JP2005530482A - ドミナントネガティブタンパク質およびそれらの用法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＴＮＦＳＦアンタゴニスト活性を有する新規タンパク質およびこれらのタンパク質をコードする核酸に関する。本発明はさらに、ＴＮＦＳＦ関連障害の処置における新規タンパク質の使用に関する。

Description

発明の詳細な説明
本出願は、２００２年１月４日に出願されたＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／３４５,８０５および２００２年４月１７日に出願されたＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／３７３,４５３の出願日の利益を主張する出願であり、それらの出願の全文を出典明示により本明細書の一部とする。
発明の分野
本発明は、アンタゴニスト活性を有する、腫瘍壊死因子スーパーファミリー［Tumor Necrosis Factor Super Family (ＴＮＦＳＦ)］の新規タンパク質、およびこれらのタンパク質をコードする核酸に関する。本発明はさらに、慢性関節リウマチ、敗血症、およびクローン病を含むがそれらに限定されない自己免疫症状などのＴＮＦＳＦ関連諸疾患、並びに末梢神経損傷および脱髄性疾患の処置におけるこれらの新規タンパク質の使用に関する。
発明の背景
多細胞生物は、個々の細胞の複雑かつ秩序ある構成体（society）から成っており、それらの細胞は、それらの機能を保持し調節するために交信し合わなければならない。細胞内のまたは細胞外の受容体群に対するリガンドとして作用するホルモン類、化学的媒体類、ケモカイン類、およびその他のサイトカイン類の、錯綜したかつ高度に調節されているネットワークにより、これは遂行される(Bodmer, J-L., et al., (2002) TIBS, 27, 19-26.）。それらのリガンドは、しばしば、リガンド−誘発性オリゴマー化または立体配位変化により活性化される（Heldin, C-H., (1995) Cell, 80, 213-223)。細胞間シグナル伝達プロセスを阻害するタンパク質の設計は、それらのタンパク質の多くが、貧血症、癌、糖尿病、炎症、神経障害および成長障害およびその他の疾患状態の処置に有用であり得ることから、多大な関心がもたれている。
これらのＴＮＦＳＦタンパク質は、多様な細胞内および細胞間シグナル伝達プロセスに関与しているサイトカイン類の中でも重要なクラスを構成している。このファミリーの原型（プロトタイプ）である、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦＡ）は、当初は腫瘍を退行させるインビボ作用が見出されたものであるが、炎症のキイ媒介物質である。近年、このＴＮＦＳＦは、分泌され膜結合した形態で存在している、少なくとも１８のユニークなサイトカインを構成しているとされる。これらのタンパク質は、先天的および適応性免疫応答並びに発生上の出来事の重要な調節物質である。それらは、二型膜タンパク質群として合成され、三量体化する保存性β−プリーツ・シート構造に折り畳まれる。殆どのＴＮＦＳＦ成分はホモ三量体を形成するが、幾らかの例外が存在する。リンホトキシンαはホモ三量体を形成でき、βはできないが、それらの２つは、お互いとで活性なヘテロ三量体を形成することもできる。同様に、ＡＰＲＩＬおよびＢＬｙＳは、一緒になってホモ三量体およびヘテロ三量体の両方を形成する。これらＴＮＦファミリーのメンバーの多くは、膜結合したままにとどまって細胞接触媒介の調節物質として作用し、その他のメンバーは膜から開裂されて細胞外ドメインを調節物質として放出する。
ＴＮＦファミリーメンバーに対する受容体群は、少なくとも２６の受容体および／または受容体誘引（decoy）分子群を含む、構造的関連分子群のファミリーを代表する。このファミリーメンバーの細胞外ドメイン群は、システインに富むドメイン（ＣＲＤ）の複数回繰り返し体、３本のジスルフィド結合を形成している６つの保存されたシステインを含有する小型タンパク質ドメインで構成されている。これらの受容体の細胞外ドメイン群は、このファミリーメンバーの多くがアポトーシスおよびその他の受容体ジグナル伝達の出来事を媒介する死のドメインを含むけれども、より一層多様である。これらのメンバーは全て、１つまたはそれ以上の細胞内アダプター分子群（それらもまた死のドメインを含み得る）との相互作用を介してアポトーシスを誘発することができる。このファミリーの他のシグナル伝達する受容体群は、ＴＲＡＦｓ（ＴＮＦ受容体連合因子群）と称するアダプター分子群のファミリーとの相互作用を介して、シグナル伝達する。ＴＮＦＳＦ受容体群を介してのシグナル伝達は、オリゴマー性（および多くの場合、三量体性）のＴＮＦＳＦリガンドの結合によって引き金が引かれる。
ＴＮＦＳＦメンバー群の各三次元構造は非常に類似しており、“ゼリーロール”またはギリシャキートポロジーを有する２枚の逆並行ベータシート（anti-parallel beta-sheets）のサンドイッチでできている。加えて、このファミリーの全ての特徴づけられたメンバーは、三量体複合体群に組み立てられる。ＴＮＦファミリーリガンド群の同種受容体群は、関連受容体群のスーパーファミリーを形成する。さらに、そこには受容体結合様式の有意な保存性のあることが明らかとなる。一般に、各受容体単量体は、２つのリガンド単量体間に形成された裂け目内で結合する。リガンド群およびそれらの受容体との複合体群のいずれもが、三次元および四次元構造で総合的に類似していることは、ある１組のリガンド−受容体システムの阻害についての、良く証明されたストラテジーが、当該ファミリー内の他のタンパク質にも当てはめ得ることを示唆している。しかしながら、当該ファミリーの他のメンバーへの拡張については、これまで何もそのメカニズムは定義されていなかった。それ故、本発明は、拮抗性である、ＴＮＦＳＦの各メンバーの変異型を創製するための方法群を提供するものである。
細胞内シグナル伝達プロセスを妨害し得るようなタンパク質を希求する要望が、今もなお存在する。従って、本発明の一つの目的は、各ドメインが、同種受容体（群）に対しての親和性および／またはシグナル伝達能力が顕著に低減されているように修飾された、多数のＴＮＦスーパーファミリー受容体−相互作用ドメインを含むタンパク質を提供することにある。そのような連結ドメインは、好ましくは、個々の単量体ドメイン群との連合を保持するものであるが、それらの不活性なオリゴマー性複合体群に隔離することによって関連する天然産生ドメイン群の作用と拮抗する、ドミナントネガティブ表現型を示すものである。
発明の要約
本発明は、上記概説の目的に従い、天然に存在するＴＮＦＳＦタンパク質群の作用と拮抗する、ＴＮＦＳＦタンパク質群の細胞外ドメインの変異型群を提供するものである。
本発明は、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質の配列と対比して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含む、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群を提供するものである。但し、当該変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群は、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質と物理的に相互作用して受容体シグナル伝達の活性化能力が実質的にない混合オリゴマー群を形成するであろうものである。
他の実施態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群は、少なくとも単量体形態にあり、そして、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質の配列と対比して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含むものであって、当該変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群が、少なくとも１つの受容体結合部位において受容体中間面と相互作用して、該受容体を受容体シグナル伝達の活性化能力が実質的にないものにするであろうものである。
本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群は、好ましくは、対応する野生型ＴＮＦＳＦタンパク質と対比して所望の受容体に対する親和性が低下しており、かつ他の受容体相互作用ドメインとの相互作用能力を保持している、少なくとも１つの受容体接触ドメインを有する。
より詳しくは、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群は、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質と物理的に相互作用して、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質の少なくとも１つの受容体を活性化する能力を低減させる。本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群は、対応天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質または非対応天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質と相互作用することができる。
より詳しくは、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群は、所望の受容体に対する親和性および／またはシグナル伝達能力が低下している少なくとも１つの修飾された受容体接触ドメインを含むものであって、該タンパク質は所望の受容体を実質的に活性化することができないが、他のＴＮＦＳＦタンパク質と相互作用する能力は保持しているものである。
別の態様では、本発明は、天然産生ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質を、ＴＮＦＳＦタンパク質の少なくとも１つの変異型細胞外ドメインを含む変異型ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質と接触させて、混合ＴＮＦＳＦオリゴマーを形成させることを含む、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質との拮抗方法を提供するものである。ある場合、例えば、この混合オリゴマーが、少なくとも１つの受容体結合部位において受容体中間面と相互作用して、その受容体を、受容体のシグナル伝達活性化が実質的にできなくなるようにするような場合には、これらの混合オリゴマーの受容体シグナル伝達は、野生型オリゴマーと対比して低くなっている。言い換えればまたは付言すれば、これらの混合オリゴマーは、受容体シグナル伝達の活性化が実質的に不能である。
本発明は、ＴＮＦスーパーファミリータンパク質リガンド類の変異型群の、各種疾患の阻止または処置への使用に関する。これらの変異型は、それら自身との複合物またはこのスーパーファミリーの天然産生メンバーとの複合体のいずれかにおけるそれらのオリゴマー性種として機能する能力を保持させながら、それらの生化学的シグナル伝達能力を除去または低減させるべく特に技術設計された（specifically engineered）ものである。
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、混合オリゴマー、最も好ましくは三量体、を形成させるための他のＴＮＦＳＦタンパク質に対する親和性は維持させながら、野生型ＴＮＦＳＦＴＮＦＳＦタンパク質と対比して、受容体を通じての顕著に低下したシグナル伝達が生じるように技術設計されている。そのような変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を、「ドミナントネガティブＴＮＦＳＦ変異型」または「ＤＮ−ＴＮＦＳＦ」と称する。これらのドミナントネガティブＴＮＦＳＦ変異型は、生化学的シグナル伝達を評価できる程度に活性化させる能力がない混合ヘテロ三量体群中に、１つまたはそれ以上の天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質を隔離することによって作用する。従って、ＤＮ−ＴＮＦＳＦタンパク質は、天然産生ＴＮＦＳＦの作用と拮抗するように作用する。
本発明は、野生型ＴＮＦＳＦタンパク質群と対比して少なくとも１つの修飾があるアミノ酸配列を含む、非天然産生変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群（例えば、天然には見出されないタンパク質群）を提供するものである。好適なタンパク質の例には、それらに限定されないが、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、リンホトキシン−β、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、Ｏｘ４０リガンド、ＡＰＲＩＬ、ＢＬｙＳ、４−ＩＢＢＬ、ＴＲＡＮＣＥおよびＲＡＮＫＬ（ＯＰＧＬ）、およびその他のＴＮＦＳＦメンバーであると認められる各種タンパク質が含まれる。
好ましい実施態様は、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群を利用するものであって、それらの変異型タンパク質は、野生型ＴＮＦＳＦメンバーの１つまたはそれ以上と相互作用して、受容体シグナル伝達を実質的に活性化する能力がない混合三量体を形成するものである。好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸変更がある変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群が、野生型ＴＮＦＳＦタンパク質と対比して使用される。
他の好ましい実施態様において、各修飾は、個別的にまたは組合せ（いかなる組合せも可能である）のいずれかでなされ得る。好ましい実施態様においては、各変異型ＴＮＦＳＦタンパク質中、少なくとも１つの、そして好ましくはより多くの位置が利用される。例えば、アミノ酸置換を組み合わせて二重変異型または三重点変異型を形成させる。
さらなる実施態様では、１つのＴＮＦＳＦ分子を、例えば、ＰＥＧ化（PEGylation）またはグリコシル化により、化学的に修飾することができる。
他の態様では、Ｎ−またはＣ−末端部分を削除する。さらなる実施態様では、１つのＴＮＦＳＦ分子を、環状に並べ替える（circularly permuted）ことができる。
別の態様では、該変異型タンパク質の２つまたはそれ以上の受容体相互作用ドメインが、リンカーペプチドまたは他の手段によって共有的に連結される。好ましくは、このリンカーペプチドは、少なくとも１つのそして約３０よりは多くないアミノ酸残基の配列であり、下記アミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒの１つまたはそれ以上を含むものである。
さらなる態様において、本発明は、非天然産生変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群をコードする組換え体核酸、発現ベクター類、および宿主細胞等を提供するものである。
別の態様において、本発明は、本発明の宿主細胞を、該核酸の発現に適した条件下に培養することを含む、非天然産生変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の製造方法を提供するものである。
さらなる態様では、本発明は、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質と医薬的坦体とを含有する医薬組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を患者に投与することを含む、ＴＮＦＳＦ関連疾患の処置方法を提供する。
図面の簡単な説明
図１は、ドミナントネガティブＴＮＦＳＦタンパク質が、それによって天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質の作用と拮抗できる総合的メカニズムを示す。各卵型は、ＴＮＦＳＦタンパク質単量体を表し、各三角形は受容体分子を表す。天然産生変異型ＴＮＦＳＦは、受容体群を活性な一つの複合体に組織化することによって典型的にシグナル伝達する。変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、それらの受容体接触ドメイン中で、受容体結合および／またはシグナル伝達が低減するように修飾されている（瘤および棒きれ）。変異型ＴＮＦＳＦ三量体を天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質三量体とともに培養すると、それらは４種の異なる三量体（それらのうち３種は不活性である）を形成して平衡する。十分な濃度のドミナントネガティブ変異型ＴＮＦＳＦは、本質的にすべての天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質を不活性なヘテロ三量体複合物にして隔離するであろう。この、および関連する、ＴＮＦＳＦタンパク質不活性化メカニズムを介して、ドミナントネガティブＴＮＦＳＦ変異型群は、それらの治療的効果を発揮する。
図２は、ＴＮＦＳＦリガンド単量体の構造的重複を示す。実験的に決定されたＣＤ４０Ｌ（１ＡＬＹ）、ＲＡＮＫＬ（１ＪＴＺ）、ＴＮＦＢ（１ＴＮＲ）、およびＴＲＡＩＬ（１ＤＧ６）の各構造は、ＴＮＦＡ（１ＴＮＦ）の構造の上に重ねて示してある。
図３は、ヒトＴＮＦＳＦメンバー群の多項配列アラインメント（ＭＳＡ）を示す。図３は、各個別配列の位置番号付けをも示す。ＴＮＦ−α（ＴＮＦＡ）およびＴＮＦＢ（ＬＴ−α）に対する番号付けは、現条約に基づいている。他の全ての配列に対する番号付けは、該タンパク質の完全長前駆体配列に基づいている。リガンド−受容体複合体構造が実験的に決められた配列に対しては、リガンド−受容体中間面にある残基を灰色にして強調してある。黒色にして強調してある中間面は、ＴＮＦスーパーファミリーリガンド類の７つの総受容体接触領域を定義するのに使用している。位置番号１から始まっている総括番号付けシステムも、参考のために、ＭＳＡの上部に含めてある。
図４Ａは、ＴＮＦ−アルファ変異型群を、野生型ＴＮＦ−アルファと予め交換して、２９３Ｔ細胞中のＴＮＦ−アルファ誘発性のＮＦｋＢ活性化を低減させていることを示すチャートである。図４Ｂは、野生型ＴＮＦ−アルファのＡ１４５／Ｙ８７ＨＴＮＦＳＦ変異型との交換が、ＨｅＬａ細胞中でのＮＦｋＢのＴＮＦＳＦ−誘発性核移行（nuclear translocation）を阻害することを示している、ＨｅＬａ細胞中でのＮＦｋＢの免疫的−位置特定写真である。図４Ｃは、ＴＮＦＳＦ変異型Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈが、ＮＦｋＢ−誘導ルシフェラーゼレポーターの、野生型ＴＮＦＳＦ−誘発性活性化を低減することを示す。
図５は、ＴＮＦ−アルファ変異型のアンタゴニスト活性を示すチャートである。
図６Ａ−Ｃは、各種ＴＮＦ−アルファ変異型による、カスパーゼ活性化についての用量応答曲線である。
図７Ａは、ドミナント−ネガティブ阻害性ＲＡＮＫＬ変異型ストラテジーモデルを示す。野生型ＲＡＮＫＬとのＲＡＮＫＬ変異型のホモ三量体およびヘテロ三量体は、ＲＡＮＫ受容体を活性化しない。ＲＡＮＫＬ変異型は、これらのヘテロ三量体種を形成させることを介して野生型ＲＡＮＫＬタンパク質を不活性にする、ドミナント−ネガティブなやり方で作用する。設計したＲＡＮＫＬタンパク質上の瘤および棒きれは、ＲＡＮＫＬの小型および大型の結合ドメインでの理論的にデザインされた、受容体結合と干渉する変異をシンボル的に示している。この野生型ＲＡＮＫＬを不活性化するメカニズムを経由して、本発明のドミナント−ネガティブ阻害性ＲＡＮＫＬ変異型群は、それらの治療的効果を発揮するのである。
図７Ｂは、コンピューター設計した阻害性ＲＡＮＫＬ変異型のリストを示す。これらの阻害性変異型は、ＲＡＮＫＬ溶解性変異型と組み合わせて、可溶性ヒトＲＡＮＫＬ変異型を製造することができる。
図７Ｃは、ＲＡＮＫＬ溶解性変異型Ｃ２２Ｓ／Ｉ２４７Ｅ媒介の破骨細胞発生が、ＯＰＧおよびＲＡＮＫ−Ｆｃによって拮抗されることを示す。各プロットは、BioSource社製ＲＡＮＫＬ商品が、Xencor社製溶解性変異型と同程度に拮抗されることを示している。ＢＳＡおよびＥｎｂｒｅｌ対照は、この拮抗がＯＰＧおよびＲＡＮＫ−Ｆｃと相互作用するＲＡＮＫＬに特異的なものであることを示している。ＲＡＮＫ−ＦｃおよびＯＰＧ対照は、それらが破骨細胞発生を媒介しないことを示している。
図７Ｄは、ＲＡＮＫＬ変異型拮抗スクリーンを示す。ＲＡＮＫＬ変異型の破骨細胞発生拮抗能力は、ＲＡＮＫＬ−Ｃ２２１Ｓ／Ｉ２４７ＥをＲＡＮＫＬ変異型と混合し、培養し、ＲＡＷ２６４.７細胞に加えたときのＴＲＡＰレベルをモニターすることによって評価した。ＴＲＡＰは、ＲＡＷ２６４.７細胞のＲＡＮＫ−媒介の破骨細胞発生進行につれて、それらの細胞から放出される。この実験は、このプロセスと拮抗するＲＡＮＫＬ変異型を同定した。図７Ｅ。１０倍過剰の変異型に対するＲＡＮＫＬ−Ｃ２２１Ｓ／Ｉ２４７Ｅの固定比率を用いるＲＡＮＫＬ変異型拮抗スクリーン。ＲＡＮＫＬ変異型の破骨細胞発生拮抗能力は、ＲＡＮＫＬ−Ｃ２２１Ｓ／Ｉ２４７ＥをＲＡＮＫＬ変異型と混合し、培養し、２ｌｏｇｓ以上に希釈し、そしてＲＡＷ２６４.７細胞に加えたときのＴＲＡＰレベルをモニターすることによって評価した。ＴＲＡＰは、ＲＡＷ２６４.７細胞のＲＡＮＫ−媒介の破骨細胞発生進行につれて、それらの細胞から放出される。この実験は、このプロセスと拮抗するＲＡＮＫＬ変異型を同定した。図７Ｆは、ＲＡＮＫＬ変異型拮抗スクリーンを示す。ＲＡＮＫＬ変異型の破骨細胞発生拮抗能力は、ＲＡＮＫＬ−Ｃ２２１Ｓ／Ｉ２４７ＥおよびＲＡＮＫＬ変異型をＲＡＷ２６４.７細胞に加えたとき、但し予培養はしない、のＴＲＡＰレベルをモニターすることによって評価した。ＴＲＡＰは、ＲＡＷ２６４.７細胞のＲＡＮＫ−媒介の破骨細胞発生進行につれて、それらの細胞から放出される。この実験は、このプロセスと拮抗するＲＡＮＫＬ変異型を同定した。図７Ｇは、ＲＡＮＫＬ拮抗変異型の要約を示す。これらの変異型は、ＲＡＮＫＬ−媒介の破骨細胞発生と拮抗することが示された。
発明の詳細な説明
本発明は、ドミナント−ネガティブな表現型または作用メカニズムを顕わす、新規なタンパク質群に関する。本発明のドミナント−ネガティブ治療ストラテジーは、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質に比して、受容体結合および／または活性化特性、および天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質をオリゴマー化する能力が低下している、新規なＴＮＦＳＦ変異型の設計に基づいている（図１）。言い換えれば、ＴＮＦＳＦ受容体群の活性化を（天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質に比して）低下する（好ましくは実質的に活性化しなくなる）に至るＴＮＦＳＦ変異型群は、少なくとも１つの天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質と交換し、それを低減したまたは不活性化したヘテロオリゴマーにして隔離し、それらのオリゴマーの生物学的活性、例えば、該受容体を結合および／または活性化する能力、を阻害する。
本発明のドミナント−ネガティブＴＮＦＳＦ変異型は、ＴＮＦＳＦタンパク質をキイ受容体接触ポイントにおいて、該受容体を結合するかまたは活性化するいずれかのリガンドの能力を崩壊させるように修飾することにより設計できる。これらのオリゴマー性ＴＮＦＳＦ変異型の天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質との交換および物理的相互作用により、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質の活性低下または脱活性が生じる。この目的をより効果的に達成するために、本発明のＴＮＦＳＦ変異型は、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質を優先的にヘテロ−オリゴマー化するように設計することもできる。あるいは、これらの変異型は、互いに相手と結合し、存在する変異型オリゴマーの量により；例えば、該変異型混合オリゴマーの結合に有利となる平衡により、どの天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質の作用をも「交換」し去るように設計することもできる。
従って、本発明は、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質と拮抗する、ＴＮＦＳＦタンパク質の細胞外ドメインの変異型を利用する方法および組成物を提供するものである。
「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、本明細書で使用するとき、タンパク質の細胞外において優勢的に存在するセグメントを意味し、それは該タンパク質の残りの部分から切り離しまたは単離すると一般に可溶性である。膜貫通タンパク質については、このセグメントは、膜貫通ドメインを介して該細胞につなぎ合わせられるか、またはタンパク分解性消化によって該細胞から放出させられ得る。あるいは、この細胞外ドメインは、該細胞から分泌されるとき、全タンパク質またはそのアミノ酸セグメント群を含み得る。一般に、ＴＮＦＳＦメンバーは、ＩＩ膜貫通タンパク質群（細胞外Ｃ末端）として発現される。未処理のこのタンパク質は、一般に、約１０ないし８０アミノ酸の不定型のシグナルアンカー／細胞内ドメインを含む。細胞外領域は、約１４０〜２１５アミノ酸の長さであり得る。ＴＮＦＳＦタンパク質の可溶性形態群は、ＴＮＦ−アルファ変換酵素群（ＴＡＣＥ）と称するマトリックスメタロプロテイナーゼによるシグナルプロペプチドのタンパク分解性開裂、または直接組換え方法により得られる。図３は、多数の異なるＴＮＦＳＦタンパク質由来の多数の細胞外ドメインを示す。当業者には理解されるように、これらのドメインは図３に示したものより短いかまたは長いものであり得る。
