); 수라민(suramin); 스와인소닌(swainsonine); 합성 글리코사미노글리칸(synthetic glycosaminoglycans); 탈리뮤스틴(tallimustine); 타목시펜 메티오디드(tamoxifen methiodide); 타우로뮤스틴(tauromustine); 타자로텐(tazarotene); 테코갈란 소듐(tecogalan sodium); 테가푸르(tegafur); 텔루라피릴륨(tellurapyrylium); 텔로머라제 저해제(telomerase inhibitors); 테모포르핀(temoporfin); 테모졸로미드(temozolomide); 테니포시드(teniposide); 테트라아클로로데카옥사이드(tetrachlorodecaoxide); 테트라조민(tetrazomine); 탈리브라스틴(thaliblastine); 탈리도미드(thalidomide); 티오코라린(thiocoraline); 트롬보포이에틴(thrombopoietin); 트롬보포이데틴 미메틱(thrombopoietin mimetic); 티말파신(thymalfasin); 티모포이테틴 리셉터 작용제(thymopoietin receptor agonist); 티모트리난(thymotrinan); 티로이드 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone); 틴 에틸 에티오퍼퓨린(tin ethyl etiopurpurin); 티라파자민(tirapazamine); 티타노센 디클로라이드(titanocene dichloride); 토포테칸(topotecan); 톱센틴(topsentin); 토레미펜(toremifene); 전분화능 줄기세포 인자(totipotent stem cell factor); 번역 저해제(translation inhibitors); 트레티노인(tretinoin); 트리아세틸루리딘(triacetyluridine); 트리시리빈(triciribine); 트리메트렉세이트(trimetrexate); 트립토렐린(triptorelin); 트로피세트론(tropisetron); 투로스테라이드(turosteride); 티로신 키나아제 저해제(tyrosine kinase inhibitors); 티르포스틴(tyrphostins); UBC 저해제(inhibitors); 유베니멕스(ubenimex); 비뇨생식굴-유래 성장 저해 인자(urogenital sinus-derived growth inhibitory factor); 유로키나아제 리셉터 길항제(urokinase receptor antagonists); 바프레오티드(vapreotide); 바리올린(variolin) B; 벡터시스템(vector system), 적혈구 유전자 치료(erythrocyte gene therapy); 벨라레솔(velaresol); 베라민(veramine); 베르딘(verdins); 베르테포르핀(verteporfin); 비노렐빈(vinorelbine); 빈잘틴(vinxaltine); 비탁신(vitaxin); 보로졸(vorozole); 자노테론(zanoterone); 제니플라틴(zeniplatin); 질라스코르브(zilascorb); 및 지노스타틴 스티말라머(zinostatin stimalamer)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
또한 HSA 링커 콘쥬게이트는 부위-특이적으로(site-specifically) 콘쥬게이션된 분자 및 부분(moieties)을 포함한다. 부위-특이적 콘쥬게이션은, 예컨대 항 튜불린제, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 저해제, 알킬레이팅제(alkylating agents), 안트로사이클린(anthracyclines), 항생제, 항엽산제(antifolates), 항대사제, 화학요법 또는 방사선 민감제(chemotherapy or radiation sensitizer), 듀오카르마이신(duocarmycins), 에토포시드(etoposides), 플루오리네이트 피리미딘(fluorinated pyrimidines), 이오노포레스(ionophores), 렉시트롭신(lexitropsins), 니트로소우레아(nitrosoureas), 플라티놀(platinols), 퓨린 항대사제(purine antimetabolites), 퓨로마이신(puromycins), 스테로이드, 탁산(taxanes), 토포이소머라제 저해제(topoisomerase inhibitors) 및 빈카 알카로이드(vinca alkaloids) 또는 본 명세서에 개시된 다른 분자 또는 부분(moieties)을 포함하는, 세포독성, 면역조절 또는 세포억제성 약제의 상기 HSA 링커의 특이적 잔기에 조절된 화학양록적 부착을 허용한다.
단백질 및 특히 항체에 치료제를 콘쥬게이션 시키는 방법들은, (예컨대, Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al., eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery (Robinson et al., eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al., eds., 1985); Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al., eds., Academic Press, 1985); Thorpe et al., Immunol. Rev. 62:119-58 (1982); and Doronina et al., Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy, Nature Biotech. 21:(7)778-784 (2003))에 잘 알려져 있다. 또한 예컨대, PCT publication WO 89/12624 참조.
HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)은, 또한 용해성 펩티드(lytic peptide)와 쌍을 이룬다. 이러한 용해성 펩티드는 세포 사멸을 유도하고 스트렙토리신(streptolysin) O; 스토이칵티스 톡신(stoichactis toxin); 팔로리신(phallolysin); 스타필로코커스 알파 톡신(staphylococcus alpha toxin); 홀로투린(holothurin) A; 디기토닌(digitonin); 멜리틴(melittin); 리소렉시틴(lysolecithin); 카르디오톡신(cardiotoxin); 및 세레브라툴루스(cerebratulus) A 톡신 (Kem et al., J. Biol. Chem. 253(16):5752-5757, 1978)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 또한 HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety) (예컨대, 항체 또는 항체 단편 콘쥬게이트)은 자연적으로 발생하는 임의의 펩티드 리신(lysins)과 일부 서열 상동성 또는 화학적 특성을 공유하는, 합성 펩티드와 쌍을 이룰 수 있다. 이러한 특성은 선형성(linearity), 양전하(positive charge), 양극성(amphipathicity) 및 소수성 환경에서 알파-헬릭스 구조의 형성을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다 (Leuschner et al., Biology of Reproduction 73:860-865, 2005). HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)은 또한, 예들 들어, 면역글로불린 Fc 서브유닛과 같은, 보체-매개 세포 용해(complement-mediated cell lysis)를 유도하는 약제와 쌍을 이룰 수 있다. HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)은 또한, (포스포리파제 A, 포스포리파제 B, 포스포리파제 C 또는 포스포리파제 D를 포함하는) 포스포리파제 패밀리의 효소들의 임의의 것 또는 그의 촉매-활성 서브유닛과 쌍을 이룰 수 있다.
HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)은 또한, 방사성 약제와 쌍을 이루어 검출 또는 치료 적용에 사용될 수 있는 약제를 형성할 수 있다. 사용될 수 있는 방사성 약제는 피브리노겐(Fibrinogen) 125I; 플루데옥시글루코스(Fludeoxyglucose) 18F; 플루오로도파(Fluorodopa) 18F; 인슐린 125I; 인슐린 131I; 로벤구안(lobenguane) 123I; 이오디파미드 소듐(Iodipamide Sodium) 131I; 이오도안티피린(Iodoantipyrine) 131I; 이오도콜레스테롤(Iodocholesterol) 131I; 로도히푸레이트 소듐(lodohippurate Sodium) 123I; 로도히푸레이트 소듐(lodohippurate Sodium) 125I; 로도히푸레이트 소듐(lodohippurate Sodium) 131I; 이오도피라세트(Iodopyracet) 125I; 이오도피라세트(Iodopyracet) 131I; 로페타민 히드로클로라이드(lofetamine Hydrochloride) 123I; 이오메틴(Iomethin) 125I; 이오메틴(Iomethin) 131I; 이오탈라메이트 소듐(Iothalamate Sodium) 125I; 이오탈라메이트 소듐(Iothalamate Sodium) 131I; 티로신 131I; 리오티로닌(Liothyronine) 125I; 리오티로닌(Liothyronine) 131I; 메리소프롤 아세테이트(Merisoprol Acetate) 197Hg; 메리소프롤 아세테이트(Merisoprol Acetate) 203Hg; 메리소프롤(Merisoprol) 197Hg; 셀레노메티오닌(Selenomethionine) 75Se; 테크네튬(Technetium) 99 mTc 안티모니 트리설파이드 콜로이드(Antimony Trisulfide Colloid); 테크네튬 99 mTc 비시세이트(Bicisate); 테크네튬 99 mTc 디소페닌(Disofenin); 테크네튬 99 mTc 에티드로네이트(Etidronate); 테크네튬 99 mTc 엑사메타짐(Exametazime); 테크네튬 99 mTc 푸리포스민(Furifosmin); 테크네튬 99 mTc 글루셉테이트(Gluceptate); 테크네튬 99 mTc 리도페닌(Lidofenin); 테크네튬 99 mTc 메브로페닌(Mebrofenin); 테크네튬 99 mTc 메드로네이트(Medronate); 테크네튬 99 mTc 메드로네이트 디소듐(Medronate Disodium); 테크네튬 99 mTc 메르티아티드(Mertiatide); 테크네튬 99mTc 옥시드로네이트(Oxidronate); 테크네튬 99 mTc 펜테테이트(Pentetate); 테크네튬 99 mTc 펜테테이트 칼슘 트리소듐(Pentetate Calcium Trisodium); 테크네튬 99 mTc 세스타미비(Sestamibi); 테크네튬 99mTc 시보록심(Siboroxime); 테크네튬 99 mTc; 숙시머(Succimer); 테크네튬 99 mTc 설퍼 콜로이드(Sulfur Colloid); 테크네튬 99 mTc 테보록심(Teboroxime; 테크네튬 99 mTc Tetrofosmin; 테크네튬 99mTc 티아티드(Tiatide); 티록신(Thyroxine) 125I; 티록신(Thyroxine) 131I; 톨포비돈(Tolpovidone) 131I; 트리올레인(Triolein) 125I; 또는 트리올레인(Triolein) 131I를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
추가적으로, 방사성동위원소는 HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트와 부위-특이적으로 결합될 수 있다. 허용가능한 반응기는 123I, 124I, 125I, 131I, 99 mTc, 111In, 64Cu, 67Cu, 186Re, 188Re, 177Lu, 90Y, 77As, 72As, 86Y, 89Zr, 211At, 212Bi, 213Bi 또는 225Ac을 포함하는, 방사성동위원소의 라벨링을 위해 부위-특이적 이중기능의 킬레이팅제를 결합시키는데 사용될 수 있다.
HSA 링커 또는 HSA 링커 콘쥬게이트에 도입되거나 쌍을 이룰 수 있는 치료 또는 세포독성 약제는, 예를 들어, 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는, 항-암 보충 증강제(anti-cancer Supplementary Potentiating Agent)를 더 포함할 수 있다: 트리사이클릭 항-진정제 (예컨대, 이미프라민(imipramine), 데시프라민(desipramine), 아미트립틸린(amitryptyline), 클로미프라민(clomipramine), 트리미프라민(trimipramine), 독세핀(doxepin), 노르트리프틸린(nortriptyline), 프로트리프틸린(protriptyline), 아목사핀(amoxapine) 및 마프로틸린(maprotiline)); 비-트리사이클릭 항-진정제 (예컨대, 세르프랄린(sertraline), 트라조돈(trazodone) 및 시타로프람(citalopram)); Ca2 + 길항제 (예컨대, 베라파밀(verapamil), 니페디핀(nifedipine), 니트렌디핀(nitrendipine) 및 카로베린(caroverine)); 칼모듈린 저해제(Calmodulin inhibitors) (예컨대, 프레닐라민(prenylamine), 트리플루오로페라진(trifluoroperazine) 및 클로미프라민(clomipramine)); 암포테리신(Amphotericin) B; 트리파라놀 유사물(Triparanol analogs) (예컨대, 타목시펜(tamoxifen)); 항부정맥제(antiarrhythmic drugs) (예컨대, 퀴니딘(quinidine)); 항고혈압제(antihypertensive drugs) (예컨대, 레세르핀(reserpine)); 티올 디플레터(Thiol depleters) (예컨대, 부티오닌(buthionine) 및 설폭시민(sulfoximine)) 및 크레마포 EL(Cremaphor EL)과 같은 다중 약내성 감소제(Multiple Drug Resistance reducing agents).
HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)를 포함하는 약제는 또한, 하나 이상의 사이토카인들 (예컨대, 과립구콜로니자극인자(granulocyte colony stimulating factor), 인터페론-알파(interferon-alpha) 및 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha))과 쌍을 이루거나 함께 투여될 수 있다. HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)은 또한, 항대사제와 쌍을 이룰 수 있다. 항대사제는 다음의 화합물 및 그들의 유도체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다: 아자티오프린(azathioprine), 클라드리빈(cladribine), 시트라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine), 플루다라빈 포스페이트(fludarabine phosphate), 플루오로우라실(fluorouracil), 젠시타빈 클로로히드레이트(gencitabine chlorhydrate), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 메토르레세이트(methotrexate), 미토브로니톨(mitobronitol), 미토탄(mitotane), 프로구아닐 클로로히드레이트(proguanil chlorohydrate), 피리메타민(pyrimethamine), 랄티트렉시드(raltitrexed), 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트(trimetrexate glucuronate), 우레탄(urethane), 빈블라스틴 설페이트(vinblastine sulfate), 빈크리스틴 설페이트(vincristine sulfate) 등. 더욱 바람직하게는, HSA 링커 또는 콘쥬케이트는, 예들 들어, 메토트렉세이트(methotrexate), 프로구아닐 클로르히드레이트(proguanil chlorhydrate), 피리메타님(pyrimethanime), 트리메토프림(trimethoprime) 또는 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트(trimetrexate glucuronate) 또는 이러한 화합물의 유도체들을 포함하는 종류의 약제, 엽산-타입 항대사물질(folic acid-type antimetabolite)과 쌍을 이룰 수 있다.
HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)은 또한, 아크라루비신 클로르히드레이트(aclarubicine chlorhydrate), 다우노루비신 클로르히드레이트(daunorubicine chlorhydrate), 독소루비신 클로르히드레이트(doxorubicine chlorhydrate), 에피루비신 클로르히드레이트(epirubicine chlorhydrate), 이다루비신 클로르히드레이트(idarubicine chlorhydrate), 피라루비신 또는 조루비신 클로르히드레이트; 캄토테신(camptothecin), 또는 10, 11 메틸렌디옥시캄토테신(methylenedioxycamptothecin)과 같은 그의 유도체 또는 관련 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 종양제의 안트라사이클린(anthracycline) 패밀리의 멤버; 또는 다양한 구조적으로-관련된 화합물, 예컨대, 안사미토신(ansamitocin) P3, 메이탄신(maytansine), 2-N-디메틸메이탄부틴(demethylmaytanbutine) 및 메이탄비시리놀(maytanbicyclinol)을 포함하는 화합물의 메이탄시노이드(maytansinoid) 패밀리의 멤버와 쌍을 이룰 수 있다.
HSA 링커, 또는 그와 결합된 임의의 분자 또는 부분(moiety)은 공지된 화학적 방법을 이용하여 세포독성 또는 치료제와 직접적으로 쌍을 이룰 수 있거나 간접적 결합을 통해 세포독성 또는 치료제와 간접적으로 쌍을 이룰 수 있다. 예들 들어, HSA 링커는 세포독성 또는 치료제에 부착된 킬레이팅기에 부착할 수 있다. 킬레이팅기는 이미노카르복실릭(ininocarboxylic) 및 폴리아미노폴리카르복실릭(polyaminopolycarboxylic) 반응기, 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA) 및 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(tetraazacyclododecane)-1,4,7,10-테트라아세트산(tetraacetic acid) (DOTA)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 일반적인 방법에 대해서는, 예컨대, Liu et al., Bioconjugate Chem. 12(4):653, 2001; Cheng et al., WO 89/12631; Kieffer et al., WO 93/12112; Albert et al., U.S.P.N. 5,753,627; 및 WO 91/01144 참조 (이들 각각은 본 명세서에 참조로서 편입된다).
예컨대, HSA 링커 또는 (본 명세서에 정의된 바와 같은, 사이에 있는 펩티드 커넥터가 있거나 없는) 하나 이상의 결합 부분, 치료 또는 세포독성 약제를 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트는, 결합 부분 (예컨대, 항체, 항체 단편, 또는 리셉터/리간드)에 의해 세포 또는 조직을 특이적으로 타겟팅할 수 있고, 그에 따라 상기 결합 부분은 직접적으로 타겟 세포 또는 조직의 선택적 파괴를 허용한다. 예들 들어, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트가 폐, 유방, 전립선 및 결장의 암세포에 특이적으로 결합하는 결합 부분을 포함할 때, 암의 진행을 방지, 안정화, 저해하거나, 또는 이러한 기관에서 발생하는 암을 치료하기 위하여 HSA 링커 콘쥬게이트는 이러한 기관의 암세포를 타겟팅 및 파괴하는데 사용될 수 있다. 또한, 예들 들어, HSA 링커 콘쥬게이트는 노인성, 흡연-관련 또는 자가면역질환 또는 병의 진행을 방지, 안정화, 저해하거나, 또는 치료하기 위해 맥관구조(vasculature), 뇌, 간, 신장, 심장, 폐, 전립선, 결장, 비인두(nasopharynx), 구강인두(oropharynx), 후두(larynx), 기관지(bronchus), 및 피부의 세포를, 예들 들어, 자가면역질환의 경우, 자가반응성 T 세포 (예컨대, 자가반응성 T 세포 상에 존재하는 종양괴사인자 수용체 (tumor necrosis factor receptor 2, TNFR2)에 결합하고 방해함으로써), 타겟팅 및 파괴하는데 사용될 수 있다.
HSA 링커는, 재조합으로 발현될 때, 세포독성 폴리펩티드와 결합될 수 있다. 세포독성 폴리펩티드는, 타겟 세포 (예컨대, 암세포)와 접촉을 일으킬 때, 세포 상 세포독성 또는 세포억제성 효과를 나타낸다. 예들 들어, 세포독성 폴리펩티드는, HSA 링커와 결합될 때, 예컨대, 아포토시스(apoptosis), 괴사(necrosis) 또는 노화(senescence)를 통해 세포사멸을 초래하는 타겟 세포의 결합에 따라 타겟 세포에서 문제를 일으킬 수 있다. 다른 방법으로서, HSA 링커와 결합된 세포독성 폴리펩티드는 분열, 대사 및 성장과 같은 정상적 세포의 생물학적 활성 또는 전이(metastasis)와 같은 비정상적 세포의 생물학적 활성을 방해하거나 저해할 수 있다.
예들 들어, 카스파제(caspase) 3과 결합된 HSA 링커는 타겟 세포 (예컨대 암세포)와 결합하여 엔도사이토시스(endocytosis)를 일으킨다. 일단 타겟 세포에 의해 내재화(internalize)되면, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트의 카스파제 일부는 전-아포토시스 카스파제 연쇄반응(pro-apoptotic caspase cascade)을 시작하여, 결국 타겟 세포의 아포토시스를 초래한다.
바람직한 구현예에서, HSA 링커 콘쥬게이트는 암세포를 죽일 수 있는 세포독성 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 세포독성 폴리펩티드는 암세포의 성장 또는 전이를 저해한다. HSA 링커와 결합된 세포독성 폴리펩티드는 또한, 죽이거나, 고형암을 퍼트리는 혈관을 형성하는 내피세포와 같은, 암 성장에 관련되거나, 필요하거나, 또는 이로운 세포의 성장을 저해하는데 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, HSA 링커 콘쥬게이트는 타겟 세포에 세포독성 또는 세포억제 효과를 나타내는 특이성, 강도 또는 기간을 조절 (예컨대, 증가)하기 위해 둘 이상의 세포독성 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 세포독성 폴리펩티드의 활성화 형태와 결합될 수 있다 (예컨대, 효소 또는 약물에 의한 절단을 활성화할 수 있는 생물학적-불활성 전-약제). 이러한 구현예에서, 상기 세포독성 폴리펩티드를 절단할 수 있는 효소 또는 약물에 상기 세포독성 폴리펩티드 전-약제의 노출 (예컨대, 생체내)은, 세포독성 폴리펩티드가 생물학적-활성을 나타내게 한다. HSA 링커를 사용하기 위해 생물학적-활성 형태로 변환시킬 수 있는 생물학적-불활성 세포독성 폴리펩티드의 예는 프로카스파제(procaspase) (예컨대, 프로카스파제 8 또는 3)이다. 예들 들어, HSA 링커의 상기 프로카스파제 6 도메인은 타겟 세포 (예컨대, 암세포)에 의한 내재화에 따라 TRAIL 또는 FasL에 의해 절단될 수 있다. 일단 절단되면, 상기 생물학적 활성 카스파제 8은 타겟 세포의 아포토시스를 유도할 수 있다.
하나의 구현예에서, HSA 링커와 결합된 세포독성 폴리펩티드는, 세포독성 또는 세포억제 특성을 가진다고 공지된, 전장 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 그들의 생물학적-활성 단편 (예컨대, 사멸 도메인(death domain))을 포함할 수 있다. 세포독성 또는 세포억제 특성이 있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 변형되어 (예컨대, 아미노산 치환, 돌연변이, 트렁케이션(truncations) 또는 추가(additions)를 일으켜) 본 명세서에 개시된 바와 같은 약제에 상기 세포독성 서열의 도입을 용이하게 할 수 있다. 원하는 변형은, 예들 들어, 단백질 발현을 용이하게 하는 아미노산 서열의 변경, 수명(longevity), 세포 분비 및 타겟 세포 독성을 포함한다.
또한 본 발명은 HSA 링커와 융합된 단백질로서 세포독성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 선택적으로 결합 부분 및 펩티드 커넥터를 포함한다. 상기 핵산 분자는 벡터 (예컨대, 발현 벡터)에 도입될 수 있고, 상기 벡터, 세포독성 폴리펩티드, HSA 링커 및 결합 부분으로 트랜스펙션 또는 트랜스덕션된 세포에서 HSA 링커를 발현하며, 존재하는 경우, 작동가능하게 연결된다 (예컨대, 융합되거나 인접하여 연결되거나 또는 함께 테더(tether)됨). 본 발명의 세포독성 폴리펩티드로 사용될 수 있는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은, 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다: 시토크롬 c와 같은 아포토시스-유도 단백질(apoptosis-inducing proteins) (서열번호 39); 카프파제 (예컨대, 카스파제 3 (서열번호 36) 및 카스파제 8 (서열번호 37)); 프로카스파제, 그랜자임 (예컨대, 그랜자임 A 및 B (서열번호 38)); TNF 알파 (TNFα: 서열번호 40), TNF-베타, Fas (서열번호 41) 및 Fas 리간드를 포함하는, 종양괴사인자 (TNF) 및 TNF 리셉터 패밀리 멤버; Fas-관련 사멸 도메인-유사 IL-1β 전환효소(Fas-associated death domain-like IL-1β converting enzyme, FLICE); TRAIL/APO2L (서열번호 45) 및 TWEAK/APO3L (예컨대, U.S. Patent Application Publication No. 2005/0187177 참조, 본 명세서에 참조로서 편입됨); Bax (서열번호 46), Bid, Bik, Bad (서열번호 42), Bak 및 RICK (예컨대, U.S. Patent Application Publication No. 2004/0224389 참조, 본 명세서에 참조로서 편입됨)을 포함하는, Bcl-2 패밀리의 전-아포토시스 멤버; 혈관 아포토시스를 유도하는 단백질 1 및 2 (vascular apoptosis inducing proteins 1 and 2, VAP1 및 VAP2; Masuda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 278:197-204 (2000)); 피에리신(pierisin) (서열번호 44; Watanabe et al., Biochemistry 96:10608-10613 (1999)); 아포토시스-유도 단백질(apoptosis-inducing protein) (서열번호 43; AIP; Murawaka et al., Nature 8:298-307 (2001)); IL-1α 프로피스 폴리펩티드(propiece polypeptide) (예컨대, U.S. Patent 6,191,269 참조, 본 명세서에 참조로서 편입됨); 아포틴(apoptin) 및 AAP-1와 같은 아포틴-관련 단백질(apoptin-associated proteins) (예컨대, European Patent Application Publication No. EP 1083224 참조, 본 명세서에 참조로서 편입됨); 엔도스타탄(endostatin) 및 안지오스타틴(angiostatin)과 같은 항-혈광신생 인자 (anti-angiogenic factors); 및 다음에 개시된 것을 포함하는 다른 아포토시스-유도 단백질, International 및 U.S. Patent Application Publications, 각각은 본 명세서에 참조로서 편입됨: U.S. 2003/0054994, U.S. 2003/0086919, U.S. 2007/0031423, WO 2004/078112, WO 2007/012430, 및 WO 2006/0125001 (델타 1 및 재그(jagged) 1의 세포내 도메인).
