CN1630663A - 结合蛋白磷酸酶2a的合成的或者天然的肽,其鉴定方法以及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的合成的或者天然肽，特别用于治疗病毒或者寄生虫感染，肽的长度少于30个氨基酸，优选20个氨基酸，尤其优选15至20个氨基酸，其特征在于它们在体外特异结合2A型蛋白磷酸酶或其亚基之一。本发明也涉及鉴定该肽的方法以及它们的用途。

Description

结合蛋白磷酸酶2A的合成的或者天然的肽， 其鉴定方法以及用途
本发明涉及新的合成的或者天然肽，特别是用于治疗病毒或者寄生虫感染或治疗肿瘤的肽，所述肽的长度少于30个氨基酸，优选少于20个氨基酸，尤其是优选15至20个氨基酸，且特征在于它们在体外特异结合2A型蛋白磷酸酶全酶或其亚基之一。本发明也涉及鉴定该肽的方法以及它们的用途。
由于本发明的肽的作用是调节细胞蛋白磷酸酶2A的活性，因此给出蛋白磷酸酶2A相关的现有知识，它们的生理功能及其和特定的细胞，病毒或者寄生虫蛋白的相互作用的介绍是很重要的。
细胞生理学部分是通过调节蛋白磷酸化来控制。细胞蛋白磷酸化状态依赖于使其发生磷酸化的蛋白激酶和使其发生去磷酸化的蛋白磷酸酶的拮抗作用。
将蛋白磷酸化酶分为主要两组：酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。丝氨酸/丝氨酸磷酸酶依赖于它们的底物和对特定抑制物的敏感性分为两种类型，即1型磷酸酶(PP1)和2型磷酸酶(PP2)。2型磷酸酶本身分成不同类型，包括磷酸酶2A(PP2A)，磷酸酶2B或者通过钙来调节其活性的钙调磷酸酶，以及通过镁来调节其活性的磷酸酶2C(PP2C)。
目前已知2A型磷酸酶在进化过程中高度保守，并涉及调节多种生物过程。已经清楚PP2A酶涉及转录调节，细胞周期调控或者病毒转化。更进一步，PP2A为不同的病毒或者寄生虫蛋白的靶蛋白，这暗示PP2A在宿主病原体相互作用中起的作用。
PP2A是寡聚体(全酶)，各包括催化亚基(C)和一个或者两个调节亚基(A)和(B)。亚基(A)由15个不完全的重复的38-40个氨基酸的保守氨基酸序列组成，其中某几个和亚基(B)和(C)相互作用。在进化过程中保守的亚基(A)和(C)组成酶的基本结构，是组成形表达。相反的，亚基(B)组成一系列调节蛋白，不通过共有结构相关并差别表达。(Cohen P.The structure and regulation of proteinphosphatases.Annu Rev Biochem 1989；58：453-508)。蛋白磷酸酶2A体内以不同形式的两种类型存在：二聚体形式(AC)和三聚体形式(ABC)。亚基(B)调节磷酸酶活性和对底物的特异性。PP2A的多种形式的存在和体内PP2A的独特的以及各种各样的功能相关。
近来，由病原体合成的不同的蛋白，尤其是病毒和寄生虫蛋白，牵涉到调节蛋白磷酸酶2A某些特定的活性。
病毒采用涉及PP2A不同的策略来促进它们在宿主细胞内的复制和存活。例如，副流感病毒将一种受PP2A控制的细胞起源的蛋白PKCζ整合到其病毒微粒中。这可以扰乱宿主蛋白磷酸化并促进其自身复制。(De BP，Gupta S，Barnejee AK.Cellular protein kinaseCζregulates human parainfluenza virus type3 replication.Proc.NatlAcad Sci USA1995；92：5204-8)。
几种具有转化能力的DNA病毒，例如乳多空病毒(papovae)或者腺病毒，以及某些逆转录酶病毒例如1型人体免疫缺陷病毒(HIV-1)，编码直接和某些宿主PP2A相互作用的蛋白。所有这些病毒包括的蛋白虽然结构不同，但是和某些全酶相互作用并改变磷酸酶活性。
具体来说，已经表明腺病毒的E4或f4蛋白结合到异三聚体PP2A并更加精确地结合调节亚基(B)，导致感染的细胞内JunB的转录减少。这种作用通过调节感染细胞的凋亡反应在病毒感染过程中起了重要作用。有趣的是，它也显示出E4或f4和PP2A相互作用以p53-非依赖方式在转化的细胞中诱导凋亡。(Shtrichman R等人，Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosisin transformed cells.J Virol 1998；72：2975-82)。
乳多空病毒家族的致肿瘤病毒包括SV40和多瘤病毒，诱导细胞转化。已经表明PP2A和SV40或者多瘤病毒的“小T”抗原相互作用并与多瘤病毒的转化性“中间T”蛋白相互作用。病毒蛋白和PP2A的相互作用清楚地涉及病毒转化。最后，通常在细胞内通过不同因子特异固定到启动子调节序列进行的转录调节程序，可能代表了涉及PP2A控制病毒表达的最重要的机制。已经证明PP2A是众多的尤其涉及细胞生长和增殖的转录因子，包括AP1/SRE，NF-κBb，Sp1和CREB，的负调节子(Waszinski，B E，Wheat W H，Jaspers S，Peruski L F，J RLickteig R L，Johnson G L，和Klemm D J，Nuclear proteinphosphatase 2A dephosphorylates protein kinase A-phosphorylatedCREB and regulates CREB transcriptional stimulation.Mol Cell Biol1993 13，2822-34)。这些转录因子的病毒调节可以进行病毒转录调节。
HIV-1的病毒蛋白，Vpr在体外和PP2A相互作用，并促进PP2A的催化活性(Tung L等人，Direct activation of protein phosphatase2A0 by HIV-1 encoded protein complex Ncp7：vpr.FEBS Lett1977；401：197-201)。Vpr可以通过抑制p34cdc2-细胞周期蛋白B复合体的活化作用来诱导感染细胞的G2终止。更进一步，Vpr和转录因子Sp1相互作用，是Sp1依赖的HIV-1转录的弱的反式激活剂。这样，属于病毒体的HIV-1的Vpr蛋白在体内应该涉及到病毒转录的起始，这是调节Tat转录因子(HIV-1病毒编码的主要转录调节子)表达的非常关键的一步。
相对于蛋白激酶在寄生虫感染中已经非常明确的作用，在最近3年才开始认识到丝氨酸/苏氨酸在寄生虫学领域作为重要的潜在的调节子。
