CN1960752A - 非人类tnf－肽的载体偶联物的医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种修饰的病毒样颗粒(VLP)，包含VLP和与其连接的来自TNF－超家族多肽的特定肽，用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病的疫苗，可以有效诱导免疫应答，特别是抗体应答。此外，本发明的组合物特别可以用于有效诱导在所述范围内的自身特异性免疫应答。

Description

非人类TNF-肽的载体偶联物的医药用途
发明背景
发明领域
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明特别提供一种修饰的病毒样颗粒(VLP)，包含VLP和与其连接的来自TNF-超家族多肽的至少一种特定肽。本发明也提供一种制备修饰的VLP的方法。本发明的修饰的VLPs可以用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病的疫苗，可以有效地诱导免疫应答，特别是抗体应答。此外，本发明的组合物特别是可用于在指定范围内有效诱导自身特异性免疫应答。
相关技术
肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员在免疫系统的发展和功能中发挥着关键的作用(F.Mackay和S.L.Kalled，Current Opinion inImmunology，14：783-790(2002))。这些成员中的绝大多数都是关键性免疫功能的有力的调节因子，并参与导致自身免疫性疾病的致病机制。例如，TNFα的调节改变会导致免疫耐受性崩溃，使自身免疫性疾病发展，然而，例如RANKL具有调节T和B细胞免疫耐受性的新功能，并在自身免疫中参与组织的破坏(F.Mackay和S.L.Kalled，Current Opinion in Immunology，14：783-790(2002))。
诱导对自身抗原的抗体应答通常是很困难的。一种改善疫苗接种有效性的方法是增加所提供抗原的重复程度。与分离的蛋白质不同，当不存在任何佐剂时，不论是否有T细胞的帮助，病毒都能诱导迅速而有效的免疫应答(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol：15：235-270(1991))。尽管病毒通常只包含很少的蛋白质，但它们能够触发比其分离组分强得多的免疫应答。至于B细胞应答，已知对病毒的免疫原性起决定性作用的一个因素是表面表位的重复性和顺序。许多病毒显示为展示规则表位阵列的准晶体表面，其中表位可以有效地与B细胞上的表位特异性免疫球蛋白交联(Bachmann和Zinkernagel，Immunol.Today 17：553-558(1996))。B细胞表面免疫球蛋白的交联是一个有力的激活信号，可以直接诱导细胞周期的发展和IgM抗体的产生。此外，这些已触发的B细胞能够激活T辅助细胞，T辅助细胞又诱导B细胞从产生IgM抗体到产生IgG抗体的转换，并产生长期存在的B细胞记忆-而这正是所有疫苗接种的目的(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。病毒的结构甚至与自身免疫性疾病中抗-抗体的产生有关，并成为对病原体自然应答的一部分(参见Fehr，T.，等人，JExp.Med.185：1785-1792(1997))。这样，高度有组织的病毒表面呈现的抗原就能诱导对于抗原的有力的抗体应答。
如所示，然而，免疫系统通常不能产生对抗自身产生的结构的抗体。对于低浓度的可溶性抗原，这是由于Th细胞水平的耐受性。在这些情况下，把自身抗原偶合到可以递送T辅助细胞的载体上可以破坏耐受性。对于高浓度的可溶性蛋白质或者低浓度的膜蛋白质，B和Th细胞可以是耐受的。但是B细胞的耐受性可以是可逆的(无反应性的)，并且通过施用偶合到外源性载体上的高度组织型抗原可以破坏该耐受性(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。
近来，披露了一些对抗来自TNF家族的自身抗原的疫苗接种方法，例如WO 95/05849、WO 00/23955、WO 02/056905和WO03/039225。在这些专利申请中大多数披露的疫苗包含载体蛋白，特别是病毒样颗粒(VLPs)，该颗粒连接到来自TNF家族的自身抗原上。但是，为了证实通过疫苗接种打破自身耐受性或自身忽略的想法，在疾病的小鼠模型中测试了包含来自小鼠蛋白质的蛋白质或肽的疫苗(参见例如WO 00/23955)。另外，在猕猴中检测了包含来自猕猴蛋白质的蛋白质或肽的疫苗。这样，建议使用来自特定物种的蛋白质的肽，该物种应当已被接种，以破坏自身耐受性。为了治疗人类的疾病，因此应当考虑包含相应的人蛋白质或其肽的人用疫苗。
发明简述
出人意料地，我们现在发现，诱导的对抗非人类，特别是对抗鼠、猫或犬类TNF-超家族成员，特别是TNFα和RANKL的抗体能够抑制各自的人TNF-超家族成员与它的人受体的结合。
因此，用非人类的TNF-超家族成员进行疫苗接种令人惊奇地提供了一种治疗数种与TNF-超家族成员有关的人类疾病和病症的途径，其中包括自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病。
我们进一步鉴定出了可以特别用于用非人类的TNF-超家族成员进行疫苗接种的表位。特别地，针对非人类TNF-超家族成员的TNF样域的某个N-末端区的抗体，出乎意料地，可以有效地对抗人类TNF-超家族的相应成员。因此，本发明提供一种预防和治疗方法，用来治疗自身免疫病和/或与骨有关的疾病，其基于使用特定的来自非人类的TNF-超家族成员的肽，该肽结合到核心颗粒上，特别是VLP-来自TNF-超家族成员的肽-偶联物，特别是在有序的和重复的阵列上。本发明优选的来自非人类TNF-超家族成员的肽包含与保守域pfam 00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基3到8同源或者相同的肽序列。这些预防和治疗组合物能够在接种的人体内诱导高效价的抗-TNF-超家族成员的抗体。
如所示，可以使用偶合到核心颗粒上的来自非人类TNF-超家族成员的肽片段，可替代地，与或不与佐剂一起施用，以在人体中诱导TNF-超家族成员特异性抗体。
因此，在C-或N-末端与核心颗粒，优选与病毒样颗粒(VLP)偶合的来自非人类TNF-超家族成员的肽，能够诱导高度特异性的抗-TNF-超家族成员的抗体，这些抗体一般能够中和人TNF-超家族成员的功能，之后在疾病或病症相关的情况中继续发挥不利作用。
我们已经发现，用C-或N-末端连接到核心颗粒或优选VLP上的本发明的来自非人类TNF-超家族成员的肽接种产生的抗体能够结合各自的人TNF-超家族成员。因此，本发明关注对抗与疾病有关的TNF-超家族成员的接种策略，用于治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病。
如本文，特别是实施例1和6所述，用C-或N-末端连接到核心颗粒或优选VLP上的本发明的TNFα-肽，特别是N-末端连接的TNFα-肽接种，诱导了能结合蛋白质型，特别是人的TNFα型的抗体。同样，特别是如实施例7所示，用C-或N-末端连接到核心颗粒或优选VLP上的RANKL-肽，特别是N-末端连接的RANKL-肽接种，诱导了能结合蛋白质型，特别是人的RANKL型的抗体。分别针对TNFα和RANKL的抗体分别对于自身免疫性疾病和与骨有关的疾病具有潜在的治疗能力。
本发明涉及本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP，或者本发明的组合物或者本发明的药物组合物在制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病的药物中的应用。所述治疗优选是治疗性治疗或者是预防性治疗。优选的自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、炎性肠病、多发性硬化症、糖尿病、自身免疫性甲状腺病、自身免疫性肝炎、牛皮癣或牛皮癣性关节炎。优选的与骨有关的疾病是骨质疏松症、牙周炎、假体周骨质溶解、骨转移、骨癌痛、佩吉特病、多发性骨髓瘤、舍格伦综合征和原发性胆汁性肝硬化。
因此，另一方面，本发明提供一种治疗自身免疫性疾病或与骨相关的疾病的方法，包括给患者，优选人施用本发明的修饰的VLP，其包含(a)病毒样颗粒(VLP)，和(b)至少有一种非人类的TNF-肽，包含与保守域pfam 00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基3到8同源的肽序列，优选与保守域pfam 00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基1到8同源的肽序列，更优选与保守域pfam00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基1到11同源的肽序列，甚至更优选与保守域pfam 00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基1到13同源的肽序列，其中a)和b)互相连接，其中优选的自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自(a)牛皮癣；(b)类风湿性关节炎；(c)多发性硬化症；(d)糖尿病；(e)骨质疏松症；(f)强直性脊柱炎；(g)动脉粥样硬化；(h)自身免疫性肝炎；(i)自身免疫性甲状腺病；(j)骨癌痛；(k)骨转移；(l)炎性肠病；(m)多发性骨髓瘤；(n)重症肌无力；(o)心肌炎；(p)佩吉特病；(q)牙周病；(r)牙周炎；(s)假体周骨质溶解；(t)多肌炎；(u)原发性胆汁性肝硬化；(v)牛皮癣性关节炎；(w)舍格伦综合征；(x)斯提耳病；(y)全身性红斑狼疮；和(z)血管炎。
另一方面，本发明还涉及本发明的修饰的VLP在制备用于治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病的药物中的应用，其中优选的自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自(a)牛皮癣；(b)类风湿性关节炎；(c)多发性硬化症；(d)糖尿病；(e)骨质疏松症；(f)强直性脊柱炎；(g)动脉粥样硬化；(h)自身免疫性肝炎；(i)自身免疫性甲状腺病；(j)骨癌痛；(k)骨转移；(l)炎性肠病；(m)多发性骨髓瘤；(n)重症肌无力；(o)心肌炎；(p)佩吉特病；(q)牙周病；(r)牙周炎；(s)假体周骨质溶解；(t)多肌炎；(u)原发性胆汁性肝硬化；(v)牛皮癣性关节炎；(w)舍格伦综合征；(x)斯提耳病；(y)全身性红斑狼疮；和(z)血管炎。
根据本发明使用的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP包含，或者可替代地由下列物质组成：(a)核心颗粒，优选是VLP，和(b)至少一种肽(TNF-肽)，其包含与保守域pfam 00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基3到8同源的肽序列，优选与保守域pfam00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基1到8同源的肽序列，其中a)和b)互相连接。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的TNF-肽所包含的肽，长度为4、5或6到50个氨基酸残基，优选长度为4、5或6到40个氨基酸残基，更优选长度为4、5或6到30个氨基酸残基，甚至更优选长度为4到20个氨基酸残基，甚至更优选长度为4、5或6到18个氨基酸残基，甚至更优选长度为4、5或6到16个氨基酸残基，甚至更优选长度为4、5或6到13个氨基酸残基，甚至更优选长度为4、5或6到11个氨基酸残基。
根据本发明使用的组合物，可以包含(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是本发明的来自非人类的TNF-超家族的肽(下文称作TNF-肽)，其中所述第二附着位点选自(i)非与所述抗原或抗原决定簇自然产生的附着位点；和(ii)与所述抗原或抗原决定簇自然产生的附着位点，其中所述第二附着位点能与所述第一附着位点连接；其中所述抗原或抗原决定簇和所述核心颗粒通过所述的连接而相互作用，优选形成有序的和重复的抗原阵列。适合用于本发明的核心颗粒的优选的实施方案是病毒、病毒样颗粒(VLP)、噬菌体、RNA-噬菌体的病毒样颗粒、细菌菌毛或鞭毛或具有内在重复结构的任何其他的核心颗粒，优选该重复结构能形成根据本发明的有序的和重复的抗原阵列。
更特别地，本发明提供一种根据本发明使用的修饰的VLP，包含病毒样颗粒和连接到其上的至少一种本发明的TNF-肽。本发明也提供一种制备本发明的修饰的VLPs的方法。本发明的修饰的VLPs和组合物可以用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病的疫苗，和作为药物预防或治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，也可以有效地诱导免疫应答，特别是抗体应答。此外，本发明的修饰的VLPs和组合物特别适用于在指定的范围内有效地诱导自身特异性免疫应答。
在本发明中，本发明的TNF-肽分别与核心颗粒和VLP优选以定向的方式结合，优选得到有序的和重复的TNF-肽的抗原阵列。此外，核心颗粒和VLP的高度重复的和有组织的结构，分别能够介导TNF-肽以高度有序的和重复的形式显示出来，产生高度有组织和重复的抗原阵列。此外，不受任何理论的限制，本发明的TNF-肽分别与核心颗粒和VLP的结合可以通过提供T辅助细胞的表位而起作用，因为对于分别用核心颗粒-TNF-肽阵列和VLP-TNF-肽阵列免疫的宿主来说，核心颗粒和VLP是外源性的。优选的阵列不同于现有技术中的偶联物，特别是，它们在阵列表面上高度有组织的结构、大小和抗原的重复性方面不同。
在本发明的一个方面中，本发明的TNF-肽在适当的表达宿主中表达或合成，而核心颗粒和VLP分别从适合该核心颗粒和VLP折叠和装配的表达宿主中表达和纯化。本发明的TNF-肽可以是化学合成的。然后通过把本发明的TNF-肽分别与核心颗粒和VLP结合来装配成本发明的TNF-肽-阵列。
在一个优选的实施方案中，本发明提供一种根据本发明使用的修饰的VLP，包含(a)病毒样颗粒，和(b)至少一种本发明的TNF-肽，其中所述的本发明的TNF-肽与所述的病毒样颗粒连接。
另一方面，本发明提供一种根据本发明使用的组合物和药物组合物，包含(a)修饰的核心颗粒，当为药物组合物时，特别是修饰的VLP，和(b)可接受的药物载体。
另一方面，本发明提供一种根据本发明使用的药物组合物，优选疫苗组合物，包含(a)病毒样颗粒；和(b)至少一种本发明的TNF-肽，其中所述的本发明的TNF-肽与所述的病毒样颗粒连接。
另一方面，本发明提供一种制备本发明的修饰的VLP的方法，包括(a)提供一种病毒样颗粒；和(b)提供至少一种本发明的TNF-肽；(c)将所述的病毒样颗粒和所述的本发明的TNF-肽组合，以使得所述的TNF-肽与所述的病毒样颗粒结合，特别是在适合介导VLP和TNF-肽之间连接的条件下结合。
类似的，本发明提供一种制备本发明的修饰的核心颗粒的方法，包括：(a)提供具有至少一个附着位点的核心颗粒；(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种本发明的TNF-肽，其中所述第二附着位点选自(i)非与本发明的TNF-肽自然产生的附着位点；和(ii)与本发明的TNF-肽自然产生的附着位点；其中所述第二附着位点能与所述第一附着位点连接；和(c)将所述核心颗粒和所述至少一种本发明的TNF-肽组合，其中所述的本发明的TNF-肽和所述核心颗粒通过所述的连接而相互作用，优选形成有序的和重复的抗原阵列以根据本发明使用。
另一方面，本发明提供一种免疫的方法，包括给人施用本发明的修饰的VLP、组合物或药物组合物。
本发明的修饰的VLP、组合物或药物组合物用于制备用于治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病的药物。
另一方面，本发明提供本发明的修饰的VLP、组合物或药物组合物在制备用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病的药物中的应用。此外，另一方面，本发明提供本发明的修饰的VLP、组合物或药物组合物，单独或与其他药物组合，在制备用于治疗或预防自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，和/或用于刺激人免疫系统的组合物、疫苗、药物或药剂中的应用。
因此，特别是，本发明提供适于预防和/或减弱或治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病或相关情况的疫苗组合物，用于治疗上述疾病或病症的方法，包括以足以破坏自身免疫的剂量施用该疫苗组合物。本发明也分别提供免疫和接种方法，用于在动物中，特别是在宠物例如猫或狗中以及在人中预防和/或降低或治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病或相关情况。本发明的组合物可以用于预防或治疗。
在特定的实施方案中，本发明提供预防、治疗和/或减弱自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病或相关情况的方法，所述疾病或情况是由“自身”基因产物，即“自身抗原”导致或加重的。在相关的实施方案中，本发明提供分别在动物和个体中诱导免疫应答的方法，其导致了抗体的产生，所述抗体能预防、治疗和/或减弱自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病或相关情况，其中所述疾病或情况是由“自身”基因产物导致或加重的。
技术人员可以理解，本发明的概念，既使用本发明的非人类的TNF-肽来破坏人的自身耐受性，也可以类似地应用于其它哺乳动物。例如，与本发明的肽相对应的“非狗的”TNF-肽可以用于在狗中破坏对于相应TNF家族成员的自身耐受性，或者与本发明的肽相对应的“非猫的”TNF-肽可以用于在猫中破坏对于相应TNF家族成员的自身耐受性。因此，在某些实施方案中，本发明更普遍地通常也涉及在动物中本发明的非-自身TNF-肽破坏动物的自身-耐受性的应用。因此，术语“非人类的”可以由术语“非自身的”来代替。但是优选术语“非人类的”就是仅指“非人类的”，例如，非来自人类(homo sapienssapiens)的(多)肽序列。
本领域的普通技术人员可以理解，当给动物或人施用本发明的组合物时，它们可以是包含改善组合物的效力所需的盐、缓冲液、佐剂、或其它物质的组合物。许多资料中提供了适合在制备药物组合物中使用的物质的例子，包括Remington′s Pharmaceutical Sciences(Osol，A，ed.，Mack Publishing Co.(1990))。
如果本发明的组合物的施用对于受试个体是可以忍受的，就称它是“药学可接受的”。此外，本发明的组合物应当以“治疗有效量”(即，产生所需的生理效应的量)施用。
可以通过本领域已知的各种方法来施用本发明的组合物，但通常通过注射、输注、吸入、口服或其它适当的物理方法来施用。可替代地，可以通过肌内、静脉内、或皮下途径来施用该组合物。施用的组合物的成分包括无菌水(例如生理盐水)或非水溶液和悬浮液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、和可注射的有机酯类例如油酸乙酯。可以使用载体或封闭敷料来增强皮肤渗透性和增强抗原吸收。
根据本领域已知的技术、下列的发明详述和权利要求，本发明的其它实施方案对于普通技术人员将是显而易见的。
附图简述
附图1：mTNFα(4-23)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
在还原条件下在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析蛋白质。用考马斯亮蓝给该凝胶染色。在左边给出了标记蛋白质的分子量，右边标明的是蛋白质带的鉴定。泳道1：预染的蛋白质标记物(NewEngland Biolabs)。泳道2：衍生的Qβ衣壳蛋白。泳道3：Qβ-mTNFα(4-23)肽偶联反应(不溶的部分)。泳道4：Qβ-mTNFα(4-23)肽偶联反应(可溶的部分)。
附图2：在用偶合到Qβ衣壳上的mTNFα(4-23)肽免疫的小鼠中中和抗体的检测。
A.mTNFα/mTNFRI相互作用的抑制。用10μg/ml的小鼠TNFα蛋白包被ELISA平板，与第32天的小鼠血清的系列稀释液和0.25nM小鼠的TNFRI-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体的结合。
B.hTNFα/hTNFRI相互作用的抑制：用10μg/ml的人TNFα蛋白包被ELISA平板，与第32天的小鼠血清的系列稀释液和0.25nM人的TNFRI-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体的结合。
附图3：在用偶合到Qβ衣壳上的fTNFα(4-23)肽免疫的小鼠中中和抗体的检测。
A.mTNFα/mTNFRI相互作用的抑制。用5μg/ml的小鼠TNFα蛋白包被ELISA平板，与第35天的小鼠血清的系列稀释液和0.25nM小鼠的TNFRI-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体的结合。
B.hTNFα/hTNFRI相互作用的抑制：用5μg/ml的人TNFα蛋白包被ELISA平板，与第35天的小鼠血清的系列稀释液和0.25nM人的TNFRI-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体的结合。
附图4：在用偶合到Qβ衣壳上的mTNFα蛋白免疫的小鼠中中和抗体的检测。
A.mTNFα/mTNFRi相互作用的抑制。用5μg/ml的小鼠TNFα蛋白包被ELISA平板，与第49天的小鼠血清的系列稀释液和0.25nM小鼠的TNFRI-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体的结合。
B.hTNFα/hTNFRI相互作用的抑制：用5μg/ml的人TNFα蛋白包被ELISA平板，与第35天的小鼠血清的系列稀释液和0.25nM人的TNFRI-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体的结合。
附图5：mRANKL肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
在还原条件下在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析蛋白质。用考马斯亮蓝给该凝胶染色。在左边给出了标记蛋白质的分子量，右边标明的是蛋白质带的鉴定。泳道1：预染的蛋白质标记物(NewEngland Biolabs)。泳道2：衍生的Qβ衣壳蛋白。泳道3：Qβ-mRANKL(155-174)肽偶联反应(不溶的部分)。泳道4：Qβ-mRANKL(155-174)肽偶联反应(可溶的部分)。
附图6：在用偶合到Qβ衣壳上的mRANKL(155-174)肽免疫的小鼠中中和抗体的检测。
A.mRANKL/mRANK相互作用的抑制。用10μg/ml的小鼠RANKL蛋白包被ELISA平板，与在没有明矾的条件下用偶联到Qβ衣壳上的mRANKL(155-174)肽免疫的4只小鼠(首次接种后35天)的混合血清的系列稀释液和0.35nM小鼠RANK-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体的结合。
B.hRANKL/hRANK相互作用的抑制：用5μg/ml的人RANKL蛋白包被ELISA平板，与在没有明矾的条件下用偶联到Qβ衣壳上的mRANKL(155-174)肽免疫的4只小鼠(首次接种后35天)的混合血清的系列稀释液和0.35nM人RANK-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体的结合。
发明详述
除非另有定义，所使用的技术和科技术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。尽管在本发明的实践或测定中可以使用与所述方法和物质类似或等同的方法或物质，但优选下文所述的方法和物质。
1.定义：
佐剂：术语“佐剂”涉及免疫应答的非特异性刺激物或使宿主内产生贮库(depot)的物质，当与本发明的疫苗和药物组合物分别组合时，可以用于增强免疫应答。可以使用许多种的佐剂。其实例包括完全和不完全弗氏佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。其他的佐剂是矿物质凝胶例如氢氧化铝，表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚，和可能对人有用的佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。这些佐剂也是本领域已知的。可以和本发明的组合物一起施用的其他佐剂包括但不限于，单磷酸类脂免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL 1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294、和病毒颗粒佐剂技术。所述佐剂也可以包含上述物质的混合物。
来自南美树Quillaja Saponaria Molina树皮的具有佐剂活性的免疫活性皂苷部分是本领域已知的。例如QS21，也称作QA21，是一种从Quillaja Saponaria Molina树中Hplc提纯的部分，它的制备方法(作为QA21)公开于U.S.5,057,540中。在Scott等人，Int.Archs.Allergy Appl.Immun.，1985，77，409中也披露了Quillaja皂苷可以作为佐剂。单磷酸类脂A及其衍生物是本领域已知的。优选的衍生物是3-脱氧-酰化单磷酸类脂A，其公开于英国专利2220211中。其他优选的佐剂如WO 00/00462所述，将其所公开的内容引入本文作为参考。
然而，本发明的一个有利的特征是，在甚至没有佐剂的情况下本发明的修饰的核心颗粒的高免疫原性。如所指出的或随着说明书将变得显而易见的那样，在可替代或优选的实施方案中，提供不含佐剂的疫苗和药物组合物，当没有佐剂时，该疫苗和药物组合物可以用于治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，因此，由于佐剂可能有副作用，上述的疫苗和药物组合物具有良好的安全谱。在本文的用于治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病的疫苗和药物组合物中，术语“不含”是指所使用的疫苗和药物组合物基本不含佐剂，优选不含有可探测量的佐剂。
氨基酸连接体：在本说明书中，“氨基酸连接体”，或者只称作“连接体”将本发明的TNF-肽与第二附着位点相连，或者更优选地，包含或含有第二附着位点，典型地-而不必需-其是一个氨基酸残基，优选是半胱氨酸残基。但是术语“氨基酸连接体”并不意味着该氨基酸连接体仅由氨基酸残基组成，即使由氨基酸残基组成的氨基酸连接体是本发明的一个优选的实施方案。氨基酸连接体的氨基酸残基优选包含本领域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸，所有L型或所有D型或其混合物。但是包含具有巯基或半胱氨酸残基的分子的氨基酸连接体也在本发明的范围内。这样的分子优选包含C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分。但是除了氨基酸连接体外，优选包括C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分并不含任何氨基酸的连接体也在本发明的范围内。本发明的TNF-肽或任选的第二附着位点和氨基酸连接体之间的连接，优选使用至少一个共价键，更优选至少一个肽键。
动物：此处的术语“动物”包括，例如人、羊、麋鹿、鹿、长耳鹿、貂、猴子、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠，但也包括鸟、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蜘蛛类动物。优选的动物是脊椎动物，更优选的动物是哺乳动物，甚至更优选的动物是真哺乳亚纲的动物。
抗体：此处的术语“抗体”涉及能与表位或抗原决定簇结合的分子。该术语包括完整的抗体和其抗原结合片段，包括单链抗体。最优选的抗体是人抗原结合抗体片段，包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包含VL或VH域的片段。抗体可以来自任何动物，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、兔、山羊、大鼠、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。此处的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，包括从人免疫球蛋白库中或从不表达内源性免疫球蛋白的一种或几种人免疫球蛋白的转基因动物中分离出来的抗体，如例如Kucherlapati等人的U.S.5,939,598所述。
抗原：此处的术语“抗原”是指能与抗体结合的，或如果被MHC分子呈递则能与T细胞受体(TCR)结合的分子。术语“抗原”也包括T-细胞表位。此外抗原能被免疫系统识别和/或能诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B-和/或T-淋巴细胞的激活。但是，至少在某些情况中，这可能需要该抗原包含或与Th细胞表位连接，并在佐剂中给药。抗原可以具有一个或多个表位(B-和T-细胞表位)。上述涉及的特异性反应表明，优选抗原典型地以高选择性的方式与它的相应抗体或TCR反应，而不与可由其他抗原诱发的许多其他抗体或TCRs反应。此处使用的抗原也可以是数种个体抗原的混合物。优选的抗原，以及因此优选的TNF-肽，是不会导致T-细胞应答(仅是B-细胞表位)的短肽(4-8个氨基酸残基，优选6-8个氨基酸残基)。
抗原决定簇：此处的术语“抗原决定簇”是指可被B-或T-淋巴细胞特异性识别的抗原的一部分。对抗原决定簇应答的B-淋巴细胞产生抗体，而T-淋巴细胞通过增殖和建立对介导细胞和/或体液免疫关键的效应功能而对抗原决定簇应答。
连接：此处的术语“连接”当用于第一和第二附着位点时，是指第一和第二附着位点优选通过至少一个非肽键结合。连接的性质可以是共价的、离子、疏水的、极性的、或其任意组合，优选连接的性质是共价的。
第一附着位点：此处的短语“第一附着位点”涉及非天然或天然来源的部件，位于本发明的TNF-肽上的第二附着位点可以与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或化学反应性基团例如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酸基团、或其组合。典型地和优选地，第一附着位点位于核心颗粒，例如优选病毒样颗粒的表面上。核心颗粒和病毒样颗粒的表面上分别有一般为重复构型的多个第一附着位点。在一个优选的实施方案中，第一附着位点与VLP通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键连接。在另一个优选的实施方案中，该第一附着位点是和VLP一起天然产生的。可替代的，在一个优选的实施方案中，把第一附着位点人工加入到VLP上。
第二附着位点：此处的短语“第二附着位点”涉及与本发明的TNF-肽连接的部件，分别位于核心颗粒和病毒样颗粒的表面上的第一附着位点可以与之连接。TNF-肽的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或化学反应性基团例如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酸基团、或其组合。在本发明的某些实施方案中，可以把至少一个第二附着位点加到本发明的TNF-肽上。因此，术语“具有至少一个第二附着位点的本发明的TNF-肽”涉及至少包含本发明的TNF-肽和第二附着位点的本发明的TNF-肽。但是，特别是对于非天然来源的，即本发明的TNF-肽内非天然存在的第二附着位点，本发明的修饰的TNF-肽也可以包含“氨基酸连接体”。
结合：此处的术语“结合”以及可以等同使用的术语“连接”，涉及可以是共价的，例如通过化学偶合，或非共价的，例如离子相互作用、疏水性相互作用、氢键等的结合或附着。共价键可以是，例如酯键、醚键、磷酸酯键、酰胺键、肽键、酰亚胺键、碳-硫键例如硫醚键、碳-磷键等等。在某些优选的实施方案中，第一附着位点和第二附着位点是通过(i)至少一个共价键，或(ii)至少一个非肽键连接的，优选通过至少一个共价的非肽键连接，甚至更优选仅仅通过非肽键连接，因此进一步优选仅仅通过非肽共价键连接。然而，此处的术语“连接”不仅包括至少一个TNF-肽与病毒样颗粒直接连接，而且，可替代地和优选地，包括至少一个TNF-肽与病毒样颗粒通过中间分子间接连接，因此典型地和优选地，通过使用至少一种，优选一种异双功能交联剂来间接连接。此外，此处的术语“连接”不仅包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点直接连接，而且，可替代地和优选地，包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子间接连接，因此典型地和优选地，通过使用至少一种，优选一种异双功能交联剂来间接连接。
外壳蛋白：此处的术语“外壳蛋白”是指能加入到噬菌体或RNA噬菌体的外壳装配体中的噬菌体或RNA噬菌体的蛋白质。但是，当涉及RNA噬菌体的外壳蛋白基因的特异性基因产物时，使用术语“CP”。例如，RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的特异性基因产物称为“QβCP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”包含“QβCP”和A1蛋白。噬菌体Qβ的衣壳主要是由QβCP和少量的A1蛋白组成的。同样，VLPQβ外壳蛋白主要包含QβCP和少量的A1蛋白。
核心颗粒：此处的术语“核心颗粒”涉及具有内在重复构造的刚性结构。此处的核心颗粒可以是合成方法的产物或生物学方法的产物。
有效量：此处的术语“有效量”涉及实现所需的生物学效果必需或者足够的量。组合物的有效量是达到所选择结果的量，该量可以由本领域的技术人员通过常规的方法来确定。例如，治疗免疫系统缺陷的有效量是在暴露于抗原下时导致免疫系统激活，导致抗原特异性免疫应答发展所必需的量。该术语也可以与“足够量”具有同样的含义。
在任何的特定应用中的有效量可以是不同的，其取决于下列因素：例如，要治疗的疾病或情况、要施用的特定组合物、受体的大小、和/或疾病或情况的严重性。本领域的普通技术人员不需要太多的实验，就可以根据经验来确定本发明的特定组合物的有效量。
表位：此处的术语“表位”涉及在动物中，优选在哺乳动物中，最优选在人中，具有抗原或免疫原活性的多肽的连续或不连续部分。在MHC分子的环境下，表位可以被抗体或T细胞通过其T细胞受体识别。此处的“免疫原表位”，定义为在动物中引发抗体应答或诱导T-细胞应答的多肽的一部分，其可以用本领域已知的任意方法来确定。(参见，例如Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002(1983))。此处的术语“抗原表位”定义为抗体能免疫特异性地与其抗原结合的蛋白质的一部分，其可以用本领域公知的任意方法来确定。免疫特异性的结合不包括非特异性结合，但也并不需要排除和其它抗原的交叉反应。抗原表位并不需要必须是免疫原性的。抗原表位也可以是T-细胞表位，在该情况下，它们可以在MHC分子的环境下被T-细胞受体免疫特异性地结合。
表位在空间构象中可以包含3个氨基酸，所述空间构象对于表位来说是唯一的。一般地，表位由至少约4个这样的氨基酸组成，更通常地，由至少约4，5，6，7，8，9，或10个这样的氨基酸组成。如果该表位是有机分子，它可以和硝基苯基一样小。优选的表位是本发明的TNF-肽，据信，它被认为是B-型表位。
融合：此处的术语“融合”是指通过编码核苷酸序列的框内组合而使得不同来源的氨基酸序列组合在一个多肽链中。术语“融合”除了与其末端之一融合外，还明确地包括内部融合，即在一条多肽链内插入不同来源的序列。
TNF-超家族成员：术语“TNF-超家族成员”涉及包含TNF样域的蛋白质。此处的“TNF-超家族成员”包括在人、猫、狗、小鼠、大鼠、一般的真哺乳亚纲动物、一般的哺乳动物以及其它的动物中已知的所有形式的TNF-超家族成员。已经用X-射线晶体分析法以2.9埃的分辨率确定了起始成员TNF的结构。该蛋白质是三聚体，每个亚单元由反平行的β-夹层组成。这些亚单元通过新的β-片层的从边到面的包装来三聚体化。比较亚单元与其他蛋白质的折叠显示了与病毒外壳蛋白特有的“薄卷饼型”结构基序的相似性。TNF-超家族成员包含约150个残基的球状TNF-样胞外域，该域在保守域的数据库CDD中被分类成cd00184、pfam00229或smart00207(Marchler-BauerA，等人(2003)，″CDD：a curated Entrez database of conserved domainalignments″，Nucleic Acids Res.31：383-387)。此外，TNF-超家族的蛋白质通常具有胞内N-末端域，较短的跨膜片段、胞外茎、和所述的约150个残基的球状TNF-样胞外域。一些成员与该通常构型略有不同(见下文)。据信通常每个TNF分子具有三个受体-相互作用位点(在三个亚单元之间)，因此允许通过受体聚集来进行信号传递。TNF-α被合成为II型膜蛋白质，然后经过翻译后裂解释放出胞外域。CD27L、CD30L、CD40L、FASL、LT-β、4-1BBL和TRAIL似乎也是II型膜蛋白质。LT-α是一种分泌性蛋白质。所有这些细胞因子形成了可被其特定受体识别的同源三聚体(或者在LT-α/β的情况下形成异源三聚体)复合物。优选TNF-超家族成员是非人类的。
