CN1216075C - 丙型肝炎病毒高变区1合成肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有丙型肝炎病毒高变区1合成肽的多肽或其药物可接受的盐，其含有一个或多个如下所示的氨基酸序列的合成肽：GQTYTSGX，其中，X为A或G。本发明还涉及上述多肽作为制备预防和/或治疗丙型肝炎的药剂的应用，以及含有上述多肽的治疗丙型肝炎的药物组合物、疫苗、编码该多肽的多核苷酸。

Description

丙型肝炎病毒高变区1合成肽及其应用

发明领域

本发明涉及分子生物学领域。尤其涉及一种含有丙型肝炎病毒高变区1合成肽的多肽或其药物可接受的盐，该多肽作为制备预防和/或治疗丙型肝炎的药剂的应用，以及含有该多肽的药物组合物、疫苗、编码该多肽的多核苷酸。

背景技术

病毒性肝炎是危害人类健康的一类重症疾病，其病原体是一类结构各异的嗜肝性病毒，迄今为止，已经发现的肝炎病毒共有7个类型，它们分别是HAV、HBV、HCV、HDV、HEV和可能的TTV及HGV。研究已明确，HCV为单链亚股RNA病毒，链长约9.4kb，含有一个几乎跨越整个基因组、编码3011个或3010个氨基酸的单一ORF。由HCV引起的丙型肝炎，最早曾被称为“输血性的非甲非乙型肝炎”，但以后的研究证明，丙型肝炎不仅由输血方式传播，而其它方式如消化道、性接触等，均可导致丙型肝炎的传播。目前，全世界大约有超过1亿的感染者，其中大约50％-90％的患者病程转为慢性，在这些慢性感染中，分别为8-46％和11-19％发展为肝硬化和肝细胞性肝癌。

丙型肝炎易慢性化的主要原因是由于丙型肝炎病毒极高的变异率，在免疫选择作用下，形成丙型肝炎病毒高变区1(HVR1区)基因的高度变异，以逃避免疫监视。报道表明，HVR1也是主要的中和抗原区段，含有重要的中和性抗原表位，能诱导宿主产生中和性抗体。因此阐明HVR1的中和抗原表位及这些抗原表位的变异规律，有助于保护性多肽及基因疫苗研制，是疫苗研究的关键。本发明人经过大量的研究，发现中国人HCV的变异并非完全随机，具有一定的保守性，各位点某种氨基酸的出现有特定的概率，且氨基酸的突变多是在具有相似理化性质的氨基酸之间，由此可见HCV的生存具有一定的生物学限制，既然高变区的变异具有一定的规律性的，本发明人提出了中国人II/III型HCV～HVR1区的保守位点是构成抗原的基本框架。另外有研究表明对不同HVR1序列诱生的抗HCV～HVR1的多肽之间有很强的交叉反应，也提示本区内有保守的抗原表位。

目前，对于丙型肝炎病毒致病机制尚不清楚，还没有确实有效的治疗方法和疫苗以防止其进一步传播，现在临床上常使用的干扰素的长期有效率仅为20％，研究和发展降低HCV感染率，减轻病毒复制量的HCV疫苗是迫切需要完成的工作。对于HCV患者来说，研制针对丙型肝炎病毒的治疗药物更为有意义。

发明内容

针对现有技术在预防和/或治疗丙型肝炎方面的不足，本发明提供含有丙型肝炎病毒高变区1合成肽的多肽或其药物可接受的盐，其含有一个或多个如下所示的氨基酸序列的合成肽：

GQTYTSGX，

X为A或G。

优选本发明为如SEQ ID NO.1所述的合成肽：GQTYTSGA或其药物可接受的盐；或如SEQ ID NO.2所述的合成肽：GQTYTSGG或其药物可接受的盐。

本发明还提供本发明的多肽在制备预防和/或治疗丙型肝炎的药剂的应用。

本发明还提供一种用于预防和/或治疗丙型肝炎的药物组合物，其含有有效量的本发明的多肽和必要时药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明还提供一种疫苗组合物，其含有有效量的本发明所述的多肽和有效量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。