最初，在恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)中确定了两种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，Ppβ和PfPP。通过酶学研究证明了寄生虫中1型和2A型的磷酸酶的活性。最后，纯化拉寄生虫酶PP2A和PP2B。
近来在小泰勒虫(Theileria parva)中研究丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，这是一种接近恶性疟原虫的原生动物，是牛的寄生虫。寄生虫感染的单核细胞和白细胞宿主细胞被转化，导致动物的白血病。泰勒虫感染的细胞中纯化的寄生虫表达蛋白激酶CK2α。现在，亚基CK2α和PP2A相互作用正调节其活性(Hériché H，等人，Regulation of proteinphosphatase 2A by direct interaction with casein kinase2α.Science1997；276：952-5).更进一步，通过CK2α亚基表达调节PP2A是寄生虫细胞中两条信号途径MAP-激酶(Chaussepied M等人泰勒虫transformation of bovine leukocytes：a parasite model for thestudy of lymphoproliferation.Res Immunol 1996；147：127-38)和蛋白激酶B(Akt)(M Baumgartner，M Chaussepied，M F Moreau，AGarcia，G Langsley.Constitutive PI3-K activity is essential forproliferation，but not survival，of Theileria parva-transformed B cells.Cellular Microbiol(2000)2，329-339)封闭的基础。
和PP2A相互作用的蛋白系列的共同其序的缺失阻碍了直接涉及将这些蛋白和PP2A结合的肽序列的信息鉴定。
由以上总结的蛋白磷酸酶2A在病毒宿主或者寄生虫宿主中相互作用的重要作用，可以了解鉴定病毒或者寄生虫蛋白和PP2A全酶或其亚基之一的结合位点的重要性。这样就可以确定这些病毒或者寄生虫病原体的新型的治疗目标。
具体来说，和PP2A相互作用的肽的鉴定可以开展新型的通过竞争性抑制来阻止由病毒或寄生虫蛋白通过和PP2A相互作用诱导的细胞机制，尤其是感染，病原体复制和细胞转化机制的药物。
本发明是关于鉴定长度减少的肽的方法，该肽结合PP2A全酶或其亚基之一。相对于天然蛋白或者大尺寸的多肽结构域，减少太小的肽的尺寸具有利于化学或者细胞体系合成，高产和廉价的优点。对于治疗用途，本发明的肽也更加稳定并易于用合适的载体转化到细胞质或者细胞核。
本发明基于可能鉴定长度少于30个氨基酸的肽，尤其是长度少于20个氨基酸的和PP2A全酶或其亚基之一结合的肽的证实。
具体来说，发明者已经表明使用Frank和Overwing描述的“班点合成”技术(Molecular Biology，1996，66卷：149-169中的方法，EpitopeMapping Protocols edited by：G E Morris Humana Press Inc，TotowaNJ)可以鉴定和PP2A全酶或其亚基之一相互作用的蛋白的结合位点。
举例来说，发明者已经鉴定了长度少于20个氨基酸的体外与纯化的PP2A全酶或其亚基之一结合的肽，该肽来自HIV-1的Vpr蛋白或者小泰勒虫寄生虫的CK2α蛋白。由于其抑制病毒或者寄生虫蛋白和特定PP2A全酶的相互作用，源自这些肽并被选择的拮抗物可以组成新型的抗癌，抗病毒或者抗寄生虫药剂。
发明涉及到鉴定其序列来自病毒，寄生虫或者细胞蛋白的肽的方法，所述的肽特异性地结合2A型蛋白磷酸酶全酶或其亚基之一，方法包括以下几个步骤：
a)以斑点的形式将序列源于病毒，寄生虫或者细胞蛋白的肽沉淀到支持物上，每个斑点对应于一个确定序列的肽的沉淀；
b)将固体支持物和含有蛋白磷酸酶2A全酶或其亚基之一的溶液接触，使用的条件允许支持物上的肽结合该全酶或其亚基之一；并且
c)鉴定固体支持物上和蛋白磷酸酶2A或其亚基之一结合的肽。
在步骤a)中，不同的肽沉积在固体支持物确定的位置(“斑点”)，每个位置对于一个特定的肽序列，并且然后一系列形成肽的二维阵列。近来已经描述了用于制备该阵列的方法。(综述，见Figeys和Pinto，2001，Electrophoresis22：208-216；Walter等人，2000，Curr OpinMicrobiol 3：298-302)。这一系列方法通常包括将肽共价固定到支持物上，尤其是使用化学连接剂。例如，技术人员可以参考“斑点合成”技术，包括在纤维素膜上直接合成含有20个残基的肽(Frank和Overwing，Methods in Molecular Biology，1996，vol66：149-169，EpitopeMapping Protocols，edited by：G E Morris，Humana Press Inc，TotowaNJ)。
通常，可以使用的任何方法，只要能够造成肽阵列沉淀到固体支持物上，可以用来检测沉淀的肽和特殊化合物专一的相互作用即可。
高度优选，一系列沉淀的肽序列包括这些序列来源的病毒，寄生虫或者细胞蛋白的所有序列。这样，该过程可以用单一步骤测试给定蛋白的完整的序列，后者被“分成”有限数目的通常有重叠序列的肽。
在一个优选的实施方案中，以斑点形式沉淀的肽长度要小于20个氨基酸，且更加优选长度小于15个氨基酸。
在另一个特定的实施方案中，肽被沉淀到纤维素膜上。
获得的阵列在步骤b)中和2A型蛋白磷酸酶全酶或其亚基之一结合。
术语“2A型蛋白磷酸酶全酶”意思是任何纯化的二聚体(AC)或者异三聚体(ABC)复合物，其来自纯化2A型蛋白磷酸酶的两个亚基(A)和(C)，如果必要可以包括亚基(B)之后重组的提取物。2A型蛋白磷酸酶优选来源于哺乳动物。
孵育支持物，例如，在含有纯化的蛋白磷酸酶或其纯化的亚基之一的缓冲液中孵育。合适的缓冲液溶液为含有5％的脱脂的Régilait(牛奶)和3％BSA的TBS(TRIS BORATE)。
通常通过直接或者间接标记蛋白磷酸酶并鉴定标记蛋白结合的斑点来确定和2A型蛋白磷酸酶全酶结合的肽。含有肽阵列的支持物用抗亚基(A)或(B)或(C)的抗体或者抗PP2A亚基(A)或(B)或(C)的抗体混合物孵育后，PP2A或其亚基之一结合到一个肽斑点上就可以显示出来，尤其是使用抗血清，使用传统用于蛋白质印迹或者固相ELISA测试的技术。
