JP2002525060A - オステオプロテゲリンリガンド活性をダウンレギュレートする方法 - Google Patents
オステオプロテゲリンリガンド活性をダウンレギュレートする方法Info
- Publication number
- JP2002525060A JP2002525060A JP2000570334A JP2000570334A JP2002525060A JP 2002525060 A JP2002525060 A JP 2002525060A JP 2000570334 A JP2000570334 A JP 2000570334A JP 2000570334 A JP2000570334 A JP 2000570334A JP 2002525060 A JP2002525060 A JP 2002525060A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- opgl
- polypeptide
- nucleic acid
- animal
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 title claims abstract description 304
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 title claims abstract description 304
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 99
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 24
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 title claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 77
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 64
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 59
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 50
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 42
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 88
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 75
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 65
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 37
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 36
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 36
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 32
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 28
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 claims description 22
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 claims description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 21
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 18
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 18
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 13
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 claims description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 12
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 10
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 10
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 claims description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 4
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 4
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 4
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 4
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 4
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 3
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 3
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 claims description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 2
- 102100039328 Endoplasmin Human genes 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 108010036652 HSC70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027421 Heat shock cognate 71 kDa protein Human genes 0.000 claims description 2
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000004030 farnesyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 125000002686 geranylgeranyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 108010017007 glucose-regulated proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 claims description 2
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 3
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 claims 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 2
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 claims 1
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 claims 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 abstract description 26
- 102000008108 Osteoprotegerin Human genes 0.000 abstract description 26
- XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N octadec-7-ynoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC#CCCCCCC(O)=O XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 26
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 20
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 abstract description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 55
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 28
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 24
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 22
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 21
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000830602 Mus musculus Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 Proteins 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 7
- 101000830603 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 7
- 102000053529 human TNFSF11 Human genes 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 6
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 6
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 6
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 5
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 5
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 5
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 4
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 4
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 4
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 4
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 4
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- -1 FCγRI Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M dimethyl(dioctadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 3
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 3
- 208000002865 osteopetrosis Diseases 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 3
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 3
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical group OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 2
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 101000879758 Homo sapiens Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 2
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037330 Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 2
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 1
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QZCJOXAIQXPLNS-UHFFFAOYSA-N 1,1,2,2,3,3,4,4,4a,5,5,6,6,7,7,8,8,8a-octadecafluoronaphthalene 4-(2-aminoethyl)benzene-1,2-diol Chemical compound NCCc1ccc(O)c(O)c1.FC1(F)C(F)(F)C(F)(F)C2(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C2(F)C1(F)F QZCJOXAIQXPLNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 241001136792 Alle Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 101100325793 Arabidopsis thaliana BCA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- PIGTXFOGKFOFTO-PPEDVFHSSA-N CC1(C)CC[C@@]2([C@H](O)C[C@]3(C)C(=CC[C@@H]4[C@@]5(C)CCC(O[C@@H]6O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H]6O)C(O)=O)[C@@](C)(C=O)[C@@H]5CC[C@@]34C)[C@@H]2C1)C(O)=O Chemical compound CC1(C)CC[C@@]2([C@H](O)C[C@]3(C)C(=CC[C@@H]4[C@@]5(C)CCC(O[C@@H]6O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H]6O)C(O)=O)[C@@](C)(C=O)[C@@H]5CC[C@@]34C)[C@@H]2C1)C(O)=O PIGTXFOGKFOFTO-PPEDVFHSSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000037164 Collema parvum Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical group 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000488157 Escherichia sp. Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101710165610 Heat-stable 19 kDa antigen Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical class OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241001644525 Nastus productus Species 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 description 1
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N R-2-phenyl-2-hydroxyacetic acid Natural products OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101001062854 Rattus norvegicus Fatty acid-binding protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 241001080173 Ridens Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000005475 Vascular calcification Diseases 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000036626 alertness Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 230000014461 bone development Effects 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229940087373 calcium oxide Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010002 chemokinesis Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229960004887 ferric hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000121 hypercalcemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- IEECXTSVVFWGSE-UHFFFAOYSA-M iron(3+);oxygen(2-);hydroxide Chemical compound [OH-].[O-2].[Fe+3] IEECXTSVVFWGSE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000009806 oophorectomy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001009 osteoporotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical group [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 231100001055 skeletal defect Toxicity 0.000 description 1
- 238000009751 slip forming Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 1
- 101150108727 trpl gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000000707 wrist Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/03—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
(57)【要約】
この発明は、オステオプロテゲリンリガンド(OPGL、TRANCE)の生物学的活性をダウン-レギュレートし、それによって過剰な骨量の損失によって特徴づけられる疾患、例えば骨粗鬆症の治療/改善を可能にする新規な方法を提供する。ダウン-レギュレーションは、その必要のある個体においてOPGLに対する免疫応答を誘導してなされる。免疫応答は、OPGLの免疫原性変異型を用いる伝統的な免疫化又は核酸がOPGL変異型をエンコードする核酸の免疫化によって生じることができる。この発明は、この発明に有用な組成物、ポリペプチド及び核酸ならびにそれらの製造で有用なベクター及び形質転換した宿主細胞にも関する。
Description
【０００１】発明の分野 この発明は、骨粗鬆症及び骨組織の連続減少によって特徴づけられる他の疾患
の治療及び予防における改良に関する。より詳細には、この発明は、骨粗鬆症を
患っているかあるいは骨粗鬆症を患う危険にさらされている被験者においてオス
テオプロテゲリンリガンド(OPGL)に対する抗体の産生を可能にすることによりOP
GLをダウンレギュレートする方法を提供する。この発明はまた、この方法に有用
な修飾OPGLを産生する方法ならびに修飾OPGL自体も提供する。また、修飾OPGLを
エンコードする核酸フラグメントならびにこれらの核酸フラグメントを組み込ん
だベクターとそれらで形質転換される宿主細胞及び細胞系も、この発明に包含さ
れる。この発明はまた、この発明の方法に有用なOPGL類似体を同定する方法なら
びに修飾OPGLからなる組成物もしくはOPGL類似体をエンコードする核酸からなる
組成物も提供する。
の治療及び予防における改良に関する。より詳細には、この発明は、骨粗鬆症を
患っているかあるいは骨粗鬆症を患う危険にさらされている被験者においてオス
テオプロテゲリンリガンド(OPGL)に対する抗体の産生を可能にすることによりOP
GLをダウンレギュレートする方法を提供する。この発明はまた、この方法に有用
な修飾OPGLを産生する方法ならびに修飾OPGL自体も提供する。また、修飾OPGLを
エンコードする核酸フラグメントならびにこれらの核酸フラグメントを組み込ん
だベクターとそれらで形質転換される宿主細胞及び細胞系も、この発明に包含さ
れる。この発明はまた、この発明の方法に有用なOPGL類似体を同定する方法なら
びに修飾OPGLからなる組成物もしくはOPGL類似体をエンコードする核酸からなる
組成物も提供する。
【０００２】発明の分野 骨粗鬆症は、世界的に主要かつ進行中の健康問題である。それは、アメリカ合
衆国、ヨーロッパ及び日本を合わせて推定7500万人の人々に影響を及ぼしている
。このように、それは世界の産業化された部分において最も一般的な全身性骨疾
患である。 骨粗鬆症は、閉経後の女性の4人に1人及び多数の男性を含む大多数の年配者に
影響を及ぼしている。1984年には、1500万人の患者にかかるアメリカ合衆国にお
ける骨粗鬆症の費用は、毎年38億USDであると見積もられた。これは、世界的な
費用に外挿すると少なくとも200億USDのオーダーであると解釈される。 骨粗鬆症は、骨量の低下と骨組織のミクロ構造の悪化によって特徴づけられる
全身性骨格疾患であり、結果として骨脆弱性及び骨折感受性の増加を生じる。全
ての骨が影響をうけるが、脊椎、手首及び股関節の骨折が典型的であり、最も一
般的である。骨粗鬆症を発症する危険性は年齢とともに増加し、男性よりも女性
においてより高い。その病因は、女性において閉経の結果として生じ、かつ全て
の個体においては加齢とともに生じる標準的な骨量の減少の強調を基礎とする機
序にあると考えられる。
衆国、ヨーロッパ及び日本を合わせて推定7500万人の人々に影響を及ぼしている
。このように、それは世界の産業化された部分において最も一般的な全身性骨疾
患である。 骨粗鬆症は、閉経後の女性の4人に1人及び多数の男性を含む大多数の年配者に
影響を及ぼしている。1984年には、1500万人の患者にかかるアメリカ合衆国にお
ける骨粗鬆症の費用は、毎年38億USDであると見積もられた。これは、世界的な
費用に外挿すると少なくとも200億USDのオーダーであると解釈される。 骨粗鬆症は、骨量の低下と骨組織のミクロ構造の悪化によって特徴づけられる
全身性骨格疾患であり、結果として骨脆弱性及び骨折感受性の増加を生じる。全
ての骨が影響をうけるが、脊椎、手首及び股関節の骨折が典型的であり、最も一
般的である。骨粗鬆症を発症する危険性は年齢とともに増加し、男性よりも女性
においてより高い。その病因は、女性において閉経の結果として生じ、かつ全て
の個体においては加齢とともに生じる標準的な骨量の減少の強調を基礎とする機
序にあると考えられる。
【０００３】 骨量は、およそ35才で最高に達する。そのピークに達した後、骨量は、再形成
における不均衡のために一生を通じて低下する。骨では無機質と有機マトリクス
の両方が減少するが、それらの基本的機構は保持される。 骨は、種々のタンパク質及びプロテオグリカンから構成される無機化された細
胞外マトリクスからなり、その主成分はＩ型コラーゲンである。細胞外マトリク
スを覆っている無機質はハイドロキシアパタイト(Ca3(PO4)2・Ca(OH)2)である。
骨は成長及び発達のあいだに連続的に形成され、物理的及び化学的シグナルに応
じて一生を通じて再形成される。 骨の成長、発達及び維持は非常に調節された過程であり、それには細胞レベル
で骨形成細胞(骨芽細胞)と骨再吸収細胞(破骨細胞)の調和された調節を要する。
骨量のレベルは、骨の形成と吸収のバランスを反映する。
における不均衡のために一生を通じて低下する。骨では無機質と有機マトリクス
の両方が減少するが、それらの基本的機構は保持される。 骨は、種々のタンパク質及びプロテオグリカンから構成される無機化された細
胞外マトリクスからなり、その主成分はＩ型コラーゲンである。細胞外マトリク
スを覆っている無機質はハイドロキシアパタイト(Ca3(PO4)2・Ca(OH)2)である。
骨は成長及び発達のあいだに連続的に形成され、物理的及び化学的シグナルに応
じて一生を通じて再形成される。 骨の成長、発達及び維持は非常に調節された過程であり、それには細胞レベル
で骨形成細胞(骨芽細胞)と骨再吸収細胞(破骨細胞)の調和された調節を要する。
骨量のレベルは、骨の形成と吸収のバランスを反映する。
【０００４】 骨芽細胞は、骨損傷後の発達及び一生を通じて生じる正常な骨再形成のあいだ
に間葉幹細胞から発生し、骨マトリクスを生じる。破骨細胞は、単核細胞-マク
ロファージ系統の造血前駆体から分化し、骨マトリクスを再吸収する。 骨芽細胞と破骨細胞の機能の不均衡により、増加した骨量(骨化石症)あるいは
減少した骨量(骨粗鬆症)によって特徴づけられる骨格異常が生じうる。 突然変異マウスでの骨化石症の研究により、破骨細胞の発達、成熟及び／又は
活性化における遺伝的欠陥によって骨吸収の低下がもたらされ、一様に深刻な骨
化石症を生じることが示された(Marks, 1989)。それにもかかわらず、生理学的
に破骨細胞の発達を調節するように作用する溶解性因子については、これまでの
ところ比較的にあまり知られていなかった。 しかしながら、最近この調節に貢献する２つのタンパク質が記載され、かつ特
徴づけられた(Simonetら, 1997; Laceyら, 1998)。これらの２つのタンパク質は
、オステオプロテゲリン(osteoprotegerin)とオステオプロテゲリンリガンドで
ある。
に間葉幹細胞から発生し、骨マトリクスを生じる。破骨細胞は、単核細胞-マク
ロファージ系統の造血前駆体から分化し、骨マトリクスを再吸収する。 骨芽細胞と破骨細胞の機能の不均衡により、増加した骨量(骨化石症)あるいは
減少した骨量(骨粗鬆症)によって特徴づけられる骨格異常が生じうる。 突然変異マウスでの骨化石症の研究により、破骨細胞の発達、成熟及び／又は
活性化における遺伝的欠陥によって骨吸収の低下がもたらされ、一様に深刻な骨
化石症を生じることが示された(Marks, 1989)。それにもかかわらず、生理学的
に破骨細胞の発達を調節するように作用する溶解性因子については、これまでの
ところ比較的にあまり知られていなかった。 しかしながら、最近この調節に貢献する２つのタンパク質が記載され、かつ特
徴づけられた(Simonetら, 1997; Laceyら, 1998)。これらの２つのタンパク質は
、オステオプロテゲリン(osteoprotegerin)とオステオプロテゲリンリガンドで
ある。
【０００５】 オステオプロテゲリンは、腫瘍壊死因子受容体群の新規な分泌メンバーである
。生体外で、オステオプロテゲリンは用量依存的に破骨細胞形成を妨げる。オス
テオプロテゲリンを発現するトランスジェニックマウスは、破骨細胞の減少に伴
って骨密度の一般的増加(骨化石症)を示す。オステオプロテゲリン組換え体を投
与すると正常なマウスでは同様の効果が生じ、ラットでは卵巣摘出に伴う骨減少
から保護される(Simonetら, 1997)。加えて、生まれた時に正常であるがオステ
オプロテゲリンが欠損しているマウス(ノックアウトマウス)では、骨粗鬆症と動
脈石灰化が早期に現れる(Bucay ら, 1998)。これらの観察は、オステオプロテゲ
リンが破骨細胞(単独ではないにしても主な骨再吸収細胞型)の分化を妨げている
可能性を強く示すものであり、そのことは、それが骨吸収の体液性レギュレータ
ーとして作用できることを示唆している。オステオプロテゲリンは、WO 97/2361
4号の主題である。 オステオプロテゲリンは破骨細胞の発達を刺激する因子に結合して中和し、そ
のようにして破骨細胞の成熟を阻害することによってその効果を発揮するとの仮
説がなされた（Simonetら, 1997）。
。生体外で、オステオプロテゲリンは用量依存的に破骨細胞形成を妨げる。オス
テオプロテゲリンを発現するトランスジェニックマウスは、破骨細胞の減少に伴
って骨密度の一般的増加(骨化石症)を示す。オステオプロテゲリン組換え体を投
与すると正常なマウスでは同様の効果が生じ、ラットでは卵巣摘出に伴う骨減少
から保護される(Simonetら, 1997)。加えて、生まれた時に正常であるがオステ
オプロテゲリンが欠損しているマウス(ノックアウトマウス)では、骨粗鬆症と動
脈石灰化が早期に現れる(Bucay ら, 1998)。これらの観察は、オステオプロテゲ
リンが破骨細胞(単独ではないにしても主な骨再吸収細胞型)の分化を妨げている
可能性を強く示すものであり、そのことは、それが骨吸収の体液性レギュレータ
ーとして作用できることを示唆している。オステオプロテゲリンは、WO 97/2361
4号の主題である。 オステオプロテゲリンは破骨細胞の発達を刺激する因子に結合して中和し、そ
のようにして破骨細胞の成熟を阻害することによってその効果を発揮するとの仮
説がなされた（Simonetら, 1997）。
【０００６】 オステオプロテゲリンリガンド（OPGL）は、膜結合型及び溶解可能型の両方で
存在するサイトカインの腫瘍壊死因子群の新規なメンバーである。OPGLは、4nM
の結合親和性でオステオプロテゲリンに結合する。生体外で、OPGLはCSF-1の存
在下で成熟破骨細胞を活性化し、骨髄前駆体からの破骨細胞の形成を調節する。
OPGLがCSF-1処理骨髄において始原破骨細胞の表面に結合することも論証された
。しかしながら、これらの始原造血細胞におけるOPGLの受容体は知られていない
。溶解性OPGLの組み換え体は、生体内における骨吸収の有力な誘導物質である(L
aceyら, 1998)。
存在するサイトカインの腫瘍壊死因子群の新規なメンバーである。OPGLは、4nM
の結合親和性でオステオプロテゲリンに結合する。生体外で、OPGLはCSF-1の存
在下で成熟破骨細胞を活性化し、骨髄前駆体からの破骨細胞の形成を調節する。
OPGLがCSF-1処理骨髄において始原破骨細胞の表面に結合することも論証された
。しかしながら、これらの始原造血細胞におけるOPGLの受容体は知られていない
。溶解性OPGLの組み換え体は、生体内における骨吸収の有力な誘導物質である(L
aceyら, 1998)。
【０００７】OPGLの記載 OPGLは、317個のアミノ酸残基(ヒト、SEQ ID NO: 2参照)又は316個のアミノ酸
残基(マウス、SEQ ID NO: 4及び6参照)からなるII型トランスメンブランタンパ
ク質として合成される。2つのアミノ酸配列のアラインメントは、相同する位置
の87％に同一のアミノ酸残基が見られることを示している。 OPGLアミノ酸配列は、N-末端に短い細胞質ドメインとそれに続く49〜69アミノ
酸残基の推定上のトランスメンブラン領域を含む。腫瘍壊死因子αに対するその
相同性に基づいて、OPGLの細胞外部分は2つの領域：アミノ酸残基70から157にわ
たるストーク領域とアミノ酸残基158からC-末端にわたる活性リガンド部分によ
って構成されることが示唆された。 OPGLに最も密接に関連しているタンパク質は、同一アミノ酸残基が25％より少
ないアポトーシス誘発サイトカインTRAILであると考えられる。OPGLはまた、ご
く最近他の状況でクローンされ、各々TRANCE（Wongら, 1997, J. Biol. Chem. 2
72: 25190-25194）及びRANKL（Andersonら, 1997, Nature 390: 175-179）と名
づけられた。そのタンパク質はまた、破骨細胞分化因子(ODF)としても知られて
いる。
残基(マウス、SEQ ID NO: 4及び6参照)からなるII型トランスメンブランタンパ
ク質として合成される。2つのアミノ酸配列のアラインメントは、相同する位置
の87％に同一のアミノ酸残基が見られることを示している。 OPGLアミノ酸配列は、N-末端に短い細胞質ドメインとそれに続く49〜69アミノ
酸残基の推定上のトランスメンブラン領域を含む。腫瘍壊死因子αに対するその
相同性に基づいて、OPGLの細胞外部分は2つの領域：アミノ酸残基70から157にわ
たるストーク領域とアミノ酸残基158からC-末端にわたる活性リガンド部分によ
って構成されることが示唆された。 OPGLに最も密接に関連しているタンパク質は、同一アミノ酸残基が25％より少
ないアポトーシス誘発サイトカインTRAILであると考えられる。OPGLはまた、ご
く最近他の状況でクローンされ、各々TRANCE（Wongら, 1997, J. Biol. Chem. 2
