KR20090060462A - 단백질 포스파타제 2ａ에 결합하는 합성 또는 천연 단백질, 이의 동정 방법 및 용도 - Google Patents
단백질 포스파타제 2ａ에 결합하는 합성 또는 천연 단백질, 이의 동정 방법 및 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 특히 바이러스 감염 또는 기생충 감염의 치료, 또는 종양의 치료에 유용한 신규의 합성 또는 천연 펩티드에 관한 것으로, 본 발명의 펩티드는 크기가 30 아미노산 미만, 바람직하게는 20 아미노산 미만, 특히 15 내지 20 아미노산이며, 이들 펩티드는 시험관 내에서 2A형 단백질 포스파타제 홀로효소 또는 그의 서브유닛중 하나에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
바이러스 치료, 기생충 치료, 종양 치료, 펩티드, 2A형 단백질, 포스파타제, 홀로효소,서브유닛
Description
본 발명은 특히 바이러스 감염 또는 기생충 감염의 치료, 또는 종양의 치료에 유용한 신규의 합성 또는 천연 펩티드에 관한 것으로, 본 발명의 펩티드는 크기가 30 아미노산 미만, 바람직하게는 20 아미노산 미만, 특히 15 내지 20 아미노산이며, 이들 펩티드는 시험관 내에서 단백질 포스파타제 2A 홀로효소 또는 그의 서브유닛중 하나에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 이들 펩티드의 동정 방법 및 용도에 관한 것이다.
세포성 단백질 포스파타제 2A의 활성의 조절에서 본 발명의 펩티드의 역할이 밝혀졌기 때문에, 상기 단백질 포스파타제 2A, 그들의 생리적인 역할 및 몇몇 세포성 단백질, 바이러스 단백질 또는 기생충 단백질과의 상호작용에 대한 현재의 지식을 상기하는 것이 중요하다.
세포 생리학은 단백질 인산화의 조절을 통해 부분적으로 조절된다. 세포성 단백질의 인산화는 인산화시 단백질 키나제 및 탈인산화시 단백질 포스파타제의 길 항작용에 따라 달라진다.
단백질 포스파타제는 2가지의 중요한 군으로 분류된다: 티로신 포스파타제와 세린/트레오닌 포스파타제. 세린/트레오닌 포스파타제는 그들의 기질 특이성 및 특정 억제제에 대한 민감성에 따라 2가지의 중요한 부류, 즉 1형 포스파타제(PP1) 및 2형 포스파타제(PP2)로 분류된다. 2형 포스파타제(PP2A)도 상이한 부류, 즉 포스파타제 2A(PP2A), 칼슘에 의해 활성이 조절되는 포스파타제 2B 또는 칼시네우린 및 마그네슘에 의해 활성이 조절되는 포스파타제 2C(PP2C)로 나뉘어 진다.
포스파타제 2A는 진화중에 잘 보존되며, 다수의 생물학적 과정의 조절에서 잠재적으로 관련되어 있는 것으로 공지되어 있다. PP2A 효소는 전사 조절에서 세포 주기 또는 바이러스 형질전환의 제어에 명백하게 관여한다. 또한, PP2A는 각종 바이러스 또는 기생충 단백질에 의하여 표적화되는데, 이는 숙주-병원체 상호작용에서 PP2A에 대한 역할을 시사한다.
PP2A는 촉매 서브유닛 (C) 및 1 또는 2 개의 조절 서브유닛 (A) 및 (B)를 각각 포함하는 올리고머 복합체 (홀로효소)이다. 서브유닛 (A)의 구조는 38 내지 40 개의 아미노산의 보존된 아미노산 서열의 15 개의 불완전 반복부로 이루어지며, 이중 특정의 반복부는 서브유닛 (B) 및 (C)와 상호작용한다. 진화중에 보존된 서브유닛 (A) 및 (C)은 효소의 기본 구조를 이루며, 구조적으로 형질전환된다. 반대로, 서브유닛 (B)은 차등 형질발현되고 공통의 구조를 통하여 결합되지 않는 조절 단백질 과(family)를 이룬다(Cohen P. The structure and regulation of protein phosphatases, Annu Rev Biochem 1989; 58: 453-508). 단백질 포스파타제 2A는 생 체내에서 이량체 형태 (AC) 및 삼량체 형태 (ABC)의 상이한 2 가지 유형의 형태로 존재한다. 서브유닛 (B)는 포스파타제 활성 및 기질에 대한 특이성을 조절한다. PP2A의 다중 형태의 존재는 생체내에서 PP2A의 뚜렷한 가변 작용과 상관관계를 갖는다.