야생형 HSA 링커 콘쥬게이트
또한 본 발명은 자연적으로-발생하는 야생형 HSA 링커를 포함하고 결합, 진단 또는 치료제의 형태로서 이들의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 3 및 4에서 제공된다. 서열번호 3으로 표시된 상기 아미노산 서열을 갖는 HSA 링커를 이용하는 모든 구현예에서, 상기 개시된 하나 이상의 펩티드 커넥터는, 상기 HSA 링커의 아미노 및/또는 카르복시 말단에, 또는 상기 HSA 링커 서열 내 아미노산 잔기에 공유적으로 부착되어, 하나 이상의 결합 부분의 콘쥬게이션을 용이하게 한다.
트렁케이션(Truncations)
본 발명은 하나 이상의 펩티드 커넥터 또는 결합 부분과 선택적으로 결합된, 트렁케이션된 야생형 HSA 폴리펩티드를 이용하여 형성된 HSA 링커 콘쥬게이트를 제공한다. 전장 야생형 HSA 아미노산 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 200 또는 그 이상의 아미노산이 결핍된 야생형 HSA 폴리펩티드(즉, 서열번호 3)는 본 명세서에 개시된 임의의 결합 부분 또는 진단 또는 치료제와 결합될 수 있다. 트렁케이션은 상기 HSA 링커의 두 말단 중 하나 또는 둘 다에서 일어날 수 있고, 또한 내부 잔기의 삭제(deletion)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 잔기의 트렁케이션은 선형(linear)(즉, 연속적(consecutive))일 필요는 없다. 야생형 HSA 링커의 예들은, 하나 이상의 도메인 I (서열번호 56; 서열번호 3의 1-197 잔기), 도메인 II (서열번호 54; 서열번호 3의 189-385 잔기), 또는 도메인 III (서열번호 57; 서열번호 3의 381-585 잔기), 또는 그들의 조합, 예컨대 도메인 I과 II, I과 III, 및 II와 III을, 하나 이상의 펩티드 커넥터 또는 결합 부분과 조합한 것을 포함한다.
콘쥬게이트 (예컨대, 이중특이적 HSA-약물 또는 방사성동위원소-포함 약제)의 혈청 선명비(Serum clearance rates)는, 상기 개시된 것 바와 같이, 트렁케이션된 야생형 HSA 링커을 포함하는 시험 콘쥬게이트(testing conjugates)에 의해 시각화될 수 있다.
추가적인 HSA 링커 변형
HSA 링커들은 상기 HSA 링커에서 아미노산 잔기의 부위-특이적 화학 변형으로 변형될 수 있으나, 필요하지는 않다. HSA의 정확하게-폴딩된(correctly-folded) 3차 구조는 단백질의 외부 표면의 아미노산 잔기를 보여준다. 화학적-활성 아미노산 잔기 (예컨대, 시스테인)는 이러한 표면-노출된 잔기를 치환하여 진단 또는 치료제의 부위-특이적 콘쥬게이션을 허용할 수 있다.
다른방법으로서(Alternatively), 또한 추가에서, HSA 링커는 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔기의 글리코실화(glycosylation)를 변경하기 위해 HSA 링커 서열로부터 이러한 아미노산 잔기의 추가 또는 제거에 의해 선택적으로 변형될 수 있다. 바람직하게는 HSA 링커에 추가된 글리코실화 부위는 본 명세서에 언급한 바와 같이 표면-노출된다. HSA 링커에 도입된 글리코실 또는 다른 탄수화물 부분(carbohydrate moeities)은 진단, 치료 또는 세포독성 약제와 직접적으로 콘쥬게이션될 수 있다.
시스테인 (티올) 콘쥬게이션
진단, 치료 또는 세포독성 약제의 화학적 콘쥬게이션을 허용하기 위해 상기 HSA 링커의 표면-노출된 아미노산 잔기는 시스테인 잔기로 치환될 수 있다. (그것 본래의 3차 구조로 폴딩될 때) 상기 HSA 링커의 표면에 노출된 시스테인 잔기는 말레이미드(maleimide) 또는 할로아세틸(haloacetyl)과 같은 티올 반응기에 진단, 치료 또는 세포독성 약제의 특이적 콘쥬게이션을 허용한다. 말레이미드기(maleimide group)에 대한 시스테인 잔기의 친핵반응성(nucleophilic reactivity)의 티올 기능성(thiol functionality)은 리신 잔기의 아미노기 또는 N-말단 아미노기와 같은, 단백질에서 다른 임의의 아미노산 기능성에 비해 약 1000배 더 높다. 이오도아세틸(iodoacetyl) 및 말레이미드(maleimide)에서 티올 특이적 기능성은 아민기와 반응할 수 있으나, 더 높은 pH (>9.0) 및 더 긴 반응시간이 필요하다 (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London). 단백질에서 유리 티올의 양은 표준 엘먼 분석(Ellman's assay)을 이용하여 측정될 수 있다. 어떤 경우에는, 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT) 또는 셀레놀(selenol)과 같은 시약으로 이황화 결합을 환원(reduction)시키는 것 (Singh et al., Anal. Biochem. 304:147-156 (2002))이 반응성 유리 티올을 생성하는데 필요하다.
시스테인 치환을 위한 부위는 HSA 링커의 표면 접근가능성(surface accessibility)의 분석에 의해 확인될 수 있다 (예컨대, 치환에 적절한 것으로 세린 및 트레오닌 잔기의 확인은 하기 실시예 1에 개시되어 있다). 상기 표면 접근가능성은 용매 분자, 예컨대 물에 의해 접촉될 수 있는 표면적 (예컨대, 스퀘어 옹스트롬(square angstrom))으로 표시될 수 있다. 물이 채워진 공간은 1.4 옹스트롬 반경을 갖는 구형(sphere)에 가깝다. 단백질의 각 아미노산의 표면 접근가능성을 계산하는 소프트웨어는 무료로 사용가능하거나 라이선스가능(licensable)하다. 예들 들어, 공지의 x-레이 결정학 파생된 단백질의 각 아미노산의 표면 접근가능성을 계산하기 위한 알고리즘을 채용한 결정학 프로그램의 CCP4 슈트가 해당한다 (The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography Acta. Cryst. D50:760-763 (1994); www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html). 또한 용매 접근가능성은 스위스생물정호학협회(Swiss Institute of Bioinformatics)로부터 다운로드된 무료 소프트웨어 DeepView Swiss PDB Viewer를 이용하여 측정될 수 있다. 상기 표면-노출된 부위에서 시스테인의 치환은 진단 또는 치료제와 결합된 티올 반응기와 반응성 시스테인의 콘쥬게이션을 허용한다.
글리코실화(Glycosylation)
또한, 변경된 혈청 선명비는 상기 HSA 링커의 글리코실화 부위를 가공(engineering)함으로써 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, HSA 링커는 글리코실화된다. 폴리펩티드의 글리코실화는 일반적으로 N-연결(N-linked) 또는 O-연결(O-linked) 중 하나이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 사이드체인(side chain)에 탄수화물 부분(carbohydrate moiety)의 부착을 지칭한다. 트리펩티드(tripeptide) 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌은, 아스파라긴 사이드체인에 탄수화물 부분의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산을 나타낸다. 따라서, 폴리펩티드에서 이러한 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결 글리코실화는 히드록시아미노산(hydroxyamino acid), 5-히드록시프롤린(hydroxyproline) 또는 5-히드록시리신(hydroxylysine)도 사용될 수 있지만, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 당(sugars), N-아실갈락토사민(N-aceylgalactosamine), 갈락토스(galactose) 또는 자일로스(xylose) 중 하나의 부착을 지칭한다.
상기 HSA 링커에 글리코실화 부위의 추가 또는 삭제는 하나 이상의 상기-개시된 (N-연결 글리코실화 부위를 위해) 트리펩티드 서열이 생성된 것처럼 아미노산 서열을 변경함으로써 용이하게 수행될 수 있다. 또한 상기 변경은 (O-연결 글리코실화 부위를 위해) 본래의(original) HSA 링커의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 추가, 삭제 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다. 그 결과 HSA 상의 탄수화물 구조는 상기 개시된 바와 같은 세포독성, 면역조절 또는 세포억제성 약제에 사용될 수도 있다.
다른 치료제와 조합된 HSA 링커 콘쥬게이트
본 명세서에 개시된 HSA 링커 콘쥬게이트는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 치료제, 세포독성제 또는 세포억제제들과 함께 투여될 수 있다. 예컨대, 유방암 환자의 경우는 ErbB2 및 ErbB3 scFvs (e.g., B2B3-1)를 함유하는 HSA 링커를 예컨대, 독소루비신, 사이클로포스파마이드 및 파클리탁셀, 유방암 치료에 공통된 화학치료요법과 함께 병용 투여될 수 있다. 이러한 경우에 사용하기 위한 바람직한 치료제는 트라스투주맙(trastuzumab)이다. 상기 조합에 관한 데이터는 하기 실시예 42-44에 명시하였다. 암 치료에 유용한 추가적인 생물학적 및 화학적 약제는 예컨대, 첨부 2(Appendix 2)에 명시하였다.
방사능요법 또는 외과수술과 조합된 HSA 링커 콘쥬게이트
HSA 링커 콘쥬게이트는 방사능요법 또는 외과수술의 전에, 함께 또는 후에 투여될 수 있다. 예컨대, 증식성 질병 (예컨대, 유방암)의 경우는 암조직 부위를 표적으로 한 방사능용법 또는 외과수술 (예컨대, lumpectomy 또는 mastectomy)과 함께 본 명세서에 기술된 다른 치료제, 세포독성제 또는 세포억제제들의 단독 또는 조합으로 HSA 링커 콘쥬게이트를 투여할 수 있다. HSA 링커 콘쥬게이트와 조합하기에 적합한 방사능요법은 근접치료(brachytherapy) 및 표적 수술중 방사능치료(targeted intraoperative radiotherapy (TARGIT))를 포함한다.
약학적 조성물
본 명세서에 제공된 약학적 조성물은 치료학적으로 또는 진단학적으로 유효량의 HSA 링커 콘쥬게이트를 함유하며, 상기 콘쥬게이트는 하나 이상의 결합 부분 (예컨대, 항체 또는 항체 단편), 진단제 (예컨대, 방사핵종 또는 킬레이팅제), 또는 치료제 (예컨대, 세포독성제 또는 면역조절제)를 포함한다. 활성성분인 HSA 링커 콘쥬게이트(하나 이상의 결합 부분, 진단제 또는 치료제와 함께 제조된)는 다양한 약물 전달 시스템에 사용될 수 있게 제제화될 수 있다. 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체가 또한 적당한 제제의 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 사용에 적합한 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)에서 찾을 수 있다. 약물 전달 방법의 간략한 리뷰는 Langer Science 249:1527-1533 (1990)를 참조한다.
본 발명의 약학적 조성물은 예방 및/또는 치료를 위해 예컨대 경피 수단과 같이, 비경구적, 비강내, 도포적, 경구적, 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 약학적 조성물은 비경구적 (예컨대, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의해), 또는 경구 섭취, 또는 도표 적용에 의해 투여된다. 따라서, 비경구 투여용 조성물은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체, 예컨대, 물, 완충수, 식염수, PBS 등에 용해되거나 현탁된, 하나 이상의 결합 부분, 콘쥬게이트된 진단제 및/또는 치료제와 함께 또는 없이 HSA 링커를 포함한다. 상기 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 등장제, 습윤제와 같이 생리학적 조건을 맞추기 위해 필요한 약학적으로 허용가능한 보조 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명은 또한 정제, 캡슐 등의 제제화를 위해 바인더 또는 필러와 같은 불활성 성분들을 포함할 수 있는 경구 투여용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 크림, 연고 등의 제제화를 위해 솔벤트 또는 유화제와 같은 불활성 성분들을 포함할 수 있는 국소 투여용 조성물을 제공한다.
이들 조성물은 종래 멸균 기술들에 의해 멸균화되거나 멸균 여과될 수 있다. 결과의 수용액은 그대로 사용될 있도록 포장되거나, 동결건조될 수 있으며, 상기 동결건조된 제제는 투여전에 멸균 수성 담체와 조합된다. 상기 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 더 바람직하게는 5 내지 9, 또는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 것이다. 결과의 고형 조성물은 예컨대 밀봉된 정제 또는 캡슐의 패키지내에 각 도스(dose) 단위가 정해진 양의 HSA 링커 콘쥬게이트(하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)를 함유하는, 다중 단일 도스 단위들로 포장될 수 있다. 상기 고형 조성물은 또한 도포 적용가능한 크림 또는 연고용으로 디자인된 짤 수 있는 튜브와 같이 유연한 양의 용기에 포장될 수 있다.
유효량의 HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)를 함유하는 조성물은 예방 및/또는 치료를 위해 포유동물 (예컨대, 인간)에 투여될 수 있다. 예방 용도에서, HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)를 함유하는 조성물은 질환 또는 질병(예컨대, 암, 자기면역질환, 또는 심혈관질환)에 감수성이거나 진행할 위험성이 있는 환자에 투여된다. 그러한 양은 "예방적 유효량"으로 정의된다. 이 용도에서, 정확한 양은 또한 환자의 건강상태에 의존하나, 일반적으로는 도스당 약 0.5 mg 내지 약 400 mg (예컨대, 도스당 10 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 또는 400 mg 또는 그 이상)의 HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된) 및 도스당 약 0.1 μg 내지 약 300 mg (예컨대, 도스당 10 μg, 30 μg, 50 μg, 0.1 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 또는 200 mg)의 하나 이상의 면역조절제의 범위이다. 한 도스의 HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)는 시간, 일, 주, 월 또는 년 당 하나 이상의 횟수로(예컨대 시간, 일, 주, 월 또는 년 당 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 횟수) 환자에 예방적으로 투여될 수 있다. 더 일반적으로는, 주당 단일 도스의 HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)가 투여된다.
치료 용도에서, 한 도스의 HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)는 하나 이상의 질환 또는 질병 증상들과 그 합병증을 치료 또는 적어도 일부 억제 또는 완화하기에 충분한 양으로 질환 또는 질병(예컨대, 암, 자기면역질환, 또는 심혈관질환)에 이미 걸린 포유동물(예컨대, 인간)에 투여된다. 이 목적을 달성하기에 적합한 양은 "치료적 유효량"으로 정의된다. 이 용도의 유효량은 질환 또는 질병의 중한 정도 또는 환자의 질병 또는 일반 상태에 의존하나, 일반적으로 도스당 약 0.5 mg 내지 약 400 mg (예컨대, 도스당 10 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 또는 400 mg 또는 그 이상)의 HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)의 범위이다. 한 도스의 HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)는 시간, 일, 주, 월 또는 년 당 하나 이상의 횟수로(예컨대 시간, 일, 주, 월 또는 년 당 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 횟수) 환자에 치료적으로 투여될 수 있다. 더 일반적으로는, 주당 단일 도스의 HSA 링커 콘쥬게이트 (하나이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)가 투여된다.
여러 구현예에서, 환자는 주당 하나 이상의 횟수 (예컨대, 주당 2, 3, 4, 5, 6, or 7 회 이상)로 도스당 약 0.5 내지 약 400 mg, 바람직하게는 주당 하나 이상의 횟수로 도스당 약 5 mg 내지 약 300 mg, 더욱 바람직하게는 주당 하나 이상의 횟수로 도스당 약 5 mg 내지 약 200 mg의 HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)가 투여될 수 있다. 환자는 또한 이주간 도스로 HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)를 약 50 mg 내지 약 800 mg의 범위로, 또는 월간 도스로 HSA 링커 또는 그에 콘쥬게이트된 어떤 결합, 진단 및/또는 치료제를 약 50 mg 내지 약 1,200 mg의 범위로 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)는 전형적 투여량 범위의 주당 약 0.5 mg 내지 주당 약 2000 mg, 주당 약 1.0 mg 내지 주당 약 1000 mg, 주당 약 5 mg 내지 주당 약 500 mg, 주당 약 10 mg 내지 주당 약 100 mg, 주당 약 20 mg 내지 주당 약 80 mg, 주당 약 100 mg 내지 주당 약 300 mg, 또는 주당 약 100 mg 내지 주당 약 200 mg로 환자에 투여될 수 있다. 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 HSA 링커 콘쥬게이트를 70 kg 환자에게 투여하기 위한 투여량(dosage)은 예컨대, 약 1 μg 내지 약 5000 mg, 약 2 μg 내지 약 4500 mg, 약 3 μg 내지 약 4000 mg, 약 4 μg 내지 약 3500 mg, 약 5 μg 내지 약 3000 mg, 약 6 μg 내지 약 2500 mg, 약 7 μg 내지 약 2000 mg, 약 μg 내지 약 1900 mg, 약 9 μg 내지 약 1800 mg, 약 10 μg 내지 약 1700 mg, 약 15 μg 내지 약 1600 mg, 약 20 μg 내지 약 1575 mg, 약 30 μg 내지 약 1550 mg, 약 40 μg 내지 약 1500 mg, 약 50 μg 내지 약 1475 mg, 약 100 μg 내지 약 1450 mg, 약 200 μg 내지 약 1425 mg, 약 300 μg 내지 약 1000 mg, 약 400 μg 내지 약 975 mg, 약 500 μg 내지 약 650 mg, 약 0.5 mg 내지 약 625 mg, 약 1 mg 내지 약 600 mg, 약 1.25 mg 내지 약 575 mg, 약 1.5 mg 내지 약 550 mg, 약 2.0 mg 내지 약 525 mg, 약 2.5 mg 내지 약 500 mg, 약 3.0 mg 내지 약 475 mg, 약 3.5 mg 내지 약 450 mg, 약 4.0 mg 내지 약 425 mg, 약 4.5 mg 내지 약 400 mg, 약 5 mg 내지 약 375 mg, 약 10 mg 내지 약 350 mg, 약 20 mg 내지 약 325 mg, 약 30 mg 내지 약 300 mg, 약 40 mg 내지 약 275 mg, 약 50 mg 내지 약 250 mg, 약 100 mg 내지 약 225 mg, 약 90 mg 내지 약 200 mg, 약 80 mg 내지 약 175 mg, 약 70 mg 내지 약 150 mg, 또는 약 60 mg 내지 약 125 mg 범위일 수 있다. 투여 용법(Dosage regimen)은 최적의 치료 반응(therapeutic response)을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 다른 양태에서, HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)는 격일 약 0.5 mg 내지 격일 약 500 mg, 바람직하게는 격일 약 5 mg 내지 격일 약 75 mg, 더욱 바람직하게는 격일 약 10 mg 내지 격일 약 50 mg, 더더욱 바람직하게는 격일 약 20 mg 내지 격일 약 40 mg의 범위로 환자에 투여될 수 있다. HSA 링커 콘쥬게이트 (하나 이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)는 또한 주당 3회 약 0.5 mg 내지 주당 3회 약 100 mg, 바람직하게는 주당 3회 약 5 mg 내지 주당 3회 약 75 mg, 더욱 바람직하게는 주당 3회 10 mg 내지 주당 3회 약 50 mg, 더더욱 바람직하게는 주당 3회 약 20 mg 내지 주당 3회 약 40 mg의 범위로 환자에 투여될 수 있다.
본 발명의 방법의 제한되지 않는 구현예에서, HSA 링커 콘쥬게이트 (하나이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)는 1, 2, 3, 또는 4 시간동안 연속적으로; 일당 또는 매 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일당 1, 2, 3, 또는 4회; 주당 또는 2주당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회; 월당 또는 2개월당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30회; 매 6개월당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회; 1년당 또는 2년당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 포유동물(예컨대, 인간)에 투여될 수 있다. HSA 링커 콘쥬게이트 (하나이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된) 치료 요법동안 서로다른 빈도수로 투여될 수도 있다. 다른 구현예에서, HSA 링커 콘쥬게이트 (하나이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)는 한 환자에 동일한 빈도수 또는 다른 빈도수로 투여될 수도 있다.
원하는 치료효과를 달성하기 위해 필요한 하나이상의 진단 또는 치료제 및 HSA 링커 또는 그것에 컨쥬게이트된 어떤 약제의 양은 선택된 특이적 진단 또는 치료제, 투여방법 및 환자의 임상조건과 같은 수많은 인자들에 의존한다. 당업자는 상기 원하는 결과를 달성하기 위한 하나이상의 진단 또는 치료제 및 HSA 링커 또는 그것에 콘쥬게이트된 어떤 약제의 적당한 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
유효량의 HSA 링커 콘쥬게이트 (하나이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)를 함유하는 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료하는 의사에 의해 선택된 투여량 수준과 패턴으로 수행될 수 있다. 투여량과 투여 스케줄은 포유동물(예컨대, 인간)의 질환 또는 질병의 중한 정도에 기초하여 결정되고 조정될 수 있으며, 상기 정도는 임상의에 의해 일반적으로 수행되는 방법에 따라 치료과정을 통해 모니터될 수 있다.
HSA 링커 콘쥬게이트 (하나이상의 결합, 진단 및/또는 치료제와 함께 제조된)는 직접적으로 또는 당업계에 알려진 어떤 약학적으로 허용가능한 담체 또는 염과 조합하여 포유동물, 예컨대 인간에 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 약학계에 일반적으로 사용되는 비독성 산첨가염 또는 금속 복합체를 포함한다. 산 첨가염의 예들은 초산, 젖산, 파모산, 말레산, 구연산, 말리산, 아스코브산, 숙신산, 벤조산, 팔미트산, 수베르산, 살리실산, 타르타르산, 메탄술폰산, 톨루엔술폰산, 또는 트리플루오로아세트산 등과 같은 유기산; 탄닉산, 카르복시메틸 셀룰로스 등과 같은 폴리머산; 및 염산, 하이드로브롬산, 황산, 인산등과 같은 무기산을 포함한다. 금속 복합체는 아연, 철 등을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체의 한예는 생리식염수이다. 다른 생리학적으로 허용가능한 담체 및 그 제제는 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences, (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA에 기술되어 있다.
