CZ2001789A3 - Způsob pro in vivo inhibici aktivity ligandu pro osteoprotegerin - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká zlepšeni terapie a prevence osteoporosy a jiných onemocněni charakterizovaných pokračující ztrátou kostní tkáně. Přesněji, předkládaný vynález poskytuje způsob pro snížení aktivity ligandu osteoprotegerinu (OPGL) umožněním produkce protilátek proti OPGL u jedinců trpících osteoporosou nebo rizikových z hlediska osteoporosy. Předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro produkci modifikovaných OPGL použitelných v tomto způsobu, stejně jako modifikovaných OPGL jako takových. Předkládaný vynález také zahrnuje fragmenty nukleových kyselin kódující takové modifikované OPGL, stejně jako vektory inkorporující tyto fragmenty nukleových kyselin a hostitelské buňky a buněčné linie transformované těmito vektory. Vynález také poskytuje způsob pro identifikaci analogů OPGL, které jsou použitelné ve způsobu podle předkládaného vynálezu, stejně jako prostředků obsahujících modifikované OPGL nebo obsahujících nukleové kyseliny kódující analogy OPGL.

Dosavadní stav techniky

Osteoporosa je významný a narůstající zdravotnický problém ve světě. Postihuje přibližně 75 milionů lidí ve Spojených Státech Amerických, Evropě a Japonsku. Proto se jedná o nej častější systémové onemocnění kostí v průmyslových zemích.

Osteoporosa postihuje jednu ze čtyř žen po menopauze a většinu žen ve stáří, včetně významného počtu mužů. Náklady na osteoporosu ve Spojených Státech Amerických s 15 miliony • · · · • ·· ·· ···

postižených byly v roce 1984 vyčísleny na 3,8 bilionu USD.

Extrapolací lze odhadovat náklady ve světě na přibližně 20 bilionů USD.

Osteoporosa je systémové onemocnění skeletu charakterizované ztrátou kostní hmoty a zhoršením mikroarchitektury kostní tkáně, s následným zvýšením křehkosti kostí a náchylnosti k frakturám. Ačkoliv jsou postiženy všechny kosti, jsou nejčastějšími frakturami fraktura páteře, zápěstí a kyčle. Riziko vzniku osteoporosy se zvyšuje s věkem a je vyšší u žen než u mužů. Zdá se, že etiologie spočívá v mechanismu, který je základem zrychlení normální ztráty kostní hmoty, ke které dochází v menopause u žen a ke které dochází u všech jedinců s pokračujícím stárnutím.

Vrcholu množství kostní hmoty je dosaženo v přibližně 35 letech věku. Po dosažení vrcholu se množství kostní hmoty snižuje v důsledku nerovnováhy v remodelování. Z kostí se ztrácí jak minerální, tak organická matrix, ale zůstává zachována její základní organizace.

Kost se skládá z mineralizované extracelulární matrice složené z různých proteinů a proteoglykanů; základní složkou je kolagen typu I. Minerálem obsaženým v extracelulární matrici je hydroxyapatit (Ca3 (ΡΟ₄) 2.Ca(OH)2) . Kost se nepřetržitě modeluje během růstu a vývoje a remodeluje se během života v reakci na fyzikální a chemické signály.

Růst, vývoj a udržování kostí jsou značně regulovanými procesy, které na buněčné úrovni zahrnuji koordinovanou regulaci buněk vytvářejících kost (osteoblastů) a buněk resorbujicích kost (osteoklastů). Množství kostní hmoty odráží rovnováhu mezi tvorbou a resorpcí kosti.

Osteoblasty vznikají z mezenchymových kmenových buněk a produkují kostní matrici během vývoje, po poranění kosti a během normální remodelace kosti, ke které dochází během života. Osteoklasty se diferencují z hematopoetických prekursorů monocytární-makrofágové linie a resorbují kostní matrici.

Nerovnováha mezi funkcí osteoblastů a osteoklastů může vést ke vzniku skeletální abnormalit charakterizovaných zmnožením kostní hmoty (osteopetrosa) nebo úbytkem kostní hmoty (osteoporosa).

Studie osteopetrosy na mutantních myší prokázaly, že genetické defekty ve vývoji, zrání a/nebo aktivaci osteoklastů vedou ke snížení resorpce kosti a uniformně k těžké osteopetrose (Marks, 1989). Nicméně, relativně málo je dosud známo o solubilních faktorech, které za fyziologického stavu regulují vývoj osteoklastů.

Nedávno byly charakterizovány dva proteiny, které se účastní této regulace (Simonet et al., 1997; Lacey et al., 1998). Těmito dvěma proteiny jsou osteoprotegerin a ligand osteoprotegerinu.

Osteoprotegerin je nový secernovaný člen rodiny receptoru pro faktor nekrosy nádorů. In vitro blokuje osteoprotegerin osteoklastogenesi způsobem závislým na dávce. Transgenní myši exprimující osteoprotegerin vykazují generalizované zvýšení hustoty kostí (osteopetrosu) asociovanou se snížením osteoklastů. Podání rekombinantního osteoprotegerinu vyvolává podobné účinky u normálních myší a chrání proti úbytku kostní hmoty indukovaného ovarektomií u krys (Simonet et al., 1997).

Dále, u osteoprotegerin-deficientních myši (knock-outované myši), které jsou normální v době porodu, se časně vyvíjí osteoporosa a arteriální kalcifikace (Bucay et al., 1998). Tato pozorování ukazují na možnost, že osteoprotegerin blokuje diferenciaci osteoklastů, základního, pokud ne jediného typu buněk resorbujících kost, což naznačuje, že může účinkovat jako humorální regulátor resorpce kosti. Osteoprotegerin je předmětem WO 97/23614.

Předpokládá se, že osteoprotegerin může vykazovat svůj účinek vazbou na a neutralizací faktoru, který stimuluje vývoj osteoklastů, a takto může inhibovat zrání osteoklastů (Simonet et al., 1997).

Ligand pro osteoprotegerin (OPGL) je člen cytokinové rodiny faktoru nekrosy nádorů a existuje jak v solubilní formě, tak ve formě vázané na membránu. OPGL se váže na osteoprotegerin s vazebnou afinitou 4 nM. In vitro aktivuje OPGL zralé osteoklasty a moduluje tvorbu osteoklastů z prekursorů kostní dřeně za přítomnosti CSF-1. Také bylo demonstrováno, že OPGL se váže na povrch progenitorů osteoklastů v kostní dřeni ošetřené CSF-1. Receptor pro OPGL na těchto hematopoetických progenitorových buňkách je, nicméně, neznámý. Rekombinantní solubilní OPGL je silným induktorem resorpce kosti in vivo (Lacey et al., 1998).

Popis OPGL

OPGL je syntetizován jako transmembránový protein II typu skládající se z 317 aminokyselin (lidský, SEQ ID NO: 2) nebo z 316 aminokyselin (myší, SEQ ID NO: 4 a 6). Přiřazení těchto dvou aminokyselinových sekvencí ukazuje, že identické aminokyselinové zbytky se nacházejí v 87% homologních pozic.

Aminokyselinová sekvence OPGL obsahuje krátkou cytoplasmatickou doménu na N-konci, po které následuje domnělý transmembránový region mezi aminokyselinovými zbytky 49 a 69. Podle jeho homologie s faktorem nekrosy nádorů a se předpokládalo, že extracelulárni část ÓPGL by se měla skládat ze dvou domén; stopkového regionu v rozsahu od aminokyselinového zbytku 70 až 157 a aktivní ligandové skupiny v rozsahu od aminokyselinového zbytku 158 do C-konce.

Nejvíce příbuzným proteinem k OPGL se zdá být cytokin indukující apoptosu - TRAIL - s méně než 25% identických aminokyselinových zbytků. OPGL byl také nedávno klonován v jiné souvislosti a byl označen jako TRANCE (Wong et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 25190-25194) a RANKL, v příslušném pořadí (Anderson et al., 1997, Nátuře 390: 175-179. Protein je také známý jako osteoklastový diferenciační faktor (ODF).

Několik N-koncových delečních variant myšího oPGL bylo exprimováno v E: coli a přečištěno. Tyto varianty se skládaly z aminokyselinových zbytků 75-316, 128-316, 137-316 a 158-316, v příslušném pořadí. Tři nej kratší varianty měly podobnou strukturu β-listu podle analýz cirkulárního dichroismu a všechny byly schopny vazby na osteoprotegerin. Významnější je, že tyto tři varianty byly aktivní v testech in vitro (Lacey et al., 1998) .

Nejkratší varianta byla studována dále. Podobně jako faktor nekrosy nádorů a existuje tato varianta OPGL v roztoku jako trimer a tvoří 3:3 komplexy při inkubaci s osteoprotegerinem. Bylo zjištěno, že vazebný afinita je 4 nM. Tato varianta indukuje významné zvýšení ionizovaného vápníku v krvi (hyperkalcemii) u myší in vivo. Současné podání osteoprotegerinu významně redukuje tento hyperkalcemický efekt

OPGL.

Nejdelší varianta (aminokyselinové zbytky 75-316) OPGL se neváže na osteoprotegerin a nemá žádnou biologickou aktivitu.

V době konstrukce N-koncových delečnich variant nebylo přirozené štěpící místo v OPGL známo. Exprese kompletního OPGL v lidských 293 fibroblastech vedla ke vzniku solubilního OPGL začínajícího aminokyselinovým zbytkem 139 myšího proteinu nebo homologním aminokyselinovým zbytkem 140 v lidském proteinu. Tyto expresní studie také ukázaly, že solubilní OPGL vzniklý expresí v lidských buňkách je glykosylovaný. Toto není překvapivé, protože jak myší, tak lidský OPGL-obsahuji tři potenciální glykosylační místa v C-koncové ligandové doméně.

Koncentrace osteoprotegerinu v krvi a ve tkáních nejsou známé, ale protein má významnou biologickou aktivitu v koncentracích 1 ng/ml.

Biologická aktivita OPGL

OPGL je účinný diferenciační faktor pro osteoklasty při kombinaci s CSF-1. Ani jedna z těchto složek není samostatně schopna indukovat diferenciaci osteoklastů z progenitorových buněk.

OPGL je účinný aktivátor zralých osteoklastů. Sám o sobě aktivuje OPGL zralé osteoklasty k resorpci kosti. Nebylo pozorováno, že by OPGL působil jako růstový faktor pro osteoklasty nebo jako faktor podporující přežívání osteoklastů v těchto pokusech.

• ··

·♦ 99 9

9

999

999

Nezdá se, že by bylo působeni OPGL omezeno druhově, protože myši OPGL také indukuje tvorbu osteoklastů v kulturách lidských mononukleárnich buněk periferní krve.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí nové terapie proti stavům charakterizovaným nadměrnou resorpcí kostí, jako je osteoporosa. Další předmětem je vývoj autovakcíny proti OPGL, za účelem nové terapie osteoporosy a dalších patologických onemocnění charakterizovaných nadměrnou resorpcí kosti.

Zjistili jsme, že data uvedená výše ukazují na patofyziologickou úlohu OPGL. Důkaz in vivo je částečný nebo nepřímý, ale podle našeho názoru významný, zejména v kombinaci s přímým důkazem.

Pozorování, že injekce rekombinantní C-koncové domény OPGL myším vede k těžké hyperkalcemii podle našeho názoru ukazuje přímo na patofyziologickou úlohu.

Nepřímý důkaz pochází od osteoprotegerin-deficientních myší (knock-outovaných myší), které jsou normální v době porodu a u kterých se časně vyvíjí osteoporosa. Toto ukazuje, že odstranění proteinu, který se váže na OPGL a neutralizuje jeho účinky, vede k osteoporose. Domníváme se, že nejpravděpodobnější příčinou je zvýšené zrání a aktivace osteoklastů způsobené OPGL.

Dvěma dalšími nepřímými důkazy je to, že jak u myší transgenních pro osteoprotegerin, tak u myší, kterým se podal injekčně osteoprotegerin, se vyvinula osteopetrosa. Toto ukazuje, že nepřirozeně vysoké koncentrace proteinu, který váže OPGL a neutralizuje jeho účinky, vedou ke vzniku osteopetrosy. Předpokládáme, že toto má důsledek ve sníženém zrání a aktivaci osteoklastů, což je způsobeno neutralizací OPGL.

Proto navrhujeme model, ve kterém OPGL a osteoprotegerin působí jako pozitivní a negativní regulátory vývoje osteoklastů, v příslušném pořadí. Jinými slovy, OPGL podporuje resorpci kosti, zatímco osteoprotegerin inhibuje resorpci kosti.

Proto může být, vzhledem k osteoporose, OPGL považován za patogenní činidlo, které podporuje resorpci kosti, která nakonec vede k osteoporose. Obdobně, osteoprotegerin může být považován za terapeutické činidlo, které působí proti patogennímu činidlu neutralizací jeho účinků.

Proto navrhujeme inhibici diferenciace/zrání/tvorby osteoklastů a aktivace osteoklastů pomocí produkce protilátek schopných neutralizovat OPGL in vivo, což je bezpečný a účinný prostředek pro léčbu/zmírnění a/nebo prevenci osteoporosy a jiných onemocnění charakterizovaných nadměrnou resorpci kosti ve srovnání s rychlostí tvorby kosti.

Proto, v nej širším a nejobecnějším aspektu, předkládaný vynález spočívá ve způsobu pro in vivo inhibici aktivity ligandu pro osteoprotegerin (OPGL) u zvířete, včetně člověka, kde uvedený způsob zahrnuje účinnou prezentaci imunologicky účinného činidla imunitnímu systému živočicha, kde uvedené činidlo je vybráno z

- alespoň jednoho OPGL polypeptidu nebo jeho subsekvence, které byly připraveny tak, že imunizace živočicha OPGL polypeptidem nebo jeho subsekvencí indukuje produkci protilátek proti OPGL polypeptidu; a/nebo

- alespoň jednoho analogu OPGL obsahujícího modifikaci OPGHL polypeptidu, kde imunizace živočicha analogem indukuje tvorbu protilátek proti OPGL polypeptidu.

Nejzajímavějším aspektem tohoto přístupu je to, že například osteoporosa může být kontrolována periodickými, ale ne příliš častými imunizacemi, což je v protikladu s jinými terapeutickými postupy, které vyžadují časté (například denní) podávání osteoprotegerinu nebo molekul majících vazebnou afinitu k analogům OPGL. Předpokládá se, že 1-4 injekce za rok imunogenního prostředku budou dostatečné pro získání požadovaného účinku, zatímco podávání osteoprotegerinu nebo jiných inhibitorů aktivity OPGL bude vyžadovat denní podávání.

Vynález se také týká analogů OPGL, stejně jako fragmentů nukleových kyselin kódujících tyto analogy. Vynález také zahrnuje imunogenní prostředky obsahující analogy nebo fragmenty nukleových kyselin.

Vynález se také týká způsobu pro identifikaci analogů OPGL, stejně jako přípravy prostředků obsahujících analogy OPGL.

Nakonec se vynález týká způsobu pro léčbu osteoporosy a jiných onemocnění charakterizovaných nadměrnou resorpcí kostí, který zahrnuje podání non-OPGL molekuly (obvykle protilátky), která blokuje interakci mezi OPGL a jeho receptorem na osteoklastech.

Podrobný popis vynálezu

• ··	··	·· · ·	• ·
·· ·	• ·	•	* · ·
• · ·♦	• ·	• ··	• ·
• · ·	• · ·	•	• · ·
• · ·	• ·	•	• ·
• · · · ·	··	• · ·	• · ·

Definice

Následující termíny použité v předkládaném vynálezu a patentových nárocích budou definovány a podrobně vysvětleny pro jednoznačné pochopení vynálezu.

Termín T-lymfocyty označuje lymfocyty původem z thymu, které jsou odpovědná za různé buňkami zprostředkované imunitní reakce, stejně jako za pomocnou aktivitu v humorální imunitní reakci. Obdobně, termín B-lymfocyty označuje lymfocyty produkující protilátky.

Termín OPGL polypeptid označuje polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci výše uvedených OPGL proteinů získaných od lidí nebo od myší (nebo jejich zkrácené formy bez významné části epitopů pro B-lymfocyty s intaktním OPGL), ale také polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci identickou k analogům těchto dvou proteinů izolovaným z jiných druhů. Termín zahrnuje také neglykosylované formy OPGL, které jsou připraveny v prokaryotickém systému, stejně jako formy mající jiný charakter glykosylace způsobený, například, použitím kvasinkových nebo jiných než savčích eukaryotických expresních systémů. Je třeba poznamenat, že termín OPGL polypeptid označuje polypeptid, který je za normálních okolností neimunogenni, je-li přítomen u léčeného zvířete. Jinými slovy, OPGL polypeptid je vlastní protein nebo analog takového vlastního proteinu, který normálně nevyvolává imunitní odpověď proti OPGL u daného zvířete.

OPGL analog je OPGL polypeptid, jehož primární struktura byla změněna. Takovou změnou může být, například, fúze OPGL polypeptidu na vhodného fúzního partnera (tj. změna primární struktury zahrnující výlučně C- a/nebo N-koncové adice

99 99 9·9·99

9 · 9 9 9 99

9999 9 9999 99

9 9 9 9 9 9 99

999 99 ·9 999 99999 aminokyselinových zbytků) a/nebo může změnou být inserce a/nebo delece a/nebo substituce v aminokyselinové sekvenci OPGL polypeptidu. Termín také zahrnuje derivatizované OPGL molekuly, jak je uvedeno dále v části týkající se modifikací OPGL.

Je třeba poznamenat, že pro vyvoláni požadované imunity proti OPGL u člověka je představitelné použití vakcín tvořených xeno-analogy (například psími nebo prasečími analogy) lidského OPGL. Takové použití xeno-analogů pro imunizaci tvoří také část předkládaného vynálezu.

Termín polypeptid, jak je zde použit, označuje jak krátké peptidy od 2 do 10 aminokyselinových zbytků, oligopeptidy od 11 do 100 aminokyselinových zbytků a polypeptidy vetší než 100 aminokyselinových zbytků. Dále termín také zahrnuje proteiny, tj. funkční biomolekuly složené alespoň z jednoho polypeptidu; pokud obsahují dva polypeptidy, tak mohou tyto polypeptidy vytvářet komplexy, mohou být kovalentně navázané nebo mohou být nekovalentně navázané. Polypeptidy v proteinu mohou být glykosylované a/nebo lipidované a/nebo mohou obsahovat prostetické skupiny.

Termín subsekvence označuje jakýkoliv nepřetržitý řetězec alespoň 3 aminokyselin, nebo - pokud je to relevantní alespoň 3 nukleotidů, které jsou odvozeny přímo od přirozené aminokyselinové sekvence OPGL nebo od sekvence nukleových kyselin OPGL, v příslušném pořadí.

Termín živočich označuje živočicha jakéhokoliv druhu (výhodně savce), jako je Homo sapiens, Canis domesticus, atd., a ne jenom jediné zvíře. Nicméně, termín také označuje populaci takových živočišných druhů, protože je důležité, že ·« ···· jedinci imunizovaní způsobem podle předkládaného vynálezu mají všichni v podstatě stejný OPGL umožňující imunizaci živočichů stejným imunogenem. Pokud, například, existují v různých lidských populacích genetické variace OPGL, může být nezbytné použít v takových odlišných populacích různé imunogeny, aby bylo možno překonat autotoleranci k OPGL v každé populaci. Odborníkům v oboru bude jasné, že živočich je žijící jedinec, který má imunitní systém. Je výhodné, aby byl živočichem obratlovec, jako je savec.

Termín inhibice aktivity OPGL in vivo označuje snížení počtu interakcí mezi OPGL a jeho (neznámým) receptorem (nebo mezi OPGL a jinými významnými vazebnými partnery pro tuto molekulu) v živém organismu. Inhibice může být dosaženo různými mechanismy; z nich je nejjednodušší prostá interference s aktivním místem v OPGL vazbou protilátky. Nicméně, předkládaný vynález také zahrnuje to, že vazba protilátky vede k odstranění OPGL fagocytujičími buňkami (jako jsou makrofágy a jiné fagocytující buňky).

Výraz dosažení prezentace ... imunitnímu systému označuje to, že imunitní systém zvířete je podroben kontrolovanému působení imunogenu. Jak bude jasné z následující diskuse, takové působení imunogenu může být provedeno různými způsoby, z nichž nejvýznamnější je vakcinace farmaceutickými prostředky obsahujícími polypeptid (tj. vakcínami, které jsou podávány pro léčbu nebo zmírnění existujícího onemocnění) nebo vakcinace nukleovými kyselinami. Důsledkem tohoto postupu je to, že imunokompetentní buňky zvířete jsou konfrontovány s antigenem imunologicky účinným způsobem, zatímco přesný způsob pro dosažení tohoto výsledku je méně významný vzhledem k předmětu předkládaného vynálezu.

• ♦ · • · 4 ···	• 4 ···· • · · • 4 4 4 4	·· • 4 • ·	• 4
♦ · 44	44 ···	• 4	• ·

Termín imunologicky účinné množství má význam obvyklý v oboru, tj. označuje množství imunogenu, které může indukovat imunitní odpověď , která významně postihuje patogenní činidlo, které sdílí imunologické rysy s imunogenem.

Termín modifikace OPGL označuje chemickou modifikaci polypeptidů, který tvoří skelet OPGL. Takovou modifikací může být například derivatizace (například alkylace) některých aminokyselinových zbytků v sekvenci OPGL, ale jak bude jasné z následujícího popisu, výhodnou modifikací je změna primární struktury aminokyselinové sekvence OPGL.

Termínem autotolerance k OPGL se míní to, že protože je OPGL vlastním proteinem ve vakcinované populaci, neudržuje se u normálních jedinců v populaci imunitní reakce proti OPGL; nelze vyloučit, že někteří jedinci v populaci živočichů mohou být schopni produkovat protilátky proti přirozenému OPGL, například v rámci autoimunitních onemocnění. Zvíře bude obvykle autotolerantní vzhledem k vlastnímu OPGL, ale nemůže být vyloučeno, že analogy OPGL z jiného druhu nebo z populace mající jiný OPGL fenotyp, budou také tolerovány uvedeným zvířetem.