好ましい実施態様において、この細胞外ドメインは、可溶性であり、（好ましくは野生型単量体との）オリゴマー類を形成する、ＴＮＦＳＦタンパク質または変異型タンパク質として、機能的に定義することができる。
別に異なる開示をしない限り、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、細胞外ドメインまたはそれらの機能的均等物から構成される。即ち、本発明の変異型は、特に記載しない限り、膜貫通ドメインを含まない。本発明のある実施態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、ＴＮＦＳＦタンパク質の膜結合天然産生形態と拮抗し、そして他の実施態様では、本発明の変異型タンパク質は、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質の可溶性形態と拮抗するか、または両方である。
本発明のＴＮＦＳＦタンパク質は、変異型タンパク質である。本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質および核酸は、天然産生または野生型ＴＮＦＳＦと識別される。「天然産生」「野生型」「天然」または文法的に相当な語句は、自然に見出されるアミノ酸配列または核酸を意味し、対立遺伝子の変化を含む；即ち、通常は計画的に修飾されないアミノ酸配列または核酸配列である。従って、「非天然産生」または「合成」または「組換え」または文法的に相当な語句は、自然には見出されないアミノ酸配列または核酸配列をここでは意味する；即ち、通常は計画的に修飾されたアミノ酸配列または核酸配列である。本明細書における「組換え核酸」の用語は、一般的に、核酸をエンドヌクレアーゼによって操作して、自然には通常見出されない形状で、独自にインビトロで形成された核酸を意味する。従って、分離された直線状の変異型ＴＮＦＳＦ核酸、または通常では結合していないＤＮＡ分子に連結することによってインビトロで形成された発現ベクターは、共にこの発明の目的には組換え体であると考えられる。一旦組換え核酸が作成され宿主細胞または生物に再導入されたら、それは非組換え的に、即ち、インビトロの操作ではなく宿主細胞のインビボの細胞機構を使用して複製するであろうと理解される；しかしながら、そのような核酸は一旦組換え的に産生されれば、以後は非組換え的に複製しても、本発明のためにはなお組換え体と考えられる。
同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、即ち、上記したような組換え核酸の発現によって作成されたタンパク質である。組換えタンパク質は、少なくとも１つまたはそれ以上の特徴により、天然産生タンパク質と識別される。例えば、このタンパク質は、その野生型宿主中では通常随伴しているタンパク質群および化合物群の幾つかまたは全部から単離し、精製することができ、かくして実質的に純粋にすることができる。例えば、単離したタンパク質は、その天然形態においては、与えられた試料中で、通常好ましくは全タンパク質の少なくとも約０.５％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成して随伴している原料の少なくとも幾つかを随伴しない。実質的に純粋なタンパク質は、少なくとも全タンパク質重量の約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、特に好ましくは少なくとも約９０％を構成する。この定義は、異なる生物体または宿主細胞中、ある生物体からの変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の製造を含む。あるいは、このタンパク質は、誘導可能プロモーターまたは高発現プロモーターの使用により、通常みられるものより顕著に高い濃度においてつくることができ、そのようにして増加した濃度レベルにおいてタンパク質をつくることができる。さらに、本明細書で概説した本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質のすべてが、それらが、対応する野生型の内因性（endogeneous）配列と対比して、アミノ酸の置換、挿入および欠失、好ましくは置換を含むことから、天然には通常みられない形態にある。
代表的な天然産生のヒトＴＮＦＳＦのアミノ酸配列は、図３に示してある。特に断らない限り、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質および変異型ＴＮＦＳＦ核酸の位置番号は、すべて、これらの配列に基づいていることに留意さるべきである。即ち、当業者には明らかなように、ＴＮＦＳＦタンパク質および変異型ＴＮＦＳＦタンパク質のアラインメントは、以下に要説するように、標準的プログラムを用いて２つのタンパク質間の「等価」位置の同定によってなされ得る。従って、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群および核酸群は、非天然産生のもの；即ち天然には存在しないものである。
好ましい実施態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、非保存性修飾（例えば、置換）を含む。本明細書中では、「非保存性」修飾とは、野生型残基と変異残基とが、疎水性、電荷、サイズおよび形状を含む物理的特性の１つまたはそれ以上において、顕著に相違している修飾を意味する。例えば、極性残基から非極性残基への、またはその逆の修飾、陽性荷電残基から陰性荷電残基への、またはその逆の修飾、および大型残基から小型残基への、またはその逆の修飾は、非保存性修飾である。例えば、改変領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、例えば、アルファ−ヘリカル（helical）またはベータ−シート構造；標的部位における分子の電荷または疎水性；または側鎖の嵩：に一層顕著に影響する置換を行い得る。一般にポリペプチドの特性に最も大きな変化を生じると期待される置換は、以下のようなものである；（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルに（または、によって）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンが、何か他の残基に（または、によって）置換される；（ｃ）電気的に陽性な側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジルが、電気的に陰性な側鎖を有する残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルに（または、によって）置換される；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有しないもの、例えば、グリシンに（または、によって）置換される、ものなどである。好ましい実施態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、少なくとも１つの非保存性修飾を有する。
保存性修飾は、総括的に以下に示すようなものである。しかしながら、当技術分野で知られているように、その他にも保存性と考えられる置換はあり得る:
Figure 2005530482
タンパク質の修飾は、好ましくは置換であり、それらにはＴＮＦＳＦメンバーの表面、境界およびコア領域へのものが含まれる。例えば、米国特許第６,１８８,９６５号および第６,２６９,３１２号参照（参照して本明細書の一部とする）。別の好ましい態様では、殊に（他の単量体または受容体のいずれかに対する）結合特性の改変が所望である場合、修飾は表面残基に対してなされ得る。
変異型タンパク質は、例えば、以前に米国特許第６,１８８,９６５号；第６,２９６,３１２号；第６,４０３,３１２号；Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.ｓ０９／４１９,３５１,０９／７８２,００４,０９／９２７,７９０,０９／８７７,６９５,および０９／８７７,６９５に記載されているＰＤＡＴＭシステム；アラニンスキャン法（米国特許第５,５０６,１０７号参照）、遺伝子シャフリング（gene shuffling）（ＷＯ０１／２５２７７）、部位飽和変異発生法、平均場（mean field）、配列ホモロジー、または当業者に知られている、点変異部位および型の選択を導く他の方法を用いることによって発生させることができる。
好ましい態様では、配列のおよび／または構造上のアラインメントを、本発明の変異型タンパク質を発生させるために使用することができる。当技術分野で知られているように、多数の; 例えば、Smith-Watermanのサーチ、Needleman-Wunsch、Double Affine Smith-Watermanのフレームサーチ、Gribskov/GCGのプロフィルサーチ、Gribskov/GCGのプロフィルスキャン、プロフィルフレームサーチ、Bucher 総括化プロフィル、Hidden Markovのモデル、Hframe、Double Frame、Blast、Psi-Blast、Clustal、およびGeneWise を含む配列−ベースのアラインメントプログラムがある。また、構造上のアラインメントプログラムには広範な種類のものが知られている。例えば、NCBI由来のVAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/Structure/VAST/vast.shtml); SSAP (Orengo および Taylor, Methods Enzymol 266(617-635 (1996)) SARF2 (Alexandrov, Protein Eng 9(9):727-732. (1996)) CE (Shindyalov and Bourne, Protein Eng 11(9):739-747. (1998)); (Orengo et al., Structure 5(8):1093-108 (1997); Dali (Holm et al., Nucleic Acid Res. 26(1):316-9 (1998))参照、これらは全て参照して本明細書の一部とする。
本発明の方法は、個々のドメインがオリゴマー化して活性複合体を形成する、ＴＮＦＳＦのどの認定メンバーにも、または関連（例えば、タンパク質のｃ１ｑファミリー）システムにも適用することができる。これらのドメインは、多数の方法で修飾して受容体結合および／または活性化を欠失または低下させることができる。加えて、各修飾ドメインは、少なくとも１つの別の修飾ドメインと共有的にカップル化させ、拮抗活性が増強したドミナントネガティブタンパク質群を発生させることができる。
好ましい態様では、これらのタンパク質は、ＴＮＦＳＦ (Oren, D.A., et al., (2002) Nature Structural Biology, 9, 288-292; Bodmer, J-L., et al., (2002) TIBS, 27, 19-26; Locksley, R.M., et al., (2001) Cell, 104, 487-501; WO 01/25277参照; これらは全て参照して明示的に本明細書の一部とする）に属する。従って、「ＴＮＦＳＦ」タンパク質の定義には、関心のあるＴＮＦＳＦメンバーが含まれる、がそれらに限定はされない。関心のあるＴＮＦＳＦメンバーにはＴＮＦに対するリガンド類；ＲＡＮＫＬ（ＵＳ５,８４３,６７８、参照して本明細書の一部とする）としても知られているオステオプロテゲリン［osteoprotegerin（ＯＰＧ）］、ＣＤ４０リガンド、ＢＬｙＳ、等および図３に示したその他のものが含まれる。しかしながら、幾つかの実施態様では、このＴＮＦＳＦは特異的にＴＮＦ−αタンパク質を除外する。
本発明の組成物および方法は、例えば、タンパク質のＣ１ｑ−関連ファミリーを含むＴＮＦＳＦの構造的同族体、それらの例には３０ｋＤａの脂肪細胞補体（adipocyte complement）−関連タンパク質（ＡＣＲＰ３０）およびそのヒト−相同分子種（ortholog）ＡＰＭ−１が含まれる、にも適用できる。ＡＣＲＰ３０は、タンパク質のＣ１ｑ−関連ファミリーに属し、コラーゲンドメインを含むかまたは含まないいずれかの、少なくとも２３メンバーを含む。コラーゲン性ドメインを含むものには、ＡＣＲＰ３０、Ｃ１ｑＡ、Ｂ、およびＣ鎖、しまりす中の冬眠−関連タンパク質（ＨＰ−２０、２５および２７）、ＣＯＲＳ２６、およびエラスチン微小原線維（Elastin microfibril）中間面−局在タンパク質（ＥＭＩＬＩＮ）がある。コラーゲンドメインを欠くものには、マルチメリン（multimerin）、およびセレブリン（cerebellins）１および３の前駆体が含まれる。これらのタンパク質の多く−それらも三量体または三量体の多量体を形成する−は、発生に、さらには免疫学的および物理学的ホメオスタシス（homeostasis）に関与してきている。
本明細書中で概説しているように、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、多様なメカニズムにより、野生型タンパク質に対するアンタゴニストとして役立っている。好ましい態様では、本発明の変異型タンパク質群は、内因性野生型ＴＮＦＳＦタンパク質群とヘテロオリゴマー群を形成し、それから対応する受容体群と結合する（しかし活性化はしない）。即ち、図１に図解しているように、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、好ましくは修飾して受容体分子との相互作用を崩壊させる。好ましくは、これらの修飾は、変異型のドメインの、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質と相互作用し、それを隔離する能力には実質的に影響しないものである。好ましい態様では、これらの修飾は、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質類の、１つまたはそれ以上の天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質とヘテロオリゴマー化する能力を増強する別の修飾と組み合わせることができる。特に好ましくは、受容体活性化およびオリゴマー化に影響する修飾は、以下にさらに概説するように、薬理動態特性を改良する化学的修飾（例えば、グリコシル化、ＰＥＧ化、融合等）とも組合せられる。
更に好ましくは、本発明は、ＴＮＦＳＦアンタゴニスト活性を有する、新規なタンパク質類および核酸類にも関する。従って、「アンタゴニスト」活性を有する変異型タンパク質は、以下にさらに定義するように、最後には受容体活性化を欠く結果となる。これは、変異型単量体類が野生型単量体類と相互作用して野生型単量体類と「拮抗する」、例えば、そのようにして野生型単量体類が受容体類と結合および／または活性化する能力がなくなる、ことによる。総括的に言えば、これらの混合オリゴマー類は少なくとも１つの変異型単量体を含み、少なくとも１つの野生型（例えば、内因性）の単量体は受容体の活性化を阻害する。
好ましい態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質群は、ドミナントネガティブタンパク質である。「ドミナントネガティブ」表現型または「作用メカニズム」とは、本明細書では、少なくとも１つの所望の受容体に対する親和性が低下しており、さらに／またはシグナル伝達が改変されており、そのようにして該タンパク質が他の受容体相互作用ドメインとオリゴマー化する能力を保持している（しかし該単量体は実質的に所望の受容体との相互作用および／またはシグナル伝達はできない）変異型ＴＮＦＳＦ単量体を含むタンパク質を意味する（図１参照）。オリゴマー性リガンド複合体の組成、即ちヘテロ三量体についての２変異型：１天然型、または１変異型：２天然型、によって、リガンド媒介受容体活性化の阻害される程度が変化する（図１参照）。言い換えれば、受容体の活性化は、２変異型：１天然型を含む複合体では完全に阻害されるが、他の比率の変異型：天然型を含む複合体では活性化は低下する。あるいは、受容体活性化は、完全には阻害されず、ヘテロ二量体の組成および対応する作用モードに基づいて変化する程度に低下するとも言える。Menart, V., et al., (2000) Eur J Physiol., 439, R113-R115; U.S. Patent Pub. Nos. 2002/0039588, 2002/0040132, 2002/0037286, 2002/0037280も参照;それらは全て参照して本明細書の一部とする。変異型ＴＮＦＳＦの天然産生ＴＮＦＳＦに対する相対的濃度の関数とする、ヘテロ三量体アセンブリのモンテカルロ（Monte carlo）シミュレーションは、１０倍過剰の変異型ＴＮＦＳＦ単量体を加えたとき、概して、天然産生ＴＮＦＳＦ単量体の９９％以上が隔離されたことを示している。
当業者には理解されるように、本発明のドミナントネガティブ変異型を創製するための２種の主たるアプローチには：（１）個々の受容体相互作用ドメインを修飾して受容体結合および／またはシグナル伝達を低減または欠失させること；および、（２）修飾した受容体相互作用ドメイン群を共有カップリングさせて受容体活性化の阻害を増強させること；が含まれている。
好ましい態様では、個々のＴＮＦＳＦタンパク質群は、それらの受容体接触ドメイン内で修飾して受容体結合および／またはシグナル伝達を低減または欠失させる。例えば、アミノ酸置換は受容体接触ドメイン中での受容体結合を低減または欠失させる修飾として発生させることができる。好ましい態様では、受容体接触ドメイン群中の少なくとも１つの非−保存性変異型を、受容体相互作用を崩壊させるためにつくることができる。図4Aおよび4B、並びに５,５０６,１０７；Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.ｓ０９／７９８,７８９；０９／９８１,２８９；１０／２６２,６３０；６０／３７４,０３５；および名称が「NOVEL VARIANTS OF RANKL PROTEIN」である同日提出の出願を参照、それらは全て参照して本明細書の一部とする。
受容体結合および／またはシグナル伝達に影響する好ましい修飾（例えば、置換、挿入、欠失等）は、上記したように、構造的アラインメント法、配列アラインメント法等を含む多様な技術を使用して確認することができる。多くの場合、ＴＮＦＳＦリガンド中で受容体と相互作用するアミノ酸群は、ＴＮＦＳＦリガンド−受容体複合体の三次元構造から直接特定できる。あるいは、関連タンパク質のリガンド−受容体複合体の分析によって、均等な情報を引き出すことができる。例えば、このＴＮＦＳＦ内で、ＴＮＦファミリーのメンバー群は、その構造が実験的に決定されている、あるＴＮＦＳＦタンパク質と構造的にアラインすることができる（例えば、Oren, D.A., et al., (2002) Nature Structural Biology, 9, 288-292参照)。あるいは、もし構造的に残基群をアラインすることが不可能ならば、配列アラインメントを使用することができる。
当技術分野では知られているように、配列アラインメント方法論には、使用可能な多数のものがある。例えば、配列相同性に基づくアラインメント法を使用して、各ＴＮＦＳＦメンバーの配列アラインメントを創り上げることができる(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3): 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)、両文献とも参照して一部とする)。
好ましい態様では、図３で強調しているように、ＴＮＦスーパーファミリーの各メンバーのアミノ酸配列を、多項配列アラインメント（ＭＳＡ）中にアラインすることができる。図３で示すアラインメントは、当初Ｐｆａｍデータベースから誘導し、次いでさらに、ＴＮＦＡ、ＴＮＦＢ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、およびＢｌｙＳの各結晶構造の（ＣＥを使用する）構造的アラインメントを駆使したものである。このＭＳＡは、それら以外の認識された各ＴＮＦＳＦメンバーおよび他の構造的相同体並びにファミリーにも使用でき、それらについての構造的既知情報を拡大させることができる。異なるＴＮＦＳＦメンバー間の構造的相同性が高度であるため、このＭＳＡを、アラインメント内での多様な位置における修飾の効果についての信頼できる予言者として使用することができる。このため、図３で示したＴＮＦＡ配列および番号付けを、他の全てのＴＮＦＳＦタンパク質配列についてのＭＳＡ参照ポイントとして使用することができる。本明細書では、「ＴＮＦＡアミノ酸Ｘに対応するＴＮＦＳＦタンパク質の位置」への参照は、その他の認識されているＴＮＦＳＦメンバーおよび他の構造的相同体並びにファミリーにおける均等位置のコレクションへの参照を意味する。例えば、ＴＮＦＡアミノ酸Ｌ７５に対応するＴＮＦＳＦタンパク質の各位置は、下記のＴＮＦＳＦタンパク質における下記アミノ酸の各位置：ＴＮＦＡ：Ｌ７５、ＴＮＦＢ：Ｙ９６、ＦＡＳＬ：Ｐ２０６、ＬＩＧＨＴ：Ｔ１６１、ＶＥＧＩ：Ｓ９９、リンホトキシンベータ：Ｔ１５８、ＡＰＲＩＬ：Ｔ１７７、ＢＬｙＳ：Ａ２０７、ＣＤ４０Ｌ：Ｐ１８８、ＲＡＮＫＬ：Ｑ２３７、ＴＲＡＩＬ：Ｑ２０５、ＣＤ２７Ｌ：Ｓ１２１、４−１ＢＢＬ：Ｓ１６２、ＴＷＥＡＫ：Ｙ１７６、ＣＤ３０Ｌ：Ｄ１５７、ＯＸ４０Ｌ：Ｎ１１４、ＡＩＴＲＬ：Ｎ１０６、および、ＴＮＦＳＦメンバーと認識された他のタンパク質中での各均等位置に対応する。
例えば、ＴＮＦＢとｐ５５（Ｒ１）受容体との複合体の構造分析は、ＴＮＦＢ中のアミノ酸Ｙ１０８が受容体と直接接触していることを示している。ＴＲＡＩＬ由来の同族性残基Ｙ２１６もまたＤＲ５受容体と直接接触している。このＭＳＡは、このようにして、ＴＮＦＡ由来の同族性残基Ｉ９７もまた受容体と直接接触していると予言する。この予言と一致して、ＴＮＦＡ−Ｉ９７のＲまたはＴへの変異は、受容体−結合親和性および生物学的シグナル伝達活性の顕著な損失を来す。この接触位置についての分析は、このファミリーの全メンバーに拡張でき、下記各位置が、受容体相互作用にとって重要であると予言する：ＦＡＳＬ：Ｙ２１８、ＬＩＧＨＴ：Ｙ１７３、ＶＥＧＩ：Ｙ１１１、ＴＮＦＣ：Ｙ１７０、ＡＰＲＩＬ：Ｒ１８９、ＢｌｙＳ：Ｖ２１９、ＣＤ４０Ｌ：Ｒ２００、ＲＡＮＫＬ：Ｉ２４９、ＣＤ２７Ｌ：Ｃ１３３、４−１ＢＢＬ：Ａ１７４、ＴＷＥＡＫ：Ａ１８８、ＣＤ３０Ｌ：Ｋ１６９、ＯＸ４０Ｌ：Ｌ１２６、およびＡＩＴＲＬ：Ｙ１１８。この種の分析は、これらのリガンドの全ての受容体接触領域について実施できる。
図３は、既知構造および変異データの分析に基づいて、７規範受容体接触領域を強調している。本発明の好ましい態様では、図３で受容体接触領域として強調している７領域のそれぞれを、各ＴＮＦＳＦメンバーの変異型の創製のための各修飾部位を決めるために使用する。別の好ましい態様では、そのような修飾は受容体親和性および／またはシグナル伝達能力を低減する。別の好ましい態様では、これらの修飾は、各タンパク質の天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質（それらは各ファミリーメンバーの対応する野生型配列を含むが必ずしもそれらに限定されない）とのオリゴマー化能力をも保存する。
図３に示したアラインメントシステム、または、上述したその他のアラインメントプログラムを使用すれば、すべてのアラインメントプログラムの番号付けシステムを参照ポイントとして使用することができ、そしてＴＮＦＡタンパク質の適合する位置を、他のＴＮＦＳＦメンバーと認識されるメンバーまたは構造的相同体並びにファミリー中の均等位置と相関させることができる。
本発明の目的のために、修飾しようとするＴＮＦＳＦタンパク質のこれらの領域は、好ましくは（しかしそれらが必須ではない）大型ドメイン、小型ドメイン、ＤＥループ、および三量体中間面からなる群から選択される。これらの大型ドメイン、小型ドメイン、およびＤＥループは、３つの離れた受容体接触ドメインであり、それぞれ当該タンパク質の数種の非−接触線状セグメント（即ち、上述した７規範受容体接触領域）から成っている。これらのドメインは、リンホトキシン−アルファおよびＴＲＡＩＬ、即ち、それらの構造（それぞれＰＤＢエントリー１ＴＮＲおよび１Ｄ０Ｇ）がそれらの同族（cognate）受容体群との複合体中で決定されている２種のＴＮＦＳＦタンパク質、の各受容体相互作用ドメインとクリスタログラフィー法を使用して対比することによってＴＮＦＳＦタンパク質−およびＭＳＡ−中で同定される。この三量体中間面は、個々のＴＮＦＳＦタンパク質単量体間の相互作用を媒介する。三量体化位置は、適切なＴＮＦＳＦタンパク質（例えば、ＴＮＦＡ、ＴＮＦＢ、ＢＬｙＳ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０Ｌ、またはＲＡＮＫＬについての）の結晶構造から直接に、または、他方のＴＮＦＳＦタンパク質との相同性の、いずれかにより同定できる。好ましい態様では、あるＴＮＦＳＦタンパク質単量体由来の、隣り合う単量体からの距離が５オングストローム以内にある原子群を含有する位置群を、三量体中間面位置と定義する。修飾は、これらの領域の１つの中で単独で、またはこれらと他の領域とを任意に組合せて行われる。
ＴＮＦＳＦタンパク質中で修飾する大型ドメインの好ましい位置群には、ＴＮＦＡの対応する２８−３４、６３−６９、１１２−１１５、および１３７−１４７位置群が含まれるが、それらに限定はされない。小型ドメインについては、修飾すべき好ましい位置群には、ＴＮＦＡの対応する７２−７９および９５−９８位置群が含まれるが、それらに限定はされない。ＤＥループについては、修飾すべき好ましい位置群には、ＴＮＦＡの対応する８４−８９位置群が含まれるが、それらに限定はされない。これらの修飾すべき三量体中間面位置群には、ＴＮＦＡの対応する１１、１３、１５、３４、３６、５３−５５、５７、５９、６１、６３、７２、７３、７５、７７、１１９、８７、９１−９９、１０２−１０４、１０９、１１２−１２５、１４７−１４９、１５１、および１５５−１５７位置群が含まれるが、それらに限定はされない。特に好ましい修飾すべき三量体中間面位置群は、ＴＮＦＡの対応する５７、３４、および９１位置群である。例えば、ＴＮＦＡの対応する３４および９１位置におけるアミノ酸ＸおよびＹは、同様に荷電したアミノ酸群（例えば、Ｘ３４Ｅ＋Ｙ９１Ｅ、Ｘ３４Ｋ＋Ｙ９１Ｒ、等）と同時に置き換えて、変異型−天然中間面の安定性を攪乱させることなく、変異型単量体−単量体中間面において静電反発力を発生させることができる。
