CN101036784A - 一种乙型肝炎治疗性细胞毒性t细胞表位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域。目前HBV感染的治疗药物主要依赖于IFN－α和核苷类似物，这些药物均不能彻底清除病毒，远期疗效较差。本发明提供一种乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗，该疫苗包括一种融合多肽，是从HBV抗原CTL表位资料中选择21个CTL表位，和两个通用型辅助性T淋巴细胞表位连接而成的融合多肽；本发明还选用酿酒酵母表达该融合抗原，并与免疫佐剂混合。本发明的疫苗能激活或增强慢性HBV感染者的细胞免疫应答，促进机体对HBV的免疫清除，可用于慢性乙型肝炎的免疫治疗。

Description

一种乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗及其制备方法

技术领域：

本发明涉及生物医药工程技术领域，是一种乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗及其制备方法。

背景技术：

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种嗜肝DNA病毒，感染人体后易形成慢性感染，是包括我国在内的东南亚国家和地区的肝硬化、原发性肝癌的首位病因。HBV感染的治疗药物目前主要依赖于IFN-α和核苷类似物，这些药物均不能彻底清除病毒，远期疗效较差。治疗性疫苗是近十年来兴起的一种特异性免疫疗法，动物和临床研究均表明接种此类疫苗可增强感染者(或动物)的细胞免疫应答，从而抑制病毒的复制。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种能激活或增强慢性HBV感染者的细胞免疫应答，用于慢性乙型肝炎的免疫治疗的乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗，及其制备方法。

本发明的乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗，包括由A和B连接而成的融合多肽：

A、二十一个细胞毒性T淋巴细胞表位

本发明从HBV抗原CTL表位资料中选择覆盖人白细胞抗原(HLA)HLA A2、A3、B7超型及A2402表型的二十一个CTL表位。CTL表位资料参见以下文献：

Maini MK，Boni C，Lee CK，et al.The role of virus-specific CD8+cells in liver damage and viral control during persistent hepatitis B virusinfection.J Exp Med.2000，191：1269-1280；

Maini MK，Boni C，Ogg GS，et al.Direct ex vivo analysis of hepatitisB virus-specific CD8 T cells associated with the control of infection.Gastroenterol.1999，117：1386-1396；

Chung MK，Yoon H，Min SS，et al.Induction of cytotoxic Tlymphocytes with peptides invitro：identification of candidate T-cellepitopes in hepatitis B virus X antigen.J Immunother.1999，22：279-287；

Chisari FV，Ferrari C.Hepatitis B virus immunopathogenesis.AnnuRev Immunol.1995，13：29-60。

上述四种HLA超型(表型)在中国人群中的覆盖率达到90％以上，所以选择这21个表位能获得较高的免疫覆盖率，并且这21个表位的保守性较强，在被HBV感染的肝细胞表面的提呈密度较高，因而可作为CTL的有效靶表位。

本发明所选择的二十一个细胞毒性T淋巴细胞表位如下(数字表示表位对应于HBV抗原的氨基酸位置，括号内为表位的氨基酸序列以及HLA限制性。)：

HBV前S2抗原：preS2 109-123(MQWNSTALHQALQDP，A3)，preS2 152-161(SILSKTGDPV，A3)

表面抗原：S 177-185(VLQAGFFLL，A2)，S 183-191(FLLTRILTI，A2)，S 249-257(LLCLIFLLV，A2)，S 313-321(IPIPSSWAF，B7)，S 335-343(WLSLLVPFV，A2)，S 348-357(GLSPTVWLSV，A2)

核心抗原：C 18-27(FLPSDFFPSV，A2/B7/B51)，C 117-125(EYLVSFGVW，A2402)，C 141-151(STLPETTVVRR，A3)

多聚酶抗原：P 354-363(TPARVTGGVF，B7)，P 377-386(LVVDFSQFSR，A3)，P 455-463(GLSRYVARL，A2)，P 530-539(FPHCLAFSYM，B7)，P 575-583(FLLSLGIHL，A2)，P 654-663(QAFTFSPTYK，A3)；P 756-764(KYTSFPWLL，A2402)

X抗原：X 92-100(VLHKRTLGL，A2)，X 115-123(CLFKDWEEL，A2)，X 126-134(EIRLKVFVL，A2)

