CN101080239A - 作为慢性肝炎治疗性疫苗的稳定化HBc嵌合体颗粒 - Google Patents

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Abstract

公开了一种治疗慢性乙型肝炎的方法，所述方法包括将T细胞刺激量的疫苗给予患者。所述疫苗包含免疫原性量的嵌合的羧基端截短的乙型肝炎病毒核壳(核心)蛋白(HBc)，所述蛋白经改造而增强了自我装配颗粒的稳定性并且其颗粒基本上不结合核酸。所述嵌合蛋白分子可包含一个或多个免疫原性表位，所述表位以肽键连接在HBc的N末端、免疫原性环和C末端中的一个或多个。因邻近所述嵌合分子的氨基端和羧基端的一端或两端存在至少一个异源半胱氨酸残基，从而获得了自我装配颗粒的增强的稳定性。

Description

作为慢性肝炎治疗性疫苗的稳定化HBc嵌合体颗粒
               相关申请的交叉引用
本申请是2003年2月21日申请的编号为10/372,076的部分继续申请，该申请本身又是2002年2月21日申请的编号为10/080,299和2002年2月22日申请的编号为10/082,014的部分继续申请，所述申请的公开内容通过引用结合到本文中。
                   技术领域
本发明涉及免疫学和蛋白质工程交叉领域，特别是涉及嵌合乙型肝炎病毒(HBV)核壳蛋白，所述核壳蛋白通过增强抗乙型肝炎病毒的免疫应答而在治疗慢性肝炎患者的疫苗中用作免疫原，并且所述核壳蛋白是经工程改造以通过C端半胱氨酸残基和N端半胱氨酸残基中的一个或两个增强自我装配颗粒的稳定性。
                   发明背景
全世界有超过3.5亿人是乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染携带者。HBV是一种感染肝脏的病毒，能增加慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(肝癌)的风险。乙型肝炎是超过80％的肝细胞癌的诱因，而且在全世界每年夺取1-2百万人的生命，业已成为重要的公共卫生挑战，并且也代表了新型治疗药的不断增长的市场。
乙型肝炎感染的严重程度取决于感染时感染者免疫系统的状态。在分娩时，当乙型肝炎从母亲传给其婴儿时，乙型肝炎是非常严重的，因为婴儿免疫系统通常还没有建立抗该病毒的有效应答。结果，在分娩时感染的婴儿中有90％发生慢性感染，其肝细胞癌的风险要高得多(20％至30％)。如果在1-5岁发生感染，慢性感染的风险下降到25-50％。如果在儿童期后期或成年期发生感染，则慢性感染的机会仅为2-6％。在成人期成为慢性感染的人群中，罕见肝细胞癌。
慢性携带者传染性高，其主要分为两类：(1)无症状的慢性迁延性乙型肝炎，其中大部分慢性携带者不会为其病症而就医，和(2)更严重的慢性活动性乙型肝炎，但是比慢性迁延性肝炎要少见。当带有无症状的慢性迁延性HBV的患者出现症状时，其症状可以相对较轻，例如疲劳、腹痛、虚弱、发热和对脂肪或酒精不耐受。该病并不总会发展成严重的肝病，但是少数患者可发展成慢性活动性乙型肝炎。慢性活动性乙型肝炎的后果包括肝硬化和原发性肝细胞癌(PHC)。在肝硬化中，形成纤维组织，代替受损肝细胞。随后肝脏硬化、肿大并变形，最终可导致肝衰竭。PHC在乙型肝炎的低流行区比较罕见，但在高流行区非常常见并且是致死的常见原因。
目前慢性乙型肝炎的治疗方法包括注射4个月干扰素α-2。美国批准的干扰素α-2有4个品牌：Schering Plough公司的IntronA、Amgen公司的Infergen、Hoffmann-La Roche公司的Roferon和GlaxoSmithKline公司的Wellferon。IntronA是唯一获准用于乙型肝炎的α干扰素，其它品牌仅获准用于丙型肝炎。
据信，干扰素α增加肝细胞表面的I类MHC分子数目，因而增强免疫细胞识别和破坏感染肝细胞的能力。干扰素α也增加在肝细胞中切割HBV-RNA的核糖核酸酶的数量，从而阻碍HBV的生长。
尽管干扰素α在某些人中可以完全消除慢性乙型肝炎感染，但是其应用因为超过半数患者对治疗无反应而受到限制。在慢性乙型肝炎患者中，干扰素α可通过减少其体内病毒数量并减缓对其肝脏的损害而减缓疾病。
干扰素α-2治疗的副作用可以很严重，以至于治疗开始时，会建议患者休息一两周。最常见的副作用是流感样症状——疲劳、发热、肌痛、浑身疼痛、寒战和恶心。也会发生温和的毛发稀疏和干燥、皮肤搔痒。
因为干扰素α疗法的无效性和副作用，所以正在研究抗病毒药和治疗性疫苗作为可能的替代治疗方案。第二代核苷类似物例如拉米夫定和泛昔洛韦已显示出有希望的结果。Zeffix(拉米夫定)，即一种核苷逆转录酶抑制剂，是治疗慢性乙型肝炎的有希望的单药候选者，已获得FDA批准于1999年在美国上市和销售。其它正在评价中的抗病毒药包括BMS200、475、更昔洛韦和阿德福韦二匹伏酯。以上候选者与干扰素α的联合疗法也正在研究之中。
Hoffman La Roche和Schering Plough公司目前已向美国食品药品管理局(FDA)申请其所谓PEG化干扰素(名称为PEGASYSTM(Hoffman La Roche)和PEG-INTRONTM(Schering Plough Corp.))的上市。PEG化干扰素是用聚乙二醇(PEG)修饰的α干扰素，以使它们可每周给药一次并在患者体内提供持续的干扰素水平。该PEG化制剂可避免因每周三次给药引起的干扰素水平的波峰和波谷和干扰素的副作用。PEG化干扰素对单一疗法或联合疗法后的复发者尤其有益。
已经研究了疫苗方法以治疗慢性肝炎。Couillin及其同事[Couillin等(1999)J.of Infect.Dis.，180：15-26]评价了用乙型肝炎表面抗原(HBsAg)接种是否能克服慢性肝炎患者对HBsAg的耐受性。他们确定HBsAg在一部分人群中是有效的。
也已在动物模型中进行了研究，以评价在该病的动物模型中是否可以诱导免疫应答。因此，Bocher及其同事[Bocher等(2001)E.J.ofImmun.，31：2071-2079]评价了在人源化(trimera)小鼠模型中针对接种的免疫应答。作为疾病模型，这些作者将PBMC从乙型肝炎慢性感染者转移到小鼠体内，然后用乙型肝炎核心蛋白(HBc)或编码乙型肝炎核心蛋白的DNA给这些小鼠接种。这些作者注意到，当用HBc或编码HBc的DNA免疫小鼠时，诱导出HBc特异性T辅助细胞和B细胞应答。这些作者还注意到，无论是HBc蛋白还是编码HBc的DNA都可以作为候选疫苗，用于抗慢性乙型肝炎感染的治疗性接种。应当注意的是，在这些研究中，需要非常大剂量的HBc来诱导免疫应答。通过加入免疫刺激性寡核苷酸(ISN)，可以进一步增强移植感染者PBMC的小鼠的免疫应答。
除了考虑主动接种外，也进行了被动免疫转移的尝试：Lau及其同事[Lau等(2002)Gastroenterology，122：614-624]证明，将HBV免疫个体的骨髓转移给慢性感染者，导致感染被消除。感染消除与对HBc具有活性的T细胞的转移有关，这使得这些作者假定，在慢性乙型肝炎感染者体内，用HBc蛋白或[编码HBc的]DNA进行治疗性免疫，是值得研究的。
因此，已经认识到乙型肝炎核心蛋白(HBc)是一种潜在有用的抗原，用于抗慢性乙型肝炎感染的治疗性接种。然而，将潜力付诸实施所必须解决的几个问题是：HBc重组体的生产是困难的。正如下面将要讨论的，产率非常低，可能是因为HBc蛋白结合核酸的固有特性，此外，所得病毒样颗粒(VLP)难以纯化到法规可接受的水平。
因为生产HBc有困难，所以已经研究了替代方法，以在慢性HBV感染者体内诱导抗HBc免疫应答。因此，例如，转让给Hultgren和Sallberg的WO 01/16163提出了多个重叠合成肽的用途，所述肽包括几个跨越HBc序列1-183位的氨基酸残基序列。这些发明人提出，用跨越完整蛋白的肽混合物进行免疫，可在慢性感染者体内诱导免疫应答，促进对病毒的清除。也已采用编码HBc蛋白的DNA来免疫慢性感染HBV的黑猩猩[Sallberg等，(1998)Human Gene Therapy 10：1719-1729]。采用编码蛋白的DNA，克服了纯化蛋白的需要，但是DNA接种在人类的成功率并不显著。
授予Thoma的美国专利第6,020,167号公开了一种据称用于治疗慢性HBV感染的疫苗。该疫苗包括具有一种或多种HBV Pre-S1或HBV核心T细胞激活表位的多肽，所述表位结合到能够呈递多肽的载体上。优选据称能形成颗粒的、具有HBV核心和表面蛋白(分别为HBc和HBsAg)完整部分或基本部分的载体作为要求保护的载体。正如下面将要讨论的，完整的核心蛋白趋向于结合核酸，这对疫苗生产来说是个问题。另外，羧基端截短以减少核酸结合的核心分子可能是不稳定的并且可在疫苗中提供不均一混合物。
嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)是有包膜的含DNA动物病毒，可在人类引起乙型肝炎(HBV)。嗜肝DNA病毒科包括其它哺乳动物乙型肝炎病毒和禽类乙型肝炎病毒，例如土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)和地松鼠乙型肝炎病毒(GSHV)，以及鸭乙型肝炎病毒(DHV)和鹭鸶乙型肝炎病毒(HeHV)。本文使用的乙型肝炎病毒(HBV)是指嗜肝DNA病毒科成员，与感染禽类宿主的病毒相比，其感染哺乳动物，除非讨论涉及具体的非哺乳动物病毒的实例。
哺乳动物乙型肝炎病毒(HBV或嗜肝DNA病毒)的核壳或核心含有一个183或185个氨基酸残基的序列(这取决于病毒亚型)，而鸭病毒衣壳含有262个氨基酸残基。几种嗜肝DNA病毒科的乙型肝炎核心蛋白单体在感染细胞中自我装配成为稳定的聚集体，称为乙型肝炎核心蛋白颗粒(HBc颗粒)。据报道，HBc颗粒有两种三维结构。第一种包含次要群体，该群体含有90个拷贝的HBc二聚体亚基蛋白或180个单独的单体蛋白，而第二种即主要群体含有120个拷贝的HBc二聚体亚基蛋白或240个单独的单体蛋白。这些颗粒被认为分别是T＝4或T＝3的颗粒，其中“T”是三角划分数。这些感染人类的病毒(人类病毒)的HBc颗粒直径分别约为30nm或34nm。Pumpens等(1995)Intervirology，38：63-74；和Metzger等(1998)J.Gen.Viol.，79：587-590。
Conway等，(1997)Nature，386：91-94描述了在9分辨率下用低温电子显微照相观察到的人类HBc颗粒的结构。Bottcher等(1997)，Nature，386：88-91描述了所述多肽折叠成人类HBc单体，并且提供了氨基酸残基形成α-螺旋区及其连接环状区的近似编号模式。Zheng等(1992)，J.Biol.Chem.，267(13)：9422-9429报道，核心颗粒的形成并不依赖于富含精氨酸的C端结构域，核酸结合或二硫键形成是根据他们对缺乏一个或多个半胱氨酸的突变蛋白的研究以及其他人用C端截短的蛋白进行的工作[Birnbaum等，(1990)J.Virol.64，3319-3330]。
已经公开了乙型肝炎核壳或病毒核心蛋白(HBc)作为免疫原性载体部分，该部分刺激免疫宿主动物的T细胞应答。参见例如美国专利第4,818,527号、第4,882,145号和第5,143,726号。该载体特别有用的用途是其在优势免疫环(immunodominant loop)部位呈递外源或异源B细胞表位的能力，所述表位存在于从所述蛋白的氨基端(N端)起约70-90位残基上，更常见在约75-85位残基上。Clarke等(1991)F.Brown等编著，Vaccines 91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，第313-318页。
在病毒复制过程中，HBV核壳与病毒RNA前基因组、病毒逆转录酶(Pol)和末端蛋白(来自Pol)缔合，形成可复制的核心(replicationcompetent core)。核壳和病毒RNA前基因组之间的缔合是由羧基端(C端)富含精氨酸区介导的。当在异源表达系统(例如在不存在病毒RNA前基因组的大肠杆菌(E.coli))中表达时，鱼精蛋白样C端(即在150至183位残基)可以结合大肠杆菌RNA。Zhang等(1992)JBC，267(13)9422-29。
在用作疫苗部分中，优选HBV核壳不结合来自宿主的核酸。Birnbaum等(1990)J.Virol.，64：3319-3330证明，HBV核壳的鱼精蛋白样C端结构域可以缺失而不干扰该蛋白装配成病毒样颗粒的能力。因此，据报道，截短至约144位的蛋白(即含有从1至约144位的HBc序列)可自我装配，而缺失超过残基139则不能进行衣壳装配[Birnbaum等，(1990)J.Virl.，64：3319-30；和Seifer等，(1995)Intervirology，38：47-62]。
Zlotnick等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，94：9556-9561研究了全长和截短HBc蛋白的颗粒装配。除了讨论全长分子外，这些作者还报道了含有1-149位HBc序列的截短蛋白的制备方法，其中48、61和107位的半胱氨酸各自被丙氨酸取代，并且其中在C端(150位)添加了一个半胱氨酸残基。该C端的硫醇在电子显微镜下进行标记时用于连接金原子簇。
新近，Metzger等(1998)J.Gen.Viol.，79：587-590报道，人类病毒序列138位上的脯氨酸(Pro-138或P138)是颗粒形成所必需的。这些作者也报道，在羧基端截短到142和140残基长度的颗粒装配能力受到影响，而截短到139和137残基的长度会引起装配能力的完全丧失。
几个研究小组已经证明，截短颗粒与标准乙型肝炎核心颗粒相比，表现出稳定性降低[Galena等(1989)J.Virol.，63：4645-4652；Inada等(1989)Virus Res.，14：27-48]，显示出在纯化制备物中颗粒大小的变异性和颗粒片段的存在[Maassen等，(1994)Arch.Virol.，135：131-142]。因此，在Metzger等(同上)的报道之前，Pumpens等，(1995)Intervirology，38：63-74已总结了文献报道，确定自我装配所需HBc序列羧基端的边缘位于氨基酸残基139和144之间，而且前两个或三个氨基端残基可以被其它序列取代，但是如果去掉4个或11个氨基端残基，则嵌合蛋白在转化的大肠杆菌细胞中将完全消失。
已经通过在各种生物体中进行异源表达，来制备重组产生的带有内部插入序列的杂合HBc颗粒(在本领域中称为HBc嵌合颗粒或HBc嵌合体)，所述颗粒含有多种插入多肽序列，所述生物体包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、痘苗病毒(Vaccinia)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。参见例如Pumpens等(1995)Intervirology，38：63-74，及其中引用的几个研究小组的工作。
当用电子显微镜进行分析时，与缺失异源表位的颗粒相比，这样的HBc嵌合体常呈现出有序程度较低的结构[Schodel等，(1994)J.Exp.Med.，180：1037-10461。在某些情况下，将异源表位插入到C端截短的HBc颗粒中，会产生显著的去稳定作用，以至于杂合颗粒在异源表达后不能复原[Schodel等(1994)Infect.Immunol.，62：1669-1676]。因此，许多嵌合HBc颗粒不稳定，以至于它们在纯化过程中因裂解而无法复原，或者它们显示出很差的稳定性，对疫苗开发造成困难。
上述Pumpens等(1995)Intervirology，38：63-74的报告中列举了形成颗粒的嵌合体，其中插入的多肽序列位于其N端、C端和两端之间。在该文中报道的插入片段长度：在N端为24-50个残基，内部为7-43个残基，在C端为11-741个残基。
最近，Kratz等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，96：1915-1920中公开了大肠杆菌表达的嵌合HBc颗粒，该颗粒包含内部融合238个残基的绿色荧光蛋白(GFP)的截短HBc序列。该嵌合体含有邻接一对富含甘氨酸柔性连接臂的插入GFP序列，该连接臂取代HBc的氨基酸残基79和80。这些颗粒据称在兔子(作为宿主动物)体内能有效诱发抗天然GFP抗体。
美国专利第5,990,085号公开了由抗原性牛抑制素肽融合到以下结构中而成的两种融合蛋白：(i)残基78和79之间的免疫原性环和(ii)羧基端截短的HBc的残基144后。据称，当给予宿主动物时，表达的融合蛋白诱导产生抗抑制素抗体。据该专利报道，免疫后30天的滴度相当低，对于具有所述环插入的融合蛋白，为1∶3000-15,000，而对于在残基144后插入的融合蛋白为1∶100-125。
美国专利第6,231,864号公开了连接半抗原的战略性修饰的乙型肝炎核心蛋白的制备方法和用途。该修饰核心蛋白含有一个长度约1个至约40个残基的插入片段，该片段含有一个化学反应性氨基酸残基，半抗原悬挂连接(pendently linked)到该残基上。
WO 01/27281公开了通过天然分子含有C端半胱氨酸的序列的存在与否，可改变抗HBc的免疫应答，从Th1应答变成Th2应答。其公开内容也记载了通过C端半胱氨酸形成的二硫化物可有助于使颗粒稳定。据称，优选紧接着其C端半胱氨酸上游存在的天然HBc序列的几个残基，但并不是必需的。据称，一个可用来取代截短C端的HBc序列的这样的替代物，包含一个C端半胱氨酸和一个对来自不同于HBc的表位进行限定的任选序列。
已公布的PCT申请WO 01/98333公开了，缺失的4个精氨酸重复序列中的一个或多个存在于天然HBc C端上，同时保留了C端半胱氨酸残基。该申请也公开了缺失区可以被来自不同于HBc的蛋白的表位取代，使得如此形成的所述分子的HBc部分对于添加的表位来说起到载体的作用。
已经公布的对应于PCT/US01/25625(于2002年2月21日公布的WO 02/13765 A2)和PCT/US01/41759(于2002年2月21日公布的WO 02/14478 A2)的PCT申请中公开了可以通过在嵌合蛋白中采用一个或多个添加的半胱氨酸残基，来达到C端截短的HBc颗粒(其颗粒由该嵌合蛋白装配而来)的稳定性。据介绍，这些添加的半胱氨酸残基在所述嵌合蛋白的C端上或其附近。
可以保留全长HBc颗粒稳定性、同时又消除全长HBc颗粒的核酸结合能力的结构特征，在采用嗜肝DNA病毒核壳传递系统的疫苗开发中非常有利。确实，Ulrich等在其对采用HBc嵌合体作为外源表位载体的近期综述[Adv.Virus Res.，50：141-182(1998)AcademicPress]中，指出了在人用疫苗中采用这样的嵌合体有待解决的3个潜在问题。第一个潜在的问题是嵌合疫苗中核酸的无意转移(inadvertenttransfer)给免疫宿主。第二个潜在问题是先前存在的抗HBc免疫的干扰作用。第三个潜在问题涉及需要再生产性制备完整的嵌合体颗粒并可耐受长期贮存。
以上4个已经公布的PCT申请看来都记载了用于克服Ulrich等在上文中公开这些潜在问题的内容，如下文中公开的，本发明提供另一种HBc嵌合体，该嵌合体提供预料不到的高滴度的抗流感抗体，并且在一方面也提供解决HBc嵌合体稳定性以及该构建体核酸结合能力基本上缺失等问题的方法。另外，一种所提出的重组嵌合体表现出针对先前存在的抗HBc抗体的最小抗原性(如果有的话)。
尽管以上对颗粒不稳定性的发现涉及N端截短的HBc嵌合分子，Neirynck等，(1999年10月)Nature Med.，5(10)：1157-1163报道了大肠杆菌中表达的HBc嵌合体的颗粒形成，该嵌合体含有在残基5与全长HBc融合的流感M2蛋白N端24个残基部分。
前面讨论的带有截短C端的杂合HBc蛋白在疫苗应用中的用途，比其全长对应物来说有几个优点，包括增加的表达水平和缺乏对大肠杆菌RNA的结合。然而，经工程改造以展示异源表位的C端截短颗粒通常是不稳定的，导致颗粒或者在表达后不能缔合成稳定的颗粒结构，或者在纯化中和/或纯化后容易解离成非颗粒结构。所述稳定性的缺乏，表现为由嵌合HBc分子组成的颗粒，该嵌合HBc分子是C端截短到HBc 149位并且还含有上述甲型流感M2蛋白残基1-24。
其他人报道，在野生型嗜肝DNA病毒核心抗原中，HBcAg起始密码子上游的半胱氨酸残基直接参与阻止颗粒的形成[Schodel等(1993年1月15日)J.Biol.Chem.，268(2)：1332-1337；Wasenauer等(1993年3月)J.Virol.，67(3)：1315-1322；和Nassal等(1993年7月)J.Virol.，67(7)：4307-4315]。这三个研究小组都报道，在野生型HBeAg中，在前核心序列-7位的半胱氨酸残基(当从-30位上游启动子甲硫氨酸翻译核心基因时存在所述残基)负责阻止颗粒形成，并因而促进颗粒HBcAg转变为分泌型非颗粒HBeAg。
下文讨论的本发明的一个方面是提供一种蛋白免疫原，所述免疫原预计用于给予乙型肝炎病毒慢性感染者，以克服上述生产和污染等问题。此外，所述蛋白已经工程改造，以保持物理稳定性，并能诱导尤其是用于清除体内已有的乙型肝炎病毒感染的免疫应答。
在下文中详细描述的本发明提供了用于治疗慢性肝炎的疫苗，所述疫苗克服了先前已观察到的有关疫苗的几个问题。因此，所提出的疫苗通过提供尤其可用于清除体内已存在的乙型肝炎病毒感染的T细胞活化，诱导增强的免疫应答，并且利用稳定而均一的、同时也基本上缺乏核酸结合的载体分子。
                    发明概述
本发明提出一种治疗乙型肝炎病毒慢性感染者的方法，即通过给予该患者一种由溶解或分散在药物可接受的稀释剂中的重组截短的和稳定化嗜肝DNA病毒核壳蛋白颗粒组成的疫苗，其用量足以加强慢性乙型肝炎病毒感染者对该病毒的免疫应答。单用或与其它疗法联用的如此增加的抗该病毒免疫应答，可以使该个体清除体内病毒并且不再被感染。优选重组截短的和稳定化嗜肝DNA病毒核壳蛋白基本上不含宿主核酸。
所述方法利用由重组嗜肝DNA病毒核壳蛋白即乙型肝炎核心(HBc)嵌合蛋白[本文中也称为嵌合乙型肝炎核心蛋白分子、HBc嵌合分子或者就称为嵌合体]组成的疫苗，所述蛋白在宿主细胞中表达后可自我装配成颗粒，并且将其溶解或分散在药物可接受的稀释剂中。相对于其C端通常在约183位残基的天然核心分子来说，所提出的嵌合分子至少在C端被截短。含有所提出的嵌合分子的颗粒优选在N端或C端或这两端上或其附近被半胱氨酸残基稳定化。所提出的嵌合分子含有HBc N端165个氨基酸残基中约125个氨基酸残基至所有残基，并且可包括一个或多个其它氨基酸残基或残基序列，这些残基或残基序列通常是HBV的B细胞表位或T细胞表位、其它病原体蛋白或其它蛋白例如牛抑制素。
在本发明的一个方面，一种所提出的治疗慢性肝炎的方法包括下述步骤：给予慢性乙型肝炎病毒感染者抗HBc的T细胞刺激量的疫苗，所述疫苗由溶解或分散在药物可接受的稀释剂中的免疫原性颗粒组成。优选免疫原性颗粒与免疫刺激佐剂联合用药。优选的免疫刺激佐剂包括脂质A类似物，例如单磷酰脂质A或合成的氨基烷基葡糖胺磷酸酯。免疫刺激分子优选与微颗粒载体例如水包油乳剂或微颗粒矿物盐类例如氢氧化铝凝胶缔合。免疫原性颗粒本身由重组乙型肝炎核心(HBc)嵌合蛋白分子组成，其嵌合蛋白分子长度至多约为550个氨基酸残基。这些嵌合蛋白分子(a)含有HBc分子N端165个氨基酸残基中约125个氨基酸残基至所有氨基酸残基的HBc序列并且有4至约75位残基和约85至约140位残基的HBc序列。HBc嵌合分子序列任选包含：(a′)以肽键连接的含有免疫原性表位的氨基酸序列，所述免疫原性表位位于所述嵌合体的N末端、HBc优势免疫环(即在约76至约85位残基之间)中和C末端中的一个或多个；或(b′)在HBc优势免疫环中的插入序列，所述插入序列的长度为1个至约40个氨基酸残基并且包含用于缀合半抗原的化学反应性接头残基；或(c′)76-85位序列的零至所有残基。
所述嵌合蛋白分子也含有以下(a′)和(b′)之一或它们两者：(a′)序列中其氨基酸位置不同于HBc前核心序列的1-3个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在所述嵌合分子中的氨基酸位置对应于从SEQ IDNO：1的HBc序列N端计算的氨基酸位置-20至约+1[N端半胱氨酸残基]；和(b′)从HBc序列C端残基开始向所述分子C端方面并且位于所述嵌合分子C端的约30个残基内的1个至约3个半胱氨酸残基[C端半胱氨酸残基]。
嵌合蛋白分子所含有的HBc序列中的保守取代氨基酸残基不大于约20％并且自我装配成颗粒。在宿主细胞表达(然后收集和纯化)中，优选这些颗粒基本上不结合核酸(表现出280nm与260nm吸光度比值约1.2至约1.7，如下所讨论)，但也可包含最少量的结合核酸，使得280nm与260nm吸光度比值约0.9至约1.15。因此，本文可以使用280nm与260nm吸光度比值约0.9至约1.7的颗粒。所述颗粒比由除了以下两点不同之外其他方面都相同的HBc嵌合分子所形成的颗粒更稳定：(i)不含任何上述C端半胱氨酸残基或N端半胱氨酸残基，或者(ii)其中所提出的嵌合分子中存在的C端半胱氨酸残基或N端半胱氨酸残基被其它残基取代。
让所述患者保持足够时间以诱导出抗HBc的活化T细胞。在本发明的其它方面，所述患者用抗病毒药例如拉米夫定进行治疗，以降低病毒载量。抗病毒药物治疗可以与接种同时进行，或者可以在接种之前进行。本发明所提出的一个方面包括一种药盒，所述药盒包括用于给予患者的抗病毒药和HBc嵌合体。
在本发明的其它方面，所述患者血清中含有HBsAg，所述治疗使得患者血清中该抗原量降低。在本发明的另一方面，所述患者血清中含有HBeAg，所述治疗使得患者血清中HBeAg抗原量降低。
优选的重组乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合分子长度约135个至约525个氨基酸残基，从其N端起含有4个以肽键连接的氨基酸残基序列结构域，命名为结构域I、II、III和IV。
该嵌合分子的结构域I包括约71个至约110个氨基酸残基，其序列包含：(i)HBc的至少5位至75位残基序列；(ii)序列中其氨基酸位置不同于HBc前核心序列的0-3个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在所述嵌合分子中的氨基酸位置对应于从SEQ ID NO：1的HBc序列N端计算的氨基酸位置-20至约+1[N端半胱氨酸残基]；和(iii)任选的免疫原性表位，所述表位含有以肽键连接HBc残基2-4之一的至多约30个氨基酸残基。
该嵌合分子的结构域II包括至多约255个氨基酸残基而且其以肽键连接结构域I的HBc残基75，其中：(i)存在HBc的76-85位序列中的零至所有残基，所述残基以肽键连接(ii)任选存在的构成免疫原性表位的1个至约245个氨基酸残基或缀合表位的一个接头残基的序列。
嵌合体结构域III是从86位至135位的HBc序列而且其以肽键连接结构域II的残基85。
嵌合分子结构域IV包括：(i)136-165位的HBc氨基酸残基序列的5-30个残基而且其以肽键连接结构域III的135位残基；(ii)位于嵌合分子C端的约30个残基内的0-3个半胱氨酸残基[C端半胱氨酸残基]；和(iii)免疫原性序列中的0至约100个氨基酸残基，所述序列与存在于HBc的165位到其C末端的序列不同。
一个优选的嵌合分子(i)具有所述嵌合体的HBc序列中的氨基酸残基不大于约10％被取代的氨基酸残基序列，和(ii)在宿主细胞中表达后自我装配成颗粒。所述颗粒基本上不结合核酸，并且比由除了以下两点不同之外其他方面都相同的HBc嵌合分子所形成的颗粒更稳定：(i)不含任何上述C端半胱氨酸残基和缺乏N端半胱氨酸残基，或者(ii)其中所提出的嵌合分子中存在的N端半胱氨酸残基被其它残基取代。
在一些实施方案中，优选结构域I的HBc序列包括5位至75位残基以及至少一个N端半胱氨酸残基。在其它实施方案中，优选所提出的嵌合分子不仅含有N端半胱氨酸残基，而且在如上所述的单独的或者在一个氨基酸残基序列中的结构域IV内也含有一个半胱氨酸残基。在另一些实施方案中，一个优选的嵌合分子仅含一个或多个C端半胱氨酸残基且结构域I没有非HBc半胱氨酸残基。在图1的各HBc序列中，半胱氨酸残基都存在于约61位。
一种所提出的方法使用一种包含上述自我装配的嵌合分子颗粒溶解或分散在药物可接受的稀释剂组合物中的疫苗，所述组合物通常也含有水。特别优选的非HBc表位存在于所提出的嵌合分子的一个或多个结构域I、II和III中，该表位是来自乙型肝炎表面蛋白(HBs)preS1区或preS2区的免疫原性序列。
本发明具有几个益处和优点。
本发明的一个具体益处是其作为治疗性疫苗提供超常的T细胞活化的用途。
本发明另一个益处是采用众所周知的细胞培养技术容易地制备重组免疫原。
本发明的一个优点是采用众所周知的重组技术容易地制备免疫原。
本发明的另一个优点是，优选的免疫原在制备过程中表现出比缺乏C端半胱氨酸残基或N端半胱氨酸残基或它们两者的其它HBc嵌合体更高的稳定性，同时基本上不含核酸。
对普通技术人员来讲，根据以下公开内容，更多益处和优点将会是显而易见的。
                    附图简述
附图是本公开内容的一部分。
图1显示图1A和图1B两个图面，提供了6个已公开的来自6种病毒的哺乳动物HBc蛋白序列的比对。第一个(SEQ ID NO：1)人类病毒序列是ayw亚型，公开于Galibert等(1983)Nature，281：646-650；第二个人类病毒序列(SEQ ID NO：2)是adw亚型，公开于Ono等(1983)Nucleic Acids Res.11(6)：1747-1757；第三个人类病毒序列(SEQ ID NO：3)是adw2亚型，公开于Valenzuela等， Animal Virus Genetics，Field等编著，Academic Press，New York(1980)，第57-70页；第四个人类病毒序列(SEQ ID NO：4)是adyw亚型，公开于Pasek等(1979)Nature，282：575-579；第五个序列(SEQ ID NO：5)是土拨鼠病毒HBc蛋白序列，公开于Galibert等(1982)J.Virol.41：51-65；第六个哺乳动物序列(SEQ ID NO：6)是地松鼠HBc蛋白序列，公开于Seeger等(1984)J.Virol.，51：367-375。
图2显示，在本文中用于制备重组HBc嵌合体的质粒载体pKK223-3N的制备过程中，对商业质粒载体pKK223-3进行的修饰。修饰序列(SEQ ID NO：7)示于市售载体序列(SEQ ID NO：8)的下面。添加的NcoI位点的碱基用小写字母表示，添加的碱基用双下划线表示，而缺失的碱基用虚线表示。标出了该序列区段上存在的两个限制位点(NcoI和HindIII)。
图3是ICC-1603颗粒的分析型大小排阻层析洗脱图，其中纵坐标显示吸光度(280nm)，而横坐标显示时间(秒)。
图4同图3所讨论的一样，是ICC-1590颗粒的分析型大小排阻层析洗脱图。
图5同图3所讨论的一样，是ICC-1560颗粒的分析型大小排阻层析洗脱图。
图6同图3所讨论的一样，是ICC-1605颗粒的分析型大小排阻层析洗脱图。
图7同图3所讨论的一样，是ICC-1604颗粒的分析型大小排阻层析洗脱图。
图8同图3所讨论的一样，是ICC-1438颗粒的分析型大小排阻层析洗脱图。
图9同图3所讨论的一样，是ICC-1492颗粒的分析型大小排阻层析洗脱图。
图10是在颗粒制备后，在还原性条件下进行的SDS-PAGE分析照片，显示出与ICC-1492构建体(第3道)相比，ICC-1438单体构建体在老化(aging)后不稳定(第2道)，其中HBc-149(第1道)、ICC-1475(第4道)和ICC-1473(第5道)作为额外的分子量对照。
图11摘自PCT/US01/25625(ICC-102.2)，图解反应方案(方案1)，显示两个反应程序：(i)用硫代-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷1-羧酸酯(硫代-SMCC)将半抗原连接到嵌合乙型肝炎核心蛋白(sm-HBc)颗粒侧面，形成活化载体，然后(II)将巯基端(半胱氨酸端)半抗原连接到活化载体上，形成缀合物颗粒。sm-HBc颗粒表示为具有一个侧氨基的方框(为了使附图清楚)，而巯基端半抗原表示为末端为SH基团的线。
定义
HBc嵌合体所附带的数值是指SEQ ID NO：1的HBc ayw氨基酸残基序列中的位置，其中从该序列已添加或缺失了一个或多个残基，无论该氨基酸残基序列的添加或缺失是否存在。因此，HBc149表示嵌合体末端在残基149，而HBc149+C150表示相对于SEQ ID NO：1序列号来讲相同的嵌合体在HBc的150位含有半胱氨酸残基。
术语“抗体”是指被称为免疫球蛋白的糖基化蛋白的家族成员的分子，所述分子可专一性结合一种抗原。
术语“抗原”以前用来指抗体或受体所结合的实体，并且也指诱导抗体产生的实体。目前将抗原的定义限定在抗体或受体所结合的实体，而术语“免疫原”用作诱导抗体产生或结合受体的实体。当本文所讨论的实体既具有免疫原性又具有抗原性时，按照其预定用途，通常是指它们或者是免疫原或者是抗原。
“抗原决定簇”是指被抗体结合位点或T细胞受体免疫结合的抗原实际结构部分。该术语与“表位”也可互换使用。因此，抗原决定簇是刺激抗体产生或T细胞活化的结构，可以通过测定抗体结合或诱导T细胞活化的结构来确定这样的结构的存在。
本文所用的术语“缀合物”是指例如通过氨基酸残基侧链有效连接载体蛋白的半抗原。
本文所用的术语“保守取代”是指一个氨基酸残基被另一个生物学上类似的残基取代。保守取代的实例包括用一个疏水残基取代另一个疏水残基的取代，或者一个极性残基被另一个极性残基的取代，所述疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，所述极性残基的取代例如精氨酸和赖氨酸之间的取代、谷氨酸和天冬氨酸之间的取代、或者谷氨酰胺和天冬酰胺之间的取代等等。
术语“相应”在各种语法形式中用于肽序列时，是指所述肽序列在其氨基端和羧基端的一端或两端加上或减去至多3个氨基酸残基，并且在多肽序列特定氨基酸残基上仅含有保守取代。
本文所用的术语“结构域”是指重组HBc嵌合分子部分，所述分子是按照(i)相对于下文报道的HBcAg亚型ayw位数的残基位置数来鉴定：Galibert等，(1979)Nature，281：646-650(SEQ ID NO：1)。据信，存在至少嵌合体结构域I、II和III的多肽部分以类似于天然存在HBcAg的相应序列的第三种形式(tertiary form)存在。
本文所用的术语“融合蛋白”是指含有至少2个氨基酸残基序列的多肽，所述序列通过各自的羧基端和氨基端氨基酸残基之间的肽键端到端(首尾)有效连接在一起，而它们在自然界正常情况下并不连接在一起。本发明的融合蛋白是HBc嵌合分子，所述分子诱导抗体产生，该抗体与多肽发生免疫反应，所述多肽在氨基酸残基序列中对应于融合蛋白的多肽部分。
本文所用的短语“乙型肝炎(病毒)”在广义上是指如上所述的哺乳动物嗜肝DNA病毒科的任何成员。
术语“多肽”和“肽”在本说明书中可互换使用，是指通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接在一起的氨基酸残基的线状系列。多肽可以具有不同长度，无论是以中性(不带电荷)形式或是以盐形式。本领域众所周知，氨基酸残基序列含有酸性基团和碱性基团，并且当肽在溶液中时，肽所显示的特定电离状态取决于周围介质的pH值，或者当肽为固体形式时，肽的特定电离状态取决于所获得到的介质的pH值。因此，“多肽”或其等同术语意指包括参考的合适氨基酸残基序列。本文的肽或多肽通常表示为从左到右并按照氨基端(N端)到羧基端(C端)的方向。
术语“残基”与短语氨基酸残基可互换使用。本文标识的所有氨基酸残基都为天然或L-构型。为了与标准多肽命名法[J.Biol.Chem.，243，3557-59(1969)]保持一致，氨基酸残基的缩写见下列对照表。
                   对照表
  单字母   三字母   氨基酸
  YGFMASILTVPKHQEZWRDNBC   TyrGlyPheMetAlaSerIleLeuThrValProLysHisGlnGluGlxTrpArgAspAsnAsxCys   L-酪氨酸甘氨酸L-苯丙氨酸L-甲硫氨酸L-丙氨酸L-丝氨酸L-异亮氨酸L-亮氨酸L-苏氨酸L-缬氨酸L-脯氨酸L-赖氨酸L-组氨酸L-谷氨酰胺L-谷氨酸L-谷氨酸或L-谷氨酰胺L-色氨酸L-精氨酸L-天冬氨酸L-天冬酰胺L-天冬氨酸或L-天冬酰胺L-半胱氨酸
HBc嵌合体所附带的数值是指SEQ ID NO：1的HBc ayw氨基酸残基序列内的位置，其中从该序列已添加或缺失了一个或多个残基，无论该氨基酸残基序列的添加或缺失是否存在。因此，HBc149表示嵌合体末端在残基149，而HBc149+C150表示相对于SEQ ID NO：1序列号来讲相同的嵌合体在HBc的150位含有半胱氨酸残基。
                  发明详述
本发明提出一种治疗慢性乙型肝炎感染的方法。所提出的方法使用一种包含嵌合重组嗜肝DNA病毒核壳蛋白即乙型肝炎核心(HBc)嵌合蛋白分子的疫苗，所述分子在宿主细胞中表达后自我装配成颗粒。所提出的嵌合分子相对于天然核心分子来说至少在C端被截短，对于图1的ayw亚型来说，所述天然核心分子的C端通常在残基183位。含有所提出的嵌合分子的颗粒被位于N端或C端或这两端上或其附近的半胱氨酸残基稳定化并且优选基本上不结合核酸，如下所述。
所提出的嵌合分子含有HBcN端165个氨基酸残基中至少约125个残基、更优选至少约135个残基至所有残基并且可包括一个或多个其它氨基酸残基序列，这些序列通常为HBV的B细胞表位或T细胞表位、其它病原体蛋白或其它蛋白例如牛抑制素。来自非HBV蛋白并可掺入嵌合分子的B细胞表位和T细胞表位的实例见下表A和表B。优选掺入嵌合分子的、来自乙型肝炎病毒的T细胞表位的实例是表面抗原Pre-S2序列144-160。优选掺入嵌合分子的、来自乙型肝炎病毒的B细胞表位的实例是表面抗原Pre-S2序列130-144。
一种所提出的治疗慢性肝炎的方法包括下述步骤：给予慢性乙型肝炎病毒感染者抗HBc的T细胞刺激量的疫苗，所述疫苗由溶解或分散在药物可接受的稀释剂中的免疫原性颗粒组成。优选将所述免疫原性颗粒与佐剂联合给予。
本文优选的佐剂是与toll样受体相互作用的分子。最优选的佐剂是脂质A类似物，例如单磷酰脂质A和氨基烷基葡糖胺磷酸酯。其它优选的佐剂包括皂苷类和化学修饰的烷基化皂苷类。佐剂可进一步包括微颗粒载体，例如水包油乳剂或矿物盐类。
所述免疫原性颗粒包括重组乙型肝炎核心(HBc)嵌合蛋白分子，嵌合蛋白分子长度至多约550个氨基酸残基。这些嵌合蛋白分子(a)含有HBc分子N端165个氨基酸残基中约125个氨基酸残基至所有残基的HBc序列并且含有4至约75位和约85至约140位残基的HBc序列。
HBc嵌合分子序列任选包含：(a′)以肽键连接的含有免疫原性表位的氨基酸序列，所述免疫原性表位位于所述嵌合体的N末端、HBc优势免疫环(即在约76至约85位残基之间)中和C末端中的一个或多个；或(b′)在HBc优势免疫环中的插入序列，所述插入序列的长度为1个至约40个氨基酸残基，所述残基包括无化学反应性残基或用于缀合半抗原的化学反应性接头残基；或(c′)76-85位序列的零至所有残基。
所述嵌合蛋白分子也含有以下(a′)和(b′)之一或它们两者：(a′)序列中其氨基酸位置不同于HBc前核心序列的1-3个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在所述嵌合分子中的氨基酸位置对应于从SEQ IDNO：1的HBc序列N端计算的氨基酸位置-20至约+1[N端半胱氨酸残基]；和(b′)从HBc序列C端残基开始向所述分子C端方面并且位于从所述嵌合分子C端起约30个残基内的1个至约3个半胱氨酸残基[C端半胱氨酸残基]。
嵌合蛋白分子所含有的HBc序列中的保守取代氨基酸残基不大于20％，并且在宿主细胞中表达后自我装配成颗粒。在本发明的一个方面，所述颗粒基本上不结合核酸，表现出280nm与260nm吸光度比值约1.2至约1.7，而在其它方面，存在着超过最小量的核酸结合，所述颗粒表现出280nm与260nm吸光度比值约0.9至约1.15。因此，概括地讲，所提出的颗粒的280nm与260nm吸光度比值可以是约0.9至约1.7。核酸结合讨论如下。所述颗粒比由除了以下两点不同之外其他方面都相同的HBc嵌合分子所形成的颗粒更稳定：(i)不含任何上述C端半胱氨酸残基或N端半胱氨酸残基，或者(ii)其中所提出的嵌合分子中存在的C端半胱氨酸残基或N端半胱氨酸残基被其它残基取代。
让接受所述疫苗的患者保持足够时间以诱导出抗HBc的活化T细胞。在其它实施方案中，对血流中具有HBsAg循环的患者实施所述方法，并让患者保持足够时间以使循环HBsAg量变小。在本发明的另一方面，所述患者血清中含有HBeAg，所述治疗导致患者血清中HBeAg抗原量的降低。本领域技术人员熟知每种抗HBc/HBeAg和HBsAg的T细胞活化的已知检测方法。
嵌合蛋白可在N端、HBc免疫原性(免疫优势)环中或C端、或者在免疫原性环中无反应性(异源)残基或B细胞表位或T细胞表位接头残基上，展示一个或多个免疫原性表位，或者具有76至85位残基的零至所有残基。在一个实施方案中，嵌合蛋白含有一个或多个N端半胱氨酸残基，所述残基在自我装配颗粒的形成中赋予增强的稳定性。
在另一个实施方案中，嵌合蛋白含有一个或多个C端半胱氨酸残基，所述残基在自我装配颗粒的形成中赋予增强的稳定性。所提出的嵌合蛋白分子在N端和C端的两端上或其附近也可含有半胱氨酸残基，也就是说，嵌合蛋白分子可同时含有N端半胱氨酸残基和C端半胱氨酸残基，如上所述。
在一些优选实施方案中，所提出的嵌合蛋白从HBc残基149位到羧基端下游基本上不含精氨酸和/或赖氨酸残基，使得自我装配颗粒基本上没有核酸结合。在其它实施方案中，存在着从149位至约163位的HBc序列，所述序列包括两个富含精氨酸的重复序列(参见图1)。在其它实施方案中，存在着至约156位的HBc序列，所述序列含有一个富含精氨酸序列。在再一些实施方案中，C端HBc序列在HBc 140和149位之间结束，而嵌合分子在图1的天然HBc序列中从150位至C端不含精氨酸重复序列，或者不含类似序列，所述类似序列含有赖氨酸残基替代一个或多个精氨酸残基。基本上没有核酸结合讨论如下，这是容易确定的。
为了便于讨论，本文涉及的所提出的嵌合体序列和序列位置编号是根据人类乙型肝炎核心蛋白亚型ayw的序列和位置编号[Galibert等，(1979)Nature，281：646-650]，其如SEQ ID NO：1中所示。然而，可以理解，考虑到哺乳动物嗜肝DNA病毒衣壳蛋白序列之间的巨大相似性以及由这些蛋白表现出类似的颗粒形成(这对本领域技术人员来说是众所周知的)，有关人类HBc亚型ayw的讨论也适用于亚型adw，以及土拨鼠蛋白和地松鼠蛋白。由于这些巨大相似性，所以本文列举的HBc序列通常为“HBc”序列，除非另有说明。
在一个实施方案中，所提出的HBc嵌合体长度至多约550个残基并且含有
(a)HBc分子N端165个氨基酸残基中约125个氨基酸残基至所有残基的HBc序列，所述HBc分子包含5至约75位残基和约85至约140位残基的HBc序列，(a′)以肽键连接的免疫原性表位，所述免疫原性表位位于所述嵌合体的N末端、HBc优势免疫环中和C末端中的一个或多个；或(b′)在HBc优势免疫环中的插入序列，所述插入序列的长度为1个至约40个氨基酸残基并且包含无化学反应性残基或用于缀合半抗原的化学反应性接头残基；或(c′)76-85位序列的零至所有残基。
嵌合蛋白分子也含有以下(a′)和(b′)之一或它们两者：(a′)序列中其氨基酸位置不同于HBc前核心序列的1-3个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在所述嵌合分子中的氨基酸位置对应于从SEQ ID NO：1的HBc序列N端计算的氨基酸位置-20至约+1[N端半胱氨酸残基]；和(b′)从HBc序列C端残基开始向所述分子C端方向并且位于从所述嵌合分子C端的约30个残基内的1个至约3个半胱氨酸残基[C端半胱氨酸残基]。
嵌合蛋白分子所含有的HBc序列中的保守取代氨基酸残基不大于约20％，并且在宿主细胞中表达后自我装配成颗粒。所述颗粒的形成比满足下述条件的颗粒稳定得多：(i)由除了不含任何上述N端半胱氨酸残基或C端半胱氨酸残基之外其他方面都相同的HBc嵌合分子所形成的颗粒，或者(ii)其中所提出的嵌合分子中存在的N端半胱氨酸残基或C端半胱氨酸残基被其它残基取代。正如已经注意到的，在一些实施方案中，所述颗粒基本上不结合核酸，在其它实施方案中，所述颗粒结合非最小量的核酸。
让所述患者保持足够时间以诱导出抗HBc的活化T细胞。在其它实施方案中，所述患者首先用抗病毒药例如拉米夫定治疗一段时间，使其足以降低病毒载量，然后一次或多次给予该患者所提出的嵌合分子以及可接受的赋形剂，任选给予佐剂。在又一个实施方案中，对血流中具有HBsAg循环的患者实施所述方法，并让患者保持足够时间以使循环HBsAg量变小。在本发明的另一方面，所述患者血清中含有HBeAg，所述治疗导致患者血清中HBeAg抗原量的降低。
所提出的嵌合分子在以下一个或两个位置含有至少一个半胱氨酸残基：(i)相对于如图1和SEQ ID NO：1中所示的HBc N端的约-20至约+1位，或(ii)从HBc序列C端残基开始向所述分子C端并且位于所述嵌合分子C端的约30个残基内。负氨基酸位置的概念通常与前导序列例如HBc的前核心序列相关。本文同样使用这一概念，是因为只需将给定嵌合分子序列与SEQ ID NO：1进行简单比对，就可以确定对应于HBc+1位的起始甲硫氨酸残基的嵌合体位置。
