CN1318105A - 负调节Osteoprotegerin配体活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了负调节osteoprotegerin配体(OPGL,TRANCE)的生物学活性的新方法，从而使得治疗/缓解以骨质过度丧失为特征的疾病如骨质疏松症成为可能。负调节是通过在需要的个体中诱导抗OPGL的免疫应答而实现。免疫应答可通过用OPGL的免疫原性变异体传统免疫接种或用编码OPGL变异体的核酸免疫接种而产生。本发明还涉及用于本发明的组合物、多肽和核酸，以及用于制备这些物质的载体和转化的宿主细胞。

Description

负调节Osteoprotegerin配体活性的方法
发明领域
本发明涉及对骨质疏松症和其它以骨组织持续性减少为特征的疾病的治疗和预防的改进。更明确地说，本发明提供了一种通过促使骨质疏松症患者或处于患病危险的个体中抗Osteoprotegerin配体(OPGL)抗体的产生从而负调节OPGL的方法。本发明也提供了生产在此方法中有用的被修饰的OPGL的方法以及被修饰的OPGL。本发明也包括编码被修饰的OPGL的核酸片段、掺入这些核酸片段的载体以及用其转化的宿主细胞和细胞系。本发明还提供了一种在本发明的方法中有用的鉴定OPGL类似物的方法，以及一种包含被修饰的OPGL或包含编码OPGL类似物的核酸的组合物。
本发明背景
骨质疏松症是全世界范围内主要的并且日益增长的健康问题。它影响到美国、欧洲和日本大约7500万人民的健康。因此，在世界上的工业化国家中，它是最常见的全身性骨骼疾病。
骨质疏松症影响到四分之一的绝经后妇女和大多数老年人，其中包括相当数量的男性老年人。美国1500万受骨质疏松症影响的人在1984年全年花费在此疾病上的钱估计是3.8亿美圆。以此外推，全世界范围内花费在此疾病上的钱至少是20亿美圆。
骨质疏松症是一种以低骨质和骨组织的细微结构退化、骨脆性增加并且易于骨折为特征的全身性骨疾病。尽管它影响到全身的骨骼，但以脊柱、腕骨和髋骨的骨折最为典型和最为普遍。随年龄增长，发展成为骨质疏松的危险性增大，并且女性的危险性大于男性。其病因学似乎存在于发生在绝经后妇女和年龄较大的所有个体中的某种加速骨质的正常损失的机制中。
骨质在人大约35岁时达到峰值。到达峰值后，由于在骨重塑中的不平衡，骨质随年龄增长而下降。骨骼失去其矿物质和有机基质但仍保留其基本结构。
骨包含一个由一系列蛋白和蛋白聚糖构成的矿物质化的细胞外基质部分；其基本成分是Ⅰ型胶原蛋白。细胞外基质的外壳中的矿物质是羟基磷灰石(Ca3(PO4)2Ca(OH)2)。骨在生长和发育过程中不停地塑造并且终生随物理的和化学的信号而重塑。
骨的生长、发育和保持是高度调节的过程，在细胞水平涉及骨形成细胞(成骨细胞)和骨再吸收细胞(破骨细胞)的协同调节。骨质的水平反映出骨形成和再吸收的平衡。
成骨细胞起源于间充质干细胞并且在骨发育过程中、受到损伤后和终生发生的重塑中产生骨基质。破骨细胞从单核巨噬细胞系的造血前体细胞分化产生并且再吸收骨基质。
成骨细胞和破骨细胞功能的不平衡导致以骨质增加(骨硬化病)和骨质减少(骨质疏松症)为特征的骨骼异常。
在突变小鼠中对骨硬化病的研究发现，在破骨细胞发育、成熟和/或活化中的遗传缺损导致骨再吸收降低并且均造成严重的硬骨病(Marks,1989)。而且，至今对在生理性调节破骨细胞发育中起作用的可溶性因子知之甚少。
但是，最近描述和鉴定了两种参与此调节过程的蛋白质(Simonet等，1997；Lacey等，1998)。这两种蛋白质是Osteoprotegerin和Osteoprotegerin配体。Osteoprotegerin是肿瘤坏死因子受体家族中的一个新的、分泌性的成员。在体外，Osteoprotegerin以一种剂量依赖的方式阻断破骨细胞的形成。表达Osteoprotegerin的转基因小鼠显示出骨密度的普遍增加(骨硬化病)同时伴随破骨细胞的减少。给正常小鼠施与重组的Osteoprotegerin产生相似的效果，并且在大鼠中可保护卵巢切除相关的骨损失(Simonet等，1997)。此外，出生时正常的Osteoprotegerin缺陷鼠(基因敲除鼠)发展成为早期骨质疏松症和动脉硬化(Bucay等，1998)。这些观察结果强有力地指出Osteoprotegerin阻断了破骨细胞……最主要的如果不是唯一的骨再吸收细胞类型的话……的分化，暗示它可以作为骨再吸收中的体液调节因子来起作用。Osteoprotegerin是WO97/23614的主题。
据推测Osteoprotegerin可能通过与一个刺激破骨细胞发育的因子结合并且中和其活性而起作用，从而抑制了破骨细胞的成熟(Simonet等，1997)。Osteoprotegerin配体(OPGL)是存在于膜上和以可溶形式存在的细胞因子肿瘤坏死因子家族的新成员。OPGL与Osteoprotegerin结合，其结合亲和性为4nM。在体外，在CSF-1存在的情况下，OPGL激活成熟的破骨细胞并且调节骨髓前体细胞形成破骨细胞。已经证明在CSF-1处理的骨髓中OPGL与破骨细胞前体细胞的表面结合。但是，这些造血细胞前体细胞上OPGL的受体尚不明确。在体内，重组的可溶性OPGL是骨再吸收的一种有效的诱导剂(Lacey等，1998)。
对OPGL的描述
OPGL是作为一个包含317个氨基酸残基(人，见SEQ ID NO:2)或316个氨基酸残基(鼠，见SEQ ID NO:4和6)的Ⅱ型跨膜蛋白而合成的。对两氨基酸序列的比较显示在87％的同源位置发现了相同的氨基酸。
在OPGL氨基酸序列的N端49位氨基酸残基和69位氨基酸残基之间推定的跨膜区之后包含一个短的胞质结构域。根据其与肿瘤坏死因子α的同源性，暗示OPGL的细胞外部分由两个功能域组成：一个是从70位氨基酸残基延伸到157位氨基酸残基的柄状区域；和一个从158位氨基酸残基延伸到C末端的活性配体部分。
与OPGL关系最密切的蛋白质似乎是诱导凋亡的细胞因子TRAIL，它们之间相同的氨基酸残基少于25％。最近在其它文献中也克隆出了OPGL，并且分别叫做TRANCE(Wong等，1997，生物化学杂志，272:25190-25194)和RANKL(Anderson等，1997，自然，390:175-179)。此蛋白也被认为是破骨细胞分化因子。
已经在大肠杆菌中表达和纯化了几种鼠源OPGL的N端缺失突变体。这些突变体分别由75-316,128-316,137-316和158-316位氨基酸残基组成。根据圆二色性研究，三个最短的突变体具有相同的β折叠结构，并且都能与Osteoprotegerin结合。但更重要的是这三个突变体在体外分析中都是有活性的(Lacey等，1998)。
对最短的突变体研究得最深入。与肿瘤坏死因子α类似，这个OPGL突变体在溶液中以三聚体的形式存在，并且当其与Osteoprotegerin一起孵育时形成3∶3的复合体。研究发现其结合的亲和性为4nM。这种突变体在体内诱导小鼠的血钙离子显著增高(高血钙)。若同时施与Osteoprotegerin则显著减轻了OPGL的这种高血钙效应。
OPGL的最长的突变体(75-316位氨基酸残基)不与Osteoprotegerin结合并且它不具备任何生物学活性。
在构建OPGL的N端缺失突变体时，并不知道其天然切割位点。在人成纤维细胞293中表达全长的OPGL导致产生了起始于鼠蛋白第139位氨基酸残基或人蛋白同源的第140位氨基酸残基的可溶性的OPGL。这些表达研究同时也显示在人类细胞系中表达产生的可溶性OPGL是糖基化的。所以在鼠和人OPGL的C末端配体结构域含有三个潜在的N-糖基化位点并不另人惊奇。
我们并不知道血液中和组织中Osteoprotegerin的浓度，但我们知道Osteoprotegerin在浓度达到1ng/ml时具有显著的生物学活性。OPGL的生物学活性
当与CSF-1结合时，OPGL是一种有效的破骨细胞分化因子。这两种组分的任何之一单独都不能诱导前体细胞分化成为破骨细胞
OPGL是成熟的破骨细胞的一种有效的激活剂。在只有OPGL存在的情况下，OPGL就可以激活成熟的破骨细胞进行骨的再吸收。在这些实验中，并未观察到OPGL以破骨细胞生长因子或破骨细胞存活因子的方式起作用。
由于鼠OPGL在人外周血单核细胞培养中也可以诱导破骨细胞形成，所以OPGL的作用似乎无物种限制性。
本发明目的
本发明的目的是对以骨再吸收过度为特征的症状如骨质疏松等提供新的治疗手段。本发明更进一步的目的是开发抗OPGL的自身疫苗，以获得一种对骨质疏松症和其它涉及骨再吸收过度的病理性异常的新的治疗方法。
本发明概述
我们发现上述的数据暗示了OPGL的一种病理生理学的作用。体内的证据是不完全的或是间接的，但在我们的观点中它是令人信服的，尤其是结合直接证据的情况下。
我们认为对小鼠注射重组的OPGL的C末端导致了严重的高钙血症的观测结果直接指出了其病理生理学的作用。
间接证据来自出生时正常但随后发展为骨质疏松症的Osteoprotegerin缺陷鼠(基因敲除鼠)。这表明除去一个与OPGL结合并中和其效应的蛋白质导致了骨质疏松。我们得出结论认为其最可能的原因是由于OPGL引起的破骨细胞成熟和活化的增加。
其它两件间接证据是Osteoprotegerin转基因小鼠和注射Osteoprotegerin的小鼠都发展成为骨质疏松症。这表明一个结合OPGL并中和其效应的非天然的、高水平的蛋白质导致了骨质疏松。我们得出结论认为其原因是由于OPGL的中和引起破骨细胞的成熟和活化的降低。
因此我们提出一种模型，在此模型中OPGL和Osteoprotegerin分别作为破骨细胞发育的正和负调节因子起作用。换一句话说，OPGL促进骨再吸收而Osteoprotegerin抑制骨再吸收。
所以，在骨质疏松中OPGL可被认为是一种促进骨再吸收并最终导致骨质疏松的“致病因子”，同样Osteoprotegerin可被视为通过中和其活性而抗“致病因子”的“治疗剂”。
因此，我们提出通过在体内产生能中和OPGL的抗体来负调节破骨细胞分化/成熟/形成和破骨细胞的激活，从而提供了一种安全有效的治疗/缓解和/或预防骨质疏松和其它以骨形成速度大于骨再吸收速度为特征的疾病的方法。
因而，从其最宽广的和最普通的范围来说，本发明涉及一种在动物---包括人---体内负调节Osteoprotegerin配体(OPGL)活性的方法，这种方法包含以免疫学有效量向动物的免疫系统呈递以下物质
------至少一种已被配制的OPGL多肽或其亚序列，从而用此OPGL多肽或其亚序列免疫动物诱导抗OPGL多肽抗体的产生，和/或，
------至少一种在OPGL多肽上引入修饰的OPGL类似物，从而用此免疫动物可诱导抗OPGL多肽抗体的产生。
与涉及频繁(例如每天)施与Osteoprotegerin或与OPGL类似物具有结合亲和性的分子的方法相比，本发明方法最具吸引力的特征是例如通过阶段性的但不很频繁的免疫可控制骨质疏松。预期每年注射免疫原成分1至4次将会足以获得所需效果，然而若施与Osteoprotegerin或OPGL活性的其它抑制剂则需每天给药。
本发明也涉及OPGL类似物以及编码这些类似物的核酸片段。包含类似物或核酸片段的免疫原性组合物也是本发明的一部分。
最后，本发明涉及一种治疗骨质疏松症和以骨再吸收过度为特征的疾病的方法，其中施与一种可阻断OPGL与其在破骨细胞上的受体相互作用的非OPGL分子(典型的是抗体)。
本发明的详细描述
定义
为阐明本发明的边界和范围，下面将详细定义和解释在本说明书和权利要求书中用到的一些术语。
术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用指来源于胸腺的淋巴细胞，它们在体液免疫应答中负责各种细胞介导的免疫应答和辅助细胞活性。同样，“B淋巴细胞”和“B细胞”可互换使用指产生抗体的淋巴细胞。
术语“OPGL多肽”在此表示具有上面所讨论的人或鼠OPGL蛋白质氨基酸序列的多肽(或与完整的OPGL共享大部分B细胞表位的截短的部分)，而且此术语也包含与分离自其它物种的这两种蛋白质的类似物具有相同的氨基酸序列的多肽。使用如酵母或其他非哺乳动物真核表达系统具有不同的糖基化特征的形式和在原核系统中制备的非糖基化的OPGL形式也在本术语包括的范围之内。但是，当使用术语“一个OPGL多肽”时，其意思是当呈递给待治疗的动物时，该多肽通常是非免疫原性的。换句话说，此OPGL是一种自身蛋白或是一个通常情况下不引起动物产生抗OPGL免疫应答的自身蛋白的类似物。
术语“OPGL的类似物”是一种已经改变其一级结构的OPGL多肽。这种改变可以是例如一种OPGL多肽与一适合的融合配偶体融合的形式(即初级结构的改变专门涉及在C和/或N末端添加氨基酸残基)和/或在OPGL多肽的氨基酸序列中插入和/或缺失和/或取代的形式。本术语也包含OPGL衍生的分子，见下面对OPGL修饰的讨论。
需注意的是在人体内作为疫苗使用人OPGL的异种类似物(例如狗或猪的类似物)可以想象其可产生预期的抗OPGL的免疫应答。这种应用异种类似物的免疫也是本发明的一部分。
术语“多肽”在本文中指2至10个氨基酸残基的短肽，从11到100个氨基酸残基的寡肽和大于100个氨基酸残基的多肽。而且，本术语也包括蛋白质，即包含至少一个多肽的功能性的生物分子；当包含至少两种多肽时，它们可能形成共价连接或非共价连接的复合物。蛋白质中的多肽可被糖基化和/或脂质化和/或包含辅基。
术语“亚序列”指任何直接衍生于天然发生的OPGL的氨基酸序列或核酸序列的至少3个氨基酸或至少3个核苷酸的一段连续序列。
术语“动物”在本文中普遍表示一种动物物种(优选哺乳动物)，例Homo sapiens,Canis domesticus等，并且不仅仅指一个动物。但是，本术语也表示某一动物物种的一个群体，因为考虑到使用同样的免疫原来免疫动物根据本发明的方法被免疫个体都完全怀有同一种OPGL非常重要。例如，如果在不同群体中存在OPGL的遗传突变体，为了在每一群体中打破对OPGL的自身耐受，就很有必要在不同的群体中使用不同的免疫原。本领域熟练技术人员都很清楚地知道本文中的动物是一个具有免疫系统的生命体。此动物优选是脊椎动物如哺乳动物。
术语“体内负调节OPGL活性”在此指在活的生物体中降低OPGL与其(未知)受体(或OPGL和其他可能的生物学上很重要的结合此分子的配偶体)之间的相互作用。可以通过几种原理获得负调节：在这些原理当中，使用抗体结合OPGL的活性位点是最简单的。但是，由于抗体结合而导致的游走细胞(例如巨噬细胞和其他吞噬细胞)去除OPGL也在本发明的范围之内。
“向免疫系统呈递…”意指动物的免疫系统以一种可以控制的方式受到免疫原的攻击。正如将要在下文中出现的一样，有很多方法可以实现这种对免疫系统的攻击，在这些方法中最重要的是使用含多肽的“药物疫苗”(一种接种后可以治疗或缓解进行中的疾病的疫苗)接种或核酸“药物疫苗”接种。对于本发明中的创造性的想法，所要达到的最重要的结果是免疫感受态细胞以一种免疫学有效的方式对抗抗原，但是，达到此效果的精确方式不很重要。
术语“免疫学有效量”具有其在本领域中的普遍含义，即能够诱导免疫应答并能和与此免疫原共享免疫学特征的致病因子明显地作用的一定数量的免疫原。
表达法OPGL已被“修饰”在此指对构成OPGL骨架的多肽的化学改变。这种修饰可以是例如衍生化(如烷基化)OPGL序列中的某些氨基酸残基，但是正如将要在下文中所描述的那样，优选的修饰包含对OPGL氨基酸序列一级结构的改变。
在讨论到“对OPGL的自身耐受”时，可以理解为既然OPGL在待免疫的群体中是一种自身蛋白，此群体中的正常个体并不产生抗OPGL的免疫应答。但并不能排除在一动物群体内某一偶然的个体可以产生抗自身OPGL的抗体，例如作为自身免疫紊乱的一部分。在任何情况下，一个动物通常只对其自身的OPGL自身耐受，但这并不能排除此动物对来自其他物种动物或来自具有不同OPGL表型的另一群体动物的OPGL类似物也产生耐受。
术语“外源T细胞表位”(或“外源T淋巴细胞表位”)是一个能在动物物种中结合MHC分子并能刺激T细胞的肽。本发明优选的外源T细胞表位是“混栖”表位，即在一动物物种或群体中能够结合大部分的某一特定类别MHC分子的表位。目前仅知道非常有限的这种混栖T细胞表位，下面将会详细讨论它们。必须注意的是为了能够尽可能让本发明所用的免疫原在大部分的动物群体中有效，它必须(1)在同一OPGL类似物中插入几个外源的T细胞表位，或(2)制备几种OPGL类似物，每种类似物中插入不同的混栖表位。还必须注意的是外源T细胞表位的概念也包含使用隐藏的T细胞表位，即来自一自身蛋白并且只有在单独存在而不是自身蛋白一部分之时才表现免疫学行为的表位。
术语“外源T辅助淋巴细胞表位”(外源的TH表位)是一个与MHCⅡ类分子结合并能与MHCⅡ类分子一起被呈递在抗原呈递细胞(APC)表面的外源T细胞表位。
(生物)分子的“功能性部分”在本文中指至少负责由此分子发挥的生物化学的或生理学效应之一的分子部分。在本领域众所周知的是，许多酶和其他效应分子都具有一个负责由此分子发挥的效应的活性位点。此分子的其他部分可能起增加稳定性或可溶性的作用，并且如果这些作用与本发明的某一实施方案无关的话，可以舍弃这些部分。例如在OPGL中可能利用某种细胞因子作为修饰部分(见下面的详细讨论)，并且在此种情形下，既然与OPGL的偶联提供了必需的稳定性，稳定性问题就无关紧要了。
术语“佐剂”具有其在疫苗技术领域的普遍含义，即一种物质或其某一种成分，它(1)自身不能产生抗疫苗免疫原的特异的免疫应答，但是它(2)可以增强抗免疫原的免疫应答。或者，换句话说，仅仅用佐剂免疫不能引起针对免疫原的免疫应答，用免疫原免疫或许可以或许不能增加抗免疫原的免疫应答，但免疫原和佐剂组合使用所引起的抗免疫原的免疫应答比仅用免疫原所引起的免疫应答要强的多。
分子“导向”在本文中指一个分子一旦被引入动物就会优先出现在某些组织或优先与某些细胞或细胞类型有关的情况。通过许多方式可以达到这种效果，包括将此分子形成组合物促进“导向”或在分子引入促进“导向”的基团。下面将会很详细地讨论这个问题。
术语“刺激免疫系统”指某一物质或组合物显示出一种普遍的、非特异性的免疫刺激效应。许多佐剂和推定的佐剂(如某些细胞因子)具有刺激免疫系统的能力。使用免疫刺激剂的结果是免疫系统的“警觉性”增加，意味着与单独用免疫原免疫相比，同时或随后用免疫原免疫诱导一个更为有效的免疫应答。
对OPGL活性负调节的优选实施方案
在本发明的方法中优选的用做免疫原的OPGL多肽是一个在OPGL氨基酸序列上至少存在一个改变的被修饰的分子，因为那种方式大大促进了获得非常重要的破坏针对OPGL的自身耐受的机会。应该注意的是这并不排除在配制品中使用这种进一步促进了破坏针对OPGL的自身耐受的被修饰的OPGL的可能，例如包含佐剂的配制品。
已经报道(DalumⅠ等，1996，免疫学杂志，157:4796-4804)在正常个体中生理性地存在潜在的自身反应性的B淋巴细胞识别的自身蛋白。但是，为了诱导这些B淋巴细胞通常产生的与相关的自身蛋白反应的抗体，需要产生细胞因子的T辅助淋巴细胞的帮助(TH细胞或TH淋巴细胞)。由于T淋巴细胞通常情况下并不识别来自自身蛋白的由抗原呈递细胞(APCs)所呈递的T细胞表位，所以正常情况下T淋巴细胞并不提供这种帮助。但是，通过在自身蛋白内提供一个“外源”成分(即通过引入一个免疫学上显著的修饰)，一旦识别APC细胞(例如，首先，单核细胞)表面的外源表位，识别外源成分的T细胞就被激活。能够识别经修饰的自身蛋白上的自身表位的多克隆B淋巴细胞(也是APCs)也摄入抗原并随后呈递其外源T细胞表位，激活的T淋巴细胞随后提供细胞因子帮助这些自身反应性的多克隆B淋巴细胞。由于由这些多克隆B淋巴细胞所产生的抗体可以与被修饰的多肽上不同的表位包括那些呈现在天然多肽上的表位反应，从而诱导产生了可以与非修饰的自身蛋白交叉反应的抗体。总之，T淋巴细胞可被引导正如多克隆B淋巴细胞已经识别完全的外源抗原一样作用，而实际上仅仅插入的表位对宿主来说是外源的。通过这种方式，诱导产生了能与未经修饰的自身抗原交叉反应的抗体。
本领域已经知道几种为打破自身耐受而对自身抗原肽进行修饰的方法。根据本发明，对修饰总结为
------引入了至少一个外源的T辅助淋巴细胞表位(TH表位)，和/或
------引入了至少一个实现被修饰的分子定向至抗原呈递细胞(APC)或B淋巴细胞的第一部分，和/或
------引入了至少一个能刺激免疫系统的第二部分，和/或
------引入了至少一个能优化被修饰的OPGL多肽呈递给免疫系统的第三部分。
但是，由于B淋巴细胞对天然分子的识别因此而加强了，在引入这些修饰的同时应保持OPGL中大多数的原始B淋巴细胞表位不变。
在一个优选的实施方案中，共价或非共价引入侧基团(以外源T细胞表位或以上提到的第一、二和三部分的方式)。这意味着在未改变氨基酸序列一级结构的情况下从OPGL衍生出一段氨基酸残基，或至少未引入链中各氨基酸之间肽键的改变。
另一个优选的实施方案利用氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加(可通过重组的方式或肽合成的方式生效；涉及长氨基酸片段的修饰使用融合多肽)。本实施方案的一个特别优选的方案是在WO95/05849中描述的技术。此技术包含一种通过使用一些氨基酸序列已经被用相应数量的包含一外源免疫优势T细胞表位的氨基酸序列取代的自身蛋白的类似物免疫来负调节自身蛋白的方法，与此同时维持类似物中自身蛋白的总体三级结构不变。就本发明的目的，如果修饰(插入、添加、缺失或取代)产生一外源的T细胞表位并且同时在OPGL中保持显著数量的B细胞表位就足够了。但是，为了获得所诱导的免疫应答的最大效率，最好在被修饰的分子中维持OPGL的总体三级结构不变。