Termín cizorodý T-lymfocytární epitop je peptid, který je schopen vazby na MHC molekulu a který stimuluje T-lymfocyty u živočicha. Výhodnými cizorodými T-lymfocytárními epitopy v předkládaném vynálezu jsou promiskuitní epitopy, tj. epitopy, které se váží na významnou frakci určité třídy MHC molekul v živočišném druhu nebo populaci. Je znám pouze velmi omezený počet takových promiskuitních T-lymfocytárních epitopů a tyto jsou podrobněji popsány dále. Je třeba poznamenat, že aby byly imunogeny použité ve způsobu podle předkládaného vynálezu účinné v co největší frakci živočišné populace, je ♦ ·· 9« 9999 99 9 ·· · · · · · 9 99 ···· · ···· · 9 φ •••99 9 9 9 9 9 9 ····· 9 9·φ ·· · ·9 99 999 99 »99 nutné: (1) insertovat několik cizorodých T-lymfocytárnich epitopů ve stejné analogu OPGL; (2) připravit několik analogů OPGL, kde každý analog má insertovaný jiný promiskuitní epitop. Je třeba si uvědomit také to, že koncept cizorodých ΤΙ ymf ocytárnich epitopů také zahrnuje použití kryptických Tlymfocytárních epitopů, tj . epitopů, které jsou odvozeny od vlastního proteinu a které se chovají imunogenně pouze tehdy, existují-li v izolované formě bez spojení s daným vlastním proteinem.

Cizorodý T-helper lymfocytární epitop je cizorodý Tlymfocytární epitop, který se váže na molekulu MHC třídy II a který může být prezentován na povrchu buňky prezentující antigen (APC) navázaný na molekulu MHC třídy II.

Termín funkční část (bio)molekuly označuje v předkládaném vynálezu část molekuly, která je odpovědná za alespoň jeden biochemický nebo fyziologický efekt molekuly. V oboru je dobře známo, že mnoho enzymů a jiných efektorových molekul má aktivní místo, které je odpovědné za efekty dané molekuly. Jiné části molekuly mohou sloužit pro stabilizaci nebo zesílení rozpustnosti a mohou být proto vynechány, pokud tyto funkce nejsou významné pro některá provedení předkládaného vynálezu, například je možné použít některé cytokiny jako modifikující skupiny v PGL (viz podrobná diskuse dále) a v takovém případě může být otázka stability irelevantní, protože vazba na OPGL dodává nutnou stabilitu.

Termín adjuvans má svůj obvyklý význam v oboru vakcinací, tj. označuje substanci nebo kompozici, která je (1) sama neschopná vyvolávat specifickou imunitní odpověď proti imunogenu ve vakcině, ale která, nicméně, (2) je schopna zesilovat imunitní reakci proti imunogenu. Jinými slovy,

• ··	99	9999	99
·	•	9	9	9	9 ·
9 999	9	9	9 9»	9	•
9 9 9	9 9	9	9	9 9	9
9 9 9	9	9	9		9
99 · «4	99		999	• ·	9

vakcinace adjuvans samotným nevyvolává imunitní reakci proti imunogenu, vakcinace imunogenem může a nemusí vyvolat imunitní reakci proti imunogenu, ale kombinované vakcinace imunogenem a adjuvans indukuje imunitní reakci proti imunogenu, která je silnější než reakce indukovaná imunogenem samotným.

Termín zacílení molekuly označuje situaci, ve které se molekula po podání zvířeti objeví přednostně v některých tkáních nebo je přednostně asociována s některými buňkami nebo typy buněk. Tohoto může být dosaženo mnoha způsoby, včetně přípravy molekuly v prostředku usnadňujícím zacílení nebo vložení skupin usnadňujících zacílení do molekuly. Tyto možnosti budou podrobněji probrány dále.

Stimulace imunitního systému označuje to, že daná substance nebo prostředek vykazuje obecný, nespecifický imunostimulační efekt. Mnoho adjuvans a domnělých adjuvans (jako jsou některé cytokiny) má schopnost stimulovat imunitní systém. Výsledkem použití imunostimulačního činidla je zvýšená pozornost imunitního systému, což znamená, že simultánní nebo následná imunizace imunogenem indukuje významně účinnější imunitní reakci ve srovnání s izolovaným použitím imunogenu.

Výhodná provedení inhibice aktivity OPGL

Je výhodné, aby byl OPGL polypeptid použitý jako imunogen ve způsobu podle předkládaného vynálezu byla modifikovaná molekula, ve které je v aminokyselinové sekvenci OPGL přítomna alespoň jedna změna, protože tímto způsobem je značně zlepšena šance na získání úplného-významného překonání autotolerance proti OPGL. Je třeba uvést, že toto nevylučuje možnost použití takových modifikovaných OPGL v prostředcích, které dále usnadňují překonání autotolerance proti OPGL, například v prostředcích obsahujících adjuvans.

•		··	····	··	9
	•	• 9	•	• ·	99
. ·	999	• *	···	• ·	9
*	• ·	• · ·	•	• · 9	9
•	• ·	• ·	•	9 9	9
	>4	·*	<·*	99	999

Bylo prokázáno (v Dalum I, et al.

1996, J. Immunol. 157:

4796-4804), že potenciálně autoreaktivní B-lymfocyty rozpoznávající vlastní proteiny jsou fyziologicky přítomny u normálních jedinců. Nicméně, proto, aby byly tyto B-lymfocyty indukovány pro skutečnou tvorbu protilátek reaktivních s relevantními vlastními proteiny, je nutná asistence Tpomocných lymfocytů produkujících cytokiny (Th~lymfocytů). Normálně není tato asistence poskytnuta, protože T-lymfocyty obecně nerozpoznávají T-lymfocytární epitopy odvozené od vlastních proteinů, jsou-li prezentovány buňkami prezentujícími antigen (APC). Nicméně, dodáním cizorodosti vlastnímu proteinu (tj. vložením imunologicky významné modifikace) je možno dosáhnout aktivace T-lymfocytů rozpoznávajících cizorodý element na APC (jako jsou, prvotně, mononukleární buňky). Polyklonální B-lymfocyty (které jsou také APC) schopné rozpoznávání vlastních epitopů na modifikovaných vlastních proteinech také internalizuji antigen a následně prezentují jeho cizorodý T-lymfocytární epitop a aktivované T-lymfocyty následně dodávají cytokiny těmto polyklonálním B-lymfocytům reaktivním s vlastními proteiny. Protože jsou protilátky produkované těmito polyklonálními Blymfocyty reaktivní s různými epitopy na modifikovaném polypeptidu, včetně těch, které jsou také přítomny v přirozeném polypeptidu, indukuje se tvorba protilátek zkříženě reaktivních s nemodifikovaným vlastním proteinem. Nakonec mohou být aktivovány T-lymfocyty, pokud populace polyklonálních B-lymfocytů rozpoznává zcela cizorodý antigenem ačkoliv pouze insertovaný epitop je cizorodý pro hostitele. Tímto způsobem jsou indukovány protilátky zkříženě reaktivní s nemodifikovanými vlastními antigeny.

• · · · •·· · « ·

V oboru je známo několik způsobů pro modifikaci vlastního peptidového antigenu pro překonání autotolerance. Podle předkládaného vynálezu modifikace mohou zahrnovat:

- vložení alespoň jednoho cizorodého T-lymfocytárního antigenu, a/nebo

- vložení alespoň jedné první skupiny, která zaměřuje modifikovanou molekulu na buňky prezentující antigen (APC), a/nebo

- vložení alespoň jedné druhé skupiny, která stimuluje imunitní systém, a/nebo

- vložení alespoň jedné třetí skupiny, která optimalizuje prezentaci modifikovaného OPGL polypeptidu imunitnímu systému.

Nicméně, všechny tyto modifikace by měly být prováděny za zachování významné frakce původních B-lymfocytárních epitopů v OPGL, protože takto je zesíleno rozpoznávání přirozených molekul B-lymfocyty.

V jednom výhodném provedení jsou kovalentně nebo nekovalentně vloženy vedlejší skupiny (ve formě cizorodých T~ lymfocytárních epitopů nebo výše uvedených prvních, druhých a třetích skupin). To znamená, že řetězce aminokyselinových zbytků z OPGL jsou derivatizovány bez alterace primární aminokyselinové sekvence,nebo alespoň bez změn v peptidových vazbách mezi jednotlivými aminokyselinami v řetězci.

Alternativní, a výhodné, provedení využívá aminokyselinové substituce a/nebo delece a/nebo inserce a/nebo adice (které mohou být provedeny rekombinantními technikami nebo peptidovou syntézou; modifikace, které postihují delší řetězce aminokyselin, mohou způsobovat vznik fúzních polypeptidů).

• 44

Jednou speciální verzí tohoto provedení je technika popsaná ve WO 95/05849, která popisuje metodu pro inhibici vlastních proteinů imunizací analogy vlastních proteinů, kde určitý počet aminokyselinových sekvencí byl substituován odpovídajícím počtem aminokyselinových sekvencí, které každá obsahovaly cizorodý imunodominantní T-iymfocytárni epitop, za současného zachování celkové terciární struktury vlastního proteinu v analogu. Pro účely předkládaného vynálezu je nicméně dostatečné, pokud modifikace (kterou je inserce, adice, delece nebo substituce) vede ke vzniku cizorodého Tlymfocytárního epitopu a zároveň zachovává významný počet Blymfocytárních epitopů v OPGL. Nicméně, pro dosažení maximální účinnosti indukované imunitní reakce je výhodné, aby byla v modifikované molekule zachována celková terciární struktura OPGL.

Následující vzorec popisuje OPGL konstrukty spadající do rozsahu předkládaného vynálezu:

(MODl) S1 (OPGLel) nl (MOD2) s2 (OPGLe2) n2 . . . (MODx) _sx (OPGLex) nx (I) kde OPGLei-OPGLex jsou x B-lymfocytárni epitopy obsahující subsekvence OPGL, které jsou nezávisle identické nebo neidentické a které mohou, ale nemusejí, obsahovat cizorodé vedlejší skupiny, x je celé číslo Ξ>3, nl-nx jsou x celých čísel ú 0 (alespoň 1 je žil) , MODi-MOD_x je x modifikaci vložených mezi konzervované B-lymfocytárni epitopy a si~s_x je x celých čísel, z nichž jedno je > 1, pokud nejsou v OPGL_e sekvencích vloženy žádné vedlejší skupiny). Proto za podmínky zachování imunogenicity konstruktu umožňuje předkládaný vynález všechny permutace původní OPGL sekvence a všechny druhy její modifikace. Vynález tedy zahrnuje modifikované OPGL získané vynecháním částí OPGL sekvence, které, například, vykazují nežádoucí účinky in vivo, nebo vynecháním částí, které jsou za normálních okolností intracelulárně a proto mohou způsobovat nežádoucí imunologické reakce.

Zachování významné frakce B-lymfocytárních epitopů nebo I celkové terciární struktury proteinu, který je modifikován způsobem zde popsaným, může být dosaženo několika způsoby. Je možno připravit polyklonální antisérum namířené proti OPGL (například antisérum připravené u králíků) a potom použít toto antisérum jako testovací činidlo (například v kompetitivní ELISA) proti produkovaným modifikovaným proteinů. Modifikované verze (analogy), které reagují ve stejném rozsahu s antisérem jako OPGL, mohou být považovány za verze se stejnou celkovou terciární strukturou jako POGL, zatímco analogy vykazující omezenou (ale stále ještě významnou a specifickou) reaktivitu s takovým antisérem mohou být považovány za verze zachovávající si významnou frakci původních B-lymfocytárních epitopů.

Alternativně mohou být připraveny monoklonální protilátky reaktivní s různými epitopy na OPGL a tyto mohou být použity jako testovací panel. Tento přístup je výhodný v tom, že umožňuje (1) mapování epitopů OPGL, a (2) mapování epitopů, které jsou zachovány v připraveném analogu.

Třetím přístupem může být určení 3-rozměrové struktury OPGL nebo jeho biologicky aktivní zkrácené varianty (viz výše) a srovnání této určené troj rozměrové struktury připravených analogů. Troj rozměrová struktura může být určena pomocí rentgenové difrakce a NMR-spektroskopie. Další informace týkající se trojrozměrné struktury mohou být získány z analýz cirkulárního dichroismu, které jsou výhodné v tom, že vyžadují pouze polypeptid v čisté formě (zatímco rentgenová difrakce • ·· ······ ·· ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 · · ··· · · · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 •99 9 9 9 9 · · · 99 99· vyžaduje získáni krystalizovaného polypeptidů a NMR vyžaduje připraveni izotopových variant polypeptidů) pro získání použitelných informací o terciární struktuře dané molekuly. Nicméně, pro získání jednoznačných dat je nakonec nutné provedení rentgenové difrakce a/nebo NMR, protože cirkulární dichroismus poskytuje pouze nepřímé důkazy o správné 3rozměrné struktuře prostřednictvím informací o prvcích sekundární struktury.

V jednom provedení vynález využívá mnohotných prezentací Blymfocytárních epitopů OPGL (tj . sloučenin vzorce I, kde je alespoň jeden B-lymfocytární epitop přítomen ve dvou pozicích). Tohoto může být dosaženo různými způsoby, například jednoduše přípravou fúsních polypeptidů obsahujících strukturu (OPGL)m, kde m je celé číslo > 2, a potom vložením modifikací popsaných výše do alespoň jedné OPGL sekvence. Je výhodné, aby vložené modifikace obsahovaly alespoň jednu duplikaci Blymfocytárního epitopu a/nebo vložení haptenu.

Jak bylo uvedeno výše, vložení cizorodého T-lymfocytárního epitopu může být provedeno vložením alespoň jedné aminokyselinové inserce, adice, delece nebo substituce, samozřejmě, že normální situací bude vložení více než jedné změny aminokyselinové sekvence (například inserce nebo substituce kompletního T-lymfocytárního epitopu), ale významným cílem je to, aby analog OPGL, po zpracování buňkou prezentující antigen (APC), vedl ke prezentaci takového imunodominantního T-lymfocytárního epitopu v kontextu molekuly MHC třídy II na povrchu APC. Proto, pokud aminokyselinová sekvence OPGL obsahuje ve vhodných pozicích počet aminokyselinových zbytků, které se také nacházejí v cizorodém Th epitopu, tak může být vložení cizorodého Th epitopu provedeno dodáním zbývajících aminokyselin cizorodého epitopu • 9 9 9 9 · · · ···

9 9 9 9 9 9 99

9999 9 9999 9· • · · · · · 9 9 99

9 9 9 9 9 99

9 99 99 99 9 999 pomocí aminokyselinových insercí, adicí, delecí a substitucí.

Jinými slovy, není nutné vkládat celý Th epitop insercí nebo delecí pro splnění účelu předkládaného vynálezu.

Je výhodné, aby počet aminokyselinových insercí, delecí, substitucí a adicí byl alespoň 2, například 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 a 25 insercí, substitucí, adicí nebo delecí. Dále je výhodné, aby počet aminokyselinových 25 insercí, substitucí, adicí nebo delecí nepřesáhl 150, například maximálně 100, maximálně 90, maximálně 80 a maximálně 70. Je zejména výhodné, aby počet 25 insercí, substitucí, adicí nebo delecí nepřesáhl 60, zejména 50 nebo 40. nejvýhodnější je, aby tento počet nepřesáhl 30. S ohledem na aminokyselinové adice je třeba uvést, že pokud je výsledný konstrukt ve formě fúsního polypeptidu, tak je jejich počet často významně vyšší než 150.

Výhodná provedení vynálezu zahrnují modifikace vložením alespoň jednoho imunodominantního T-lymfocytárního epitopu. je třeba si uvědomit, že otázka imunodominance T-lymfocytárního epitopu závisí na daném živočišném druhu. Termín imunodominantní, jak je zde použit, označuje epitopy, které u vakcinovaného jedince/populace vedou ve vzniku významné imunitní reakce, ale je dobře známo, že T-lymfocytární epitop, který je imunodominantní u jednoho jedince/populace, nemusí nutně být imunodominantní u jiného jedince stejného druhu, ani když se může vázat na MHC-II molekuly u tohoto druhého jedince. Proto je pro účely předkládaného vynálezu imunodominantním T-lymfocytárním epitopem T-lymfocytární epitop, který může být účinný ve způsobení pomocného působení T-lymfocytů při prezentaci antigenu. typicky mají imunodominantní T-lymfocytární epitopy tu vlastnost, že jsou vždy prezentovány ve vazbě na MHC molekuly třídy li, bez • · · · · · • · · · ohledu na polypeptid, ve kterém se vyskytuji.

Jinou významnou skutečností je MHC restrikce Tlymfocytárních epitopů. Obecně, přirozené T-lymfocytární epitopy jsou MHC restrihované, t.j. některé polypeptidy tvořící T-lymfocytární epitopy se budou účinně vázat pouze na podskupinu MHC molekul třídy II. Toto má nakonec ten efekt, že použití jednoho specifického T-lymfocytárního epitopu povede k zisku složky vakciny, která je účinná pouze u části populace a podle velikosti této frakce může být nutné vložit více Tlymfocytárních epitopů do stejné molekuly, nebo alternativně, připravit vícesložkovou vakcínu, ve které jsou složkami OPGL varianty, které se navzájem liší charakterem vložených Tlymfocytárních epitopů.

Pokud je MHC restrikce použitých T-lymfocytů zcela neznámá (například když má vakcinovaný živočich chabě charakterizované složení MHC), tak může být frakce populace pokrytá specifickým složením vakciny určena podle následujícího vzorce:

- kde pi je frekvence responderů na i-tý cizorodý T~ lymfocytární epitop přítomný ve vakcíně v populaci, a n je celkový počet cizorodých T-lymfocytárních epitopů ve vakcíně. tedy, vakcina obsahující 3 cizorodé T-lymfocytární epitopy mající frekvence odpovědi v populaci 0,8, 0,7 a 0,6 dosáhne odpovědi

0,2 x 0,3 x 0,4

0, 976

t.j. 97,6 % populace bude mít statisticky významnou MHC-II zprostředkovanou reakci na vakcínu.

Výše uvedený vzorec se nedá použít na situace, kdy je znám více nebo méně přesný charakter MHC restrikce použitých peptidu. Pokud se, například, některý peptid váže pouze na lidské MHC II molekuly kódované HLA-DR alelami DR1, DR3, DR5 a DR7, potom použití tohoto peptidu společně s jiným peptidem, který se váže na zbývající MHC-II molekuly kódované HLA-DR alelami, pokryje 100% dané populace. Podobně, pokud se druhý peptid váže pouze na DR3 a DR5, tak přidání tohoto peptidu vůbec nezvýší pokrytí. Pokud se výpočet odpovědi populace založí pouze na MHC restrikci T-lymfocytárních epitopů ve vakcíně, pak může být frakce populace pokrytá specifickou vakcínou stanovena pomocí následujícího vzorce:

kde (pj je součet frekvencí v populaci alelových haplotypů kódujících MHC molekuly, které se váží na jeden z Tlymfocytárních epitopů ve vakcíně a který náleží do j-té skupiny 3 známých HLA lokusů (DP, DR a DQ) ; v praxi se nejprve určí to, která molekula MHC bude rozpoznávat každý Tlymfocytárni epitop ve vakcíně a potom se tyto typizují (DP, DR a DQ) - potom se pro každý typ sečtou jednotlivé frakvence různých uvedených alelových haplotypů, čímž se dosáhne <ρι, φ₂ a Φ3.

Může se stát, že hodnota pi ve vzorci II přesáhne příslušnou teoretickou hodotu 7ti:

Π ο-ύ)² (IV) kde Vj je součet frekvencí frekvencí v populaci alelových haplotypů kódujících MHC molekuly, které se váží na i-tý Tlymfocytární epitop ve vakcíně a který náleží do j-té skupiny známých HLA lokusů (DP, DR a DQ). To znamená, že v 1-πι populaci je frekvence responderů f_residua_i = (ρι-πι) / (l-πι) . Proto může být vzorec III upraven na vzorec V:

kde termín 1-fresiduai-i je nula, pokud je negativní. Je třeba poznamenat, že vzorec V vyžaduje, aby byly všechny epitopy byly haplotypově mapovány proti identické sadě haplotypů.

Proto je při výběru T-lymfocytárních epitopů , které mají být vloženy do analogu OPGL, mít všechny informace o epitopu, které jsou dostupné: (1) frekvenci responderů v populaci pro každý epitop, (2) charakter MHC restrikce a (3) frekvenci relevantních haplotypů v populaci.

Existuje mnoho přirozených promiskuitních Tlymfocytárních epitopů, které jsou aktivní u velké části jedinců živočišného druhu a tyto jsou výhodně použity ve vakcíně, což snižuje potřebu velmi velkého počtu různých analogů OPGL v jedné vakcíně.

Promiskuitní epitop podle předkládaného vynálezu může být přirozený lidský T-lymfocytárni epitop, jako jsou epitopy z tetanického toxoidu (například P2 a P30 epitopy), difterického toxoidu, hemaglutininu chřipkového viru (HA) a CS antigenu P.falciparum.

Během let bylo identifikováno mnoho dalších promiskuitních T-lymfocytárnich epitopů. byly identifikovány hlavně peptidy schopné vazby na velkou frakci HLA.DR molekul kódovaných různými HLA-DR alelami a tyto všechny jsou možnými Tlymfocytárními epitopy pro vložení do analogů OPGL podle předkládaného vynálezu. Viz též epitopy popsané v následujících odkazech: WO 98/23653 (Frazer, IH, et al., University of Queensland); Southwood, S. et al., 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F. et al., 1988, Nátuře 336: 778-780; Chicz, R.M. et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 2747; Hammer, J. et al., 1993, Cell, 74: 197-203; a Falk, K. et al., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Poslední odkaz se týká také HLA.DQ a -DP ligandů. Všechny epitopy uvedené v těchto 5 odkazech jsou relevantní jako kandidáti naq přirozené epitopy použité v předkládaném vynálezu, stejně jako epitopy sdílící společné motivy s těmito epitopy.

Alternativně může být epitopem jakýkoliv artificiální Tlymfocytární epitop, který je schopen vazby na velkou frakci MHC molekul třídy II. Z tohoto hlediska jsou pan-DR epitopové peptidy (PADRE) popsané ve WO 95/07707 a v Alexander, J. et al., 1994, Immunity 1: 751-761 zajímavými kandidáty na epitopy použité v předkládaném vynálezu. Je třeba uvést, že nějúčinější PADRE peptidy popsané v uvedených odkazech obsahují D-aminokyseliny na C- a N-koncích pro zlepšení stability po podání. Nicméně, předkládaný vynález se primárně týká inkorporace relevantních epitopů jako součásti modifikovaného OPGL, který by měl být potom degradován enzymaticky v lysozomovém kompartmentu APC, aby byla umožněna následná prezentace v kontextu MHC-II molekuly a proto se nepředpokládá použití D-aminokysen v epitopech použitých v předkládaném vynálezu.

Jedním zejména výhodným PADRE peptidem je peptid obsahující aminokyselinovou sekvenci AKFVAAWTLKAAA nebo její imunologicky účinnou subsekvenci. Tento a jiné epitopy se stejným chyběním MHC restrikce, jsou výhodnými T~lymfocytárními epitopy , které jsou presentovány v analogách OPGL podle předkládaného • ·· ·· ··♦· ·· · ••9 · · · * · · · ···· · ···· · · · • · ··· 9 9 9 9 9 9 *········ 26 ♦·· ·· ·· ··· ·· ··· vynálezu. Takové super-promiskuitní epitopy umožňují nej jednodušší provedení vynálezu, ve kterém je imunitnímu systému vakcinovaného zvířete prezentován pouze jeden modifikovaný OPGL.