好ましい態様では、修飾の部位およびタイプの選択は、当該アラインメントの他の配列群を参照してなされる。従って、好ましい態様では、配列Ａからの当初アミノ酸Ｘを配列Ｂからのアミノ酸Ｙに変異させ、そのようにしてＹはアミノ酸Ｘに関連して非保存性置換とする。例えば、ＴＮＦＡ由来のアミノ酸Ｙ８７を、ＡＰＲＩＬ由来の非保存性Ｒ１８９とアラインさせる。事実、以前の研究で示されているように、ＴＮＦＡにおけるＹ８７Ｒ置換は、ＴＮＦＡによる受容体結合およびシグナル伝達において顕著な減少を導く。別の実施態様では、より保存性の変異も利用され得る。別の実施態様では、野生型残基をアラニンに変異させる。
好ましい態様では、受容体接触および／または三量体化中間面における有用な修飾が、タンパク質設計、または、ＰＤＡＴＭ技法（ＵＳ６,１８８,９６５；６,２６９,３１２；６,４０３,３１２；ＵＳＳＮ０９／７１４,３５７；０９／８１２,０３４；０９／８２７,９６０；０９／８３７,８８６；０９／７８２,００４および１０／２１８,１０２参照：すべて参照して本明細書の一部とする）のようなアルゴリズムモデリングを用いて選択される。当技術分野で知られているように、このクラスのアルゴリズムでは、一般に、原子−レベル、または、アミノ酸−レベルのスコアリング関数を使用して、あるタンパク質の全体的な第３級および第４級構造とのアミノ酸配列の適合性（compatibility）を評価する。従って、このクラスのアルゴリズムを使用して、受容体−結合の崩壊（それは、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の適切に折り畳みそしてそれら自身とまたはそれらの天然産生標的とオリゴマー化する能力を実質的に攪乱しない）を選択することができる。これらの技法では、典型的に、標的タンパク質の高−解像度の構造情報入力を使用する。好ましい態様では、適切なＴＮＦＳＦタンパク質の実験的に決定された構造を入力として使用する。別の実施態様では、ＭＳＡを使用して、ＴＮＦＳＦメンバー（その三次元構造がクリスタログラフィーまたは関連方法を使用して決定されているファミリーのサブセットに基づいて）に対して原子−レベルの相同性モデルの構築をガイドすることができる。ＴＮＦＳＦに対しては、高−解像度構造が、ＴＮＦＡ、ＴＮＦＢ（ＬＴ−アルファ）、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０Ｌ、およびＢＬｙＳについて決定されている。これらの相同性モデルは、低減した受容体結合および／またはシグナル伝達および／またはドミナント−ネガティブ活性を有する変異型ＴＮＦスーパーファミリーリガンド類の設計をガイドするための構造的足場として、代わる代わる使用することができる。
別の実施態様では、タンパク質設計アルゴリズムを、個々の受容体相互作用ドメインにおいて、受容体相互作用ドメインと受容体との間に立体的反発力を創り出す変異を発生させるために使用することができる。発生できる他の変異には、静電反発力を創り出す変異、および不都合なアミノ酸群の脱溶媒和を創り出す変異が含まれるが、それらに限定はされない。
好ましい態様では、多数の受容体相互作用および／または三量体化ドメインにおける置換、挿入、欠失またはその他の修飾を組み合わせてもよい。それらの組合せは、それらがドミナント−ネガティブ活性に相加的または相乗的効果を奏する点でしばしば有利である。それらの例としては、大型および／または小型ドメイン（例えば、ＭＳＡの９４および１１２位置）、大型ドメインおよびＤＥループ（例えば、ＭＳＡの９５および１２４位置）、大型ドメインおよび三量体化ドメイン（例えば、ＭＳＡの９４および８３位置）におけるアミノ酸群の同時的置換、または単独ドメイン内での多数置換があげられるが、それらに限定されない。これら以外の例としては、各置換のすべての組合せが含まれる。
好ましい態様では、定義した受容体接触領域が、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換のための部位、または化学的修飾部位導入のための部位を構成する。好ましい態様では、欠失または挿入は、ＭＳＡに従って行う。例えば、ＭＳＡの調査により、ＢＬｙＳアミノ酸２２０−２２３が多くの別のファミリーメンバーと関連する４−残基挿入を構成していることを明らかにしている。この領域は、多くのＴＮＦリガンド−受容体システム中で受容体と直接相互作用することがよく知られているタンパク質のＤＥループ領域中に存在する。従って、これら４つの残基の欠失は、他方ではＢＬｙＳタンパク質の構造的集積は維持すると予測されるものの、ＢＬｙＳのその受容体に対する親和性を低減するものと期待される。
さらなる実施態様では、上述の各変異型は、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドに対する他の修飾と組合せることができる。これらには、さらなるアミノ酸置換、挿入、または欠失、および／または化学的（例えば、ＰＥＧ化）または、グリコシル化のような、翻訳後修飾が含まれるが、それらに限定されない（ＷＯ９９／４５０２６；ＷＯ０１／４９８３０；ＷＯ０１／４９８３０；ＷＯ０２／０２５９７；ＷＯ０１／５８４９３；ＷＯ０１／５１５１０,Ｕ.Ｓ.ＰａｔｅｎｔＮｏｓ.４,００２,５３１；５,１８３,５５０；５,０８９,２６１；６,１５３,２６５；５,２６４,２０９；５,３８３,６５７；５,７６６,８９７；５,９８６,０６８；４,２８０,９５３；５,０８９,２６１；５９９０２３７；６４６１８０２；６４９５６５９；６４４８３６９；６４３７０２５；５９００４６１；６４１３５０７；５４４６０９０；５６７２６６２；５９１９４５５；６１１３９０６；５９８５２３６；６２１４９６６；６２５８３５１；５９３２４６２；ＥＰ０７８６２５７；ＥＰ０９０２０８５；ＥＰ１０６４９５１；ＥＰ０５４４８２６；ＥＰ０４２４４０５；ＥＰ０４００４７２；ＥＰ０３１１５８９；；Veronese, F.M. (2001) Biomaterials, 22: 405-471；参照。これらは全て参照して本明細書の一部とする）。幾つかの実施態様、例えば、疾患の動物モデル作成においては、他の配列の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を含む融合タンパク質を実施できる。例えば、標識（例えば、自動蛍光（autofluorescent）タンパク質、サバイバルおよび／または選択タンパク質）、安定性および／または精製配列、トキシン類、当該スーパーファミリーの他のメンバー由来の変異型タンパク質（例えば、「二重特異性（bi-specific）抗体群」の創製と類似する)を含む融合パートナー、または他の実用タンパク質配列を使用して実施できる。さらなる融合パートナーは、以下に記述するものである。ある場合には、これらの融合パートナーはタンパク質ではない。
好ましい態様では、別のアミノ酸置換をして、変異型リガンドとその内部対応物間のヘテロ−オリゴマー相互作用を最適化、および／または変異型単独の場合のオリゴマー性状態の脱安定化をする。例えば、あるＴＮＦＡ内Ｌ５７Ｆ変異は、変異型ホモ三量体の形成には不都合であるものの、変異型：天然型ヘテロ三量体の形成促進のためには設計されつづけてきている。そのような修飾は、変異型単量体と天然型単量体との交換を促進して、作用のドミナント−ネガティブメカニズムを促進するのに有用である。
当業者には理解されるであろうが、シグナル伝達能力が低減した変異型ＴＮＦスーパーファミリーリガンド類は、多様な方法により見出すことができる。それらの方法には、指向性進化（directed evolution：例えば、エラープローン（error-prone）ＰＣＲ、ＤＮＡシャフリング、等）、単一−部位飽和変異法、およびアラニン−スキャン変異法、が含まれるが、それらに限定はされない。さらに、これらのまたは他の方法の使用が、本明細書で記載した７規範接触領域外に存在する置換、挿入、または欠失−それらは受容体結合および／またはシグナル伝達活性を低減する−の発見を可能とする。
他の実施態様では、コイルドコイルモチーフを二量体組立を助けるために使用する(Dahiyat et al., Protein Science 6:1333-7 (1997) およびＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／５０２,９８４；参照。いずれもそれらの全部を参照して本明細書の一部とする）。らせん化−コイルモチーフは、下記配列：ＧＣＮ４の構造に基づくＲＭＥＫＬＥＱＫＶＫＥＬＬＲＫＮＥＲＬＥＥＥＶＥＲＬＫＱＬＶＧＥＲ；ＡＡＬＥＳＥＶＳＡＬＥＳＥＶＡＳＬＥＳＥＶＡＡＬ、およびＬＡＡＶＫＳＫＬＳＡＶＫＳＫＬＡＳＶＫＳＫＬＡＡ、前記定義のらせん化−コイルロイシンジッパー領域（Martin et al., EMBO J. 13(22): 5303-5309 (1994)参照、参照して本明細書の一部とする）のひとつを含むが、それらに限定はされない。例えば、タンパク質含有ロイシンジッパー由来の、他のコイルドコイル配列も、当技術分野で知られており、本発明で使用する。（例えば、Myszka et al., Biochem. 33:2362-2373 (1994)参照、参照して本明細書の一部とする）。
同様に、分子動力学計算を使用して、変異型配列スコアを個々に計算し、リストを作成することによって、コンピューター的に配列をスクリーンすることができる。
好ましい態様では、各残基ペアポテンシャルを使用して、コンピューター的スクリーニング中に各配列をスコアすることができる(Miyazawa et al., Macromolecules 18(3): 534-552 (1985), 参照、参照して明示的に本明細書の一部とする）。
当業者には明らかであるが、さらなるＴＮＦＳＦタンパク質を同定し、図Ｘで強調しているＭＳＡに加えることができる。これらの配列の供給源は広範に変化し、１またはそれ以上の既知データベース由来の配列から取り上げた配列［GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))を含むが、それに限定されない］を含み得る。
加えて、これらのデータベース由来の配列を、接触分析または遺伝子予測に附することができる;Wheeler, et al., Nucleic Acids Res 28(1):10-14. (2000)、およびBurge and Karlin, J Mol Biol 268(1):78-94. (1997)参照。
当技術分野では知られているように、配列アラインメントには多数の使用可能な方法論がある。例えば、配列相同性に基づくアラインメント法（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3): 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)参照）；いずれも参照して本明細書の一部とする）を使用して、各ＴＮＦＳＦメンバーの配列アラインメントを創製することができる。これらの配列アラインメントは、それから検討して、観察した配列改変を決定する。これらの配列改変は表示し、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を決定する。
配列に基づくアラインメントは、多様に使用することができる。例えば、当技術分野で知られているように、多数の関連タンパク質を整列させ、「可変性」および「保存性」残基を決定することができる；即ち、当該ファミリーメンバー間の同一性を改変するかまたは保持する各残基を特定できる。これらの結果は、それらの特性を実験的にプローブすることができる、変異型タンパク質ライブラリーの設計をガイドするために使用することができる。例えば、ファミリーメンバー間で高度に可変性（即ち、低保存性）である位置を、全アミノ酸またはそのサブセットのいずれかを使用して、ランダム化できる。あるいは配列改変を表示し、それらから適切な置換群を決定することができる。あるいは、容認された配列改変を使用して、コンピューター的モデリングおよび／またはスクリーニング過程中に、各位置で考慮されるアミノ酸群を決定することができる。他の改変は、配列アラインメントに際して起こるアミノ酸群についてのスコアを偏らせることであり、それによって、コンピューター的スクリーニングの間に見出した、しかしなお他のアミノ酸群考慮の余地がある、確からしさを増加する。この偏りは、結果として、目指した変異型ＴＮＦＳＦタンパク質のライブラリーを生じるであろうが、しかしアラインメント中に見出されなかったアミノ酸類を、考慮することを排除しない。
本明細書中で使用するとき、変異型ＴＮＦＳＦまたはＴＮＦＳＦタンパク質タンパク質には、ＴＮＦＳＦ単量体群、二量体群または三量体群が含まれ、野生−型タンパク質を含む三量体群中に組み込む場合に前二者が好ましい。
これらのＴＮＦＳＦタンパク質群は、いかなる種類の生物体由来のものでもよいが、ＴＮＦＳＦタンパク質群を有する哺乳動物由来のものが特に好ましい。好適な哺乳動物には、齧歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモット等）、霊長類、家畜動物類（羊、山羊、豚、牛、馬、等を含む）；特に好ましい態様ではヒト由来のもの（その配列を図６Ｂに示す）が含まれるが、それらに限定されない。当業者には明らかであるが、ヒト以外の哺乳動物のＴＮＦＳＦタンパク質に基づくＴＮＦＳＦタンパク質を、ヒトの疾患の動物モデルで使用することができる。
本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質のアンタゴニストである。本明細書で、「天然産生ＴＮＦＳＦのアンタゴニスト」とは、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質が、該アンタゴニストが存在しない場合のＴＮＦＳＦの天然産生メンバーによる活性化と対比して、受容体シグナル伝達の活性化を阻害または著しく低減させることを意味する。
好ましい態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、その対応する野生−型ＴＮＦＳＦタンパク質(即ち、それから変異型が誘導された、内因性天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質)と物理的に相互作用し、そのようにして、変異型ＴＮＦＳＦと野生−型ＴＮＦＳＦタンパク質とを含む複合体が、ＴＮＦＳＦ受容体の活性化不能となるようにする。好ましくは、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、野生−型ＴＮＦＳＦタンパク質と優先的に相互作用して、野生−型ＴＮＦＳＦタンパク質との混合三量体を形成し、そのようにして、受容体結合が起こらなくなるように、および／またはＴＮＦＳＦシグナル伝達が開始しないようにする（図１）。
別の実施態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、非−対応野生−型タンパク質（即ち、それから変異型が誘導されたタンパク質と異なる天然産生タンパク質）と物理的に相互作用する。例えば、ＡＰＲＩＬが、それ自身でホモ三量体を形成すること、およびＢＬｙＳとヘテロ三量体を形成することが知られていることから、ドミナント−ネガティブ変異型ＡＰＲＩＬタンパク質は、天然産生ＡＰＲＩＬまたはＢＬｙＳタンパク質の阻害に使用できる。同様に、リンホトキシンαおよびβが、互いと活性なヘテロ三量体を形成することから、本発明のドミナント−ネガティブ変異型ＬＴ−αタンパク質を使用して、ＬＴ−βを不活性化することができる。
本明細書で、混合三量体とは、天然産生のおよび変異型のＴＮＦＳＦタンパク質の各単量体が、相互作用して三量体ＴＮＦＳＦを形成していることを意味する（図１）。混合三量体は、１変異型ＴＮＦＳＦタンパク質：２天然型ＴＮＦＳＦタンパク質、２変異型ＴＮＦＳＦタンパク質：１天然型ＴＮＦＳＦタンパク質を含み得る。ある実施態様では、三量体は、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質のみを含んで形成することもできる（図１Ｂ）。
好ましい態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦアンタゴニストタンパク質は、対応する野生−型ＴＮＦＳＦタンパク質に対して高度に特異性のアンタゴニストである。しかしながら、別の実施態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦ拮抗性タンパク質は、１種以上の野生−型ＴＮＦＳＦタンパク質に対して特異性である。例えば、変異型ＡＰＲＩＬタンパク質類は、野生−型ＡＰＲＩＬタンパク質のみに、野生−型ＡＰＲＩＬおよびＢＬｙＳに、野生−型ＢＬｙＳのみに、特異性のアンタゴニストであり得る。本発明の変異型ＴＮＦＳＦアンタゴニストタンパク質のさらなる特徴には、改善された安定性、薬物動態、および天然産生ＴＮＦＳＦに対する高度な親和性が含まれる。天然産生ＴＮＦＳＦに対して高度な親和性を有する変異型は、上述したようにＴＮＦＳＦ拮抗性を示す変異型から発生させ得る。
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は天然ＴＮＦＳＦと対比して生物学的活性の減少を示す。限定でないが、受容体への結合の減少、活性化の減少および／または細胞毒活性または有害な副作用を導き得る他の望まれない活性の最終的な消失を含む。ここで「細胞毒活性」は、細胞を選択的に殺すかまたは阻害するＴＮＦＳＦ変異型の活性を意味する。生物学的活性が天然と対比して７５−５０％未満を示す変異型ＴＮＦＳＦタンパク質が好ましい。さらに好ましいのは、生物学的活性が天然産生ＴＮＦＳＦの２５％未満を示す変異型ＴＮＦＳＦタンパク質であり、一層さらに好ましいのは、１５％未満を示す変異型ＴＮＦＳＦタンパク質であり、最も好ましいのは、１０％未満を示す変異型ＴＮＦＳＦタンパク質である。適切なアッセイには、ＴＮＦＳＦ細胞毒性アッセイ、ＤＮＡ結合アッセイ；転写アッセイ（レポータコンストラクト使用；Stavridi、前出参照）；サイズ排除クロマトグラフィーアッセイおよび放射性標識／免疫沈降法（Corcoran et al.、前出参照）；そして安定性アッセイ（円偏向二色性（ＣＤ）アッセイと平衡研究の使用を含む；Mateu、前出参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの全ては出典明示により本明細書の一部とする。これらのアッセイは、標識変異型タンパク質を利用し得る。適する標識には、放射性同位元素、発色団（特に発蛍光団）、酵素、粒子（例えば、磁性粒子）などが含まれる。
ある実施態様において、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の結合親和性に重要な少なくとも１つの特性が、天然ＴＮＦＳＦの同じ特性と対比した場合に変わっている。特に、受容体親和性が変わった変異型ＴＮＦＳＦタンパク質が好ましい。天然ＴＮＦＳＦに対するオリゴマー化の親和性が変わった変異型ＴＮＦＳＦタンパク質も好ましい。
従って、本発明は、変異型ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質が野生型（例えば、内因性）ＴＮＦＳＦ単量体に優先的にオリゴマー化するが、ＴＮＦＳＦ受容体を実質的に作動させ（agonize）ないような、変化した結合親和性を持つ変異型ＴＮＦＳＦタンパク質（例えば、変異型単量体を含有する混合オリゴマー）を提供する。この場合の「優先的に」は、変異型ＴＮＦＳＦ単量体と野生型ＴＮＦＳＦ単量体が等量与えられたときに、生じる三量体の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％が、変異型と野生型ＴＮＦＳＦとの混合三量体であることを意味する。少なくとも約５０％が好ましく、少なくとも約８０−９０％が特に好ましい。換言すると、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質が、野生型ＴＮＦＳＦタンパク質と対比して、野生型ＴＮＦＳＦタンパク質に対して大きい親和性をもつことが好ましい。「ＴＮＦ受容体と実質的に相互作用しない」とは、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質がＴＮＦＳＦ受容体と結合し、この受容体を活性化させる、および／または、ＴＮＦＳＦシグナル伝達経路を開始させることが実質的にできないことを意味する。好ましい実施態様では、少なくとも１０％の受容体活性化の減少が見られる。２０％、５０％、７６％、８０−９０％より大きいのが好ましい。「ＴＮＦＳＦ受容体を作動させる」とは、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質が受容体シグナル伝達を増強することを意味する。一般に、野生型ＴＮＦＳＦのアゴニストとして機能する変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は好ましくない。
変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、インビボおよびインビトロのアッセイを使用して、実験的に試験し、確認し得る。適するアッセイには、活性アッセイおよび結合アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＴＮＦＳＦタンパク質のアンタゴニストであるＴＮＦＳＦ変異型の同定に利用し得るスクリーニングには、限定ではないが、カスパーゼ活性化、ＮＦ−ｋＢ核移行 (Wei et al., Endocrinology 142, 1290-1295, (2001)) または c-Jun (Srivastava et al., JBC 276, 8836-8840 (2001)) 転写因子活性化アッセイ、Ｂ細胞増殖アッセイおよびＩｇＥ分泌アッセイが含まれる。
好ましい実施態様では、以下の相互作用の結合親和性を測定し、比較する：１）変異型ＴＮＦＳＦオリゴマー形成、２）野生型ＴＮＦＳＦオリゴマー形成、３）同族受容体への変異型ＴＮＦＳＦの結合、４）同族受容体への野生型ＴＮＦＳＦの結合、５）誘引受容体への変異型ＴＮＦＳＦの結合、および６）誘引受容体への野生型ＴＮＦＳＦの結合。適するアッセイには、動力学的定数と平衡結合定数の定量的比較が含まれるが、これらに限定されるものではない。動力学的会合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）、そして平衡結合定数（Ｋｄ）を、文献の標準手順に従いＢＩＡｃｏｒｅ社製装置により、表面プラズモン共鳴を使用して測定し得る［Pearce et al., Biochemistry 38:81−89(1999)]。結合親和性と動力学を測定するのに、AlphaScreenＴＭ (Packard BioScience（登録商標））などの近接アッセイを含むがこれに限定されるわけではない、いくつかの代替方法も使用できる。
ＴＮＦＳＦ変異型はまた、混合三量体を含むがこれに限定されるわけではない混合オリゴマーを形成できるか否かを決定するために試験できる。好ましい実施態様では、これは、天然ＴＮＦＳＦと変異型ＴＮＦＳＦを識別可能なタグで標識し、天然ＴＮＦＳＦと変異型ＴＮＦＳＦを合わせ、両タイプのタグを含有するオリゴマーをスクリーニングすることにより達成される。例えば、ＦＬＡＧタグ付き天然ＴＮＦＳＦおよびＨｉｓタグ付き変異型ＴＮＦＳＦを合わせることができ、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施してＦＬＡＧとＨｉｓの両方のタグを含有する三量体を同定できる。他の代替法は、未変性ゲルを走らせて混合物を別々の種に分離し、そしてクーマシー染色または抗ＦＬＡＧと抗Ｈｉｓタグ抗体の両方を使用するウエスタン・ブロットを使用して検出するものである。この方法は、ＦＬＡＧおよびＨｉｓタグが、未変性ゲルにおけるタンパク質の移動を有意に乱すという事実に依っている。当業者に明らかなように、多くの代替的プロトコールもまた、混合三量体形成の測定に使用できる。
上記概説の通り、本発明は、変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドをコードする変異型ＴＮＦＳＦ核酸を提供する。変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドは、好ましくは、少なくとも１つの特性が、天然産生ＴＮＦＳＦポリペプチドの同じ特性と対比した場合に変化している。変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドの特性は、本発明の結果である。
ポリペプチドの文脈における「変化した特性」またはその文法的均等物は、本明細書で使用する場合、選択または検出され得る、そして天然産生のタンパク質の対応する特性と比較され得る、ポリペプチドの特徴または属性を意味する。これらの特性には、限定でないが、以下のものがある；細胞毒活性、酸化安定性、基質特異性、基質結合または触媒活性、熱安定性、アルカリ安定性、ｐＨ活性プロファイル、タンパク質分解に対する抵抗性、動力学的会合（Ｋｏｎ）および解離（Ｋｏｆｆ）速度、タンパク質の折り畳み、免疫応答の誘発、リガンド結合能力、受容体結合能力、分泌される能力、細胞表面に表示される能力、オリゴマー化能力、シグナル伝達能力、細胞増殖刺激能力、細胞増殖阻止能力、アポトーシス誘発能力、リン酸化またはグルコシル化により修飾される能力、および疾患処置能力。
他に特定しない限り、列挙した特性のいずれにおいても、実質的な変化は、変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドの特性を天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質の特性と対比したとき、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは５０％、より好ましくは２倍に増加または減少している。
細胞毒活性の変化は、野生型タンパク質と対比して変異型ＴＮＦＳＦタンパク質により開始される細胞死が少なくとも７５％またはそれ以上減少することで証明する。
結合親和性の変化は、野生型ＴＮＦ受容体タンパク質または野生型ＴＮＦＳＦに対する結合親和性が少なくとも５％またはそれ以上増加または減少することで証明する。