下面的公式描述了本发明普遍涵括的OPGL构建物：
(MOD1)s1(OPGLe1)n1(MOD2)s2(OPGLe2)n2……(MODx)sx(OPGLex)nx    (Ⅰ)
其中OPGLe1-OPGLex是含有OPGL亚序列的x个相同或不相同并且包含或不包含外源侧链基团的B细胞表位，x是一个大于等于3的整数，n1-nx是x个大于等于0的整数(至少一个大于等于1)。MOD1-MODx是在保存的B细胞表位间引入的x个修饰，s1-sx是x个大于等于0的整数(如果在OPGLe序列中没有引入侧链基团则至少有一个大于等于1)。因此，给定对构建物的免疫原性的总的功能性限制，本发明允许原始OPGL序列的所有各种排列，以及其中的所有种类的修饰。因此，包括在本发明中的是通过忽略在体内起反作用的OPGL的部分序列或通过忽略部分正常情况下位于胞内并且可能因此引起预料不到的免疫学反应的序列而获得的被修饰的OPGL。
可以有几种方法保持大部分的B细胞表位或甚至是在此描述的易于被修饰的蛋白的总体三级结构不变。一种方法是制备针对OPGL的多克隆抗血清(例如在兔中制备的抗血清)，并且此后使用此种抗血清作为抗所产生的被修饰蛋白的测试试剂(如，在竞争性ELISA中)。与抗血清反应的程度和OPGL相似的被修饰的模本(类似物)则被认为是具有与OPGL相同的总体三级结构；而与抗血清显示出有限的(但仍然显著的和特异的)反应性的类似物被认为是保持了原始B细胞表位的大部分。
另外，可以选择制备可与OPGL上相同的表位反应的单克隆抗体并且用于一系列测试。这种方法的优点是给予了(1)OPGL的表位图谱，和(2)在制备的类似物中保持的表位图谱。
当然，第三种方法可以解决OPGL或其生物活性截短部分的三维结构(见上)，并且将其与已经解决了三维结构的所制备的类似物的三维结构比较。在X-射线衍射研究和NMR光谱学的帮助下，可以解决其三维结构。为了提供给定分子的有用的三级结构信息，其他有关三级结构的信息在一定程度上可以从具有仅需要纯度较高的多肽的优点的圆二色性研究中获得(而X射线衍射需要晶体化的多肽并且NMR需要多肽的同位素突变体)。但是，由于圆二色性研究只能凭借其二级结构的信息提供关于正确的三维结构的间接的信息，最终结论仍需要用X射线衍射和/或NMR法获得。
本发明的一个优选实施方案使用OPGL上B淋巴细胞表位的多重呈递(即公式Ⅰ中，一个B细胞表位至少出现在两个位置上)。可以通过各种不同的方法达到此效果，例如，通过简单制备包含(OPGL)m结构的融合肽，其中m是一个大于等于2的整数，然后至少在OPGL序列之一上引入在此所讨论的修饰。引入的修饰最好包括B淋巴细胞表位的至少一个重复和/或引入半抗原。
正如上面所提到的，通过引入至少一个氨基酸的插入、添加、缺失或取代来完成一个外源T细胞表位的引入。当然，通常情况下在氨基酸序列上引入的改变不止一个(例如通过一个完整的T细胞表位的插入或取代)，但OPGL类似物才是所要达到的重要目标，当被抗原呈递细胞(APC)处理时，将会产生这样一个与MHCⅡ类分子结合共同呈递在APC细胞表面的外源优势免疫表位。因此，如果OPGL的氨基酸序列的合适位置包含许多也可在外源Th表位中发现的氨基酸残基，那么通过氨基酸插入、添加、缺失和取代的方法保留外源表位的氨基酸，从而引入外源Th表位。换句话说，就本发明的目的而言，并不需要通过插入或取代引入全长的Th表位。
插入、缺失、取代或添加的优选的氨基酸数目至少是2，例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20和25个插入、取代、添加或缺失。而且插入、取代、添加或缺失的氨基酸数目最好不超过150，例如最多100，最多90，最多80和最多70。尤其优选的是插入、缺失或添加的氨基酸数目不超过60，并在某些特别的情况下不超过50或甚至是40。最优选的情况是不超过30。关于氨基酸添加应该注意的是，当产生的构建物采取融合多肽的形式时，通常认为其氨基酸数目大于150。
本发明的优选实施方案包括通过引入至少一个外源优势免疫T细胞表位而造成的修饰。将认识到一个T细胞表位的免疫优势取决于所讨论的动物物种。正如在此所用的，术语“免疫优势”仅指在被接种的个体/群体中产生明显的免疫应答的表位，但众所周知的事实是在一个个体/群体中占免疫优势的T细胞表位在同一物种的另一个体中就未必是免疫优势的，尽管在后者中它可以与MHCⅡ类分子结合。因此，就本发明的目的而言，一个优势免疫T细胞表位是当呈现在抗原上时能有效提供T细胞辅助的T细胞表位。较为典型的是，优势免疫T细胞表位具有总是被呈递结合在MHCⅡ类分子上的内在特征，不管其所处的多肽如何。
另外很重要的一点是T细胞表位的MHC限制性。通常情况下，自然发生的T细胞表位是MHC限制性的，即组成T细胞表位的某一多肽只与MHCⅡ类分子的某一亚群有效结合。这又具有这样的效果，在大多数情况下使用一个特异的T细胞表位会导致一种疫苗组合物只在一部分群体中有效，根据那部分群体的大小，有必要在同一分子中包含更多的T细胞表位，或另外制备一个多成分的疫苗，其中的组分是凭借所引入的T细胞表位的性质来区分彼此的OPGL突变体。
如果对所用的T细胞的MHC限制性一无所知(例如在对被接种的动物的MHC组成不甚明了的情况下)，通过下列的公式可决定一个特异性疫苗组合物能覆盖的群体比例：
其中pi指对呈现在疫苗组合物中的第ith个外源T细胞表位的应答者占群体的频率，n是疫苗组合物中外源T细胞表位的总数。因此，一个含有3个在群体中应答频率分别是0.8,0.7,0.6的外源T细胞表位的疫苗组合物，会得出
              1-0.2×0.3×0.4=0.976即97.6％的群体在统计学上会对此疫苗产生MHCⅡ类分子介导的应答。
上面的公式并不适用于对所使用的肽的MHC限制性模式有或多或少精确了解的情况。例如，如果某一肽只与由HLA-DR等位基因DR1,DR3,DR5和DR7编码的人MHCⅡ类分子结合，那么将此肽与另一个可与由剩下的HLA-DR等位基因编码的MHCⅡ类分子结合的肽混合使用足可以达到讨论的群体100％的覆盖率。如果将应答群体的计算仅仅以疫苗中的T细胞表位的MHC限制性为基础，凭借下列公式可决定由某一特异疫苗组合物所覆盖的群体比例：
其中φj是编码MHC分子的可与疫苗中的任何一个T细胞表位结合并且属于第jth个已知的3个HLA的部位(DP,DR和DQ)等位基因单倍型在群体中的频率之和。在实际应用中，应首先确定哪个MHC分子可识别疫苗中的每一个T细胞表位并且随后根据类型将它们列出(DP,DR和DQ)。然后，对每一种类型来说，列出来的不同等位基因单倍型的个体频率被相加，因此产生了ψ1,ψ2和ψ3。
可能发生公式中pi值超过相应的∏i理论值的情况： π i = 1 - Π j = 1 3 ( 1 - v j ) 2 - - - - - - - - - ( IV ) 其中vj是编码MHC分子的可与疫苗中的第ith个T细胞表位结合并且属于第jth个已知的3个HLA的部位(DP,DR和DQ)等位基因单倍型在群体中的频率之和。这意味着在1-∏i的群体中应答者的频率为f剩余_i=(pi-∏i)/(1-∏i)。因此，调整公式Ⅲ就产生了公式Ⅴ：
其中，如果阴性的话，1-f剩余_i的值设为0。必须注意的是公式Ⅴ要求相同的单倍型群所有的表位都作出单倍型图谱。
因此，在选择引入OPGL类似物中的T细胞表位时，将这些表位的现有的所有知识包括在内非常重要：1)群体对每一表位的应答频率，2)MHC限制性数据，和3)相关的单倍型在群体中的频率。
在一动物物种或动物群体的大部分个体中存在许多有活性的、自然发生的“混栖”T细胞表位，并且这些“混栖”T细胞表位被优选引入，籍此降低在同一疫苗中使用很大数量的不同的OPGL类似物的需要。
根据本发明，混栖表位可能是一自然发生的人类T细胞表位，例如来自破伤风类毒素(如P2和P30表位)、白喉类毒素、流感病毒血凝素(HA)和恶性疟原虫CS抗原的表位。
过去数年中，也已经阐明了许多其他的混栖T细胞表位。特别是可与大部分的由已经阐明的不同HLA-DR等位基因编码的HLA-DR分子结合的多肽，并且根据本发明在所使用的类似物中这些都是可能被引入的T细胞表位。见下列参考文献所讨论的表位，在此参考文献都并入文中：WO98/23635(FrazerIH等，转让给昆士兰大学)；Southwood S等，1998，免疫学杂志，160:3363-3373；Sinigaglia F等，1998，自然，336:778-780；Chicz AM等，1993，实验医学杂志，178:27-47；Hammer J等，1993，细胞，74:197-203；和Falk K等，1994，免疫遗传学39:230-242。后一参考文献还涉及到HLA-DR和HLA-DP配体。在这5篇参考文献中所列出的所有表位都是被用于本发明的相关的天然候选表位，和与这些表位共享普通基序的表位一样。
另外，表位也可以是任何可以与大部分的MHCⅡ类分子结合的人工T细胞表位。根据本发明，本文中在WO95/07707和AlexanderJ等，1994，免疫1:751-761相应文章中所描述的泛DR表位肽(‘PADRE’)(在此参考文献都并入文中)都是待用的非常令人感兴趣的候选表位。应该注意的是，为了在施与疫苗时增加稳定性，这些文章中所公开的最有效的PADRE肽的C和N末端都带有D氨基酸。但是，本发明的基本目标在于将相关表位合并作为被修饰的OPGL分子的一部分，此OPGL随后在APC细胞的溶酶体胞中被酶降解掉以便随后呈递在MHCⅡ类分子上，因此在本发明所用的表位中掺入D-氨基酸是不利的。
一个特别优选的PADRE肽是具有AKFVAAWTLKAAA氨基酸序列或其免疫学有效亚序列的肽。这个以及其他同样缺乏MHC限制性的表位是优选的应该存在于本发明方法中所用的OPGL类似物中的T细胞表位。这个超混栖表位将解释本发明中最简单的实施方案，其中仅单一的OPGL被呈递给被接种动物的免疫系统。
如上所述，对OPGL的修饰也可包括引入使修饰后的OPGL定向至APC或B淋巴细胞的第一部分。例如，第一部分可以是B淋巴细胞特异性的表面抗原或APC特异性表面抗原的一个特异的结合配偶体。本领域已经知道很多这样的特异的表面抗原。例如，这个部分可以是在B淋巴细胞或APC细胞上有受体的碳水化合物(如甘露或甘露糖)。另外，第二部分可以是半抗原。可特异性识别APCs或淋巴细胞表面分子的抗体片段也可被用做第一部分(表面分子可以是例如巨噬细胞或单核细胞的Fcγ受体，如FcγRⅠ或，另外其他任何特异的表面标志如CD40和CTLA-4)。应该注意的是，所有这些可仿效的定向分子也可被用做佐剂的一部分，见下。
为了获得增强的免疫应答，作为将修饰的OPGL多肽定位至某一类型细胞的替代或补充方法，可能凭借将上面所提到的刺激免疫系统的第二部分包括在内来提高应答水平。这样的第二部分的典型例子是细胞因子和热休克蛋白或分子伴侣以及其有效部分。
根据本发明待用的合适的细胞因子通常情况下也可作为疫苗组合物的佐剂起作用，即例如γ干扰素(IFN-γ)，白细胞介素1(IL-1)，白细胞介素2(IL-2)，白细胞介素4(IL-4)，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素12(IL-12)，白细胞介素13(IL-13)，白细胞介素15(IL-15)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；另外细胞因子分子的功能性部分也足以用做第二部分。关于将这些细胞因子用做佐剂物质，见下面的讨论。
根据本发明，适于用做第二部分的合适的热休克蛋白或分子伴侣有HSP70,HSP90,HSC70,GRP94(也称做gp96，见Wearch PA等，1998，生物化学37:5709-19)和CRT(钙网蛋白)。
另外，第二部分也可以是一种毒素，例如李斯特氏菌毒素(LLO)、脂质体A和热稳定的内毒素。一些细菌衍生物如MDP(胞壁二肽)、CFA(完全弗氏佐剂)和海藻糖双酯TDM和TDE也是有趣的可能用做第二部分的物质。
引入一个可以增加被修饰的OPGL呈递给免疫系统的第三部分也是本发明的一个重要的实施方案。本技术领域已经出现了几个这种原理的实施例。例如，据我们所知，在布氏疏螺旋体蛋白OspA上的棕榈酰基脂质化锚蛋白可被利用以提供自身佐剂多肽(见，例WO96/40718)…似乎脂质化的蛋白带有一个由多肽的脂质化锚部分组成的核心，分子的剩余部分从其中突出从而形成一个胶囊样的结构，导致对抗原决定簇的多重呈递。因此，使用这种以及相关利用脂质化锚的方法(例如，肉豆蔻基，法呢基，香叶基-香叶基，GPI锚和N-酰基甘油二酯基)是本发明的优选实施方案，特别是因为在重组产生的蛋白质中提供这种脂质化锚很直接并且仅仅需要使用如自然发生的信号肽序列作为被修饰的OPGL多肽的融合配偶体。另外一种可能是使用补体成分C3的C3d片段或C3本身(见Dempsey等，1996，自然271:348-350和Lou&Kohler,1998，自然生物工程16:458-462)。
本发明的另外一个也可导致向免疫系统呈递多重拷贝的OPGL的重要表位区的(例如，至少是两个)实施方案是将OPGL亚序列或其突变体与另一个分子偶联在一起。例如，可以使用多聚体，例如碳水化合物如葡聚糖，见如Lees A等，1994，疫苗12:1160-1166；Lees A等，1990，免疫学杂志145:3594-3600。而且甘露和甘露糖也是有用的替代物。从如大肠杆菌和其他细菌来源的完整的膜蛋白也可是有用的结合配偶体，传统的载体分子例如KLH，破伤风类毒素，白喉类毒素和BSA也是优选的有用的结合配偶体。
原始的OPGL的某些区域似乎很适于进行修饰。由于OPGL与TNF-a和肿瘤坏死因子家族其他成员的结构关系，所以预测在170-192,198-218,221-246,256-261，或285-316位置(氨基酸序列号SEQ ID Nos:4,6和12)引入T细胞表位或其他修饰很有可能产生预期效果。这些位置指鼠的OPGL---在人OPGL分子上相应的位置是171-193,199-219,229-247,257-262，或286-317位置(氨基酸序列号SEQ ID No:2)。
这些选定的区域考虑到以下几点1)保存已知的和预测的B细胞表位，2)保持三级结构等。如上所述，无论如何，对已经在不同位置引入T细胞表位的一系列被修饰的OPGL分子进行筛选是非常容易的。
既然本发明的最优选的实施方案包括负调节人OPGL，因此上面所讨论的OPGL多肽优选是人OPGL多肽，在本实施方案中，特别优选的多肽是已经通过用等长的或不等长的并且含有一个外源TH表位的至少一个氨基酸序列取代在SEQ ID NO:2中的至少一个氨基酸序列(或在SEQ ID NO:2的一个多肽中221位的半胱氨酸被丝氨酸取代)而被修饰的人OPGL多肽。被取代的氨基酸残基选自SEQID NO:2中257-262,289-303和222-243位氨基酸残基。在实施例中详细讨论了隐藏在这些构建物后的基本原理。
OPGL和被修饰的OPGL多肽的配制
当凭借向动物施与疫苗的方式来实现将OPGL多肽或被修饰的OPGL多肽呈递给动物免疫系统时，多肽的配制遵循本技术领域普遍认可的基本原理。
制备含有肽序列作为活性成分的疫苗是本技术领域所普遍熟知的，正如在美国专利4608251,4601903,4599231,4599230,4596792和4578770中举例说明的那样。在此参考文献都并入文中。典型的是，这些疫苗被制备为可注射的溶液或悬液形式，也可制备为注射前适于溶于或悬浮于液体中的固体形式，制备物可被乳化。活性的免疫原成分常与药物学上可接受的并与此活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂有，例如水，盐，葡萄糖，甘油，酒精或其类似物以及它们的组合物。此外，如果需要的话，疫苗可以含有少量的辅助物质例如加湿剂或乳化剂，pH缓冲剂或增强这些疫苗效果的佐剂；见下面关于佐剂的详细讨论。
通常用传统的肠胃外的方式施与疫苗，例如通过皮下、皮内、真皮内、真皮下或肌肉注射。适于其他接种方式的另外的配制品包括栓剂和在一些情况下口服、经颊、舌下、腹膜内、阴道内、肛内、硬脑膜外、脊髓和颅内配制品。对于栓剂而言，粘合剂和载体可包括，例如聚乙二醇和甘油三酯；这些栓剂可形成自含有0.5％到10％，优选1-2％活性成分的混合物。口服剂型包括这些通常使用的赋形剂如制药等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖化钠、纤维素、碳酸镁及其类似物。这些组分采用溶液、悬液、药片、药丸、胶囊、缓释配制品或粉末的形式并且含有10-95％，优选25-70％的活性成分。对于口服剂型而言，白喉毒素是一种非常令人感兴趣的配制配偶体(并且也是一种可能的缀合配偶体)。
多肽可能以中性或含盐的形式被配制进疫苗之中。药物学上可接受的盐包括酸加合盐(与肽的游离氨基形成)并且其由无机酸例如盐酸或磷酸或诸如醋酸、草酸、酒石酸和苦杏仁酸及其类似物的有机酸形成。由游离羧基基团形成的盐也可来自无机盐如钠、钾、铵、钙或氧化铁和诸如异丙基胺、三甲胺、2-巯基乙醇、组氨酸、普鲁卡因及其类似物的有机盐。
以一种与剂量和剂型相容的方式接种疫苗，并且这个量是治疗上有效的和有免疫原性的。接种疫苗的量取决于被治疗的个体，例如，此个体的免疫系统产生免疫应答的能力和所期望的保护程度。合适的剂量范围约等于每次接种几百微活性成分，优选的范围是约0.1微克到200微克(尽管在1-10毫克的较高剂量范围内需慎重考虑)，例如在从约0.5微克到1000微克的范围内，优选的范围是从1微克到500微克尤其是在10微克到100微克的范围内。对于初次免疫和加强免疫的合适的策略也是不定的，但以初次免疫后随后加强接种或其他免疫方式为特征。
应用的方式可能变化很大。任何一种传统的施与疫苗的方式都是可行的。这些方法包括口服在生理学可接受的固体基础上或在生理学可接受的散剂基础上通过注射或类似的非胃肠道途径。疫苗的剂量将取决于接种疫苗的途径并且根据被接种个体的年龄和抗原的剂型而变化。
疫苗的一些多肽在一种疫苗中具有足够的免疫原性，但对于另外一些多肽来说如果疫苗进一步包含佐剂物质那么就会增强免疫应答。
对于疫苗来说，已经知道有许多方法可以达到佐剂效果。在“佐剂的理论和实际应用”，1995,Ducan ES Stewart-Tull(编者)，约翰威利父子公司，ISBN 0-471-95170-6，和在“疫苗：新一代的免疫学佐剂”，1995,Gregoriadis G(编者)，Plenum Press,纽约，ISBN 0-306-45283-9中都详细地说明了其一般原理和方法，在此以上两书并入文中。
特别优选的是，使用一种已经证明可以促进打破对自身抗原自身耐受状态的佐剂。实际上，在一些利用未经修饰的OPGL作为自身疫苗活性成分的情况下，这是必须的。合适的佐剂的无限的实施例选自包含一种免疫定向佐剂，一种免疫调节佐剂如毒素、细胞因子和细菌衍生物；油剂；聚合物；胶囊形成佐剂；皂苷；免疫刺激复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊粉和胶囊化佐剂的组。通常情况下，应该注意的是在上文中涉及的在类似物中用做第一、二、三部分的有用的化合物和制剂也同样适用于其在本发明疫苗佐剂中的应用。
佐剂的应用包括使用氢氧化铝或磷酸铝佐剂，通常用0.05-0.1％的缓冲盐溶液，与糖混合形成多聚物(例如Carbopol)的合剂使用0.25％的溶液，通过在70至101℃的范围内分别加热处理30秒至2分钟可使蛋白质聚集，使用胶联剂使蛋白质聚集也是可行的。通过用胃蛋白酶处理过的抗体(Fab片段)与铝的作用聚集蛋白质，与细菌细胞如C.parvun或内毒素或革兰氏阳性菌的脂多糖成分混合，乳化在生理学上可接受的油性介质如二缩甘露醇单油酸酯(Aracel A)中或用20％的全氟碳(Fluosol-DA)溶液作为阻断取代物来乳化也可实施。油合剂如角鲨烯和IFA也是优选的。
根据本发明，DDA是DNA和γ-菊粉的一种非常有效的候选佐剂，而且弗氏完全和不完全佐剂以及皂树皂甙如Quil A和QS21也如RIBI一样是令人感兴趣的候选佐剂。上面提到的C3和C3d以及胞壁二肽(MDP)也是进一步可能的佐剂。
已知脂质体剂型也具有佐剂效果，因此根据本发明脂质体佐剂也是优选的。
根据本发明，免疫刺激复合物基质类型(ISCOM基质)的佐剂也是优选的选择，特别是已经表明这种类型的佐剂能上调APCs MHCⅡ类分子的表达。ISCOM基质由任意分离的)来自皂树的皂甙(三萜系化合物)，胆固醇和磷脂组成。当与有免疫原性的蛋白质混合时，所产生的呈颗粒状的剂型即已知的ISCOM颗粒，其中皂甙占60-70％，胆固醇和磷脂占10-15％，蛋白质占10-15％，以上比例均为重量/重量比。有关免疫刺激复合物的构成和使用的详细信息可参见上面提到的论及佐剂的教科书，Morein B等，1995，临床免疫治疗3:461-471以及Barr IG和Mitchell GF,1996,免疫和细胞生物学，74:8-25(在此参考文献都并入文中)对如何制备完全的免疫刺激复合物也都提供了有用的指导。
另外一种很令人感兴趣的(并且因此，优选的)可以达到佐剂效果的可能是应用Gosselin等1992年描述的技术(在此并入文中)。简言之，通过将抗原与抗单核/巨噬细胞表面的Fcγ受体的抗体(或结合抗原的抗体片段)结合，可加强对相关抗原如本发明中的抗原的呈递。特别是抗原和抗FcγRⅠ抗体的结合已经被证明可以为了接种的目的增加免疫原性。
其他可能的情况包括使用上面提到的定向和免疫调节物质(细胞因子)作为OPGL被修饰后形式的候选的第一和第二部分。就此而言，合成的细胞因子诱导剂如多聚I:C也是可能的选择。