72: 25190-25194）及びRANKL（Andersonら, 1997, Nature 390: 175-179）と名
づけられた。そのタンパク質はまた、破骨細胞分化因子(ODF)としても知られて
いる。
【０００８】 マウスOPGLの幾つかのN-末端欠失変異型が大腸菌(E.coli)で発現され、精製さ
れた。これらの変異型は、各々75-316、128-316、137-316及び158-316アミノ酸
残基からなった。3つの最も短い変異型は円二色性研究に基づけば同様のβ-シー
ト構造を有し、全てがオステオプロテゲリンに結合することができた。けれども
より重要なことは、その3つの変異型が生体外アッセイにおいて活性であったこ
とである(Laceyら, 1998)。 最も短い変異型をさらに研究した。腫瘍壊死因子αのように、この変異型OPGL
は溶液中に三量体として存在し、オステオプロテゲリンとインキュベートしたと
き3：3複合体を形成する。その結合親和性は、4nMであることが見出された。こ
の変異型は、マウスにおいて生体内で血中イオン化カルシウムの有意な増加(高
カルシウム血症)を誘発する。オステオプロテゲリンの共同投与により、OPGLの
この高カルシウム血の作用は有意に減少した。 OPGLの最も長い変異型(アミノ酸残基75-316)は、オステオプロテゲリンに結合
せず、生物学的活性を全く有しなかった。
れた。これらの変異型は、各々75-316、128-316、137-316及び158-316アミノ酸
残基からなった。3つの最も短い変異型は円二色性研究に基づけば同様のβ-シー
ト構造を有し、全てがオステオプロテゲリンに結合することができた。けれども
より重要なことは、その3つの変異型が生体外アッセイにおいて活性であったこ
とである(Laceyら, 1998)。 最も短い変異型をさらに研究した。腫瘍壊死因子αのように、この変異型OPGL
は溶液中に三量体として存在し、オステオプロテゲリンとインキュベートしたと
き3：3複合体を形成する。その結合親和性は、4nMであることが見出された。こ
の変異型は、マウスにおいて生体内で血中イオン化カルシウムの有意な増加(高
カルシウム血症)を誘発する。オステオプロテゲリンの共同投与により、OPGLの
この高カルシウム血の作用は有意に減少した。 OPGLの最も長い変異型(アミノ酸残基75-316)は、オステオプロテゲリンに結合
せず、生物学的活性を全く有しなかった。
【０００９】 N-末端欠失変異型の構築時には、OPGLにおける天然の切断部位は知られていな
かった。ヒトの293個の繊維芽細胞での全長OPGLの発現により、マウスタンパク
質のアミノ残基139あるいはヒトタンパク質の相同なアミノ酸残基140で始まる溶
解性OPGLが生じた。これらの発現研究は、ヒト細胞での発現から生じる溶解性OP
GLがグリコシル化されていることも示した。このことは、マウスとヒトのOPGLが
ともにC-末端リガンド領域に３つの潜在的なN-グリコシル化部位を含むので、驚
くべきことではない。 血中及び組織中のオステオプロテゲリン濃度は知られていないが、そのタンパ
ク質は1ng/mlの濃度で有意な生物学的活性を有している。
かった。ヒトの293個の繊維芽細胞での全長OPGLの発現により、マウスタンパク
質のアミノ残基139あるいはヒトタンパク質の相同なアミノ酸残基140で始まる溶
解性OPGLが生じた。これらの発現研究は、ヒト細胞での発現から生じる溶解性OP
GLがグリコシル化されていることも示した。このことは、マウスとヒトのOPGLが
ともにC-末端リガンド領域に３つの潜在的なN-グリコシル化部位を含むので、驚
くべきことではない。 血中及び組織中のオステオプロテゲリン濃度は知られていないが、そのタンパ
ク質は1ng/mlの濃度で有意な生物学的活性を有している。
【００１０】OPGLの生物学的活性 OPGLは、CSF-1と組み合わさると、有力な破骨細胞分化因子である。これらの
成分は、どちらも単独では始原細胞からの破骨細胞の分化を誘発することはでき
ない。 OPGLは、成熟破骨細胞の有力な活性化因子である。それ自体で、OPGLは成熟破
骨細胞を活性化し、骨を再吸収する。これらの実験では、OPGLが破骨細胞成長因
子又は破骨細胞生存因子として作用することは観察されなかった。 マウスOPGLもヒト末梢血単核細胞の培養で破骨細胞の形成を誘発したので、OP
GLの作用が種に限定されるとは考えられない。発明の目的 この発明の目的は、骨粗鬆症のような過剰な骨再吸収によって特徴づけられる
症状に対する新規な治療を提供することである。さらなる目的は、OPGLに対する
自己ワクチンを開発し、骨粗鬆症及び過剰な骨再吸収を伴う他の病理学的疾患の
新規な治療を得ることである。
成分は、どちらも単独では始原細胞からの破骨細胞の分化を誘発することはでき
ない。 OPGLは、成熟破骨細胞の有力な活性化因子である。それ自体で、OPGLは成熟破
骨細胞を活性化し、骨を再吸収する。これらの実験では、OPGLが破骨細胞成長因
子又は破骨細胞生存因子として作用することは観察されなかった。 マウスOPGLもヒト末梢血単核細胞の培養で破骨細胞の形成を誘発したので、OP
GLの作用が種に限定されるとは考えられない。発明の目的 この発明の目的は、骨粗鬆症のような過剰な骨再吸収によって特徴づけられる
症状に対する新規な治療を提供することである。さらなる目的は、OPGLに対する
自己ワクチンを開発し、骨粗鬆症及び過剰な骨再吸収を伴う他の病理学的疾患の
新規な治療を得ることである。
【００１１】発明の要約 上記に参照したデータは、OPGLの病態生理学的役割を示唆していることが分か
る。生体内の証拠は部分的に情況的つまり間接的なものであるが、我々の意見で
は、特に直接的証拠と組み合せると説得力のあるものである。 OPGLの組換え型C-末端領域のマウスへの注入により重篤な高カルシウム血症が
生じるという観察は、我々の意見では、病態生理学的役割を直接に示す。 間接的証拠は、出生時は正常であっても早期に骨粗鬆症を発症するオステオプ
ロテゲリン欠乏マウス(ノックアウトマウス)に由来する。これは、OPGLに結合し
その作用を中和するタンパク質の除去が骨粗鬆症をもたらすことを示している。
この最も可能性のある理由は、OPGLによって引き起こされる破骨細胞の成熟と活
性化の上昇であると推断される。
る。生体内の証拠は部分的に情況的つまり間接的なものであるが、我々の意見で
は、特に直接的証拠と組み合せると説得力のあるものである。 OPGLの組換え型C-末端領域のマウスへの注入により重篤な高カルシウム血症が
生じるという観察は、我々の意見では、病態生理学的役割を直接に示す。 間接的証拠は、出生時は正常であっても早期に骨粗鬆症を発症するオステオプ
ロテゲリン欠乏マウス(ノックアウトマウス)に由来する。これは、OPGLに結合し
その作用を中和するタンパク質の除去が骨粗鬆症をもたらすことを示している。
この最も可能性のある理由は、OPGLによって引き起こされる破骨細胞の成熟と活
性化の上昇であると推断される。
【００１２】 他の2つの間接的証拠は、オステオプロテゲリンのトランスジェニックマウス
と組換えオステオプロテゲリンを注入したマウスがともに骨粗鬆症を発症するこ
とである。これは、OPGLに結合してその作用を中和する異常な高レベルのタンパ
ク質が骨粗鬆症をもたらすことを示している。つまり、これは、OPGLの中和によ
って引き起こされる破骨細胞の成熟と活性化の低下における理由であるものと結
論される。 したがって、OPGLとオステオプロテゲリンが、それぞれ破骨細胞の発生の陽性
及び陰性のレギュレーターとして作用するモデルが示唆される。言い換えれば、
OPGLは骨の再吸収を促進するが、オステオプロテゲリンは骨再吸収を阻害する。 つまり、骨粗鬆症との関係で、OPGLは、最後には骨粗鬆症をもたらす骨の再吸
収を促進する「発病剤」として考えられる。同様に、オステオプロテゲリンは、
その作用の中和を介して「発病剤」を妨げる「治療剤」として認識され得る。
と組換えオステオプロテゲリンを注入したマウスがともに骨粗鬆症を発症するこ
とである。これは、OPGLに結合してその作用を中和する異常な高レベルのタンパ
ク質が骨粗鬆症をもたらすことを示している。つまり、これは、OPGLの中和によ
って引き起こされる破骨細胞の成熟と活性化の低下における理由であるものと結
論される。 したがって、OPGLとオステオプロテゲリンが、それぞれ破骨細胞の発生の陽性
及び陰性のレギュレーターとして作用するモデルが示唆される。言い換えれば、
OPGLは骨の再吸収を促進するが、オステオプロテゲリンは骨再吸収を阻害する。 つまり、骨粗鬆症との関係で、OPGLは、最後には骨粗鬆症をもたらす骨の再吸
収を促進する「発病剤」として考えられる。同様に、オステオプロテゲリンは、
その作用の中和を介して「発病剤」を妨げる「治療剤」として認識され得る。
【００１３】 したがって、OPGLを中和しうる抗体の生体内産生によって、破骨細胞の分化/
成熟/形成及び破骨細胞の活性化をダウン-レギュレートし、それによって、骨粗
鬆症及び骨形成速度に比して過剰な骨再吸収速度によって特徴づけられる他の疾
患の治療/改善及び/又は予防のための安全かつ効率的な手段を提供することが提
案される。 つまり、もっとも広くかつもっとも一般的な範囲において、この発明は、 - OPGLポリペプチド又はそのサブ配列での動物の免疫化がOPGLポリペプチドに
対する抗体の産生を誘導するよう系統立てられている、少なくともひとつのOPGL
ポリペプチド又はそのサブ配列、及び/又は - OPGL類似体を用いる動物の免疫化で、結果としてOPGLポリペプチドに対する
抗体の産生を誘導する修飾がOPGLポリペプチドに誘導されている、少なくともひ
とつのOPGL類似体 の免疫学的に有効な量を動物の免疫系に提示することからなる、ヒトを含む動物
におけるオステオプロテゲリンリガンド(OPGL)活性を生体内でダウン-レギュレ
ートする方法に関する。
成熟/形成及び破骨細胞の活性化をダウン-レギュレートし、それによって、骨粗
鬆症及び骨形成速度に比して過剰な骨再吸収速度によって特徴づけられる他の疾
患の治療/改善及び/又は予防のための安全かつ効率的な手段を提供することが提
案される。 つまり、もっとも広くかつもっとも一般的な範囲において、この発明は、 - OPGLポリペプチド又はそのサブ配列での動物の免疫化がOPGLポリペプチドに
対する抗体の産生を誘導するよう系統立てられている、少なくともひとつのOPGL
ポリペプチド又はそのサブ配列、及び/又は - OPGL類似体を用いる動物の免疫化で、結果としてOPGLポリペプチドに対する
抗体の産生を誘導する修飾がOPGLポリペプチドに誘導されている、少なくともひ
とつのOPGL類似体 の免疫学的に有効な量を動物の免疫系に提示することからなる、ヒトを含む動物
におけるオステオプロテゲリンリガンド(OPGL)活性を生体内でダウン-レギュレ
ートする方法に関する。
【００１４】 この試みのもっとも魅力的な観点は、例えば骨粗鬆症が、オステオプロテゲリ
ン又はOPGL類似体への結合親和性を有する分子の頻繁な(例えば、毎日の)投与を
伴う治療方法とは対照的に、周期的ではあるがあまり頻繁ではない免疫化によっ
て制御できるということである。免疫原性組成物を用いる場合、一年当たり1〜4
回の注入で所望の効果を得るのに十分であるが、オステオプロテゲリン又は他の
OPGL活性阻害剤の投与では毎日の投与を要するものと予想される。 この発明は、OPGL類似体ならびにこれらのサブセットをエンコードする核酸フ
ラグメントにも関する。また、その類似体又は核酸フラグメントからなる免疫原
性組成物は本発明の一部である。 また、この発明は、OPGL類似体の同定方法ならびにOPGL類似体からなる組成物
の製造方法に関する。 最後に、この発明は、破骨細胞におけるOPGLとその受容体との相互作用を妨げ
る非-OPGL分子(一般的には抗体)を投与する、骨粗鬆症及び過剰な骨再吸収で特
徴づけられる他の疾患の治療方法に関する。
ン又はOPGL類似体への結合親和性を有する分子の頻繁な(例えば、毎日の)投与を
伴う治療方法とは対照的に、周期的ではあるがあまり頻繁ではない免疫化によっ
て制御できるということである。免疫原性組成物を用いる場合、一年当たり1〜4
回の注入で所望の効果を得るのに十分であるが、オステオプロテゲリン又は他の
OPGL活性阻害剤の投与では毎日の投与を要するものと予想される。 この発明は、OPGL類似体ならびにこれらのサブセットをエンコードする核酸フ
ラグメントにも関する。また、その類似体又は核酸フラグメントからなる免疫原
性組成物は本発明の一部である。 また、この発明は、OPGL類似体の同定方法ならびにOPGL類似体からなる組成物
の製造方法に関する。 最後に、この発明は、破骨細胞におけるOPGLとその受容体との相互作用を妨げ
る非-OPGL分子(一般的には抗体)を投与する、骨粗鬆症及び過剰な骨再吸収で特
徴づけられる他の疾患の治療方法に関する。
【００１５】発明の詳細な説明 定 義 以下において、この明細書及び請求の範囲で用いられる幾つかの用語を定義し
、詳細に説明して、この発明の境界を明らかにする。 用語「T-リンパ球」及び「T-細胞」は、種々の細胞媒介性免疫応答ならびに体
液性免疫応答でのヘルパー活性の原因である胸腺由来リンパ球について互換的に
用いられる。同様に、「B-リンパ球」及び「B-細胞」は、抗体産生リンパ球につ
いて互換的に用いられる。 「OPGLポリペプチド」は、ここでヒト及びマウス由来の上記OPGLタンパク質の
アミノ酸配列を有するポリペプチド(又はB-細胞エピトープの実質量を完全型OPG
Lと共有する、その端を切り取った(truncate)型)を意味することを意図するが、
他種から単離されるこれらの2つのタンパク質の類似体に同一のアミノ酸配列を
有するポリペプチドもこの用語に含まれる。また、原核生物系でつくられるOPGL
の非グリコシル化形態は、例えば酵母又は他の非哺乳動物の真核生物発現系の使
用によりグリコシル化パターンが異なる形態のように、この用語の境界内に含ま
れる。しかし、用語「OPGLポリペプチド」を用いる際には、当該ポリペプチドが
治療されるべき動物に提示される際に、通常、非免疫原性であることを意図する
。言い換えれば、OPGLポリペプチドは自己タンパク質、又は当該動物のOPGLに通
常は免疫応答を生じない、かかる自己タンパク質の類似体である。
、詳細に説明して、この発明の境界を明らかにする。 用語「T-リンパ球」及び「T-細胞」は、種々の細胞媒介性免疫応答ならびに体
液性免疫応答でのヘルパー活性の原因である胸腺由来リンパ球について互換的に
用いられる。同様に、「B-リンパ球」及び「B-細胞」は、抗体産生リンパ球につ
いて互換的に用いられる。 「OPGLポリペプチド」は、ここでヒト及びマウス由来の上記OPGLタンパク質の
アミノ酸配列を有するポリペプチド(又はB-細胞エピトープの実質量を完全型OPG
Lと共有する、その端を切り取った(truncate)型)を意味することを意図するが、
他種から単離されるこれらの2つのタンパク質の類似体に同一のアミノ酸配列を
有するポリペプチドもこの用語に含まれる。また、原核生物系でつくられるOPGL
の非グリコシル化形態は、例えば酵母又は他の非哺乳動物の真核生物発現系の使
用によりグリコシル化パターンが異なる形態のように、この用語の境界内に含ま
れる。しかし、用語「OPGLポリペプチド」を用いる際には、当該ポリペプチドが
治療されるべき動物に提示される際に、通常、非免疫原性であることを意図する
。言い換えれば、OPGLポリペプチドは自己タンパク質、又は当該動物のOPGLに通
常は免疫応答を生じない、かかる自己タンパク質の類似体である。
【００１６】 「OPGL類似体」は、その一次構造で変化を受けやすいOPGLポリペプチドである
。かかる変化は、例えば適当な融合パートナーへのOPGLポリペプチドの融合形態
(つまり、アミノ酸残基のC-及び/又はN-末端付加を独占的に伴う一次構造での変
化)であってもよく、及び/又はOPGLポリペプチドのアミノ酸配列における挿入及
び/又は欠失及び/又は置換形態であってもよい。誘導されるOPGL分子も、この用
語に包含される(OPGLの修飾に関する以下参照)。 ヒトOPGLの外来類似体(例えばイヌ又はブタの類似体)のヒトでのワクチンとし
ての使用は、OPGLに対する所望の免疫を生じることが想像できることに留意され
たい。免疫化のための外来類似体のこのような使用も、この発明の一部と考えら
れる。 用語「ポリペプチド」は、この明細書で2-10アミノ酸残基の短いペプチド、11
-100アミノ酸残基のオリゴペプチド、及び100アミノ酸残基より多いポリペプチ
ドのいずれも意味することを意図する。さらに、この用語は、タンパク質、つま
り少なくともひとつのポリペプチドからなる機能的生体分子を含むことも意図す
る。少なくとも2つのポリペプチドからなる際には、これらは複合体を形成し、
共有結合するか、又は非共有的に結合していてもよい。タンパク質中のポリペプ
チドは、グリコシル化及び/又は脂質化していてもよく、かつ/又は補欠分子族を
含んでいてもよい。
。かかる変化は、例えば適当な融合パートナーへのOPGLポリペプチドの融合形態
(つまり、アミノ酸残基のC-及び/又はN-末端付加を独占的に伴う一次構造での変
化)であってもよく、及び/又はOPGLポリペプチドのアミノ酸配列における挿入及
び/又は欠失及び/又は置換形態であってもよい。誘導されるOPGL分子も、この用
語に包含される(OPGLの修飾に関する以下参照)。 ヒトOPGLの外来類似体(例えばイヌ又はブタの類似体)のヒトでのワクチンとし
ての使用は、OPGLに対する所望の免疫を生じることが想像できることに留意され
たい。免疫化のための外来類似体のこのような使用も、この発明の一部と考えら
れる。 用語「ポリペプチド」は、この明細書で2-10アミノ酸残基の短いペプチド、11
-100アミノ酸残基のオリゴペプチド、及び100アミノ酸残基より多いポリペプチ
ドのいずれも意味することを意図する。さらに、この用語は、タンパク質、つま
り少なくともひとつのポリペプチドからなる機能的生体分子を含むことも意図す
る。少なくとも2つのポリペプチドからなる際には、これらは複合体を形成し、
共有結合するか、又は非共有的に結合していてもよい。タンパク質中のポリペプ
チドは、グリコシル化及び/又は脂質化していてもよく、かつ/又は補欠分子族を
含んでいてもよい。
【００１７】 用語「サブ配列」は、それぞれ天然に存在するOPGLアミノ酸配列又は核酸配列
から直接誘導される、少なくとも3アミノ酸、又は適切な場合には、少なくとも3
ヌクレオチドのいずれかの連続的なストレッチを意味する。 用語「動物」は、この明細書で、一般的に動物種(好ましくは哺乳動物)、例え
ばホモ・サピエンス、キャニス・ドメスティカス(Canis domesticus)等を意味し
、わずか１つの動物ではないことを意図する。しかし、この用語は、そのような
動物種の個体群も意味する。なぜなら、この発明の方法によって免疫化された個
体は全て、同じ免疫原での動物の免疫化を可能にする同一のOPGLを実質的に有し
ていることが重要であるからである。例えばOPGLの遺伝的変異型が種々のヒト個
体群に存在する場合、これらの種々の個体群で異なる免疫原を用いて、各群での
OPGLに対する自己耐性(autotolerance)を破壊できるようにすることが必要かも
しれない。この明細書において、動物が免疫系を有する生物であることは当業者
に明らかである。動物は、哺乳動物のような脊椎動物であることが好ましい。
から直接誘導される、少なくとも3アミノ酸、又は適切な場合には、少なくとも3
ヌクレオチドのいずれかの連続的なストレッチを意味する。 用語「動物」は、この明細書で、一般的に動物種(好ましくは哺乳動物)、例え
ばホモ・サピエンス、キャニス・ドメスティカス(Canis domesticus)等を意味し
、わずか１つの動物ではないことを意図する。しかし、この用語は、そのような
動物種の個体群も意味する。なぜなら、この発明の方法によって免疫化された個
体は全て、同じ免疫原での動物の免疫化を可能にする同一のOPGLを実質的に有し
ていることが重要であるからである。例えばOPGLの遺伝的変異型が種々のヒト個
体群に存在する場合、これらの種々の個体群で異なる免疫原を用いて、各群での
OPGLに対する自己耐性(autotolerance)を破壊できるようにすることが必要かも
しれない。この明細書において、動物が免疫系を有する生物であることは当業者
に明らかである。動物は、哺乳動物のような脊椎動物であることが好ましい。
【００１８】 ここで、用語「OPGL活性の生体内ダウン-レギュレーション」によれば、生物
におけるOPGLとその(未知の)受容体との相互作用(又はOPGLとこの分子に関して
生物学的に重要な可能性がある他の結合パートナー)の数の減少が意味される。
ダウン-レギュレーションは、幾つかの機序によって達成され得る。これらのう
ち、抗体結合によるOPGL中の活性部位の干渉がもっとも単純である。しかし、抗
体結合がスカベンジャー細胞(例えばマクロファージ及び他の食細胞)によってOP
GLの除去を生じることも、本発明の範囲内である。 表現「免疫系に・・・提示する」は、動物の免疫系が制御された様式で免疫原性
の対抗(challenge)に付されていることを意味することを意図する。以下の開示
から明らかであるように、免疫系のこのような対抗は幾つかの方法で行うことが
できる。そのうちもっとも重要なのは、「ファーマシン(pharmaccine)」を含む
ポリペプチド(つまり、進行中の疾患を治療又は改善するために投与されるワク
チン)でのワクチン注射又は核酸「ファーマシン」のワクチン注射である。動物
の免疫受容細胞が免疫学的に有効な様式で抗原と相対することは達成するのに重
要な結果であるが、この結果を達成するのに正確な様式は、この発明の基礎とな
る創意に富む考えにはあまり重要ではない。
におけるOPGLとその(未知の)受容体との相互作用(又はOPGLとこの分子に関して
生物学的に重要な可能性がある他の結合パートナー)の数の減少が意味される。
ダウン-レギュレーションは、幾つかの機序によって達成され得る。これらのう
ち、抗体結合によるOPGL中の活性部位の干渉がもっとも単純である。しかし、抗
体結合がスカベンジャー細胞(例えばマクロファージ及び他の食細胞)によってOP
GLの除去を生じることも、本発明の範囲内である。 表現「免疫系に・・・提示する」は、動物の免疫系が制御された様式で免疫原性
の対抗(challenge)に付されていることを意味することを意図する。以下の開示
から明らかであるように、免疫系のこのような対抗は幾つかの方法で行うことが
できる。そのうちもっとも重要なのは、「ファーマシン(pharmaccine)」を含む
ポリペプチド(つまり、進行中の疾患を治療又は改善するために投与されるワク
チン)でのワクチン注射又は核酸「ファーマシン」のワクチン注射である。動物
の免疫受容細胞が免疫学的に有効な様式で抗原と相対することは達成するのに重
要な結果であるが、この結果を達成するのに正確な様式は、この発明の基礎とな
る創意に富む考えにはあまり重要ではない。
【００１９】 用語「免疫原性的に有効な量」とは、当該分野での通常の意味、つまり免疫学
的特徴を免疫原と共有している発病剤を著しく連動させる免疫応答を誘導し得る
免疫原の量である。 OPGLが「修飾」されているとの表現を用いる際には、ここで、OPGLの骨格を成
すポリペプチドの化学的修飾が意味される。このような修飾は、例えばOPGL配列
のあるアミノ酸残基の誘導化(例えばアルキル化)であってもよいが、以下の開示
から認められるように、好ましい修飾は、OPGLアミノ酸配列の一次構造の変化か
らなる。 「OPGLに対する自己耐性」を論じる際には、OPGLはワクチン注射される個体群
において自己タンパク質であるので、正常な個体は群でOPGLに対する免疫応答を
高めないものと理解される。但し、動物個体群の個体が時折り例えば自己免疫疾
患の一環として天然OPGLに対する抗体を産生しうることは否定できない。いずれ
にせよ、動物は通常自分自身のOPGLに自己耐性であるにすぎないが、他の動物種
又はOPGL表現型の異なる個体群由来のOPGL類似体にも、該動物が耐性をもちうる
ことは否定できない。
的特徴を免疫原と共有している発病剤を著しく連動させる免疫応答を誘導し得る
免疫原の量である。 OPGLが「修飾」されているとの表現を用いる際には、ここで、OPGLの骨格を成
すポリペプチドの化学的修飾が意味される。このような修飾は、例えばOPGL配列
のあるアミノ酸残基の誘導化(例えばアルキル化)であってもよいが、以下の開示
から認められるように、好ましい修飾は、OPGLアミノ酸配列の一次構造の変化か
らなる。 「OPGLに対する自己耐性」を論じる際には、OPGLはワクチン注射される個体群
において自己タンパク質であるので、正常な個体は群でOPGLに対する免疫応答を
高めないものと理解される。但し、動物個体群の個体が時折り例えば自己免疫疾
患の一環として天然OPGLに対する抗体を産生しうることは否定できない。いずれ
にせよ、動物は通常自分自身のOPGLに自己耐性であるにすぎないが、他の動物種
又はOPGL表現型の異なる個体群由来のOPGL類似体にも、該動物が耐性をもちうる
ことは否定できない。
【００２０】 「外来T-細胞エピトープ」(つまり、「外来T-リンパ球エピトープ」)は、動物
種においてMHC分子に結合でき、T-細胞を刺激するペプチドである。この発明で
好ましい外来T-細胞エピトープは「乱交雑」エピトープ、つまり動物の種又は個
体群で特定クラスのMHC分子の実質的なフラクションに結合するエピトープであ
る。このような乱交雑T-細胞エピトープは、ごく限られた数しか知られていない
。それらを、詳細に後述する。適切には、この発明にしたがって用いられている
免疫原ができるだけ大きな動物個体群のフラクションで有効であるようにするた
め、1)同じOPGL類似体に幾つかの外来T-細胞エピトープを挿入するか、又は2)各
類似体に種々の乱交雑エピトープが挿入されている幾つかのOPGL類似体を製造す
る必要があり得る。外来T-細胞エピトープの概念は、クリプティックT-細胞エピ
トープ、つまり自己タンパク質に由来し、当該の自己タンパク質の部分なしに単
離型で存在する際にのみ免疫原性挙動を示すエピトープの使用も包含することも
留意されたい。 「外来Tヘルパーリンパ球エピトープ」(外来THエピトープ)は、クラスII のMH
C群分子に結合する外来T細胞エピトープであり、クラスIIのMHC分子に結合する
抗原提示細胞(APC)表面上で提示され得る。
種においてMHC分子に結合でき、T-細胞を刺激するペプチドである。この発明で
好ましい外来T-細胞エピトープは「乱交雑」エピトープ、つまり動物の種又は個
体群で特定クラスのMHC分子の実質的なフラクションに結合するエピトープであ
る。このような乱交雑T-細胞エピトープは、ごく限られた数しか知られていない
。それらを、詳細に後述する。適切には、この発明にしたがって用いられている
免疫原ができるだけ大きな動物個体群のフラクションで有効であるようにするた
め、1)同じOPGL類似体に幾つかの外来T-細胞エピトープを挿入するか、又は2)各
類似体に種々の乱交雑エピトープが挿入されている幾つかのOPGL類似体を製造す
る必要があり得る。外来T-細胞エピトープの概念は、クリプティックT-細胞エピ
トープ、つまり自己タンパク質に由来し、当該の自己タンパク質の部分なしに単
離型で存在する際にのみ免疫原性挙動を示すエピトープの使用も包含することも
留意されたい。 「外来Tヘルパーリンパ球エピトープ」(外来THエピトープ)は、クラスII のMH
C群分子に結合する外来T細胞エピトープであり、クラスIIのMHC分子に結合する
抗原提示細胞(APC)表面上で提示され得る。
【００２１】 この明細書において(生体)分子の「機能部分」は、分子によって奏される生化
学的又は生理学的作用の少なくともひとつについて原因となる分子の部分を意味
することを意図する。当該分野で、多くの酵素と他のエフェクター分子が、当該
分子によって奏される作用の原因となる活性部位を有することは周知である。分
子の他の部分は安定化又は可溶化を増強する目的に役立つことがあり、したがっ
て、この発明のある具体例の状況でこれらの目的が関連していない場合に除外さ
れ得る。例えば、OPGLにおける修飾分子としてあるサイトカインを用いることが
でき(詳細は後述参照)、このような場合にはOPGLへの結合が必要な安定性を生じ
るので、安定性の供給は不適切な可能性がある。 用語「アジュバント」はワクチン技術の分野で通常の意味を有し、つまり1)そ
れ自体では、ワクチンの免疫原に特異的な免疫応答を高めることができないが、
2)それにもかかわらず、免疫原に対する免疫応答を増強できる物質もしくは材料
組成物である。つまり、換言すれば、アジュバントのみでのワクチン注射は免疫
原に免疫応答を生じず、免疫原でのワクチン注射は免疫原に対する免疫応答を生
じるか、もしくは生じないが、免疫原とアジュバントを用いる組合わせたワクチ
ン注射は、免疫原のみによって誘導されるよりも強力な免疫応答を免疫原に誘導
する。
学的又は生理学的作用の少なくともひとつについて原因となる分子の部分を意味
することを意図する。当該分野で、多くの酵素と他のエフェクター分子が、当該
分子によって奏される作用の原因となる活性部位を有することは周知である。分
子の他の部分は安定化又は可溶化を増強する目的に役立つことがあり、したがっ
て、この発明のある具体例の状況でこれらの目的が関連していない場合に除外さ
れ得る。例えば、OPGLにおける修飾分子としてあるサイトカインを用いることが
でき(詳細は後述参照)、このような場合にはOPGLへの結合が必要な安定性を生じ
るので、安定性の供給は不適切な可能性がある。 用語「アジュバント」はワクチン技術の分野で通常の意味を有し、つまり1)そ
れ自体では、ワクチンの免疫原に特異的な免疫応答を高めることができないが、
2)それにもかかわらず、免疫原に対する免疫応答を増強できる物質もしくは材料
組成物である。つまり、換言すれば、アジュバントのみでのワクチン注射は免疫
原に免疫応答を生じず、免疫原でのワクチン注射は免疫原に対する免疫応答を生
じるか、もしくは生じないが、免疫原とアジュバントを用いる組合わせたワクチ
ン注射は、免疫原のみによって誘導されるよりも強力な免疫応答を免疫原に誘導
する。
【００２２】 この明細書で分子の「標的化」は、動物中の導入による分子がある組織で優先
的に現れるか、又はある細胞もしくは細胞型と優先的に結合している状況を意味
することを意図する。これは、標的化を容易にする組成物での分子の形成又は標
的化を容易にする基の分子での導入を含む幾つかの方法で達成され得る。これら
の討論は、以下で詳細にする。 「免疫系の刺激」は、物質又は材料組成物が一般的な非特異的免疫刺激作用を
奏することを意味する。幾つかのアジュバントと推定されるアジュバント(例え
ばある種のサイトカイン)は、免疫系を刺激する能力を共有する。免疫刺激剤を
用いると、免疫原の単離使用と比較して免疫原での刺激又はその後の免疫化が著
しく有効な免疫応答を誘導することを意味する免疫系の「警告(alertness)」が
増強される。
的に現れるか、又はある細胞もしくは細胞型と優先的に結合している状況を意味
することを意図する。これは、標的化を容易にする組成物での分子の形成又は標
的化を容易にする基の分子での導入を含む幾つかの方法で達成され得る。これら
の討論は、以下で詳細にする。 「免疫系の刺激」は、物質又は材料組成物が一般的な非特異的免疫刺激作用を
奏することを意味する。幾つかのアジュバントと推定されるアジュバント(例え
ばある種のサイトカイン)は、免疫系を刺激する能力を共有する。免疫刺激剤を
用いると、免疫原の単離使用と比較して免疫原での刺激又はその後の免疫化が著
しく有効な免疫応答を誘導することを意味する免疫系の「警告(alertness)」が
増強される。
【００２３】OPGL活性ダウン-レギュレーションの好ましい具体例 この発明の方法で免疫原として用いられるOPGLポリペプチドは、OPGLアミノ酸
配列に少なくともひとつの変更がある修飾分子であることが好ましい。なぜなら
、OPGLに対する自己耐性の非常に重要な破壊を得る機会がこの方法でかなり容易
になるからである。これは、OPGLに対する自己耐性の破壊をさらに促進する製剤
、例えばアジュバントを含む製剤においてかかる修飾OPGLを用いる可能性を除く
ものではないことに留意されたい。
配列に少なくともひとつの変更がある修飾分子であることが好ましい。なぜなら
、OPGLに対する自己耐性の非常に重要な破壊を得る機会がこの方法でかなり容易
になるからである。これは、OPGLに対する自己耐性の破壊をさらに促進する製剤
、例えばアジュバントを含む製剤においてかかる修飾OPGLを用いる可能性を除く
ものではないことに留意されたい。
【００２４】 自己タンパク質を認識する潜在的に自己反応性のB-リンパ球は正常な個体に生
理学的に存在することが示されている(Dalum Iら, 1996, J. Immunol. 157: 479
6-4804)。しかし、これらのB-リンパ球が関連性ある自己タンパク質と実際に反
応性の抗体を産生するよう誘導するには、T-ヘルパーリンパ球(TH-細胞又はTH-
リンパ球)を産生するサイトカインからの補助が必要である。通常、この助力は
、T-リンパ球が一般的に抗原提示細胞(APC)によって提示される際に自己タンパ
ク質由来のT-細胞エピトープを認識しないため、提供されない。しかし、自己タ
ンパク質に「外来性」要素を提供する(つまり、免疫学的に著しい修飾を導入す
る)ことによって、外来要素を認識するT-細胞はAPC上の外来エピトープを認識し
て活性化される(例えば、最初は、単核細胞)。修飾した自己タンパク質上で自己
エピトープを認識し得るポリクローナルB-リンパ球(APCでもある)も抗原を内向
し、その後、その外来T-細胞エピトープを提示し、活性化T-リンパ球が、その後
、これらの自己反応性ポリクローナルB-リンパ球にサイトカインの助力を提供す
る。これらのポリクローナルB-リンパ球によって生じる抗体は、天然ポリペプチ
ドにも存在するエピトープを含む修飾ポリペプチド上での種々のエピトープと反
応性であるので、非修飾自己タンパク質と交差反応性の抗体が誘導される。結論
として、T-リンパ球は、ポリクローナルB-リンパ球の群が完全な外来抗原を認識
するかのような作用をもたらすことができるが、実際には、挿入されたエピトー
プが宿主に外来であるにすぎない。このようにして、非修飾自己抗原と交差反応
し得る抗体が誘導される。
理学的に存在することが示されている(Dalum Iら, 1996, J. Immunol. 157: 479
6-4804)。しかし、これらのB-リンパ球が関連性ある自己タンパク質と実際に反
応性の抗体を産生するよう誘導するには、T-ヘルパーリンパ球(TH-細胞又はTH-
リンパ球)を産生するサイトカインからの補助が必要である。通常、この助力は
、T-リンパ球が一般的に抗原提示細胞(APC)によって提示される際に自己タンパ
ク質由来のT-細胞エピトープを認識しないため、提供されない。しかし、自己タ
ンパク質に「外来性」要素を提供する(つまり、免疫学的に著しい修飾を導入す