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の宿主動物における抗原性プロファイルは、宿主ＴＮＦＳＦの抗原性プロファイルに対し類似しており、そして好ましくは同等である；即ち、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は免疫応答に対し宿主生物（例えば、患者）を有意に刺激しない；即ち、いずれの免疫応答も臨床的には有意でなく、アレルギー反応または抗体によるタンパクの中和もない。即ち、好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、付加的な、または野生型もしくは天然産生ＴＮＦＳＦと異なるエピトープを含有しない。ここでの「エピトープ」または「決定基」は、抗体を生成および／または抗体に結合するタンパク質の部分を意味する。従って、殆どの例では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質に対して、その天然の宿主において有意な量の抗体は生成されない。一般的に、これは下記概説するように表面残基を有意に変えないことにより、またはグルコシル化され得る表面上のアミノ酸残基を付加しないことにより（新しいグルコシル化は、免疫応答をもたらし得るので）、または新しいＭＨＣ結合エピトープを導入しないことにより、達成される。
本発明の変異型タンパク質は、図３に示すアミノ酸配列よりも、短くても長くてもよい。本発明で使用する場合、「野生型ＴＮＦＳＦ」は、天然の哺乳動物のタンパク質（好ましくはヒト）である。ＴＮＦＳＦは、多型であり得る。従って、好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の定義に含まれるものは、本明細書で示す配列の部分または断片である。変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の断片は、ａ）少なくとも１つの抗原エピトープを共有する；ｂ）少なくとも指示された相同性を有する；ｃ）そして好ましくは本明細書で定義される変異型ＴＮＦＳＦの生物学的活性を示す場合、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質とみなされる。
好ましい実施態様では、より詳しく下記概説するように、野生型ＴＮＦＳＦと対比して、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、ここで概説するものよりもさらに多くのアミノ酸変化を含む。例には、大腸菌での可溶発現を可能にするために導入されるアミノ酸置換、溶液挙動（solution behavior）を最適にするために導入されるアミノ酸置換、および免疫原性を調節するために導入されるアミノ酸置換が含まれるが、これらに限定されるものではない。そして、ここで概説するように、ここで描かれた変化のいずれをも、さらに新しい変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を形成するためにどのようにも組み合わせ得る。
さらに、例えば、ここで概説するように、エピトープまたは精製タグの付加、他の融合配列等の付加により、図に描かれたものより長い変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を作成し得る。例えば、発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を、他の治療的タンパク質に、または薬物動態的な目的でＦｃまたは血清アルブミンのような他のタンパク質に、融合させ得る。例えば、米国特許第５,７６６,８８３号および第５,８７６,９６９号（両方とも出典明示により本明細書の一部とする）参照。
変異型ＴＮＦＳＦタンパク質はまた、変異型ＴＮＦＳＦ核酸にコードされるものとして同定され得る。核酸の場合、核酸配列の包括的相同性はアミノ酸の相同性と相応するが、遺伝子コードの縮重および様々な生物のコドン偏向を配慮する。従って、核酸配列相同性は、タンパク質配列のものよりも低いことも高いこともあり、低い相同性が好ましい。
好適な実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦ核酸は変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をコードする。当業者に明らかなように、遺伝子コードの縮重のために、全て本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をコードする、極めて多数の核酸を作成し得る。従って、特定のアミノ酸配列を同定したら、当業者は、変異型ＴＮＦＳＦのアミノ酸配列を変更しない方法で１またはそれ以上のコドンの配列を単純に改変することによって、異なる核酸をいくつでも作成し得る。
本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質および核酸は、好ましくは組換え体である（合成的に作成されない限り）。本明細書で使用する「核酸」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの両方を含む分子を表す。この核酸はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドを包含し、センスおよびアンチセンス核酸を含む。このような核酸はまた、生理的環境下におけるかかる分子の安定性および半減期を増すために、リボース−リン酸骨格に修飾を含有し得る。
核酸は、２本鎖、１本鎖であるか、または２本鎖と１本鎖の配列の両方の部分を含有し得る。当業者に明らかなように、１本鎖（「ワトソン（Watson）」）の描写は他の鎖（「クリック（Crick）」）の配列を定義する；従って、図６に示す配列はその配列の相補鎖も含む。
本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の定義には、本明細書に概説し、各図に示す変異型ＴＮＦＳＦ配列のアミノ酸配列変異型も含まれる。即ち、この変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、ヒトＴＮＦＳＦと対比して、ドミナントネガティブタンパク質を生成させるのに使用されるもの以外に、さらなる可変位置を含有し得る。「ドミナントネガティブ可変位置」に関し、これらの変異型は、置換、挿入または欠失変異型の３群の１またはそれ以上に属する。全変異型は、通常、以下により製造する。即ち、カセットまたはＰＣＲ変異誘発またはその他の当分野で周知の技術を用いて変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をコードするＤＮＡにヌクレオチドの位置特異的変異誘発を行い、その変異型をコードするＤＮＡを産生し、その後、そのＤＮＡを上記概説したように組換え細胞培養で発現させる。しかしながら、約１００〜１５０残基までの変異型ＴＮＦＳＦタンパク質断片は、確立された技術を使用してインビトロ合成によって製造し得る。アミノ酸配列変異型は、予め決定された変異の性質、即ち、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質のアミノ酸配列の天然産生対立遺伝子または種間変化から変異型を隔てさせている特色により、特徴付けられる。この変異型は、典型的に、天然産生類似体と定性的に同じ生物学的活性を示すが、改変された特徴を有する変異体も選択できる。
アミノ酸配列変異を導入するための部位または領域は予め決定しておくが、変異それ自体を予め決定しておく必要はない。例えば、所定の部位における変異の効率を最適化するために、標的コドンまたは領域で無作為変異誘発を行い、発現された変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を、所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングしてもよい。既知配列を持つＤＮＡ内の予め決定された部位で置換変異を行うための技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発がある。変異体の検索は、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の活性、または本明細書で概説するような付加的特性（例えば、安定性）についての各アッセイを使用して、最適な特徴について行う。
アミノ酸置換は、典型的には単一な残基のものである；挿入は通常は約１個から約２０個までのオーダーのアミノ酸であるが、かなり長い挿入も許容され得る。欠失は約１個から約２０個までの範囲の残基にわたるが、場合により欠失はさらに大きなものであり得る。
置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組合せを使用して、最終的誘導体に到達してもよい。一般にこのような変化は少数のアミノ酸に行い、分子の変化を小さくする（例えば、保存的改変）。しかしながら、さらに大きな変化もある種の環境では許容され得る（例えば、非保存的改変）。
変異体は、典型的に元来の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質と定性的に同じ生物学的活性を発揮し、同じ免疫応答を誘起するが、必要に応じて、変異型は、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の特徴を改変するようにも選択される。あるいは、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の生物学的活性が変化するように変異型を設計し得る。例えば、グリコシル化部位を変更または除去し得る。同様に、生物学的機能も変更し得る；例えば、ある例では、より強力な、またはより弱いＴＮＦＳＦ活性を持つことが望ましいであろう。
本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質および核酸は、多数の方法で作成できる。個々の核酸およびタンパク質を、当分野で知られ、下記概説する方法で作成できる。あるいは、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質のライブラリーを試験用に作成できる。
好ましい実施態様では、当業者に知られる多数の方法で、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質のセットまたはライブラリーを生成させ得る。
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦライブラリーの異なるタンパク質メンバーを化学合成し得る。これは、設計されたタンパク質が短い場合、好ましくは１５０アミノ酸長未満、より好ましくは１００アミノ酸未満、そして特に好ましくは５０アミノ酸未満である場合に特に有用であるが、当分野で知られるように、より長いタンパク質を化学的または酵素的に作成できる。例えば、Wilken et al., Curr. Opin. Biotechnol. 9:412−26(1998) を参照（出典明示により本明細書の一部とする）。
好ましい実施態様では、特に、より長いタンパク質または大きいサンプルが望まれるタンパク質のためには、メンバーの配列をコードするＤＮＡなどの核酸を創製するためにライブラリー配列を使用し、次いでこれを所望により宿主細胞中にクローニングし、発現させ、アッセイし得る。従って、各メンバーのタンパク質配列をコードする核酸、特にＤＮＡを作成し得る。これは周知方法を用いて行う。コドン、適切な発現ベクターおよび適切な宿主細胞の選択は、いくつかの要因によって変わり、必要に応じて容易に最適化し得る。
好ましい実施態様では、例えばアンタゴニスト活性および／または本明細書で概説したような他の所望の活性を試験するために変異体ライブラリーを作成する場合、プールしたオリゴヌクレオチドを用いる複数のＰＣＲ反応を行う。この実施態様では、全長遺伝子に対応する重複オリゴヌクレオチドを合成する。また、これらのオリゴヌクレオチドは各可変位置にある異なるアミノ酸またはサブセットの全てを表し得る。好ましい実施態様では、これらのオリゴヌクレオチドを等しい割合でプールし、複数のＰＣＲ反応を実施して、ライブラリーにより定義される変異の組合せを含有する全長配列を創製する。さらに、これはエラープローンＰＣＲ法を使用して行い得る。
好ましい実施態様では、ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２に記載のように、異なるオリゴヌクレオチドを確率分布表に対応する相対量で添加する。このようにして、複数のＰＣＲ反応は、変異の所望の組み合わせを所望の割合で有する全長配列をもたらす。
好ましい実施態様では、各重複オリゴヌクレオチドは、変化させようとする位置を１つだけ含む；別の実施態様では、変異位置が互いに近接しすぎてこのことを不可能にし、各オリゴヌクレオチド当たり複数の変異を使用してあらゆる可能性の組換えを完成させる。即ち、各オリゴは、変異されている単一位置か、または変異されている１以上の位置のコドンを含有し得る。変異されている複数位置は、オリゴの長さが非実用的になるのを防ぐために、配列内で近接していなければならない。あるオリゴヌクレオチド上の複数の変異位置に対して、特定の変異の組合せをコードしているオリゴヌクレオチドを包含または排除することにより、その組合せをライブラリー中に包含または排除し得る。例えば、本明細書で論じるように、可変位置間に相関関係があり得る；即ち、位置Ｘがある残基の場合には、位置Ｙは特定の残基でなければならない（または、あってはならない）。これらの可変位置のセットは、本明細書においては時々「クラスター」と呼称される。クラスターが互いに近接した残基を含み、従って１つのヌクレオチドプライマー上に存在できるときには、クラスターを「良好な」相関に設定し、ライブラリーの有効性を減少させ得る悪い組合せを除去できる。しかしながら、クラスターの残基が配列中で離れていて、従って合成のためには異なるオリゴヌクレオチド上に存在するであろう場合には、残基を「良好な」相関に設定するか、または可変残基として完全に排除するのが望ましい。別の実施態様では、クラスター変異がもっぱら一緒に現れるように、ライブラリーを数段階で創出し得る。この方法、即ち、変異クラスターを同定し、そしてそれらを同じオリゴヌクレオチド上に置くかもしくはライブラリーから除去すること、またはクラスターを保存しながら数段階でライブラリーを生成させることにより、実験的ライブラリーが、適正に折畳まれたタンパク質にかなり富むようにできる。クラスターの同定は、例えば、既知のパターン認識法の使用、変異発生頻度の比較、または実験的に生成させる配列のエネルギー解析（例えば、もし相互作用エネルギーが高ければ、位置は相関している）の使用などの多数の方法で実行することができる。これらの相関は、位置相関（例えば、可変位置１と２が常に一緒に変化するか、または決して一緒に変化しない）でも、配列相関（例えば、位置１に残基Ａがあれば、常に位置２に残基Ｂがある）でもよい。Pattern discovery in Biomolecular Data: Tools, Techniques, and Applications; edited by Jason T.L. Wang, Bruce A. Shapiro, Dennis Shasha. New York: Oxford University, 1999; Andrews, Harry C. Introduction to mathematical techniques in pattern recognition; New York, Wiley-lnterscience [1972]; Applications of Pattern Recognition; Editor, K.S. Fu. Boca Raton, Fla. CRC Press, 1982; Genetic Algorithms for Pattern Recognition; edited by Sankar K. Pal, Paul P. Wang. Boca Raton: CRC Press, c1996; Pandya, Abhijit S., Pattern recognition with neural networks in C++ / Abhijit S. Pandya, Robert B. Macy. Boca Raton, Fla.: CRC Press, 1996; Handbook of pattern recognition & computer vision / edited by C.H. Chen, L.F. Pau, P.S.P. Wang. 2nd ed. Singapore; River Edge, N.J.: World Scientific, c1999; Friedman, Introduction to Pattern Recognition: Statistical, Structural, Neural, and Fuzzy Logic Approaches; River Edge, N.J.: World Scientific, c1999, Series title: Series in machine perception and artificial intelligence; vol. 32; を参照（全て出典明示により本明細書の一部とする）。さらに、コンセンサスモチーフの探索に使用するプログラムもまた同様に使用できる。
長さが異なるタンパク質を発現するライブラリーを創出するために、コドンを挿入または欠失したオリゴヌクレオチドを使用し得る。特に、挿入または欠失のためのコンピューター処理配列スクリーニングは、長さが異なるタンパク質を定義する二次ライブラリーをもたらし得る。それらは、プールした様々な長さのオリゴヌクレオチドのライブラリーにより発現させることができる。
他の好ましい実施態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、このファミリー（例えば、変異体のセット）をシャフリングすることによって創製する；即ち、上位配列（順位順のリストを使用する場合）のいくつかのセットを、エラープローンＰＣＲを用いて、または用いずに、シャフリングすることができる。この文脈における「シャフリング」とは、一般に無作為なやり方での、関連配列の組換えを意味する。これは、米国特許第５,８３０,７２１号、第５,８１１,２３８号、第５,６０５,７９３号、第５,８３７,４５８号およびＰＣＴ／ＵＳ／１９２５６に定義および例示されている「シャフリング」を包含し、これらは全て出典明示によりその全体を本明細書の一部とする。この配列のセットは、人工的なセット；例えば確率表（例えば、ＳＣＭＦを使用して作製されたもの）またはモンテカルロのセット由来のものであってもよい。同様に、「ファミリー」は、上位の１０および下位の１０配列、上位の１００配列等であってよい。これもまたエラープローンＰＣＲを使用して行い得る。
従って、好ましい実施態様では、本明細書に記載のコンピューター処理法を使用してインシリコ（in silico）シャフリングを行う。即ち、２つのライブラリーまたは２つの配列で開始して、配列の無作為組換えを生成させ、評価し得る。
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、２またはそれ以上の天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質から形成されるキメラである。特に好ましい実施態様では、キメラは、１またはそれ以上の天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質由来の受容体接触領域を、他の天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質のアミノ酸配列と連結することにより形成する。
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質のライブラリーを生成させるために、エラープローンＰＣＲを行う。米国特許第５,６０５,７９３号、第５,８１１,２３８号、第５,８３０,７２１号（これらは全て出典明示により本明細書の一部とする）を参照されたい。これは、ライブラリーの最適配列もしくは上位メンバー、またはその他の何らかの人工的セットもしくはファミリーについて行い得る。この実施態様では、一次ライブラリーのコンピュータースクリーニングで見出された最適配列の遺伝子を合成し得る。次いで、そのライブラリーの変異位置にある変異をコードしているオリゴヌクレオチド（偏向オリゴヌクレオチド）の存在下に、最適配列の遺伝子でエラープローンＰＣＲを実施する。それらのオリゴヌクレオチドの添加は、そのライブラリーにその変異を組み込むことを好む偏向を産むであろう。あるいは、ある変異のためのオリゴヌクレオチドのみを使用して該ライブラリーを偏らせ得る。
好ましい実施態様では、エラープローンＰＣＲによる遺伝子シャフリングを、偏向オリゴヌクレオチドの存在下に、最適配列の遺伝子に実施し、変異型ＴＮＦＳＦライブラリー中に見出される変異の比率を反映するＤＮＡ配列ライブラリーを創製できる。偏向オリゴヌクレオチドの選択は様々な方法で行うことができる；その頻度の偏向に基づいて選択できる、即ち、高変異頻度位置をコードするオリゴヌクレオチドを使用できる；あるいは、多様性を増大させるように、最も変化し易い位置を含むオリゴヌクレオチドを使用できる；二次ライブラリーを順位付ける場合、いくつかの上位スコアの位置を使用して偏向オリゴヌクレオチドを生成させることができる；無作為な位置を選択し得る；数個の上位スコアのものと数個の下位スコアのものを選択し得る、等である。重要なことは、好ましい可変位置および配列に基づく新たな配列を生成させることである。
好ましい実施態様では、図面に模式的に示すように、野生型遺伝子またはその他の遺伝子を用いるＰＣＲを使用し得る。この実施態様では、出発遺伝子を使用する；必要ではないが、一般に、この遺伝子は、通常野生型遺伝子である。いくつかの場合には、これは、大域的最適配列をコードする遺伝子、またはリストのその他の配列、または、例えば異なる生物由来の相同性配列をアラインメントすることで得られるコンセンサス配列であり得る。この実施態様では、変異位置に対応し、ライブラリー中の異なるアミノ酸を含むオリゴヌクレオチドを使用する。当分野で知られるように、末端でＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲを行う。これには２つの利点がある。第一に、これは一般的により少ないオリゴヌクレオチドで済み、かつ誤りが少ないという結果をもたらす。第二に、野生型遺伝子を使用する場合、合成する必要が無いという点で、実験上の利点がある。
変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をコードする本発明の核酸を使用して、様々な発現ベクターを作成する。この発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクター、または宿主ゲノム中に組み込まれるベクターであり得る。一般に、これらの発現ベクターは、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をコードする核酸に機能し得るように連結した、転写および翻訳調節核酸を包含する。「制御配列」という用語は、機能し得るように連結したコード配列の特定の宿主生物における発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適する制御配列は、例えばプロモーター、所望によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を包含する。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれたとき、「機能し得るように連結」している。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、これがポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのＤＮＡに機能し得るように連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、これがコード配列の転写に影響を及ぼすならば、その配列に機能し得るように連結している；または、リボソーム結合部位は、これが翻訳を促進するように配置されているならば、コード配列に機能し得るように連結している。
好ましい実施態様では、内因性分泌配列が天然産生タンパク質または変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の低レベル分泌を導く場合、この天然産生分泌リーダー配列を置換することが望ましい。この実施態様では、関連のない分泌リーダー配列が変異型ＴＮＦＳＦコード核酸に機能し得るように連結され、タンパク質分泌の増加を導く。従って、ＴＮＦＳＦおよびその分泌配列の分泌と比較したとき、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の分泌増強をもたらすいかなる分泌リーダー配列も望ましい。タンパク質の分泌を導く好適な分泌リーダー配列は当分野で知られている。
別の好ましい実施態様では、天然産生タンパク質またはタンパク質の分泌リーダー配列を当分野で既知の技術によって除去し、その後発現させると、組換えタンパク質の細胞内蓄積がもたらされる。
一般に、「機能し得るように連結」とは、連結しているＤＮＡ配列が連続しており、そして、分泌リーダーの場合には、連続しかつ読み取り枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要がない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、慣行的実務に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。融合タンパク質の発現に用いられる宿主細胞には、転写および翻訳の調節核酸が一般に適当である；例えば、Bacillusでの融合タンパク質の発現には、Bacillus由来の転写および翻訳調節核酸配列が好ましく使用される。多数のタイプの適当な発現ベクター、および適当な制御配列が、様々な宿主細胞について当分野で知られている。
一般に、転写および翻訳の制御配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、並びにエンハンサーまたはアクチべーター配列が包含されるが、これらに限定される訳ではない。好ましい実施態様では、制御配列は、プロモーター並びに転写開始および停止配列を包含する。
