CN1903363A - 一种嵌合型病毒样颗粒dna疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗。该嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗是在多克隆位点插入有由人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸残基、不致病保护性目的抗原和人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸残基组成的嵌合蛋白的编码基因的重组真核表达载体。该嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗不仅可以产生较强的B细胞活性，激发高强度的抗体水平，更重要的是通过间接提呈(cross presentation)增强细胞免疫水平，激活T细胞和毒性T细胞活性，激活更为强烈的完全免疫反应，使机体产生保护性免疫能力。

Description

一种嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗

技术领域

本发明涉及一种DNA疫苗，特别涉及一种嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗。

背景技术

有多种方法可以预防各种病原体感染，提高机体免疫力是最主要的手段，一般是以接种疫苗而达到的。接种疫苗是预防各种病原体感染的有效措施。常见的病原体有病毒、微生物、真核细胞、寄生虫和环境因子等有机体和分子。目前已有多种方法用来生产抗传染性病原体的疫苗，如灭活疫苗，减毒活疫苗、重组疫苗，亚单位疫苗和核酸疫苗等。它们的基本作用原理是相同的，即借助与病原体结合的组织相容性蛋白激发免疫反应，达到免疫个体不被传染性病原体感染的目的。当个体与传染性病原体接触时，其免疫系统能够识别病原体蛋白而产生有效的保护反应抵抗传染。目前所用的许多疫苗就是由从病原体中分离出来的非传染性和低传染性的蛋白或核酸物质所组成。较为安全的疫苗有两类，重组蛋白疫苗和核酸疫苗。

重组蛋白疫苗又称重组亚单位苗，是指将不致病保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，再以这种生物合成的基因产物制成的疫苗。这种亚单位疫苗只含有产生保护性免疫应答所必需的免疫原成分，不含免疫所不需要的成分，因此有很多优点。首先是安全性好，疫苗中不含传染性材料，接种后不会发生急性、持续或潜伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情况，如妊娠动物。其次，这些疫苗减少或消除了常规疫苗或死疫苗难以避免的热原、变应原、免疫抑制原和其它有害的反应原。此外，这种疫苗产生的免疫应答可以与感染产生的免疫应答相区别，因此更适合于疫病的控制和消灭计划。但此类疫苗存在严重的不足之处，人们已经发现，重组蛋白疫苗难以产生完整的免疫反应，即不产生细胞免疫反应，包括毒性T-淋巴细胞。原因是多方面的。如：1)基因片段体外表达不能提供与天然病毒一致的空间构像，从而激活的免疫反应效率低；2)基因重组蛋白的抗原提呈过程往往只是局限于与MHC-II型分子的结合，无法激活细胞免疫活性，从而使多数研制的基因重组疫苗达不到应有的保护水平。目前世界上成功的基因重组疫苗是八十年代初研制的人乙肝疫苗。由于其特殊的蛋白质结构形成的病毒样颗粒，使其成为唯一上市的基因重组疫苗。另外DNA疫苗的出现，给疫苗的发展提供了一个新的希望。它不仅安全，方便，更重要的是，它可以激活体液和细胞双重反应。但是几年的研究表明，DNA疫苗的免疫源性比减毒病毒疫苗低一些(Berzofsky，J.A.Nature Reviews，2001，1：209)。所以探索更有效的方法成为今后方向。近年来，免疫学研究发现，空壳的病毒颗粒，即病毒样颗粒作为免疫原，可以提高免疫效率，尤其是在重组蛋白疫苗达不到的激活毒性T-淋巴细胞活性方面，病毒样颗粒可以通过交叉提呈方式激活毒性T-淋巴细胞活性，同时激活高强度的抗体水平。