Jak bylo uvedeno výše, modifikace OPGL také zahrnuje vložení první skupiny, která směruje modifikovaný OPGL k APC nebo k B-lymfocytům. První skupinou může být například specifický vazebný partner pro specifický povrchový antigen Blymfocytu nebo pro specifický povrchový antigen APC. V oboru je známo mnoho takových specifických povrchových antigenů. například může být skupinou karbohydrát, pro který existuje receptor na -lymfocytech nebo na APC (například mannan nebo mannosa). Alternativně může být druhou skupinou hapten. Jako první skupina může být také použit fragment protilátky, který rozpoznává povrchovou molekulu na APC nebo lymfocytech (povrchovou molekulou může být například FCy receptor makrofágů nebo monocytů, jako je FCyRI nebo, alternativně, jakýkoli jiný specifický povrchový markér, jako je CD40 nebo CTLA-4). Je třeba uvést, že tyto zaměřovači skupiny mohou být také použity jako součást adjuvans, viz též dále.

Jako alternativa nebo doplněk k zacílení modifikovaného OPGL polypeptidu na některé typy buněk pro dosažení silnější imunitní reakce je možno zvýšit úroveň reaktivity imunitního systému obsažením výše uvedené druhé skupiny, která stimuluje imunitní systém. Typickými příklady takových druhých skupin jsou cytokiny a proteiny teplotního šoku nebo molekulové chaperony, stejně jako jejich účinné části.

Vhodnými cytokiny pro použití v předkládaném vynálezu jsou ty, které normálně působí jako adjuvans ve vakcinačním prostředku, t.j. například interferon y ((IFN-γ), interleukin 1 ((IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 2 ((IL-12), interleukin 13 ((IL—13), interleukin 15 (IL-15) a faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů (GM-CSF); alternativně může být jako druhá skupina použita funkční část cytokinové molekuly. Pro použití takových cytokinů jako adjuvantních substancí viz dále.

Vhodnými proteiny teplotního šoku nebo molekulovými chaperony pro použití jako druhá skupina v předkládaném vynálezu jsou HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 ((též známý jako gp96, viz Wearsch, PA, et al., 1998, Biochemistry 37: 5709-19) a CRT (calretikulin). Alternativně může být druhou skupinou toxin, jako je listeriolycin (LLO), lipid A a termolabilní enterotoxin. Zajímavými možnostmi jsou také různé mykobakteriální deriváty, jako je MDP (muramyldipeptid), CFA (kompletní Freundovo adjuvans) a trehalosové diestery TDM a TDE.

Při provedení předkládaného vynálezu je také významná možnost vložení třetí skupiny, která zlepšuje prezentaci modifikovaného OPGL imunitnímu systému. V oboru existuje několik příkladů tohoto principu, například je známo, že palmitoylová lipidační kotva b proteinu OspA Borrelia burgdorferi může být použita tak, aby poskytovala samoadjuvantní polypeptidy ((viz například WO 96/40718) - zdá se, že lipidované proteiny vytvářejí struktury podobné micelám s jádrem skládajícím se z lipidační kotvy polypeptidů a z něj vyčnívajícími ostatními částmi molekuly, což vede ke znásobení prezentace antigenních determinant. Proto jsou použití těchto a příbuzných přístupů využívajících jiných lipidačních kotvících skupin (například myristylové skupiny, farnesylové skupiny, geranyl-geranylové skupiny, GPI-skupiny a N• ·· ·· ···· ·· ♦ · · · * · · « • ··· · · ··· · · ♦ · · · · · · · « ··· ·· ·· ··· ·» ·»· acyldiglyceridové skupiny) výhodnými provedeními vynálezu, zejména za dodržení podmínky, že taková lipidační kotva v rekombinantně produkovaném proteinu je jednoduchá a vyžaduje pouze použití, například, přirozených signálních sekvencí jako fúsních partnerů pro modifikovaný OPGL polypeptid. Jinou možností je použití C3d fragmentu faktoru C3 komplementu nebo 03 fragmentu samotného (viz Dempsey et al., 1996, Science 271: 480-350 a Lou and Kohler 1998, Nátuře Biotechnology 16: 458-462).

Alternativní provedení vynálezu, které také vede k výhodné prezentaci mnoha (například alespoň 2) kopií významných epitopových regionů OPGL imunitnímu systému, je kovalentní navázání OPGL, jeho subsekvence nebo varianty, na určité molekuly. Například mohou být použity polymery, například uhlovodany jako je dextran, viz například Lees A. et al., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A. et al., 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600, ale mannosa nebo mannan jsou také použitelnými alternativami. Integrální membránové proteiny u, například, E. coli a jiných bakterií, jsou také vhodnými partnery pro konjugaci. Tradiční nosiče, jako je přílipkový hemokyanin (KLH), tetanický toxoid, difterický toxoid a hovězí sérový albumin (BSA), jsou také vhodnými a použitelnými partnery pro konjugaci.

Některé oblasti přirozeného OPGL se zdají být vhodnější pro provedení modifikací. Vzhledem k strukturální podobnosti OPGL s TNF-α a jinými členy rodiny faktoru nekrosy nádorů se předpokládá, že vložení T-lymfocytárních epitopů nebo jiných modifikací v oblastech definovaných pozicemi 170-192, 198-218, 221-246, 256-261 nebo 285-316 (aminokyselinové číslování podle SEQ ID NO: 4, 6 a 12) bude s největší pravděpodobností vést k požadovanému výsledku. Tyto pozice se týkají myšího OPGL 29 • ·· · 4 · · · ··· • 44 · 4 4 4 44 • ··· · 4 444 «4 • · 4 4 4 · ···4 • · 4 4 · 444 ·· · 44 44 444 444 příslušné pozice v lidské molekule jsou 171-193, 199-219, 222247, 257-262 a 286-317 (aminokyselinové číslování podle SEQ ID NO: 2) .

Důvody pro vybrání těchto oblastí jsou (a) zachování známých a předpokládaných B-lymfocytárních epitopů, (b) zachování terciární struktury atd. V jakémkoliv případě je, . jak bylo uvedeno výše, snadné vyšetřovat sadu modifikovaných OPGL molekul, které byly upraveny vložením T-lymfocytárního epitopu do různých míst.

Protože nejvýhodnější provedení předkládaného vynálezu zahrnují inhibicí lidského OPGL, je proto výhodné, aby OPGL polypeptid uváděný výše byl lidský OPGL polypeptid. V tomto provedení je zejména výhodné, aby byl lidský OPGL polypeptid modifikován substitucí alespoň jedné aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO: 2 (nebo v polypeptidů, kde byl Cys-221 v SEQ ID NO: 2 substituován serinem) alespoň jednou aminokyselinovou sekvencí stejné nebo jiné délky a obsahující cizorodý Th epitop. Substituované aminokyselinové zbytky jsou vybrány ze zbytků 257-262, 289-303 a 222-243 v SEQ ID NO: 2. Důvody pro takové konstrukty jsou podrobně popsány v příkladech.

Příprava OPGL a modifikovaných OPGL polypeptidů

Při provádění prezentace OPGL polypeptidů nebo modifikovaného OPGL polypeptidů imunitnímu systému živočicha prostřednictvím jeho podání živočichovi je příprava polypeptidů provedena podle principů obecně známých v oboru.

Příprava vakcín, které obsahují peptidové sekvence jako aktivní složky, je dobře známá v oboru, jak je doloženo například v US patentech 4608251; 4601903; 4599231; 4599230;

4596792 a 4578770, které jsou zde všechny uvedeny jako odkazy. Obvykle jsou takové vakcíny připraveny jako injekční prostředky, buď jako kapalné roztoky nebo suspenze; nebo jako pevné formy vhodné pro rozpuštění nebo suspendování v kapalině před injekčním podáním. Přípravek může být také emulsifikovaný. Aktivní imunogenní složka je často smísena s přísadami, které jsou farmaceuticky přijatelné a kompatibilní s aktivní složkou. Vhodnými přísadami jsou, například, voda, salinický roztok, dextrosa, glycerol, ethanol a podobně, a jejich kombinace. Dále - pokud je to vhodné - může vakcína obsahovat také malá množství pomocných substancí, jako jsou smáčivá nebo zvlhčovači činidla, pH pufrovací činidla nebo adjuvans, která zvyšují účinnost vakcíny; viz podrobný popis adjuvans uvedený dále.

Vakcíny jsou obvykle podány parenterálně, injekcí, například subkutánní, intrakutánní, intradermální, subdermální nebo intramuskulární. Další prostředky, které jsou vhodné pro jiné způsoby podání, jsou čípky a - v některých případech orální, bukální, sublinguální, inraperitoneální, intavaginální, analální, epidurální, spinální a intrakraniální prostředky. Pro čípky mohou být tradičními pojivý a nosiči například polyalkanglykoly nebo triglyceridy; takové čípky mohou být připraveny ze směsí obsahujících aktivní složku v rozmezí od 0,5% do 10%, lépe 1-2%. Orální prostředky mohou obsahovat běžné přísady, jako je například manitol, laktosa, škrob, stearan hořečnatý, sacharin sodný, celulosa, uhličitan hořečnatý a podobně, vše farmaceutické čistoty, tyto prostředky mohou mít také formu roztoků, suspenzí, tablet, pilulek, kapslí, prostředků se zpomaleným uvolňováním nebo prášků a obsahují 10-95% aktivní složky, výhodně 25-70%. Pro orální prostředky je zajímavou přísadou cholera-toxin (a také je vhodným partnerem pro konjugaci).

Polypeptidy mohou být připraveny ve vakcíně v neutrální formě nebo ve formě soli. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují adiční soli s kyselinami (tvořené s volnými aminoskupinami peptidu) a mezi použitelné kyseliny patří anorganické kyseliny, jako je, například, kyselina chlorovodíková nebo fosforečná, nebo organické kyseliny, jako je kyselina octová, vonná, mandlová a podobně. Soli tvořené s volnými karboxylovými skupinami mohou být také připraveny z anorganických baží, jako jsou například hydroxid sodný, draselný, amonný, vápenatý nebo železitý, a z organických baží, jako je například isopropylamin, trimethylamin, 2ethylaminoethanol, histidin, prokain a podobně.

vakcíny jsou podány způsobem slučitelným s dávkovou formou a v množství, které bude terapeuticky účinné a imunogenní. Podaná kvantita závisí na léčeném subjektu, včetně, například, kapacity imunitního systému jedince pro udržování imunitní reakce a požadovaného stupně ochrany. Vhodné dávky jsou v řádu několika stovek mikrogramů aktivního činidla na vakcinaci, s výhodným rozmezím od přibližně 0,1 pg do 2000 pg (je možno podat I dávky 1-10 mg), jako je například rozsah od 0,5 μg do přibližně 1000 μg, lépe od 1 μg do přibližně 500 μg a nejlépe od 10 μg do přibližně 100 μg. Vhodné režimy pro počáteční dávku a následné dosycovací dávky jsou také variabilní, ale obvykle je podána počáteční dávka a po ní další očkování nebo jiné formy podání.

Způsob aplikace může být různý. Lze použít jakékoliv běžné metody pro podání vakcín. Mezi tyto způsoby patří orální podání na pevné fyziologicky přijatelné bázi nebo ve fyziologicky přijatelné disperzi, parenterální podání, injekcí nebo jiným způsobem. Dávka vakcín závisí na způsobu podání a

• 9 4»·· • · • · ·· liší se podle věku vakcinovaného jedince a podle přípravy antigenu.

Některé polypeptidy vakciny jsou dostatečně imunogenní ve vakcíně, ale některé jiné imunitní reakce budou zesíleny, pokud bude vakcína dále obsahovat adjuvantní substanci.

Jsou známé různé metody pro dosaženi adjuvantního efektu pro vakciny. Obecné principy a způsoby jsou popsány v The theory and practical Application of Adjuvants, 1995, DuncanE.S., Stewart-Tull (ed.), John Wiley and Sons, Ltd., ISBN 0471-95170-6, a také ve Vaccines: New generation Immunological Adjuvants, 1995, Gregoriadis, G. et al. (ed.) , Plenům Press,

New York, ISBN 0-306-45283-9, kde obě tyto citace jsou zde uvedeny jako odkazy.

Zejména výhodné je použiti adjuvans, které usnadní překonání autotolerance k autoantigenům; ve skutečnosti je toto zásadní v případech, kdy je nemodifikovaný OPGL použit jako aktivní složka v autovakcíně. Příklady vhodných adjuvans jsou vybrány ze skupiny zahrnující adjuvans napomáhající prezentaci antigenu imunitnímu systému; imunomodulační adjuvans jako jsou toxiny, cytokiny a mykobakteriální deriváty; olejové prostředky; polymery; adjuvans vytvářející micely; saponiny; imunostimulační komplexní matrice (ISCOM matrice); částice; DDA; hlinitá adjuvans; DNA adjuvans; γinulin; a enkapsulační adjuvans. Obecně je třeba uvést, že výše uvedený popis, který se týká sloučenin a činidel použitelných jako první, druhá a třetí skupina v analogách, se také týká jejich použití jako adjuvans ve vakcíně podle předkládaného vynálezu.

Použití adjuvans zahrnuje použití činidel jako je hydroxid

• ··	··	····	• fc fc
·· ·	•	•	•	•	fc	• fc
• ···	•	•		•	•	•
• · ·	fc ·	•	• ·	•	•	•
• · ·	«1	4»	•	•	•	fc
··· ··	··	···	• fc		···

hlinitý nebo fosforečnan hlinitý (kamenec), které se běžně používají jako 0,05 až 0,1% roztok v pufrovaném salinickém roztoku, smíšených se syntetickými polymery sacharidů (například Carbopol®) použitými jako 0,25% roztok, agregace proteinu ve vakcíně teplem za použití teplot od 70 °C do 101 °C po dobu 30 sekund až 2 minut, a také agregace pomocí zesíťoacích činidel. Agregace reaktivací protilátkami k albuminu zpracovanými pepsinem (Fab fragmenty), smísením s bakteriálními buňkami jako je C. parvum nebo s endotoxiny nebo lipopolysacharidovými složkami gram-negativních bakterií, emulgováním ve fyziologicky přijatelném olejovém vejhikulu, jako je mannidmonooleat Aracel A) nebo emulgováním s 20% roztokem perfluorkarbonu (Fluosol-DA) použitému jako blokovací substituční činidlo, může být také použito. Výhodné je také smísení s oleji, jako je skvalen a IFA.

Podle předkládaného vynálezu je DDA (dimethyldioktadecylammoniumbromid) zajímavým kandidátem na adjuvans, stejně jako DNA a γ-inulin, ale také jako Freundovo kompletní adjuvans a nekompletní adjuvans a quillaja saponiny, jako je QuilA a QS21 a RIBI. Dalšími možnostmi jsou monofosforyllipid A (MPL), výše uvedené C3d a C3 a mramyldipeptid (MDP).

O liposomálních prostředcích je také známo, že mají adjuvantní účinek, a proto jsou liposomální adjuvans výhodnými adjuvans podle předkládaného vynálezu.

Také adjuvans typu imunostimulační komplexní matrice (ISCOM® matrice) jsou výhodnou volbou pro předkládaný vynález, zejména proto, že bylo prokázáno, že adjuvans tohoto typu jsou schopná zvýšit expresi MHC molekul II typu na APC. ISCOM® matrice se skládá z (volitelně frakcionovaných) saponinů • ·· · · ···· ·· • · · ··· ··· • ··· · ···· · · (triterpenoidů) z Quillaja saponaria, cholesterolu a fosfolipidu. Při smísení s imunogenním proteinem vznikají částice známé jako ISCOM částice, ve kterých saponin tvoří 6070% hmotnostních, cholesterol a fosfolipid 10-15% hmotnostních a protein 10-15% hmotnostních. Podrobnosti týkající se složení a použití imunostimulačních komplexů mohou být nalezeny například ve výše uvedených učebnicích týkajících se adjuvans, ale také v Morein B., et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461475, stejně jako v Barr IG a Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biology 74: 8-25 (obě práce jsou zde uvedeny jako odkazy) uvádjí užitečné instrukce pro přípravu kompletních imunostimulačních komplexů.

Jinou značně zajímavou (a proto výhodnou) možností pro dosažení adjuvantního efektu je použití techniky popsané v Gosselin et al., 1992 (která je zde uvedena jako odkaz). Stručně, prezentace relevantního antigenu, jako je antigen podle předkládaného vynálezu, může být zesílena konjugováním antigenu na protilátky (nebo její vazebný fragment pro antigen) proti Fcy receptorům na monocytech/makrofágách. Bylo prokázáno, že zejména konjugáty mezi antigenem a anti-FcyRI zesilují imunogenicitu pro účely vakcinace.

Další možností je použití zaměřovačích a imunomodulačních substancí (t.j. cytokinů) uvedených výše jako kandidáty na první a druhé skupiny v modifikovaných verzích OPGL. V této souvislosti je možno použít také syntetických induktorů cytokinů, jako je polyI:C.

Vhodné mykobakteriální deriváty jsou vybrány ze skupiny zahrnující muramyldipeptid, kompletní Freundovo adjuvans, RIBI a diesterů trehalosy, jako je TDM a TDE.

• · · · · ···· · 9 9 • · · · · 9 999 · 9

9 9 99 9 999 ··· ·· ·9 999 99 999

Vhodná činidla zaměřující antigen na imunitní systém jsou vybrána ze skupiny zahrnující CD40 ligand a CD40 protilátky nebo jejich specifické vazebné fragmenty (viz výše), mannosu, Fab fragment a CTLA-4.

Vhodná polymerová adjuvans jsou vybrána ze skupiny zahrnující uhlovodany jako je dextran, PEG, škrob, mannan a mannosu; plastových polymerů jako takových; a latexu, jako jsou latexové korálky.

Jiným zajímavým způsobem pro modulování imunitní odpovědi je použití OPGL imunogenu (volitelně společně s adjuvans a farmaceuticky přijatelnými nosiči a vehikuly) ve virtuální lymfatické uzlině (VLN) (lékařský prostředek vyvinutý v ImunoTherapy lne., 360 Lexington Avenue, New York, NY 100176501). VLN (tenká trubička) napodobuje strukturu a funkci lymfatické uzliny. Inserce VLN pod kůži vytváří místo sterilního zánětu se zvýšením koncentrace cytokinů a chemokinů. T- a B-lymfocyty, stejně jako APC, rychle reagují na výstražné signály, migruji do místa zánětu a akumulují se uvnitř porosní matrice VLN. Bylo prokázáno, že nutná dávka antigenu vyžadovaná pro udržení imunitní reakce na antigen je při použití VLN snížena a že imunologická ochrana dosažená vakcinací za použití VLN je lepší než konvenční imunizace využívající Ribi jako adjuvans. Technologie je stručně popsána v Gelber C. et al., 1998, Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Smáli Amounts of Immunogens Using a Novel medical Device Designated the Virtual Lymph Node, v From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12^th - 15^th 1998, Seascape Resort, Aptos, California.

Předpokládá se, že vakcina by měla být podána 1-6-krát za rok, jako například 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6-krát za rok jedinci,

Φ ·» · · φφφφ ·· • ΦΦ Φ···· • ··φ φ φφφφφ φ • φ φφφ · · · ·· ··· φφ φ ·· • ΦΦ · · φφ φφφ·· který potřebuje takovou léčbu. Dříve bylo prokázáno, že paměťová imunita indukovaná použitím výhodných autovakcín podle předkládaného vynálezu není trvalá a proto imunitní systém potřebuje být periodicky vystavován působení OPGL nebo modifikovaných OPGL polypeptidů.

V důsledku genetických variací mohou různí jedinci reagovat různě silnou imunitní odpovědí na stejný polypeptid. Proto může vakcina podle předkládaného vynálezu obsahovat několik různých polypeptidů pro zesílení imunitní reakce, viz též diskusi uvedenou výše týkající se výběru vložených cizorodých T-lymfocytárních epitopů. Vakcina může obsahovat dva nebo více polypeptidů, kde všechny polypeptidy jsou takové, jak byly definovány výše.

Vakcina může v důsledku toho obsahovat 3-20 různých modifikovaných nebo nemodifikovaných polypeptidů, jako například 3-10 různých polypeptidů.

Vakcinace nukleovými kyselinami

Alternativou ke klasickému podání vakciny na bázi peptidu je technika vakcinace nukleovou kyselinou (též známá jako imunizace nukleovou kyselinou”, genetická imunizace a genová imunizace), která nabízí mnoho atraktivních vlastností.

Za prvé, oproti klasické vakcinací nevyžaduje vakcinace nukleovou kyselinou zdroj velkoobjemové produkce imunogenního činidla (například ve formě průmyslové fermentace mikroorganismů produkujících modifikovaný OPGL). Kromě toho, není zde potřeba přečištění prostředku a znovuskládání imunogenu. Konečně, protože vakcinace nukleovou kyselinou spočívá v biochemickém aparátu vakcinovaného jedince, který • · · ··· ··· • ··· ····· · · • · ··· · ··· ·

0*7 · · · · · ···

J ι ··· ·· ·· ··· ·· · vyrábí expresní produkt vložené nukleové kyseliny, dochází k optimálnímu posttranslačnímu zpracování produktu exprese; toto je zejména významné v případě autovakcinace, protože jak bylo uvedeno výše - významná frakce původních OPGL Blymfocytárních epitopů by měla být v modifikované molekule zachována a protože B-lymfocytární epitopy mohou být tvořeny částmi jakékoliv biomolekuly (například uhlovodanu, lipidu, proteinu atd.). Proto může být přirozená glykosylace a lipidace imunogenu velmi významná pro celkovou imunogenicitu a toto je nejlépe zajištěno produkcí imunogenu v hostiteli.

Proto výhodné provedení předkládaného vynálezu zahrnuje prezentaci modifikovaného OPGL imunitnímu systému prostřednictvím vložení nukleové kyseliny kódující modifikovaný OPGL do buněk živočicha a takto dosažením exprese in vivo v buňkách, do kterých byla nukleová kyselina vložena.

V tomto provedení je vloženou nukleovou kyselinou výhodně

DNA, která může být ve formě holé DNA, DNA připravené s nabitými nebo nenabitými lipidy, DNA připravené v liposomech, DNA obsažené ve virovém vektoru, DNA připravené s proteinem nebo polypeptidem usnadňujícím transfekci, DNA připravené se zaměřovačům proteinem nebo polypeptidem, DNA připravené s vápníkovým srážecím činidlem, DNA navázané na molekulu inertního nosiče, DNA enkapsulované v chitinu nebo chitosanu a DNA připravené s adjuvans. V této souvislosti je třeba uvést, že prakticky všechny úvahy týkající se použití adjuvans v tradiční přípravě vakcín se dají použít pro přípravu DNA vakcín. Proto se všechny popisy týkající se použití adjuvans v kontextu vakcín na bázi polypeptidu týkají také jejich použití v technologii vakcinace nukleovými kyselinami.