由于氨基酸残基序列通常是从左到右排列，其方向从N端到C端，任何在被HBc起始甲硫氨酸占据的位置左边的比对嵌合分子残基具有负位置。一个所提出的半胱氨酸残基可以存在于HBc比对起始甲硫氨酸左边约20个残基到对应于该起始甲硫氨酸的位置上。
一方面，优选的HBc嵌合体具有一段约135个至约525个L-α-氨基酸残基序列并且含有4个连续的以肽键连接的结构域，即结构域I、II、III和IV。这4个结构域按照与天然蛋白相同的方式连接在一起，也就是说，与含有不是α-氨基酸的残基因而不能形成肽键的多肽、含有D-氨基酸残基的多肽或寡肽缀合物(其中两个或更多个多肽有效连接至氨基酸残基侧链)相比，它们彼此通过肽键连接在一起。因此，可以使用重组技术常用方法，通过表达而制备所提出的嵌合HBc蛋白。
该嵌合分子的结构域I包括约71个至约110个氨基酸残基，其序列包含：(i)至少HBc的5至75位残基的序列；(ii)序列中其氨基酸位置不同于HBc前核心序列的1-3个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在所述嵌合分子中的氨基酸位置对应于从SEQ ID NO：1的HBc序列N端计算的氨基酸位置-20至约+1、优选氨基酸位置-14位至约+1位[N端半胱氨酸残基]；和(iii)任选含有与HBc残基2-4之一以肽键连接的至多约30个氨基酸残基的序列，所述序列包括免疫原性表位。该免疫原性序列(如果存在的话)通常是用于诱导抗乙型肝炎免疫应答的表位。
该嵌合分子结构域II包括以肽键连接结构域I的HBc残基75的至多约255个氨基酸残基，其中(i)存在HBc 76至85位序列中的零至所有残基，所述残基与以下序列以肽键连接：(ii)任选存在的构成免疫原性表位的1个至约245个氨基酸残基序列，或(iii)在HBc优势免疫环中的插入序列，所述插入序列的长度为1个至约40个氨基酸残基，所述残基含有无化学反应性的残基或用于缀合半抗原的化学反应性接头残基。特别优选76-85位的10个残基的序列(76-85位序列)存在，但是被含有表位序列或含有接头序列的1个至约245个残基间隔开。
结构域III是86至135位肽序列而且其以肽键连接的结构域II残基85。
嵌合分子结构域IV包括：(i)136位至149位的HBc氨基酸残基序列的5-14个残基而且其以肽键连接结构域III的135位残基，(ii)从所述嵌合分子C端起约30个残基内的0-3个半胱氨酸残基[C端半胱氨酸残基]，和(iii)在150位到其C端的HBc中并不存在的免疫原性序列中的0至约100个氨基酸残基。优选结构域IV含有0至约50个氨基酸残基的序列，所述序列在上述HBc位置中不存在，更优选所述序列是0至约25个残基。结构域IV也优选含有一个C端半胱氨酸残基。
所述嵌合分子(i)具有一个在所述嵌合体的HBc序列中不大于约10％氨基酸残基被取代的氨基酸残基序列，和(ii)在宿主细胞中表达后自我装配成颗粒。所述颗粒基本上不结合核酸，并且比由除了以下两点不同之外其他方面都相同的HBc嵌合分子所形成的颗粒更稳定：(i)不含任何上述C端半胱氨酸残基和缺乏N端半胱氨酸残基，或(ii)其中所提出的嵌合分子的N端半胱氨酸残基被其它残基取代。
一方面，所提出的嵌合分子包括含表位的序列，所述序列在N端以肽键连接HBc残基2-5之一。另一方面，所提出的嵌合分子包含含有表位的序列或含有接头残基的序列，所述序列以肽键连接位于优势免疫环中HBc残基76和85之间的分子的中部附近。又一方面，含有表位的序列位于嵌合分子C端部分，所述分子以肽键连接HBc残基136-149之一。在其它方面，两个或三个含有表位的序列存在于以上位置，或者一个或两个含有表位的序列与用于表位的接头残基一起存在。如上所述，每个这样的嵌合分子也含有N端半胱氨酸残基或C端半胱氨酸残基或它们两者。这些嵌合分子及其自我装配颗粒的几个具体实例讨论如下。
正如已经注意到的，在这一方面，一种所提出的HBc嵌合分子含有约135个至约525个氨基酸残基。在一些优选的实施方案中，存在HBc残基4，而在其它优选的实施方案中存在残基2-5，所以结构域I可在HBc残基4或2开始并延伸到残基75，即在HBc 75位的HBc残基。残基1是甲硫氨酸，为DNA起始密码子的氨基酸。优选通常存在于HBc 1位的天然甲硫氨酸不存在，使得在编码DNA或NA中仅存在一个起始信号。
可在结构域I或结构域II优势免疫环中存在的异源免疫原性表位优选含有约15至约50个残基，尽管一个短至约6个氨基酸残基的插入序列可以诱导并被抗体和T细胞受体所识别，因而是有用的。
在本发明的另一个实施方案中，一个或多个无化学反应性的(异源)氨基酸残基插入到结构域II中，不能起到B-表位的作用，但却能在感染乙型肝炎病毒患者体内的血中降低抗体循环对所述嵌合颗粒的识别作用。在本发明的一个优选方面，所述嵌合分子在残基75、76、77、78、79、80、81或82位含有一个氨基酸插入，最优选在残基77位含有一个氨基酸插入。所述插入的无化学反应性残基可以是丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸残基，最优选是丙氨酸残基。有望赋予所述颗粒比天然HBc颗粒更小的抗原性；也就是说，由HBV感染产生的抗HBc抗体对该颗粒识别力更差。本领域技术人员可以使用任何数量的氨基酸残基和序列插入到结构域II中以降低其抗原性。
优选从76位至85位的结构域II所有残基都存在，尽管被一个或多个其它残基间隔开。结构域II必须含有至少4个残基，这样就可以具有不干扰表达或使用的任何序列，但是这些残基优选为75和85位残基之间的序列部分。
结构域III含有以肽键连接残基85的HBc残基86至135。
结构域IV含有由以下序列组成的至少5个残基的序列：(i)136至140位、优选至149位的HBc残基序列而且其以肽键连接残基135，(ii)0-3个半胱氨酸残基和(iii)任选可含有至多约100个残基的免疫原性表位的序列，特别是当HBc序列在残基140结束时，尽管更优选至多约25个残基的更短序列。该结构域IV免疫原性序列优选对HBc序列来说是异源的，并且与约165位至HBc C端的HBc序列不同。所述免疫原性序列，当存在于结构域IV中时，优选为T细胞表位，但也可以是B细胞表位，例如通常存在于结构域I和II的某一个中的情况正是如此。下表A和表B提供了来自HBc序列和来自乙型肝炎表面蛋白(HBs或HBsAg)preS1区和preS2区的说明性T细胞表位。
结构域IV也可含有0-3个半胱氨酸残基并且这些Cys残基存在于嵌合分子羧基端(C端)约30个残基内。优选存在一个半胱氨酸(Cys)残基并且该Cys优选作为羧基端(C端)残基存在，除非T细胞表位作为结构域IV部分而存在。当这样的T细胞表位存在时，优选的Cys优选在HBc嵌合体C端的最后5个残基之内。
在一个实施方案中，特别优选的嵌合体含有两个免疫原性表位。这两个免疫原性表位存在于结构域I和II、或者II和IV、或者I和IV中。在一些实施方案中，这两个免疫原性表位之一优选为B细胞表位。在其它实施方案中，这两个免疫原性表位之一为T细胞表位。更优选这两个免疫原性表位是相同或不同的T细胞表位。另外，在B细胞表位位置上可以存在大量B细胞表位，同理，在T细胞表位位置上可存在大量T细胞表位。
在所述嵌合分子在结构域II中含有免疫原性表位的实施方案中，优选所述序列含有一个或多个B细胞表位，氨基酸残基76和85之间的HBc序列存在，但是被免疫原性表位间隔开，并且所述嵌合体在结构域IV中还包括一个或多个T细胞表位，所述结构域IV与HBc残基140-165之一以肽键连接。
同样优选这样的嵌合分子：其中在结构域II中存在缀合表位的异源接头残基，从而在结构域II中提供一个或多个免疫原性表位，残基76和85存在，但是被异源接头残基间隔开，其中存在以肽键连接HBc残基140-165之一的T细胞表位。由所述嵌合分子所形成的颗粒通常含有的缀合表位与C端以肽键连接的T细胞表位之比约为1∶4至1∶1，其比例通常约为1∶2。
在上述嵌合分子的一个说明性结构中，缀合表位的异源接头残基存在于结构域II中，而T细胞表位存在于结构域IV中，在结构域II中不存在额外的B细胞表位。在如下讨论的ELISA测定中，通过结合抗环单克隆抗体测定，所述嵌合体表现出T细胞表位的免疫原性，同时表现出最小的HBc抗原性。
一种优选所提出的HBc嵌合分子含有约135个至约525个残基的序列。一种优选的HBc嵌合分子的序列长度约170个至约250个氨基酸残基，所述分子可含有一个或两个优选长度分别为约15至约50个残基、优选HBc部分长度为约140至约165个残基的免疫原性表位。特别优选的嵌合分子的长度约190至约210个残基，所述分子含有一个或两个免疫原性表位。一个特别优选的嵌合分子的长度约140至约165个残基，所述分子不含添加的免疫原性表位。可以理解，由于N端和C端HBc部分的长度变异和几个可插入到免疫原性环中的所提出的表位的不同长度，因而考虑了宽范围的嵌合分子长度。
一种所提出的重组蛋白在宿主细胞中表达后，自我装配形成基本上不结合核酸的颗粒。所提出的HBc嵌合体颗粒通常为球形，并且对给定的制备物来说，通常大小均一。因此，这些嵌合颗粒装配具有类似形状和大小的天然HBc颗粒并且可以从感染者体内回收。
一种所提出的嵌合颗粒包括上述嵌合分子。更概括地讲，所述嵌合颗粒包括嵌合C端截短的HBc蛋白，所述蛋白具有N端165个残基中至少约125个残基的序列并且含有(i)免疫原性表位，所述表位以肽键连接其N端、C端或优势免疫环、或优势免疫环中的异源无反应性残基或用于表位的接头残基中的一个或多个，和(ii)上述1-3个N端半胱氨酸残基和1-3个C端半胱氨酸残基之一或它们两者，并且至少从135位起的5个HBc残基序列。
一种所提出的颗粒在结构域IV中基本上不含精氨酸和/或赖氨酸残基，致使所述自我装配颗粒基本上不结合核酸，并且表现出280∶260吸光度比值约1.2至约1.7，如下讨论。因此，一种所提出的嵌合蛋白不含约155和183位之间的HBc序列，更优选不含约155和183位之间的HBc序列。
上述N端半胱氨酸残基的存在，意想不到地增强了嵌合分子形成稳定的免疫原性颗粒的能力(如下所论述)。因此，一种所提出的HBc嵌合体颗粒免疫原趋向于形成颗粒，当通过分析型大小排阻层析法(其细节如下所论述)检测时，所述颗粒在收集和初步纯化中保持在一起。
所提出的颗粒比由除了以下两点不同之外其他方面都相同的HBc嵌合分子所形成的颗粒更稳定：(i)缺乏N-端半胱氨酸残基并且也不含任何上述的C端半胱氨酸残基，或者(ii)其中在所提出的嵌合分子中存在的N端半胱氨酸残基被其它残基取代。在一些实例中，除非存在N端半胱氨酸，否则不形成颗粒。在以下实施例中举例说明两类序列稳定性增强的实例。
制备一种所提出的含有N端半胱氨酸残基的颗粒，通常比由缺乏N端半胱氨酸的嵌合分子装配而来的颗粒收率更高。可以从所得颗粒的数量上、或者从如下所述的使用Superposes6HR的分析型凝胶过滤分析中，看出这样的收率上的增加。
所提出的颗粒表现出基本上没有核酸结合，这可以容易地通过比较所述颗粒在水溶液中280和260nm的吸光度(即280∶260吸光度比值)来测定。所提出的颗粒基本上不结合核酸，所述核酸是用来表达所述蛋白的生物体的细胞中原有的寡聚DNA和/或多聚DNA和RNA种类。所述核酸表现出260nm吸光度和在280nm相对少的吸光度，而蛋白例如所提出的嵌合体在260nm吸光度相对少，在280nm具有较大吸光度。
因此，重组表达的HBc颗粒或嵌合HBc颗粒(所述颗粒在残基150-183(或150-185)位含有富含精氨酸和富含赖氨酸的序列)在本领域有时称为鱼精蛋白区，所述颗粒280nm吸光度与260nm吸光度比值(280∶260吸光度比值)约为0.8。另一方面，颗粒在结构域IV中基本上不含精氨酸和赖氨酸残基，致使自我装配颗粒基本上没有核酸结合，所述颗粒例如以下没有富含精氨酸的核酸结合区的天然存在的HBc样颗粒，所述HBc样颗粒含有少于约10、优选少于约6、更优选少于3个精氨酸或赖氨酸残基或其彼此相邻的混合物。说明性的蛋白具有在约HBc残基165位、优选在约155、更优选在约140位至149位结束的天然序列或嵌合序列，其280∶260吸光度比值约0.9至约1.7。更典型的280∶260吸光度比值，对于在约165位结束的序列来说约0.9至约1.0，对于在约155结束的序列来说约1.1至约1.2，对于其在约140至约149位结束的序列来说约1.4至约1.7。其范围主要是因为给定的嵌合HBc颗粒的结构域II和IV中存在的芳族氨基酸残基数目。
所提出的嵌合HBc蛋白的结构域I构成起始为至少氨基酸残基5位至75位的HBc氨基酸残基序列，结构域III构成从86位至137位的HBc序列。来自任何哺乳动物嗜肝DNA病毒的序列都可用于结构域I和III，而且来自两种或更多种病毒的序列可以在一个嵌合体中使用。为了便于构建，优选在整个嵌合体中始终使用人ayw序列。
已经报道，具有结构域I(其含有最初3个氨基端(N端)残基的多于一个缺失)的HBc嵌合体导致在大肠杆菌细胞中完全缺乏HBc嵌合蛋白。Pumpens等，(1995)Intervirology，38：63-74。另一方面，最近进行了一项研究：其中将来自流感M2蛋白的免疫原性23聚体多肽融合到HBc N端序列，据该研究报道，当天然HBc序列残基1-4被取代时，所得融合蛋白形成颗粒。Neirynck等(1999年10月)NatureMed.，5(10)：1157-1163。因此，本领域认为，当添加的氨基酸序列以肽键连接HBc残基2-4之一时，颗粒可以形成，而如果不存在附加的序列并且多于残基1-3从HBc的N端缺失时，颗粒不能形成。
以肽键连接HBc N端的最初5个残基的N端表位序列可含有一个半胱氨酸残基或包括免疫原性序列的至多约30个残基的序列。1-3个半胱氨酸残基可以存在于所述序列方便的位置上，但是通常邻近添加序列的C端，使得相对于SEQ ID NO：1中所示的HBc N端来说，添加的N端半胱氨酸残基在约-20至约+1位，更优选在约-14至约+1位。示例性的序列包括如下讨论并举例的B细胞表位或T细胞表位(分别参见表A和表B)、来自流感M2蛋白23聚体多肽(Neirynck等，同上)(所述多肽包括2个半胱氨酸残基)以及含有至少约6个残基的序列变异体、另一种(异源)蛋白(例如由于所用表达系统而存在于融合蛋白中的β-半乳糖苷酶)的序列，或其它乙型肝炎相关序列例如来自PreS1区或PreS2区或主要HBsAg免疫原性序列。
结构域II是一个约5至约250个氨基酸残基的序列。在这些残基中，0个(没有)、优选至少4个残基、更优选至少8个残基构成HBc序列的76至85位的部分，并且1个至约245个残基、优选1个至约50个残基对HBc来说是异源(外源)的或者对应于免疫原性HBc序列例如B细胞表位或T细胞表位。
因此，至少HBc残基75和85分别存在于结构域I和II中。这些残基构成(i)例如B细胞表位或T细胞表位等表位的异源接头残基，或(ii)免疫原性B细胞表位或T细胞表位，其优选含有6至约50、更优选约15至约50、最优选约20至约30个氨基酸残基，并且其位置使得它们以肽键连接在0、或优选至少4、更优选至少8个残基，或HBc序列76至85位所有残基之间。免疫原性B细胞表位优选在此位置连接接头残基或者以肽键连接HBc序列，B细胞表位的用途说明性地讨论如下。
这些优选的至少4个HBc残基可以都在一个序列中(例如残基82-85)，或者可以分开在异源接头残基两侧(邻接)，其中存在残基76-77和84-85，或者其中存在残基76和83-85。更优选，结构域II含有HBc序列从残基76至85的至少8个残基。最优选76至85位的所有10个残基的序列都存在于所述嵌合体中。
添加到HBc环状序列的1个至约245个残基对HBc序列来说可以是异源的，或者可以对应于HBc序列的一个或多个免疫原性部分。一个添加的异源残基是如上所述的B细胞表位的异源接头残基。如上所述，通常长达至少6个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、更优选长约15至约50个残基的较长序列，是在包含免疫原(例如B细胞表位或T细胞表位)的序列中，除非是由限制位点编码的异源残基。
示例性的肽B细胞表位(用于所提出的嵌合体表达后连接接头残基并用于在HBc嵌合体内在一个或多个N端、在免疫原性环内或在所述嵌合体的C端表达)，以及所述基因(所述序列得自所述基因)的通用名称、已发表表位的文献或专利引文和SEQ ID NO.一并如下表A所示。
                                    表A
B细胞表位
生物体   基因   序列  引文*   SEQ ID NO
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)HIV口蹄疫病毒 PspA1PsP2P23GP120VP1 KLEELSDKIDELDAEQKKYDEDQKKTEE-KAALEKAASEEM-DKAVAAVQQAQDKPADAPAAEAPA-AEPAAQQDKPADARKRIHIGPGR-AFYITKNYNGECRYNRNA-VPNLRGDLQVL-AQKVARTLP 11234 910111213
  流感病毒A8/PR8甲型流感病毒(A8/PR8/34)乙型流感病毒鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)   HAM2NBV Ag YRNLLWLTEKSLLTEVETPIR-NEWGCRCNGSSDSLLTEVETPIR-NEWGCRCNDSSDSLLTEVETPIR-NEWGARANDSSDEQQSAVDADDS-HFVSIELESLLTEVETPIR-NEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIR-NEWGSRCNDSSDSLLTEVETPIR-NEWGCRSNDSSDSLLTEVETPIR-NEWGCRANDSSDSLLTEVETPIR-NEWGARCNDSSDMSLLTEVETPIR-NEWGCRCNDSSDMSLLTEVETPIR-NEWGSRSNDSSDMGISLLTEVETPIR-NEWGCRCNDSSD-ELLGWLWGIMSLLTEVETPIR-NEWGARANDSSDMSLLTEVETPIR-NEWGCRANDSSDMSLLTEVETPIR-NEWGARCNDSSDMSLLTEVETPIR-NEWGCRSNDSSDMSLLTEVETPIR-NEWGSRCNDSSDX1X2X3X4X5X6X7X8T-X10X11RX13X14X15X16X17X18-19X20X21-X22X23X24NNATFNYTNVNPISHIRDILKVIVDSMNHH-GDARSKLREELAE-LTAELKIYSVIQA-EINKHLSSSGTIN-IHDKSINLMDKNL-YGYTDEEIFKASA-EYKILEKMPQTTI-QVDGSEKKIVSIK-DFLGSENKRTGAL-GNLKNSYSYNKDN-NELSHFATTCSD 82929359 141516171819202122232425262728293031323334
  流感嗜血菌(Haemophilus inftuenzae)粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)间日疟原虫(Plasmodium vivax) pBOMPcopBHACSCS CSSSNNDAA-GNGAAQFGGYNKLGTVSYGEENDEAAYSKN-RRAVLAYLDIEKDKKK-RTDEQLQAE-LDDKYAGKGYLDIEKNKKK-RTEAELQAE-LDDKYAGKGYIDIEKKGKI-RTEAELLAE-LNKDYPGQGYGVSPKVCKDVTV-EGSNEFAPVQNLTRIQSTWRQKTV-DLPAGTKYVKAAIAPAKAAA-APAKAATAPA(NANP)4NANPNVDP-(NANP)3NVDPNANPNVDP-(NANP)3(NANP)3NVDPNANPNANPNVDP-(NANP)3NVDPNANPNPNVDP(NANP)3NVNPNVDP-(NANP)3NVDPNPNVDP(NANP)3-NVDPNANVDP(NANP)3NVNVDP(NANP)3NVDPNVDP(NANP)3-NVDPMADP(NANP)3NVDP(NANP)3NVDPDP(NANP)3-NVDPNAGDRADGQPAG- 1011121424 3536373839404142434445464748495051525354555657
柏氏疟原虫(Plasmodium berghi)约氏疟原虫(Plasmodium yoelli)表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)呼吸道合胞病毒(RSV)溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)日本血吸虫(Schistosoma japonicum)曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)牛抑制素 CSCSAgI/II侵染素G凝集素paraparaαc亚基   DRADGQPAGRADDRAAGQP-AGDGQPAGANGAGNQPG-ANGAGDQPGANGADNQPG-ANGADDQPGANGAGNQPG-ANGADNQPGANGAGNQPG-ANGADDQPGAPGANQEGGAA-APGANQEGGAAANGAGNQPGAN-GAGDQPGANGA-DNQPGANGADD-QPGDPPPPNPN-DPPPPNPN(QGPGAP)4KPRPIYEA-KLAQNQKAKADYEAK-LAQYEKDLKDRTLIEQKCSICSNNPT-CWAICKVECASTVCQNDN-SCPIIADVEKCNQDLQSEISLSLE-NGELIRRAKSA-ESLASELQRRVDDLQSEISLSLE-NSELIRRAKAA-ESLASDLQRRVDSTPPLPWPW-SPAALRLLQ-RPPEEPAA   202728216181921222230   585960616263646566676869707172737475
  埃博拉病毒(Ebola virus)大肠杆菌(Escherichia coli)阿尔茨海默病β-淀脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis) 膜锚定糖蛋白ST粉样蛋白PorA ATQVEQHRR-TDNDSTAHNTPVYKLD-ISEATQVEGKLGLITNTI-AGVAVLICCELCCYPACAGCNNTFYCCELCC-YPACAGCNSSNYCCELCC-YPACAGCNDAEFRHDSGYE-VHHQKLVFFAE-DVGSNKGAIIG-LMVGGVVIADAEFRHDSGYE-VHHQKLEDVGSNKGAIIDAEFRHDSGYE-VHHQKLVFFAE-DVGSNKGAIIGYVAVENGVAKKVAHFVQQTPKSQPTLVPHVVVNNKVATHVPPLQNIQPQVTKRAQAANGGAASGQVKVTKVTKAYVDEQSKYHAHFVQNKQNQPPTLVPKPSSTNAKTGNKVEVTKAYWTTVNTGSATTTTFVPYVDEKKKMVHAHYTRQNNADVFVPYYTKDTNNNLTLVPPPQKNQSQPVVTKAPPSKGQTGNKVTKGPPSKSQPQVKVTKAQPQTANTQQGGKVKVTKAQPQVTNGVQGNQVKVTKA 31313133333334 767778798081828384858687888990919293949596979899100101102
NspA免疫球蛋白E   QPSKAQGQTNNQVKVTKAPPSSNQGKQAQTGNTVTKAPPSKSQGKTGNQVKVTKAPPSKSQGTNNNQVKVTKAPPSKSQPGQVKVTKVTKAQLQLTEQPSSTNGQTGNQVKVT-KAQLQLTEAPSKSQGAASNQVKVT-KASAYTPAHVYVDNKVAKHVASAYTPAHFVQNKQNNNPTLVPVEGRNYQLQLTEPAQNSKSAYTPAQLQLTEPPSKNQAQTQNKVTKAGRDAFELFLLGSGSDERHANVGRDAFELFLLGSGSDEA-KGTDPLKNHGRDAFNLFLLGRIGDDDEGRNAFELFLIGSATSDQQVKVTKAKSRIRTKITLVPAVVGKPGSDHAKASSSLGSAKGFSPRTRYKNYKAPSTDFKLSLNRASVDLGGSDSFSQTGKVNTVKNVRSGELSAGVRVKGKVNTVKNVRSGELSVGVRVKAPEWPGSRDKRTLEDGQVMDVDSTTQEGELGHTFEDSTKKGGGHFPPTPGTINIFTPPTINHRGYWVGEFCINHRGYWVCGDPAMAPEWPGSRDKRTLMEDGQVMDVDMSTTQEGELMGHTFEDSTKKMGGGHFPPTMPGTINI   103104105106107108109110111112113114115116117118119120121122123124125126127128129130131132133134135136137138139140
乙型肝炎 表面PreS1PreS2 MFTPPTMINHRGYWVMGEFCINHRGYWVCGDPAMGTNLSVPN-PLGFFPDHQLDPPLGFFPDHPLGFFPDHQLMQWNSTAFHQ-TLQDPRVRG-LYLPAGGMQWNSTAFHQ-TLQDPMQWNSTALHQ-ALQDPQDPRVRQDGRVRDPRVRG-LYLPAGGDPRVRG-LYFPAGG 363637373839 141142143144145146147148149150151152153
*下表B中给出了已发表表位所引用的参考文献。
在以上SEQ ID NO：32的甲型流感M2序列中，
残基X1至X8不存在或存在，并且当存在时为天然存在于M2蛋白序列中的残基，即分别为甲硫氨酸、丝氨酸、亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、缬氨酸和谷氨酸，前提条件是当一个带下标X残基存在时，任何具有更高下标数至8的剩余下标X也存在，
残基X15和X16存在或不存在，并且当存在时，分别为色氨酸和甘氨酸，
残基X17和X19存在或不存在，并且当存在时，独立地为半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸，
残基X18存在或不存在，并且当存在时为精氨酸，和
残基X20至X24存在或不存在，并且当存在时，为天然存在于M2蛋白序列中的残基，即分别为天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，前提条件是当一个带下标X残基存在时，任何剩余的具有更低下标数至15的下标X也存在。
位于异源残基或序列两侧的结构域II的剩余残基是HBc的76-85位的残基。因此，在一个典型实例中，当78-82残基被取代时，结构域II中的嵌合序列是76-77，接着是限制位点编码残基、免疫原性(表位)序列、再是限制位点编码残基、然后是HBc序列84-85。通过78和79残基之间的插入策略制备而来的嵌合体典型的示例性序列是2-78位的HBc，接着是限制位点编码残基、免疫原性序列、再是限制位点编码残基和HBc序列79-85。其它跨越结构域I和II的所提出的嵌合体的序列从这些说明和下文中将会是显而易见的，不需列举。
已经发现，含有大量甘氨酸残基且长度约5至约9个残基的亲水性短肽可有助于含有所述序列的嵌合颗粒的表达，所述短肽以肽键连接上述脑膜炎奈瑟氏球菌B细胞表位序列的C端。一个有用的短肽公开于Karpenko等，Amino Acids(2000)18：329-337，其具有SEQID NO：144的序列GSGDEGG。
正如已经注意到的，异源无化学反应性的残基或用于缀合表位的接头可以以肽键连接HBc序列中的氨基酸残基76和85之间的位置。在免疫原性表位的情况下，残基76-85的HBc序列优选存在，但是被添加的一个或多个残基间隔开。该嵌合体优选包括4位至至少140位的HBc序列和一个邻近嵌合体蛋白N端或C端的半胱氨酸残基。更优选1-149位的HBc序列存在，但是在残基76和85之间被缀合表位的异源接头间隔开，而且所述嵌合分子含有C端半胱氨酸。
先前讨论了无化学反应性的残基。缀合表位的异源接头最优选为赖氨酸(K)残基。谷氨酸或天冬氨酸、酪氨酸和半胱氨酸残基也可用作接头残基，同样，酪氨酸和半胱氨酸残基也可以。人们注意到，可以存在不止一个接头，例如3个赖氨酸的序列，但是这样的用法并不是优选的，因为可以从这样的用法中形成不均一缀合物：其中缀合的半抗原在第一个嵌合体中键合一个接头并在第二个嵌合分子中键合一个不同的接头。美国专利第6,231,864 B1号公开了含有一个或多个连接残基但缺乏稳定的N端半胱氨酸残基的HBc嵌合分子。
人们也注意到，所提出的HBc嵌合体中存在的插入的无化学反应性的残基、接头残基或含有免疫原性表位的序列也可被(邻接)免疫原性(表位)序列一侧或两侧的“柔性连接臂”从HBc序列残基中分开。特别是在免疫原性序列长度大于约30个氨基酸残基的情况下。示例性的柔性连接臂序列通常含有约4至约10个甘氨酸残基，这被认为是允许插入序列从另外的凸出环状序列向外“凸出”并且进一步增加了构建体的稳定性。这些柔性连接臂类似于如上所述的涉及脑膜炎奈瑟氏球菌B细胞表位序列(例如SEQ ID NO：125的肽)。说明性的其它柔性连接臂序列公开于Kratz等(1999年3月)Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，96：1915-1920，并且用下列氨基酸残基序列加以说明：
GGGGSGGGGT    SEQ ID NO：155
GGGGSGGGG     SEQ ID NO：156。
在含有插入表位序列的C端使用以下序列，而其后的所述序列分别用在插入的免疫原性序列的N端和C端：
GSGDEGG       SEQ ID NO：154
GGGGSGGG      SEQ ID NO：157。
如上所述，结构域III构成从86至135位的HBc序列。因此，上述结构域I和II的说明性嵌合体的序列可以延伸，使得首先讨论的嵌合体具有从84位至140位的HBc序列，其次讨论的嵌合体具有从79位至140位的HBc序列。
结构域IV是这样一个序列，所述序列(i)包括从136至140位并任选至149位的HBc序列，(ii)含有0-3个半胱氨酸残基，和(iii)在免疫原性序列中的至多约100个氨基酸残基，所述免疫原性序列优选对165位至C端的HBc来说是异源的，前提条件是结构域IV含有从136至140位的HBc序列的至少5个氨基酸残基。结构域IV免疫原性序列更优选含有至多约50个氨基酸残基，最优选含有至多约25个残基。因此，结构域IV序列基本上可以是任何序列，除了从165位至C端的C端HBc序列之外。
结构域IV序列的长度可以是5个残基；也就是说136至140位残基，至多约125个氨基酸残基(至多约HBc 165位加上至多约100免疫原性序列的免疫原性残基)，所述残基包含至多总共3个半胱氨酸，其长度足以使得所提出的嵌合蛋白总长度约135个至约525个残基。当以肽键连接结构域I或II中的一个或两个的表位分别含有至多约30或约50个残基时，正如优选的那些表位，所述嵌合分子(包括结构域IV的表位)的更优选长度约170个至约250个残基。含有两个免疫原性表位的特别优选的嵌合分子长度为约190至约210个残基。通过如上所述测定280∶260吸光度比值，来确定所得颗粒未与核酸结合。
结构域IV序列可包括0-3个Cys残基。当存在时，优选一个或多个Cys残基在嵌合蛋白分子C端或在嵌合蛋白分子C端的约5个氨基酸残基内。另外，当不止一个Cys残基存在于结构域IV序列中，优选这些Cys残基彼此相邻。
优选结构域IV序列构成T细胞表位，生物体针对所提出的嵌合体的大量相同或不同的T细胞表位或额外的B细胞表位计划用作免疫原。同表A一样，下表B提供了示例性的结构域IV的T细胞表位序列，其中说明性的添加的C端半胱氨酸残基加有下划线。
                                          表B
  T细胞表位
  生物体   基因   序列*   引文  SEQ ID NO
  HIV白喉棒杆菌(Corynebacterium diptheriae)布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)流感病毒A8/PR8克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)间日疟原虫(P.vivax)约氏疟原虫(P.yoelii)表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)   P24毒素ospAHAMSP1AgI/II   GPKEPFRDY-VDRFYK CFQVVHNSYN-RPAYSPG CVEIKEGTVTLKRE-IDKNGKVTVSL CTLSKNISKSG-EVSVELND CSSVSSFERFE CLIDALLGDP CTLIDALLG CSHNFTLVASVII-EEAPSGNT CSVQIPKVPYPNGIVY CDFNHYYTLKTGLEAD CPSDKHIEQYKKI-KNSISCEYLNKIQNSLST-EWSPCSVTYLDKVRATVGTE-WTPCSVTEFVKQISSQLTE-EWSQCSVTKPRPIYEAKL-AQNQK CAKADYEAKLA-QYEKDL C 3567832321315232616 15159160161162163164165166167168169170171172173
LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)破伤风梭菌(Clostridium tetani)脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)乙型肝炎 NPtoxPorBPorBOpaBOpa-5dOpac表面PreS1PreS2 RPQASGVYM-GNLTAQ CQYIKANSKFIG-ITEL CAIWQVEQKASIAGTDSGWCNYKNGGFFVQYGGAYKRHCHMSQTEVAATLAYRFGNVCTPRVSYAHGFKGLVDDADCRFGNAVPRISYAHGFDFICAFKYARHANVGRNAFELFCSGAWLKRNTGIGNYTQINACAGEFGTLRAGRVANQCIGNYTQINAASVGLRCGRNYQLQLTEQPSRTCSGSVQFVPAQNSKSACHANVGRDAFNLFLLGCLGRIGDDDEAKGTDPCSVQFVPAQNSKSAYKCNYAFKYAKHANVGRDCAHGFDFIERGKKGENCGVDYDFSKRTSAIVSCHDDMPVSVRYDSPDFCRFGNAVPRISYAHGFDFIERGKKGENCNYAFKYAKHANVGRDAFNLFLLGCSGAWLKRNTGIGNYTQINAASVGLRCSGSVQFVPAQNSKSAYTPACTGANNTSTVSDYFRNRITCIYDFKLNDKFDKFKPYIGCLSAIYDFKLNDKFKPYIGCNGWYINPWSEVKFDLNSRCMGTNLSVPN-PLGFFPDHQLDPPLGFFPDHPLGFFPDHQLMQWNSTAFHQ-TLQDPRVRG-LYLPAGGMQWNSTAFHQ-TLQDPMQWNSTALHQ-ALQDPQDPRVRQDGRVR 172036，40363737 174175176177178179180181182183184185186187188189190191192193194195196197198199200201144145146147148149150151
*加有下划线的C( C)不是来自天然序列。
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在所提出的嵌合分子和颗粒中，优选存在从残基4到至少140位残基的HBc氨基酸序列。更优选存在从2至149位和约165位的序列。B细胞表位，当存在时，优选存在于残基76和85之间。正如已经注意的，至少一个半胱氨酸残基存在于结构域I的N端上或其附近，或者存在于其C端上或其附近。如上所述。一个或多个T细胞表位也可作为HBc序列N端或C端添加序列而存在。一种所提出的重组HBc嵌合体基本上不含结合核酸。一种含有添加的N端或C端Cys残基的所提出的嵌合体颗粒在形成后也比不含添加Cys的类似颗粒更稳定。
一种所提出的重组HBc嵌合分子通常存在并用作自我装配颗粒。这些颗粒由180-240个嵌合分子(90或120个二聚体对)、通常为240个嵌合分子组成，所述分子在二硫化物还原剂例如2-巯基乙醇存在下分解成蛋白分子，因此认为各分子主要通过二硫键结合在一起成为颗粒。
尽管不希望受到理论的束缚，但认为观察到所提出的HBc嵌合体增加的稳定性和在某些情况下增加的表达，是因为所述颗粒的嵌合蛋白分子之间形成N端胱氨酸二硫键。无论是否以半胱氨酸或胱氨酸形式存在，N端半胱氨酸残基都被称为半胱氨酸，因为这就是由核酸中存在的密码子所编码的残基，从所述核酸表达所述蛋白和装配颗粒。
这些颗粒类似于在HBV感染者体内观察到的颗粒，但是这些颗粒是非感染性的。一旦在各种原核宿主和真核宿主中表达，各个重组HBc嵌合分子在宿主中装配成颗粒，所述颗粒可以容易地从宿主细胞中收获并纯化，如果需要的话。
如上所述，HBc优势免疫环通常位于从所述完整蛋白氨基端(N端)起约75至85位。将结构域II中含有免疫原性表位的序列插入到优势免疫环状序列中。这样的插入可基本上消除HBc环状序列的HBc免疫原性，而在装配的嵌合体颗粒中的极强免疫原性位置上存在免疫原性序列或接头残基。
除了上述N-截短和C-截短、各种表位和间隔基的插入外，所提出的嵌合分子在构成HBc结构域I、II、III和IV的氨基酸残基中也可含有保守取代。保守取代的定义同上。可以观察到一个说明性的保守取代：在2和3位(天冬氨酸和异亮氨酸；DI)残基被谷氨酸和亮氨酸(EL)残基取代，所述残基由EcoRI限制位点编码，所述限制位点用于添加编码所需N端表位(包括N端半胱氨酸残基)的核酸。
提出更罕见的“非保守”变化，例如用色氨酸取代甘氨酸。类似的小变化也可包括氨基酸缺失或插入，或两者都包括。采用本领域众所周知的计算机软件例如LASERGENE软件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)，可以知道如何确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失，而不会破坏生物学活性或颗粒形成。
本发明嵌合分子的HBc部分即具有HBc序列的部分，具有不同于作为限制酶人工产物的添加的表位、接头、柔性连接臂或异源残基的序列或残基，最优选具有图1(SEQ ID NO：1)中所示的亚型ayw的氨基酸残基序列，较小的任何部分或亚型ayw序列因一端或两端截短而不存在的部分。通常该序列是HBc的2至149位序列。优选程度稍低的是亚型adw、adw2和adyw的相应氨基酸残基序列，也示于图1(SEQ ID NO：2、3和4)。优选程度更低的是排在2至149位的土拨鼠和地松鼠序列，是图1中的最后两个序列(SEQ ID NO：5和6)。正如别处所述，可以在一个嵌合体中一起使用来自不同哺乳动物HBc蛋白的不同序列部分。
当上述本发明嵌合分子的HBc部分具有不同于对应2至约165位的哺乳动物HBc分子的序列时，与SEQ ID NO：1从2至165位相比，不大于约20％的氨基酸残基被取代。与SEQ ID NO：1从2至165位相比，优选不大于约10％、更优选不大于约5％、最优选不大于约3％的氨基酸残基被取代。
因此，一个所提出的164个HBc残基的嵌合体可含有至多约32个、优选含有约16个不同于SEQ ID NO：1的2至165位残基的残基。更优选约8个残基不同于残基2-165位的ayw序列(SEQ ID NO：1)，最优选约5个残基不同。优选不在结构域II的优势免疫环或末端、而在所述嵌合分子的非螺旋部分的取代，并且通常在残基2至约15和残基24至约50之间，以有助于保证颗粒形成。参见Koschel等(1999年3月)，J.Virol.，73(3)：2153-2160。
当HBc序列在C端超过165位被截短或者在N端被截短，或者在免疫原性环中含有一个或多个缺失时，取代残基数目会按比例减少，因为序列总长度小于164个残基。为了计算的目的，在所述分子其它位置的缺失被认为是保守取代。
在本发明的再一方面，在HBc 48位和107位的一个或优选两个半胱氨酸残基被其它残基取代，所述其它残基例如优选在任何上述HBc嵌合分子中的丝氨酸残基。在37℃下在20mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)贮存14天后，这些自我装配的颗粒比除了在48位和107位含有两个半胱氨酸残基之外其他方面都相同的HBc嵌合分子所形成的颗粒更稳定。因此，当残基48位和107位的一个或者更优选两个半胱氨酸都不存在时，增强了另外因N端半胱氨酸或C端半胱氨酸或它们两者存在而稳定化的颗粒的贮存稳定性。
因此，在所有所提出的嵌合分子中，通常在48位和107位存在的HBc半胱氨酸残基被其它残基(例如丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)取代，并且所提出的嵌合分子含有至少一个N端半胱氨酸残基或C端半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基对HBc序列来说并不是天然的。因此，在一些实施方案中，优选结构域I的HBc序列包括5位至75位残基以及至少一个N端半胱氨酸残基。在其它实施方案中，优选所提出的嵌合分子不仅含有N端半胱氨酸残基，而且如上所述在结构域IV内也含有一个单独的半胱氨酸残基或者在氨基酸残基序列中的半胱氨酸残基。在又一些实施方案中，优选的嵌合分子仅含一个或多个C端半胱氨酸残基，并且结构域I不含非HBc半胱氨酸残基。HBc半胱氨酸残基存在于图1中各HBc序列的约61位。
嵌合体的制备
通常用众所周知的重组DNA技术，制备所提出的嵌合HBc免疫原。因此，向编码HBc的前体序列上添加入或从中缺失编码特定多肽序列的核酸序列，以形成编码所提出的嵌合体的核酸。
说明性的所提出的嵌合免疫原通常使用存在于甲型流感M2序列中的半胱氨酸残基作为N端半胱氨酸。下文讨论了通过体外诱变编码HBc分子的多核苷酸来制备所述嵌合分子的引物。当含有半胱氨酸的M2多肽表位在N端不存在时，可以通过体外诱变，采用仅编码M2多肽的含有半胱氨酸部分的引物，或者就编码一个N端起始序列(例如Met-Cys-或Met-Gly-Cys-)的引物，来提供N端半胱氨酸。
在本发明的再一方面，将重组生产的免疫原性嵌合体颗粒给予HBV感染者，同时给予重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。重组乙型肝炎表面抗原可任选含有PreS1区或PreS2区中的一个或两个都含有。
乙型肝炎表面抗原的制备方法是本领域众所周知的。用酵母生产重组乙型肝炎表面抗原的实例描述于美国专利第4,977,092号。HBc嵌合体颗粒和HBsAg可以放在同一容器中或者可以作为一个药盒，其中HBc嵌合体颗粒放在一个容器中，HBsAg放在第二个容器中，两者在注射前混合。一个优选的HBsAg剂量约10μg至约100μg，最优选约20μg至约50μg。HBsAg任选配制在氢氧化铝凝胶中。在一个优选的使用方法中，联合给予HBc颗粒和HBsAg以及佐剂例如MPL或RC-529。
免疫后，让所述患者保持足够时间以诱导针对HBc嵌合体颗粒的免疫应答。维持时间通常持续约3周至约12周的时间，并且可以包括一次加强免疫，即用所述疫苗进行第二次免疫。也提出后来的加强给药。
在如下所述的ELISA测定中，通过从免疫患者体内获取血浆或血清样品并测定其中抗体结合合适抗原(例如合成的HBsAg多肽抗原)的能力，或者通过另一种免疫测定(例如本领域众所周知的蛋白质印迹法)，容易确定抗HBsAg或其它抗体的产生。
以下两个策略都优选用于将免疫原性表位序列、化学反应性接头残基序列或无化学反应性序列插入到环状序列中。第一个策略是取代，其中编码优势免疫环部分的DNA被切下，并用编码免疫原性表位(例如B细胞序列)的DNA来取代。第二个策略是插入，其中将免疫原性表位插入到所述环的相邻残基之间。
在一个示例性取代方法中，用聚合酶链式反应(PCR)，采用定点诱变，以提供编码一对不同的限制位点(例如EcoRI和SacI)的嵌合HBcDNA序列，所述限制位点之一邻近编码优势免疫环的DNA的两端。示例性的被取代的残基是76至81。编码环的部分被切下，编码免疫原性B细胞表位的所需序列连接到限制位点，并用所得DNA表达HBc嵌合体。参见例如Pumpens等，(1995)Intervirology，38：63-74中的表2中该项技术的示例性用途。
或者，一个限制位点或两个位点可以编码成定点诱变区，用限制酶切割该DNA，以提供“粘”端。粘端可用于连接或者用核酸内切酶制成平端，然后将平端异源DNA区段连接到切割区。这类将序列取代到HBc中的实例可以在Schodel等，(1991)F.Brown等编著，Vaccines 91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork，第319-325页；Schodel等，Behring Inst.Mitt.，1997(98)：第114-119页和Schodel等，J.Exp.Med.，(1994)180(3)：第1037-4页中报告的工作中找到，后两篇论文分别讨论了抗约氏疟原虫(P.yoelii)和柏氏疟原虫(P.berghei)疫苗的制备。