최근, 병원체에 의하여 합성된 각종 단백질, 특히 바이러스 및 기생충 단백질은 단백질 포스파타제 2A의 특정의 특이성 활성을 변경시키는 것과 관련되어 있다.
숙주 세포에서의 이의 복제 및 생존을 촉진시키는 바이러스에 의하여 PP2A를 포함한 각종의 전략이 채택되고 있다. 예를 들면, 파라인플루엔자 바이러스는 PP2A의 제어하에 세포성 기원의 단백질인 단백질 PKCζ을 이의 바이러스성 입자에 혼입시킨다. 이는 숙주 단백질의 인산화를 방해할 수 있으며, 이의 복제를 촉진할 수 있다(De BP, Gupta S, Barnejee AK. Cellular protein kinase C ζregulates human parainfluenza virus type 3 replication. Proc. Natl Acad Sci USA 1995; 92: 5204-8).
형질전환력을 갖는 수개의 DNA 바이러스, 예컨대 파포바에 (papovae) 또는 아데노바이러스 뿐 아니라, 사람 면역결핍 바이러스 1 (HIV-1)와 같은 특정의 레트로바이러스는 특정의 숙주 PP2A와 직접 상호작용하는 단백질에 대하여 암호화한다. 이들 바이러스 모두는 구조적으로 상이하기는 하나, 특정의 홀로효소와 상호작용하며 포스파타제 활성을 변경시키는 단백질을 포함한다.
특히, 아데노바이러스의 E4orf4 단백질은 이종삼량체 PP2A에, 보다 정확하게 는 감염된 세포에서의 JunB의 전사의 감소를 야기하는 조절 서브유닛 (B)에 결합하는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 감염된 세포의 아폽토시스 반응을 조절함으로써 바이러스 감염중에 중요한 역할을 수행할 수 있다. 또한, E4orf4와 PP2A의 상호작용은 p53-독립적 방법으로 형질전환된 세포에서의 아폽토시스를 유발한다는 점이 흥미롭다(Shtrichman R 등, Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J Virol 1998; 72: 2975-82).
SV40 및 폴리오마 바이러스를 비롯한 파포바에 과의 종양 형성 바이러스는 세포 형질전환을 유발한다. PP2A는 SV40 또는 폴리오마의 "작은 T" 항원과 상호작용하며, 폴리오마의 "중간 T" 단백질의 형질전환과 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 바이러스성 단백질과 PP2A의 상호작용은 바이러스성 형질전환에 연관된 것이 명백하다. 마지막으로, 프로모터 조절 서열에 특이적으로 고정되는 각종 인자에 의한 세포에서 통상적으로 수행된 과정인 전사 조절은 아마도 PP2A에 의한 바이러스 형질발현의 제어에 관련된 가장 중요한 기전을 나타낸다. PP2A는 특히 AP1/SRE, NF-κB, Sp1 및 CREB를 비롯한 세포 성장 및 증식의 과정에 관련된 다수의 전사 인자에 대한 음성 조절체가 되는 것으로 입증되었다(Waszinski, B E, Wheat W H, Jaspers S, Peruski L F, J R Lickteig R L, Johnson G L, and Klemm D J, Nuclear protein phosphatase 2A dephosphorylates protein kinase A-phosphorylated CREB and regulates CREB transcriptional stimulation. Mol Cell Biol 1993 13, 2822-34). 이러한 전사 인자의 바이러스 조절은 바이러스 전사의 변경을 가능케 한다.