本发明还提供一种编码含有本发明多肽的多核苷酸。

本发明人在研究中国人群丙型肝炎病毒II/III型高变区1序列变异规律的基础上，通过计算机模建分析设计并合成了本发明的多肽，并对这些多肽进行了与HCV患者血清的反应性的研究，体外刺激HCV感染PBMC细胞因子分泌的研究，以及免疫小鼠体内免疫原性及血清中细胞因子研究。

本发明提供的多肽或其药物可接受的盐，其含有一个或多个如下所示的氨基酸序列的合成肽：

GQTYTSGX，

X为A或G。

在本发明的实施方案中，本发明的多肽可以含有一个或多个如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列：GQTYTSGA(肽A)或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列GQTYTSGG(肽B)。在相邻的序列之间任选有适当的接头或没有接头。换句话说，本发明的多肽分子中如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列可以任选通过适当的接头相互连接，形成同聚或异聚的多聚体。本发明的多肽还可以与本发明人同一申请日提交的另一申请所公开的含有合成肽：GQTYTSG的多肽连接，形成异聚的多聚体。另外，本发明多肽还可以与其它的蛋白形成融合蛋白，如可以与牛血清白蛋白形成融合蛋白，以增强其免疫原性。

优选本发明多肽为如SEQ ID NO.1所述的合成肽：GQTYTSGA(肽A)或如SEQ ID NO.2所述的合成肽：GQTYTSGG(肽B)。

根据计算机多肽HLA(人白细胞抗原)结合力分析及本发明的实施例2、3和4所示的结果，肽A和肽B表现出广泛的交叉反应性和强的诱导抗体产生的能力。这说明其中包含完整的抗原表位，另外，从本发明的实验数据也可以看出，肽A和肽B结构简单，生物活性好，是很好的活性肽分子，并具有优良的诱导内源性γ-IFN因子及Th2类细胞因子的功能。

本发明的多肽可以单独使用，也可以以药物可接受的盐形式使用。“药物可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触，而无过多的毒性、刺激、变态反应等的盐。药物可接受的盐是本领域熟知的。这种盐可以在本发明多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将多肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、二己酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。能用于形成药物可接受盐的优选的酸是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药物可接受的碱加成盐中的阳离子包括但不限于碱金属或碱土金属离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝等，以及非毒性季铵阳离子如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。优选的碱加成盐包括磷酸盐、tris和乙酸盐。

如实施例2、3和4所示，本发明的多肽或其药物可接受的盐具有诱导细胞因子γ-IFN、IL-4、IL-10和抗体产生的作用。由于γ-IFN主要是Th1分泌的细胞因子，是人体免疫系统抵抗病毒感染的主要细胞因子之一，而针对HCV的细胞免疫反应对于HCV的清除具有相当重要的意义。因此，本发明同时提供了一种具有预防和/或治疗丙型肝炎的作用的多肽。

本发明的多肽可以按本领域技术人员已知的常规固相合成方法合成。例如本发明多肽肽可以按Steward and Young(Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2^ndEd.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成仪或Pioneer^TM肽合成仪按固相化学技术合成。也可以先合成多个片段，然后连在一起形成更大的片段。对于固相肽合成，在Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，1963和J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1973中可以找到许多技术的介绍。一般，这些方法包括向成长的肽链上依次添加一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸。一般，第一个氨基酸的氨基或羧基用适当的保护基保护，然后将保护的氨基酸连在惰性固相载体上，随后在适于形成酰胺键的条件下加入相应氨基或羧基被适当保护的序列中的下一个氨基酸。然后从新加入的氨基酸残基上除去保护基，再加入必要时适当保护的下一个氨基酸，如此重复操作。当所有氨基酸以正确的顺序连接后，相继或同时除去任何剩余的保护基和固相支持物，得到最终的多肽。通过简单修改此一般程序，可能一次向成长链添加一个以上的氨基酸。