る)ことによって、外来要素を認識するT-細胞はAPC上の外来エピトープを認識し
て活性化される(例えば、最初は、単核細胞)。修飾した自己タンパク質上で自己
エピトープを認識し得るポリクローナルB-リンパ球(APCでもある)も抗原を内向
し、その後、その外来T-細胞エピトープを提示し、活性化T-リンパ球が、その後
、これらの自己反応性ポリクローナルB-リンパ球にサイトカインの助力を提供す
る。これらのポリクローナルB-リンパ球によって生じる抗体は、天然ポリペプチ
ドにも存在するエピトープを含む修飾ポリペプチド上での種々のエピトープと反
応性であるので、非修飾自己タンパク質と交差反応性の抗体が誘導される。結論
として、T-リンパ球は、ポリクローナルB-リンパ球の群が完全な外来抗原を認識
するかのような作用をもたらすことができるが、実際には、挿入されたエピトー
プが宿主に外来であるにすぎない。このようにして、非修飾自己抗原と交差反応
し得る抗体が誘導される。
【００２５】 自己耐性を破壊するためにペプチド自己抗原を修飾する幾つかの方法が、当該
分野で知られている。したがって、この発明によれば、修飾は、 - 少なくともひとつの外来T-細胞エピトープを導入し、及び/又は - 少なくともひとつの第一分子を導入し、それにより抗原提示細胞(APC)に修飾
分子の標的化をもたらし、及び/又は - 少なくともひとつの第二分子を導入し、それにより免疫系を刺激し、及び/又
は - 少なくともひとつの第三分子を導入し、それにより免疫系への修飾OPGLポリ
ペプチドの提示を最適化する ことを含み得る。 しかし、これら全ての修飾は、OPGLで最初のB-リンパ球エピトープの実質的フ
ラクションを維持しているあいだに行うべきである。なぜなら、天然分子のB-リ
ンパ球認識はそれによって増強されるためである。
分野で知られている。したがって、この発明によれば、修飾は、 - 少なくともひとつの外来T-細胞エピトープを導入し、及び/又は - 少なくともひとつの第一分子を導入し、それにより抗原提示細胞(APC)に修飾
分子の標的化をもたらし、及び/又は - 少なくともひとつの第二分子を導入し、それにより免疫系を刺激し、及び/又
は - 少なくともひとつの第三分子を導入し、それにより免疫系への修飾OPGLポリ
ペプチドの提示を最適化する ことを含み得る。 しかし、これら全ての修飾は、OPGLで最初のB-リンパ球エピトープの実質的フ
ラクションを維持しているあいだに行うべきである。なぜなら、天然分子のB-リ
ンパ球認識はそれによって増強されるためである。
【００２６】 ひとつの好ましい具体例において、側基(side group)(外来T-細胞エピトープ
又は上記の第一、第二及び第三分子の形態)は、共有的又は非共有的に導入され
る。これは、OPGL由来のアミノ酸残基のストレッチが、一次アミノ酸配列を変え
ずに、又は少なくとも鎖中の個々のアミノ酸間のペプチド結合に変更を導入せず
に誘導されることを意味する。 代替的かつ好ましい具体例は、アミノ酸の置換及び/又は欠失及び/又は挿入及
び/又は付加を利用する(これらは組換え手段又はペプチド合成によって行われて
もよい;長いアミノ酸のストレッチに関与する修飾は融合ポリペプチドを生じ得
る)。この具体例のひとつの特に好ましい変形はWO 95/05849号に記載される技術
であり、これは、それぞれが外来の免疫優勢T-細胞エピトープを含む相当する数
のアミノ酸配列で幾つかのアミノ酸配列を置換している自己タンパク質の類似体
で免疫化する一方、同時に自己タンパク質の全体的な三次構造を類似体で維持す
ることによる自己タンパク質のダウン-レギュレート法を開示している。しかし
、この発明の目的のためには、修飾(挿入、付加、欠失又は置換)が外来T-細胞エ
ピトープを生じ、同時に実質的な数のB-細胞エピトープをOPGLに保持すれば、十
分である。しかしながら、誘導される免疫応答効率を最大限にするには、OPGLの
全体的な三次構造は修飾分子に維持することが好ましい。
又は上記の第一、第二及び第三分子の形態)は、共有的又は非共有的に導入され
る。これは、OPGL由来のアミノ酸残基のストレッチが、一次アミノ酸配列を変え
ずに、又は少なくとも鎖中の個々のアミノ酸間のペプチド結合に変更を導入せず
に誘導されることを意味する。 代替的かつ好ましい具体例は、アミノ酸の置換及び/又は欠失及び/又は挿入及
び/又は付加を利用する(これらは組換え手段又はペプチド合成によって行われて
もよい;長いアミノ酸のストレッチに関与する修飾は融合ポリペプチドを生じ得
る)。この具体例のひとつの特に好ましい変形はWO 95/05849号に記載される技術
であり、これは、それぞれが外来の免疫優勢T-細胞エピトープを含む相当する数
のアミノ酸配列で幾つかのアミノ酸配列を置換している自己タンパク質の類似体
で免疫化する一方、同時に自己タンパク質の全体的な三次構造を類似体で維持す
ることによる自己タンパク質のダウン-レギュレート法を開示している。しかし
、この発明の目的のためには、修飾(挿入、付加、欠失又は置換)が外来T-細胞エ
ピトープを生じ、同時に実質的な数のB-細胞エピトープをOPGLに保持すれば、十
分である。しかしながら、誘導される免疫応答効率を最大限にするには、OPGLの
全体的な三次構造は修飾分子に維持することが好ましい。
【００２７】 以下の式は、この発明によって一般的に包含されるOPGL構築物を記載している
： (MOD1)s1(OPGLe1)n1(MOD2)s2(OPGLe2)n2....(MODx)sx(OPGLex)nx
(I) [式中、OPGLe1-OPGLex は、独立して同一又は非同一であり、かつ外来の側基を
含有するかもしくは含有しない OPGLのサブ配列を含有するx B-細胞エピトープ
であり、xは3以上の整数であり、n1-nxは0以上のx整数(少なくとも1以上)であり
、MOD1-MODxは保持されているB-細胞エピトープ間に導入されるx修飾であり、か
つs1-sxは0以上のx整数である(側基がOPGLe 配列に導入されない場合には、少な
くとも1以上である)]。したがって、構築物の免疫原性に一般的な機能的抑制が
なされているので、この発明は、最初のOPGL配列に関する全ての種類の置換及び
それにおける全ての種類の修飾を可能にする。したがって、この発明には、例え
ば生体内で副作用を生じるOPGL配列の部分を省くか、又は通常は細胞内の部分、
つまり望ましくない免疫学的反応を生じる部分を省いて得られる修飾OPGLが含ま
れる。
： (MOD1)s1(OPGLe1)n1(MOD2)s2(OPGLe2)n2....(MODx)sx(OPGLex)nx
(I) [式中、OPGLe1-OPGLex は、独立して同一又は非同一であり、かつ外来の側基を
含有するかもしくは含有しない OPGLのサブ配列を含有するx B-細胞エピトープ
であり、xは3以上の整数であり、n1-nxは0以上のx整数(少なくとも1以上)であり
、MOD1-MODxは保持されているB-細胞エピトープ間に導入されるx修飾であり、か
つs1-sxは0以上のx整数である(側基がOPGLe 配列に導入されない場合には、少な
くとも1以上である)]。したがって、構築物の免疫原性に一般的な機能的抑制が
なされているので、この発明は、最初のOPGL配列に関する全ての種類の置換及び
それにおける全ての種類の修飾を可能にする。したがって、この発明には、例え
ば生体内で副作用を生じるOPGL配列の部分を省くか、又は通常は細胞内の部分、
つまり望ましくない免疫学的反応を生じる部分を省いて得られる修飾OPGLが含ま
れる。
【００２８】 ここに記載されるように、B-細胞エピトープの実質的フラクション又は修飾に
付されるタンパク質の全体的な三次構造までもの維持は、幾つかの方法でなしう
る。ひとつは、OPGLに対して指向されるポリクローナル抗血清(例えば、ウサギ
でつくられる抗血清)を単に製造し、その後、生じる修飾タンパク質に試験剤(例
えば競合ELISAにおける)としてこの抗血清を用いることである。OPGLのように抗
血清と同程度に反応する修飾型(類似体)は、OPGLと同じ全体的な三次構造を有す
るものとみなさなければならないが、このような抗血清と限られた(しかし依然
として著しくかつ特異的な)反応性を示す類似体は、最初のB-細胞エピトープの
実質的フラクションを維持するものとみなされる。 また、OPGL上の種々のエピトープと反応性のモノクローナル抗体の選択を準備
し、試験パネルとして用いることができる。この試みは、1) OPGLのエピトープ
マッピング、及び2) つくられる類似体で維持されるエピトープのマッピングを
可能にする利点がある。
付されるタンパク質の全体的な三次構造までもの維持は、幾つかの方法でなしう
る。ひとつは、OPGLに対して指向されるポリクローナル抗血清(例えば、ウサギ
でつくられる抗血清)を単に製造し、その後、生じる修飾タンパク質に試験剤(例
えば競合ELISAにおける)としてこの抗血清を用いることである。OPGLのように抗
血清と同程度に反応する修飾型(類似体)は、OPGLと同じ全体的な三次構造を有す
るものとみなさなければならないが、このような抗血清と限られた(しかし依然
として著しくかつ特異的な)反応性を示す類似体は、最初のB-細胞エピトープの
実質的フラクションを維持するものとみなされる。 また、OPGL上の種々のエピトープと反応性のモノクローナル抗体の選択を準備
し、試験パネルとして用いることができる。この試みは、1) OPGLのエピトープ
マッピング、及び2) つくられる類似体で維持されるエピトープのマッピングを
可能にする利点がある。
【００２９】 当然に、第三の試みは、OPGL又は生物学的に活性なその端を切り取った型(上
記参照)の三次元構造を解析し、これを製造した類似体の解析した三次元構造と
比較することである。三次元構造は、X-線回折研究及びNMR-分光計によって解析
できる。三次元構造に関する別の情報は、円二色性研究からある程度得ることが
できる。この研究は、単に純粋型のポリペプチドを要するという利点を有し(こ
れに対し、X-線回折は結晶化ポリペプチドの供給を要し、NMRは同位体変異体ポ
リペプチドの供給を要する)、所定の分子の三次構造に有用な情報を提供する。
しかし、結局、X-線回折及び/又はNMRは、円二色性研究が二次構造の要素情報を
介して正確な三次元構造を間接的に立証しているにすぎないため、決定的データ
を得るのに必要である。 この発明のひとつの好ましい具体例は、OPGLのB-リンパ球エピトープの多重提
示(つまり、少なくともひとつのB-細胞エピトープが2つの位置で存在する式I)を
利用する。これは、種々の方法、例えば構造(OPGL)m [式中、mは2以上の整数]か
らなる融合ポリペプチドを単に製造し、次いでここに論じる修飾を少なくともひ
とつのOPGL配列に導入して達成される。導入された修飾は、B-リンパ球エピトー
プの少なくともひとつの複製及び/又はハプテンの導入を含むことが好ましい。
記参照)の三次元構造を解析し、これを製造した類似体の解析した三次元構造と
比較することである。三次元構造は、X-線回折研究及びNMR-分光計によって解析
できる。三次元構造に関する別の情報は、円二色性研究からある程度得ることが
できる。この研究は、単に純粋型のポリペプチドを要するという利点を有し(こ
れに対し、X-線回折は結晶化ポリペプチドの供給を要し、NMRは同位体変異体ポ
リペプチドの供給を要する)、所定の分子の三次構造に有用な情報を提供する。
しかし、結局、X-線回折及び/又はNMRは、円二色性研究が二次構造の要素情報を
介して正確な三次元構造を間接的に立証しているにすぎないため、決定的データ
を得るのに必要である。 この発明のひとつの好ましい具体例は、OPGLのB-リンパ球エピトープの多重提
示(つまり、少なくともひとつのB-細胞エピトープが2つの位置で存在する式I)を
利用する。これは、種々の方法、例えば構造(OPGL)m [式中、mは2以上の整数]か
らなる融合ポリペプチドを単に製造し、次いでここに論じる修飾を少なくともひ
とつのOPGL配列に導入して達成される。導入された修飾は、B-リンパ球エピトー
プの少なくともひとつの複製及び/又はハプテンの導入を含むことが好ましい。
【００３０】 上記のように、外来T-細胞エピトープの導入は、少なくともひとつのアミノ酸
の挿入、付加、欠失又は置換の導入によって達成される。当然に、正常な状況は
、アミノ酸配列での1以上の変更の導入(例えば完全なT-細胞エピトープの挿入又
はそれによる置換)であるが、達成するのに重要な目的は、抗原提示細胞(APC)で
処理される際に、OPGL類似体が、APC表面にクラスII MHC分子の関係で提示され
る外来の免疫優勢T-細胞エピトープを生じることである。つまり、OPGLアミノ酸
配列が適当な位置で外来THエピトープにも見られるアミノ酸残基を幾つか含んで
いる場合には、外来THエピトープの導入は、アミノ酸の挿入、付加、欠失及び置
換で外来エピトープの残りのアミノ酸を供給することによって達成される。言い
換えれば、この発明の目的を満足するために、挿入又は置換によって完全なTHエ
ピトープを導入する必要はない。
の挿入、付加、欠失又は置換の導入によって達成される。当然に、正常な状況は
、アミノ酸配列での1以上の変更の導入(例えば完全なT-細胞エピトープの挿入又
はそれによる置換)であるが、達成するのに重要な目的は、抗原提示細胞(APC)で
処理される際に、OPGL類似体が、APC表面にクラスII MHC分子の関係で提示され
る外来の免疫優勢T-細胞エピトープを生じることである。つまり、OPGLアミノ酸
配列が適当な位置で外来THエピトープにも見られるアミノ酸残基を幾つか含んで
いる場合には、外来THエピトープの導入は、アミノ酸の挿入、付加、欠失及び置
換で外来エピトープの残りのアミノ酸を供給することによって達成される。言い
換えれば、この発明の目的を満足するために、挿入又は置換によって完全なTHエ
ピトープを導入する必要はない。
【００３１】 アミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加の数は、少なくとも2、例えば3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20及び25の挿入、置換
、付加又は欠失であることが好ましい。さらに、アミノ酸の挿入、置換、付加又
は欠失の数は150を上回らないことが好ましく、例えば多くても100、多くても90
、多くても80、ならびに多くても70である。特に、置換、挿入、欠失又は付加の
数は60を上回らないことが好ましく、とりわけこの数は50、又は40をも上回るべ
きではない。30以下の数が、最も好ましい。アミノ酸の付加に関しては、得られ
る構築物が融合ポリペプチドの形態である場合は、しばしば150よりも相当高い
数になることに留意されたい。 本発明の好ましい具体例は、少なくともひとつの外来の免疫優勢T-細胞エピト
ープを導入することによる修飾を包含する。T-細胞エピトープの免疫優勢の問題
は、当該の動物種に依存することは理解されるだろう。ここで使用する限り、「
免疫優勢」という語は単に、ワクチン注射した個体/個体群において顕著な免疫
応答を生じさせるエピトープを言及する。しかしながら、一個体/一個体群で免
疫優勢であるT-細胞エピトープが、たとえ同種の他の個体でMHC-II分子に結合す
ることができたとしても、必ずしもその他の個体で免疫優勢であるとは限らない
ことは周知の事実である。したがって、本発明の目的において、免疫優勢T-細胞
エピトープは、抗原中に存在する際にT-細胞を助けるのに効果的なT-細胞エピト
ープである。一般的に、免疫優勢T-細胞エピトープは、それらが見られるポリペ
プチドに関係なく、MHCクラスII分子に結合した状態で実質的に常時提示される
という固有の特徴を有する。
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20及び25の挿入、置換
、付加又は欠失であることが好ましい。さらに、アミノ酸の挿入、置換、付加又
は欠失の数は150を上回らないことが好ましく、例えば多くても100、多くても90
、多くても80、ならびに多くても70である。特に、置換、挿入、欠失又は付加の
数は60を上回らないことが好ましく、とりわけこの数は50、又は40をも上回るべ
きではない。30以下の数が、最も好ましい。アミノ酸の付加に関しては、得られ
る構築物が融合ポリペプチドの形態である場合は、しばしば150よりも相当高い
数になることに留意されたい。 本発明の好ましい具体例は、少なくともひとつの外来の免疫優勢T-細胞エピト
ープを導入することによる修飾を包含する。T-細胞エピトープの免疫優勢の問題
は、当該の動物種に依存することは理解されるだろう。ここで使用する限り、「
免疫優勢」という語は単に、ワクチン注射した個体/個体群において顕著な免疫
応答を生じさせるエピトープを言及する。しかしながら、一個体/一個体群で免
疫優勢であるT-細胞エピトープが、たとえ同種の他の個体でMHC-II分子に結合す
ることができたとしても、必ずしもその他の個体で免疫優勢であるとは限らない
ことは周知の事実である。したがって、本発明の目的において、免疫優勢T-細胞
エピトープは、抗原中に存在する際にT-細胞を助けるのに効果的なT-細胞エピト
ープである。一般的に、免疫優勢T-細胞エピトープは、それらが見られるポリペ
プチドに関係なく、MHCクラスII分子に結合した状態で実質的に常時提示される
という固有の特徴を有する。
【００３２】 もう一つの重要な点は、T-細胞エピトープのMHC制限の問題である。一般に天
然に存在するT-細胞エピトープはMHC制限性であり、すなわち、T-細胞エピトー
プを構成するあるペプチドのみがMHCクラスII分子のサブセットに効果的に結合
する。これはその結果、多くの場合において、1個の特異的なT-細胞エピトープ
の使用が個体群のフラクションにのみ有効なワクチン成分を生じるという効果を
有する。また、フラクションのサイズ次第でより多くのT-細胞エピトープを同一
分子内に必然的に含めることができ、あるいは導入されたT-細胞エピトープの性
質によって互いに識別されるOPGL変異型が成分である多成分ワクチンを製造する
ことができる。 使用するT-細胞のMHC制限が全く未知である場合(例えばワクチン注射した動物
があまり確定されていないMHC組成を有している場合)、特異的なワクチン組成に
よってカバーされる個体群のフラクションは以下の式によって決定することがで
きる：
然に存在するT-細胞エピトープはMHC制限性であり、すなわち、T-細胞エピトー
プを構成するあるペプチドのみがMHCクラスII分子のサブセットに効果的に結合
する。これはその結果、多くの場合において、1個の特異的なT-細胞エピトープ
の使用が個体群のフラクションにのみ有効なワクチン成分を生じるという効果を
有する。また、フラクションのサイズ次第でより多くのT-細胞エピトープを同一
分子内に必然的に含めることができ、あるいは導入されたT-細胞エピトープの性
質によって互いに識別されるOPGL変異型が成分である多成分ワクチンを製造する
ことができる。 使用するT-細胞のMHC制限が全く未知である場合(例えばワクチン注射した動物
があまり確定されていないMHC組成を有している場合)、特異的なワクチン組成に
よってカバーされる個体群のフラクションは以下の式によって決定することがで
きる：
【数１】
【００３３】 [式中、piはワクチン組成中に存在するiの外来T-細胞エピトープに対して応答す
る個体群における頻度、及びnはワクチン組成中の外来T-細胞エピトープの総数
である]。このように、個体群において0.8、0.7及び0.6の応答頻度をそれぞれ有
する3個の外来T-細胞エピトープを含むワクチン組成は 1 - 0.2 × 0.3 × 0.4 = 0.976 となり、すなわち、個体群の97.6％がMHC-IIを介したワクチンへの応答を統計的
に高める。
る個体群における頻度、及びnはワクチン組成中の外来T-細胞エピトープの総数
である]。このように、個体群において0.8、0.7及び0.6の応答頻度をそれぞれ有
する3個の外来T-細胞エピトープを含むワクチン組成は 1 - 0.2 × 0.3 × 0.4 = 0.976 となり、すなわち、個体群の97.6％がMHC-IIを介したワクチンへの応答を統計的
に高める。
【００３４】 上記の式は、使用されるペプチドの多少とも明確なMHC制限パターンが知られ
ている場合には適用されない。例えば、あるペプチドのみがHLA-DRアレレDR1、D
R3、DR5及びDR7によってエンコードされるヒトMHC-II分子に結合する場合には、
このペプチドを、HLA-DRアレレによってエンコードされる残りのMHC-II分子に結
合する別のペプチドとともに使用することにより、当該個体群で100％の到達範
囲が達成される。同様に、第二のペプチドがDR3及びDR5のみに結合する場合には
、このペプチドの付加は到達範囲を全く増加させない。個体群応答の算出の基礎
を完全にワクチン中のT-細胞エピトープのMHC制限におく場合、特異的なワクチ
ン成分でカバーされる個体群のフラクションは以下の式によって決定される：
ている場合には適用されない。例えば、あるペプチドのみがHLA-DRアレレDR1、D
R3、DR5及びDR7によってエンコードされるヒトMHC-II分子に結合する場合には、
このペプチドを、HLA-DRアレレによってエンコードされる残りのMHC-II分子に結
合する別のペプチドとともに使用することにより、当該個体群で100％の到達範
囲が達成される。同様に、第二のペプチドがDR3及びDR5のみに結合する場合には
、このペプチドの付加は到達範囲を全く増加させない。個体群応答の算出の基礎
を完全にワクチン中のT-細胞エピトープのMHC制限におく場合、特異的なワクチ
ン成分でカバーされる個体群のフラクションは以下の式によって決定される：
【数２】
【００３５】 [式中、ψjはワクチン中のT-細胞エピトープのいずれか1個を結合し、かつjの3
つの公知のHLA座(DP、DR及びDQ)に属するMHC分子をエンコードするアレリックハ
プロタイプの個体群における頻度の合計である。実際には、どのMHC分子がワク
チン中の各T-細胞エピトープを認識するかをまず測定し、その後、これらを型(D
P、DR及びDQ)によってリストする。次いで、リストした種々のアレリックハプロ
タイプの個々の頻度を型ごとに合計し、ψ1、ψ2及びψ3を得る]。 式IIの値piは対応する理論値πiを超えることがあるかもしれない。
つの公知のHLA座(DP、DR及びDQ)に属するMHC分子をエンコードするアレリックハ
プロタイプの個体群における頻度の合計である。実際には、どのMHC分子がワク
チン中の各T-細胞エピトープを認識するかをまず測定し、その後、これらを型(D
P、DR及びDQ)によってリストする。次いで、リストした種々のアレリックハプロ
タイプの個々の頻度を型ごとに合計し、ψ1、ψ2及びψ3を得る]。 式IIの値piは対応する理論値πiを超えることがあるかもしれない。
【数３】
【００３６】 [式中、νjは ワクチン中のiのT-細胞エピトープを結合し、かつjの3つの公知の
HLA座(DP、DR及びDQ)に属するMHC分子をエンコードするアレリックハプロタイプ
の個体群における頻度の合計である。これは、1-πiの個体群では、応答頻度はf
誤差(residual)_i = (pi-πi)/(1-πi)となることを意味する。したがって、式I
IIを調整して式Vとすることができる:
HLA座(DP、DR及びDQ)に属するMHC分子をエンコードするアレリックハプロタイプ
の個体群における頻度の合計である。これは、1-πiの個体群では、応答頻度はf
誤差(residual)_i = (pi-πi)/(1-πi)となることを意味する。したがって、式I
IIを調整して式Vとすることができる:
【数４】
【００３７】 [式中、用語1−f誤差_iは、負のときは0に設定される]。全てのエピトープが同
一セットのハプロタイプにハプロタイプマップ(haplotype mapped)されているこ
とを式Vが要求することに留意されたい。 したがって、OPGL類似体に導入されるT-細胞エピトープを選択するときは、エ
ピトープに関する利用可能な全ての知識: 1)個体群における各エピトープへの応
答頻度、2)MHC制限データ及び3)関連するハプロタイプ個体群における頻度、を
含めることが重要である。 動物種の個体又は動物個体群の大部分において活性な、天然に存在する「乱交
雑」T-細胞エピトープが多量に存在する。これらは好ましくはワクチンに導入さ
れ、それによって同一ワクチンにおける極めて多量の異なるOPGL類似体の必要性
を低減する。
一セットのハプロタイプにハプロタイプマップ(haplotype mapped)されているこ
とを式Vが要求することに留意されたい。 したがって、OPGL類似体に導入されるT-細胞エピトープを選択するときは、エ
ピトープに関する利用可能な全ての知識: 1)個体群における各エピトープへの応
答頻度、2)MHC制限データ及び3)関連するハプロタイプ個体群における頻度、を
含めることが重要である。 動物種の個体又は動物個体群の大部分において活性な、天然に存在する「乱交
雑」T-細胞エピトープが多量に存在する。これらは好ましくはワクチンに導入さ
れ、それによって同一ワクチンにおける極めて多量の異なるOPGL類似体の必要性
を低減する。
【００３８】 本発明によれば、乱交雑エピトープは、破傷風トキソイド(例えばP2及びP30エ
ピトープ)、ジフテリアトキソイド、インフルエンザウイルス血球凝集素(hemagl
uttinin)(HA)及びピー・ファルシパルム(P. falciparum) CS抗原由来エピトープ
のような天然に存在するヒトT-細胞エピトープであってもよい。 長年にわたり、その他の乱交雑T-細胞エピトープが多数同定されている。特に
、異なるHLA-DRアレレによってエンコードされるHLA-DR分子の大部分に結合しう
るペプチドが同定されており、これらは全て本発明にしたがって使用されるOPGL
類似体に導入される可能性のあるT-細胞エピトープである。すべてここに引用し
て組み込まれる以下の文献に記載されるエピトープも参照のこと: WO 98/23635
号 (Frazer IH ら、The University of Queenslandに譲受); Southwood S ら、1
998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F ら、1988, Nature 336: 778-
780; Chicz RM ら、1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J ら、1993, Cell
74: 197-203; 及び Falk K ら、1994, Immunogenetics 39: 230-242。最後の文
献はHLA-DQリガンド及びHLA-DPリガンドについても論じている。これら5文献に
挙げられるエピトープは全て本発明で使用される天然のエピトープと共通のモチ
ーフを共有するため、その候補として適切である。
ピトープ)、ジフテリアトキソイド、インフルエンザウイルス血球凝集素(hemagl
uttinin)(HA)及びピー・ファルシパルム(P. falciparum) CS抗原由来エピトープ
のような天然に存在するヒトT-細胞エピトープであってもよい。 長年にわたり、その他の乱交雑T-細胞エピトープが多数同定されている。特に
、異なるHLA-DRアレレによってエンコードされるHLA-DR分子の大部分に結合しう
るペプチドが同定されており、これらは全て本発明にしたがって使用されるOPGL
類似体に導入される可能性のあるT-細胞エピトープである。すべてここに引用し
て組み込まれる以下の文献に記載されるエピトープも参照のこと: WO 98/23635
号 (Frazer IH ら、The University of Queenslandに譲受); Southwood S ら、1
998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F ら、1988, Nature 336: 778-
780; Chicz RM ら、1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J ら、1993, Cell
74: 197-203; 及び Falk K ら、1994, Immunogenetics 39: 230-242。最後の文
献はHLA-DQリガンド及びHLA-DPリガンドについても論じている。これら5文献に
挙げられるエピトープは全て本発明で使用される天然のエピトープと共通のモチ
ーフを共有するため、その候補として適切である。
【００３９】 あるいは、エピトープは、MHCクラスII分子の大部分を結合しうるいずれかの
人為的なT-細胞エピトープであってもよい。この明細書においては、WO 95/0770
7号及び対応する論文Alexander J ら、1994, Immunity 1: 751-761 (両者ともこ
こに引用して組み込む)に記載のpan DR エピトープペプチド("PADRE")が、本発
明にしたがって使用されるエピトープの候補として興味深い。これらの論文に開
示される最も有効なPADREペプチドは、投与時の安定性を改善するためにC-末端
及びN-末端にD-アミノ酸を担持することに留意されたい。しかしながら、本発明
は第一に、適切なエピトープを修飾OPGLの一部として組み込むことを目的とする
。これはその後、APCのリソソーム分画内で酵素的に破壊し、続いてMHC-II分子
に関連して提示を行う。したがって、本発明において使用されるエピトープにD-
アミノ酸を組み込むことは得策ではない。 特に好ましいPADREペプチドのひとつは、アミノ酸配列AKFVAAWTLKAAA又は免疫
学的に有効なそのサブ配列を有するペプチドである。これと、同じMHC制限を欠
いている他のエピトープが、本発明の方法で使用されるOPGL類似体で提示すべき
好ましいT-細胞エピトープである。このような超-乱交雑エピトープは、ワクチ
ン注射した動物の免疫系に単一の修飾OPGLのみを提示する、本発明の最も簡単な
具体例を可能にする。
人為的なT-細胞エピトープであってもよい。この明細書においては、WO 95/0770
7号及び対応する論文Alexander J ら、1994, Immunity 1: 751-761 (両者ともこ
こに引用して組み込む)に記載のpan DR エピトープペプチド("PADRE")が、本発
明にしたがって使用されるエピトープの候補として興味深い。これらの論文に開
示される最も有効なPADREペプチドは、投与時の安定性を改善するためにC-末端
及びN-末端にD-アミノ酸を担持することに留意されたい。しかしながら、本発明
は第一に、適切なエピトープを修飾OPGLの一部として組み込むことを目的とする
。これはその後、APCのリソソーム分画内で酵素的に破壊し、続いてMHC-II分子
に関連して提示を行う。したがって、本発明において使用されるエピトープにD-
アミノ酸を組み込むことは得策ではない。 特に好ましいPADREペプチドのひとつは、アミノ酸配列AKFVAAWTLKAAA又は免疫
学的に有効なそのサブ配列を有するペプチドである。これと、同じMHC制限を欠
いている他のエピトープが、本発明の方法で使用されるOPGL類似体で提示すべき
好ましいT-細胞エピトープである。このような超-乱交雑エピトープは、ワクチ
ン注射した動物の免疫系に単一の修飾OPGLのみを提示する、本発明の最も簡単な
具体例を可能にする。
【００４０】 上記のように、OPGLの修飾は、修飾OPGLをAPC又はB-リンパ球に標的化する第
一分子の導入を含んでいてもよい。例えば、第一分子は、B-リンパ球の特異的な
表面抗原又はAPC特異的な表面抗原に特異的な結合パートナーであってもよい。
そのような特異的な表面抗原の多くは、当該分野において公知である。例えば、
分子は、B-リンパ球又はAPCへの受容体がある炭水化物であってもよい(例えばマ
ンナン又はマンノース)。あるいは、第二分子はハプテンであってもよい。APC又
はリンパ球の表面分子を特異的に認識する抗体フラグメントも、第一分子として
使用することができる(表面分子は例えば、FCγRIのようなマクロファージ及び
単球のFCγ受容体、あるいはCD40又はCTLA-4等のいずれかの他の特異的な表面マ
ーカーであってもよい)。これら全ての代表的な標的化分子はアジュバントの一
部としても使用できることに留意されたい(以下を参照のこと)。 免疫応答を増強するために修飾OPGLポリペプチドをある細胞型に標的化するこ
との代案又は補足として、免疫系を刺激する上記の第二分子を含むことによって
免疫系の反応性レベルを増強することができる。このような第二分子の一般的な
例としては、サイトカイン及び熱ショックタンパク質又は分子シャペロンならび
にそれらの有効な部分がある。
一分子の導入を含んでいてもよい。例えば、第一分子は、B-リンパ球の特異的な
表面抗原又はAPC特異的な表面抗原に特異的な結合パートナーであってもよい。
そのような特異的な表面抗原の多くは、当該分野において公知である。例えば、
分子は、B-リンパ球又はAPCへの受容体がある炭水化物であってもよい(例えばマ
ンナン又はマンノース)。あるいは、第二分子はハプテンであってもよい。APC又
はリンパ球の表面分子を特異的に認識する抗体フラグメントも、第一分子として
使用することができる(表面分子は例えば、FCγRIのようなマクロファージ及び
単球のFCγ受容体、あるいはCD40又はCTLA-4等のいずれかの他の特異的な表面マ
ーカーであってもよい)。これら全ての代表的な標的化分子はアジュバントの一
部としても使用できることに留意されたい(以下を参照のこと)。 免疫応答を増強するために修飾OPGLポリペプチドをある細胞型に標的化するこ
との代案又は補足として、免疫系を刺激する上記の第二分子を含むことによって
免疫系の反応性レベルを増強することができる。このような第二分子の一般的な
例としては、サイトカイン及び熱ショックタンパク質又は分子シャペロンならび
にそれらの有効な部分がある。
【００４１】 本発明にしたがって使用される適切なサイトカインは、通常ワクチン組成物に
おいてアジュバントとしても機能するもの、例えばインターフェロンγ(IFN-γ)
、インターロイキン1(IL-1)、インターロイキン2(IL-2)、インターロイキン4(IL
-4)、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン12(IL-12)、インターロイキ
ン13(IL-13)、インターロイキン15(IL-15)及び顆粒球-マクロファージコロニー
刺激因子(GM-CSF)である;あるいはサイトカイン分子の機能的部分が第二分子と
して十分である。このようなサイトカインのアジュバント物質としての使用に関
しては、下記の記載を参照のこと。 本発明によれば、第二分子として使用される適当な熱ショックタンパク質又は
分子シャペロンは、HSP70、HSP90、HSC70、GRP94(gp96としても知られている、W
earsch PA ら. 1998, Biochemistry 37: 5709-19参照)ならびにCRT(カルレチク