该家族的一些成员能够通过与相关的受体结合开始细胞凋亡，其中一些相关的受体具有细胞内死亡域。此处的TNF-超家族成员包括TNFα、LTα、LTα/β、FasL、CD40L、TRAIL、RANKL、CD30L、4-1BBL、OX40L、GITRL和BAFF、CD27L、TWEAK、APRIL、TL1A、EDA和在其中可以识别出TNF-样域的任何其他的多肽。这种识别可以是通过本领域技术人员已知的各种方法来完成的，例如在NCBI网页上URL为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/下可以获得的程序BlastP(蛋白质-蛋白质Blast)。域识别可以通过下列Blastp程序的默认设置来进行：选择数据库＝nr，进行CD检索＝开，高级blasting选项：选自＝所有生物体，基于组成的统计＝开，选择滤镜＝低复杂性，期望值＝10，字长＝3，矩阵＝Blosum 62，空位值＝存在11延伸1(choosedatabase＝nr，Do CD-search＝on，Options fir advanced blasting：selectfrom＝all organisms，composition-based statistics＝on，choose filter＝low complexity，expect＝10，word size＝3，Matrix＝Blosum 62，gapcosts＝existence 11 extension 1)。这样的搜索可以帮助在所要查询的具有TNF-样域的多肽中探测到TNF-样域。
此处的TNF-超家族成员包括具有或不具有蛋白质修饰的TNF-超家族成员，所述蛋白质修饰例如是磷酸化、糖基化或遍在蛋白化。此外，术语TNF-超家族成员也包括TNF-超家族成员存在的所有剪接变异体。此外，由于在不同物种的相同TNF-超家族成员之间的高度序列同源性，所有天然的变异体和通过基因工程构建与各自的人TNF-超家族成员具有超过75％，优选超过90％，更优选超过95％，甚至更优选超过99％同一性的TNF-超家族成员而产生的变异体，在此也被称为“TNF-超家族成员”。
此处的术语“TNF-肽”或“本发明的TNF肽”是一种肽，其包含与保守域pfam 00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基3到8同源，即在本文中相对应的肽序列，优选与保守域pfam 00229(SEQ IDNO：1)的共有序列的氨基酸残基1到8同源的肽序列，更优选与所述共有序列的氨基酸残基1到11同源的肽序列，甚至更优选与所述共有序列的氨基酸残基1到13同源的肽序列。
同源的肽是来自非动物本身的TNF-超家族成员的肽，例如，如果要给人接种，使用的就是来自非人类的TNF-超家族成员的肽。具体地，该TNF-超家族成员是非人类的哺乳动物的TNF超家族成员，例如小鼠RANKL或小鼠TNFα，其表示对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基。这些同源的肽是技术人员通过将TNF超家族的共有序列(SEQ IDNO：1)和所述的其他动物的TNF-超家族成员进行比对就可以识别的。如上所述，TNF-肽包含对应于共有序列的上述氨基酸残基的肽序列。也就是说，在具有共有序列(例如共有序列的氨基酸残基3到8)的特定同源区外，TNF-肽可以不同于为TNF-超家族成员的多肽。然而，优选地在上述具有共有序列的同源区外的TNF-肽部分与为TNF-超家族成员的多肽具有至少70％的同一性，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或者甚至100％的同一性。在本发明的优选的应用中，即在制备治疗人类疾病的药物的应用中，优选的TNF-超家族成员是非人类哺乳动物的TNF-超家族成员。
在这种情况中，当本发明的TNF-肽包含在较大的范围，即融合多肽或具有加入的连接肽或附着位点的TNF-肽中时，本发明的TNF-肽的后面优选不是那些在该TNF-肽所来源的多肽的范围内跟随在其后面的氨基酸残基。
TNF-肽的获得包括，在真核或原核表达系统中重组表达为单独的TNF-肽，但优选表达为与其他氨基酸或蛋白质的融合物，例如，促进TNF-肽的折叠、表达或溶解，或促进TNF-肽的纯化。优选的是TNF-肽与VLPs或衣壳的亚单元蛋白质之间的融合物。在该情况下，可以将一个或几个氨基酸在N-或C-末端加到TNF-肽上，但是优选TNF-肽在融合多肽的N-末端，即经其本身的C-末端偶合或连接到其融合配体上。
可替代地和优选地，为了能把TNF-肽偶合到VLPs或衣壳或核心颗粒的亚单元蛋白质上，可以把至少一个第二附着位点加到TNF-肽上。可替代地，可以用本领域已知的方法，特别是通过有机化学肽合成法来合成TNF-肽。这些肽甚至可以包含在相应的TNF-超家族成员蛋白质中不存在的氨基酸。可以通过，例如磷酸化来修饰该肽，但这种修饰对于本发明的有效的修饰的VLPs并不是必需的。
残基：此处的术语“残基”是指在多肽主链或侧链中的特定氨基酸。
免疫应答：此处的术语“免疫应答”涉及体液免疫应答和/或细胞免疫应答，其导致B和/或T淋巴细胞和/或抗原呈递细胞的激活或增殖。
然而在一些例子中，免疫应答是低强度的，仅仅在使用至少一种根据本发明的物质时才会变成可检测到的。“免疫原”涉及一种用于刺激活体的免疫系统的试剂，其使得免疫系统的一种或几种功能得到增强，并针对免疫原试剂。“增强”免疫应答的物质是指，当与没有添加该物质时测定的相同免疫应答相比时，添加了该物质所观测到的免疫应答更大或更强或不同的物质。
免疫：此处的术语“免疫”或相关术语涉及给予对靶抗原或表位产生基本的免疫应答(包括抗体和/或细胞免疫例如效应CTL)的能力。该术语并不要求建立完全的免疫，而是说所产生的免疫应答基本上大于基线。例如，哺乳动物如果在应用本发明的方法后产生了对靶抗原的细胞和/或体液免疫应答，就可以认为它已经对靶抗原免疫。
天然来源：此处的术语“天然来源”是指其整体或部分不是合成的，而是在自然界存在的或自然产生的。
非天然：此处的该术语是指并非来自自然，更具体的，该术语是指来自人工制造。
非天然来源：此处的术语“非天然来源”通常是指合成的或非来自自然的；更具体地，该术语是指来自人工制造的。
有序的和重复的抗原或抗原决定簇阵列：此处的术语“有序的和重复的抗原或抗原决定簇阵列”通常涉及重复构型的抗原或抗原决定簇，其特征在于，典型地和优选地，分别就核心颗粒和病毒样颗粒而言，是具有均匀空间排列的抗原或抗原决定簇。在本发明的一个实施方案中，该重复构型可以是几何构型。适当的有序的和重复的抗原或抗原决定簇阵列的典型和优选的例子是具有严格重复的亚晶体次序的抗原或抗原决定簇阵列，优选具有1到30纳米的间隔，优选2到15纳米，甚至更优选2到10纳米，甚至再更优选2到8纳米，进一步优选3到7纳米。
菌毛：此处的术语“菌毛”(″pili″，单数为″pilus″)涉及细菌细胞的细胞外结构，由组织为有序和重复构型的蛋白质单体(例如菌毛素单体)组成。此外，菌毛是在例如细菌细胞附着到宿主细胞表面受体上、细胞间基因交换、和细胞-细胞识别的过程中所涉及的结构。菌毛的例子包括1-型菌毛、P-菌毛、F1C菌毛、S-菌毛、和987P-菌毛。菌毛的其它例子将在下文列出。
菌毛样结构：此处的短语“菌毛样结构”涉及具有与菌毛具有相似性质并且由蛋白质单体组成的结构。“菌毛样结构”的一个例子是由表达修饰的菌毛蛋白质的细菌细胞形成的结构，其中该修饰的菌毛蛋白质没有形成与天然菌毛相同的有序的和重复的阵列。
多肽：此处的术语“多肽”和“肽”涉及包含用酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)的分子。它们是氨基酸的分子链。本发明优选的肽是五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽以及长度为高达和包括300，优选250，甚至更优选200，更优选150，进一步更优选100，更进一步优选75，更优选50个氨基酸残基的所有其它的肽。用于本发明的目的的是包含超过50到10000个氨基酸残基的多肽。该术语也涉及多肽或肽的表达后修饰例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。重组或衍生的多肽或肽不一定从指定的核苷酸序列翻译而成。它也可以用任何的方式来产生，包括化学合成，其优选用于肽。
自身抗原：此处的术语“自身抗原”涉及由宿主的DNA编码的蛋白质，宿主的DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物被定义为自身的。此外，两种或多种自身分子的组合产生的蛋白质也可认为是自身的。
治疗：此处的术语“治疗”涉及哺乳动物，特别是人的预防和/或治疗。例如当用于自身免疫性或与骨相关(AI或BR)的疾病时，该术语涉及增加患者对发展成AI或BR疾病的耐受性，或者，换言之，减少患者发展成AI或BR、或显示出与AI或BR有关的疾病征兆的可能性的预防性疗法，以及在患者已经发展成AI或BR后治疗，以对抗AI或BR，例如减弱或消除AI或BR或者阻止它恶化。
疫苗：此处的术语“疫苗”涉及包含本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的制剂，其是能施用于动物的形式。典型地，疫苗包含常规的盐或缓冲的水溶液介质，本发明的组合物悬浮或溶解在该介质中。在这种形式中，本发明的组合物可以方便地用于预防、改善或治疗所述的情况。一旦引入到宿主内，疫苗就能刺激免疫应答，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生，和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、T辅助细胞、树突状细胞的激活，和/或其它的细胞应答。典型地，本发明的修饰的核心颗粒，优选本发明的修饰的VLP，优选主要诱导B-型应答，更优选只诱导B-型应答，这将会有其它的优点。
任选地，本发明的疫苗还包括佐剂，其相对于本发明的化合物可以较小或较大的比例存在。
病毒样颗粒(VLP)：此处的术语“病毒样颗粒”涉及与病毒颗粒类似的结构。此外，本发明的病毒样颗粒是非复制性的和非传染性的，因为它缺乏全部或部分的病毒基因组，特别是病毒基因组的复制和传染组分。本发明的病毒样颗粒可以包含与它们的基因组不同的核苷酸。本发明病毒样颗粒的一个典型的和优选的实施方案是病毒衣壳，例如相应病毒、噬菌体或RNA-噬菌体的病毒衣壳。可互换使用的术语“病毒衣壳”或“衣壳”，涉及由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。典型地和优选地，病毒蛋白质亚单位分别装配为具有内在的重复性结构的病毒衣壳和衣壳，其中所述结构典型地是球状的或管状的。例如，RNA-噬菌体或HBcAg的衣壳具有二十面体对称的球形结构。此处的术语“衣壳样结构”涉及在维持足够程度的有序性和重复性的同时，在上述定义范围内由与衣壳形态相似的病毒蛋白质亚单位组成的，但不同于典型的对称装配体的大分子装配体。
噬菌体的病毒样颗粒：此处的术语“噬菌体的病毒样颗粒”或可以等同使用的术语“RNA-噬菌体的病毒样颗粒”所涉及的病毒颗粒，与噬菌体的结构类似，但是非复制的和非传染性的，并至少缺乏编码噬菌体的复制机制的基因，典型地也缺乏编码用于使病毒附着到或进入宿主中的蛋白质的一种或几种基因。但是，该定义包括噬菌体的病毒样颗粒，其中仍然存在上述的一种或几种基因，但其是非激活的，因此也会导致非复制和非传染性的噬菌体的病毒样颗粒。
RNA噬菌体外壳蛋白的VLP：由RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚单元自装配成的并任选包含宿主RNA的衣壳结构称作“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。一个具体的例子是Qβ外壳蛋白的VLP。在这个具体的情况中，Qβ外壳蛋白的VLP既可以是仅由QβCP亚单元装配成的(通过包含例如TAA终止密码子的QβCP基因的表达产生，而通过抑制作用排除了较长的A1蛋白的任何表达，见T.M.，等人，Intervirology 39：9-15(1996))，也可以在衣壳装配体中包含A1蛋白亚单元。
病毒颗粒：此处的术语“病毒颗粒”涉及病毒的形态学形式。在一些病毒类型中，它包含由蛋白质衣壳围绕的基因组；其他的类型则具有另外的结构(例如被膜、尾部等)。
一个：除非另有说明，当在本文中使用“一个”时，它们是指“至少一个”或者“一个或更多”。优选地，它们是指“一个”。
本领域技术人员将会明白，本发明的某些实施方案包括使用重组核酸技术，例如克隆、聚合酶链反应、DNA和RNA的纯化、在原核细胞和真核细胞中表达重组蛋白等等。这些方法是本领域技术人员公知的，可以在出版的实验室方法手册中找到(例如，Sambrook，J.等人，eds.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997))。操作组织培养细胞系的基本的实验室技术(Celis，J.，ed.，Cell Biology，Academic Press，2nd edition，(1998))和基于抗体的技术(Harlow，E.和Lane，D.，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，″Guide to Protein Purification，″Meth.Enzymol.128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，Protein Purification Principles and Practice，3rd ed.，Springer-Verlag，New York(1994))也在文献中有充分的描述，将它们全部引入本文作为参考。
2.增强免疫应答的组合物和方法
本发明还涉及本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP或本发明的组合物或本发明的药物组合物在制备治疗自身免疫性疾病或与骨有关的疾病的药物中的应用。所述治疗优选是治疗性治疗或是预防性治疗。优选的自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、炎性肠病、多发性硬化症、糖尿病、自身免疫性甲状腺病、自身免疫性肝炎、牛皮癣或牛皮癣性关节炎。优选的与骨有关的疾病是骨质疏松症、牙周炎、假体周骨质溶解、骨转移、骨癌痛、佩吉特病、多发性骨髓瘤、舍格伦综合征和原发性胆汁性肝硬化。
本发明的修饰的核心颗粒或组合物，包含，或者由下列物质组成：(a)核心颗粒，优选是VLP，和(b)至少一种非自身的肽，优选非人类的肽(TNF-肽)，其包含与保守域pfam 00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基3到8同源的、优选的非人类的肽序列，优选与保守域pfam 00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基1到8同源的肽序列，更优选与所述共有序列的氨基酸残基1到11同源的肽序列，甚至更优选与所述共有序列的氨基酸残基1到13同源的肽序列，其中a)和b)互相连接。
优选的非自身的和优选的非人类的来自TNFα的TNF-肽包含，更优选由肽VAHVVA(SEQ ID NO：31)组成，更优选它们包含，或甚至由肽KPVAHVVA(SEQ ID NO：32)组成，甚至更优选它们包含，或甚至由肽KPVAHVVAN(SEQ ID NO：33)组成。其他更优选的非自身的、非人类的来自TNFα的TNF-肽包含，更优选由SSQNSSDKPVAHVVANHQVE(SEQ ID NO：129)或SSQNSSDKPVAHVVANHQAE(SEQ ID NO：130)或S SRTPSBKPVAHVVANPQAE(SEQ ID NO：131)或SSRTPSDKPVAHVVANPEAE(SEQ ID NO：132)或SKPVAHVVAN(SEQ ID NO：191)或SSRTPSDKPVAHVVANPEAE(SEQ ID NO：194)或SSRTPSDKPVAHVVANPEAE(SEQ ID NO：195)组成。
在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，更优选由肽CGGVAHVVA(SEQ ID NO：134)或肽CGGKPVAHVVA(SEQ ID NO：29)或肽CGGKPVAHVVAN(SEQID NO：135)或肽CGGSSQNSSDKPVAHVVANHQVE(SEQ ID NO：127)或肽CGGSSQNSSDKPVAHVVANHQAE(SEQ ID NO：136)或肽CGGSSRTPSBKPVAHVVANPQAE(SEQ ID NO：137)或肽CGGSSRTPSDKPVAHVVANPEAE(SEQ ID NO：128)或肽CGGSKPVAHVVAN(SEQ ID NO：192)组成。
在一个优选的实施方案中，本发明的非自身的和优选非人类的TNF-肽与病毒样颗粒结合，以形成有序的和重复的抗原-VLP-阵列。在另一个优选的实施方案中，该非自身的和优选非人类的TNF-肽由长度为4到75个氨基酸残基，优选长度为4到50个氨基酸残基，更优选长度为4到40个氨基酸残基，更优选长度为4到35个氨基酸残基，更优选长度为4到30个氨基酸残基，甚至更优选长度为4到25个氨基酸残基，甚至更优选长度为4到20个氨基酸残基，甚至更优选长度为4到18个氨基酸残基，甚至更优选长度为4到16个氨基酸残基，甚至更优选长度为4到14个氨基酸残基，甚至更优选长度为4到13个氨基酸残基，甚至更优选长度为4到12个氨基酸残基的肽组成。可替代地，上述长度范围(4到50、4到40、4到30、4到25、4到20、4到18、4到16、4到14、4到13和4到12)中的下限优选可以是5、6、7或8个氨基酸残基。
在另一个优选的实施方案中，该非自身的和优选非人类的TNF-肽包括由在1到10个位点，更优选在2-8个位点，甚至更优选在2到6个位点，仍然更优选在2到4个位点，最优选在3到4个位点处与最同源的自身、优选人的TNF-肽不同的肽组成。
在另一个优选的实施方案中，该非自身的和优选非人类的TNF-肽包括与最同源的自身、优选人的TNF-肽具有75％到98％同一性，更优选具有80％到97％同一性，甚至更优选具有85％到96％同一性，仍然更优选具有85％到95％同一性，最优选具有90％到95％同一性的肽。
在另一个优选的实施方案中，要治疗的动物是人、狗、猫、牛或马。优选地，要治疗的动物是人。非人类的TNF-肽优选是非人类的脊椎动物的TNF-肽，更优选非人类的真哺乳亚纲动物的TNF-肽，甚至更优选猫、犬、牛或小鼠TNF-肽，最优选小鼠TNF-肽。如果要治疗的动物是狗，那么非自身的TNF-肽是非犬的TNF-肽，优选是非犬的脊椎动物的TNF-肽，更优选非犬的真哺乳亚纲动物的TNF-肽，甚至更优选猫、人、牛或小鼠TNF-肽。如果要治疗的动物是猫，那么非自身的TNF-肽是非猫的TNF-肽，优选是非猫的脊椎动物的TNF-肽，更优选非猫的真哺乳亚纲动物的TNF-肽，甚至更优选犬、人、牛或小鼠TNF-肽。
在另一个优选的实施方案中，该非自身的和优选非人类的TNF-肽包含，优选由与小鼠TNFα(SEQ ID NO：2)的氨基酸残基10到15，更优选氨基酸残基8到15，甚至更优选氨基酸残基8到20，最优选氨基酸残基1到20同源的肽序列组成。
在另一个优选的实施方案中，该TNF-肽来自脊椎动物，优选哺乳动物，更优选真哺乳动物亚纲的多肽，选自TNFα、LTα、LTα/β、FasL、CD40L、TRAIL、RANKL、CD30L、4-1BBL、OX40L、GITRL和BAFF、CD27L、TWEAK、APRIL、TL1A、EDA，优选选自TNFα、LTα、LTα/β，或选自TRAIL和RANKL，或选自FasL、CD40L、CD30L和BAFF，或选自4-1BBL、OX40L和LIGHT，或选自LTα、LTα/β、FasL、CD40L、TRAIL、CD30L、4-1BBL、OX40L、GITRL和BAFF。
在一个优选的实施方案中，所使用的修饰的核心颗粒，优选修饰的VLP的TNF-肽来自选自TNFα、LTα和LTα/β的脊椎动物的多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、炎性肠病、多发性硬化症、糖尿病、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、重症肌无力、舍格伦综合征和多发性硬化症，最优选牛皮癣的药物。
当TNF-肽来自LTα时，所述TNF-肽优选包含，或者甚至由肽AAHLVG(SEQ ID NO：34)或肽AAHLIG(SEQ ID NO：35)组成，更优选所述TNF-肽包含，或者甚至由肽KPAAHLVG(SEQ ID NO：36)或KPAAHLIG(SEQ ID NO：37)组成，甚至更优选它包含，或者甚至由肽LKPAAHLVG(SEQ ID NO：38)或LKPAAHLIG(SEQ ID NO：39)或HLTHGILKPAAHLVGYPSKQ(SEQ ID NO：133)或HLTHGLLKPAAHLVGYPSKQ(SEQ ID NO：139)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，更优选由肽CGGHLTHGILKPAAHLVGYPSKQ(SEQ ID NO：140)或肽CGGHLTHGLLKPAAHLVGYPSKQ(SEQ ID NO：141)组成。
当该TNF-肽来自LTβ时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽AAHLIG(SEQ ID NO：40)组成，更优选它包含，或甚至由肽PAAHLIGA(SEQ ID NO：41)或肽PAAHLIGI(SEQ ID NO：42)或肽ETDLNPELPAAHLIGAWMSG(SEQ ID NO：142)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，或者更优选由肽CGGETDLNPELPAAHLIGAWMS G(SEQ ID NO：143)组成。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的LIGHT多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎和糖尿病的药物。
当TNF-肽来自LIGHT时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽AAHLTG(SEQ ID NO：91)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽NPAAHLTG(SEQ ID NO：92)或AAHLTGAN(SEQ ID NO：93)组成，甚至更优选它包含，或甚至由肽VNPAAHLTGANS(SEQ ID NO：94)或ANPAAHLTGANA(SEQ ID NO：95)或DQRSHQANPAAHLTGANASL(SEQ ID NO：144)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，或者更优选由肽CGGDQRSHQANPAAHLTGANASL(SEQ ID NO：145)组成。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的FasL多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选全身性红斑狼疮、糖尿病、自身免疫性甲状腺病、自身免疫性肝炎和多发性硬化症的药物。
当TNF-肽来自FasL时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽VAHLTG(SEQ ID NO：51)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽RSVAHLTG(SEQ ID NO：52)或RKVAHLTG(SEQ ID NO：53)或RRAAHLTG(SEQ ID NO：54)或KKAAHLTG(SEQ ID NO：55)或PSEKKEPRSVAHLTGNPHSR(SEQ ID NO：146)或PSETKKPRSVAHLTGNPRSR(SEQ ID NO：147)或PSEKRELRKVAHLTGKPNSR(SEQ ID NO：198)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，或者更优选由肽CGGPSEKKEPRSVAHLTGNPHSR(SEQ ID NO：148)或肽CGGPSETKKPRSVAHLTGNPRSR(SEQ ID NO：149)组成。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的CD40L多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、炎性肠病、舍格伦综合征和动脉粥样硬化的药物。
当TNF-肽来自CD40L时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽AAHVIS(SEQ ID NO：43)或肽AAHVVS(SEQ ID NO：44)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽QIAAHVIS(SEQ ID NO：45)或RIAAHVIS(SEQ ID NO：46)组成，甚至更优选它包含，或甚至由肽NPQIAAHVIS(SEQ ID NO：47)或DPQIAAHVIS(SEQ ID NO：48)或DPQIAAHVVS(SEQ ID NO：49)或EPQIAAHVIS(SEQ ID NO：50)或QRGDEDPQIAAHVVSEANSN(SEQ ID NO：150)或QKGDQDPRIAAHVISEASSN(SEQ ID NO：196)或QKGDQDPRVAAHVISEASSS(SEQ ID NO：197)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，或者更优选由肽CGGQRGDEDPQIAAHVVSEANSN(SEQ ID NO：151)组成。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的TRAIL多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、多发性硬化症和自身免疫性甲状腺病的药物。
当TNF-肽来自TRAIL时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽AAHIT(SEQ ID NO：64)或肽AAHLT(SEQ ID NO：65)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽VAAHITG(SEQ ID NO：66)组成，甚至更优选它包含，或甚至由肽PQKVAAHITG(SEQ ID NO：67)或PQRVAAHITG(SEQ ID NO：68)或PRGGRPQKVAAHITGITRRS(SEQ ID NO：152)或PRGRRPQRVAAHITGITRRS(SEQ ID NO：153)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，或者更优选由肽CGGPRGGRPQKVAAHITGITRRS(SEQ ID NO：154)或肽CGGPRGRRPQRVAAHITGITRRS(SEQ ID NO：155)组成。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的RANKL多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、骨质疏松症、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、多发性骨髓瘤、牙周炎、假体周骨质溶解、骨转移、骨癌痛、牙周病和佩吉特病，最优选牛皮癣的药物。
当TNF-肽来自RANKL时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽FAHLTI(SEQ ID NO：69)或肽SAHLTV(SEQ ID NO：70)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽EAQPFAHLTI(SEQ ID NO：71)或QPFAHLTIN(SEQ ID NO：72)组成，甚至更优选它包含，或甚至由肽KPEAQPFAHLTINA(SEQ ID NO：73)或AQPFAHLTIN(SEQ ID NO：190)或KLEAQPFAHLTINA(SEQ ID NO：74)或KRSKLEAQPFAHLTINATDI(SEQ ID NO：75)或QRGKPEAQPFAHLTINAASI(SEQ ID NO：76)或RRGKPEAQPFAHLTINAADI(SEQ ID NO：156)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，或者更优选由肽CGGQRGKPEAQPFAHLTINAASI(SEQ ID NO：157)或肽CGGRRGKPEAQPFAHLTINAADI(SEQ ID NO：158)或肽CGGAQPFAHLTIN(SEQ ID NO：189)组成。
在本发明一个优选的实施方案中，非自身的和优选非人类的TNF-肽包含，优选由与SEQ ID NO：22(小鼠RANKL蛋白全长)的氨基酸残基164到169，更优选SEQ ID NO：22的氨基酸残基162到169，甚至更优选SEQ ID NO：22的氨基酸残基160到170，还甚至更优选SEQ ID NO：22的氨基酸残基160到171，最优选SEQ ID NO：22的氨基酸残基155到174，即SEQ ID NO：3同源的肽序列组成。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的CD30L多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺病、舍格伦综合征、心肌炎和原发性胆汁性肝硬化的药物。
当TNF-肽来自CD30L时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽WAYLQV(SEQ ID NO：111)或肽AAYMRV(SEQ ID NO：112)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽KGAAAYMRV(SEQ IDNO：113)或肽KKSWAYLQV(SEQ ID NO：114)或肽LKSTPSKKSWAYLQVSKHLN(SEQ ID NO：159)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，更优选由肽CGGLKSTPSKKSWAYLQVSKHLN(SEQ ID NO：160)组成。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的4-1BBL多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，炎性肠病和多发性硬化症，优选类风湿性关节炎的药物。
当TNF-肽来自4-1BBL时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽FAQLVA(SEQ ID NO：115)或肽FAKLLA(SEQ ID NO：116)或肽LVAQNVLL(SEQ ID NO：117)或肽LLAKNQAS(SEQ ID NO：118)或肽QGMFAQLVA(SEQ ID NO：119)或肽NTTQQGSPVFAKLLAKNQAS(SEQ ID NO：161)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，或者更优选由肽CGGNTTQQGSPVFAKLLAKNQAS(SEQ ID NO：162)组成。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的OX40L多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎和炎性肠病的药物。
当TNF-肽来自OX40L时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽FILTSQ(SEQ ID NO：120)或肽FIGTSK(SEQ ID NO：121)或肽FILPLQ(SEQ ID NO：122)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽KGFILTSQK(SEQ ID NO：123)或肽RLFIGTSKK(SEQ ID NO：124)或AVTRCEDGQLFISSYKNEYQ(SEQ ID NO：163)或PVTGCEGGRLFIGTSKNEYE(SEQ ID NO：164)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，更优选由肽CGGAVTRCEDGQLFISSYKNEYQ(SEQ ID NO：165)或肽CGGPVTGCEGGRLFIGTSKNEYE(SEQ ID NO：166)组成。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的BAFF多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎和舍格伦综合征的药物。
当TNF-肽来自BAFF时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽LQLIAD(SEQ ID NO：88)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽QDCLQLIADS(SEQ ID NO：89)或QACLQLIADS(SEQ ID NO：90)或NLRNIIQDCLQLIADSDTPT(SEQ ID NO：167)或NLRNIIQDSLQLIADSDTPT(SEQ ID NO：193)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，更优选由肽CGGNLRNIIQDCLQLIADSDTPT(SEQ ID NO：168)或肽CGGNLRNIIQDSLQLIADSDTPT(SEQ ID NO：138)组成。
当TNF-肽来自CD27L时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽AELQLN(SEQ ID NO：56)或LQLNLT(SEQ ID NO：57)或LQLNHT(SEQ ID NO：58)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽VAELQLN(SEQ ID NO：59)或TAELQLN(SEQ ID NO：60)组成，甚至更优选它包含，或甚至由肽TAELQLNL(SEQ ID NO：61)或VAELQLNL(SEQ ID NO：62)或VAELQLNH(SEQ ID NO：63)或PEPHTAELQLNLTVPRKDPT(SEQ ID NO：169)或PELHVAELQLNLTDPQKDLT(SEQ ID NO：170)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，更优选由肽CGGPEPHTAELQLNLTVPRKDPT(SEQ ID NO：171)或肽CGGPELHVAELQLNLTDPQKDLT(SEQ ID NO：172)组成。
当TNF-肽来自TWEAK时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽AAHYEV(SEQ ID NO：77)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽RAIAAHYEV(SEQ ID NO：78)或AAHYEVHP(SEQ IDNO：79)组成，甚至更优选它包含，或甚至由肽ARRAIAAHYEVHP(SEQ ID NO：80)或PRRAIAAHYEVHP(SEQ ID NO：81)或RKARPRRAIAAHYEVHPRPG(SEQ ID NO：173)或RKARPRRAIAAHYEVHPQPG(SEQ ID NO：174)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，更优选由肽CGGRKARPRRAIAAHYEVHPRPG(SEQ ID NO：175)或肽CGGRKARPRRAIAAHYEVHPQPG(SEQ ID NO：176)组成。
当TNF-肽来自APRIL时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽SVLHLV(SEQ ID NO：82)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽HSVLHLVP(SEQ ID NO：83)或QSVLHLVP(SEQ ID NO：84)组成，甚至更优选它包含，或甚至由肽KKQHSVLHLVP(SEQ ID NO：85)或KKKHSVLHLVP(SEQ ID NO：86)或KKKQSVLHLVP(SEQ IDNO：87)或QKHKKKHSVLHLVPVNITS(SEQ ID NO：177)或QKHKKKQSVLHLVPINITS(SEQ ID NO：178)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，更优选由肽CGGQKHKKKHSVLHLVPVNITS(SEQ ID NO：179)或肽CGGQKHKKKQSVLHLVPINITS(SEQ ID NO：180)组成。