진단 및 치료 용도
HSA 링커 콘쥬게이트는 예컨대, 증식성 질환 (예컨대, 멜라노마, 클리어세포 사르코마 및 신장암과 같은 암) 및 자가면역질환 (예컨대, 다발경화증, 류마티스 관절염 및 포도막염)의 진단 또는 치료를 포함하는, 인간의 진단 및 치료 용도를 위해 사용될 수 있다. 인간 증식성 및 자가면역 질환의 이하 토론은 당업자에게 어떻게 HSA 링커 콘쥬게이트를 진단 및 치료 용도에 적용할 수 있을지에 대한 일반적인 이해를 제공하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
증식성 질환 (암)
HSA 링커 콘쥬게이트는, 유방암, 멜라노마, 클리어세포 사르코마, 신장암(예컨대 신장세포 카시노마), 전립선암, 폐암, 위암 및 난소암과 같은 증식성 질환을 진단, 치료, 예방 또는 제거하기 위해 사용될수 있다. 증식성 질환을 갖거나 걸린 것으로 의심되는 환자의 진단 또는 치료용의 HSA 링커와 함께 조인된 결합 부분들은 증식성 질환과 연관된 표적 분자들 (예컨대, 타이로신 키나제 리셉터와 같은 세포표면 리셉터들)에 특이적 결합, 작용화, 활성화, 길항화 또는 저해하는 그들의 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 예컨대 인슐린-유사 성장인자 리셉터 (IGFR, 예컨대, IGF1R 및 IGF2R), 섬유아세포 성장인자 리셉터 (FGFR), 혈소판-유래 성장인자 리셉터 (PDGFR), 혈관내피 성장인자 리셉터 (VEGFR), 종양괴사인자 리셉터 (TNFR), 표피 성장인자 리셉터 (EGFR, 예컨대, ErbB2 (HER2/neu)), Fc 리셉터, c-키느 리셉터, 또는 중배엽 상피 전이인자 리셉터 (c-met; 또한 간세포 성장인자 리셉터 (HGFR)로도 알려진)를 표적으로 하는 결합 부분들은 증식성 질환의 진단 또는 치료를 위해 HSA 링커에 함께 조인될 수 있다. HSA 링커 콘쥬게이트에 의한 암세포에의 특이적 결합은 결합된 암세포의 검출(예컨대, 본 명세서에 정의된 검출가능한 라벨에 함께 조인된 HSA 링커) 또는 파괴 (예컨대, 세포독성제에 함께 조인된 HSA 링커)를 허용한다. 유방암 및 신장암의 치료를 위한 HSA 링커 콘쥬게이트의 적용예를 후술한다.
유방암(Breast Cancer)
유방암의 일반 형태는 침투성 관상 카시노마, 유방 관(duct)의 악성 암, 및 침투성 소엽 카시노마, 유방 소엽(lobule)의 악성 암을 포함한다. 몇몇 유형의 유방암 세포가 높은 레벨의 표피 성장인자 리셉터, 특히 ErbB2 (i.e., HER2/neu)를 발현한다고 알려졌다. EGFRs의 이상 신호전달 또는 비조절된 활성화는 유방암을 포함한 많은 암들의 개발 및 진행에 연관되어 있다. 기능장애 EGFR 패스웨이를 통해 매개된 비조절된 세포 증식은 상피 유래의 다양한 고형 종양에서 발견될 수 있으며, 데이터가 종양 EGFR 발현, 과발현 및 조절장애를 화학요법에 내성인 발달된 질환, 전이성 표현형, 및 전체적으로 더 나쁜 예후와 연결시켜 준다.
EGFR (예컨대, anti-ErbB2; 트라스투주맵)에 특이적인 하나 이상의 결합 부분에 함께 조인된 HSA 링커는 유방암을 진단 또는 치료하기 위해 본 명세서에 기술된 진단제 (예컨대, 검출가능한 라벨) 또는 세포독성제, 세포억제제, 또는 치료제와 함께 사용될 수 있다. 이와 선택적으로, ErbB2 및 ErbB3, 예컨대 "B2B3-1"에 특이적인 결합 부분들을 포함하는 이중특이적(bispecific) HSA 링커 콘쥬게이트는 예컨대, 유방암, 신장암, 난소암 및 폐암과 같은 암들의 진단 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
상술한 바와 같이, 유방암 치료에 사용되는 HSA 링커 콘쥬게이트는 방사성용법 또는 외과수술의 전에(예컨대, 신보강 화학요법), 동시에, 또는 후에(예컨대, 보조 화학요법)에 투여될 수 있다. HSA 링커 콘쥬게이트는 또한 유방암 치료에 유용한 다른 화합물 (예컨대, 생물학적 또는 화학적 치료제와 같은 항종양제들) 과 함께 병용 투여될 수 있다. 예컨대, 유사분열 저해제 (예컨대, 탁산), 토포이소머라제 저해제, 알킬레이팅제 (예컨대, 플라티눔-기초 약제 포함), 선택적 에스트로겐 조절제(SERM), 아로마타제 저해제, 대사억제제, 항종양 항체 (예컨대, 안트라사이클린 항생제), 항-VEGF 약제, 항-ErbB2 (HER2/neu) 약제, 및 항-ErbB3 약제를 포함하는 표 1에 나열된 항종양들이 유방암 치료에 특히 유용하다고 알려졌다. HSA 링커 콘쥬게이트는 유방암 치료에 유익하다고 알려진 참조 2(Appendix 2)에 나열된 것을 포함하는 어떤 화합물과 조합으로 임상의에 의해 투여될 수 있다.
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신장암 (Renal Cancer)
신장세포 카시노마와 같은 신장암은 종래의 방사능요법 및 화학요법에 특히 내성이다. 따라서, HSA 링커와 함께 조인된 생물학적 요법의 적용이 이들 암 환자들의 매력적인 선택이 되고 있다. 예컨대, type I 인터페론 또는 인터루킨 2 리셉터를 작용화(agonize)하는 결합 부분과 함께 조인된 HSA 링커가 신장암 치료에 사용될 수 있다. 고형 종양으로서, 종양 혈관신생을 표적으로 저해하는 결합 부분들 (예컨대, 베바시주맵과 같은 항-혈관내피성장인자 (VEGF) 항체)이 치료 효과를 위해 또한 사용될 수 있다.
자가면역 질환 (Autoimmune Diseases)
HSA 링커 콘쥬게이트는 예컨대, 다발경화증 (MS), 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM), 류마티스 관절염 (RA), 포도막염(uveitis), 스조그렌 증상(Sjogren's syndrome), 그레이브 질환(Grave's disease), 건선, 및 중증근육무력증(myasthenia gravis)과 같은 인간에서의 자가면역 질환 및 질병을 진단, 치료, 예방 또는 안정화하기 위해 사용될 수 있다. 자가면역 질환 및 질병은 면역계의 자기-반응성 요소들 (예컨대, T 세포, B 세포, 및 자기-반응성 항체)에 의해 유발될 수 있다. 따라서, 자기-반응성 면역세포와 항체를 저해, 차단, 길항 또는 결핍하는 결합 부분들이 (예컨대, 항-림프구 또는 항-흉선세포 글로불린; 바실릭시맵(basiliximab), 다클리주맵(daclizumab), 또는 무로모냅-CD3 단클론성 항체들) 치료용으로 HSA 링커와 함께 조인될 수 있다. 염증성 신호전달 저해제 (ISI)와 같은 작용을 하는 결합 부분들이 자가면역 치료를 위해 HSA 링커와 함께 조인될 수 있다. 또한, 인테그린 기능을 저해하거나 길항(antagonize)하는 결합 부분들이 (예컨대, an integrin antagonist, as defined herein) 질환의 진행을 개선시키거나 정지시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 결합 부분은 가용성 TNF 리셉터, 예컨대 에타너셉트(etanercept) 또는 레너셉트(lenercept); 프로-염증성 사이토카인 또는 프로-염증성 세포 표면 신호전달 분자에 대한 항체, 예컨대, 아달리무맵(adalimumab), 세르톨리주맵(certolizumab), 인플릭사맵(inflixamab), 골리무맵(golimumab), 및 리툭산(rituxan); 우성-음성 프로-염증성 사이토카인 변이체, 예컨대 XENP345, XPROTM1595, 아나킨라(anakinra), 및 U.S. 특허출원공개번호 20030166559 및 20050265962에 기술된 변이체들; 프로-염증성 사이토카인 또는 프로-염증성 세포표면 신호전달 분자의 하류(downstream) 패스웨이의 저해제, 예컨대 DE 096, 5-아미노-2-카르보닐티오펜 유도체 (WO2004089929에 기술된), ARRY-797, BIRB 796 BS, (1-5-tert-부틸-2-p-톨릴-2H-피라졸-3-일)-3-[4-2(모르폴린-4-일-에폭시)-나프탈렌-1-일]-우레아, CHR-3620, CNI-1493, FR-167653 (Fujisawa Pharmaceutical, Osaka, Japan), ISIS 101757 (Isis Pharmaceuticals), ML3404, NPC31145, PD169316, PHZ1112, RJW67657, 4-(4-(4-플루오로페닐)-1-(3-페닐프로필)-5-(4-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일)-3-부틴-1-올, SCIO-469, SB202190, SB203580, (4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸술피닐페닐)-5-(4-피리딜)1H-이미다졸), SB239063, 트랜스-1-(4-히드록시사이클로헥실)-4-(4-플루오로페닐-메톡시피리디미딘-4-일)이미다졸, SB242235, SD-282, SKF-86002, TAK 715, VX702, 및 VX745; 또는 TNF-알파 전환 효소 (TACE)의 저해제, 예컨대 BB-1101, BB-3103, BMS-561392, 부티닐옥시페닐 β 술폰 피페리딘 히드록소메이트, CH4474, DPC333, DPH-067517, GM6001, GW3333, Ro 32-7315, TAPI-1, TAPI-2, and TMI 005); 또는 항-이디오타입(anti-idiotypic) 약제, 예컨대 단클론성 항체, LJP 394 (abetimus, RIQUENT　 La Jolla Pharmaceuticals)이다.
다른 구현예에서, 결합 부분은 본 명세서에 기술된 인터페론이다. HSA 링커와 함께 조인할 수 있는 결합 부분은 예컨대, 인터페론-베타 (REBIF (IFN-β 1a), AVONEX (IFN-β 1a), 및 BETASERON (IFN-β 1b), 인터페론-t (TAUFERONTM), 인터페론-알파 (예컨대, ROFERON-A　 (IFN-α-2a), INTRON-A　 (IFN-α-2b), REBETRON　 (IFN- α-2b), ALFERON-N　 (IFN-α-n3), PEG-INTRON　 (모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜과 공유결합 콘쥬게이트된 IFN-α-2b), INFERGEN　 (IFN-α-2b에 88% 상동성을 갖는 비-자연적 발생 유형 1 인터페론), or PEGASYS　 (페길화된 IFN-α-1a)), 및 ACTIMMUNE (IFN-g-1b)를 포함한다.
본 발명은 또한 자가면역 치료를 위해 프로-염증성 분자 또는 그들의 특이적 리셉터를 길항하는 결합 부분과 HSA 링커 콘쥬게이트를 제공한다. MS 및 RA의 진단 및 치료를 위한 HSA 링커 콘쥬게이트의 특정 적용예를 후술한다.
다발경화증 (Multiple Sclerosis)
다발경화증 (MS)은 중추신경계 (CNS)의 신경의 비가역적 퇴행에 의해 특징지워지는 신경학적 질환이다. 비록 그 원인은 불명확하지만, MS에서의 신경퇴행은 정상적으로는 신경의 외각층을 감싸 신경을 절연시키는 단백질인 수초(myelin)의 박피 및 탈수초(demyelination)의 직접적 결과이다. T 세포는 MS의 발달에 중요한 역할을 한다. 염증성 MS 병변은 인간 HLA-DR2과 같은 MHC class II-링크된 분자들에 의해 제시되는 자기 항원들에 응답하는 침윤성 CD4+ T 세포들을 가질 수 있다. 상기 침윤성 CD4 T 세포 (TH1 세포)는 대식세포와 같은 항원-제시 세포들 (APCs)이 추가적 프로-염증성 사이토카인들 (예컨대, IL-1β IL-6, IL-8 및 IL-12)을 생산하도록 활성화하는 프로-염증성 사이토카인 IL-2, IFN-γ 및 TNF-a을 생산한다. IL-12는 또한 IFN-γ 합성을 유도한다. 그 결과는 인간 질환을 이끄는 신경 껍질(sheaths)의 진행성 탈수초(demyelination)이다.
HSA 링커 콘쥬게이트는 MS의 진단에 도움을 주게 사용될 수 있다. 진단용 HSA 링커 콘쥬게이트는 하나 이상의 (예컨대, 이중특이적 HSA 링커 콘쥬게이트) 면역 세포 활성화 마커들 (예컨대, CD69, CD28, HLA-DR 및 CD45)를 특이적으로 표적하는 결합 부분들을 포함한다. 다른 인자들이나 세포들에 비해 하나 이상의 이들 프로-염증성 또는 면역세포 활성화 매개인자들의 불균형은 진단제(예컨대, 방사성동위원소 또는 플루오로크롬)와 함께 조인된 HSA 링커 콘쥬게이트를 이용하여 측정될 수 있다.
HSA 링커 콘쥬게이트는 MS가 진행되거나 걸릴 위험인 사람을 치료하거나, 상기 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, a4 인테그린 (예컨대, 나탈리주맵), CD52 (예컨대, 알렘투주맵), CD80, P-셀렉틴, 스핑고신-1-포스페이트 리셉터-1 (S1PR1), 히알루로네이트 리셉터, 류코사이트 기능 항원-1 (LFA-1), CD11 (예컨대, 에팔리주맵), CD18, CD20 (예컨대, 리툭시맵), CD85, ICOS 리간드, CCR2, CXCR3, 또는 CCR5을 특이적으로 표적화하고 길항하는 결합 부분들은 MS에 걸린 환자의 치료용 HSA 링커에 함께 조인되었을때 유용할 수 있다. 유사하게, 타입 I 인터페론 (예컨대, 인터페론 -알파 및 -베타)를 중화하고, 타입 I 인터페론 리셉터 (예컨대, IFNaR1)를 길항하는 결합 부분들이 또한 치료 용도를 위해 HSA 링커와 함께 조인할 수 있다.
류마티스 관절염 (Rheumatoid arthritis)
류마티스 관절염 (RA)은 면역계가 관절을 공격하도록 유도하는 만성, 염증성 자가면역 질환이다. 상기 질환은 무력성(disabling)이고 통증성인 염증성 질병으로서, 통증 및 관절 파괴로 인해 이동성의 실질적인 손실을 가져올 수 있다. RA는 전신성 질환으로서 종종 피부, 혈관, 심장, 폐 및 근육을 포함하는 전신에 걸쳐 관절외 조직에 영향을 준다.
RA에 걸린 환자는 자주 HLA-DR4/DR1 클러스터의 세포내 발현 증가를 가진다. 하나 또는 둘의 이들 세포 표면 분자에 특이적인 HSA 링커 콘쥬게이트가 RA의 진단에 유용하다.
HSA 링커 콘쥬게이트는 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하기 위하여 RA가 발달하거나 걸릴 위험이 있는 사람을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, TNF-a (예컨대, 에타너셉트, 인플릭시맵, 및 아달리무맵), IL-1 (예컨대, 아나킨라), 또는 CTLA-4 (예컨대, 아바타셉트)를 특이적으로 표적화하고 길항하는 결합 부분들이 사용될 수있다. B 세포를 특이적으로 표적화하고 결핍화하는 결합 부분들 (예컨대, 리툭시맵과 같은 항-CD20 항체)이 또한 RA를 치료 또는 예방하기 위해 본 발명의 HSA 링커와 함께 조인될 수 있다.
포도막염 (Uveitis)
포도막염은 안구(eye)의 중간층의 염증을 특별히 일컸으나, 안구 내부와 관련된 어떤 염증성 진행도 포함될 수 있다. 포도막염은 원천이 자가면역 또는 특발성(idiopathic)일 수 있다.
HSA 링커 콘쥬게이트는 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하기 위해 자가면역 포도막염이 진행되거나 걸릴 위험이 있는 사람을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 알파-페토프로테인 (예컨대, 인간 AFP; NCBI 기탁번호 NM_001134), 또는 그것의 생물학적-활성 단편이 자가면역 또는 특발성 포도막염과 연관된 염증을 감소시키거나 제거하기 위해 HSA 링커와 함께 조인될 수 있다.
키트 (Kits)
본 발명은 질환 또는 질병 (예컨대, 암, 자가면역질환, 심혈관질환)를 치료하기 위한 치료학적 유효량으로 HSA 링커, 및 하나 이상의 결합 부분 (예컨대, 항체 또는 항체 단편), 진단제 (예컨대, 방사핵종 또는 킬레이팅제), 및 치료제 (예컨대, 세포독성 또는 면역조절제), 그리고 필요하면 이들을 HSA 링커에 콘쥬게이트하는데 사용될 수 있는 시약, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물을 포함하는 키트를 더 제공한다. 상기 키트는 그안에 들어있는 상기 조성물을 투여하도록 실시자(예컨대, 의사, 간호사 또는 환자)에게 허용하는 지시서를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 키트는 유효량의 HSA 링커, 또는 그것의 어떤 결합 (예컨대, 항체 또는 항체 단편 (예컨대, scFv)), 진단 (예컨대, 방사핵종 또는 킬레이팅제), 및/또는 치료 (예컨대, 세포독성 또는 면역조절제) 콘쥬게이트를 함유하는 단일-도스 약학적 조성물의 다중 패키지를 포함할 수 있다. 임의적으로, 상기 약학적 조성물을 투여하는데 필요한 기구 또는 장치가 키트에 포함될 수 있다. 예컨대, 키트는 유효량의 HSA 링커, 또는 그것에 콘쥬게이트된 어떤 결합, 진단, 및/또는 치료제를 함유하는 하나 이상의 미리-충전된 주사기들을 제공할 수 있다. 또한, 상기 키트는 질환 또는 질병 (예컨대, 암, 자가면역질환, 심혈관질환)에 걸린 환자가 HSA 링커, 또는 그것에 콘쥬게이트된 어떤 결합, 진단, 및/또는 치료제를 함유하는 약학적 조성물을 사용하기 위한 지시서 또는 투여 스케줄과 같은 추가적 성분들을 포함할 수 있다.
본 발명의 정신 또는 범위에 벗어나지 않고 본 발명의 조성물, 방법 및 키트에 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당업계의 기술자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨가된 청구범위와 그 균등물의 범위에 속하는 한, 본 발명의 수정 및 변형들을 포함한다고 의도된다.
본 발명은 인간 혈청 알부민(HSA) 링커 및 이와 콘쥬게이션된 결합, 진단 및 치료제에 관한 것이다. 또한 HSA 링커 콘쥬게이트의 진단 및 치료 적용을 위한 방법 및 키트를 설명한다.
도 1은 대표적인 HSA 링커 컨쥬게이트의 도식으로 표현하여 나타낸 것이다. 아미노 말단 결합 부분 및 HSA 링커 사이의 커넥터는 알라닌(alanine), 알라닌(alanine) 및 세린(serine)의 서열을 갖는다. HSA 링커와 카르복시 말단 결합 부분 사이의 커넥터는 알라닌(alanine), 알라닌(alanine), 알라닌(alanine), 로이신(leucine)의 서열을 갖는다 (서열번호 5).
도 2는 B2B3 변이체들이 ZR75-1 유방암 세포에서 HRG-유도된 pErbB3을 억제함을 나타낸 그래프이다.
도 3A-D는 B2B3 HSA 링커 콘쥬게이트 B1D2-2 (A5-HSA-B1D2, 도 3A), B1D2-1 (H3-HSA-B1D2, 도 3B), B2B3-10 (H3-HSA-F5B6H2, 도 3C), 및 B2B3-8 (F4-HSA-F5B6H2, 도 3D)를 24 시간 사전-처리한 후 BT474 유방암 세포에서 인산화된 ErbB3의 억제를 나타낸 그래프이다. 상기 HSA 링커 콘쥬게이트에 관한 더 자세한 내용은 하기, 예컨대 표 6에 명시하였다.
도 4A-D는 B2B3 HSA 링커 콘쥬게이트 B1D2-2 (A5-HSA-B1D2, 도 4A), B1D2-1 (H3-HSA-B1D2, 도 4B), B2B3-10 (H3-HSA-F5B6H2, 도 4C), 및 B2B3-8 (F4-HSA-F5B6H2, 도 4D)를 24 시간 사전-처리한 후 BT474 유방암 세포에서 인산화된 AKT의 억제를 나타내는 그래프이다. 상기 HSA 링커 콘쥬게이트에 관한 더 자세한 내용은 하기, 예컨대 표 6에 명시하였다.
도 5A-D는 B2B3 HSA 링커 콘쥬게이트 B1D2-2 (A5-HSA-B1D2, 도 5A), B1D2-1 (H3-HSA-B1D2, 도 5B), B2B3-10 (H3-HSA-F5B6H2, 도 5C), 및 B2B3-8 (F4-HSA-F5B6H2, 도 5D)를 24 시간 사전-처리한 후 BT474 유방암 세포에서 인산화된 ERK의 억제를 나타내는 그래프이다. 상기 HSA 링커 콘쥬게이트에 관한 더 자세한 내용은 하기, 예컨대 표 6에 명시하였다.
도 6은 BT474 유방암 세포에 B2B3-1 변이체들의 처리가 Gl 정지 및 S기에서 세포 수의 감소를 유발함을 보여주는 그래프이다.
도 7은 1 μM B2B3-1과 사전-배양하여 HRG의 결합을 실질적으로 차단시킨 BT-474-M3 세포를 유세포 분석기로 측정한 히스토그램을 나타낸 것이다.
도 8A-D는 B2B3-1이 B-T474-M3 및 ZR75-30 세포주에서 ErbB3 및 AKT 인산화를 억제함을 나타내는 그래프이다. 유방암 세포주 BT-474-M3 (도 8A 및 8C) 및 ZR75-30 (도 8B 및 8D)은 투여량 적정(dose titration)으로 B2B3-1을 24 시간 동안 사전-처리한 후, 5 nM의 HRG lβ EGF 도메인으로 10 분 동안 자극시켰다. 그 다음 ErbB3 및 AKT 인산화 상태(status)는 ELISA 분석을 이용하여 검사하였다.
도 9는 BT474 유방암 세포에서 신호전달 단백질에 대한 B2B3-1의 농도 증가에 따른 처리 효과를 나타내는 웨스턴 블롯 사진이다. “p-”는 신호전달 단백질의 티로신(tyrosine)-인산화된(posphorylated) 형태를 나타낸 것이다. 베타 튜뷸린(tubulin) (본 맥락에서는 신호전달 단백질이 아님)은 로딩 컨트롤로 제공한다. 베타 튜뷸린(tubulin) (본 맥락에서는 신호전달 단백질이 아님)은 로딩 컨트롤로 제공한다.
도 10은 B2B3-1 처리한 BT474 유방암 세포의 면역침강법(immunoprecipitation) 웨스턴 블롯의 사진을 나타낸 것이다. 베타 튜뷸린은 면역침강 반응 내로 투입하는 세포 단백질의 수준(level)을 위한 컨트롤로 제공한다.
도 11A-C는 BT-474 세포주에 B2B3-1 처리가 G1 정지 및 S기에서 세포 집단의 감소를 유발함을 나타내는 그래프이며 (도 11A), 처리하지 않은 세포와 비교하여 BT-474 및 SKBr3 세포에서 콜로니 형성을 억제함을 나타내는 그래프이다 (도 11B). 게다가, B2B3-1은 세포 임피던스 분석에서 BT-474-M3 세포의 증식을 억제한다 (도 11C).
도 12는 ZR75-1 세포에서 B2B3-1이 ErbB3의 인산화를 자극하지 않음을 보여주는 그래프이다.
도 13A-B는 B2B3-1이 ErbB3 (도 13A) 및 ErbB2 (도 13B)에 특이적으로 결합함을 보여주는 그래프이다.
도 14는 MALME-3 세포에 대한 B2B3-1의 총결합력(avidity) 결합이 ErbB2-오직 결합하는 변이체, SKO-3 및 ErbB3-오직 결합하는 변이체, SKO-2와 비교하여 겉보기 결합 친화도의 상당한 증가를 야기함을 보여주는 그래프이다.