HBc免疫原性环内的插入位置和环残基的存在对免疫原活性来说是重要的。因此，正如上述已公开的PCT申请PCT/US01/25625和PCT/US01/41759所述，疟疾B细胞表位在HBc残基78和79位之间的位置提供了颗粒免疫原，所述免疫原的免疫原性比位于残基76和81之间切下并替代的区域中相同的免疫原要高10-1000倍。另外，残基78和79之间插入相同的疟疾免疫原，与残基77和78之间插入的相比，提供意想不到的增加的免疫原性，约为15倍。
因此，总的来讲优选插入。在一个说明性的插入策略的实例中，用定点诱变产生彼此相邻的且位于编码相邻氨基酸残基(例如在残基78和79位)密码子之间的两个限制位点。该技术在HBc环内上述相邻残基之间添加了编码4个氨基酸残基(2个用于限制位点)的12个碱基对。
在用限制酶进行切割、连接编码免疫原性B细胞表位序列的DNA以及该DNA表达形成HBc嵌合体之后，可以看到，HBc环状氨基酸序列在其N端侧被2个由5′限制位点编码的残基间隔开、接着向C端方向是免疫原性B细胞表位序列、接着又是两个由3′限制位点编码的免疫原性非环状残基，然后是环状序列剩余部分。这一同样策略可用于将N端半胱氨酸或N端免疫原性序列插入到结构域I中，正如Neirynck等，(1999年10月)Nature Med.，5(10)：1157-1163中报道的一样，或者用于将T细胞表位或一个或多个半胱氨酸残基插入到结构域IV中。Schodel等，(1990)F.Brown等编著，Vaccines 90，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，第193-198页中报道了采用在残基82和83之间插入的类似策略。
更具体地讲，编码C端截短的HBc序列(例如HBc149)的DNA序列经工程改造，使其在残基78和79之间含有相邻EcoRI和SacI位点。用这两种酶切割该DNA，提供一个编码HBc 1-78位3′-端带有EcoRI粘端的片段，而其它片段具有5′-端SacI粘端并编码79-149位残基。将具有5′AATT突出端的合成核酸、接着是编码所需B细胞表位的序列和AGCT 3′突出端连接起来，提供编码B细胞表位的HBc嵌合体序列，所述表位每侧都邻接两个在残基78和79之间的异源残基[分别为GlyIle(GI)和GluLeu(EL)]，同时通常破坏EcoRI位点而保留SacI位点。
将含有半胱氨酸的序列插入到结构域IV中的类似策略，例如疟疾T细胞表位，所述表位含有从326位至345位的恶性疟原虫(P.falciparum)CS蛋白序列并在本文中称为PF/CS326-345(Pf-UTC)。此时，将EcoRI和HindIII限制位点工程改造，使之置于氨基酸残基149位之后的HBc DNA序列中。用EcoRI和HindIII消化后，将具有上述AATT 5′突出端的合成DNA、接着是T细胞表位编码序列、一个或多个终止密码子和3′AGCT突出端连接到经消化的序列上，形成编码HBc残基1-149、接着是两个异源残基(GI)、终止密码子和HindIII位点的序列。
采用具有SacI限制位点、接着是在残基79位编码HBc起始的序列的正向引物，进行PCR扩增，然后用SacI和HindIII消化，提供编码HBc 79-149位加上两个添加的残基和C端T细胞表位的序列。用SacI消化该构建体，然后连接，提供编码所需重组HBc嵌合体免疫原的完整基因，所述免疫原从HBc 1-78位的N端起具有这样的序列：两个添加的残基、疟疾B细胞表位、两个添加的残基、HBc 79-149位、两个添加的残基和T细胞表位，如图2C所示。
可以采用类似技术，将连接B细胞表位的异源接头残基放入环区序列中。所提出的接头残基包括特别优选的赖氨酸(Lys)以及天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和酪氨酸(Tyr)。
人们注意到，SEQ ID NO：1中所示的氨基酸残基序列在77和78位含有Glu和Asp残基。尽管如此，仍可提出额外的、异源的、含羧基残基的引入。其它因素可以降低原有谷氨酸和天冬氨酸的化学反应性。例如，本领域已经知道，相邻脯氨酸(例如在79位上发现的)可以中和并因而降低邻近羧基的化学反应性。
此时，采用首次提到的插入策略，将5个异源残基插入到所述环状序列中；一个是用于缀合B细胞表位的异源接头残基，而邻近这个残基两侧的两个残基本上身也邻近环状序列残基并且是所述插入限制位点的表达产物(限制酶人工产物)。人们注意到，也可以用定点诱变，将单个密码子添加到编码B细胞表位的异源接头残基的HBc环状序列中。
人们注意到，优选使用在(邻接)B细胞表位或T细胞表位两侧的两个异源残基是方便的。结果，也可以在插入序列的一侧或两侧采用不是HBc序列部分的0-3个或更多个添加的残基。插入序列和HBc核酸的一端或两端可以被合适的核酸酶(例如S1核酸酶)“逐个切掉(chewed back)”，以提供可以连接在一起的平端。添加的异源残基既不是插入的B细胞表位或T细胞表位的部分，也不是HBc序列的部分，因此所述添加的异源残基不计入到所述结构域中存在的残基数，除非这些残基是已存在的残基的保守取代，正如下文讨论的某些构建体中的残基GluLeu取代AspIle一样。
人们也注意到，采用众所周知的合成方法，可以合成所需重组HBc嵌合体核酸的全部或部分，所述合成方法如同美国专利第5,656,472号中讨论和说明的合成编码烟草(Nicotiana tabacum)59个残基的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶信号肽的177个碱基对DNA的方法一样。例如，可以合成具有平端或“粘端”的结构域I和II，所述平端或“粘端”可用于连接结构域III和IV，以提供表达所提出的HBc嵌合体的构建体，所提出的HBc嵌合体在B细胞表位N端侧含有0个添加的残基，而在C端侧或在结构域II/III连接部位或在其它所需位置上含有0-3个添加的残基。
Clarke等(1991)F.Brown等编著，Vaccines 91，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，第313-318页报道了一个替代的插入技术。此时，采用了遗传密码简并性的优点，这些研究者改造了一个限制位点，该位点对应于编码存在于这些位点的原来残基的残基80和81。因此，这些已表达的HBc嵌合体不含编码限制位点的残基，而含有紧邻插入序列的HBc环的残基。
本文也提出编码上述HBc嵌合分子或该编码序列的互补序列的核酸序列(区段)。在一些优选的实施方案中，所述核酸片段以分离纯化形式存在。
在活的生物体中，蛋白质或多肽的氨基酸残基序列通过遗传密码与编码蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)基因序列直接相关。因此，通过众所周知的遗传密码的简并性，可以按需要制备另外的DNA序列和相应RNA序列(核酸)，所述另外的DNA和相应RNA序列编码相同的嵌合体氨基酸残基序列，但是与上述基因序列完全不同，以至于这两个序列在高严格性条件下不杂交，而在中等严格性条件下才会杂交。
高严格性条件可定义为包括在约50-55℃的温度下在6XSSC中杂交，并且最后在68℃温度下在1-3XSSC中洗涤。中等严格性条件包括在约50℃至约65℃下在0.2-0.3M NaCl中杂交，接着在约50℃至约55℃的温度下在0.2X SSC、0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)中洗涤。
以下核酸序列(DNA序列或RNA序列)：(1)自身编码或其互补序列编码其HBc部分从残基4至136位的嵌合分子，当存在时，是SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6；和(2)至少在中等严格性条件(如上所述)下与SEQ ID NO：202、203、204、205、206或207的DNA序列杂交；和(3)其HBc序列与SEQ ID NO：202、203、204、205、206和207的DNA序列共享至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、最优选100％的同一性，所述HBc序列定义为DNA变异体序列。众所周知，当有效连接合适的启动子时，核酸序列例如所提出的核酸序列可在如本文其它地方所述的合适的表达系统中表达。
编码所提出的嵌合分子的类似物或类似核酸(DNA或RNA)序列也提出作为本发明的一部分。一个嵌合体类似核酸序列或其互补核酸序列编码HBc氨基酸残基序列，所述HBc氨基酸残基序列与SEQID NO：1、2、3、4、5或6中所示的HBc序列从残基4位至残基136位的部分至少有80％、更优选至少90％、最优选至少95％的同一性。该DNA或RNA在本文中称为“类似于”SEQ ID NO：202、203、204、205、206和207的核酸序列或其“类似物”，并且在中度严格性杂交条件下，与SEQ ID NO：202、203、204、205、206和207的核酸序列或其互补序列杂交。编码类似序列的核酸，当适当转染和表达后，也会产生所提出的嵌合体。
不同宿主对用于编码特定氨基酸残基的特定密码子通常具有偏好性(preferences)。所述密码子偏好性是众所周知的，而且，采用例如体外诱变，可以改变编码所需嵌合体序列的DNA序列，使得宿主偏好密码子用于表达所述酶的特定宿主。另外，也可以利用遗传密码的简并性，来编码SEQ ID NO：202、203、204、205、206或207序列的HBc部分，以避免与SEQ ID No：1、2、3、4、5或6的DNA或其互补序列的显著同一性。因此，一个有用的类似DNA序列在中等严格性条件下，不必与SEQ ID NO：202、203、204、205、206或207核苷酸序列或互补序列杂交，但仍可以提供所提出的嵌合分子。
在本发明中也提出重组核酸分子例如DNA分子，所述分子包含有效连接外源核酸区段(例如DNA区段或序列)和启动子的载体，所述外源核酸区段限定了编码上述所提出的嵌合体的基因，而所述启动子适合于驱动该基因在相容性宿主生物中的表达。更具体地讲，也提出包含载体的重组DNA分子，所述载体包含有效连接DNA区段的启动子，所述启动子用于驱动嵌合体在宿主生物细胞中表达，所述DNA区段限定了嵌合体或DNA变异体的HBc部分基因，所述变异体与SEQ ID NO：202、203、204、205、206或207的嵌合体基因具有至少90％的同一性，并且与该基因在中度严格性条件下杂交。
还提出重组DNA分子，所述分子包括含有有效连接DNA区段的启动子的载体，所述启动子用于驱动嵌合体在宿主生物细胞中的表达，所述DNA区段是编码HBc嵌合体部分氨基酸残基序列的类似核酸序列，所述编码HBc嵌合体部分氨基酸残基序列与SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6序列的HBc部分具有至少80％同一性、更优选90％同一性、最优选95％同一性。当适当转染并在宿主细胞中表达后，该重组DNA分子提供所提出的嵌合分子。
人们注意到，因为地松鼠HBc N端序列30个氨基酸残基与其它任何HBc序列都不能比对，其序列及其编码核酸序列及其互补序列都不包括在以上的百分同一性内，而且也不是用于杂交测定的编码30个残基序列或其互补序列的核酸的部分。同样，在HBc N端和C端的一端或两端截短的序列也不包括在百分同一性计算中，而且也不是其中去除优势免疫环残基以便用于插入免疫原性表位的序列。因此，仅包括嵌合分子中存在的HBc编码碱基或HBc序列残基，并且在百分同一性计算中与比对的核酸或氨基酸残基序列进行比较。
由于本文公开的基因的编码序列示于SEQ ID NO：172、173、174、175、176和177，因此分离的核酸区段、优选DNA序列、变异体及其类似物都可以通过体外诱变来制备，这是本领域众所周知的，在 Current Protocols In Molecular Biology，Ausabel等编著，JohnWiley & Sons(New York：1987)第8.1.1-8.1.6页中有讨论，它开始于基因的起始ATG密码子，结束于每个基因的终止密码子或正好在其下游。因此，所需限制位点可以在起始密码子或其上游进行改造，或者在终止密码子或其下游进行改造，使得可以制备、切除和分离其它基因。
正如本领域众所周知的，只要存在所需的核酸、说明性的DNA序列(包括起始信号和终止信号)，则添加的碱基对通常会存在于所述区段的两端，并且所述区段仍可以用于表达蛋白。这当然推测有效连接DNA序列的区段不存在，所述DNA序列抑制表达、表达另一种消耗需要表达的酶的产物、表达消耗需要由这个所需酶产生的反应产物的产物，或者干扰所述DNA区段的基因的表达。
因此，只要DNA区段不含这样的干扰DNA序列，本发明的DNA区段长度可以约500至约15,000个碱基对。重组DNA分子、特别是表达载体的最大尺寸主要取决于方便和宿主细胞可以容纳的载体大小，必要时，只要复制和表达所需的所有最小DNA序列都存在即可。最小载体尺寸是众所周知的。这样长度的DNA区段不是优选的，但仍可以使用。
可以通过化学技术，合成编码上述嵌合体的DNA区段，所述技术例如Matteucci等(1981)J.Am.Chem.Soc.，103：3185的磷酸三酯法。当然，通过化学合成编码序列，可以通过取代编码天然氨基酸残基序列的合适碱基，即可简单地进行任何所需修饰。然而，优选包括上述序列的DNA区段。
所提出的HBc嵌合体可在各种转化宿主系统中、通常在宿主细胞中产生(表达)，尽管如此其还可在无细胞情况下表达，所以也提出了体外系统。这些宿主细胞系统包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒)或用细菌表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者适当转化的动物细胞系统例如CHO、VERO或COS细胞。本发明并不限于所用的宿主细胞。
含有编码HBc嵌合体的基因的DNA区段优选得自含有该基因的重组DNA分子(质粒载体)。能够指导嵌合体基因表达成为HBc嵌合体蛋白的载体在本文被称为“表达载体”。
表达载体含有包括启动子在内的表达控制元件。嵌合体编码基因有效连接表达载体，使得启动子序列指导RNA聚合酶结合并表达嵌合体编码基因。用于表达多肽编码基因的是启动子，所述启动子是诱导型启动子、病毒启动子、合成启动子、组成型启动子，正如Poszkowski等(1989)EMBO J.，3：2719和Odell等(1985)Nature，313：810所述，并且被时间调节、空间调节和时空调节，正如Chua等(1989)Science，244：174-181所述。
一个优选的用于原核细胞例如大肠杆菌的启动子是Rec 7启动子，该启动子被外源提供的萘啶酮酸所诱导。一个更优选的启动子存在于质粒载体JHEX25(得自Promega Corp.，Madison WI)中，所述启动子被外源提供的异丙基-β-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷(IPTG)所诱导。一个再更优选的启动子即tac启动子存在于质粒载体pKK223-3中，也可被外源提供的IPTG所诱导。使用约25μM至约100μM IPTG进行诱导，pKK223-3质粒可以在各种大肠杆菌菌株(例如XL-1、TB1、BL21和BLR)中成功表达。令人吃惊的是，已经发现，约25μM至约50μM浓度的IPTG在2L摇瓶和发酵罐中能提供最优化结果。
在已公布的上述申请WO 02/14478 A2中，详细讨论了所提出的嵌合分子在以下生物内的表达：其他微生物例如沙门氏菌属(Salmonella)如伤寒沙门氏菌(S.typhi)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌的杂合体，酵母例如酿酒酵母(S.cerivisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，单子叶植物细胞和双子叶植物细胞、通常和特别是当需要口服疫苗或接种时在双子叶植物储藏器官例如根、种子或果实，以及昆虫细胞例如通过使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)或杆状病毒得到的S.Frugiperda细胞或粉纹夜蛾属(Trichoplusia)。尽管这些表达模式是所提出的，但是在本文中将不再作进一步讨论。
已经开发了各种方法，通过互补的粘端或平端，使DNA有效连接载体。例如可以将互补的同聚物序列段添加到有待插入到载体DNA中的DNA区段中。然后，将载体和DNA区段通过互补的同聚体尾之间的氢键连接，形成重组DNA分子。
或者，可以使用含有一个或多个限制性内切核酸酶位点的合成接头，将DNA区段连接至表达载体上，如上所述。将合成接头连接到平端的DNA区段上，即在能催化该平端DNA分子连接的酶(例如噬菌体T4 DNA连接酶)存在下，通过将平端DNA区段与大量过量的合成接头分子一起孵育。
因此，反应产物是在其末端携带合成接头序列的DNA区段。然后，用合适的限制性内切核酸酶切割这些DNA区段，然后连接到表达载体中，所述载体已经采用产生与所述合成接头相匹配的末端的酶进行切割。含有各种限制性内切核酸酶位点的合成接头可得自各种商业来源，包括New England BioLabs，Beverly，MA。也可采用PCR技术，获取所需DNA区段，在所述PCR技术中，正向引物和反向引物均含有扩增后可以被切割的所需限制位点，使得可以将基因插入到载体中。或者，正如本领域众所周知的，PCR产物可以直接克隆到含有T突出端的载体(Promega Corp.，A3600，Madison，WI)中。
表达的嵌合蛋白在宿主细胞中自我装配成颗粒，无论是在单细胞还是在多细胞宿主中的细胞中。用标准技术收获含有颗粒的细胞，然后用弗氏压碎器、溶菌酶、超声波仪、玻珠打浆机或显微流体装置(microfluidizer)(Microfluidics International Corp.，Newton MA)来裂解细胞。细胞裂解液经澄清后，用45％硫酸铵沉淀颗粒，重悬浮于20mM磷酸钠(pH 6.8)中，针对相同的缓冲液进行透析。用快速离心澄清透析物，然后上清液用琼脂糖CL-4B进行凝胶过滤层析。鉴别含有颗粒的流分，进行羟基磷灰石层析，再用硫酸铵沉淀，然后重新悬浮、透析和过滤除菌并贮存于-70℃。
HBc嵌合体缀合物
可以化学(共价)连接物质的嵌合HBc颗粒也构成本发明的一部分。具体地讲，对应于HBV表面抗原的肽序列可以共价结合嵌合颗粒。非HBV序列也可以有利地与HBc嵌合体缀合。或者，非肽化合物可以有利地与HBc嵌合体颗粒缀合。所述非肽化合物可包括寡核苷酸、糖类、免疫刺激性烷基化糖类。
任何化学反应性部分(半抗原)可以连接到所提出的HBc嵌合体或嵌合体颗粒上，所述嵌合体颗粒例如在结构域II的环状区含有赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸、半胱氨酸或酪氨酸等异源接头残基的嵌合体颗粒。目标分子通常是B细胞免疫原，但也可以是使所述嵌合体靶向免疫系统专一性受体或细胞的免疫刺激分子或肽序列。共价结合的半抗原可以是多肽、蛋白质、寡核苷酸、碳水化合物(糖；即寡糖或多糖)或非多肽化合物、非碳水化合物的化合物例如2，4-二硝基苯或药物例如可卡因或尼古丁。
如此形成的HBc嵌合体颗粒缀合物用作接种物或疫苗，如下文所述。因为嵌合蛋白在表达后自我装配，而且表达后形成缀合物，与游离蛋白分子相比，通常用装配颗粒进行缀合物的形成。
通过蛋白或多肽的氨基酸残基侧链将各个半抗原分子有效连接到所述蛋白或多肽上，以形成悬挂连接的免疫原性缀合物(例如支链多肽聚合物)的方法在本领域是众所周知的，并且在2002年2月21日公布的PCY WO 02/14478 A2中有详细介绍。
接种物和疫苗
优选将呈颗粒形式的上述重组HBc嵌合体免疫原溶解或分散在免疫原性有效量的药物可接受的溶媒组合物中，以制成接种物或疫苗，所述组合物优选是水溶液。当给予需要诱导抗体的宿主动物或患有慢性乙型肝炎病毒感染并因此需要免疫的宿主动物(例如哺乳动物(例如小鼠、狗、山羊、绵羊、马、牛、猴子、猿或人类)或鸟(例如鸡、火鸡、鸭或鹅))时，接种物诱导抗体，所诱导的抗体与添加的B细胞表位(例如存在于免疫原中的Pre-S2 B细胞表位)发生免疫反应。在疫苗中，这些诱导的抗体也被认为在体内与病毒或病毒感染的细胞发生免疫反应(与病毒或病毒感染的细胞结合)，保护宿主不受流感感染。接种物在免疫宿主动物体内可以诱导活化T细胞的产生，但是这些活化T细胞没有保护性，而疫苗诱导的活化T细胞能保护宿主。
因此，在一种动物中是疫苗的组合物，对另一种宿主来说可以是接种物，因为在未感染甲型流感的第二种宿主中诱导抗体。在此情况下，据信，HBV慢性携带者主要通过活化T细胞而得到保护。
每次免疫中重组HBc嵌合体免疫原的用量称为免疫原性有效量，该用量可以在宽范围内变动，取决于重组HBc嵌合体免疫原、免疫的动物宿主和疫苗中存在的佐剂，如下所述。疫苗和接种物的免疫原性有效量分别提供保护性或抗体活性，如上所述。
疫苗或接种物通常含有重组HBc嵌合体免疫原，其浓度为每次接种(单位剂量)约1微克至约1毫克，优选每单位剂量约10微克至约50微克。免疫小鼠通常含有10μg或20μg嵌合体颗粒。
在本发明的一个优选实施方案中，将嵌合HBc颗粒或悬挂连接半抗原的嵌合颗粒以诱导T细胞活化的方式给予慢性感染乙型肝炎病毒的患者。所述治疗包括重复注射给药。最优选的给药方法包括肌内或皮下注射，但是替代的优选方法包括皮内给药。可以使用例如Powderject Pharmaceuticals，Plc(Oxford，England)开发的设备，通过颗粒轰击，进行皮内给药，或者可以通过使用贴剂来进行皮内给药。
优选用于给予免疫原性颗粒的贴剂具有多个约50微米至约1000微米长的短小突起，这些突起可以刺入表皮，提供免疫原性颗粒从贴剂进入真皮的通道。朗格汉斯细胞(Langerhans cell)活化剂优选与皮内给药同时给予。活化剂包括樟脑、二甲基亚砜和邻苯二甲酸二苯酯。如果通过肌内或皮下注射给药，优选在Th-1启动佐剂存在下给予嵌合HBc分子颗粒。
给予患者一个或多个剂量的嵌合颗粒。所述颗粒的剂量优选约10μg至约500μg，最优选约20μg至约100μg，以诱导增强的抗乙型肝炎病毒的T细胞应答。抗病毒免疫应答的增强可以通过T细胞应答和/或B细胞应答来测量。所提出的方法的结果是，与患者原先的未经处理的应答相比，患者体内增强了两种抗HBV应答中的一种或两种。
在本发明的一些方面，免疫方案可包括所有或部分HBsAg分子，包括Pre-S1区和Pre-S2区。可以在同一天或隔天一起、单独给予这样的免疫，或者作为一个免疫原的几次免疫、接着是其他免疫原的几次免疫的系列给药。
可以通过多种技术测定T细胞活化。在常规实践中，用所提出的HBc嵌合体颗粒疫苗或接种物接种宿主动物，然后收集外周单核血细胞(PMBC)。然后，将这些PMBC在T细胞免疫原存在下，体外培养约3-5天。在抗HBV的T细胞应答的情况下，T细胞免疫原可以是HBsAg、HBc或其片段。然后，可以分析培养PMBC的增殖或例如IL-2、GM-CSF或IFN-γ等细胞因子的分泌。T细胞活化的测定是本领域众所周知的。参见例如美国专利第5,478,726号及其中引用的技术。
测定B细胞应答就是测定抗体。就HBV而言，抗表面抗原的抗体(包括pre-S1区和pre-S2区)的出现是增强的免疫应答的指标。
疫苗通常含有重组HBc嵌合体免疫原，其浓度为每次接种(单位剂量)约1微克至约1毫克，优选每单位剂量约10微克至约50微克。术语“单位剂量”当涉及本发明的疫苗或接种物时，是指适于作为动物单位剂量的物理上分离的剂量，每单位含有预定量的活性物质，所述预定量是根据单独或与所需稀释剂(即载体或溶媒)共同产生所需免疫原性效应而计算出来的。
通常从回收的重组HBc嵌合体免疫原制备疫苗，即通过将免疫原(优选以颗粒形式)分散在生理可耐受(可接受)的稀释用溶媒例如水、盐水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、乙酸缓冲盐溶液(ABS)、5％甘露醇溶液、林格溶液等中，以形成含水组合物。稀释用溶媒也可包括如下文所述的油性材料，例如花生油、角鲨烷或角鲨烯。溶媒还可含有如下文所述的免疫刺激分子。
含有蛋白类材料作为活性成分的疫苗的制备方法也是本领域众所周知的。通常，这类疫苗制成供胃肠外用，或者可以呈液体溶液剂或者可以是混悬剂；也可制备适于在注射前配成溶液剂或混悬剂的固体形式。制剂也可以被乳化。
免疫原性活性成分通常与药物可接受的并与其活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，如有必要，接种物或疫苗可含有少量辅料，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂，这些辅料可以增强所述组合物的免疫原性效力。
所提出的疫苗最好还包括佐剂。用于本发明的疫苗和接种物的合适的佐剂包括能够增强针对嵌合体B细胞表位的抗体应答的佐剂，以及能够增强针对嵌合体中含有的T细胞表位的细胞介导应答的佐剂。佐剂是本领域众所周知的(参见例如 Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach，1995，Pharmaceutical Biotechnology，第6卷，Powell，M.F.和Newman，M.J.编著，Plenum Press，New York andLondon，ISBN 0-306-44867-X)。
示例性的佐剂包括不能用于人体的完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、角鲨烯、角鲨烷和明矾[例如AlhydrogelTM(Superfos，Denmark)]，这些都是本领域众所周知的材料，可以从若干市售来源获得。
优选与本发明免疫原一起使用的佐剂包括铝盐或钙盐(例如氢氧化物或磷酸盐)。一个特别优选用于本文的佐剂是氢氧化铝凝胶，例如AlhydrogelTM。对于氢氧化铝凝胶，将嵌合蛋白与所述佐剂混合，使得每剂合有约50微克至约800微克的铝，优选含有介于400微克和600微克之间的铝。磷酸钙纳米粒(CAP)是一种由Biosante，Inc(Lincolnshire，IL)开发的佐剂。目标免疫原或者可以在其颗粒外面包衣，或者在里面包胶囊[He等(2000年11月)Clin.Diagn.Lab.Immunol.，7(6)：899-903]。
另一种特别优选与本发明免疫原一起使用的佐剂是乳剂。所提出的乳剂可以是水包油乳剂或油包水乳剂。除了免疫原性嵌合体蛋白颗粒外，这类乳剂还包括角鲨烯、角鲨烷、花生油等油相作为众所周知的分散剂。优选非离子型分散剂，这类材料包括山梨坦和二缩甘露醇的单-和二-C12-C24-脂肪酸酯，例如山梨坦单硬脂酸酯、山梨坦单油酸酯和二缩甘露醇单油酸酯。给予含有免疫原的乳剂作为乳剂。
优选这类乳剂为油包水乳剂，与嵌合体蛋白颗粒在水相中乳化，所述乳剂包含角鲨烯、甘油和表面活性剂例如二缩甘露醇单油酸酯(ArlacelTMA)，任选含有角鲨烷。油相优选包含约0.1％至约10％的疫苗，更优选约0.2％至约1％。油相的替代组分包括α-生育酚、混合链甘油二酯和甘油三酯和山梨坦酯。众所周知，这类乳剂的实例包括MontanideTM ISA-720和MontanideTM ISA 703(Seppic，Castres，France)，每种都含有角鲨烯和角鲨烷，其中以角鲨烯为主，但是在MontanideTM ISA 703中较少。最优选使用MontanideTM ISA-720，并且使用油水比例为7∶3(w/w)。其它优选的水包油乳化佐剂包括在WO95/17210和EP 0 399 843中公开的佐剂。
本文也提出小分子佐剂的用途。本文使用的一类小分子佐剂是7-取代-8-氧代-或8-硫代-鸟苷衍生物，该衍生物描述于美国专利第4,539,205、4,643,992、5,011,828和5,093,318号，其公开内容通过引用结合到本文中。这些材料中，特别优选7-烯丙基-8-氧代鸟苷(洛索立宾)。该分子在诱导抗原-(免疫原-)特异性应答中已显示出是特别有效的。
优选有用的佐剂包括单磷酰脂质A(MPL)，即3-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)，这是一种众所周知由Seattle，WA的Corixa公司(以前为Ribi Immunochem，Hamilton，Montana)生产的佐剂。该佐剂含有从细菌中提取的三种组分：单磷脂酰脂质(MPL)A、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，这三种组分(MPL+TDM+CWS)含在2％角鲨烯/Tween80乳剂中。可以通过GB 2122204B中公开的方法制备该佐剂。3-脱-O-酰基化单磷酰脂质A的一种优选形式是呈乳剂形式，所述乳剂具有的小颗粒直径小于0.2μm(EP 0 689 454 B1)。
最优选结构上与MPL佐剂相关的化合物，所述佐剂称为氨基烷基葡糖胺磷酸酯(AGP)，例如得自Corixa公司，其商品名为RC-529{2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基氨基]-乙基-2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基氨基]-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙基铵盐}。RC-529佐剂在角鲨烯乳剂中作为Corixa公司的RC-529SE销售，而在水性制剂中作为Corixa公司的RC-529AF销售(参见美国专利第6,355,257和6,303,347号；美国专利第6,113,918号；和美国公布号03-0092643)。
其它最优选的佐剂包括CpG(亦称ODN；含有CpG核苷酸基序一次或多次加上侧翼序列的寡核苷酸)，得自Coley PharmaceuticalGroup；称为QS21的佐剂，得自Aquila Biopharmaceuticals，Inc.；含有QS21和MPL离子水包油乳剂的SBAS2(现在称为ASO2)，得自SKB(现在称为Glaxo-SmithKline)；所谓胞壁酰二肽类似物，描述于美国专利第4,767,842号；和MF59，得自Chiron公司(参见美国专利第5,709,879号和第6,086,901号)。
更具体地讲，也可使用来自南美树木Quillaja Saponaria Molina树皮、具有佐剂活性的免疫活性皂苷流分(例如QuilTM A)。QuilTM A的衍生物例如QS21(QuilTM A经HPLC纯化的流分衍生物)，其生产方法公开于美国专利第5,057,540号。除了QS21(亦称QA21)之外，也公开了其它流分例如QA17。
胞壁酰二肽佐剂包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thur-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称为去甲-MDP)和N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP)1983A，称为MTP-PE)。
优选的佐剂混合物还包括3D-MPL和QS21的组合(EP 0 671 948B1)、包括3D-MPL和QS21在内的水包油乳剂(WO 95/17210，PCT/EP98/05714)、与其它载体配制在一起的3D-MPL(EP 0689454B1)、配制在含胆固醇脂质体中的QS21(WO 96/33739)或免疫刺激性寡核苷酸(WO 96/02555)。备选佐剂包括描述于WO 99/52549中的佐剂以及聚氧乙烯醚的非颗粒混悬剂(英国专利申请第9807805.8号)。
特别优选使用以下两种激动剂之一或它们两者的佐剂：(a)toll样受体-4(TLR-4)激动剂，例如MPL或结构相关化合物例如RC-529佐剂或脂质A模拟物；和(b)toll样受体-9(TLR-9)激动剂，例如含有非甲基化寡脱氧核苷酸的CpG基序。当药物可接受的稀释剂与上述含有免疫原性HBc的颗粒混合或与所述免疫原性颗粒化学连接并且免疫合适的宿主动物(例如慢性感染乙型肝炎病毒的人)时，所述佐剂在免疫宿主体内提高γ-生产(gamma-producing)CD 8+T细胞、CD 4+T细胞和细胞毒性T淋巴细胞的产量。所述佐剂混合物中也可以含有明矾。初步结果表明，明矾趋向于增加促进IgG1-型抗体产生的Th2免疫应答，而RC-529-型佐剂增加促进IgG2a和IgG2b抗体产生的Th1免疫应答和T细胞应答(当T细胞免疫原存在时，如同当HBc颗粒包括所述免疫原的情况一样)。
最优选的佐剂混合物包括稳定的油包水乳剂，所述乳剂还含有氨基烷基葡糖胺磷酸酯，例如描述于美国专利第6,113,918号。在氨基烷基葡糖胺磷酸酯中，最优选称为RC-529{(2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基氨基]乙基-2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基氨基]-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙基铵盐}的分子。优选的油包水乳剂描述于WO 9956776。
在一个优选的使用方法中，以药盒形式提供佐剂和免疫原。所述药盒包括重组生产的免疫原性嵌合体颗粒的容器和佐剂的容器。这两个容器的内容物在使用前混合在一起，优选在给予患者之前即刻混合。在最优选的使用方法中，以冻干饼形式提供重组生产的嵌合体颗粒。冻干饼用佐剂的含水制剂重建。
佐剂按佐剂量来使用，佐剂量可以根据佐剂、哺乳动物和重组HBc嵌合体颗粒免疫原的不同而变化。通常用量可以在每次免疫约1μg至约1mg的范围内变化。本领域技术人员知道，可以容易地确定合适浓度或用量。
疫苗通常配制成供胃肠外给药。示例性的免疫可以以皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或皮内(ID)形式进行。适于其它给药方式的其它制剂包括栓剂和在某些情况下的口服制剂。也提出供接种用的喷鼻剂的使用，正如Neirynck等(1999年10月)Nature Med.，5(10)：1157-1163所述。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可以包括例如polyalkalene glycols或甘油三酯，所述栓剂可以由含有范围在0.5％至10％、优选1-2％的活性成分的混合物制备而来。口服制剂包括通常使用的赋形剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
疫苗组合物采取以下形式：溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉剂，并且含有免疫原性有效量的HBc嵌合体或HBc嵌合体缀合物(优选为颗粒)作为活性成分。在典型的组合物中，免疫原性有效量的优选HBc嵌合体或HBc嵌合体缀合物颗粒每剂约1μg至约1mg活性成分，更优选每剂约5μg至约50μg，如上所述。
HBc嵌合体颗粒和HBc嵌合体颗粒缀合物可以呈中性或盐形式配制在疫苗中。药物可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白或半抗原的游离氨基成盐)，并且可以用无机酸或有机酸生成，所述无机酸例如盐酸或磷酸，所述有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。与游离羧基生成的盐也可以衍生自无机碱和有机碱，所述无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，所述有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
在又一个实施方案中，提出一种疫苗或接种物，其中将编码所提出的HBc嵌合体的基因转染到合适的减毒肠道菌例如伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂合体或大肠杆菌中。以上提供的引文中公开了示例性的减毒或无毒伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂合体。特别提出这些疫苗和接种物用于抵抗通过鼻粘膜、肠粘膜和生殖道粘膜感染或传播的疾病，例如流感、酵母例如曲霉属(Aspergiullus)和念珠菌属(Candida)、病毒例如脊髓灰质炎病毒、口蹄疫(moot-and-mouth disease)病毒、甲型肝炎病毒，以及细菌例如霍乱弧菌属(Cholera)、沙门氏菌属(Salmonella)和大肠杆菌，以及在除了IgG系统应答以外或取代IgG系统应答而需要粘膜IgA应答的情况下。
肠道菌可以被冻干，与干的药物可接受的稀释剂混合，制成口服用片剂或胶囊剂并且象常规固相药物一样给予宿主动物。另外，这类细菌疫苗的含水制剂适用于通过口服、鼻腔、直肠或阴道给药进行粘膜免疫。
可以通过口服转基因植物组织例如根(例如胡萝卜)或种子(例如大米或玉米)，使用含有提出嵌合分子颗粒的植物材料，达到口服免疫。在这种情况下，唾液或胃肠道的体液提供用于免疫的常用含水介质，而周围的植物组织提供药物可接受的稀释剂。
以与剂量配方相容的方式、以治疗有效量和免疫原性量给予疫苗。给药量取决于待治疗的受试者、受试者免疫系统合成抗体的能力和所需保护程度。给药所需活性成分精确用量取决于医生的判断并且每个个体都不相同。然而，合适的剂量范围每个个体大约为10微克活性成分。合适的初次给药和加强给药的方案也是可变的，但通常是初次给药后间隔一段时间(数周或数月)，再次注射给药或以其它方式给药。
人们注意到，在HBV感染者体内诱导治疗性免疫应答的替代方法是将免疫原性嵌合体颗粒离体给予患者的树突细胞，然后将该树突细胞回输给同一患者。从体内分离树突细胞并在抗原存在下培养它们的方法是本领域众所周知的[Nestle等(2001)Nature Medicine 7，761-765及其中引用的参考文献]。
因此，本发明的另一方面是在慢性HBV感染者体内诱导抗HBc的T细胞应答的方法。该方法包括下述步骤：从患者体内分离树突细胞，使树突细胞接触免疫原性嵌合体颗粒并保持接触，以形成活化树突细胞，任选用细胞因子例如GMCSF刺激所述树突细胞，然后将所述活化的树突细胞回输给同一患者。
用以下非限制性实施例说明本发明。
实施例1：含B细胞表位嵌合体的制备
A.质粒载体pKK223-3N(一种修饰形式的pKK223-3)的制备
通过建立唯一的NcoI限制位点，修饰质粒载体pKK223-3(Pharmacia)，能够使HBc基因作为NcoI-HindIII限制片段插入并随后在大肠杆菌宿主细胞中表达。为了修饰pKK223-3质粒载体，用PCR引物pKK223-3/433-452-F和pKK223-NcoI-mod-R，并用pKK223-3作为模板，制备新的SphI-HindIII片段。该PCR片段用限制酶SphI和HindIII切割，产生467bp片段，所述片段然后与pKK223-3载体的4106bp片段连接，以有效取代原来的480bp SphI-HindIII片段。因此，所得质粒(pKK223-3N)比亲代质粒短13bp并且含有引入的NcoI位点上游的修饰核苷酸序列(参见图1，其中虚线表示不存在的碱基)。最后的质粒pKK223-3N大小为4573bp。质粒pKK223-3N中的限制位点如图1所示，而由pKK223-3形成质粒pKK223-3N的核苷酸变化如下用下划线表示。
pKK223-3/433-452-F    GGTGCATGCAAGGAGATG    SEQ ID NO：208
pKK223-NcoI-mod-R
GCGAAGCTTCGGATC ccatggTTTTTTCCTCCTTATGTGAAATTGTTATCCG-
           CTC                   SEQ ID NO：209
B.V1和V2克隆载体的制备
用PCR构建修饰的HBc149基因，使其能够接受将合成dsDNA片段定向插入到优势免疫环区内。[在氨基酸E77和D78之间接受插入序列的质粒称为V1，而在D78和P79之间接受插入序列的质粒称为V2]。用两个PCR引物对将HBc149基因分成两半进行扩增，其中一个扩增其氨基端，另一个扩增其羧基端。对于V1，PCR反应产物(N端和C端)都是246bp片段；对于V2，其产物是249bp(N端)和243bp片段(C端)。
制备的N端片段用NcoI和EcoRI消化，而其C端片段用EcoRI和HindIII消化。然后，V1和V2片段对在共同的EcoRI突出端连接在一起。然后，所得NcoI-HindIII片段连接到pKK223-3N载体中，所述载体已经用NcoI和HindIII消化。
为了将B细胞表位插入到V1和V2质粒中，所述质粒用EcoRI和SacI限制酶消化。然后插入含有5′EcoRI和3′SacI突出端的合成dsDNA片段。在这两种情况下，V1和V2、由限制位点编码的甘氨酸-异亮氨酸(EcoRI)和谷氨酸-亮氨酸(SacI)氨基酸对邻接插入的B细胞表位。插入的限制位点在以下引物中加有下划线。
V1
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGG CCATGGACATCGACCCTTA           SEQ ID NO：210
HBc-E77/EcoRI-R
5′-GCG GAATTCCTTCCAAATTAACACCCACC      SEQ ID NO：211
HBc-D78/EcoRI-SacI-F
5′-CGC GAATTCAAAAA GAGCTCGATCCAGCCTCTAGAGAC
                                       SEQ ID NO：212
HBc149/HindIII-R
5′-CGC AAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG    SEQ ID NO：213
V2
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGG CCATGGACATCGACCCTTA           SEQ ID NO：210
HBc-D78/EcoRI-R
5′-GCG GAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC    SEQ ID NO：214
HBc-P79/EcoRI-SacI-F
5′-CGC GAATTCAAAAAA GAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG
                                       SEQ ID NO：215
HBc149/HindIII-R
5′-CGC AAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG    SEQ ID NO：213
表达免疫优势环中含有N端半胱氨酸和来自恶性疟原虫的CS-重复表位的嵌合体颗粒的载体
制备两个表达载体[V2.Pf1(N-MGCELDP)和V2.Pf1(N-MGCDIDP)]，以确定N端半胱氨酸残基稳定嵌合体颗粒的能力。为了制备载体V2.Pf1(N-MGCELDP)，用寡核苷酸HBc(MGCELDP)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R扩增来自载体V2.Pf1的杂合HBc基因。所得528bp片段用NcoI和HindIII切割并插入到已用相同的两种酶切割的pKK-223-3N中。
为了制备载体V2.Pf1(N-MGCDIDP)，用寡核苷酸HBc(MGCDIDP)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R扩增来自载体V2.Pf1的杂合HBc基因。所得528bp片段用NcoI和HindIII切割并插入到已用相同的两种酶切割的pKK-223-3N中。
HBc(MGCELDP)-NcoI-F
          M  G   C E  L  D  P  Y  K  E  F  G
5′-GCG CCATGGGGTGTGAGCTCGACCCTTATAAAGAATTTGG
                       SEQ ID NO：216
                       SEQ ID NO：217
HBc(MGCDIDP)-NcoI-F
         M  G    C D  I  D  P  Y  K  E  F  G
5′-GCG CCATGGGGTGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGG
                       SEQ ID NO：218
                       SEQ ID NO：219
C.V7克隆载体的制备
为了能将T细胞表位与HBc嵌合体C端融合，构建一个新的载体，即V7。在缬氨酸-149和HindIII位点之间插入唯一的EcoRI和SacI限制位点，以便将合成dsDNA定向插入到EcoRI-HindIII(或EcoRI-SacI)限制位点中。采用以下PCR引物对，扩增在氨基端带有NcoI限制位点、在羧基端带有EcoRI、SacI和HindIII位点的HBc 149基因。PCR反应产物(479bp)用NcoI/HindIII消化并克隆到pKK223-3N中，形成V7。