合适的细菌衍生物选自由胞壁酰二肽、完全弗氏佐剂、RIBI和海藻糖二酯如TDM和TDE所组成的组。
合适的免疫定向佐剂选自由CD40配体CD40抗体或其特异性结合片段(见上面的讨论)、甘露糖、Fab片段和CTLA-4组成的组。
合适的多聚物佐剂选自碳水化合物如右旋糖苷、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖、塑料多聚物如，和乳胶如乳胶珠组成的组。
另外一种令人感兴趣的调节免疫应答的方式是在“虚拟淋巴结”中(一种由位于360 Lexington Avenue,New York,NY 10017-6501的免疫治疗公司开发的专利性医疗装置)包括OPGL免疫原(与佐剂以及药物学可接受的载体和赋形剂任选组合)。VLN(细长的管状装置)模拟淋巴结的结构和功能。在皮肤下插入VLN产生了一个细胞因子和趋化因子迅速增多的无菌的炎症位点，T和B淋巴细胞以及APCs迅速对危险信号发生反应，定位炎症位点并聚集在VLN的可透过的基质中。已经表明当使用VLN时针对某一抗原产生免疫应答的必须抗原剂量减少了，并且使用VLN接种产生的免疫保护超过了传统的使用Ribi作为佐剂的免疫。在“从实验室到临床，摘要，10月12-15日，1998，海景胜地，Aptos,加州”中Gelber C等“应用名为虚拟淋巴结的新型医疗装置诱导出了针对少量抗原的强大的细胞和体液免疫应答”一文中简要描述了此技术。
据预测每年需要接种此疫苗1至6次，如每年1,2,3,4,5,6次给需要它的个体接种疫苗。先前已经表明根据本发明使用优选的自身疫苗所引起的记忆免疫是短暂的，因此需要用OPGL或被修饰的OPGL多肽周期性的攻击免疫系统。
由于遗传变异，不同的个体针对相同的多肽所产生的免疫应答强度不同。因此，根据本发明为了增强免疫应答，疫苗应当包含几种不同的多肽，见上面关于引入外源T细胞表位的选择的讨论，此疫苗可以含有2或更多的多肽，其中所有的多肽在上面已经阐释过了。
因此疫苗可以含有3至20个不同的经修饰的或未经修饰的多肽，例如3至10个不同的多肽。
核酸接种
作为传统的接种以肽为基础的疫苗的另外一种选择，核酸接种技术(也称为“核酸免疫”“遗传免疫”和“基因免疫”)具有许多引人注目的特征。
首先，与传统的疫苗方法相比，核酸免疫并不需要用来大规模地生产免疫原性物质的资源(例如，工业上大规模微生物发酵以产生被修饰形式的OPGL)。而且，不需要免疫原纯化装置和再折叠方案。最后，由于核酸免疫依赖于被免疫个体自身的生物化学装置去产生被引入的核酸的表达产物，所以希望对表达产物进行最佳的翻译后处理；这在自身接种的情况下尤其重要，如上所述，这是因为在修饰后的分子中应当保留大部分的原始OPGL B细胞表位，并且在理论上B细胞表位可被任何(生物)分子(如碳水化合物、脂类、蛋白质等)的部分所取代。因此，免疫原天然的糖基化和脂质化特征对于总体的免疫原性来说是非常重要的，并且使宿主产生免疫原很好地确保了这一点。
因此，本发明的一个优选的实施方案包含通过将编码被修饰的OPGL的核酸引入动物细胞来实现向免疫系统呈递被修饰的OPGL，并且凭此获得了由被引入核酸的细胞进行的体内表达。
在本实施方案中，被引入的核酸优选是DNA，可采用裸DNA的形式，DNA与带电荷的或不带电荷的脂类配制在一起，DNA配制在脂质体中，DNA被包含在病毒载体中，DNA与促进转染的蛋白或多肽配制在一起，DNA与导向蛋白或多肽配制在一起，DNA与钙沉淀试剂配制在一起，DNA与惰性载体分子结合在一起，DNA由壳多糖或脱乙酰壳多糖胶囊化，和DNA与佐剂配制在一起。在本文中需要注意的是，在实际应用中所有与在传统疫苗配制物使用佐剂有关的设想同样适用于DNA疫苗。因此，多肽疫苗中涉及佐剂使用的所有说明同样适用于核酸接种技术。
关于上面已经详细讨论的多肽疫苗的接种途径和接种方案，也同样适用于本发明中的核酸疫苗并且以上关于多肽免疫途径和免疫计划的所有讨论也都适用于核酸疫苗。需要增加的一点是核酸疫苗可适用于静脉内和动脉内接种。而且，本领域中众所周知，核酸疫苗可以使用基因枪接种，因此，这个及其相关的接种方式也被认为是本发明的一部分。最后，也有报道称在核酸疫苗的接种上应用VLN产生了很好的结果，因此这种独特的接种方式是尤其优选的。
而且，用做免疫作用剂的核酸可包含编码第一、第二或第三部分的区域，例如以上面所描述的免疫刺激物质的形式如上面所讨论的细胞因子作为有用的佐剂。本实施方案的一个优选的样本包括将类似物的编码区和免疫调节子的编码区处于不同的读码框内或至少在不同的启动子的控制之下，由此避免了所产生的类似物或表位作为免疫调节子的融合配偶体的情况。另外，可以使用两种不相同的核酸片段，这是因为当将两个编码区包含在同一个分子中时具有确保其共同表达的优点。
因此，本发明也涉及诱导产生抗OPGL抗体的组合物，此组合物包含
----本发明的核酸片段或载体(见下面关于载体的讨论)，和
----药物学和免疫学可接受的如上所述的赋形剂和/或载体和/或佐剂
在正常情况下，编码OPGL突变体的核酸以载体的形式被引入，其中表达被控制在病毒启动子之下。根据本发明关于载体更为详细的讨论参见先前的讨论。涉及核酸疫苗配制和使用的详细说明见Donnelly JJ等，1997，免疫学年度评论，15:617-648和Donnelly JJ等，1997，生命科学，60:163-172，在此参考文献都并入文中。活疫苗
第三种实现被修饰的OPGL呈递给免疫系统的方法是使用活疫苗技术。在活疫苗接种中，呈递给免疫系统这一过程受到一种非致病性的已经被用一编码被修饰的OPGL的核酸片段或用一含有此核酸片段的载体转化的微生物而实现。这种非致病性的微生物可以是任何合适的减毒的细菌菌株(通过传代的方法或利用重组DNA技术去除致病性表达产物的方法减毒)，例如牛结核杆菌卡介苗、非致病性的脓毒败血症链球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌和志贺氏细菌等。关于制备最先进的活疫苗的综述见Saliou P,1995,应用综述45:1492-1496和Walker PD,1992,疫苗10:977-990，在此参考文献都并入文中。关于用于这些活疫苗的核酸片段和载体的细节参见下面的讨论。
作为活细菌疫苗的另外一种选择，将在下面讨论的本发明的核酸片段可被插入到一无毒性的病毒疫苗载体中如痘苗病毒株或其他任何可用的痘病毒。
正常情况下，非致病的微生物或病毒仅被接种到动物体内一次，但在某些情况下为了维持保护性免疫，在一生中有必要接种这种微生物多于一次。曾经构想的在上面详细讨论的用于多肽接种的免疫方案在活疫苗或病毒疫苗的应用中也是有用的。
另外，在活疫苗或病毒疫苗接种之前或之后常组合多肽和/或核酸接种。例如，可能利用活疫苗或病毒疫苗产生初始免疫，随后用多肽或核酸疫苗加强免疫的方法。
微生物或病毒可被用含有第一、二、三部分编码区的核酸所转化，例如采用上面所描述的利用免疫调控物质如细胞因子作为有用的佐剂的形式。本实施方案的一个优选的样本包括将类似物的编码区和免疫调节子的编码区处于不同的读码框内或至少在不同的启动子的控制之下，由此避免了所产生的类似物或表位作为免疫调节子的融合配偶体的情况。另外，可以使用两种不相同的核酸片段用做转染作用剂。当然，使第一、二、三部分处于同一读码框中可将其作为一种表达产物而提供，即本发明的一种类似物，根据本发明这样的实施方案是尤其优选的。
在疾病治疗中使用本发明的方法
从上面的讨论中我们可以看到，本发明方法的设立考虑到了对以骨质过度损失为特征的疾病的控制。在本文中，骨质疏松症是本发明方法的主要目标，与复杂的骨折有关的骨损失也是治疗/缓解此疾病的一个可行的目标。因此，本发明的一个重要的负调节OPGL活性的实施方案包含治疗和/或预防和/或缓解骨质疏松或其他以骨再吸收过度为特征的症状，此方法包括根据本发明的方法负调节OPGL活性至骨再吸收显著降低的程度。
与病理速率相比，本文中骨再吸收速率显著下降至少3％，但包括稍微高一点的百分比，如至少5％，至少7％，至少9％，至少11％，至少13％，至少15％和至少17％，但预期更高的百分比，如至少20％，或甚至是至少30％。尤其优选的是骨再吸收的下降导致了骨形成和骨再吸收之间的平衡的逆转，即骨生成速度大于骨再吸收的速度。当然，不能维持这种不平衡(因为这会导致硬骨病)，但通过仔细控制需要免疫个体的接种次数和免疫学效果，可以随时间推移获得导致骨质净保存的平衡。另外，如果在一个体中本发明的方法不能终止骨损失，本发明的方法可(与其他已知的在骨质疏松患者中减少骨损失的方法任意组合使用)被用以获得骨损失的显著减少，因此延长在此个体中存在充足的骨质的时间。
用以测量骨再吸收和骨形成速率的方法是本领域所熟知的。凭借生化分析的方法有可能通过测量Ⅰ胶原蛋白某种片段(见WO93/15107和WO94/14844)在血液中的浓度来测定骨再吸收的速率。另外，通过物理学的方法也可测定骨损失速率。本领域方法中通过无侵害的物理学的方法测定骨质的最具有代表性的说明见WO88/06862,WO94/12855,WO95/14431，和WO97/00643。
本发明的肽、多肽和组合物
正如在上文中所显而易见的那样，本发明基于为了间接获得降低的破骨细胞活性而用OPGL抗原免疫个体这一概念。获得这样的免疫的优选方法是利用修饰后的OPGL，籍此提供本领域中此前所未包括在内的分子。
我们认为在此所讨论的被修饰的OPGL分子就其本身来说是有创造性的，因此本发明的一个重要部分涉及一种来自动物OPGL的OPGL类似物，其中引入了一个其后果是用此类似物免疫动物诱导产生的抗体可与未经修饰的OPGL多肽特异性反应的修饰。更为可取的是，这个修饰的性质与上面在讨论本发明方法的各种实施方案使用修饰的OPGL时所描述的修饰类型一致。因此，在此提供的涉及被修饰OPGL分子的任何说明都与描述本发明OPGL类似物的目的有关，并且任何这样的说明同样适用于对这些类似物的描述中。需要注意的是优选的被修饰的OPGL分子包含可造成与OPGL序列具有70％一致性的多肽或与其亚序列至少具有10个氨基酸一致的修饰。较高一些的序列一致性是更为优选的。例如只晒是75％，或甚至是至少80,85,90或95％。可用(Nref-Ndif)100/Nref来计算蛋白质和核酸的序列一致性，其中Ndif是在序列比较时两序列中不相同的氨基酸残基的总数，Nref是其中一个序列中的残基数目。因此，AGTCAGTC DNA序列与AATCAATC序列具有75％的序列一致性(Ndif=2并且Nref=8)。
本发明也涉及在应用本发明方法中有用的组合物。因此，本发明也涉及含有免疫学上有效量的是动物自身蛋白的OPGL多肽的免疫原性组合物，据说OPGL多肽与一免疫学可接受的佐剂配制在一起以用于打破动物针对此OPGL多肽的自身耐受，此组合物还包含药物学和免疫学可接受的稀释液和/或赋形剂和/或载体和/或赋形剂。换句话说，本发明的这一部分与天然发生的已经联系本发明方法的实施方案描述过的OPGL多肽的配制有关。
本发明也涉及含有免疫学上有效量的上面阐明的免疫原性组合物，据说此组合物还包含药物学和免疫学可接受的稀释液和/或赋形剂和/或载体和/或赋形剂和任选的佐剂。换句话说，本发明的这一部分有关被修饰的OPGL的配制；基本如上所述。当涉及被修饰的或未修饰的OPGL用于本发明方法以负调节OPGL时，对佐剂、载体和赋形剂的选择与上面所讨论的一致。
多肽的制备采用本领域众所周知的方法，通常通过重组基因技术包括将一编码OPGL类似物的核酸序列引入到一合适的载体中来制备较长一些的多肽，用此载体转化合适的宿主细胞表达此核酸序列，从宿主细胞或其上清中提取表达产物，随后进行纯化和任选的进一步修饰，例如再折叠和衍生化。
较短一些的多肽优选众所周知的固相或液相多肽合成技术来制备。但是，最近此技术的进展已经提出可能利用此技术产生全长的多肽和蛋白这一问题。因此，它也在本发明通过合成方法制备长构建物的范围之内。
本发明的核酸片段和载体
从上面的说明中我们可以得知被修饰的OPGL多肽既可以通过重组技术，又可凭借化学合成或半合成的方法来制备。当修饰存在于对蛋白质载体(如KLH，白喉类毒素，破伤风类毒素和BSA)和非蛋白质分子如碳水化合物多聚物偶联时和当然当修饰包含加入侧链或侧链基团至OPGL多肽来源的肽链时，后两种方法尤其有用。
就重组基因技术而言，和当然就核酸免疫而言，编码被修饰的OPGL的核酸片段是重要的化学产物。因此，本发明的一个重要部分涉及编码OPGL类似物的核酸片段，即一包含已经加入或插入融合配偶体的天然OPGL序列的OPGL衍生的多肽或最好是OPGL衍生的多肽，其中已经通过插入、添加，优选是取代或缺失的方法引入外源T细胞表位。本发明的核酸片段是DNA或RNA片段。
本发明的核酸片段通常情况下被插入到合适的载体中以形成携带有本发明核酸片段的克隆或表达载体，这些新型的载体也是本发明的一部分。关于构建本发明这些载体的细节将在下面转化细胞和微生物一文中讨论到。依据应用的目的和类型，载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、微型染色体或病毒的形式，只在某些细胞中瞬时表达的裸DNA也是一种重要载体。本发明优选的克隆和表达载体是可以自主复制的，因此为了高水平表达或用于随后克隆的高水平复制的目的，可以获得高拷贝数。
本发明载体的一般轮廓是在5’-3’方向以可操作的连接方式包含以下特征：驱动本发明的核酸片段表达的启动子，任选的一编码可使多肽片段分泌(至细胞外相，或至间充质)或结合在膜上的前导肽的核酸片段，本发明的核酸片段，和任选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系上操作表达载体时，为了转化细胞的遗传稳定性优选的方法是当载体被导入宿主细胞后整合到宿主细胞基因组中。相反，当在动物体内操作将导致体内表达的载体时，为安全起见优选的是此载体不能整合到宿主细胞基因组中；典型的是，当用到裸DNA或非整合的病毒载体时，本领域熟练技术人员熟知应该选择哪一个。
本发明的载体被用于转化细胞以产生本发明的被修饰的OPGL多肽，也作为本发明的一部分的这些转化的细胞可以是用于本发明核酸片段和载体增殖的细胞和细胞系，也可以是用于重组生产本发明中被修饰的OPGL多肽的细胞和细胞系。另外，被转化的细胞也可以是合适的或疫苗株，其中核酸片段(单一或多个拷贝)已经被插入以造成被修饰的OPGL分子的分泌或者整合到细菌细胞膜或细胞壁上。
本发明优选的转化细胞是微生物如细菌(如埃希氏杆菌属(例大肠杆菌)，芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌)，沙门氏菌，或分支杆菌(优选非致病性的，例牛结核杆菌卡介苗))，酵母(酿酒酵母)和原生动物。另外，被转化的细胞也可以来自多细胞的生物体，如真菌类，昆虫细胞，植物细胞或哺乳动物细胞。最优选的是人的细胞，见下面关于细胞系和载体的讨论。最近在申请者的实验室中使用商业上可用的果蝇黑色素细胞系(S2细胞系和载体系统，Invitrogen)生产重组的多肽的结果显示很有希望，因此，这个表达系统是特别优选的。
为了克隆或优化表达的目的，优选的情况是被转化的细胞可以复制本发明的核酸片段。表达核酸片段的细胞是本发明任选的有用的实施方案；它们可被用于在非致病性细菌中小规模或大规模地制备被修饰的OPGL或在活疫苗中作为疫苗组合物。
当使用转化细胞生产本发明的被修饰的OPGL时，表达产物或者是被分泌到培养液中或者是被运送到转化细胞的表面上是很方便的，尽管不是最重要的。
当一株有效的生产细胞已经被鉴别出时，在其基础上，优选的情况是建立携带有本发明能表达编码修饰的OPGL核酸片段的载体的稳定的细胞系。更优选的情况是，这个稳定的细胞系分泌或携带有本发明的OPGL类似物，因此利于其纯化。
通常情况下，含有复制子和来自与宿主细胞相容的物种的控制序列的智力载体被与宿主细胞一起使用。此载体通常带有一个复制位点，以及可在转化细胞中提供表型选择的标记序列，例如，最典型的是用来自大肠杆菌种的pBR322质粒转化大肠杆菌(见，例Boliver等，1997)。pBR322质粒含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，因此为鉴定转化细胞提供了简单的方法。pBR322质粒或其他细菌质粒或噬菌体也必须含有，或被修饰后含有可被真核微生物用于表达的启动子。
最常被用于重组DNA构建的启动子包括B-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，1978；Itakura等，1977；Goeddel等，1979)和色氨酸启动子系统(Goeddel等，1979；EP-A-0036776)。在经常使用这些最常用的启动子的同时，也发现和使用其他的微生物启动子，关于它们的核酸序列的资料已经发表，以使本领域熟练技术人员能将其与质粒连接使用(Siebwenlist等，1980)。在大肠杆菌中某些原核基因可在它们自己启动子控制下有效地表达，从而排除了通过人工方法加入另外一个启动子的需要。
除了原核生物外，真核微生物如酵母培养物也可以使用，并且在此此启动子能够启动表达。酿酒酵母和面包酵母是在真核微生物中最常用的，尽管其它一些菌株也是可用的。为了在对于在酵母中的表达而言，YRp7质粒是普遍使用的(Stinchcomb等，1977；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。这个质粒已经包含了为在色氨酸例如ATCC NO 44076或PEP4-1(Jones,1977)中失去生长能力的酵母突变株提供选择标记的trp1基因。trp1基因损伤作为酵母宿主细胞基因组的一个特征，为利用在色氨酸不存在的情况下生长来检测转化提供了一个有效的环境。
在酵母载体中合适的启动子序列包括3-磷酸甘油激酶的启动子(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)，例如烯醇酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡(萄)糖激酶。在构建合适的表达质粒时，与这些基因有关的终止序列也被连接到表达载体序列的3’端以期望表达产生mRNA多聚腺苷酸尾并终止。
具有转录被控制在生长条件之下的额外优点的启动子有醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢有关的降解酶，和前述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以及和麦芽糖和半乳糖代谢有关的酶的启动子区。任何含有酵母相容的启动子、复制起点和终止序列的质粒载体都是合适的。
除了微生物，来自多细胞生物的细胞培养物也可被用做宿主细胞。早理论上，任何这样的细胞培养物都是可行的，无论来自脊椎动物培养物还是来自无脊椎动物培养物。但是，脊椎动物细胞最令人感兴趣，并且近年来在培养中繁殖脊椎动物(组织培养)已经成为常规方法(组织培养，1973)。这些有用的细胞系有VERO和Hela细胞系，中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)，和W138,BHK,COS-7,293，草地夜蛾(sf)细胞(从位于1000 Research Parkway,Meriden,CT06450,USA的蛋白质科学和Invitrogen公司有售的完全表达系统)和MDCK细胞系。在本发明中，尤其优选的细胞系是从位于RO.Box2312,9704 CH Groningen，荷兰的Invitrogen公司有售的S2细胞系。
这些细胞的表达载体通常包括(如果需要的话)复制的起点，存在于被表达基因之前的启动子以及任何必要的核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。
为用于哺乳动物细胞，表达载体上的控制功能常由病毒成分提供，例如，普遍使用的启动子来自多瘤病毒，腺病毒2型，以及最常用的猴病毒40(SV40),SV40的早期和晚期启动子尤其有用，因为它们作为含有SV40病毒的复制起点的片段很容易从病毒中获得(Fiers等，1978)。如果在病毒的复制起点从Hind Ⅲ位点到BglⅠ位点大约250bp的序列被包含在内的话，SV40的大片段或小片段也可被使用。另外，使用与所需基因序列有关的启动子或控制序列也是可能的，并且常是希望的，如果这控制序列与宿主细胞系统相容。
复制起点可由构建载体时包括一外源的起点如可能来自SV40或其他病毒(例如多瘤病毒，腺病毒，VSV,BPV)提供，也可由宿主细胞染色体复制机制提供。如果载体整合入宿主细胞染色体的话，后者就足够了。
对有用的OPGL类似物的鉴别
本领域熟练技术人员都知道并不是原始OPGL的所有突变体或修饰体都具有在动物体内诱导可与原始形式交叉反应的抗体的能力。但是，对达到在此所讨论的免疫反应性最低要求的修饰的OPGL分子来说，要建立一个有效的筛选标准并不困难。因此，本发明的另一部分是关于鉴别一个能在动物体内诱导产生抗未修饰的OPGL抗体的被修饰的OPGL的方法。在此未经修饰的OPGL多肽是非免疫原性的自身蛋白，此方法包括
----通过肽合成或基因工程方法制备一系列彼此不同的被修饰的OPGL多肽，其中该动物物种中的OPGL多肽的氨基酸序列已被添加、插入、删除或被取代了氨基酸，由此，在该系列多肽的氨基酸序列中包含对该动物物种是外源的T细胞表位，或者制备一系列编码该一系列彼此不同的被修饰的OPGL多肽的核酸片段，
----测试该一系列被修饰的OPGL多肽或核酸片段中的成员的诱导该动物物种产生抗未经修饰的OPGL抗体的能力，和