プロモーター配列は、構成的または誘導可能プロモーターのいずれかをコードしている。プロモーターは、天然産生プロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。１より多いプロモーターの要素を合しているハイブリッドプロモーターもまた当分野で知られており、本発明において有用である。好ましい実施態様では、プロモーターは、細胞、特に哺乳動物細胞での高度発現を可能にする強力なプロモーターであり、例えばＣＭＶプロモーター、とりわけＴｅｔ調節エレメントと組み合わせたものである。
加えて、発現ベクターはさらなるエレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは２つの複製系を有し、故にこれを２つの生物で、例えば発現用に哺乳動物または昆虫細胞内で、そしてクローニングおよび増幅用に原核生物宿主内で、維持することを可能にする。さらに、発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つの配列、および、好ましくは発現コンストラクトに隣接する２つの相同配列を含有する。この組み込みベクターは、ベクターに包含するために適切な相同性配列を選択することにより、宿主細胞内の特異的な座に向かわせ得る。組み込みベクターのコンストラクトは当分野で周知である。
加えて、好ましい実施態様では、発現ベクターは、形質移入された宿主細胞の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子を含有する。選択遺伝子は当分野で周知であり、使用する宿主細胞によって変わる。
好ましい発現ベクター系は、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８に一般的な記載のあるレトロウイルスベクター系であり、これらは共に出典明示により本明細書の一部とする。
好ましい実施態様では、発現ベクターは上記の構成成分および変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をコードする遺伝子を含む。当業者は理解できるであろうが、全ての組み合わせが可能であり、従って、本明細書で使用するように、レトロウイルスであってもそうでなくてもよい１またはそれ以上のベクターより成る構成成分の組み合わせを、本明細書中では「ベクター組成物」と称する。
変異型ＴＮＦＳＦ核酸は、単独または発現ベクターと組み合わせて細胞に導入する。本明細書中、「導入する」または文法上の等価表現は、核酸が、その後の核酸の発現に好適な方法で細胞に入ることを意味する。導入の方法は、下記で論ずるような標的となる細胞タイプによってほぼ規定される。方法の例には、ＣaＰＯ4沈殿、リポソーム融合、リポフェクチン（登録商標）、電気穿孔、ウイルス感染等が含まれる。変異型ＴＮＦＳＦ核酸は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ（例えば下記概説するレトロウイルス導入によって）、または、細胞質中に一過的にまたは安定に存在し得る（即ち、常套のプラスミドの使用により、標準的制御配列、選択マーカーの利用により、等）。
本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質移入された宿主細胞を、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の発現を誘導または惹起するのに適当な条件下で培養することによって産生される。変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の発現に適当な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変わり、日常的な実験によって当業者により容易に確認できるであろう。例えば、発現ベクター中の構成的プロモーターは、宿主細胞の生育および増殖の最適化を必要とし、また、誘導的プロモーターの使用は、誘導に適する生育条件を必要とする。さらに、いくつかの実施態様では、回収のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現で使用されるバキュロウイルス系は溶解性ウイルスであり、従って回収時期の選択が、生成物の収量にとって決定的となり得る。
適当な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、真菌、並びに昆虫、および哺乳動物細胞を含む動物細胞が包まれる。特に興味深いものは、Drosophila melangaster 細胞、Saccharomyces cerevisiaeおよびその他の酵母類、E. coli、Bacillus subtilis、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Neurospora、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Pichia Pastoris 等である。
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を哺乳動物細胞で発現する。哺乳動物発現系もまた当分野で知られており、レトロウイルス系が包含される。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、そして融合タンパク質のコード配列の、ｍＲＮＡへの下流（３'）転写を開始させることのできる、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コード配列の５'末端に近接して位置する転写開始領域、および、この転写開始位置の上流に位置する２５−３０塩基対を使用するＴＡＴＡボックスを有する。このＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに、正しい位置でＲＮＡ合成を開始するように指令すると考えられる。哺乳動物プロモーターはさらに、典型的にはＴＡＴＡボックスの上流１００ないし２００塩基対以内に位置する上流のプロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）を含むであろう。上流のプロモーターエレメントは、転写開始速度を決定し、どちらの方向にも作用できる。哺乳動物プロモーターとして特に有用なのは、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。なぜなら、ウイルス遺伝子はしばしば高発現され、かつ宿主範囲が広範であるからである。例には、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＣＭＶプロモーターが含まれる。
典型的には、哺乳動物細胞に認識される転写終結およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３'に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共にコード配列に隣接している。成熟ｍＲＮＡの３'末端は、部位特異的翻訳後開裂およびポリアデニル化によって形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０から誘導されるものが含まれる。
哺乳動物宿主およびその他の宿主に外因性核酸を導入する方法は、当分野で周知であり、使用する宿主細胞によって変わる。方法には、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ウイルス感染、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接的マイクロインジェクションが挙げられる。本明細書に概説するように、特に好ましい方法は、ＰＣＴＵＳ９７／０１０１９（出典明示により本明細書の一部とする）に概説されるレトロウイルス感染を利用するものである。
当業者には理解されるであろうが、本発明に使用される哺乳動物細胞のタイプは広範にわたり得る。基本的に、いかなる哺乳動物細胞も使用し得、マウス、ラット、霊長類およびヒトの細胞が特に好ましいが、当業者には理解されるように、シュードタイピング（pseudotyping）による系の修飾により、全ての真核細胞、好ましくは高等真核生物を使用することが可能になる。以下により詳細に記載するように、細胞が生物活性ペプチドの存在下で選択可能な表現型を表すようにスクリーニングを設定する。以下に詳述するように、細胞内にペプチドが存在する故に変化した表現型を示す細胞を選択できるように適切なスクリーニングを設定できる限り、多岐にわたる疾患症状に関わる細胞型がとりわけ有用である。
従って、好適な細胞型には、全てのタイプの腫瘍細胞（特に黒色腫、骨髄性白血病、肺、乳房、卵巣、大腸、腎臓、前立腺、膵臓および精巣の癌腫）、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球（Ｔ細胞およびＢ細胞）、マスト細胞、好酸球、血管内膜細胞、肝細胞、単核白血球を包含する白血球、造血、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓および筋細胞幹細胞などの幹細胞（分化および脱分化因子のスクリーニングに使用するため）、破骨細胞、軟骨細胞およびその他の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、肝臓細胞、腎臓細胞、および脂肪細胞が包含されるが、これらに限定される訳ではない。好適な細胞にはさらに、Jurkat Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、Ｃｏｓ等を包含するが、これらに限定されない、既知の研究用細胞が含まれる。ＡＴＣＣ細胞株カタログ（出典明示により本明細書の一部とする）を参照。
ある実施態様では、細胞は、さらに遺伝学的に操作され得る。即ち、変異型ＴＮＦＳＦ核酸以外の外因性核酸を含む。
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を細菌系で発現させる。細菌発現系は当分野で周知である。
好適な細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合でき、かつ変異型ＴＮＦＳＦタンパク質のコード配列の、ｍＲＮＡへの下流（３'）転写を開始することができる任意の核酸配列である。細菌プロモーターは、コード配列の５'末端の近傍に通常位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的にＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は、とりわけ有用なプロモーター配列を提供する。例には、ガラクトース、乳糖およびマルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモーター配列、並びにトリプトファンなどの生合成酵素に由来する配列が挙げられる。バクテリオファージ由来のプロモーターもまた使用し得、当分野で知られている。加えて、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用である；例えば、ｔａｃプロモーターはｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然産生プロモーターを包含し得る。
機能的なプロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位が望ましい。E.coli では、このリボソーム結合部位は Shine-Delgarno（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドンと、開始コドンの３−１１ヌクレオチド上流に位置する３−９ヌクレオチド長の配列を含む。発現ベクターはまた、細菌において変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の分泌をもたらすシグナルペプチド配列を含む。シグナル配列は、典型的には、当分野で周知のように、細胞からのタンパク質の分泌を指令する疎水性アミノ酸から成るシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、生育培地中に分泌される（グラム陽性細菌）か、または、細胞の外膜と内膜の間に位置するペリプラズム間隙中に分泌される（グラム陰性細菌）。細菌での発現のためには、通常、変異型ＴＮＦＳＦコード核酸と機能し得るように連結された細菌分泌リーダー配列が好ましい。
細菌発現ベクターはまた、形質移入された細菌株の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子を含み得る。好適な選択遺伝子には、細菌を、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンなどの薬物に対して耐性にする遺伝子が包含される。選択マーカーにはまた、生合成遺伝子、例えばヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路中の生合成遺伝子が包含される。
これらの構成成分を組み立てて発現ベクターとする。細菌のための発現ベクターは当分野で周知であり、なかでも Bacillus subtilis、E.coli、Streptococcus cremoris、Streptococcus lividans 用のベクターが包含される。
細菌発現ベクターは、当分野で周知の技術、例えば塩化カルシウム処理、電気穿孔等を用いて、細菌宿主細胞中に形質移入する。
ある実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を昆虫細胞で産生する。昆虫細胞の形質移入用発現ベクター、特にバキュロウイルスをベースとする発現ベクターは、当分野で周知である。
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を酵母細胞で産生する。酵母発現系は当分野で周知であり、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans および C. maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis および K. lactis、Pichia guillerimondii および P. pastoris、Schizosaccharomyces pombe、および Yarrowia lipolytica 用の発現ベクターが包含される。酵母での発現に好ましいプロモーター配列には、誘導可能ＧＡＬ１,１０プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、および酸ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーターが包含される。酵母選択可能マーカーには、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ツニカマイシン耐性を付与するＡＬＧ７、Ｇ４１８耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および酵母を銅イオンの存在下で生育させるＣＵＰ１遺伝子が包含される。
好ましい実施態様では、修飾したＴＮＦＳＦ変異型を、少なくとも１つのさらなるＴＮＦＳＦ変異型とリンカーを介して共有結合によりカップルさせ、修飾ドメインのドミナントネガティブ作用を改善する。修飾した受容体ドメインを一緒に共有結合的に連結させるのに、数々の戦略を使用し得る。これらには、２つのドメインのＮ末端とＣ末端との間のポリペプチド連結などのリンカー、単量体間のジスルフィド結合を介する連結、化学的クロスリンク試薬を介する連結が含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、Ｎ末端および／またはＣ末端の一部を欠失させ、リンカーを介して残りの断片を連結するか、または断片を直接連結することにより、Ｎ末端とＣ末端を共有結合的につなげ得る。
「リンカー」、「リンカー配列」、「スペーサー」、「つなぎ配列」またはこれらの文法的均等物は、本明細書では、２個の分子を接続し、しばしば２個の分子を好ましい配置に置くのに役立つ、分子または分子群（単量体またはポリマーなど）を意味する。本実施態様のある態様では、リンカーはペプチド結合である。２個のポリペプチド鎖を接続するある特定の場合に適するリンカーの選択は、様々なパラメータによって決まる。例えば、２個のポリペプチド鎖の性質（例えば、それらが自然に多量体化するのか否か（例えば、二量体を形成するのか否か））、もし３次元構造決定からわかるのであれば、接続されるＮ末端とＣ末端との間の距離、および／またはタンパク質分解および酸化に対するリンカーの安定性などである。さらに、リンカーは、柔軟性を与えるアミノ酸残基を含有し得る。従って、リンカーペプチドは、優勢的に以下のアミノ酸残基を含む：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒ。これらの連結されたＴＮＦＳＦタンパク質は、不自然な流体力学的特性を有し（即ち、それらは構成的な二量体を形成する）、従って、他の天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質と効率的に相互作用し、ドミナントネガティブのヘテロ三量体を形成する。
リンカーペプチドは、２個のＴＮＦＳＦ変異型単量体を、これらが相互に正しい配置をとり、天然ＴＮＦＳＦタンパク質のアンタゴニストとして所望の活性を保持するような方法で連結するのに、適切な長さを有するべきである。この目的のために適する長さは、少なくとも１、かつ３０を超えないアミノ酸残基を含む。好ましくは、リンカーは約１ないし３０アミノ酸長であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０アミノ酸長のリンカーが好ましい。出典明示により全体を本明細書の一部とするＷＯ０１／２５２７７も参照されたい。
さらに、リンカーペプチドに含めるために選択されるアミノ酸残基は、ポリペプチドの活性を有意に妨害しない特性を示すべきである。従って、リンカーペプチドは、全体として、ポリペプチドの活性と相反する電荷を示すべきではなく、または内部の折り畳みを妨害するべきではなく、または単量体の１またはそれ以上のアミノ酸残基と、受容体単量体ドメインの結合を重大に妨げる結合または他の相互作用を形成すべきではない。
当業者に理解されるように、有用なリンカーには、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎを含む。ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、およびシェーカー型カリウムチャネルのつなぎなどの他の柔軟なリンカー、および多数の様々な他の柔軟なリンカーが含まれる。グリシン−セリンポリマーが好ましい。なぜなら、これらの両アミノ酸は、比較的構造化されておらず、従って成分間の中立的つなぎとして役立ち得るからである。第２に、セリンは親水性であり、従って球状グリシン鎖であり得るものを可溶化することができる。第３に、類似の鎖が、一本鎖抗体などの組換えタンパク質のサブユニットをつなぐのに効果的であると示された。
適するリンカーは、２個のポリペプチド鎖間のギャップを架橋できる天然産生のモチーフについての既知の３次元構造データベースを検索することによっても同定し得る。適するリンカーを得る他の方法は、ランダムな突然変異誘発を通して単純なリンカー（例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ）を最適化することによる。あるいは、一度適するポリペプチドリンカーを定めたら、ＰＤＦＴＭ技術の適用により、連結されるドメインとより最適に相互作用するアミノ酸を選択し、さらなるリンカーポリペプチドを創製できる。本発明で使用し得る他のタイプのリンカーには、人工ポリペプチドリンカーおよびインテインが含まれる。他の好ましい実施態様では、２個の受容体単量体を単量体間接触部位で連結するために、ジスルフィド結合を設計する。この実施態様のある態様では、２個の受容体を＜５オングストロームの距離で連結する。加えて、本発明の変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドは、所望により、例えば発現を増大させるか、またはタンパク質を安定化するために、他のタンパク質にさらに融合し得る。
ある実施態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦ核酸、タンパク質および抗体を、その骨格以外で標識を用いて標識する。本明細書において「標識する」とは、ある化合物が、その化合物の検出を可能にするために結合させた少なくとも１つの元素、アイソトープまたは化学化合物を有することを意味する。一般に、標識は３つのクラスに分類される：ａ）アイソトープ標識、これは放射性または重アイソトープであり得る；ｂ）免疫標識、これは抗体または抗原であり得る；そしてｃ）着色または蛍光色素。標識はいかなる位置で化合物に組み込んでもよい。
一度作成したら、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を修飾し得る。当該タンパク質の共有結合的および非共有結合的修飾は、本発明の範囲に含まれる。このような修飾は、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることにより、変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドに導入し得る。
共有結合による修飾の１つのタイプは、変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドの標的アミノ酸残基を、変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドの選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることを包含する。例えば、以下に詳述するように、抗変異型ＴＮＦＳＦ抗体の精製方法またはスクリーニングアッセイで使用するための、非水溶性支持体マトリックスまたは表面に、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をクロスリンクするには、二官能性試薬による誘導体化が有用である。一般的に使用されるクロスリンク試薬には、例えば１,１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル類、ジスクシンイミジルエステル類、例えば３,３'−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）を包含するホモ二官能性イミドエステル類、二官能性マレイミド類、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１,８−オクタン並びにメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートのような試薬が含まれる。
その他の修飾には、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の各々対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化［T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)］、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
本発明の範囲内に包含される変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドの他のタイプの共有結合的修飾は、該ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含むものである。「天然グリコシル化パターンの変更」は、本発明のためには、天然配列変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドに見出される１またはそれ以上の炭水化物部分を除去する、および／または天然配列変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドに存在しない１以上のグリコシル化部位を付加する意味であると意図されている。
変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列を変化することによって達成し得る。この変更は、例えば、天然配列または変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドに（Ｏ結合型グリコシル化部位用に）１またはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基を付加、またはそれらにより置換することによって達成し得る。変異型ＴＮＦＳＦアミノ酸配列は、場合により、ＤＮＡレベルでの変化を介して変化させ得る。特に、所望のアミノ酸に翻訳されるであろうコドンを生成させるように、変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドをコードするＤＮＡを、予め選択した塩基で変異させることによる。
変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドへのＮ結合型グリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列を変化させることにより達成し得る。変化は、例えば、天然配列または変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドに１またはそれ以上のアスパラギン残基を付加、またはそれらにより置換することにより為し得る。修飾は、例えば、Ｎ−Ｘ−Ｙ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｙは好ましくはスレオニン、セリンまたはシステインである）を含むがこれらに限定されるわけではない、正準の結合型グリコシル化部位の導入により為し得る。変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドの炭水化物部分の数を増やす他の手段は、ポリペプチドにグリコシドを化学的または酵素的にカップリングさせることによる。かかる方法は、当分野で、例えば１９８７年９月１１日発行のＷＯ８７／０５３３０および Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259−306 (1981) に記載されている。