为了插入T细胞表位，质粒(V7)用EcoRI/HindIII(或EcoRI-SacI)消化，然后将具有EcoRI/HindIII(或EcoRI/SacI)突出端的合成dsDNA片段连接到V7上。对于所有V7构建体，天然HBc的最后一个氨基酸(缬氨酸-149)和插入的T细胞表位的第一个氨基酸被甘氨酸-异亮氨酸二肽序列间隔开，所述二肽序列由形成EcoRI限制位点的核苷酸编码。对于在EcoRI/SacI插入的表位，在T细胞表位之后、在终止密码子之前有由SacI位点贡献的额外的谷氨酸-亮氨酸残基。限制位点在以下引物中也加有下划线。
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGG CCATGGACATCGACCCTTA    SEQ ID NO：210
HBc149/SacI-EcoRI-H3-R
5′-CGC AAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG
                                SEQ ID NO：220
D.V12表达构建体的制备
从V2和V7载体构建V12载体，V12载体在氨基酸78和79之间含有B细胞表位，并且在缬氨酸-149下游含有T细胞表位。用两个PCR引物(HBc-P79/SacI-F和pKK223-2/4515-32R)扩增含有插入在EcoRI/HindIII的T细胞表位的V7载体的羧基端，以提供对应于氨基酸79-149加上T细胞表位的dsDNA片段，所述片段邻接SacI和HindIII限制位点。
PCR产物用SacI和HindIII切割，然后克隆到已经用相同两种酶切割制备的所需V2载体中。PCR引物适用于所有V7基因羧基端的扩增，其与T细胞表位存在于HBc基因氨基酸149之后无关。
对该方法普遍性的一个例外就是：含有Pf-CS(C17A)突变的V12构建体的制备，该构建体从现有的V12构建体制备而来。在这种情况下，用HBc149/NcoI-F(SEQ ID NO：180)和错配反向PCR引物(SEQID NO：292)扩增V12构建体，有利于C17A突变。所得PCR产物用NcoI和HindIII消化并克隆到pKK223-3N(事先用相同的酶切割)中。限制位点加有下划线。
HBc-P79/SacI-F       5′-CGC GAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG
                                            SEQ ID NO：221
pKK223-2/4515-32R    5′-GTATCAGGCTGAAAATC
                                            SEQ ID NO：222
E.将恶性疟原虫CS-重复B细胞表位插入到V2中
对于V2和V7构建体，将编码目的B细胞表位(V2)或T细胞表位(V7)的合成dsDNA片段插入到EcoRI/SacI限制位点中。编码目的B细胞表位和T细胞表位的合成dsDNA片段制备如下：通过以等摩尔浓度混合互补单链DNA寡核苷酸，加热到95℃达5分钟，然后以每分钟-1℃的速率冷却至室温。该退火反应在TE缓冲液中进行。双链DNA如下所示，编码的表位序列如上所示。在以下一些氨基酸残基序列中使用符号#表示存在的终止密码子。
Pf1
  I  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGAACGCTA
    TTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCTTGCGAT
       N  P  E  L    SEQ ID NO：223
       ATCCGGAGCT    SEQ ID NO：224
       TAGGCC        SEQ ID NO：225
Pf3
  I  N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGCTAATCCGAACGTTGACCCGAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGA
    TTGCGATTAGGCTTGCAACTGGGCTTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCT
N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  E  L SEQ ID NO：226
ACGCTAATCCGAACGTTGACCCGAACGCTAATCCGGAGCT SEQ ID NO：227
TGCGATTAGGCTTGCAACTGGGCTTGCGATTAGGCCTCGAGG
                                         SEQ ID NO：228
Pf3.1
  I  N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGCGAATCCGAACGTGGATCCGAATGCCAACCCTAACGCCAACCC
TTGCGCTTAGGCTTGCACCTAGGCTTACGGTTGGGATTGCGGTTGGG
             N  A  N  P  E  L    SEQ ID NO：229
           AAATGCGAACCCAGAGCT    SEQ ID NO：230
           TTTACGCTTGGGTC        SEQ ID NO：231
Pf3.2
  I  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  V  D  P
AATTAACGCGAATCCGAATGCCAACCCTAACGCCAACCCAAACGTGGATCCGA
    TTGCGCTTAGGCTTACGGTTGGGATTGCGGTTGGGTTTGCACCTAGGCT
           N  A  N  P  E  L         SEQ ID NO：232
           ATGCGAACCCAGAGCT         SEQ ID NO：233
           TACGCTTGGGTC             SEQ ID NO：234
Pf3.3
  I  N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGCGAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAA
    TTGCGCTTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTT
N  A  N  P  N  V  D  P N  A  N  P  E  L     SEQ ID NO：235
ACGCCAACCCGAATGTTGACCCCAATGCCAATCCGGAGCT    SEQ ID NO：236
TGCGGTTGGGCTTACAACTGGGGTTACGGTTAGGCC        SEQ ID NO：237
Pf3.4
  I  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCA
    TTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGT
           N  P  N  V  E  L                 SEQ ID NO：238
           ACCCGAATGTTGAGCT                 SEQ ID NO：239
           TGGGCTTACAAC                     SEQ ID NO：240
Pf3.5
  I  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCA
    TTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGT
           N  P  N  V  D  P  E  L           SEQ ID NO：241
           ACCCGAATGTTGACCCTGAGCT           SEQ ID NO：242
           TGGGCTTACAACTGGGAC               SEQ ID NO：243
Pf3.6
  I  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCA
    TTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGT
           N  P  N  V  D  P  N  A  E  L    SEQ ID NO：244
           CCCGAATGTTGACCCTAATGCTGAGCT     SEQ ID NO：245
           TGGGCTTACAACTGGGATTACGAC        SEQ ID NO：246
Pf3.7
  I  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGA
    TTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCT
           N  V  E  L                       SEQ ID NO：247
           ATGTTGAGCT                       SEQ ID NO：248
           TACAAC                           SEQ ID NO：249
pf3.8
  I  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGA
    TTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCT
           N  V  D  P  E  L                 SEQ ID NO：250
           ATGTTGACCCTGAGCT                 SEQ ID NO：251
           TACAACTGGGAC                     SEQ ID NO：252
Pf3.9
  I  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGA
    TTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCT
           N  V  D  P  N  A  E  L           SEQ ID NO：253
           ATGTTGACCCTAATGCTGAGCT           SEQ ID NO：254
           TACAACTGGGATTACGAC               SEQ ID NO：255
Pf3.10
  I  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACC
    CTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGG
              N  V  E  L                   SEQ ID NO：256
           CGAATGTTGAGCT                   SEQ ID NO：257
           GCTTACAAC                       SEQ ID NO：258
Pf3.11
  I  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  V
AATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGAATGTTG
    CTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCTTACAAC
           D  P  E  L                       SEQ ID NO：259
           ACCCTGAGCT                       SEQ ID NO：260
           TGGGAC                           SEQ ID NO：261
Pf3.12
  I  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  V
AATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGAATGTTG
    CTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCTTACAAC
           D  P  N  A  E  L                 SEQ ID NO：262
           ACCCTAATGCCGAGCT                 SEQ ID NO：263
           TGGGATTACGGC                     SEQ ID NO：264
F.恶性疟原虫通用T细胞表位
Pf-UTC(PF/CS326-345)
I  E  Y  L  N  K  I  Q  N  S  L  S  T  E  W  S  P
AATTGAATATCTGAACAAAATCCAGAACTCTCTGTCCACCGAATGGTCTCCGT
    CTTATAGACTTGTTTTAGGTCTTGAGAGACAGGTGGCTTACCAGAGGCA
           C  S  V  T  #  #                 SEQ ID NO：265
           GCTCCGTTACCTAGTA                 SEQ ID NO：266
           CGAGGCAATGGATCATTCGA             SEQ ID NO：267
间日疟原虫(P.vivax)CS-重复B细胞表位
Pv-T1A
I  P  A  G  D  R  A  D  G  Q  P  A  G  D  R  A  A
AATTCCGGCTGGTGACCGTGCAGATGGCCAGCCAGCGGGTGACCGCGCTGCAG
    GGCCGACCACTGGCACGTCTACCGGTCGGTCGCCCACTGGCGCGACGTC
           G  Q  P  A  G  E  L              SEQ ID NO：268
           GCCAGCCGGCTGGCGAGCT              SEQ ID NO：269
           CGGTCGGCCGACCGC                  SEQ ID NO：270
Pv-T1B
I  D  R  A  A  G  Q  P  A  G  D  R  A  D  G  Q  P
AATTGACAGAGCAGCCGGACAACCAGCAGGCGATCGAGCAGACGGACAGCCCG
    CTGTCTCGTCGGCCTGTTGGTCGTCCGCTAGCTCGTCTGCCTGTCGGGC
           A  G  E  L                       SEQ ID NO：271
           CAGGGGAGCT                       SEQ ID NO：272
           GTCCCC                           SEQ ID NO：273
Pv-T2A
I  A  N  G  A  G  N  Q  P  G  A  N  G  A  G  D  Q
AATTGCGAACGGCGCCGGTAATCAGCCGGGGGCAAACGGCGCGGGTGATCAAC
    CGCTTGCCGCGGCCATTAGTCGGCCCCCGTTTGCCGCGCCCACTAGTTG
           P  G  E  L                       SEQ ID NO：274
           CAGGGGAGCT                       SEQ ID NO：275
           GTCCCC                           SEQ ID NO：276
Pv-T2B
  I  A  N  G  A  D  N  Q  P  G  A  N  G  A  D  D  Q
AATTGCGAACGGCGCCGATAATCAGCCGGGTGCAAACGGGGCGGATGACCAAC
    CGCTTGCCGCGGCTATTAGTCGGCCCACGTTTGCCCCGCCTACTGGTTG
           P  G  E  L            SEQ ID NO：277
           CAGGCGAGCT            SEQ ID NO：278
           GTCCGC                SEQ ID NO：279
Pv-T2C
  I  A  N  G  A  G  N  Q  P  G  A  N  G  A  G  D  Q
AATTGCGAACGGCGCCGGTAATCAGCCGGGAGCAAACGGCGCGGGGGATCAAC
    CGCTTGCCGCGGCCATTAGTCGGCCCTCGTTTGCCGCGCCCCCTAGTTG
P  G  A  N  G  A  D  N  Q  P  G  A  N  G  A  D  D
CAGGCGCCAATGGTGCAGACAACCAGCCTGGGGCGAATGGAGCCGATGACC
GTCCGCGGTTACCACGTCTGTTGGTCGGACCCCGCTTACCTCGGCTACTGG
           Q  P  G  E  L               SEQ ID NO：280
           AACCCGGCGAGCT               SEQ ID NO：281
           TTGGGCCGC                   SEQ ID NO：282
PV-T3
I  A  P  G  A  N  Q  E  G  G  A  A  A  P  G  A  N
AATTGCGCCGGGCGCCAACCAGGAAGGTGGGGCTGCAGCGCCAGGAGCCAATC
    CGCGGCCCGCGGTTGGTCCTTCCACCCCGACGTCGCGGTCCTCGGTTAG
           Q  E  G  G  A  A  E L            SEQ ID NO：283
           AAGAAGGCGGTGCAGCGGAGCT           SEQ ID NO：284
           TTCTTCCGCCACGTCGCC               SEQ ID NO：285
实施例2：测定方法
A.抗原性
1.颗粒ELISA
纯化颗粒稀释至浓度为10μg/ml的包被缓冲液(50mM碳酸氢钠，pH 9.6)并包被在ELISA板的孔(50μL/孔)上。将ELISA板在室温下孵育过夜(约18小时)。翌日早上，各孔用ELISA洗涤缓冲液[磷酸缓冲盐溶液(PBS)，pH 7.4，0.05％Tween-20]洗涤并用3％BSA的PBS(75μL/孔)封闭1小时。ELISA板贮存于干燥的-20℃直至使用。
为了测定颗粒的抗原性，抗血清用1％BSA的PBS稀释，加入50μL/孔到抗原包被的ELISA的各孔中。血清孵育1小时，用ELISA洗涤缓冲液洗涤，然后用抗小鼠(IgG)-HRP(The Binding Site，SanDiego，CA；HRP＝辣根过氧化物酶)缀合物(50μL/孔)或其它合适的抗体探测30分钟。用ELISA洗涤缓冲液洗涤后，加入TM蓝色底物(50μL/孔)，目测其反应。10分钟后，加入1N H2SO4(100μL/孔)终止反应，在设置在450nm的ELISA读板器上读数。
2.合成肽ELISA
20个氨基酸残基的合成肽(NANP)5稀释至浓度为2μg/ml的包被缓冲液(50mM碳酸氢钠，pH9.6)并包被在ELISA板的孔(50μL/孔)上。在通风橱中孵育过夜(约18小时)，使各孔中的肽干燥。翌日早上，各孔用ELISA洗涤缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4，0.05％Tween-20)洗涤并用3％BSA的PBS(75μL/孔)封闭1小时。ELISA板贮存于干燥的-20℃直至使用。
为了测定颗粒的抗体抗原性，抗血清(单克隆或多克隆)用1％BSA的PBS稀释，加入50μL/孔到抗原包被的ELISA的各孔中。血清孵育1小时，用ELISA洗涤缓冲液洗涤，然后用抗小鼠(IgG)-HRP缀合物(同上，50μL/孔)或其它合适的抗体探测30分钟，再用ELISA洗涤缓冲液洗涤，然后加入TM蓝色底物(50μL/孔)进行显现。10分钟后，加入1N H2SO4(100μL/孔)终止反应，在设置在450nm的ELISA读板器上读数。
B.颗粒的免疫原性
为了测定颗粒的免疫原性，用20μg颗粒的完全弗氏佐剂免疫小鼠(IP)，然后在4周用10μg颗粒的不完全弗氏佐剂加强接种。小鼠在2、4、6和8周放血。
C.热稳定性方案
用50mM Na3PO4(pH6.8)将纯化颗粒稀释至浓度为1mg/ml，然后加入叠氮化钠至终浓度为0.02％，以防止细菌生长。颗粒在37℃孵育，在所需时间点取出等分试样。样品与SDS-PAGE样品缓冲液(还原性)混合，然后跑15％SDS-PAGE凝胶。凝胶用考马斯蓝染色，然后进行分析。
D：杂合颗粒分析型凝胶过滤的分析
用25ml Superose6HR 10/30层析柱(Amersham Pharmacia#17-0537-01)和BioCADTM SPRINT灌注层析系统，对纯化的杂合HBc颗粒进行分析型凝胶过滤分析。设置紫外检测器，在波长260nm和280nm进行监测。柱子用3倍柱体积(CV；约75ml)的缓冲液(50mM Na3PO4，pH 6.8)以0.75ml/分钟的流速平衡。
待分析的颗粒用50mM Na3PO4(pH6.8)稀释至浓度为1mg/ml。然后，200微升(μL)样品上样到200μL环并注入柱子。用50mM Na3PO4(pH 6.8)以0.75ml/分钟的流速从柱子上洗脱样品。用BioCADTM软件(PerSeptiveTM)对280nm曲线进行积分，得到结果。
实施例3：280∶260吸光度比值的测定
蛋白样品用磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH7.4)稀释至浓度为0.1mg/ml和0.3mg/ml之间。用PBS作为分光光度计的空白，在260nm和280nm波长下测定蛋白样品的吸光度。然后，用280nm测定的样品吸光度值除以260nm测定的同一样品吸光度值，得到给定样品的280∶260吸光度比值。包括天然颗粒(HBc183)、在残基149位(HBc149)后截短的HBc颗粒、以及本文鉴定的几个HBc嵌合体在内的几个样品得到的比值见下表8。全长颗粒ICC-1559是首次报道于下文的颗粒的制备物：Neirynck等，(1999年10月)Nature Med.，5(10)：1157-1163，而全长颗粒ICC-1607是类似颗粒，其中在多肽17和19位(SEQ ID NO：9的X17和X19)的M2多肽半胱氨酸突变成丝氨酸残基。
                    表8
颗粒编号   全长，(F)或C端截短，(T)   280∶260吸光度比值
  HBc183ICC-1532   F   0.84
  HBc149   T   1.59
  ICC-1438   T   1.57
  ICC-1473   T   1.64
  ICC-1475   T   1.04
  ICC-1492   T   1.33
  ICC-1559   F   0.68
  ICC-1560   T   1.36
  ICC-1590   T   1.51
  ICC-1603   T   1.68
  ICC-1604   T   1.40
  ICC-1605   T   1.26
  ICC-1607   F   0.73
  ICC-1600   T   1.23
  ICC-1601   T   1.12
  ICC-1634   T   0.92
  ICC-1632   T   0.96
  ICC-1642   T   未做
  ICC-1643   T   0.77
实施例4：截短的HBc颗粒C端半胱氨酸
A.向杂合HBc颗粒C端添加半胱氨酸残基
用聚合酶链式反应(PCR)，表达杂合HBc颗粒的基因可以容易地突变，以便在N端含有添加半胱氨酸的HBc嵌合体C端引入半胱氨酸或含有半胱氨酸的肽。例如，可采用编码SEQ ID NO：287的PCR寡核苷酸引物，与合适的第二引物一起，扩增杂合HBc基因并在密码子V149和终止密码子之间掺入一个半胱氨酸密码子。示例性的构建体是如下所述称为ICC-1492的构建体。另外参见如下所述的V2.Pf1[N-M2(17-24/C19S)]的制备方法。
乙型肝炎核心颗粒可以从183(或185，取决于病毒亚型)至140被截短并保留装配成颗粒状的病毒样颗粒的能力。许多研究小组已经采用截短至氨基酸149的颗粒，因为氨基酸150代表了富含精氨酸的C端结构域的第一个精氨酸残基。
实施例5：流感M2构建体
最近，Neirynck等，(1999年10月)Nature Med.，5(10)：1157-1163和WO 99/07839报道了M2的24个氨基酸的胞外结构域与缺乏氨基酸残基1-4的全长HBc颗粒(HBc183)的N端融合。该构建体的示意性代表在本文中称为IM2HBc，如下所示，其中24聚体连接到HBc的N端。
                IM2HBc
          MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-HBc(5-183)
                SEQ ID NO：286
在一个说明性的制备方法中，M2表位插入到乙型肝炎核心优势免疫环中，用上述技术进行所述插入和纯化，成功表达和纯化了被称为ICC-1475的颗粒。M2表位的突变形式(其中在M2天然17和19位的两个半胱氨酸残基被丙氨酸残基取代)也在优势免疫环(ICC-1473颗粒)和所得纯化颗粒中表达。这两种颗粒如下所示。
      ICC-1475
HBc(1-78)- GI-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD- EL-HBc(79-149)
                            SEQ ID NO：287
      ICC-1473
HBc(1-78)- GI-SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD- EL-HBc(79-149)-C
                            SEQ ID NO：288
当与天然序列(ICC-1475)相比，ICC-1473颗粒构建体产生的颗粒纯度高约7倍。还需测定是否半胱氨酸残基的突变改变了所述颗粒的保护能力。然而，传递给HBc优势免疫环的表位通常比它们融合到其它区(包括N端)有明显更大的免疫原性，后者所得颗粒表现出降低的抗HBc免疫原性。
也已经制备了颗粒，其中M2N端24聚体表位融合到C端截短的乙型肝炎核心颗粒的N端。所述构建体(ICC-1438)也含有N端前核心序列(SEQ ID NO：289)。制备了类似构建体，所述构建体在杂合蛋白(ICC-1492)末端含有一个半胱氨酸残基，在这种情况下紧接在HBc基因的Val-149之后。这些构建体如下所示。
      ICC-1438
M GISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD ELLGWLWGI-HBc(2-149)
                            SEQ ID NO：289
      ICC-1492
M GISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD ELLGWLWGI-HBc(2-149)-C
                            SEQ ID NO：290
应当注意的是，为了防止从天然HBc起始甲硫氨酸开始翻译，使该残基的密码子发生突变，以编码异亮氨酸残基。对EcoRI(GI)和SacI(EL)限制位点作出贡献的残基加上下划线。前核心序列位于加有下划线的EL残基和“-HBc(2-149)”之间。
在本文其它地方讨论的SDS-PAGE分析显示，在制备时，ICC-1438单体构建体与ICC-1492(第3道)相比是不稳定的(第2道)，HBc-149(第1道)、ICC-1475(第4道)和ICC-1473(第5道)在图10的SDS-PAGE凝胶中作为额外的分子量对照。用颗粒的分析型凝胶过滤，不能证明ICC-1438单体的不稳定性。
预期ICC-1475(图10，第4道)和ICC-1473(图10，第5道)都具有比ICC-1438和ICC-1492略低的分子量，因为前两者均含有定向插入到优势免疫环中的M2表位并因而缺乏ICC-1438和ICC-1498中存在的前核心序列(SEQ ID NO：259)。正如所预期的，ICC-1492大于ICC-1475和ICC-1473；然而，与ICC-1492相同都保留C端半胱氨酸残基的ICC-1438因为明显的切割，清楚地显示不大于ICC-1475和ICC-1473。
也提出一种构建体，所述构建体含有连接到HBc N端(结构域I)或环(结构域II)的如上所述M2的N端胞外序列，也含有HBc C端(结构域IV)的半胱氨酸残基。
为了修饰含有优势免疫环融合物的杂合HBc颗粒氨基端，以便掺入半胱氨酸残基以及来自M2的最小序列，合成一序列合成的寡核苷酸。为了制备V2.Pf1(N-M2(17-24/C17S)，采用寡核苷酸M2(17-24/C17S)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R，从载体V2.Pf1扩增杂合HBc基因。所得546bp片段用NcoI和HindIII切割并插入到已经用相同两种酶切割的pKK-223-3N中。
为了制备V2.Pf1[N-M2(17-24/C19S)]，采用寡核苷酸M2(17-24/C19S)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R，在载体V2.Pf1中扩增杂合HBc基因。所得540bp片段用NcoI和HindIII切割并插入到已经用相同两种酶切割的pKK-223-3N中。
M2(17-24/C17S)-NcoI-F
      M  G  S  R  C N  D  S  S  D  I  D  P  Y  K  E
 GGCG CCATGGGGTCTAGATGTAACGATTCAAGTGACATCGACCCTTATAAAGA
          F  G                              SEQ ID NO：291
          ATTTCG                            SEQ ID NO：292
M2(17-24/C19S)-NcoI-F
      M  G  C N  D  S  S  D  I  D  P  Y  K  E  F  G
GCG CCATGGGGTGTAACGATTCAAGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGG
                                 SEQ ID NO：293
                                 SEQ ID NO：294
实施例6：有和无N端半胱氨酸残基和C端半胱氨酸残基的HBc嵌合分子
制备了一系列含有HBc嵌合分子的颗粒，所述颗粒含有甲型流感M2蛋白残基1-24，所述蛋白以肽键连接在HBc的N端上或其附近，所述HBc在C端残基149截短。所述组分嵌合蛋白分子含有不同的N端序列(包括M2序列或变异体)，有些含有C端半胱氨酸残基。
通过分析型大小排阻层析法，分析下表9中列出的所有纯化颗粒，评价纯化后颗粒结构的保留。称为ICC-1603的、不合N端半胱氨酸残基的颗粒显示分解成亚颗粒结构的证据(图3)，因为所述蛋白在1500秒范围内洗脱(颗粒在约1000秒洗脱)。
颗粒ICC-1590的类似分析(所述ICC-1590类似于ICC-1603 ICC-颗粒，除了N端M2序列的两个丝氨酸残基突变成半胱氨酸残基外)表明该构建体在纯化后保留了颗粒，其洗脱发生在约1000秒，这通常是杂合颗粒(图4)。没有证据显示ICC-1590颗粒的分解。
对其嵌合蛋白也具有两个N端半胱氨酸残基的ICC-1560颗粒进行分析表明，纯化后也是颗粒，尽管它的确表现出某种程度的分解(图5)，这表明其稳定性并不象ICC-1590颗粒一样强。比较ICC-1590和ICC-1560颗粒的N端构型(下表11)显示，ICC-1560颗粒中两个半胱氨酸残基的相对位置因3个氨基酸残基的缺失(DEL)相对于ICC-1590颗粒移位了3个氨基酸残基，表明半胱氨酸残基可能是从核心基因开始到能够最优化交联之间的最小距离所需。
实施例7：具有M2或M2变异体序列和C端半胱氨酸残基的颗粒
ICC-1603颗粒见图3，在纯化后快速分解。包括ICC-1605颗粒的HBc嵌合分子类似于ICC-1603颗粒，除了ICC-1605组分嵌合分子具有单个C端稳定性半胱氨酸以外。制备一种质粒，指导ICC-1605颗粒的表达，以研究是否将C端半胱氨酸残基添加到ICC-1603颗粒中，可以更大地赋予颗粒稳定性。纯化后，用分析型大小排阻层析，来分析ICC-1605颗粒(图6)。
该项研究的结果证明，颗粒稳定性比ICC-1603颗粒更加完全，但是与含有两个氨基端半胱氨酸残基和不含C端稳定性半胱氨酸的ICC-1590颗粒相比是不完全的。尽管大量ICC-1605保留颗粒，但是有证据表明，存在着宽范围被洗脱的亚颗粒结构的不均一混合物。这样的观察结果表明，对于这一杂合颗粒(ICC-1603)，ICC-1605颗粒中看到的C端稳定性比ICC-1590颗粒中看到的N端稳定性更不完全。
为了研究杂合颗粒氨基端和羧基端半胱氨酸稳定性的相容性，构建了一个表达质粒，以指导ICC-1604颗粒的表达。ICC-1604颗粒组分嵌合分子含有两个氨基端稳定化半胱氨酸残基以及一个C端稳定化半胱氨酸(正如在ICC-1605颗粒中一样)，所述氨基端稳定化半胱氨酸残基存在于天然M2多肽序列(如同在ICC-1590)中。对ICC-1604颗粒的分析表明，它们在纯化后保留均一的颗粒状态(图7)，这表明这两种稳定化方法是互补的，并且可以彼此一起使用。
用颗粒ICC-1438和ICC-1492，研究了HBc N端和N端半胱氨酸残基之间的备选接头序列。这些颗粒在M2融合物和HBc氨基酸D4之间都含有氨基酸序列ELLGWLWGIDI(SEQ ID NO：265)。该序列C端9个氨基酸残基来自HBc前核心序列的氨基酸-6至HBc的氨基酸I3，其中HBc起始密码子突变成异亮氨酸，以防止从该位置开始翻译(所述翻译将会破坏该项研究)。HB前核心序列包括在-7位的半胱氨酸。
这些颗粒仅在以下事实中是不同的：ICC-1438组分嵌合分子终止于HBc的149位，而ICC-1492组分嵌合分子终止于HBc的149并且在相对于SEQ ID NO：1的HBc的150位含有一个末端半胱氨酸。当用分析型凝胶过滤进行分析时，采用一个替代而与上述类似的方法，其中颗粒约在10分钟洗脱，这两种构建体在纯化后都显示为颗粒(图8中的ICC-1438和图10中的ICC-1492)。该项研究证明了截短颗粒的氨基端半胱氨酸和羧基端半胱氨酸稳定性的相容性，以及对在氨基酸序列和在N端半胱氨酸残基与HBc基因起点之间距离上的相当大的变异性的耐受性。
                                   表9
  构建体名称   N端融合   HBc N端起点   M2和HBc之间的残基   C端终点   结合的核酸   C端半胱氨酸稳定
  ICC-1560   M2(1-24)   D4   无   149   无   无
  ICC-1603   M2(1-24)(2C＞2S)   D4   EL   149   无   无
  ICC-1590   M2(1-24)   D4   EL   149   无   无
  ICC-1604   M2(1-24)   D4   EL   149   无   有(C150)
  ICC-1605   M2(1-24)(2C＞2S)   D4   EL   149   无   有(C150)
  ICC-1438   M2(1-24)   D2   ELLGWLWGI   149   无   无
  ICC-1492   M2(1-24)   D2   ELLGWLWGI   149   无   有(C150)
下表10显示一个比对表，表明HBeAg以及称为ICC-1590、ICC-1560、ICC-1603、ICC-1604和ICC-1605的颗粒N端的构型。按照从所有构建体共享的SEQ ID NO：1的HBc N端氨基酸残基4位，将各序列进行比对。给N端半胱氨酸残基(如存在的话)加上下划线。
                    表10
  构建体名称   序列   SEQ ID NO
HBeAg SKL CLGWLWGMDID 295
  ICC-1590/ICC-1604ICC-1560ICC-1603/ICC-1605ICC-1438/ICC-1492 MSLLTEVETPIRNEWG CR CNDSSDELDMSLLTEVETPIRNEWG CR CNDSSDMSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDELDMGISLLTEVETPIRNEWG CR CNDSSDELLGWLWGIDID 29624297298
下表11提供了一份结果的表格，其中对本文所提出的含有N端甲型流感M2序列或变异体的颗粒进行了稳定性评价。正如所看到的，从HBc嵌合分子已经制备了稳定的颗粒，所述HBc嵌合分子在相对于SEQ ID NO：1的HBc序列的N端负14(-14)位至约N端本身含有N端半胱氨酸残基。
                            表11
  构建体名称  HBc D4和N端半胱氨酸残基之间的氨基酸  C端半胱氨酸稳定性   所形成的稳定颗粒
  Cys 1   Cys 2
  HBeAg   -   9  无   无
  ICC-1603   -   -  无   无
  ICC-1605   -   -  有   有/无
  ICC-1590   9   7  无   有
  ICC-1604   9   7  有   有
  ICC-1560   6   4  无   有
  ICC-1438   18   16  无   有
  ICC-1492   18   16  有   有
实施例8.部分截短的HBc颗粒：用于表达部分截短颗粒的表达载体的合成
为了制备用于表达部分截短的HBc颗粒的表达质粒，采用单个氨基端寡核苷酸PCR引物(HBc149/NcoI-F)以及一个独特C端引物。例如，为了制备HBc156(E.Cr；ICC-1600颗粒)表达质粒，使用引物HBc149/NcoI-F和HBc156(E.cR)-H3-R。使用引物HBc149/NcoI-F和HBc156C(E.cR)-H3-R来制备HBc156(E.cR)+C(ICC-1601颗粒)表达质粒。所有使用的引物的序列显示如下。
除了截短所述颗粒，以及在某些情况下掺入C端半胱氨酸残基之外，也使用用于在大肠杆菌中优化表达的密码子。已知几个精氨酸密码子、特别是AGA和AGG在大肠杆菌中很少使用，并且据信这在大肠杆菌有效表达蛋白中是个问题，即通过在翻译过程中导致多肽合成中止而引起过早的终止。在HBc的150和183之间的16个精氨酸密码子中，7个由稀有AGA密码子编码，2个由非常稀有的AGG密码子编码。因此，在该项研究中，用大肠杆菌更常用的密码子取代所有AGA和AGG密码子。为了能够连续取代稀有精氨酸密码子，首先合成HBc156基因(ICC-1600和HBc156+C ICC-1601颗粒)，然后用作HBc163构建体(ICC-1634和HBc163+C ICC-1632颗粒)的模板；然后用HBc163构建体作为HBc171构建体(ICC-1642和HBc171+C ICC-1643颗粒)的模板；最后，用HBc171构建体作为精氨酸密码子最优化HBc182和HBc183构建体的模板。也制备了一个非最优化HBc182构建体(ICC-1575)作为对照。所有PCR产物都用限制酶NcoI和HindIII切割并克隆到已经用如上所述相同的酶切割的表达载体pKK223-3N中。
氨基端引物序列(NcoI限制位点加有下划线)：
    HBc149/NcoI-F
    5′-TTGGG CCATGGACATCGACCCTTA
               SEO ID NO：210
羧基端引物序列(HindIII限制位点加有下划线)
HBc156(E.cR)-H3-R
5′-GCG AAGCTTACTAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG
                                  SEQ ID NO：299
HBc156C(E.cR)-H3-R
5′-GCG AAGCTTACTAACAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGT-
            CTCCGG                SEQ ID NO：300
HBc163(E.cR)-H3-R
5′-GCG AAGCTTACTAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG
                                  SEQ ID NO：301
HBc163C(E.cR)-H3-R
5′-GCG AAGCTTACTAACAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG
                                           SEQ ID NO：302
HBc171(E.cR)-H3-R
5′-GCG AAGCTTACTACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT
                                           SEQ ID NO：303
HBc171C(E.cR)-H3-R
5′-GCG AAGCTTACTAACACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT
                                           SEQ ID NO：304
HBc183(E.cR)-H3-R
5′-GCG AAGCTTACTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGATCGCCGGCGACGCGG-
CGATTGAGAGCGTC                            SEQ ID NO：305
HBc182-H3-R
5′-GCG AAGCTTACTATTGAGATTCCCGAGATTGA
                                           SEQ ID NO：306
HBc183-H3-R
5′-GGA AAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG
                                           SEQ ID NO：307
HBc149/EindIII-R
5′-CGC AAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG        SEQ ID NO：213
HBc149+C/HindIII-R
5′-CGC AAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG  SEQ ID NO：308
实施例9.颗粒制剂
含Corixa 529-SE制剂
重组乙型肝炎核心颗粒溶液在纯化后经过滤除菌。将适量的含有所需剂量的免疫原性颗粒(通常为0.02-0.2mg)的溶液加入到小瓶中。以所需浓度(通常为0.01-0.2mg)加入Corixa 529-SE(得自CorixaCorp.，WA)，然后加入盐水使体积达到1ml。搅拌所得混合物直至基本上均匀为止。
含Alhydrogel和Corixa RC-529制剂