----鉴别和任选地分离该一系列被修饰的OPGL多肽中的在该动物物种体内显著引起抗未经修饰的OPGL抗体产生的成员，或鉴别和任选地分离由该一系列核酸片段中的在该动物物种体内显著引起抗未经修饰的OPGL抗体产生的成员编码的多肽表达产物。
在本文中，“一系列彼此不同的被修饰的OPGL多肽”指根据上面讨论的标准挑选出来的不相同的被修饰的OPGL多肽的集合(例如结合圆二色性，NMR光谱，和/或X-射线衍射特征研究)。此系列可仅由少数成员组成，但也可含有数百成员。
对此系列成员的测试最终可在体内进行，但是可在体外进行一些测试，以缩小为本发明的目的服务的被修饰的OPGL分子的数量。
既然引入外源T细胞表位的目标是通过T细胞辅助来支持B细胞应答，先决条件是被修饰的OPGL分子可以引起T细胞增殖。T细胞增殖可用体外标准的增殖分析来测试。简言之，从受试者获得富含T细胞的样品并随后培养，培养的T细胞与受试者的在此之前已被提取的APCs细胞和被修饰的分子接触，并处理以呈递其T细胞表位，测定T细胞增殖并与合适的对照相比较(例如培养的T细胞与已用完整的原始OPGL处理的APCs细胞相接触)。另外，可通过测定T细胞在识别外源T细胞时所释放出的相关细胞因子的浓度来测量增殖。
已经提出任何一种类型的至少一个被修饰的OPGL可以引发抗OPGL抗体产生有很大的可能性，所以制备一种含有至少一个可在动物物种中诱导抗未经修饰的OPGL抗体产生的被修饰的多肽的免疫原性组合物是可能的，其中未经修饰的OPGL多肽是该动物物种的自身蛋白。此方法包含将此系列中在该动物物种中明显诱导与OPGL反应的抗体产生的成员与药物学和免疫学可接受的载体和/或赋形剂和/或稀释液和/或赋形剂混合，与药物学和免疫学可接受的至少一种佐剂任选组合使用。
与多肽群测试有关的本发明的上述方面可以通过首先制备本发明一些彼此不同的核酸序列或载体，然后将它们插入到合适的表达载体中，用此载体转化合适的宿主细胞来表达本发明的核酸序列从而很方便地完成。这些步骤之后是表达产物的分离。优选的情况是核酸片段或载体通过包含分子扩增技术如PCR或通过核酸合成的操作来制备。
本发明的另一部分是有关在动物，包括人当中治疗、预防或缓解以骨再吸收过度为特征的疾病的方法，此方法包含向动物施与有效量的不同于osteoprotegerin的至少一种可以阻断OPGL对破骨细胞活性刺激效应的物质，现在认为在本领域中从未尝试过此种方法。
本发明的这一部分的优选实施方案涉及使用OPGL特异的抗体(多抗或单抗)或其特异性结合的突变体作为阻断OPGL刺激效应的物质。优选的情况是抗体是IgG或IgM分子，或其特异性结合的突变体来自IgG或IgM。抗体的特异性结合的突变体可以很方便的是Fab片段、F(ab’)2片段，人源化的单抗或其片段，或者是二聚或多聚抗体片段如diaboxdy(由剑桥抗体技术公司生产的双特异性和二聚体的人工抗体衍生的分子)。
实施例
已经决定克隆或合成编码鼠158-316位氨基酸残基和人159-317位氨基酸残基的截短的鼠和人OPGL的cDNAs(编号分别与SEQ IDNos:2和4一致)。由于这些截短了的分子具有生物学活性，使自身抗体针对OPGL的这个部位是合理的。此外，这样会使蛋白质稍微小一些，因此易于操作。
已经合成了一段编码鼠OPGL 158-316位氨基酸残基的cDNA，从已发表的序列去除了次优的大肠杆菌和Pichia pastoris密码子。此外，一个N末端组氨酸标记，来自酿酒酵母的α交配因子信号序列的切割位点的部分，以及合适的限制性酶切位点都被加入到开放读码框中(见SEQ ID NO:7)。
这种编码野生型OPGL的cDNA已经使用BspHⅠ和HindⅢ限制性酶克隆入标准的大肠杆菌表达载体(pTrc99a)，以及使用SacⅠ和KpnⅠ限制性酶克隆入标准的克隆载体(pBluescript KS+)中(产生了SEQ ID NO:9)。
在大肠杆菌细胞中的表达导致了大约30％的总大肠杆菌蛋白是重组的OPGL，利用以下方法再折叠和纯化这种蛋白质：
1．通过离心收获细胞。
2．细胞重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中并且再次离心。
3．弃上清，细胞重悬于3倍体积的下述溶液中(100mM Tris(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物，5mM二硫苏糖醇(DDT),0.5M NaClpH8.0)
4．每克细胞加入8μl 50mM PMSF和80μl溶菌酶(10mg/ml)，室温孵育20分钟。
5．对于每克细胞沉淀，加入4mg脱氧胆酸，悬液在37℃孵育至变得粘稠。
6．每克细胞重量加入20μl DNA酶(1mg/ml)，加入MgCl2至5mM，悬液室温孵育30分钟。
7．将悬液置于冰上超声直至粘性消失。
8．20000g离心30分钟后，沉淀重悬于水中，再离心，沉淀每克细胞重量用3ml 1M的尿素溶液重悬。
9．20000g离心30分钟后，沉淀重悬于1M盐酸胍，100mM Tris(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物pH7.8的溶液中。
10．20000g离心30分钟后，沉淀重悬于6M盐酸胍，20mMTris(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物，5％乙醇，18％β-巯基乙醇，pH8.0的溶液中，并在4℃搅拌过夜。
11．40000g离心1-4小时后，上清过滤后-20℃冻存。
12．利用Superdex 200(发玛西亚)通过凝胶过滤层析分离可溶的包涵体。
13．收集含有重组OPGL的部分并用下述液体稀释至0.1mg/ml∶1.5M盐酸胍，20mMTris(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物，1mM DTT,pH7.5。
14．用10倍体积的下述溶液在4℃透析过夜：1.5M盐酸胍，20mM Tns(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物，1mM DTT,pH7.5。
15．用10倍体积的下述溶液在4℃透析过夜：1.0M盐酸胍，20mM Tris(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物，1mM DTT,pH7.5。
16．用10倍体积的下述溶液在4℃透析过夜：0.5M盐酸胍，20mM Tris(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物，1mM DTT,pH7.5。
17．用10倍体积的下述溶液在4℃透析过夜：20mM Tris(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物，150mM精氨酸，1mM DTT,pH7.5。
18．用10倍体积的下述溶液在4℃透析过夜：20mM Tris(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物，150mM精氨酸，pH7.5。
19．再折叠产物冻干并-20℃贮存。
用这种方法再折叠的效率大约是40％，纯度大于65％，纯化方法和再折叠过程仍有待于进一步改进。固定化的再折叠仍在研究之中，正如有Pedersen等，1999所描述的那样，必要时可用酶解方法去除组氨酸标记。已经用SDS-PAGE，N末端测序，氨基酸分析和质谱测定鉴定和证实了重组蛋白的性质。
鼠野生型OPGL的一个半胱氨酸取代突变体正在构建中(其中对应于SEQ ID NO:4氨基酸残基的半胱氨酸被用丝氨酸取代；见SEQID NOs:11和12)。取代是为了消除纯化的重组蛋白潜在的稳定性问题。见下面始自SEQ ID NO:9的DNA的描述，这种突变的截短的OPGL将作为完整的类似物中疫苗构建的基础。而且，为同样的目的，人OPGL的相应半胱氨酸-丝氨酸突变体(丝氨酸221被取代)也将被构建出来。
疫苗分子起初是通过在指定位置插入或内部取代破伤风类毒素的P2或P30表位而构建的，在后来也可用其他的合适的优势免疫T细胞表位。
引入突变的位置是根据现有的或预测的B细胞表位和预测的原始分子二级结构要素的知识，以及为塑造OPGL细胞外部分的二级和三级结构利用对现有的TNFα(1a8m.pdb)和CD40配体(1a1y.pdb)的三维结构进行序列比较的知识而选定的。在鼠OPGL分子中引入突变的位置在170-192,198-218,221-246,256-261和285-316位氨基酸残基(见SEQ ID NO:4)，而在人OPGL分子中引入的突变在171-193,199-219,222-247,257-262和286-317位氨基酸残基位置。
至今已经有4种鼠OPGL的变异体被构建并且在大肠杆菌中表达。
编码带有N末端组氨酸标记的mOPGL(158-316)_P30(256-261)的DNA(SEQ ID NO:13)
利用SEQ ID NO:22和25作为引物对SEQ ID NO:9进行PCR扩增。产物PCR片段用SacⅡ和KpnⅠ进行限制性酶切分析并随后用琼脂糖凝胶纯化,然后以SEQ ID NO:9为模板，以SEQ ID NO:26引物和载体特异性引物进行二次PCR扩增。产物PCR片段用KpnⅠ和HindⅢ酶切，然后将两个片段与用SacⅡ和HindⅢ酶切处理的在pBluescript KS+中的SEQ ID NO:9连接。为了纠正此构建物中的单碱基突变，利用SEQ ID NO:33和29作为引物利用构建物作为模板进行PCR扩增，产物PCR片段用PstⅠ和EcoRⅠ酶切处理，凝胶纯化并随后连接至已经用PstⅠ和EcoRⅠ消化的错误的构建物中。利用BspHⅠ和HindⅢ限制酶将证实的构建物(SEQ ID NO:13)转移到pTrc99a中。
编码带有N末端组氨酸标记的mOPGL(158-316)_P2(256-261)的DNA(SEQ ID NO:15)
利用SEQ ID NO:27和28作为引物不加模板进行PCR扩增。产物PCR片段PstⅠ和EcoRⅠ酶切处理，并随后用琼脂糖凝胶纯化。产物片段与用SacⅡ和HindⅢ酶切处理的在pBluescript KS+中的SEQ ID NO:9连接。随后利用BspHⅠ和HindⅢ限制酶将证实的构建物(SEQ ID NO:15)转移到pTrc99a中。
编码带有N末端组氨酸标记的mOPGL(158-316)_P2(288-302)的DNA(SEQ ID NO:17)
利用SEQ ID NO:22和29作为引物进行SEQ ID NO:9的PCR扩增。产物PCR片段用PstⅠ和BstBⅠ进行限制性酶切分析并随后用琼脂糖凝胶纯化出来。以SEQ ID NO:30引物和一载体特异性引物作为引物，以SEQ ID NO:9为模板进行二次PCR扩增。产物PCR片段BstBⅠ和KpnⅠ酶切处理，并随后用琼脂糖凝胶纯化。两个片段与用PstⅠ和KpnⅠ酶切处理的在pBluescript KS+中的SEQ ID NO:9连接。随后利用BspHⅠ和HindⅢ限制酶将证实的构建物(SEQ IDNO:17)转移到pTrc99a中。
编码带有N末端组氨酸标记的mOPGL(158-316)_P30(221-241)的DNA(SEQ ID NO:19)
利用SEQ ID NO:22和23作为引物进行SEQ ID NO:9的PCR扩增。产物PCR片段用SacⅡ和KpnⅠ进行限制性酶切分析并随后用琼脂糖凝胶纯化，然后以SEQ ID NO:9为模板，以SEQ ID NO:24和31为引物进行二次PCR扩增。产物PCR片段用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切，两个片段与用SacⅡ和EcoRⅠ酶切处理的在pBluescript KS+中的SEQ ID NO:9连接。随后利用BspHⅠ和HindⅢ限制酶将证实的构建物(SEQ ID NO:19)转移到pTrc99a中。
这些截短的OPGL变异体已经在大肠杆菌中进行了表达，对于所有的变异体而言所产生的变异体占总蛋白的20％以上。上面所描述的对野生型蛋白(SEQ ID NO:9)的纯化和再折叠过程仍将进一步发展。对每一种变异体而言，这个过程将作为发展最佳程序的基础。利用组氨酸标记进行变异体蛋白的固定化折叠是现在正在进行的另外一种方法。
另外，如果需要糖基化的话，利用限制性酶可将变异体直接转到Pichia pastoris表达载体中，或利用PCR转到其他的酵母表达系统中。应该注意的是，糖基化对于OPGL的体内活性并不是必需的。如Lacey等报导的那样，也可在人293成纤维细胞中表达截短的OPGL。也将考虑在昆虫细胞中表达(例如S2细胞系和载体系统或sf细胞系和载体系统，Invitrogen公司有售)。
由于没有现成的商业上出售的抗体，纯化的变异体将被用于免疫兔子以诱导产生抗体用于检测。此外，在评价候选自身疫苗中，这种抗体是在生物学分析中需要的并且非常有用的工具。抗体的制备使用本领域所熟知的标准方法。
对最佳的学自身疫苗的选择是根据在体外分析其对破骨细胞成熟/激活的抑制活性或在体内动物模型中对骨硬化症的抑制活性作出的。在文献中描述了有用的分析方法和动物模型系统(例Lacey等；Fuller等；和Simonet等)。
通过向未麻醉的雄性BALB/c小鼠注射100μl重组蛋白(每千克鼠重用0,0.1和1.0毫克蛋白)，一小时后使用包被有钙浸润的肝磷脂的毛细管从小鼠眼主静脉采血125微升来分析重组蛋白的活性。使用ICA2(辐射计，丹麦)测量钙水平。在此分析中，纯化的并且再折叠的重组鼠OPGL(SEQ ID NO:9)是有反应的，将钙离子的循环水平提高了10％。
对候选自身疫苗的评价可利用如使用自身疫苗接种并且向小鼠注射重组的mOPGL随后监测它们对钙离子释放至外周血的抑制作用来实现。
应该注意的是，作为被修饰OPGL的一种替代物，针对抗OPGL抗体的独特型的抗独特型抗体也可作为在本发明的范围内的免疫原。而且，利用可以在例如使用抗OPGL或osteroprotegerin作为捕获探针的噬菌体展示系统分离出的模拟型多肽也被认为是本发明免疫原的一部分。
参考文献
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   1               5                  10                  15gag gag atg ggc ggc ggc ccc gga gcc ccg cac gag ggc ccc ctg cac   277Glu Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His
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             85                  90                  95Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro
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            165                 170                 175Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp
        180                 185                 190Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn
    195                 200                 205Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His
210                 215                 220Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr225                 230                 235                 240Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Prc Ser Ser His Asn Leu Met Lys
            245                 250                 255Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Ash Ser Glu Phe His Phe Tyr
        260                 265                 270Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile
    275                 280                 285Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala
290                 295                 300Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp305                 310                 315<210>5<211>2299<212>DNA<213>Mus musculus<220><221>CDS<222>(170)..(1120)<400>5gagctcggat ccactactcg acccacgcgt ccgcccacgc gtccggccag gacctctgtg 60aaccggtcgg ggcgggggcc gcctggccgg gagtctgctc ggcggtgggt ggccgaggaa 120gggagagaac gatcgcggag cagggcgccc gaactccggg cgccgcgcc atg cgc cgg 178
                                                  Met Arg Arg
                                                    1gcc age cga gac tac ggc aag tac ctg cgc agc tcg gag gag atg ggc   226Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu Glu Met Gly
  5                  10                  15agc ggc ccc ggc gtc cea cac gag ggt ccg ctg cac ccc gcg cct tct   274Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro Ala Pro Ser20                  25                  30                  35gca ccg gct ccg gcg ccg cca ccc gcc gcc tcc cgc tcc atg ttc ctg   322Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met Phe Leu
             40                  45                  50gcc ctc ctg ggg ctg gga ctg ggc cag gtg gtc tgc agc arc gct ctg 370Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Ile Ala Leu
         55                  60                  65ttc ctg tac ttt cga gcg cag atg gat cct aac aga ata tca gaa gac 418Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ila Ser Glu Asp
     70                  75                  80agc act cac tgc ttt tat aga atc ctg aga ctc cat gaa aac gca ggt 466Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn Ala Gly
 85                  90                  95ttg cag gac tcg act ctg gag agc gaa gac aca cta cct gac tcc tgc 514Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro Asp Ser Cys100                 105                 110                 115agg agg atg aaa caa gcc ttt cag ggg gcc gtg cag aag gaa ctg caa 562Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys Glu Leu Gln