当TNF-肽来自TL1A时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽RAHLTV(SEQ ID NO：96)或肽RAHLTI(SEQ ID NO：97)或肽KAHLTI(SEQ ID NO：98)或肽TQHFKN(SEQ ID NO：99)或PPRGKPRAHLTIKKQTP(SEQ ID NO：181)或PSRDKPKAHLTIMRQTP(SEQ ID NO：182)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，更优选由肽CGGPPRGKPRAHLTIKKQTP(SEQ ID NO：183)或CGGPSRDKPKAHLTIMRQTP(SEQ ID NO：184)组成。
当TNF-肽来自EDA时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽AVVHLQ(SEQ ID NO：100)或肽VVHLQG(SEQ ID NO：101)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽QPAVVHLQG(SEQ ID NO：102)或PAVVHLQGQG(SEQ ID NO：103)组成，甚至更优选它包含，或甚至由肽TRENQPAVVHLQ(SEQ ID NO：104)或ENQPAVVHLQGQGS(SEQ ID NO：105)或QPAVVHLQGQGSAI(SEQ ID NO：106)或TGTRENQPAVVHLQGQGSAI(SEQ ID NO：185)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，更优选由肽CGGTGTRENQPAVVHLQGQGSAI(SEQ ID NO：186)组成。
当TNF-肽来自GITR时，所述TNF-肽优选包含，或甚至由肽CMVKF(SEQ ID NO：107)或肽CMAKF(SEQ ID NO：108)组成，更优选所述TNF-肽包含，或甚至由肽ESCMVKFE(SEQ ID NO：109)或EPCMAKFG(SEQ ID NO：110)或KPTVIESCMVKFELSSSKW(SEQID NO：187)组成。在一个优选的实施方案中，具有第二附着位点的TNF-肽包含，更优选由肽CGGKPTVIESCMVKFELSSSKW(SEQ IDNO：188)组成。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的CD27L多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选动脉粥样硬化和心肌炎的药物。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的TWEAK多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、全身红斑狼疮和多发性硬化症的药物。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的APRIL多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选全身红斑狼疮、类风湿性关节炎和舍格伦综合征的药物。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳亚纲动物的TL1A多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病，优选炎性肠病的药物。
在一个实施方案中，核心颗粒包含，或选自病毒、细菌的菌毛、细菌菌毛素形成的结构、噬菌体、病毒样颗粒、RNA-噬菌体的病毒样颗粒、病毒衣壳颗粒或其重组形式。可以选择本领域已知的任何具有有序的和重复的外壳蛋白和/或核心蛋白结构的病毒作为本发明的核心颗粒；适当的病毒的例子包括辛德比斯病毒和其他α病毒、弹状病毒(例如水泡性口膜炎病毒)、微小核糖核酸病毒(例如，人鼻病毒、Aichi病毒)、披膜病毒(例如，风疹病毒)、正粘液病毒(例如，索戈托病毒、贝特肯病毒、禽流感病毒)、多瘤病毒(例如，多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、鸟多瘤病毒BFDV)、细小病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒、口蹄疫病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒、烟草花叶病毒、禽兽棚病毒、和人乳头状瘤病毒，优选RNA噬菌体、噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体M11、噬菌体MX1、噬菌体NL95、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体GA、噬菌体SP、噬菌体MS2、噬菌体f2、噬菌体PP7(例如参见Bachmann，M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today 17：553-558(1996)的表1)。
在另一个实施方案中，本发明利用病毒的基因遗传工程方法产生有序的和重复的病毒包膜蛋白和本发明的TNF-肽之间的融合。可替代地，该病毒包膜蛋白包含第一附着位点，其中可替代地或优选地，该第一附着位点是异源蛋白、肽、抗原决定簇或精选的反应性氨基酸残基。在另一个实施方案中，本发明的TNF-肽还有另外的第二附着位点。本领域技术人员已知的其他基因操作可以在本发明组合物的构造中使用；例如，可能需要通过基因突变来限制重组病毒的复制能力。此外，用于本发明的病毒是由于化学或物理灭活，或如所示，由于缺乏可复制基因组而不能复制的病毒。选择与本发明的TNF-肽或可替代的与第一附着位点融合的病毒蛋白质应当具有有序的和重复的结构。所述有序的和重复的结构包括亚晶体结构，本发明的TNF-肽与病毒表面附着或连接的间距为3-30nm，优选3-15nm，甚至更优选3-8nm。该类型融合蛋白的建立将导致在病毒表面具有多重的、有序的和重复的本发明的TNF-肽，或第一附着位点，并反映天然病毒蛋白质的正常结构。本领域技术人员将会理解，第一位点可以是可以特定附着到抗原或抗原决定簇上，产生有序和重复的抗原阵列的任何适当的蛋白质、多肽、糖、多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成的聚合物、次级代谢物或其组合，或者是上述物质的一部分。当然，病毒包膜蛋白在本发明的TNF-肽上的直接融合，可以在没有引入第一和/或第二附着位点的情况下进行。
在本发明的另一个实施方案中，核心颗粒是重组α病毒，更具体地，是重组辛德比斯病毒。α病毒家族的几个成员，辛德比斯病毒(Xiong，C.等人，Science 243：1188-1191(1989)；Schlesinger，S.，TrendsBiotechnol.11：18-22(1993))、塞姆利基森林病毒(SFV)(Liljestrom，P.和Garoff，H.，Bio/Technology 9：1356-1361(1991))及其他(Davis，N.L.等人，Virology 171：189-204(1989))，已经受到了相当大的关注，可以作为基于病毒的表达载体用于各种不同的蛋白质(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8：578-582(1997)；Liljestrom，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5：495-500(1994))，和作为候选者用于疫苗的研制。近来，很多专利涉及α病毒在异源蛋白的表达和疫苗的研制中的用途(参见U.S.5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245和5,814,482)。
用于制备基于病毒的核心颗粒的适当的宿主细胞公开于WO02/056905的第28页第37行至第29页第12行。此外，将多核苷酸载体引入宿主细胞的方法在WO 02/056905的第29页第13-27行给出。此外，作为重组宿主细胞用于制备基于病毒的核心颗粒的哺乳动物细胞公开于WO 02/056905的第29页第28-35行。将上述所指出的段落明确引入本文作为参考。
在本发明中适合作为核心颗粒使用的RNA病毒的其它例子包括但不限于，在WO 03/039225的第32页第5行到第34页第13行(0096段)公开的那些。此外，可以作为核心颗粒使用的举例的DNA病毒包括但不限于，在WO 03/039225的第34页第14行到第35页第13行(0097段)公开的那些。
在其它的实施方案中，细菌菌毛素、细菌菌毛素的亚部分、或包含细菌菌毛或其亚部分的融合蛋白可以分别用于制备本发明的修饰的核心颗粒和组合物和疫苗组合物。细菌菌毛素可以是从自然中纯化的或可以是重组制备的。菌毛素蛋白的例子包括由大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)、施氏假单胞菌、和绿脓假单胞菌产生的菌毛素。适用于本发明的菌毛素蛋白的氨基酸序列包括在GenBank报告AJ000636，AJ132364，AF229646，AF051814，AF051815和X00981中公开的那些，在此将其全部公开的内容引入作为参考。
在细菌菌毛素蛋白输出到细菌的周质中以前，通常通过处理该蛋白除去N-末端的前导序列。此外，本领域技术人员将会意识到，分别用于制备本发明的组合物和疫苗组合物的细菌菌毛素蛋白通常不具有天然存在的前导序列。
适用于本发明的菌毛素蛋白的具体和优选的例子公开于WO02/056905的第41页第13行到21行。适用于本发明的菌毛素蛋白的一个具体的例子是大肠杆菌的P-菌毛素(GenBank报告AF237482)。适用于本发明的1型大肠杆菌菌毛素的例子是具有如GenBank报告P04128所示的氨基酸序列的菌毛素，该氨基酸序列是由如GenBank报告M27603所示的核苷酸序列的核酸编码的。将这些GenBank报告的全部公开内容引入本文作为参考。同时，通常地和优选地将上述蛋白质的成熟形式用于分别制备本发明的组合物和疫苗组合物。
适合用于实施本发明的细菌菌毛素或菌毛素亚部分通常可以连接形成有序的和重复的抗原阵列。因此，包括例如，但不限于截短型菌毛突变体也在本发明的范围内。
在体外制备菌毛和菌毛样结构的方法和修饰可用于本发明的这些菌毛和菌毛样结构的优选方法公开于WO 02/056905的第41页第25行到第43页第22行。
在大多数例子中，分别用于本发明的组合物和疫苗组合物的菌毛或菌毛样结构包括单一类型的菌毛素亚单元。通常使用由相同亚单元组成的菌毛或菌毛样结构。
然而，本发明的组合物也包括包含由异源菌毛素亚单元形成的菌毛或菌毛样结构的组合物和疫苗。表达本发明的优选实施方案的可能的方法公开于WO 02/056905的第43页第28行到第44页第6行。
可以把菌毛素蛋白融合到本发明的TNF-肽上。在一个优选的实施方案中，至少一个本发明的TNF-肽通过共价交联连接到菌毛或菌毛样结构上。在一个非常优选的实施方案中，第一附着位点是在菌毛素上天然或非天然具有的赖氨酸的氨基，第二附着位点是与本发明的TNF-肽连接的半胱氨酸的巯基。然后，第一和第二附着位点通过异双功能交联剂连接。
在本申请的全文中的病毒样颗粒涉及类似病毒颗粒但不是病原性的结构。一般地，病毒样颗粒缺乏病毒基因组，因此，是非传染性的。同时，病毒样颗粒可以通过异源表达大量地制备出来，并可以容易地纯化。
在一个优选的实施方案中，该核心颗粒是病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。技术人员可以用公众易于获得的重组DNA技术和病毒编码序列来制备VLP。例如，可以构建病毒包膜或核心蛋白的编码序列，以便用商业可以获得的杆状病毒载体在病毒启动子的调节性控制下和适当的序列修饰下在杆状病毒表达载体中表达，以使得编码序列功能性地连接到调节序列上。病毒包膜或核心蛋白的编码序列也可以构建用于例如，在细菌表达载体中表达。
VLP的例子包括但不限于，乙型肝炎病毒(Ulrich，等人，Virus Res.50：141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes，等人，Gene 160：173-178(1995))、辛德比斯病毒、轮状病毒(US 5,071,651和US 5,374,426)、口蹄疫病毒(Twomey，等人，Vaccine 13：1603-1610，(1995))、诺瓦克病毒(Jiang，X.，等人，Science 250：1580-1583(1990)；Matsui，S.M.，等人，J.Clin.Invest.87：1456-1461(1991))的衣壳蛋白、逆转录病毒的GAG蛋白(WO 96/30523)、反转录转座子Ty蛋白p1、乙型肝炎病毒的表面蛋白(WO 92/11291)、人乳头状瘤病毒(WO 98/15631)、Ty和优选RNA噬菌体例如fr-噬菌体、GA-噬菌体、AP205-噬菌体和Qβ-噬菌体。
在一个更具体的实施方案中，VLP可以包含或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：重组多肽或其片段，选自轮状病毒的重组多肽、诺瓦克病毒的重组多肽、α病毒的重组多肽、口蹄疫病毒的重组多肽、麻疹病毒的重组多肽、辛德比斯病毒的重组多肽、多瘤病毒的重组多肽、逆转录病毒的重组多肽、乙型肝炎病毒的重组多肽(例如，HBcAg)、烟草花叶病毒的重组多肽、禽兽棚病毒的重组多肽、人乳头状瘤病毒的重组多肽、噬菌体的重组多肽、RNA噬菌体的重组多肽、Ty的重组多肽、fr-噬菌体的重组多肽、GA-噬菌体的重组多肽和Qβ-噬菌体的重组多肽。病毒样颗粒可以还包含或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：上述多肽的一种或多种片段，以及这些多肽的变异体。多肽的变异体可以与其野生型对应物在氨基酸水平上具有至少80％、85％、90％、95％、97％、或99％的同一性。
在一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，优选基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA噬菌体的重组蛋白或其片段。优选地，该RNA噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；l)噬菌体PP7和m)噬菌体AP205。
在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA-噬菌体Qβ或RNA-噬菌体fr或RNA-噬菌体AP205的重组蛋白或其片段。
在本发明另一个优选的实施方案中，该重组蛋白包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA噬菌体的外壳蛋白。
因此，本发明另一个优选的实施方案是形成衣壳或VLP的RNA噬菌体外壳蛋白，或与自装配为衣壳或VLP相适应的噬菌体外壳蛋白的片段。例如，可以在大肠杆菌中重组表达噬菌体Qβ外壳蛋白。此外，一旦发生这些表达，这些蛋白质就自发地形成衣壳。此外，这些衣壳形成具有内在的重复构造的结构。
可以用于制备本发明组合物的噬菌体外壳蛋白的具体优选的例子包括，RNA噬菌体的外壳蛋白，例如噬菌体Qβ(SEQ ID NO：4；PIR数据库；登记号VCBPQβ，涉及QβCP，和SEQ ID NO：5；登记号AAA16663涉及QβA1蛋白)、噬菌体R17(SEQ ID NO：6；PIR登记号VCBPR7)、噬菌体fr(SEQ ID NO：7；PIR登记号VCBPFR)、噬菌体GA(SEQ ID NO：8；GenBank登记号NP-040754)、噬菌体SP(SEQ ID NO：9；GenBank登记号CAA30374，涉及SP CP，和SEQ ID NO：10；登记号NP 695026，涉及SP A1蛋白)、噬菌体MS2(SEQ ID NO：11；PIR登记号VCBPM2)、噬菌体M11(SEQ ID NO：12；GenBank登记号AAC06250)，噬菌体MXI(SEQ ID NO：13；GenBank登记号AAC14699)、噬菌体NL95(SEQ ID NO：14；GenBank登记号AAC 14704)、噬菌体f2(SEQ ID NO：15；GenBank登记号P03611)、噬菌体PP7(SEQ ID NO：16)、和噬菌体AP205(SEQ ID NO：28)。此外，噬菌体Qβ的A1蛋白(SEQ ID NO：5)或从C-末端缺失多达100、150或180个氨基酸的C-末端截短形式可以掺入到Qβ外壳蛋白的衣壳装配中。一般地，在衣壳装配中应当限定QβA1蛋白与QβCP的百分比，以确保衣壳的形成。
已经发现，当在大肠杆菌中表达时，Qβ外壳蛋白会自装配为衣壳(Kozlovska TM.等人，GENE 137：133-137(1993))。所获得的衣壳或病毒样颗粒显示为具有25nm直径和T＝3近似对称的二十面体的噬菌体样衣壳结构。此外，噬菌体的晶体结构也已经解析。该衣壳包含180个拷贝的外壳蛋白，它们通过二硫键在共价的五聚体和六聚体中连接(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-5554(1996))，导致Qβ外壳蛋白的衣壳具有显著的稳定性。但是，由重组Qβ外壳蛋白形成的衣壳或VLPs可以包含与衣壳中的其它亚单元不通过二硫键连接或不完全连接的亚单元。但是，一般在VLP中超过约80％的亚单元通过二硫键互相连接。因此，一旦将重组Qβ外壳蛋白加样到非还原SDS-PAGE上，就可以看见对应于Qβ外壳蛋白单体的带以及对应于Qβ外壳蛋白的五聚体或六聚体的带。在非还原SDS-PAGE中，不完全二硫键连接的亚单元可以作为二聚体、三聚体或甚至四聚体的带显示出来。Qβ衣壳蛋白也可以显示对于有机溶剂和变性剂的不同寻常的耐受性。令人惊奇地，我们观测到，浓度高达30％的DMSO和乙腈及浓度高达1M的胍对于衣壳的稳定性没有影响。Qβ外壳蛋白的衣壳的高稳定性是一个有利的特征，特别是用于根据本发明的哺乳动物和人的免疫和接种中。
我们通过如Stoll，E.等人，J.Biol.Chem.252：990-993(1977)所述的N-末端Edman测序观测到，一旦在大肠杆菌中表达，通常就会除去Qβ外壳蛋白的N-末端甲硫氨酸。由N-末端甲硫氨酸未被除去的Qβ外壳蛋白组成的VLP，或包含其中N-末端甲硫氨酸被除去或仍然存在的Qβ外壳蛋白混合物的VLP也在本发明的范围内。
根据本发明，其它优选的RNA噬菌体，特别是Qβ的病毒样颗粒，公开于WO 02/056905中，在此将其全部公开内容引入作为参考。特别是，在WO 02/056905的实施例18中详细地说明了从Qβ制备VLP颗粒。
一旦在细菌宿主中表达，其它的RNA噬菌体外壳蛋白也显示了自装配(Kastelein，RA.等人，Gene 23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad Nauk SSSR 287：452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170：238-242(1989)，Ni，CZ.，等人，Protein Sci.5：2485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249：283-297(1995))。Qβ噬菌体衣壳，除了外壳蛋白外还包含所谓的通读蛋白A1和成熟蛋白A2。A1是通过在UGA终止密码子处的抑制作用产生的，长度为329个氨基酸。在本发明中使用的噬菌体Qβ重组外壳蛋白的衣壳不含A2溶解蛋白，而包含来自宿主的RNA。RNA噬菌体的外壳蛋白是RNA结合蛋白，在病毒的生命周期中，其与复制酶基因的核糖体结合位点的茎环相互作用而作为翻译抑制因子。相互作用的序列和结构要素是已知的(Witherell，GW.和Uhlenbeck，OC.Biochemistry28：71-76(1989)；Lim F.等人，J.Biol.Chem.271：31839-31845(1996))。一般已知，茎环和RNA参与病毒的装配(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-5554(1996))。
在本发明的一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA噬菌体的重组蛋白或其片段，其中该重组蛋白包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA噬菌体的突变外壳蛋白，优选上述的RNA噬菌体的突变外壳蛋白。在一个优选的实施方案中，该突变外壳蛋白是与本发明的TNF-肽的融合蛋白。在另一个优选的实施方案中，RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过取代除去至少一个，或至少两个赖氨酸残基，或通过取代添加至少一个赖氨酸残基来进行修饰；可替代地，RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过删除至少一个，或至少两个赖氨酸残基，或通过插入添加至少一个赖氨酸残基来进行修饰。删除、取代、或添加至少一个氨基酸残基使得改变了偶合度，即，特别是每个RNA噬菌体的VLP亚单元上TNF肽的量，以与疫苗的要求相匹配和相适应。
在另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段，其中该重组蛋白包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的外壳蛋白，或具有氨基酸序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的外壳蛋白的混合物，或SEQ ID NO：5的突变体，其中优选N-末端的甲硫氨酸被除去。
在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：Qβ的重组蛋白或其片段，其中该重组蛋白包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：突变Qβ外壳蛋白。在另一个优选的实施方案中，该突变外壳蛋白通过取代除去至少一个赖氨酸残基，或通过取代添加至少一个赖氨酸残基来进行修饰。可替代地，这些突变外壳蛋白通过删除至少一个赖氨酸残基，或通过插入添加至少一个赖氨酸残基来进行修饰。
在Qβ外壳蛋白的衣壳的表面暴露着4个赖氨酸残基。暴露的赖氨酸残基被精氨酸取代的Qβ突变体也可以用于本发明。因此下列的Qβ外壳蛋白突变体和突变QβVLPs可以用于实施本发明：″Qβ-240″(Lys13-Arg；SEQ ID NO：17)、″Qβ-243″(Asn 10-Lys；SEQ ID NO：18)、″Qβ-250″(Lys 2-Arg，Lys 13-Arg；SEQ ID NO：19)、″Qβ-251″(SEQ IDNO：20)和″Qβ-259″(Lys 2-Arg，Lys 16-Arg；SEQ ID NO：21)。因此，在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：突变Qβ外壳蛋白，其包含的蛋白质所具有的氨基酸序列选自a)氨基酸序列SEQ ID NO：17；b)氨基酸序列SEQ ID NO：18；c)氨基酸序列SEQ ID NO：19；d)氨基酸序列SEQ ID NO：20；和e)氨基酸序列SEQ ID NO：21。上述的Qβ外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLPs和衣壳的构建、表达和纯化分别在WO 02/056905中进行了描述。特别涉及的是上述申请的实施例18。
在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：Qβ的重组蛋白，或其片段，其中该重组蛋白包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：上述的Qβ突变体之一和相应的A1蛋白的混合物。
在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA-噬菌体AP205的重组蛋白，或其片段。
AP205基因组包括成熟蛋白、外壳蛋白、复制酶和在相关噬菌体中不存在的2个开放阅读框；溶解基因和在成熟基因的翻译中发挥作用的开放阅读框(Klovins，J.，等人，J.Gen.Virol.83：1523-33(2002))。WO 2004/007538，特别是实施例1和实施例2描述了怎样获得包含AP205外壳蛋白的VLP，以及特别是其表达和纯化。因此将WO 2004/007538，特别是上述所指出的实施例引入本文作为参考。AP205VLPs是高度免疫原性的，可以与本发明的TNF-肽连接而产生疫苗构建体，该构建体展示以重复的方式定向的本发明的TNF肽。对所显示的本发明的TNF肽产生高效价，表明结合的本发明的TNF肽可以和抗体分子相互作用，并且是免疫原性的。
在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA-噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白，或其片段。
能够装配的突变形式的AP205VLPs，包括在氨基酸5上脯氨酸替换成苏氨酸的AP205外壳蛋白，也可以用于实施本发明，产生本发明另一个优选的实施方案。AP205Pro-5-Thr的克隆和VLPs的纯化公开于WO 2004/007538中，特别是其实施例1和实施例2中。在此将WO 2004/007538的公开内容，特别是其实施例1和实施例2明确地引入作为参考。
在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段和RNA噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段的混合物。
在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或重组突变外壳蛋白的片段。
能够分别装配为VLP和衣壳的重组AP205外壳蛋白片段也可以用于实施本发明。这些片段可以通过分别在外壳蛋白和突变外壳蛋白的中间或末端删除来产生。在外壳蛋白和突变外壳蛋白序列中插入或本发明的TNF肽与外壳蛋白或突变外壳蛋白序列融合，以及与装配到VLP中相匹配是本发明的其它实施方案，分别产生嵌合型AP205外壳蛋白和颗粒。插入、删除和与外壳蛋白序列融合的结果以及是否与装配为VLP相匹配`，都可以通过电子显微镜来确定。
由上述的AP205外壳蛋白、外壳蛋白片段和嵌合型外壳蛋白形成的颗粒可以分离成纯的形式，分离方法包括通过沉淀的分级分离步骤和纯化步骤的组合，其中纯化步骤包括用例如Sephrose CL-4B、Sephrose CL-2B、Sephrose CL-6B柱和其组合进行凝胶过滤。其他的分离病毒样颗粒的方法是本领域已知的，也可以用于分离噬菌体AP205的病毒样颗粒(VLPs)。例如，在U.S.4,918,166中描述了使用超速离心法来分离酵母反转录转座子Ty的VLPs，在此将该专利整体引入作为参考。
已经确定了数种RNA噬菌体的晶体结构(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-554(1996))。使用这些信息，可以鉴定暴露于表面的残基，因此可以修饰RNA噬菌体外壳蛋白以便通过插入或取代来插入一个或几个反应性氨基酸残基。因此，这些修饰型的噬菌体外壳蛋白也可以用于本发明。因此，形成衣壳或衣壳样结构(例如，噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP、噬菌体AP205、和噬菌体MS2的外壳蛋白)的蛋白质变异体也可以用于制备本发明的修饰的核心颗粒。优选修饰的VLPs，和组合物。
尽管上述讨论的变异蛋白的序列与它们野生型对应物不同，但这些变异蛋白通常仍保留了形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明还包括分别包含形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变异体的组合物和疫苗组合物，以及分别制备这些组合物和疫苗组合物的方法、用于制备这些组合物的个体蛋白质亚单元、以及编码这些蛋白质亚单元的核酸分子。因此，在本发明范围内包括形成衣壳或衣壳样结构的野生型蛋白质的变异体形式，其保留了连接并形成衣壳或衣壳样结构的能力。
因此，本发明还包括分别包含蛋白质的组合物和疫苗组合物，其中该蛋白质包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：分别与形成有序的阵列和具有内在的重复结构的野生型蛋白质具有至少80％、85％、90％、95％、97％、或99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的范围内还包括编码用于制备本发明的组合物的蛋白质的核酸分子。
在另外的实施方案中，本发明还包括包含蛋白质的组合物，其中该蛋白质包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：与SEQ ID NOs：4-21所示的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、或99％同一性的氨基酸序列。
适用于本发明的蛋白质也包括形成衣壳或衣壳样结构或VLP的蛋白质的C-末端截短型突变体。这些截短型突变体的具体例子包括具有SEQ ID NOs：4-21任一所示的氨基酸序列，其中从C末端除去1，2，5，7，9，10，12，14，15，或17个氨基酸的蛋白质。典型地，这些C末端截短型突变体保留了形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其他蛋白质还包括形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质的N-末端截短型突变体。这些截短型突变体的具体例子包括具有SEQ ID NOs：4-21任一所示的氨基酸序列，其中从N末端除去1，2，5，7，9，10，12，14，15，或17个氨基酸的蛋白质。典型地，这些N末端截短型突变体保留了形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其他蛋白质包括形成衣壳或衣壳样结构的N-和C-末端截短型突变体。适当的截短型突变体包括具有SEQ IDNOs：4-21任一所示的氨基酸序列，其中从N末端除去1，2，5，7，9，10，12，14，15，或17个氨基酸和从C末端除去1，2，5，7，9，10，12，14，15，或17个氨基酸的蛋白质。典型地，这些N末端和C-末端截短型突变体保留了形成衣壳或衣壳样结构的能力。
本发明还包括包含蛋白质的组合物，其中该蛋白质包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：与上述的截短型突变体具有至少80％、85％、90％、95％、97％、或99％同一性的氨基酸序列。
因此，本发明包括修饰的核心颗粒，优选修饰的VLPs，和由形成衣壳或VLPs的蛋白质制备的组合物和疫苗组合物，由从单体蛋白亚单元和VLP或衣壳制备组合物的方法，制备这些单体蛋白质亚单元的方法，编码这些亚单元的核酸分子，以及用本发明的组合物在个体中接种和/或诱导免疫应答的方法。
在一个实施方案中，本发明提供的一种疫苗组合物，还包含佐剂。在另一个实施方案中，该疫苗组合物不含佐剂。在本发明的另一个实施方案中，该疫苗组合物包含本发明的核心颗粒，其中该核心颗粒包含，优选是，病毒样颗粒，其中优选地所述的病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。优选地，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA噬菌体的重组蛋白或其片段，优选RNA噬菌体的外壳蛋白。在一个优选的实施方案中，RNA噬菌体的外壳蛋白具有的氨基酸选自(a)SEQ ID NO：4；(b)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的混合物；(c)SEQ ID NO：6；(d)SEQ ID NO：7；(e)SEQ ID NO：8；(f)SEQ ID NO：9；(g)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的混合物；(h)SEQ ID NO：11；(i)SEQ ID NO：12；(k)SEQ ID NO：13；(l)SEQ ID NO：14；(m)SEQ ID NO：15；(n)SEQ ID NO：16；和(o)SEQ ID NO：28。可替代地，本发明的疫苗组合物的病毒样颗粒的重组蛋白包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA噬菌体的突变外壳蛋白，其中RNA噬菌体选自：(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(k)噬菌体f2；(l)噬菌体PP7；和(m)噬菌体AP205。
在一个优选的实施方案中，所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过除去，或通过取代添加至少一个赖氨酸残基进行修饰，在另一个优选的实施方案中，所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过删除至少一个赖氨酸残基或通过插入添加至少一个赖氨酸残基来进行修饰。在一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ，或RNA噬菌体fr，或RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段。
如前所述，本发明包括病毒样颗粒或其重组形式。在另一个优选的实施方案中，用于本发明的组合物的颗粒由乙型肝炎核心蛋白(HBcAg)或HBcAg的片段组成。在另一个实施方案中，用于本发明的组合物的颗粒由乙型肝炎核心蛋白(HBcAg)或HBcAg蛋白质的片段组成。Zhou等人(J.Virol.66：5393-5398(1992))证明，经修饰除去天然具有的半胱氨酸残基的HBcAg保留了连接和形成衣壳的能力。因此，适用于本发明的组合物的VLP包括，包含修饰的HBcAg或其片段的VLP，其中一个或多个天然具有的半胱氨酸残基被删除或被其他的氨基酸残基(例如，丝氨酸残基)所取代。
HBcAg是通过处理乙型肝炎核心抗原前体蛋白而产生的蛋白质。已经鉴别出了很多的HBcAg的同种型，本领域技术人员很容易就可以得到它们的氨基酸序列。在多数情况下，本发明的组合物和疫苗组合物是分别使用HBcAg的处理形式(即，乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N-末端前导序列已被除去的HBcAg)制备的。
此外，当在没有经过处理的情况下进行HBcAg的制备时，HBcAg通常是以“已处理”的形式表达的。例如，当使用引导蛋白质表达到细胞质中的大肠杆菌表达系统制备本发明的HBcAg时，通常表达这些蛋白质以使得乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N-末端前导序列不存在。
在例如WO 00/32227中，特别是其实施例17到19和21到24，以及WO01/85208，特别是其实施例17到19，21到24，31和41，以及WO02/056905中，披露了可用于本发明的乙型肝炎病毒样颗粒的制备。对于后一个申请，特别涉及实施例23，24，31和51。将这三篇文献明确引入作为参考。
本发明也包括经修饰删除或取代了一个或多个另外的半胱氨酸残基的HBcAg变异体。本领域已知，游离的半胱氨酸残基可以涉及很多的化学副反应。这些副反应包括二硫化物交换、与例如在与其他物质的联合治疗中注射或形成的化学物质或代谢物的反应、或直接氧化和在暴露于UV光时与核苷酸反应。这样可能产生有毒的加合物，特别是考虑到HBcAg具有强烈的与核酸结合的倾向。因此，这些有毒的加合物可能分布在众多类型之间，它们单独地可能以较低浓度存在，但当合并在一起时会达到毒性水平。
由上述看来，在疫苗组合物中使用经修饰除去了天然具有的半胱氨酸残基的HBcAg的一个优点是，当附着抗原或抗原决定簇时，有毒类型可以结合的位点的数目将会减少或完全除去。
已经鉴别出了很多适合用于实施本发明的天然存在的HBcAg变异体。许多的HBcAg变异体，以及数种乙型肝炎核心抗原前体变异体的氨基酸序列在GenBank报告AAF121240、AF121239、X85297、X02496、X85305、X85303、AF151735、X85259、X85286、X85260、X85317、X85298、AF043593、M20706、X85295、X80925、X85284、X85275、X72702、X85291、X65258、X85302、M32138、X85293、X85315、U95551、X85256、X85316、X85296、AB033559、X59795、X85299、X85307、X65257、X85311、X85301、X85314、X85287、X85272、X85319、AB010289、X85285、AB010289、AF121242、M90520、P03153、AF110999、和M95589中披露，在此将每个公开的内容引入作为参考。上述的乙型肝炎核心抗原前体变异体的序列在WO 01/85208中的SEQ ID NOs：89-138中进一步公开。其他适合用于本发明组合物的，和可以根据本说明书所公开的内容进一步修饰的HBcAg变异体，在WO 00/198333、WO 00/177158和WO 00/214478中进行了描述。