病毒样颗粒作为载体的研究近年来成为关注的方向之一，如利用VSV-G抗原(Marsac，D.，et al，2002)、HBV-S抗原(Chengalvala，M.V.et al.1999.Vaccine 17：1035；Netter，H.，et al.2001.J.Virol，75：2130)、parvovirus(Sedlik，C.，et al，1997.Proc.Natl.Acad.Sci.94：7503)、酵母转座子的Ty抗原等(Layton，G.，et al.，1993.J.of Immunol.151：1097)。采用病毒样颗粒有许多优势如：1)更有效的使抗原提呈；2)非复制型，安全性好；3)不需佐剂；4)可产生细胞免疫反应，尤其是可以激活MHC-1限制性CTL反应(Fehr，T.，et al，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.95：9477)。所以此技术将被看成有前景的技术。关于病毒样颗粒如何使得抗原激活CTL活性，仍然有许多需要探讨的问题。许多研究表明，纳米至微米的小球结构使得抗原提呈细胞提呈过程与可溶性蛋白不同，如内吞(endocytic)或吞噬(phagocytic)，从而激活不同的MHC分子途径(Lee，I.-H.et al，1996.J.Med.Virol.50：145；Schirmbeck，R.1995，J.Immunology，155：4676)。

虽然HBV-S抗原可以形成颗粒，并且加载在S抗原上的重组疟疾疫苗已加入临床试验(Bojang，et al.2001.Lancet 358：1927)，但是S抗原颗粒所产生免疫反应要远远低于核心抗原。几乎所有HBV感染的病人都会产生针对核心抗原C表位较强的免疫反应(Salfeld，J.，et al，1989.J.Virol.63：798)。核心抗原分子小，只有22kd，有利于基因操作和表达(Koletzki，D.，et al，1997，J.Gen.Virol，78：2049)。

但是，以上的改造只是将体外表达的产物进行纯化后免疫机体，而产生免疫反应。其制备和纯化过程复杂，成本高。

发明内容

本发明的目的是提供一种嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗。

本发明所提供的嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗，是在多克隆位点插入有由人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸残基、不致病保护性目的抗原和人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸残基组成的嵌合蛋白的编码基因的重组真核表达载体。

所述嵌合蛋白中，人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸残基位于氨基端，人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸残基位于羧基端，不致病保护性目的抗原位于中间。

为了不影响目的抗原的空间结构和抗原表位的展示，所述不致病保护性目的抗原的氨基端与人乙肝病毒核心抗原的自氨基端的第78位氨基酸残基通过具有序列表中序列5的氨基酸残基序列的连接肽linker1连接；所述不致病保护性目的抗原的羧基端与人乙肝病毒核心抗原的自氨基端的第80位氨基酸残基通过具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的连接肽linker2连接。

所述人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸残基具有序列表中序列1的氨基酸残基序列；所述人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸残基具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。

用于构建所述重组真核表达载体的出发载体为可在哺乳动物细胞中表达外源基因的表达载体，如proVAX，pVAX，pcDNA3或pCI等可以用于真核细胞表达的载体。

所述不致病保护性目的抗原可为现有的已知不致病保护性抗原，如口蹄疫病毒VP1，或禽流感病毒NA和NH抗原，或新城疫病毒HN和F抗原，或艾滋病病毒GP160抗原和NEF抗原或肿瘤相关抗原如，MAG-1、gastrin等。

所述嵌合蛋白具有序列表中序列3的氨基酸残基序列，名称为HBc-VP1。

序列表中的序列3由370个氨基酸残基组成，自氨基端第79位至83位氨基酸残基为连接肽linker1，自氨基端第297位至301位氨基酸残基为连接肽linker2。

所述嵌合蛋白HBc-VP1的编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列4的DNA序列；

2)编码序列表中序列3蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中序列4的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中序列4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的序列4由1110个脱氧核苷酸组成，其编码序列为自5′端第1位至1110位脱氧核苷酸。

所述疫苗具体可为proVAX-ABC；proVAX-ABC是将序列表中序列4的DNA序列插入proVAX的EcoRI及XbaI的酶切位点间得到的重组表达载体。

所述DNA疫苗中还可含有佐剂，如左旋咪唑、矿物油或铝盐佐剂。

为了使不致病保护性目的抗原能在人乙肝病毒核心抗原中进行有效地表达并且能够展示在核心抗原之外，本发明以可形成病毒样颗粒的人乙肝病毒核心抗原为载体，将不致病保护性目的抗原基因片段克隆和嵌合于人乙肝病毒核心抗原表位的编码基因中(人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第78位氨基酸和80位氨基酸的密码子之间)形成DNA疫苗，再将该DNA疫苗注射于体内，在表达过程中，不致病保护性目的抗原与人乙肝病毒核心抗原共同形成嵌合型病毒样颗粒。不致病保护性目的抗原呈现在人乙肝病毒核心抗原表面而提高其免疫的提呈，不仅可以产生较强的B细胞活性，激发高强度的抗体水平，更重要的是通过间接提呈(crosspresentation)增强细胞免疫水平，激活T细胞和毒性T细胞活性，激活更为强烈的完全免疫反应，使机体产生保护性免疫能力。