Způsoby podáni a schémata podání vakcín na bázi polypeptidů, které byly podrobně popsány výše, jsou také použitelné pro vakcíny na bázi nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu a všechny úvahy týkající se způsobů podání a schémat podání pro polypeptidy se týkají také nukleových kyselin. Vakcíny na bázi nukleových kyselin mohou být podány také intravenosně nebo intraarteriálně. Dále, v oboru je dobře známo, že nukleokyselinové vakcíny mohou být podány za použití takzvaného genového děla a proto je také tento a ekvivalentní způsoby podání považován za součást předkládaného vynálezu. Nakonec, použití VLN v podání nukleových kyselin vedlo dle literatury k dobrým výsledkům a proto je tento způsob podání zejména výhodný.

Dále, nukleové kyseliny použité jako imunizační činidlo mohou obsahovat regiony kódující první, druhou a/nebo třetí skupinu, například ve formě imunomodulačních substancí popsaných výše, jako jsou cytokiny uvedené jako použitelná adjuvans. Výhodná verze tohoto provedení zahrnuje použití kódujícího regionu pro analog a kódujícího regionu pro imunomodulátor v různých čtecích rámcích nebo alespoň pod kontrolou různých promotorů. Proto je vyloučeno to, aby byl analog nebo epitop produkován jako fúsní partner k imunomodulátoru. Alternativně mohou být použity dva odlišné hukleotidové fragmenty, ale toto je méně výhodné z důvodu výhody zajištění současné exprese při obsažení obou kódujících regionů ve stejné molekule.

V souladu s tím se vynález také týká prostředku pro indukci produkce protilátek proti OPGL, který obsahuje

- fragment nukleové kyseliny nebo vektor podle předkládaného vynálezu (viz popis vektorů uvedený dále), a

- farmaceuticky nebo imunologicky přijatelné vehikulum a/nebo

nosič a/nebo adjuvans, jak byly popsány výše.

za normálních okolností je nukleová kyselina kódující variantu OPGL vložena ve formě vektoru, ve kterém je exprese pod kontrolou virového promotoru. Pro podrobnější popis vektorů podle předkládaného vynálezu viz dále. Podrobný popis týkající se přípravy a použití-nukleokyselinových vakcín je uveden, například, v Donnelly, J.J., et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648; a Donnely J.J. et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Obě tyto práce jsou zde uvedeny jako odkazy.

Živé vakciny

Třetí alternativou pro prezentaci modifikovaných OPGL imunitnímu systému je použití technologie živých vakcín. Při použití živých vakcín je prezentace imunitnímu systému provedena podáním nepatogenních mikroorganismů živočichovi, kde uvedené mikroorganismy byly transformovány fragmentem nukleové kyseliny kódujícím modifikovaný OPGL nebo vektorem obsahujícím takový fragment nukleové kyseliny. Nepatogenním mikroorganismem může být jakýkoliv vhodný atenuovaný bakteriální kmen (atenuovaný pasážováním nebo odstraněním patogenních produktů exprese technikou rekombinantní DNA), jako je například Mycobacterium bovis BCG., nepatogenní Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella atd. Přehledy týkající se přípravy živých vakcín jsou uvedeny v Saliou P., 1995, Rev. Prát. 45: 14921496 a Walker, P.D., 1992, Vaccine 10: 977-990, které jsou zde uvedeny jako odkazy. Podrobnosti týkající se fragmentů nukleových kyselin a vektorů použitých v takových živých vakcínách jsou uvedeny dále.

Alternativně k bakteriálním živým vakcínám může být • · · · ···· • · · · ··· · · ··· fragment nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu popsaný dále inkorporován do nevirulentniho virového vakcinačního vektoru, jako je kmen vakcinie nebo jakýkoliv jiný vhodný pox virus.

Obvykle je nepatogenní mikroorganismus nebo virus zvířeti pouze jednou, ale v některých případech může nutné podat mikroorganismus více než jednou za život udržení protektivní imunity. Předpokládá se, že imunizační podán být pro schémata, jako jsou schémata uvedená pro polypeptidovou vakcinaci, budou použitelná pro živé nebo virové vakciny.

Alternativně se živá nebo virová vakcina kombinuje s předchozí nebo následnou polypeptidovou a/nebo nukleokyselinovou vakcinaci. Například, je možno provést primární imunizaci živou nebo virovou vakcínou a potom provést následné dosycovací imunizace za použití polypeptidové nebo nukleokyselinové vakciny.

Mikroorganismus nebo virus může být transformován nukleovou kyselinou kóduj ici například ve formě první, druhou a/nebo třetí skupinu, imunomodulačních substancí popsaných výše, cytokiny uvedené jako jako jsou verze tohoto provedení zahrnuje použitelná adjuvans. Výhodná použití kódujícího regionu pro imunomodulátor v různých analog a kódujícího regionu pro čtecích rámcích nebo alespoň pod kontrolou různých promotorů, to, aby byl analog nebo epitop produkován k imunomodulátoru. Alternativně mohou být

Proto je vyloučeno jako fúsní partner jako transformační fragmenty. Samozřejmě při přítomnosti první a/nebo druhé a/nebo třetí skupiny ve stejném čtecím rámci může být získán expresní produkt, analog podle předkládaného vynálezu, a takové provedení je v předkládaném vynálezu zejména výhodné.

činidla použity dva odlišné nukleotidové

Použiti způsobu podle předkládaného vynálezu při léčbě onemocnění

Jak je jasné z uvedeného popisu, poskytnutí způsobu podle předkládaného vynálezu umožňuje kontrolu onemocnění charakterizovaných nadměrnou ztrátou kostní hmoty. V tomto kontextu je osteoporosa klíčovým cílem pro způsob podle předkládaného vynálezu, ale také vhodným cílem je ztráta kosti spojená s komplikovanými frakturami kostí. Proto zahrnuje významné provedení způsobu podle předkládaného vynálezu pro léčbu a/nebo prevenci a/nebo zmírnění osteoporosy nebo jiného stavu charakterizovaného nadměrnou resorpcí kosti, kde způsob obsahuje inhibici aktivity OPGL způsobem podle předkládaného vynálezu v takovém rozsahu, že rychlost resorpce kosti je významně snížena.

V předkládaných souvislostech je takové významné snížení alespoň 3% ve srovnání s patologickou rychlostí, ale předpokládá se vyšší snížení, například alespoň 5%, alespoň 7%, alespoň 9%, alespoň 11%, alespoň 13%, alespoň 15% a alespoň 17%, ale očekávají se i ještě vyšší snížení, jako například alespoň 20% nebo i alespoň 30%. Zejména výhodné je, aby snížení kostní resorpce vedlo k inverzi rovnováhy mezi tvorbou a resorpcí kosti, tj. aby bylo dosaženo stavu, kdy je rychlost tvorby kosti vyšší než rychlost resorpce kosti. Samozřejmé je, že tato nerovnováha nemůže být udržována (protože by vedla k osteopetrose), ale pečlivým kontrolováním počtu a imunologických důsledků imunizace jedince je možno dosáhnout časem rovnováhy, která vede k zachování kostní hmoty. Alternativně, pokud nemůže způsob podle předkládaného vynálezu ukončit u jedince ztrátu kostní hmoty, může způsob podle předkládaného vynálezu (volitelně v kombinaci s jinými známými metodami pro snížení ztráty kostí u pacientů s osteoporosou) být použit pro dosažení významného snížení ztráty kostní hmoty, což prodlouží dobu, po kterou má pacient dostatek kostní hmoty.

Způsoby pro měření rychlosti resorpce kosti a tvorby kosti jsou známé v oboru. Biochemické testy umožňují určit rychlost kostní resorpce pomocí měření koncentrací některých fragmentů kolagenu typu I v krvi (viz WO 93/15107 a WO 94/14844). Alternativně může být rychlost ztráty kostní hmoty měřena fyzikálně; representativní popisy způsobů pro hodnocení kostní hmoty neivazivními, fyzikálními metodami jsou uvedeny ve WO 88/06862, WO 94/12855, WO 95/14431 a WO 97/00643.

Peptidy, polypeptidy a prostředky podle předkládaného vynálezu

Jak je zřejmé z výše uvedeného popisu, je předkládaný vynález založen na konceptu imunizace jedinců proti OPGL antigenu pro nepřímé dosažení snížené aktivity osteoklastů. Výhodným způsobem pro dosaženi takové imunizace je použití modifikovaných verzí OPGL, což poskytuje molekuly, které nebyly dříve popsány v oboru.

Předpokládá se, že modifikované OPGL molekuly zde uvedené jsou sami o sobě nové a proto se významná část předkládaného vynálezu týká OPGL analogu, který je odvozen od živočišného OPGL a který obsahuje modifikace vedoucí k tomu, že imunizace živočicha analogem vede k produkci protilátek reagujících specificky s nemodifikovaným OPGL polypeptidem. Výhodně odpovídá charakter modifikace typům modifikací popsaným výše v popisu různých provedení způsobu podle předkládaného vynálezu při použití modifikovaného OPGL. Proto jsou jakékoliv zde uvedené popisy týkající se modifikovaných OPGL molekul ♦ · ·· ···· ·· • · · · · · · ··· · · ··· 9 9 relevantní pro účely popisu OPGL analogů podle předkládaného vynálezu.

Je třeba uvést, že výhodné modifikované molekuly OPGL obsahují modifikace, které vedou ke vzniku polypeptidu, který má alespoň 70% identitu sekvence s OPGL nebo s jeho subsekvencí délky alespoň 10 aminokyselin. Vyšší identity sekvence jsou výhodné, například alespoň 75% identita nebo i 80%, 85%, 90% nebo 95%. Identita sekvence pro proteiny a nukleové kyseliny může být vypočtena jako (Nref - Ndif) . 100/Nref, kde Ndif je celkový počet neidentických zbytků ve dvou seřazených sekvencích a kde Nref je počet zbytků v jedné ze sekvencí. Tak má DNA sekvence AGTCAGTC 75% identitu sekvence se sekvencí AATCAATC (Ndif = 2 a N_ref = 8) .

Vynález se také týká prostředků použitelných v provedení způsobu podle předkládaného vynálezu. Tak se vynález týká také imunogenního prostředku obsahujícího imunologicky účinné množství OPGL polypeptidu, který je pro zvíře vlastním proteinem, kde uvedený OPGL polypeptid je připraven společně s imunologicky přijatelným adjuvans tak, že je dosaženo překonání autotolerance živočicha k OPGL polypeptidu, kde prostředek dále obsahuje farmaceuticky a imunologicky přijatelné ředidlo a/nebo vehikulum a/nebo nosič a/nebo přísadu. Jinými slovy, tato část vynálezu se týká přípravků přirozených OPGL polypeptidů, které byly popsány v souvislosti s provedeními způsobu podle předkládaného vynálezu.

Vynález se týká také imunogenního prostředku obsahujícího imunologicky účinné množství analogu OPGL, kde uvedený prostředek dále obsahuje farmaceuticky a imunologicky přijatelné ředidlo a/nebo vehikulum a/nebo nosič a/nebo přísadu. Jinými slovy, tato část vynálezu se týká přípravků ·· φφ ···· φφ • φ · φ φ φ · • •Φ φ φ φφφ φ φ • ••φφ φφφφ ·♦· ·· φφ φφφ φφ φφφ obsahujících modifikovaný OPGL, jak byl popsán výše. Volba adjuvans, nosičů a vehikul je stejná, jak byla popsána výše při popisu přípravy modifikovaných a nemodifikovaných OPGL pro použití ve způsobu pro inhibici OPGL.

Polypeptidy jsou připraveny způsoby .dobře známými v oboru. Delší polypeptidy jsou obvykle připraveny pomocí rekombinantní techniky zahrnující vložení sekvence nukleové kyseliny kódující analog OPGL do vhodného vektoru, transformaci vhodné hostitelské buňky vektorem, expresi sekvence nukleové kyseliny, získání produktu exprese z hostitelské buňky nebo ze supernatantu kultury a následné přečištění a volitelně další modifikace, například znovusložení nebo derivatizaci.

Kratší peptidy jsou výhodně připraveny za použití známých technik peptidové syntézy na pevné fázi nebo v kapalné fázi. Nicméně, nedávné pokroky v této technologii umožňují produkci kompletních polypeptidů a proteinů pomocí těchto technik a proto předkládaný vynález zahrnuje syntetickou přípravu delších konstruktů.

Fragmenty nukleové kyseliny a vektory podle předkládaného vynálezu

Z výše uvedeného popisu je jasné, že modifikované OPGL polypeptidy mohou být připraveny pomocí rekombinantních technik, ale také chemickou syntézou nebo semisyntézou; poslední dvě možnosti jsou zejména významné tehdy, když modifikace spočívá v navázání na proteinový nosič (jako je KLH, difterický toxoid, tetanický toxoid a BSA) a neproteinové molekuly, jako jsou karbohydratové polymery a samozřejmě také tehdy, když modifikace zahrnuje adici vedlejších řetězců nebo vedlejších skupin k peptidovému řetězci odvozenému od OPGL.

Pro účely rekombinantní technologie - a samozřejmě také pro účely imunizace nukleovými kyselinami - jsou fragmenty nukleových kyselin kódující modifikovaný OPGL významnými chemickými produkty. Proto se významná část předkládaného vynálezu týká fragmentů nukleových kyselin, které kódují analogy OPGL, tj. polypeptid odvozený od OPGL, který buď obsahuje sekvenci přirozeného OPGL, ke které byl přidán nebo na kterou byl fúsován fúsní partner, nebo - výhodně polypeptid odvozený od OPGL, do kterého byl vložen cizorodý Tlymfocytární epitop prostřednictvím inserce a/nebo adice, výhodně prostřednictvím substituce a/nebo delece. Fragmenty nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou DNA nebo RNA fragmenty.

Fragmenty nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou obvykle insertovány ve vhodných vektorech za vzniku klonovacích nebo expresních vektorů obsahujících fragment nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu; takové nové vektory jsou součástí předkládaného vynálezu. Podrobnosti týkající se konstrukce těchto vektorů podle předkládaného vynálezu budou popsány dále v souvislosti s transformovanými buňkami a mikroorganismy. Vektory mohou, podle účelu a typu aplikace, být ve formě plasmidů, fágů, kosmidů, minichromosomů nebo virů, ale může se jednat také o „holou DNA, které je exprimována pouze přechodně v určitých typech buněk. Výhodné klonovací a expresní vektory podle předkládaného vynálezu jsou schopné autonomní replikace, což umožňuje dosažení vysokého počtu kopií pro vysokou expresi nebo vysokou úroveň replikace pro následné klonování.

Obecně obsahuje vektor podle předkládaného vynálezu následující prvky ve směru 5'->3', které jsou v operativní ··· • · *·

• · · ·· ··· ·· • · ·· vazbě: promotor pro řízeni exprese fragmentu nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, volitelně sekvenci nukleové kyseliny kódující vedoucí peptid umožňující sekreci (do extracelulární fáze, nebo - pokud je to použitelné - do periplasmy) nebo integraci polypeptidového fragmentu do membrány, fragment nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, a volitelně sekvenci nukleové kyseliny kódující terminátor. Při použití expresního vektoru v produkujících kmenech nebo buněčných liniích je pro zlepšení genetické stability transformovaných buněk výhodné, aby byl vektor, po vložení do hostitelské buňky, integrován do genomu hostitelské buňky. Naopak, při použití vektorů v dosažení in vivo exprese ve zvířatech (tj. při použití vektoru při DNA vakcinaci) je z důvodů bezpečnosti výhodné, aby vektor nemohl být integrován do genomu hostitelské buňky; obvykle se použije holá DNA nebo neintegrující virové vektory, jejichž výběr je dobře známý odborníkům v oboru.

Vektory podle předkládaného vynálezu jsou použity pro transformaci hostitelských buněk k produkci modifikovaných OPGL polypeptidu podle předkládaného vynálezu. Takové transformované buňky, které jsou také součástí předkládaného vynálezu, mohou být kultivované buňky nebo buněčné linie použité pro propagaci fragmentů nukleových kyselin a vektorů podle předkládaného vynálezu, nebo mohou být použity pro rekombinantní produkci modifikovaných OPGL polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Alternativně mohou být transformované buňky vhodnými kmeny pro živé vakciny, kde uvedený fragment nukleové kyseliny (v jedné nebo více kopiích) je do nich insertován tak, aby bylo dosaženo sekrece nebo integrace modifikovaného OPGL do bakteriální membrány nebo do buněčné stěny.

·· ····

Výhodnými bakteriálními buňkami podle předkládaného vynálezu jsou mikroorganismy, jako jsou bakterie (jako jsou Escherichia spp (například E. coli), Bacillus (například Bacillus subtilis), Salmonella nebo Mycobacterium (výhodně nepatogenní, například M. bovis BCG), kvasinky (jako je S.

cerevisiae) a protozoa. Alternativně může být transformované buňka původem z mnohobuněčného organismu, jako jsou houby, hmyz, rostliny a savci. Nej výhodnější jsou buňky od člověka, viz popis vektorů a buněčných linií uvedený dále. Nedávné výsledky naznačily výhodné použití komerčně dostupné linie od Drosophila melanogaster (Schneider 2 (S2) buněčná linie a vektorový systém od Invitrogen) pro rekombinantní produkci polypeptidů v laboratoři přihlašovatelů vynálezu a proto je tento expresní systém zejména výhodný.

Pro účely klonování a/nebo optimalizované exprese je výhodné, aby byla transformovaná buňka schopná replikovat fragment nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. Buňky exprimující fragment nukleové kyseliny jsou výhodnými provedeními vynálezu; tyto buňky mohou být použity pro maloobejmovou nebo velkoobjemovou přípravu modifikovaného OPGL nebo - v případě nepatogenních bakterií - jako složky živých vakcín.

Při produkci modifikovaného OPGL podle předkládaného vynálezu pomocí transformovaných buněk je vhodné, i když ne zásadní, aby byl produkt exprese buď exportován do kultivačního media nebo přítomen na povrchu transformovaných buněk.

Po identifikaci účinné produkční buňky je výhodné, aby se z ní vytvořila stabilní buněčná linie nesoucí vektor podle předkládaného vynálezu a exprimující fragment nukleové ·· • · · • · • · •· ···· • · · to •· · ···· • to • to toto • · toto kyseliny kódující modifikovaný OPGL. Výhodně tato stabilní buněčná linie nese nebo secernuje analog OPGL podle předkládaného vynálezu, což usnadňuje jeho přečištění.

Obecně, jsou v hostiteli použity plasmidové vektory obsahující replikon a kontrolní sekvence, které jsou odvozeny od druhu kompatibilního s hostitelskou buňkou, vektory obvykle obsahuje replikačni místo, stejně jako značící sekvence, které umožňují fenotypovou selekci transformovaných buněk. Například, E. coli je obvykle transformována za použití pBR322, plasmidu odvozeného od E. coli (viz například Bolivar et al., 1977). pBR322 plasmid obsahuje geny pro resistenci na ampicilin a tetracyklin a proto poskytuje snadný prostředek pro identifikaci transformovaných buněk. pBR plasmid, nebo jiný mikrobiální plasmid nebo fág musí také obsahovat - nebo musí být modifikován tak, aby obsahoval - plasmid, který může být použit prokaryotickým mikroorganismem pro expresi.

Mezi promotory nej častěji používané pro rekombinantni DNA konstrukty patří B-laktamasový (penicilinasový) a laktosový promotorový systém (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) a tryptofanový (trp) promotorový systém (Goeddel et al., 1979; EP-A-0036776). Ačkoliv toto jsou nejběžnější používané promotory, mohou být použity i další mikrobiální promotory a podrobnosti týkající se jejich nukleotidových sekvencí byly publikovány, což umožňuje jejich funkční ligaci na plasmidové vektory (Siebwenlist et al., 1980). Některé geny z prokaryont mohou být účinně exprimovány v E. coli z jejich vlastních promotorových sekvencí, takže není nutné artificiální přidání jiného promotoru.

Kromě prokaryotických organismů mohou být použity také eukaryotické mikroby, jako jsou kvasinkové kultury, a také zde • ♦· ·· ···· ·· • · · · · · · · · • ··· · · φφφ φφ • · · · · · · · φφ • · · · ···· ·*· ·♦ ·· ♦···· · by měl být promotor schopen řízení exprese. Saccharomyces cerevisiae, nebo běžné pekařské kvasinky, jsou nejčastěji používanými eukaryotickými mikroorganismy, ačkoliv je dostupných mnoho dalších kmenů. Pro expresi v Saccharomyces je běžně použit plasmid Yrp7 (Stinchcomb et al·., 1979; Kingsman et al. , 1979; Tschemper et al., 1980). Tento plasmid již obsahuje trpí gen, který je selekčním markérem pro mutantní kmeny kvasinek neschopných růstu v tryptofanu, jako je například ATCC č. 44076 nebo PEP4-1 (Jones, 1977). Přítomnost trpí léze jako charakteristika genomu kvasinkové hostitelské buňky potom poskytuje účinné prostředí pro detekci transformace pomocí kultivace za nepřítomnosti tryptofanu.

Mezi vhodné promotorové sekvence ve kvasinkových vektorech patří promotory pro 3-fosfoglyceratkinasu (Hitzman et al., 1980) nebo jiné glykolytické enzymy (Hess et al., 1968; Holladn et al., 1978), jako je enolasa, glyceraldehyd-3fosfatdehydrogenasa, hexokinasa, pyruvátdekarboxylasa, fosfofruktokinasa, glůukosa-6-fosfat isomerasa, 3fosfoglyceratmutasa, pyruvatkinasa, triosafosfatisomerasa, fosfoglukosaisomerasa a glukokinasa. Při konstrukci vhodných expresních plasmidů jsou terminační sekvence asociované s těmito geny také ligovány do expresního vektoru 3' k sekvenci, která má být exprimována, pro dosažení polyadenylace mRNA a terminace.

Jiné promotory, které mají další výhodu v transkripci řízené kultivačními podmínkami, jsou promotorový region alkohol-dehydrogenasy 2, isocytrochromu C, kyselé fosfatasy, degradačních enzymů asociovaných s metabolismem dusíku a výše uvedené glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenasy, a enzymy odpovědné za využití maltosy a galaktosy. Vhodný je jakýkoliv plasmidový vektor obsahující promotor, sekvenci rozpoznávající ·· ····

• · ·· • ··· ·· • · · ·· • · ·· ·· · počátek replikace a terminačni sekvenci kompatibilní s kvasinkami.