B、两个通用型辅助性T淋巴细胞表位

HLA DR限制性表位PADRE肽(AKFVAAWTLKAAA)；

HLA DQ限制性HIV Nef 56-68肽(AWLEAQEEEEVGF)。

上述通用型辅助性T淋巴细胞表位可参见以下文献：

Alexander J，Fikes J，Hoffman S，et al.The optimization of helper Tlymphocyte(HTL)function in vaccine development.Immunol Res.1998；18(2)：79-92；

Pancre V，Georges B，Angyalosi G，et al.Novel promiscuousHLA-DQ HIV Nef peptide that induces IFN-gamma-producing memoryCD4+ T cells.Clin Exp Immunol.2002，129(3)：429-437。

本发明还对表位中的次级氨基酸残基进行替代修饰，用酪氨酸替代六个HLA A2限制性表位(S 177-185、S 249-257、S 313-320、S335-343、S 348-357、X 126-134)的第1位氨基酸残基，用异亮氨酸替代四个HLA A3限制性表位(preS2 152-161、C 141-151、P 377-386、P 654-663)的第5位氨基酸残基。将以上10个经过修饰的CTL表位和11个天然CTL表位及2个Th表位通过互联网上的HLA I、II类抗原分析程序进行表位排列，基本原则是融合抗原中的每个表位能被有效加工和相邻表位之间不能形成新CTL表位，各个CTL表位之间用K、A、Y、G或R连接，CTL表位与Th表位之间以GPGG连接。进一步用计算机辅助模拟蛋白酶体介导CTL表位处理有关程序进行分析，选择一种较理想的候选方案，经过适当优化以后得到以下选优的排列方案：M-PADRE-GPGG-HIV Nef 56-68-GPGGP-P 756-764-KA-S 335-343-AY-preS2109-123-RR-S 177-185-KR-P 354-363-KAA-X 92-100-AYY-S 313-320-Y-S 348-357-GA-P 575-583-K-P 654-663-KR-X 115-123-AY-C 18-27-C 141-151-KA-P 455-463-R-C 117-125-AY-S 183-191-KR-P 377-386-YY-X126-134-KAA-P 530-539-S 249-257-RR-preS2 152-161

本发明的乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗，其中由A和B连接而成的融合多肽优选的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗，还包括医学上可接受的免疫佐剂。

上述免疫佐剂优选含有6个拷贝免疫刺激寡核苷酸序列，全长1943碱基对质粒佐剂，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗的制备方法，包括将编码二十一个细胞毒性T淋巴细胞表位和两个通用型辅助性T淋巴细胞表位的DNA序列利用重叠延伸PCR和酶切、连接等分子生物学方法进行串联，再与乙型肝炎病毒表面抗原基因融合，然后利用酿酒酵母表达该融合蛋白，再与含有6个拷贝免疫刺激寡核苷酸序列的质粒免疫佐剂混合，得到T细胞表位疫苗。

本发明中的融合多肽可被抗原提呈细胞加工、处理为各个的T细胞表位，并被提呈到具有相应受体的T细胞表面，本发明中的免疫佐剂又能有效活化抗原提呈细胞的免疫活性，促进T细胞的激活。另外本发明用酿酒酵母表达了融合抗原，该融合抗原以HBV表面抗原(HBsAg)为载体，能自然形成直径约20nm的病毒样颗粒，在该融合抗原的分子设计中，对CTL表位提呈、CTL活化及CTL效应各环节进行了优化。本疫苗能激活或增强慢性HBV感染者的细胞免疫应答，用于慢性乙型肝炎的免疫治疗。

附图说明

图1：酿酒酵母表达产物的western-blot检测

其中1：蛋白分子量标记；2：以HBsAg 1-160 aa为载体的融合

抗原；3：空载体质粒转化的酵母菌裂解液对照

图2：电镜观察酿酒酵母表达的颗粒样颗粒抗原(×125,000)

图3：免疫刺激质粒pKO-CG6的结构

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：T细胞表位融合蛋白的表达

1，选择CTL表位

从HBV抗原CTL表位资料中选择覆盖人白细胞抗原(HLA)HLAA2、A3、B7超型及A2402表型的21个CTL表位及两个通用型Th细胞表位。

以下为本发明所选择的HBV不同抗原中的CTL表位(数字表示表位对应于HBV抗原的氨基酸位置，括号内为表位的氨基酸序列以及HLA限制性。)：

HBV前S2抗原：preS2 109-123(MQWNSTALHQALQDP，A3)，preS2 152-161(SILSKTGDPV，A3)