在另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：SEQ ID NO：25的重组蛋白。
多肽的氨基酸序列是否与上述的氨基酸序列或其亚部分具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的同一性，可以用常规的已知的计算机程序，例如Bestfit程序来确定。当使用Bestfit或其他的序列对比程序来确定特定的序列是否与参照氨基酸序列具有例如95％同一性时，需要设定参数以便在参照氨基酸序列的全长上计算同一性的百分比，在参照序列中允许有高达氨基酸残基总数5％的同源性的缺口。
上述的HBcAg变异体和前体的氨基酸序列可以彼此相对地类似。因此，提到位于相应于SEQ ID NO：25的特定位置的位置上的HBcAg变异体的氨基酸残基，是指在SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的该位置上存在的氨基酸残基。这些HBcAg变异体之间的同源性在感染哺乳动物的乙型肝炎病毒之间通常足够高，因此本领域技术人员检查SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列和特定的HBcAg变异体的氨基酸序列，并鉴别出“相应的”氨基酸残基几乎毫无困难。
本发明也包括疫苗组合物，其包含感染鸟类的乙型肝炎病毒的HBcAg变异体，以及包含这些HBcAg变异体的片段的疫苗组合物。对于这些HBcAg变异体，在将它们包含到本发明的疫苗组合物前，在这些多肽中天然存在的一个、二个、三个或更多半胱氨酸残基可以被其他的氨基酸残基所取代或被删除。
如上所述，除去游离的半胱氨酸残基可以减少毒性组分结合到HBcAg上的位点的数目，也能除去相同或相邻的HBcAg分子的赖氨酸和半胱氨酸残基发生交联的位点。因此，在本发明的另一个实施方案中，乙型肝炎病毒衣壳蛋白的一个或几个半胱氨酸残基已被删除或被其他的氨基酸残基取代。
在另外的实施方案中，本发明的组合物和疫苗组合物分别包含C-末端区(例如SEQ ID NO：25的氨基酸残基145-185或150-185)已被除去的HBcAg。因此，适合用于实施本发明的其它修饰的HBcAg包括C末端截短型突变体。适当的截短型突变体包括从C末端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
适合用于实施本发明的HBcAg也包括N末端截短型突变体。适当的截短型突变体包括从N末端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的修饰的HBcAg。
其他适合用于实施本发明的HBcAg包括N-和C-末端截短型突变体。适当的截短型突变体包括，从N末端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸和从C末端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
本发明还包括分别包含HBcAg多肽的组合物和疫苗组合物，其中HBcAg多肽包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：与上述截短型突变体具有至少80％、85％、90％、95％、97％、或99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的某些实施方案中，将赖氨酸残基导入进HBcAg多肽中，以介导本发明的TNF-肽与HBcAg的VLP的结合。在优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP，和本发明的组合物是用HBcAg制备的，其中该HBcAg包含，或由SEQ ID NO：25的氨基酸1-144或1-149、1-185组成，其已被修饰，以使得对应于79和80位的氨基酸被具有氨基酸序列Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ IDNO：27)的肽取代，形成具有SEQ ID NO：26所示序列的HBcAg多肽。在另外的优选的实施方案中，在SEQ ID NO：25的48和107位的半胱氨酸残基突变成丝氨酸。本发明还包括包含相应多肽的组合物，其中所述多肽具有任一上述乙型肝炎核心抗原前体变异体所示的氨基酸序列，而所述变异体也具有上述的氨基酸改变。在本发明的范围内还包括其它的能连接而形成衣壳或VLP并具有上述氨基酸改变的其他的HBcAg变异体。因此，本发明还包括分别包含HBcAg多肽的组合物和疫苗组合物，其中HBcAg多肽包含，或由下列物质组成：与任一野生型氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、或99％同一性的氨基酸序列，和适当时已经经过处理从而除去N-末端前导序列和用上述改变来修饰的这些蛋白质的形式。
本发明的组合物或疫苗组合物可以包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗组合物可以由具有不同氨基酸序列的HBcAg组成。例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和一个或几个氨基酸残基已被修改(例如，删除、插入或取代)的修饰的HBcAg的疫苗组合物。此外，本发明的优选的疫苗组合物是具有高度有序的和重复的抗原阵列的那些，其中该抗原是本发明的TNF-肽。
在本发明另一个优选的实施方案中，至少一个本发明的TNF-肽通过至少一个共价键分别结合到所述的核心颗粒和病毒样颗粒上。优选地，至少一个TNF-肽通过至少一个共价键分别结合到所述的核心颗粒和病毒样颗粒上，所述共价键是非肽键，以形成核心颗粒-TNF肽阵列或偶联物，其典型地和优选地是有序的和重复的阵列或偶联物。该TNF-肽-VLP阵列和偶联物分别典型地和优选地具有重复的和有序的结构，因为至少一个但通常超过一个的本发明的TNF-肽以定向的方式分别结合到VLP和核心颗粒上。优选超过120，优选超过180，更优选超过270，甚至更优选超过360个本发明的TNF-肽结合到VLP上。至少一个本发明的TNF-肽定向地和直接地以及确定地分别结合和附着到VLP和核心颗粒上确保了分别形成重复的和有序的TNF-VLP和核心颗粒的阵列和偶联物，这一点在下文将会变得显而易见。而且，VLP和核心颗粒各自的典型的内在高度重复的和有组织的结构有利地有助于其能够以优选的高度有序的和重复的方式展示本发明的TNF-肽，分别产生高度有组织的和重复的TNF-肽-VLP/核心颗粒阵列和偶联物。
在本发明另一个优选的实施方案中，该核心颗粒或病毒样颗粒包含至少一个第一附着位点，其中所述至少一个TNF-肽还包含至少一个第二附着位点，该第二附着位点选自(i)非与至少一个TNF-肽自然产生的附着位点；和(ii)与至少一个TNF-肽自然产生的附着位点，其中所述TNF-肽和核心颗粒或病毒样颗粒的结合是通过第一附着位点和第二附着位点之间的连接来实现的，其中优选地该连接是通过至少一个非肽键。
在本发明又一个优选的实施方案中，该修饰的VLP包含所述的具有至少一个第一附着位点的VLP，此外，该修饰的VLP包含所述的具有至少一个第二附着位点的TNF肽，该第二附着位点选自(i)非与至少一个TNF-肽自然产生的附着位点；和(ii)与至少一个TNF-肽自然产生的附着位点，其中该第二附着位点能与第一附着位点连接；其中优选地TNF肽和VLP通过所述连接相互作用而形成有序的和重复的抗原阵列。优选地，该连接是通过至少一个非肽键。
本发明公开了将本发明的至少一个TNF-肽分别结合到核心颗粒和VLP上的方法。如所示，在本发明的一个优选的方面，本发明的TNF-肽通过化学交联、典型地和优选地通过异双功能交联剂，分别结合到核心颗粒和VLP上。若干种异双功能交联剂是本领域已知的。在优选的实施方案中，该异双功能交联剂包含可与优选的第一附着位点反应，即分别与核心颗粒和VLP或至少一个VLP亚单元的赖氨酸残基的侧链氨基反应的官能团，以及能与优选的第二附着位点反应的另一个官能团，该第二附着位点即添加或设计地添加到本发明的TNF-肽上的，任选地也可以通过还原来进行反应的半胱氨酸残基。该方法的第一步，一般称作衍生化，是核心颗粒或VLP与交联剂反应。该反应的产物是活化的核心颗粒或活化的VLP，也称作活化载体。在第二步中，用通常的方法例如过滤或透析除去未反应的交联剂。在第三步中，本发明的TNF-肽与活化载体反应，该步骤一般称作偶合步骤。任选地在第四步中，通过例如透析除去未反应的本发明的TNF-肽。数种异双功能交联剂是本领域已知的。它们包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其他可以获得的，例如来自Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)，并具有与氨基反应的一个官能团和与半胱氨酸残基反应的一个官能团的交联剂。上述的交联剂都使得在与氨基反应后形成酰胺键，与半胱氨酸形成硫醚键。适合实施本发明的另一类交联剂，其特征在于在本发明的TNF-肽和核心颗粒或VLP之间通过偶合引入了二硫键。属于该类的优选的交联剂包括例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。用交联剂分别将核心颗粒和VLP衍生化的程度受到多种试验条件的影响，例如反应物各自的浓度、一种试剂相对于另一种的过量、pH、温度和离子强度。可以通过改变上述的试验条件来调节偶合度，即每个核心颗粒和VLP的亚单元中分别具有的本发明的TNF-肽的量，以适应疫苗的要求。本发明的TNF-肽的溶解性会限制能偶合到每个亚单元上的本发明的TNF-肽的量，在获得的疫苗为不溶性的情况下，降低每亚单元具有的本发明的TNF-肽的量是有利的。
将本发明的TNF-肽分别结合到核心颗粒和VLP上的一个特别有利的方法是，将核心颗粒和VLP表面的赖氨酸残基分别与本发明的TNF-肽上的半胱氨酸残基连接。因此，在本发明一个优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，第二附着位点是半胱氨酸残基。在某些实施方案中，可能需要将包含半胱氨酸残基作为第二附着位点或其一部分的氨基酸连接体与本发明的TNF-肽构建在一起，用于分别偶合到核心颗粒和VLP上。可替代地，可以通过添加把半胱氨酸引入到本发明的TNF-肽中。可替代地，可以通过化学偶合引入半胱氨酸残基。
在本发明另一个优选的实施方案中，至少一个第一附着位点包含氨基，或优选地，是氨基，其中甚至更优选地，第一附着位点是赖氨酸残基的氨基。
在本发明另一个优选的实施方案中，至少一个第二附着位点包含巯基，或优选地，是巯基，其中甚至更优选地，第二附着位点是半胱氨酸的巯基。
在本发明另一个优选的实施方案中，第一附着位点不是巯基，或优选地不包含巯基，其中更优选地，第一附着位点不是，更优选地不包含半胱氨酸残基的巯基。
氨基酸连接体的选择取决于本发明的TNF-肽的性质，它的生化性质，例如pI、电荷分布和糖基化。一般地，柔性的氨基酸连接体是比较有利的。氨基酸连接体的优选实施方案公开于WO 03/039225的第60页第24行到第61页第11行(第00179和00180段)，在此将其明确地引入作为参考。
在本发明另一个优选的实施方案中，特别是如果本发明的TNF-肽来自RANKL或TNFα，优选的氨基酸连接体是在肽的C-末端的GGCG(SEQ ID NO：24)、GGC或GGC-NH2(″NH2″代表酰胺化)连接体，或在N-末端的CGG。一般地，甘氨酸残基会插入到较大氨基酸和作为第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免在偶合反应中较大氨基酸的可能的空间位阻。
添加到本发明的TNF-肽上的半胱氨酸残基必须处于它的还原状态，以与异双功能交联剂在活化的VLP上反应，即必须有游离的半胱氨酸或具有游离巯基的半胱氨酸残基。当发挥结合位点功能的半胱氨酸残基是氧化型时，例如如果它形成了二硫键，则需要用例如DTT、TCEP或β-巯基乙醇来还原该二硫键。
根据上述优选的方法用异双功能交联剂把本发明的TNF-肽分别与核心颗粒和VLP结合，使得本发明的TNF-肽以定向的方式分别偶合到核心颗粒和VLP上。把本发明的TNF-肽分别与核心颗粒和VLP结合的其他方法包括使用碳二亚胺、EDC和NHS将本发明的TNF-肽分别与核心颗粒和VLP交联的方法。本发明的TNF-肽也可以首先通过例如与SATA、SATP或亚胺硫醇反应而硫醇化。然后如果需要，在脱保护后把本发明的TNF-肽分别如下偶合到核心颗粒和VLP上。在分离过量的硫醇化试剂后，本发明的TNF-肽先用包含半胱氨酸反应性部分的异双功能交联剂活化，再分别与核心颗粒和VLP反应，因此显示了至少一个或数个，优选一个与半胱氨酸残基反应的官能团，硫醇化的本发明的TNF-肽能如上所述与之反应。任选地，在反应混合物中包括较低量的还原剂。在其他方法中，用具有和核心颗粒和VLP的胺基或羧基反应的官能团的同双功能交联剂例如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3、(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或其他已知的同双功能交联剂把本发明的TNF-肽分别附着到核心颗粒和VLP上。
把VLP结合到本发明的TNF-肽上的其他方法包括，将核心颗粒和VLP分别生物素化并且本发明的TNF-肽表达为链霉抗生物素蛋白-融合蛋白的方法，或将本发明的TNF-肽和核心颗粒和VLP分别例如如WO 00/23955所述生物素化的方法。在这种情况下，可以首先通过调节本发明的TNF-肽与链霉抗生物素蛋白的比例将本发明的TNF-肽结合到链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白上，以使得其游离的结合位点仍然可以用于分别结合在下一步中加入的核心颗粒和VLP。或者，可以在“单瓶”反应中将所有组分混合。如果受体和配体的可溶形式可以获得，并能分别交联到核心颗粒和VLP，或本发明的TNF-肽上，则其他配体-受体对可以作为结合剂用于将本发明的TNF-肽与核心颗粒和VLP分别结合。或者，配体或受体可以与本发明的TNF-肽融合，这样就介导分别与核心颗粒和VLP的结合，该核心颗粒和VLP分别与该受体或配体化学结合或融合。通过插入或取代也可以实现所述融合作用。
如以上所示，在本发明的一个有利的实施方案中，该VLP是RNA噬菌体的VLP，在一个更优选的实施方案中，该VLP是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP。
一种或几种抗原分子，即本发明的TNF-肽，如果空间允许，可以优选通过RNA噬菌体的VLP上暴露的赖氨酸残基附着到RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳或VLP的一个亚单元上。因此，RNA噬菌体外壳蛋白的VLP，特别是Qβ外壳蛋白VLP的一个特定特征是每个亚单元有偶合数个抗原的可能性。这样就允许产生密集的抗原阵列。
在本发明一个优选的实施方案中，至少一个本发明的TNF-肽分别与核心颗粒和病毒样颗粒的结合和附着，是通过在病毒样颗粒的至少一个第一附着位点和加入到本发明的TNF-肽上的至少一个第二位点之间的相互作用和连接分别完成的。
Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在它们的表面显示了数量确定的赖氨酸残基，具有3个赖氨酸残基指向衣壳内部并与RNA相互作用，而另外4个赖氨酸残基暴露于衣壳外部的确定的拓扑学。这些确定的性质有利于抗原附着到颗粒的外部，而不是颗粒的内部，在颗粒内部赖氨酸残基与RNA相互作用。其他的RNA噬菌体外壳蛋白的VLP在它们表面也有数量确定的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基也有确定的拓扑学。
在本发明另一个优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基和/或第二附着位点包含巯基或半胱氨酸残基。在本发明一个非常优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基并且第二附着位点是半胱氨酸残基。
在本发明非常优选的实施方案中，本发明的TNF-肽通过已添加到该本发明的TNF-肽上的半胱氨酸残基与RNA噬菌体外壳蛋白的VLP，特别是Qβ外壳蛋白的VLP的赖氨酸残基结合。
来自RNA噬菌体的VLP的另一个优点是在细菌中它们的高表达收率，这样就能以可承受的成本制备大量的物质。另一个优选的实施方案是来自RNA噬菌体外壳蛋白和本发明的TNF-多肽的融合蛋白的VLP。
使用VLP作为载体允许分别产生具有可变抗原密度的稳定抗原阵列和偶联物。特别地，使用RNA噬菌体的VLP，特别是使用RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP允许达到非常高的表位或抗原密度。可以使用本申请的教导来制备具有高表位或抗原密度的RNA噬菌体外壳蛋白的VLP的组合物。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物和疫苗具有的抗原密度为0.05到4.0。此处的术语“抗原密度”涉及，在VLP，优选RNA噬菌体的VLP的每个亚单元，优选每个外壳蛋白上连接的本发明的TNF-肽的平均数。因此，可以用在本发明的组合物或疫苗中的VLP，优选RNA噬菌体的VLP的所有亚单元或单体上的平均数来计算该值。在本发明另一个优选的实施方案中，抗原密度优选是0.1到4.0。
如上所述，4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的VLP的表面。典型地，这些残基通过与交联剂分子反应而衍生化。当不是所有的暴露赖氨酸残基都能与抗原偶合时，在衍生化步骤后，已与交联剂反应的赖氨酸残基与附着到ε-氨基上的交联剂分子就留下来。这就使对VLP的溶解性和稳定性不利的一种或几种正电荷消失。通过例如在下文所述的Qβ外壳蛋白突变体中那样用精氨酸取代某些赖氨酸残基，我们避免了正电荷的过度消失，因为精氨酸残基并不能与优选的交联剂反应。此外，用精氨酸取代赖氨酸残基会产生更确定的抗原阵列，而只有较少的位点可与抗原反应。
因此，在下列的Qβ外壳蛋白突变体和突变QβVLP中，用精氨酸取代暴露的赖氨酸残基。这样，在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：突变Qβ外壳蛋白。优选的突变外壳蛋白包含或由选自下组的氨基酸序列组成；a)Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ ID NO：17)，b)Qβ-243(Asn10-Lys；SEQ ID NO：18)，c)Qβ-250(SEQ ID NO：19的Lys2-Arg)d)Qβ-251(SEQ ID NO：20的Lys 16-Arg)；和e)Qβ-259″(SEQ ID NO：21的Lys2-Arg、Lys16-Arg)。上述Qβ外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化在WO 02/056905中进行了描述。特别是上述申请的实施例18。在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：Qβ的重组蛋白，或其片段，其中该重组蛋白包含，基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：上述突变体的任一种和相应的A1蛋白的混合物。
将抗原附着到VLP，特别是RNA噬菌体外壳蛋白的VLP上的一个特别有利的方法是将RNA噬菌体外壳蛋白的VLP的表面上的赖氨酸残基与自然存在于或构建到抗原，即本发明的TNF-肽上的半胱氨酸残基连接。为了使半胱氨酸残基可以有效地作为第二附着位点，必须存在可用的巯基以进行偶合。因此，半胱氨酸必须处于其还原状态，即游离的半胱氨酸或具有游离巯基的半胱氨酸残基才是可用的。当发挥第二附着位点功能的半胱氨酸残基处于其氧化型时，例如如果它形成了二硫键，需要用例如DTT、TCEP或β-巯基乙醇来还原该二硫键。对于每种抗原必须调整还原剂的浓度和还原剂相对于抗原的摩尔过量程度。如果需要，测定滴定范围，从浓度为10μM或更低开始到高达10到20mM或更高的还原剂，并评价抗原和载体的偶合。尽管如WO 02/056905所述低浓度的还原剂适应该偶合反应，而较高的浓度会抑制该偶合反应，但技术人员应当了解，在较高浓度下必须通过透析或凝胶过滤除去还原剂。有利地，透析或平衡缓冲液的pH低于7优选6。必须测定低pH的缓冲液和抗原活性或稳定性的相容性。
在RNA噬菌体外壳蛋白的VLP上的表位密度可以通过选择交联剂和其他的反应条件来进行调节。例如，交联剂Sulfo-GMBS和SMPH一般允许达到较高的表位密度。高浓度的反应物会确定地影响衍生化，可以用对反应条件的操作来控制偶合到RNA噬菌体外壳蛋白的VLP，特别是Qβ外壳蛋白的VLP上的抗原数量。
在设计非天然的第二附着位点之前，必须选择应当融合、插入或一般地改造的位置。这样就会选择第二附着位点的位置，以避免第二附着位点或包含相同第二附着位点的任意氨基酸交联剂发生空间位阻。在另一个实施方案中，需要的抗体应答所针对的位点不同于自身抗原与其自然配体的相互作用位点。在这些实施方案中，可以选择第二附着位点以使得它能避免产生针对自身抗原与其自然配体的相互作用位点的抗体。
在优选的实施方案中，本发明的TNF-肽包含添加的能分别与核心颗粒和VLP或VLP亚单元上的第一附着位点连接的单个第二附着位点或单个反应性附着位点。这确保了至少一个，但一般大于一个，优选大于10、20、40、80、120、150、180、210、240、270、300、360、400、450个本发明的TNF-肽分别与核心颗粒和VLP确定和均匀地结合和连接。因此，在抗原上具有单个第二附着位点或单个反应性位点分别确保了结合和连接类型的单一性和均匀性，产生极其有序和重复的阵列。例如，如果是通过赖氨酸-(作为第一附着位点)和半胱氨酸-(作为第二附着位点)的相互作用分别来进行结合和连接，根据本发明的该优选实施方案，它就确保了每个本发明的TNF-肽上添加的1个半胱氨酸残基只有一个能分别与VLP和核心颗粒的第一附着位点结合和连接。
在某些实施方案中，将第二附着位点构建到本发明的TNF-肽上是通过包含根据本发明的内容适合作为第二附着位点的氨基酸的氨基酸连接体的融合来完成的。因此，在本发明一个优选的实施方案中，氨基酸连接体优选通过至少一个共价键结合到TNF-肽上。优选地，该氨基酸连接体包含，或由第二附着位点组成。在另一个优选的实施方案中，该氨基酸连接体包含巯基或半胱氨酸残基。在另一个实施方案中，该氨基酸连接体是半胱氨酸。上文已经提到了根据本发明的氨基酸连接体的某些选择标准和氨基酸连接体的其他优选
实施方案。
在本发明另一个优选的实施方案中，至少一种本发明的TNF-肽分别融合到核心颗粒和病毒样颗粒上。如上所述，VLP典型地包括至少一个装配为VLP的亚单元。因此，在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的TNF-肽融合到病毒样颗粒或能掺入VLP中产生嵌合型VLP-亚单元TNF-肽蛋白融合物的蛋白质的至少一个亚单元上。
本发明的TNF-肽的融合，可以通过插入VLP亚单元序列内、或通过融合到VLP-亚单元或能掺入VLP中的蛋白质的N-或C-末端上来完成。下文中，当涉及肽和VLP亚单元的融合蛋白时，包括融合到亚单元序列的末端或在亚单元序列内部插入肽，与本发明的TNF-肽的融合是发生在融合多肽的N-末端，即经其C-末端融合到VLP的亚单元上。
融合作用也可以通过将本发明的TNF-肽序列插入到部分亚单元序列被删除的VLP亚单元的变异体中来完成，也就是说还涉及截短型突变体。截短型突变体可以在N-或C-末端或者在内部删除了部分VLP亚单元的序列。例如，例如删除了氨基酸残基79到81的特定VLPHBcAg是具有内部删除的截短型突变体。本发明的TNF-肽融合到截短型突变VLP亚单元的N-或C-末端也是本发明的实施方案。此外，把表位融合到VLP亚单元的序列中也可以通过取代来完成，例如，氨基酸79-81被外源性表位取代的特定的VLP HBcAg。因此，下文所涉及的融合可以通过将本发明的TNF-肽序列插入到VLP亚单元的序列中，或通过用本发明的TNF-肽序列取代VLP亚单元的部分序列，或者是通过删除、取代或插入的组合来完成。
嵌合型TNF-肽-VLP亚单元一般能自装配为VLP。显示融合到它们亚单元上的表位的VLP在此也被称为嵌合型VLP。如所示，该病毒样颗粒包含，或由至少一个VLP亚单元组成。在本发明的另一个实施方案中，该病毒样颗粒包含，或由嵌合型VLP亚单元和非嵌合型VLP亚单元组成，形成所谓的嵌合型颗粒，其中非嵌合型VLP亚单元即不含有融合于其上的抗原的VLP亚单元。这对于确保形成VLP和装配到VLP上是有利的。在这些实施方案中，总VLP亚单元中嵌合型VLP-亚单元的比例可以是1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95％或更高。
可以把侧面的氨基酸残基加入到本发明的TNF-肽序列的任一末端，以满足上文对于本发明的融合多肽所述的需求，也可以融合到VLP的亚单元序列的任一末端，或把这些肽序列内部插入到VLP的亚单元的序列中。甘氨酸和丝氨酸残基是特别有利的氨基酸，可以用于添加到要融合的本发明的TNF-肽上的侧面序列中。甘氨酸残基提供了另外的柔性，可以减小在把外源性序列融合到VLP亚单元的序列中时潜在的失稳效应。
在本发明一个特别的实施方案中，该VLP是乙型肝炎核心抗原VLP。与HBcAg的N-末端融合的融合蛋白(Neyrinck，S.等人，NatureMed 5：1157-1163(1999))，或向所谓的主要免疫显性区(MIR)中的插入已经有文献进行了描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001))，WO 01/98333)，并且是本发明优选的实施方案。在MIR中具有删除的HBcAg的自然存在的变异体也已经有文献进行了描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)，在此将其特别全部引入作为参考)，融合到N-或C-末端以及插入到MIR与野生型HBcAg相比相应的删除位点所在位置是本发明的另一个实施方案。融合到C-末端也已经有文献进行了描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))。本领域技术人员很容易即可找到怎样用经典的分子生物学技术构建融合蛋白的教导(Sambrook，J.等人，eds.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd.edition，ColdSpring Habor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，Ho等人，Gene 77：51(1989))。
在本发明另一个优选的实施方案中，该VLP是RNA噬菌体的VLP。RNA噬菌体的主要外壳蛋白在细菌，尤其是大肠杆菌中一经表达就会自然地装配为VLP。可以用于制备本发明组合物的噬菌体外壳蛋白的具体例子包括RNA噬菌体的外壳蛋白，例如噬菌体Qβ(SEQ ID NO：4；PIR数据库，登记号VCBPQβ，涉及QβCP和SEQID NO：5；登记号AAA16663，涉及Qβ A1蛋白)和噬菌体fr(SEQID NO：7；PIR登记号VCBPFR)。
在一个更优选的实施方案中，至少一个本发明的TNF-肽融合到Qβ外壳蛋白上。其中表位已经融合到Qβ的A1蛋白的截短型的C末端或插入到A1蛋白内的融合蛋白已经有文献进行了描述(Kozlovska，T.M.，等人，Intervirology，39：9-15(1996))。通过在UGA终止密码子处抑制来产生A1蛋白，如果把N-末端的甲硫氨酸的切割也考虑在内，则其长度为329个或328个氨基酸。在丙氨酸(QβCP基因编码的第二个氨基酸)前的N-末端甲硫氨酸的切割通常发生在大肠杆菌中，这种情况也适用于Qβ外壳蛋白CP的N-末端。A1基因中位于UGA琥珀密码子3′方向的部分编码CP的延伸部分，其长度为195个氨基酸。在CP延伸部分的72和73位之间插入至少一个本发明的TNF-肽产生了本发明的另外的实施方案(Kozlovska，T.M.，等人，Intervirology 39：9-15(1996))。把本发明的TNF-肽融合到C-末端截短型QβA1蛋白的C-末端产生了本发明另外的优选实施方案。例如Kozlovska等人，(Intervirology，39：9-15(1996))描述了一种QβA1蛋白融合物，其中表位融合到19位截短的QβCP延伸部分的C-末端。
如Kozlovska等人(Intervirology，39：9-15(1996))所述，显示融合表位的颗粒的装配一般需要存在A1蛋白-TNF-肽融合物和野生型CP，以形成嵌合型颗粒。然而，本发明的范围内也包括包含病毒样颗粒，特别是包含RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP的实施方案，其中所述VLP仅仅由具有融合到其上的至少一个本发明的TNF-肽的VLP亚单元构成。
可以用很多方法来完成嵌合型颗粒的制备。Kozlovska等人，Intervirolog，39：9-15(1996)描述了两种方法，都可以用于实施本发明。在第一种方法中，融合表位在VLP上的有效显示是通过编码QβA1蛋白融合物的质粒在大肠杆菌株中表达而介导的，其中QβA1蛋白融合物在CP和CP延伸部分之间具有UGA终止密码子，该大肠杆菌株包含编码可导致UGA密码子翻译为Trp的克隆UGA抑制型tRNA的质粒(pISM3001质粒(Smiley B.K.，等人，Gene 134：33-40(1993)))。在另一种方法中，CP基因终止密码子被修饰为UAA，并且共转化表达A1蛋白-TNF-肽融合物的第二质粒。该第二质粒编码不同的抗生素抗性，复制起点与第一质粒相匹配(Kozlovska，T.M.，等人，Intervirology 39：9-15(1996))。在第三种方法中，如Kozlovska等人，Intervirology，39：9-15(1996)的附图1所示，以双顺反子的形式编码CP和A 1蛋白-TNF-肽融合物，有效连接到启动子，例如Trp启动子上。
在另一个实施方案中，将本发明的TNF-肽插入到frCP的氨基酸2和3之间(切割的CP的编号，即N-末端的甲硫氨酸被切除)，这样就产生了TNF-肽-frCP融合蛋白。用于构建和表达自装配为VLP的frCP融合蛋白并且在本发明实施中有用的载体和表达系统也已经有文献进行了描述(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993))。在一个特定的实施方案中，本发明的TNF-肽序列插入到frCP缺失变异体中的氨基酸2后，其中fr CP的残基3和4已被删除(Pushko P.等人，ProtoEng.6：883-891(1993))。
在RNA噬菌体MS-2的N-末端突起的β-发夹结构中表位的融合，和随后在RNA噬菌体MS-2的自装配VLP上融合表位的呈现，也已经有文献进行了描述(WO 92/13081)，通过插入或取代把发明的TNF-肽融合到MS-2RNA噬菌体的外壳蛋白中也落在本发明的范围内。
在本发明另一个实施方案中，本发明的TNF-肽融合到乳头瘤病毒的衣壳蛋白上。在更特别的实施方案中，本发明的TNF-肽融合到1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1上。用于构建和在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达的BPV-1融合蛋白的载体和表达系统已经有文献进行了描述(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO 00/23955)。用本发明的TNF-肽取代BPV-1 L1中的氨基酸130-136产生BPV-1 L1-TNF-肽融合蛋白，这也是本发明的一个优选的实施方案。在杆状病毒载体中克隆和在被杆状病毒感染的Sf9细胞中表达也已经有文献进行了描述，并可以用于本发明的实施(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO 00/23955)。显示融合的本发明TNF-肽的已装配颗粒的纯化可以通过很多方法来完成，例如，凝胶过滤或蔗糖梯度超速离心法(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO 00/23955)。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的TNF-肽融合到能掺入到Ty VLP中的Ty蛋白上。在更特别的实施方案中，本发明的TNF-肽融合到由TYA基因编码的p1或衣壳蛋白上(Roth，J.F.，Yeast 16：785-795(2000))。已经从酿酒酵母中分离出了酵母反转录转座子Ty1，2，3和4，而从稷酒裂殖酵母中分离出了反转录转座子Tf1(Boeke，J.D.和Sandmeyer，S.B.，″Yeast Transposable elements，″in Themolecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces：Genomedynamics，Protein Synthesis，and Energetics.，p.193，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1991))。反转录转座子Ty1和2与植物和动物元中的copia类有关，而Ty3属于反转录转座子的gypsy家族，其与植物和动物的反转录病毒有关。在Ty1反转录转座子中，p1蛋白也被称为Gag或衣壳蛋白，长度为440个氨基酸。在VLP成熟期间，p1在408位被切割，从而产生作为VLP基本成分的p2蛋白。
与p 1的融合蛋白和用于在酵母中表达所述融合蛋白的载体已经有文献进行了描述(Adams，S.E.，等人，Nature 329：68-70(1987))。因此，例如，可以通过将编码本发明的TNF-肽的序列插入pMA5620质粒的BamH1位点中而使本发明的TNF-肽与p1融合(Adams，S.E.，等人，Nature 329：68-70(1987))。将编码外源性表位的序列克隆到pMA5620载体内产生了融合蛋白的表达，其中该融合蛋白包含其C-末端融合到外源性表位N-末端的Ty1-15的p1的氨基酸1-381。此外，本发明的TNF-肽的N-末端融合，或内部插入p1序列中，或部分取代p1序列也落在本发明的范围内。特别地，本发明的TNF-肽插入到Ty蛋白p1的氨基酸30-31，67-68，113-114和132-133之间的Ty序列中(EP0677111)也是本发明的优选实施方案。
适合本发明的TNF-肽融合的其他VLP是，例如逆转录病毒样颗粒(W09630523)、HIV2 Gag(Kang，Y.C.，等人，Biol.Chem.380：353-364(1999))、豇豆花叶病毒(Taylor，K.M.等人，Biol.Chem.380：387-392(1999))、细小病毒VP2 VLP(Rueda，P.等人，Virology263：89-99(1999))、HBsAg(US 4,722,840，EP0020416B1)。
适合本发明实施的嵌合型VLP的例子是在Intervirology 39：1(1996)中描述的那些。预期可以用于本发明的VLP的其他例子是：HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、烟草花叶病毒。也可以制备SV-40、多瘤病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒和诺瓦克病毒的病毒样颗粒，这些VLP的嵌合型VLP也在本发明的范围内。
本发明的TNF-肽可以通过在强启动子的控制下表达编码本发明的TNF-肽的DNA而制备。有关于此的各种例子在文献中已经有描述并可能在修改后使用，以优选地在本文的融合多肽例如与GST或DHFR的融合物中表达任意所需种类的本发明的TNF-肽。
这些本发明的TNF-肽可以用标准的分子生物学技术来制备，其中编码目标片段的核苷酸序列通过PCR来扩增，并被克隆成与多肽标签，例如组氨酸标签、Flag标签、myc标签或抗体的恒定区(Fc区)的融合物。通过在本发明的TNF-肽与标签之间引入肠激酶切割位点，可以在用肠激酶消化纯化后将本发明的TNF-肽与标签分离。在另一种方法中，可以用本领域技术人员已知的标准肽合成反应在体外用或不用磷酸化修饰来合成本发明的TNF-肽。
在本申请的全文中给出了如何修饰本发明的TNF-肽，特别是将其结合到病毒样颗粒上的教导。用包含分别结合到核心颗粒和VLP上的本发明的TNF-肽，优选本发明的人TNF-肽的本发明组合物来对TNF-超家族的某一成员进行免疫，可以提供一种治疗自身免疫性疾病和与骨有关的疾病的方法。
在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的TNF-肽还包含至少一种非自然存在于所述本发明的TNF-肽中的第二附着位点。在一个优选的实施方案中，所述附着位点包含本发明的氨基酸连接体，优选为C、CG、GC、GGC或CGG的连接体序列。
一些非常优选的本发明的TNF-肽将在实施例中进行描述。这些肽包含一个N-或C-末端半胱氨酸残基作为添加的第二附着位点用于偶联到VLP上。当分别偶合到VLP和核心颗粒上时，这些非常优选的非自身，优选非人类的本发明的TNF-肽具有特别增强的免疫原性。
在本发明的另一个优选的实施方案中，由长度为4到8个氨基酸残基，优选长度为4到7个氨基酸残基，更优选长度为4到6个氨基酸残基的肽组成的TNF-肽能克服当作为较短片段的靶向自身蛋白可能不包含T细胞表位时可能出现的安全性问题。一般地，该肽越短，T细胞激活就越安全。
TNF-超家族的其他优选的成员和来自这些分子的本发明的TNF-肽可能在未来在现在尚未得到序列信息的那些种类中发现。上述的在TNF-超家族成员的定义中说明的Blastp搜索能够帮助确定存在于这些蛋白质中的TNF-域。