HIV-1의 바이러스 단백질, Vpr은 PP2A와 시험관내에서 상호작용하며, PP2A의 촉매 활성을 자극한다(Tung L 등, Direct activation of protein phosphatase 2A0 by HIV-1 encoded protein complex Ncp7: vpr. FEBS Lett 1997; 401: 197-201). Vpr은 p34cdc2-사이클린 B 복합체의 활성화를 억제함으로써 감염된 세포의 G2 중지를 유발한다. 추가로, Vpr은 전사 인자 Sp1과 상호작용하며, Sp1 의존성 HIV-1의 전사에 대한 약한 전이활성체가 된다. 그래서, 비리온으로 혼입되는 HIV-1의 Vpr 단백질은 생체내에서 Tat 전사 인자 (HIV-1 바이러스에 의해 암호화되는 주요 전사 조절체)의 형질발현을 조절하는데 필수적인 단계인 바이러스 전사의 개시에 참여하여야만 한다.
기생충 감염에서의 단백질 키나제의 정립된 역할과는 반대로, 세린/트레오닌 포스파타제가 기생충학 분야에서 중요한 잠재적 조절체가 되는 것으로 인식되기 시작한지는 불과 3년 정도되었다.
초기에는, 2 개의 세린/트레오닌 포스파타제, Ppb 및 PfPP가 플라스모디움 팔시파럼(Plasmodium falciparum)에서 구별되었었다. 기생충에서의 포스파타제 1 및 포스파타제 2A 활성의 존재는 효소학 연구에 의하여 입증되었다. 마지막으로 기생충 효소 PP2A 및 PP2B를 정제하였다.
세린/트레오닌 포스파타제는 최근 소의 기생충인 피. 팔시파럼과 유사한 또다른 원생동물인 테일레리아 파르바(Theileria parva)가 연구되었다. 기생충에 의하여 감염된 단핵구 및 백혈구 숙주 세포가 형질전환되어 동물에게서 백혈병을 일으킨다. 테일레리아로 감염된 세포의 정제된 기생충은 단백질 키나제 CK2α를 형질발현한다. 이제, 서브유닛 CK2α는 PP2A와 반응하여 이의 활성을 양성 변경시켜야 만 한다. 문헌 (Heriche H 등, Regulation of protein phosphatase 2A by direct interaction with casein kinase 2α, Science 1997; 276: 952-5). 추가로, CK2α서브유닛의 형질발현을 통한 PP2A의 변경은 기생충 감염된 세포에서의 2 가지 시그날 경로, 즉 MAP-키나제의 차단(Chaussepied M 등, Theileria transformation of bovine leukocytes: a parasite model for the study of lymphoproliferation, Res Immunol 1996; 147: 127-38) 및 단백질 키나제 B (Akt)의 차단(M. Baumgartner, M. Chaussepied, MF Moreau, A. Garcia, G. Langsley. Constitutive PI3-K activity is essential for prolifilation, but not survival of Theileria parva - transformed B cells. Cellular Microbiol. (2000) 2, 329-339)에 기초한다.
PP2A와 상호작용하는 일련의 단백질에 대한 공통의 모티프의 부재는 단백질과 PP2A의 결합에 직접 관련된 펩티드 모티프의 정보 동정을 방해한다.
전술한 바와 같이 바이러스-숙주 상호작용 또는 기생충-숙주 상호작용에서의 단백질 포스파타제 2A의 주요한 역할로 인해서, 바이러스 또는 기생충 단백질과 PP2A 홀로효소 또는 이의 서브유닛중 하나의 결합 부위의 구별의 중요성을 이해할 수 있으며, 그리하여 이들 바이러스 또는 기생충 병원체에 대한 신규한 치료적 표적을 구별할 수 있게 된다.
특히, PP2A와 상호작용하는 펩티드의 동정은 신규한 약제가 개발되어 경쟁적 억제에 의하여 PP2A와 상호작용을 통한 바이러스 또는 기생충 단백질에 의해 야기되는 세포 기전, 특히 감염, 병원체 증식 및 세포 형질전환의 기전을 차단할 수 있어야만 한다.
본 발명은 PP2A 홀로효소 또는 이의 서브유닛중 하나를 결합하는, 크기가 감소된 펩티드를 동정하는 수단에 관한 것이다. 크기가 큰 천연의 단백질 또는 폴리펩티드와 달리, 크기가 감소된 펩티드는 화학적으로 또는 세포계내에서 용이하게 높은 수율로 저렴하게 합성될 수 있는 잇점을 갖는다. 또한, 본 발명의 펩티드는 치료적 용도면에서 적절한 벡터를 사용하여 세포의 핵에 또는 세포질에 더욱 용이하게 그리고 안정적으로 전달된다.