            120                 125                 130cac att gtg ggg cca cag cgc ttc tca gga gct cca gct atg atg gaa 610His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala Met Met Glu
        135                 140                 145ggc tca tgg ttg gat gtg gcc cag cga ggc aag cct gag gcc cag cca 658Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro G1u Ala Gln Pro
    150                 155                 160ttt gca cac ctc acc atc aat gct gcc agc atc cca tcg ggt tcc cat 706Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly Ser His
165                 170                 175aaa gtc act ctg tcc tct tgg tac cac gat cga ggc tgg gcc aag atc 754Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys Ile180                 185                 190                 195tct aac atg acg tta agc aac gga aaa cta agg gtt aac caa gat ggc 802Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn Gln Asp Gly
            200                 205                 210ttc tat tac ctg tac gcc aac att tgc ttt cgg cat cat gaa aca tcg 850Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu Thr Ser
        215                 220                 225gga agc gta cct aca gac tat ctt cag ctg atg gtg tat gtc gtt aaa 898Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val Val Lys
    230                 235                 240acc agc atc aaa arc cca agt tct cat aac ctg atg aaa gga ggg agc 946Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Mct Lys Gly Gly Ser
245                 250                 255acg aaa aac tgg tcg ggc aat tct gaa ttc cac ttt tac tcc ata aat   994Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn260                 265                 270                 275gtt ggg gga ttt ttc aag ctc cga gct ggt gaa gaa att agc att cag   1042Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser Ile Gln
            280                 285                 290gtg tcc aac cct tcc ctg ctg gat ccg gat caa gat gcg acg tac ttt   1090Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe
        295                 300                 305ggg gct ttc aaa gtt cag gac ata gac tga gactcatttc gtggaacatt     1140Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
    310                 315agcatggatg tcctagatgt ttggaaactt cttaaaaaat ggatgatgtc tatacatgtg 1200taagactact aagagacatg gcccacggtg tatgaaactc acagccctct ctcttgagcc 1260tgtacaggtt gtgtatatgt aaagtccata ggtgatgtta gattcatggt gattacacaa 1320cggttttaca attttgtaat gatttcctag aattgaacca gattgggaga ggtattccga 1380tgcttatgaa aaacttacac gtgagctatg gaagggggtc acagtctctg ggtctaaccc 1440ctggacatgt gccactgaga accttgaaat taagaggatg ccatgtcatt gcaaagaaat 1500gatagtgtga agggttaagt tcttttgaat tgttacattg cgctgggacc tgcaaataag 1560ttcttttttt ctaatgagga gagaaaaata tatgtatttt tatataatgt ctaaagttat 1620atttcaggtg taatgttttc tgtgcaaagt tttgtaaatt atatttgtgc tatagtattt 1680gattcaaaat atttaaaaat gtctcactgt tgacatattt aatgttttaa atgtacagac 1740gtatttaact ggtgcacttt gtaattcccc cgaaggtact cgtagctaag ggggcagaac 1800actgtttctg gtgaccacat gtagtttatt tctttattct ttttaactta atagagtctt 1860cagacttgtc aaaactatgc aagcaaaata aataaataaa aataaaatga ataccctgaa 1920taataagtag gatgttggtc accaggtgcc tttcaaattt agaagctaat tgactttagg 1980agctgacata gccaaaaagg atacataata ggctactgaa atctgtcagg agtatttatg 2040caattattga acaggtgtct ttttttacaa gagctacaaa ttgtaaattt tgtttctttt 2100ttttcccata gaaaatgtac tatagtttat cagccaaaaa acaatccact ttttaattta 2160gtgaaagtta ttttattata ctgtacaata aaagcattgt ctctgaatgt taattttttg 2220gtacaaaaaa taaatttgta cgaaaacctg aaaaaaaaaa aaaaaaaggg cggccgctct 2280agagggccct attctatag                                          2299<210>6<211>216<212>PRT<213>Mus musculus<400>6Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu1               5                  10                  15Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro
         20                  25                  30Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser
     35                  40                  45Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser
 50                  55                  60Ile Ala Leu Pha Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile65                  70                  75                  80Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu
             85                  90                  95Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro
        100                 105                 110Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys
    115                 120                 125Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala
130                 135                 140Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu145                 150                 155                 160Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser
            165                 170                 175Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp
        180                 185                 190Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Sar Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn
    195                 200                 205Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His
210                 215                 220Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr225                 230                  235                240Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys
            245                 250                 255Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr
        260                 265                 270Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile
    275                 280                 285Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala
290                 295                 300Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp305             310                 315<210>7<211>564<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(564)<220><223>人工序列描述：具有用于大肠杆菌和P.pastoris表达的优化密码子的合成PCR产物<220><221>misc_结合<222>(43)..(84)<223>His标记<220><221>misc_特征<222>(1)..(36)<223>酿酒酵母α-交配因子的C-末端部分<220><221>misc_特征<222>(85)..(561)<223>编码野生型鼠OPGL，残基158-316<400>7gag ctc gga tcc ctc gag aaa aga gag gct gaa gct cat gtc atg aaa 48Glu Leu Gly Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala His Val Met Lys1               5                  10                  15cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa aaa cct gaa gct 96His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro Glu Ala
         20                  25                  30cag cca ttc gct cac ctg acc atc aac gct gca tcg acc cct tct ggt 144Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly
     35                  40                  45tct cat aaa gtt acc ctg tct tct tgg tat cac gac cgc ggt tgg gct 192Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala
 50                  55                  60aaa atc tct aac atg acc ctg tct aac ggt aaa ctg aga gtt aac cag 240Lys Ila Ser Asn Met Thr Leu Ser Ash Gly Lys Leu Arg Val Asn Gln65                 70                   75                  80gac ggt ttc tac tac ctg tac gct aac atc tgt ttc aga cat cac gaa 288Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu
             85                  90                  95acc tct ggt tct gtt cca acc gac tac ctg cag ctg atg gtt tac gtt 336Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val
        100                 105                 110gtt aaa acc tct atc aaa atc cca tct tca cat aac ctg atg aaa ggt 384Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys Gly
    115                 120                 125ggt tct acc aaa aac tgg tct ggt aac tct gaa ttc cat ttc tac tct 432Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser
130                 135                 140atc aac gtc ggt ggt ttc ttc aaa ctg aga gct ggt gaa gaa atc tct 480Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser145                 150                 155                 160atc cag gtt tct aac cct tct ctg ctg gac cca gac cag gac gct acc 528Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr
            165                 170                 175tac ttc ggg gcc ttc aaa gtt cag gac atc gac tag                 564Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
        180                 185<210>8<211>187<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述：具有用于大肠杆菌和P.pastoris表达的优化密码子的合成PCR产物<400>8Glu Leu Gly Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala His Val Met Lys1               5                  10                  15His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gin Lys Pro Glu Ala
         20                  25                  30Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly
     35                  40                  45Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala
 50                  55                  60Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn Gln65                  70                  75                  80Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu
             85                  90                  95Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val