Kromě mikroorganismů mohou být také jako hostitelé použity kultury buněk odvozených od mnohobuněčných organismů. V zásadě je použitelná jakákoliv buněčná kultura, ať z obratlovců nebo z bezobratlých. Nicméně, významnější jsou buňky z obratlovců a propagace buněk od obratlovců v kultuře (tkáňové kultuře) se stala v posledních letech rutinním postupem (Tissue Culture, 1973). Příklady takových použitelných hostitelských buněčných linií jsou VĚRO a HeLa buňky, ovariálni buňky čínského křečka (CHO) a W138, BHK, COS-7, 293, buňky Spodoptera frugiperda (SF) (komerčně dostupné jako kompletní expresní systém od Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT06450, USA a od Invitrogen) a MDCK buněčné linie. V předkládaném vynálezu je zejména výhodnou buněčnou linií S₂ dostupná od Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The Netherlands.

Expresní vektory pro takové buňky obvykle obsahují (pokud je to nutné) sekvenci rozpoznávající počátek replikace, promotor umístěný před exprimovaným genem, společně s nezbytnými vazebnými místy pro ribozomy, místa pro sestřih RNA, polyadenylační místo a sekvence pro ukončení transkripce.

Pro použití v savčích buňkách jsou kontrolní funkce na expresních vektorech často dodány virovým materiálem. Například, běžně používané promotory jsou odvozené od polyomaviru, adenoviru 2 a nejčastěji od opičího viru 40 (SV40). Časné a pozdní promotory SV40 viru jsou zejména výhodné, protože jsou oba získány snadno z viru jako fragment, který také obsahuje SV40 virový zdroj replikace (Fiers et al., 1978). Také mohou být použity menší nebo větší fragmenty SV40, s podmínkou, že obsahují přibližně 250 bp sekvenci od HindlII

• · ··· · • ♦ · « • · · • ·· ·· • φ · φ • · ··· · * · φ · · • · · · • · • · • · ·· ··· místa směrem k BglI místu umístěnému ve virové sekvenci rozpoznávající počátek replikace. Dále je také možné, a často žádoucí, použít promotorové nebo kontrolní sekvence normálně asociované se sekvencí požadovaného genu, což zaručí, že takové kontrolní sekvence budou kompatibilní se systémy hostitelské buňky.

Sekvence rozpoznávající počátek replikace může být dodána buď úpravou vektoru tak, aby obsahoval exogenní sekvenci rozpoznávající počátek replikace, která může být odvozena z SV40 nebo jiného viru )například polyomaviru, adenoviru, VSV, BPV), nebo může být dodána chromosomálním replikačním mechanismem hostitelské buňky. Pokud je vektor integrován do chromosomu hostitelské buňky, tak je často dostatečná druhá varianta.

Identifikace použitelných analogů OPGL

Odborníkům v oboru bude jasné, že ne všechny možné varianty a modifikace přirozeného OPGL budou schopny vyvolat tvorbu protilátek u zvířete, které jsou zkříženě reaktivní s přirozenou formou. Není, nicméně, obtížné provést účinné standardní vyšetření na modifikované OPGL molekuly, které splňují minimální požadavky na zde popisovanou imunologickou reaktivitu. Proto se další část předkládaného vynálezu týká způsobu pro identifikaci modifikovaného OPGL polypeptidů, který je schopen indukovat protilátky proti nemodifikovanému OPGL polypeptidů u zvířete, kde nemodifikovaný OPGL polypeptid je (neimunogenní) vlastní protein, kde uvedený způsob zahrnuje:

- přípravu, pomocí peptidové syntézy nebo technik genového inženýrství, sady navzájem odlišných modifikovaných OPGL polypeptidů, ve kterých byly v aminokyselinové sekvenci OPGL • ·

polypeptidu daného živočišného druhu provedeny inserce, delece nebo substituce aminokyselin, které vedly ke vzniku aminokyselinových sekvencí obsahujících T-lymfocytární epitopy, které jsou cizorodé pro živočišný·druh, nebo přípravu sady fragmentů nukleových kyselin kódujících sadu vzájemně odlišných modifikovaných OPGL polypeptidů;

- testování členů sady modifikovaných OPGL polypeptidů nebo fragmentů nukleových kyselin na jejich schopnost indukovat produkci protilátek proti nemodifikovanému OPGL v živočišném druhu; a

- identifikaci a volitelně izolaci členů sady modifikovaných OPGL polypeptidů, které významně indukují produkci protilátek proti nemodifikovanému OPGL v druhu nebo identifikaci a volitelně izolaci polypeptidových expresních produktů kódovaných členy sady fragmentů nukleových kyselin, které významně indukují produkci protilátek proti nemodifikovanému OPGL v živočišném druhu.

V této souvislosti je sada vzájemně odlišných modifikovaných OPGL polypeptidů soubor neidentických modifikovaných OPGL polypeptidů, které byly, například, vybrány podle kriterií uvedených výše (například kombinací analýzy cirkulárního dichroismu), NMR spektrální analýzy a/nebo rentgenové difrakce). Tato sada může obsahovat pouze několik členů, ale předpokládá se, že může obsahovat také několik stovek členů.

Test členů sady může být nakonec proveden in vivo, ale může být proveden určitý počet testů in vitro, které zužují počet modifikovaných molekul, které mohou být použity pro předkládaný vynález.

Protože účelem vkládání cizorodých T-lymfocytárních epitopů ···

9 · • 9 • ···· •· •· • · · · · je podpora B-lymfocytárni odpovědi prostřednictvím pomoci Tlymfocytů, je podmínkou to, aby byla modifikovaným OPGL polypeptidem indukována proliferace T-lymfocytů. Proliferace T-lymfocytů může být testována standardními proliferačnimi testy in vitro. Stručně, vzorek bohatý na T-lymfocyty se získá od jedince kontaktuj i molekulu a a potom se kultivuje. Kultivované T-lymfocyty se s APC jedince, které předem Vychytaly modifikovanou zpracovaly ji a prezentují její T-lymfocytárni epitopy. Proliferace T-lymfocytů se sleduje a srovnává se s vhodnou kontrolou (například T-lymfocyty v kultuře kontaktovanými s APC, které zpracovaly přirozený, intaktni OPGL). Alternativně může být proliferace měřena stanovením koncentrace relevantních cytokinů uvolňovaných T-lymfocyty v reakci na rozpoznání cizorodých T-lymfocytárnich epitopů.

Takto může být dosaženo situace, že je značně pravděpodobné, že jeden modifikovaný OPGL ze sady je schopen indukovat tvorbu protilátek proti OPGL a je možné připravit imunogenní prostředek obsahující alespoň jeden OPGL polypeptid, který může indukovat protilátky proti nemodifikovanému OPGL u živočicha, u kterého je nemodifikovaný OPGL polypeptid vlastním proteinem, kde tato příprava zahrnuje smísení člena sady, který signifikantně indukuje produkci protilátek u živočicha, které jsou reaktivní s OPGL, s farmaceuticky a imunologicky přijatelným vehikulem a/nebo ředidlem a/nebo přísadou, v kombinaci s alespoň jedním farmaceuticky nosičem a/nebo volitelně a imunologicky přijatelným adjuvans.

Výše uvedené aspekty předkládaného vynálezu se týkají testu sady polypeptidu, který je proveden nejprve pomocí přípravy mnoha vzájemně odlišných sekvencí nukleových kyselin nebo vektorů podle předkládaného vynálezu, inserci těchto sekvencí nebo vektorů do vhodných expresních vektorů, transformaci vhodných hostitelských buněk vektory a expresi sekvencí nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu. Tyto kroky mohou být následovány izolací produktů exprese. Je výhodné, aby byly sekvence nukleové kyseliny a/nebo vektory připraveny způsobem zahrnujícím provedení molekulární amplifikační techniky, jako je PCR, nebo pomocí syntézy nukleových kyselin.

Jiná část předkládaného vynálezu se týká způsobu pro léčbu, profylaxi nebo zmírnění onemocnění charakterizovaného nadměrnou resorpcí kosti u zvířete, včetně člověka, který zahrnuje podání účinného množství alespoň jedné substance odlišné od osteoprotegerinu, která blokuje stimulační efekt OPGL na aktivitu osteoklastů, uvedenému zvířeti. Předpokládáme, že takový postup nebyl nikdy v oboru navržen.

Výhodné provedení tohoto aspektu vynálezu zahrnuje použití protilátky specifické k OPGL (póly- nebo monoklonální) nebo její varianty se specifickou vazbou, jako substance blokující stimulační efekt OPGL. Je výhodné, aby byla protilátkou IgG nebo IgM molekula nebo specificky se vážící varianta odvozená od IgG nebo IgM. Specificky se vážící variantou protilátky může být Fab fragment, F(ab')2 fragment, humanizovaná monoklonální protilátka nebo její fragment, nebo fragment dinebo multimerní protilátky, jako je diaprotilátka (bispecifická dimerická molekula odvozená od protilátky vyráběná Cambridge Antibody Technology).

Příklady provedeni vynálezu

Rozhodli jsme se klonovat nebo syntetizovat cDNA kódující myší a lidský OPGL ve zkrácené verzi obsahující aminokyselinové zbytky 158-316 v případě myšího a zbytky 159• · • ·

9 · •9 •9

9· · • · · · 9· · 9 9 ·9 9 ♦ ♦ ♦ 9 9 99 • · 9 9· ·· ··· ··9

317 v případě lidského OPGL (čísla odpovídají číslováni v SEQ ID NO: 2 a 4, v příslušném pořadí). Protože zkrácené verze vykazují biologickou aktivitu, je logické zaměřit autoprotilátky proti této části OPGL. Kromě toho je při tomto provedení protein menší, což usnadňuje manipulaci s proteinem.

Syntetická cDNA kódující myší OPGL zbytky 158-316 byla syntetizována odstraněním suboptimálních E. coli a Pichia pastoris kodonů z publikované sekvence. Dále byly do otevřeného čtecího rámce inkorporovány N-kocová histidinová koncovka, část štěpícího místa signální sekvence a-párovacího faktoru ze Saccharomyces cerevisiae a vhodná místa pro restrikční enzymy (viz SEQ ID NO: 7).

Tato cDNA kódující přirozený myší OPGL byla klonována do standardního Escherichia coli expresního vektoru (pTrc99a) za použití BspHI a HindlII restrikčních enzymů a standardního klonovacího vektoru (pBluescript KS+) za použití Sací a KpnI restrikčních enzymů (za zisku SEQ ID NO: 9).

Exprese v buňkách Escherichia coli vedla k přibližně 30% rekombinantního OPGL přítomných v celkových proteinech Escherichia coli. Protein byl znovusložen a přečištěn za použití následujícího postupu:

1. Buňky byly získány odstředěním.

2. Buňky se suspendovaly ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) a odstředily se.

3. Supernatant se odstranil a buňky se resuspendovaly ve třech objemech (100 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridu, mM dithiothreitolu (DTT), 0,5 M NaCl, pH 8,0).

4. K buňkám se přidalo 8 μΐ 50 mM PMSF a 80 μΐ lysozymu (10 mg/ml) na gram buněk a provedla se inkubace při teplotě okolí po dobu 20 minut.

5. Na každý gram buněčné pelety se přidaly 4 mg kyseliny deoxycholové a suspenze se inkubovala při 37 °C do vzniku viskozity.

6. přidá se 20 μΐ DNAsy (1 mg/ml) na gram buněk a MgC12 do 5 mM a suspenze se inkubuje při teplotě okolí po dobu 30 minut.

7. Suspenze se sonikuje na ledu do vymizení viskozity.

8. Po odstředění (20000 x g po dobu 30 minut) se peleta resuspenduje v H2O, opakovaně se odstředí a resuspenduje se ve 3 ml 1 M močoviny na gram hmotnosti buněk.

9. Po odstředění (20000 x g po dobu 30 minut) se peleta resuspenduje v 1 M guanidinhydrochloridu, 100 mM

Tris(hydroxymethyl)aminomethahydrochloridu, pH 7,5.

10. Po odstředění (20000 x g po dobu 30 minut) se peleta resuspenduje v 1 M guanidinhydrochloridu, 20 mM

Tris(hydroxymethyl)aminomethahydrochloridu, 1% βmerkaptoethanolu, pH 8,0, a mísí se přes noc při teplotě 4 °C.

11. Po odstředění (40000 x g po dobu 1-4 hodin) se supernatant přefiltruje a uskladní se při -20 °C.

12. Solubilizovaná inklusní tělíska se separují gelovou filtrační chromatografií za použití Superdex 200 materiálu (Pharmacia).

13. Frakce obsahující rekombinantní OPGL se shromáždí a ředí se na 0,1 mg/ml 1,5 M guanidinhydrochloridu, 20 mM

Tris(hydroxymethyl)aminomethahydrochloridem, 1 mM DTT, pH 7,5.

14. Materiál se dialyzuje přes noc při 4 °C proti 10 objemům

1,5 M guanidinhydrochloridu, 20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethahydrochloridu, 1 mM DTT, pH 7,5.

15. Materiál se dialyzuje přes noc při 4 °C proti 10 objemům

1,0 M guanidinhydrochloridu, 20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethahydrochloridu, 1 mM DTT, pH 7,5.

16. Materiál se dialyzuje přes noc při 4 °C proti 10 objemům

0,5 M guanidinhydrochloridu, 20 mM Tris(hydroxymethyl)57 • ·

aminomethahydrochloridu, 1 mM DTT, pH 7,5.

17. Materiál se dialyzuje přes noc při 4 °C proti 10 objemům mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethahydrochloridu, 150 mM argininu, 1 mM DTT, pH 7,5.

18. Materiál se dialyzuje přes noc při 4 °C proti 10 objemům mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethahydrochloridu, 150 mM argininu, pH 7,5.

19. Složený materiál se lyofilizuje a uskladní se při -20 °C.

Účinnost skládání tímto postupem je přibližně 40% a čistota přesahuje 65%. Přečištění a skládáni jsou stále předmětem dalších zlepšování. Skládání za imobilizovaného stavu je předmětem výzkumu a enzymatické odstranění histidinové koncovky je možno provést způsobem popsaným v Pedersen et al., 1999. Vlastnosti rekombinantního proteinu byly charakterizovány a verifikovány pomocí SDS-PAGE, N-koncového sekvencování,aminokyselinové analýzy a hmotnostní spektrometrie.

Připravil se cysteinový substituční mutant přirozeného myšího OPGL (ve kterém je cystein odpovídající aminokyselinovému zbytku v SEQ ID NO: 4 substituován serinem, viz SEQ ID NO: 11 a 12). Toto je provedeno pro eliminaci potenciálních problémů se stabilitou u přečištěného rekombinantního proteinu. Tento mutovaný zkrácený OPGL slouží jako základ pro vakcinační konstrukty v souladu s popisem uvedeným dále, který platí pro DNA SEQ ID NO: 9. Pro stejný účel byl také připraven příslušný Cys->Ser mutant (ve kterém je substituován Cys221) lidského OPGL.

Vakcinační molekuly se nejprve připravily insercí nebo substitucí buď P2, nebo P30 epitopů z tetanického toxoidu ve vybraných pozicích. Později mohou být použity jiné vhodné · · · · · · ··· ·· ·· ·«· imunodominantní T-lymfocytární epitopy.

Pozice pro vkládáni variaci jsou vybrány podle znalostí existujících nebo předpokládaných B-lymfocytárních epitopů a předpokládaných prvků sekundární struktury přirozené molekuly, stejně jako podle porovnání s existující troj rozměrovou strukturou TNFa (la8m.pdb) a CD40 ligandů (laly.pdb) pro modelování sekundární a terciární struktury extracelulární části OPGL. Vkládání do myší molekuly proběhne v regionech odpovídajících aminokyselinovým zbytkům 170-192, 198-218, 221246, 256-261 a 285-316 (viz číslování aminokyselin podle SEQ ID NO: 4), zatímco vkládání do lidské molekuly proběhne v regionech odpovídajících aminokyselinovým zbytkům 171-193, 199-219, 222-247, 257-262 a 286-317.

Byly konstruovány čtyři varianty myšího OPGL a tyto varianty byly rekombinantně exprimovány v Escherichia coli:

DNA kódující mOPGL(158-316)_P30(256-261) s N-koncovou histidinovou koncovkou (SEQ ID NO: 13)

PCR SEQ ID NO: 9 byla provedena za použití SEQ ID NO: 22 a 25 jako primerů. Vzniklý PCR fragment byl restrikčně tráven SacII a KpnI a potom byl přečištěn z agarosového gelu. Druhá PCR za použití SEQ ID NO: 9 jako templátu byla provedena za použití primeru SEQ ID NO: 26 a primeru specifického pro vektor. Vzniklý PCR fragment byl restrikčně tráven KpnI a HindlII. Oba fragmenty byly potom ligovány do SEQ ID NO: 9 v pBluescript KS+ restrikčně tráveném SacII a HindlII. Pro správnou mutaci jedné baze v tomto konstruktu byla provedena PCR za použití konstruktu jako templátu s primery SEQ ID NO: 33 a 29. Vzniklý PCR fragment byl restrikčně tráven Pstl + EcoRI, byl přečištěn na gelu a potom byl ligován do chybného konstruktu tráveného Pstl a EcoRI. Verifikovaný konstrukt (SEQ ID NO: 13) byl potom přenesen do pTrc99a za použití restrikčních enzymů BspHI a HindlII.

DNA kódující mOPGL(158-316)_P2(256-261) s N-koncovou histidinovou koncovkou (SEQ ID NO: 15)

PCR byla provedena za použití SEQ ID NO: 27 a 28 jako primerů bez templátu. Vzniklý PCR fragment byl restrikčně tráven Pstl a EcoRI a potom byl přečištěn z agarosového gelu. Získaný fragment byl potom ligován do SEQ ID NO: 9 v pBluescript KS+ restrikčně tráveném SacII a HindlII. Verifikovaný konstrukt (SEQ ID NO: 15) byl potom přenesen do pTrc99a za použití restrikčních enzymů BspHI a HindlII.

DNA kódující mOPGL(158-316)_P2(288-302) s N-koncovou histidinovou koncovkou (SEQ ID NO: 17)

PCR SEQ ID NO: 9 byla provedena za použití SEQ ID NO: 22 a 29 jako primerů. Vzniklý PCR fragment byl restrikčně tráven Pstl a BstBI a potom byl přečištěn z agarosového gelu. Druhá PCR za použití SEQ ID NO: 9 jako templátu byla provedena za použití primerů SEQ ID NO: 30 a primerů specifického pro vektor. Vzniklý PCR fragment byl restrikčně tráven BstBI a KpnI a potom byl přečištěn na gelu. Oba fragmenty byly potom ligovány do SEQ ID NO: 9 v pBluescript KS+ restrikčně tráveném Pstl a KpnI. Verifikovaný konstrukt (SEQ ID NO: 17) byl potom přenesen do pTrc99a za použití restrikčních enzymů BspHI a HindlII.

DNA kódující mOPGL(158-316)_P30(221-241) s N-koncovou histidinovou koncovkou (SEQ ID NO: 19) • 4

4

PCR SEQ ID NO: 9 byla provedena za použiti SEQ ID NO: 22 a 29 jako primerů. Vzniklý PCR fragment byl restrikčně tráven SacII a KpnI a potom byl přečištěn z agarosového gelu. Druhá PCR za použiti SEQ ID NO: 9 jako templátu byla provedena za použití primerů SEQ ID NO: 34 a 31. Vzniklý PCR fragment byl restrikčně tráven KpnI a EcoRI a potom byl přečištěn na gelu. Oba fragmenty byly potom ligovány do SEQ ID NO: 9 v pBluescript KS+ restrikčně tráveném SacII a EcoRI. Verifikovaný konstrukt (SEQ ID NO: 19) byl potom přenesen do pTrc99a za použití restrikčních enzymů BspHI a HindlII.

Exprese těchto zkrácených variant OPGL proběhla v E. coli za zisku více než 20% celkového proteinu pro všechny varianty. Další vývoj výše popsaných přečišťovacích a skládacích postupů pro přirozený protein (SEQ ID NO: 9) bude proveden. Tento postup může sloužit jako základ pro vývoj optimálních postupů pro každou z variant. Imobilizované skládání variant proteinů využívající histidinovou koncovku je dalším postupem, na kterém se pracuje.

Alternativně mohou být varianty přímo přeneseny do expresních vektorů pro Pichia pastoris pomocí restrikčních enzymů, nebo do jiných kvasinkových expresních systému za použití PCR, pokud je požadována glykosylace. je třeba poznamenat, že glykosylace není nutná pro biologickou aktivitu OPGL in vivo. Je také možné exprimovat zkrácené OPGL v lidských 293 fibroblastech, jak je popsáno v Lacey et al. Exprese ve hmyzích buňkách je také možná (například v Schneider 2 (S2) buněčné linii a vektorovém systému nebo v buňkách Spodoptera frugiperda (SF) a vektorových systémech, kde obě linie jsou dostupné od Invitrogen).

Přečištěné varianty mohou být použity pro produkci ·· · * ♦ ♦ • ··· · · ··· • · · · · · • · · · · · · » .

**· ** ·· ··· ·· ··· protilátek u králíků pro pozdější použití jako detekční nástroje, protože neexistují žádné komerčně dostupné protilátky. Dále bude tento materiál velmi hodnotným prostředkem v biologických testech pro hodnocení potenciálně vhodných sloučenin pro autovakcíny. Příprava protilátek bude provedena za použití metod známých v oboru.

Selekce nejlepších kandidátů pro autovakcíny se provede hodnocením inhibiční aktivity v testech zrání/aktivace osteoklastů in vitro nebo in vivo na zvířecích modelech osteoporosy. Použitelné testy a modelové systémy jsou popsány v literatuře (například v Lacey et al., Fuller et al., a Simonet et al.).

Aktivita rekombinantních proteinů bude analyzována intravenosní injekcí 100 μΐ neanestezovaným Balb/c myším (0, 0,1 a 1,0 mg proteinu na kg hmotnosti myši) a o hodinu později odebráním 125 μΐ krve z hlavní žíly boltce za použití kapilárky potažené heparinem nasyceným vápníkem. Koncentrace vápníku se měří za použití ICA2 (Radiometer, Denmark). Přečištěný a složený rekombinantní myší OPGL (SEQ ID NO: 9) je reaktivní v tomto testu a zvyšuje koncentrace ionizovaného vápníku v cirkulaci o až 100%.

Kandidáti na autovakcínu budou hodnoceni například za použití autovakcinace a následného sledování inhibice uvolňování ionizovaného vápníku do periferní krve po injekci rekombinantního mOPGL myším (jak je popsáno v Burgess et al.).

Je třeba uvést, že jako alternativa k modifikovanému OPGL mohou antiidiotypové protilátky namířené proti idiotypu antiOPGL protilátky také sloužit jako imunogeny podle předkládaného vynálezu. Obdobně, použití mimotopových • · · · · · • ·

• ♦♦ ··· ·· · ♦ · · • · ·· ·· • · ♦ • · · • · · • · · · · polypeptidu, které mohou být izolovány, například, pomocí fágového zobrazovacího systému za použití anti-OPGL nebo osteoprotegerinu jako zachycovací sondy, jako imunogenů, spadá také do rozsahu předkládaného vynálezu.