本发明的嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗可与佐剂或不与佐剂混合免疫动物，激活细胞内一系列信号而产生完全免疫反应。本发明的嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗可防治病原体感染、抗肿瘤、治疗自主免疫疾病和清除蛋白性毒素引起的中毒症状等。本发明的嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗针对性的致病病原体有：病毒、原核细胞、真核细胞。真核细胞病原体包括单细胞致病病原体和多细胞寄生虫类。病毒性病原体包括呼吸道病毒(冠状病毒、流感和轮状病毒)、疮疹病毒(德国麻疹、水痘、牛痘、天花、带状疮疹等)、中枢神经系统病毒(沅病毒)、免疫系统病毒(艾滋病毒)、生殖系统病毒(尖锐湿疣)、畜牧病毒(口蹄疫病毒、猪瘟)、和一切可能的致病性病毒。

本发明的嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗能够有效的激发完全免疫反应，又避免使用感染性的制剂，载体和不安全的遗传物质。其它常规免疫接种技术(除了核酸疫苗以外)，如果不使用感染性制剂就不会激活细胞毒性T细胞反应，因此灭活或失活疫苗，亚单位疫苗接种均不产生完全的免疫反应。本发明的嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗能有效地克服常规免疫接种技术的这些不足。本发明的嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗能够有效的提高激发完全免疫反应的能力，保护机体抵抗病原体侵染，而且制备简单无需复杂设备，使用时操作简单。

附图说明

图1为嵌合蛋白HBc-VP1基因克隆示意图

图2为RT-PCR检测嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗proVAX-ABC在Hela细胞中的表达结果

图3为透射电镜检测嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗proVAX-ABC在Hela细胞中的表达结果

图4A为转proVAX-ABC的Hela细胞培养上清液与抗口蹄疫VP1的抗体反应结果

图4B为转proVAX-ABC的Hela细胞培养上清液与抗人乙肝病毒核心抗原的抗体反应结果

图5为ELISA检测proVAX-ABC免疫小鼠IgG抗体水平的变化结果。

图6为流式细胞检测免疫proVAX-ABC的小鼠T细胞体外增殖情况。

图7为RT-PCR检测免疫proVAX-ABC的小鼠体内细胞因子表达水平结果。

图8为流式细胞检测免疫proVAX-ABC的小鼠体内CTL水平结果。

具体实施方式

下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗的制备

1、含有嵌合蛋白HBc-VP1的编码基因的重组表达载体proVAX-ABC的构建

为了使口蹄疫病毒VP1基因能在人乙肝病毒核心抗原中进行有效地表达并且能够展示在核心抗原之外，将口蹄疫病毒VP1基因片段克隆于人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第78位氨基酸和80位氨基酸的密码子之间，以利于抗原的展示和提呈。具体方法如下：

(1)引物设计：根据人乙肝病毒核心抗原基因及口蹄疫病毒VP1基因的序列，并按照图1中的克隆思路设计3套引物。引物序列分别为

CP01：5’-AAGAATTCGGCACGGACATTGACCCGTATAAA-3’，

CP02：5’-ACCTCCACCTCCGGAGTCTTCCAAATTACTTCCC-3’)，CP01与CP02克隆得到人乙肝病毒核心抗原基因的上游区(1-78氨基酸)，并命名为A片段；

CP03：5’-TCCGGAGGTGGAGGTTCCACCACCTCTGCGGGTGAG-3’，

CP04：5’-TCCACCTCCACCCAGAAGCTGTTTTGCGGG-3’，CP03与CP04克隆得到口蹄疫VP1基因，并命名为B片段；

CP05：5’-GGAGGTGGAGGTTCCAGGGAATTAGTAGTCAG-3’，

CP06：5’-AATCTAGACTAACATTGAGATTCCCGAG-3’，CP05与CP06克隆得到人乙肝病毒核心抗原基因的下游区(80-148氨基酸)，并命名为C片段。