リン(calreticulin))であってもよい。 あるいは、第二分子はリステリオリシン(listeriolycin)(LLO)、脂質A及び非
耐熱性エンテロトキシンのような毒素であってもよい。また、MDP(ムラミルジペ
プチド)、CFA(完全フロイントアジュバント)及びトレハロースジエステルTDM及
びTDEなどの多数のマイコバクテリア誘導体が、興味深い可能性のあるものであ
る。
おいてアジュバントとしても機能するもの、例えばインターフェロンγ(IFN-γ)
、インターロイキン1(IL-1)、インターロイキン2(IL-2)、インターロイキン4(IL
-4)、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン12(IL-12)、インターロイキ
ン13(IL-13)、インターロイキン15(IL-15)及び顆粒球-マクロファージコロニー
刺激因子(GM-CSF)である;あるいはサイトカイン分子の機能的部分が第二分子と
して十分である。このようなサイトカインのアジュバント物質としての使用に関
しては、下記の記載を参照のこと。 本発明によれば、第二分子として使用される適当な熱ショックタンパク質又は
分子シャペロンは、HSP70、HSP90、HSC70、GRP94(gp96としても知られている、W
earsch PA ら. 1998, Biochemistry 37: 5709-19参照)ならびにCRT(カルレチク
リン(calreticulin))であってもよい。 あるいは、第二分子はリステリオリシン(listeriolycin)(LLO)、脂質A及び非
耐熱性エンテロトキシンのような毒素であってもよい。また、MDP(ムラミルジペ
プチド)、CFA(完全フロイントアジュバント)及びトレハロースジエステルTDM及
びTDEなどの多数のマイコバクテリア誘導体が、興味深い可能性のあるものであ
る。
【００４２】 免疫系への修飾OPGLの提示を高める第三分子を導入することの可能性もまた、
本発明の重要な具体例である。この原理の幾つかの例が、当該分野において示さ
れている。例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)タンパ
ク質OspAのパルミトイル脂質化アンカーを利用して、自己アジュバント化ポリペ
プチドを提供できることが知られている(例えばWO 96/40718号参照)。脂質化し
たタンパク質は、ポリペプチドの脂質化アンカー部分とそこから突出する残りの
分子部分からなる核を有するミセル状構造を形成し、その結果、抗原決定基を多
数提示するものと考えられる。したがって、これの使用及び異なる脂質化アンカ
ー(例えばミリスチル基、ミリスチル基、ファルネシル基、ゲラニル-ゲラニル基
、GPIアンカー及びN-アシルジグリセライド基)を用いた関連研究は、特に組換え
て製造したタンパク質内の脂質化アンカーの供給がかなり簡単で、例えば天然に
存在するシグナル配列を修飾OPGLポリペプチドの融合パートナーとして使用する
ことのみを要するため、本発明の好ましい具体例である。もう一つの可能性とし
て、相補因子C3又はC3自体のC3dフラグメントの使用が挙げられる(Dempsey ら、
1996, Science 271, 348-350 及び Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology
16, 458-462参照)。
本発明の重要な具体例である。この原理の幾つかの例が、当該分野において示さ
れている。例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)タンパ
ク質OspAのパルミトイル脂質化アンカーを利用して、自己アジュバント化ポリペ
プチドを提供できることが知られている(例えばWO 96/40718号参照)。脂質化し
たタンパク質は、ポリペプチドの脂質化アンカー部分とそこから突出する残りの
分子部分からなる核を有するミセル状構造を形成し、その結果、抗原決定基を多
数提示するものと考えられる。したがって、これの使用及び異なる脂質化アンカ
ー(例えばミリスチル基、ミリスチル基、ファルネシル基、ゲラニル-ゲラニル基
、GPIアンカー及びN-アシルジグリセライド基)を用いた関連研究は、特に組換え
て製造したタンパク質内の脂質化アンカーの供給がかなり簡単で、例えば天然に
存在するシグナル配列を修飾OPGLポリペプチドの融合パートナーとして使用する
ことのみを要するため、本発明の好ましい具体例である。もう一つの可能性とし
て、相補因子C3又はC3自体のC3dフラグメントの使用が挙げられる(Dempsey ら、
1996, Science 271, 348-350 及び Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology
16, 458-462参照)。
【００４３】 OPGLの重要なエピトープ領域の複数(例えば少なくとも2)のコピーの好ましい
提示を免疫系に行う本発明のさらに別の具体例は、OPGL、サブ配列又はその変異
型のある分子への共有結合である。例えば、デキストランのような炭水化物など
のポリマーが使用可能である(例えばLees A ら、1994, Vaccine 12: 1160 -1166
; Lees A ら、 1990, J Immunol. 145: 3594-3600参照)が、マンノース及びマン
ナンも有用な代替手段である。例えば大腸菌及び他の細菌由来の膜内在性タンパ
ク質も、有用な接合パートナーである。キーホールリンペットヘモシニアン(KLH
)、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及びウシ血清アルブミン(BSA)など
の従来の担体分子も、好ましく有用な接合パートナーである。 天然OPGLのある領域は、修飾を行うのに最も適しているようである。TNF-αと
腫瘍壊死因子群の他のメンバーに対するOPGLの構造的関係から、位置170-192、1
98-218、221-246、256-261又は285-316(SEQ ID No: 4、6及び12のアミノ酸番号)
によって画定される領域でのT-細胞エピトープの導入又は他の修飾が、所望の結
果を生じる見込みが最もあるということが予測される。これらの位置はマウスOP
GLを言及するものであり、ヒト分子における対応位置は171-193、199-219、222-
247、257-262、及び286-317 (SEQ ID NO: 2のアミノ酸番号)である。
提示を免疫系に行う本発明のさらに別の具体例は、OPGL、サブ配列又はその変異
型のある分子への共有結合である。例えば、デキストランのような炭水化物など
のポリマーが使用可能である(例えばLees A ら、1994, Vaccine 12: 1160 -1166
; Lees A ら、 1990, J Immunol. 145: 3594-3600参照)が、マンノース及びマン
ナンも有用な代替手段である。例えば大腸菌及び他の細菌由来の膜内在性タンパ
ク質も、有用な接合パートナーである。キーホールリンペットヘモシニアン(KLH
)、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及びウシ血清アルブミン(BSA)など
の従来の担体分子も、好ましく有用な接合パートナーである。 天然OPGLのある領域は、修飾を行うのに最も適しているようである。TNF-αと
腫瘍壊死因子群の他のメンバーに対するOPGLの構造的関係から、位置170-192、1
98-218、221-246、256-261又は285-316(SEQ ID No: 4、6及び12のアミノ酸番号)
によって画定される領域でのT-細胞エピトープの導入又は他の修飾が、所望の結
果を生じる見込みが最もあるということが予測される。これらの位置はマウスOP
GLを言及するものであり、ヒト分子における対応位置は171-193、199-219、222-
247、257-262、及び286-317 (SEQ ID NO: 2のアミノ酸番号)である。
【００４４】 これらの選択領域の基礎となる考察として、a)公知かつ予測されるB-細胞エピ
トープの保存、b) 三次構造の保存などがある。いずれにせよ、上記したように
、T-細胞エピトープの導入をすべてについて異なる位置で行った修飾OPGL分子群
をスクリーンすることはかなり容易である。 本発明の最も好ましい具体例にはヒトOPGLのダウンレギュレーションが含まれ
るため、上記に論じたOPGLポリペプチドがヒトOPGLポリペプチドであることが好
ましい。この具体例では、ヒトOPGLポリペプチドが、SEQ ID NO: 2(又はSEQ ID
NO: 2のCys-221がセリンと置換されたポリペプチド)中の少なくとも1個のアミノ
酸配列を、同等又は異なる長さであって外来のTHエピトープを含む少なくとも1
個のアミノ酸配列と置換することによって修飾されていることが好ましい。置換
されたアミノ酸残基は、SEQ ID NO: 2の257-262、289-303及び222-243残基から
選択される。このような構築物についての原理は、実施例において詳細に論ずる
。
トープの保存、b) 三次構造の保存などがある。いずれにせよ、上記したように
、T-細胞エピトープの導入をすべてについて異なる位置で行った修飾OPGL分子群
をスクリーンすることはかなり容易である。 本発明の最も好ましい具体例にはヒトOPGLのダウンレギュレーションが含まれ
るため、上記に論じたOPGLポリペプチドがヒトOPGLポリペプチドであることが好
ましい。この具体例では、ヒトOPGLポリペプチドが、SEQ ID NO: 2(又はSEQ ID
NO: 2のCys-221がセリンと置換されたポリペプチド)中の少なくとも1個のアミノ
酸配列を、同等又は異なる長さであって外来のTHエピトープを含む少なくとも1
個のアミノ酸配列と置換することによって修飾されていることが好ましい。置換
されたアミノ酸残基は、SEQ ID NO: 2の257-262、289-303及び222-243残基から
選択される。このような構築物についての原理は、実施例において詳細に論ずる
。
【００４５】OPGL及び修飾OPGLポリペプチド製剤 動物に投与することによってOPGLポリペプチド又は修飾OPGLポリペプチドを動
物の免疫系に提示する際、ポリペプチド製剤は、当該分野において一般に承認さ
れている原理に基づく。 ペプチド配列を有効成分として含有するワクチンの調製法は、ここに引用して
すべて組み込まれる米国特許第4,608,251号；第4,601,903号；第4,599,231号；
第4,599,230号；第4,596,792号及び4,578,770号に例示されるように、一般に当
該分野においてよく理解されている。一般に、このようなワクチンは液体溶液又
は懸濁液のいずれかのような注射剤；溶液又は懸濁液に入れるのに適した固体と
して調製してもよく、注射前の液体としても調製することができる。製剤は乳化
されていてもよい。有効な免疫原性成分は、しばしば医薬的に許容され、かつ有
効成分に和合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤は、例えば水、塩水、ブド
ウ糖、グリセロール、エタノール等及びそれらの組み合わせである。また、望ま
しい場合には、ワクチンはワクチンの有効性を高める補助物質、例えば湿潤剤又
は乳化剤、pH緩衝剤又はアジュバントを少量含んでいてもよい。アジュバントに
ついての下記の詳細な記述を参考のこと。
物の免疫系に提示する際、ポリペプチド製剤は、当該分野において一般に承認さ
れている原理に基づく。 ペプチド配列を有効成分として含有するワクチンの調製法は、ここに引用して
すべて組み込まれる米国特許第4,608,251号；第4,601,903号；第4,599,231号；
第4,599,230号；第4,596,792号及び4,578,770号に例示されるように、一般に当
該分野においてよく理解されている。一般に、このようなワクチンは液体溶液又
は懸濁液のいずれかのような注射剤；溶液又は懸濁液に入れるのに適した固体と
して調製してもよく、注射前の液体としても調製することができる。製剤は乳化
されていてもよい。有効な免疫原性成分は、しばしば医薬的に許容され、かつ有
効成分に和合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤は、例えば水、塩水、ブド
ウ糖、グリセロール、エタノール等及びそれらの組み合わせである。また、望ま
しい場合には、ワクチンはワクチンの有効性を高める補助物質、例えば湿潤剤又
は乳化剤、pH緩衝剤又はアジュバントを少量含んでいてもよい。アジュバントに
ついての下記の詳細な記述を参考のこと。
【００４６】 ワクチンは従来、例えば、表皮下、表皮内、真皮内、真皮下又は筋肉内のいず
れかの注射によって非経口的に投与される。他の投与方法に適した追加的な製剤
としては坐剤があり、時に経口、口腔内、舌下、腹腔内、鞘膜内、肛門、硬膜外
、脊髄及び頭蓋内製剤がある。坐剤は例えばポリアルカレングリコール又はトリ
グリセライドなどの従来の結合剤及び担体を含んでもよい。このような坐剤は有
効成分を0.5％〜10％の範囲で、好ましくは1-2％の範囲で含有する混合物から形
成してもよい。経口製剤は、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、
澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マ
グネシウム等の通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、
錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤又は粉剤の形状をとり、10-95％、好ま
しくは25-70％の有効成分を含有する。経口製剤については、コレラ毒素が興味
深い製剤パートナーである（可能性のある接合パートナーでもある）。 ポリペプチドは、中性又は塩の形態としてワクチンとして製剤化することがで
きる。医薬的に許容される塩としては、酸付加塩(ペプチドの遊離アミノ基で形
成される)及び塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マ
ンデル酸などの有機酸で形成される酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基で
形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は
水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン
、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘
導してもよい。
れかの注射によって非経口的に投与される。他の投与方法に適した追加的な製剤
としては坐剤があり、時に経口、口腔内、舌下、腹腔内、鞘膜内、肛門、硬膜外
、脊髄及び頭蓋内製剤がある。坐剤は例えばポリアルカレングリコール又はトリ
グリセライドなどの従来の結合剤及び担体を含んでもよい。このような坐剤は有
効成分を0.5％〜10％の範囲で、好ましくは1-2％の範囲で含有する混合物から形
成してもよい。経口製剤は、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、
澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マ
グネシウム等の通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、
錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤又は粉剤の形状をとり、10-95％、好ま
しくは25-70％の有効成分を含有する。経口製剤については、コレラ毒素が興味
深い製剤パートナーである（可能性のある接合パートナーでもある）。 ポリペプチドは、中性又は塩の形態としてワクチンとして製剤化することがで
きる。医薬的に許容される塩としては、酸付加塩(ペプチドの遊離アミノ基で形
成される)及び塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マ
ンデル酸などの有機酸で形成される酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基で
形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は
水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン
、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘
導してもよい。
【００４７】 ワクチンは、用量決定製剤に適した方法で、治療的に有効かつ免疫原性となる
ような量で投与される。投与量は、例えば免疫応答を高める個体の免疫系の能力
、及び所望の防御の程度を含めて、被治療者に依存する。適当な用量範囲は、1
回のワクチン接種あたりで有効成分が数百μgのオーダーであり、好ましい範囲
は(1-10 mg範囲でのより高い量を考慮しても)約0.1μg〜2,000μgであり、例え
ば約0.5μg〜1,000μg、好ましくは1μg〜500μg、特に約10μg〜100μgである
。初回投与のための適当な養生法及び追加注射も変えられるが、典型的には初回
投与の後に続けて接種するか、又はその他の投与が行われる。 投与の方法は広く異なっていてもよい。いずれの従来のワクチン投与法も適用
可能である。これらは、生理的に許容される固体の基剤での経口投与、又は注射
等による生理的に許容される分散剤の非経口的投与を含む。ワクチンの用量は投
与経路に依存し、ワクチン接種を受ける人の年齢と抗原の製剤に応じて変化する
。 ワクチンのポリペプチドにはワクチン内で十分に免疫原性のものもあるが、そ
の他の幾つかにおいては、ワクチンがアジュバント物質をさらに含む場合に免疫
応答が高められる。
ような量で投与される。投与量は、例えば免疫応答を高める個体の免疫系の能力
、及び所望の防御の程度を含めて、被治療者に依存する。適当な用量範囲は、1
回のワクチン接種あたりで有効成分が数百μgのオーダーであり、好ましい範囲
は(1-10 mg範囲でのより高い量を考慮しても)約0.1μg〜2,000μgであり、例え
ば約0.5μg〜1,000μg、好ましくは1μg〜500μg、特に約10μg〜100μgである
。初回投与のための適当な養生法及び追加注射も変えられるが、典型的には初回
投与の後に続けて接種するか、又はその他の投与が行われる。 投与の方法は広く異なっていてもよい。いずれの従来のワクチン投与法も適用
可能である。これらは、生理的に許容される固体の基剤での経口投与、又は注射
等による生理的に許容される分散剤の非経口的投与を含む。ワクチンの用量は投
与経路に依存し、ワクチン接種を受ける人の年齢と抗原の製剤に応じて変化する
。 ワクチンのポリペプチドにはワクチン内で十分に免疫原性のものもあるが、そ
の他の幾つかにおいては、ワクチンがアジュバント物質をさらに含む場合に免疫
応答が高められる。
【００４８】 ワクチンへのアジュバント効果を達成するための様々の方法が、公知である。
一般的な原理及び方法は、ともに引用してここに組み込まれる"The Theory and
Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (編
集), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6、また"Vaccines: New Gener
ationn Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G ら (編集), Plenum P
ress, New York, ISBN 0-306-45283-9に詳細に述べられている。 自己抗原に対する自己耐性の破壊を促進することが立証されているアジュバン
トを使用することが、特に好ましい。事実、これは非修飾OPGLが自己ワクチンで
有効成分として使用される場合に不可欠である。適当なアジュバントの非制限的
な例は、免疫標的化アジュバント；毒素、サイトカイン及びマイコバクテリア誘
導体などの免疫調節アジュバント；油製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント
；サポニン；免疫刺激複合マトリクス(ISCOMマトリクス)；粒子；DDA；アルミニ
ウムアジュバント；DNAアジュバント；γ-イヌリン；及び包膜アジュバントから
なる群より選択される。通常、類似体において第一、第二及び第三の分子として
有用な化合物及び剤に関する上記の開示は、本発明のワクチンのアジュバントに
おけるそれらの使用にも必要な変更を加えて引用する。
一般的な原理及び方法は、ともに引用してここに組み込まれる"The Theory and
Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (編
集), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6、また"Vaccines: New Gener
ationn Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G ら (編集), Plenum P
ress, New York, ISBN 0-306-45283-9に詳細に述べられている。 自己抗原に対する自己耐性の破壊を促進することが立証されているアジュバン
トを使用することが、特に好ましい。事実、これは非修飾OPGLが自己ワクチンで
有効成分として使用される場合に不可欠である。適当なアジュバントの非制限的
な例は、免疫標的化アジュバント；毒素、サイトカイン及びマイコバクテリア誘
導体などの免疫調節アジュバント；油製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント
；サポニン；免疫刺激複合マトリクス(ISCOMマトリクス)；粒子；DDA；アルミニ
ウムアジュバント；DNAアジュバント；γ-イヌリン；及び包膜アジュバントから
なる群より選択される。通常、類似体において第一、第二及び第三の分子として
有用な化合物及び剤に関する上記の開示は、本発明のワクチンのアジュバントに
おけるそれらの使用にも必要な変更を加えて引用する。
【００４９】 アジュバントの使用は、緩衝食塩水中の0.05 〜 0.1％溶液として通常使用さ
れる水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム(alum)等の薬剤、0.25％溶液と
して使用される糖の合成ポリマー（たとえばカルボポル(Carbopol)(登録商標)）
との混和物、70〜101℃の温度でそれぞれ30秒〜2分熱処理することによるワクチ
ン内でのタンパク質の凝集の使用を含み、ならびに架橋剤による凝集も可能であ
る。ペプシンで処理した抗体(Fabフラグメント)での再活性化によるアルブミン
への凝集、シー・パルブム(C. parvum)又は内毒素又はグラム陰性細菌のリポ多
糖成分などの細菌細胞との混合物、マンニッド(mannide)モノ-オレイン酸(Arace
l A)のような生理的に許容される油媒介体、又は阻害基体として使用されるパー
フルオロカーボン(Fluosol-DA)の20％溶液エマルジョンも、用いられる。スクア
レン及びIFAなどの油との混和物も好ましい。 本発明によれば、DDA (ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド)はDNA
やγ-イヌリンと同様、アジュバントの候補として興味深い。しかし、フロイン
ト完全アジュバント及び不完全アジュバント、ならびにQuilA及びQS21のような
キラヤサポニンもまた、RIBIとして興味深いものである。さらなる可能性として
は、モノホスホリルリピドA(MPL)、上記のC3及びC3d、ならびにムラミルジペプ
チド(MDP)がある。
れる水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム(alum)等の薬剤、0.25％溶液と
して使用される糖の合成ポリマー（たとえばカルボポル(Carbopol)(登録商標)）
との混和物、70〜101℃の温度でそれぞれ30秒〜2分熱処理することによるワクチ
ン内でのタンパク質の凝集の使用を含み、ならびに架橋剤による凝集も可能であ
る。ペプシンで処理した抗体(Fabフラグメント)での再活性化によるアルブミン
への凝集、シー・パルブム(C. parvum)又は内毒素又はグラム陰性細菌のリポ多
糖成分などの細菌細胞との混合物、マンニッド(mannide)モノ-オレイン酸(Arace
l A)のような生理的に許容される油媒介体、又は阻害基体として使用されるパー
フルオロカーボン(Fluosol-DA)の20％溶液エマルジョンも、用いられる。スクア
レン及びIFAなどの油との混和物も好ましい。 本発明によれば、DDA (ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド)はDNA
やγ-イヌリンと同様、アジュバントの候補として興味深い。しかし、フロイン
ト完全アジュバント及び不完全アジュバント、ならびにQuilA及びQS21のような
キラヤサポニンもまた、RIBIとして興味深いものである。さらなる可能性として
は、モノホスホリルリピドA(MPL)、上記のC3及びC3d、ならびにムラミルジペプ
チド(MDP)がある。
【００５０】 リポソーム製剤もまたアジュバント効果を与えることが知られている。したが
ってリポソームアジュバントは本発明において好ましい。 免疫刺激複合マトリクス型(ISCOM（登録商標）マトリクス)アジュバントも、
本発明による好ましい選択肢である。なぜなら、特にこの種のアジュバントがAP
CによるMHCクラスIIの発現をアップレギュレートしうることが示されているから
である。ISCOM（登録商標）マトリクスは、キラヤ・サポナリア(Quillaja sapon
aria)由来の(任意に分画した)サポニン(トリテルペノイド)、コレステロール、
及びリン脂質からなる。免疫原性タンパク質と混和した場合、得られる粒状製剤
はサポニン成分60-70％ w/w、コレステロール及びリン脂質10-15％ w/w及びタン
パク質10-15％ w/wからなるISCOM粒子として知られるものである。免疫刺激複合
体の組成及び使用に関する詳細は、例えばアジュバントに関する上記教本に見ら
れるが、Morein B ら、1995, Clin. Immunother. 3: 461-475ならびにBarr IG
及び Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (ともに引例して
ここに組み込む)にも完全免疫刺激複合体の製法に関する有用な教示が提示され
ている。
ってリポソームアジュバントは本発明において好ましい。 免疫刺激複合マトリクス型(ISCOM（登録商標）マトリクス)アジュバントも、
本発明による好ましい選択肢である。なぜなら、特にこの種のアジュバントがAP
CによるMHCクラスIIの発現をアップレギュレートしうることが示されているから
である。ISCOM（登録商標）マトリクスは、キラヤ・サポナリア(Quillaja sapon
aria)由来の(任意に分画した)サポニン(トリテルペノイド)、コレステロール、
及びリン脂質からなる。免疫原性タンパク質と混和した場合、得られる粒状製剤
はサポニン成分60-70％ w/w、コレステロール及びリン脂質10-15％ w/w及びタン
パク質10-15％ w/wからなるISCOM粒子として知られるものである。免疫刺激複合
体の組成及び使用に関する詳細は、例えばアジュバントに関する上記教本に見ら
れるが、Morein B ら、1995, Clin. Immunother. 3: 461-475ならびにBarr IG
及び Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (ともに引例して
ここに組み込む)にも完全免疫刺激複合体の製法に関する有用な教示が提示され
ている。
【００５１】 別の非常に興味ある(したがって、好ましい)アジュバント効果を達成する可能
性は、Gosselin ら,1992（ここに引用して取りこむ）に記述された技術を用いる
ことである。簡単には、本発明の抗原のような関連抗原の提示は、抗原を単球/
マクロファージ上のFcγ受容体に対する抗体(又は抗原結合性抗体フラグメント)
に接合して、増強することができる。特に抗原と抗-FcγRIとの接合は、ワクチ
ン注射を目的として免疫原性を高めることが立証されている。 他の可能性には、OPGLの修飾型における第一及び第二の候補分子として上記し
た標的化物質及び免疫調節物質(特にサイトカイン)の使用が含まれる。これに関
連して、ポリI:Cのようなサイトカインの合成誘導物質も可能性がある。
性は、Gosselin ら,1992（ここに引用して取りこむ）に記述された技術を用いる
ことである。簡単には、本発明の抗原のような関連抗原の提示は、抗原を単球/
マクロファージ上のFcγ受容体に対する抗体(又は抗原結合性抗体フラグメント)
に接合して、増強することができる。特に抗原と抗-FcγRIとの接合は、ワクチ
ン注射を目的として免疫原性を高めることが立証されている。 他の可能性には、OPGLの修飾型における第一及び第二の候補分子として上記し
た標的化物質及び免疫調節物質(特にサイトカイン)の使用が含まれる。これに関
連して、ポリI:Cのようなサイトカインの合成誘導物質も可能性がある。
【００５２】 適当なマイコバクテリア誘導体は、ムラミルジペプチド、完全フロイントアジ
ュバント、RIBI、及びTDMならびにTDEのようなトレハロースのジエステルからな
る群から選択される。 適当な免疫標的アジュバントは、CD40リガンド及びCD40抗体又は特異的に結合
するそれらのフラグメント(上記参照)、マンノース、Fabフラグメント及びCTLA-
4からなる群から選択される。 適当なポリマーアジュバントは、デキストラン、PEG、デンプン、マンナン及
びマンノースのような炭水化物;プラスチックポリマー自体;及びラテックスビー
ズのようなラテックスからなる群から選択される。
ュバント、RIBI、及びTDMならびにTDEのようなトレハロースのジエステルからな
る群から選択される。 適当な免疫標的アジュバントは、CD40リガンド及びCD40抗体又は特異的に結合
するそれらのフラグメント(上記参照)、マンノース、Fabフラグメント及びCTLA-
4からなる群から選択される。 適当なポリマーアジュバントは、デキストラン、PEG、デンプン、マンナン及
びマンノースのような炭水化物;プラスチックポリマー自体;及びラテックスビー
ズのようなラテックスからなる群から選択される。
【００５３】 免疫応答を調節するさらに別の興味ある方法は、「仮想(virtual)リンパ節」(VLN
) (ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501に
より開発された専売医療用装置)にOPGL免疫原(任意に、アジュバントならびに医
薬的に許容される担体及びビヒクルと共にある)を含むことである。VLN(薄い管状
装置)は、リンパ節の構造と機能を模倣している。皮膚下へのVLNの挿入により、サ
イトカイン及びケモキネシスの急増を伴う無菌炎症部位が生じる。T-細胞及びB-
細胞ならびにAPCは危険シグナルに迅速に応答して、炎症部位に戻り、VLNの多孔性
マトリクス内部に蓄積する。VLNを用いると抗原への免疫応答を高めるのに必要な
抗原量が減少すること、及びVLNを用いるワクチン注射により付与される免疫保護
がアジュバントとしてRibiを用いる通常の免疫化をしのぐことが分かっている。
技術は、特に「From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, 10月12
日〜15日、1998年、Seascape Resort, Aptos, California」中のGelber C ら, 1998
,「Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small A
mounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual
Lymph Node」中に簡単に記述されている。
) (ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501に
より開発された専売医療用装置)にOPGL免疫原(任意に、アジュバントならびに医
薬的に許容される担体及びビヒクルと共にある)を含むことである。VLN(薄い管状
装置)は、リンパ節の構造と機能を模倣している。皮膚下へのVLNの挿入により、サ
イトカイン及びケモキネシスの急増を伴う無菌炎症部位が生じる。T-細胞及びB-
細胞ならびにAPCは危険シグナルに迅速に応答して、炎症部位に戻り、VLNの多孔性
マトリクス内部に蓄積する。VLNを用いると抗原への免疫応答を高めるのに必要な
抗原量が減少すること、及びVLNを用いるワクチン注射により付与される免疫保護
がアジュバントとしてRibiを用いる通常の免疫化をしのぐことが分かっている。
技術は、特に「From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, 10月12
日〜15日、1998年、Seascape Resort, Aptos, California」中のGelber C ら, 1998
,「Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small A
mounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual
Lymph Node」中に簡単に記述されている。
【００５４】 ワクチンは、1年につき1、2、3、4、5又は6回のように、1〜6回、その必要時
に個体に投与されるべきであると考えられる。本発明による好ましい自己ワクチ
ンを用いて誘導される免疫記憶は永続的ではなく、したがって、免疫系は定期的
にOPGL又は修飾 OPGLのポリペプチドを用いて免疫性を試験する必要のあること
が、以前に示されている。 遺伝的変異のため、異なる個体は同じポリペプチドに様々な強度の免疫応答で
反応しうる。したがって、本発明によるワクチンは、免疫応答を増すために数個
の異なるポリペプチドからなっていてもよい(外来T-細胞エピトープ導入の選択
に関する上記議論も参照)。ワクチンは、全てのポリペプチドが上記で定義され
ているような2以上のポリペプチドからなっていてもよい。 ワクチンは、したがって、3〜10の異なるポリペプチドのような3〜20の異なる
修飾又は未修飾のポリペプチドからなっていてもよい。
に個体に投与されるべきであると考えられる。本発明による好ましい自己ワクチ
ンを用いて誘導される免疫記憶は永続的ではなく、したがって、免疫系は定期的