本发明涉及本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP在制备用于治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病的药物中的应用，以及一种治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病的方法，包括给患者，优选人施用本发明的修饰的VLP。所述治疗优选是治疗性治疗或预防性治疗。优选的自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、炎性肠病、多发性硬化症、糖尿病、自身免疫性甲状腺病、自身免疫性肝炎、牛皮癣或牛皮癣性关节炎。优选的与骨有关的疾病是骨质疏松症、牙周炎、假体周骨质溶解、骨转移、骨癌痛、佩吉特病、多发性骨髓瘤、舍格伦综合征和原发性胆汁性肝硬化。
在一个优选的实施方案中，所使用的修饰的核心颗粒，优选修饰的VLP的TNF-肽来自于选自TNFα、LTα和LTα/β的脊椎动物的多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、炎性肠病、多发性硬化症、糖尿病、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、重症肌无力、舍格伦综合征和多发性硬化症，最优选牛皮癣的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的LIGHT多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎和糖尿病的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的FasL多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选全身性红斑狼疮、糖尿病、自身免疫性甲状腺病、自身免疫性肝炎和多发性硬化症的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的CD40L多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、炎性肠病、舍格伦综合征和动脉粥样硬化的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的TRAIL多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、多发性硬化症和自身免疫性甲状腺病的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的RANKL多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、骨质疏松症、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、多发性骨髓瘤、牙周炎、假体周骨质溶解、骨转移、骨癌痛、牙周病和佩吉特病，最优选牛皮癣的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的CD30L多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺病、舍格伦综合征、心肌炎和原发性胆汁性肝硬化的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的4-1BBL多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，炎性肠病和多发性硬化症，优选类风湿性关节炎的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的OX40L多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、炎性肠病和多发性硬化症的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，优选修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的BAFF多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎和舍格伦综合征的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的CD27L多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选动脉粥样硬化和心肌炎的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的TWEAK多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮和多发性硬化症的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的APRIL多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎和舍格伦综合征的药物。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明的修饰的核心颗粒，特别是修饰的VLP的TNF-肽来自于脊椎动物，特别是真哺乳动物亚纲的TL1A多肽。这些偶联物优选用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病，优选炎性肠病的药物。
相关领域的技术人员将会理解，对上述方法和应用进行其他适当的修改和变更将是显而易见的，而且也不会脱离本发明或其任何实施方案的范围。现在已经对本发明进行了详细描述，通过参考下列的实施例将会更清楚地理解，这些实施例仅仅是用于解释的目的，而不是对本发明进行限制。
实施例
现在通过解释说明和实施例来对本发明进行完整的描述以达到清楚地理解的目的，在不影响本发明或其任意实施方案的范围的条件下，在条件、组成和其他参数的广泛和等同的范围内通过修改或改变本发明来达到相同的目的对于本领域的普通技术人员将是显而易见的，这些修改或改变也包括在附属的权利要求的范围内。
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请说明了本发明所属领域的技术人员的技术水平，在此以相同的范围将其引入作为参考，这样每个出版物、专利或专利申请都似乎是特别地和分别地引入作为参考。
实施例1
A.小鼠的TNFα(4-23)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取3ml在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的3.06mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与99.2μl SMPH溶液(65mM，在DMSO中)在室温下反应60分钟。反应溶液4℃下在更换的两份3120mM HEPES，150mMNaCl pH 7.2中透析，分别4小时和14小时。将69μl衍生化和已透析的Qβ溶液与265.5μl 20mM HEPES pH 7.2和7.5μl具有第二附着位点(SEQ ID NO：127CGGSSQNSSDKPVAHVVANHQVE)的mTNF-α(4-23)肽(23.6mg/ml，在DMSO中)混合，并在15℃温育2小时进行化学交联。通过4℃下在PBS中进行两次2小时的透析除去未偶合的肽。在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析偶合产物。附图1显示的是考马斯染色的凝胶。可以看到分子量比Qβ衣壳单体增加的几个带，这清楚地表明，mTNF-α(4-23)肽成功地交联到了Qβ衣壳上。
B.用偶合到Qβ衣壳蛋白上的mTNF-α(4-23)肽免疫小鼠
用偶合到mTNF-α(4-23)肽上的Qβ衣壳蛋白免疫4只Balb/c系雌性小鼠。在PBS中将25μg总蛋白稀释成200μl，在0、16和23天皮下注射(在两个腹侧各100μl)。2只小鼠接受没有添加任何佐剂的疫苗，而另2只接受含有明矾的疫苗。小鼠在0和32天眶后取血，用小鼠和人TNFα-特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
用浓度为1μg/ml的小鼠TNFα蛋白或人TNFα蛋白包被ELISA平板。封闭该平板，然后与系列稀释的第32天的小鼠血清温育。用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。用导致在450nm处半数最大光密度的稀释度的平均值计算小鼠血清的抗体效价。对于无佐剂免疫的小鼠，平均抗-小鼠TNFα效价是18800，而对于含明矾进行免疫的小鼠则为16200。令人惊奇地，相同血清的抗-人TNFα效价的测定产生了惊人的相似值，平均分别为17900和12900。这些数据表明，用偶合到Qβ衣壳蛋白上的mTNF-α(4-23)肽进行免疫得到了相当程度地识别小鼠和人TNFα蛋白的抗体。
D.中和抗体的检测
为了测定在小鼠中产生的抗体是否有中和活性，建立了对小鼠和人TNFα和它们的同源受体小鼠TNFRI和人TNFRI的体外结合测定。因此，用10μg/ml的小鼠或人TNFα蛋白包被ELISA平板，分别与重组小鼠TNFRI-hFc融合蛋白或重组人TNFRI-hFc融合蛋白的系列稀释液温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测结合的蛋白。发现两种TNFRI/hFc融合蛋白都以高亲和力(0.1-0.5nM)与它们各自的配体结合。然后测定用偶合到Qβ衣壳上的mTNF-α(4-23)免疫的小鼠的血清抑制小鼠和人TNFα蛋白与它们各自受体结合的能力。因此，用10μg/ml的小鼠或人TNFα蛋白包被ELISA平板，分别与第32天的小鼠血清的系列稀释液和0.25nM的小鼠或人TNFRI-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体与固定的TNFα蛋白的结合。附图2A表明，所有的血清都特异性抑制了小鼠TNFα蛋白和其受体的结合。此外，如附图2B所示，相同的血清也以相似的效力抑制了人TNFα蛋白和它同源受体的结合。这些数据表明，用偶合到Qβ衣壳上的mTNF-α(4-23)肽免疫，可以得到能中和小鼠和人TNFα蛋白与它们的同源受体相互作用的抗体。
实施例2
A.猫的(f)TNFα(4-23)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的3ml 3.06mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与25.2μl SMPH溶液(65mM，在DMSO中)在室温下反应60分钟。反应溶液4℃下在更换的两份3120mM HEPES pH 7.2中透析，分别4小时和14小时。将30μl衍生化和已透析的Qβ溶液与167.8μl20mM HEPES pH 7.2和2.2μl具有第二附着位点(SEQ ID NO：128CGGSSRTPSDKPVAHVVANPEAE)的fTNF-α(4-23)肽(23.6mg/ml，在DMSO中)混合，并在15℃温育2小时进行化学交联。通过4℃下在PBS中进行两次2小时的透析除去未偶合的肽。
B.用偶合到Qβ衣壳蛋白上的fTNF-α(4-23)肽免疫小鼠
用偶合到fTNF-α(4-23)肽上的Qβ衣壳蛋白免疫6只Balb/c系雌性小鼠。在PBS中将25μg总蛋白稀释成200μl，在0、14和21天皮下注射(在两个腹侧各100μl)。3只小鼠接受没有添加任何佐剂的疫苗，而另3只接受含有明矾的疫苗。小鼠在0和35天眶后取血，用小鼠和人TNFα-特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
用浓度为1μg/ml的小鼠TNFα或人TNFα包被ELISA平板。封闭该平板，然后与系列稀释的第35天的小鼠血清温育。用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。用导致在450nm处半数最大光密度的稀释度的平均值计算小鼠血清的抗体效价。对于无佐剂免疫的小鼠，平均抗-人TNFα效价是4491，而对于含明矾进行免疫的小鼠则为21538。测定相同血清的抗-小鼠TNFα效价，接受无明矾的疫苗的小鼠为1470，而接受含明矾的疫苗的小鼠为6007。这些数据表明，用偶合到Qβ上的fTNF-α(4-23)肽进行免疫得到了识别小鼠和人TNFα蛋白的抗体。
D.中和抗体的检测
测定用偶合到Qβ衣壳上的fTNF-α(4-23)免疫的小鼠的血清抑制小鼠和人TNFα蛋白与它们各自受体结合的能力。因此，用浓度为5μf/ml的小鼠或人TNFα蛋白包被ELISA平板，分别与第35天的小鼠血清的系列稀释液和0.25nM的小鼠或人TNFRI-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体与固定的TNFα蛋白的结合。附图3A表明，所有的血清都特异性抑制了小鼠TNFα蛋白和其受体的结合。此外，如附图3B所示，相同的血清也以相似的效力抑制了人TNFα蛋白和它同源受体的结合。这些数据表明，用偶合到Qβ衣壳上的fTNF-α(4-23)肽免疫，可以得到能中和小鼠和人TNFα蛋白与它们的同源受体相互作用的抗体。
实施例3
A.小鼠的TNFα(4-23)肽与Qβ衣壳的偶合
由N-末端、包含半胱氨酸的连接体、六组氨酸标签和成熟鼠TNF-α蛋白(相应于未成熟蛋白的氨基酸78到233)(SEQ ID NO：23)组成的融合蛋白，在大肠杆菌中重组表达，并通过亲和色谱法纯化到均匀。取在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的包含1.4mg/ml该蛋白的溶液与等摩尔的TCEP在室温下温育60分钟以还原N-末端的半胱氨酸残基。然后取在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的500μl 3.06mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与4.2μl SMPH溶液(65mM，在DMSO中)在室温下反应60分钟。反应溶液4℃下在更换的两份3120mM HEPES pH 7.2中透析，分别2小时和14小时。将60μl衍生化和已透析的Qβ溶液与30μl H2O和180μl纯化的和预先还原的小鼠TNFα蛋白混合，并在15℃温育4小时进行化学交联。4℃下在PBS中用分子量阻断值为300,000Da的纤维素酯膜进行两次2小时的透析除去未偶合的蛋白质。
B.用偶合到Qβ衣壳上的小鼠TNF-α蛋白免疫小鼠
用偶合到小鼠TNF-α蛋白上的Qβ衣壳蛋白免疫4只雌性C57B1/6小鼠。在PBS中将25μg总蛋白稀释成200μl，在0、14和35天皮下注射(在两个腹侧各100μl)。小鼠在0和49天眶后取血，用小鼠和人TNFα-特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
用浓度为1μg/ml的小鼠TNFα或人TNFα蛋白包被ELISA平板。封闭该平板，然后与系列稀释的来自第49天的小鼠血清温育。用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。用导致在450nm处半数最大光密度的稀释度的平均值计算小鼠血清的抗体效价。平均抗-小鼠TNFα效价是21940，而同一血清的平均抗-人TNFα效价为160。这些数据表明，与上述实施例1的结果不同，用偶合到完全小鼠TNF-α蛋白上的Qβ进行免疫仅得到了对小鼠TNFα高度特异性的抗体。
D.中和抗体的检测
然后测定用偶合到Qβ衣壳上的小鼠TNF-α免疫的小鼠的血清抑制小鼠和人TNFα蛋白与它们各自受体结合的能力。因此，用浓度为5μg/ml的小鼠或人TNFα蛋白包被ELISA平板，分别与第49天的小鼠血清的系列稀释液和0.25nM的小鼠或人TNFRI-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体与固定的TNFα蛋白的结合。附图4A表明，所有的血清都特异性抑制了小鼠TNFα蛋白和其受体的结合。相反地，如附图4B所示，相同的血清没有抑制人TNFα蛋白和它同源受体的结合。这些数据表明，用偶合到Qβ衣壳上的小鼠TNFα免疫，可以得到能中和小鼠TNFα蛋白而非人TNFα蛋白与它们各自的受体相互作用的抗体。
实施例4
A.mTNFα(11-18)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的3.06mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与10倍摩尔过量的SMPH溶液(SMPH母液，溶解在DMSO中)在室温下反应60分钟。反应溶液4℃下在更换的两份3120mM HEPESpH 7.2中透析，分别4小时和14小时。将衍生化和已透析的Qβ溶液与20mM HEPES pH 7.2和5倍摩尔过量的具有第二附着位点(SEQ IDNO：29：CGGKPVAHVVA)的mTNF-α(11-18)肽混合，并在16℃温育2小时进行化学交联。通过4℃下在PBS中进行两次2小时的透析除去未偶合的肽。当沉淀时，使用过量较少的SMPH和/或肽。在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离偶合产物并用考马斯染色以鉴定mTNF-α肽与Qβ衣壳的交联。
B.用偶合到Qβ衣壳蛋白上的mTNF-α(11-18)肽免疫小鼠
用偶合到mTNF-α(11-18)肽上的Qβ衣壳蛋白免疫8只Balb/c系雌性小鼠。在PBS中将25μg总蛋白稀释成200μl，在0、14和21天皮下注射(在两个腹侧各100μl)。4只小鼠接受没有添加任何佐剂的疫苗，而另4只接受含有明矾的疫苗。小鼠在0和35天眶后取血，用小鼠TNFα蛋白-特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
用浓度为1μg/ml的小鼠TNFα蛋白包被ELISA平板。封闭该平板，然后与系列稀释的第35天的小鼠血清混合液温育。用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。用导致在450nm处半数最大光密度的稀释度的平均值计算小鼠血清的抗体效价。抗-小鼠TNFα蛋白效价的测定证明诱导了识别TNFα蛋白的抗体。
D.中和抗体的检测
为了测定在小鼠中产生的抗体是否有中和活性，建立了对于小鼠或人TNFα蛋白和它们的同源受体TNFRI的体外结合测定。因此，用10μg/ml的小鼠或人TNFα蛋白包被ELISA平板，分别与重组小鼠或人TNFRI-hFc融合蛋白的系列稀释液温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测结合的蛋白。然后测定用偶合到Qβ衣壳上的mTNF-α(11-18)免疫的小鼠的血清抑制小鼠或人TNFα蛋白与它们各自受体结合的能力。因此，用10μg/ml的小鼠或人TNFα蛋白包被ELISA平板，分别与第35天的小鼠血清混合液的系列稀释液和0.35nM的小鼠或人受体融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体与固定的TNFα蛋白的结合和血清对它的抑制作用。
实施例5
A.mTNFα(9-20)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的3.06mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与10倍摩尔过量的SMPH溶液(SMPH母液，溶解在DMSO中)在室温下反应60分钟。反应溶液4℃下在更换的两份3120mM HEPESpH 7.2中透析，分别4小时和14小时。将衍生化和已透析的Qβ溶液与20mM HEPES pH 7.2和5倍摩尔过量的具有第二附着位点(SEQ IDNO：30：CGGSDKPVAHVVANHQ)的mTNF-α(9-20)肽混合，并在16℃温育2小时进行化学交联。通过4℃下在PBS中进行两次2小时的透析除去未偶合的肽。当沉淀时，使用过量较少的SMPH和/或肽。在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离偶合产物并用考马斯染色以鉴定mTNF-α肽与Qβ衣壳的交联。
B.用偶合到Qβ衣壳蛋白上的mTNF-α(9-20)肽免疫小鼠
用偶合到mTNF-α(9-20)肽上的Qβ衣壳蛋白免疫8只Balb/c系雌性小鼠。在PBS中将25μg总蛋白稀释成200μl，在0、14和21天皮下注射(在两个腹侧各100μl)。4只小鼠接受没有添加任何佐剂的疫苗，而另4只接受含有明矾的疫苗。小鼠在0和35天眶后取血，用小鼠TNFα蛋白-特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
用浓度为1μg/ml的小鼠TNFα蛋白包被ELISA平板。封闭该平板，然后与系列稀释的第35天的小鼠血清混合液温育。用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。用导致在450nm处半数最大光密度的稀释度的平均值计算小鼠血清的抗体效价。抗-小鼠TNFα蛋白效价的测定表明诱导了识别TNFα蛋白的抗体。
D.中和抗体的检测
为了测定在小鼠中产生的抗体是否有中和活性，建立了对小鼠或人TNFα蛋白和它们的同源受体TNFRI的体外结合测定。因此，用10μg/ml的小鼠或人TNFα蛋白包被ELISA平板，分别与重组小鼠或人TNFRI-hFc融合蛋白的系列稀释液温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测结合的蛋白。然后测定用偶合到Qβ衣壳上的mTNF-α(9-20)免疫的小鼠的血清抑制小鼠或人TNFα蛋白与它们各自受体结合的能力。因此，用10μg/ml的小鼠或人TNFα蛋白包被ELISA平板，分别与第35天的小鼠血清混合液的系列稀释液和0.35nM的小鼠或人受体融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体与固定的TNFα蛋白的结合和血清对它的抑制作用。
实施例6
在胶原诱导的关节炎模型中Qβ-mTNFα(4-23)的效力
在鼠的胶原诱导的关节炎(CIA)模型中测定Qβ-mTNFα(4-23)免疫的效力。该模型反映人类风湿性关节炎免疫学和组织学的大多数方面，因此常规地可以用于测定抗炎药的效力。用50μg的Qβ-mTNFα(4-23)(n＝15)或单独用50μgQβ(n＝15)对雄性DBA/1小鼠皮下免疫三次(第0、14和28天)，然后用与弗氏完全佐剂混合的200μg牛II型胶原皮内注射两次(第34和55天)。在第二次胶原/CFA注射后，定期检查小鼠，根据观测到的变红和肿胀程度给予每一肢在0到3之间的临床得分。在第二次胶原/CFA注射三周后，在用Qβ-mTNFα(4-23)免疫的组中每肢的平均临床得分为0.04，而单用Qβ免疫的组则为0.67。此外接受Qβ-mTNFα(4-23)免疫的80％的小鼠在整个实验期间未出现症状，而接受Qβ的小鼠则只有33％未出现症状。我们断定，在CIA模型中用Qβ-mTNFα(4-23)免疫可以保护小鼠免于出现关节炎的临床征兆。
实施例7
A.mRANKL(155-174)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取3ml在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的3.06mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与25.2μl SMPH溶液(65mM，在DMSO中)在室温下反应60分钟。反应溶液4℃下在更换的两份31 20mM HEPES pH 7.2中透析，分别4小时和14小时。将30μl衍生化和已透析的Qβ溶液与167.8μl20mM HEPES pH 7.2和2.2μl具有第二附着位点(SEQ ID NO：157：CGGQRGKPEAQPFAHLTINAASI)的mRANKL(155-174)肽(23.6mg/ml，在DMSO中)混合，并在16℃温育2小时进行化学交联。通过4℃下在PBS中进行两次2小时的透析除去未偶合的肽。在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析偶合产物。附图5显示的是考马斯染色的凝胶。可以看到分子量比Qβ衣壳单体增加的几个带，这清楚地表明，mRANKL(155-174)肽成功地交联到了Qβ衣壳上。
B.用偶合到Qβ衣壳蛋白上的mRANKL(155-174)肽免疫小鼠
用偶合到mRANKL(155-174)肽上的Qβ衣壳蛋白免疫8只Balb/c系雌性小鼠。在PBS中将25μg总蛋白稀释成200μl，在第0、14和21天皮下注射(在两个腹侧各100μl)。4只小鼠接受没有添加任何佐剂的疫苗，而另4只接受含有明矾的疫苗。小鼠在0和35天眶后取血，用小鼠和人RANKL-特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
用浓度为1μg/ml的小鼠RANKL或人RANKL蛋白包被ELISA平板。封闭该平板，然后与系列稀释的第35天的小鼠血清混合液温育。用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。用导致在450nm处半数最大光密度的稀释度的平均值计算小鼠血清的抗体效价。对于无佐剂免疫的小鼠，抗-小鼠RANKL效价是8600，而对于含明矶进行免疫的小鼠则为54000。相同血清的抗-人RANKL效价的测定产生了惊人的相似值，平均分别为11200和55800。这些数据表明，用偶合到Qβ上的mRANKL(155-175)肽进行免疫得到了程度相当地识别小鼠和人RANKL蛋白的抗体。
D.中和抗体的检测
为了测定在小鼠中产生的抗体是否有中和活性，建立了对小鼠和人RANKL和它们的同源受体小鼠RANK和人RANK的体外结合测定。因此，用10μg/ml的小鼠或人RANKL蛋白包被ELISA平板，分别与重组小鼠RANK-hFc融合蛋白或重组人RANK-hFc融合蛋白的系列稀释液温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测结合的蛋白。发现两种RANKL-hFc融合蛋白都以高亲和力(0.1-0.5nM)与它们各自的配体结合。然后测定用偶合到Qβ衣壳上的mRANKL(155-174)免疫的小鼠的血清抑制小鼠和人RANKL蛋白与它们各自受体结合的能力。因此，用10μg/ml的小鼠或人RANKL蛋白包被ELISA平板，分别与第35天的小鼠血清混合液的系列稀释液和0.35nM的小鼠或人RANK-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体与固定的RANKL蛋白的结合。附图6A表明，血清混合液特异性抑制了小鼠RANKL蛋白和其受体的结合。此外，如附图6B所示，相同的血清混合液也以相似的效力抑制了人RANKL蛋白和它同源受体的结合。这些数据表明，用偶合到Qβ衣壳上的mRANKL(155-174)肽免疫，可以得到能中和小鼠和人RANKL蛋白与它们的同源受体相互作用的抗体。
实施例8
A.mRANKL(162-170)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的3.06mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与10倍摩尔过量的SMPH溶液(SMPH母液，溶解在DMSO中)在室温下反应60分钟。反应溶液4℃下在更换的两份3120mM HEPESpH 7.2中透析，分别4小时和14小时。将衍生化和已透析的Qβ溶液与20mM HEPES pH 7.2和5倍摩尔过量的具有第二附着位点(SEQ IDNO：125CGGQPFAHLTIN)的mRANKL(162-170)肽混合，并在16℃温育2小时进行化学交联。通过4℃下在PBS中进行两次2小时的透析除去未偶合的肽。当沉淀时，使用过量较少的SMPH和/或肽。在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离偶合产物并用考马斯染色以鉴定mRANKL肽与Qβ衣壳的交联。
B.用偶合到Qβ衣壳蛋白上的mRANKL(162-170)肽免疫小鼠
用偶合到mRANKL(162-170)肽上的Qβ衣壳蛋白免疫8只Balb/c系雌性小鼠。在PBS中将25μg总蛋白稀释成200μl，在第0、14和21天皮下注射(在两个腹侧各100μl)。4只小鼠接受没有添加任何佐剂的疫苗，而另4只接受含有明矾的疫苗。小鼠在0和35天眶后取血，用小鼠RANKL特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
用浓度为1μg/ml的小鼠RANKL蛋白包被ELISA平板。封闭该平板，然后与系列稀释的第35天的小鼠血清混合液温育。用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。用导致在450nm处半数最大光密度的稀释度的平均值计算小鼠血清的抗体效价。抗-小鼠RANKL效价的测定表明诱导了识别RANKL蛋白的抗体。
D.中和抗体的检测
为了测定在小鼠中产生的抗体是否有中和活性，建立了对小鼠或人RANKL蛋白和它各自的同源受体RANK-hFc的体外结合测定。因此，用10μg/ml的小鼠或人RANKL蛋白包被ELISA平板，分别与重组小鼠或人RANK-hFc融合蛋白的系列稀释液温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测结合的蛋白。然后测定用偶合到Qβ衣壳上的mRANKL(162-170)免疫的小鼠的血清抑制小鼠或人RANKL蛋白与它们各自受体结合的能力。因此，用10μg/ml的小鼠或人RANKL蛋白包被ELISA平板，分别与第35天的小鼠血清混合液的系列稀释液和0.35nM的小鼠或人受体融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体与固定的RANKL蛋白的结合和血清对它的抑制作用。
实施例9
A.mRANKL(160-171)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的3.06mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与10倍摩尔过量的SMPH溶液(SMPH母液，溶解在DMSO中)在室温下反应60分钟。反应溶液4℃下在更换的两份3120mM HEPESpH 7.2中透析，分别4小时和14小时。将衍生化和已透析的Qβ溶液与20mM HEPES pH 7.2和5倍摩尔过量的具有第二附着位点(SEQ IDNO：126 CGGEAQPFAHLTINA)的mRANKL(160-171)肽混合，并在16℃温育2小时进行化学交联。通过4℃下在PBS中进行两次2小时的透析除去未偶合的肽。当沉淀时，使用过量较少的SMPH和/或肽。在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离偶合产物并用考马斯染色以鉴定mRANKL肽与Qβ衣壳的交联。
B.用偶合到Qβ衣壳蛋白上的mRANKL(160-171)肽免疫小鼠
用偶合到mRANKL(160-171)肽上的Qβ衣壳蛋白免疫8只Balb/c系雌性小鼠。在PBS中将25μg总蛋白稀释成200μl，在第0、14和21天皮下注射(在两个腹侧各100μl)。4只小鼠接受没有添加任何佐剂的疫苗，而另4只接受含有明矾的疫苗。小鼠在0和35天眶后取血，用小鼠RANKL特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
用浓度为1μg/ml的小鼠RANKL蛋白包被ELISA平板。封闭该平板，然后与系列稀释的第35天的小鼠血清混合液温育。用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。用导致在450nm处半数最大光密度的稀释度的平均值计算小鼠血清的抗体效价。抗-小鼠RANKL效价的测定表明诱导了识别RANKL蛋白的抗体。
D.中和抗体的检测
为了测定在小鼠中产生的抗体是否有中和活性，建立了对小鼠或人RANKL和它们的同源受体RANK-hFc的体外结合测定。因此，用10μg/ml的小鼠或人RANKL蛋白包被ELISA平板，分别与重组小鼠或人RANK-hFc融合蛋白的系列稀释液温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测结合的蛋白。然后测定用偶合到Qβ衣壳上的mRANKL(160-171)免疫的小鼠的血清抑制小鼠或人RANKL蛋白与它们各自受体结合的能力。因此，用10μg/ml的小鼠或人RANKL蛋白包被ELISA平板，分别与第35天的小鼠血清混合液的系列稀释液和0.35nM的小鼠或人受体融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体与固定的RANKL蛋白的结合和血清对它的抑制作用。
实施例10
A.mRANKL(161-170)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的2.8mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与20倍摩尔过量的SMPH溶液(SMPH母液，溶解在DMSO中)在室温下反应35分钟。反应溶液4℃下在更换的两份5120mM HEPES，pH 7.4中透析，共4小时。将衍生化和已透析的Qβ溶液与20mMHEPES pH 7.4和5倍摩尔过量的具有第二附着位点(CGGAQPFAHLTIN，SEQ ID NO：189)的mRANKL(161-170)肽混合，并在15℃温育2小时进行化学交联。4℃下在5120mM HEPES pH 7.4中透析过夜，并且4℃下在31相同的缓冲液中再透析2小时来除去未偶合的肽。在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离偶合产物并用考马斯染色以鉴定mRANKL(161-170)肽与Qβ衣壳的交联。可以看到分子量比Qβ衣壳单体增加的几个带，这清楚地表明，mRANKL(161-170)肽成功地交联到了Qβ衣壳上。
B.用偶合到Qβ衣壳蛋白上的mRANKL(161-170)肽免疫小鼠
用偶合到mRANKL(161-170)肽上的Qβ衣壳蛋白免疫4只C57B1/6系雌性小鼠。在PBS中将50μg总蛋白稀释成200μl，在第0、14和28天皮下注射(在两个腹侧各100μl)。小鼠在第28天眶后取血，用小鼠RANKL蛋白特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
用浓度为1μg/ml的小鼠RANKL蛋白包被ELISA平板。封闭该平板，然后与系列稀释的第28天的小鼠血清温育。用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。用导致在450nm处半数最大光密度的稀释度的平均值计算小鼠血清的抗体效价。平均抗-小鼠RANKL效价为19500，这表明用偶合到Qβ上的mRANKL(161-170)肽免疫得到了可以识别全长mRANKL蛋白的抗体。
D.中和抗体的检测
测定用偶合到Qβ衣壳上的mRANKL(161-170)免疫的小鼠的血清抑制小鼠或人RANKL蛋白与它们各自受体结合的能力。因此，用10μg/ml的小鼠或人RANKL蛋白包被ELISA平板，分别与第35天的小鼠血清混合液的系列稀释液和0.35nM的小鼠或人mRANKL-hFc受体融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体与固定的RANKL蛋白的结合和血清对它的抑制作用。
实施例11
A.mTNFα(10-19)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的2.8mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与20倍摩尔过量的SMPH溶液(SMPH母液，溶解在DMSO中)在室温下反应35分钟。反应溶液4℃下在更换的两份3120mM HEPES，pH 7.4中透析，共6小时。将衍生化和已透析的Qβ溶液与20mMHEPES pH 7.4和5倍摩尔过量的具有第二附着位点(SEQ ID NO：192，CGGSKPVAHVVAN)的mTNFα(10-19)肽混合，并在15℃温育2小时进行化学交联。通过4℃下在20mM HEPES pH 7.4中进行两次2小时的透析除去未偶合的肽。在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离偶合产物并用考马斯染色以鉴定mTNFα肽与Qβ衣壳的交联。可以看到分子量比Qβ衣壳单体增加的几个带，这清楚地表明，mTNFα(10-19)肽成功地交联到了Qβ衣壳上。
B.用偶合到Qβ衣壳蛋白上的mTNFα(10-19)肽免疫小鼠
用偶合到mTNFα(10-19)肽上的Qβ衣壳蛋白免疫4只C57B1/6系雌性小鼠。在PBS中将50μg总蛋白稀释成200μl，在第0、14和28天皮下注射(在两个腹侧各100μl)。小鼠在第28天眶后取血，用小鼠或人TNFα蛋白特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
用浓度为1μg/ml的小鼠或人TNFα蛋白包被ELISA平板。封闭该平板，然后与系列稀释的第28天的小鼠血清温育。用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。用导致在450nm处半数最大光密度的稀释度的平均值计算小鼠血清的抗体效价。平均抗-小鼠TNFα效价是24500，而平均抗-人TNFα效价为25000。这些数据表明，用偶合到Qβ上的mTNF-α(10-19)肽进行免疫得到了程度相当地识别小鼠和人TNFα蛋白的抗体。