本发明的方法可以用来鉴定肽，尤其是用来治疗某些病毒或者寄生虫感染的，测量其长度小于30个氨基酸或甚至小于20个氨基酸的肽，所述的肽可以在体外结合2A型蛋白磷酸酶全酶或其亚基之一上。
更进一步，使用肽合成领域普通知识，技术人员可以从生产具有上述有利特征的肽。
结果，本发明提供了小于30个氨基酸优选小于20个氨基酸的天然或者合成肽，其特征在于该肽在体外特异地结合2A蛋白磷酸酶全酶或其亚基之一(A)或(B)或(C)。术语“特异结合”意思是该肽能够竞争性地抑制病毒蛋白或者寄生虫来源的蛋白同PP2A的结合。
本发明的一个优选实施方案中，本发明肽的特征在于它是病毒，寄生虫或者细胞蛋白的片段，这些蛋白在体外结合到2A型蛋白磷酸酶或其亚基之一，或者其为和上述蛋白片段区别在于取代或者缺失了部分氨基酸的序列，该有区别的序列仍然保留了结合2A型蛋白磷酸酶或其亚基的特性。优选，该有区别的序列和原始序列相比被取代或者缺失的氨基酸数目不超过20％，更加优选这些氨基酸占原始序列的10％。优选，仅仅替换或者缺失了那些不影响肽体外结合PP2A的性质的氨基酸。
具体来说，一段区别的序列是和源序列比较与2A型蛋白磷酸酶或其亚基之一结合的亲和力增加的肽序列。以上详细说明的另一区别序列是肽序列和最初鉴定的肽序列同源的一段肽序列。本发明中使用的术语“同源肽”意思是序列源于一类非最初鉴定的肽序列的序列而且用传统的最佳比对程序例如BESTFIF程序，该一级序列可以和最初鉴定的肽序列比对(Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group，GCG)。具体来说，如果用传统的最佳比对程序例如BESTFIF程序比对序列之后，序列A和B具有至少50％的相同性，优选75％相同性，那么，认为序列A和序列B是同源的。再次优选，如果序列类似相同，全序列上除了几个残基具有10％-20％的可变性，认为这两个序列也是同源的。更进一步，认为具有相同化学功能的氨基酸(例如Arg和Lys)是等同的。分析的和PP2A或其亚基之一结合的肽通常选自病毒，寄生虫或者细胞蛋白的片段，这些蛋白显示出在体外和体内和2A型蛋白磷酸酶相互作用。
具体来说，这种病毒，寄生虫或者细胞蛋白选自以下一种蛋白：SV40或者多瘤病毒t抗原，多瘤病毒中间t抗原，PP2A的B型(B，B’，B”)亚基，CK2α，CaMIV，p70S6-激酶，Pak1/Pak3，Tap42/alpha4，PTPA，Set/I1/I2-PP2A，E4或f4，tau，Vpr或者CD28，CXCR2(趋化因子受体)。
本发明优选的肽是CD28蛋白片段，尤其是由序列PRRPGPTRKHY(SEQ ID No：132)和(PRRPGPTRK)2(SEQ ID No：133)组成的肽，这两段序列分别对应称为FD2和FD3的肽，其细胞内穿透能力和对细胞生存能力的影响在以下实验部分作出描述。本发明也关于和上述蛋白片段区别在于取代或者缺失了某些氨基酸的肽序列，所述有区别的序列仍然保留了结合2A型蛋白磷酸酶或其亚基的特性。
本发明尤其优选的肽是HIV病毒的Vpr蛋白的片段，尤其是HIV-1或者HIV-2病毒的Vpr蛋白的片段，或者是和上述蛋白片段区别在于取代或者缺失了部分氨基酸的序列，该序列仍然保留了结合2A型蛋白磷酸酶或其亚基的性质。本发明不包括EMBL数据库中的编号为P89821具有以下序列的Vpr蛋白片段：LFIHFRIGCQHSRIGITRRRRVRDGSSRP*。相反，在下述应用中使用所述肽属于本发明的范围之内。
能够引用的特殊例子的肽，该肽来自和来自精蛋白的2A型蛋白磷酸酶相互作用的蛋白，该肽的序列为：RRRRRRRSRGRRRRTY(SEQ ID No：140，称为FD8)或者和SEQ ID No：140的差别在于替换或者缺失了某些氨基酸的序列，不过该有区别的序列保留了结合2A型蛋白磷酸酶或其亚基之一的特性。
再次优选，本发明的肽的特征在于它包括于以下序列之一：
a)VEALIRILQQLLFIHFRI(SEQ ID No：1)；
b)RHSRIGIIQQRRTRNG(SEQ ID No：2)；或者
c)和SEQ ID No：1或者SEQ ID No：2的差别在于替换或者缺失了一些氨基酸的序列，不过该有区别序列保留了结合2A型蛋白磷酸酶或者其亚基之一的特性。
本发明特别优选的肽为SEQ ID No：2肽的片段，该片段构成为或者含有序列RHSRIG(SEQ ID No：135)，称为FD9，它的细胞内穿透能力和对细胞生存能力的影响在以下实验部分作出描述。
本发明也涉及了具有含上述的本发明肽的多肽框架的化合物。该化合物的分子量为10-150千道尔顿并具有结合蛋白磷酸酶2A的能力。
本发明也涉及了多肽，其特征在于它由本发明肽的重复组成。
该多肽的具体例子为肽RHSRIG聚合体，尤其是二聚体(RHSRIG)2(SEQ ID No：136)或者三聚体(RHSRIG)3(SEQ IDNo：137)，分别称为FD10和FD11，其细胞内穿透能力和对细胞生存能力的影响在以下实验部分作出描述。
序列和SEQ ID No：1或者SEQ ID No：2的差别在于替换或者缺失了一些氨基酸并且在本发明范围内的肽，可以引述其序列由HIV-1，HIV-2和SIV的不同类型突变体的Vpr蛋白的序列之一包括的肽，对应于SEQ ID No：1或者SEQ ID No：2突变体的同源序列。
可以引用以下序列：VEALIRILQQLL(SEQ ID No：6)，ALIRILQQLLFI(SEQ ID No：7)，IRILQQLLFIHF(SEQ ID No：8)，ILQQLLFIHFR(SEQ ID No：9)，RHSRIGIIQQRR(SEQ ID No：10)，SRIGIIQQRRTR(SEQ ID No：11)和IGIIQQRRTRNG(SEQ ID No：12)对应于鉴定为结合PP2A亚基A的十二肽。
本发明的与SEQ ID No：2差别在于缺失或者替换了其中某些氨基酸的特殊序列为序列RHSRIGVTRQRRARNG(SEQ ID No：139)，在以下实验部分也称为FD13。
本发明优选的肽是选自序列SEQ ID No：1和SEQ ID No：2的肽，其特征在于它的给药诱导肿瘤细胞凋亡。
选择能够诱导肿瘤细胞凋亡的肽的方法可以被实施，例如，使用以下实验描述的MTT存活能力测试。
本发明进一步优选的实施方案提供其特征在于它来自CK2α蛋白片段的肽。具体来说，天然或者合成肽的特征在于它来自寄生虫小泰勒虫的CK2α蛋白。
更加优选，本发明肽的特征在于它包括于以下序列之一：
a)RKIGRGKFSEVFEG(SEQ ID No：3)；
b)TVTKDCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL(SEQ ID No：4)；