도 15A-C는 마우스, 사이노몰거스 원숭이, 및 인간 혈청에서 B2B3-1의 안정성을 나타내는 그래프이다. 100 nM B2B3-1을 마우스 (도 15A), 사이노몰거스 원숭이 (도 15B), 또는 인간 (도 15C) 혈청에서 120 시간 동안 37 ℃로 배양하였다. 샘플은 0, 24, 48, 72, 96 및 120 시간에 제거하였으며, ErbB2 및 ErbB3에 결합하는 B2B3-1의 능력은 ELISA로 측정하였다 (RLU = 상대적인 빛의 단위).
도 16은 BT-474-M3 유방암 이종이식 모델에서 B2B3-1 투여량 반응을 나타내는 그래프이다. 종양 반응에 대한 B2B3-1 투여량의 관계는 투여량으로 배양한 BT-474-M3 유방 종양주에서 평가하였다. HSA는 52.5 mg/kg로 처리하였으며, 이는 90 mg/kg B2B3-1 투여량과 동일한 투여량이다.
도 17A-E는 B2B3-1이 ErbB2 의존적 방식으로 다양한 이종이식 모델에 효과적임을 보여주는 그래프이다. Calu-3 (인간 폐 선암; 도 17A), SKOV-3 (인간 난소 선암; 도 17B), NCI-N87 (인간 위장 암종; 도 17C), ACHN (인간 신장 선암; 도 17D), 및 MDA-MB-361 (인간 유방 선암; 도 17E) 이종이식 모델을 나타낸 것이다. 마우스들은 매 3일마다 30 mg/kg의 B2B3-1로 또는 B2B3-1과 동일한 투여량의 대조구 HSA로 처리하였다.
도 18A-D는 ADRr 유방암 이종이식 모델에서 ErbB2의 과-발현이 B2B3-1에 대한 반응자(responder)를 비-반응자(non-responder)로 변환시킴을 보여주는 그래프이다. ErbB2는 레트로바이러스 발현 시스템(retroviral expression system)을 이용하여 야생형 ADRr 이종이식 (도 18A) 및 ADRr-E2 이종이식에서 과-발현시켰다.
도 19A-B는 B2B3-1 활성이 시험관내(in vitro) (도 19A) 및 생체내(in vivo)에서 ErbB2 발현 수준에 긍정적으로 관여함을 보여주는 그래프이다.
도 20A-B는 B2B3-1 처리가 종양 세포 주기를 변형시킴을 보여주는 그래프이다. 도 20A는 BT474-M3 유방 종양 세포에 6 시간 동안 B2B3-1을 처리시 세포 주기 억제자인 p27kip1을 핵으로 전이시킴을 보여주는 형광 현미경 사진을 포함한다. Hoechst 염색은 핵 확인에 사용되었다. 도 20B는 B2B3-1을 72 시간 처리한 BT-474-M3 세포의 웨스턴 블롯이며, 이는 세포 주기 조절자인 사이클린 D1(Cyclin Dl)의 수준을 감소시킨다. 세포골격 단백질 빈큐린(vinculin)은 본 실험에서 단백질을 로딩하는 기준(control)으로 탐침되었다.
도 21A-B는 BT474 유방 종양 이종이식에 B2B3-1의 처리가 p27kip1을 핵으로 전이시킴을 보여주는 현미경 사진이다. BT474 유방 종양 이종이식을 1회 30 mg/kg의 B2B3-1 (도 21A)로 또는 동일 투여량의 HSA (도 21B)로 매 3일마다 총 4회 처리하고, p27kip1을 염색하였다.
도 22A-B는 BT474-M3 유방 종양 이종이식에서 B2B3-1 처리가 증식 마커 Ki67의 감소를 야기함을 보여주는 형광 현미경 사진이다. BT474-M3 유방 종양 이종이식은 1회 30 mg/kg의 B2B3-1 (도 22A)로 또는 동일 투여량의 HSA (도 22B)로 매 3일마다 총 4회 처리하였다.
도 23A-B는 BT474-M3 유방암 이종이식 종양에서 B2B3-1 처리가 혈관 밀도의 감소를 야기함을 보여주는 형광 현미경 사진이다 (CD31 염색으로 감소를 결정함). BT474-M3 유방 종양 이종이식은 1회 30 mg/kg의 B2B3-1 (도 23A)로 또는 동일 투여량의 HSA (도 23B)로 매 3일마다 총 4회 처리하였다.
도 24A-B는 B2B3-1이 생체내 ErbB3의 인산화를 억제함을 보여주는 그래프이다. B2B3-1 (M1-M5) 또는 대조구 HSA (H1-H2)로 처리한 개개의 BT-474-M3 이종이식 종양으로부터의 용해물을 SDS-PAGE로 검사하고, 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 pErbB3 및 베타 투불린으로 탐침하였다 (도 24A). 평균 베타 투불린 신호에 대한 평균 pErbB3 신호의 표준화는 B2B3-1을 처리한 종양이 HSA 종양 보다 상대적으로 더 적은 pErbB3을 함유함을 증명하였다.
도 25A 및 B는 BT-474-M3 shPTEN 및 shControl 이종이식에서 B2B3-1의 생체내 활성을 보여주는 그래프이다. 배양시킨 BT-474-M3 종양 세포는 컨트롤 벡터 (도 25A)와 또는 shPTEN 발현하는 레트로바이러스 벡터 (도 25B)와 형질전환시켜 PTEN 활성을 억제시켰다. 따라서, PTEN 활성이 억제되도록 제작한 BT-474-M3 유방암 세포는 마우스들의 오른쪽 치면 내에 주사하였으며, 반면 대조구 벡터로 형질전환시킨 세포는 동일한 마우스들의 왼쪽 치면 내에 주사하였다. 마우스들을 30mg/kg B2B3-1로 매 3일마다 또는 10mg/kg 헤셉틴(Herceptin)으로 매주 처리하였으며, HSA는 대조구로써 B2B3-1과 동일한 투여량으로 주사하였다. B2B3-1 및 허셉틴은 대조구 BT-474-M3 유방암 세포에 형성된 종양 크기의 감소를 촉진시키며 (도 25A), 반면 오직 B2B3-1 (허셉틴 처리하지 않음)은 PTEN의 발현을 억제시킨 BT-474-M3 유방암 세포에 형성된 종양 크기의 감소를 촉진시킨다 (도 25B).
도 26A-B는 PTEN 활성을 감소시킨 BT-474-M3 이종이식에서 B2B3-1이 AKT의 인산화를 감소시킴을 보여준다. 처리 (q3dxl1)를 완료한 후 종양을 용해시키고, 웨스턴 블롯 분석으로 PTEN, pErbB3, 및 pAKT 발현 수준을 검사하였다 (도 26A). 총 AKT 및 총 단백질에 대해 표준화된 pAKT의 밴드 강도에 대한 밀도계측은 B2B3-1이 헤셉틴이 없을 경우 상기 단백질의 인산화를 억제할 수 있음을 증명한다 (도 26B).
도 27A-D는 nu/nu 마우스들에 5 (도 27A), 15 (도 27B), 30 (도 27C), 및 45 (도 27D) mg/kg으로 일시 투약(bolus dose)한 B2B3-1에 대한 단회 투약(single dose) 약동학적 특성들을 나타내는 그래프이다. B2B3-1 혈청 농도는 HSA 분석 또는 ErbB2/ErbB3 분석으로 비교가능하게 측정되었으며, 이는 B2B3-1의 항원 반응 활성이 순환(circulation)에서 유지됨을 의미한다.
도 28은 누드 마우스들에 5, 15, 30, and 45 mg/kg으로 일시 투약(bolus dose)한 B2B3-1에 대한 투약-노출(dose-exposure) 관계를 나타내는 그래프이다. 투여량이 증가할수록 B2B3-1에 대한 전반적인 노출은 선형으로 증가한다.
도 29는 매 3일마다 총 4회 4 mg/kg (n=2), 20 mg/kg (n=2) 및 200 mg/kg (336 시간까지 n=4, 384, 552 및 672 시간 시점에 대해 n=2)로 투약된 사이노몰거스 원숭이에서 측정된 B2B3-1 혈청 농도를 나타내는 그래프이다.
도 30은 B2B3-1 발현 플라스미드 pMPl0k4H3-mHSA-B1D2를 나타낸 것이다.
도 31은 네오마이신 저항 플라스미드 pSV2-neo를 나타낸 것이다.
도 32는 하이그로마이신 저항 플라스미드 pTK-IIyg를 나타낸 것이다.
도 33은 q7d 투여된 B2B3-1이 q3d 투여하는 경우와 동일한 효능을 보임을 증명하는 데이터를 보여준다.
도 34는 B2B3-1 및 트라스투주맙이 ErbB3 억제의 서로 다른 메커니즘을 나타냄을 증명하는 데이터를 보여준다.
도 35 A-C는 실시예 43에 개시된 실험의 결과를 나타낸 것이며, 이는 트라스투주맙 및 B2B3-1 조합 처리를 인간 유방 종양에 대한 모델로써 역할하는, 다양한 인간 유방암 세포주의 타원체(spheroids)에서 연구하였다. 도 35A는 BT-474-M3 세포를 이용하여 얻은 데이터이며, 도 35B는 SKBR3 세포를 이용하여 얻은 데이터이며, 도 35C는 MDA-MB-361 세포를 이용하여 얻은 데이터이다. B2B3-1의 단독 또는 조합에서의 몰 농도는 X-축에 나타내었다. 트라스투주맙의 단독 또는 조합에서의 몰 농도는 각각 B2B3-1의 농도를 나타낸 것의 3분의 1이다.
도 36은 실시예 44에 설명된 생체내(in vivo) 종양 이종이식 실험의 결과를 보여준다. X-축에서 “Days”는 종양 이식 후의 날짜를 나타낸다. 각각의 데이터 포인트에 대한 에러바(error bar)는 적어도 두 개의 독립적 이종이식에 대한 반응을 나타낸다.
도 37은 실시예 44에 개시된 것과 같이 본질적인 이종이식 모델로부터 얻은 데이터를 보여주며, N-87 위 종양 세포가 이용된 종양 세포는 제외하였으며, 이는 US 국립 암 연구소로부터 얻을 수 있다.
도 38은 도 36에 제시된 데이터의 서브셋(subset)을 보여준다.
하기 실시예들은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다. 본 출원에서 기술은 다양한 비-중요성 파라미터들을 기꺼이 인지할 것이며, 동일하거나 유사한 결과를 필수적으로 산출하기 위해 변경 또는 변형 될 수 있다.
실시예 1: 세포독성(cytotoxic) 또는 세포억제성(cytostatic) 약물들의 부위(site)-특이적 컨쥬게이션을 위한 HSA 링커에 잔기들을 확인하는 방법.
HSA에 대한 약물의 사이트(site) 컨쥬게이션을 위한 부위들을 확인하기 위해 크리스탈 구조를 연구하였으며, 표면에 노출된 세린(serine) 및 트레오닌(threonine) 잔기들을 확인하였다. 상기 특정(particular) 표면-노출된 아미노산들은 이후 약물 컨쥬게이션을 허용하여 시스테인(cysteine)으로 변이될 수 있으며, 상기 시스테인은 말레이미드(maleimide)와 같은 티올(thiol)-특이적 컨쥬게이팅 약제를 이용하여 치환된 시스테인에의 약물 컨쥬게이션을 허용한다. 약한 환원(mild reduction)이 약물 컨쥬게이션 전에 요구될 수 있다. 컨쥬게이트된 약물의 수는 HSA 내에 도입된 표면 노출된 시스테인 잔기들의 수에 의해 조절된다. 세린 또는 트레오닌은 시스테인과 가장 구조상의 동일성을 가지기 때문에 돌연변이에 대한 가장 적합한 잔기로써 선택되었다. 하지만, 표면에 노출된 다른 잔기들 또한 시스테인으로 변이될 수 있으며, 세포억제성 또는 세포독성 약물들과 성공적으로 컨쥬게이트될 수 있다.
HSA의 크리스탈 구조는 RSCB Protein Data Bank (lbmO - Sugio et al., "Crystal structure of human serum albumin at 2.5 A resolution," Protein Eng. 12:439-446 (1999))에 기탁되었다. 상기 HSA의 구조는 스위스 생물정보학 연구소(Swiss Institute of Bioinformatics)로부터 다운로드된 DeepView Swiss PDB Viewer를 이용하여 분석하였다. 세린 및 트레오닌 잔기의 50%, 40%, 및 30% 표면 노출이 시스테인으로 돌연변이하기 위해 가장 적합한 것으로 확인되었다 (표 2). 돌연변이는 표준 분자 생물학 절차들을 이용하여 도입(introduce)될 수 있다. 티올에 반응하는 약물 또는 시스테인에 도입(introduce)되는 킬레이팅(chelating) 약제의 컨쥬게이션은 표준 단백질 화학 기술을 이용하여 테스트할 수 있다.
Figure pct00002
실시예 2: 아스파라긴(asparagine)-링크된 글리코실화(glycosylation) 부위의 도입(introduction)을 위한 HSA 링커에서 잔기들을 확인하는 방법.
HSA에 아스파라긴-링크된 글리코실화(glycosylation) 부위의 도입을 위한 영역(region)을 확인하기 위해, 크리스탈 구조를 연구하였으며, 표면에 노출된 아스파라긴, 세린 및 트레오닌 잔기들(>30%)을 확인하였으며 상기 잔기들은 돌연변이에 적합한 것이다. 글리코실화는 아스파라긴-X-세린/트레오닌 공통서열(consensus sequence)이 존재할 때 아스파라긴 잔기들에서 발생하며, 여기서 X는 프롤린(proline)일 수 없다. 표 2는 아스파라긴-링크된 글리코실화의 도입을 위해 HSA에서 돌연변이 가능한 사이트들을 열거한 것이다.
Figure pct00003
* 상기 돌연변이들은 또한 HSA에서 매우 드물게 발생한다고 보고되었다(Carlson et al, "Alloalbuminemia in Sweden: Structural study and phenotypic distribution of nine albumin variants," Proc.Nat.Acad.Sci. USA 89:8225- 8229 (1992); Madison el al, "Genetic variants of human serum albumin in Italy: point mutants and a carboxyl-terminal variant," Proc.Nat.Acad.Sci. USA 91 :6476-6480 (1994); Hutchinson et al, "The N-terminal sequence of albumin Redhill, a variant of human serum albumin," FEBS Lett. 193:211-212 (1985); Brennan et al, "Albumin Redhill (-1 Arg, 320 Ala-Thr): a glycoprotein variant of human serum albumin whose precursor has an aberrant signal peptidase cleavage site," Proc.Nat.Acad.Sci. USA 87:26- 30 (1990); Minchiotti el al, "Structural characterization of four genetic variants of human serum albumin associated with alloalbuminemia in Italy," Eur.J.Biochem. 247:476-482 (1997); Peach et al, "Structural characterization of a glycoprotein variant of human serum albumin: albumin Casebrook (494 Asp-Asn)," Biochim.Biophys.Acta 1097:49-54 (1991)).
실시예 3
B2B3-1은 인간 항(anti)-ErbB2 scFv 항체(서열번호 27)인 B1D2 및 인간 항-ErbB3 scFv(서열번호 26)인 H3을 포함하는 이중특이적(bispecific) scFv 항체 융합 분자이다. 상기 두 개의 scFv는 변형된 인간 혈청 알부민 (HSA) 링커에 결합(join)된다. 항-ErbB3 scFv인 H3은 짧은 커넥터(connector) 폴리펩티드를 통합하는(incorporating) HSA 링커의 아미노 말단에 재조합적으로 융합되며, 항-ErbB2 scFv인 B1D2는 추가적인 짧은 커넥터 폴리펩티드를 통합하는 변형된 HSA 링커의 카르복시 말단에 재조합적으로 융합된다. 각각의 커넥터 폴리펩티드는 프로테아제(protease) 저항 특성을 기반으로 선택된다. 상기 변형된 HSA 링커는 두 개의 아미노산 치환을 포함한다. 천연(native) HSA의 위치 34에서 시스테인 잔기는 상기 부위에서 산화에 의한 단백질 이질성(heterogeneity)의 가능성(potential)을 감소시키기 위해 세린으로 변이된다. 천연 HSA의 아미노산 503에서 아스파라긴 잔기는 글루타민으로 변이되며, 천연 HSA는 약리학적 반감기를 감소시킬 수 있는 디아미데이션(deamidation)에 민감할 것이다. B2B3-1은 항-ErbB2 svFv 결합 부분에 대한 높은 친화력(affinity)의 효력(virtue)으로 종양(tumor)에서 과-발현하는 ErbB2에 선택적으로 결합하며, 상기 친화력은 10.0 nM 내지 0.01 nM 범위의 kD 및 더 구체적으로 약 0.3 nM의 kD을 갖는 것으로 여겨지고 있다. 50 내지 1 nM 범위의 kD 및 더 구체적으로 약 16 nM의 kD을 갖는 항-ErbB3 scFv에 의한 ErbB3의 결합 후, HRG로 유도되는 ErbB3의 인산화(phosphorylation)를 억제한다. 변형된 HSA 링커는 이중특이적 분자에 대해 확장된 순환 반감기(circulating half-life)를 준다. B2B3-1은 119.6 kDa의 분자량을 가지며, 바람직하게는 글리코실화 되지 않는다.
B2B3-1은 서브-나노몰(sub-nanomolar) 효능으로 리간드-유도된 ErbB3의 인산화를 억제한다; 이러한 활성은 적어도 부분적으로, 두 리셉터를 발현하는 암세포의 특이적 표적을 용이하게하는 그것의 이량체화 파트너(dimerization partner)인 ErbB2의 풍부한 발현 때문인 것으로 여겨지고 있다.
실시예 4
도 2에 나타낸 바와 같이, B2B3-1 변이체(variant)는 ZR75-1 유방암 세포에서 HRG-유도되는 pErbB3을 억제한다. ZR75-1 유방암 세포를 투여량(dose) 범위의 B2B3-1 변이체로 24 시간 동안 처리한 다음 HRG를 자극하였다. pErbB3 수준(level)은 ELISA로 세포 용해물(cell lysate)에서 측정하였으며, IC50 값은 억제 퍼센트와 함께 계산하였다. 반복 실험하여 나타난 평균 IC50 값 (Y axis)과 에러 바(error bar)를 나타내었다. 억제 퍼센트 값은 해당 바(bar) 위에 나타내었다.
ELISA Assays
달리 표시된 것을 제외하고, 전체 및 인산(phospho)-ErbB3 ELISA를 위한 ELISA 시약은 R&D System으로부터 구입한 DUOSET kits 였다. 96-웰 NUNC MAXISORB 플레이트에 50 μl의 항체를 코팅시키고, 상온에서 밤새도록 배양시켰다. 다음날 아침, 플레이트를 BIOTEK 플레이트 세척기에서 칼슘 또는 마그네슘을 제거한 Dulbecco's PBS(phosphate buffered saline)에 트윈(tween) 세제 (0.05% Tween-20)를 첨가한 PBST 1000 μl/well로 3번 세척하였다. 그 다음, 플레이트를 2% BSA가 첨가된 PBS로 상온에서 1 시간 동안 차단시켰다. 상기 플레이트를 BIOTEK 플레이트 세척기에서 1000 μl/well의 PBST로 3번 세척하였다. 세포를 37 ℃, 5% 이산화탄소에서 성장시키고, 차가운 PBS로 세척한 후, 150mM NaCl, 5mM 피로인산 나트륨(sodium pyrophosphate), 10μM bpV (phen), 50μM 페닐아르신(phenylarsine), 1mM 오르토바나드산염(sodium orthovanadate), 및 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail) (Sigma, P2714)을 첨가한 포유류 단백질 추출물(mammalian protein extract, MPER) 용해 버퍼 (Pierce, 78505)로 수집하였다. 50 μL의 세포 용해물 및 50% 용해 버퍼 및 1% BSA로 희석된 표준(standard)을 추가적 과정을 위해 반복하여 사용하였다. 시료를 4 ℃ 플레이트 쉐이커(plate shaker)에서 2 시간 동안 배양하고, 전과 동일하게 세척하였다. 약 50 μl의 검출 항체를 2% BSA로 희석하고, PBST를 첨가하고, 상온에서 약 1-2 시간 동안 배양하였다. 인산(phospho)-ErbB3에 대한 검출 항체는 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase)로 직접 콘쥬게이트시키고, 반면 전체 ErbB3에 대해서는 바이오틴 부착된 마우스 항-인간 ErbB3 이차 검출 항체를 이용하였다. 상기 플레이트를 전과 동일하게 세척하였다. 전체 ErbB3에 대한 약 50 μl의 스트렙타비딘-HRP를 첨가하고, 30 분 동안 배양하고, 전과 동일하게 세척하였다. 약 50 μl의 슈퍼시그날 ELISA 피코(SUPERSIGNAL ELISA Pico) (Thermo Scientific) 기질을 첨가하고, 플레이트를 융합(FUSION) 플레이트 리더를 이용하여 판독하였다. 중복 시료들을 평균내고, 에러 바(error bar)는 두 개의 반복결과 사이의 표준 편차를 나타낸 것이다.
실시예 5
B2B3-1 변이체 A5-HSA-B1D2 (도 3-5의 panel A), H3-HSA-B1D2 (도 3-5의 panel B), H3-HSA-F5B6H2 (도 3-5의 panel C), 및 F4- HSA-F5B6H2 (도 3-5의 panel D)의 24 시간 사전-처리 후 인산화된 ErbB3 (도 3A-D), AKT (도 4A-D), 및 ERK (도 5 A-D)의 억제를 측정하였다. BT474 유방암 세포를 투여량(dose) 범위의 B2B3-1 변이체로 24 시간 동안 처리한 다음 HRG를 자극하였다. pErbB3, pAKT, 및 pERK 수준은 ELISA로 세포 용해물에서 측정하였으며, IC50 값은 억제 퍼센트와 함께 계산하였다. 상기 결과들은 B1B2-1이 10-8 몰 농도 및 그 이상에서 HRG-유도하는 AKT, ERK, 및 ErbB3 인산화의 50% 이상 억제를 제공하는 유일한 HSA 링커 콘쥬게이트임을 증명한다.
실시예 6
도 6에 나타낸 바와 같이, B2B3-1 변이체들로 BT474 유방암 세포의 처리는 G1 세포 주기의 정지(arrest) 및 S기(phase)에서 세포 집단(polulation)의 감소를 일으킨다. BT474 세포를 1 μM의 B2B3-1 변이체로 처리하고, 72 시간 동안 관리하였다. 처리 완료 후, 세포를 트립신 처리하고, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide) 및 단일 세포가 함유된 저장성 용액(hypotonic solution)에 서서히 분산시켜 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였다. G1 및 S기에서 세포 주기 분포는 세포 주기 분석 (FlowJo software cell cycle platform)으로 디자인된 커브-피팅 알고리즘(curve-fitting algorithm)을 이용하여 측정하였다.