D.中和抗体的检测
测定用偶合到Qβ衣壳上的mTNF-α(10-19)免疫的小鼠的血清抑制小鼠TNFα蛋白与其受体结合的能力。因此，用10μg/ml的小鼠TNFα蛋白包被ELISA平板，与第35天的小鼠血清混合液的系列稀释液和0.35nM的重组小鼠TNFRI-hFc融合蛋白共温育。用辣根过氧化物酶偶联的抗-hFc抗体检测受体与固定的TNFα蛋白的结合和血清对它的抑制作用。
实施例12
A.鼠(m)CD40L(2-23)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取2.78ml在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的2mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与158μl SMPH溶液(50mM，在DMSO中)在室温下反应30分钟。反应溶液4℃下在更换的两份31磷酸缓冲盐水，pH 7.2中透析，分别2小时和14小时。将2.78ml衍生化和已透析的Qβ溶液与925μl磷酸缓冲盐水，pH 7.2和794μl具有第二附着位点(SEQ IDNO：151，CGGQRGDEDPQIAAHVVSEANSN)的mCD40L(2-23)肽(23.5mg/ml，在DMSO中)混合，并在15℃温育2小时进行化学交联。通过4℃下在更换两次的31磷酸缓冲盐水，pH 7.2中进行两次2小时和1次14小时的透析除去未偶合的肽。在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析偶合产物。可以看到分子量比Qβ衣壳单体增加的几个带，这清楚地表明，mCD40L(2-23)肽成功地交联到了Qβ衣壳上。
B.用偶合到Qβ衣壳蛋白上的CD40L(2-23)肽免疫小鼠
用偶合到mCD40L(2-23)肽上的Qβ衣壳蛋白免疫4只C57BL/6系雌性小鼠。在PB S中将50μg总蛋白稀释成200μl，在第0、14和28天皮下注射(在两个腹侧各100μl)。小鼠在第0和42天眶后取血，用小鼠CD40L特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
用浓度为1μg/ml的mCD40L蛋白包被ELISA平板。封闭该平板，然后与系列稀释的第42天的小鼠血清温育。用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。用导致在450nm处半数最大光密度的稀释度的平均值计算小鼠血清的抗体效价。第42天的平均抗-mCD40L效价是1287。
D.抗体对可溶mCD40L蛋白的识别
为了测定在小鼠中产生的抗体能否结合可溶的重组mCD40L，建立了对mCD40L的体外抑制测定。1∶1000稀释的用mCD40L(2-23)肽免疫的小鼠的混合血清与0nM到150nM不等浓度的可溶的重组mCD40L温育。将该混合液转移到用0.5μg/ml mCD40L蛋白包被的ELISA平板上，用酶标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合的抗体。在这些条件下，抗体与60nM可溶的mCD40L预温育足以使抗体随后与结合在平板上的mCD40L的结合降低两倍，用在450nm处半数最大光密度值测定得到证明。这表明来自mCD40L(2-23)肽免疫的小鼠的抗体与可溶的mCD40L和结合在平板上的mCD40L都可以结合。
E.测定中和抗体
来自mCD40L(2-23)免疫的小鼠的抗体用于中和在体外由小鼠(m)CD40L/CD40结合诱导的B细胞的增殖。B细胞来自小鼠淋巴样器官，包括脾和淋巴结的细胞悬液，并可以通过磁珠分离或使用流式细胞仪通过细胞分选来进一步纯化。在体外采用标准方法，使用一种来源的mCD40L和存活因子例如鼠的IL-4结合B细胞mCD40，来诱导B细胞增殖。mCD40L是由下列来源提供的，例如，可溶的重组mCD40L(Craxton等人，(2003)Blood 101，4464-4471)、重组表达的膜-结合mCD40L(Hasbold J.等人，(1998)Eur.J.Immunol.28，1040-1051)、活化的鼠T细胞、或在纯化的活化鼠T细胞膜上的mCD40L(Hodgkin P.等人，(1996)J.Exp.Med.184，277-281)。可以用标准方法来测定B细胞的增殖，包括基于流式细胞术的荧光染料稀释测定(Lyons A.B.和Parish C.R.(1994)J.Immunol.Methods 171，131-137)，或通过掺入放射性或化学修饰的DNA碱基类似物，例如[3H]-胸苷或5-溴-2′-脱氧尿苷。通过与单独用Qβ免疫的小鼠的抗体或与未免疫小鼠的抗体相比较，用mCD40L(2-23)免疫的小鼠的抗体的存在抑制了B细胞的增殖，从而证明了抗mCD40L的中和抗体的存在。以全血清或通过蛋白G亲和色谱法从血清中分离出来的纯化IgG部分的形式，将抗体加入到如上所述的B细胞增殖培养物中。
实施例13
鼠(m)BAFF(36-55)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取3ml在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的2mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与171μlSMPH溶液(50mM，在DMSO中)在室温下反应30分钟。反应溶液4℃下在更换的三份31磷酸缓冲盐水，pH 7.2中透析，分别为2次2小时和1次14小时。将3ml衍生化和已透析的Qβ溶液与1ml磷酸缓冲盐水，pH 7.2和214.5μl具有第二附着位点(SEQ ID NO：138，CGGNLRNIIQDSLQLIADSDTPT)的mBAFF(36-55)肽(24.4mg/ml，在DMSO中)混合，并在15℃温育2小时进行化学交联。通过4℃下在更换的三份31磷酸缓冲盐水，pH 7.2中透析2次2小时和1次14小时除去未偶合的肽。在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析偶合产物。可以看到分子量比Qβ衣壳单体增加的几个带，这清楚地表明，mBAFF(36-55)肽成功地交联到了Qβ衣壳上。
实施例14
鼠(m)LTβ(34-53)肽与Qβ衣壳蛋白的偶合
取3ml在20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2中的2mg/ml Qβ衣壳蛋白溶液与85.8μl SMPH溶液(50mM，在DMSO中)在室温下反应30分钟。反应溶液4℃下在更换的三份31磷酸缓冲盐水，pH 7.2中透析，每次两小时。将3ml衍生化和已透析的Qβ溶液与993μl 20mMHEPES，pH 7.2和429μl具有第二附着位点(SEQ ID NO：143，CGGETDLNPELPAAHLIGAWMSG)的mLTβ(34-53)肽(23.4mg/ml，在DMSO中)混合，并在15℃温育2小时进行化学交联。通过4℃下在更换的三份3120mM HEPES，pH 7.2中透析2次2小时和1次14小时除去未偶合的肽。在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析偶合产物。可以看到分子量比Qβ衣壳单体增加的几个带，这清楚地表明，mLTβ(34-53)肽成功地交联到了Qβ衣壳上。
实施例15
用mTNF(4-23)Qβ免疫的人类受试者的血清可以抑制人TNFα和其受体hTNF-RI的结合
用100μg mTNF(4-23)Qβ对人类志愿者皮下免疫。28天后进行相同剂量的第二次免疫。通过最后免疫两周后抽取血清进行ELISA来分析抗-TNFα-特异抗体的水平。用hTNFα(Peprotech)(1μg/ml)包被ELISA平板(Maxisorp，Nunc)过夜，并用封闭剂Superblock(Pierce)封闭。在洗涤后，平板与所要研究的血清的8倍稀释液温育2小时。在另一个洗涤步骤后，加入第二抗-人IgG辣根过氧化物酶偶联物(Jackson ImmunoResearch)一小时。通过与邻苯二胺(OPD，Fluka)反应4.5分钟来检测结合的酶，并加入硫酸来终止该反应。在ELISA仪上读出492nm处的光密度。该ELISA表明了用小鼠TNF(4-23)Qβ诱导的可结合人TNFα的抗体对人类受试者的接种。利用在实施例1中所述的测定表明，人TNFα和其受体hTNF-RI的结合会被用mTNF(4-23)Qβ免疫的受试者的血清抑制，这进一步支持了对mTNF(4-23)接种而诱导的抗体与人TNFα蛋白的交叉反应性。
实施例17
用mTNF(4-23)Qβ治疗牛皮癣
在第0和28天用100μg或300μg mTNF(4-23)Qβ对患有中度到重度斑块状牛皮癣的患者免疫。在第84天给予另一次的加强免疫。用牛皮癣面积和严重性指数(PASI)和医师整体评价(PGA)标准来评价临床效力。在基线时以及每隔两周获得临床得分。由于抗体效价的预期变异性，接种的临床效力的评价将通过抗体应答的程度来区别应答的大小(PASI得分或PGA得分)。用抗体效价作为共变量或根据患者的抗体应答对他们进行分级来完成评价。结果表明，用mTNF(4-23)Qβ接种降低了斑块状牛皮癣患者的临床得分。
                                 序列表
<110>赛托斯生物技术公司
     马丁·F·巴赫曼
     帕特里克·毛雷尔
     贡特尔·施波恩
<120>非人类TNF-肽的载体偶联物的医药用途
<130>P1040PC00
<150>US 60/575,827
<151>2004-06-02
<160>198
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pfam00229的共有序列的前25个氨基酸残基
<400>1
Lys Pro Ala Ala His Leu Val Gly Lys Pro Leu Gly Gln Gly Pro Leu
1               5                   10                  15
Ser Trp Glu Asn Asp Gly Gly Thr Ala
            20                  25
<210>2
<211>156
<212>PRT
<213>小鼠
<400>2
Leu Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1               5                   10                  15
Val Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg
            20                  25                  30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu
        35                  40                  45
Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val
                85                  90                  95
Lys Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro
            100                 105                 110
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly
        115                 120                 125
Asp Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala
    130                 135                 140
Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu
145                 150                 155
<210>3
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠RANKL的氨基酸155-174
<400>3
Gln Arg Gly Lys Pro Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn
1               5                   10                  15
Ala Ala Ser Ile
            20
<210>4
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>4
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>5
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>5
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1               5                   10                  15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu
                165                 170                 175
Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala
            180                 185                 190
Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr
    210                 215                 220
Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr
225                 230                 235                 240
Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu
                245                 250                 255
Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu
            260                 265                 270
Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His
        275                 280                 285
Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly
    290                 295                 300
Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile
305                 310                 315                 320
Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala
                325
<210>6
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体R17
<400>6
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>7
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体fr
<400>7
Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>8
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体GA
<400>8
Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
        35                  40                  45
Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser
65                  70                  75                  80
Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe
            100                 105                 110
Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe
        115                 120                 125
Tyr Ala
    130
<210>9
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>9
Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>10
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>10
Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val
    50                  55                  60
Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala
            100                 105                 110
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn
        115                 120                 125
Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp
    130                 135                 140
Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly
                165                 170                 175
Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg
            180                 185                 190
Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu
            260                 265                 270
Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser
                325
<210>11
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体MS2
<400>11
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu
            100                 105                 110
Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>12
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体M11
<400>12
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>13
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体MX1
<400>13
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>14
<211>330
<212>PRT
<213>噬菌体NL95
<400>14
Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly
1               5                   10                  15
Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly
                165                 170                 175
Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys
            180                 185                 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp
                245                 250                 255
Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr
            260                 265                 270
Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu
                325                 330
<210>15
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体f2
<400>15
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>16
<211>128
<212>PRT
<213>噬菌体PP7
<400>16
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1               5                   10                  15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
            20                  25                  30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
        35                  40                  45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
    50                  55                  60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala
            100                 105                 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
        115                 120                 125
<210>17
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qbeta 240突变体
<400>17
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>18
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 243突变体
<400>18
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>19
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 250突变体
<400>19
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>20
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 251突变体
<400>20
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>21
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 259突变体
<400>21
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>22
<211>316
<212>PRT
<213>小鼠
<400>22
Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro
            20                  25                  30
Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser
        35                  40                  45
Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser
    50                  55                  60
Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu
                85                  90                  95
Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys
        115                 120                 125
Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala
    130                 135                 140
Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu
145                 150                 155                 160
Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser
                165                 170                 175
Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp
            180                 185                 190
Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn
        195                 200                 205
Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His
    210                 215                 220
Glu Thr Ser Gly Ser Val  ProThr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr
225                 230                 235                 240
Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys
                245                 250                 255
Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr
            260                 265                 270
Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile
        275                 280                 285
Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala
    290                 295                 300
Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
305                 310                 315
<210>23
<211>170
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合多肽：His-标签与成熟鼠TNFalpha
<400>23
Met Gly Cys Gly Gly Gly His His His His His His Gly Ser Leu Arg
1               5                   10                  15
Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala
            20                  25                  30
Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala Asn
        35                  40                  45
Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val Val
    50                  55                  60
Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu phe Lys Gly
65                  70                  75                  80
Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe
                85                  90                  95
Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys Ser
            100                 105                 110
Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr
        115                 120                 125
Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln
    130                 135                 140
Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser
145                 150                 155                 160
Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu
                165                 170
<210>24
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C末端连接体
<400>24
Gly Gly Cys Gly
1
<210>25
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>25
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>26
<211>152
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>26
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val
                85                  90                  95
Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr
            100                 105                 110
Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
        115                 120                 125
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
    130                 135                 140
Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
145                 150
<210>27
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>连接体
<400>27
Gly Gly Lys Gly Gly
1               5
<210>28
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>28
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>29
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>linker peptide CGG fused with AA 11-18 from mouse TNFalpha
<400>29
Cys Gly Gly Lys Pro Val Ala His Val Val Ala
1               5                   10
<210>30
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>与小鼠TNFalpha的氨基酸9-20融合的连接肽
<400>30
Cys Cys Gly Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn His Gln
1               5                   10                  15
<210>31
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>31
Val Ala His Val Val Ala
1               5
<210>32
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>32
Lys Pro Val Ala His Val Val Ala
1               5
<210>33
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>33
Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
1               5
<210>34
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>34