制备本发明的较短的多肽，例如肽A或肽B优选的方法是固相肽合成，在本发明的一个优选实施方案中，使用413A自动合成仪(PE公司的产品)制备本发明的多肽。其中使用α氨基被酸或碱敏感性基团保护的氨基酸。这种保护基应该在肽键形成条件下稳定，又容易除去而不破坏成长的肽链、不会引起其中的任何手性中心外消旋。适当的保护基有9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、2-氰基叔丁氧羰基等。9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)是合成本发明肽特别优选的。可以使用戊二醛交联的方法，也可以使用基因表达的方式获得。

本发明还提供本发明的多肽作为制备预防和/或治疗丙型肝炎的药剂的应用。

本发明的实施例3和4中，可以看出在人PBMC培养上清和免疫小鼠血清中γ-IFN、白介素-4、白介素-10都有不同程度的提高，尤其是γ-IFN水平的升高是一个非常令人感兴趣的现象，因为γ-IFN主要是Th1分泌的细胞因子，是人体免疫系统抵抗病毒感染的主要细胞因子之一，它通过诱导2-5A合成酶，进而活化RNaseL，降解病毒RNA，从而抑制病毒蛋白的合成。根据本发明的实验结果，本发明的多肽具有激活一定强度的细胞免疫反应的能力，而针对HCV的细胞免疫反应对于HCV的清除具有相当重要的意义。虽然丙型肝炎的治疗与预防是两个不同的方面，在治疗中发挥作用的细胞因子与抗体水平并不紧密相关。但本发明的实施例2和4中，同时也证明肽A和肽B也具有诱导抗体产生的能力。

本发明提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的本发明多肽和必要时药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。可以根据预防和/或治疗目的，给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，例如溶液剂、脂质体包裹剂、微胶囊剂及其他缓释制剂。载体或赋形剂的例子包括生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲盐水、甘油、乙醇及上述溶液的组合。可根据需要在组合物中添加辅助成份，例如与本发明多肽有协同作用的化合物；人血清白蛋白、低分子量肽、氨基酸和金属阳离子等蛋白保护剂；等等。例如，本发明提供一种上述药物组合物，其含有本发明的多肽和Al(OH)₃，其中每毫升生理盐水或中性磷酸盐缓冲液(PBS)中含有如SEQ IDNO.1所示合成肽和/或SEQ ID NO.2所示合成肽约1.0-15mg(即以肽A或肽B为基准)，含有Al(OH)₃约0.5-2mg。所述中性磷酸盐缓冲液为本领域熟知的，优选pH约7.2-7.4。上述试剂经灭菌过滤后，约2ml/安培瓶，使用时采用肌肉注射方式。上述药物组合物更优选含有本发明的多肽和Al(OH)₃，其中每毫升生理盐水或中性磷酸盐缓冲液(PBS)中含有如SEQ IDNO.1所示合成肽和/或SEQ ID NO.2所示合成肽约1.0-12mg/ml，Al(OH)₃约1mg。当然，药物组合物也可以直接由有效量的本发明的多肽和生理盐水构成，使用时采用静脉滴注方式。

本发明还提供一种丙型肝炎疫苗组合物，其含有有效量本发明的多肽和有效量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。在本发明的实施例4中，肽A和肽B在小鼠体内诱导对应抗体的产生，三组免疫小鼠血清学结果同阴性对照组进行T检验，P＜0.05。为了进一步提高本发明多肽的免疫原性，本发明多肽可以进一步与其它蛋白形成融合肽。例如，可以与牛血清白蛋白形成的融合肽，以通过结合大的免疫原性强的分子，来提高目的多肽的免疫原性。

此外，本发明还涉及一种编码含有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示合成肽的多肽的多核苷酸。本领域普通技术人员已知，可以根据不同氨基酸对应的密码子，确定编码含有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示合成肽的多肽的多核苷酸，当然，由于密码子的简并性，所述的多核苷酸可以有不同的形式，优选根据不同生物密码子的使用频率，选择相应的密码子。本发明的多肽的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。本发明提供了编码本发明肽A的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示；本发明提供了编码本发明肽B的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示。