にOPGL又は修飾 OPGLのポリペプチドを用いて免疫性を試験する必要のあること
が、以前に示されている。 遺伝的変異のため、異なる個体は同じポリペプチドに様々な強度の免疫応答で
反応しうる。したがって、本発明によるワクチンは、免疫応答を増すために数個
の異なるポリペプチドからなっていてもよい(外来T-細胞エピトープ導入の選択
に関する上記議論も参照)。ワクチンは、全てのポリペプチドが上記で定義され
ているような2以上のポリペプチドからなっていてもよい。 ワクチンは、したがって、3〜10の異なるポリペプチドのような3〜20の異なる
修飾又は未修飾のポリペプチドからなっていてもよい。
【００５５】核酸のワクチン注射 ペプチド-ベースのワクチンの伝統的な投与に代わるものとして、核酸ワクチ
ン注射の技術(「核酸免疫化」「遺伝的免疫化」及び「遺伝子免疫化」としても
知られる)も、多くの魅力的な特徴を提供するものである。 第一に、伝統的なワクチンの試みとは対照的に、核酸ワクチン注射には、免疫
原性剤に関して資源を消費する大規模な製造(例えば、修飾OPGLを産生する微生
物の産業規模の発酵形態)が必要ではない。さらに、免疫原のための精製装置及
び再生スキームが必要ない。最終的に、核酸ワクチン注射はワクチン注射された
個体の生化学器官に依存して導入された核酸の発現産物を産生するので、発現産
物の最適な翻訳後プロセシングが起こることが期待される。これは、自己ワクチ
ン注射の場合に特に重要である。というのは、上述のように、最初のOPGL B-細
胞エピトープの有意なフラクションは修飾分子内に保存されるべきであり、かつ
B-細胞エピトープは原則として、いずれかの(生体)分子(例えば、炭水化物、脂
質、タンパク質等)の部分から構成されていてもよいからである。従って、免疫
原の天然のグリコシル化及び脂質化パターンは全体の免疫原性に非常に重要であ
り、これは、免疫原を宿主に産生させることによって最善に保証される。
ン注射の技術(「核酸免疫化」「遺伝的免疫化」及び「遺伝子免疫化」としても
知られる)も、多くの魅力的な特徴を提供するものである。 第一に、伝統的なワクチンの試みとは対照的に、核酸ワクチン注射には、免疫
原性剤に関して資源を消費する大規模な製造(例えば、修飾OPGLを産生する微生
物の産業規模の発酵形態)が必要ではない。さらに、免疫原のための精製装置及
び再生スキームが必要ない。最終的に、核酸ワクチン注射はワクチン注射された
個体の生化学器官に依存して導入された核酸の発現産物を産生するので、発現産
物の最適な翻訳後プロセシングが起こることが期待される。これは、自己ワクチ
ン注射の場合に特に重要である。というのは、上述のように、最初のOPGL B-細
胞エピトープの有意なフラクションは修飾分子内に保存されるべきであり、かつ
B-細胞エピトープは原則として、いずれかの(生体)分子(例えば、炭水化物、脂
質、タンパク質等)の部分から構成されていてもよいからである。従って、免疫
原の天然のグリコシル化及び脂質化パターンは全体の免疫原性に非常に重要であ
り、これは、免疫原を宿主に産生させることによって最善に保証される。
【００５６】 このため、本発明の好ましい具体例は、修飾OPGLをエンコードする核酸を動物
細胞に導入し、それにより、核酸が導入された細胞を生体内で発現させることに
より、修飾OPGLを免疫系に提示することからなる。 この具体例において、導入される核酸は、裸のDNAの形態であってもよいDNA、
荷電又は非荷電の脂質で製剤化したDNA、リポソーム中に製剤化したDNA、ウイル
スベクターに含まれるDNA、トランスフェクション-促進タンパク質又はポリペプ
チドで製剤化したDNA、標的タンパク質又はポリペプチドで製剤化したDNA、カル
シウム沈降剤で製剤化したDNA、不活性担体分子と結合したDNA、キチン又はキト
サンで被包化したDNA、及びアジュバントで製剤化したDNAが好ましい。この明細
書において、伝統的なワクチン製剤化におけるアジュバントの使用に付随する全
ての実際上の問題は、DNAワクチンの製剤化にもあてはまることが留意される。
このため、ポリペプチドをベースとするワクチンの文脈中におけるアジュバント
の使用に関するこの全ての開示は、核酸ワクチン注射技術におけるそれらの使用
に必要な変更を加えて適用される。
細胞に導入し、それにより、核酸が導入された細胞を生体内で発現させることに
より、修飾OPGLを免疫系に提示することからなる。 この具体例において、導入される核酸は、裸のDNAの形態であってもよいDNA、
荷電又は非荷電の脂質で製剤化したDNA、リポソーム中に製剤化したDNA、ウイル
スベクターに含まれるDNA、トランスフェクション-促進タンパク質又はポリペプ
チドで製剤化したDNA、標的タンパク質又はポリペプチドで製剤化したDNA、カル
シウム沈降剤で製剤化したDNA、不活性担体分子と結合したDNA、キチン又はキト
サンで被包化したDNA、及びアジュバントで製剤化したDNAが好ましい。この明細
書において、伝統的なワクチン製剤化におけるアジュバントの使用に付随する全
ての実際上の問題は、DNAワクチンの製剤化にもあてはまることが留意される。
このため、ポリペプチドをベースとするワクチンの文脈中におけるアジュバント
の使用に関するこの全ての開示は、核酸ワクチン注射技術におけるそれらの使用
に必要な変更を加えて適用される。
【００５７】 上に詳述したポリペプチドベースのワクチンの投与経路及び投与スキームにつ
いては、これらも本発明の核酸ワクチンに適用可能であり、ポリペプチド用の投
与経路及び投与スキームに関した上記議論は全て必要な変更を加えて核酸に適用
される。これには、静脈内及び動脈内に核酸ワクチンを投与することが適切であ
ることが、付け加えられる。さらに、核酸ワクチンはいわゆる遺伝子銃を用いて
投与してもよく、それゆえ、これと等価な投与様式が本発明の一部とみなされる
ことは当該分野で周知である。最終的に、核酸の投与におけるVLNの使用も良好
な結果を出すことが報告されており、従ってこの特定な投与様式は特に好ましい
。 さらに、免疫化剤として用いられる核酸は、第一、第二及び/又は第三の分子
をエンコードする領域を、例えば有用なアジュバントとして述べたサイトカイン
のような上記免疫調節物質の形態で含んでいてもよい。この具体例の好ましい変
形には、異なるリーディングフレーム中又は少なくとも異なるプロモーター制御
下で、類似体のコード領域及び免疫モジュレーターのコード領域を有することを
含む。その結果、類似体又はエピトープが免疫モジュレーターの融合パートナー
として産生されることが避けられる。代わりに、2つの別個のヌクレオチドフラ
グメントを用いることができるが、これは、双方のコード領域が同じ分子に含ま
れている際に確実に共発現(co-expression)されるという利点のため、あまり好
ましくない。
いては、これらも本発明の核酸ワクチンに適用可能であり、ポリペプチド用の投
与経路及び投与スキームに関した上記議論は全て必要な変更を加えて核酸に適用
される。これには、静脈内及び動脈内に核酸ワクチンを投与することが適切であ
ることが、付け加えられる。さらに、核酸ワクチンはいわゆる遺伝子銃を用いて
投与してもよく、それゆえ、これと等価な投与様式が本発明の一部とみなされる
ことは当該分野で周知である。最終的に、核酸の投与におけるVLNの使用も良好
な結果を出すことが報告されており、従ってこの特定な投与様式は特に好ましい
。 さらに、免疫化剤として用いられる核酸は、第一、第二及び/又は第三の分子
をエンコードする領域を、例えば有用なアジュバントとして述べたサイトカイン
のような上記免疫調節物質の形態で含んでいてもよい。この具体例の好ましい変
形には、異なるリーディングフレーム中又は少なくとも異なるプロモーター制御
下で、類似体のコード領域及び免疫モジュレーターのコード領域を有することを
含む。その結果、類似体又はエピトープが免疫モジュレーターの融合パートナー
として産生されることが避けられる。代わりに、2つの別個のヌクレオチドフラ
グメントを用いることができるが、これは、双方のコード領域が同じ分子に含ま
れている際に確実に共発現(co-expression)されるという利点のため、あまり好
ましくない。
【００５８】 したがって、本発明は、 - 本発明の核酸フラグメント又はベクター(以下のベクターの議論参照)、及び
- 上記の医薬的及び免疫学的に許容されるビヒクル及び/又は担体及び/又はア
ジュバント からなる、OPGLに対する抗体産生を誘導する組成物にも関する。 正常な環境下では、OPGL 変異型-エンコード核酸は、発現がウイルスプロモー
ター制御下にあるベクターの形態で導入される。本発明のベクターのより詳細な
議論については、以下の論述を参照のこと。また、製剤及び核酸ワクチンの使用
に関する詳細な記載も利用可能である：Donnelly JJ ら, 1997, Annu. Rev. Imm
unol. 15: 617-648及びDonnelly JJ ら, 1997, Life Sciences 60: 163-172 参
照。これら文献双方をここに引用して取りこむ。
- 上記の医薬的及び免疫学的に許容されるビヒクル及び/又は担体及び/又はア
ジュバント からなる、OPGLに対する抗体産生を誘導する組成物にも関する。 正常な環境下では、OPGL 変異型-エンコード核酸は、発現がウイルスプロモー
ター制御下にあるベクターの形態で導入される。本発明のベクターのより詳細な
議論については、以下の論述を参照のこと。また、製剤及び核酸ワクチンの使用
に関する詳細な記載も利用可能である：Donnelly JJ ら, 1997, Annu. Rev. Imm
unol. 15: 617-648及びDonnelly JJ ら, 1997, Life Sciences 60: 163-172 参
照。これら文献双方をここに引用して取りこむ。
【００５９】生ワクチン 修飾OPGLを免疫系に提示するための第三の代替法は、生ワクチン技術の使用で
ある。生ワクチン注射において、免疫系への提示は、修飾OPGLをエンコードする
核酸フラグメント又はそのような核酸フラグメントを取りこむベクターで形質転
換した非病原性微生物を動物に投与してなされる。非病原性微生物は、いずれか
の適当な弱毒化(継代培養、又は組換えDNA技術で病原性の発現産物を除くことに
よって弱毒化した) 細菌株、例えばマイコバクテリウム‐ボビス(Mycobacterium
boviz) BCG.、非病原性ストレプトコッカス(Streptococcus)種、大腸菌、サル
モネラ(Salmonella)種、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、シゲラ(Shigella
)等であってもよい。最先端技術を用いた生ワクチンの製造を扱ったレビューは
、例えば、ともにここに引用して取りこまれる、Saliou P, 1995, Rev. Prat. 4
5: 1492-1496及びWalker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990に見られる。そのよう
な生ワクチンで用いられる核酸フラグメント及びベクターについての詳細は、以
下の議論を参照されたい。
ある。生ワクチン注射において、免疫系への提示は、修飾OPGLをエンコードする
核酸フラグメント又はそのような核酸フラグメントを取りこむベクターで形質転
換した非病原性微生物を動物に投与してなされる。非病原性微生物は、いずれか
の適当な弱毒化(継代培養、又は組換えDNA技術で病原性の発現産物を除くことに
よって弱毒化した) 細菌株、例えばマイコバクテリウム‐ボビス(Mycobacterium
boviz) BCG.、非病原性ストレプトコッカス(Streptococcus)種、大腸菌、サル
モネラ(Salmonella)種、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、シゲラ(Shigella
)等であってもよい。最先端技術を用いた生ワクチンの製造を扱ったレビューは
、例えば、ともにここに引用して取りこまれる、Saliou P, 1995, Rev. Prat. 4
5: 1492-1496及びWalker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990に見られる。そのよう
な生ワクチンで用いられる核酸フラグメント及びベクターについての詳細は、以
下の議論を参照されたい。
【００６０】 細菌性生ワクチンの代わりとして、以下に議論する本発明の核酸フラグメント
は、ワクシニア菌株又は他の適当なポックスウイルスのような非毒性ウイルスワ
クチンベクターに取りこんでもよい。 通常は、非病原性微生物又はウイルスを動物に1度だけ投与するが、ある場合
には、生涯のあいだに1度以上微生物を投与し、防御免疫を維持する必要がある
かもしれない。ポリペプチドワクチン注射に関し上記で詳細にしたような免疫化
スキームは、生ワクチン又はウイルスワクチンを用いる際に有用であろうことが
予想される。 あるいは、生ワクチン注射又はウイルスワクチン注射は、以前の又はその後の
ポリペプチド及び/又は核酸のワクチン注射と組み合わせられる。例えば、生ワ
クチン又はウイルスワクチンでの一次免疫化の後、ポリペプチドもしくは核酸の
アプローチを用いる追加免疫化を行うことができる。
は、ワクシニア菌株又は他の適当なポックスウイルスのような非毒性ウイルスワ
クチンベクターに取りこんでもよい。 通常は、非病原性微生物又はウイルスを動物に1度だけ投与するが、ある場合
には、生涯のあいだに1度以上微生物を投与し、防御免疫を維持する必要がある
かもしれない。ポリペプチドワクチン注射に関し上記で詳細にしたような免疫化
スキームは、生ワクチン又はウイルスワクチンを用いる際に有用であろうことが
予想される。 あるいは、生ワクチン注射又はウイルスワクチン注射は、以前の又はその後の
ポリペプチド及び/又は核酸のワクチン注射と組み合わせられる。例えば、生ワ
クチン又はウイルスワクチンでの一次免疫化の後、ポリペプチドもしくは核酸の
アプローチを用いる追加免疫化を行うことができる。
【００６１】 微生物もしくはウイルスは、例えば有用なアジュバントとして論じたサイトカ
インのように、上記の免疫調節物質の形態で第一、第二及び/又は第三の分子を
エンコードする領域を含む核酸で形質転換してもよい。この具体例の好ましい変
形は、異なるリーディングフレーム中又は少なくとも異なるプロモーター制御下
で、類似体のコード領域及び免疫モジュレーターのコード領域を有することを含
む。その結果、類似体又はエピトープが免疫モジュレーターの融合パートナーと
して産生されることが避けられる。代わりに、2つの別個のヌクレオチドフラグ
メントを形質転換剤として用いることができる。当然に、同じリーディングフレ
ーム中に第一及び/又は第二及び/又は第三の分子を有することによって発現産物
として本発明の類似体を生じることができ、そのような具体例は、本発明によれ
ば特に好ましい。
インのように、上記の免疫調節物質の形態で第一、第二及び/又は第三の分子を
エンコードする領域を含む核酸で形質転換してもよい。この具体例の好ましい変
形は、異なるリーディングフレーム中又は少なくとも異なるプロモーター制御下
で、類似体のコード領域及び免疫モジュレーターのコード領域を有することを含
む。その結果、類似体又はエピトープが免疫モジュレーターの融合パートナーと
して産生されることが避けられる。代わりに、2つの別個のヌクレオチドフラグ
メントを形質転換剤として用いることができる。当然に、同じリーディングフレ
ーム中に第一及び/又は第二及び/又は第三の分子を有することによって発現産物
として本発明の類似体を生じることができ、そのような具体例は、本発明によれ
ば特に好ましい。
【００６２】疾患治療における本発明の方法の使用 上記議論から認識されるように、本発明の方法により、骨量の過度な損失によ
って特徴づけられる疾患を抑制することができる。この明細書において骨粗鬆症
疾患が発明の方法の主要な目的であるが、複雑骨折に関連した骨損失も、治療/
改善に適した目的である。ゆえに、OPGL活性をダウンレギュレートする本発明の
方法の重要な具体例は、骨粗鬆症又は過剰な骨再吸収で特徴づけられる他の症状
の治療及び/又は予防及び/又は改善することからなる。その方法は、骨再吸収速
度が著しく低下する程度に、本発明の方法にしたがってOPGL活性をダウンレギュ
レーションすることからなる。
って特徴づけられる疾患を抑制することができる。この明細書において骨粗鬆症
疾患が発明の方法の主要な目的であるが、複雑骨折に関連した骨損失も、治療/
改善に適した目的である。ゆえに、OPGL活性をダウンレギュレートする本発明の
方法の重要な具体例は、骨粗鬆症又は過剰な骨再吸収で特徴づけられる他の症状
の治療及び/又は予防及び/又は改善することからなる。その方法は、骨再吸収速
度が著しく低下する程度に、本発明の方法にしたがってOPGL活性をダウンレギュ
レーションすることからなる。
【００６３】 本明細書中で、骨再吸収におけるそのような有意な減少は、病理学的速度に比
べて少なくとも3％であるが、少なくとも5％、少なくとも7％、少なくとも9％、
少なくとも11％、少なくとも13％、少なくとも15％及び少なくとも17％のような
、より高い割合が予想され、少なくとも20％、もしくは少なくとも30％のような
さらに高い割合が期待される。骨再吸収の低下は、骨成形と骨再吸収との均衡が
逆転する結果となり、すなわち骨成形速度が骨再吸収速度を上回るようになるこ
とが特に好ましい。当然、この不均衡は持続すべきではないが(というのも骨化
石症になるからである)、必要のある個体の免疫化の数と免疫学的影響を注意深
く制御することにより、時間をかけて均衡を得て、骨量を最終的に維持すること
ができる。あるいは、個体において本発明の方法で骨損失を終わらせることがで
きなければ、本発明の方法は(骨粗鬆症患者において骨損失を減少させる他の公
知の方法と任意に組み合わせて)骨損失を有意に低下させて時間を延ばし、十分
な骨量が個体中に存在するように用いることができる。
べて少なくとも3％であるが、少なくとも5％、少なくとも7％、少なくとも9％、
少なくとも11％、少なくとも13％、少なくとも15％及び少なくとも17％のような
、より高い割合が予想され、少なくとも20％、もしくは少なくとも30％のような
さらに高い割合が期待される。骨再吸収の低下は、骨成形と骨再吸収との均衡が
逆転する結果となり、すなわち骨成形速度が骨再吸収速度を上回るようになるこ
とが特に好ましい。当然、この不均衡は持続すべきではないが(というのも骨化
石症になるからである)、必要のある個体の免疫化の数と免疫学的影響を注意深
く制御することにより、時間をかけて均衡を得て、骨量を最終的に維持すること
ができる。あるいは、個体において本発明の方法で骨損失を終わらせることがで
きなければ、本発明の方法は(骨粗鬆症患者において骨損失を減少させる他の公
知の方法と任意に組み合わせて)骨損失を有意に低下させて時間を延ばし、十分
な骨量が個体中に存在するように用いることができる。
【００６４】 骨再吸収及び骨成形の速度の測定方法は、当該分野で公知である。コラーゲン タイプIの一定のフラグメントの血中濃度を測定して骨再吸収速度を測定するこ
とは、生化学的アッセイにより可能である(WO 93/15107号及びWO 94/14844号参
照)。あるいは、骨損失速度は物理学的手段により評価することができる;非侵襲
性の物理学的方法で骨量を評価する方法に関する当該分野における代表的な記載
は、WO 88/06862号、WO 94/12855号、WO 95/14431号及びWO 97/00643号に見られ
る。
とは、生化学的アッセイにより可能である(WO 93/15107号及びWO 94/14844号参
照)。あるいは、骨損失速度は物理学的手段により評価することができる;非侵襲
性の物理学的方法で骨量を評価する方法に関する当該分野における代表的な記載
は、WO 88/06862号、WO 94/12855号、WO 95/14431号及びWO 97/00643号に見られ
る。
【００６５】本発明のペプチド、ポリペプチド及び組成物 上記から明らかなように、本発明は、破骨細胞活性を間接的に低下させるため
にOPGL抗原に対して個体を免疫化するとの概念に基づく。そのような免疫化を行
う好ましい方法は修飾型OPGLを用いることであり、それによって当該分野でこれ
まで開示されていない分子が提供される。 ここで論じた修飾OPGL分子は、それ自身の権利において創作性に富むもので、
従って本発明の重要な部分は修飾が導入された動物OPGLから誘導されるOPGL類似
体に関するものと考える。これは、結果として、類似体での動物の免疫化により
、非修飾 OPGL ポリペプチドと特異的に反応する抗体の産生を誘導する。修飾の
性質は、修飾OPGLを用いる場合の本発明の方法の様々な具体例を論じる際に上述
の修飾型と順応しているのが好ましい。ゆえに、修飾 OPGL分子に関連するここ
で表した開示は、いずれも本発明のOPGL類似体を記述する目的に関連しており、
そのような開示は、いずれもこれら類似体の記述に必要な変更を加えて適用され
る。
にOPGL抗原に対して個体を免疫化するとの概念に基づく。そのような免疫化を行
う好ましい方法は修飾型OPGLを用いることであり、それによって当該分野でこれ
まで開示されていない分子が提供される。 ここで論じた修飾OPGL分子は、それ自身の権利において創作性に富むもので、
従って本発明の重要な部分は修飾が導入された動物OPGLから誘導されるOPGL類似
体に関するものと考える。これは、結果として、類似体での動物の免疫化により
、非修飾 OPGL ポリペプチドと特異的に反応する抗体の産生を誘導する。修飾の
性質は、修飾OPGLを用いる場合の本発明の方法の様々な具体例を論じる際に上述
の修飾型と順応しているのが好ましい。ゆえに、修飾 OPGL分子に関連するここ
で表した開示は、いずれも本発明のOPGL類似体を記述する目的に関連しており、
そのような開示は、いずれもこれら類似体の記述に必要な変更を加えて適用され
る。
【００６６】 好ましい修飾OPGL 分子は、OPGLと、又は長さが少なくとも10アミノ酸のその
サブ配列と少なくとも70％の配列同一性を有するポリペプチドを生じる修飾から
なることが注目される。より高度な配列同一性、例えば少なくとも75％又は少な
くとも80、85、90もしくは95％であることが好ましい。タンパク質及び核酸につ
いての配列同一性は、(Nref- Ndif)・100/Nref［式中、Ndifは、配列されたとき
の2つの配列中の非同一な残基の総数であり、Nrefは、配列のひとつにおける残
基数である］として計算できる。ゆえに、DNA 配列 AGTCAGTCは、配列AATCAATC
と75％の配列同一性を有する(Ndif=2 及びNref=8)。 本発明はまた、本発明の方法を実行するのに有用な組成物にも関連する。ゆえ
に、本発明は、動物中の自己タンパク質であるOPGLポリペプチドの免疫原性的に
有効な量からなる免疫原性組成物にも関する。該OPGLポリペプチドは、OPGL ポ
リペプチドに対する動物の自己耐性を破壊するように免疫学的に許容されるアジ
ュバントと共に製剤化され、組成物は医薬的かつ免疫学的に許容される希釈剤及
び/又はビヒクル及び/又は担体及び/又は賦形剤をさらに含む。すなわち、本発
明のこの部分は、本発明の方法の具体例と関連して記述される天然に存在するOP
GL ポリペプチド製剤に関する。
サブ配列と少なくとも70％の配列同一性を有するポリペプチドを生じる修飾から
なることが注目される。より高度な配列同一性、例えば少なくとも75％又は少な
くとも80、85、90もしくは95％であることが好ましい。タンパク質及び核酸につ
いての配列同一性は、(Nref- Ndif)・100/Nref［式中、Ndifは、配列されたとき
の2つの配列中の非同一な残基の総数であり、Nrefは、配列のひとつにおける残
基数である］として計算できる。ゆえに、DNA 配列 AGTCAGTCは、配列AATCAATC
と75％の配列同一性を有する(Ndif=2 及びNref=8)。 本発明はまた、本発明の方法を実行するのに有用な組成物にも関連する。ゆえ
に、本発明は、動物中の自己タンパク質であるOPGLポリペプチドの免疫原性的に
有効な量からなる免疫原性組成物にも関する。該OPGLポリペプチドは、OPGL ポ
リペプチドに対する動物の自己耐性を破壊するように免疫学的に許容されるアジ
ュバントと共に製剤化され、組成物は医薬的かつ免疫学的に許容される希釈剤及
び/又はビヒクル及び/又は担体及び/又は賦形剤をさらに含む。すなわち、本発
明のこの部分は、本発明の方法の具体例と関連して記述される天然に存在するOP
GL ポリペプチド製剤に関する。
【００６７】 本発明は、免疫学的に有効な量の上記OPGL類似体からなる免疫原性組成物にも
関する。該組成物は、さらに医薬的かつ免疫学的に許容される希釈剤及び/又は
ビヒクル及び/又は担体及び/又は賦形剤と、任意にアジュバントを含む。すなわ
ち、本発明のこの部分は、本質的に上述したような修飾OPGL製剤に関する。アジ
ュバント、担体及びビヒクルの選択は、したがって、OPGLをダウンレギュレーシ
ョンするこの発明の方法を使用するための、修飾及び非修飾OPGLの製剤で参照す
る際に上記したものと一致する。 ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従い製造される。より長いポリペプ
チドは、通常、OPGL 類似体エンコードする核酸配列の適当なベクターへの導入
、ベクターでの適当な宿主細胞の形質転換、核酸配列の発現、宿主細胞又はその
培養上清からの発現産物の回収、ならびにその後の精製及び任意のさらなる修飾
、例えば再生もしくは誘導化を含む遺伝子組換え技術を用いてつくられる。 より短いペプチドは、固相又は液相のペプチド合成の周知技術を用いてつくる
ことが好ましい。しかし、この技術における近年の進歩はこれらの手段により全
長ポリペプチド及びタンパク質の製造を可能にするものであり、従って、合成手
段による長い構築物を製造することも本発明の範囲内である。
関する。該組成物は、さらに医薬的かつ免疫学的に許容される希釈剤及び/又は
ビヒクル及び/又は担体及び/又は賦形剤と、任意にアジュバントを含む。すなわ
ち、本発明のこの部分は、本質的に上述したような修飾OPGL製剤に関する。アジ
ュバント、担体及びビヒクルの選択は、したがって、OPGLをダウンレギュレーシ
ョンするこの発明の方法を使用するための、修飾及び非修飾OPGLの製剤で参照す
る際に上記したものと一致する。 ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従い製造される。より長いポリペプ
チドは、通常、OPGL 類似体エンコードする核酸配列の適当なベクターへの導入
、ベクターでの適当な宿主細胞の形質転換、核酸配列の発現、宿主細胞又はその
培養上清からの発現産物の回収、ならびにその後の精製及び任意のさらなる修飾
、例えば再生もしくは誘導化を含む遺伝子組換え技術を用いてつくられる。 より短いペプチドは、固相又は液相のペプチド合成の周知技術を用いてつくる
ことが好ましい。しかし、この技術における近年の進歩はこれらの手段により全
長ポリペプチド及びタンパク質の製造を可能にするものであり、従って、合成手
段による長い構築物を製造することも本発明の範囲内である。
【００６８】本発明の核酸フラグメント及びベクター 修飾OPGLポリペプチドが、遺伝子組換え技術のみならず化学合成又は半合成に
よってつくられること；修飾がタンパク質担体(例えばKLH、ジフテリアトキソイ
ド、破傷風トキソイド及びBSA)及び炭水化物ポリマーのような非タンパク様分子
への結合からなる場合、及び、当然に修飾がOPGLポリペプチド-誘導ペプチド鎖
への側鎖又は側基の付加からなる場合にも、後者の2つの選択は特に関連性があ
ることは、上記の記載から認識されるであろう。 遺伝子組換え技術のため、及び当然に核酸免疫化の目的のため、修飾 OPGLを
エンコードする核酸フラグメントは重要な化学生成物である。ゆえに、本発明の
重要な部分は、OPGL類似体をエンコードする核酸フラグメント、すなわち、融合
パートナーを付加するか、もしくは挿入した天然OPGL配列からなるOPGL誘導ポリ
ペプチド、又は好ましくは、挿入及び/又は付加、好ましくは置換及び/又は欠失
によって外来T-細胞エピトープを導入されたOPGL由来ポリペプチドに関連する。
本発明の核酸フラグメントは、DNA又はRNAフラグメントのいずれかである。
よってつくられること；修飾がタンパク質担体(例えばKLH、ジフテリアトキソイ
ド、破傷風トキソイド及びBSA)及び炭水化物ポリマーのような非タンパク様分子
への結合からなる場合、及び、当然に修飾がOPGLポリペプチド-誘導ペプチド鎖
への側鎖又は側基の付加からなる場合にも、後者の2つの選択は特に関連性があ
ることは、上記の記載から認識されるであろう。 遺伝子組換え技術のため、及び当然に核酸免疫化の目的のため、修飾 OPGLを
エンコードする核酸フラグメントは重要な化学生成物である。ゆえに、本発明の
重要な部分は、OPGL類似体をエンコードする核酸フラグメント、すなわち、融合
パートナーを付加するか、もしくは挿入した天然OPGL配列からなるOPGL誘導ポリ
ペプチド、又は好ましくは、挿入及び/又は付加、好ましくは置換及び/又は欠失
によって外来T-細胞エピトープを導入されたOPGL由来ポリペプチドに関連する。
本発明の核酸フラグメントは、DNA又はRNAフラグメントのいずれかである。
【００６９】 本発明の核酸フラグメントは通常は適当なベクターに挿入され、本発明の核酸
フラグメントを有するクローニング又は発現ベクターを形成する;そのような新
規なベクターも本発明の一部である。本発明のこれらベクターの構築に関する詳
細は、以下の形質転換細胞及び微生物の文脈中で論じる。ベクターは、適用の目
的及びタイプに応じて、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ-染色体又はウ
イルスの形態であってもよいが、所定の細胞中でのみ一過的に発現される裸のDN
A も重要なベクターである。本発明の好ましいクローニング及び発現ベクターは
自律複製することができ、それにより、その後のクローニングのための高レベル
での発現又は高レベルでの複製の目的のための高コピー数を可能にする。
フラグメントを有するクローニング又は発現ベクターを形成する;そのような新
規なベクターも本発明の一部である。本発明のこれらベクターの構築に関する詳
細は、以下の形質転換細胞及び微生物の文脈中で論じる。ベクターは、適用の目
的及びタイプに応じて、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ-染色体又はウ
イルスの形態であってもよいが、所定の細胞中でのみ一過的に発現される裸のDN
A も重要なベクターである。本発明の好ましいクローニング及び発現ベクターは
自律複製することができ、それにより、その後のクローニングのための高レベル
での発現又は高レベルでの複製の目的のための高コピー数を可能にする。
【００７０】 本発明のベクターの一般的な概略は、5’→3’方向及び操作可能な連鎖におい
て、本発明の核酸フラグメントの発現を駆動するためのプロモーター、任意にポ
リペプチドフラグメントの(細胞外相、又は適用可能であれば、周辺細胞質相へ
の)分泌又は膜中への組み込みを可能にするリーダーペプチドをエンコードする
核酸配列、本発明の核酸フラグメント、及び任意に転写終結区をエンコードする
核酸配列の特徴を含む。産生株又は細胞系で発現ベクターを用いて操作するとき
、形質転換細胞の遺伝的安定性の目的のため、宿主細胞への導入の際に、ベクタ
ーを宿主細胞ゲノムに組み込むことが好ましい。逆に、用いられるベクターを動
物での生体内発現に作用させる際(すなわち、DNAワクチン注射でベクターを用い
る際)には、安全上の理由から、ベクターを宿主細胞ゲノムに組み込むことがで
きないことが好ましい;典型的には、裸のDNA又は非組み込みウイルスベクターが
用いられ、その選択は当該分野の当業者には周知である。
て、本発明の核酸フラグメントの発現を駆動するためのプロモーター、任意にポ
リペプチドフラグメントの(細胞外相、又は適用可能であれば、周辺細胞質相へ
の)分泌又は膜中への組み込みを可能にするリーダーペプチドをエンコードする
核酸配列、本発明の核酸フラグメント、及び任意に転写終結区をエンコードする
核酸配列の特徴を含む。産生株又は細胞系で発現ベクターを用いて操作するとき
、形質転換細胞の遺伝的安定性の目的のため、宿主細胞への導入の際に、ベクタ
ーを宿主細胞ゲノムに組み込むことが好ましい。逆に、用いられるベクターを動
物での生体内発現に作用させる際(すなわち、DNAワクチン注射でベクターを用い
る際)には、安全上の理由から、ベクターを宿主細胞ゲノムに組み込むことがで
きないことが好ましい;典型的には、裸のDNA又は非組み込みウイルスベクターが
用いられ、その選択は当該分野の当業者には周知である。
【００７１】 本発明のベクターは、宿主細胞を形質転換するのに用いられ、本発明の修飾OP
GL ポリペプチドを産生する。そのような形質転換細胞は、また本発明の一部で
あるが、本発明の核酸フラグメント及びベクターの増殖に用いられるか又は本発
明の修飾OPGLポリペプチドの組換え産生に用いられる培養細胞又は細胞系であっ
てもよい。あるいは、形質転換細胞は、核酸フラグメント(単一の又は多数のコ
ピー)が挿入されて、細菌膜又は細胞壁に修飾 OPGLの分泌又は組み込みをもたら
す適当な生ワクチン株であってもよい。 本発明の好ましい形質転換細胞は、微生物、例えば細菌(エシェリキア種[例え
ば大腸菌]、バチルス[例えば枯草菌(Bacillus subtilis)]、サルモネラ又はマイ
コバクテリウム[好ましくは非病原性、例えばマイコバクテリウム・ボビスBCG]
、酵母(例えばサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae))及び原
生動物である。あるいは、形質転換細胞は、真菌、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳
動物細胞のような多細胞生物から誘導される。ヒト由来の細胞が最も好ましい(
以下の細胞系及びベクターの議論参照)。最近の結果は、出願人の研究室でのポ
リペプチドの組換え産生用に、市場で入手可能なDrosophila melanogaster細胞
系(Invitrogenから入手可能なシュナイダー2 (S2) 細胞系及びベクター系)の使
用に大きな見こみがあることを示しており、従ってこの発現系は特に好ましい。
GL ポリペプチドを産生する。そのような形質転換細胞は、また本発明の一部で
あるが、本発明の核酸フラグメント及びベクターの増殖に用いられるか又は本発
明の修飾OPGLポリペプチドの組換え産生に用いられる培養細胞又は細胞系であっ
てもよい。あるいは、形質転換細胞は、核酸フラグメント(単一の又は多数のコ
ピー)が挿入されて、細菌膜又は細胞壁に修飾 OPGLの分泌又は組み込みをもたら