(2)基因克隆：

利用上述3对引物分别以人乙肝病毒核心抗原基因及口蹄疫VP1基因的cDNA(H.L.Jing，Z.Ma，Y.Li，F.H.Zhang and B.Wang.Effects of ChemicalAdjuvants on DNA vaccination.2004，Vaccine，22，2925-2935)为模板，PCR得到3个基因片段。将3种PCR产物通过凝胶回收、纯化并定量。根据图1设计，再以CP01及CP06为引物，以3种PCR产物混合后为模板，利用3种PCR产物两两重叠的性质，PCR得到嵌合基因ABC，即具有序列表中序列4的DNA序列的嵌合蛋白HBc-VP1的编码基因。其中，3个基因片段PCR反应体系：2μl PCR缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl₂，0.01％(0.01g/100ml)gelatin；Takara公司，大连)，2μl 10mM dNTP(Takara公司，大连)和0.25U of exTaq聚合酶(Takara公司，大连)。PCR扩增程序：先94℃30s，58℃30s，74℃50s，30个循环；然后72℃，10min。将PCR得到的ABC以T-A克隆的方式克隆至pMD18-T载体，对其进行序列分析，选择正确的阳性克隆命名为pMD18-T-ABC，进行下一步的实验。

(3)proVAX-ABC的构建：由于引物CP01与CP06中分别设计有EcoRI及XbaI的酶切位点，利用EcoRI及XbaI分别对pMD18-T-ABC及真核表达载体proVAX(proVAX真核表达载体在pGEM-T载体(Promega公司产品)的基础上构建而成。具体的方法是，将pGEM-T载体的启动子、多克隆位点及其polyA等序列切除，再将含有CMV启动子、人绒毛膜促性腺激素的信号肽序列、多克隆位点及BGH polyA等序列插入载体的相应部位。同时，将pGEM-T载体的氨苄青霉素抗性基因的序列切除，并将以pEGFP-N3载体(Clonetech公司产品)为模板，PCR扩增出的卡那霉素抗性基因序列插入载体的相应部位。最终得到的新载体命名为proVAX)并进行双酶切，将酶切获得的ABC与proVAX载体进行回收、连接，选择含有具有序列表中序列4的DNA序列的嵌合蛋白HBc-VP1的编码基因(ABC)的阳性克隆，命名为proVAX-ABC。

2、嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗proVAX-ABC在Hela细胞中的体外表达检测

碱裂解法大量提取纯化三种质粒DNA proVAX，proVAX-VP1(将口蹄疫VP1的cDNA基因克隆到proVAX载体的EcoRI及XbaI位点内而得到的重组载体)和proVAX-ABC，利用脂质体方法转染Hela细胞，按Lipofectamine转染试剂盒(Invitrogen公司产品)说明书进行操作。在转染后48h，收获细胞。用Trizol法提取细胞的总RNA，反转录得到cDNA，然后用VP1特异性引物(P1-5’ACCACCTCTGCGGGTGAG-3’，P2-5’TTCCAGGGAATTAGTAGTCAG-3’)和ABC特异性的引物(CP01与CP06)进行PCR，检测Hela细胞中目的基因的表达。结果如图2所示，proVAX-VP1转染后的Hela细胞在700bp左右出现特异性条带，proVAX-ABC转染后的Hela细胞在1100bp左右出现特异性条带，表明VP1基因与ABC均能在Hela细胞中成功的表达。图2中，泳道1为DNA2000分子量标准(购自大连宝生物公司)；泳道2-3分别为proVAX-VP1和proVAX-ABC转染后的RT-PCR结果；泳道4-5为proVAX空载体转染后的RT-PCR对照；泳道6-7分别为proVAX-VP1和pro-VAX-ABC转染后，以RNA为模板的PCR对照。