        100                 105                 110Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys Gly
    115                 120                 125Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn ser Glu Phe His Phe Tyr Ser
130                 135                 140Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser145                 150                 155                 160Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr
            165                 170                 175Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
       180                  185<210>9<211>519<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：编码与His标记融合的鼠OPGL残基158-316的DNA<220><221>CDS<222>(1)..(519)<220><221>misc_结合<222>(1)..(42)<223>His标记<220><221>misc_特征<222>(43)..(519)<223>鼠OPGL，残基158-316<400>9atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa aaa cct 48Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1               5                  10                  15gaa gct cag cca ttc gct cat ctg acc atc aac gct gca tcg atc cct 96Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30tct ggt ttt cat aaa gtt acc ctg tct tct tgg tat cac gac cgc ggt 144Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45tgg gct aaa atc tct aac atg acc ctg tct aac ggt aaa ctg aga gtt 192Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60aac cag gac ggt ttc tac tac ctg tac gct aac atc tgt ttc aga cat 240Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His65                  70                  75                  80cac gaa acc tct ggt tct gtt cca acc gac tac ctg cag ctg atg gtc 288His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val
             85                  90                  95tac gtt gtt aaa acc tct atc aaa atc cca tct tca cat aac ctg atg 336Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met
        100                 105                 110aaa ggt ggt tct acc aaa aac tgg tct ggt aac tct gaa ttc cat trc 384Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
    115                 120                 125tac tct arc aac gtt ggt ggt ttc ttc aaa ctg aga gct ggt gaa gaa 432Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu
130                 135                 140arc tct arc cag gtt tct aac cct tct ctg ctg gac cca gac cag gac 480Ile Sar Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp145                 150                 155                 160gct acc tac ttc ggg gcc ttc aaa gtt cag gac atc gac             519Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
            165                 170<210>10<211>173<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述：编码与His标记融合的鼠OPGL残基158-316的DNA<400>10Met Lys Mis Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1               5                  10                  15Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His65                  70                  75                  80His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val
             85                  90                  95Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met
       100                  105                 110Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
    115                 120                 125Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu
130                 135                 140Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp145                 150                 155                 160Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
            165                 170<210>11<211>519<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：具有C至S突变的鼠OPGL残基158-316和His标记的融合体<220><221>CDS<222>(1)..(519)<220><221>misc_结合<222>(1)..(42)<223>His标记<220><221>misc特征<222>(43)..(228)<223>鼠OPGL，残基158-219<220><221>misc_特征<222>(232)..(519)<223>鼠OPGL，残基221-316<220><221>突变<222>(229)..(231)<223>tgt(cys)to tcc(Ser)<220><400>L1atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa aaa cct 48Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1                5                  10                  15gaa gct cag cca ttc gct cat ctg acc atc aac gct gca tcg atc cct 96Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30tct ggt tct cat aaa gtt acc ctg tct tct tgg tat cac gac cgc ggt 144Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45tgg gct aaa atc tct aac atg acc ctg tct aac ggc aaa ctg aga gtt 192Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60aac cag gac ggt ttc tac tac ctg tac gct aac atc tcc ttc aga cat 240Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Ser Phe Arg His65                  70                  75                  80cac gaa acc tct ggt tct gtt cca acc gac tac ctg cag ctg atg gtt 288His Glu Thr Ser Gly Scr Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val
             85                  90                  95tac gtt gtt aaa acc tct atc aaa atc cca tct tca cat aac ctg atg 336Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met
        100                 105                 110aaa ggt ggt tcc acc aaa aac tgg tct ggt aac tct gaa ttc cat ttc 334Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
    115                 120                 125tac tct atc aac gtt ggt ggt ttc ttc aaa ctg aga gct ggt gaa gaa 432Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu
130                 135                 140atc tct atc cag gtt tct aac cct tct ctg ctg gac cca gac cag gac 480Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp145                 150                 155                 160gct acc tac ttc ggg gcc ttc aaa gtt cag gac atc gac             519Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
            165                 170<210>12<211>173<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述：具有C至S突变的鼠OPGL残基158-316和His标记的融合体<400>12Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1               5                  10                  15Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Ser Phe Arg His65                  70                  75                  80His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val
             85                  90                  95Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met
        100                 105                 110Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
    115                 120                 125Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu
130                 135                 140Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asn Pro Asp Gln Asp145                 150                 155                 160Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
            165                 170<210>13<211>564<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：由导入破伤风类毒素P30表位而修饰的鼠OPGL残基158-316与His标记的融合体<220><221>CDS<222>(1)..(564)<220><221>misc_结合<222>(1)..(42)<223>His标记<220><221>misc_特征<222>(43)..(336)<223>鼠OPGL，残基158-255<220><221>misc_特征<222>(337)..(399)<223>破伤风类毒素P30表位<220><221>misc_特征<222>(400)..(564)<223>鼠OPGL，残基262-316<400>13atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa aaa cct 48Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1               5                  10                  15gaa gct cag cca ttc gct cat ctg acc acc aac gct gca tcg atc cct 96Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30tct ggt tct cat aaa gtt acc ctg tct tct tgg tat cac gac cgc ggt 144Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45tgg gct aaa atc tct aac atg acc ctg tct aac ggt aaa ctg aga gtt 192Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60aac cag gac ggt ctc cac tac ccg tac gct aac atc tgt ttc aga cat 240Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His65                   70                  75                  80cac gaa acc tct ggt tct gtt cca acc gac tac ctg cag ctg atg gtt 288His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val
             85                  90                  95tac gtt gtt aaa acc tct atc aaa atc cca tct tca cat aac ctg atg 336Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met
        100                 105                 110ttc aac aac ttc acc gtt tct ttc tgg ctg agg gta ccg aaa gtt tct 384Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
    115                 120                 125gct tct cac ctg gaa aac tgg tct ggt aac tct gaa ttc cat ttc tac 432Ala Ser His Leu Glu Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr
130                 135                 140tct atc aac gtt ggt ggt tte ttc aaa ctg aga gct ggt gaa gaa atc 480Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile145                 150                 155                 160tct atc cag gtt tct aac cct tct ctg ctg gac cca gac cag gac gct 528Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala
            165                 170                 175acc tac ttc ggg gcc ttc aaa gtt cag gac atc gac                 564Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
        180                 185<210>14<211>188<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述：由导入破伤风类毒素P30表位而修饰的鼠OPGL残基158-316与His标记的融合体<400>14Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1               5                  10                  15Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Lau Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His65                  70                  75                  80His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val