す適当な生ワクチン株であってもよい。 本発明の好ましい形質転換細胞は、微生物、例えば細菌(エシェリキア種[例え
ば大腸菌]、バチルス[例えば枯草菌(Bacillus subtilis)]、サルモネラ又はマイ
コバクテリウム[好ましくは非病原性、例えばマイコバクテリウム・ボビスBCG]
、酵母(例えばサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae))及び原
生動物である。あるいは、形質転換細胞は、真菌、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳
動物細胞のような多細胞生物から誘導される。ヒト由来の細胞が最も好ましい(
以下の細胞系及びベクターの議論参照)。最近の結果は、出願人の研究室でのポ
リペプチドの組換え産生用に、市場で入手可能なDrosophila melanogaster細胞
系(Invitrogenから入手可能なシュナイダー2 (S2) 細胞系及びベクター系)の使
用に大きな見こみがあることを示しており、従ってこの発現系は特に好ましい。
【００７２】 クローニング及び/又は最適化した発現の目的のため、形質転換細胞が本発明
の核酸フラグメントを複製しうることが好ましい。核フラグメントを発現する細
胞が、好ましい本発明の有用な具体例である;それらは、小規模又は大規模な修
飾OPGLの製造に用いることができ、また、非病原性の細菌の場合、ワクチンとし
て生ワクチン中で構成する。 形質転換細胞を用いて本発明の修飾OPGLを製造するとき、少しも必須ではない
が、発現産物が、培養培地中に運ばれるか又は形質転換細胞表面に担持されるこ
とが都合がよい。 効果的な産生細胞を同定する際には、それを基礎として、本発明のベクターを
有し、修飾OPGLをエンコードする核酸フラグメントを発現する安定な細胞系を確
立するのが好ましい。好ましくは、この安定な細胞系は本発明のOPGL類似体を分
泌又は有し、それによりその精製を促進する。
の核酸フラグメントを複製しうることが好ましい。核フラグメントを発現する細
胞が、好ましい本発明の有用な具体例である;それらは、小規模又は大規模な修
飾OPGLの製造に用いることができ、また、非病原性の細菌の場合、ワクチンとし
て生ワクチン中で構成する。 形質転換細胞を用いて本発明の修飾OPGLを製造するとき、少しも必須ではない
が、発現産物が、培養培地中に運ばれるか又は形質転換細胞表面に担持されるこ
とが都合がよい。 効果的な産生細胞を同定する際には、それを基礎として、本発明のベクターを
有し、修飾OPGLをエンコードする核酸フラグメントを発現する安定な細胞系を確
立するのが好ましい。好ましくは、この安定な細胞系は本発明のOPGL類似体を分
泌又は有し、それによりその精製を促進する。
【００７３】 一般に、宿主細胞と和合性の種から誘導されるレプリコン及び制御配列を含む
プラスミドベクターが、宿主と関連して用いられる。ベクターは、通常、複製部
位、ならびに形質転換細胞で表現型選択を提供できるマーキング配列を有する。
例えば、大腸菌は、一般的に大腸菌種由来のプラスミドpBR322を用いて典型的に
形質転換される(例えばBolivar ら, 1977参照)。pBR322プラスミドは、アンピシ
リン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、ゆえに形質転換細胞を同定する容
易な手段を提供している。pBRプラスミド又は他の微生物プラスミドもしくはフ
ァージは、発現用の原核微生物によって使用できるプロモーターも含まなくては
ならず、又はそれを含むように修飾しなければならない。 組換えDNA 構築物で最も一般的に用いられるこれらのプロモーターは、B-ラク
タマーゼ(ペニシリナーゼ)及びラクトースプロモーター系(Chang ら, 1978; Ita
kura ら, 1977; Goeddel ら, 1979)及びトリプトファン(trp)プロモーター系(Go
eddel ら, 1979; EP-A-0 036 776)を含む。これらは最も一般的に用いられるが
、他の微生物プロモーターが発見され、利用されている。それらのヌクレオチド
配列に関する詳細が発表されているので、当業者はプラスミドベクターを用いて
機能的に連結させることができる(Siebwenlist ら, 1980)。原核生物由来のある
遺伝子は、人為的手段による他のプロモーターの付加を要しないので、それら自
身のプロモーター配列から大腸菌中で効果的に発現させることができる。
プラスミドベクターが、宿主と関連して用いられる。ベクターは、通常、複製部
位、ならびに形質転換細胞で表現型選択を提供できるマーキング配列を有する。
例えば、大腸菌は、一般的に大腸菌種由来のプラスミドpBR322を用いて典型的に
形質転換される(例えばBolivar ら, 1977参照)。pBR322プラスミドは、アンピシ
リン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、ゆえに形質転換細胞を同定する容
易な手段を提供している。pBRプラスミド又は他の微生物プラスミドもしくはフ
ァージは、発現用の原核微生物によって使用できるプロモーターも含まなくては
ならず、又はそれを含むように修飾しなければならない。 組換えDNA 構築物で最も一般的に用いられるこれらのプロモーターは、B-ラク
タマーゼ(ペニシリナーゼ)及びラクトースプロモーター系(Chang ら, 1978; Ita
kura ら, 1977; Goeddel ら, 1979)及びトリプトファン(trp)プロモーター系(Go
eddel ら, 1979; EP-A-0 036 776)を含む。これらは最も一般的に用いられるが
、他の微生物プロモーターが発見され、利用されている。それらのヌクレオチド
配列に関する詳細が発表されているので、当業者はプラスミドベクターを用いて
機能的に連結させることができる(Siebwenlist ら, 1980)。原核生物由来のある
遺伝子は、人為的手段による他のプロモーターの付加を要しないので、それら自
身のプロモーター配列から大腸菌中で効果的に発現させることができる。
【００７４】 原核生物に加えて、酵母培養物のような真核微生物も用いることができ、ここ
に、プロモーターは発現を駆動することができる。多数の他の株が一般的に入手
可能であるが、サッカロミセス・セレビジエ又は一般的なパン酵母が真核微生物
で最も一般的に用いられる。サッカロミセスでの発現には、例えばプラスミド Y
Rp7が一般に用いられる(Stinchcomb ら, 1979; Kingsman ら, 1979; Tschemper
ら, 1980)。このプラスミドは、トリプトファン中での成長能力を欠いた酵母の
突然変異株、例えばATCC No. 44076又はPEP4-1 (Jones, 1977)用の選択マーカー
を提供するtrpl 遺伝子を既に含むものである。そのため、酵母宿主細胞ゲノム
の特徴としてのtrpl 損傷の存在は、トリプトファン不在下での成長によって形
質転換体を検出するのに効果的な環境となる。
に、プロモーターは発現を駆動することができる。多数の他の株が一般的に入手
可能であるが、サッカロミセス・セレビジエ又は一般的なパン酵母が真核微生物
で最も一般的に用いられる。サッカロミセスでの発現には、例えばプラスミド Y
Rp7が一般に用いられる(Stinchcomb ら, 1979; Kingsman ら, 1979; Tschemper
ら, 1980)。このプラスミドは、トリプトファン中での成長能力を欠いた酵母の
突然変異株、例えばATCC No. 44076又はPEP4-1 (Jones, 1977)用の選択マーカー
を提供するtrpl 遺伝子を既に含むものである。そのため、酵母宿主細胞ゲノム
の特徴としてのtrpl 損傷の存在は、トリプトファン不在下での成長によって形
質転換体を検出するのに効果的な環境となる。
【００７５】 酵母ベクターでの適当なプロモート配列は、3-ホスホグリセレートキナーゼ (
Hitzmanら, 1980)又は他の解糖酵素(Hessら, 1968; Hollandら, 1978)、例えば
エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキ
ナーゼ、脱炭酸ピルビン酸、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース-6-ホスフェ
ートイソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリ
オースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキ
ナーゼのプロモーターを含む。適当な発現プラスミドの構築においては、これら
の遺伝子に関連している終結配列も、mRNAのポリアデニル化及び終結を生じるこ
とが望ましい発現ベクター配列の3'に連結される。 成長条件によって転写が制御されるという別の利点がある他のプロモーターは
、アルコール脱水素酵素2、イソシトクロームC、酸ホスファターゼ、窒素代謝に
関連した分解酵素及び上述のグリセルアルデヒド-3-ホスフェート脱水素酵素、
及びマルトースならびにガラクトースの利用の原因となる酵素のプロモーター領
域である。酵母和合性のプロモーター、複製起点及び終結配列を含むいずれのプ
ラスミドベクターも適当である。
Hitzmanら, 1980)又は他の解糖酵素(Hessら, 1968; Hollandら, 1978)、例えば
エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキ
ナーゼ、脱炭酸ピルビン酸、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース-6-ホスフェ
ートイソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリ
オースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキ
ナーゼのプロモーターを含む。適当な発現プラスミドの構築においては、これら
の遺伝子に関連している終結配列も、mRNAのポリアデニル化及び終結を生じるこ
とが望ましい発現ベクター配列の3'に連結される。 成長条件によって転写が制御されるという別の利点がある他のプロモーターは
、アルコール脱水素酵素2、イソシトクロームC、酸ホスファターゼ、窒素代謝に
関連した分解酵素及び上述のグリセルアルデヒド-3-ホスフェート脱水素酵素、
及びマルトースならびにガラクトースの利用の原因となる酵素のプロモーター領
域である。酵母和合性のプロモーター、複製起点及び終結配列を含むいずれのプ
ラスミドベクターも適当である。
【００７６】 微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物も宿主として用いてもよい。原
則として、脊椎動物の培養物であるか無脊椎動物の培養物であるかにかかわらず
、いずれのかかる細胞培養物も作用し得る。しかし、脊椎動物細胞における興味
がもっとも強く、培養物(組織培養物)での脊椎動物細胞の増殖が近年常套的な手
法となっている(Tissue Culture, 1973)。このような有用な宿主細胞系の例には
、VERO及びヒーラー細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、及びW138
、BHK、COS-7 293、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) (SF)
細胞(完全な発現系として、特にProtein Sciences (1000 Research Parkway, Me
riden, CT 06450,合衆国)及びInvitrogenから市場で入手可能)、及びMDCK細胞系
がある。この発明において、特に好ましい細胞系はInvitrogen (PO Box 2312, 9
704 CH Groningen、オランダ)から入手できるS2である。 このような細胞用の発現ベクターは、通常(必要であれば)複製起点、発現され
るべき遺伝子の前に位置するプロモーター、加えていずれかの必要なリボゾーム
結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結配列を含む。
則として、脊椎動物の培養物であるか無脊椎動物の培養物であるかにかかわらず
、いずれのかかる細胞培養物も作用し得る。しかし、脊椎動物細胞における興味
がもっとも強く、培養物(組織培養物)での脊椎動物細胞の増殖が近年常套的な手
法となっている(Tissue Culture, 1973)。このような有用な宿主細胞系の例には
、VERO及びヒーラー細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、及びW138
、BHK、COS-7 293、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) (SF)
細胞(完全な発現系として、特にProtein Sciences (1000 Research Parkway, Me
riden, CT 06450,合衆国)及びInvitrogenから市場で入手可能)、及びMDCK細胞系
がある。この発明において、特に好ましい細胞系はInvitrogen (PO Box 2312, 9
704 CH Groningen、オランダ)から入手できるS2である。 このような細胞用の発現ベクターは、通常(必要であれば)複製起点、発現され
るべき遺伝子の前に位置するプロモーター、加えていずれかの必要なリボゾーム
結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結配列を含む。
【００７７】 哺乳動物細胞での使用には、発現ベクターでの制御機能が、ウイルス物質によ
ってしばしば提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオ
ーマ、アデノウイルス2、もっとも頻繁にはシミアウイルス40(SV40)に由来する
。SV40ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ともにSV40ウイルス複製起点を
も含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので、特に有用である(F
iersら, 1978)。より小さいか、又はより大きいSV40フラグメントも、HindIII部
位からウイルス複製起点に位置するBglI部位にわたって伸びている約250bpの配
列を含む場合には、用いることができる。さらに、所望の遺伝子配列に通常結合
しているプロモーター又は制御配列も、かかる制御配列が宿主細胞系に和合性で
ある場合には、利用することができ、また利用することがしばしば望ましい。 複製起点は、SV40もしくは他のウイルス(例えば、ポリオーマ、アデノ、VSV、
BPV)から誘導されるような外性起点を含むようにベクターを構築するか、又は
宿主細胞系染色体複製機序によって提供してもよい。ベクターが宿主細胞染色体
に組みこまれる際には、後者でしばしば十分である。
ってしばしば提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオ
ーマ、アデノウイルス2、もっとも頻繁にはシミアウイルス40(SV40)に由来する
。SV40ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ともにSV40ウイルス複製起点を
も含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので、特に有用である(F
iersら, 1978)。より小さいか、又はより大きいSV40フラグメントも、HindIII部
位からウイルス複製起点に位置するBglI部位にわたって伸びている約250bpの配
列を含む場合には、用いることができる。さらに、所望の遺伝子配列に通常結合
しているプロモーター又は制御配列も、かかる制御配列が宿主細胞系に和合性で
ある場合には、利用することができ、また利用することがしばしば望ましい。 複製起点は、SV40もしくは他のウイルス(例えば、ポリオーマ、アデノ、VSV、
BPV)から誘導されるような外性起点を含むようにベクターを構築するか、又は
宿主細胞系染色体複製機序によって提供してもよい。ベクターが宿主細胞染色体
に組みこまれる際には、後者でしばしば十分である。
【００７８】有用なOPGL類似体の同定 天然のOPGLの可能性ある変異型又は修飾型が、全て天然型と交差反応性の動物
で抗体を誘発する能力を有しているとは限らないことは、当業者に明らかであろ
う。しかし、ここで論じる免疫学的反応性の最小要件を充たす修飾OPGL分子につ
いて有効で標準的なスクリーンを行うことは、難しくない。したがって、この発
明の別の部分は、非修飾OPGLポリペプチドが(非免疫原性の)自己タンパク質であ
る動物種における、非修飾OPGLに対する抗体を誘導し得る修飾OPGLポリペプチド
の同定方法に関する。その方法は、 - ペプチド合成又は遺伝子工学技術によって、動物種のOPGLポリペプチドのア
ミノ酸配列にアミノ酸を付加し、挿入し、配列からアミノ酸を欠失させ、又は配
列にアミノ酸を置換する相互に異なる修飾OPGLポリペプチドのセットを製造し、
それによって、動物種に外来のT-細胞エピトープからなるセットにおいてアミノ
酸配列を生じさせるか、又は相互に異なる修飾OPGLポリペプチドのセットをエン
コードする核酸フラグメントのセットを製造し、 - 非修飾OPGLに対する動物種による抗体産生の誘導能力について、修飾OPGLポ
リペプチド又は核酸フラグメントのセットのメンバーを試験し、かつ - その種において非修飾OPGLに対する抗体産生を著しく誘導する修飾OPGLポリ
ペプチドのセットのメンバーを同定して、任意に単離するか、又はその動物種に
おける非修飾OPGLポリペプチドに対する抗体産生を著しく誘導する核酸フラグメ
ントのセットのメンバーによってエンコードされるポリペプチド発現産物を同定
して、任意に単離する ことからなる。
で抗体を誘発する能力を有しているとは限らないことは、当業者に明らかであろ
う。しかし、ここで論じる免疫学的反応性の最小要件を充たす修飾OPGL分子につ
いて有効で標準的なスクリーンを行うことは、難しくない。したがって、この発
明の別の部分は、非修飾OPGLポリペプチドが(非免疫原性の)自己タンパク質であ
る動物種における、非修飾OPGLに対する抗体を誘導し得る修飾OPGLポリペプチド
の同定方法に関する。その方法は、 - ペプチド合成又は遺伝子工学技術によって、動物種のOPGLポリペプチドのア
ミノ酸配列にアミノ酸を付加し、挿入し、配列からアミノ酸を欠失させ、又は配
列にアミノ酸を置換する相互に異なる修飾OPGLポリペプチドのセットを製造し、
それによって、動物種に外来のT-細胞エピトープからなるセットにおいてアミノ
酸配列を生じさせるか、又は相互に異なる修飾OPGLポリペプチドのセットをエン
コードする核酸フラグメントのセットを製造し、 - 非修飾OPGLに対する動物種による抗体産生の誘導能力について、修飾OPGLポ
リペプチド又は核酸フラグメントのセットのメンバーを試験し、かつ - その種において非修飾OPGLに対する抗体産生を著しく誘導する修飾OPGLポリ
ペプチドのセットのメンバーを同定して、任意に単離するか、又はその動物種に
おける非修飾OPGLポリペプチドに対する抗体産生を著しく誘導する核酸フラグメ
ントのセットのメンバーによってエンコードされるポリペプチド発現産物を同定
して、任意に単離する ことからなる。
【００７９】 この明細書において、「相互に異なる修飾OPGLポリペプチドのセット」は、例
えば上述した基準(例えば、円二色性、NMRスペクトル及び/又はX-線回折パター
ン研究の組合わせ)に基づいて選択される非同一の修飾OPGLポリペプチドの集合
物である。セットは、ほんの数個のメンバーからなっていてもよいが、数百のメ
ンバーを含んでいてもよいものと考えられる。 セットメンバーの試験は、最後に生体内で行うことができるが、この発明の目
的に合う修飾分子数をしぼる幾つかの生体外試験を行ってもよい。 外来T-細胞エピトープを導入する目的は、T-細胞の助力によるB-細胞の応答を
支持することであるので、T-細胞増殖が修飾OPGLによって誘導されることが必要
条件である。T-細胞増殖は、生体外での標準的な増殖アッセイによって試験する
ことができる。手短に言えば、T-細胞用に強化した試料は目的物から得られ、そ
の後培養物に保持される。培養したT-細胞は、修飾分子をあらかじめ取り上げ、
T-細胞エピトープを提示するよう処理した目的物のAPC類と接触させる。T-細胞
の増殖をモニターし、適当な対照(例えば、完全な天然OPGLを処理したAPC類と接
触している培養物中のT-細胞)と比較する。あるいは、増殖は、外来T-細胞の認
識に応じてT-細胞によって放出される関連サイトカインの濃度を決定することに
よっても測定できる。
えば上述した基準(例えば、円二色性、NMRスペクトル及び/又はX-線回折パター
ン研究の組合わせ)に基づいて選択される非同一の修飾OPGLポリペプチドの集合
物である。セットは、ほんの数個のメンバーからなっていてもよいが、数百のメ
ンバーを含んでいてもよいものと考えられる。 セットメンバーの試験は、最後に生体内で行うことができるが、この発明の目
的に合う修飾分子数をしぼる幾つかの生体外試験を行ってもよい。 外来T-細胞エピトープを導入する目的は、T-細胞の助力によるB-細胞の応答を
支持することであるので、T-細胞増殖が修飾OPGLによって誘導されることが必要
条件である。T-細胞増殖は、生体外での標準的な増殖アッセイによって試験する
ことができる。手短に言えば、T-細胞用に強化した試料は目的物から得られ、そ
の後培養物に保持される。培養したT-細胞は、修飾分子をあらかじめ取り上げ、
T-細胞エピトープを提示するよう処理した目的物のAPC類と接触させる。T-細胞
の増殖をモニターし、適当な対照(例えば、完全な天然OPGLを処理したAPC類と接
触している培養物中のT-細胞)と比較する。あるいは、増殖は、外来T-細胞の認
識に応じてT-細胞によって放出される関連サイトカインの濃度を決定することに
よっても測定できる。
【００８０】 いずれかのタイプのセットの少なくともひとつの修飾OPGLがOPGLに対する抗体
産生を誘導できることはかなり確実であるので、非修飾OPGLポリペプチドが自己
タンパク質である動物種において、非修飾OPGLに対する抗体を誘導できる少なく
ともひとつの修飾OPGLポリペプチドからなる免疫原性組成物を製造することがで
きる。その方法は、OPGLと反応性である動物種において抗体産生を著しく誘導す
るセットのメンバーを、医薬的かつ免疫学的に許容される担体及び/又はビヒク
ル及び/又は希釈剤及び/又は賦形剤と混合し、任意に医薬的かつ免疫学的に許容
される少なくともひとつのアジュバントと組合わせることからなる。 ポリペプチドセットの試験に関するこの発明の上記の観点は、この発明の相互
に異なる核酸配列又はベクターを多数最初に製造し、これらを適当な発現ベクタ
ーに挿入し、適当な宿主細胞をベクターで形質転換し、かつこの発明の核酸配列
を発現することによって簡便に行われる。これらの工程は、その後、発現産物の
単離を続けてもよい。核酸配列及び/又はベクターは、PCRのような分子増幅技術
の実行からなる方法又は核酸合成の手段によって製造される。
産生を誘導できることはかなり確実であるので、非修飾OPGLポリペプチドが自己
タンパク質である動物種において、非修飾OPGLに対する抗体を誘導できる少なく
ともひとつの修飾OPGLポリペプチドからなる免疫原性組成物を製造することがで
きる。その方法は、OPGLと反応性である動物種において抗体産生を著しく誘導す
るセットのメンバーを、医薬的かつ免疫学的に許容される担体及び/又はビヒク
ル及び/又は希釈剤及び/又は賦形剤と混合し、任意に医薬的かつ免疫学的に許容
される少なくともひとつのアジュバントと組合わせることからなる。 ポリペプチドセットの試験に関するこの発明の上記の観点は、この発明の相互
に異なる核酸配列又はベクターを多数最初に製造し、これらを適当な発現ベクタ
ーに挿入し、適当な宿主細胞をベクターで形質転換し、かつこの発明の核酸配列
を発現することによって簡便に行われる。これらの工程は、その後、発現産物の
単離を続けてもよい。核酸配列及び/又はベクターは、PCRのような分子増幅技術
の実行からなる方法又は核酸合成の手段によって製造される。
【００８１】 この発明の別の部分は、破骨活性に対するOPGLの刺激作用を阻害するオステオ
プロテゲリンとは異なる少なくともひとつの物質の有効量をヒトを含む動物に投
与することからなる、過剰な骨再吸収によって特徴づけられる動物の疾患の治療
、予防又は改善のための方法に関する。現在のところ、このようなアプローチは
当該分野でこれまで示唆されていないと考えられる。 この発明のこの部分の好ましい具体例は、OPGL-特異的な抗体(ポリ-又はモノ
クローナル)又はOPGLの刺激作用を阻害する物質としてのその特異的な結合変異
型の使用に関する。抗体はIgG 又はIgM分子であり、又は特異的な結合変異型はI
gG又はIgMから誘導することが好ましい。抗体の特異的な結合変異型は、便利に
は、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、ヒト化モノクローナル抗体もしく
はそのフラグメント、又はダイアボディ(diabody) のような二量体もしくは多量
体抗体フラグメント(Cambridge Antibody Technologyによって製造される、二重
特異性かつ二量体の人工抗体-由来分子)であってもよい。
プロテゲリンとは異なる少なくともひとつの物質の有効量をヒトを含む動物に投
与することからなる、過剰な骨再吸収によって特徴づけられる動物の疾患の治療
、予防又は改善のための方法に関する。現在のところ、このようなアプローチは
当該分野でこれまで示唆されていないと考えられる。 この発明のこの部分の好ましい具体例は、OPGL-特異的な抗体(ポリ-又はモノ
クローナル)又はOPGLの刺激作用を阻害する物質としてのその特異的な結合変異
型の使用に関する。抗体はIgG 又はIgM分子であり、又は特異的な結合変異型はI
gG又はIgMから誘導することが好ましい。抗体の特異的な結合変異型は、便利に
は、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、ヒト化モノクローナル抗体もしく
はそのフラグメント、又はダイアボディ(diabody) のような二量体もしくは多量
体抗体フラグメント(Cambridge Antibody Technologyによって製造される、二重
特異性かつ二量体の人工抗体-由来分子)であってもよい。
【００８２】実施例 マウスの場合に158-316アミノ酸残基及びヒトの場合に159-317アミノ酸残基(
数は、それぞれSEQ ID NO: 2 及び 4における番号付けに相当した)からなる端を
切り取った型のマウスとヒトのOPGLをエンコードするcDNA類をクローンするか、
又は合成することを決定した。これらの端を切り取った型は生物活性を示すので
、OPGLのこの部分に自己抗体を指向させるのが論理的である。さらに、それによ
り、タンパク質がより小さくなり、この結果扱いやすくなる。 マウスのOPGL残基158-316をエンコードする合成cDNAは、発表されている配列
から、やや最適な大腸菌及びピキア・パストリス(Pichia pastoris)のコドンを
除いて合成した。さらに、N-末端ヒスチジン標識、サッカロマイセス・セレビジ
エ由来のα接合因子シグナル配列の切断部位部分、及び適当な制限酵素をオープ
ンリーディングフレームに導入した(SEQ ID NO: 7参照)。 野生型マウスOPGLをエンコードするこのcDNAは、BspHIならびにHindIIIの制限
酵素を用いる標準的な大腸菌発現ベクター(pTrc99a)及び SacIならびにKpnI制限
酵素を用いる標準的なクローニングベクター(pBluescript KS+)にクローンした(
SEQ ID NO: 9が生じる)。
数は、それぞれSEQ ID NO: 2 及び 4における番号付けに相当した)からなる端を
切り取った型のマウスとヒトのOPGLをエンコードするcDNA類をクローンするか、
又は合成することを決定した。これらの端を切り取った型は生物活性を示すので
、OPGLのこの部分に自己抗体を指向させるのが論理的である。さらに、それによ
り、タンパク質がより小さくなり、この結果扱いやすくなる。 マウスのOPGL残基158-316をエンコードする合成cDNAは、発表されている配列
から、やや最適な大腸菌及びピキア・パストリス(Pichia pastoris)のコドンを
除いて合成した。さらに、N-末端ヒスチジン標識、サッカロマイセス・セレビジ
エ由来のα接合因子シグナル配列の切断部位部分、及び適当な制限酵素をオープ
ンリーディングフレームに導入した(SEQ ID NO: 7参照)。 野生型マウスOPGLをエンコードするこのcDNAは、BspHIならびにHindIIIの制限
酵素を用いる標準的な大腸菌発現ベクター(pTrc99a)及び SacIならびにKpnI制限
酵素を用いる標準的なクローニングベクター(pBluescript KS+)にクローンした(
SEQ ID NO: 9が生じる)。
【００８３】 大腸菌細胞における発現により、全大腸菌タンパク質のうち約30％の組換えOP
GLが生じた。タンパク質は以下の方法を用いて再生し、精製した： 1. 細胞を遠心分離で収集する。 2. 細胞をリン酸緩衝液(PBS)に再懸濁し、再度遠心分離する。 3. 上清を捨て、3つの容量 (100 mMのトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン
塩酸塩、5 mMのジチオトレイトール(DTT)、0.5 M NaCl、pH 8.0) に細胞を再懸
濁する。 4. 細胞を、細胞グラム当たり8μlの50 mM PMSF及び80μlのリゾチーム(10 mg/
ml)に加え、20分室温でインキュベートする。 5. 細胞ペレットグラムそれぞれにつき、4 mgのデオキシコール酸を加え、懸濁
液が粘性になるまで37℃でインキュベートする。 6. 細胞グラム重量当たり20μlのDNase (1 mg/ml)を加え、MgCl2を5 mMまで、
懸濁液を室温で30分インキュベートする。 7. 懸濁液を、粘性がなくなるまで氷上で超音波処理する。 8. 遠心分離(30分、20000 x g)後、ペレットをH2Oに再懸濁して再度遠心分離し
、細胞グラム重量当たり3 mlの1 Mユレアに再懸濁する。 9. 遠心分離(30分、20000 x g)後、ペレットを、1 Mグアニジン塩酸塩、100 mM
トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩(pH 7.5)に再懸濁する。
GLが生じた。タンパク質は以下の方法を用いて再生し、精製した： 1. 細胞を遠心分離で収集する。 2. 細胞をリン酸緩衝液(PBS)に再懸濁し、再度遠心分離する。 3. 上清を捨て、3つの容量 (100 mMのトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン
塩酸塩、5 mMのジチオトレイトール(DTT)、0.5 M NaCl、pH 8.0) に細胞を再懸
濁する。 4. 細胞を、細胞グラム当たり8μlの50 mM PMSF及び80μlのリゾチーム(10 mg/
ml)に加え、20分室温でインキュベートする。 5. 細胞ペレットグラムそれぞれにつき、4 mgのデオキシコール酸を加え、懸濁
液が粘性になるまで37℃でインキュベートする。 6. 細胞グラム重量当たり20μlのDNase (1 mg/ml)を加え、MgCl2を5 mMまで、
懸濁液を室温で30分インキュベートする。 7. 懸濁液を、粘性がなくなるまで氷上で超音波処理する。 8. 遠心分離(30分、20000 x g)後、ペレットをH2Oに再懸濁して再度遠心分離し
、細胞グラム重量当たり3 mlの1 Mユレアに再懸濁する。 9. 遠心分離(30分、20000 x g)後、ペレットを、1 Mグアニジン塩酸塩、100 mM
トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩(pH 7.5)に再懸濁する。
【００８４】 10. 遠心分離(30分、20000 x g)後、ペレットを、6 Mグアニジン塩酸塩、20 mM
トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩、5％エタノール、1％β-メルカ
プトエタノール(pH 8.0)に再懸濁し、一晩4℃で攪拌する。 11. 遠心分離(1-4時間、40000 x g)後、上清をろ過し、-20℃で保存する。 12. 可溶化した封入体を、Superdex 200(Pharmacia)を用いてゲルろ過クロマト
グラフィーで分離する。 13. 組換えOPGLを含有する画分をプールし、1.5Mグアニジン塩酸塩、20mM トリ
ス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩、1 mM DTT(pH 7.5)を用いて0.1 mg/m
lに希釈する。 14. 10容量の1.5Mグアニジン塩酸塩、20 mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノメ
タン塩酸塩、1 mM DTT (pH 7.5)に対して物質を4℃で一晩透析する。 15. 10容量の1.0Mグアニジン塩酸塩、20 mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノメ
タン塩酸塩、1 mM DTT (pH 7.5)に対して物質を4℃で一晩透析する。 16. 10容量の0.5Mグアニジン塩酸塩、20 mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノ
メタン塩酸塩、1 mM DTT (pH 7.5)に対して物質を4℃で一晩透析する。 17. 10容量の20 mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩、150 mMアル
ギニン、1 mM DTT (pH 7.5)に対して物質を4℃で一晩透析する。 18. 10容量の20 mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩、150 mMアル
ギニン(pH 7.5)に対して物質を4℃で一晩透析する。 19. 再生した物質を凍結乾燥し、-20℃で保存する。
トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩、5％エタノール、1％β-メルカ
プトエタノール(pH 8.0)に再懸濁し、一晩4℃で攪拌する。 11. 遠心分離(1-4時間、40000 x g)後、上清をろ過し、-20℃で保存する。 12. 可溶化した封入体を、Superdex 200(Pharmacia)を用いてゲルろ過クロマト