変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドに存在する炭水化物部分の除去は、化学的に、酵素的に、またはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異誘発的置換により達成し得る。化学的脱グリコシル化技法は当分野で知られており、例えば、Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) および Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリペプチドの炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987) に記載のように、様々なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成できる。
このような誘導された部分は、溶解性、吸収性、および血液脳関門の透過性、生物学的半減期などを改善し得る。このような変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドの部分または修飾は、あるいは、タンパク質の起こりえる望まれない副作用などを除去または軽減し得る。そのような効果を媒介できる部分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980) に開示されている。
変異型ＴＮＦＳＦの他のタイプの共有結合的修飾は、変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドを、米国特許第４,６４０,８３５号；第４,４９６,６８９号；第４,３０１,１４４号；第４,６７０,４１７号；第４,７９１,１９２号；第４,１７９,３３７号；第５,１８３,５５０号に記載の方法で、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなどの様々な非タンパク質性ポリマーの１つに連結させることを含む。これらの非タンパク質性ポリマーは、変異型ＴＮＦＳＦの、受容体結合を崩壊させる能力および／またはインビボの安定性を高めるためにも使用し得る。
他の好ましい実施態様では、（ａ）特徴解析用の標識部位を導入するため、および（ｂ）ＰＥＧ化部位を導入するために、システインを変異型または野生型ＴＮＦＳＦ中に設計する。例えば、使用し得る標識は、当分野で周知であり、ビオチン、タグおよび蛍光標識（例えばフルオレセイン）を含むがこれらに限定されるものではない。これらの標識は、また当分野で周知のように、様々なアッセイにおいて特性解析を達成するために使用し得る。当分野で周知のように、ＰＥＧ化を達成するために様々なカップリング化学を使用し得る。例には、リジン基およびＮ末端を含むがこれらに限定されるものではない一級アミンでの修飾を可能にする Shearwater および Enzon の技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。両方とも出典明示により本明細書の一部とする、Kinstler et al, Advanced Drug Deliveries Reviews, 54, 477-485 (2002) および MJ Roberts et al, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 459-476 (2002) を参照されたい。
本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質に他の修飾を為し得る。これには、安定性、用量管理（例えば、両親媒性ポリマー（ＷＯ０１４１８１２Ａ２参照、Nobex Corporationから販売）、クリアランス（例えば、ＰＥＧ、ＨＳＡへの結合に影響を与える両親媒性部分）などを高めるタンパク質修飾が含まれる。
修飾に最適な部位は、目視検査、構造分析、配列分析および分子シミュレーションを含む様々な基準を使用して選択できる。個々の残基を分析し、単量体構造を乱さない変異部位を同定し得る。次いで、単量体の各側鎖から他のサブユニットへの距離を算出し、化学修飾がオリゴマー化を乱さないことを確かめる。受容体結合の崩壊が生じてもよく、そして本発明のＴＮＦＳＦ変異型の活性に有利であり得る。
別の好ましい実施態様では、依然としてＴＮＦＳＦ分子が正しく折り畳まれるようにしつつ、野生型ＴＮＦＳＦ単量体のＮまたはＣ末端のいずれかの部分を欠失させる。加えて、これらの修飾されたＴＮＦＳＦタンパク質は、実質的に受容体結合および／または活性化を欠き、場合により他の野生型ＴＮＦＳＦ分子または修飾ＴＮＦＳＦタンパク質と相互作用して上記のように三量体（または他のオリゴマー）を形成し得る。
ことさらに、ＮもしくはＣ末端、または両方からの、約１ないし約５５アミノ酸の除去または欠失が好ましい。より好ましい実施態様には、残基１０を超えるＮ末端の欠失が含まれ、最初の４７のＮ末端アミノ酸の欠失がより好ましい。Ｃ末端のロイシンの欠失は、代替的実施態様である。
他の好ましい実施態様では、野生型ＴＮＦＳＦまたは本発明により生成される変異型は、環状に並べ替えることができる。全ての天然のタンパク質は、Ｎ末端で開始しＣ末端で終了するアミノ酸配列を有する。ＮおよびＣ末端をつなぎ、野生型タンパク質と対比して生物学的特性を保持または改善しつつ（例えば、高められた安定性および活性など）、環状化された、または環状に並べ替えられたＴＮＦＳＦタンパク質を創製し得る。ＴＮＦＳＦタンパク質の場合、通常タンパク質の一次構造の内側にあるアミノ酸位置でＮおよびＣ末端の新規セットを創製し、本来のＮおよびＣ末端を、長さ０ないし３０のアミノ酸からなるペプチドリンカーを介してつなぐ（リンカー設計を合わせるために、本来の末端の近くに位置するいくつかのアミノ酸を除去する場合もある）。好ましい実施態様では、新規ＮおよびＣ末端は、新規タンパク質の安定性および活性が本来のタンパク質のものと類似するように、ループやターンなどの不規則的な二次構造エレメント中に位置する。環状に並べ替えられたＴＮＦＳＦタンパク質は、さらにＰＥＧ化またはグリコシル化し得る。さらに好ましい実施態様では、ＰＤＡＴＭ技術は、ＴＮＦＳＦ変異型を、特に環状並べ替えることにより創製される領域において、さらに最適化するために使用し得る。これらには、新規ＮおよびＣ末端、並びに本来の末端およびリンカーペプチドが含まれる。
タンパク質を並べ替えるために、様々な技法を使用し得る。US 5,981,200; Maki K, Iwakura M., Seikagaku. 2001 Jan; 73(1): 42−6; Pan T., Methods Enzymol. 2000; 317:313−30; Heinemann U, Hahn M., Prog Biophys Mol Biol. 1995; 64(2−3): 121−43; Harris ME, Pace NR, Mol Biol Rep. 1995−96; 22(2−3):115−23; Pan T, Uhlenbeck OC., 1993 Mar 30; 125(2): 111−4; Nardulli AM, Shapiro DJ. 1993 Winter; 3(4):247−55, EP 1098257 A2; WO 02/22149; WO 01/51629; WO 99/51632; Hennecke, et al., 1999, J. Mol. Biol., 286, 1197−1215; Goldenberg et al J. Mol. Biol 165, 407−413 (1983); Luger et al, Science, 243, 206−210 (1989); および Zhang et al., Protein Sci 5, 1290−1300 (1996)を参照されたい。全て出典明示により本明細書の一部とする。
加えて、タンパク質が全く末端を含有しない、完全に環状のＴＮＦＳＦを生成させ得る。これは、インテイン技術を利用して達成される。このように、ペプチドは環状化でき、特にインテインは環状化を達成するために利用され得る。
環状化および環状に並べ替えることは、本発明のＴＮＦＳＦタンパク質のドミナントネガティブ活性を生成させるのに使用し得る。
本発明の変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドはまた、別の非相同ポリペプチドまたはアミノ酸配列と融合した変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドを含むキメラ分子を形成させる方法で修飾し得る。ある実施態様では、かかるキメラ分子は、変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供する、タグポリペプチドとの融合物を含む。このエピトープタグは一般に、変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドのアミノまたはカルボキシル末端に位置する。このようなエピトープタグ付き形態の変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドの存在は、そのタグポリペプチドに対する抗体を使用して検出できる。また、エピトープタグの提供は、その変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドを、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する他のタイプの親和性マトリックスを使用する親和性精製によって容易に精製できるようにする。代替的実施態様では、キメラ分子は、変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定領域との融合物を含み得る。二価形態のキメラ分子については、このような融合はＩgＧ分子のＦｃまたはＦａｂ領域に対するものであり得る。他の融合成分には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、疎水性ペプチド、脂肪酸分子、標識などが含まれる。
様々なタグポリペプチドおよびそれらの各抗体が当分野で周知である。例には、ポリ−ヒスチジン（ポリｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159−2165 (1988)]；ｃ−ｍｙｃタグおよびこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Evan et al., Molecular and Cellular Biology、5:3610−3616 (1985)]；および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Paborsky et al., Protein Engineering、3(6):547−553(1990)] が含まれる。その他のタグポリペプチドには、Ｆｌａｇペプチド［Hopp et al., BioTechnology 6:1204−1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin et al., Science 255:192−194 (1992)]；チューブリンエピトープペプチド［Skinnere et al., J. Biol. Chem. 266:15163−15166 (1991)]；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識［Lutz−Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:6393−6397 (1990)］が包含される。
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を、発現後に精製または単離する。変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、サンプル中にどのような他の成分が存在するかに応じて、当業者に知られる様々な方法で単離または精製し得る。標準的精製法には、電気泳動、分子的、免疫学的技術、並びに、イオン交換、疎水性、親和性および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーおよびクロマトフォーカシングを包含する、クロマトグラフィー技術が含まれる。例えば、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は標準的抗ライブラリー抗体カラムを使用して精製し得る。タンパク質濃縮と連結した限外濾過およびダイアフィルトレーション技術もまた有用である。好適な精製技術の一般的指針については、Scopes, R.; Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982) を参照。必要な精製の程度は変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の用途に応じて変わる。いくつかの例では精製は必要ないであろう。
好ましい実施態様では、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、拮抗される天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質から分離して産生され、精製される。つまり、変異型単量体を作成し、単量体またはオリゴマーの形態で、野生型タンパク質に導入する。例えば、好ましい方法は、変異型単量体の患者への投与を含み、それにより変異型単量体がホモオリゴマー（一般に三量体）に「交換」して入り、混合オリゴマーを産生し、受容体活性化の減少に至る。別の実施態様では、変異型オリゴマーが投与され得、その後交換する。しかしながら、遺伝子治療適用などのいくつかの実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、天然産生ＴＮＦＳＦ標的と実質的に同時に産生され得る。
一度作成したら、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質および核酸は、数々の適用に用途がある。好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、ＴＮＦＳＦ関連疾患を処置するために患者に投与される。
本明細書中の「ＴＮＦＳＦ関連疾患」または「ＴＮＦＳＦ応答性障害」または「症状」は、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を含む医薬組成物の投与により改善し得る障害を意味する。限定でないが、自己免疫、炎症性および免疫性障害を含む。変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、免疫調節疾患の病理における主要なエフェクターである。
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質は、例えば、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、血管炎、酒さ（rosecea）、アクネ、湿疹（excema）、心筋炎および心筋の他の症状、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞（synovial fibroblasts）、骨髄ストロマ；骨減少；パジェット病、骨巨細胞腫；多発性骨髄腫；乳癌；廃用性骨減少症（disuse osteopenia）；栄養失調症、歯周病、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球症、脊髄損傷、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性（monoostotic）線維性骨異形成、多骨性（polyostotic）線維性骨異形成、歯周再構成（periodontal reconstruction）、および骨折；サルコイドーシス；多発性骨髄腫；溶骨性骨肉腫、乳癌、肺癌、腎臓癌および直腸癌；骨転移、骨痛の管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎および他の脊椎関節症；移植拒絶、ウイルス感染、血液新形成および新生様症状、例えば、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、毛様細胞白血病およびリンパ形質細胞性白血病）、リンパ球前駆細胞の腫瘍（Ｂ細胞急性リンパ芽球白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球白血病／リンパ腫を含む）、胸腺腫、成熟ＴおよびＮＫ細胞の腫瘍（末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大顆粒リンパ球性白血病を含む）、ランゲルハンス細胞組織球症、骨髄新形成（急性骨髄性白血病（成熟を認めるＡＭＬ、分化していないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病および急性単球性白血病を含む）、骨髄異形成症候群、および慢性骨髄増殖性障害（慢性骨髄性白血病を含む）など）、中枢神経系の腫瘍、例えば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星細胞腫、骨髄腫、上衣細胞腫および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽頭癌、基底細胞腫、膵臓癌、胆管の癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮、膣部または子宮頸の癌、卵巣癌、原発性肝癌または子宮体癌）、および血管系の腫瘍（血管肉腫および血管外皮細胞腫）、骨粗鬆症、肝炎、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、脊椎関節炎、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および敗血症ショック、クローン病、乾癬、強皮症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、膵島同種移植拒絶、血液悪性腫瘍（多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形性症候群（ＭＤＳ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）など）、癌、および、腫瘍、末梢神経損傷または脱髄性疾患に関連する炎症を処置するのに使用される。
本明細書中、「治療上有効な用量」とは、それが投与される目的の効果を奏する用量を意味する。正確な用量は処置目的によって変わり、既知の技術を用いて当業者が確認できるであろう。好ましい実施態様では、約０.０１ないし約５０μｇ／ｋｇの用量を使用し、静脈内または皮下のいずれかに投与する。当分野で知られるように、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の分解、全身対局所送達、および新たなプロテアーゼ合成の速度、並びに年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用および状態の重篤度についての調節が必要であり得る。これらは当業者により日常的実験で確認されるであろう。
本発明の目的のための「患者」とは、ヒトおよびその他の動物の両者、特に哺乳動物、および生物を包含する。従って、この方法は、ヒトの治療および獣医学的適用の両者に適用可能である。好ましい実施態様では患者は哺乳動物であり、最も好ましい実施態様では、患者はヒトである。
本発明において「処置」という用語は、疾患または障害に対する治療的処置、並びに予防または抑制方法を包含することを意味する。従って、例えば疾患の発症前に変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をうまく投与することは、その疾患の「処置」をもたらす。別の例として、疾患の症状に対抗するために、その疾患の臨床症状発現後に変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をうまく投与することは、その疾患の「処置」を含む。「処置」はまた、疾患を根絶するために、その疾患の出現後に変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を投与することをも包含する。臨床症状の緩和の可能性および恐らくは疾患の軽減を伴う、発症後および臨床症状発現後にうまく投与することは、該疾患の「処置」を含む。
「処置を必要とする」ものには、既にその疾患または障害を有する哺乳動物、およびその疾患または障害に罹り易い哺乳動物が包含され、その疾患または異常を防止すべき哺乳動物が包含される。
別の実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質、変異型ＴＮＦＳＦ遺伝子、または変異型ＴＮＦＳＦ抗体の治療上有効な用量を、ＴＮＦＳＦタンパク質の不適当な発現を含む疾患を有する患者に投与する。本発明の範囲内にある「ＴＮＦＳＦタンパク質の不適当な発現を含む疾患」とは、ＴＮＦＳＦタンパク質の量の変化による、またはＴＮＦＳＦタンパク質変異体の存在に起因する、異常なＴＮＦＳＦタンパク質を特徴とする疾患または障害の包含を意味する。過剰は、分子レベルでの発現の過剰、作用位置での延長されたもしくは蓄積された出現、または正常状態と比べて増強されたＴＮＦＳＦタンパク質の活性を包含するが、これらに限定されない、いかなる原因にも起因し得る。この定義には、ＴＮＦＳＦタンパク質の減少を特徴とする疾患または異常が包含される。この減少は、分子レベルでの発現の減少、作用位置での短縮されたまたは減少した出現、ＴＮＦＳＦタンパク質の変異、または正常状態と比して低下したＴＮＦＳＦタンパク質の活性を包含するが、これらに限定されない、いかなる原因にも起因し得る。ＴＮＦＳＦタンパク質の正常な発現、出現、または活性と比較した、このようなＴＮＦＳＦタンパク質の過剰または低下は、本明細書に記載し引用したアッセイ（但しこれらに限定されない）に従って、測定できる。
好ましくは無菌水性溶液の形態での、本発明の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内、経皮、局所（例えば、ジェル、膏薬、ローション、クリームなど）、腹腔内、筋肉内、肺内（例えば、Aradigm から販売されている AERx（登録商標）吸入可能技法または Inhale Therapeutics から販売されている InhanceＴＭ 肺送達システム)、腟内、直腸内、または眼内を包含するがこれらに限定されない、様々な方法で行い得る。いくつかの例では、例えば、創傷、炎症などの処置において、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を液剤または噴霧剤として直接適用し得る。導入の様式に応じて、医薬組成物は様々な方法で製剤化し得る。
また、本発明の組成物に、持続放出または制御放出製剤を使用し得る。例えば、ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）のマトリックスに組み込まれた所望の生物活性分子で構成されるミクロスフェアをベースとする送達システム、ProLease（登録商標）(Alkermesから販売)、および他の医薬的に適合する重合性マトリックスを使用して持続放出製剤を創製し得る。
治療的に活性な変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の製剤内濃度は、約０.１から１００重量％まで変わり得る。別の好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の濃度は０.００３ないし１.０モル濃度の範囲であり、体重１キログラム当たり０.０３、０.０５、０.１、０.２、０.３ミリモルの用量が好ましい。
本発明の医薬組成物は、患者への投与に好適な形態で変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を含む。好ましい実施態様では、医薬組成物は、医薬的に許容し得る塩として存在するような、水溶性の形態であり、これは酸および塩基付加塩を両方とも含むことを意味する。「医薬的に許容し得る酸付加塩」とは、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸等の有機酸を用いて形成された、遊離塩基の生物学的効力を保持し、かつ生物学的またはその他の意味で有害でない塩を表す。「医薬的に許容し得る塩基付加塩」とは、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩等の無機塩基から誘導されるものを包含する。アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩が特に好ましい。医薬的に許容し得る有機非毒性塩基から誘導される塩は、第一、第二、および第三アミン、天然産生置換アミンを包含する置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミンの塩を包含する。
この医薬組成物は、以下のものの１またはそれ以上を含み得る：血清アルブミンなどの担体タンパク質；ＮａＯＡｃなどの緩衝剤；微結晶性セルロース、乳糖、トウモロコシおよびその他の澱粉などの増量剤；結合剤；甘味料およびその他の香料；着色剤；並びにポリエチレングリコール。添加剤は当分野で周知であり、様々な製剤に使用されている。
さらなる実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質はミセル製剤に添加されている；米国特許第５,８３３,９４８を参照（出典明示によりその全体を本明細書の一部とする）。
医薬組成物の組み合わせを投与し得る。さらに、該組成物は他の治療薬と組み合わせて投与し得る。