同时，由于proVAX载体为分泌型表达载体，其表达产物可被分泌到培养基上清液中。为进一步鉴定上述ABC表达产物是否是病毒样颗粒，在转染后48h，收集细胞培养液的上清液，利用投射电镜检测培养上清中是否有病毒样颗粒的表达。结果如图3所示，投射电镜检测检测结果表明转染proVAX-ABC后培养液中有30-50nm病毒样颗粒的表达(图3中A箭头示)，表明嵌合蛋白HBc-VP1的编码基因ABC能在真核细胞中成功的表达并分泌。图3中，A为转染proVAX-ABC后Hela细胞上清液透射电镜检测结果；B为转染proVAX-VP1后Hela细胞上清液透射电镜检测结果。

3、Western Blot法检测ABC产物的正确性

在上述表达后，取20μl上清在样品变性液中100℃处理后，置于12％SDS-PAGE胶电泳后，电转移至尼龙薄膜上。鉴定上述电泳中的条带是否是嵌合蛋白HBc-VP1和VP1，利用兔抗口蹄疫的抗血清(以商品的口蹄疫疫苗为抗原按常规方法免疫兔子得到的抗血清)或抗人乙肝病毒核心抗原的抗体(华美生物公司)与分别于转移后的硝酸纤维素膜上反应，在有HRP标记的第二抗体下，使其显色。结果如图4所示，图4A为与抗口蹄疫VP1的抗体反应结果，图4B为与抗人乙肝病毒核心抗原的抗体反应结果；结果表明在与抗口蹄疫的抗体反应后，56kd的ABC产物(嵌合蛋白HBc-VP1)呈现阳性(A)；在与抗人乙肝病毒核心抗原的抗体反应后，ABC产物(嵌合蛋白HBc-VP1)显阳性(B)。说明Hela细胞表达的ABC正确。图4A和图4B中，泳道1为Hela细胞培养上清液，泳道2为转proVAX的Hela细胞培养上清液，泳道3为转proVAX-ABC的Hela细胞培养上清液。

实施例2、嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗proVAX-ABC的动物实验

1、小鼠实验

4-6周龄雌性C57BL/6小鼠(购于中国医学科学院实验动物研究所)，分4组，每组6只，分别为免疫proVAX-VP1(100μg/每只/次)，proVAX-ABC(100μg/每只/次)，proVAX(100μg/每只/次)及其PBS对照组(100μl/每只/次)。每只小鼠第0天首免，第14天加强免疫一次。第一次免疫后14，28，42，56，70天采集小鼠血清，-20℃保存备用。

(1)ELISA检测proVAX-VP1免疫小鼠IgG抗体水平的变化

以1μg/ml 146S抗原(去除牛口蹄疫O型灭活疫苗(购自内蒙古金宇生物制药厂)中的矿物油，得到146S抗原)包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜；PBST(0.05％Tween20溶于PBS)洗涤3次，每次5min，3％BSA，100μl/孔，37℃封闭1h；PBST洗涤后，将第一次免疫后14，28，42，56，70天的小鼠血清做2倍梯度稀释，以未免疫的小鼠血清作对照，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，加入经1∶1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(其终浓度为1ng/ml)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，加底物TMB显色，100μl/孔，37℃避光显色15min；加入0.2M硫酸终止显色，100μl/孔；OD 450nm/620nm处测光密度值。实验孔的OD值为对照孔的两倍时认为是阳性。结果如图5所示，表明免疫空载体proVAX组未产生病毒特异性IgG；proVAX-VP1及proVAX-ABC免疫后均能产生较高水平的IgG，但后者较前者有显著的增强。

(2)proVAX-VP1免疫小鼠T细胞增殖实验

加强免疫后7天处死小鼠，在无菌条件下，取小鼠脾脏，研碎，用红细胞裂解液除去红细胞，并过尼龙柱除去B细胞制成单细胞悬液，PBS液洗3次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到1×10⁷个/ml，加入绿色荧光染料CFSE(终浓度为5μM)，室温染色20min。PBS液洗3次，将细胞悬于1640培养基并调整细胞浓度到加1×10⁵个/ml，入24孔培养板中。每组细胞加rHBsAg抗原(购自北京生物制品研究所)至终浓度为5μg/ml，培养48h后，流式细胞仪检测细胞增殖的比例。结果如图6所示，表明免疫空载体proVAX后仅能产生低水平的本底T细胞扩增(增殖比例为18.5％)，而proVAX-VP1及proVAX-ABC免疫后能产生较高水平的淋巴细胞扩增，与空载体有显著差异(P＜0.05)；且proVAX-ABC组产生的增殖效果(增殖比例为49.1％)比proVAX-VP1组(增殖比例为36.7％)又有显著的提高(图6)。图6中，A为免疫空载体proVAX的小鼠T细胞增殖情况，B为免疫proVAX-VP1的小鼠T细胞增殖情况，C为免疫proVAX-ABC的小鼠T细胞增殖情况；图中，M1表示细胞增值的百分比。