본 발명은 PP2A 홀로효소 또는 이의 서브유닛중 하나와 상호작용하는 30 개 미만의 아미노산 크기를 갖는 펩티드, 특히 20 개 미만의 아미노산 크기를 갖는 펩티드를 동정할 수 있는 예시로부터 유래한다.
구체적으로, 본 발명자들은 문헌(Frank 및 Oerwing, Methods in Molecular Biology, 1996, vol. 66: 149-169, Epitope Mapping Protocols - 미국 뉴저지 토토와에 소재하는 G.E. Morris Humana Press Inc.에서 출판)에 기술된 바와 같은 "스팟 합성" 기법을 이용하여 홀로효소 PP2A 또는 그의 서브유닛중 하나와 상호작용하는 단백질의 결합 위치를 동정할 수 있다는 것을 확인하였다.
예를 들어, 본 발명자들은 시험관 내에서 정제된 홀로효소 PP2A 또는 그의 서브유닛중 하나와 상호작용하는 20개 이하 아미노산의 작은 크기의 펩티드를 동정하였는데, 상기 펩티드는 HIV-1의 Vpr 단백질 또는 기생충 티. 파르바의 CK2α단백 질로부터 유래한 것이다. 길항물질은 이들 펩티드로부터 유도 및 선택되는데, 그 이유는 이들이 바이러스 단백질 또는 기생충 단백질과 특정의 PP2A 홀로효소와의 상호작용을 억제하고, 이것이 신규한 항종양제, 항바이러스제 또는 구충제를 구성하기 때문이다.
또한, 본 발명은 단백질 포스파타제 2A 홀로효소 또는 그의 서브유닛중 하나에 특이적으로 결합하며, 서열이 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 세포성 단백질에서 유래하는 펩티드의 동정 방법에 관한 것인데, 상기 동정 방법은
(a) 지지체 상에 서열이 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 세포성 단백질에서 유래하는 펩티드를 스팟의 형태로 부착하는 단계로서, 각각의 스팟이 정해진 서열의 펩티드 부착물에 상응하는 것인 단계;
(b) 지지체 상의 펩티드가 상기 홀로효소 또는 그의 서브유닛중 하나에 결합할 수 있는 조건 하에서 단백질 포스파타제 2A 홀로효소 또는 그의 서브유닛중 하나를 함유하는 용액과 상기 고형 지지체를 접촉시키는 단계; 및
(c) 고형 지지체 상에서 단백질 포스파타제 2A 또는 그의 서브유닛중 하나를 고정하는 펩티드를 동정하는 단계를 포함한다.
상기 단계 (a)에서, 상이한 펩티드는 정해진 위치(스팟)에서 고형 지지체 상에 부착되며, 특이성 펩티드 서열 및 시리즈에 상응하는 각각의 위치는 2차원을 갖는 펩티드 네트웍(어레이)를 형성한다. 상기한 바와 같은 네트웍을 제조하는 상이한 방법은 참조 문헌(Figeys 및 Pinto, 2001 Electrophoresis 22: 208-216; Walter 등, 2000 Curr Opin Microbiol 3: 298-302)에 기술되어 있다. 이들 방법 모두는 일 반적으로 지지체 상에 펩티드를 공유적으로 고정시키는 것, 구체적으로 화학 링커를 이용하여 고정시키는 것을 포함한다. 예로서, 당업자는 셀룰로스막상의 20 개 이하의 잔기를 포함하는 펩티드를 직접 합성하는 것으로 이루어진 "스팟 합성" 기법을 참조할 수 있다. (Frank 및 Overwing, Methods in Molecular Biology, 1996, vol. 66: 149-169, Epitope Mapping Protocols - 미국 뉴저지 토토와에 소재하는 G.E. Morris Humana Press Inc.에서 출판).
일반적으로, 부착된 펩티드 및 특정의 화합물간의 특이적 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있는 고상 지지체상에 부착된 펩티드의 어레이를 산출할 수 있다면 어떠한 방법도 사용될 수 있다.