c)KILRLIDWGLAEFYHP(SEQ ID No：5)；
d)SEQ ID No：3，SEQ ID No：4或者SEQ ID No：5的同源序列，来自恶性疟原虫或利什曼原虫(Leishmania)；或者
e)以替换或者缺失氨基酸而源于上述序列的序列，不过该有区别的序列保留了结合2A型蛋白磷酸酶或其亚基之一的特性，且尤其是序列TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL(SEQ ID No：142)。
序列和SEQ ID No：3，4或5不同的肽中可以引述的是来自位点1(RKIGRGKFSEVFEG)(SEQ ID No：3)的序列，尤其是序列为RKIGRGKFSEVF的肽和序列为IGRGKFSEVFEG的肽或者序列来自位点2(TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL)(SEQ IDNo：4)，尤其是下列肽：
TVTKDKCVIKIL(SEQ ID No：13)；
TKDKCVIKILKP(SEQ ID No：14)；
DKCVIKILKPVK(SEQ ID No：15)；
CVIKILKPVKKK(SEQ ID No：16)；
IKILKPVKKKKI(SEQ ID No：17)；
ILKPVKKKKIKR(SEQ ID No：18)；
KPVKKKKIKREI(SEQ ID No：19)；
VKKKKIKREIKI(SEQ ID No：20)；
KKKIKREIKILQ(SEQ ID No：21)；
KIKREIKILQNL(SEQ ID No：22)；
以及最终序列来自位点3KILRLIDWGLAEFTHP(SEQ ID No：5)的序列或者肽序列为KILRLIDWGLAE(SEQ ID No：23)，肽序列为LRLIDWGLAEFY(SEQ ID No：24)，或者肽序列为LIDWGLAEFYHP(SEQ ID No：25)。
包括同源于小泰勒虫的序列，来自恶性疟原虫蛋白CK2α蛋白位点3的本发明肽的一个实施，是肽RQKRLI(SEQ ID No：141)。本发明也包含了肽RQKRLI的聚合体且特别是三聚体(RQKRLI)3(SEQID No：134)，在实验部分称为FD7。
优选，本发明涉及来自寄生虫小泰勒虫的CK2α蛋白的肽，特征在于它的给药减少寄生虫发育。
本发明肽的进一步实施方案特征在于该肽来自tau蛋白。Tau序列具有对应于E4或f4腺病毒蛋白结合位点的基序。在阿尔茨海默疾病中，tau蛋白由蛋白磷酸酶2A调节。该肽应该在治疗阿尔茨海默疾病中有效。
由本发明方法鉴定的肽在治疗某些肿瘤和某些病毒或者寄生虫感染中尤其有效。技术人员可以使用结合竞争测试来选择源自由本发明方法鉴定的序列的新型肽，所述的肽竞争性地抑制其来源天然肽同PP2A全酶或其亚基之一的结合。
从而，本发明也涉及上述确定的天然或者合成的肽，其特征在于竞争性地抑制其来源天然肽同PP2A全酶或其亚基之一的相互作用。
为了有效的在体内治疗某些肿瘤或者某些病毒或者寄生虫感染，本发明的肽可以连接到能够将所述的肽转化到真核细胞中的载体上。然而，如以下讨论的，本发明的肽有可能本身具有穿透细胞的能力，就是说不需要另外的载体。
自然地，本发明涉及能够合成本发明肽的方法。尤其是，本发明涉及多核苷酸，特征在于它的序列构成为编码本发明肽的序列。优选的多核苷酸为其序列选择以下序列之一的多核苷酸。
SEQ IDs No：26
(5’GTGGAAGCCTTAATAAGAATTCTGCAACAACTGCTGTTTATTCATTTCAGAATT)；
No：27
(5’CGACATAGCAGAATAGGCATTATTCAACAGAGGAGAACAAGAAATGGA)；
No：28
(5’AGGAAGATCGGAAGAGGGAAGTTCAGTGAAGTTTTTGAGGGA)；
No：29
(5’ACAGTAACGAAGGATAAATGCGTAATAAAAATCCTAAAGCCTGTAAAGAAGAAGAAAATCAAGAGAGAGAGATTAAGATTCTACAGAACCTA)；
或者No：30
(5’AAAATACTAAGGCTAATTGACTGGGGATTAGCTGAGTTTTACCACCCA)，分别编码肽：1-5。
本发明也涉及多核苷酸，其序列和SEQ ID No：26-30之一的序列互补以及其序列在严紧条件下和所述的多核苷酸杂交的序列。
术语“严紧条件”意思为允许两条单链DNA在65℃特异杂交，例如在6xSSC，0.5％SDS，5xDenhardt’s溶液以及100微克非特异载体DNA或者任何其它含有相当离子强度的溶液中，然后在65℃洗涤例如至多为0.2X SSC和0.1％SDS或者其它等离子强度的溶液。严紧条件确定的参数依赖于温度，在该温度下50％的双链分离(Tm)。对于超过30个碱基的序列，Tm由以下关系确定：Tm＝81.5+0.41(％G+C)+16.6log(阳离子浓度)-0.63(％甲酰胺)-(600/碱基数)。对于小于30个碱基的序列，Tm由以下关系确定：Tm＝4(G+C)+2(A+T)。严紧条件用Sambrook等人2001年描述的流程(分子克隆：实验室手册，第三版，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，Cold SpringHarbour，New York)来确定。
合成含由本发明方法确定的肽基序重复的多肽是有利的。结果，本发明涉及的多核苷酸的特征在于它包括编码本发明肽的多核苷酸多聚体。本发明也涉及特征在于它是由本发明的肽重复组成的多肽。
本发明也涉及细胞表达载体，其特征在于它包括以上确定的多核苷酸和允许本发明的肽在宿主中表达的调控序列。
本发明也涉及用于制备本发明的肽的方法，包括用以上确定的细胞表达载体转化宿主细胞，随后培养转化的宿主细胞并从培养基中回收肽。
本发明进一步涉及抗血清或者免疫血清或者纯化的多克隆抗体或者单克隆抗体，其特征在于所述的抗体或者抗血清或者免疫血清能够特异性结合根据本发明的肽。
获得特异的抗由本发明方法鉴定的肽的抗体，例如通过注射本发明的肽免疫动物，并回收产生的抗体。通过技术人员已知的技术获得单克隆抗体，例如Kohler和Mistein描述的杂交瘤方法(1975)。
获得特异抗目的蛋白磷酸酶2A的抗体，其在免疫治疗上具有特殊应用。例如，它们能够作为病毒或者寄生虫针对蛋白磷酸酶2A的蛋白拮抗剂，以阻止病毒或者寄生虫的发育。
类似地，编码本发明肽的多核苷酸可以直接转入到目的细胞的核中，如果需要可以使用合适的载体，在体内表达相应的肽，所述的肽可通过竞争性抑制蛋白磷酸酶2A和其来源的病毒或者寄生虫蛋白之间的特定的相互作用。