表面抗原：S 177-185(VLQAGFFLL，A2)，S 183-191(FLLTRILTI，A2)，S 249-257(LLCLIFLLV，A2)，S 313-321(IPIPSSWAF，B7)，S 335-343(WLSLLVPFV，A2)，S 348-357(GLSPTVWLSV，A2)

核心抗原：C 18-27(FLPSDFFPSV，A2/B7/B51)，C 117-125(EYLVSFGVW，A2402)，C 141-151(STLPETTVVRR，A3)

多聚酶抗原：P 354-363(TPARVTGGVF，B7)，P 377-386(LVVDFSQFSR，A3)，P 455-463(GLSRYVARL，A2)，P 530-539(FPHCLAFSYM，B7)，P 575-583(FLLSLGIHL，A2)，P 654-663(QAFTFSPTYK，A3)；P 756-764(KYTSFPWLL，A2402)

X抗原：X 92-100(VLHKRTLGL，A2)，X 115-123(CLFKDWEEL，A2)，X 126-134(EIRLKVFVL，A2)

通用型Th细胞抗原表位：

HLA DR限制性表位PADRE肽(AKFVAAWTLKAAA)；HLA DQ限制性HIV Nef 56-68肽(AWLEAQEEEEVGF)。

2，表位的氨基酸替代修饰

对表位中的次级氨基酸残基进行替代修饰，用酪氨酸替代六个HLA A2限制性表位(S 177-185、S 249-257、S 313-320、S 335-343、S 348-357、X 126-134)的第1位氨基酸残基，用异亮氨酸替代四个HLA A3限制性表位(preS2 152-161、C 141-151、P 377-386、P 654-663)的第5位氨基酸残基。

3，表位排列、连接方式的优化

将以上10个经过修饰的CTL表位和11个天然CTL表位及2个Th表位通过互联网上的HLA I、II类抗原分析程序进行表位排列，基本原则是融合抗原中的每个表位能被有效加工和相邻表位之间不能形成新CTL表位，各个CTL表位之间用K、A、Y、G或R连接，CTL表位与Th表位之间以GPGG连接。进一步用计算机辅助模拟蛋白酶体介导CTL表位处理有关程序进行分析，选择一种较理想的候选方案，经过适当优化以后得到以下排列方案：M-PADRE-GPGG-HIV Nef 56-68-GPGGP-P 756-764-KA-S 335-343-AY-preS2109-123-RR-S 177-185-KR-P 354-363-KAA-X 92-100-AYY-S 313-320-Y-S 348-357-GA-P 575-583-K-P 654-663-KR-X 115-123-AY-C 18-27-C 141-151-KA-P 455-463-R-C 117-125-AY-S 183-191-KR-P 377-386-YY-X126-134-KAA-P 530-539-S 249-257-RR-preS2 152-161

融合多肽的氨基酸序列SEQ ID NO.1所示。

4，CTL表位融合基因的合成

利用酿酒细胞偏爱的密码子合成以下T细胞表位融合多肽的编码基因TG，将TG插入质粒载体pUC18，得到重组质粒pUC18-TG，TG的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5，HBV表面抗原基因的合成

利用酿酒细胞偏爱的密码子合成HBV表面抗原第1至160位氨基酸的编码基因HBs160，其氨基酸序列见SEQ ID NO.3。将TG插入质粒载体pUC18，得到重组质粒pUC18-HBs160，HBs160的核苷酸序列见SEQ ID NO.4。