将Corixa RC-529(通常为0.02-0.2mg；得自Corixa Corp.，WA)加入到氢氧化铝凝胶(1mg)中。然后加入重组纯化的免疫原性嵌合体颗粒(通常剂量为0.02-2mg)，再加入盐水使体积达到1ml。搅拌所得混合物直至基本上均匀为止。
本文引用的每篇专利和论文都通过引用结合到本文中。
以上描述和实施例都是说明性的，不得解释为限制性的。还可以在本发明的精神和范围内作其它变动，并且这对于本领域技术人员来说是容易提出的。
                           序列表
<110>Page，Mark
     Friede，Martin
     Sehmidt，Annette Elisabeth
     Stober，Detlef
<120>作为慢性肝炎治疗性疫苗的稳定化HBc嵌合体颗粒
<130>4564/91569
<140>尚未指定
<141>2004-02-20
<150>10/677,074
<151>2003-10-01
<150>10/372,076
<151>2003-02-21
<160>308
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>1
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>2
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>2
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>3
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>3
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp IIe Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Pro Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>4
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>4
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>5
<211>183
<212>PRT
<213>北美土拨鼠(Marmota monax)
<400>5
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu
1               5                   10                  15
Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu
    50                  55                  60
Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln
65                  70                  75                  80
Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln
            100                 105                 110
His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Cys
            180
<210>6
<211>217
<212>PRT
<213>地松鼠(Spermophilus variegatus)
<400>6
Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro
1               5                   10                  15
Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp
            20                  25                  30
Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe
        35                  40                  45
Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala
    50                  55                  60
Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro
65                  70                  75                  80
His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr
                85                  90                  95
Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg
            100                 105                 110
Ile Ile Val Asp His Val Asn Asn Thr Trp Gly Leu Lys Val Arg Gln
        115                 120                 125
Thr Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gly His Thr Val
    130                 135                 140
Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr
                165                 170                 175
Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Arg Ser Pro Arg Arg
            180                 185                 190
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
        195                 200                 205
Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys
    210                 215
<210>7
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pkk223
<400>7
ttcacacagg aaacagaatt cccggggatc cgtcgacctg cagccaagct t             51
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pkk223
<400>8
ttcacataag gaggaaaaaa ccatgggatc cgaagctt                            38
<210>9
<211>15
<212>PRT
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>9
Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu
1               5                   10                  15
<210>10
<211>35
<212>PRT
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>10
Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Glu Lys Ala Ala Ser Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val
            20                  25                  30
Gln Gln Ala
        35
<210>11
<211>27
<212>PRT
<213>微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)
<400>11
Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu
1               5                   10                  15
Pro Ala Ala Gln Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala
            20                  25
<210>12
<211>17
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>12
Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ile Thr Lys
1               5                   10                  15
Asn
<210>13
<211>31
<212>PRT
<213>口蹄疫病毒
<400>13
Tyr Asn Gly Glu Cys Arg Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg
1               5                   10                  15
Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro
            20                  25                  30
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>14
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys
1               5                   10
<210>15
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>15
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp
            20
<210>16
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>16
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>17
<211>21
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>17
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser
            20
<210>18
<211>19
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>18
Glu Gln Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp Ser His Phe Val Ser Ile
1               5                   10                  15
Glu Leu Glu
<210>19
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>19
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>20
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>20
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>21
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>21
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>22
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>22
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>23
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>23
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>24
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>24
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>25
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>25
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>26
<211>35
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>26
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile
        35
<210>27
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>27
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>28
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>28
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>29
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>29
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ala Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>30
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>30
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>31
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>31
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>32
<211>24
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(1)
<223>1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，则2至8位的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(2)..(2)
<223>2位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则3至8位的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(3)..(3)
<223>3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则4至8位的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(4)..(4)
<223>4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则5至8位的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(5)..(5)
<223>5位的Xaa是苏氨酸、脯氨酸或不存在。如果是苏氨酸或脯氨酸，则6至8位的Xaa
     不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(6)..(6)
<223>6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则7至8位的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(7)..(7)
<223>7位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则8位的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(8)..(8)
<223>8位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(10)..(10)
<223>10位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(11)..(11)
<223>11位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(13)..(13)
<223>13位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(14)..(14)
<223>14位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(15)..(15)
<223>15位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(16)..(16)
<223>16位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，则15位的Xaa
     不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(17)..(17)
<223>17位的Xaa不存在或存在，如果存在的话，17位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
     氨酸。如果17位的Xaa存在，则15至16位的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(18)..(18)
<223>18位的Xaa是精氨酸、赖氨酸或不存在。如果是精氨酸或赖氨酸，则15至17位的
     Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(19)..(19)
<223>19位的Xaa不存在或存在，如果存在的话，19位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
     氨酸。如果19位的Xaa存在，则15至18位的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(20)..(20)
<223>20位的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸或不存在。如果是天冬酰胺或丝氨酸，则15至19
     位的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(21)..(21)
<223>21位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则15至20位
     的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(22)..(22)
<223>22位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则15至21位的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(23)..(23)
<223>23位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则15至22位的Xaa不存在。
<220>
<221>其他特征
<222>(24)..(24)
<223>24位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则15至23位的Xaa不存在。
<400>32
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20
<210>33
<211>17
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>33
Asn Asn Ala Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Val Asn Pro Ile Ser His Ile
1               5                   10                  15
Arg
<210>34
<211>142
<212>PRT
<213>鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)
<400>34
Asp Ile Leu Lys Val Ile Val Asp Ser Met Asn His His Gly Asp Ala
1               5                   10                  15
Arg Ser Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Thr Ala Glu Leu Lys
            20                  25                  30
Ile Tyr Ser Val Ile Gln Ala Glu IIe Asn Lys His Leu Ser Ser Ser
        35                  40                  45
Gly Thr Ile Asn Ile His Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Asp Lys Asn
    50                  55                  60
Leu Tyr Gly Tyr Thr Asp Glu Glu Ile Phe Lys Ala Ser Ala Glu Tyr
65                  70                  75                  80
Lys Ile Leu Glu Lys Met Pro Gln Thr Thr Ile Gln Val Asp Gly Ser
                85                  90                  95
Glu Lys Lys Ile Val Ser Ile Lys Asp Phe Leu Gly Ser Glu Asn Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Gly Ala Leu Gly Asn Leu Lys Asn Ser Tyr Ser Tyr Asn Lys
        115                 120                 125
Asp Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Ala Thr Thr Cys Ser Asp
    130                 135                 140
<210>35
<211>19
<212>PRT
<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)
<400>35
Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ala Gln Phe
1               5                   10                  15
Gly Gly Tyr
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)
<400>36
Asn Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu
1               5                   10
<210>37
<211>16
<212>PRT
<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)
<400>37
Asn Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr
1               5                   10                  15
<210>38
<211>28
<212>PRT
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>38
Leu Asp Ile Glu Lys Asp Lys Lys Lys Arg Thr Asp Glu Gln Leu Gln
1               5                   10                  15
Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr
            20                  25
<210>39
<211>28
<212>PRT
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>39
Leu Asp Ile Glu Lys Asn Lys Lys Lys Arg Thr Glu Ala Glu Leu Gln
1               5                   10                  15
Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr
            20                  25
<210>40
<211>28
<212>PRT
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>40
Ile Asp Ile Glu Lys Lys Gly Lys Ile Arg Thr Glu Ala Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Glu Leu Asn Lys Asp Tyr Pro Gly Gln Gly Tyr
            20                  25
<210>41
<211>25
<212>PRT
<213>牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)
<400>41
Gly Val Ser Pro Lys Val Cys Lys Asp Val Thr Val Glu Gly Ser Asn
1               5                   10                  15
Glu Phe Ala Pro Val Gln Asn Leu Thr
            20                  25
<210>42
<211>20
<212>PRT
<213>牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)
<400>42
Arg Ile Gln Ser Thr Trp Arg Gln Lys Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly
1               5                   10                  15
Thr Lys Tyr Val
            20
<210>43
<211>21
<212>PRT
<213>克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)
<400>43
Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala
1               5                   10                  15
Ala Thr Ala Pro Ala
            20
<210>44
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>44
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
<210>45
<211>24
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>45
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro
            20
<210>46
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>46
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Asn Pro
            20
<210>47
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>47
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Asn Pro
            20
<210>48
<211>28
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>48
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro
            20                  25
<210>49
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>49
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala
1               5                   10                  15
Asn Pro Asn Val
            20
<210>50
<211>22
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>50
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala
1               5                   10                  15
Asn Pro Asn Val Asp Pro
            20
<210>51
<211>24
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>51
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala
1               5                   10                  15
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala
            20
<210>52
<211>18
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>52
Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Val
<210>53
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>53
Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Val Asp Pro
            20
<210>54
<211>22
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>54
Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Val Asp Pro Asn Ala
            20
<210>55
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>55
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1               5                   10                  15
<210>56
<211>18
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>56
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1               5                   10                  15
Asp Pro
<210>57
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>57
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1               5                   10                  15
Asp Pro Asn Ala
            20
<210>58
<211>19
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>58
Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln
1               5                   10                  15
Pro Ala Gly
<210>59
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>59
Arg Ala Asp Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Gly Gln Pro
1               5                   10                  15
Ala Gly
<210>60
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>60
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>61
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>61
Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>62
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>62
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>63
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>63
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>64
<211>22
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>64
Ala Pro Gly Ala Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Ala Pro Gly Ala Asn
1               5                   10                  15
Gln Glu Gly Gly Ala Ala
            20
<210>65
<211>36
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>65
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp
            20                  25                  30
Asp Gln Pro Gly
        35
<210>66
<211>16
<212>PRT
<213>柏氏疟原虫(Plasmodium berghei)
<400>66
Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
<210>67
<211>24
<212>PRT
<213>约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)
<400>67
Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly
1               5                   10                  15
Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro
            20
<210>68
<211>15
<212>PRT
<213>表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)
<400>68
Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys
1               5                   10                  15
<210>69
<211>16
<212>PRT
<213>表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)
<400>69
Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu
1               5                   10                  15
<210>70
<211>9
<212>PRT
<213>弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)
<400>70
Lys Asp Arg Thr Leu Ile Glu Gln Lys
1               5
<210>71
<211>15
<212>PRT
<213>呼吸道合胞病毒
<400>71
Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys
1               5                   10                  15
<210>72
<211>25
<212>PRT
<213>溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)
<400>72
Val Glu Cys Ala Ser Thr Val Cys Gln Asn Asp Asn Ser Cys Pro Ile
1               5                   10                  15
Ile Ala Asp Val Glu Lys Cys Asn Gln
            20                  25
<210>73
<211>34
<212>PRT
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>73
Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Gly Glu Leu Ile
1               5                   10                  15
Arg Arg Ala Lys Ser Ala Glu Ser Leu Ala Ser Glu Leu Gln Arg Arg
            20                  25                  30
Val Asp
<210>74
<211>34
<212>PRT
<213>曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)
<400>74
Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Ser Glu Leu Ile
1               5                   10                  15
Arg Arg Ala Lys Ala Ala Glu Ser Leu Ala Ser Asp Leu Gln Arg Arg
            20                  25                  30
Val Asp
<210>75
<211>26
<212>PRT
<213>牛抑制素
<400>75
Ser Thr Pro Pro Leu Pro Trp Pro Trp Ser Pro Ala Ala Leu Arg Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ala Ala
            20                  25
<210>76
<211>17
<212>PRT
<213>埃博拉病毒(Ebola virus)
<400>76
Ala Thr Gln Val Glu Gln His His Arg Arg Thr Asp Asn Asp Ser Thr
1               5                   10                  15
Ala
<210>77
<211>17
<212>PRT
<213>埃博拉病毒(Ebola virus)
<400>77
His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Ala Thr Gln Val
1               5                   10                  15
Glu
<210>78
<211>17
<212>PRT