Odkazy:

1.	Bucay,	N. et al., 1998, Genes	Dev.	12: 1260-1268.
2.	Lacey,	D.L. et al., 1998, Cell 93:	165-176.
3.	Marks,	S.C. Jr., 1989, Am. J.	Med.	Genet. 34: 43-53.
4 .	Simonet	., W.S. et al. (1997) ,	Cell	89: 309-319.
5.	Fuler,	W.S. et al., 1997, J.	Exp.	Med. 188: 997-1001

6. Burgess, T.L. et al., 1999, J. Cell. Biol. 145: 527-538.

7. Pedersen J. et al., 1999, Protein Expr. Purif. 15: 389-400.

• 44	44	4444	φ 4
• · ·	• *	•	• ♦ 4
• 4 4 4	• 4	4 4 4	• 4
• 4 ·	• · 4	•	4 φ 4
• · ·	• ·	•	• 4
• · · 4 4	• 4	• 4 4	·· 4

Seznam sekvenci <110> M&E Biotech A/S

HALKIER, Torben

HAANING, Jesper <120> Způsob pro in vivo inhibici aktivity ligandu pro osteoprotegerin

<130>	22021	PC	1
<140>
<141>
<160>	35
<170>	Patentln	ver
<210>	1
<211>	2271
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens

<220>

<221> CDS <222> (185)...(1138) <400> 1 aagcttggta ccgagctcgg aaagccgggc tccaagtcgg cgcagacaag aaggggaggg atccactact cgacccacgc cgccccacgt cgaggctccg agcgggagag ggaggagagc gtccgcgcgc cccaggagcc 60 ccgcagcctc cggagttggc 120 tccgaagcga gagggccgag 180 cgcc atg cgc cgc gcc agc aga gac tac acc aag tac ctg cgt ggc tcg 229 Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser

1

5

10

15

gag

gag

atg

ggc

ggc

ggc

ccc

gga

gcc

ccg

cac

gag

ggc

ccc

ctg

cac

277

*

Glu

Glu

Met

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Pro

His

Glu

Gly

Pro

Leu

His

20

25

30

gcc

ccg

ccg

ccg

cct

gcg

ccg

cac

cag

ccc

ccc

gcc

gcc

tcc

cgc

tcc

325

Ala

Pro

Pro

Pro

Pro

Ala

Pro

His

Gin

Pro

Pro

Ala

Ala

Ser

Arg

Ser

35

40

45

atg

ttc

gtg

gcc

ctc

ctg

ggg

ctg

ggg

ctg

ggc

cag

gtt

gtc

tgc

agc

373

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Gin

Val

Val

Cys

Ser

55 60 φ φ ·· φ φ

gtc

gcc

ctg

ttc

ttc

tat

ttc

aga

gcg

cag

atg

gat

cct

aat aga

ata

421

Val

Ala

Leu

Phe

Phe

Tyr

Phe

Arg

Ala

Gin

Met

Asp

Pro

Asn Arg

Ile

65

70

75

tea

gaa

gat

ggc

act

cac

tgc

att

tat

aga

att

ttg

aga

ctc

cat

gaa

469

Ser

Glu

Asp

Gly

Thr

His

Cys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Leu

Arg

Leu

His

Glu

80

85

90

95

aat

gca

gat

ttt

caa

gac

aca

act

ctg

gag

agt

caa

gat

aca

aaa

tta

517

Asn

Ala

Asp

Phe

Gin

Asp

Thr

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Asp

Thr

Lys

Leu

100

105

110

ata

cct

gat

tea

tgt

agg

aga

att

aaa

cag

gcc

ttt

caa

gga

get

gtg

565

Ile

Pro

Asp

Ser

Cys

Arg

Arg

Ile

Lys

Gin

Ala

Phe

Gin

Gly

Ala

Val

115

120

125

caa

aag

gaa

tta

caa

cat

atc

gtt

gga

tea

cag

cac

atc

aga

gca

gag

613

Gin

Lys

Glu

Leu

Gin

His

Ile

Val

Gly

Ser

Gin

His

Ile

Arg

Ala

Glu

130

135

140

aaa

gcg

atg

gtg

gat

ggc

tea

tgg

tta

gat

ctg

gcc

aag

agg

age

aag

661

Lys

Ala

Met

Val

Asp

Gly

Ser

Trp

Leu

Asp

Leu

Ala

Lys

Arg

Ser

Lys

145

150

155

ctt

gaa

get

cag

cct

ttt

get

ca t

ctc

act

att

aat

gcc

acc

gac

atc

709

Leu

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Thr

Asp

Ile

160

165

170

175

cca

tet

ggt

tcc

cat

aaa

gtg

agt

ctg

tcc

tet

tgg

tac

cat

gat

cgg

757

Pro

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Ser

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

180

185

190

ggt

tgg

gcc

aag

atc

tcc

aac

atg

act

ttt

age

aat

gga

aaa

cta

ata

805

Gly

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

195

200

205

gtt

aat

cag

gat

ggc

ttt

tat

tac

ctg

tat

gcc

aac

att

tgc

ttt

ega

853

Val

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

210

215

220

cat

cat

gaa

act

tea

gga

gac

cta

get

aca

gag

tat

ctt

caa

cta

atg

901

His

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Asp

Leu

Ala

Thr

Glu

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

225

230

235

gtg

tac

gtc

act

aaa

acc

age

atc

aaa

atc

cca

agt

tet

cat

acc

ctg

949

Val

Tyr

Val

Thr

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Thr

Leu

240

245

250

255

atg

aaa

gga

gga

age

acc

aag

tat

tgg

tea

ggg

aat

tet

gaa

ttc

cat

997

Met

Lys

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Tyr

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

260

265

270

·« ···· • « • ···

ttt tat tcc ata aac gtt ggt gga ttt ttt aag Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys	tta cgg tet Leu Arg Ser 285	gga gag Gly Glu	1045
	275	280
gaa atc agc Glu Ile Ser 290	atc gag gtc tcc aac ccc tcc tta Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu 295	ctg gat ccg Leu Asp Pro 300	gat cag Asp Gin	1093
gat gca aca Asp Ala Thr 305	tac ttt ggg gct ttt aaa gtt ega Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg 310	gat ata gat Asp Ile Asp 315	tga	1138
gccccagttt	ttggagtgtt	atgtatttcc	tggatgtttg	gaaacatttt	ttaaaacaag	1198
ccaagaaaga	tgtatatagg	tgtgtgagac	tactaagagg	catggcccca	acggtacacg	1258
actcagtatc	catgctcttg	accttgtaga	gaacacgcgt	atttacagcc	agtgggagat	1318
gttagactca	tggtgtgtta	cacaatggtt	tttaaatttt	gtaatgaatt l	cctagaatta	1378
aaccagattg	gagcaattac	gggttgacct	tatgagaaac	tgcatgtggg	ctatgggagg	1438
ggttggtccc	tggtcatgtg	ccccttcgca	gctgaagtgg	agagggtgtc	atetagegea	1498
attgaaggat	catctgaagg	ggcaaattct	tttgaattgt	tacatcatgc	tggaacctgc	1558
aaaaaatact	ttttctaatg	aggagagaaa	atatatgtat	ttttatataa	tatctaaagt	1618
tatatttcag	atgtaatgtt	ttctttgcaa	agtattgtaa	attatatttg	tgctatagta	1678
tttgattcaa	aatatttaaa	aatgtcttgc	tgttgacata	tttaatgttt	taaatgtaca	1738
gacatattta	actggtgcac	tttgtaaatt	ccctggggaa	aacttgcagc	taaggagggg	1798
aaaaaaatgt	tgtttcctaa	tatcaaatgc	agtatatttc	ttcgttcttt	ttaagttaat	1858
agattttttc	agacttgtca	agcctgtgca	aaaaaattaa	aatggatgcc	ttgaataata	1918
agcaggatgt	tggccaccag	gtgcctttca	aatttagaaa	ctaattgact	ttagaaagct	1978
gacattgcca	aaaaggatac	ataatgggcc	actgaaatct	gtcaagagta	gttatataat	2038
tgttgaacag	gtgtttttcc	acaagtgccg	caaattgtac	cttttttttt	ttttcaaaat	2098
agaaaagtta	ttagtggttt	atcagcaaaa	aagtccaatt	ttaatttagt	aaatgttatc	2158
ttatactgta	caataaaaac	attgcctttg	aatgttaatt	ttttggtaca	aaaataaatt	2218
tatatgaaaa	aaaaaaaaaa	agggcggccg	ctctagaggg	ccctattcta	tag	2271

<210> 2 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2 Met Arg 1

Arg

Ala

Ser Arg Asp 5

Tyr Thr

Lys Tyr 10

Leu Arg

Gly

Ser 15

Glu

Glu

Met

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Pro

His

Glu

Gly

Pro

Leu

His

Ala

20

25

30

Pro

Pro

Pro

Pro

Ala

Pro

His

Gin

Pro

Pro

Ala

Ala

Ser

Arg

Ser

Met

35

40

45

Phe

Val

Ala

Leu

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Gin

Val

Val

Cys

Ser

Val

50

55

60

Ala

Leu

Phe

Phe

Tyr

Phe

Arg

Ala

Gin

Met

Asp

Pro

Asn

Arg

Ile

Ser

65

70

75

80

Glu

Asp

Gly

Thr

His

Cys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Leu

Arg

Leu

His

Glu

Asn

85

90

95

Ala

Asp

Phe

Gin

Asp

Thr

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Asp

Thr

Lys

Leu

Ile

100

105

110

Pro

Asp

Ser

Cys

Arg

Arg

Ile

Lys

Gin

Ala

Phe

Gin

Gly

Ala

Val

Gin

115

120

125

Lys

Glu

Leu

Gin

His

Ile

Val

Gly

Ser

Gin

His

Ile

Arg

Ala

Glu

Lys

130

135

140

Ala

Met

Val

Asp

Gly

Ser

Trp

Leu

Asp

Leu

Ala

Lys

Arg

Ser

Lys

Leu

145

150

155

160

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Thr

Asp

Ile

Pro

165

170

175

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Ser

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

180

185

190

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Val

195

200

205

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

210

215

220

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Asp

Leu

Ala

Thr

Glu

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

225

230

235

240

Tyr

Val

Thr

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Thr

Leu

Met

245

250

255

Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe ·· ··· ·

260

265

270

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ser

Gly

Glu

Glu

275

280

285

-

Ile

Ser

Ile

Glu

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

290

295

300

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Arg

Asp

Ile

Asp

305 310 315 <210> 3 <211> 951 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1) .. (951) <220>

<221> různé vlastnosti <222> (142) .. (213)

Transmembránova doména <220>

<221> i různé vlastnosti <222> (454?..(948) <223> doména podobná faktoru nekrosy nádorů (TNF) <400> 3

atg Met 1

cgc Arg

cgg Arg

gcc Ala

age Ser 5

ega Arg

gac Asp

tac ggc

aag Lys 10

tac Tyr

ctg Leu

cgc Arg

age Ser

tcg Ser 15

gag Glu

48

Tyr

Gly

gag

atg

ggc

age

ggc

ccc

ggc

gtc

cca

cac

gag

ggt

ccg

ctg

cac

ccc

96

Glu

Met

Gly

Ser

Gly

Pro

Gly

Val

Pro

His

Glu

Gly

Pro

Leu

His

Pro

20

25

30

gcg

cct

tet

gca

ccg

gct

ccg

gcg

ccg

cca

ccc

gcc

gcc

tcc

cgc

tcc

144

Ala

Pro

Ser

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Ala

Ala

Ser

Arg

Ser

35

40

45

atg

ttc

ctg

gcc

ctc

ctg

ggg

ctg

gga

ctg

ggc

cag

gtg

gtc

tgc

age

192

Met

Phe

Leu

Ala

Leu

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Gin

Val

Val

Cys

Ser

50

55

60

atc

gct

ctg

ttc

ctg

tac

ttt

ega

gcg

cag

atg

gat

cct

aac

aga

ata

240

Ile

Ala

Leu

Phe

Leu

Tyr

Phe

Arg

Ala

Gin

Met

Asp

Pro

Asn

Arg

Ile

65

70

75

80

·· ··«·

tea Ser

gaa Glu

gac Asp

agc act

cac His

tgc Cys

ttt Phe

tat aga

atc Ile

ctg Leu

aga Arg

ctc Leu

cat His 95

gaa Glu

288

Ser

Thr 85

Tyr

Arg 90

aac

gca

ggt

ttg

cag

gac

tcg

act

ctg

gag

agt

gaa

gac

aca

cta

cct

336

Asn

Ala

Gly

Leu

Gin

Asp

Ser

Thr

Leu

Glu

Ser

Glu

Asp

Thr

Leu

Pro

100

105

110

gac

tcc

tgc

agg

agg

atg

aaa

caa

gcc

ttt

cag

ggg

gcc

gtg

cag

aag

384

Asp

Ser

Cys

Arg

Arg

Met

Lys

Gin

Ala

Phe

Gin

Gly

Ala

Val

Gin

Lys

115

120

125

gaa

ctg

caa

cac

att

gtg

ggg

cca

cag

cgc

ttc

tea

gga

get

cca

get

432

Glu

Leu

Gin

His

Ile

Val

Gly

Pro

Gin

Arg

Phe

Ser

Gly

Ala

Pro

Ala

130

135

140

atg

atg

gaa

ggc

tea

tgg

ttg

gat

gtg

gcc

cag

ega

ggc

aag

cct

gag

480

Met

Met

Glu

Gly

Ser

Trp

Leu

Asp

Val

Ala

Gin

Arg

Gly

Lys

Pro

Glu

145

150

155

160

gcc

cag

cca

ttt

gca

cac

ctc

acc

atc

aat

get

gcc

agc

atc

cca

tcg

528

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

Ser

165

170

175

ggt

tcc

cat

aaa

gtc

act

ctg

tcc

tet

tgg

tac

cac

gat

ega

ggc

tgg

576

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

Trp

180

185

190

gcc

aag

atc

tet

aac

atg

acg

tta

agc

aac

gga

aaa

cta

agg

gtt

aac

624

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

Asn

195

200

205

caa

gat

ggc

ttc

tat

tac

ctg

tac

gcc

aac

att

tgc

ttt

cgg

cat

cat

672

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

His

210

215

220

gaa

aca

tcg

gga

agc

gta

cct

aca

gac

tat

ctt

cag

ctg

atg

gtg

tat

720

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

Tyr

225

230

235

240

gtc

gtt

aaa

acc

agc

atc

aaa

atc

cca

agt

tet

cat

aac

ctg

atg

aaa

768

Val

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

Lys

245

250

255

gga

ggg

agc

acg

aaa

aac

tgg

tcg

ggc

aat

tet

gaa

ttc

cac

ttt

tat

816

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

260

265

270

tcc

ata

aat

gtt

ggg

gga

ttt

ttc

aag

ctc

ega

get

ggt

gaa

gaa

att

864

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Ile

275

280

285

·· ···« ·*·

age att

cag Gin

gtg Val

tcc aac Ser Asn

cct Pro 295

tcc Ser

ctg Leu

ctg gat Leu Asp

ccg Pro 300

gat Asp

caa gat gcg Gin Asp Ala

912

Ser

Ile 290

acg

tac

ttt

ggg

get

ttc

aaa

gtt

cag

gac

ata

gac

tga

951

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

305

310

315

<210> 4 <211> 316 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 4

Arg

Asp

Tyr

Gly

Lys 10

Tyr

Leu

Arg

Ser

Ser 15

Glu

Met 1

Arg Arg

Ala

Ser 5

Glu

Met

Gly

Ser

Gly

Pro

Gly

Val

Pro

His

Glu

Gly

Pro

Leu

His

Pro

20

25

30

Ala

Pro

Ser

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Ala

Ala

Ser

Arg

Ser

35

40

45

Met

Phe

Leu

Ala

Leu

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Gin

Val

Val

Cys

Ser

50

55

60

Ile

Ala

Leu

Phe

Leu

Tyr

Phe

Arg

Ala

Gin

Met

Asp

Pro

Asn

Arg

Ile

65

70

75

80

Ser

Glu

Asp

Ser

Thr

His

Cys

Phe

Tyr

Arg

Ile

Leu

Arg

Leu

His

Glu

85

90

95

Asn

Ala

Gly

Leu

Gin

Asp

Ser

Thr

Leu

Glu

Ser

Glu

Asp

Thr

Leu

Pro

100

105

110

Asp

Ser

Cys

Arg

Arg

Met

Lys

Gin

Ala

Phe

Gin

Gly

Ala

Val

Gin

Lys

115

120

125

Glu

Leu

Gin

His

Ile

Val

Gly

Pro

Gin

Arg

Phe

Ser

Gly

Ala

Pro

Ala

130

135

140

Met

Met

Glu

Gly

Ser

Trp

Leu

Asp

Val

Ala

Gin

Arg

Gly

Lys

Pro

Glu

145

150

155

160

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asr.

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

Ser

165

170

175

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

Trp

180

185

190

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

Asn

195

200

205

•	··		···«	99	e
··		•	•	•	9		··
•	·♦·	• ·	···	9 9	•
*	t ·	* 9	•	•	9 9	•	•
•	• ·	• · ·	•	9	•	9
	99	»·	999	99	99'

Gin Asp

Gly

Phe

Tyr Tyr Leu 215

Tyr Ala Asn

Ile

Cys 220

Phe

Arg

His

His

210

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

Tyr

225

230

235

240

Val

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

Lys

245

250

255

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

260

265

270

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Ile

275

280

285

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

290

295

300

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

305

310

315

<210> 5 <211> 2299 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (170)..(1120) <400> 5 gagctcggat ccactactcg acccacgcgt ccgcccacgc gtccggccag gacctctgtg 60 aaccggtcgg ggcgggggcc gcctggccgg gagtctgctc ggcggtgggt ggccgaggaa 120 gggagagaac gatcgcggag cagggcgccc gaactccggg cgccgcgcc atg cgc cgg 178 Met Arg Arg

gcc Ala

agc Ser 5

ega Arg

gac Asp

tac Tyr

ggc aag tac

ctg Leu

cgc agc Arg Ser

tcg Ser 15

gag Glu

gag atg Glu Met

ggc Gly

Gly Lys 10

Tyr

agc

ggc

ccc

ggc

gtc

cca

cac

gag

ggt

ccg

ctg

cac

ccc

gcg

cct

tet

Ser

Gly

Pro

Gly

Val

Pro

His

Glu

Gly

Pro

Leu

His

Pro

Ala

Pro

Ser

20

25

30

35

gca

ccg

get

ccg

gcg

ccg

cca

ccc

gcc

gcc

tcc

cgc

tcc

atg

ttc

ctg

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Ala

Ala

Ser

Arg

Ser

Met

Phe

Leu

40

45

50

gcc Ala

ctc Leu

ctg Leu

ggg Gly 55

ctg Leu

gga Gly

ctg Leu

ggc cag

gtg Val

gtc Val

tgc Cys

agc Ser

atc Ile 65

gct Ala

ctg Leu

370

Gly

Gin 60

ttc

ctg

tac

ttt

ega

gcg

cag

atg

gat

cct

aac

aga

ata

tea

gaa

gac

418

Phe

Leu

Tyr

Phe

Arg

Ala

Gin

Met

Asp

Pro

Asn

Arg

Ile

Ser

Glu

Asp

70

75

80

agc

act

cac

tgc

ttt

tat

aga

atc

ctg

aga

ctc

cat

gaa

aac

gca

ggt

466

Ser

Thr

His

Cys

Phe

Tyr

Arg

Ile

Leu

Arg

Leu

His

Glu

Asn

Ala

Gly

85

90

95

ttg

cag

gac

tcg

act

ctg

gag

agt

gaa

gac

aca

cta

cct

gac

tcc

tgc

514

Leu

Gin

Asp

Ser

Thr

Leu

Glu

Ser

Glu

Asp

Thr

Leu

Pro

Asp

Ser

Cys

100

105

110

115

agg

agg

atg

aaa

caa

gcc

ttt

cag

ggg

gcc

gtg

cag

aag

gaa

ctg

caa

562

Arg

Arg

Met

Lys

Gin

Ala

Phe

Gin

Gly

Ala

Val

Gin

Lys

Glu

Leu

Gin

120

125

130

cac

att

gtg

ggg

cca

cag

ege

ttc

tea

gga

gct

cca

gct

atg

atg

gaa

610

His

Ile

Val

Gly

Pro

Gin

Arg

Phe

Ser

Gly

Ala

Pro

Ala

Met

Met

Glu

135

140

145

ggc

tea

tgg

ttg

gat

gtg

gcc

cag

ega

ggc

aag

cct

gag

gcc

cag

cca

658

Gly

Ser

Trp

Leu

Asp

Val

Ala

Gin

Arg

Gly

Lys

Pro

Glu

Ala

Gin

Pro

150

155

160

ttt

gca

cac

ctc

acc

atc

aat

gct

gcc

agc

atc

cca

tcg

ggt

tcc

cat

706

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

Ser

Gly

Ser

His

165

170

175

aaa

gtc

act

ctg

tcc

tet

tgg

tac

cac

gat

ega

ggc

tgg

gcc

aag

atc

754

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

Trp

Ala

Lys

Ile

180

185

190

195

tet

aac

atg

acg

tta

agc

aac

gga

aaa

cta

agg

gtt

aac

caa

gat

ggc

8 02

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

Asn

Gin

Asp

Gly

200

205

210

ttc

tat

tac

ctg

tac

gcc

aac

att

tgc

ttt

cgg

cat

cat

gaa

aca

tcg

850

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

His

Glu

Thr

Ser

215

220

225

gga

agc

gta

cct

aca

gac

tat

ctt

cag

ctg

atg

gtg

tat

gtc

gtt

aaa

898

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

Tyr

Val

Val

Lys

230

235

240

acc

agc

atc

aaa

atc

cca

agt

tet

cat

aac

ctg

atg

aaa

gga

ggg

agc

946

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

Lys

Gly

Gly

Ser

245

250

255

acg

aaa

aac

tgg

tcg

ggc

aat

tet

gaa

ttc

cac

ttt

tat

tcc ata

aat

994

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

Ser Ile

Asn

260

265

270

275

gtt

ggg

gga

ttt

ttc

aag

ctc

ega

gct

ggt

gaa

gaa

att

agc att

cag

1042

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Ile

Ser Ile

Gin

280

285

290

gtg

tcc

aac

cct

tcc

ctg

ctg

gat

ccg

gat

caa

gat

gcg

acg tac

ttt

1090

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

Thr Tyr

Phe

295

300

305

ggg

gct

ttc

aaa

gtt

cag

gac

ata

gac

tga

gaeteattte i

gtggaacatt

1140

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

310

315

agcatggatg	tcctagatgt	ttggaaactt	cttaaaaaat	ggatgatgtc	tatacatgtg	1200
taagactact	aagagacatg	gcccacggtg	tatgaaactc	acagccctct	ctcttgagcc	1260
tgtacaggtt	gtgtatatgt	aaagtccata	ggtgatgtta	gattcatggt	gattacacaa	1320
cggttttaca	attttgtaat	gatttcctag	aattgaacca	gattgggaga	ggtattccga	1380
tgcttatgaa	aaacttacac	gtgagctatg	gaagggggtc	acagtctctg	ggtctaaccc	1440
ctggacatgt	gccactgaga	accttgaaat	taagaggatg	ccatgtcatt	gcaaagaaat	1500
gatagtgtga	agggttaagt	tcttttgaat	tgttacattg	cgctgggacc	tgcaaataag	1560
ttcttttttt	ctaatgagga	gagaaaaata	tatgtatttt	tatataatgt	ctaaagttat	1620
atttcaggtg	taatgttttc	tgtgcaaagt	tttgtaaatt	atatttgtgc	tatagtattt	1680
gattcaaaat	atttaaaaat	gtctcactgt	tgacatattt	aatgttttaa	atgtacagat	1740
gtatttaact	ggtgcacttt	gtaattcccc	tgaaggtact	cgtagctaag	ggggcagaat	1800
actgtttctg	gtgaccacat	gtagtttatt	tetttattet	ttttaactta	atagagtett	1860
cagacttgtc	aaaactatgc	aagcaaaata	aataaataaa	aataaaatga	ataccttgaa	1920
taataagtag	gatgttggtc	accaggtgcc	tttcaaattt	agaagctaat	tgactttagg	1980
agctgacata	gccaaaaagg	atacataata	ggctactgaa	atctgtcagg	agtatttatg	2040
caattattga	acaggtgtct	ttttttacaa	gagctacaaa	ttgtaaattt	tgtttctttt	2100
ttttcccata	gaaaatgtac	tatagtttat	cagccaaaaa	acaatccact	ttttaattta	2160
gtgaaagtta	ttttattata	ctgtacaata	aaagcattgt	ctctgaatgt	taattttttg	2220

gtacaaaaaa taaatttgta cgaaaacctg aaaaaaaaaa aaaaaaaggg cggccgctct 2280 • · · • · · agagggccct attctatag