(3)RT-PCR检测细胞因子

加强免疫后7天后，按步骤(2)的方法得到T淋巴细胞，用Trizol(北京鼎国生物公司)提淋巴细胞的总RNA，进行逆转录得到cDNA，通过PCR检测持家基因HPRT的表达，调节各组cDNA的浓度一致，各组cDNA进行特异引物PCR扩增，PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统照相。PCR反应条件和引物序列见表1。

                           表1.PCR引物

靶基因	引物序列	PCR反应参数
			HPRT	5’-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG，3’-GAGGGTAGGCTGGCCTATGGCT	94℃30s，60℃30s和72℃40s，共30个循环
IL-2	5’-TCCACTTCAAGCTCTACAG，3’-GAGTCAAATCCAGAACATGCC	94℃30s，55℃30s和72℃40s，共30个循环
			IFN-γ	5’-CATTGAAAGCCTAGAAAGTCTG，3’-CTCATGGAATGCATCCTTTTTCG	94℃30s，58℃30s和72℃40s，共30个循环
IL-4	5’-GAAAGAGACCTTGACACAGCTG.3’-GAACTCTTGCAGGTAATCCAGG	94℃30s，54℃30s和72℃for 40s，共30个循环
			IL-12	5’-TACTCCTTGTTGTCCCCTCTG，3’-GTGGCCATATGGGAACTGAAG，	94℃30s，55℃30s和72℃40s，共30个循环
IL-5	5’-GAAAGAGACCTTGACACAGCTG，3’-GAACTCTTGCAGGTAATCCAGG，	94℃30s，52℃30s和72℃40s，共30个循环

实验结果如图7所示，表明免疫空载体组与未免疫的对照组仅有IL-12和IL-5有少量表达，其余各种细胞因子的表达均未检测到；而proVAX-VP1及proVAX-ABC免疫后IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的表达均显著提高，且后者与前者相比，IL-12和IFN-γ的表达也有显著的提高。图7中，泳道1为免疫空载体组，泳道2为免疫proVAX-VP1组，泳道3为免疫proVAX-ABC组，泳道4为未免疫的对照组。

(4)流式细胞仪检测体内CTL

加强免疫后7天，取未免疫Balb/c小鼠，引颈处死，无菌条件下制备脾脏单细胞悬液，按步骤(2)的方法得到CFSE高浓度(5μM)和CFSE低浓度(5μM)染色的脾脏细胞。将高浓度染色后的细胞与口蹄疫病毒VP1蛋白肽(SSKYGDTSTNNVRGD，由上海吉尔生化合成)共孵育30min，作为靶细胞。低浓度染色的细胞不孵育肽作为对照。将两组染色后的细胞混合，以尾静脉注射的方法转移到各免疫组小鼠的体内。四小时后，将转移细胞后的小鼠处死，制备脾脏细胞悬液，铜网过滤后流式细胞仪检测各组小鼠体内阳性荧光细胞数，并计算其杀伤率。杀伤率＝100×[1-(试验组的CFSE高浓度阳性荧光细胞百分比/试验组CFSE低浓度阳性荧光细胞百分比)/(阴性对照组的CFSE高浓度阳性荧光细胞百分比/阴性对照CFSE低浓度阳性荧光细胞百分比)]。该公式中，阴性对照组为未免疫小鼠，试验组为免疫空载体组、proVAX-VP1免疫组、proVAX-ABC免疫组。结果如图8所示，表明免疫空载体组和未免疫组均未能产生有效的CTL反应，而proVAX-VP1及proVAX-ABC免疫后CTL反应有显著的提高，其杀伤效率分别达到24.8％和41.7％。图8中，A、B、C、D分别为未免疫小鼠(阴性对照组)、免疫空载体组小鼠、proVAX-VP1免疫组小鼠、proVAX-ABC免疫组小鼠；M1表示CFSE低浓度阳性荧光细胞的百分比，M2表示CFSE高浓度阳性荧光细胞的百分比。