실시예 7
B2B3-1 (서열번호 16)은 종양 세포 표적을 위해 이량체화 파트너(dimerization partner)인 ErbB2의 풍부한 발현을 이용하여 ErbB3의 활성을 억제한다. 친화력이 높은 항-ErbB2 scFv 항체인 B1D2는 종양 세포에서 과-발현하는 ErbB2에 대한 B2B3-1의 표적화(targeting)를 촉진시킨다. B1D2는 변형된 HSA 링커에 의해 친화력이 낮은 항-ErbB3 scFv 항체인 H3에 연결되며, H3은 ErbB3의 리간드, HRG의 결합을 차단한다. B2B3-1에 의해 매개되는 ErbB3 인산화 및 하부 AKT 신호전달의 저해는 상기 차단(blockade) 때문인 것으로 여겨지고 있다. ErbB2에 결합하는 scFv, B1D2는 모(parent) scFv C6.5로부터 유래되며, ErbB2에 작용(agonistic)뿐만 아니라 길항(antagonistic) 활성도 억제한다. 따라서, B1D2는 오로지(solely) 표적화 약제로써의 기능이 가능하다. ErbB3에 결합하는 scFv의 낮은 친화력 결합은 정상, 즉 ErbB2는 조금 또는 전혀 발현하지 않고 ErbB3을 발현하는 비-암성(non-cancerous) 조직에 대한 B2B3-1의 결합을 강하게 방해(prevent)하는 것으로 여겨지고 있으며, 그것에 의해 비-특이적 독성에 대한 가능성(potential)이 감소된다. ErbB2 및 ErbB3을 모두 발현하는 종양 세포에서, ErbB3 리셉터 복합체와 HRG 상호작용을 강하게 억제하는 ErbB3 scFv의 낮은 친화력을 극복하는 것은 상기 두 리셉터들과 결합하는 이중특이적 B2B3-1의 총결합력(avidity) 효과이다.
HRG를 억제하는 B2B3-1의 ErbB3에 대한 결합 능력은 유세포 분석기 (FACS)를 이용하여 연구하였다. 인간 유방암 세포주 (ErbB2를 과-발현하는 BT-474 변이체) 세포들을 1 μM B2B3-1으로 처리한 후, 10 nM 바이오틴화된(biotinylated) HRG lβ EGF 도메인과 배양하였다. 광범위한 세척 후, 스트렙타비딘(streptavidin)-AlexaFluor 647 컨쥬게이트를 이용하여 결합을 평가하였다. 모든 배양은 4 ℃에서 수행하였다. 도 7은 ErbB3에 대한 HRG의 결합을 차단하는 B2B3-1의 능력을 나타낸 것이며, 1 μM의 농도에서 100% 차단을 제공함을 나타낸다.
실시예 8
ErbB3에 결합하는 HRG을 차단하는 B2B3-1의 능력을 증명한 후, ErbB3을 발현하고, ErbB2을 과-발현하는 두 세포주에 대한 시험관내(in vitro) ErbB3 신호전달에 대한 B2B3-1의 효과를 연구하였다. 유방암 세포주 BT-474-M3(described in, e.g., Drummond et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:3392; Park et al. (2002) Clin. Cancer Res. 8:1172; Kirpotin et al. (2006) Cancer Res. 66:6732) 및 ZR75-30(obtainable from the US NIH Lawrence Berkeley National Laboratory breast cancer cell collection)는 하룻밤동안 혈청을 결핍시키고, 24시간동안 투여량 적정(dose titration)의 B2B3-1로 사전-처리한 다음, 5 nM의 HRG lβ EGF 도메인으로 10 분 동안 자극시켰다. 이후 ErbB3 및 AKT의 인산화 상태(status)는 상술한 바와 같이 일반적인 ELISA 분석을 이용하여 검사하였다. 그 결과 두 세포주에서 투여량-의존적인 방식(dose-dependent manner)으로 포텐트 IC50으로 B2B3-1이 HRG에 의해 유도되는 ErbB3 및 AKT의 인산화 활성을 억제함을 보여준다 (도 8 A-D).
실시예 9
도 9는 BT474 유방암 세포에서 신호전달 단백질에 대한 B2B3-1 처리 효과를 나타낸 것이다. 세포들을 투여량(dose) 범위의 B2B3-1로 24 시간 동안 처리한 다음, 헤레굴린(heregulin)을 자극하였다. pErbB2, pErbB3, pErk 및 pAKT의 수준 및 그들에 상응하는 전체 단백질 수준은 웨스턴 블롯(Western blot) 분석으로 세포 용해물에서 결정하였다. 결과들은 B2B3-1 처리에 의해 투여량-의존적인 방식으로 적어도 pErbB2 및 pErbB3의 수준이 감소됨을 나타낸다.
실시예 10
도 10은 B2B3-1로 처리된 BT474 유방암 세포의 면역침강(immunoprecipitation)-웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 세포들을 투여량(dose) 범위의 B2B3-1로 24 시간 동안 처리한 다음, 헤레굴린(heregulin)을 자극하였다. ErbB2-연관된 복합체는 항-ErbB2 항체를 이용하여 세포 용해물로부터 분리하였으며, 그 다음 pErbB2 및 pErbB3 및 그들에 상응하는 전체 단백질 수준을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과 B2B3-1은 ErbB2와 ErbB3에 교차결합 함을 보여주며, 실질적으로 그 이상의 ErbB3 및 인산(phospho)-ErbB3는 항-ErbB2 항체에 의해 침전되었다.
실시예 11
B2B3-1의 항-종양 활성은 여러 분석을 이용하여 시험관 내에서 연구하였다. 첫 번째 분석에서는, 세포 주기의 Gl기에서 BT-474 또는 SKBR3 세포 축적 및 동시에 S기에서의 감소에 대한 B2B3-1의 효과를 검사하였다. 간략히, 세포들을 1 μM B2B3-1 또는 PBS 비히클(vehicle)로 72 시간 동안 처리하였다. 처리 완료 후, 세포를 트립신 처리하고, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide) 및 단일 세포가 함유된 저장성 용액(hypotonic solution)에 서서히 분산시켜 유세포 분석기(flow cytometry)로 측정하였다. G1 및 S기에서 세포 주기 분포는 세포 주기 분석 (FlowJo software cell cycle platform, Tree Star, Inc.)으로 디자인된 커브-피팅 알고리즘(curve-fitting algorithm)을 이용하여 측정하였다. B2B3-1이 S기에서는 세포의 비율을 유의하게(modestly) 감소시키고, Gl기에서는 세포 집단을 증가시킴을 발견하였다 (도 11A). 두 번째 실험에서는 B2B3-1으로 처리한 후 형성된 세포 콜리니의 수를 연구하였다. BT-474 및 SKBR3 유방암 세포를 1 μM B2B3-1 존재 하에 플레이트하고(plated), 배지만 존재 하에 플레이트한 세포와 비교하였다. 배지 단독 또는 B2B3-1 처리를 포함하는 배지를 3일 마다 보충하였다. 14일 후 콜리니의 수를 계산하고, 처리하지 않은 세포와 비교하였다. 도 11B는 대조구(control) 세포와 비교하여 세포를 B2B3-1으로 처리하였을 때 형성된 콜로니의 수가 40-45% 감소되었음을 나타낸다. 마지막으로, 세포 증식을 억제하는 B2B3-1의 능력을 RT-CES (Real-Time Cell Electronic Sensing System: ACEA Biosciences)을 이용하여 세포 임피던스(cell impedance) 분석을 평가하였다. BT-474 세포를 마이크로일렉트로닉 센서 어레이(microelectronic sensor array)가 통합된 플레이트에 접종하고, 투여량 적정(dose titration)의 B2B3-1 또는 배지 만을 72 시간 동안 처리하였다. 세포-전극 임피던스 반응(cell-electrode impedance response)의 발생을 반영하는(reflecting) 데이터는 72 시간 동안 매 시간마다 수집하였으며, IC50 값은 처리 68 시간 후에 측정하였다. 도 11C는 B2B3-1이 33 nM의 IC50을 갖는 BT-474 세포의 임피던스를 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 12
본 발명자들은 또한 B2B3-1이 아고니스틱(agonistic) 활성을 나타내는 지에 대해 교차-결합(cross-link) ErbB2 및 ErbB3 리셉터에 동시에 결합하는 B2B3-1의 능력을 기반으로 연구하였다. 혈청이 결핍된 ZR75-1 유방암 세포를 1 μM B2B3-1 또는 PBS 비히클(vehicle)로 24 시간 동안 배양하였다. 또한 세포를 B2B3-1 또는 PBS 비히클로 24 시간 동안 처리한 다음 5 nM HRG 1β EGF 도메인으로 10 분간 자극하였다. 세포를 용해시키고, 용해물의 pErbB3 양(content)을 상술한 바와 같이 일반적인 ELlSA로 평가하였다. 도 12는 B2B3-1만을 포함시켜 처리한 세포의 인산화된 ErbB3 수준이 처리하지 않은 세포의 수준과 비교할만한(comparable) 수준임을 보여주며, 이는 B2B3-1이 ErbB3 인산화를 촉진하는 아고니스트(agonist)로써 작용하지 않음을 나타낸다.
실시예 13
ErbB2 및 ErbB3에는 특이성(specificity)으로 결합하고, ErbB 패밀리 구성원(family member)과 관련된 EGFR 및 ErbB4에는 결합하지 않는 B2B3-1의 능력을 ELISA로 연구하였다. 플레이트를 ErbB2 또는 ErbB3의 재조합 세포외 도메인(recombinant extracellular domain)으로 코팅하였다. 상기 플레이트를 봉쇄시키고, EGFR, ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4의 경쟁적 재조합 세포외 도메인의 희석 시리즈의 존재 하에서 반-최대(half-maximal) 결합 농도의 B2B3-1로 배양하였다. 그 결과 오직 가용성 ErbB2 세포외 도메인만 ErbB2-코팅된 플레이트에 대한 B2B3-1 결합을 차단시킴을 보인다 (도 13A). 마찬가지로, 오직 가용성 ErbB3 세포외 도메인만 ErbB3-코팅된 플레이트에 대한 B2B3-1 결합을 차단시킨다 (도 13B). 상기의 결과들은 ErbB2에 대한 항-ErbB2 아암(arm) B1D2 및 ErbB3에 대한 항-ErbB3 아암(arm) H3의 특이성을 증명하는 것으로 여겨진다. 가용성 ErbB2 세포외 도메인을 ErbB3 코팅된 플레이트에 B2B3-1과 배양하였을 때 관찰되는 증가된 신호는 플레이트 상에 ErbB2, ErbB3, B2B3-1 복합체의 형성 때문인 것으로 추측된다.
실시예 14
ErbB2 및 ErbB3을 모두 발현하는 종양 세포에 결합하는 B2B3-1의 능력을 B3B3-1의 단일특이적(monospecific) 변이체들을 이용하여 연구하였다. SKO-2 (서열번호 67) 및 SKO-3 (서열번호 68)는 B2B3-1의 변이체이며, 각각 ErbB2 또는 ErbB3와 상호작용하는 능력이 부족하다.
SKO-2 및 SKO-3는 QUIKCHANGE 부위 특이적(site directed) 돌연변이 유발 키트 (STRATAGENE)를 이용하여 제작하였으며, 상기 키트는 주형(template) 벡터의 반대 가닥들(strands) 각각에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 이용한다. 이들을 비틀린(staggered) 닉(nick)을 포함하는 돌연변이 플라스미드를 생산하는 온도 사이클링(temperature cycling) 동안 연장시켰다. 온도 사이클링 후, 생성물을 Dpn Ⅰ으로 처리하고, 이를 모(parental) DNA 주형을 분해(digest)하는데 이용하였다. 이후 플라스미드 DNA를 증식시키기 위해 원하는 돌연변이를 포함하는 니크된(nicked) 벡터 DNA를 XL1-BLUE 슈퍼콤피턴트(supercompetent) 세포 (STRATEGENE) 내로 형질전환시켰다.
SKO-2를 제조하기 위해, 항-ErbB2 scFv, B1D2의 VH CDR3 루프(loop)에서 5 뉴클레오티드를 아미노산 치환(substitution); H95A, W100hA. 및 E100jA 하여 돌연변이시켰다. 상기 위치에서의 돌연변이는 ErbB2에 대한 B1D2 모(parent) scFv, C6.5의 결합을 녹-아웃(knock-out) 시킴이 증명되었다 (Schier et al, 1996 JMB). 상기 돌연변이는 순차진행적인 방식(stepwise manner)으로 B2B3-1 플라스미드 pMP9043 (서열번호 60)을 도입시킨다. 첫째, 돌연변이 c295g 및 a296c는 프라이머 5'- GTA CTT TTG TGC CCG GGC CGA TGT GGG CTA CTG C -3' (서열번호 61) 및 5'- GCA GTA GCC CAC ATC GGC CCG GGC ACA AAA GTA C -3' (서열번호 62)를 이용하여 일으켰으며, 온도 사이클링은 95 ℃에서 1분 동안 한 후 95 ℃에서 1분, 55 ℃에서 분, 및 65 ℃에서 17.2분간 30 사이클링 하였다. 돌연변이는 플라스미드 DNA의 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. t334g, g335c, 및 a341c에 돌연변이를 도입하기 위해, c295g 및 a296c에서 시퀀스-확인된 돌연변이 플라스미드로 2회차 부위-특이적 돌연변이 유발을 수행하였으며, 이때 프라이머 5'- GAC ATG TGC CAA GGC CCC CGC GTG GCT GGG AGT G -3' (서열번호 63 ) 및 5'- CAC TCC CAG CCA CGC GGG GGC CTT GGC ACA TGT C -3' (서열번호 64)를 이용하였다. 온도 사이클링은 95 ℃에서 30초 한 후, 95 ℃에서 30초, 55 ℃에서 1분 및 68 ℃에서 17.2분간 18 사이클링 하였다. 돌연변이는 결과로 얻은 플라스미드 DNA의 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
SKO-3을 제조하기 위해, 돌연변이된 B1D2 scFv를 항-ErbB3 scFv, H3으로 대체하기 위해 최초 B2B3-1 플라스미드 내로 서브클론(subclone)하였다. SKO-2에 대한 프라이머 어닐링은 5’ACAGTGGCGGCCGCCACCATGGGCTGGTCTCTGATCCTGCTGTTCCTGGTGGCCGTGGCCACGCGTGTGCTGTCCCAGGTGCAGCTCGTCCAGAGCGGCGC (서열번호 65) 및 5’GGAGGCGGCGCCCAGGACTGTCAGCTTGGTGCCACCGCCG (서열번호 66)을 이용하여 SKO-2로부터 돌연변이된 B1D2 scFv를 분리하고, Kas Ⅰ/ Not Ⅰ 제한 분해된 B2B3-1 플라스미드 내에 서브클로닝하기 위해 Kas Ⅰ 및 Not Ⅰ 제한 부위를 도입하였다. PCR은 다음과 같이 수행하였다: 94 ℃에서 1분 후, 94 ℃에서 30초, 58 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분 동안 30 사이클한 후, 72 ℃에서 5분 동안 1 사이클하여 돌연변이 B1D2를 증폭하였다. 성공적인 클로닝은 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. SKO-2 및 SKO-3 플라스미드는 쉐이크 플라스크 또는 10L 웨이브 백(WAVE bag)에서 CHO-K1 세포로부터 안정하게 발현시키고, 블루 세파로즈(SEPHAROSE) 및 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 배양된(conditioned) 배지로부터 정제하였다.
거의 동일한 수의 ErbB2 및 ErbB3 리셉터를 발현하는 MALME-3M 멜라노마 세포(melanoma cell)를 포화 농도(saturating concentration)의 염소 항-HSA Alexafluor-647이 컨쥬게이트된 항체의 존재 하에 희석 시리즈의 B2B3-1, SKO-2, 또는 SKO-3으로 배양하였다. 세포 결합은 유세포 분석기로 평가하였으며, 겉보기(apparent) 결합 친화도는 각각의 분자에 대해 결정하였다. 대조구 세포는 이차 항체로만 배양한 것이다. 측정 불가능한 세포 결합은 SKO-2에서 관찰되었으며, SKO-2는 오직 H3에 의해 매개되는 ErbB3에 대해 낮은 친화력의 결합을 보유하며, ErbB2 결합 활성은 부족하다. ErbB2에 높은 친화력으로 결합하는 B1D2 scFv 기능을 보유하지만 ErbB3에 결합하는 능력은 부족한 SKO-3은 6.7 nM의 KD를 갖는다. B2B3-1은 0.2 nM의 KD로 세포에 결합하며, 이는 증가된 결합이 이중특이적으로 디자인된 상기 분자에 의해 매개됨을 증명한다 (도 14).
실시예 15
생리적 조건 하에서 B2B3-1의 안정성은 인간(human), 사이노몰거스 원숭이(Cynomolgus monkey), 또는 마우스(mouse) 혈청에 100 nM B2B3-1을 37 ℃에서 120 시간의 기간 동안 배양함으로써 평가하였다. 샘플은 0, 24, 48, 72, 96 및 120 시간에 제거하였으며(removed), ErbB2 및 ErbB3에 결합하는 B2B3-1의 능력은 ELISA로 측정하였다. 상기 ELISA는 96-well 플레이트를 재조합 ErbB2 세포외 도메인으로 밤새도록 코팅한 다음 차단 단계 후, 희석 시리즈의 B2B3-1로 배양하는 단계를 포함한다. 이후 플레이트를 Fc-ErbB3 세포외 도메인 융합 단백질로 배양시킨 다음 염소 항인간-Fc-HRP를 컨쥬게이트 하였다. 플레이트는 수퍼시그날 화학발광 치환체( supersignal chemiluminescense substrate)를 첨가하여 현상하였다(developed). 도 15A-C는 생리적 조건 하에서 B2B3-l이 세가지 모든 종의 혈청에 안정하게 남아있음을 보여주며, 측정된 모든 시간 포인트에서 ErbB2 및 ErbB3에 결합하는 비교할만한(comparable)능력을 가졌다.
실시예 16: 생체내( in vivo ) BT-474-M3 인간 유방암 이종이식 모델에서 B2B3-1 투여량(dose) 반응
생체내(in vivo) B2B3-1의 효능은 인간 BT-474-M3 이종이식을 제공한 누드 마우스들을 이용하여 평가하였다. 그룹 당 10 마리의 마우스들을 0.3, 1, 3, 10, 30 또는 90 mg/kg B2B3-1을 매 3일마다 12회 처리하였다. 대조구 그룹은 90 mg/kg B2B3-1 투여량에 대한 동일 몰 투여량의 PBS 비히클(vehicle) 또는 HSA를 처리하였다. 모든 투여량은 복강내(interperitoneally) 투여하였다. 종양 사이즈는 일주일에 두 번 측정하였으며, 상응하는 종양의 부피를 계산하였다. 그 결과 대조구 그룹과 비교하여 B2B3-1 처리는 BT-474-M3 종양 크기의 상당한 감소를 유도함을 보여준다 (도 16). 완전한 퇴화(regression)는 가장 낮은 투여량의 B2B3-1 (0.1 mg/kg)을 처리한 마우스들을 제외하고 B2B3-1을 처리한 각각의 그룹에서 관찰되었다.
실시예 17
도 17A-E에 나타낸 바와 같이, B2B3-1는 ErbB2 의존적 방식으로 여러 이종이식 모델에서 종양 크기를 감소시킨다. B2B3-1은 1×105 리셉터/세포(receptors/cell) 이상의 ErbB2를 발현하는 Calu-3 (도 17A), SKOV-3 (도 17B), NCI-N87 (도 17C), 및 MDA-MB-361 (도 17E) 이종이식 모델에서 효과가 있었으나, 4.5×10 ErbB2 리셉터/세포(receptors/cell)를 발현하는 ACHN (도 17D) 이종이식 모델에서는 효과가 낮았다. 마우스들은 매 3일마다 30 mg/kg의 B2B3-1로 처리하였다.
실시예 18
ADRr 유방암 이종이식 모델에서 ErbB2의 과-발현은 B2B3-1에 대한 반응자(responder)를 B2B3-1 비-반응자(non-responder)로 변환시킨다 (도 18A 및 18B). ErbB2는 레트로바이러스 발현 시스템(retroviral expression system)을 이용하여 ADRr 유방암 세포에서 과-발현시켰다. 높은 수준으로 ErbB2를 발현하는 형질전환된(transfected) 세포 (ADRr-E2)는 FACS를 이용하여 선별하였으며, 이후에 종양 이종이식을 구축(establish)하기 위해 누드 마우스들에 피하 주사하였다. 마우스들은 매 3일마다 30 mg/kg의 B2B3-1로 처리하였다. 야생형(wild type) ADRr 이종이식 (도 18A) 에서는 B2B3-1에 대한 무반응이 관찰된 반면, ADRr-E2 이종이식 (도 18B) 에서는 B2B3-1에 대해 반응하였다.
실시예 19
도 19A-B에 나타낸 바와 같이, 시험관내 (도 19A) 및 생체내 (도 19B)에서 B2B3-1 활성은 ErbB2 발현 수준에 긍정적으로(positively) 관여한다. B2B3-1의 ErbB3 인산화 억제는 ELlSA 분석을 이용하여 5×104 리셉터/세포(receptors/cell) 내지 2.4×106 리셉터/세포(receptors/cell) 범위의 ErbB2 발현 수준을 갖는 9 개의 종양 세포주에서 결정되었다. 기초 수준(basal level)으로 ErbB3 인산화를 억제하는 B2B3-l의 능력의 범위(extent) (% pErbB3 억제)는 ErbB2 발현 수준에 긍정적으로 관여함을 발견하였다. 유사하게, B2B3-1 활성은 저 내지 고(low to high) 수준으로 ErbB2을 발현하는 10 개의 종양 이종이식 모델에서 평가되었다. 또한 이종이식 반응은 ErbB2 발현 수준에 긍정적으로 관여한다.
실시예 20
BT474-M3 유방 종양 세포에 B2B3-1 처리는 핵(nucleus)으로 p27kip1의 전위(translocation)를 야기한다 (도 20A). BT474-M3를 1 μM의 B2B3-1로 6 시간 동안 처리하였다. p27kip1의 하부-세포질(sub-cellular) 위치는 면역형광 기술을 이용하여 평가하였다. B2B3-1를 처리한 세포에서 핵으로 p27kip1의 전이는 세포 증식이 억제되는 결과를 보여주었다. 처리하지 않은 세포에서는 p27kip1이 세포질(cytoplasm)에 남아있다.
세포 주기에 대한 B2B3-1의 효과를 더 연구하기 위해, B2B3-1로 72 시간 동안 처리한 BT-474-M3 세포를 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 세포 주기 조절인자 사이클린 D1(Cyclin D1)에 탐침시켰다(probed) (도 20B). 세포골격(cytoskeleton) 단백질 빈큐린(vinculin)은 본 실험에서 단백질을 로딩하는 기준(control)으로 사용되었다. B2B3-1 처리는 처리하지 않은 세포와 비교하여 사이클린 D1(Cyclin D1)의 수준을 감소시켰다.
실시예 21
도 21A-B에 나타낸 바와 같이, BT474-M3 유방 종양 이종이식에 B2B3-1 처리는 핵(nucleus)으로 p27kip1의 전위(translocation)를 야기한다. BT474 유방 종양 이종이식을 1회 30 mg/kg의 B2B3-1 (도 21A) 또는 동일한 투여량의 HSA (도 21B)로 매 3일마다 총 4회 처리하였다. p27kip1에 대한 증가된 핵 염색은 HSA 대조구 종양과 비교하여 B2B3-1 처리한 종양에서 관찰되었으며, 이는 생체내 B2B3-1의 항-증식성 효과를 나타내는 것이다.
실시예 22
B2B3-1 처리는 BT474 유방암 이종이식 종양에서 증식 마커인 Ki67의 감소를 야기한다. BT474-M3 유방 종양 이종이식을 1회 30 mg/kg의 B2B3-1 (도 22A) 또는 동일한 투여량의 HSA (도 22B)로 매 3일마다 총 4회 처리하였다. 이후의 Ki67에 대한 종양 단편(section)의 염색은 HSA를 처리한 종양과 비교하여 B2B3-1으로 처리한 종양에서 감소된 발현 패턴을 증명하였다.