             85                  90                  95Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met
        100                 105                 110Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
    115                 l20                 125Ala Ser His Leu Glu Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr
130                 135                 140Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile145                 150                 155                 160Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala
            165                 170                 175Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
        180                 185<210>15<211>546<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：具有导入的破伤风类毒素P2表位的鼠OPGL残基158-316与His标记的融合体<220><221>CDS<222>(1)..(546)<220><221>misc_结合<222>(1)..(42)<223>His标记<220><221>misc特征<222>(43)..(336)<223>鼠OPGL，残基158-255<220><221>misc_特征<222>(382)..(546)<222>鼠OPGL，残基262-316<220><221>misc_特征<222>(337)..(381)<223>破伤风类毒素P2表位<400>15atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa aaa cct 48Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1               5                  10                  15gaa gct cag cca ttc gct cat ctg acc atc aac gct gca tcg atc cct 96Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30tct ggt tct cat aaa gtt acc ctg tct tct tgg tat cac gac cgc ggt 144Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45tgg gct aaa atc tct aac atg acc ctg tct aac ggt aaa ctg aga gtt 192Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60aac cag gac ggt ttc tac tac ctg tac gct aac atc tgt ttc aga cat 240Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His65                  70                  75                  80cac gaa acc tct ggt tct gtt cca acc gac tac ctg cag ctg atg gtt 288His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val
             85                  90                  95tac gtt gtt aaa acc cct atc aaa atc caa tct tca cat aac ctg atg 336Tyr Val Val Lys Thr Pro Ile Lys Ile Gln Ser Ser His Asn Leu Met
        100                 105                 110cag tac atc aaa gct aat tcg aaa ttc atc ggt atc acc gaa ctg aac 384Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Asn
    115                 120                 125tgg tct ggt aac tct gaa ttc cat ttc tac tct atc aac gtt ggt ggt 432Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly
130                 135                 140ttc ttc aaa ctg aga gct ggt gaa gaa atc tct acc cag gtt tct aac 480Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn145                 150                 155                 160cct tct ctg ctg gac cca gac cag gac gct acc tac ttc ggg gcc ttc 528Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe
            165                 170                 175aaa gtt cag gac atc gac                                         546Lys Val Gln Asp Ile Asp
        180<210>16<211>182<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述：具有导入的破伤风类毒素P2表位的鼠OPGL残基158-316与His标记的融合体<400>16Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1               5                  10                  15Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His65                  70                  75                  80His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val
             85                  90                  95Tyr Val Val Lys Thr Pro Ile Lys Ile Gln Ser Ser His Asn Leu Met
        100                 105                 110Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Asn
    115                 120                 125Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly
130                 135                 l40Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn145                 150                 155                 160Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala  Phe
            165                 170                 175Lys Val Gln Asp Ile Asp
        180<210>17<211>519<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：具有导入的破伤风类毒素P2表位的鼠OPGL残基158-316与His标记的融合体<220><221>CDS<222>(1)..(519)<220><221>misc_结合<222>(1)..(42)<223>His标记<220><221>misc_特征<222>(43)..(432)<223>鼠OPGL，残基158-287<220><221>misc_特征<222>(478)..(519)<223>鼠OPGL，残基303-316<220><221>misc_特征<222>(433)..(477)<223>破伤风类毒素P2表位<400>17atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa aaa cct 48Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1               5                  10                  15gaa gct cag cca ttc gct cat ctg acc atc aac gct gca tcg atc cct 96Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30tct ggt tct cat aaa gtt acc ctg tct tct tgg tat cac gac cgc ggt 144Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45tgg gct aaa atc tct aac atg acc ctg tct aac ggt aaa ctg aga gtt 192Trp Ala Lys Ile Set Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60aac cag gac ggt ttc tac tac ctg tac gct aac atc tgt trc aga cat 240Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His65                  70                  75                  80cac gaa acc tct ggt tct gtt cca acc gac tac ctg cag ctg atg gtt 288His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val
             85                  90                  95tac gtt gtt aaa acc tct atc aaa atc cca tct tca cat aac ctg atg 335Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met
        100                 105                 110aaa ggt ggt tct acc aaa aac tgg tct ggt aac tct gaa ttc cat ttc 384Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
    115                 120                 125tac tct atc aac gtt ggt ggt ttc ttc aaa ctg aga gct ggt gaa gaa 432Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu
130                 135                 140cag tac atc aaa gct aat tcg aaa ttc atc ggt atc acc gaa ctg gac 480Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Asp145                 150                 155                 160gct acc tac ttc ggg gcc ttc aaa gtt cag gac atc gac             519Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
            165                 170<210>18<211>173<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述：具有导入的破伤风类毒素P2表位的鼠OPGL残基158-316与His标记的融合体<400>18Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1               5                  10                  15Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His65                 70                   75                  80His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val
             85                  90                  95Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met
        100                 105                 110Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
    115                 120                 125Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu
130                 135                 140Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Asp145                 150                 155                 160Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
            165                 170<210>19<211>519<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：具有导入的破伤风类毒素P30表位的鼠OPGL残基158-316与His标记的融合体<220><221>CDS<222>(1)..(519)<220><221>misc_结合<222>(1)..(42)<223>His标记<220><221>misc_特征<222>(43)..(231)<223>鼠OPGL，残基158-220<220><221>misc_特征<222>(295)..(519)<223>鼠OPGL，残基242-316<220><221>misc_特征<222>(232)..(294)<223>破伤风类毒素P30表位<400>19atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa aaa cct 48Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1               5                  10                  15gaa gct cag cca ttc gct cat ctg acc atc aac gct gca tcg atc cct 96Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30tct ggt tct cat aaa gtt acc ctg tct tct tgg tat cac gac cgc ggt 144Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45tgg gct aaa atc tct aac atg acc ctg tct aac ggt aaa ctg aga gtt 192Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60aac cag gac ggt ttc tac tac ctg tac gct aac atc tgt ttc aac aac 240Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Asn Asn65                  70                  75                  80ttc acc gtt tct ttc tgg ctg agg gta ccg aaa gtt tct gct tct cac 288Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
             85                  90                  95ctg gaa gtt aaa acc tct atc aaa atc cca tct tca cat aac ctg atg 336Leu Glu Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met
        100                 105                 110aaa ggt ggt tct acc aaa aac tgg tct ggt aac tct gaa ttc cat ttc 384Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
    115                 120                 125tac tct atc aac gtt ggt ggt ttc ttc aaa ctg aga gct ggt gaa gaa 432Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu
130                 135                 140atc tct atc cag gtt tct aac cct tct ctg ctg gac cca gac cag gac 480Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp145                 150                 155                 160gct acc tac ttc ggg gcc ttc aaa gtt cag gac atc gac             519Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