具体实施方式

实施例1  合成肽制备

本发明人在研究中国人群丙型肝炎病毒II/III型高变区1序列变异规律的基础上，利用Goldkey软件，根据蛋白质结构和抗原性预测原理，其局部亲水性及主链柔韧性预测，结合HLA分子呈递的抗原肽的一些特点设计，用413A型自动合成仪(PE公司的产品)的合成。

合成肽的序列如下：

HCV包膜区(E2)

     383        389

     ↑          ↑

肽A：G Q T Y T S G A    SEQ ID NO.1

肽B：G Q T Y T S G G    SEQ ID NO.2

合成肽产品经高压液相色谱(HPLC)分析进行纯度鉴定，纯度均大于95％，符合设计要求。

实施例2本发明合成肽同丙型肝炎患者血清的反应性研究

1.血清来源

30份抗HCV抗体阳性血清，随机从2000-2001年解放军302医院HCV感染住院的患者中选取，PCR检测血清HCV RNA90％为阳性。对照血清：取自解放军总医院输血科健康献血人员，化验检查各项指标均正常。乙型肝炎(HBV)患者血清选自解放军302医院乙型肝炎住院患者，化验检查均呈乙型肝炎病毒表面抗原阳性。

2.方法

本发明合成肽同患者血清反应性的检测采用间接ELISA：分别用本发明合成肽肽A，肽B，和肽(A+B)各10ug，加于碱性包被液中(0.1M NaHCO₃，35ml；0.1M Na₂CO₃，15ml；DDH₂O，50ml)包被聚丙乙烯微孔条，4℃过夜。每种样品作2个复孔。加120ulFCS-PBS 37℃封闭2小时。依次加入各组患者血清(1∶100稀释，37℃孵育1小时)和羊抗人IgG(1∶1000，孵育同上)。最后每孔加入ELISA洗液：A、B液(北京科卫试剂厂产品)50ul，置暗处放5分钟，于450nm波长下检测光吸收度(A)。采用DG3022型酶联免疫检测仪(PE公司的产品)。

3.结果

3.1本发明多肽结合HCV患者血清(30份)的阳性结果如下：

表1

肽编号	阳性例数	阳性百分比(％)
			A	15	50
B	14	46.6
			(A+B)	17	56.6

其中肽A，肽B，和肽(A+B)的结合百分比分别达到50％、46.6％和56.6％。此组同HBV患者血清及健康人血清结合试验结果均为阴性。

3.2根据试验结果作出表，如下：

表2本发明肽A同实验组HCV感染病人血清及阴性对照组正常人血清反应结果比较

组别	阳性人数	阴性人数
			肽A	15	15
阴性对照组	0	10

经STATA软件分别对两组间进行统计学分析，卡方检验P＝0.00，＜0.01，两组的阳性率差异有显著性意义。也就是说，此组合成肽可以引起HCV感染病人血清反应，与阴性对照组正常人血清无反应。

表3本发明肽A同实验组HCV感染病人血清及HBV感染病人血清反应比较

组别	阳性人数	阴性人数
			试验组	15	15
HBV患者血清对照组	0	10

分别对两组间进行统计学分析，卡方检验P＝0.00，＜0.01，两组的阳性率差异有显著性意义。也就是说，此组合成肽可以引起HCV感染病人血清反应，与HBV感染病人血清无反应。

表4本发明肽B同实验组HCV感染病人血清及HBV感染病人血清反应比较

组别	阳性人数	阴性人数
			试验组	14	16
HBV患者血清对照组	0	10

分别对两组间进行统计学分析，卡方检验P＝0.00，＜0.01，两组的阳性率差异有显著性意义。也就是说，此组合成肽可以引起HCV感染病人血清反应，与阴性对照组正常人血清无反应。