6，HBV表面抗原与T细胞表位融合基因的拼接及酿酒酵母表达质粒的构建

利用PCR方法将adw型HBV表面抗原第1至160位氨基酸的编码基因与T细胞表位基因拼接为一段融合基因。

引物1：5′-GGATCCCCACCATGGAAAACATTACTTCTG-3′

引物2：5′-CAGCAACGAA CTTAGCCATCTTAGCGAAAG CCCAAGAGG-3′

引物3：5′-CCTCTTGGGCTTTCGCTAAGATGGCTAAGTTCGTTGCTG-3′

引物4：5′-GAATTCTTAAACTGGGTCACCGGTCTTAG-3′

在0.5毫升离心管建立以下反应体系，用于扩增编码HBs160的DNA片段：

质粒pUC18-HBs160       10ng

10xTaqase缓冲液        5μl

引物1(5mM)             2μl

引物2(5mM)             2μl

dNTP(10mM)             2μl

MgCl2(25mM)            2μl

Taqase(2U/μl)         0.5μl

补充双蒸去离子水至总反应体积50μl，在PE2400型PCR仪进行热循环反应：先94℃变性2分钟，再94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸50秒，共进行30个循环，然后72℃延伸5分钟，温度降至4℃结束反应。PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收。

以质粒pUC18-TG为模板，以引物3、引物4扩增编码多表位融合基因TG的DNA片段，反应条件及程序同上。PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收。

HBs160与TG融合基因HBs160-TG的PCR拼接：

在0.5毫升离心管建立以下反应体系：

DNA片段HBs160            50ng

DNA片段TG                50ng

10xTaqase缓冲液          5μl

引物1(5mM)               2μl

引物4(5mM)               2μl

dNTP(10mM)               2μl

MgCl2(25mM)              2μl

Taqase(2U/μl)           0.5μl

补充双蒸去离子水至总反应体积50μl，在PE2400型PCR仪进行热循环反应：先94℃变性2分钟，再94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸50秒，共进行30个循环，然后72℃延伸5分钟，温度降至4℃结束反应。PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收，以BamH I、EcoRI酶切，酶切产物插入经过BamH I、EcoRI酶切线性化的酿酒酵母表达质粒载体pYES2(Invitrogen产品)。

在0.5毫升离心管建立以下反应体系：

BamH I、EcoRI酶切的HBs160-TG融合基因     6μl

5×T4 DNA连接酶缓冲液                    2μl

BamH I、EcoRI酶切的pYES2                 2μl

T4DNA连接酶(2U/μl)                      1μl

混匀，置于16℃水浴16小时，取5μl转化感受态大肠杆菌DH5α，得到的氨苄青霉素抗性菌落接种于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB液体培养基，再提取重组质粒进行酶切鉴定，命名为pYES2-HBs160-TG，其结构如图1所示。

7，融合蛋白在酿酒酵母中的表达

将重组表达质粒pYES2-HBs160-TG以电穿孔转化酿酒酵母细胞INVSc1二倍体(Invitrogen产品)，将单克隆转化子接种于15ml含2％葡萄糖，不含尿嘧啶的合成培养基培养，30℃高速振荡培养过夜，次日测OD600，计算细菌浓度，然后离心沉淀细菌，去培养上清，沉淀以含2％半乳糖的合成培养基悬浮，再将悬浮的细菌接种于含2％半乳糖的合成培养基，使OD600为0.4，30℃高速振荡培养6～小时，离心收集细菌沉淀，以高压匀浆法破碎细菌，破碎液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳以及免疫印迹分析，用疏水层析的方法从破碎液中纯化融合蛋白，再进行氯化铯梯度离心，对各组分进行电镜观察。结果：用HBV表面抗原的单克隆抗体能检测到特异性反应条带(图1)，CsCl密度梯度离心能形成约1.3g/ml的S抗原性峰，对峰管样品进行电镜检测表明表达的融合蛋白能形成直径22nm的球形颗粒(图2)。

实施例2：免疫佐剂质粒的构建

1，CpG ODN载体DNA片段的扩增

以真核表达质粒载体pVAX1(Invitrogen产品)为模板，PCR扩增编码卡那霉素抗性基因(KanR)和pUC质粒复制起始点(pUC ori)的DNA片断，

上游引物：5′-GAATTCAAGCTTAGAGACAGGATGAGGATC-3′，

下游引物：5′-GAATTCGGATCC GTCAACGCGT ATATCTGG-3′。

反应条件及程序同前。

2，CpG ODN载体质粒pKO的连接

上述得到的扩增产物以内切酶EcoRI酶切，得到的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA条带，再用T4 DNA连接酶进行自身环化连接，将连接产物转化大肠杆菌