실시예 23
B2B3-1 처리는 BT474-M3 유방암 이종이식 종양에서 혈관 밀도의 감소를 야기하며, 이는 CD31 발현에 대해 분석함으로써 결정하였다 (도 23A-B). BT474 유방 종양 이종이식을 1회 30 mg/kg의 B2B3-1 (도 23A) 또는 동일한 투여량의 HSA (도 23B)로 매 3일마다 총 4회 처리하였다. 종양은 혈관 마커인 CD31의 존재를 위해 염색하였다. B2B3-1을 처리한 종양에서는 HSA를 처리한 대조구 종양과 비교하여 혈관 밀도 표식이 감소되었다.
실시예 24: B2B3-1은 생체내 ErbB3의 인산화를 억제한다.
BT-474-M3 이종이식 종양을 30 mg/kg B2B3-1 또는 17.5 mg/kg HSA로 매 3일마다 총 4회 처리하고, 마지막 투여 24 시간 후 종양을 수확하였다(harvested). 종양을 용해시키고, SDS-PAGE를 수행한 다음 B2B3-1의 표적 ErbB3의 상대적인 인산화 수준을 평가하기 위해 웨스턴 분석을 수행하였다. 동일한 정량의 단백질을 각각의 레인(lane)에 로딩하고, 총 단백질 수준은 베타 투불린(beta tubulin)에 대해 탐침(probing)시킴으로써 조절하였다. 인산화된 ErbB3에 특이적인 항체들을 이용한 웨스턴 블롯 분석은 HSA를 처리한 종양 보다 B2B3-1을 처리한 종양에서 pErbB3을 더 적게 포함함을 보여준다 (도 24A). 웨스턴 블롯 분석의 밀도계측(densitometry) 후 평균 베타 투불린 적분 밴드 강도(mean beta tubulin integral band intensity)에 대한 평균 pErbB3 적분 밴드 강도(mean pErbB3 integral band intensity)의 표준화(normalization)를 수행하여 B2B3-1을 처리한 종양이 HSA를 처리한 대조구 종양 보다 상당히 적은 pErbB3을 포함하고 있음을 증명하였다 (도 24B). 상기 데이터는 B2B3-1이 생체내 그것의 표적 ErbB3의 인산화를 억제함을 확인시킨다.
실시예 25: TEN 활성을 감소시킨 BT-474-M3 이종이식에서 B2B3-l의 생체내 활성.
ShRNA 기술은 BT-474-M3 유방암 세포에서 종양 억제 유전자 포스파타아제(phosphatase) 및 텐신 유사체(tensin homolog) (PTEN)의 활성을 억제시키는데 적용되었다. 간략히, 배양된 BT-474-M3 세포를 레트로바이러스(retroviral) 형질전환에 의해 shPTEN 또는 shControl RNA로 형질전환시킨다. 감소된 PTEN을 갖도록 형질전환된 세포를 FACS를 이용하여 선별하고, 이후 이종이식 종양 구축을 위해 누드 마우스들의 오른쪽 치면(right flank) 내에 피하 주사하였다. 컨트롤 벡터(control vector)로 형질전화된 세포들은 동일한 마우스의 왼쪽 치면 내에 피하 주사하였다. 상기 마우스들을 30mg/kg B2B3-1로 매 3일마다 또는 10mg/kg 트라스투주맙(trastuzumab)으로 매주 처리하였다. HSA는 대조구로써 B2B3-1과 동일한 투여량을 주사하였다. 모든 주사는 i.p 로 하였다.
B2B3-1 및 트라스투주맙은 대조구 BT-474-M3 유방암 세포에 형성된 종양 크기의 감소를 촉진시키며 (도 25A), 반면 오직 B2B3-1 (트라스투주맙 처리하지 않음)은 PTEN의 발현을 억제시킨 BT-474-M3 인간 유방암 세포에 형성된 종양 크기의 감소를 촉진시킨다 (도 25B).
실시예 26: PTEN 활성이 감소된 BT-474-M3 유방암 세포에서 B2B3-l은 ErbB3 신호전달을 억제한다.
종양 이종이식에서 신호전달하는 ErbB3의 인산화를 억제하는 B2B3-1의 능력은 상술한 PTEN이 결핍된(deficient) BT-474-M3 모델을 이용하여 연구하였다. 조작된(engineered) 세포주 또는 대조구 세포주의 이종이식 종양을 30 mg/kg B2B3-1, 17.5 mg/kg HSA로 매 3일바다 또는 10 mg/kg 트라스투주맙으로 매주 처리하고, 마지막 투여량 처리 24 시간 후 종양을 수확하였다. 종양을 용해시키고, SDS-PAGE를 수행한 다음 B2B3-1의 표적 ErbB3, AKT의 인산화 수준 및 총 PTEN의 상대적인 수준을 평가하기 위해 웨스턴 분석을 수행하였다. 동일한 정량의 단백질을 각각의 레인(lane)에 로딩하고, 총 단백질 수준은 PCNA에 대해 탐침(probing)함으로써 조절하였다. 인산화된 ErbB3에 특이적인 항체들을 이용한 웨스턴 블롯 분석은 HSA 처리 또는 허셉틴을 처리한 종양 보다 B2B3-1을 처리한 종양에서 pAKT를 더 적게 포함함을 보여준다 (도 26A). 웨스턴 블롯 분석의 밀도계측(densitometry) 후 평균 PCNA 적분 밴드 강도(mean PCNA integral band intensity)에 대한 평균 pAKT 적분 밴드 강도(mean pAKT integral band intensity)의 표준화(normalization)를 수행하여 B2B3-1을 처리한 종양이 HSA를 처리한 대조구 및 허셉틴-처리한 종양 보다 상당히 적은 pAKT를 포함하고 있음을 증명하였다 (도 26B).
실시예 27
B2B3-1에 대한 약동학적 파라미터(pharmacokinetic parameter) nu/nu 마우스들에서 연구하였다. 동물들은 무작위로 그룹화하였으며, 5, 15, 30, 또는 45 mg/kg B2B3-1의 단일 투약(single dose)으로 정맥내에(intravenous; IV) 투여하였다 (도 27A-D, 각각). 혈액은 투여 전 및 투여 후 0.5, 4, 8, 24, 48, 72, 및 120 시간에 수집하였다. 세 마리 마우스가 상기 각 포인트에 사용되었다. B2B3-1의 혈청 수준은 두 가지 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 첫 번째 방법은 ErbB2 및 ErbB3에 대한 B2B3-1의 기능적인 결합을 요구하며, 반면 두 번째 방법은 오직 혈청에서 B2B3-1의 구성요소인 HSA를 측정한다. HSA ELISA는 폴리클로날-항 HSA 포획 항체(polyclonal-anti HSA capture antibody)와 HRP-컨쥬게이트된 폴리클로날 항-HSA 검출 항체(HRP-conjugated polyclonal anti-HSA detection antibody)를 이용한다. ErbB2/ErbB3 결합 방법 대(versus) HSA 방법을 이용하여 측정된 B2B3-1 혈청 농도의 감소는 기능적인 B2B3-1의 손실을 나타내었다. 도 27A-D는 B2B3-1의 약동학적 특성들은 상기 두 가지 ELISA 방법을 사용하여 평가하였을 때 비교가능함을 보여주며, B2B3-1은 마우들에서 안정하게 순환함을 나타낸다.
실시예 28
B2B3-1 혈청 농도는 두 가지 구획(two-compartment), 이중 지수(biexponential) 모델 및 쇼 바이페이직 디스포지션(show biphasic disposition)을 이용하여 피팅(fit) 하였다. 최종 반감기(terminal half-live)는 5, 15, 30, 또는 45 mg/kg 투여량에 대해 각각 17, 16, 23, 및 18 시간에 측정하였으며, 표 4에 나타내었다. B2B3-1 투여량의 증가는 노출의 선형 증가를 야기한다 (도 28).
Figure pct00004
실시예 29
또한 약동학적 분석을 위한 혈액 샘플들은 암컷 사이노몰거스 원숭이(Cynomolgus monkey)에서 투여량 범위-시험 독성 연구(dose range-finding toxicology study)로부터 획득하였다. 본 연구에서, 동물들은 4, 20 또는 200 mg/kg의 B2B3-1를 매 3일마다 총 4회 투여하여 주입하였다. 샘플링(sampling)은 투여 전 및 각각의 투여날(dosing day) (연구날 1, 4, 7 및 10)에 투여 5 분 후에 발생시켰으며, 이는 투여 전 및 1 일째 첫 번째 주입이 완료된 후 1, 2, 4, 8, 24 및 48 시간 및 10 일째 마지막 주입이 완료된 후 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72 및 120 시간에서의 정점/저점(peak/trough) 농도를 제공하기 위함이다. 회복을 위해 200 mg/kg을 투여한 동물의 혈청 샘플은 마지막 주입 후 168, 336 및 456 시간에 수집하였다.
사이노몰거스 원숭이 혈청 샘플들은 이전에 설명된 ErbB2/ErbB3 ELISA 방법을 이용하여 평가하였다. 시간 경과(time course)에 따른 각 투여량에 대한 혈청 농도는 도 29에 나타내었다. 상기 분석은 1일 및 10일 째 B2B3-1을 투여한 후 혈청에 대한 평균 농도-시간 프로파일은 Cmax로부터 시간에 따라 일반적으로 농도가 감소하므로 정성적으로 유사함을 보여준다. 평균 반감기는 1 일째 38.3 내지 67.2 시간 및 10 일째 45.0 내지 121.0 시간 범위에서 평가하였다 (표 4).
실시예 30
B2B3-1 이중특이적 scFv 융합 단백질을 인코딩(encoding)하는 플라스미드는 유일한 인간 항-ErbB3 scFv ("H3"으로 지정), 인간 항-ErbB2 scFv ("B1D2"으로 지정), 및 변형된 인간 혈청 알부민 (HSA) 링커의 유전자 서열 조합으로 제조하였다. 항-ErbB3 scFv인 H3은 펩티드 (Ala-Ala-Ser) 연결을 통해 HSA 링커의 아미노 말단에 재조합적으로 결합시켰으며, 항-ErbB2 scFv인 B1D2는 펩티드 (Ala-Ala- Ala-Leu - 서열번호 5) 연결을 통해 HSA 링커의 카르복시 말단에 유전적으로(genetically) 결합시켰다. 펩티드 커넥터들은 포유류 발현 벡터를 제조(construction)하는 동안 제한 부위(restriction site)에 도입(introduction)하여 형성시켰으며, 단일쇄 항체 단편 및 HSA 링커와 함께 포유류 발현에 최적화된 코돈 사용도(codon usage)로 합성하였다.
B1D2 scFv는 ErbB2-결합 scFv C6.5의 돌연변이 유발로 제조된 재조합 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별하였으며, ErbB2-결합 scFv C6.5는 비-면역(non-immune) 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별하였다. H3 scFv는 Sheets et al에 의해 처음으로 제조된 비-면역 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별하였다. B1D2 및 H3 단일쇄 항체 단편을 인코딩하는 유전자 서열은 CHO 세포 코돈 선호도(codon preference)로 최적화 하였으며, 이후의 B2B3-1 인코딩 플라스미드 제조를 위해 합성하였다.
변형된 HSA 링커는 두 개의 아미노산 치환을 포함한다. 34 위치에서 시스테인 잔기는 상기 부위에서 산화에 의한 단백질 이질성(heterogeneity)의 가능성(potential)을 감소시키기 위해 세린으로 변이시켰다. 아미노산 503에서 아스파라긴 잔기는 글루타민으로 변이시켰으며, 야생형(wild type) HSA은 탈아미노화(deamination)에 민감하며, 약리학적 반감기를 감소시키는 결과를 야기할 수 있다.
변형된 HSA 링커를 인코딩하는 유전자 서열은 이후의 B2B3-1 인코딩 플라스미드를 제조하기 위해 포유류 발현에 최적화된 코돈 사용도(codon usage)로 합성하였다.
실시예 31
B2B3-1 코딩(coding) 서열은 도 30에 나타낸 플라스미드 pMP10k4H3-mHSA-BlD2를 제작하기 위해 표준 분자 생물학 기술(standard molecular biology technique)을 이용하여 pMPlOk 기초 벡터(base vector) 내에 클로닝시켰다. 대부분은 이 구조체는 일반적으로 사용되는 유전 요소들을 사용하였다. B2B3-1 발현은 인간 GAPD 프로모터(promoter)에 의해 유도(driven)된다. 상기 벡터는 MAR(Matrix Attachment Regions) 또는 MAR 인자로 언급되는 유전 인자를 이용한다. 상기 MAR 유전 인자는 크로마틴(chromatin)의 역동적 조직(dynamic organization)을 조절하며, 근처 유전자들을 둘러싼 크로마틴의 효과로부터 보호함으로써 카피수 의존적, 위치-비의존적 유전자 발현을 증가시킨다. MAR 인자들은 재조합 단백질 생산을 위한 원하는 수준의 발현을 나타내는 클론을 분리하는 확률(probability)을 향상시키며, 생산의 안정성을 증가시킨다. B2B3-1 제조에 사용된 상기 MAR 인자들은 인간 MAR 인자들을 비-코딩(non-coding)한다. 게다가, B2B3-1 플라스미드, 네오마이신 항생제 저항 플라스미드 (도 31) 및 하이그로마이신 저항 플라스미드 (도 32)는 또한 안정한 형질전환체를 위해 선택하여 사용하였다.
실시예 32: 유전자 형질전환(gene transfection)의 첫 번째 라운드
중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary) CHO-Kl 세포를 ATCC (ATCC # CCL-61)로부터 구입하였다. CHO-Kl 세포주는 T.T. Puck에 의해 제작된 모(parental) CHO 세포주의 서브-클론(sub-clone)이며, 혈청 및 프롤린에 의존적으로 부착한다. B2B3-1 형질전환을 위해 사용된 CHO-Kl 세포는 형질전환 전에 혈청이 없는 배지에서 현탁 성장을 위해 사전-적응시켰다. 반복적인 형질전환 절차는 B2B3-1 세포주를 개발하기 위해 이용되었다. 형질전환 24 시간 전, 1.O×1O6 cells/mL의 CHO-Kl 세포를 8 mM L-글루타민(L-glutamine), 0.1 mM 소디움 하이포크산틴(sodium hypoxanthine), 및 0.016 mM 티미딘(thymidine)이 보충된 SFM4CHO (Serum Free) 배지 (HyClonc, Logan, UT)에 서브 계대되었다. 형질전환 당일, 세포를 OptiMEM 배지 (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)에 재현탁시키고, 40,000 세포를 24 웰 플레이트의 각 월에 위치시켰다. 첫 번째 형질전환에, B2B3-1 발현 플라스미드 (pMP10k4H3-mHSA-BlD2) 및 네오마이신(neomycin) 저항 플라스미드 (도 30; pSV2-neo (Selexis, Inc., Marlborough, MA))를 75:l (B2B3-l:neomycin resistance)의 플라스미드 몰비로 함께 혼합하였다. 이후 상기 플라스미드 혼합물을 양이온 지질 형질전환제(cationic lipid transfection reagent) (Lipofectamine LTX, Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)와 혼합하고, 지질/DNA(lipid/DNA) 복합체를 CHO-Kl 세포에 첨가한 후, 24 웰 플레이트를 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에 두었다.
실시예 33: 고 생산자(High Producer)의 선택 및 스크리닝
각각의 형질전환 웰의 내용물(contents)을 PBS로 세척하고, 트립신 처리하고(trypsinized), 96 웰 플레이트에 두 번에 걸쳐 분산시켰다. 성장 배지는 10% FBS (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)가 보충된 DMEM/F12 (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) 배지 및 500 mg/L의 게네티신(geneticin) (G418; Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)으로 구성된 배지를 사용하였다. 96-웰 플레이트 내에 배지는 8 mM L-글루타민(L-glutamine), 0.1 mM 소디움 하이포크산틴(sodium hypoxanthine), 0.016 mM 티미딘(thymidine), 및 500mg/L 게네티신(geneticin)이 보충된 SFM4CHO 배지로 4 일마다 교체하였다. 선택 배지(selection medium)로 2 주간 추가 배양한 후, 살아있는 세포들은 뚜렷한 콜로니들을 형성시킨다. 클론은 정양적 스팟 블롯 기술(quantitative spot blot technique)을 이용하여 평가하였다. 톱 생산(Top producing) 콜로니들은 트립신 처리하고, 24-웰 플레이트의 단일 웰에 확장시켰다.
7 일간 생산성 분석은 B2B3-1을 많이 생산하는 콜로니를 선별하기 위해 사용되었다. 24-웰 플레이트에 확장한 세포들을 8 mM L-글루타민(L-glutamine), 0.1 mM 소디움 하이포크산틴(sodium hypoxanthine), 및 0.016 mM 티미딘(thymidine)이 보충된 SFM4CHO 배지로 7 일 동안 증식시켰다. 사용된 배지에서 B2B3-1 농도를 결정하였다. 24-웰 규모로부터 톱 클론(top clone)을 125 mL 배플드 쉐이크 플라스크(baffled shake flask) 내에 확장시켰다. 8 mM L-글루타민(L-glutamine), 0.1 mM 소디움 하이포크산틴(sodium hypoxanthine), 및 0.016 mM 티미딘(thymidine)이 보충된 SFM4CHO 배지를 넣은 쉐이크 플라스크에서 7 일간 연구는 성장 및 B2B3-1 생성을 위한 세포 푸울(cell pool)을 선별하기 위해 사용되었다.
실시예 34: 유전자 형질전환(gene transfection)의 두 번째 라운드
첫 번째 형질전환 라운드 (supra)로부터 결정된 최고의 생산 세포 푸울(cell pool)은 생산을 증가시키기 위해 두 번째 형질전환 하였다. 형질전환 24 시간 전, 1.O×1O6 cells/mL의 세포 푸울을 8mM L-글루타민(L-glutamine), 0.1 mM 소디움 하이포크산틴(sodium hypoxanthine), 및 0.016 mM 티미딘(thymidine)이 보충된 SFM4CHO (Serum Free) 배지 (HyClonc, Logan, UT)에 서브 계대하였다. 형질전환 당일, 세포를 OptiMEM 배지 (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)에 재현탁시키고, 40,000 세포를 24 웰 플레이트의 각 월에 위치시켰다. 첫 번째 형질전환에, B2B3-1 및 하이그로마이신(hygromycin) 저항 플라스미드 (도 32; pTK-Hyg (Clontech, Mountain View, CA))를 50:l (B2B3-l:hygromycin resistance)의 플라스미드 몰비로 함께 혼합하였다. 이후 상기 플라스미드 혼합물을 양이온 지질 형질전환제(cationic lipid transfection reagent) (Lipofectamine LTX, Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)와 혼합하고, 지질/DNA(lipid/DNA) 복합체를 30 분 동안 형성시켰다. 상기 DNA/지질 복합체를 세포 푸울에 첨가한 후, 24 웰 플레이트를 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에 두었다.
실시예 35: 두 번째 형질전환으로부터 고 생산자(High Producer)의 선택 및 스크리닝
각각의 형질전환 웰의 내용물(contents)을 PBS로 세척하고, 트립신 처리하고(trypsinized), 96 웰 플레이트에 두 번에 걸쳐 분산시켰다. 성장 배지는 10% FBS가 보충된 DMEM/F12 및 400 mg/L의 하이그로마이신 B(hygromycin B) (Invitrogen Corp)로 구성된 배지를 사용하였다. 96-웰 플레이트 내의 배지는 8 mM L-글루타민(L-glutamine), 0.1 mM 소디움 하이포크산틴(sodium hypoxanthine), 0.016 mM 티미딘(thymidine), 및 400 mg/L의 하이그로마이신 B(hygromycin B)가 보충된 하이클론(Hyclone) SFM4CHO 배지로 4 일마다 교체하였다. 선택의 추가 2 주 후, 살아있는 세포들은 뚜렷한 콜로니들을 형성시킨다. 클론은 정양적 스팟 블롯 기술(quantitative spot blot technique)을 이용하여 평가하였다. 톱 생산(Top producing) 콜로니들은 트립신 처리하고, 24-웰 플레이트의 단일 웰에 확장시켰다.
7 일간 생산성 분석은 B2B3-1을 많이 생산하는 콜로니를 선별하기 위해 사용되었다. 확장한 세포들을 7 일 동안 증식시키고, 사용된 배지에서 B2B3-1 농도를 결정하였다.
24-웰 플레이트로부터 톱 클론(top clone)을 8 mM L-글루타민(L-glutamine), 0.1 mM 소디움 하이포크산틴(sodium hypoxanthine), 및 0.016 mM 티미딘(thymidine)이 보충된 하이클론(Hyclone) SFM4CHO 배지를 넣은 125 mL 배플드 쉐이크 플라스크(baffled shake flask) 내에 확장시켰다. 쉐이크 플라스크에서 7 일간 연구는 B2B3-1 생성 및 성장의 세포 푸울(cell pool)을 선별하기 위해 사용되었다. 사용된 배지는 단백질 아레신(Protein Aresin) 및 HPLC 기구를 이용하여 정량하였다.
실시예 36: 제한 희석 클로닝(Limiting Dilution Cloning)
생산성 분석에 의해 확인된 최고 성장 및 최고의 B2B3-1-생산하는 콜로니를 125 mL 쉐이커 플라스크에 전이시키고, 5 개의 96-웰 플레이트에 1 cell/well로 측정된 세포 농도로 평판 배양하였다. 상기 96-웰 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2 인큐베이터에 두었다. 콜리니들의 형성을 추적(track)하기 위해 웰을 격주(bi-weekly)로 검사하였다. 단일 세포로부터 생성된 콜로니들은 콜로니의 대칭 형상(symmetrical shape)을 기반으로 확인하였다. 이러한 콜로니들을 포함하는 웰은 24-웰 7-일 평가 및 125mL 쉐이커 플라스크 7-일 평가로 더 스크리닝하여 구분하였다.
제한 희석 클로닝의 두 번째 라운드는 첫 번째 라운드와 유사한 방식으로 수행하였다. 클론(clone) 선정을 확인하기 위해 100 mL 페드 배치(fed batch) 평가를 추가적으로 수행하였다. 전-시드(pre-seed) 뱅크(bank)는 동결보존하였다.
실시예 37: B2B3-l의 제제화(formulation)
B2B3-1은 환자의 내약성(tolerability)에 따라 1 주일에 한번 60 또는 90 분 동안 정맥내 주입을 통해 투여하였다. 환자(예컨대, 인간)에 투여하기 위한 B2B3-1은 멸균 20 mM L-히스티딘 하이드로클로라이드(L-histidine hydrochloride), 150 mM 소디움 클로라이드(sodium chloride), pH 6.5 용액에 25mg/mL 농도로 제제화하였다.
실시예 38: 유방암(Breast Cancer)의 치료
환자의 암은 ErbB2 (HER2/neu)를 포함하는 표피 성장 인자 리셉터의 수준이 높게 발현하는 것으로 여겨지고 있으므로, ErbB2 결합 부분에 결합되는 HSA 링커, 예컨대 B2B3-1, B2B3-2, v-3, B2B3-4, B2B3-5, B2B3-6, B2B3-7, B2B3-8, B2B3-9, 또는 B2B3-10 (표 6, 하기)로 처리한 후 나타날 것이다. 이러한 경우에 암 생체검사의 유전자형(genotypic) 또는 조직학적(histologic) 심사(screen)는 환자의 종양에서 ErbB2의 증가된 발현을 나타낸다.