本发明因此涉及药物组合物，该药物组合物包括选自本发明的多核苷酸或者抗体的一种成分。
本发明也涉及药物组合物，该药物组合物包括本发明的一种肽以及药物学上可接受的载体。
本发明进一步涉及上述的本发明肽在制备用于治疗病毒或者寄生虫感染的药物中的用途。
优选，本发明涉及上述其序列来自Vpr蛋白片段的多肽的用途，用于制备可以抑制HIV感染的药物。
可有利地选择本发明的肽来刺激与细胞蛋白2A激活相关的凋亡的诱导。这样，本发明也涉及本发明上述的肽在制备可以诱导目的细胞尤其是肿瘤细胞凋亡的药物中的用途。
在进一步优选的方面，本发明涉及其序列来自CK2α蛋白片段的肽在制备抑制寄生虫感染的药物中的用途。更具体地，本发明涉及肽在制备治疗疟疾的药物中的用途。
病毒或者寄生虫感染导致包含本发明肽序列的蛋白的特异表达。因此编码本发明肽的序列可用作探针从患者生物样品提取的RNA中检测特定病毒感染或者寄生虫感染。
类似的，本发明的抗体可用于特异地识别在感染时表达的病毒或者寄生虫蛋白含有的肽的序列。
这样，本发明涉及本发明多核苷酸或者本发明抗体在体外诊断寄生虫或者病毒疾病中的用途。
本发明也涉及选择并使用结合蛋白磷酸酶2A，并能够穿透细胞的肽。
该肽的实例由来自小泰勒虫的CK2α蛋白的肽FD6(SEQ ID No：20)说明。本发明中已经显示，细胞中该肽的出现不会影响培养和维持的活的哺乳动物细胞的存活性。
以下实验部分说明应用本发明鉴定肽的方法鉴定来自HIV-1的Vpr蛋白的以及小泰勒虫寄生虫蛋白CK2α的肽。本发明也涉及选择并使用结合蛋白磷酸酶2A，并可能穿透细胞的肽，所述的肽可以使调节蛋白磷酸酶2A的分子靶向并接触细胞内的蛋白磷酸酶2A。
图解
图1：用PP2A结构亚基A(A)和全酶PP2A1(B)筛选含有覆盖HIV-1的Vpr序列的肽的膜。
覆盖54-57四条肽序列限定位点2的序列 VEALIRILQQLLFIHFRI(SEQ ID No：1)
肽54：VEALIRILQQLL
肽55：ALIRILQQLLFI
肽56：IRILQQLLFIHF
肽57：ILQQLLFIHFRI
覆盖64-66三条肽序列限定位点1的序列 RHSRIGIIQQRRTRNG(SEQ ID No：2)
肽64：RHSRIGIIQQRR
肽65：SRIGIIQQRRTR
肽66：IGIIQQRRTRNG
图2：用(A)PP2A结构亚基A和(B)全酶PP2A1筛选含有覆盖泰勒虫的CK2α序列的肽的膜。
覆盖含有两条肽序列限定位点1的序列RKIGRGKFSEVFEG(SEQ ID No：3)
肽66：RKIGRGKFSEVF
肽67：IGRGKFSEVFEG
覆盖74-83十条肽序列限定位点2的序列TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL(SEQ ID No：4)
肽74：TVTKDKCVIKIL
肽75：TKDKCVIKILKP
肽76：DKCVIKILKPVK
肽77：CVIKILKPVKKK
肽78：IKILKPVKKKI
肽79：ILKPVKKKKIKR
肽80：KPVKKKKIKREI
肽81：VKKKKIKREIKI
肽82：KKKIKREIKILQ
肽83：KIKREIKILQNL
覆盖三条肽序列限定位点3的序列KILRLIDWGLAEFTHP(SEQID No：5)
肽129：KILRLIDWGLAE
肽130：LRLIDWGLAEFY
肽131：LIDWGLAEFYHP
图3：图3为柱状图代表了表3中引述的肽进行细胞渗透测试获得的胞内渗透值。
图4：图4说明MTT存活测试评估不同的肽对于Hela细胞存活的影响。
在肽FD8(4A)，FD13/FD14(4B)和FD11/FE12(4C)浓度增加时测试Hela细胞的存活(表示为初始数量的百分比)
实验部分
A材料和方法
A.1纯化的PP2A蛋白
从猪脑中提取三聚体PP2A1蛋白纯化为同质蛋白。
PP2A重组的结构亚基在E coli中表达并用Cohen等人描述的方法(Cohen P，Aiemany S，Hemmings B A，Resink T J，Stralfors P，TungH Y.Protein phosphatase-1 and protein phosphastase2A from rabbitskeletal muscle.Methods Enzymol 1988 159，390-408)，或者Bosch等人描述的方法(Bosch M，Cayla X，Van Hoof C，Hemmings B A，OzonR，Merlevede W，Goris J.the PR55 and PR65 subunits of proteinphosphastase 2A from Xenopus laevis.Molecular cloning anddevelopmental regulation of expression.Eur J Biochem1995，230，1037-45)进行纯化。
A.2.鉴定HIV Vpr的PP2A结合位点和小泰勒虫(T parva)CK2α的PP2A结合位点的方法
通过以上描述的“点肽”技术(Frank and Overwing，1996，MethMol Biol 66，149-169)鉴定来自CK2α蛋白(由T parva原虫编码)或者Vpr蛋白(由HIV-1病毒编码)的PP2A的结合蛋白。
该方法包括在纤维素膜上固定的位置原位合成十二肽，其中序列系列覆盖目的蛋白(Vpr或者CK2α)的全序列。膜上两个连续点的肽通过两个氨基酸交叠。
合成覆盖HIV-1的Vpr蛋白的全序列的68个十二肽和覆盖泰勒虫的CK2α蛋白序列的205个十二肽，并将其共价连接到纤维素膜上。
在环境温度下每张制备的膜先用含有5％脱脂的Régilait(牛奶)和3％BSA的TBS饱和1小时，然后在含有4ug/ml纯化的蛋白(PP2A亚基A或者全酶PP2A1)的相同缓冲液中孵育过夜。和蛋白质印迹一样，在将膜和抗结构蛋白A(图1A和2A)的抗体以及识别PP2A蛋白A，B和C(图1B和2B)的抗体混合物一起孵育之后，每种纯化的蛋白(结构亚基A或者三聚体全酶PP2A1)和肽序列的特异的相互作用就显示出来。
用传统的用于孵育的TBST缓冲液(TBS+TWEEN)15分钟冲洗膜5次，在环境温度下用二抗(偶联有过氧化物酶)再孵育1小时。最后用TBST缓冲液15分钟冲洗膜5次并且显现。
A.3细胞渗透测试
1-细胞
我们分析了Hela细胞系，它来自人的子宫颈癌细胞。
2-定量确定内化的肽
裂解缓冲液
0.1m Tris缓冲液，pH8含有0.5％NP40.