得到的重组质粒pKO。pKO包含KanR和pUC ori，以及三个可以用于插入外源基因片段的单一酶切位点HindIII、EcoRI和BamHI。

3，CpG ODN质粒pKO-CG6的构建

合成含有3个CpG基序的两条互补寡核苷酸链，5′与3′末端分别加入HindIII、EcoRI酶切位点(正链中的下划线为CpG基序)：

ODN1：5′-AGCTTGGTGCATCGATGCAGCATCGAGGCAGGTGCATCGATACAGGGGGG-3′，

ODN2：5′-AATTCCCCCCTGTATCGATGCACCTGCCTCGATGCTGCATCGATGCACCA-3′，

将等量(1nmol)的ODN1、ODN2分别用多聚核苷酸激酶(PNK)进行磷酸化修饰，然后于95℃变性5min，再冷却至室温，产物与经过HindIII/EcoRI酶切的质粒载体pKO连接，得到含有3个CpG基序的质粒pKO-CG3。

合成含有3个CpG基序的两条互补寡核苷酸链，5′与3′末端分别加入EcoRI、BamHI酶切位点(正链中的下划线为CpG基序)：

ODN3：5′-AATTCGGTGCATCGATGCAGCATCGAGGCAGGTGCATCGATACAGGGGGG-3′，

ODN4：5′-GATCCCCCCCTGTATCGATGCACCTGCCTCGATGCTGCATCGATGCACCA-3′，

将等量(1nmol)的ODN3、ODN4分别用多聚核苷酸激酶(PNK)进行磷酸化修饰，然后于95℃变性5min，再冷却至室温，产物与经过EcoRI/BamHI酶切的质粒载体pKO-CG3，即得到含有6个CpG基序的质粒pKO-CG6。pKO-CG6质粒全长1943bp，结构如图3所示，含有6个CpG基序，其序列见SEQ ID NO.5。

实施例3：疫苗的制备

用疏水层析和分子筛方法从酵母细胞中纯化出T细胞表位融合抗原，用质粒大量制备系统(德国Qiagen产品)从大肠杆菌中纯化质粒佐剂，以一定的缓冲液溶解，如磷酸盐缓冲液(pH 7.0～7.4)，以一定的配伍，一定的浓度，如T细胞表位融合抗原40～80μg、质粒佐剂100～500μg，将二者混合，即可作为候选疫苗，进行动物试验，检测其药效、药理活性以及可能的毒副作用，分析其免疫原性，评价其作为治疗性乙肝疫苗的应用前景。

                            SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>一种乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗及其制备方法

<130>说明书，权利要求书

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>276

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Met Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Pro

1               5                   10                  15

Gly Gly Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Gly

            20                  25                  30

Pro Gly Gly Pro Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Lys Ala Trp

        35                  40                  45

Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Ala Tyr Met Gln Trp Asn Ser Thr

    50                  55                  60

Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Arg Val Leu Gln Ala Gly

65                  70                  75                  80

Phe Phe Leu Leu Lys Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe

                85                  90                  95

Lys Ala Ala Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ala Tyr Tyr Ile

            100                 105                 110

Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Tyr Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp

        115                 120                 125

Leu Ser Val Gly Ala Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Lys Gln

    130                 135                 140

Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Lys Arg Cys Leu Phe Lys Asp

145                 150                 155                 160

Trp Glu Glu Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val

                165                 170                 175

Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Lys Ala Gly Leu Ser

            180                 185                 190

Arg Tyr Val Ala Arg Leu Arg Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp

        195                 200                 205

Ala Tyr Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Lys Arg Leu Val Val

    210                 215                 220

Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Tyr Tyr Glu Ile Arg Leu Lys Val Phe

225                 230                 235                 240

Val Leu Lys Ala Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Leu

                245                 250                 255

Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Arg Arg Ser Ile Leu Ser Lys Thr