本明細書で提供されるある実施態様では、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を包含するがこれらに限定されない抗体を、当分野で知られる方法を用いて変異型ＴＮＦＳＦタンパク質に対して作製する。好ましい実施態様では、これらの抗変異型ＴＮＦＳＦ抗体を免疫療法に使用する。従って、免疫療法の方法を提供する。「免疫療法」とは、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質に対して作製された抗体による、ＴＮＦＳＦ関連疾患の処置を意味する。本明細書で使用する免疫療法とは、受動的または能動的であってよい。本明細書で定義する受動免疫療法は、レシピエント（患者）への抗体の受動的移動である。能動免疫は、レシピエント（患者）における抗体および／またはＴ細胞応答の誘導である。免疫応答の誘導は、レシピエントに、それに対して抗体が作製される変異型ＴＮＦＳＦタンパク質抗原を提供した結果であり得る。当業者に理解されるように、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質抗原は、それに対して抗体が作製されることが望まれる変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドをレシピエントに注射することによって、または、レシピエントを、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質抗原を発現することのできる変異型ＴＮＦＳＦタンパク質コード核酸と、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質抗原の発現のための条件下で、接触させることによって、提供し得る。
別の好ましい実施態様では、治療用化合物を、抗体、好ましくは抗変異型ＴＮＦＳＦタンパク質抗体とコンジュゲートさせる。この治療用化合物は細胞毒性物質であり得る。この方法では、腫瘍組織または細胞に細胞毒性物質を標的化することが、罹患細胞の数の減少をもたらし、それにより、癌および変異型ＴＮＦＳＦ関連疾患に伴う症状を低減させる。細胞毒性物質は多数かつ多岐にわたり、細胞毒性薬物または毒素またはかかる毒素の活性断片を包含するが、これらに限定されない。好適な毒素およびそれらの対応断片には、ジフテリアＡ鎖、エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン等が包含される。細胞毒性物質はまた、細胞周期タンパク質に対して作製された抗体にラジオアイソトープをコンジュゲートさせることにより、または、抗体に共有結合させたキレート剤に放射性核種を結合させることによって作成される放射性化学物質を包含する。
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を治療物質として投与し、上記概説のように製剤化できる。同様に、変異型ＴＮＦＳＦ遺伝子（全長配列、部分配列、または変異型ＴＮＦＳＦコード領域の制御配列を包含する）を、当分野で知られるように、遺伝子治療適用において投与し得る。これらの変異型ＴＮＦＳＦ遺伝子は、当業者に理解されるように、遺伝子治療（即ち、ゲノムへの組み込みのため）またはアンチセンス組成物としての、アンチセンス適用を包含できる。
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をコードする核酸を、遺伝子治療にも使用し得る。遺伝子治療適用では、例えば欠陥遺伝子の置換用に、治療上有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成するために細胞内に遺伝子を導入する。「遺伝子治療」は、１回の処置によって永続的効果が達成されるものと、治療上有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの１回または反復投与を含む遺伝子治療剤の投与の、両方の常套的遺伝子治療を包含する。ある遺伝子の発現をインビボで遮断するための治療用物質として、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡを使用できる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に引き入れることができ、細胞膜による取り込みが限定されているため細胞内濃度が低いにも拘わらず、そこでそれらがインヒビターとして作用するということが既に示されている [Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:4143−4146 (1986)]。このオリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電したホスホジエステル基を非荷電基で置換することにより、それらの取り込みを高めるように修飾できる。
生存細胞に核酸を導入するために利用できる様々な技術がある。この技術は、核酸を、培養細胞にインビトロで移行させるのか、または意図する宿主の細胞にインビボで移行させるのかによって異なる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移行させるのに好適な技術には、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等の使用が包含される。現在好ましいインビボ遺伝子移行技術には、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターによる形質移入およびウイルス外殻タンパク質−リポソーム媒介形質移入が包含される［Dzau et al., Trends in Biotechnology 11:205−210(1993)]。いくつかの状況では、核酸供給源に、標的細胞を標的化する物質、例えば細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等を供給することが望ましい。リポソームを採用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、標的化および／または取り込みの促進のために使用できる。例えば、特定の細胞タイプに指向性のカプシドタンパク質またはその断片、周期的にインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的とし、細胞内半減期を増大させるタンパク質である。受容体媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば Wu et al., J. Biol. chem. 262:4429−4432 (1987)；および Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3410−3414 (1990) に記載されている。遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコールの総説については Anderson et al., Science 256:808−813(1992) を参照されたい。
他の実施態様では、変異型ＴＮＦＳＦ遺伝子は、単一の遺伝子または変異型ＴＮＦＳＦ遺伝子の組み合わせのいずれかのＤＮＡワクチンとして投与される。裸のＤＮＡワクチンは、当分野で一般的に知られている。Brower, Nature Biotechnology, 16:1304−1305 (1998)。ＤＮＡワクチンとしての遺伝子の使用方法は当業者に周知であり、変異型ＴＮＦＳＦ遺伝子または変異型ＴＮＦＳＦ遺伝子の一部を、処置を必要とする患者における発現のためのプロモーターの制御下に置くことを包含する。
ＤＮＡワクチンに使用される変異型ＴＮＦＳＦ遺伝子は、全長変異型ＴＮＦＳＦタンパク質をコードしていてよいが、より好ましくは、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質から誘導されるペプチドを含む変異型ＴＮＦＳＦタンパク質の部分をコードしている。好ましい実施態様では、患者を、変異型ＴＮＦＳＦ遺伝子から誘導される複数のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンで免疫する。同様に、本明細書で定義する複数の変異型ＴＮＦＳＦ遺伝子またはその部分で患者を免疫することも可能である。理論に束縛されないが、ＤＮＡワクチンによりコードされるポリペプチドの発現、細胞障害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞および抗体が誘導され、これらはＴＮＦＳＦタンパク質を発現する細胞を認識し、かつ破壊または排除する。
好ましい実施態様では、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンと共にアジュバント分子をコードする遺伝子を包含する。かかるアジュバント分子には、ＤＮＡワクチンによりコードされる変異型ＴＮＦＳＦポリペプチドに対する免疫原性応答を増大させるサイトカインが包含される。付加的または代替的アジュバントが当業者に知られており、本発明で用途がある。
特許、特許出願（仮、実用新案およびＰＣＴ）および出版物を含む、本明細書に引用されている文献は、全て出典明示によりそれらの全体を本明細書の一部とする。
以下の実施例は、上記発明の使用様式をより詳細に説明し、そして本発明の様々な態様を実行するために企図される最良の形態を記載するのに役立つ。これらの実施例は、決して本発明の真の範囲を限定するために役立たず、むしろ例示説明の目的で提示されることが理解される。
実施例
ＴＮＦ−アルファライブラリーの発現、精製およびＴＮＦ−アルファ変異型の活性アッセイ
方法：
１）終夜培養物の調製
９６ウェルＰＣＲプレート中の形質転換能 Tuner(DE3)pLyS 細胞を、１μlのＴＮＦ−アルファライブラリーＤＮＡで形質転換し、３４ｍg／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＬＢ寒天プレートに広げた。３７℃で終夜生育させた後、コロニーを各プレートから、９６深ウェルブロックに入っている３４ｍg／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１００ｍg／ｍｌのアンピシリンを有する１.５ｍｌのＣＧ培地に採取した。ブロックを２５０ｒｐｍ、３７℃で終夜震盪した。
２）発現
コロニーをプレートから、２４ウェルブロック中の５ｍｌのＣＧ培地（３４ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン）に採取し、ＯＤ６００ ０.６になるまで３７℃、２５０ｒｐｍで生育させ、その時点で各ウェルに１ｍＭ濃度までＩＰＴＧを加えた。培養物をさらに４時間生育させた。
３）分解
２４ウェルブロックを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットを７００μlの分解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）に再懸濁した。−８０℃で２０分間冷凍し、３７℃で解凍した（２回）後に、ＭgＣl２を１０ｍＭまで、ＤＮａｓｅＩを７５ｍｇ／ｍｌまで加えた。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。
４）Ｎｉ ＮＴＡカラム精製
非変性条件用の Qiagen Ni NTA スピンカラム精製プロトコールに従って精製を行った。精製されたタンパク質を１ＸＰＢＳに対して１時間４℃で４回透析した。Millipore マルチスクリーンＧＶフィルタープレートを使用して、透析されたタンパク質をフィルター滅菌し、後の滅菌哺乳動物細胞培養物へのタンパク質添加を可能にした。
５）定量
精製タンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥで定量し、コーマシー染色および Kodak（登録商標）デジタル・イメージ密度測定を行った。
ＴＮＦ−アルファアンタゴニスト活性
Ａ）材料と方法：アッセイ用に細胞を播いた：２.５ｘ１０５細胞／ｍｌでＷＥＨＩを播く（５０μｌ／ウェル）。次のようにアッセイ培地を調製した：１Ｘ Assay Medium、４０ｍｌ完全ＲＰＭＩ培地、８０μｌアクチノマイシンＤ（最終濃度２μｇ／ｍｌ）。アッセイ培地＋野生型ＴＮＦ−アルファを調製した（野生型ＴＮＦ−アルファは、１.１ｍｇ／ｍｌ−１μｇ／ｍｌである：１：１０００；ＲＰＭＩ１ｍｌ中、原液１μｌ−２０ｎｇ／ｍｌ：１μｇ／ｍｌの１：５０；アッセイ培地４０ｍｌ中、８００μｌ。ＴＮＦアルファ変異型の希釈は、下記に通りに行った。
Figure 2005530482
５）阻害アッセイ用の希釈：
１Ｘアッセイ培地にＴＮＦ受容体（ＴＮＦ Ｒ）を希釈するための原液：原液は１００μｇ／ｍｌである。２０μｇ／ｍｌ用：１：５希釈：１００μｇ／ｍｌ原液６０μｌ＋野生型ＴＮＦ−アルファを有する１Ｘアッセイ培地２４０μｌ
以下に示すように、２０ｎｇ／ｍｌの野生型ＴＮＦ−アルファを含有するＴＮＦ Ｒアッセイ培地（細胞上で最終的に１０ｎｇ／ｍｌ）を希釈した：
Figure 2005530482
上記希釈は全て、細胞に添加する１６時間前に行った。その後、各希釈サンプル１２０μｌを４℃でインキュベートし、各サンプル１２０μｌを３７℃でインキュベートした。翌朝、各サンプル５０μｌを細胞に添加した。細胞を３７℃で４時間インキュベートした。４時間のインキュベーション後、カスパーゼ基質１００μｌを各ウェルに添加し、続いて３７℃で２時間インキュベートした。蛍光を読む。結果を図６に示す。
組合せたＴＮＦ−アルファ変異体のＴＮＦ−アルファアンタゴニスト活性
材料と方法：
アッセイ用に細胞を播いた：ＷＥＨＩ１６４−１３Ｖａｒ細胞を、７.５ｘ１０５細胞／ｍｌで播き（５０μｌ／ウェル）、３７℃で終夜インキュベートし、アッセイ培地を調製した（１０Ｘ、細胞上の最終濃度は１０ｎｇ／ｍＬになる）（完全ＲＰＭＩ７ｍｌ、３１０μｇ／ｍＬ野生型ｈｉｓ−ＴＮＦ[Lot#263−56] ５μＬ、１ｍｇ／ｍＬアクチノマイシンＤ１４０μＬ）。ＴＮＦ−アルファ変異体の希釈は、以下のように、実験開始３日前にこれらのサンプルを混合することにより行った：
Figure 2005530482
全ての希釈を行った後、ＷＴｈｉｓＴＮＦａを含有する１０Ｘアッセイ培地６８.４（ＴＮＦ Ｒには３４.２）ｕＬを、各希釈ウェルに添加した。次いで、９６ウェルを３日間インキュベーター内に置いた。各サンプル５０ｕｌをＷＥＨＩ１６４−１３Ｖａｒ細胞に４時間添加した。インキュベーションが完了したら、カスパーゼ基質１００ｕｌを添加した。１.５時間インキュベートした。Ｒ１１０標準をＲＰＭＩ中で１：１００に希釈し、８点の１／２希釈を続けることにより、Ｒ１１０曲線も調製した。各希釈１００ｕｌを、細胞なしのプレートに添加した。これらの希釈は細胞に基質を添加する直前に行った。基質１００ｕｌもＲ１１０曲線希釈に添加した。３７℃での１.５時間のインキュベーションが完了したら、４８４／５３５ｎｍ波長で Wallac 蛍光計を使用して全サンプルを読んだ。結果を図６に示す。
ＴＮＦ−アルファ変異体の固定平衡スクリーニング
反応液５０μＬ中、０.０１ｍｇ／ｍＬ野生型ｈｉｓ−ＴＮＦ[lot#263−56]を０.１ｍｇ／ｍＬ変異型ＴＮＦ−アルファと共にリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中で混合することにより、１：１０固定平衡比のＴＮＦ−アルファ変異体を調製した。
Figure 2005530482
この混合物を調製し、３７℃で３−４日間インキュベートした。アッセイ用に細胞を播いた：ヒトＵ９３７細胞を、１ｘ１０６細胞／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）で播き、３７℃で終夜インキュベートした。
カスパーゼアッセイ
完全ＲＰＭＩ培地を温め、２ｕｇ／ｍＬアクチノマイシンＤを添加した。各５０ｕＬの反応液全部を、アクチノマイシンＤを添加したＲＰＭＩ培地４５０ｕＬと混合した。この混合物を１：１に１１回希釈し、固定平衡用の用量曲線を生成させた。５０ｕＬの希釈混合物を細胞に４部（quadruplicate）適用した。細胞をＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦ−アルファ変異型固定平衡中で１.５時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、カスパーゼ基質１００ｕｌを添加し、１.５時間インキュベートした。Ｒ１１０標準をＲＰＭＩ中で１：１００に希釈し、８点の１／２希釈を続けることにより、Ｒ１１０曲線も調製した。１００ｕｌの各希釈を、細胞なしのプレートに添加した。これらの希釈は細胞に基質を添加する直前に行った。基質１００ｕｌもＲ１１０曲線希釈に添加した。３７℃での１.５時間のインキュベーションが完了したら、４８４／５３５ｎｍ波長で Wallac 蛍光計を使用して全サンプルを読んだ。結果を図６Ａ−Ｃに示す。
結合アッセイ
２０モル濃度過剰のＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンをタンパク質サンプルに添加し、サンプルを氷上で２時間インキュベートすることにより、ＴＮＦａのビオチン化を実施した。過剰のビオチンをサンプルから透析により除去した。カップリング率は、１ないし４の範囲にあった。ビオチン化ＴＮＦａのタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce）により測定した。マイクロタイタープレートのウェルを２.５ｍｇ／ｍｌ濃度の抗ＦＬＡＧ抗体で被覆し、３％ＢＳＡにより終夜４℃でブロックした。ＦＬＡＧタグ付きタンパク質ＴＮＦＲ１受容体をＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、抗ＦＬＡＧ被覆マイクロタイタープレートのウェルに添加し、プレートを２時間室温でインキュベートした。０−１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にあるビオチン化ＴＮＦａタンパク質を４部で抗−ＦＬＡＧ−ＴＮＦＲ１−被覆ウェルに添加し、総結合を表した。非特異的結合は、０−１μｇ／ｍｌの濃度範囲にあるビオチン化ＴＮＦアルファタンパク質を、抗ＦＬＡＧ抗体のみで被覆したウェルに４部で添加することにより測定した。終夜＋４℃で結合を生じさせ、平衡を確実にした。アルカリホスファターゼ結合ニュートラアビジン（neutravidin）(Pierce）をＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中１：１０,０００希釈でウェルに添加し、３０分間室温でインキュベートした。ＣＳＰＤ ｓｔａｒ基質（Applied Biosystems, Foster City, CA）を添加して発光を検出し、測定した（Wallac VICTOR, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA)。総結合から非特異的結合を差し引くことにより、ＴＮＦａの特異的結合を算出した。データを結合方程式ｙ＝（ＢＬｍａｘ＊ｘ）／（Ｋｄ＋ｘ）にフィットさせた。
結合アッセイの結果を図６に示す。全変異型は、受容体結合の低下を示した。
実施例７
ＴＮＦ−アルファ変異型は野生型ＴＮＦ−アルファと交換し、ＮＦｋＢの活性化を低下させる
試験したＴＮＦ−アルファ変異体は、Ａ１４５Ｒ、二重変異体Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈおよび三重変異体Ｅ１４６Ｋ／Ｖ９１Ｅ／Ｎ３４Ｅであった。Ｈｉｓ−タグ付きＴＮＦ−アルファを、１０倍過剰（１：１０）の様々な変異体と共に、３日間３７℃で予めインキュベートした。野生型ＴＮＦ−アルファ単独および予め交換したＴＮＦ−アルファ変異型のヘテロ三量体を、２９３Ｔ細胞においてＮＦｋＢ作動性ルシフェラーゼレポーター（pNFkB−luc, Clontech）を活性化する能力について試験した。２９３Ｔ細胞を１.２ｘ１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。Fugene 形質移入試薬を製造者のプロトコール（Roche）に従って使用し、ｐＮＦｋＢ−ｌｕｃ（ＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼレポーター）またはｐＴａｌ（対照：ルシフェラーゼ遺伝子を作動させる基底プロモーターであるが、ＮＦｋＢ結合エレメントを含まない）で細胞を形質転換した。形質移入の１２時間後、細胞を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ野生型ＴＮＦ−アルファまたは予め交換した１０ｎｇ／ｍｌ：ＴＮＦ／１００ｎｇ／ｍｌ変異型の混合物で処理した。処理の１２時間後、Steady−Glo Luciferase Assay System (Promega) を製造者のプロトコールに従って使用し、９６ウェルプレート中の細胞をルシフェラーゼアッセイ用に加工した。各ウェルからの発光を、Packard TopCount NXT (Packard Bioscience) 発光カウンターを使用して測定した。処理サンプルを４部で試験し、各処理につき、標準偏差を含む棒の値として発光の平均値をプロットした。結果を図２０Ａに示す。グラフは、本発明のＴＮＦ−アルファ変異型は、野生型ＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢ活性化を低下させるのに有効であったことを示す。ＴＮＦ−アルファ変異型Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈは、ＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢ活性化を低下させるのに最も有効であった。
ＨｅＬａ細胞におけるＮＦｋＢの免疫局在
ＨｅＬａ細胞を、１２ｍｍ滅菌カバースリップ（Fisherbrand）上に、１.５ｘ１０５細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレート中で播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。翌日、様々な濃度のｈｉｓタグ付き野生型ＴＮＦ−アルファ、Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ変異型単独、またはｈｉｓ−タグ付きＴＮＦ−アルファおよび１０倍過剰のＡ１４５／Ｙ８７Ｈ変異型（３日間、３７℃で予め交換した）により、３７℃、５％ＣＯ２で細胞を処理した。３０分間のインキュベーションの後、６ウェルプレート中でカバースリップに接着した細胞を、ＰＢＳで短く洗浄し、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで１０分間固定した。次いで、細胞を免疫細胞化学用に加工する前に、細胞をＰＢＳでさらに５回洗浄するか、または最後のＰＢＳ洗浄液中で終夜維持した。カバースリップ上に固定した細胞を、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで処理した。緩衝液を吸引し、カバースリップ毎に５０ｕｌの０.１％ＢＳＡ／０.１％ＴＸ−１００／ＰＢＳを用いて、加湿チャンバー内で１５分間、３７℃でカバースリップ上の細胞をブロックした。ブロック用試薬を除去し、ＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニット（pAb C-20, Santa Cruz Bioscience）に対する一次抗体と置き換えた。１時間、３７℃でインキュベートした後、抗体を除去し、カバースリップを５回ＰＢＳで洗浄した。ブロック緩衝液に希釈（１：１００）した５０ｕｌのＦＩＴＣ結合二次抗体（Jackson Immuno laboratories）を各カバースリップ（Jackson Immunolaboratories）に添加し、カバースリップを遮光加湿チャンバー内でさらに１時間インキュベートし、二次抗体をＰＢＳによる５回の洗浄で除去した。カバースリップを蒸留水で短くすすぎ、遮光チャンバー内で空気乾燥させ、Anti−fade (Molecular Probes）を使用してスライドにマウントした。Cool SNAP−Pro CCD カメラ (Media Cybernetics）と組み合わせた Nikon Eclipse TS100 顕微鏡でＦＩＴＣフィルターおよび４０ｘ対物レンズを使用して、抗体に反応した細胞のデジタル画像を捉え、Image Pro Plus ソフトウェア (Media Cybernetics）を使用して操作した。
図４Ｂは、ＨｅＬａ細胞におけるＮＦｋＢの免疫局在の写真を示す。これは、ＨｅＬａ細胞において、野生型ＴＮＦ−アルファとＡ１４５／Ｙ８７Ｈ ＴＮＦ−アルファ変異型の交換が、ＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢの核移行を阻害することを示す。ＴＮＦ−アルファ変異型Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ単独は、野生型ＴＮＦ−アルファと異なり、ＮＦｋＢの核移行を誘導しない。さらに、過剰の変異型（１０倍過剰のＴＮＦ−アルファ変異体Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ）とヘテロ三量体を形成するように交換（３日間、３７℃）された野生型ＴＮＦ−アルファは、そのＮＦｋＢの核移行を誘導する能力を喪失する。このデータは、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるこの変異型の効果と一致する。
ＴＮＦＡ変異体Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈは、ＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢ作動性ルシフェラーゼレポーターの活性化を低減させる
Ｈｉｓ−タグ付き野生型ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−アルファ変異型Ａ１４５／Ｙ８７Ｈおよび交換した野生型ＴＮＦ−アルファ：Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈヘテロ三量体（１０倍過剰のＴＮＦ−アルファ変異型Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈと、３７℃で１日交換した）を、上記実施例７Ａの通りに、ＮＦｋＢルシフェラーゼレポーターアッセイで試験した。実験は、より広い範囲の最終ＴＮＦ−アルファ濃度および増大する用量（０.７８、１.５６、３.１３、６.２５、１２.５、２５ｎｇ／ｍｌ）を、各ＴＮＦ−アルファ濃度において１０倍過剰のＴＮＦ−アルファ変異型（Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ）で使用したことを除き、実施例７Ａの通りに実行した。