<213>埃博拉病毒(Ebola virus)
<400>78
Gly Lys Leu Gly Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly Val Ala Val Leu
1               5                   10                  15
Ile
<210>79
<211>14
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>79
Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn
1               5                   10
<210>80
<211>18
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>80
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly
1               5                   10                  15
Cys Asn
<210>81
<211>18
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>81
Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly
1               5                   10                  15
Cys Asn
<210>82
<211>42
<212>PRT
<213>阿尔茨海默病b-淀粉样蛋白(Alzheimer’s disease b-Amyloid)
<400>82
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
        35                  40
<210>83
<211>17
<212>PRT
<213>阿尔茨海默病b-淀粉样蛋白(Alzheimer’s disease b-Amyloid)
<400>83
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu
<210>84
<211>11
<212>PRT
<213>阿尔茨海默病b-淀粉样蛋白(Alzheimer’s disease b-Amyloid)
<400>84
Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
1               5                   10
<210>85
<211>33
<212>PRT
<213>阿尔茨海默病b-淀粉样蛋白(Alzheimer’s disease b-Amyloid)
<400>85
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly
<210>86
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>86
Tyr Val Ala Val Glu Asn Gly Val Ala Lys Lys Val Ala
1               5                   10
<210>87
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>87
His Phe Val Gln Gln Thr Pro Lys Ser Gln Pro Thr Leu Val Pro
1               5                   10                  15
<210>88
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>88
His Val Val Val Asn Asn Lys Val Ala Thr His Val Pro
1               5                   10
<210>89
<211>12
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>89
Pro Leu Gln Asn Ile Gln Pro Gln Val Thr Lys Arg
1               5                   10
<210>90
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>90
Ala Gln Ala Ala Asn Gly Gly Ala Ala Ser Gly Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>91
<211>10
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>91
Tyr Val Asp Glu Gln Ser Lys Tyr His Ala
1               5                   10
<210>92
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>92
His Phe Val Gln Asn Lys Gln Asn Gln Pro Pro Thr Leu Val Pro
1               5                   10                  15
<210>93
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>93
Lys Pro Ser Ser Thr Asn Ala Lys Thr Gly Asn Lys Val Glu Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>94
<211>17
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>94
Tyr Trp Thr Thr Val Asn Thr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Thr Phe Val
1               5                   10                  15
Pro
<210>95
<211>11
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>95
Tyr Val Asp Glu Lys Lys Lys Met Val His Ala
1               5                   10
<210>96
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>96
His Tyr Thr Arg Gln Asn Asn Ala Asp Val Phe Val Pro
1               5                   10
<210>97
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>97
Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Asn Asn Asn Leu Thr Leu Val Pro
1               5                   10
<210>98
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>98
Pro Pro Gln Lys Asn Gln Ser Gln Pro Val Val Thr Lys Ala
1               5                   10
<210>99
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>99
Pro Pro Ser Lys Gly Gln Thr Gly Asn Lys Val Thr Lys Gly
1               5                   10
<210>100
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>100
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Pro Gln Val Lys Val Thr Lys Ala
1               5                   10
<210>101
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>101
Gln Pro Gln Thr Ala Asn Thr Gln Gln Gly Gly Lys Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>102
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>102
Gln Pro Gln Val Thr Asn Gly Val Gln Gly Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>103
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>103
Gln Pro Ser Lys Ala Gln Gly Gln Thr Asn Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>104
<211>20
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>104
Pro Pro Ser Ser Asn Gln Gly Lys Asn Gln Ala Gln Thr Gly Asn Thr
1               5                   10                  15
Val Thr Lys Ala
            20
<210>105
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>105
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Gly Lys Thr Gly Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>106
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>106
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Gly Thr Asn Asn Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>107
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>107
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Pro Gly Gln Val Lys Val Thr Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>108
<211>24
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>108
Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Ser Thr Asn Gly Gln Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>109
<211>24
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>109
Gln Leu Gln Leu Thr Glu Ala Pro Ser Lys Ser Gln Gly Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>110
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>110
Ser Ala Tyr Thr Pro Ala His Val Tyr Val Asp Asn Lys Val Ala Lys
1               5                   10                  15
His Val Ala
<210>111
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>111
Ser Ala Tyr Thr Pro Ala His Phe Val Gln Asn Lys Gln Asn Asn Asn
1               5                   10                  15
Pro Thr Leu Val Pro
            20
<210>112
<211>12
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>112
Val Glu Gly Arg Asn Tyr Gln Leu Gln Leu Thr Glu
1               5                   10
<210>113
<211>12
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>113
Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Thr Pro Ala
1               5                   10
<210>114
<211>22
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>114
Gln Leu Gln Leu Thr Glu Pro Pro Ser Lys Asn Gln Ala Gln Thr Gln
1               5                   10                  15
Asn Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>115
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>115
Gly Arg Asp Ala Phe Glu Leu Phe Leu Leu Gly Ser Gly Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
<210>116
<211>31
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>116
Arg His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala Phe Glu Leu Phe Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Ser Asp Glu Ala Lys Gly Thr Asp Pro Leu Lys Asn His
            20                  25                  30
<210>117
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>117
Gly Arg Asp Ala Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Arg Ile Gly Asp Asp
1               5                   10                  15
Asp Glu
<210>118
<211>17
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>118
Gly Arg Asn Ala Phe Glu Leu Phe Leu Ile Gly Ser Ala Thr Ser Asp
1               5                   10                  15
Gln
<210>119
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>119
Gln Val Lys Val Thr Lys Ala Lys Ser Arg Ile Arg Thr Lys Ile
1               5                   10                  15
<210>120
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>120
Thr Leu Val Pro Ala Val Val Gly Lys Pro Gly Ser Asp
1               5                   10
<210>121
<211>17
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>121
His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro
1               5                   10                  15
Arg
<210>122
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>122
Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu
1               5                   10                  15
<210>123
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>123
Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser
1               5                   10                  15
Gln Thr
<210>124
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>124
Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala
1               5                   10                  15
Gly Val Arg Val Lys
            20
<210>125
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>125
Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val
1               5                   10                  15
Gly Val Arg Val Lys
            20
<210>126
<211>13
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>126
Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu
1               5                   10
<210>127
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>127
Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp
1               5
<210>128
<211>8
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>128
Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu
1               5
<210>129
<211>10
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>129
Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys
1               5                   10
<210>130
<211>8
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>130
Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr
1               5
<210>131
<211>6
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>131
Pro Gly Thr Ile Asn Ile
1               5
<210>132
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>132
Phe Thr Pro Pro Thr
1               5
<210>133
<211>8
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>133
Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val
1               5
<210>134
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>134
Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp Pro
1               5                   10                  15
Ala
<210>135
<211>14
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>135
Met Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu
1               5                   10
<210>136
<211>10
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>136
Met Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp
1               5                   10
<210>137
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>137
Met Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu
1               5
<210>138
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>138
Met Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys
1               5                   10
<210>139
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>139
Met Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr
1               5
<210>140
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>140
Met Pro Gly Thr Ile Asn Ile
1               5
<210>141
<211>6
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>141
Met Phe Thr Pro Pro Thr
1               5
<210>142
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>142
Met Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val
1               5
<210>143
<211>18
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>143
Met Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp
1               5                   10                  15
Pro Ala
<210>144
<211>21
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>144
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1               5                   10                  15
His Gln Leu Asp Pro
            20
<210>145
<211>8
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>145
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1               5
<210>146
<211>10
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>146
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu
1               5                   10
<210>147
<211>26
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>147
Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg
1               5                   10                  15
Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly
            20                  25
<210>148
<211>15
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>148
Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro
1               5                   10                  15
<210>149
<211>15
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>149
Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro
1               5                   10                  15
<210>150
<211>6
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>150
Gln Asp Pro Arg Val Arg
1               5
<210>151
<211>6
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>151
Gln Asp Gly Arg Val Arg
1               5
<210>152
<211>13
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>152
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly
1               5                   10
<210>153
<211>13
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>153
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly
1               5                   10
<210>154
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头肽
<400>154
Gly Ser Gly Asp Glu Gly Gly
1               5
<210>155
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>柔性连接臂序列
<400>155
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr
1               5                   10
<210>156
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>柔性连接臂序列
<400>156
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>157
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>柔性连接臂序列
<400>157
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1               5
<210>158
<211>16
<212>PRT
<213>HIV
<400>158
Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Cys
1               5                   10                  15
<210>159
<211>17
<212>PRT
<213>白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)
<400>159
Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Cys
<210>160
<211>25
<212>PRT
<213>布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)
<400>160
Val Glu Ile Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Lys Arg Glu Ile Asp Lys
1               5                   10                  15
Asn Gly Lys Val Thr Val Ser Leu Cys
            20                  25
<210>161
<211>19
<212>PRT
<213>布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)
<400>161
Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu
1               5                   10                  15
Asn Asp Cys
<210>162
<211>11
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>162
Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Cys
1               5                   10
<210>163
<211>10
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>163
Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Cys
1               5                   10
<210>164
<211>9
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>164
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Cys
1               5
<210>165
<211>21
<212>PRT
<213>克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)
<400>165
Ser His Asn Phe Thr Leu Val Ala Ser Val Ile Ile Glu Glu Ala Pro
1               5                   10                  15
Ser Gly Asn Thr Cys
            20
<210>166
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>166
Ser Val Gln Ile Pro Lys Val Pro Tyr Pro Asn Gly Ile Val Tyr Cys
1               5                   10                  15
<210>167
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>167
Asp Phe Asn His Tyr Tyr Thr Leu Lys Thr Gly Leu Glu Ala Asp Cys
1               5                   10                  15
<210>168
<211>18
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>168
Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Lys Lys Ile Lys Asn Ser Ile
1               5                   10                  15
Ser Cys
<210>169
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>169
Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro
1               5                   10                  15
Cys Ser Val Thr
            20
<210>170
<211>19
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>170
Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp Thr Pro Cys
1               5                   10                  15
Ser Val Thr
<210>171
<211>20
<212>PRT
<213>约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)
<400>171
Glu Phe Val Lys Gln Ile Ser Ser Gln Leu Thr Glu Glu Trp Ser Gln
1               5                   10                  15
Cys Ser Val Thr
            20
<210>172
<211>16
<212>PRT
<213>表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)
<400>172
Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys Cys
1               5                   10                  15
<210>173
<211>17
<212>PRT
<213>表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)
<400>173
Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu
1               5                   10                  15
Cys
<210>174
<211>16
<212>PRT
<213>淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
<400>174
Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gln Cys
1               5                   10                  15
<210>175
<211>16
<212>PRT
<213>破伤风梭菌(Clostridium tetani)
<400>175
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys
1               5                   10                  15
<210>176
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>176
Ala Ile Trp Gln Val Glu Gln Lys Ala Ser Ile Ala Gly Thr Asp Ser
1               5                   10                  15
Gly Trp Cys
<210>177
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>177
Asn Tyr Lys Asn Gly Gly Phe Phe Val Gln Tyr Gly Gly Ala Tyr Lys
1               5                   10                  15
Arg His Cys
<210>178
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>178
His Asn Ser Gln Thr Glu Val Ala Ala Thr Leu Ala Tyr Arg Phe Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Cys
<210>179
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>179
Thr Pro Arg Val Ser Tyr Ala His Gly Phe Lys Gly Leu Val Asp Asp
1               5                   10                  15
Ala Asp Cys
<210>180
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>180
Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser Tyr Ala His Gly Phe Asp
1               5                   10                  15
Phe Ile Cys
<210>181
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>181
Ala Phe Lys Tyr Ala Arg His Ala Asn Val Gly Arg Asn Ala Phe Glu
1               5                   10                  15
Leu Phe Cys
<210>182
<211>20
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>182
Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly Ile Gly Asn Tyr Thr Gln
1               5                   10                  15
Ile Asn Ala Cys
            20
<210>183
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>183
Ala Gly Glu Phe Gly Thr Leu Arg Ala Gly Arg Val Ala Asn Gln Cys
1               5                   10                  15
<210>184
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>184
Ile Gly Asn Tyr Thr Gln Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg Cys
1               5                   10                  15
<210>185
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>185
Gly Arg Asn Tyr Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Arg Thr Cys
1               5                   10                  15
<210>186
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>186
Ser Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Cys
1               5                   10                  15
<210>187
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>187