B2B3 링커 콘쥬게이트 (예컨대, B2B3-1, 서열번호 16)는 30mg/kg 보다 높지 않은 투여량으로 환자의 내약성(tolerability)에 따라 1 주일에 한번 또는 1주일에 두번 일정 기간 동안 예건대, 60 또는 90 분 동안 정맥내 주입을 통해 유방암으로 진단된 환자에 투여하였다. 상기 환자에 투여하기 위한 상기 B2B3 HSA 링커 콘쥬게이트는 멸균 20 mM L-히스티딘 하이드로클로라이드(L-histidine hydrochloride), 150 mM 소디움 클로라이드(sodium chloride), pH 6.5 용액에 25mg/mL 농도로 배합하였다. 상기 B2B3 HSA 링커 콘쥬게이트의 임상적으로 통제되는(clinician supervising) 투여는 상기 환자에 알맞은 치료 코스를 결정하기 위해 일반적인 배합 및 투여량 관례를 따른다.
상기 임상의(clinician)는 B2B3 HSA 링커 콘쥬게이트로 하나 또는 그 이상의 치료를 더 투여할 수 있다. 예컨대, 하나 또는 그 이상의 치료적 약물 또는 화합물은 B2B3 HSA 링커 콘쥬게이트 예컨대, 독소루비신(doxorubicin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 및 파클리탁셀(paclitaxel)을 포함하는 유방암의 치료를 위한 일반적인 화학요법(chemotherapeutic regimen)과 조합하여 투여될 수 있다. 대안적으로, 임상의(clinician)는 유방암 환자 치료를 목적으로 외과적 또는 방사선 치료와 조합하여 상기 B2B3 HSA 링커 콘쥬게이트를 투여할 수 있다.
실시예 39
환자의 암은 ErbB2 (HER2/neu)를 포함하는 표피 성장 인자 리셉터의 수준이 높게 발현하는 것으로 여겨지고 있으므로, ErbB2 결합 부분에 결합되는 HSA 링커, 예컨대 B2B3-1, B2B3-2, v-3, B2B3-4, B2B3-5, B2B3-6, B2B3-7, B2B3-8, B2B3-9, 또는 B2B3-10 (표 6, 하기)으로 처리한 후 나타날 것이다. 이러한 경우에 암 생체검사의 유전자형(genotypic) 또는 조직학적(histologic) 심사(screen)는 환자의 종양에서 ErbB2의 증가된 발현을 나타낸다.
B2B3 링커 콘쥬게이트 (예컨대, B2B3-1, 서열번호 16)는 단독 또는 선행 실시예에 개시된 바와 같이 하나 이상의 다른 필수적인 치료들과 조합하여 난소암으로 진단된 환자에 투여된다.
실시예 40: 추가적인 HSA 링커 콘쥬게이트
HSA 링커 컨쥬게이트는 하기 표 5에 열거된 하나 또는 그 이상의 인자(그룹 A-E)를 이용하여 제작될 수 있다. 특히, 하기 표 5에서 그룹 C로 나타낸 HSA 링커 콘쥬게이트는 표 5에 나타낸 그룹 A 및 E로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 결합 부분과 결합한다. 게다가, HSA 링커 컨쥬게이트는 또한 표 5에서 그룹 B 및 D로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 펩티드 커넥터를 각각 HSA 링커의 아미노 및 카르복시 말단에 더 포함할 수 있다. 펩티드 커넥터들은 커넥터 시퀀스의 길이를 증가 또는 감소시키기 위해 반복될 수 있고 또는 절단될 수 있다.
실시예 41: 생체내( in vivo )에서 q7d 투여된 B2B3-1는 q3d 투여된 B2B3-1과 동등한 효능을 보인다
q7d (매 7일마다 한번) 투여하는 요법(regimen)을 이용한 B2B3-1 효능은 인간 유방암 세포주 BT-474-M3 이종이식 종양을 제공한 Charles River Labs으로부터 얻은 5-6 주의 흉선 제거한 암컷 누드 마우스 (nu/nu)에서 측정하였다 (도 33). 마우스들은 PBS 내 20×106 인간 BT-474-M3 세포로 주사하기 24 시간 전 반대 플랭크(opposite flank)에 피하로 에스트로겐-방출 이식을 받았다 (0.72 mg pellet, 60 day, slow-release, Innovative Research of America). 투여(Dosing)는 종양 성장이 확립되었을 때 (거의 400 mm3의 종양 부피) 시작하였으며, 그룹 당 10 마리의 마우스들에 연구 코스를 위해 30 mg/kg B2B3-1을 매 3일마다 한번 또는 22 mg/kg, 66 mg/kg, 132 mg/kg 또는 198mg/kg B2B3-1을 매 7일마다 한번 복강주사로 투여하였다. 종양은 디지털 캘리퍼스(digital calipers)를 이용하여 일주일에 두 번 측정하였다. 종양 부피는 공식: π/6 x (W2 x L) 을 이용하여 계산하였으며, 여기서 W는 짧은 직경(short diameter) 및 L은 긴 직경(long diameter)이다. 약동학적 계산(Pharmacokinetic calculation)은 q7d 66 mg/kg 투여가 q3d 30 mg/kg 투여와 같이 이종이식 종양에 대한 B2B3-1의 유사한 노출을 보임을 제시한다. PBS 비히클은 대조군으로써 사용하였다. B2B3-1 효능은 q3d, 30 mg/kg 투여 및 q7d, B2B3-1의 세 가지 높은 투여량의 투여에서 동등하며, 이는 B2B3-1에 대한 q7d 투여 스케쥴이 상기 모델에 적절함을 나타낸다.
실시예 42: B2B3-1 및 트라스투주맙( trastuzumab )은 ErbB3 억제의 서로 다른 메커니즘을 갖는다
ErbB3 활성을 유도하는 헤레굴린(heregulin)을 억제하는 B2B3-1의 능력은 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 이용하여 테스트하였다. 혈청-결핍된 BT-474-M3 세포의 단층(Monolayer)을 100 nM B2B3-1 또는 트라스투주맙(trastuzumab)로 24 시간 동안 처리한 후, 10 분 동안 5 nM HRG 1β EGF로 자극하였다. 또한 세포를 10nM 및 100 nM B2B3-1 또는 10nM 및 100 nM 트라스투주맙으로 처리하고, 왼쪽은 자극하지않았다. 용해물은 ErbB3, pErbB3, AKT, 및 pAKT에 대한 면역블롯(immunoblot) 분석을 위해 사용되었다. 웨스턴 블롯 분석 (도 34)은 B2B3-1 처리가 리간드 의존적 방식으로 pErbB3 및 pAKT의 억제하는 결과를 증명하는 반면, 트라스투주맙에 의한 pErbB3 및 pAKT의 억제는 단지 리간드의 존재에서만 보임을 증명한다.
실시예 43: B2B3-1은 시험관내(in vitro)에서 트라스투주맙과 적용하였을 때 부가적인 효과를 갖는다
타원체(spheroid) 암 세포의 성장에 대한 B2B3-1, 트라스투주맙 및 상기 두 약물의 조합의 효과는 4 개의 서로 다른 유방암 세포주를 이용하여 평가하였다. BT-474-M3, SKBR3 (ATCC), 또는 MDA-MB-361 (ATCC) 인간 유방암 세포의 2,000 세포를 둥근-바닥 낮은 부착 96-웰 플레이트 (round-bottom low adherence 96-well plates) (Corning96 Well Clear Round Bottom Ultra Low Attachment Microplate - Product #7007)에 접종하고, 다음날 타원체(spheroid)를 측정하고, B2B3-1, 트라스투주맙 또는 트라스투주맙에 대해 3배 몰 많은 B2B3-1의 비율로 두 약물의 조합을 투약 범위로 처리하였다. 12일 후 타원체의 성장한 표면적(surface area)를 측정하고, 처리하지 않은 세포와 비교하였다. 도 35A-C에서 볼 수 있듯이, B2B3-1과 트라스투주맙의 조합은 높은 농도 범위에서 테스트된 모든 세포주에서 단일 제제(single agent)에 비해 타원체 성장을 크게 억제하는 결과를 보였으나, 낮은 농도의 약물에서는 그렇지 않았다. 이러한 결과는 또한 B2B3-1은 ErbB2 (HER2)의 결합에 있어서 트라스투주맙과 경쟁하지 않음을 나타낸다.
실시예 44: B2B3-1은 생체내( in vivo )에서 트라스투주맙과 적용하였을 때 부가적인 효과를 갖는다
생체내(in vivo)에서 트라스투주맙과 공동-투여하였을 때 B2B3-1의 효과는 BT-474-M3 이종이식 모델을 이용하여, Charles River Labs으로부터 얻은 5-6 주의 흉선 제거한 암컷 누드 마우스 (nu/nu)에서 연구하였다. 마우스들은 PBS 내 20×106 인간 BT-474-M3 세포로 주사하기 24 시간 전 반대 플랭크(opposite flank)에 피하로 에스트로겐-방출 이식을 받았다 (0.72 mg pellet, 60 day, slow-release, Innovative Research of America). 투여(Dosing)는 종양 성장이 확립되었을 때 (거의 400 mm3의 종양 부피) 시작하였다. 종양은 디지털 캘리퍼스(digital calipers)를 이용하여 일주일에 두 번 측정하였다. 종양 부피는 공식: π/6 x (W2 x L) 을 이용하여 계산하였으며, 여기서 W는 짧은 직경(short diameter) 및 L은 긴 직경(long diameter)이다. 그룹 당 10 마리의 마우스들에 연구 코스를 위해 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 B2B3-1로 q3d, 1 mg/kg 또는 0.1 mg/kg의 트라스투주맙으로 q7d 또는 상기 두 약물의 조합을 복강주사로 투여하였다. B2B3-1 및 트라스투주맙의 모든 조합 (10 mg/kg B2B3-1 + 1 mg/kg 트라스투주맙, 10 mg/kg B2B3-1 + 0.1 mg/kg 트라스투주맙, 3 mg/kg B2B3-1 + 1 mg/kg 트라스투주맙, 3 mg/kg B2B3-1 + 0.1 mg/kg 트라스투주맙)은 단일 제제(single agent)와 비교를 위해 투여하였다.
도 35에 보이는 바와 같이, 단일 제제와 비교하여 모든 조합에서 실질적으로 큰 효능을 보였으며, 10 mg/kg B2B3-1과 두 가지 투여량의 트라스투주맙 및 3 mg/kg B2B3-1과 1 mg/kg 트라스투주맙으로 투여한 조합 그룹에 대해서는 일찍 적어도 20일 후 상당한 효능이 관찰되었다. 10 mg/kg B2B3-1 + 1 mg/kg 트라스투주맙 조합 그룹에서, 5 내지 10 마리의 마우스들은 조합과 동일한 투여량을 주입한 0 내지 10 마리의 단일 제제 그룹과 비교하여 완전히 종양이 퇴행되었다(regressed). 3 mg/kg B2B3-1 + 1 mg/kg 트라스투주맙 조합 그룹에서, 7 내지 10 마리의 마우스들은 조합과 동일한 동일한 투여량을 주입한 0 내지 10 마리의 단일 제제 그룹과 비교하여 완전히 종양이 퇴행되었다(regressed). 이러한 결과는 B2B3-1이 ErbB2 (HER2)의 결합에 있어서 트라스투주맙과 경쟁하지 않음을 나타낸다. 이러한 결과는 또한 적어도 3 mg/kg의 B2B3-1 및 적어도 0.1 mg/kg의 트라스투주맙의 조합으로 처리하는 것은 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 B2B3-1 단독 또는 0.1 mg/kg 또는 1 mg/kg의 트라스투주맙 단독으로 처리하는 것 보다 더 효과적임을 증명한다. 특히, 적어도 3 mg/kg의 B2B3-1 및 1 mg/kg의 트라스투주맙의 조합은 본질적으로 인간 유방암 세포 종양이식을 수반한 누드 마우스의 전체 종양 퇴행을 적어도 약 50% 유도하는 반면, 동일 농도의 B1B2-1 또는 트라스투주맙 단독은 이러한 마우스들의 종양 퇴행을 심지어 10%도 제공하지 못한다.
HSA 링커, 펩티드 커넥터 및 상기 언급된 결합 부위의 특이적 구현예들을 포함한다. 하기, 표 6은 HSA 링커의 아미노 또는 카르복시 말달에 대한 펩티드 커넥터 뿐만 아니라, 다양한 ErbB2-특이적 또는 ErbB3-특이적 결합 부위와 10 개의 HSA 링커 콘큐게이트를 열거한 것이다.
본 기술에 숙력된 자들은 본 명세서에 개시된 특정 구현예들의 많은 등가물(equivalent)을 인식할 것이고, 단지 통상적인 실험을 이용하여 확인하고 실행할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구항들에 의해 포함되도록 의도되었다. 종속항에 언급된 모든 조합의 구현예들은 본 명세서의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
각각의 명세서 및 모든 US 및 해외 특허 및 본 명세서에 개시된 보류 및 등록된 특허는 그것 전체로서 참조로서 편입된다.
Figure pct00005
첨부 1
SEQUENCE ANNOTATIONS AND SEQUENCE ALIGNMENT
서열번호: 60
pMP9043
gtgccgacgatagagcagacctcgctaaatatatctgcgagaatcaggattccattagctctaagctgaaagaatgttgcgagaagcccctcctggaaaagagtcattgtatcgccgaggtggaaaacgacgagatgccagcagatctgccatcactcgctgccgactttgtggaatccaaagatgtctgcaagaattacgcagaggctaaagacgtgttcctggggatgtttctgtatgagtacgcccggcgtcaccccgattatagcgtcgtgctcctgctccgactggcaaagacctacgaaacaactctggagaaatgttgcgctgccgcagaccctcatgaatgttatgctaaggtgttcgatgagtttaagccactcgtcgaagagccccagaacctgattaaacagaattgcgaactgttcgagcagctcggtgaatacaagtttcagaacgccctgctcgtgcgttataccaaaaaggtccctcaggtgtctacaccaactctggtggaggtcagtaggaatctgggcaaagtgggatcaaagtgttgcaaacaccccgaggcaaagagaatgccttgtgctgaagattacctctccgtcgtgctgaaccagctctgcgtgctgcatgaaaagaccccagtcagcgatcgggtgacaaaatgttgcaccgaatctctggtcaatcgccgaccctgtttcagtgccctcgaagtggacgaaacttatgtgcctaaggagtttcaggctgaaacattcacctttcacgccgatatctgcactctgtccgagaaagaaaggcagattaagaaacagacagcactggtcgagctcgtgaagcataaaccaaaggctaccaaggagcagctgaaagccgtcatggacgatttcgcagcttttgtggaaaagtgttgcaaagccgacgataaggagacttgtttcgcagaagaggggaaaaagctcgtggctgccagccaggcagctctgggtctggccgcagctctgcaggtgcagctcgtccagagcggcgctgaggtgaagaagccaggcgagtccctgaagatctcctgtaagggctccggctacagcttcacctcctactggatcgcttgggtgaggcagatgccaggaaagggactggagtacatgggcctgatctaccctggcgactccgacaccaagtactccccatccttccagggccaggtgaccatcagcgtggacaagtccgtgtctaccgcctacctgcaatggtcctccctgaagccttctgactctgccgtgtacttttgtgcccggcacgatgtgggctactgcaccgaccggacatgtgccaagtggcccgagtggctgggagtgtggggacagggaacactggtgacagtgagttctggcggtggcggctcttccggcggtggctctggtggcggcggatctcagagcgtgctgacacagccacctagcgtgtccgctgcccctggccagaaggtgacaatcagctgctccggcagctcttccaacatcggcaacaactacgtgtcttggtatcagcagctgcccggaacagctccaaaactgctgatctatgaccacaccaatcggcctgccggcgtgccagatcggttctctggctctaagagcggcacctccgccagcctggctatctctggcttcagatctgaggatgaggctgactactattgtgcctcctgggactacaccctgtctggctgggtgttcggcggtggcaccaagctgacagtcctgggatgatgactcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggtccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtacctagaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttccttggccaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagcacgtactacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttctagaattcgctgtctgcgagggccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgcggtgatgcctttgagggtggccgcgtccatctggtcagaaaagacaatctttttgttgtcaagcttgaggtgtggcaggcttgagatctggccatacacttgagtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcagatatccagcacagtggcggccgccaccatgggctggtctctgatcctgctgttcctggtggccgtggccacgcgtgtgctgtcccaggtgcagctgcaggagtctggcggcggactggtgaagcctggcggctccctgcggctgtcctgcgccgcctccggcttcaccttctcctcctactggatgtcctgggtgcggcaggcccctggcaagggcctggagtgggtggccaacatcaaccgggacggctccgcctcctactacgtggactccgtgaagggccggttcaccatctcccgggacgacgccaagaactccctgtacctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagggaccggggcgtgggctacttcgacctgtggggcaggggcaccctggtgaccgtgtcctccgctagtactggcggcggaggatctggcggaggagggagcgggggcggtggatcccagtccgccctgacccagcctgcctccgtgtccggctcccctggccagtccatcaccatcagctgcaccggcacctcctccgacgtgggcggctacaacttcgtgtcctggtatcagcagcaccccggcaaggcccctaagctgatgatctacgacgtgtccgaccggccttccggcgtgtccgacaggttctccggctccaagtccggcaacaccgcctccctgatcatcagcggcctgcaggcagacgacgaggccgactactactgctcctcctacggctcctcctccacccacgtgatctttggcggcggaacaaaggtgaccgtgctgggcgccgcctccgacgctcacaagagcgaagtggcacataggttcaaagatctgggcgaagagaactttaaggccctcgtcctgatcgctttcgcacagtacctccagcagtctccctttgaagatcacgtgaaactggtcaatgaggtgaccgaatttgccaagacatgcgtggctgatgagagtgcagaaaactgtgacaaatcactgcatactctctttggagataagctgtgcaccgtcgccacactcagagagacttatggggaaatggctgactgttgcgcaaaacaggagcctgaacggaatgagtgtttcctccagcacaaggatgacaacccaaatctgccccgcctcgtgcgacctgaggtcgatgtgatgtgcaccgcctttcatgacaacgaagagacattcctgaagaaatacctgtatgaaattgctcgtaggcacccatacttttatgcccccgagctcctgttctttgcaaagagatacaaagctgccttcactgaatgttgccaggcagctgataaggccgcatgtctcctgcctaaactggacgagctccgggatgaaggtaaggcttccagcgccaaacagcgcctgaagtgcgcttctctccagaagtttggcgagcgagcattcaaagcctgggctgtggcccgtctcagtcagaggtttccaaaggcagaatttgctgaggtctcaaaactggtgaccgacctcacaaaggtccatactgagtgttgccacggagatctgctggaat
서열번호: 67
QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARADVGYCTDRTCAKAPAWLGVWGQGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYCASWDYTLSGWVFGGGTKLTVLGAASDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARHDVGYCTDRTCAKWPEWLGVWGQGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYCASWDYTLSGWVFGGGTKLTVLG
서열번호: 68
QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLGAASDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARADVGYCTDRTCAKAPAWLGVWGQGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYCASWDYTLSGWVFGGGTKLTVLG
B2B3-1 (H3-mHSA-B1D2)
1 QVQLQESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMS WVRQA PGKGLEWVA N
51 INRDGSASYY VDSVKG RFTI SRDDAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR DR
101 GVGYFDL WGR GTLVTVSSAS TGGGGSGGGG SGGGGSQSAL TQPASVSGSP
151 GQSITISC TG TSSDVGGYNF VS WYQQHPGK APKLMIY DVS DRPS GVSDRF
201 SGSKSGNTAS LIISGLQADD EADYYC SSYG SSSTHVI FGG GTKVTVLGAA
251 SDAHKSEVAH RFKDLGEENF KALVLIAFAQ YLQQSPFEDH VKLVNEVTEF
301 AKTCVADESA ENCDKSLHTL FGDKLCTVAT LRETYGEMAD CCAKQEPERN
351 ECFLQHKDDN PNLPRLVRPE VDVMCTAFHD NEETFLKKYL YEIARRHPYF
401 YAPELLFFAK RYKAAFTECC QAADKAACLL PKLDELRDEG KASSAKQRLK
451 CASLQKFGER AFKAWAVARL SQRFPKAEFA EVSKLVTDLT KVHTECCHGD
501 LLECADDRAD LAKYICENQD SISSKLKECC EKPLLEKSHC IAEVENDEMP
551 ADLPSLAADF VESKDVCKNY AEAKDVFLGM FLYEYARRHP DYSVVLLLRL
601 AKTYETTLEK CCAAADPHEC YAKVFDEFKP LVEEPQNLIK QNCELFEQLG
651 EYKFQNALLV RYTKKVPQVS TPTLVEVSRN LGKVGSKCCK HPEAKRMPCA
701 EDYLSVVLNQ LCVLHEKTPV SDRVTKCCTE SLVNRRPCFS ALEVDETYVP
751 KEFQAETFTF HADICTLSEK ERQIKKQTAL VELVKHKPKA TKEQLKAVMD
801 DFAAFVEKCC KADDKETCFA EEGKKLVAAS QAALGLAAAL QVQLVQSGAE
851 VKKPGESLKI SCKGSGYSFT SYWIA WVRQM PGKGLEYMG L IYPGDSDTKY
901 SPSFQG QVTI SVDKSVSTAY LQWSSLKPSD SAVYFCAR HD VGYCTDRTCA
951 KWPEWLGV WG QGTLVTVSSG GGGSSGGGSG GGGSQSVLTQ PPSVSAAPGQ
1001 KVTISC SGSS SNIGNNYVS W YQQLPGTAPK LLIY DHTNRP A GVPDRFSGS
1051 KSGTSASLAI SGFRSEDEAD YYC ASWDYTL SGWV FGGGTK LTVLG
CDR 루프(loop)는 H3 (밑줄친 1-248에서 이탤릭체로 굵게 나타낸 CDRs) 및 B1D2 (밑줄친 841-1095에서 이탤릭체로 굵게 나타낸 CDRs) 내에서 강조하였다. HSA로 변형된 커넥터는 점선으로된-밑줄로된 것이다.