野生型ＴＮＦ−アルファ：Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈヘテロ三量体は、活性化レベルを有意に低下させた。これは、野生型ＴＮＦ−アルファに対するＴＮＦ−アルファＡ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ変異型の阻害効果を示す。図４Ｃの下の点線が示すように、野生型ＴＮＦ−アルファと異なり、ＴＮＦ−アルファ変異型Ａ１４５／Ｙ８７Ｈ単独は、ＮＦｋＢ活性化に対して有意なアゴニスト的（agonizing）効果を有さない。図４Ｃの灰色の実線が示すように、ＮＦｋＢ結合エレメントなしのレポーターは、ＴＮＦ−アルファに応答しないので、野生型ＴＮＦ−アルファに誘導される活性化は、ＮＦｋＢ活性化依存性である。
アンタゴニスト性ＲＡＮＫＬ変異体ライブラリーの設計
一本鎖多様性を含むドミナントネガティブ戦略を使用して、そして競合阻害性アンタゴニストの選択により、アンタゴニスト性ＲＡＮＫＬ変異体を生成させた。
ドミナントネガティブＲＡＮＫＬライブラリー変異体
ＰＤＡＴＭを利用して、ＲＡＮＫＬのヒト構造モデルを生成させ、ＲＡＮＫ結合を乱すアミノ酸を選択した。ヒトＯＰＧＬの結晶構造がないので、相同性モデルを創製する必要があった。ここでは、ヒト配列およびマウスＲＡＮＫＬ構造（ＰＤＢ＃１ＪＴＺ）に基づいて、ＰＤＡＴＭを側鎖置換に使用した。このモデル形成は、マウスとヒトのＲＡＮＫＬ配列間の８７％の配列同一性により促進された。ドミナントネガティブＲＡＮＫＬ治療戦略は、受容体結合および／または活性化特性が低下し、野生型ＲＡＮＫＬとヘテロ三量体を形成する能力を有する（図２１）、新規ＲＡＮＫＬ変異型の設計をベースとする。換言すれば、ＲＡＮＫを活性化しないＲＡＮＫＬ変異型が、野生型ＲＡＮＫＬタンパク質と交換し、それを不活性ヘテロ三量体に隔離し、その活性を阻害する。この処理の結果、破骨細胞の数と活性が低下し、骨再吸収の減少と包括的な骨のミネラル密度の増加を導く。
重要なＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ接触点のアミノ酸を、リガンドの受容体活性化能力を乱すアミノ酸と置換することにより、ドミナントネガティブＲＡＮＫＬ変異型を設計した。ＰＤＡＴＭ技法を使用して、最適なタンパク質の折り畳みに適する置換を選択した。これらの三量体ＲＡＮＫＬ変異型と三量体野生型ＲＡＮＫＬとの交換は、野生型ＲＡＮＫＬの不活性化と、破骨細胞形成の低下をもたらす。この目標の達成をより効果的に補助するために、ＲＡＮＫＬ変異型を野生型ＲＡＮＫＬと優先的にヘテロ三量体形成するように設計することもできる。
一本鎖ドミナントネガティブポリペプチド
単量体を共有結合により連結するための多数の戦略が存在する。これには、ゼロまたはそれ以上のアミノ酸からなる、２つのドメインのＮおよびＣ末端間のポリペプチド連結（複数のドメインを含む一本鎖ポリペプチドをもたらす）；単量体間のジスルフィド結合を介する連結；化学的架橋剤を介する連結が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
受容体結合が除去（または低減）されるように個々のドメインを修飾するために、多数の戦略が存在する。これには、リガンドドメインと受容体との間に立体的相反を創製するアミノ酸修飾；静電気的相反を創製するアミノ酸修飾；不利なアミノ酸の脱溶媒和を創製する修飾；およびリガンド／受容体中間面でのアミノ酸の化学修飾（例えば、ＰＥＧ化またはグリコシル化）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
ＲＡＮＫＬ単量体の三量体への連結
これらの変異体のドミナントネガティブ挙動を改善するために、２個の修飾受容体相互作用ドメイン間に一本鎖二量体を創製する。
ＲＡＮＫＬ変異型ライブラリーの構築
リンパ節ｃＤＮＡにＲＴ−ＰＣＲを使用して、全長ＲＡＮＫＬｃＤＮＡをクローニングした。ＴＥＶおよびＨＩＳタグのＰＣＲ媒介性付加の後、２つの長さのＲＡＮＫＬ、アミノ酸１４７ないし３１７および１５９ないし３１７を、ｐＥＴ３３ｂにサブクローニングした。
所望のアミノ酸置換をもたらすヌクレオチドの変化を導入するために、変異誘発反応を実施した。変異誘発反応は、特定のアミノ酸変化を導入するヌクレオチド変動を伴う、分岐し重複するオリゴヌクレオチド対を利用する。これらのオリゴヌクレオチドは、Ｐｆｕポリメラーゼを使用して、多数回の熱サイクルを通して伸長され、これらの伸長産物をＤｐｎＩで切断した後に、ＴＯＰ１０細菌細胞に産物を形質移入する。クローンを配列決定して設計した変化を確認し、熱サイクル中にｃＤＮＡに修飾が導入されていないことを保証した。
非アゴニスト、スーパーアゴニスト、およびアンタゴニストについてのＲＡＮＫＬ変異型スクリーニング
８９個のヒトＲＡＮＫＬ変異型からなるライブラリーを構築した。ライブラリーの全構成員は、図１ｂのアミノ酸配列および２つの溶解性付与置換、Ｃ２２１Ｓ／Ｉ２４７Ｅ、並びに８９個のコンピューター処理により設計された阻害的修飾を含む。これらの８９個のヒトＲＡＮＫＬ変異型タンパク質を大腸菌で発現および精製し、ＲＡＷ２６４.７細胞における破骨細胞発生をモニターするアッセイで、５２個を非アゴニスト、スーパーアゴニスト、およびアンタゴニストについてスクリーニングした。ＲＡＷ２６４.７細胞を精製ヒトＲＡＮＫＬ変異型タンパク質で処理し、放出されたＴＲＡＰを測定することにより、非アゴニストおよびスーパーアゴニストを同定した。スクリーニングした５２個のＲＡＮＫＬ変異型の中で、２１個のＲＡＮＫＬ変異型が非アゴニストと同定され、一方Ｃ２２１Ｓ／Ｉ２４７Ｅ／Ａ１７２Ｒはスーパーアゴニストであると判明した。加えて、上記の拮抗作用スクリーニングにより、６個の拮抗作用変異型が同定された。これらの拮抗作用変異型は、ヒトＲＡＮＫＬの破骨細胞発生活性を低下させる能力を有する。
酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性のバイオアッセイ
非アゴニスト作用、スーパーアゴニスト作用および拮抗作用をアッセイするために、ＴＲＡＰ活性のバイオアッセイを使用した。ＲＡＮＫＬ変異型タンパク質をＲＡＷ２６４.７などの細胞株に添加した後に、ＴＲＡＰ活性を測定し、非アゴニストまたはスーパーアゴニストであるＲＡＮＫＬ変異型を同定した（図２３−２５、２９）。アンタゴニストのＲＡＮＫＬ変異型を同定するために、ＲＡＮＫＬ変異型タンパク質を活性ＲＡＮＫＬ可溶性変異型の１つであるＣ２２１Ｓ／Ｉ２４７Ｅと混合し、タンパク質混合物をＲＡＷ２６４.７に添加し、ＴＲＡＰ活性を測定することにより、さらなるスクリーニングを実施した。ＲＡＮＫＬ可溶性変異型Ｃ２２１Ｓ／Ｉ２４７Ｅの活性を下げるアンタゴニストのＲＡＮＫＬ変異型を同定した。
ＲＡＷ２６４.７細胞（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−７１）を、７５ｃｍ２のフラスコ中、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内、３７℃で、２ｍＭＬ−グルタミン（Gibco-BRL#12571-063）、１０％熱非動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Hyclone#SH30071.03）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco-BRL#15140-122）各々１００ユニット／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌを含むａ−ＭＥＭを含有する生育培地中で培養維持した。
組換えマウスＲＡＮＫＬ（R&D#462-TR）、組換えヒト可溶性ＲＡＮＫＬ（Biosource#PHP0034)、および組換えヒト可溶性ＲＡＮＫＬ変異体を、１０％熱非動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Hyclone#SH30071.03）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco-BRL#15140-122）各々１００ユニット／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌを添加したｌ−グルタミン（Gibco-BRL#12571-063）を含むａ−ＭＥＭからなるアッセイ培地中で、その使用濃度に希釈した。ＲＡＮＫＬ標準およびサンプル２５０ｍｌを９６ウェルアッセイプレートに３部（triplicate）または４部で添加し、アッセイ培地１２５ｍｌを含有する次のウェルに１２５ｍｌを移すことにより、１：２に連続希釈した。
消耗した培地を吸引し、予め温めた培地１０ｍｌをフラスコに添加し、細胞スクレーパーを使用して細胞をフラスコからそぎ落とすことにより、細胞を回収した。細胞を１５ｍｌの円錐管に移し、１０００ｒｐｍで５分間回転させ、アッセイ培地１０ｍｌに再懸濁した。細胞を計数し、９６ウェルアッセイプレート中、１.５ｘ１０３／１２５ｍｌ／ウェルの密度で播いた。アッセイプレートを、３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で、７２時間インキュベートした。
ＲＡＷ２６４.７から誘発された破骨細胞様細胞の量を、酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を測定することにより判定した。ｐ−ニトロフェノールリン酸（ｐＮＰＰ）（ICN#100878）２０ｍｇをＴＲＡＰ緩衝液ｐＨ５.０（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１１.５ｍｇ／ｍｌ酒石酸ナトリウム（ICN#195503））１０ｍｌに添加することにより、ＴＲＡＰ基質を調製した。アッセイプレートから培地を吸引し、廃棄した。１：１エタノールおよびアセトン溶液で細胞を１分間固定し、ＰＢＳ（Hyclone#SH30256.02）１００−１５０ｍｌ／ウェルで１回洗浄した。ＴＲＡＰ溶液１００ｍｌを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。０.２Ｎ ＮａＯＨ溶液５０ｍｌ／ウェルを添加することにより反応を停止させ、４０５ｎｍで吸光度を読んだ。吸光度が飽和に達した場合、溶液を１：５に希釈し、再度読んだ。
酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の細胞学的染色
並行実験で、ＲＡＷ２６４.７細胞からの破骨細胞発生を、酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）多核陽性細胞の存在により、細胞学的染色を使用して測定した。染色に先立ち、０.２Ｍ酢酸ナトリウム溶液３５.２ｍｌ、０.２Ｍ酢酸溶液１４.８ｍｌおよび水５０ｍｌを合わせることにより、０.１Ｍ酢酸緩衝液を調製した。ＴＲＡＰ緩衝液ｐＨ５.０（５０ｍＭ酢酸緩衝液、３０ｍＭ酒石酸ナトリウム（Sigma#S-8640）、０.１ｍｇ／ｍｌ Napthol AS-MX Phosphate Disodium Salt (Sigma#N-5000)、０.１％ Triton X-100）１０ｍｌを、各アッセイ用に新しく調製した。ＴＲＡＰ緩衝液を３７℃の水浴で温め、０.３ｍｇ／ｍｌのFast Red Violet LB Stain (Sigma#F-3381）を添加し、染色物を３７℃の水浴に戻した。アッセイプレートから培地を吸引し、廃棄した。ＰＢＳ（Hyclone#SH30256.02）１５０ｍｌ／ウェルで細胞を１回洗浄し、続いて１０％グルタルアルデヒド溶液１００ｍｌ／ウェルで、１５分間３７℃で固定した。予め温めたＰＢＳ１５０ｍｌ／ウェルで細胞を２回洗浄した。予め温めたＴＲＡＰステイン（stain）１００ｍｌを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で５−１０分間インキュベートした。ＴＲＡＰステインを除去し、ＰＢＳ１００ｍｌを各ウェルに添加し、細胞が乾くのを防止した。ＴＲＡＰ陽性多核細胞（３個以上の核）を計数した。図７に結果を示す。
他のＴＮＦＳＦ変異型
ＢｌｙＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＡＰＲＩＬ、ＯＸ−４０を上記開示のプロトコールに従って生成させた。それらを対応する野生型ＴＮＦＳＦメンバーと交換した。ＡＰＲＩＬおよびＢｌｙＳは、それらの間で、そして対応するＡＰＲＩＬまたはＢｌｙＳと、交換した。結合アッセイおよび用量反応曲線を、各ＴＮＦＳＦメンバーについて行った。
本発明の特定の実施態様を例示説明のために記載したが、添付の特許請求の範囲に記載された発明を逸脱することなく、詳細について多数の変形を為し得ることが、当業者に理解される。
図１は、ドミナントネガティブＴＮＦＳＦタンパク質が、それによって天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質の作用と拮抗できる総合的メカニズムを示す。 図２は、ＴＮＦＳＦリガンド単量体の構造的重複を示す。 図３は、ヒトＴＮＦＳＦメンバー群の多項配列アラインメント（ＭＳＡ）を示す。 図４Ａは、ＴＮＦ−アルファ変異型群を、野生型ＴＮＦ−アルファと予め交換して、２９３Ｔ細胞中のＴＮＦ−アルファ誘発性のＮＦｋＢ活性化を低減させていることを示すチャートである。図４Ｂは、野生型ＴＮＦ−アルファのＡ１４５／Ｙ８７ＨＴＮＦＳＦ変異型との交換が、ＨｅＬａ細胞中でのＮＦｋＢのＴＮＦＳＦ−誘発性核移行を阻害することを示している、ＨｅＬａ細胞中でのＮＦｋＢの免疫的−位置特定写真である。図４Ｃは、ＴＮＦＳＦ変異型Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈが、ＮＦｋＢ−誘導ルシフェラーゼレポーターの、野生型ＴＮＦＳＦ−誘発性活性化を低減することを示す。 図５は、ＴＮＦ−アルファ変異型のアンタゴニスト活性を示すチャートである。 図６Ａ−Ｃは、各種ＴＮＦ−アルファ変異型による、カスパーゼ活性化についての用量応答曲線である。 図７Ａは、ドミナント−ネガティブ阻害性ＲＡＮＫＬ変異型ストラテジーモデルを示す。 図７Ｂは、コンピューター設計した阻害性ＲＡＮＫＬ変異型のリストを示す。 図７Ｃは、ＲＡＮＫＬ溶解性変異型Ｃ２２Ｓ／Ｉ２４７Ｅ媒介の破骨細胞発生が、ＯＰＧおよびＲＡＮＫ−Ｆｃによって拮抗されることを示す。 図７Ｄは、ＲＡＮＫＬ変異型拮抗スクリーンを示す。 図７Ｅは、１０倍過剰の変異型に対するＲＡＮＫＬ−Ｃ２２１Ｓ／Ｉ２４７Ｅの固定比率を用いるＲＡＮＫＬ変異型拮抗スクリーンを示す。 図７Ｆは、ＲＡＮＫＬ変異型拮抗スクリーンを示す。 図７Ｇは、ＲＡＮＫＬ拮抗変異型の要約を示す。

Claims (44)

  1. 天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質に拮抗する（antagonize）方法であって、天然産生ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質を、ＴＮＦＳＦタンパク質の少なくとも１つの変異型細胞外ドメインを含む変異型ＴＮＦＳＦ単量体と接触させ、混合ＴＮＦＳＦオリゴマーを形成させることを含む方法。
  2. 該混合オリゴマーが野生型オリゴマーと比較して低減された受容体シグナル伝達を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 該混合オリゴマーが受容体シグナル伝達を実質的に活性化できない、請求項２に記載の方法。
  4. 該混合オリゴマーが少なくとも１つの受容体結合部位において受容体中間面と相互作用し、該受容体が実質的に受容体シグナル伝達を活性化できないようにする、請求項１に記載の方法。
  5. 該変異型ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質が、その対応する野生型ＴＮＦＳＦタンパク質と対比して低減された所望の受容体に対する親和性を有する少なくとも１つの受容体接触ドメインを含み、かつ他のＴＮＦＳＦ単量体と相互作用する能力を保持している、請求項１に記載の方法。
  6. 該変異型ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質が、天然産生ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質と物理的に相互作用し、天然産生ＴＮＦＳＦが少なくとも１つの受容体を活性化する能力を低減させる、請求項１に記載の方法。
  7. 該変異型ＴＮＦＳＦタンパク質が融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  8. 該変異型タンパク質が化学修飾されている、請求項１に記載の方法。
  9. 該化学修飾がＰＥＧ化である、請求項８に記載の方法。
  10. 該混合オリゴマーが、単量体間に共有結合によるクロスリンク（cross-linkage）を含む、請求項８に記載の方法。
  11. 該混合オリゴマーが、単量体間に少なくとも１つのリンカーペプチドを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 該リンカーペプチドが、少なくとも１つのそして約３０よりは多くないアミノ酸残基の配列である、請求項１１に記載の方法。
  13. 該リンカーペプチドが、少なくとも５つのそして約２０よりは多くないアミノ酸残基の配列である、請求項１２に記載の方法。
  14. 該リンカーペプチドが、少なくとも１０のそして約１５よりは多くないアミノ酸残基の配列である、請求項１３に記載の方法。
  15. 該リンカーペプチドが、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒの少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の方法。
  16. 混合ＴＮＦＳＦオリゴマーの作成方法であって、ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質の少なくとも１つの変異型細胞外ドメインを含む変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を、天然産生ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質を含むホモオリゴマーと、少なくとも１つの天然産生ＴＮＦＳＦ単量体が変異型単量体と交換して混合オリゴマーを形成する条件で、接触させることを含む方法。
  17. ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質の少なくとも１つの変異型細胞外ドメインを含む少なくとも１つの変異型ＴＮＦＳＦタンパク質、および天然産生ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質を含む、混合ＴＮＦＳＦオリゴマー。
  18. ＴＮＦＳＦタンパク質の少なくとも１つの変異型細胞外ドメインを含む変異型ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質。
  19. 変異型ＴＮＦＳＦタンパク質が少なくとも１つの受容体結合部位で受容体中間面と相互作用し、該受容体が実質的に受容体シグナル伝達を活性化できないようにする、変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  20. その対応する野生型ＴＮＦＳＦタンパク質と対比して低減された所望の受容体に対する親和性を有する少なくとも１つの受容体接触ドメインを含み、かつ他の受容体相互作用ドメインと相互作用する能力を保持している、請求項１８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  21. 少なくとも１つの請求項１８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質単量体を含む混合ＴＮＦＳＦオリゴマーであって、該混合オリゴマーが、野生型オリゴマーと対比して対応する受容体を活性化する能力が低減されたものである、混合ＴＮＦＳＦオリゴマー。
  22. 該変異型ＴＮＦＳＦタンパク質が天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質と物理的に相互作用して混合三量体を形成する、請求項１８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  23. 受容体接触位置に修飾を含む請求項１８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質単量体を少なくとも１つ含む、混合ＴＮＦＳＦオリゴマー。
  24. 該変異型ＴＮＦＳＦタンパク質が三量体中間面位置に修飾を含む、請求項１８に記載の変異型ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質。
  25. 該変異型ＴＮＦＳＦタンパク質がその対応する天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質と物理的に相互作用する、請求項１８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  26. 該変異型ＴＮＦＳＦタンパク質がそれに対応しない天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質と物理的に相互作用する、請求項１８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  27. 請求項１８ないし請求項２６のいずれかに記載の変異型ＴＮＦＳＦ単量体タンパク質をコードする組換え核酸。
  28. 請求項２７に記載の組換え核酸を含む発現ベクター。
  29. 請求項２７に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
  30. 請求項２８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  31. 請求項２９または請求項３０に記載の宿主細胞を、該核酸の発現に適する条件で培養することを含む、非天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質の製造方法。
  32. 該ＴＮＦＳＦタンパク質を回収することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 請求項１８ないし請求項２６のいずれかに記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質および医薬的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
  34. 処置を必要とする患者に、請求項１８ないし請求項２６のいずれかに記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質を投与することを含む、ＴＮＦＳＦ関連障害の処置方法。
  35. 該ＴＮＦＳＦ関連障害が自己免疫疾患である、請求項３４に記載の方法。
  36. 少なくとも１つの修飾が非保存的である、請求項１８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  37. 少なくとも１つの修飾が表面の修飾である、請求項１８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  38. 該修飾が、大型ドメイン、小型ドメイン、ＤＥループ、三量体中間面およびそれらの組合せからなる群から選択されるドメインに位置する、請求項３６に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  39. 少なくとも１つの該大型ドメイン位置が、ＴＮＦＡ対応位置２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、６３、６４、６５、６６、７７、６８、６９、１１２、１１３、１１４、１１５、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６および１４７からなる群から選択される、請求項３８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  40. 少なくとも１つの該小型ドメイン位置が、ＴＮＦＡ対応位置７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９、９５、９６、９７および９８からなる群から選択される、請求項３８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  41. 少なくとも１つの該ＤＥループ位置が、ＴＮＦＡ対応位置８４、８５、８６、８７、８８および８９からなる群から選択される、請求項３８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  42. 少なくとも１つの該三量体中間面位置が、ＴＮＦＡ対応位置１１、１３、１５、３４、３６、５３、５４、５５、５７、５９、６１、６３、７２、７３、７５、７７、１１９、８７、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０２、１０３、１０４、１０９、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１４７、１４８、１４９、１５１、１５５、１５６および１５７からなる群から選択される、請求項３８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  43. 少なくとも１つの該三量体中間面位置が、５７、３４および９１からなる群から選択される、請求項４２に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
  44. 該変異型ＴＮＦＳＦタンパク質が可溶性天然産生ＴＮＦＳＦタンパク質に拮抗する、請求項１８に記載の変異型ＴＮＦＳＦタンパク質。
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