His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Cys
1               5                   10                  15
<210>188
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>188
Leu Gly Arg Ile Gly Asp Asp Asp Glu Ala Lys Gly Thr Asp Pro Cys
1               5                   10                  15
<210>189
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>189
Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Lys Cys
1               5                   10                  15
<210>190
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>190
Asn Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Val Gly Arg Asp Cys
1               5                   10                  15
<210>191
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>191
Ala His Gly Phe Asp Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn Cys
1               5                   10                  15
<210>192
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>192
Gly Val Asp Tyr Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Ala Ile Val Ser Cys
1               5                   10                  15
<210>193
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>193
His Asp Asp Met Pro Val Ser Val Arg Tyr Asp Ser Pro Asp Phe Cys
1               5                   10                  15
<210>194
<211>27
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>194
Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser Tyr Ala His Gly Phe Asp
1               5                   10                  15
Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn Cys
            20                  25
<210>195
<211>24
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>195
Asn Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala
1               5                   10                  15
Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Cys
            20
<210>196
<211>26
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>196
Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly Ile Gly Asn Tyr Thr Gln
1               5                   10                  15
Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg Cys
            20                  25
<210>197
<211>20
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>197
Ser Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr
1               5                   10                  15
Thr Pro Ala Cys
            20
<210>198
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>198
Thr Gly Ala Asn Asn Thr Ser Thr Val Ser Asp Tyr Phe Arg Asn Arg
1               5                   10                  15
Ile Thr Cys
<210>199
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>199
Ile Tyr Asp Phe Lys Leu Asn Asp Lys Phe Asp Lys Phe Lys Pro Tyr
1               5                   10                  15
Ile Gly Cys
<210>200
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>200
Leu Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Lys Leu Asn Asp Lys Phe Lys Pro Tyr
1               5                   10                  15
Ile Gly Cys
<210>201
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>201
Asn Gly Trp Tyr Ile Asn Pro Trp Ser Glu Val Lys Phe Asp Leu Asn
1               5                   10                  15
Ser Arg Cys
<210>202
<211>549
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>202
atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct    60
tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa    120
gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt    180
tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg    240
tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc    300
ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg    360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta    420
tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact    480
ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa    540
tctcaatgt                                                            549
<210>203
<211>555
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>203
atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct    60
tctgacttct ttccttccgt acgagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa    120
gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc    180
tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgca agatccagca    240
tccagagatc tagtagtcaa ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta    300
ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc    360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta    420
tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga    480
agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct    540
cgggaatctc aatgt                                                     555
<210>204
<211>555
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>204
atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct    60
tctgacttct ttccttccgt cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa    120
gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc    180
tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca    240
tctagggatc ttgtagtaaa ttatgttaat actaacgtgg gtttaaagat caggcaacta    300
ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc    360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta    420
tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga    480
agaactccct cgcctcgcag acgcagatct ccatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct    540
cgggaatctc aatgt                                                     555
<210>205
<211>549
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>205
atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct    60
tctgacttct ttccttccgt acgagatctt ctagataccg ccgcagctct gtatcgggat    120
gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt    180
tgctggggag acttaatgac tctagctacc tgggtgggta ctaatttaga agatccagca    240
tctagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatgtgg gcctaaagtt cagacaatta    300
ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cggttctaga gtatttggtg    360
tcttttggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta    420
tcaacgcttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact    480
ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa    540
tctcaatgt                                                            549
<210>206
<211>549
<212>DNA
<213>北美土拨鼠(Marmota monax)
<400>206
atggctttgg ggcatggaca tagatcctta taaagaattt ggttcatctt atcagttgtt    60
gaattttctt cctttggact tctttcctga tcttaatgct ttggtggaca ctgctactgc    120
cttgtatgaa gaagaactaa caggtaggga acattgctct ccgcaccata cagctattag    180
acaagcttta gtatgctggg atgaattaac taaattgata gcttggatga gctctaacat    240
aacttctgaa caagtaagaa caatcattgt aaatcatgtc aatgatacct ggggacttaa    300
ggtgagacaa agtttatggt ttcatttgtc atgtctcact ttcggacaac atacagttca    360
agaattttta gtaagttttg gagtatggat caggactcca gctccatata gacctcctaa    420
tgcacccatt ctctcgactc ttccggaaca tacagtcatt aggagaagag gaggtgcaag    480
agcttctagg tcccccagaa gacgcactcc ctctcctcgc aggagaagat ctcaatcacc    540
gcgtcgcag                                                            549
<210>207
<211>651
<212>DNA
<213>地松鼠(Spermophilus variegatus)
<400>207
atgtatcttt ttcacctgtg ccttgttttt gcctgtgttc catgtcctac tgttcaagcc    60
tccaagctgt gccttggatg gctttgggac atggacatag atccctataa agaatttggt    120
tcttcttatc agttgttgaa ttttcttcct ttggactttt ttcctgatct caatgcattg    180
gtggacactg ctgctgctct ttatgaagaa gaattaacag gtagggagca ttgttctcct    240
catcatactg ctattagaca ggccttagtg tgttgggaag aattaactag attaattaca    300
tggatgagtg aaaatacaac agaagaagtt agaagaatta ttgttgatca tgtcaataat    360
acttggggac ttaaagtaag acagacttta tggtttcatt tatcatgtct tacttttgga    420
caacacacag ttcaagaatt tttggttagt tttggagtat ggattagaac tccagctcct    480
tatagaccac ctaatgcacc cattttatca actcttccgg aacatacagt cattaggaga    540
agaggaggtt caagagctgc taggtccccc cgaagacgca ctccctctcc tcgcaggaga    600
aggtctcaat caccgcgtcg cagacgctct caatctccag cttccaactg c             651
<210>208
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>208
Gly Gly Thr Gly Cys Ala Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Thr Gly
<210>209
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>209
gcgaagcttc ggatcccatg gttttttcct ccttatgtga aattgttatc cgctc         55
<210>210
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>210
ttgggccatg gacatcgacc ctta                                           24
<210>211
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>211
gcggaattcc ttccaaatta acacccacc                                      29
<210>212
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>212
cgcgaattca aaaagagctc gatccagcgt ctagagac                            38
<210>213
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>213
cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g                                   31
<210>214
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>214
Gly Cys Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys
1               5                   10                  15
Cys Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Cys
            20                  25                  30
<210>215
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>215
Cys Gly Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Gly Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Thr Ala Gly Ala
            20                  25                  30
Gly Ala Cys Cys Thr Ala Gly
        35
<210>216
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>216
Met Gly Cys Glu Leu Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly
1               5                   10
<210>217
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>217
gcgccatggg gtgtgagctc gacccttata aagaatttgg                          40
<210>218
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>218
Met Gly Cys Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly
1               5                   10
<210>219
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>219
gcgccatggg gtgtgacatc gacccttata aagaatttgg                          40
<210>220
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>220
cgcaagctta gagctcttga attccaacaa cagtagtctc cg                       42
<210>221
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>221
cgcgagctcc cagcgtctag agacctag                                       28
<210>222
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>222
gtatcaggct gaaaatc                                                   17
<210>223
<211>19
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>223
Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu
<210>224
<211>57
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>224
aattaacgct aatccgaacg ctaatccgaa cgctaatccg aacgctaatc cggagct       57
<210>225
<211>49
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>225
ccggattagc gttcggatta gcgttcggat tagcgttcgg attagcgtt                49
<210>226
<211>31
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>226
Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu
            20                  25                  30
<210>227
<211>93
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>227
aattaacgct aatccgaacg ttgacccgaa cgctaatccg aacgctaatc cgaacgctaa    60
tccgaacgtt gacccgaacg ctaatccgga gct                                 93
<210>228
<211>92
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>228
ggagctccgg attagcgttc gggtcaacgt tcggattagc gttcggatta gcgttcggat    60
tagcgttcgg gtccaacgtt cggattagcg tt                                  92
<210>229
<211>23
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>229
Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu
            20
<210>230
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>230
aattaacgcg aatccgaacg tggatccgaa tgccaaccct aacgccaacc caaatgcgaa    60
cccagagct                                                            69
<210>231
<211>61
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>231
ctgggttcgc atttgggttg gcgttagggt tggcattcgg atccacgttc ggattcgcgt    60
t                                                                    61
<210>232
<211>23
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>232
Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp
1               5                   10                  15
Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu
            20
<210>233
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>233
aattaacgcg aatccgaatg ccaaccctaa cgccaaccca aacgtggatc cgaatgcgaa    60
cccagagct                                                            69
<210>234
<211>61
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>234
ctgggttcgc attcggatcc acgtttgggt tggcgttagg gttggcattc ggattcgcgt    60
t                                                                    61
<210>235
<211>31
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>235
Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu
            20                  25                  30
<210>236
<211>93
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>236
aattaacgcg aatccgaacg tggatccaaa tgccaaccct aacgctaatc caaacgccaa    60
cccgaatgtt gaccccaatg ccaatccgga gct                                 93
<210>237
<211>85
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>237
ccggattggc attggggtca acattcgggt tggcgtttgg attagcgtta gggttggcat    60
ttggatccac gttcggattc gcgtt                                          85
<210>238
<211>23
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>238
Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Ala Asn Pro Asn Val Glu Leu
            20
<210>239
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>239
aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa    60
tgttgagct                                                            69
<210>240
<211>61
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>240
caacattcgg gttggcgttg ggattagcgt tagggttggc atttggatcc acgttcggat    60
t                                                                    61
<210>241
<211>25
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>241
Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Glu Leu
            20                  25
<210>242
<211>75
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>242
aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa    60
tgttgaccct gagct                                                     75
<210>243
<211>67
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>243
cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatccacgt    60
tcggatt                                                              67
<210>244
<211>27
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>244
Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu
            20                  25
<210>245
<211>81
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>245
aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa    60
tgttgaccct aatgctgagc t                                              81
<210>246
<211>73
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>246
cagcattagg gtcaacattc gggttggcgt ttggattagc gttagggttg gcatttggat    60
ccacgttcgg att                                                       73
<210>247
<211>21
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>247
Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Val Glu Leu
            20
<210>248
<211>63
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>248
aattaacgtg gatccaaatg ccaaccctaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga    60
gct                                                                  63
<210>249
<211>55
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>249
caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatcc acgtt         55
<210>250
<211>23
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>250
Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Val Asp Pro Glu Leu
            20
<210>251
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>251
aattaacgtg gatccaaatg ccaaccctaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga    60
ccctgagct                                                            69
<210>252
<211>61
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>252
cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatccacgt    60
t                                                                    61
<210>253
<211>25
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>253
Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu
            20                  25
<210>254
<211>75
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>254
aattaacgtg gatccaaatg ccaaccctaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga    60
ccctaatgct gagct                                                     75
<210>255
<211>67
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>255
cagcattagg gtcaacattc gggttggcgt ttggattagc gttagggttg gcatttggat    60
ccacgtt                                                              67
<210>256
<211>19
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>256
Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Val Glu Leu
<210>257
<211>57
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>257
aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgagct       57
<210>258
<211>49
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>258
caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatc                49
<210>259
<211>21
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>259
Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Val Asp Pro Glu Leu
            20
<210>260
<211>63
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>260
aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgaccctga    60
gct                                                                  63
<210>261
<211>55
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>261
cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatc         55
<210>262
<211>23
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>262
Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu
            20
<210>263
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>263
aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgaccctaa    60
tgccgagct                                                            69
<210>264
<211>61
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>264
cggcattagg gtcaacattc gggttggcgt ttggattagc gttagggttg gcatttggat    60
c                                                                    61
<210>265
<211>21
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>265
Ile Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser
1               5                   10                  15
Pro Cys Ser Val Thr
            20
<210>266
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>266
aattgaatat ctgaacaaaa tccagaactc tctgtccacc gaatggtctc cgtgctccgt    60
tacctagta                                                            69
<210>267
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>267
agcttactag gtaacggagc acggagacaa ttcggtggac agagagttct ggattttgtt    60
cagatattc                                                            69
<210>268
<211>24
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>268
Ile Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala
1               5                   10                  15
Ala Gly Gln Pro Ala Gly Glu Leu
            20
<210>269
<211>72
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>269
aattccggct ggtgaccgtg cagatggcca gccagcgggt gaccgcgctg caggccagcc    60
ggctggcgag ct                                                        72
<210>270
<211>64
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>270
cgccagccgg ctggcctgca gcgcggtcac ccgctggctg gccatctgca cggtcaccag    60