表5本发明肽A同实验组HCV感染病人血清及HBV感染病人血清反应比较

组别	阳性人数	阴性人数
			试验组	14	16
HBV患者血清对照组	0	10

分别对两组间进行统计学分析，卡方检验P＝0.00，＜0.01，两组的阳性率差异有显著性意义。也就是说，此组合成肽可以引起HCV感染病人血清反应，与HBV感染病人血清无反应。

实施例3本发明多肽体外刺激HCV感染PBMC细胞因子分泌的研究

1.外周血细胞来源：23份HCV感染阳性血标本取自302医院HCV感染住院的患者中选取，PCR检测血清HCV RNA90％为阳性。血清HCV抗体阳性。

2.方法

2.1标本PBMC的提取

取新鲜静脉肝素抗凝血3ml，加等量Hank’s液稀释，混匀，轻铺到与血体积等量的淋巴细胞分离液液面上，1500-2000rpm/min，离心30分钟，吸出云雾状的淋巴细胞层，用Hank’s液洗两次，可获得大量的淋巴细胞。

2.2细胞培养

将获得的淋巴细胞在显微镜下计数，按每份的细胞数大约为1*10⁵/100ul将细胞平均分配，加到96孔细胞培养板上，加入一定量(10ug/孔)的抗原合成肽，另设不加肽的阴性对照孔及PHA刺激的阳性对照孔，(每种样品设三复孔)，震荡混匀，置入37℃，5％CO₂孵箱中培养，观察。培养过程中连续显微镜下观察细胞状态，记录。

2.3培养上清的收集

用多头细胞收集器仔细将细胞收获于试管中，1000-rpm/min，离心10分钟沉淀细胞，收集培养上清。

2.4细胞因子的检测：采用ELASA法

(1)除空白孔外，分别将标本或不同浓度的标准品(100微升/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温(20-25℃)孵育120分钟。

(2)洗板4次。

(3)除空白孔外，加入检测剂工作液(100微升/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温(20-25℃)孵育60分钟。

(4)洗板4次。

(5)加入底物A、B(各50微升/孔)，闭光室温10-30分钟。

2.5标本荧光标记

(1)收集培养细胞。

(2)2％FCS清洗两遍。

(3)加入荧光抗体1微升/10⁵细胞。避光室温静置20分钟。

(4)2％FCS清洗一遍。

(5)加入1％多聚甲醛2毫升，4℃保存。

2.6淋巴细胞分类检测

对培养后集落出现好的样本进行培养，并利用流式细胞仪(BD公司FACSCALIBUR型)检测荧光CD4和CD8抗体标记细胞。

2.7统计学方法：Stata统计软件计算

肽A组和肽B组测定结果分别与阴性组结果进行t检验。由于测定IL-10和γ-IFN的结果同阴性组方差不齐，统计学方法采用秩和检验。

3.结果

3.1光镜观察：

HCV感染病人的PBMC加入合成肽后第二天，镜下观察可见细胞生活良好，体大，个圆，透光性好，阳性对照孔可见满视野多个小细胞增殖团，实验孔可见散在的小细胞增殖团，培养4天左右，可见散在的小细胞团较前增大，形成明显的集落团。阴性对照孔未见明显的集落团出现。HBV病人的PBL加入合成肽后未见集落团。

3.2体外培养HCV患者增殖PBMC FACS淋巴细胞分类结果

多肽刺激后培养72小时增殖细胞群淋巴细胞分类中CD4+细胞所占比重增加(肽A平均上升4.6％，肽B平均上升3.7％)，而CD8+细胞比重下降(肽A平均下降3.4％，肽B平均下降3.2％)，说明增殖细胞重要为CD4+细胞。

3.3体外细胞因子分泌水平变化研究

第5号标本对肽A和肽B组都有较好的增殖反应，故对它的细胞因子分泌水平随时间的变化进行了研究。

结果表明：IL-4、IL-10、γ-IFN水平是随培养时间的延长而升高的。并且在培养后48-72小时间达到最高水平。

3.4培养72小时的上清中细胞因子水平

结果见表6

	细胞因子
				IL-4	IL-10	γ-IFN
	肽A	38.4±26.0	114.8±111.6				59.0±56.8
肽B				35.0±34.3	102.6±91.8	59.8±56.2
	对照	6.6±2.2	4.6±1.5				7.1±2.6