일련의 부착된 펩티드 서열은, 서열이 유래하는 바이러스, 기생충 또는 세포성 단백질의 완전 서열을 포함하는 것이 매우 바람직하다. 그래서, 이러한 방법은 소정의 단백질의 완전 서열을 단일의 단계로 테스트할 수 있으며, 이는 일반적으로 중첩된 서열을 갖는 유한수의 펩티드로 구획된다.
바람직한 구체예에서, 스팟 형태로 부착된 펩티드는 크기가 20 개 미만의 아미노산, 바람직하게는 크기가 15 개 미만의 아미노산이 될 수 있다.
특정의 구체예에서, 펩티드는 셀룰로스막에 부착된다.
얻은 어레이는 단백질 포스파타제 2A 홀로효소 또는 이의 서브유닛중 하나와 단계 b)에서 접촉된다.
용어 "단백질 포스파타제 2A 홀로효소"라는 것은 단백질 포스파타제 2A의 2 개의 서브유닛 (A) 및 (C) 및 필요할 경우 서브유닛 (B)을 정제한 후 정확하게 재 구성되거나 또는 세포성의 임의의 정제된 이량체 (AC) 또는 이종삼량체 (ABC) 복합체를 의미한다. 단백질 포스파타제 2A는 포유동물로부터 유래하는 것이 바람직하다.
지지체는 예를 들면 정제된 단백질 포스파타제 또는 이의 정제된 서브유닛중 하나를 포함하는 완충액중에서 항온처리된다. 적절한 완충액은 5%의 탈지유 및 3%의 BSA를 포함하는 TBS (TRIS BORATE)이다.
단백질 포스파타제 2A 홀로효소가 결합되는 펩티드는 일반적으로 단백질 포스파타제를 직접 또는 간접 표지하고 그리고, 표지된 단백질이 결합되는 스팟을 식별함으로써 일반적으로 구별된다. PP2A 또는 이의 서브유닛중 하나가 펩티드 스팟중 하나에 결합되는 것은, 특히 서브유닛 (A) 또는 (B) 또는 (C)에 대한 항체 또는, PP2A의 서브유닛 (A), (B) 또는 (C)에 대한 항체의 혼합물과 함께 펩티드 어레이를 포함하는 지지체를 항온처리한 후, 웨스턴 블롯 또는 고상 ELISA 테스트에 통상적으로 사용되는 기법을 이용한 항혈청을 사용하여 판별될 수 있다.
본 발명의 방법은 크기가 30 개 미만의 아미노산 또는 심지어 20 개 미만의 아미노산으로 측정된 특정의 바이러스 또는 기생충 감염을 치료하는데 사용하기 위한 펩티드를 동정하는데 적용할 수 있으며, 이러한 펩티드는 단백질 포스파타제 2A 홀로효소 또는 이의 서브유닛중 하나를 시험관내에서 결합시킬 수 있다.
추가로, 펩티드 합성 분야의 통상의 지식을 사용하여, 당업자는 전술한 이로운 성질을 갖는, 본 발명의 방법에 의하여 동정된 펩티드의 단편으로부터 유도된 펩티드를 산출해낼 수 있을 것이다.
결론적으로, 본 발명은 30 개 미만의 아미노산, 바람직하게는 20 개 미만의 아미노산으로 측정된 천연 또는 합성 펩티드를 제공하는 것으로서, 시험관내에서 단백질 포스파타제 2A 홀로효소 또는 이의 서브유닛 (A), (B) 또는 (C)중 하나를 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 용어 "특이적으로 결합한다"라는 것은 펩티드가 바이러스 또는 기생충 기원의 단백질과 PP2A의 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 시험관 내에서 단백질 포스파타제 2A 또는 이의 서브유닛중 하나에 결합하는 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 세포성 단백질의 단편이거나 또는, 단백질 포스파타제 2A 또는 그의 서브유닛중 하나에 결합되는 특성이 보존됨에도 불구하고 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 상기 단백질 단편과 구별되는 서열인 것을 특징으로 한다. 초기 서열과 비교하여 뚜렷한 서열로부터 치환되거나 또는 결실된 아미노산의 갯수는 초기 서열을 구성하는 아미노산 갯수의 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만인 것이 바람직하다. 펩티드와 PP2A의 시험관내 결합이 치환되거나 또는 결실되는 것에 영향을 미치지 않는 결실을 갖는 아미노산이 바람직하다.