2、豚鼠实验

400-500g豚鼠(购于中国医学科学院实验动物研究所)随机分六组，分别免疫proVAX-VP1(200μg/每只/次)，proVAX-VP1(500μg/每只/次)，proVAX-ABC(200μg/每只/次)，proVAX-ABC(500μg/每只/次)，proVAX(500μg/每只/次)及口蹄疫灭活疫苗FMDV疫苗(内蒙古金宇生物药品厂)(1mL/每只/次)。第一次免疫后14天加强免疫一次。第一次免疫后28天心脏采血法采集抗血清，利用口蹄疫中和抗体试剂盒(中国农科院兰州兽医研究所购买)对血清口蹄疫特异性中和抗体水平进行检测。豚鼠加强免疫后14天，采集血清后，对其进行活病毒攻毒实验。方法是脚掌皮下注射O型口蹄疫活病毒(内蒙古金宇生物药品厂)0.2ml，毒量为100半数感染量(100ID50)。攻毒后1至7天对其发病情况进行监测，其保护程度可以分为：全保护(豚鼠所有脚掌均无水疱发生)；半保护(只有豚鼠攻毒的脚掌发生水疱)；未保护(除攻毒外其它脚掌发生水疱)。其严重程度可分为：无症状；中等症状(注射脚掌出现水疱)；严重(两只或两只以上的脚掌发生水疱)。

结果如表2所示，表明免疫空载体组未产生有效的中和抗体水平；免疫proVAX-VP1和proVAX-ABC后，中和抗体水平显著提高，且高剂量组与低剂量组中和抗体也有显著差别。当中和抗体水平达到或超过32时，豚鼠基本能保护；保护率与抗原免疫剂量也有正相关的关系(表2)。

表2.各免疫组豚鼠中和抗体产生情况及攻毒后1至7天的发病和保护情况

组别豚鼠编号	中和抗体滴度	保护情况	发病
				proVAX-VP1(200μg)6789	16＜83216	无无保护无	严重严重无严重
proVAX-VP1(500μg)1112131415	1616326432	无无无保护保护	严重严重严重无无
				proVAX-ABC(200μg)21222324	16646416	无保护保护无	严重无无严重
proVAX-ABC(500μg)3132333435	12864326432	保护保护保护保护部分保护	无无无无轻
				proVAX(500μg)4142434445	＜8＜8888	无无无无无	严重严重严重严重严重
口蹄疫病毒灭活疫苗(100μg)5152535455	641281286464	保护保护保护保护保护	无无无无无

               序列表

<160>6

<210>1

<211>78

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

1               5                   10                  15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

            20                  25                  30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

        35                  40                  45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

    50                  55                  60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp

65                  70                  75

<210>2

<211>69

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys

1               5                   10                  15

Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

            20                  25                  30

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr

        35                  40                  45

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

    50                  55                  60

Glu Thr Thr Val Val

<210>3

<211>370

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

1               5                   10                  15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

            20                  25                  30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

        35                  40                  45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

    50                  55                  60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Gly