ccgg                                                                 64
<210>271
<211>21
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>271
Ile Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln
1               5                   10                  15
Pro Ala Gly Glu Leu
            20
<210>272
<211>63
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>272
aattgacaga gcagccggac aaccagcagg cgatcgagca gacggacagc ccgcagggga    60
gct                                                                  63
<210>273
<211>55
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>273
cccctgcggg ctgtccgtct gctcgatcgc ctgctggttg tccggctgct ctgtc         55
<210>274
<211>21
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>274
Ile Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Pro Gly Glu Leu
            20
<210>275
<211>63
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>275
aattgcgaac ggcgccggta atcagccggg ggcaaacggc gcgggtgatc aaccagggga    60
gct                                                                  63
<210>276
<211>55
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>276
cccctggttg atcacccgcg ccgtttgccc ccggctgatt accggcgccg ttcgc         55
<210>277
<211>21
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>277
Ile Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp
1               5                   10                  15
Gln Pro Gly Glu Leu
            20
<210>278
<211>63
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>278
aattgcgaac ggcgccgata atcagccggg tgcaaacggg gcggatgacc aaccaggcga    60
gct                                                                  63
<210>279
<211>55
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>279
cgcctggttg gtcatccgcc ccgtttgcac ccggctgatt atcggcgccg ttcgc         55
<210>280
<211>39
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>280
Ile Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala
            20                  25                  30
Asp Asp Gln Pro Gly Glu Leu
        35
<210>281
<211>117
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>281
aattgcgaac ggcgccggta atcagccggg agcaaacggc gcgggggatc aaccaggcgc    60
caatggtgca gacaaccagc ctggggcgaa tggagccgat gaccaacccg gcgagct       117
<210>282
<211>109
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>282
cgccgggttg gtcatcggct ccattcgccc caggctggtt gtctgcacca ttggcgcctg    60
gttgatcccc cgcgccgttt gctcccggct gattaccggc gccgttcgc                109
<210>283
<211>25
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>283
Ile Ala Pro Gly Ala Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Ala Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Glu Leu
            20                  25
<210>284
<211>75
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>284
aattgcgccg ggcgccaacc aggaaggtgg ggctgcagcg ccaggagcca atcaagaagg    60
cggtgcagcg gagct                                                     75
<210>285
<211>67
<212>DNA
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>285
ccgctgcacc gccttcttga ttggctcctg gcgctgcagc cccaccttcc tggttggcgc    60
ccggcgc                                                              67
<210>286
<211>203
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBc嵌合体
<400>286
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr
            20                  25                  30
Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg
        35                  40                  45
Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser
    50                  55                  60
Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu
65                  70                  75                  80
Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn
            100                 105                 110
Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu
        115                 120                 125
Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val
    130                 135                 140
Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
145                 150                 155                 160
Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
        195                 200
<210>287
<211>176
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBc嵌合体
<400>287
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile
65                  70                  75                  80
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
                85                  90                  95
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val
            100                 105                 110
Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu
        115                 120                 125
Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu
    130                 135                 140
Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg
145                 150                 155                 160
Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
                165                 170                 175
<210>288
<211>177
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBc嵌合体
<400>288
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile
65                  70                  75                  80
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
                85                  90                  95
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val
            100                 105                 110
Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu
        115                 120                 125
Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu
    130                 135                 140
Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg
145                 150                 155                 160
Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
                165                 170                 175
Cys
<210>289
<211>183
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBc嵌合体
<400>289
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu
        35                  40                  45
Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu
    50                  55                  60
Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu
65                  70                  75                  80
His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp
                85                  90                  95
Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp
            100                 105                 110
Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly
        115                 120                 125
Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe
    130                 135                 140
Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr
                165                 170                 175
Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
            180
<210>290
<211>184
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBc嵌合体
<400>290
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu
        35                  40                  45
Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu
    50                  55                  60
Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu
65                  70                  75                  80
His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp
                85                  90                  95
Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp
            100                 105                 110
Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly
        115                 120                 125
Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe
    130                 135                 140
Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr
                165                 170                 175
Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Cys
            180
<210>291
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>291
Met Gly Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Gly
<210>292
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>292
ggcgccatgg ggtctagatg taacgattca agtgacatcg acccttataa agaatttcg     59
<210>293
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>293
Met Gly Cys Asn Asp Ser Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly
1               5                   10                  15
<210>294
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>294
gcgccatggg gtgtaacgat tcaagtgaca tcgaccctta taaagaattt gg            52
<210>295
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>295
Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp
1               5                   10
<210>296
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>296
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
            20                  25
<210>297
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>297
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
            20                  25
<210>298
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>298
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile Asp Ile Asp
        35
<210>299
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>299
Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Cys Gly Thr Cys Gly Ala
            20                  25                  30
Cys Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Gly Thr Cys Thr
        35                  40                  45
Cys Cys Gly Gly
    50
<210>300
<211>55
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>300
Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala
1               5                   10                  15
Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Cys Gly Thr
            20                  25                  30
Cys Gly Ala Cys Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Gly
        35                  40                  45
Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly
    50                  55
<210>301
<211>49
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>301
Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Cys Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys Gly Ala
            20                  25                  30
Cys Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Cys
        35                  40                  45
Gly
<210>302
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>302
Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala
1               5                   10                  15
Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Gly Cys
            20                  25                  30
Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys
        35                  40                  45
Cys Thr Cys Gly
    50
<210>303
<211>49
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>303
Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Gly
1               5                   10                  15
Cys Gly Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala
            20                  25                  30
Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly
        35                  40                  45
Thr
<210>304
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>304
Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala
1               5                   10                  15
Cys Gly Gly Cys Gly Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly Thr
            20                  25                  30
Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly
        35                  40                  45
Gly Ala Gly Thr
    50
<210>305
<211>66
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>305
Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala
1               5                   10                  15
Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Thr
            20                  25                  30
Thr Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys
        35                  40                  45
Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly
    50                  55                  60
Thr Cys
65
<210>306
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>306
Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Ala Gly Ala Thr Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Thr Thr Gly Ala
            20                  25                  30
<210>307
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>307
Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala
1               5                   10                  15
Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Thr Cys Cys Cys Gly
            20                  25
<210>308
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>308
Cys Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Gly Cys Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys
            20                  25                  30
Gly Gly Ala Ala Gly
        35
87

Claims (51)

1.一种治疗慢性肝炎的方法，所述方法包括：
(a)给予慢性感染乙型肝炎病毒的患者T细胞刺激量的疫苗，所述疫苗包含溶解或分散在药物可接受的稀释剂中的免疫原性颗粒，所述免疫原性颗粒包含重组乙型肝炎核心(HBc)嵌合蛋白分子，所述嵌合蛋白分子长度至多约为550个氨基酸残基并且含有
(i)HBc分子N端165个氨基酸残基中至少约125个氨基酸残基的HBc序列，所述HBc分子包含4至约75位残基和约85至约140位残基的HBc序列，并且任选包含(a′)以肽键连接的免疫原性表位，所述免疫原性表位位于所述嵌合体的N末端、HBc优势免疫环中和C末端中的一个或多个；或(b′)在HBc优势免疫环中的插入序列，所述插入序列的长度为1个至约40个氨基酸残基并且包含用于缀合半抗原的化学反应性接头残基，
(ii)以下(a′)和(b′)之一或它们两者：(a′)序列中其氨基酸位置不同于HBc前核心序列的1-3个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在所述嵌合分子中的氨基酸位置对应于从SEQ ID NO：1的HBc序列N端计算的氨基酸位置-20至约+1，即N端半胱氨酸残基；和(b′)位于从所述HBc序列C端残基开始向所述嵌合分子C端方向并且位于所述嵌合分子C端的约30个残基内的1个至约3个半胱氨酸残基，即C端半胱氨酸残基，
所述嵌合分子(a′)所含有的HBc序列中的保守取代氨基酸残基不大于约20％，(b′)在宿主细胞中表达后自我装配成颗粒，所述颗粒基本上不结合核酸，和
所述颗粒比由除了以下两点不同之外其他方面都相同的HBc嵌合分子所形成的颗粒更稳定：不含任何上述C端半胱氨酸残基或N端半胱氨酸残基，或者其中所提出的嵌合分子中存在的C端半胱氨酸残基或N端半胱氨酸残基被其它残基取代；和
(b)让所述患者保持足够时间以诱导出抗HBc的活化T细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述以肽键连接的免疫原性表位或用于缀合表位的异源接头残基是免疫原性表位。
3.权利要求2的方法，其中所述免疫原性表位是B细胞表位。
4.权利要求3的方法，其中所述重组HBc嵌合蛋白分子含有第二免疫原性表位，所述第二免疫原性表位在不同于第一免疫原性表位所键合的位置上以肽键连接在所述嵌合体的N末端、HBc优势免疫环中或C末端。
5.权利要求3的方法，其中所述B细胞表位以肽键连接在HBc序列氨基酸残基76和85之间的位置上，并且存在HBc序列76至85位中的至少5个残基。
6.权利要求5的方法，其中在氨基酸残基76和85之间的HBc序列存在，但是被所述B细胞表位间隔开。
7.权利要求2的方法，其中所述重组HBc嵌合蛋白分子还包括以肽键连接的免疫原性T细胞表位，所述T细胞表位在不同于第一免疫原性表位所键合的位置上以肽键连接在所述嵌合体的N末端、HBc优势免疫环中或C末端。
8.权利要求7的方法，其中所述T细胞免疫原性表位以肽键连接C端HBc氨基酸残基。
9.权利要求8的方法，其中存在至少一个所述C端半胱氨酸残基。
10.权利要求1的方法，其中所述嵌合体含有未被间隔的4位到至少140位的HBc氨基酸残基序列和一个在HBc嵌合蛋白分子N端的半胱氨酸残基。
11.权利要求10的方法，其中所述嵌合体含有未被间隔的4位至149位的HBc氨基酸残基序列。
12.权利要求1的方法，其中所述嵌合体含有存在于HBc优势免疫环中的用于缀合表位的异源接头残基。
13.权利要求12的方法，其中所述用于缀合表位的异源接头残基以肽键连接在HBc序列氨基酸残基76和85之间的位置上，并且至少存在HBc序列76至85位中的4个残基。
14.权利要求13的方法，其中氨基酸残基76和85之间的HBc序列存在，但是被所述用于缀合表位的异源接头残基间隔开。
15.权利要求14的方法，其中所述重组HBc嵌合蛋白分子含有4位到至少140位的HBc氨基酸残基序列。
16.权利要求15的方法，其中所述嵌合体含有4位至149位的HBc氨基酸残基序列。
17.权利要求16的方法，其中所述用于缀合表位的异源接头残基选自赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和酪氨酸残基。
18.一种治疗慢性肝炎的方法，所述方法包括：
给予罹患慢性乙型肝炎病毒感染的患者T细胞刺激量的疫苗，所述疫苗由溶解或分散在药物可接受的稀释剂中的免疫原性有效量的免疫原性颗粒组成，所述免疫原性颗粒由重组乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合分子组成，所述分子长度约135个至约525个氨基酸残基并且从其N端起含有4个以肽键连接的氨基酸残基序列结构域，所述结构域命名为结构域I、II、III和IV，其中
(i)结构域I包括约71个至约110个氨基酸残基，结构域I序列包含：(a′)HBc的至少5位至75位残基序列；(b′)序列中其氨基酸位置不同于HBc前核心序列的0-3个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在所述嵌合分子中的氨基酸位置对应于从SEQ ID NO：1的HBc序列N端计算的氨基酸位置-20至约+1，即N端半胱氨酸残基；和(c′)任选的免疫原性表位，所述免疫原性表位含有以肽键连接HBc残基2-4之一的至多约30个氨基酸残基；
(ii)结构域II包括约5个至约250个氨基酸残基而且其以肽键连接结构域I的HBc残基75，其中(a′)存在HBc序列的76-85位中的零至所有残基，所述残基以肽键连接(b′)任选存在的构成免疫原性表位的1个至约245个氨基酸残基序列或用于缀合表位的异源接头残基；
(iii)结构域III是从86位至135位的HBc序列而且其以肽键连接结构域II的残基85；和
(iv)结构域IV包括(a′)136-149位的HBc氨基酸残基序列中的5-14个残基而且其以肽键连接结构域III的135位残基，(b′)自所述嵌合分子C端起约30个残基内的0-3个半胱氨酸残基，即C端半胱氨酸残基，和(c′)免疫原性序列中的0至约100个氨基酸残基，所述免疫原性序列对165位至C端的HBc来说是异源的，
所述嵌合分子(i)的HBc序列中不大于约10％氨基酸残基被取代，(ii)在宿主细胞中表达后自我装配成颗粒，和(iii)含有至少一个N端半胱氨酸残基或C端半胱氨酸残基，所述颗粒基本上不结合核酸并且比由除了以下两点不同之外其他方面都相同的HBc嵌合分子所形成的颗粒更稳定：(i)不含任何上述C端半胱氨酸残基或N端半胱氨酸残基，或者(ii)其中所述嵌合分子中存在的所述半胱氨酸被其它残基取代。
19.权利要求18的方法，其中所述重组HBc嵌合蛋白分子含有两个免疫原性表位。
20.权利要求19的方法，其中所述重组HBc嵌合蛋白分子含有两个免疫原性表位，所述表位存在于结构域I和II、II和IV或者I和IV中。
21.权利要求19的方法，其中所述两个免疫原性表位中的一个是B细胞表位。
22.权利要求19的方法，其中所述两个免疫原性表位中的一个是T细胞表位。
23.权利要求19的方法，其中所述两个免疫原性表位中的一个是相同或不同的T细胞表位。
24.权利要求18的方法，其中所述结构域I包括以肽键连接HBc残基2-4之一的免疫原性表位，并且所述表位是T细胞表位。
25.权利要求18的方法，其中结构域II含有免疫原性表位并且所述表位是B细胞表位。
26.权利要求18的方法，其中对165位至C端的HBc来说是异源的所述序列是免疫原性T细胞表位而且其以肽键连接HBc残基140-149中的一个。
27.权利要求18的方法，其中结构域II含有一个用于缀合表位的异源接头残基。
28.权利要求24的方法，其中所述重组HBc嵌合蛋白分子含有1-3个位于所述嵌合分子C端约30个残基内的C端半胱氨酸残基。
29.权利要求28的方法，其中所述重组HBc嵌合蛋白分子含有结构域II中存在的免疫原性表位，所述表位是B细胞表位。
30.权利要求29的方法，其中所述B细胞表位含有6个至约50个氨基酸残基。
31.权利要求29的方法，其中所述B细胞表位含有20个至约30个氨基酸残基。
32.权利要求28的方法，其中所述重组HBc嵌合蛋白分子含有1个位于所述嵌合分子C端约30个残基内的半胱氨酸残基。
33.权利要求28的方法，其中在氨基酸残基76和85之间的HBc序列存在，但是被所述免疫原性表位间隔开。
34.权利要求32的方法，其中所述半胱氨酸残基位于所述嵌合蛋白分子C端约5个氨基酸残基内。
35.权利要求18的方法，其中对165位至C端的HBc来说是异源的所述序列是免疫原性T细胞表位而且其以肽键连接HBc残基140-149中的一个。
36.权利要求18的方法，其中所述免疫原性表位或用于缀合表位的异源接头残基是用于缀合表位的异源接头残基。
37.权利要求36的方法，其中所述用于缀合表位的异源接头残基选自赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和酪氨酸残基。
38.权利要求37的方法，其中所述重组HBc嵌合蛋白分子含有一个位于所述HBc嵌合蛋白分子C端的半胱氨酸残基。
39.一种治疗慢性肝炎的方法，所述方法包括：
给予罹患慢性乙型肝炎病毒感染的患者T细胞刺激量的疫苗，所述疫苗由溶解或分散在药物可接受的稀释剂中的免疫原性有效量的免疫原性颗粒组成，所述免疫原性颗粒由重组乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合分子组成，所述分子长度约170个至约250个氨基酸残基，所述分子从其N端起含有4个以肽键连接的氨基酸残基序列结构域，所述结构域命名为结构域I、II、III和IV，其中
(a)结构域I包括HBc 4位至75位残基序列以及至多约25个残基的第一序列，所述第一序列中以肽键连接所述HBc序列的氨基端残基，所述至多约25个残基的第一序列含有0或1个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在所述嵌合分子中的氨基酸位置对应于从SEQ IDNO：1的HBc序列N端计算的氨基酸位置-14至约+1，即N端半胱氨酸残基；
(b)结构域II包括约5至约55个氨基酸残基而且其以肽键连接结构域I的HBc残基75，其中至少存在HBc序列76至85位中的4个残基而且其以肽键连接任选的第二序列，第二序列至多约50个氨基酸残基而且所述第二序列对76至85位的HBc来说是异源的；
(c)结构域III是从86位至135位的HBc序列而且其以肽键连接结构域II残基85；和
(d)结构域IV包括(i)136-149位的HBc氨基酸残基序列中的5-14个残基而且其以肽键连接结构域III的135位残基，(ii)在所述嵌合分子C端约30个残基内的0或1个半胱氨酸残基即C端半胱氨酸残基，和(iii)第三序列中的0至约50个氨基酸残基，第三序列对165位至C端的HBc来说是异源的，
所述嵌合分子(i)在宿主细胞中表达后自我装配成颗粒，(ii)包括至少总有一个所述N端半胱氨酸残基或C端半胱氨酸残基和(iii)相对于SEQ ID NO：1的HBc序列中所示的序列来说，其HBc序列中不大于约5％的氨基酸残基被取代，所述颗粒的280nm与260nm吸光度比值约1.2至约1.7，并且比由除了以下两点不同之外其他方面都相同的HBc嵌合分子所形成的颗粒更稳定：缺乏所述N端半胱氨酸残基或C端半胱氨酸残基，或者其中所述嵌合分子中存在的N端半胱氨酸或C端半胱氨酸残基被其它残基取代。
40.权利要求39的方法，其中结构域II的所述第二序列对B细胞表位进行限定。
41.权利要求40的方法，其中所述第二序列含有15个至约50个氨基酸残基。
42.权利要求40的方法，其中所述第二序列含有20个至约30个氨基酸残基。
43.权利要求40的方法，其中氨基酸残基76和85之间的HBc序列存在，但是被所述第二序列间隔开。
44.权利要求40的方法，其中所述B细胞表位是存在于选自以下病原体中的氨基酸序列：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、人免疫缺陷病毒(HIV)、口蹄疫病毒、流感病毒、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodiumvivax)、柏氏疟原虫(Plasmodium berghei)、约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、呼吸道合胞病毒(RSV)、溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、乙型肝炎病毒(HBV)和埃博拉病毒(Ebolavirus)。
45.权利要求40的重组HBc嵌合蛋白分子，其中对165位至C端的HBc来说是异源的所述序列是免疫原性T细胞表位而且其以肽键连接HBc残基140-149中的一个。
46.权利要求45的重组HBc嵌合蛋白分子，其中所述T细胞表位来自HBV。
47.权利要求40的重组HBc嵌合蛋白分子，其中所述N端半胱氨酸残基位于所述嵌合蛋白分子N端约5个氨基酸残基内。
48.一种提高抗乙型肝炎病毒的一种或多种γ-生产CD8+T细胞、CD 4+T细胞和细胞毒性T淋巴细胞产量的方法，所述方法包括：
(a)给予慢性感染乙型肝炎病毒的患者T细胞刺激量的疫苗，所述疫苗包含溶解或分散在药物可接受的稀释剂中的免疫原性颗粒，所述稀释剂含有以下两种激动剂之一或它们两者：(a)toll样受体-4(TLR-4)激动剂，和(b)toll样受体-9(TLR-9)激动剂，所述免疫原性颗粒包含重组乙型肝炎核心(HBc)嵌合蛋白分子，所述嵌合蛋白分子长度至多约为550个氨基酸残基并且含有
(i)HBc分子N端165个氨基酸残基中至少约125个氨基酸残基的HBc序列，所述HBc分子包含4至约75位残基和约85至约140位残基的HBc序列，并且任选包含(a′)以肽键连接的免疫原性表位，所述免疫原性表位位于所述嵌合体的N末端、HBc优势免疫环中和C末端中的一个或多个；或(b′)在HBc优势免疫环中的插入序列，所述插入序列的长度为1个至约40个氨基酸残基并且含有用于缀合半抗原的化学反应性接头残基，
(ii)以下(a′)和(b′)之一或它们两者：(a′)序列中其氨基酸位置不同于HBc前核心序列的1-3个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在所述嵌合分子中的氨基酸位置对应于从SEQ ID NO：1的HBc序列N端计算的氨基酸位置-20至约+1，即N端半胱氨酸残基；和(b′)从所述HBc序列C端残基开始向所述分子C端方向并且位于所述嵌合分子C端的约30个残基内的1个至约3个半胱氨酸残基，即C端半胱氨酸残基，
所述嵌合体分子(a′)所含有的HBc序列中的保守取代氨基酸残基不大于约20％，和(b′)在宿主细胞中表达后自我装配成颗粒，所述颗粒基本上不结合核酸，和
所述颗粒比由除了以下两点不同之外其他方面都相同的HBc嵌合分子所形成的颗粒更稳定：不含任何上述C端半胱氨酸残基或N端半胱氨酸残基，或者其中所提出的嵌合体分子中存在的C端半胱氨酸残基或N端半胱氨酸残基被其它残基取代；和
(b)让所述患者保持足够时间以诱导出抗HBc的活化T细胞。
49.权利要求48的方法，其中所述TLR-4的激动剂与单磷酰脂质A在结构上相关。
50.权利要求49的方法，其中与单磷酰脂质A在结构上相关的所述激动剂是氨基烷基葡糖胺磷酸酯。
51.权利要求48的方法，其中将所述TLR-4激动剂和所述TLR-9激动剂中的一个或两个与所述药物可接受的稀释剂和所述免疫原性颗粒混合。
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