            165                 170<210>20<211>173<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述：具有导入的破伤风类毒素P30表位的鼠OPGL残基158-316与His标记的融合体<400>20Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Lys Pro1               5                  10                  15Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro
         20                  25                  30Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
     35                  40                  45Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val
 50                  55                  60Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Asn Asn65                  70                  75                  80Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
             85                  90                  95Leu Glu Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met
        100                 105                 110Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
    115                 120                 125Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu
130                 135                 140Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp145                 150                 155                 160Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
            165                 170<210>21<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>21agctgcaggt agtcggttgg aacagaacca gaggtttcgt gatgtctgaa acagatgtta 60gcgtacag                                                          69<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>22ctcatctgac catcaacgct gcat<210>23<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>23tttcggtacc ctcagccaga aagaaacggt gaagttgttg aaacagatgt tagcgtacag 60gtag                                                              64<210>24<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>24tgagggtacc gaaagtttct gcttctcacc tggaagttaa aacccctatc aaaatccaat 60c                                                                 61<210>25<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>25tttcggtacc ctcagccaga aagaaacggt gaagttgttg aacatcaggt tatgtgaaga 60ttg                                                               63<210>26<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>26tgagggtacc gaaagtttct gcttctcacc tggaaaactg gtctggtaac tctgaattcc 60at                                                                62<210>27<211>79<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>27tacctgcagc tgatggttta cgttgttaaa acccctatca aaatccaatc ttcacataac 60ctgatgcagt acatcaaag                                              79<210>28<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>28tggaattcag agttaccaga ccagttcagt tcggtgatac cgatgaattt cgaattagct 60ttgatgtact gcatcaggtt atg                                         83<210>29<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>29gaatttcgaa ttagctttga tgtactgttc ctcaccagct ctcagtttg               49<210>30<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>30gctaattcga aattcatcgg tatcaccgaa ctggacgcta cctacttcgg ggc          53<210>31<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>31cttactagtc gatgtcctga actttg                                        26<210>32<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成PCR引物<400>32agtggaattc agagttacca gaccagtttt tggtagaacc acctttcatc aggttatgtg   60aagatgggat tttg                                                     74<210>33<211>65<212>DNA<213>Clostridium tetani<400>33actacctgca gctgatggtt tacgttgtta aaacctctat caaaatccca tcttcacata 60acctg                                                             65<210>34<211>15<212>PRT<213>Clostridium tetani<400>34Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1               5                  10                  15<2L0>35<211>21<212>PRT<213>Clostridium tetani<400>35Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1               5                  10                  15Ala Ser His Leu Glu
        20

Claims (56)

1．一种在动物包括人体内负调节osteoprotegerin配体(OPGL)活性的方法，这种方法包含以免疫学有效量向动物的免疫系统呈递以下物质
------至少一种已被配制的OPGL多肽或其亚序列，从而用此OPGL多肽或其亚序列免疫动物诱导抗OPGL多肽抗体的产生，和/或，
------至少一种在OPGL氨基酸序列中引入至少一个修饰的OPGL类似物，其结果是用此类似物免疫动物诱导抗OPGL多肽抗体的产生。
2．如权利要求1的方法，其中被呈递的OPGL类似物的OPGL氨基酸序列带有至少一个修饰。
3．如权利要求2的方法，其中所述修饰导致大部分的OPGL B细胞表位被保存下来并且
------引入了至少一个外源的T辅助淋巴细胞表位(TH表位)，和/或
------引入了至少一个实现被修饰的分子定向至抗原呈递细胞(APC)或B淋巴细胞的第一部分，和/或
------引入了至少一个能刺激免疫系统的第二部分，和/或
------引入了至少一个能优化被修饰的OPGL多肽呈递给免疫系统的第三部分。
4．如权利要求3的方法，其中所述修饰包括以侧链基团的形式经与OPGL或其亚序列中合适的化学基团共价或非共价结合而引入外源TH表位和/或第一和/或第二和/或第三部分的修饰。
5．如权利要求3或4的方法，其中所述修饰包括氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加。
6．如权利要求5的方法，其中所述修饰导致一融合多肽的产生。
7．如权利要求5或6的方法，其中引入的氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加导致OPGL的总体三级结构的大部分保留下来。
8．如权利要求2到7任一项的方法，其中所述修饰包括至少一个OPGL B细胞表位的重复和/或引入半抗原。
9．如权利要求3到8任一项的方法，其中外源T细胞表位在动物体内是免疫优势的。
10．如权利要求3到9任一项的方法，其中外源T细胞表位是混栖的。
11．如权利要求10的方法，其中至少一种外源T细胞表位选自一天然的混栖T细胞表位和一人工的MHCⅡ类分子结合肽序列。
12．如权利要求11的方法，其中天然的T细胞表位选自破伤风类毒素表位如P2和P30、白喉类毒素表位、流感病毒血凝素表位和恶性疟原虫CS表位。
13．如权利要求3到12任一项的方法，其中第一部分是B淋巴细胞特异性表面抗原或APC特异性表面抗原的基本上特异的结合配偶体，例如在B淋巴细胞或APC细胞上有受体的半抗原或碳水化合物。
14．如权利要求3到13任一项的方法，其中第二部分选自细胞因子、激素和热休克蛋白。
15．如权利要求6的方法，其中细胞因子选自γ干扰素(IFN-γ)，Flt3L，白细胞介素1(IL-1)，白细胞介素2(IL-2)，白细胞介素4(IL-4)，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素12(IL-12)，白细胞介素13(IL-13)，白细胞介素15(IL-15)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，或者是其有效部分，热休克蛋白选自HSP70,HSP90,HSC70,GRP94和钙网蛋白(CRT)，或者是其有效部分。
16．如权利要求3到15任一项的方法，其中第三部分是脂类，如棕榈酰基、肉豆蔻基，法呢基，香叶基-香叶基，GPI锚和N-酰基甘油二酯基。
17．如前述任一项权利要求的方法，其中OPGL多肽或其亚序列在170-192的任一位置，198-218的任一位置，221-246的任一位置，256-261的任一位置，或285-316的任一位置被修饰，氨基酸位置号与SEQ ID NOs:4,6和12的任一个序列一致，或者OPGL多肽在171-193的任一位置，199-219的任一位置，222-247的任一位置，257-262的任一位置，或286-317的任一位置被修饰，氨基酸位置号与SEQ ID No:2一致。
18．如权利要求17的方法，其中所述修饰包括用等长的或不等长的并且含有一个外源TH表位的一个氨基酸序列取代权利要求17中所阐明的位置的至少一个氨基酸序列。
19．如权利要求18的方法，其中含有外源TH表位的氨基酸序列取代SEQ ID NO:4中256-261和/或288-302和/或221-241位氨基酸或SEQ ID NO:2或221位的半胱氨酸被丝氨酸取代的一多肽中257-262和/或289-303和/或222-243位氨基酸。
20．如前述任一项权利要求的方法，其中向免疫系统呈递抗原通过具有至少两个拷贝的OPGL多肽，其亚序列或与一能呈递抗原决定簇多拷贝的载体分子共价或非共价连接的被修饰的OPGL多肽而实现。
21．如前述任一项权利要求的方法，其中OPGL多肽，其亚序列或被修饰的OPGL多肽与一促进破坏对自身抗原的自身耐受的佐剂配制在一起。
22．如前述任一项权利要求的方法，其中有效量的OPGL多肽或OPGL类似物通过选自非胃肠道途径，如真皮内、真皮下、皮内、皮下或肌肉注射途径；腹膜途径；口服途径；经颊途径；舌下途径；硬脑膜外途径；脊髓途径；肛内途径；和颅内途径的途径给予动物。
23．如权利要求22的方法，其中OPGL多肽、其亚序列或其类似物的有效量处于0.5微克到2000微克之间。
24．如权利要求22或23的方法，其中OPGL多肽或类似物被包含在一虚拟淋巴结(VLN)装置内。
25．如权利要求1到21任一项的方法，其中向免疫系统呈递被修饰的OPGL通过向动物细胞引入编码被修饰的OPGL的核酸并籍此被引入核酸的细胞获得体内表达而实现。
26．如权利要求25的方法，其中被引入的核酸选自裸DNA，与带电荷的或不带电荷的脂类配制在一起的DNA，配制在脂质体中的DNA，被包含在病毒载体中的DNA，与促进转染的蛋白或多肽配制在一起的DNA，与导向蛋白或多肽配制在一起的DNA，与钙沉淀试剂配制在一起的DNA，与惰性载体分子偶联的DNA，壳多糖或脱乙酰壳多糖胶囊化的DNA，和与佐剂配制在一起的DNA。
27．如权利要求27的方法，其中核酸被包含在一VLN装置内。
28．如权利要求22到27任一项的方法，其中包括每年至少施与/引入一次，如至少2次，至少3次，至少4次，至少6次和至少12次施与/引入。
29．一种治疗和/或预防和/或缓解骨质疏松或其他以骨再吸收过度为特征的疾病的方法，此方法包廓根据本发明权利要求1到28任一项的方法负调节OPGL活性至使得骨再吸收速率显著下降的程度，如下降至少3％，至少7％，至少9％，至少11％，至少13％，至少15％，至少17％，至少20％，和至少30％。
30．一种衍生自动物OPGL多肽的OPGL类似物，其中引入了一个修饰，其结果是利用此类似物免疫动物诱导抗OPGL多肽抗体产生。
31．如权利要求30的OPGL类似物，其中所述修饰如权利要求1到19任一项的方法中的定义。
32．一种免疫原性组合物，包含
-----免疫学有效量的动物自身OPGL多肽，所述OPGL多肽与免疫学可接受的佐剂配制在一起以破坏动物对OPGL多肽的自身耐受，此组合物还包含药物学和免疫学可接受的载体和/或赋形剂，或
-----免疫学有效量的如权利要求30和31的OPGL类似物，此组合物还包含药物学和免疫学可接受的载体和/或赋形剂和任选地佐剂。
33．一种编码权利要求30和31的OPGL类似物的核酸片段。
34．一种携带权利要求33的核酸片段的载体。
35．如权利要求34的载体，其能自主复制。
36．如权利要求34或35的载体，其选自由质粒、噬菌体、粘粒、微型染色体和病毒组成的组。
37．如权利要求34到36任一项的载体，其在5’-3’方向和以可操作的连接方式包含驱动权利要求33的核酸片段表达的启动子，任选地一编码可使多肽片段分泌或结合在膜上的前导肽的核酸序列，权利要求33的核酸片段，和任选的终止子。
38．如权利要求34到37任一项的载体，当被引入宿主细胞时，此载体可与或不与宿主细胞染色体整合。
39．如权利要求37或38的载体，其中启动子在真核细胞和/或原核细胞中驱动表达。
40．一种携带有如权利要求34到39任一项的载体的转化的细胞。
41．权利要求40的转化的细胞，其能够复制权利要求33的核酸片段。
42．如权利要求41的转化的细胞，其是选自细菌、酵母、原生动物的微生物，或衍生自多细胞生物体如真菌的细胞，昆虫细胞如S2和SF细胞，植物细胞和哺乳动物细胞。
43．如权利要求40到42任一项的转化的细胞，其表达权利要求33的核酸片段。
44．如权利要求43的转化的细胞，其分泌或在其表面结合权利要求30或31的OPGL类似物。
45．如权利要求1到19任一项的方法，其中呈递给免疫系统是通过施与携带编码并表达OPGL多肽或类似物的核酸片段的非致病性微生物或病毒而实现。
46．一种诱导抗OPGL抗体产生的组合物，此组合物包含
----权利要求33的核酸片段或权利要求34到39任一项的载体，和
----药物学和免疫学可接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。
47．一种稳定的细胞系，其携带权利要求34到39任一项的载体并且表达权利要求33的核酸片段，且任选地分泌或在其表面结合权利要求30或31的OPGL类似物。
48．一种制备权利要求40到44任一项的细胞的方法，此方法包括用权利要求33的核酸片段或权利要求34到39任一项的载体转化宿主细胞。
49．一种鉴定被修饰的OPGL多肽的方法，该多肽能在未经修饰的OPGL多肽是其自身蛋白的动物物种中诱导产生抗未修饰的OPGL的抗体，此方法包括
----通过肽合成或基因工程方法制备一系列彼此不同的被修饰的OPGL多肽，其中该动物物种中的OPGL多肽的氨基酸序列已被添加、插入、删除或被取代了氨基酸，由此，在该系列多肽的氨基酸序列中包含对该动物物种是外源的T细胞表位，或者制备一系列编码该一系列彼此不同的被修饰的OPGL多肽的核酸片段，
----测试该一系列被修饰的OPGL多肽或核酸片段中的成员的诱导该动物物种产生抗未经修饰的OPGL抗体的能力，和
----鉴别和任选地分离该一系列被修饰的OPGL多肽中的在该动物物种体内显著引起抗未经修饰的OPGL抗体产生的成员，或鉴别和任选地分离由该一系列核酸片段中的在该动物物种体内显著引起抗未经修饰的OPGL抗体产生的成员编码的多肽表达产物。
50．一种制备免疫原性组合物的方法，该组合物包含至少一个可在动物物种内诱导抗未经修饰的OPGL抗体产生的被修饰的多肽，在所述动物物种中未经修饰的OPGL多肽是其自身蛋白，此方法包括
----通过肽合成或基因工程方法制备一系列彼此不同的被修饰的OPGL多肽，其中该动物物种中的OPGL多肽的氨基酸序列已被添加、插入、删除或被取代了氨基酸，由此，在该系列多肽的氨基酸序列中包含对该动物物种是外源的T细胞表位，
----测试该一系列中的成员诱导该动物物种产生抗未经修饰的OPGL抗体的能力，和
----将该系列中在动物物种中明显诱导可与OPGL反应的抗体产生的成员与药物学和免疫学可接受的载体和/或赋形剂混合，任选地与至少一种药物学和免疫学可接受的佐剂组合。
51．如权利要求49或50的方法，其中所述系列成员包括制备彼此不同的核酸序列，每一核酸序列均为如权利要求33的核酸序列，然后将它们插入到合适的表达载体中，用此载体转化合适的宿主细胞，表达所述核酸序列，任选地随后分离表达产物。
52．如权利要求51的方法，其中核酸系列和/或载体通过借助分子扩增技术如PCR或通过核酸合成的操作来制备。
53．OPGL或其亚序列在制备负调节动物体内OPGL活性的包含佐剂的免疫原性组合物中的应用。
54．OPGL或其亚序列在制备用于治疗、预防或缓解骨质疏松症或其他以骨再吸收过度为特征的疾病的包含佐剂的免疫原性组合物中的应用。
55．OPGL类似物在制备负调节动物体内OPGL活性的任选地包含佐剂的免疫原性组合物中的应用。
56．OPGL类似物在制备用于治疗、预防或缓解骨质疏松症或其他以骨再吸收过度为特征的疾病的任选地包含佐剂的免疫原性组合物中的应用。
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