OPD缓冲液
25.7毫升的0.2M磷酸二钠盐+24.3毫升的0.1M柠檬酸+50毫升的纯净水；调节到pH5.0
生物素化的-抗生素肽复合体
4摩尔肽和1摩尔抗生素-过氧化物酶在环境温度下孵育20分钟。
-分析不同肽进入Hela细胞的胞内渗透
将Hela细胞(100l含有104)接种到96孔板(平底)中，使用完全DMEM培养基并加入2.5％青霉素/氨卞青霉素和10％胎牛血清。在37℃下CO2箱(5％)中培养过夜，加入复合体(生物素-抗生素过氧化物酶肽)不同的稀释液。在培养4小时后，吸出上清，用PBS将细胞洗3遍，用胰酶处理并在PBS中计数。在计数之后，细胞置于300ul的裂解液中。
-测量过氧化物酶的活性
50ul的OPD缓冲液加入96孔的ELISA培养板中，并加入50ul的裂解缓冲液或者50ul的细胞裂解液(通常，使用不同的系列稀释(至1/2))。为了显现，加入50ul的OPD溶液(在暗处)。用100ul的1N的HCl停止反应(大约10分钟)
-结果分析
过氧化物酶的活性通过在490nm下读数ELISA读数装置(620nm的参考滤光器)得到，从标准曲线中计算裂解液中的过氧化物酶的量，并推断至相同数量的细胞(103或者104)：
肽分子数＝(6*1023/肽的分子量)*PO的ng数*10-9
A.4细胞存活性测试
Hela细胞(100ul含有104)接种到96孔板(平底)中，使用含有2.5％青霉素/氨卞青霉素和10％肽牛血清的完全的DMEM培养基。在不同的肽浓度中，细胞在37℃下CO2箱(5％)中培养过夜。在培养72小时后，吸出含有肽的培养基，加入100ul的0.5毫克/毫升的MTT(只在DMEM中稀释)至每个孔。37℃下暗处培养30分钟，然后吸出MTT，并将50ul的DMSO加入到所有孔中。需要等待十分钟完成细胞裂解，并搅动裂解液使得孔中的反应产品均匀分散。然后，用690nm参考滤光器读出平板在570nm处的读数。
B.结果和讨论
B.1.鉴定由两种病原体(HIV-1和小泰勒虫)编码的蛋白的含 有和PP2A(PP2A1和亚基A)结合的位点的肽序列
在用纯化的三聚体PP2A全酶孵育含有覆盖HIV-1的Vpr和Tparva的CK2α序列的肽的膜之后得到的结果允许确定Vpr和CK2α肽的5个可以特定结合PP2A的序列并在下表显示：
表1：含有HIV-1 Vpr和CK2α同PP2A的结合位点的肽序列
 亚基A  PP2A1
 HIV-1 Vpr     位点1位点2  RHSRIGIIQQRRTRNG  RHSRIGIIQQRRTRNG
 VEALIRILQQLLFIHFRI
 小泰勒虫CK2α 位点1位点2位点3  RKIGRGKFSEVFEG
 TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL
 KILRLIDWGLAEFYHP  KILRLIDWGLAEFYHP
更精确地，鉴定含有HIV-1 Vpr的同PP2A1蛋白(图1B，“位点1”)以及同亚基A(图1A，“位点1”和“位点2”)的结合位点的两条肽序列。也鉴定含有小泰勒虫CK2α的同PP2A1蛋白(图2B，“位点3”)以及和结构亚基A(图2A，“位点1”，“位点2”和“位点3”)的结合位点的三条肽序列。
B.2使用结合PP2A的HIV-1 Vpr肽的重要性
外源表达或者由于HIV-1的Vpr前病毒感染引起的表达诱导Hela细胞，T淋巴细胞系和初级淋巴细胞调亡(Stewart等人，1997 J Virol71：5579-9)。最初使用Vpr突变体使得该影响与细胞停止在细胞周期G2期相关。最近已经表明，Vpr也能够诱导同G2期，停止不相关的调亡(Nishizawa等人，2000，Virology 27，16-26)。
据报道在和E4或f4腺病毒蛋白相互作用后PP2A的活化诱导转化细胞的调亡(Shtrichman R等人，2000，Oncogene19，3757-3765)。类似的，Vpr的表达也诱导转化细胞的调亡。(Stewart等人，1999，PNAS，96，12039-12043)。
进一步地，本领域已知的Vpr突变体的分析表明由本发明方法鉴定的并特异结合PP2A蛋白的肽包含了与Vpr调亡前作用(pro-apototic)相关的序列。
这样，和PP2A相互作用的并由本发明方法鉴定的病毒蛋白Vpr和E4orf4的片段在诱导肿瘤细胞的调亡中非常有用。
鉴定的肽也自然用于抑制HIV或者其它相关的病毒和逆转录酶病毒引起的感染。
B.3.使用结合PP2A的小泰勒虫CK2α序列的重要性
Okadaic酸和SV40小T抗原的使用证明了PP2A通过新的涉及P13-激酶，PKCζ(鉴定为MAP-激酶-激酶-激酶或者MEKK)，MEK蛋白和两种MAP激酶ERk-1和ERk-2，以及转录因子NF-kB和Sp1的磷酸化级联反应途径控制细胞增殖。(Sontag E，Sontag J M，GarciaA(1997)，EMBO J，16，5662-5671；Ayllon V，Martinez A，C，Garcia A，Cayla X和Rebollo A(2000)，EMBO J 19，1-10，A Garcia，S Cereghini，E Sontag(2000)，J Biol Chem275，9385-9389)。进一步地，PP2A在调节MAP激酶级联反应中的功能已经由Chambaz研究组提出(Hériché等人，(1997)，Science，276，952-955)，研究显示过表达细胞的CK2α亚基活化去磷酸化MEK蛋白的PP2A。
Ole-Moi等人的研究(Embo J.1993，12，1621-1631)表明泰勒虫转化诱导宿主蛋白高度磷酸化。该效应部分是由于组成性活化细胞的CK2α造成的，细胞CK2α本身依赖于由寄生虫编码并分泌到转化细胞的细胞液中的CK2α型亚基的作用。
正如以下所示，由本发明方法鉴定的对应3个同PP2A的结合位点的序列的比较，可以鉴定一类基序的存在：K-I-G/L-R/K，其在位点2部分重复。
位点1：
位点2：
位点3： (部分重复，KIL/RLI)
有趣的是，CK2α的ATP结合位点部分覆盖位点1和位点2，这表明在CK2α和亚基A相互作用后抑制激酶活性。进一步地，可从下表2看出，含有小泰勒虫的CK2α的与PP2A的结合位点的3个序列在包括恶性疟原虫和利什曼虫寄生虫的多个物种中保守。