B2B3 및 mHSA를 포함하는 다양한 HSA 링커 콘쥬게이트에 대한 시퀀스 배열
1 45
A5-mHSA-ML3.9 (1) QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFNTYDMNWVRQAPGKGL
A5-mHSA-B1D2 (1) QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFNTYDMNWVRQAPGKGL
A5-mHSA-F5B6H2 (1) QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFNTYDMNWVRQAPGKGL
B12-mHSA-B1D2 (1) QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGL
B12-mHSA-F5B6H2 (1) QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGL
F4-mHSA-B1D2 (1) QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL
F4-mHSA-F5B6H2 (1) QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL
H3-mHSA-B1D2 (1) QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGL
H3-mHSA-F5B6H2 (1) QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGL
46 90
A5-mHSA-ML3.9 (46) EWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
A5-mHSA-B1D2 (46) EWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
A5-mHSA-F5B6H2 (46) EWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
B12-mHSA-B1D2 (46) EWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRPED
B12-mHSA-F5B6H2 (46) EWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRPED
F4-mHSA-B1D2 (46) EWVSTISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED
F4-mHSA-F5B6H2 (46) EWVSTISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED
H3-mHSA-B1D2 (46) EWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAED
H3-mHSA-F5B6H2 (46) EWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAED
91 135
A5-mHSA-ML3.9 (91) TAVYYCARDG---VATTPFDYWGQGTLVTVS---SGGGGSGGGGS
A5-mHSA-B1D2 (91) TAVYYCARDG---VATTPFDYWGQGTLVTVS---SGGGGSGGGGS
A5-mHSA-F5B6H2 (91) TAVYYCARDG---VATTPFDYWGQGTLVTVS---SGGGGSGGGGS
B12-mHSA-B1D2 (91) TAVYYCARDLGAKQWLEGFDYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
B12-mHSA-F5B6H2 (91) TAVYYCARDLGAKQWLEGFDYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
F4-mHSA-B1D2 (91) TAVYYCAKGYSSSWSEVASGYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
F4-mHSA-F5B6H2 (91) TAVYYCAKGYSSSWSEVASGYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
H3-mHSA-B1D2 (91) TAVYYCARDR----GVGYFDLWGRGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
H3-mHSA-F5B6H2 (91) TAVYYCARDR----GVGYFDLWGRGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
136 180
A5-mHSA-ML3.9 (130) GGGGSQSVLTQPPS-VSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQ
A5-mHSA-B1D2 (130) GGGGSQSVLTQPPS-VSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQ
A5-mHSA-F5B6H2 (130) GGGGSQSVLTQPPS-VSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQ
B12-mHSA-B1D2 (136) GGGGSSYELTQDPA-VSVALGQTVRITCQGDSLRS---YYASWYQ
B12-mHSA-F5B6H2 (136) GGGGSSYELTQDPA-VSVALGQTVRITCQGDSLRS---YYASWYQ
F4-mHSA-B1D2 (136) GGGGSAIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIR---NDLGWYQ
F4-mHSA-F5B6H2 (136) GGGGSAIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIR---NDLGWYQ
H3-mHSA-B1D2 (132) GGGGSQSALTQPAS-VSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQ
H3-mHSA-F5B6H2 (132) GGGGSQSALTQPAS-VSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQ
181 225
A5-mHSA-ML3.9 (174) QLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAED
A5-mHSA-B1D2 (174) QLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAED
A5-mHSA-F5B6H2 (174) QLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAED
B12-mHSA-B1D2 (177) QKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSTSGNSASLTITGAQAED
B12-mHSA-F5B6H2 (177) QKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSTSGNSASLTITGAQAED
F4-mHSA-B1D2 (178) QKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDD
F4-mHSA-F5B6H2 (178) QKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDD
H3-mHSA-B1D2 (176) QHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADD
H3-mHSA-F5B6H2 (176) QHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADD
226 270
A5-mHSA-ML3.9 (219) EADYYCQSYDSS-LSALFGGGTKLTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
A5-mHSA-B1D2 (219) EADYYCQSYDSS-LSALFGGGTKLTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
A5-mHSA-F5B6H2 (219) EADYYCQSYDSS-LSALFGGGTKLTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
B12-mHSA-B1D2 (222) EADYYCNSRDSSGNHWVFGGGTKVTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
B12-mHSA-F5B6H2 (222) EADYYCNSRDSSGNHWVFGGGTKVTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
F4-mHSA-B1D2 (223) FATYFCQQAHSF--PPTFGGGTKVEIKRGAASDAHKSEVAHRFKD
F4-mHSA-F5B6H2 (223) FATYFCQQAHSF--PPTFGGGTKVEIKRGAASDAHKSEVAHRFKD
H3-mHSA-B1D2 (221) EADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
H3-mHSA-F5B6H2 (221) EADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
271 315
A5-mHSA-ML3.9 (262) LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
A5-mHSA-B1D2 (262) LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
A5-mHSA-F5B6H2 (262) LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
B12-mHSA-B1D2 (266) LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
B12-mHSA-F5B6H2 (266) LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
F4-mHSA-B1D2 (266) LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
F4-mHSA-F5B6H2 (266) LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
H3-mHSA-B1D2 (265) LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
H3-mHSA-F5B6H2 (265) LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
316 360
A5-mHSA-ML3.9 (307) AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
A5-mHSA-B1D2 (307) AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
A5-mHSA-F5B6H2 (307) AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
B12-mHSA-B1D2 (311) AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
B12-mHSA-F5B6H2 (311) AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
F4-mHSA-B1D2 (311) AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
F4-mHSA-F5B6H2 (311) AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
H3-mHSA-B1D2 (310) AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
H3-mHSA-F5B6H2 (310) AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
361 405
A5-mHSA-ML3.9 (352) QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
A5-mHSA-B1D2 (352) QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
A5-mHSA-F5B6H2 (352) QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
B12-mHSA-B1D2 (356) QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
B12-mHSA-F5B6H2 (356) QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
F4-mHSA-B1D2 (356) QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
F4-mHSA-F5B6H2 (356) QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
H3-mHSA-B1D2 (355) QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
H3-mHSA-F5B6H2 (355) QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
406 450
A5-mHSA-ML3.9 (397) FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
A5-mHSA-B1D2 (397) FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
A5-mHSA-F5B6H2 (397) FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
B12-mHSA-B1D2 (401) FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
B12-mHSA-F5B6H2 (401) FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
F4-mHSA-B1D2 (401) FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
F4-mHSA-F5B6H2 (401) FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
H3-mHSA-B1D2 (400) FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
H3-mHSA-F5B6H2 (400) FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
451 495
A5-mHSA-ML3.9 (442) AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
A5-mHSA-B1D2 (442) AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
A5-mHSA-F5B6H2 (442) AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
B12-mHSA-B1D2 (446) AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
B12-mHSA-F5B6H2 (446) AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
F4-mHSA-B1D2 (446) AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
F4-mHSA-F5B6H2 (446) AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
H3-mHSA-B1D2 (445) AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
H3-mHSA-F5B6H2 (445) AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
496 540
A5-mHSA-ML3.9 (487) TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
A5-mHSA-B1D2 (487) TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
A5-mHSA-F5B6H2 (487) TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
B12-mHSA-B1D2 (491) TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
B12-mHSA-F5B6H2 (491) TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
F4-mHSA-B1D2 (491) TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
F4-mHSA-F5B6H2 (491) TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
H3-mHSA-B1D2 (490) TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
H3-mHSA-F5B6H2 (490) TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
541 585
A5-mHSA-ML3.9 (532) LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
A5-mHSA-B1D2 (532) LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
A5-mHSA-F5B6H2 (532) LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
B12-mHSA-B1D2 (536) LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
B12-mHSA-F5B6H2 (536) LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
F4-mHSA-B1D2 (536) LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
F4-mHSA-F5B6H2 (536) LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
H3-mHSA-B1D2 (535) LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
H3-mHSA-F5B6H2 (535) LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
586 630
A5-mHSA-ML3.9 (577) MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
A5-mHSA-B1D2 (577) MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
A5-mHSA-F5B6H2 (577) MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
B12-mHSA-B1D2 (581) MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
B12-mHSA-F5B6H2 (581) MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
F4-mHSA-B1D2 (581) MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
F4-mHSA-F5B6H2 (581) MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
H3-mHSA-B1D2 (580) MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
H3-mHSA-F5B6H2 (580) MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
631 675
A5-mHSA-ML3.9 (622) FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
A5-mHSA-B1D2 (622) FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
A5-mHSA-F5B6H2 (622) FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
B12-mHSA-B1D2 (626) FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
B12-mHSA-F5B6H2 (626) FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
F4-mHSA-B1D2 (626) FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
F4-mHSA-F5B6H2 (626) FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
H3-mHSA-B1D2 (625) FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
H3-mHSA-F5B6H2 (625) FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
676 720
A5-mHSA-ML3.9 (667) STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
A5-mHSA-B1D2 (667) STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
A5-mHSA-F5B6H2 (667) STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
B12-mHSA-B1D2 (671) STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
B12-mHSA-F5B6H2 (671) STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
F4-mHSA-B1D2 (671) STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
F4-mHSA-F5B6H2 (671) STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
H3-mHSA-B1D2 (670) STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
H3-mHSA-F5B6H2 (670) STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
721 765
A5-mHSA-ML3.9 (712) HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
A5-mHSA-B1D2 (712) HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
A5-mHSA-F5B6H2 (712) HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
B12-mHSA-B1D2 (716) HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
B12-mHSA-F5B6H2 (716) HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
F4-mHSA-B1D2 (716) HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
F4-mHSA-F5B6H2 (716) HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
H3-mHSA-B1D2 (715) HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
H3-mHSA-F5B6H2 (715) HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
766 810
A5-mHSA-ML3.9 (757) FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
A5-mHSA-B1D2 (757) FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
A5-mHSA-F5B6H2 (757) FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
B12-mHSA-B1D2 (761) FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
B12-mHSA-F5B6H2 (761) FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
F4-mHSA-B1D2 (761) FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
F4-mHSA-F5B6H2 (761) FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
H3-mHSA-B1D2 (760) FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
H3-mHSA-F5B6H2 (760) FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
811 855
A5-mHSA-ML3.9 (802) FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVQSGA
A5-mHSA-B1D2 (802) FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVQSGA
A5-mHSA-F5B6H2 (802) FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVESGG
B12-mHSA-B1D2 (806) FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVQSGA
B12-mHSA-F5B6H2 (806) FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVESGG
F4-mHSA-B1D2 (806) FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVQSGA
F4-mHSA-F5B6H2 (806) FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVESGG
H3-mHSA-B1D2 (805) FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVQSGA
H3-mHSA-F5B6H2 (805) FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVESGG
856 900
A5-mHSA-ML3.9 (847) EVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPG
A5-mHSA-B1D2 (847) EVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPG
A5-mHSA-F5B6H2 (847) GLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGR
B12-mHSA-B1D2 (851) EVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPG
B12-mHSA-F5B6H2 (851) GLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGR
F4-mHSA-B1D2 (851) EVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPG
F4-mHSA-F5B6H2 (851) GLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGR
H3-mHSA-B1D2 (850) EVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPG
H3-mHSA-F5B6H2 (850) GLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGR
901 945
A5-mHSA-ML3.9 (892) DSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARH
A5-mHSA-B1D2 (892) DSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARH
A5-mHSA-F5B6H2 (892) GDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKM
B12-mHSA-B1D2 (896) DSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARH
B12-mHSA-F5B6H2 (896) GDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKM
F4-mHSA-B1D2 (896) DSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARH
F4-mHSA-F5B6H2 (896) GDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKM
H3-mHSA-B1D2 (895) DSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARH
H3-mHSA-F5B6H2 (895) GDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKM
946 990
A5-mHSA-ML3.9 (937) DVGYCSSSNCAKWPEYFQHWGQGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGS
A5-mHSA-B1D2 (937) DVGYCTDRTCAKWPEWLGVWGQGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGS
A5-mHSA-F5B6H2 (937) TSNAVG----------FDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGGGSG
B12-mHSA-B1D2 (941) DVGYCTDRTCAKWPEWLGVWGQGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGS
B12-mHSA-F5B6H2 (941) TSNAVG----------FDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGGGSG
F4-mHSA-B1D2 (941) DVGYCTDRTCAKWPEWLGVWGQGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGS
F4-mHSA-F5B6H2 (941) TS----------NAVGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGGGSG
H3-mHSA-B1D2 (940) DVGYCTDRTCAKWPEWLGVWGQGTLVTVSSGGGGSSGGGSGGGGS
H3-mHSA-F5B6H2 (940) TSNAVG----------FDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGGGSG
991 1035
A5-mHSA-ML3.9 (982) QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNY-VSWYQQLPGTA
A5-mHSA-B1D2 (982) QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNY-VSWYQQLPGTA
A5-mHSA-F5B6H2 (972) QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGRHSNIGLGYGVHWYQQLPGTA
B12-mHSA-B1D2 (986) QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNY-VSWYQQLPGTA
B12-mHSA-F5B6H2 (976) QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGRHSNIGLGYGVHWYQQLPGTA
F4-mHSA-B1D2 (986) QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNY-VSWYQQLPGTA
F4-mHSA-F5B6H2 (976) QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGRHSNIGLGYGVHWYQQLPGTA
H3-mHSA-B1D2 (985) QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNY-VSWYQQLPGTA
H3-mHSA-F5B6H2 (975) QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGRHSNIGLGYGVHWYQQLPGTA
1036 1080
A5-mHSA-ML3.9 (1026) PKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYC
A5-mHSA-B1D2 (1026) PKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYC
A5-mHSA-F5B6H2 (1017) PKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGFKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
B12-mHSA-B1D2 (1030) PKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYC
B12-mHSA-F5B6H2 (1021) PKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGFKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
F4-mHSA-B1D2 (1030) PKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYC
F4-mHSA-F5B6H2 (1021) PKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGFKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
H3-mHSA-B1D2 (1029) PKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYC
H3-mHSA-F5B6H2 (1020) PKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGFKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
1081 1104
A5-mHSA-ML3.9 (1071) ASWDYTLSGWVFGGGTKLTVLG--
A5-mHSA-B1D2 (1071) ASWDYTLSGWVFGGGTKLTVLG--
A5-mHSA-F5B6H2 (1062) QSYDRRTPGWVFGGGTKLTVLG--
B12-mHSA-B1D2 (1075) ASWDYTLSGWVFGGGTKLTVLG--
첨부 2
항암제
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013

다른 구현예
본 발명은 그의 특정 구현예와 연결하여 개시되어 있고, 더 변형가능한 것으로 이해되어야 하며 이러한 적용은 임의의 변경, 사용 또는 적용에 이어, 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지의 또는 전통적인 사용에 따른 본 발명의 상세한 설명에서 벗어나는 것을 포함하여 본 명세서에 속하고 필수적인 특징을 적용하는 일반적으로 본 발명의 원리을 포함하는 것으로 간주된다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 등록특허는 각 독립적인 특허 또는 등록특허가 그것 전체로서 참조로서 편입되는 것으로 특별하고 개별적으로 지시한 것 처럼 동일한 내용으로 본 명세서에 참조로서 편입된다.
<110> Merrimack Pharmaceuticals, Inc. et al. <120> Human Serum Albumin Linkers and Conjugates thereof <130> 06727/031WO1 <150> 61/115,797 <151> 2008-11-18 <150> PCT/US09/040259 <151> 2009-04-10 <160> 55 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Ser Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr 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Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile 385 390 395 400 Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala 405 410 415 Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys 420 425 430 Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys 435 440 445 Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe 450 455 460 Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg 465 470 475 480 Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu 485 490 495 Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala 500 505 510 Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser 515 520 525 Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys 530 535 540 Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu 545 550 555 560 Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn 565 570 575 Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr 580 585 590 Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala 595 600 605 Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro 610 615 620 His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu 625 630 635 640 Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu 645 650 655 Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys 660 665 670 Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu 675 680 685 Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met 690 695 700 Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val 705 710 715 720 Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr 725 730 735 Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp 740 745 750 Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Gln Ala Glu Thr Phe Thr Phe His 755 760 765 Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln 770 775 780 Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu 785 790 795 800 Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys 805 810 815 Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys 820 825 830 Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu Gln 835 840 845 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 850 855 860 Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 865 870 875 880 Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met Gly 885 890 895 Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 900 905 910 Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu 915 920 925 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 930 935 940 Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp Pro 945 950 955 960 Glu Trp Leu Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 965 970 975 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 980 985 990 Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys 995 1000 1005 Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 1010 1015 1020 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 1025 1030 1035 Leu Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg 1040 1045 1050 Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser 1055 1060 1065 Gly Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp 1070 1075 1080 Asp Tyr Thr Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 1085 1090 1095 Thr Val Leu Gly 1100 <210> 68 <211> 1095 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 68 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Arg Asp Gly Ser Ala Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Val Gly Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala 130 135 140 Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly 145 150 155 160 Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Asp Arg 180 185 190 Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr 195 200 205 Ala Ser Leu Ile Ile Ser Gly Leu Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Ser Ser Ser Thr His Val Ile Phe Gly Gly 225 230 235 240 Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ala Ala Ser Asp Ala His Lys Ser 245 250 255 Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala 260 265 270 Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Ser Pro Phe Glu 275 280 285 Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys 290 295 300 Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu 305 310 315 320 Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly 325 330 335 Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys 340 345 350 Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg 355 360 365 Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe 385 390 395 400 Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe 405 410 415 Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys 420 425 430 Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg 435 440 445 Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala 450 455 460 Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala 465 470 475 480 Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys 485 490 495 Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala 500 505 510 Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu 515 520 525 Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val 530 535 540 Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe 545 550 555 560 Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val 565 570 575 Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr 580 585 590 Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu 595 600 605 Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val 610 615 620 Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys 625 630 635 640 Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn 645 650 655 Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro 660 665 670 Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys 675 680 685 Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu 690 695 700 Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val 705 710 715 720 Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg 725 730 735 Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu 740 745 750 Phe Gln Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser 755 760 765 Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val 770 775 780 Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp 785 790 795 800 Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu 805 810 815 Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala 820 825 830 Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 835 840 845 Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly 850 855 860 Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met 865 870 875 880 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser 885 890 895 Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val 900 905 910 Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro 915 920 925 Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Asp Val Gly Tyr Cys 930 935 940 Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Ala Pro Ala Trp Leu Gly Val Trp Gly 945 950 955 960 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly 965 970 975 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro 980 985 990 Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly 995 1000 1005 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln 1010 1015 1020 Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp His Thr Asn 1025 1030 1035 Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly 1040 1045 1050 Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg Ser Glu Asp Glu 1055 1060 1065 Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu Ser Gly Trp 1070 1075 1080 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 1085 1090 1095

Claims (36)

  1. 다음을 함유하는 HSA 링커 콘쥬게이트:
    i) 서열번호 6-15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인간 혈청 알부민 (HSA) 링커; 및
    ii) 항체, 단일쇄 Fv 분자, 이중특이적(bispecific) 단일쇄 Fv ((scFv)2) 분자, 도메인 항체, 디아보디(diabodies), 트리아보디(triabodies), 호르몬, Fab 단편, F(ab)2 분자, 탠덤 scFv (taFv) 단편, 리셉터, 리간드, 앱타머, 및 그들의 생물학적-활성 단편으로 구성된 군에서 선택된 제1 및 제2 결합 부분(moieties), 여기서 상기 제1 결합 부분은 상기 HSA 링커의 아미노 말단에 결합되고, 상기 제2 결합 부분은 상기 HSA 링커의 카르복시 말단에 결합된다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 HSA 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HSA 링커인 것을 특징으로 하는 HSA 링커 콘쥬게이트.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 제1 결합 부분은 ErbB3에 특이적으로 결합하고, 상기 제2 결합 부분은 ErbB2에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 HSA 링커 콘쥬게이트.
  4. 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-1.
  5. 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-2.
  6. 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-3.
  7. 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-4.
  8. 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-5.
  9. 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-6.
  10. 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-7.
  11. 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-8.
  12. 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-9.
  13. 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-10.
  14. 제 1 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합되어 있는 것을 특징으로 하는 HSA 링커 콘쥬게이트.
  15. 제 1 내지 13항 중 어느 한 항의 유효량의 HSA 링커 콘쥬게이트를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 질환(disease) 또는 질병(disorder)을 갖는 환자의 치료방법.
  16. 사이클로포프파마이드(cyclophosphamide), 캠프토테신(camptothecin), 호모캠프토테신(homocamptothecin), 콜치신(colchicine), 콤브레스타틴(combrestatin), 콤브레스타틴(combrestatin), 리족신(rhizoxin), 돌리스타틴(dolistatin), 안사미토신(ansamitocin) p3, 마이탄시노이드(maytansinoid), 오리스타틴(auristatin), 칼레아치미신(caleachimicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실 (5-FU), 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 레트로졸(letrozole), 에피루비신(epirubicin), 베바시주맙(bevacizumab), 페루투주맙(pertuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 및 그들의 유도체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 치료제와 조합된 제 1 내지 13항 중 어느 한 항의 HSA 링커 콘쥬게이트를 포함하는 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 치료제는 트라스투주맙(trastuzumab)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 16항에 있어서, 상기 치료제는 트라스투주맙이고, 상기 HSA 링커 콘쥬게이트는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 HSA 링커 콘쥬게이트 B2B3-1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 치료제의 첫 번째 투여 및 상기 HSA 링커 콘쥬게이트의 두 번째 투여를 인간 유방 종양 세포를 이용한 누드 마우스 인간 이종이식 모델에서 테스트하였을 때, 상기 조합은 상기와 동일한 모델에서 치료제 단독의 첫 번째 투여 또는 HSA 링커 콘쥬게이트 단독의 두 번째 투여에 의해 제공된 것 보다 더 높은 효능을 제공하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 적어도 3 mg/kg의 B2B3-1 및 적어도 0.1 mg/kg의 트라스투주맙을 개체(subject)에 투여하는 투여 형태(dosage form)를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 3 mg/kg의 B2B3-1 및 0.1 mg/kg의 트라스투주맙을 개체(subject)에 투여하는 알맞은(adapted) 투여 형태(dosage form)를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 21항에 있어서, 10 mg/kg의 B2B3-1 및 1 mg/kg의 트라스투주맙을 개체(subject)에 투여하는 알맞은(adapted) 투여 형태(dosage form)를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 22항에 있어서, 3 mg/kg의 B2B3-1 및 0.1 mg/kg의 트라스투주맙을 개체(subject)에 투여하였을 때, 3 mg/kg의 B2B3-1 단독 또는 0.1 mg/kg의 트라스투주맙 단독에 의한 동일 개체의 치료보다 더 효과적인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 23항에 있어서, 10 mg/kg의 B2B3-1 및 1 mg/kg의 트라스투주맙을 개체(subject)에 투여하였을 때, 10 mg/kg의 B2B3-1 단독 또는 0.1 mg/kg의 트라스투주맙 단독에 의한 동일 개체의 치료보다 더 효과적인 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 22항에 있어서, 3 mg/kg의 B2B3-1 및 0.1 mg/kg의 트라스투주맙을 복수의 개체(subject)에 투여하였을 때, 투여 20일 후 상기 개체의 종양 퇴화가 10% 이상 유도되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 23항에 있어서, 10 mg/kg의 B2B3-1 및 1 mg/kg의 트라스투주맙을 각각 복수의 개체(subject)에 투여하였을 때, 투여 20일 후 상기 개체의 종양 퇴화가 적어도 50% 유도되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 16항에 있어서, 상기 치료제는 라파티닙(lapatinib)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제 16항에 있어서, 상기 치료제는 택산(taxane)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 택산(taxane)은 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 16항에 있어서, 상기 치료제는 레트로졸(letrozole)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 3항에 있어서, ErbB3에 결합하는 1차 결합 부분은 약 16 nM의 Kd를 갖고, ErbB2에 결합하는 2차 결합 부분은 약 0.3 nM의 Kd를 갖는 것을 특징으로 하는 HSA 링커 콘쥬게이드.
  33. 제 1 내지 14항 및 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 종양에 대한 치료를 필요로하는 개체(subject)에 유효량의 상기 HSA 링커 콘쥬게이트를 투여하는 것을 포함하는 상기 개체의 치료방법.
  34. 제 16 내지 30항 중 어느 한 항에 있어서, 종양에 대한 치료를 필요로하는 개체(subject)에 유효량의 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 상기 개체의 치료방법.
  35. 제 1 내지 14항 및 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 치료를 위한 약제(medicament) 제조에 이용하는 것을 특징으로 하는 HSA 링커 콘쥬게이트의 용도.
  36. 제 16 내지 30항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 치료를 위한 약제(medicament) 제조에 이용하는 것을 특징으로 하는 조성물의 용도.
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