65                  70                  75                  80

Gly Gly Ser Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala

                85                  90                  95

Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His

            100                 105                 110

Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Arg

        115                 120                 125

Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu

    130                 135                 140

Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu

145                 150                 155                 160

Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala

                165                 170                 175

Pro Glu Thr Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys

            180                 185                 190

Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val

        195                 200                 205

Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Asp Thy Ser Thr

    210                 215                 220

Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg

225                 230                 235                 240

Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val

                245                 250                 255

Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg

            260                 265                 270

Pro Leu Leu Ala Ile Gln Pro Ser Asp Ala Arg His Lys Gln Lys Ile

        275                 280                 285

Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu

    290                 295                 300

Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln

305                 310                 315                 320

Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val

                325                 330                 335

Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala

            340                 345                 350

Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr

        355                 360                 365

Val Val

<210>4

<211>1110

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct      60

tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag      120

gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg      180

tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacggaggt      240

ggaggttcca ccacctccac aggtgagtcg gctgatcccg tgactgccac tgttgagaac      300

tacggtggtg agacacaggt ccagagacgc caacacacgg atgtctcgtt catattagac      360

agatttgtga aagtaacacc aagagaccaa attaatgtgt tggacctgat gcaaacccct      420

gcacacactt tggtaggcgc gctcctccgt actgccacct actacttcgc agatctagaa      480

gtggcagtga aacacgaggg gaaccttacc tgggtcccga atggggcgcc cgagacagcg      540

ttggacaata ccaccaatcc aacggcttac cacaaggcac cgctcacccg gcttgcactg      600

ccttacacgg caccacaccg tgtcttggct actgtttaca acgggaactg caagtatggc      660

gagagccccg tgaccaatgt gagaggtgac ctgcaagtat tggcccagaa ggcggcaaga      720

acgctgccta cctccttcaa ttacggtgcc atcaaagcca ctcgggtgac tgaactgctt      780

taccgcatga agagggccga aacatactgc ccccggcctc ttttggccat tcacccgagc      840

gaagctagac acaaacaaaa gattgtggcg cctgtgaaac agcttttggg aggtggaggt      900

ggatccaggg aattagtagt cagctatgtc aacgttaata tgggcctaaa aatcagacaa      960

ctattgtggt ttcacatttc ctgtcttact tttggaagag aaactgttct tgagtatttg      1020

gtgtcttttg gagtgtggat tcgcactcct cccgcttaca gaccaccaaa tgcccctatc      1080

ttatcaacac ttccggaaac tactgttgtt                                       1110

<210>5

<211>5

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Gly Gly Gly Gly Ser

1               5

<210>6

<211>5

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Gly Gly Gly Gly Gly

1               5

Claims (10)

1、嵌合型病毒样颗粒DNA疫苗，是在多克隆位点插入有由人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸残基、不致病保护性目的抗原和人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸残基组成的嵌合蛋白的编码基因的重组真核表达载体。

2、根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于：所述嵌合蛋白中，人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸残基位于氨基端，人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸残基位于羧基端，不致病保护性目的抗原位于中间；所述不致病保护性目的抗原的氨基端与人乙肝病毒核心抗原的自氨基端的第78位氨基酸残基通过具有序列表中序列5的氨基酸残基序列的连接肽连接；所述不致病保护性目的抗原的羧基端与人乙肝病毒核心抗原的自氨基端的第80位氨基酸残基通过具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的连接肽连接。

3、根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于：所述人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸残基具有序列表中序列1的氨基酸残基序列；所述人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸残基具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。

4、根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于：用于构建所述重组真核表达载体的出发载体为可在哺乳动物细胞中表达外源基因的表达载体。

5、根据权利要求4所述的DNA疫苗，其特征在于：用于构建所述重组真核表达载体的出发载体为proVAX，pVAX，pcDNA3或pCI。

6、根据权利要求1、2或3或4所述的DNA疫苗，其特征在于：所述不致病保护性目的抗原为口蹄疫病毒VP1，或禽流感病毒NA和NH抗原，或新城疫病毒HN和F抗原，或艾滋病病毒GP160抗原和NEF抗原或肿瘤相关抗原MAG-1和gastrin。

7、根据权利要求6所述的DNA疫苗，其特征在于：所述嵌合蛋白具有序列表中序列3的氨基酸残基序列。

8、根据权利要求7所述的DNA疫苗，其特征在于：所述嵌合蛋白的编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列4的DNA序列；

2)编码序列表中序列3蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中序列4的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中序列4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

9、根据权利要求1、2或3或4所述的DNA疫苗，其特征在于：所述疫苗为proVAX-ABC；proVAX-ABC是将序列表中序列4的DNA序列插入proVAX的EcoR I及Xba I的酶切位点间得到的重组表达载体。

10、根据权利要求9所述的DNA疫苗，其特征在于：所述疫苗中还含有佐剂；所述佐剂为左旋咪唑、矿物油或铝盐佐剂。

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