表2：比较多种CK2α序列同来自小泰勒虫的含有PP2A结合位点的肽(恶性疟原虫序列从EST推断出来；其它的来自“Swissprot”基因库。)仅仅指出和小泰勒虫序列不同的残基。
位点1
小泰勒虫/恶性疟原虫R KIGRGK SEV FEG
恶生疟原虫/Bovine/Dictyo
位点2
小泰勒虫的T
Figure A0281838600273
IK LKPVKKKK
Figure A0281838600275
KREI L
Figure A0281838600277
NL
恶性疟原虫
Figure A0281838600278
C
Figure A0281838600279
AV
Bovine N N-E V
利什曼虫NN VVV
利什曼虫 V
Figure A02818386002714
Q V-L T
Dictyo
位点3
T.parva L RLIDWGLAEFYH P
利什曼虫 I
恶性疟原虫R Q
Bovine R
Figure A02818386002719
仔细分析相互作用表明来自不同种的CK2α应该和PP2A相互作用；例如图2中描述的来自小泰勒虫CK2α的肽131可以结合PP2A，其中位点3的最初4个氨基酸被缺失。这表明最初3个氨基酸不同的的利什曼虫，恶性疟原虫的CK2α可以结合PP2A。这和KILRLI基序具有重复的可以作为PP2A结合位点的K/R-II/L-I/L序列这一事实相一致。
细胞内存在的这些肽，对应于蛋白同PP2A的体内结合位点，可以干扰这些寄生虫的发育。
B.4.本发明的肽化合物对细胞的生物学影响
表3列出的不同的肽以生物素化的形式合成，用HPLC纯化(Neosystem)并在Hela细胞中分析它们对胞内渗透和细胞存活的影响。表1中显示的一系列肽的研究允许确定6条有可能穿透进入Hela细胞的肽(图3)。
■FD6：12个AA的肽，来自PP2A亚基A和小泰勒虫CK2α蛋白相互作用的一个位点。
■FD7：18个AA的肽，对应于3个6AA六基序的重复体；该序列来自恶性疟原虫CK2α，和与PP2A结合的小泰勒虫序列同源；
■FD8：来自鱼精蛋白的肽(一种已知的PP2A的激活剂)；
■FD11：18个AA的肽，对应于3个6AA六基序的重复体，来自FD14序列；
■FD14：FD14，其复制已鉴定的HIV-1 Vpr的同PP2A的结合位点；
■FD13：该肽对应于HIV-1 Vpr序列，它和FD14肽序列同源，代表了另外一种HIV-1 Vpr的PP2A结合位点。
进一步地，在表1中显示的系列肽中进行的存活研究可以鉴定3种抑制Hela细胞存活的肽：
■FD8：影响Hela细胞的存活(图4A)；
■FD14：清除地影响Hela细胞的存活(图4B)；
■F12：18个AA的肽，其序列来自FD11肽(R突变为A)。该肽和Chlamydia muridarum的葡糖胺转移酶蛋白同源，影响Hela细胞的存活(图4C)。这种生物影响归因于和质膜的相互作用。
表3：模拟目的蛋白同PP2As的结合位点的肽
 原蛋白 肽编号  肽序列  SEQ ID No：
 CD28
 FD2  -PRRPGPTRKHY  SEQ ID No：132
 FD3  -(PRRPGPTRK)2  SEQ ID No：133
 CK2α小泰勒虫
 FD6  -VKKKKIKREIKI  SEQ ID No：20
 CK2α恶性疟原虫(小泰勒虫类似物)  FD7  -(RQKRLI)3  SEQ ID No：134
 Vpr(HIV-1)
 FD9  -RHSRIG  SEQ ID No：135
 FD10  -(RHSRIG)2  SEQ ID No：136
 FD11  -(RHSRIG)3  SEQ ID No：137
 FD12*  -(AHSRIG)3-(FD11突变体，R…A)  SEQ ID No：138
 FD13  RHSRIGVTRQRRARNG(FD14类似物)  SEQ ID No：139
 FD14  RHSRIGIIQQRRTRNG  SEQ ID No：2
 精蛋白  FD8  RRRRRRRRSRGRRRRTY  SEQ ID No：140
讨论
来自某些蛋白的与PP2As相互作用的肽是否是新型的抗肿瘤方法？
我们的研究可以鉴定两种来自两种已知和PP2As相互作用的蛋白，Vpr和精蛋白的渗透性肽(FD8/FD14)。这些通常富含精氨酸和赖氨酸的肽可以通过常规内化机制渗透入细胞。近来报道该机制在富含精氨酸序列的内化肽中很常见(Tomoki Suzuki等人，2002，在富含精氨酸的肽中可能存在共同的内化机制Possible existence ofcommon interlization mechanisms among arginien-rich peptides，JBC277，2437-2443)。通常，存在富含精氨酸或者赖氨酸表明蛋白结合PP2As，这说明其它穿透肽可以在PP2A系列中鉴定。
Vpr，由HIV-1病毒编码的蛋白，涉及维持高病毒释放而且涉及确立和HIV相关的发病机理。因外因或者前病毒HIV-1感染的Vpr的表达诱导Hela细胞，T淋巴细胞系，初级淋巴细胞和转化的细胞的调亡(Stewart等人，J Virol 1997，71，5579-9；Stewart等人1999，PNAS，96，12039-12043)。进一步的，已经报告PP2A和另一病毒蛋白，腺病毒E4或f4相互作用(Marcellus等人，J Virol2000，74，7869-7877)可以诱导肿瘤细胞调亡。总之，这些结果表明，某些PP2As的激活的假设可以作为一种诱导肿瘤凋亡的新方法。在这点上，我们显示在图4B的结果表明来自HIV-1 Vpr的F14肽可以代表一种抗肿瘤的生物肽。肽13生物效应缺乏(其序列和FD14比较有4个AA不同-见表2)表明FD14的结构对于调节Hela细胞存活关键。结果，模拟FD14肽结构的化学分子的生产可以产生新型的抗肿瘤物质。

Claims (40)

1.肽，其长度少于30个氨基酸，优选少于20个氨基酸，特征在于其在体外特定结合2A型蛋白磷酸酶全酶或其亚基之一。
2.根据权利要求1的肽，其特征在于它是病毒，寄生虫或者细胞蛋白的片段，该蛋白在体外结合2A型蛋白磷酸酶，或者它是由于取代或者缺失了氨基酸而区别于上述蛋白片段的序列，然而所述区别序列仍然保留了结合2A型蛋白磷酸酶或其亚基之一的特性。