2299 <210> 6 <211> 316 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 6

Ala

Ser 5

Arg

Asp Tyr Gly Lys 10

Tyr

Leu

Arg

Ser

Ser 15

Glu

Met 1

Arg Arg

Glu

Met

Gly

Ser

Gly

Pro

Gly

Val

Pro

His

Glu

Gly

Pro

Leu

His

Pro

20

25

30

Ala

Pro

Ser

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Ala

Ala

Ser

Arg

Ser

35

40

45

Met

Phe

Leu

Ala

Leu

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Gin

Val

Val

Cys

Ser

50

55

60

Ile

Ala

Leu

Phe

Leu

Tyr

Phe

Arg

Ala

Gin

Met

Asp

Pro

Asn

Arg

Ile

65

70

75

80

Ser

Glu

Asp

Ser

Thr

His

Cys

Phe

Tyr

Arg

Ile

Leu

Arg

Leu

His

Glu

85

90

95

Asn

Ala

Gly

Leu

Gin

Asp

Ser

Thr

Leu

Glu

Ser

Glu

Asp

Thr

Leu

Pro

100

105

110

Asp

Ser

Cys

Arg

Arg

Met

Lys

Gin

Ala

Phe

Gin

Gly

Ala

Val

Gin

Lys

115

120

125

Glu

Leu

Gin

His

Ile

Val

Gly

Pro

Gin

Arg

Phe

Ser

Gly

Ala

Pro

Ala

130

135

140

Met

Met

Glu

Gly

Ser

Trp

Leu

Asp

Val

Ala

Gin

Arg

Gly

Lys

Pro

Glu

145

150

155

160

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

Ser

165

170

175

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

Trp

180

185

190

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

Asn

195

200

205

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

His

210

215

220

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

Tyr

225

230

235

240

• · · ·

Val

Val

Lys

Thr

Ser 245

Ile Lys

Ile

Pro

Ser 250

Ser His

Asn

Leu

Met 255

Lys

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

260

265

270

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Ile

275

280

285

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Tkla

290

295

300

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

305

310

315

<210> 7 <211> 564 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(564) <220>

<223> Popis artificiální sekvence: Syntetický PCR produkt s optimálními kodony pro expresi v E.coli a P. pastoris <220>

<221> různé navázané složky <222> (43)..(84) <223> : His koncovka <220>

<221> ^různé vlastnosti <222> (1).7(36) <223> c-koncová část α-párovaciho faktoru S.cerevisiae <220>

<221> různé vlastnosti <222> (85)..(561) <223> kódující zbytky 158-316 přirozeného myšího OPGL <400> 7 gag ctc gga tcc ctc gag aaa aga gag gct gaa gct cat gtc atg aaa 48

Glu Leu Gly Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala His Val Met Lys

10 15

cac His

caa Gin

cac His

caa Gin 20

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin

cat His 25

caa Gin

cat His

caa Gin

aaa Lys

cct Pro 30

gaa Glu

gct Ala

96

cag

cca

ttc

gct

cat

ctg

acc

atc

aac

gct

gca

tcg

atc

cct

tet

ggt

144

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

Ser

Gly

35

40

45

tet

cat

aaa

gtt

acc

ctg

tet

tet

tgg

tat

cac

gac

ege

ggt

tgg

gct

192

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

Trp

Ala

50

55

60

aaa

atc

tet

aac

atg

acc

ctg

tet

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

aac

cag

240

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

Asn

Gin

65

70

75

80

gac

ggt

ttc

tac

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

tgt

ttc

aga

cat

cac

gaa

288

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

His

Glu

85

90

95

acc

tet

ggt

tet

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

atg

gtt

tac

gtt

336

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

Tyr

Val

100

105

110

gtt

aaa

acc

tet

atc

aaa

atc

cca

tet

tca

cat

aac

ctg

atg

aaa

ggt

384

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

Lys

Gly

115

120

125

ggt

tet

acc

aaa

aac

tgg

tet

ggt

aac

tet

gaa

ttc

cat

ttc

tac

tet

432

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

Ser

130

135

140

atc

aac

gtt

ggt

ggt

ttc

ttc

aaa

ctg

aga

gct

ggt

gaa

gaa

atc

tet

480

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Ile

Ser

145

150

155

160

atc

cag

gtt

tet

aac

cct

tet

ctg

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

gct

acc

528

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

Thr

165

170

175

tac

ttc

ggg

gcc

ttc

aaa

gtt

cag

gac

atc

gac

tag

564

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

180 185 <210> 8 <211> 187 <212> PRT <213> Artificiálni sekvence <223> popis artificiálni sekvence: Syntetický PCR produkt s optimálními kodony pro expresi v E.coli a P. pastoris • ·

6 .

<400> 8

Glu 1

Leu

Gly

Ser

Leu Glu Lys 5

Arg

Glu Ala 10

Glu

Ala

His

Val

Met 15

Lys

His

Gin

His

Gin

His

Gin

His

Gin

His

Gin

His

Gin

Lys

Pro

Glu

Ala

20

25

30

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

Ser

Gly

35

40

45

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

Trp

Ala

50

55

60

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

Asn

Gin

65

70

75

80

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

His

Glu

85

90

95

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

Tyr

Val

100

105

110

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

Lys

Gly

115

120

125

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

Ser

130

135

140

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Ile

Ser

145

150

155

160

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

Thr

165

170

175

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

180

185

<210> 9 <211> 519 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> p_Opis artificiální sekvence: DNA kódující zbytky 158-316 přirozeného myšíh OPGL fúzovaná na His koncovku <220>

<221> CDS <222> (1)..(519) <220>

<221> různé navázané složky <222> (1).7(42) <223> His koncová <220>

<221> různé vlastnosti <222> (43)..(519) <223> zbytky 158-316 myšího OPGL 5 <400> 9

atg Met 1

aaa Lys

cac His

caa Gin

cac His 5

caa Gin

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin 10

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin

aaa Lys 15

cct Pro

48

gaa

gct

cag

cca

ttc

gct

cat

ctg

acc

atc

aac

gct

gca

tcg

atc

cct

96

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

tet

ggt

tet

cat

aaa

gtt

acc

ctg

tet

tet

tgg

tat

cac

gac

cgc

ggt

144

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

tgg

gct

aaa

atc

tet

aac

atg

acc

ctg

tet

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

aac

cag

gac

ggt

ttc

tac

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

tgt

ttc

aga

cat

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

cac

gaa

acc

tet

ggt

tet

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

atg

gtt

288

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

tac

gtt

gtt

aaa

acc

tet

atc

aaa

atc

cca

tet

tea

cat

aac

ctg

atg

336

Tyr

Val

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

aaa

ggt

ggt

tet

acc

aaa

aac

tgg

tet

ggt

aac

tet

gaa

ttc

cat

ttc

384

Lys

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

tac

tet

atc

aac

gtt

ggt

ggt

ttc

ttc

aaa

ctg

aga

gct

ggt

gaa

gaa

432

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

130

135

140

atc

tet

atc

cag

gtt

tet

aac

cct

tet

ctg

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

480

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

145 150 155 160 gct acc tac ttc ggg gcc ttc aaa gtt cag gac atc gac

Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gin Asp Ile Asp

165 170

519 <210> 10 <211> 173 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <223> Popis artificiální sekvence: DNA kódující zbytky 158-316 přirozeného myšíhc OPGL fúzovaná na His koncovku <400> 10 ~

Met 1

Lys

His

Gin

His 5

Gin

His

Gin

His

Gin 10

His

Gin

His

Gin

Lys 15

Pro

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

Tyr

Val

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

Lys

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

130

135

140

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

145

150

155

160

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165

170

<210> 11 <211> 519 <212> DNA <213>

Artificiální sekvence <220>

<223> popis artificiální sekvence: Fúze myšího OPGL, zbytků 158-316, s mutací C na S, a His koncovky

I <220>

<221> CDS <222> (1)..(519) <220>

<221> různé navázané složky <222> (1) . . (42) ^<223:: His koncovka <220>

<221> různé vlastnosti <222> (43)..(228) <223> 1 zbytky 158-219 myšího OPGL <220>

<221> různé vlastnosti <222> (232)..(519) <223> .zbytky 221-316 myšího OPGL <220>

<221> ^Mutace <222> (229)..(231) <223> t_tgt (Cys) na tcc (Ser) <220>

<400> 11

atg Met 1

aaa Lys

cac His

caa Gin

cac His 5

caa Gin

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin 10

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin

aaa Lys 15

cct Pro

48

gaa

get

cag

cca

ttc

get

cat

ctg

acc

atc

aac

get

gca

tcg

atc

cct

96

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

tet

ggt

tet

cat

aaa

gtt

acc

ctg

tet

tet

tgg

tat

cac

gac

ege

ggt

144

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

tgg

get

aaa

atc

tet

aac

atg

acc

ctg

tet

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

aac

cag

gac

ggt

ttc

tac

tac

ctg

tac

get

aac

atc

tec

ttc

aga

cat

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Ser

Phe

Arg

His

65

70

75

80

cac

gaa

acc

tet

ggt

tet

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

atg

gtt

288

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

tac Tyr

gtt Val

gtt Val

aaa Lys 100

acc Thr

tet Ser

atc Ile

aaa Lys

atc Ile 105

cca Pro

tet Ser

tea Ser

cat His

aac Asn 110

ctg Leu

atg Met

336

aaa

ggt

ggt

tet

acc

aaa

aac

tgg

tet

ggt

aac

tet

gaa

ttc

cat

ttc

304

Lys

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

tac

tet

atc

aac

gtt

ggt

ggt

ttc

ttc

aaa

ctg

aga

get

ggt

gaa

gaa

432

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

130

135

140

atc

tet

atc

cag

gtt

tet

aac

cct

tet

ctg

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

480

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

145

150

155

160

get

acc

tac

ttc

ggg

gcc

ttc

aaa

gtt

cag

gac

atc

gac

519

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165

170

<210> 12 <211> 173 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <223> Popis artificiální sekvence: Fúze myšího OPGL, zbytků 158-316, s mutací C na S, a His koncovky

<400> 12

Gin

His 5

Gin

His

Gin

His

Gin 10

His

Gin

His

Gin

Lys 15

Pro

Met 1

Lys

His

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Ser

Phe

Arg

His

65

70

75

80

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

Tyr

Val

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

Lys

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

· ·♦ ··♦·

Tyr

Ser 130

Ile Asn

Val

Gly

Gly 135

Phe

Phe

Lys

Leu Arg Ala 140

Gly Glu

Glu

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp-Gin

Asp

145

150

155

160

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165

170

<210> 13 <211> 564 <212> DNA <213>

Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: Fúze myšího OPGL, zbytků 158-316, modifikovaných vložením P30 epitopů tet·»”⁴ ”kého toxoidu, a His koncovky <220>

<221> CDS <222> (1)..(564) <220>

<221> různé navázané složky <222> (1)..(42) <223> hís koncovka <220>

<221> různé vlastnosti <222> (43)..(336) <223> zbytky 158-255 myšího OPGL <220>

<221> různé vlastnosti <222> (337) .. (399) <223> ~p30 epitop tetanického toxoidu <220>

<221> ^různé vlastnosti <222> (400) .. (564) <223> zbytky 262-316 myšího OPGL <400> 13 atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa aaa cct 48

Met Lys His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin Lys Pro

10 15 • · «««·

gaa Glu

gct Ala

cag Gin

cca Pro 20

ttc Phe

gct Ala

cat His

ctg Leu

acc Thr 25

atc Ile

aac Asn

gct Ala

gca Ala

tcg Ser 30

atc Ile

cct Pro

96

tet

ggt

tet

cat

aaa

gtt

acc

ctg

tet

tet

tgg

tat

cac

gac

cgc

ggt

144

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

tgg

gct

aaa

atc

tet

aac

atg

acc

ctg

tet

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

aac

cag

gac

ggt

ttc

tac

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

tgt

ttc

aga

cat

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

cac

gaa

acc

tet

ggt

tet

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

atg

gtt

288

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

tac

gtt

gtt

aaa

acc

tet

atc

aaa

atc

cca

tet

tca

cat

aac

ctg

atg

336

Tyr

Val

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

ttc

aac

aac

ttc

acc

gtt

tet

ttc

tgg

ctg

agg

gta

ccg

aaa

gtt

tet

384

Phe

Asn

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

115

120

125

gct

tet

cac

ctg

gaa

aac

tgg

tet

ggt

aac

tet

gaa

ttc

cat

ttc

tac

432

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

130

135

140

tet

atc

aac

gtt

ggt

ggt

ttc

ttc

aaa

ctg

aga

gct

ggt

gaa

gaa

atc

480

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Ile

145

150

155

160

tet

atc

cag

gtt

tet

aac

cct

tet

ctg

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

gct

528

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

165

170

175

acc

tac

ttc

ggg

gcc

ttc

aaa

gtt

cag

gac

atc

gac

564

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

180 185 <210> 14 <211> 188 <212> PRT <213>

<223>

Artificiální sekvence

Popis artificiální sekvence: Fúze myšího OPGL, zbytků 158-316, modifikovaných vložením P30 epitopů tetanického toxoidu, a His koncovky • W ···· • · • ··· .83

<400> 14

Met 1

Lys

His

Gin His 5

Gin His

Gin

His

Gin 10

His

Gin

His

Gin

Lys 15

Pro

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

Tyr

Val

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

Phe

Asn

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

115

120

125

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

130

135

140

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Ile

145

150

155

160

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

As n

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

165

170

175

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

180

185

<210> 15 <211> 546 <212> DNA <213>

Artificiálni sekvence <220>

<223> Popis artificiálni sekvence: Fúze myšího OPGL, zbytků 158-316, P2 epitopu tetanického toxoidu, a His koncovky s vložením <220>

<221> CDS <222> (1)..(546)

84, • ·ΦΦ <220>

<221> různé ná vázané složky <222> (1)..(42) <223> His koncovka <220>

<221> ^různé vlastnosti <222> (43)..(336) <223> izbytky 158-255 myšího OPGL <220>

<221> různé vlastnosti <222> (382)..(546) <223> zbytky 262-316 myšího OPGL <220>

<221> různé vlastnosti <222> (337?..(3Θ1) <223> ' P2 epitop tetanického toxoid» <400> 15

atg Met 1

aaa Lys

cac His

caa Gin

cac His 5

caa Gin

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin 10

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin

aaa Lys 15

cct Pro

48

gaa

get

cag

cca

ttc

get

cat

ctg

acc

atc

aac

get

gca

tcg

atc

cct

96

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

tet

ggt

tet

cat

aaa

gtt

acc

ctg

tet

tet

tgg

tat

cac

gac

ege

ggt

144

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

tgg

get

aaa

atc

tet

aac

atg

acc

ctg

tet

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

aac

cag

gac

ggt

ttc

tac

tac

ctg

tac

get

aac

atc

tgt

ttc

aga

cat

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

cac

gaa

acc

tet

ggt

tet

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

atg

gtt

288

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

tac

gtt

gtt

aaa

acc

cct

atc

aaa

atc

caa

tet

tca

cat

aac

ctg

atg

336

Tyr

Val

Val

Lys

Thr

Pro

Ile

Lys

Ile

Gin

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

cag

tac

atc

aaa

get

aat

tcg

aaa

ttc

atc

ggt

atc

acc

gaa

ctg

aac

384

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ada

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Asn

115

120

125

··· ·

tgg Trp

tet Ser 130

ggt Gly

aac tet gaa

ttc Phe 135

cat His

ttc tac Phe Tyr

tet Ser

atc aac

gtt Val

ggt Gly

ggt Gly

432

Asn

Ser

Glu

Ile 140

Asn

ttc

ttc

aaa

ctg

aga

gct

ggt

gaa

gaa

atc

tet

atc

cag

gtt

tet

aac

480

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

145

150

155

160

cct

tet

ctg

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

gct

acc

tac

ttc

ggg

gcc

ttc

528

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

165

170

175

aaa

gtt

cag

gac

atc

gac

546

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

180 <210> 16 <211> 182 <212> PRT c213> Artificiální sekvence c223> p_Opis artificiální sekvence: Fúze myšího OPGL. zbytků 158-316, *P2 epitopu tetanického toxoidu, a His koncovky s vložením

<400> 16

His

Gin

His

Gin 10

His

Gin

His

Gin

Lys 15

Pro

Met 1

Lys

His

Gin

His 5

Gin

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

Tyr

Val

Val

Lys

Thr

Pro

Ile

Lys

Ile

Gin

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Asn

115

120

125

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

130

135

140

• · · » · • ··♦

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

145

150

155

160

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

165

170

175

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

180 <210> 17 <211> 519 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: Fúze myšího OPGL, zbytků 158-316, P2 epitopu tetanického toxoidu, a His koncovky <220>

<221> CDS <222> (1) . .(519) <220>

<221> různé navázané složky <222> (1) . . (42) <223> His koncovka <220>

^<221> různé vlastnosti <222> (43) .. (432) <223> i zbytky 158-287 myšího OPGL <220>

<221> různé vlastnosti <222> (478)..(519) <223> zbytky 303-316 myšího OPGL <220>

<221> různé vlastnosti <222> (433).. (477) <223> p2 epitop tetanického toxoidu <400> 17 s vložením

atg Met 1

aaa Lys

cac His

caa Gin

cac His 5

caa Gin

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin 10

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin

aaa Lys 15

cct Pro

48

gaa

gct

cag

cca

ttc

gct

cat

ctg

acc

atc

aac

gct

gca

tcg

atc

cct

96

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ada

Ser

Ile

Pro

20

25

30

·♦·· !

tet Ser

ggt Gly

tet Ser 35

cat His

aaa Lys

gtt Val

acc Thr

ctg Leu 40

tet Ser

tet Ser

tgg Trp

tat Tyr

cac His 45

gac Asp

ege Arg

ggt Gly

144

tgg

gct

aaa

atc

tet

aac

atg

acc

ctg

tet

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

aac

cag

gac

ggt

ttc

tac

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

tgt

ttc

aga

cat

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

cac

gaa

acc

tet

ggt

tet

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

atg

gtt

2Θ8

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

tac

gtt

gtt

aaa

acc

tet

atc

aaa

atc

cca

tet

tea

cat

aac

ctg

atg

336

Tyr

Val

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

aaa

ggt

ggt

tet

acc

aaa

aac

tgg

tet

ggt

aac

tet

gaa

ttc

cat

ttc

384

Lys

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

tac

tet

atc

aac

gtt

ggt

ggt

ttc

ttc

aaa

ctg

aga

gct

ggt

gaa

gaa

432

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

130

135

140

cag

tac

atc

aaa

gct

aat

tcg

aaa

ttc

atc

ggt

atc

acc

gaa

ctg

gac

480

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Asp

145

150

155

160

gct

acc

tac

ttc

ggg

gcc

ttc

aaa

gtt

cag

gac

atc

gac

519

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165 170 <210> 18 <211> 173 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <223>

Popis artificiální sekvence: Fuze myšxho OPGL, zbytků 158—316

P2 epitopu tetanického toxoidu, a His koncovky s vložením <400> 18

Met 1	Lys	His	Gin	His 5	Gin	His	Gin
Glu	Ala	Gin	Pro 20	Phe	Ala	His	Leu

His	Gin 10	His	Gin	His	Gin	Lys 15	Pro
Thr	Ile	Asn	Ala	Ala	Ser	Ile	Pro
25					30

Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly ··

35

40

45

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

-

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

Tyr

Val

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

Lys

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

130

135

140

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Asp

145

150

155

160

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165

170

<210> 19 <211> 519 <212> DNA <213>

Artificiální sekvence <220>

<223> popis artificiální sekvence: Fúze myšího OPGL, zbytků 158-316, s vložením P30 epitopu tetanického toxoidu, a His koncovky <220>