Ala Ala His Leu Val Gly
1               5
<210>35
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>35
Ala Ala His Leu Ile Gly
1               5
<210>36
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>36
Lys Pro Ala Ala His Leu Val Gly
1               5
<210>37
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>37
Lys Pro Ala Ala His Leu Ile Gly
1               5
<210>38
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>38
Leu Lys Pro Ala Ala His Leu Val Gly
1               5
<210>39
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>39
Leu Lys Pro Ala Ala His Leu Ile Gly
1               5
<210>40
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>40
Ala Ala His Leu Ile Gly
1               5
<210>41
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>41
Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Ala
1               5
<210>42
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>42
Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Ile
1               5
<210>43
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>43
Ala Ala His Val Ile Ser
1               5
<210>44
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>44
Ala Ala His Val Val Ser
1               5
<210>45
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>45
Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
1               5
<210>46
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>46
Arg Ile Ala Ala His Val Ile Ser
1               5
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>47
Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
1               5                   10
<210>48
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>48
Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
1               5                   10
<210>49
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>49
Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser
1               5                   10
<210>50
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>50
Glu Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
1               5                   10
<210>51
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>51
Val Ala His Leu Thr Gly
1               5
<210>52
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>52
Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly
1               5
<210>53
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>53
Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly
1               5
<210>54
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>54
Arg Arg Ala Ala His Leu Thr Gly
1               5
<210>55
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>55
Lys Lys Ala Ala His Leu Thr Gly
1               5
<210>56
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>56
Ala Glu Leu Gln Leu Asn
1               5
<210>57
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>57
Leu Gln Leu Asn Leu Thr
1               5
<210>58
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>58
Leu Gln Leu Asn His Thr
1               5
<210>59
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>59
Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn
1               5
<210>60
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>60
Thr Ala Glu Leu Gln Leu Asn
1               5
<210>61
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>61
Thr Ala Glu Leu Gln Leu Asn Leu
1               5
<210>62
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>62
Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn Leu
1               5
<210>63
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>63
Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His
1               5
<210>64
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>64
Ala Ala His Ile Thr
1               5
<210>65
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>65
Ala Ala His Leu Thr
1               5
<210>66
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>66
Val Ala Ala His Ile Thr Gly
1               5
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>67
Pro Gln Lys Val Ala Ala His Ile Thr Gly
1               5                   10
<210>68
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>68
Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
1               5                   10
<210>69
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>69
Phe Ala His Leu Thr Ile
1               5
<210>70
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>70
Ser Ala His Leu Thr Val
1               5
<210>71
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>71
Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile
1               5                   10
<210>72
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>72
Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn
1               5
<210>73
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>73
Lys Pro Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala
1               5                   10
<210>74
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>74
Lys Leu Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala
1               5                   10
<210>75
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>75
Lys Arg Ser Lys Leu Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn
1               5                   10                  15
Ala Thr Asp Ile
            20
<210>76
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>76
Gln Arg Gly Lys Pro Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn
1               5                   10                  15
Ala Ala Ser Ile
            20
<210>77
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>77
Ala Ala His Tyr Glu Val
1               5
<210>78
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>78
Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val
1               5
<210>79
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>79
Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro
1               5
<210>80
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>80
Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro
1               5                   10
<210>81
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>81
Pro Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro
1               5                   10
<210>82
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>82
Ser Val Leu His Leu Val
1               5
<210>83
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>83
His Ser Val Leu His Leu Val Pro
1               5
<210>84
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>84
Gln Ser Val Leu His Leu Val Pro
1               5
<210>85
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>85
Lys Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro
1               5                   10
<210>86
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>86
Lys Lys Lys His Ser Val Leu His Leu Val Pro
1               5                   10
<210>87
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>87
Lys Lys Lys Gln Ser Val Leu His Leu Val Pro
1               5                   10
<210>88
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>88
Leu Gln Leu Ile Ala Asp
1               5
<210>89
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>89
Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser
1               5                   10
<210>90
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>90
Gln Ala Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser
1               5                   10
<210>91
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>91
Ala Ala His Leu Thr Gly
1               5
<210>92
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>92
Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly
1               5
<210>93
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>93
Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn
1               5
<210>94
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>94
Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser
1               5                   10
<210>95
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>95
Ala Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ala
1               5                   10
<210>96
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>96
Arg Ala His Leu Thr Val
1               5
<210>97
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>97
Arg Ala His Leu Thr Ile
1               5
<210>98
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>98
Lys Ala His Leu Thr Ile
1               5
<210>99
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>99
Thr Gln His Phe Lys Asn
1               5
<210>100
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>100
Ala Val Val His Leu Gln
1               5
<210>101
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>101
Val Val His Leu Gln Gly
1               5
<210>102
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>102
Gln Pro Ala Val Val His Leu Gln Gly
1               5
<210>103
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>103
Pro Ala Val Val His Leu Gln Gly Gln Gly
1               5                   10
<210>104
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>104
Thr Arg Glu Asn Gln Pro Ala Val Val His Leu Gln
1               5                   10
<210>105
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>105
Glu Asn Gln Pro Ala Val Val His Leu Gln Gly Gln Gly Ser
1               5                   10
<210>106
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>106
Gln Pro Ala Val Val His Leu Gln Gly Gln Gly Ser Ala Ile
1               5                   10
<210>107
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>107
Cys Met Val Lys Phe
1               5
<210>108
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>108
Cys Met Ala Lys Phe
1               5
<210>109
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>109
Glu Ser Cys Met Val Lys Phe Glu
1               5
<210>110
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>110
Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly
1               5
<210>111
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>111
Trp Ala Tyr Leu Gln Val
1               5
<210>112
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>112
Ala Ala Tyr Met Arg Val
1               5
<210>113
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>113
Lys Gly Ala Ala Ala Tyr Met Arg Val
1               5
<210>114
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>114
Lys Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val
1               5
<210>115
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>115
Phe Ala Gln Leu Val Ala
1               5
<210>116
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>116
Phe Ala Lys Leu Leu Ala
1               5
<210>117
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>117
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
1               5
<210>118
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>118
Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser
1               5
<210>119
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>119
Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
1               5
<210>120
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>120
Phe Ile Leu Thr Ser Gln
1               5
<210>121
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>121
Phe Ile Gly Thr Ser Lys
1               5
<210>122
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>122
Phe Ile Leu Pro Leu Gln
1               5
<210>123
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>123
Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys
1               5
<210>124
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>124
Arg Leu Phe Ile Gly Thr Ser Lys Lys
1               5
<210>125
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>125
Cys Gly Gly Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn
1               5                   10
<210>126
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>126
Cys Gly Gly Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala
1               5                   10                  15
<210>127
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>127
Cys Gly Gly Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1               5                   10                  15
Val Ala Asn His Gln Val Glu
            20
<210>128
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>128
Cys Gly Gly Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1               5                   10                  15
Val Ala Asn Pro Glu Ala Glu
            20
<210>129
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>129
Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
1               5                   10                  15
His Gln Val Glu
            20
<210>130
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>130
Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
1               5                   10                  15
His Gln Ala Glu
            20
<210>131
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>131
Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asx Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Gln Ala Glu
            20
<210>132
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>132
Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Glu Ala Glu
            20
<210>133
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>133
His Leu Thr His Gly Ile Leu Lys Pro Ala Ala His Leu Val Gly Tyr
1               5                   10                  15
Pro Ser Lys Gln
            20
<210>134
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>134
Cys Gly Gly Val Ala His Val Val Ala
1               5
<210>135
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>135
Cys Gly Gly Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
1               5                   10
<210>136
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>136
Cys Gly Gly Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1               5                   10                  15
Val Ala Asn His Gln Ala Glu
            20
<210>137
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>137
Cys Gly Gly Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asx Lys Pro Val Ala His Val
1               5                   10                  15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu
            20
<210>138
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>138
Cys Gly Gly Asn Leu Arg Asn Ile Ile Gln Asp Ser Leu Gln Leu Ile
1               5                   10                  15
Ala Asp Ser Asp Thr Pro Thr
            20
<210>139
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>139
His Leu Thr His Gly Leu Leu Lys Pro Ala Ala His Leu Val Gly Tyr
1               5                   10                  15
Pro Ser Lys Gln
            20
<210>140
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>140
Cys Gly Gly His Leu Thr His Gly Ile Leu Lys Pro Ala Ala His Leu
1               5                   10                  15
Val Gly Tyr Pro Ser Lys Gln
            20
<210>141
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>141
Cys Gly Gly His Leu Thr His Gly Leu Leu Lys Pro Ala Ala His Leu
1               5                   10                  15
Val Gly Tyr Pro Ser Lys Gln
            20
<210>142
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>142
Glu Thr Asp Leu Asn Pro Glu Leu Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Ala
1               5                   10                  15
Trp Met Ser Gly
            20
<210>143
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>143
Cys Gly Gly Glu Thr Asp Leu Asn Pro Glu Leu Pro Ala Ala His Leu
1               5                   10                  15
Ile Gly Ala Trp Met Ser Gly
            20
<210>144
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>144
Asp Gln Arg Ser His Gln Ala Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala
1               5                   10                  15
Asn Ala Ser Leu
            20
<210>145
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>145
Cys Gly Gly Asp Gln Arg Ser His Gln Ala Asn Pro Ala Ala His Leu
1               5                   10                  15
Thr Gly Ala Asn Ala Ser Leu
            20
<210>146
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>146
Pro Ser Glu Lys Lys Glu Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn
1               5                   10                  15
Pro His Ser Arg
            20
<210>147
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>147
Pro Ser Glu Thr Lys Lys Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn
1               5                   10                  15
Pro Arg Ser Arg
            20
<210>148
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>148
Cys Gly Gly Pro Ser Glu Lys Lys Glu Pro Arg Ser Val Ala His Leu
1               5                   10                  15
Thr Gly Asn Pro His Ser Arg
            20
<210>149
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>149
Cys Gly Gly Pro Ser Glu Thr Lys Lys Pro Arg Ser Val Ala His Leu
1               5                   10                  15
Thr Gly Asn Pro Arg Ser Arg
            20
<210>150
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>150
Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu
1               5                   10                  15
Ala Asn Ser Asn
            20
<210>151
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>151
Cys Gly Gly Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val
1               5                   10                  15
Val Ser Glu Ala Asn Ser Asn
            20
<210>152
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>152
Pro Arg Gly Gly Arg Pro Gln Lys Val Ala Ala His Ile Thr Gly Ile
1               5                   10                  15
Thr Arg Arg Ser
            20
<210>153
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>153
Pro Arg Gly Arg Arg Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Ile
1               5                   10                  15
Thr Arg Arg Ser
            20
<210>154
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>154
Cys Gly Gly Pro Arg Gly Gly Arg Pro Gln Lys Val Ala Ala His Ile
1               5                   10                  15
Thr Gly Ile Thr Arg Arg Ser
            20
<210>155
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>155
Cys Gly Gly Pro Arg Gly Arg Arg Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile
1               5                   10                  15
Thr GlyIle Thr Arg Arg Ser
           20
<210>156
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>156
Arg Arg Gly Lys Pro Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn
1               5                   10                  15
Ala Ala Asp Ile
            20
<210>157
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>157
Cys Gly Gly Gln Arg Gly Lys Pro Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu
1               5                   10                  15
Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile
            20
<210>158
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>158
Cys Gly Gly Arg Arg Gly Lys Pro Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu
1               5                   10                  15
Thr Ile Asn Ala Ala Asp Ile
            20
<210>159
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>159
Leu Lys Ser Thr Pro Ser Lys Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ser
1               5                   10                  15
Lys His Leu Asn
            20
<210>160
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>160
Cys Gly Gly Leu Lys Ser Thr Pro Ser Lys Lys Ser Trp Ala Tyr Leu
1               5                   10                  15
Gln Val Ser Lys His Leu Asn
            20
<210>161
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>161
Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys
1               5                   10                  15
Asn Gln Ala Ser
            20
<210>162
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>162
Cys Gly Gly Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu
1               5                   10                  15
Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser
            20
<210>163
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>163
Ala Val Thr Arg Cys Glu Asp Gly Gln Leu Phe Ile Ser Ser Tyr Lys
1               5                   10                  15
Asn Glu Tyr Gln
            20
<210>164
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>164
Pro Val Thr Gly Cys Glu Gly Gly Arg Leu Phe Ile Gly Thr Ser Lys
1               5                   10                  15
Asn Glu Tyr Glu
            20
<210>165
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>165
Cys Gly Gly Ala Val Thr Arg Cys Glu Asp Gly Gln Leu Phe Ile Ser
1               5                   10                  15
Ser Tyr Lys Asn Glu Tyr Gln
            20
<210>166
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>166
Cys Gly Gly Pro Val Thr Gly Cys Glu Gly Gly Arg Leu Phe Ile Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Lys Asn Glu Tyr Glu
            20
<210>167
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>167
Asn Leu Arg Asn Ile Ile Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser
1               5                   10                  15
Asp Thr Pro Thr
            20
<210>168
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>168
Cys Gly Gly Asn Leu Arg Asn Ile Ile Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile
1               5                   10                  15
Ala Asp Ser Asp Thr Pro Thr
            20
<210>169
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>169
Pro Glu Pro His Thr Ala Glu Leu Gln Leu Asn Leu Thr Val Pro Arg
1               5                   10                  15
Lys Asp Pro Thr
            20
<210>170
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>170
Pro Glu Leu His Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn Leu Thr Asp Pro Gln
1               5                   10                  15
Lys Asp Leu Thr
            20
<210>171
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>171
Cys Gly Gly Pro Glu Pro His Thr Ala Glu Leu Gln Leu Asn Leu Thr
1               5                   10                  15
Val Pro Arg Lys Asp Pro Thr
            20
<210>172
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>172
Cys Gly Gly Pro Glu Leu His Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Pro Gln Lys Asp Leu Thr
            20
<210>173
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>173
Arg Lys Ala Arg Pro Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His
1               5                   10                  15
Pro Arg Pro Gly
            20
<210>174
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>174
Arg Lys Ala Arg Pro Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His
1               5                   10                  15
Pro Gln Pro Gly
            20
<210>175
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>175
Cys Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr
1               5                   10                  15
Glu Val His Pro Arg Pro Gly
            20
<210>176
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>176
Cys Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr
1               5                   10                  15
Glu Val His Pro Gln Pro Gly
            20
<210>177
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>177
Gln Lys His Lys Lys Lys His Ser Val Leu His Leu Val Pro Val Asn
1               5                   10                  15
Ile Thr Ser
<210>178
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>178
Gln Lys His Lys Lys Lys Gln Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn
1               5                   10                  15
Ile Thr Ser
<210>179
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>179
Cys Gly Gly Gln Lys His Lys Lys Lys His Ser Val Leu His Leu Val
1               5                   10                  15
Pro Val Asn Ile Thr Ser
            20
<210>180
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>180
Cys Gly Gly Gln Lys His Lys Lys Lys Gln Ser Val Leu His Leu Val
1               5                   10                  15
Pro Ile Asn Ile Thr Ser
            20
<210>181
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>181
Pro Pro Arg Gly Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Ile Lys Lys Gln Thr
1               5                   10                  15
Pro
<210>182
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>182
Pro Ser Arg Asp Lys Pro Lys Ala His Leu Thr Ile Met Arg Gln Thr
1               5                   10                  15
Pro
<210>183
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>183
Cys Gly Gly Pro Pro Arg Gly Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Ile Lys
1               5                   10                  15
Lys Gln Thr Pro
            20
<210>184
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>184
Cys Gly Gly Pro Ser Arg Asp Lys Pro Lys Ala His Leu Thr Ile Met
1               5                   10                  15
Arg Gln Thr Pro
            20
<210>185
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>185
Thr Gly Thr Arg Glu Asn Gln Pro Ala Val Val His Leu Gln Gly Gln
1               5                   10                  15
Gly Ser Ala Ile
            20
<210>186
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>186
Cys Gly Gly Thr Gly Thr Arg Glu Asn Gln Pro Ala Val Val His Leu
1               5                   10                  15
Gln Gly Gln Gly Ser Ala Ile
            20
<210>187
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>187
Lys Pro Thr Val Ile Glu Ser Cys Met Val Lys Phe Glu Leu Ser Ser
1               5                   10                  15
Ser Lys Trp
<210>188
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>188
Cys Gly Gly Lys Pro Thr Val Ile Glu Ser Cys Met Val Lys Phe Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Ser Lys Trp
            20
<210>189
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>189
Cys Gly Gly Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn
1               5                   10
<210>190
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>190
Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn
1               5                   10
<210>191
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>191
Ser Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
1               5                   10
<210>192
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>192
Cys Gly Gly Ser Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
1               5                   10
<210>193
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>193
Asn Leu Arg Asn Ile Ile Gln Asp Ser Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser
1               5                   10                  15
Asp Thr Pro Thr
            20
<210>194
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>194
Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Glu Ala Glu
            20
<210>195
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>195
Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
1              5                   10                  15
Pro Glu Ala Glu
            20
<210>196
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>196
Gln Lys Gly Asp Gln Asp Pro Arg Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu
1               5                   10                  15
Ala Ser Ser Asn
            20
<210>197
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>197
Gln Lys Gly Asp Gln Asp Pro Arg Val Ala Ala His Val Ile Ser Glu
1               5                   10                  15
Ala Ser Ser Ser
            20
<210>198
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>198
Pro Ser Glu Lys Arg Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys
1               5                   10                  15
Pro Asn Ser Arg
            20

Claims (25)

1.修饰的病毒样颗粒在制备用于治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病的药物中的应用，该病毒样颗粒包含
(a)病毒样颗粒(VLP)，和
(b)至少一种非人类的TNF-肽，其包含与保守域pfam 00229(SEQID NO：1)的共有序列的氨基酸残基3到8同源的肽序列，优选与保守域pfam 00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基1到8同源的肽序列，更优选与保守域pfam 00229(SEQ ID NO：1)的共有序列的氨基酸残基1到11同源的肽序列，更优选与保守域pfam 00229(SEQ IDNO：1)的共有序列的氨基酸残基1到13同源的肽序列，
其中(a)和(b)互相连接，
其中优选地所述自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自：
(a)牛皮癣；
(b)类风湿性关节炎；
(c)多发性硬化症；
(d)糖尿病；
(e)骨质疏松症；
(f)强直性脊柱炎；
(g)动脉粥样硬化；
(h)自身免疫性肝炎；
(i)自身免疫性甲状腺病；
(j)骨癌痛；
(k)骨转移；
(l)炎性肠病；
(m)多发性骨髓瘤；
(n)重症肌无力；
(o)心肌炎；
(p)佩吉特病；
(q)牙周病；
(r)牙周炎；
(s)假体周骨质溶解；
(t)多肌炎；
(u)原发性胆汁性肝硬化；
(v)牛皮癣性关节炎；
(w)舍格伦综合征；
(x)斯提耳病；
(y)全身性红斑狼疮；和
(z)血管炎。
2.权利要求1的应用，其中所述TNF-肽来自于非人类的脊椎动物的多肽，该多肽选自TNFα、LTα、LTα/β、FasL、CD40L、TRAIL、RANKL、CD30L、4-1BBL、OX40L、LIGHT、GITRL和BAFF、CD27L、TWEAK、APRIL、TL1A、EDA，优选选自TNFα、LTα、LTα/β，或选自TRAIL和RANKL，或选自FasL、CD40L、CD30L和BAFF，或选自4-1BBL、OX40L和LIGHT，或选自LTα、LTα/β、Fasl、CD40L、TRAIL、CD30L、4-1BBL、OX40L、LIGHT、GITRL和BAFF。
3.权利要求1到2任一的应用，其中所述修饰的VLP形成有序的和重复的抗原阵列。
4.前述任一项权利要求的应用，其中所述VLP(a)和所述TNF-肽(b)是共价连接的。
5.前述任一项权利要求的应用，其中所述修饰的VLP的所述TNF-肽由具有长度为6到75个氨基酸残基，优选长度为6到50个氨基酸残基，更优选长度为6到40个氨基酸残基，再更优选长度为6到30个氨基酸残基，甚至更优选长度为6到25个氨基酸残基，甚至更优选长度为6到20个氨基酸残基的肽组成。
6.前述任一项权利要求的应用，其中所述修饰的VLP的所述非人类的TNF-肽与最同源的人TNF-肽在1到10个位点，更优选2到8个位点，更优选2到6个位点，甚至更优选2到4个位点，最优选3到4个位点处不同。
7.前述任一项权利要求的应用，其中所述修饰的VLP的所述非人类的TNF-肽与最同源的人TNF-肽75％到98％相同，更优选80％到97％，甚至更优选85％到95％和最优选90％到95％相同。
8.前述任一项权利要求的应用，其中所述非人类的TNF-肽是脊椎动物的TNF-肽，优选真哺乳动物亚纲的TNF-肽，甚至更优选猫、犬、牛或小鼠的TNF-肽，最优选小鼠的TNF-肽。
9.前述任一项权利要求的应用，其中所述非人类的TNF-肽包含，或优选由同源于或等同于SEQ ID NO：2的氨基酸残基13到18，优选SEQ ID NO：2的氨基酸残基11到18，更优选SEQ ID NO：2的氨基酸残基11到23，再更优选SEQ ID NO：2的氨基酸残基4到23的肽序列组成。
10.前述任一项权利要求的应用，其中所述修饰的VLP的所述TNF-肽来源于脊椎动物的多肽，优选来源于真哺乳动物亚纲的多肽，该多肽选自TNFα、LTα和LTα/β，用于制备治疗自身免疫性疾病和/或与骨有关的疾病的药物，其中优选地所述自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自：
a.)牛皮癣；
b.)类风湿性关节炎；
c.)牛皮癣性关节炎；
d.)炎性肠病；
e.)全身性红斑狼疮；
f.)强直性脊柱炎；
g.)斯提耳病；
h.)多肌炎；
i.)血管炎；
j.)糖尿病；
k.)重症肌无力；
l.)舍格伦综合征；和
m.)多发性硬化症。
11.权利要求10的应用，其中所述TNF-肽包含，或优选由SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：129的肽序列组成，更优选其中所述TNF-肽包含，优选由SEQ ID NO：129组成。
12.权利要求1到9任一项的应用，其中所述修饰的VLP的所述TNF-肽来自于：
(i)脊椎动物的LIGHT多肽，用于制备治疗自身免疫性疾病或与骨有关的疾病的药物，其中所述自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自类风湿性关节炎和糖尿病；或
(ii)脊椎动物的FasL多肽，用于制备治疗自身免疫性疾病或与骨有关的疾病的药物，其中所述自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自全身性红斑狼疮、糖尿病、自身免疫性甲状腺病、多发性硬化症和自身免疫性肝炎；或
(iii)脊椎动物的CD40L多肽，用于制备治疗自身免疫性疾病或与骨有关的疾病的药物，其中所述自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、全身性红斑狼疮、炎性肠病和舍格伦综合征；或
(iv)脊椎动物的TRAIL多肽，用于制备治疗自身免疫性疾病或与骨有关的疾病的药物，其中所述自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自类风湿性关节炎、多发性硬化症和自身免疫性甲状腺病；或
(v)脊椎动物的RANKL多肽，用于制备治疗自身免疫性疾病或与骨有关的疾病的药物，其中所述自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自牛皮癣、类风湿性关节炎、骨质疏松症、牛皮癣性关节炎、牙周炎、牙周病、假体周骨质溶解、骨转移、多发性骨髓瘤、骨癌痛、和佩吉特病。
13.权利要求12的应用，其中所述TNF-肽包含，优选由选自SEQID NO：22的氨基酸残基164到169、SEQ ID NO：22的氨基酸残基162到169、SEQ ID NO：22的氨基酸残基162到174，SEQ ID NO：22的氨基酸残基160到170，SEQ ID NO：22的氨基酸残基160到171，SEQID NO：22的氨基酸残基155到174的肽序列组成，其中进一步优选所述的TNF-肽包含，优选由SEQ ID NO：3组成。
14.权利要求1到9任一的应用，其中所述修饰的VLP的所述TNF-肽来自于：
(i)脊椎动物的CD30L多肽，用于制备治疗自身免疫性疾病或与骨有关的疾病的药物，其中所述自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺病、心肌炎、舍格伦综合征和原发性胆汁性肝硬化；或
(ii)脊椎动物的4-1BBL多肽，用于制备治疗自身免疫性疾病或与骨有关的疾病的药物，其中所述自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自类风湿性关节炎、炎性肠病和心肌炎；或
(iii)脊椎动物的OX40L多肽，用于制备治疗自身免疫性疾病或与骨有关的疾病的药物，其中所述自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自类风湿性关节炎、多发性硬化症和炎性肠病；或
(iv)脊椎动物的BAFF多肽，用于制备治疗自身免疫性疾病或与骨有关的疾病的药物，其中所述自身免疫性疾病或与骨有关的疾病选自类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮和舍格伦综合征。
15.前述任一项权利要求的应用，其中所述VLP包含，或由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成，其中优选的所述RNA噬菌体是RNA噬菌体Qβ、RNA噬菌体fr或RNA噬菌体AP205，其中进一步优选所述RNA噬菌体是RNA噬菌体Qβ。
16.权利要求15的应用，其中所述重组蛋白包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA噬菌体的外壳蛋白，其中，优选所述RNA噬菌体的外壳蛋白具有选自下列的氨基酸：
(a)SEQ ID NO：4；
(b)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的混合物；
(c)SEQ ID NO：6；
(d)SEQ ID NO：7；
(e)SEQ ID NO：8；
(f)SEQ ID NO：9；
(g)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的混合物；
(h)SEQ ID NO：11；
(i)SEQ ID NO：12；
(k)SEQ ID NO：13；
(l)SEQ ID NO：14；
(m)SEQ ID NO：15；
(n)SEQ ID NO：16；和
(o)SEQ ID NO：28。
17.权利要求1到15的应用，其中所述重组蛋白包含，或基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：RNA噬菌体的突变外壳蛋白，其中，优选所述RNA噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(k)噬菌体f2；
(l)噬菌体PP7；和
(m)噬菌体AP205。
18.权利要求17的应用，其中所述RNA噬菌体的所述突变外壳蛋白已通过下列方法修饰：(i)经取代除去至少一个赖氨酸残基；(ii)经取代添加至少一个赖氨酸残基；(iii)删除至少一个赖氨酸残基；和/或(iv)经插入添加至少一个赖氨酸残基。
19.前述任一项权利要求的应用，其中所述VLP(a)通过至少一个非肽键与所述TNF-肽(b)连接。
20.权利要求1到18任一项的应用，其中所述TNF-肽融合到所述VLP上，其中优选所述TNF-肽经其C-末端，或经其N-末端融合到VLP上。
21.前述任一项权利要求的应用，在所述VLP(a)和所述TNF-肽(b)之间还包含氨基酸连接体(c)，其中(c)和(b)一起不会形成具有来自人TNFα的序列的肽，其中优选(c)和(b)一起不会形成具有来自人或小鼠TNFα的序列的肽；其中优选所述氨基酸连接体选自：
a.)GGC；
b.)GGC-CONH2；
c.)GC；
d.)GC-CONH2；
e.)C；和
f.)C-CONH2。
22.前述任一项权利要求的应用，其中所述修饰的VLP包括具有至少一个第一附着位点的所述VLP，其中所述修饰的VLP包含具有至少一个第二附着位点的所述TNF肽，其中所述第二附着位点能连接到所述第一附着位点上；其中优选所述TNF肽和VLP通过所述连接相互作用而形成有序的和重复的抗原阵列。
23.权利要求22的应用，其中所述第一附着位点包含氨基，或优选是氨基，其中甚至更优选所述第一附着位点是赖氨酸残基的氨基。
24.权利要求22到23任一的应用，其中所述第二附着位点包含巯基，或优选是巯基，并且其中甚至进一步优选所述第二附着位点是半胱氨酸残基的巯基。
25.权利要求22到24任一的应用，其中所述第一附着位点不是巯基，优选不包含巯基，并且其中进一步优选所述第一附着位点不是，优选不包含半胱氨酸残基的巯基。
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