γ-IFN检测结果表明：肽A组和肽B组γ-IFN都明显的分泌升高，分别为59.0±56.8，59.8±56.2(pg/ml)，与阴性对照组(7.1±2.6)相比明显升高，差异有显著意义(P＜0.05)。

IL-4检测结果表明：肽A组和肽B组IL-4都明显的分泌升高，分别为38.4±26.0，35.0±34.3(pg/ml)，与阴性对照组(6.6±2.2)相比明显升高，差异有显著意义(P＜0.05)。

IL-10检测结果表明：肽A组和肽B组IL-10都明显的分泌升高，分别为11 4.8±111.6，102.6±91.8(pg/ml)，与阴性对照组(4.6±1.5)相比明显升高，差异有显著意义(P＜0.05)。

表7不同病人PBMC经合成肽刺激后细胞因子水平的变化

	5号		8号		9号		13号		16号		20号
													肽A	肽B	肽A	肽B	肽A	肽B	肽A	肽B	肽A	肽B	肽A	肽B
	IL-4	↑	↑	↑	↑↑	↑	↑↑	↑↑↑	↑	↑↑	↑	↑													↑↑
IL-10													↑↑↑	↑↑↑		↑↑↑	↑	↑↑	↑	↑	↑↑	↑↑		↑↑
	γ-IFN	↑	↑	↑	↑	↑	↑	↑	↑↑↑	↑↑	↑	↑													↑

实施例4本发明的多肽在小鼠体内免疫原性和血清中细胞因子的研究

1.实验动物

BALB/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心，均为雄性性6周龄。

2.方法

2.1免疫小鼠

本发明多肽直接免疫小鼠，分为2小组分别命名：肽A组，肽B组。每组5只小鼠。肽A组和肽B组分别用上述肽A和肽B合成肽免疫小鼠。另设一组阴性对照组，第一次免疫合成肽用量为50ug，将弗氏完全佐剂(GIBCOBRL公司)与合成肽抗原各50ul等体积混合，用微量搅拌器充分混匀，多点注射小鼠足垫，阴性对照组只注射完全弗氏佐剂。2周后进行第二次免疫，即加强免疫。用同样的合成肽量，改用不弗氏完全佐剂(GIBCOBRL公司)，注射体积和方法同上。免疫进行两次后进行冲击免疫，用PBS 200ul溶解100ug的合成肽，经肌肉注射，阴性对照组只注射200ul的PBS。第一次及第二次加强免疫后一天对小鼠进行剪尾取血，第二次加强免疫三天后，摘除小鼠眼球放血，收取血清作标本。

2.2小鼠血清抗体检测，采用ELASA法

(1)分别用各种合成肽作为抗原包被聚丙乙烯微孔条，每种样品用三复孔，合成肽用量分别用10ug，加入到100ul碱性包被液中，4℃过夜。

(2)用120ul PBS封闭，37℃孵育2小时。

(3)加入各组小鼠血清，1∶100稀释，37℃孵育1小时。

(4)每孔加入羊抗鼠IgG(华美生物制品公司)100ul(1∶1000)稀释，37℃孵育1小时。

(5)每孔加入A、B液50ul，置暗处放5分钟，检测450nm波长下的光密度(OD)值。

2.3小鼠血清细胞因子检测，采用ELASA法。

(1)除空白孔外，分别将标本或不同浓度的标准品(100微升/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温(20-25℃)孵育120分钟。

(2)洗板4次。

(3)除空白孔外，加入检测剂工作液(100微升/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温(20-25℃)孵育60分钟。

(4)洗板4次。

(5)加入底物A、B(各50微升/孔)，闭光室温10-30分钟。

(6)加入终止液(50微升/孔)，混匀后即刻测量450nm波长下OD值。

3.结果

3.1合成肽免疫效果

表8：450nm波长下检测抗合成肽抗体对应的平均OD值(1∶100稀释)