グラフィーで分離する。 13. 組換えOPGLを含有する画分をプールし、1.5Mグアニジン塩酸塩、20mM トリ
ス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩、1 mM DTT(pH 7.5)を用いて0.1 mg/m
lに希釈する。 14. 10容量の1.5Mグアニジン塩酸塩、20 mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノメ
タン塩酸塩、1 mM DTT (pH 7.5)に対して物質を4℃で一晩透析する。 15. 10容量の1.0Mグアニジン塩酸塩、20 mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノメ
タン塩酸塩、1 mM DTT (pH 7.5)に対して物質を4℃で一晩透析する。 16. 10容量の0.5Mグアニジン塩酸塩、20 mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノ
メタン塩酸塩、1 mM DTT (pH 7.5)に対して物質を4℃で一晩透析する。 17. 10容量の20 mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩、150 mMアル
ギニン、1 mM DTT (pH 7.5)に対して物質を4℃で一晩透析する。 18. 10容量の20 mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩、150 mMアル
ギニン(pH 7.5)に対して物質を4℃で一晩透析する。 19. 再生した物質を凍結乾燥し、-20℃で保存する。
【００８５】 この方法を用いる再生効率は約40％で、純度は65％より高い。精製方法と再生
処理は、依然としてさらに改善すべき課題である。固定化再生は研究中であり、
ヒスチジン標識の酵素的な除去はPedersenら(1999)によって記載されているよう
にして本質的に行われるであろう。組換えタンパク質の性質は、SDS-PAGE、N-末
端シーケンシング、アミノ酸解析及び質量分析を用いて特徴づけし、確認した。 野生型マウスOPGLのシステイン置換変異体は、構築中である(SEQ ID NO: 4に
おけるアミノ酸残基に相当するシステインはセリンで置換する; SEQ ID NO: 11
及び12参照)。これを行って、精製した組換えタンパク質を用いて潜在的な安定
性の問題を除いた。この突然変異させたOPGLの端を切り取った型は、SEQ ID NO:
9を有するDNAから着手される後述の記載と完全に同様にワクチン構築の基礎と
して役立つであろう。さらに、ヒトOPGLの相当するCys→Ser突然変異体(Cys- 22
1が置換されている)も、同じ目的のために製造される。
処理は、依然としてさらに改善すべき課題である。固定化再生は研究中であり、
ヒスチジン標識の酵素的な除去はPedersenら(1999)によって記載されているよう
にして本質的に行われるであろう。組換えタンパク質の性質は、SDS-PAGE、N-末
端シーケンシング、アミノ酸解析及び質量分析を用いて特徴づけし、確認した。 野生型マウスOPGLのシステイン置換変異体は、構築中である(SEQ ID NO: 4に
おけるアミノ酸残基に相当するシステインはセリンで置換する; SEQ ID NO: 11
及び12参照)。これを行って、精製した組換えタンパク質を用いて潜在的な安定
性の問題を除いた。この突然変異させたOPGLの端を切り取った型は、SEQ ID NO:
9を有するDNAから着手される後述の記載と完全に同様にワクチン構築の基礎と
して役立つであろう。さらに、ヒトOPGLの相当するCys→Ser突然変異体(Cys- 22
1が置換されている)も、同じ目的のために製造される。
【００８６】 ワクチン分子は、選択した位置に破傷風トキソイド由来のエピトープP2又はP3
0のいずれかを挿入するか、又は内部置換して最初に構築される。他の適当な免
疫優勢T-細胞エピトープは、後の段階で用いることができる。 変異導入のための選択位置は、存在するか又は予想されるB-細胞エピトープ及
び天然分子に関して予想される二次構造要素についての知識に基づいて、ならび
にOPGLの細胞外部分の二次及び三次構造をモデリングするためのTNFα (1a8m.pd
b)及びCD40リガンド(1aly.pdb)の三次構造とのアラインメントを用いて選択する
。マウス分子での導入は、アミノ酸残基170-192、198-218、221-246、256-261及
び285-316 (SEQ ID NO: 4でのアミノ酸の番号付け参照)に相当する領域で生じる
が、ヒト分子での導入は、アミノ酸残基171-193、199-219、222-247、257-262及
び286-317に相当する領域で生じる。 これまでに、マウスOPGLの4つの変異型が構築され、大腸菌で組み換えて発現
されている。
0のいずれかを挿入するか、又は内部置換して最初に構築される。他の適当な免
疫優勢T-細胞エピトープは、後の段階で用いることができる。 変異導入のための選択位置は、存在するか又は予想されるB-細胞エピトープ及
び天然分子に関して予想される二次構造要素についての知識に基づいて、ならび
にOPGLの細胞外部分の二次及び三次構造をモデリングするためのTNFα (1a8m.pd
b)及びCD40リガンド(1aly.pdb)の三次構造とのアラインメントを用いて選択する
。マウス分子での導入は、アミノ酸残基170-192、198-218、221-246、256-261及
び285-316 (SEQ ID NO: 4でのアミノ酸の番号付け参照)に相当する領域で生じる
が、ヒト分子での導入は、アミノ酸残基171-193、199-219、222-247、257-262及
び286-317に相当する領域で生じる。 これまでに、マウスOPGLの4つの変異型が構築され、大腸菌で組み換えて発現
されている。
【００８７】N-末端ヒスチジン標識を有するmOPGL[158-316] _P30[256-261]をエンコードするD NA (SEQ ID NO: 13) : SEQ ID NO: 9 のPCRは、プライマーとしてSEQ ID NO: 22及び25を用いて行っ
た。得られたPCRフラグメントはSacII及びKpnIで制限消化し、次いでアガロース
ゲルから精製した。鋳型としてSEQ ID NO: 9を用いる第二のPCRは、プライマーS
EQ ID NO: 26とベクター特異的なプライマーを用いて行った。得られたPCRフラ
グメントは、KpnIとHindIIIで制限消化した。次に、双方のフラグメントを、Sac
IIとHindIIIで制限消化したpBluescript KS+においてSEQ ID NO: 9に連結した。
この構築で1つの塩基の突然変異を修正するために、鋳型として該構築物を用い
るPCRをプライマーSEQ ID NO: 33と29を用いて行った。得られたPCRフラグメン
トはPstI + EcoRIで制限消化し、ゲルから精製し、次いで、PstIとEcoRIで消化
した誤った構築物に連結した。次に、確認された構築物(SEQ ID NO: 13)を、制
限酵素BspHIとHindIIIを用いてpTrc99aに転移した。
た。得られたPCRフラグメントはSacII及びKpnIで制限消化し、次いでアガロース
ゲルから精製した。鋳型としてSEQ ID NO: 9を用いる第二のPCRは、プライマーS
EQ ID NO: 26とベクター特異的なプライマーを用いて行った。得られたPCRフラ
グメントは、KpnIとHindIIIで制限消化した。次に、双方のフラグメントを、Sac
IIとHindIIIで制限消化したpBluescript KS+においてSEQ ID NO: 9に連結した。
この構築で1つの塩基の突然変異を修正するために、鋳型として該構築物を用い
るPCRをプライマーSEQ ID NO: 33と29を用いて行った。得られたPCRフラグメン
トはPstI + EcoRIで制限消化し、ゲルから精製し、次いで、PstIとEcoRIで消化
した誤った構築物に連結した。次に、確認された構築物(SEQ ID NO: 13)を、制
限酵素BspHIとHindIIIを用いてpTrc99aに転移した。
【００８８】N-末端ヒスチジン標識を有するmOPGL[158-316] _P2[256-261]をエンコードするDN A (SEQ ID NO: 15) : 鋳型なしに、プライマーSEQ ID NO: 27及び28を用いてPCRを行った。得られた
PCRフラグメントはPstI及びEcoRIで制限消化し、次いでアガロースゲルから精製
した。次に、得られたフラグメントを、SacIIとHindIIIで制限消化したpBluescr
ipt KS+ においてSEQ ID NO: 9に連結した。確認された構築物(SEQ ID NO: 15)
を、次に、制限酵素BspHI及びHindIIIを用いてpTrc99aに転移した。N-末端ヒスチジン標識を有するmOPGL[158-316] _P2[288-302]をエンコードするDN A (SEQ ID NO: 17) : SEQ ID NO: 9のPCRは、プライマーSEQ ID NO: 22及び29を用いて行った。得ら
れたPCRフラグメントをPstI及び BstBIで制限消化し、次に、アガロースゲルか
ら精製した。SEQ ID NO: 9を鋳型として用いる第二のPCRは、プライマー SEQ ID
NO: 30及びベクター特異的なプライマーを用いて行った。得られたPCRフラグメ
ントはBstBIとKpnIで制限消化し、次いでゲルを精製した。次に、PstIとKpnIで
制限消化したpBluescript KS+ において、双方のフラグメントをSEQ ID NO: 9に
連結した。確認された構築物(SEQ ID NO: 17)を、次に、制限酵素BspHI及び Hin
dIIIを用いてpTrc99aに転移した。
PCRフラグメントはPstI及びEcoRIで制限消化し、次いでアガロースゲルから精製
した。次に、得られたフラグメントを、SacIIとHindIIIで制限消化したpBluescr
ipt KS+ においてSEQ ID NO: 9に連結した。確認された構築物(SEQ ID NO: 15)
を、次に、制限酵素BspHI及びHindIIIを用いてpTrc99aに転移した。N-末端ヒスチジン標識を有するmOPGL[158-316] _P2[288-302]をエンコードするDN A (SEQ ID NO: 17) : SEQ ID NO: 9のPCRは、プライマーSEQ ID NO: 22及び29を用いて行った。得ら
れたPCRフラグメントをPstI及び BstBIで制限消化し、次に、アガロースゲルか
ら精製した。SEQ ID NO: 9を鋳型として用いる第二のPCRは、プライマー SEQ ID
NO: 30及びベクター特異的なプライマーを用いて行った。得られたPCRフラグメ
ントはBstBIとKpnIで制限消化し、次いでゲルを精製した。次に、PstIとKpnIで
制限消化したpBluescript KS+ において、双方のフラグメントをSEQ ID NO: 9に
連結した。確認された構築物(SEQ ID NO: 17)を、次に、制限酵素BspHI及び Hin
dIIIを用いてpTrc99aに転移した。
【００８９】N-末端ヒスチジン標識を有するmOPGL[158-316] _P30[221-241]をエンコードするD NA (SEQ ID NO: 19) : SEQ ID NO: 9のPCRは、プライマー SEQ ID NO: 22 及び23を用いて行った。得
られたPCRフラグメントはSacII及び KpnIで制限消化し、次いでアガロースゲル
から精製した。鋳型としてSEQ ID NO: 9を用いる第二のPCRは、プライマーSEQ I
D NO: 24 及び 31を用いて行った。PCRフラグメントをKpnI と EcoRIで制限消化
し、次いでゲルを精製した。次に、SacIIとEcoRIで消化したpBluescript KS+に
おいて、双方のフラグメントをSEQ ID NO: 9に連結した。次いで、確認された構
築物(SEQ ID NO: 19)を、制限酵素BspHIとHindIIIを用いてpTrc99aに転移した。 これらのOPGLの端を切り取った変異型は大腸菌中で発現し、全ての変異型につ
いて全タンパク質のうちの20％以上を生じる。野生型タンパク質(SEQ ID NO: 9)
についての上記の精製及び再生方法は、さらに改善されるであろう。この方法は
、変異型それぞれに最適な方法を開発する基礎として役立つであろう。ヒスチジ
ン標識を利用する変異型タンパク質の固定化再生は、別の試みで追跡させるであ
ろう。
られたPCRフラグメントはSacII及び KpnIで制限消化し、次いでアガロースゲル
から精製した。鋳型としてSEQ ID NO: 9を用いる第二のPCRは、プライマーSEQ I
D NO: 24 及び 31を用いて行った。PCRフラグメントをKpnI と EcoRIで制限消化
し、次いでゲルを精製した。次に、SacIIとEcoRIで消化したpBluescript KS+に
おいて、双方のフラグメントをSEQ ID NO: 9に連結した。次いで、確認された構
築物(SEQ ID NO: 19)を、制限酵素BspHIとHindIIIを用いてpTrc99aに転移した。 これらのOPGLの端を切り取った変異型は大腸菌中で発現し、全ての変異型につ
いて全タンパク質のうちの20％以上を生じる。野生型タンパク質(SEQ ID NO: 9)
についての上記の精製及び再生方法は、さらに改善されるであろう。この方法は
、変異型それぞれに最適な方法を開発する基礎として役立つであろう。ヒスチジ
ン標識を利用する変異型タンパク質の固定化再生は、別の試みで追跡させるであ
ろう。
【００９０】 あるいは、変異型は、制限酵素を用いてピキア・パストリスの発現ベクター又
はグリコシル化が望ましい際にはPCRを用いて他の酵母発現系に直接転移するこ
とができる。グリコシル化がOPGLの生体内での生物活性に必要でないことは、留
意されるべきである。また、Laceyらに報告されているように、ヒトの293個の線
維芽細胞でも端を切り取ったOPGLを発現することができる。昆虫細胞での発現も
、考えられる(例えば、シュナイダー 2 (S2)細胞系及びベクター系、又はスポド
プテラ・フルギペルダ(SF)の細胞及びベクター系、ともにInvitrogenから入手可
能)。 精製した変異型は、市場で入手可能な抗体がないので、後に用いるウサギでの
抗体産生に検出手段として用いられる。さらに、この物質は、自己ワクチン候補
物の評価に必要な生物学的アッセイで非常に貴重な手段であろう。抗体の製造は
、当該分野で公知の標準的な方法を用いて行われるであろう。
はグリコシル化が望ましい際にはPCRを用いて他の酵母発現系に直接転移するこ
とができる。グリコシル化がOPGLの生体内での生物活性に必要でないことは、留
意されるべきである。また、Laceyらに報告されているように、ヒトの293個の線
維芽細胞でも端を切り取ったOPGLを発現することができる。昆虫細胞での発現も
、考えられる(例えば、シュナイダー 2 (S2)細胞系及びベクター系、又はスポド
プテラ・フルギペルダ(SF)の細胞及びベクター系、ともにInvitrogenから入手可
能)。 精製した変異型は、市場で入手可能な抗体がないので、後に用いるウサギでの
抗体産生に検出手段として用いられる。さらに、この物質は、自己ワクチン候補
物の評価に必要な生物学的アッセイで非常に貴重な手段であろう。抗体の製造は
、当該分野で公知の標準的な方法を用いて行われるであろう。
【００９１】 最良の自己ワクチン候補物の選択は、破骨細胞の成熟/活性化については生体
外アッセイ、又は骨粗鬆症については生体内動物モデルにおける阻害活性の評価
に基づく。有用なアッセイ及びモデル系は、文献に記載されている(例えば、Lac
eyら、Fullerら、及びSimonetら)。 組換えタンパク質の活性は、麻酔をかけていないオスのBalb/Cマウスに100μl
を静脈注射し(マウスkg当たり0、0.1及び1.0 mgタンパク質)、カルシウム飽和ヘ
パリンで被覆した毛細管チューブを用いて主要な眼静脈から血液125μlを1時間
後に回収して分析する。カルシウムレベルは、ICA2 (Radiometer, Denmark)を用
いて測定する。精製し、再生した組換えマウスOPGL (SEQ ID NO: 9)は、イオン
化カルシウムの循環レベルを10％まで増すことによって、このアッセイで反応性
である。
外アッセイ、又は骨粗鬆症については生体内動物モデルにおける阻害活性の評価
に基づく。有用なアッセイ及びモデル系は、文献に記載されている(例えば、Lac
eyら、Fullerら、及びSimonetら)。 組換えタンパク質の活性は、麻酔をかけていないオスのBalb/Cマウスに100μl
を静脈注射し(マウスkg当たり0、0.1及び1.0 mgタンパク質)、カルシウム飽和ヘ
パリンで被覆した毛細管チューブを用いて主要な眼静脈から血液125μlを1時間
後に回収して分析する。カルシウムレベルは、ICA2 (Radiometer, Denmark)を用
いて測定する。精製し、再生した組換えマウスOPGL (SEQ ID NO: 9)は、イオン
化カルシウムの循環レベルを10％まで増すことによって、このアッセイで反応性
である。
【００９２】 自己ワクチン候補物は、例えば自己ワクチン注射をし、次いで、マウスへの組
換えmOPGLの注入による末梢血液へのイオン化カルシウムの放出阻害のモニター
を用いて評価される(Burgessらにより記載されているとおり)。 修飾OPGLに代わるものとして、抗-OPGL抗体のイディオタイプに指向する抗イ
ディオタイプ抗体も、この発明の範囲内で有用な免疫原として役立つであろうこ
とが留意される。同様に、例えば、捕捉(catching)プローブとして抗-OPGL又は
オステオプロテゲリンを用いるファージディスプレイ系で単離され得るミモタイ
プ(mimotypic)ポリペプチドの使用も、この発明の免疫原の一部として考慮され
る。
換えmOPGLの注入による末梢血液へのイオン化カルシウムの放出阻害のモニター
を用いて評価される(Burgessらにより記載されているとおり)。 修飾OPGLに代わるものとして、抗-OPGL抗体のイディオタイプに指向する抗イ
ディオタイプ抗体も、この発明の範囲内で有用な免疫原として役立つであろうこ
とが留意される。同様に、例えば、捕捉(catching)プローブとして抗-OPGL又は
オステオプロテゲリンを用いるファージディスプレイ系で単離され得るミモタイ
プ(mimotypic)ポリペプチドの使用も、この発明の免疫原の一部として考慮され
る。
【００９３】 参考文献 1. Bucay, N.ら、(1998), Genes Dev. 12, 1260-1268 2. Lacey, D. L. ら、(1998), Cell 93, 165-176 3. Marks, S. C., Jr. (1989), Am. J. Med. Genet. 34, 43-53 4. Simonet, W. S.ら、(1997), Cell 89, 309-319 5. Fuller, K.ら、(1998), J. Exp. Med. 188, 997-1001 6. Burgess, T. L.ら、(1999), J. Cell Biol. 145, 527-538 7. Pedersen J ら、(1999) Protein Expr. Purif. 15, 389-400
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年７月３１日（２０００．７．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 19/10 ４Ｃ０８５ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 19/10 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８７ Ｃ０７Ｋ 14/705 1/19 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 35/76 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｋｏｇｌｅ Ａｌｌｅ ６，ＤＫ−2970 Ｈｏｒｓｈｏｌｍ ＤＥＮＭＡＲＫ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CA18 CA19 CB01 CB17 CB20 CB21 DA36 DA77 FB03 4B024 AA01 BA31 CA04 DA02 DA05 DA11 HA01 4B064 AG31 BH07 BH09 CA19 CE06 CE07 DA01 4B065 AA91Y AA93Y AB01 CA24 CA45 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA02 BA03 BA07 BA08 BA22 BA23 BA44 CA53 CA56 DA53 NA14 ZA972 4C085 AA02 AA03 AA13 AA14 BB11 DD01 DD61 DD62 DD63 FF24 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA97 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 NA01 NA14 ZA97 4H045 AA11 AA30 BA10 CA40 DA86 EA31 FA74 GA10 GA15 GA22
Claims (56)
- 【請求項１】 - OPGLポリペプチド又はそのサブ配列での動物の免疫化がO
PGLポリペプチドに対する抗体の産生を誘導するよう系統立てられている、少な
くともひとつのOPGLポリペプチド又はそのサブ配列、及び/又は - OPGL類似体を用いる動物の免疫化で、結果としてOPGLポリペプチドに対する
抗体の産生を誘導する少なくともひとつの修飾がOPGLアミノ酸配列に誘導されて
いる、少なくともひとつのOPGL類似体 の免疫原性的に有効な量をヒトを含む動物の免疫系に提示することからなる、動
物におけるオステオプロテゲリンリガンド(OPGL)活性を生体内でダウン-レギュ
レートする方法。 - 【請求項２】 OPGLアミノ酸配列の少なくともひとつの修飾を用いてOPGL類
似体が提示される請求項１による方法。 - 【請求項３】 修飾により、結果としてOPGL B-細胞エピトープの実質的フ
ラクションが保持され、 - 少なくともひとつの外来Tヘルパーリンパ球エピトープ(THエピトープ)を導入
し、及び/又は - 少なくともひとつの第一分子を導入し、それにより抗原提示細胞(APC)又はB-
リンパ球に修飾分子の標的化をもたらし、及び/又は - 少なくともひとつの第二分子を導入し、それにより免疫系を刺激し、及び/又
は - 少なくともひとつの第三分子を導入し、それにより免疫系への修飾OPGLポリ
ペプチドの提示を最適化する 請求項２による方法。 - 【請求項４】 修飾が、OPGL又はそのサブ配列における適切な化学基への共
有的もしくは非共有的な結合による側基として、外来THエピトープ及び/又は第
一及び/又は第二及び/又は第三の分子の導入を含む請求項３による方法。 - 【請求項５】 修飾が、アミノ酸の置換及び/又は欠失及び/又は挿入及び/
又は付加を含む請求項３又は４による方法。 - 【請求項６】 修飾により融合ポリペプチドが提示される請求項５による方
法。 - 【請求項７】 アミノ酸の置換及び/又は欠失及び/又は挿入及び/又は付加
の導入により、OPGLの全体的な三次構造が実質的に保持される請求項５又は６に
よる方法。 - 【請求項８】 修飾が、少なくともひとつのOPGL B-細胞エピトープの複製
及び/又はハプテンの導入を含む請求項２〜７のいずれか１つによる方法。 - 【請求項９】 外来T-細胞エピトープが動物で免疫優勢である請求項３〜８
のいずれか１つによる方法。 - 【請求項１０】 外来T-細胞エピトープが乱交雑である請求項３〜９のいず
れか１つによる方法。 - 【請求項１１】 少なくともひとつの外来T-細胞エピトープが、天然の乱交
雑T-細胞エピトープ及び人為的なMHC-II結合ペプチド配列から選択される請求項
１０による方法。 - 【請求項１２】 天然のT-細胞エピトープが、P2又はP30のような破傷風ト
キソイドエピトープ、ジフテリアトキソイドエピトープ、インフルエンザウイル
ス血球凝集素エピトープ及びピー・ファルシパルム CSエピトープから選択され
る請求項１１による方法。 - 【請求項１３】 第一分子が、ハプテン、又はB-リンパ球もしくはAPCへの
受容体がある炭水化物のような、B-リンパ球の特異的な表面抗原又はAPC特異的
な表面抗原に実質的に特異的な結合パートナーである請求項３〜１２のいずれか
１つによる方法。 - 【請求項１４】 第二分子が、サイトカイン、ホルモン及び熱ショックタン
パク質から選択される請求項３〜１３のいずれか１つによる方法。 - 【請求項１５】 サイトカインが、インターフェロンγ(IFN-γ)、Flt3L、
インターロイキン1(IL-1)、インターロイキン2(IL-2)、インターロイキン4(IL-4
)、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン12(IL-12)、インターロイキン1
3(IL-13)、インターロイキン15(IL-15)及び顆粒球-マクロファージコロニー刺激
因子(GM-CSF)から選択されるか又はその有効な部分であり、かつ熱ショックタン
パク質が、HSP70、HSP90、HSC70、GRP94ならびにカルレチクリン(CRT)から選択
されるか又はその有効な部分である請求項６による方法。 - 【請求項１６】 第三分子が、パルミトイル基、ミリスチル基、ファルネシ
ル基、ゲラニル-ゲラニル基、GPIアンカー及びN-アシルジグリセライド基のよう
な脂質の性質である請求項３〜１５のいずれか１つによる方法。 - 【請求項１７】 OPGLポリペプチド又はそのサブ配列が、位置170-192のい
ずれか1つ、位置198-218のいずれか1つ、位置221-246のいずれか1つ、位置256-2
61のいずれか1つ又は位置285-316のいずれか1つ(アミノ酸番号はSEQ ID No: 4、
6及び12のいずれか１つの番号による)で修飾されるか、又はOPGLポリペプチドが
、位置171-193のいずれか1つ、位置199-219のいずれか1つ、位置222-247のいず
れか1つ、位置257-262のいずれか1つ、又は位置286-317のいずれか1つ(アミノ酸
番号はSEQ ID NO: 2の番号による)で修飾される前記請求項のいずれか１つによ
る方法。 - 【請求項１８】 修飾が、同等又は異なる長さであって外来のTHエピトープ
を含むアミノ酸配列で、請求項１７に定義する位置内における少なくともひとつ
のアミノ酸配列を置換することからなる請求項１７による方法。 - 【請求項１９】 外来のTHエピトープを含むアミノ酸配列が、SEQ ID NO: 4
にみられるアミノ酸256-261及び/又は288-302及び/又は221-241、又はSEQ ID NO
: 2もしくはCys-221に相当するシステインをSerで置換しているタンパク質にみ
られるアミノ酸257-262及び/又は289-303及び/又は222-243を置換している請求
項１８による方法。 - 【請求項２０】 免疫系への提示が、OPGLポリペプチド、そのサブ配列、又
は抗原決定基の多コピーを提示し得る担体分子に共有的に又は非共有的に結合し
ている修飾OPGLポリペプチドのコピーを少なくとも2つ有することによってもた
らされる前記請求項のいずれかひとつによる方法。 - 【請求項２１】 OPGLポリペプチド、そのサブ配列、又は修飾OPGLポリペプ
チドが、自己抗原に対する自己耐性の破壊を容易にするアジュバントとともに製
剤化される前記請求項のいずれかによる方法。 - 【請求項２２】 OPGLポリペプチド又はOPGL類似体の有効量が、真皮内、真
皮下、表皮内、表皮下及び筋肉内のような非経口的経路；腹膜経路；経口経路；
口腔経路；舌下経路；硬膜外経路；脊髄経路；肛門経路；及び頭蓋内経路から選
択される経路を介して動物に投与される前記請求項のいずれかひとつによる方法
。 - 【請求項２３】 有効量が、OPGLポリペプチド、そのサブ配列又はその類似
体の0.5μg〜2000μgである請求項２２による方法。 - 【請求項２４】 OPGLのポリペプチド又は類似体が、仮想リンパ節(VLN)装
置に含有される請求項２２又は２３による方法。 - 【請求項２５】 修飾OPGLの免疫系への提示が、修飾OPGLをエンコードする
核酸を動物の細胞に導入し、それにより、核酸が導入された細胞を生体内で発現
させて成される請求項１〜２１のいずれか１つによる方法。 - 【請求項２６】 導入される核酸が、裸のDNA、荷電又は非荷電の脂質で製
剤化したDNA、リポソーム中に製剤化したDNA、ウイルスベクターに含めたDNA、
トランスフェクション-促進タンパク質又はポリペプチドで製剤化したDNA、標的
タンパク質又はポリペプチドで製剤化したDNA、カルシウム沈降剤で製剤化したD
NA、不活性担体分子と結合したDNA、キチン又はキトサンで被包化したDNA、及び
アジュバントで製剤化したDNAから選択される請求項２５による方法。 - 【請求項２７】 核酸が、VLN装置に含有される請求項２７による方法。
- 【請求項２８】 一年当たりに少なくとも1回の投与/導入、例えば少なくと
も2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも6回及び少なくとも12回の投
与/導入を含む請求項２２〜２７のいずれか１つによる方法。 - 【請求項２９】 少なくとも3％、少なくとも7％、少なくとも9％、少なく
とも11％、少なくとも13％、少なくとも15％、少なくとも17％、少なくとも20％
及び少なくとも30％の低下のような、骨再吸収速度が著しく低下するような程度
に、請求項１〜２８のいずれか１つの方法によるOPGL活性をダウン-レギュレー
トすることからなる、骨粗鬆症又は過剰な骨再吸収で特徴づけられる他の疾患及
び症状の治療及び/又は予防及び/又は改善方法。 - 【請求項３０】 修飾が導入されており、類似体での動物の免疫化で結果と
してOPGLポリペプチドに対する抗体産生が誘導される、動物OPGLポリペプチドか
ら誘導されるOPGL類似体。 - 【請求項３１】 修飾が請求項１〜１９のいずれか１つに定義される請求項
３０によるOPGL類似体。 - 【請求項３２】 免疫原性組成物であって、 - 動物中の自己OPGLポリペプチドの免疫原性的に有効な量からなり、該OPGLポ
リペプチドがOPGLポリペプチドに対する動物の自己耐性を破壊するように免疫学
的に許容されるアジュバントとともに製剤化されており、該組成物は、医薬的か
つ免疫学的に許容される担体及び/又はビヒクルをさらに含み、又は - 請求項３０又は３１によるOPGL類似体の免疫原性的に有効な量からなり、該
組成物は、医薬的かつ免疫学的に許容される担体及び/又はビヒクル、任意にア
ジュバントをさらに含む、 組成物。 - 【請求項３３】 請求項３０又は３１によるOPGL類似体をエンコードする核
酸フラグメント。 - 【請求項３４】 請求項３３による核酸フラグメントを有するベクター。
- 【請求項３５】 自律複製しうる請求項３４によるベクター。
- 【請求項３６】 プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ-染色体及びウイ
ルスからなる群から選択される請求項３４又は３５によるベクター。 - 【請求項３７】 5’→3’方向及び操作可能な連鎖において、請求項３３に
よる核酸フラグメントの発現を駆動するためのプロモーター、任意にポリペプチ
ドフラグメントの分泌又は膜中への組み込みを可能にするリーダーペプチドをエ
ンコードする核酸配列、請求項３３による核酸フラグメント、及び任意に転写終
結区を含む請求項３４〜３６のいずれか１つによるベクター。 - 【請求項３８】 宿主細胞に導入される際に、宿主細胞ゲノムに組み込むこ
とができるか、又は組み込むことができない請求項３４〜３７のいずれか１つに
よるベクター。 - 【請求項３９】 プロモーターが真核細胞及び/又は原核細胞での発現を駆
動する請求項３７又は３８によるベクター。 - 【請求項４０】 請求項３４〜３９のいずれか１つのベクターを有する形質
転換細胞。 - 【請求項４１】 請求項３３による核酸フラグメントを複製しうる請求項４
０による形質転換細胞。 - 【請求項４２】 細菌、酵母、原生生物から選択される微生物、又は真菌、
S2もしくはSF細胞のような昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞から選択される
多細胞生物由来細胞である請求項４１による形質転換細胞。 - 【請求項４３】 請求項３３による核酸フラグメントを発現する請求項４０
〜４２のいずれか１つによる形質転換細胞。 - 【請求項４４】 請求項３０又は３１によるOPGL類似体を分泌するか、又は
その表面に有する請求項４３による形質転換細胞。 - 【請求項４５】 免疫系への提示が、OPGLポリペプチド又は類似体をエンコ
ードし、発現する核酸フラグメントを有する非病原性微生物もしくはウイルスを
投与することによってなされる請求項１〜１９のいずれか１つによる方法。 - 【請求項４６】 - 請求項３３による核酸フラグメント又は請求項３４〜
３９のいずれか１つによるベクター、及び - 医薬的かつ免疫学的に許容される担体及び/又はビヒクル及び/又はアジュバ
ント からなる、OPGLに対する抗体産生を誘導する組成物。 - 【請求項４７】 請求項３４〜３９のいずれか１つによるベクターを有し、
かつ請求項３３による核酸フラグメントを発現し、任意に請求項３０もしくは３
１によるOPGL類似体を分泌するか、もしくはその表面に有する安定な細胞系。 - 【請求項４８】 請求項３３による核酸フラグメント又は請求項３４〜３９
のいずれか１つによるベクターで宿主細胞を形質転換することからなる、請求項
４０〜４４のいずれか１つによる細胞の製造方法。 - 【請求項４９】 - ペプチド合成又は遺伝子工学技術によって、動物種のO
PGLポリペプチドのアミノ酸配列にアミノ酸を付加し、挿入し、配列からアミノ
酸を欠失させ、又は配列にアミノ酸を置換する相互に異なる修飾OPGLポリペプチ
ドのセットを製造し、それによって、動物種に外来のT-細胞エピトープからなる
セットにおいてアミノ酸配列を生じさせるか、又は相互に異なる修飾OPGLポリペ
プチドのセットをエンコードする核酸フラグメントを製造し、 - 非修飾OPGLに対する動物種による抗体産生の誘導能力について、修飾OPGLポ
リペプチド又は核酸フラグメントのセットのメンバーを試験し、かつ - その種において非修飾OPGLに対する抗体産生を著しく誘導する修飾OPGLポリ
ペプチドのセットのメンバーを同定して、任意に単離するか、又はその動物種に