3.根据权利要求2的肽，其特征在于所述的病毒，寄生虫或者细胞蛋白选自以下蛋白之一：SV40或者多瘤病毒t抗原，多瘤病毒的中间t抗原，PP2A的B型(B，B’，B”)亚基，CXCR2(趋化因子受体)，CK2α，CaMIV，p70S6-激酶，Pak1/Pak3，Tap42/alpha4，PTPA，Set/I1/I2-PP2A，E4或f4，tau，CD28或者Vpr。
4.根据权利要求3的肽，其特征在于它是CD28蛋白的片段，选自以下肽序列之一：
a)PRRPGPTRKHY(SEQ ID No：132)；或者
b)该序列由于替换或者缺失了氨基酸而和a)中所示序列不同，不过该序列保留了结合2A型蛋白磷酸酶或者其亚基之一的特性。
5.根据权利要求3的肽，其特征在于所述的病毒，寄生虫或者细胞蛋白是HIV病毒的Vpr蛋白。
6.根据权利要求5的肽，其特征在于所述的Vpr蛋白来自HIV-1或者HIV-2病毒。
7.根据权利要求6的肽，其特征在于它选自以下肽序列之一：
a)RRRRRRRSRGRRRRTY(SEQ ID No：140)；或者
b)该序列由于替换或者缺失氨基酸而和a)中所示序列不同，不过该序列保留了结合2A型蛋白磷酸酶或者其亚基之一的特性。
8.根据权利要求6的肽，其特征在于它包括于以下序列之一：
a)VEALIRILQQLLFIHFRI(SEQ ID No：1)；
b)RHSRIGIIQQRRTRNG(SEQ ID No：2)；或者
c)该序列和SEQ ID No：1或者SEQ ID No：2的区别在于替换或者缺失氨基酸，不过该区别序列保留了结合2A型蛋白磷酸酶或其亚基之一的特性。
9.根据权利要求8的肽，其特征在于它为序列RHSRIGVTRQRRARNG(SEQID No：139)
10.根据权利要求8的肽，其特征在于由序列RHSRIG(SEQ IDNo：135)组成。
11.根据权利要求1到10任一项的肽，其特征在于它的给药诱导肿瘤细胞凋亡。
12.根据权利要求3的肽，其特征在于所述病毒，寄生虫或者细胞蛋白是CK2α蛋白。
13.根据权利要求12的肽，其特征在于所述的CK2α蛋白来自寄生虫小泰勒虫。
14.根据权利要求12或者13的肽，其特征在于它的给药减少寄生虫的发育。
15.根据权利要求12-14任一项的肽，其特征在于它包括于以下序列之一：
a)RKIGRGKFSEVFEG(SEQ ID No：3)；
b)TVTKDCVIKILKFPVKKKKIKREIKILQNL(SEQ ID No：4)；
c)KILRLIDWGLAEFYHP(SEQ ID No：5)；或者
d)来自恶性疟原虫或利什曼原虫的SEQ ID No：3，SEQ ID No：4或者SEQ ID No：5的同源序列；或者
由替换或者缺失氨基酸而源于上述序列的序列，不过该区别序列保留了结合2A型蛋白磷酸酶或其亚基之一的特性，且尤其是序列TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL。
16.根据权利要求15的肽，其特征在于它是肽RQKRLI(SEQ IDNo：141)。
17.根据权利要求1-16任一项的肽，其特征在于它竞争性抑制它的来源天然蛋白同PP2A全酶或其亚基之一的相互作用。
18.根据权利要求1-17任一项的肽，其特征在于它结合到能够将所述的肽转移到真核细胞中的载体上。
19.多肽，其特征在于它由根据权利和要求1-13任一项的肽的重复而组成。
20.根据权利要求19的多肽，其特征在于它选自以下序列之一：
a)(RHSRIG)2(SEQ ID No：136)；
b)(RHSRIG)3(SEQ ID No：137)；或者
c)(RQKRLI)3(SEQ ID No：134)。
21.多核苷酸，其特征在于其序列由根据权利要求1-20任一项中的肽的编码序列组成。
22.多核苷酸，其特征在于它的序列选自以下序列之一：SEQ IDNo：26，27，28，29或者30。
23.多核苷酸，其特征在于它由权利要求21或22的多核苷酸的多聚体组成。
24.细胞表达载体，其特征在于它包括根据权利要求21-23任一项的多核苷酸以及允许在宿主细胞中表达根据权利和要求1-20任一项中的肽的调控序列。
25.纯化的多克隆或者单克隆抗体，其特征在于它能够特异地结合根据权利要求1-20任一项中的肽。
26.药物组合物，其包括根据权利要求1-20任一项中的肽，结合药物学上可接受的载体。
27.药物组合物，其包括选自根据权利要求21-23中任一项的多肽，根据权利要求24的表达载体或者根据权利要求25的抗体的元素。
28.肽，其特征在于它选自以下序列之一：
●SEQ IN No：137；
●SEQ IN No：139；
●SEQ IN No：140。
29.肽，其特征在于它具有序列SEQ IN No：20。
30.权利要求1至20，28或者29任何一项的肽或者多肽的用途，用于制备治疗病毒或者寄生虫感染的药物。
31.权利要求5至10，28或者29任何一项的肽或者多肽的用途，用于制备抑制HIV感染的药物。
32.权利要求5至20或者28中任一项的肽的用途，用于制备可以诱导靶细胞，尤其是肿瘤细胞调亡的药物。
33.权利要求12至16任何一项的肽的用途，用于制备抑制寄生虫感染的药物。
34.权利要求12至16任何一项的肽的用途，用于制备治疗疟疾的药物。
35.根据权利要求21-23任一项的多核苷酸或者权利要求25的抗体的用途，用于体外诊断寄生虫或者病毒疾病。
36.鉴定其序列来自病毒，寄生虫或者细胞蛋白的肽的方法，所述的肽特异性结合2A型蛋白磷酸酶全酶或其亚基之一，该方法包括以下几个步骤：
a)以斑点的形式将序列源于病毒，寄生虫或者细胞蛋白的肽沉淀到支持物上，每个斑点对应于一个具有确定序列的肽的沉淀；
b)将固体支持物和含有蛋白磷酸酶2A全酶或其亚基之一的溶液接触，使用的条件允许支持物上的肽结合该全酶或其亚基之一；并且
c)鉴定固体支持物上和蛋白磷酸酶2A或其亚基之一结合的肽。
37.根据权利要求36的方法，其特征在于以斑点形式沉淀的肽长度小于20个氨基酸，更加优选长度小于15个氨基酸。
38.根据权利要求36或者37的方法，其特征在于肽沉淀在纤维素膜上。
39.根据权利要求36-40任何一项的方法，其特征在于一系列沉淀的肽序列覆盖这些序列所来源的病毒，寄生虫或者细胞蛋白的完整序列。
40.制备权利要求1-20，28或者29任何一项的肽的方法，包括用权利要求24中定义的细胞表达载体来转化宿主细胞，随后在培养基中培养转化的宿主细胞并回收肽。
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