小鼠编号	肽编号
			肽A	肽B
	No.1	0.160			0.147
No.2			0.179	0.168
	No.3	0.153			0.154
No.4			0.165	0.135
	No.5	0.170			0.141
均值			0.165±0.010	0.149±0.013
	阴性对照	0.028±0.012			0.018±0.015

3.2小鼠血清细胞因子水平

结果如下所示，

表9实验小鼠血清中各细胞因子浓度(pg/ml)

分组	细胞因子
				IL-4	IL-10	γ-IFN
	肽A	30.64±4.9	27.94±6.4				28.46±5.9
肽B				31.22±5.0	26.92±5.8	24.81±5.8
	对照	3.6±0.1	6.86±1.0				4.9±0.2

上述实验结果表明小鼠脾脏细胞对上述肽A和肽B都表现出了明显的增殖反应。这与血清中各肽特异性抗体滴度高低的趋势是一致的。而且，血清中γ-IFN、IL-4、IL-10，都有不同程度的提高。尤其是γ-IFN水平的升高是一个非常令人感兴趣的现象，因为γ-IFN主要是Th1分泌的细胞因子，是人体免疫系统抵抗病毒感染的主要细胞因子之一，它通过诱导2-5A合成酶，进而活化RNaseL，降解病毒RNA，从而抑制病毒蛋白的合成。说明本发明的多肽具有激活一定强度的细胞免疫反应的能力，而针对HCV的细胞免疫反应对于HCV的清除具有相当重要的意义。

                                        序列表

<110>程云

     中国人民解放军传染病研究所

<120>丙型肝炎病毒高变区1合成肽及其应用

<130>D0301060F

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>丙型肝炎病毒高变区1合成肽

<400>1

Gly Gln Thr Tyr Thr Ser Gly Ala

1               5

<210>2

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>丙型肝炎病毒高变区1合成肽

<400>2

Gly Gln Thr Tyr Thr Ser Gly Gly

1               5

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(3，9，15，18，21，24)

<223>n＝u或c或a或g

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)

<223>r＝a或g

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>y＝u或c

<400>3

gancaracnu ayacnucnga ngcn                                            24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(3，9，15，18，21，24)

<223>n＝u或c或a或g

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)

<223>r＝a或g

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>y＝u或c

<400>4

gancaracnu ayacnucnga ngan                                            24

Claims (9)

1、一种多肽或其药物可接受的盐，所述多肽的氨基酸序列如下所示：

GQTYTSGX，

其中，X为A或G。

2、权利要求1所述的多肽或其药物可接受的盐，其特征在于其为如SEQ ID NO.1所述的多肽：GQTYTSGA或其药物可接受的盐。

3、权利要求1所述的多肽或其药物可接受的盐，其特征在于其为如SEQ ID NO.2所述的多肽：GQTYTSGG或其药物可接受的盐。

4、权利要求1-3任一项所述的多肽或其药物可接受的盐在诱导细胞因子γ-IFN、IL-4、IL-10和抗体产生中的应用。

5、权利要求1-3任一项所述的多肽或其药物可接受的盐在制备预防和/或治疗丙型肝炎的药剂的应用。

6、一种用于预防和/或治疗丙型肝炎的药物组合物，其含有治疗有效量的权利要求1-3任一项的多肽或其药物可接受的盐；和必要时药学上可接受的载体或赋形剂。

7、权利要求6所述的药物组合物，其含有权利要求1-3任一项的多肽和Al(OH)₃，其中每毫升生理盐水或中性磷酸盐缓冲液含有如SEQ IDNO.1所示多肽和/或SEQ ID NO.2所示多肽1.0-15mg，含有Al(OH)₃0.5-2mg。

8、一种丙型肝炎疫苗组合物，其含有有效量的权利要求1-3任一项所述的多肽或其药物可接受的盐；和有效量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。

9、一种编码权利要求1-3任一项多肽的多核苷酸。