おける非修飾OPGLポリペプチドに対する抗体産生を著しく誘導する核酸フラグメ
ントのセットのメンバーによってエンコードされるポリペプチド発現産物を同定
して、任意に単離する ことからなる、非修飾OPGLポリペプチドが自己タンパク質である動物種にお
ける、非修飾OPGLに対する抗体を誘導し得る修飾OPGLポリペプチドの同定方法。 - 【請求項５０】 - ペプチド合成又は遺伝子工学技術によって、動物種のO
PGLポリペプチドのアミノ酸配列にアミノ酸を付加し、挿入し、配列からアミノ
酸を欠失させ、又は配列にアミノ酸を置換する相互に異なる修飾OPGLポリペプチ
ドのセットを製造し、それによって、動物に外来のT-細胞エピトープからなるセ
ットにおいてアミノ酸配列を生じさせ、 - 非修飾OPGLに対する動物種による抗体産生の誘導能力について、セットのメ
ンバーを試験し、かつ - OPGLと反応性である動物種において抗体産生を著しく誘導するセットのメン
バーを、医薬的かつ免疫学的に許容される担体及び/又はビヒクルと混合し、任
意に医薬的かつ免疫学的に許容される少なくともひとつのアジュバントと組合わ
せる ことからなる、非修飾OPGLポリペプチドが自己タンパク質である動物種にお
いて、非修飾OPGLに対する抗体を誘導できる少なくともひとつの修飾OPGLポリペ
プチドからなる免疫原性組成物の製造方法。 - 【請求項５１】 セットのメンバーの製造が、各配列が請求項３３による核
酸配列である相互に異なる核酸配列の製造、該核酸配列の適当な発現ベクターへ
の挿入、適当な宿主細胞のベクターでの形質転換、及び核酸配列の発現、任意に
その後の発現産物の単離からなる請求項４９又は５０による方法。 - 【請求項５２】 核酸配列及び/又はベクターの製造が、PCRのような分子増
幅技術又は核酸合成によってなされる請求項５１による方法。 - 【請求項５３】 動物でOPGL活性をダウンレギュレートするアジュバントか
らなる免疫原性組成物を製造するためのOPGL又はそのサブ配列の使用。 - 【請求項５４】 骨粗鬆症又は過剰な骨再吸収によって特徴付けられる他の
症状の治療、予防もしくは改善用のアジュバントからなる免疫原性組成物を製造
するためのOPGL又はそのサブ配列の使用。 - 【請求項５５】 任意に、動物でOPGL活性をダウンレギュレートするアジュ
バントからなる免疫原性組成物を製造するためのOPGL類似体の使用。 - 【請求項５６】 任意に、骨粗鬆症又は過剰な骨再吸収によって特徴付けら
れる他の症状の治療、予防もしくは改善用のアジュバントからなる免疫原性組成
物を製造するためのOPGL類似体の使用。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA199801164 | 1998-09-15 | ||
| US10289698P | 1998-10-02 | 1998-10-02 | |
| US199801164 | 1998-10-02 | ||
| US60/102,896 | 1998-10-02 | ||
| PCT/DK1999/000481 WO2000015807A1 (en) | 1998-09-15 | 1999-09-13 | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002525060A true JP2002525060A (ja) | 2002-08-13 |
| JP2002525060A5 JP2002525060A5 (ja) | 2006-11-02 |
Family
ID=26065320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000570334A Pending JP2002525060A (ja) | 1998-09-15 | 1999-09-13 | オステオプロテゲリンリガンド活性をダウンレギュレートする方法 |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6645500B1 (ja) |
| EP (1) | EP1114166B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002525060A (ja) |
| KR (1) | KR100671036B1 (ja) |
| CN (1) | CN1318105A (ja) |
| AT (1) | ATE291628T1 (ja) |
| AU (1) | AU754971B2 (ja) |
| CA (1) | CA2343654A1 (ja) |
| CZ (1) | CZ2001789A3 (ja) |
| DE (1) | DE69924392T2 (ja) |
| EE (1) | EE200100149A (ja) |
| ES (1) | ES2239457T3 (ja) |
| HK (1) | HK1040261A1 (ja) |
| HR (1) | HRP20010188A2 (ja) |
| HU (1) | HUP0103578A3 (ja) |
| ID (1) | ID28386A (ja) |
| IL (2) | IL141588A0 (ja) |
| NO (1) | NO20011304L (ja) |
| NZ (1) | NZ510508A (ja) |
| PL (1) | PL196790B1 (ja) |
| PT (1) | PT1114166E (ja) |
| SK (1) | SK3062001A3 (ja) |
| TR (1) | TR200100737T2 (ja) |
| WO (1) | WO2000015807A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009273466A (ja) * | 2001-06-26 | 2009-11-26 | Amgen Fremont Inc | Ｏｐｇｌへの抗体 |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL132304A0 (en) * | 1997-04-16 | 2001-03-19 | Amgen Inc | Osteoprotegerin binding proteins and receptors |
| US6316408B1 (en) * | 1997-04-16 | 2001-11-13 | Amgen Inc. | Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors |
| IL141588A0 (en) * | 1998-09-15 | 2002-03-10 | M & E Biotech As | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity |
| GB9908263D0 (en) * | 1999-04-13 | 1999-06-02 | Binding Site The Limited | Eliciting improved immune responses |
| WO2000067777A1 (en) * | 1999-05-07 | 2000-11-16 | Biofan Pty Ltd | A method of prophylaxis and treatment and agents useful therefor |
| US6673771B1 (en) | 1999-07-28 | 2004-01-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of inhibiting osteoclast activity |
| DE60043346D1 (de) * | 1999-07-28 | 2009-12-31 | Univ Pennsylvania | Methoden zur hemmung der aktivität der osteoklasten |
| WO2001023559A1 (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Eli Lilly And Company | Osteoclast differentiation factor regulatory region |
| AUPQ314799A0 (en) * | 1999-09-29 | 1999-10-21 | University Of Western Australia, The | Bone cell factor |
| SK287468B6 (sk) * | 2000-02-21 | 2010-10-07 | H. Lundbeck A/S | Použitie analógu autológneho Aß alebo APP polypeptidu živočícha, analóg, fragment nukleovej kyseliny, vektor, transformovaná bunka, bunková línia a kompozície |
| KR100879810B1 (ko) * | 2000-02-21 | 2009-01-22 | 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 | 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법 |
| AU3868001A (en) † | 2000-02-23 | 2001-09-03 | Amgen Inc | Antagonistic selective binding agents of osteoprotegerin binding protein |
| US20030103978A1 (en) * | 2000-02-23 | 2003-06-05 | Amgen Inc. | Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein |
| JP2003534022A (ja) * | 2000-05-26 | 2003-11-18 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | Ｒａｎｋリガンド介在障害の治療に有用な抗−ｒａｎｋリガンドモノクローナル抗体 |
| JP2004520011A (ja) * | 2000-08-21 | 2004-07-08 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | Ｒａｎｋリガンド介在障害の治療において有用な抗−ｒａｎｋリガンドモノクローナル抗体 |
| WO2002024228A1 (fr) * | 2000-09-21 | 2002-03-28 | Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. | Méthode de régulation de la formation d'ostéoclastes |
| MXPA03002443A (es) | 2000-09-22 | 2004-12-06 | Immunex Corp | Ensayos de clasificacion para agonistas o antagonistas del activador receptor de nf-kb. |
| US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
| EP1385532A4 (en) * | 2001-03-22 | 2004-12-15 | Barnes Jewish Hospital | STIMULATION OF THE OSTEOGENESIS WITH RANG-LIGAND FUSION PROTEINS |
| EP1377610A2 (en) | 2001-04-03 | 2004-01-07 | Société des Produits Nestlé S.A. | Osteoprotegerin in milk |
| MY144532A (en) * | 2001-08-20 | 2011-09-30 | Lundbeck & Co As H | Novel method for down-regulation of amyloid |
| US20030109444A1 (en) * | 2001-10-12 | 2003-06-12 | Jonathan Lam | Bone anti-resorptive compounds |
| JP4336467B2 (ja) * | 2001-10-15 | 2009-09-30 | 株式会社林原生物化学研究所 | 破骨細胞形成抑制因子の産生を調節し得る物質のスクリーニング方法 |
| JP2005530482A (ja) | 2002-01-04 | 2005-10-13 | ゼンコー・インコーポレイテッド | ドミナントネガティブタンパク質およびそれらの用法 |
| EP1560843A4 (en) * | 2002-01-04 | 2006-09-06 | Xencor Inc | NEW VARIANTS OF RANKL PROTEIN |
| US7381792B2 (en) | 2002-01-04 | 2008-06-03 | Xencor, Inc. | Variants of RANKL protein |
| CA2481074A1 (en) * | 2002-04-05 | 2003-10-23 | Amgen Inc. | Human anti-opgl neutralizing antibodies as selective opgl pathway inhibitors |
| US6921538B2 (en) * | 2002-05-10 | 2005-07-26 | Allergan, Inc. | Therapeutic treatments for neuropsychiatric disorders |
| WO2004052233A2 (en) | 2002-12-10 | 2004-06-24 | Schering-Plough Ltd. | Canine rankl and methods for preparing and using the same |
| CN1960752A (zh) * | 2004-06-02 | 2007-05-09 | 赛托斯生物技术公司 | 非人类tnf－肽的载体偶联物的医药用途 |
| US20080107597A1 (en) * | 2006-01-12 | 2008-05-08 | Anaptys Biosciences, Inc. | Isolation of antibodies that cross-react and neutralize rankl originating from multiple species |
| WO2008088594A2 (en) * | 2007-01-12 | 2008-07-24 | Anaptysbio, Inc. | Isolation of antibodies that cross-react and neutralize rankl orginating from multiple species |
| CN101434656B (zh) * | 2007-11-16 | 2011-12-14 | 首都医科大学 | Opg-hsp70融合蛋白的制备方法及用途 |
| EP3029061B1 (en) * | 2008-06-18 | 2017-09-13 | The Texas A&M University System | Mesenchymal stem cells, compositions, and methods for treatment of cardiac tissue damage |
| WO2011128892A2 (en) * | 2010-04-12 | 2011-10-20 | Protea Vaccine Technologies Ltd. | Modified forms of pneumococcal surface immunogenic protein b (psipb) |
| CN107286245B (zh) * | 2016-04-11 | 2021-10-08 | 北京普纳生物科技有限公司 | Pd-l1和pd-l2重组蛋白及其用途 |
| CN107286244B (zh) * | 2016-04-11 | 2021-10-08 | 北京普纳生物科技有限公司 | 抗免疫检查点pd-l1和pd-l2肿瘤疫苗 |
| CN108498786A (zh) * | 2018-02-13 | 2018-09-07 | 南昌大学第二附属医院 | 载骨保护素的缓释纳米粒及其制备方法和应用 |
| KR102154637B1 (ko) * | 2018-11-12 | 2020-09-10 | 조선대학교산학협력단 | Rankl의 돌연변이체, 및 이를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
| WO2024054566A1 (en) * | 2022-09-07 | 2024-03-14 | The Regents Of The University Of California | Treatment of cancer by blockade of osteoprotegerin |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5196512A (en) * | 1989-11-10 | 1993-03-23 | Eniricerche S.P.A. | Synthetic peptides useful as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates and their use in the development of synthetic vaccines |
| JPH09505031A (ja) * | 1993-08-26 | 1997-05-20 | モーリトセン・アンド・エルスナー・エー／エス | 外来ｔ−細胞エピトープを補助として用いた、自己タンパク質に対する抗体応答の誘発 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995005879A1 (en) | 1993-08-27 | 1995-03-02 | The Dow Chemical Company | Process for the separation of enantiomers |
| AU7353094A (en) * | 1994-04-01 | 1995-10-23 | University Of Utah, The | Molecular cloning and expression of a gamma-interferon inducible activator of the proteasome |
| US6340459B1 (en) * | 1995-12-01 | 2002-01-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients |
| US6369027B1 (en) * | 1995-12-22 | 2002-04-09 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
| DE69738811D1 (de) * | 1996-12-13 | 2008-08-14 | Schering Corp | Oberflächenantigene aus Säugern |
| DE69738841D1 (de) * | 1996-12-23 | 2008-08-28 | Immunex Corp | Ligand für rezeptor aktivator of nf-kappa b, ligand ist mitglied der tnf superfamilie |
| IL132304A0 (en) * | 1997-04-16 | 2001-03-19 | Amgen Inc | Osteoprotegerin binding proteins and receptors |
| US5843678A (en) * | 1997-04-16 | 1998-12-01 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin binding proteins |
| IL141588A0 (en) * | 1998-09-15 | 2002-03-10 | M & E Biotech As | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity |
-
1999
- 1999-09-13 IL IL14158899A patent/IL141588A0/xx unknown
- 1999-09-13 ID IDW20010822A patent/ID28386A/id unknown
- 1999-09-13 ES ES99942778T patent/ES2239457T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-13 HU HU0103578A patent/HUP0103578A3/hu unknown
- 1999-09-13 CN CN99810872A patent/CN1318105A/zh active Pending
- 1999-09-13 DE DE69924392T patent/DE69924392T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-09-13 KR KR1020017003379A patent/KR100671036B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-09-13 EE EEP200100149A patent/EE200100149A/xx unknown
- 1999-09-13 PT PT99942778T patent/PT1114166E/pt unknown
- 1999-09-13 SK SK306-2001A patent/SK3062001A3/sk not_active Application Discontinuation
- 1999-09-13 AT AT99942778T patent/ATE291628T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-09-13 JP JP2000570334A patent/JP2002525060A/ja active Pending
- 1999-09-13 PL PL346698A patent/PL196790B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-09-13 CZ CZ2001789A patent/CZ2001789A3/cs unknown
- 1999-09-13 EP EP99942778A patent/EP1114166B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-13 WO PCT/DK1999/000481 patent/WO2000015807A1/en active IP Right Grant
- 1999-09-13 TR TR2001/00737T patent/TR200100737T2/xx unknown
- 1999-09-13 CA CA002343654A patent/CA2343654A1/en not_active Abandoned
- 1999-09-13 AU AU56173/99A patent/AU754971B2/en not_active Ceased
- 1999-09-13 NZ NZ510508A patent/NZ510508A/en unknown
- 1999-09-15 US US09/396,937 patent/US6645500B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-02-22 IL IL141588A patent/IL141588A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-03-14 HR HR20010188A patent/HRP20010188A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2001-03-14 NO NO20011304A patent/NO20011304L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-01-08 HK HK02100128.3A patent/HK1040261A1/zh unknown
-
2003
- 2003-09-17 US US10/664,801 patent/US20040115199A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5196512A (en) * | 1989-11-10 | 1993-03-23 | Eniricerche S.P.A. | Synthetic peptides useful as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates and their use in the development of synthetic vaccines |
| JPH09505031A (ja) * | 1993-08-26 | 1997-05-20 | モーリトセン・アンド・エルスナー・エー／エス | 外来ｔ−細胞エピトープを補助として用いた、自己タンパク質に対する抗体応答の誘発 |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| JPN6009055699, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ, 199805, Ｖｏｌ．２４６，Ｎｏ．２, ｐ３３７−３４１ * |
| JPN6009055701, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ, 199805, Ｖｏｌ．２４６，Ｎｏ．１, ｐ１９９−２０４ * |
| JPN6009055702, Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, 199803, Ｖｏｌ．９５，Ｎｏ．７, ｐ３５９７−３６０２ * |
| JPN6009055703, Ｃｅｌｌ, 199804, Ｖｏｌ．９３，Ｎｏ．２, ｐ１６５−１７６ * |
| JPN6009055704, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ, 199806, Ｖｏｌ．２４７，Ｎｏ．３, ｐ６１０−６１５ * |
| JPN6009055705, Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ, 199804, Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．４, ｐ４３１−４３５ * |
| JPN6009055706, Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｐｄａｔｅ, 1997, Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４, ｐ３０１−３１０ * |
| JPN6009055708, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, 1992, Ｖｏｌ．１４９，Ｎｏ．２, ｐ７１７−７２１ * |
| JPN6009055710, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, 1994, Ｖｏｌ．１５２，Ｎｏ．６, ｐ２９２１−２９２９ * |
| JPN6009055712, Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, 1989, Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１２, ｐ２２３７−２２４２ * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009273466A (ja) * | 2001-06-26 | 2009-11-26 | Amgen Fremont Inc | Ｏｐｇｌへの抗体 |
| JP2012153701A (ja) * | 2001-06-26 | 2012-08-16 | Amgen Fremont Inc | Ｏｐｇｌへの抗体 |
| JP2012229236A (ja) * | 2001-06-26 | 2012-11-22 | Amgen Fremont Inc | Ｏｐｇｌへの抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ510508A (en) | 2005-05-27 |
| DE69924392D1 (de) | 2005-04-28 |
| NO20011304L (no) | 2001-05-15 |
| HRP20010188A2 (en) | 2002-04-30 |
| HUP0103578A3 (en) | 2005-11-28 |
| AU5617399A (en) | 2000-04-03 |
| EP1114166A1 (en) | 2001-07-11 |
| EE200100149A (et) | 2002-08-15 |
| CA2343654A1 (en) | 2000-03-23 |
| PL346698A1 (en) | 2002-02-25 |
| DE69924392T2 (de) | 2006-03-09 |
| CZ2001789A3 (cs) | 2001-08-15 |
| ID28386A (id) | 2001-05-17 |
| PT1114166E (pt) | 2005-08-31 |
| NO20011304D0 (no) | 2001-03-14 |
| HK1040261A1 (zh) | 2002-05-31 |
| KR20010085807A (ko) | 2001-09-07 |
| CN1318105A (zh) | 2001-10-17 |
| IL141588A (en) | 2008-07-08 |
| IL141588A0 (en) | 2002-03-10 |
| EP1114166B1 (en) | 2005-03-23 |
| ES2239457T3 (es) | 2005-09-16 |
| KR100671036B1 (ko) | 2007-01-18 |
| ATE291628T1 (de) | 2005-04-15 |
| SK3062001A3 (en) | 2002-02-05 |
| WO2000015807A1 (en) | 2000-03-23 |
| TR200100737T2 (tr) | 2001-07-23 |
| HUP0103578A2 (hu) | 2002-01-28 |
| AU754971B2 (en) | 2002-11-28 |
| US20040115199A1 (en) | 2004-06-17 |
| US6645500B1 (en) | 2003-11-11 |
| PL196790B1 (pl) | 2008-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1114166B1 (en) | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity | |
| US7070784B1 (en) | Method for down-regulating GDF-8 activity using immunogenic GDF-8 analogues | |
| AU2006312847A1 (en) | Therapeutic vaccines targeting HMGB1 | |
| US20070184023A1 (en) | Method for down-regulation of vegf | |
| US20020172673A1 (en) | Method for down-regulating IgE | |
| JP2005518194A (ja) | 乱交雑ｔ細胞エピトープ挿入物を有するマルチマータンパク質の免疫原性擬態物 | |
| US20080253993A1 (en) | Immunogenic Egfr Peptides Comprising Foreign T Cell Stimulating Epitope | |
| ZA200403686B (en) | Immunogenic mimetics of multimer proteins with promiscuous T cell epitope inserts | |
| WO2009003889A2 (en) | Immunogenic analogues of rankl | |
| JP2007523605A (ja) | 細胞毒性が低減された免疫原性ヒトＴＮＦαアナログおよびそれらの製造方法 | |
| EP1541587A2 (en) | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity | |
| HALKIER et al. | Sommaire du brevet 2343654 | |
| HALKIER et al. | Patent 2343654 Summary | |
| EA006940B1 (ru) | Применение opgl и его аналогов для отрицательной регуляции opgl в организме животного |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060911 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060911 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091104 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100622 |