<221> CDS <222> (1)..(519) <220>

<221> různé navázané složky <222> (1)..(42) <223> His koncovka <220>

<221> různé vlastnosti <222> (43). . (231) <223> zbytky 158-220 myšího OPGL <220>

různé vlastnosti <221>

<222> (295) .. (519) <223> zbytky 242-316 myšího OPGL <220>

<221> různé vlastnosti <222> (232)..(294) <223> P30 epitop tetanického toxoidu <400> 19

atg Met 1

aaa Lys

cac His

caa Gin

cac His 5

caa Gin

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin 10

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin

aaa Lys 15

cct Pro

48

gaa

gct

cag

cca

ttc

gct

cat

ctg

acc

atc

aac

gct

gca

tcg

atc

cct

96

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

tet

ggt

tet

cat

aaa

gtt

acc

ctg

tet

tet

tgg

tat

cac

gac

cgc

ggt

144

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

tgg

gct

aaa

atc

tet

aac

atg

acc

ctg

tet

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

aac

cag

gac

ggt

ttc

tac

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

tgt

ttc

aac

aac

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Asn

Asn

65

70

75

80

ttc

acc

gtt

tet

ttc

tgg

ctg

agg

gta

ccg

aaa

gtt

tet

gct

tet

cac

288

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

85

90

95

ctg

gaa

gtt

aaa

acc

tet

atc

aaa

atc

cca

tet

tea

cat

aac

ctg

atg

336

Leu

Glu

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

aaa

ggt

ggt

tet

acc

aaa

aac

tgg

tet

ggt

aac

tet

gaa

ttc

cat

ttc

384

Lys

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

tac

tet

atc

aac

gtt

ggt

ggt

ttc

ttc

aaa

ctg

aga

gct

ggt

gaa

gaa

432

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

130

135

140

atc

tet

atc

cag

gtt

tet

aac

cct

tet

ctg

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

480

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

145 150 155 160 gct acc tac ttc ggg gcc ttc aaa gtt cag gac atc gac

Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gin Asp Ile Asp

165 170

519 • · ··· · <210> 20 <211> 173 <212> PRT

Artificiální sekvence

P°Pis artificiální sekvence: Fúze myšího OPGL, zbytků 158-316, P30 epitopu tetanického toxoidu, a His koncovky s vložením <400> 20

Met 1

Lys

His

Gin

His 5

Gin

His

Gin

His

Gin 10

His

Gin

His

Gin

Lys 15

Pro

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Asn

Asn

65

70

75

80

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

711a

Ser

His

85

90

95

Leu

Glu

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

Lys

Gly

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Gly

Phe

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

130

135

140

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

145

150

155

160

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165

170

<210> 21 <211> 68 <212> DNA <213> Artificiální.sekvence <223> popis artificiální sekvence: syntetický PCR primer <220>

···· ·· 9· •4 •* •4

	91
<400> 21
agctgcaggt agtcggttgg	aacagaacca gaggtttcgt gatgtctgaa acagatgtta	60
gcgtacag		68

<210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> p_Opi_s artificiální sekvence: syntetický PCR primer <400> 22 ctcatctgac catcaacgct gcat 24 <210> 23 <211> 64 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: syntetický PCR primer <400> 23 tttcggtacc ctcagccaga aagaaacggt gaagttgttg aaacagatgt tagcgtacag 60 gtag 64 <210> 24 <211> 61 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> 1 Popis artificiální sekvence: syntetický PCR primer <400> 24 tgagggtacc gaaagtttct gcttctcacc tggaagttaa aacccctatc aaaatccaat 60 c 61 <210> 25 <211> 63 <212> DNA <213>

Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: syntetický PCR primer

• 44	4·	····	• 4	V
44 ·	•	4	4	4 4	44
• ···	• 4	4··	4 4	4
• · 4	• ·	•	•	4 4 4	4
• · ·	• *	4	4 4	4
··· 44	··	···	44	4 4 «

<400> 25 tttcggtacc ctcagccaga aagaaacggt gaagttgttg aacatcaggt tatgtgaaga 60 ttg 63 <210> 26 <211> 62 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: syntetický PCR primer <400> 26 tgagggtacc gaaagtttct gcttctcacc tggaaaactg gtctggtaac tctgaattcc 60 at 62 <210> 27 <211> 79 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: syntetický PCR primer <400> 27 tacctgcagc tgatggttta cgttgttaaa acccctatca aaatccaatc ttcacataac 60 ctgatgcagt acatcaaag 79 <210> 28 <211> 83 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: syntetický PCR primer <400> 28 tggaattcag agttaccaga ccagttcagt tcggtgatac cgatgaattt cgaattagct ttgatgtact gcatcaggtt atg <210> 29 <211> 49 <212> DNA <213> , Artificiální sekvence • · · • · · ·

<220>

<223> Popis artificiálni sekvence: syntetický PCŘ'primer <400> 29 gaatttcgaa ttagctttga tgtactgttc ttcaccagct ctcagtttg 49 <210> 30 <211> 53 <212> DNA <213> Artificiálni sekvence <220>

<223> popis artificiálni sekvence: syntetický PCR primer <400> 30 gctaattcga aattcatcgg tatcaccgaa ctggacgcta cctacttcgg ggc 53 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artifx··.. sekvence <220>

<223> popis artificiálni sekvence: syntetický PCR primer <400> 31 cttactagtc gatgtcctga actttg <210> 32 <211> 74 <212> DNA <213> . Artificiálni sekvence <220>

<223> popis artificiálni sekvence: syntetický PCR primer <400> 32 agtggaattc agagttacca gaccagtttt tggtagaacc acctttcatc aggttatgtg 60 aagatgggat tttg 74 <210> 33 <211> 65 <212> DNA <213> Clostridium tetani <400> 33 actacctgca gctgatggtt tacgttgtta aaacctctat caaaatccca tcttcacata 60 acctg 65 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 34

Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 15 10 15 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 35

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 15 10 15

Ala Ser His Leu Glu

Patentové

Claims (56)

1. Způsob pro in vivo inhibici aktivity ligandu pro osteoprotegerin (OPGL) u zvířete, včetně člověka, vyznačující se tím, že zahrnuje účinnou prezentaci imunologicky účinného činidla imunitnímu systému živočicha, kde uvedené činidlo je vybráno z

- alespoň jednoho OPGL polypeptidů nebo jeho subsekvence, které byly připraveny tak, že imunizace živočicha OPGL polypeptidem nebo jeho subsekvencí indukuje produkci protilátek proti OPGL polypeptidů; a/nebo

- alespoň jednoho analogu OPGL obsahujícího alespoň jednu modifikaci aminokyselinové sekvence OPGL, kde imunizace živočicha analogem indukuje tvorbu protilátek proti OPGL polypeptidů;

kde vlastní OPGL zvířete je inhibován v důsledku vazby na protilátek, kde OPGL je protein, který působí jako diferenciační faktor pro osteoklasty a má aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 2 pro lidský OPGL a SEQ ID NO: 4 a 6 pro myší OPGL.

2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že je prezentován analog OPGL s alespoň jednou modifikací aminokyselinové sekvence OPGL.

3. Způsob podle nároku 2vyznačující se tím, že modifikace vede k tomu, že je zachována významná frakce Blymfocytárních epitopů OPGL a že

- je vložen alespoň jeden T-pomocný lymfocytární epitop (Th epitop), a/nebo

- je vložena alespoň jedna první skupina, která způsobuje cílené dodání modifikované molekuly buňkám prezentujícím antigen (APC) nebo B-lymfocytům, a/nebo

ΦΦ·· • φ φφφφ

- je vložena alespoň jedna druhá skupina, která stimuluje imunitní systém, a/nebo

- je vložena alespoň jedna třetí skupina, která optimalizuje prezentaci modifikovaného OPGL polypeptidů imunitnímu systému.

4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že modifikace zahrnuje vložení cizorodého Th epitopů a/nebo první a/nebo druhé a/nebo třetí skupiny jako vedlejší skupiny, kovalentní nebo nekovalentní vazbou na vhodné chemické skupiny v OPGL nebo jeho subsekvenci.

5. Způsob podle nároků 3 nebo 4vyznačující se tím, že modifikace zahrnuje aminokyselinové substituce a/nebo delece a/nebo inserce a/nebo adice.

6. Způsob podle nároku 5vyznačující se tím, že modifikace vede ke vzniku fúzního polypeptidů.

7. Způsob podle nároků 5 nebo 6vyznačující se tím, že vložení aminokyselinové substituce a/nebo delece a/nebo inserce a/nebo adice vede k významnému zachování celkové terciární struktury OPGL.

8. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 2-7 vyznačuj ící se t i m, že modifikace zahrnuje duplikaci alespoň jednoho OPGL B-lymfocytárního epitopů a/nebo vložení haptenu.

9. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 3-8 vyznačuj ící se t i m, že cizorodý T-lymfocytární epitop je u zvířete imunodominantní.

10. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 3-9 vyznačuj íc i se t i m, že cizorodý T-lymfocytární epitop je schopen vazby na velkou část MHC molekul třídy II.

11. Způsob podle nároku 10 vyznačují' cl se tím, že alespoň jeden cizorodý T-lymfocytární epitop je vybrán z přirozeného T-lymfocytárního epitopů a .artificiálni peptidové sekvence vážící se na MHC třídy II.

12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že přirozený T-lymfocytární epitop je vybrán ze skupiny zahrnující epitopy tetanického toxoidu, jako je P2 nebo P30, epitop difterického toxoidu, epitop hemaglutininu chřipkového viru a CS epitop P. falciparum.

13. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 3-12 vyznačující se tím, že první skupina je specifický vazebný partner pro povrchový antigen specifický pro B-lymfocyty nebo pro povrchový antigen specifický pro APC, jako je hapten nebo uhlovodan, pro který existuje receptor na B-lymfocytech nebo APC.

14. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 3-13 vyznačující se tím, že druhá skupina je vybrána z cytokinů, hormonů a proteinů teplotního šoku.

15. Způsob podle nároku 6vyznačující se tím, že cytokin je vybrán ze skupiny zahrnující interferon γ (IFNγ), Flt3L, interleukin 1 ((IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 ((IL-12), interleukin 13 ((IL-13), interleukin 15 (IL-15) a faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů (GM-CSF), a tím, že protein teplotního šoku je vybrán ze skupiny zahrnující HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 a kalretikulin (CRT) nebo jejich účinné části.

16. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 3-15 vyznačující se tím, že třetí skupina má lipidový charakter, jako je palmitoylová skupina, myristylová skupina, farnesylová skupina, geranyl-geranylová skupina, GPIkotvicí skupina a N-acyldiglyceridová skupina.

17. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že OPGL polypeptid nebo jeho subsekvence byla modifikována v jakékoliv z pozic 170192, v jakékoliv z pozic 198-218, v jakékoliv z pozic221-246, v jakékoliv z pozic 256-261 nebo v jakékoliv z pozic 285-316,

6 a 12, nebo tím, že OPGL polypeptid byl podle číslování aminokyselin podle jakékoliv ze SEQ ID NO: 4, modifikován v jakékoliv pozic

171-193, v jakékoliv z pozic 199-219, v jakékoliv pozic

222-247, v jakékoliv z pozic 257-262 nebo v jakékoliv pozic

286-317 podle číslování aminokyselin podle

SEQ ID NO: 2.

18. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že modifikace zahrnuje substituci alespoň jedné aminokyselinové sekvence v pozicích definovaných v nároku 17 aminokyselinovou sekvencí stejné nebo jiné délky, která obsahuje cizorodý Th epitop.

19. Způsob podle nároku 18 vyznačujíc i se tím, že aminokyselinová sekvence obsahující cizorodý Th epitop substituuje aminokyseliny 256-261 a/nebo 288-302 a/nebo 221241 v SEQ ID NO: 4 nebo aminokyseliny 257-262 a/nebo 289-303 a/nebo 222-243 v SEQ ID NO: 2 nebo v polypeptidů, ve kterém byl cystein odpovídající Cys-221 substituován Ser.

·· · ♦ ···· · · • · · · · · · •·· · ···· · ·

20. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že prezentace imunitnímu systému je provedena za použití alespoň dvou kopií OPGL polypeptidu, jeho subsekvence nebo modifikovaného OPGL polypeptidu, kovalentně nebo nekovalentně navázaného na molekulu nosiče, který je schopen provést účinnou prezentaci mnoha kopií antigenních determinant.

21. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že OPGL polypeptid, jeho subsekvence nebo modifikovaný OPGL polypeptid byl připraven s adjuvans, které usnadňuje překonání autotolerance k autoantigenům.

22. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že účinné množství OPGL polypeptidu nebo analogu OPGL je podáno zvířeti způsobem vybraným z parenterálního způsobu jako je intradermální, subdermální, intrakutání, subkutánní a intramuskulární způsob podání; orálního způsobu; bukkálního způsobu; subliguálního způsobu; epidurálního způsobu; spinálního způsobu; análního způsobu; a intrakraniálniho způsobu.

23. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že že účinné množství je od 0,5 μg do 2000 μg OPGL polypeptidu, jeho subsekvence nebo analogu.

24. Způsob podle nároku 22 nebo 23 vyznačující se tím, že OPGL polypeptid nebo analog je obsažen ve virtuální lymfatické uzlině (VLN).

25. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1-21 vyznačující se tím, že prezentace

100

9 9 9 · · ···· «·

9 9 9 ··· ··· • ··· · 9999 9 φ ·· · · · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 99 99 999 99 9 modifikovaného OPGL imunitnímu systému je provedena vložením nukleové kyseliny kódující modifikovaný OPGL do buněk zvířete a takto dosažením exprese vložené nukleové kyseliny buňkami in vivo.

26. Způsob podle nároku 25 vyznačuj. ící se tím, že vložená nukleová kyselina je vybrána ze skupiny zahrnující holé DNA, DNA připravené s nabitými nebo nenabitými lipidy, DNA připravené v liposomech, DNA obsažené ve virovém vektoru, DNA připravené s proteinem nebo polypeptidem usnadňujícím transfekci, DNA připravené se proteinem nebo polypeptidem umožňujícím cílené podání, DNA připravené s vápníkovým srážecím činidlem, DNA navázané na molekulu inertního nosiče, DNA enkapsulované v chitinu nebo chitosanu a DNA připravené s adjuvans.

27. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je obsažena ve VLN prostředku.

28. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 22-27 vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jedno podání/vložení za rok, jako například alespoň 2, alespoň 3, alespoň 4, alespoň 6 a alespoň 12 podání/vložení.

29. Způsob pro léčbu a/nebo prevenci a/nebo zmírnění osteoporosy nebo jiného onemocnění nebo stavu charakterizovaného nadměrnou resorpcí kosti vyznačující se tím, že zahrnuje inhibici aktivity OPGL podle jakéhokoliv z nároků 1-28 v takovém rozsahu, že rychlost resorpce kosti se významně sníží, například o alespoň 3%, alespoň 7%, alespoň 9%, alespoň 11%, alespoň 13%, alespoň 15% a alespoň 17%, alespoň 20% a alespoň 30%.

101

30. Analog OPGL, který je odvozen od OPGL polypeptidu a do kterého byla vložena modifikace, která způsobuje to, že po imunizaci zvířete analogem dochází k produkci protilátek proti OPGL polypeptidu a kde tato modifikace je definována v jakémkoliv z nároků 17-19, za současného zachování významné frakce B-lymfocytárních epitopů OPGL zvířete.

31. Analog OPGL podle nároku 30, kde modifikací je modifikace podle nároku 19.

32. Imunogenní prostředek vyznačující se tím, že obsahuje

- imunologicky účinné množství OPGL polypeptidu autologního pro zvíře, kde uvedený OPGL polypeptid je připraven společně s imunologicky přijatelným adjuvans pro překonání autotolerance zvířete k OPGL polypeptidu, kde prostředek dále obsahuje farmaceuticky a imunologicky přijatelný nosič a/nebo vehikulum, nebo

- imunologicky účinné množství analogu OPGL podle nároku 30 nebo 31, kde prostředek dále obsahuje farmaceuticky a imunologicky přijatelný nosič a/nebo vehikulum a volitelně adjuvans.

33. Fragment nukleové kyseliny, který kóduje analog OPGL podle nároku 30 nebo 31.

34. Vektor vyznačující se tím, že obsahuje fragment nukleové kyseliny podle nároku 33.

35. Vektor podle nároku 34 vyznačující se tím, že je schopen autonomní replikace.

102

36. Vektor podle nároku 34 nebo 35 vyznačující se tím, že je vybrán ze skupiny zahrnující plasmid, fág, kosmid, minichromosom a virus.

37. Vektor podle jakéhokoliv z nároků 34-36 vyznačující se tím, že obsahuje, ve směru 5'->3' a v operativní vazbě: promotor pro řízení exprese fragmentu nukleové kyseliny podle nároku 33, volitelně sekvenci nukleové kyseliny kódující vedoucí peptid umožňující sekreci nebo integraci polypeptidového fragmentu do membrány, fragment nukleové kyseliny podle nároku 33 a volitelně terminátor.

38. Vektor podle jakéhokoliv z nároků 34-37 vyznačující se tím, že po vložení do buněk je schopen nebo neschopen integrace do genomu hostitelské buňky.

39. Vektor podle nároku 37 nebo 38 vyznačující se tím, že promotor řídí expresi v eukaryotické buňce a/nebo v prokaryotické buňce.

40. Tranformovaná buňka obsahující vektor podle jakéhokoliv z nároků 34-39.

41. Transformovaná buňka podle nároku 40, která je schopna replikovat fragment nukleové kyseliny podle nároku 33.

42. Transformovaná buňka podle nároku 41, kterou je mikroorganismus vybraný z bakterií, kvasinek a protozoí, nebo buňka odvozená od mnohobuněčného organismu vybraná ze skupiny zahrnující buňky hub, hmyzí buňky jako je S2 nebo SF buňka, rostlinné buňky a savčí buňky.

43. Transformovaná buňka podle jakéhokoliv z nároků 40-42

103 ·♦ · · φφφφ φ · • · · φ φ · ·

Φ·· φ φφφφ · · φφφφ φ · · φφ φφ φφφ ·· · která exprimuje fragment nukleové kyseliny podle nároku 33.

44. Transformovaná buňka podle nároku 43, která secernuje nebo nese na svém povrchu analog OPGL podle nároku 30 nebo 31.

45. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1-19. vyznačující se tím, že prezentace imunitnímu systému je provedena podáním nepatogenního mikroorganismu nebo viru, který nese fragment nukleové kyseliny, který kóduje a exprimuje OPGL polypeptid nebo analog.

46. Prostředek pro indukci produkce protilátek proti OPGL vyznačující se tím, že obsahuje fragment nukleové kyseliny podle nároku 33 nebo vektor podle jakéhokoliv z nároků 34-39, a

- farmaceuticky a imunologicky přijatelný nosič a/nebo vehikulum a/nebo adjuvans.

47. Stabilní buněčná linie obsahující vektor podle jakéhokoliv z nároků 34-39, která exprimuje fragment nukleové kyseliny podle nároku 33 a která volitelně secernuje nebo nese analog OPGL podle nároku 30 nebo 31 na svém povrchu.

48. Způsob přípravy buněk podle jakéhokoliv z nároků 40-44 vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci hostitelských buněk fragmentem nukleové kyseliny podle nároku 33 nebo vektorem podle jakéhokoliv z nároků 34-39.

49. Způsob pro identifikaci modifikovaného OPGL polypeptidů, který je schopen indukovat tvorbu protilátek proti nemodifikovanému OPGL u zvířete, u kterého je nemodifikovaný OPGL polypeptid vlastním proteinem, vyznačující se tím, že zahrnuje ♦ ·· φ φ φφφφ φ φ • · · · φ · φφφ φφφφ φ φ · · φ φ ·

104 φ φ φ φ φ φφφ φφφ φφ φφ φφφ φφ

- přípravu, pomocí peptidové syntézy nebo technik genového inženýrství, sady navzájem odlišných modifikovaných OPGL polypeptidů, ve kterých byly v aminokyselinové sekvenci OPGL polypeptidu daného živočišného druhu provedeny inserce, delece nebo substituce aminokyselin, které vedly ke vzniku aminokyselinových sekvencí obsahujících ,Τ-lymfocytární epitopy, které jsou cizorodé pro živočišný druh, nebo přípravu sady fragmentů nukleových kyselin kódujících sadu vzájemně odlišných modifikovaných OPGL polypeptidů;

- testování členů sady modifikovaných OPGL polypeptidů nebo fragmentů nukleových kyselin na jejich schopnost indukovat produkci protilátek proti nemodifikovanému OPGL v živočišném druhu; a

- identifikaci a volitelně izolaci členů sady modifikovaných OPGL polypeptidů, které významně indukují produkci protilátek proti nemodifikovanému OPGL v druhu nebo identifikaci a volitelně izolaci polypeptidových expresních produktů kódovaných členy sady fragmentů nukleových kyselin, které významně indukují produkci protilátek proti nemodifikovanému OPGL v živočišném druhu.

50. Způsob přípravy imunologického prostředku obsahujícího alespoň jeden modifikovaný OPGL polypeptid, který je schopen indukovat tvorbu protilátek proti nemodifikovanému OPGL u zvířete, u kterého je nemodifikovaný OPGL polypeptid vlastním proteinem, vyznačující se tím, že zahrnuje

- přípravu, pomocí peptidové syntézy nebo technik genového inženýrství, sady navzájem odlišných modifikovaných OPGL polypeptidů, ve kterých byly v aminokyselinové sekvenci OPGL polypeptidu daného živočišného druhu provedeny inserce, delece nebo substituce aminokyselin, které vedly ke vzniku aminokyselinových sekvencí obsahujících T-lymfocytární epitopy, které jsou cizorodé pro živočišný druh;

105

- testování členů sady na jejich schopnost indukovat produkci protilátek proti nemodifikovanému OPGL v živočišném druhu; a

- smísení členů sady, který významně indukující produkci protilátek u zvířete, které jsou reaktivní s OPGL, s farmaceuticky a imunologicky přijatelným nosičem a/nebo vehikulem, volitelně v kombinaci s alespoň jedním farmaceuticky a imunologicky přijatelným adjuvans.

51. Způsob podle nároku 49 nebo 50 vyznačující se tím, že příprava členů sady zahrnuje přípravu vzájemně odlišných sekvencí nukleové kyseliny, kde každá sekvence je sekvence nukleové kyseliny podle nároku 33, inserci sekvencí nukleové kyseliny do vhodných expresních vektorů, transformaci vhodných hostitelských buněk vektory a expresi sekvencí nukleové kyseliny, a potom volitelně izolaci produktů exprese.

52. Způsob podle nároku 51 vyznačující se tím, že příprava sekvencí nukleových kyselin a/nebo vektorů je provedena pomocí molekulárních amplifikačních technik, jako je PCR, nebo pomocí syntézy nukleových kyselin..

53. Použití OPGL nebo jeho subsekvence pro přípravu imunogenního prostředku obsahujícího adjuvans pro inhibici aktivity OPGL u zvířete.

54. Použití OPGL nebo jeho subsekvence pro přípravu imunogenního prostředku obsahujícího adjuvans pro léčbu, profylaxi nebo zmírnění osteoporosy nebo jiného stavu charakterizovaného nadměrnou resorpcí kosti.

55. Použití analogu OPGL podle nároku 30 nebo 31 pro přípravu imunogenního prostředku obsahujícího adjuvans pro inhibici aktivity OPGL u zvířete.

·♦ «···

106

56. Použití analogu OPGL podle nároku 30 nebo 31 pro přípravu imunogenního prostředku obsahujícího adjuvans pro léčbu, profylaxi nebo zmírnění osteoporosy nebo jinéhostavu charakterizovaného nadměrnou resorpcí kosti.