            260                 265                 270

Gly Asp Pro Val

        275

<210>2

<211>828

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atggctaagt tcgttgctgc ttggaccttg aaggctgctg ctggtccagg tggtgcttgg    60

ttggaagctc aagaagaaga agaagttggt ttcggtccag gtggtccaaa gtacacctct    120

ttcccatggt tgttgaaggc ttggttgtct ttgttggttc cattcgttgc ttacatgcaa    180

tggaactcta ccgctttgca ccaagctttg caagacccaa gaagagtttt gcaagctggt    240

ttcttcttgt tgaagagaac cccagctaga gttaccggtg gtgttttcaa ggctgctgtt    300

ttgcacaaga gaaccttggg tttggcttac tacatcccaa tcccatcttc ttgggctttc    360

tacggtttgt ctccaaccgt ttggttgtct gttggtgctt tcttgttgtc tttgggtatc    420

cacttgaagc aagctttcac cttctctcca acctacaaga agagatgttt gttcaaggac    480

tgggaagaat tggcttactt cttgccatct gacttcttcc catctgtttc taccttgcca    540

gaaaccaccg ttgttagaag aaaggctggt ttgtctagat acgttgctag attgagagaa    600

tacttggttt ctttcggtgt ttgggcttac ttcttgttga ccagaatctt gaccatcaag    660

agattggttg ttgacttctc tcaattctct agatactacg aaatcagatt gaaggttttc    720

gttttgaagg ctgctttccc acactgtttg gctttctctt acatgttgtt gtgtttgatc    780

ttcttgttgg ttagaagatc tatcttgtct aagaccggtg acccagtt                 828

<210>3

<211>160

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1               5                   10                  15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

            20                  25                  30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys

        35                  40                  45

Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

    50                  55                  60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65                  70                  75                  80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

                85                  90                  95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly

            100                 105                 110

Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala

        115                 120                 125

Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp

    130                 135                 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys

145                 150                 155                 160

<210>4

<211>480

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atggaaaaca ttacttctgg tttcttgggt ccattgttgg tcttgcaagc tggtttcttc    60

ttgttgacca gaatcttgac catcccacaa tctttggact cctggtggac ctccttgaac    120

ttcttgggtg gttctccagt ctgtttgggt caaaactctc aatctccaac ctccaaccac    180

tctccaacct cctgtccacc aatctgtcca ggttacagat ggatgtgttt gagaagattc    240

attatcttct tgttcatctt gttgttgtgt ttgatcttct tgttggtctt gttggactac    300

caaggtatgt tgccagtctg tccattgatc ccaggttcta ccactacctc taccggtcca    360

tgtaagacct gtaccactcc agctcaaggt aactctatgt tcccatcctg ttgttgtacc    420

aagccaaccg acggtaactg tacctgtatc ccaatcccat cctcttgggc tttcgctaag    480

<210>5

<211>106

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aagcttggtg catcgatgca gcatcgaggc aggtgcatcg atacaggggg gaattcaggt    60

gcatcgatgc agcatcgagg caggtgcatc gatacagggg ggatcc                   106

Claims (7)

1、一种乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗，其特征在于它包括由A和B连接而成的融合多肽：

A、二十一个HBV抗原的细胞毒性T淋巴细胞表位

preS2 109-123，

preS2 152-161，

S 177-185，

S 183-191，

S 249-257，

S 313-321，

S 335-343，

S 348-357，

C 18-27，

C 117-125，

C 141-151，

P 354-363，

P 377-386，

P 455-463，

P 530-539，

P 575-583，

P 654-663，

P 756-764，

X 92-100，

X 115-123，

X 126-134；

B、两个通用型辅助性T淋巴细胞表位

HLA DR限制性表位PADRE肽，

HLA DQ限制性HIV Nef56-68肽。

2、根据权利要求1所述的一种乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗，其特征在于由A和B连接而成的融合多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3、根据权利要求1或2所述的一种乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗，其特征在于它还包括医学上可接受的免疫佐剂。

4、根据权利要求3所述的一种乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗，其特征在于其中的免疫佐剂是质粒佐剂，它的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

5、一种如权利要求1所述的乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗的制备方法，其特征在于它包括将编码二十一个细胞毒性T淋巴细胞表位和两个通用型辅助性T淋巴细胞表位的DNA序列利用分子生物学方法进行串联，再与乙型肝炎病毒表面抗原基因融合，然后利用酿酒酵母表达该融合蛋白。

6、根据权利要求5所述的一种乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗的制备方法，其特征在于它还包括表达出的融合蛋白再与免疫佐剂混合，得到T细胞表位疫苗。

7、根据权利要求6所述的一种乙型肝炎治疗性细胞毒性T细胞表位疫苗的制备方法，其特征在于其中的免疫佐剂是质粒佐剂，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

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