특히, 하나의 뚜렷한 서열은 이것이 유래하는 서열과 비교하여 단백질 포스파타제 2A 홀로효소 또는 이의 서브유닛중 하나에 대한 결합 친화력을 증가시키는 펩티드 서열이다. 전술한 바와 같은 추가의 뚜렷한 서열은 초기 동정된 펩티드 서열과 상동성을 갖는 펩티드 서열이다. 본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 "상동성 펩티드"는 초기에 동정된 펩티드 서열 이외의 종의 단백질로부터 유래한 서열을 의 미하며, 1차 서열은 BESTFIT 프로그램 (위스컨신 지네틱스 소프트웨어 팩키지, 지네틱스 컴퓨터 그룹, GCG)과 같은 통상의 최적의 정렬 프로그램을 사용하여 초기에 동정된 펩티드 서열과 정렬될 수 있다. 특히, BESTFIT 프로그램과 같은 최적의 정렬 프로그램을 사용하여 서열을 정렬한 후의 서열 A 및 B가 50% 이상의 동일성, 바람직하게는 75% 이상의 동일성을 갖는 경우, 서열 A는 서열 B와 상동성을 갖는 것으로 간주한다. 또한, 전체 서열에 대한 10%∼20%의 생존력을 나타낼 수 있는 수개의 잔기를 제외하고, 서열이 준-동일성인 경우 2 개의 서열은 상동성을 갖는 것으로 간주하는 것이 바람직하다. 또한, 동일한 화학 작용기를 갖는 아미노산 (예컨대 Arg 및 Lys)은 균등한 것으로 간주한다. PP2A 또는 이의 서브유닛중 하나와의 결합에 대하여 분석하고자 하는 펩티드는 일반적으로 생체내에서 또는 시험관내에서 단백질 포스파타제 2A와 상호작용하는 것으로 나타난 바이러스, 기생충 또는 세포성 단백질로부터 선택된다.
상기 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 세포성 단백질은 SV40 또는 폴리오마의 t 항원, 폴리오마의 중간 t 항원, PP2A의 B(B, B', B'')형 서브유닛, CK2α, CaMIV, p70S6-키나제, Pak1/Pak3, Tap42/알파 4, PTPA, Set/I1/I2-PP2A, E4orf4, tau, Vpr 또는 CD28, CCXR2(케모카인 수용체)로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 펩티드는 CD28 단백질의 단편, 특히 각각 FD2 및 FD3로 지칭된 펩티드에 해당하는 서열 PRRPGPTRKHY (서열 번호: 33) 및 (PRRPGPTRK)2 (서열 번호: 34)으로 구성된 펩티드이며, 세포내 투과 용량 및 세포 생존력에 대한 효과는 후술하는 실험 부문에서 설명한 바와 같다. 또한, 본 발명은 단백질 포스파타제 2A 또는 그의 서브유닛중 하나에 결합되는 성질이 보존됨에도 불구하고 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 상기 단백질과 구별되는 펩티드 서열에 관한 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 펩티드는 HIV 바이러스의 Vpr 단백질의 단편, 구체적으로 HIV-1 또는 HIV-2의 Vpr 단백질의 단편, 또는 2A형 단백질 포스파타제 또는 그의 서브유닛중 하나에 결합하는 특성이 보전됨에도 불구하고 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 상기 단백질 단편과 구별되는 서열이다. 본 발명은 하기 서열을 보유하는 Vpr 단백질의 단편인 상기 펩티드를 포함하지 않는다: EMBL 데이타베이스(승인 번호 P89821)에 개시된 LFIHFRIGCQHSRIGITRRRRVRDGSSRP* (서열 번호 44). 대조적으로, 후술하는 본 발명의 명세서에 기재된 펩티드의 이용은 본 발명의 범위내에 포함된다.
인용할 수 있는 프로타민으로부터 유래하는 2A형 단백질 포스파타제와 상호작용하는 단백질로부터 유래하는 펩티드의 특정 예는 서열 RRRRRRRSRGRRRRTY(서열 번호 41, FD8)의 펩티드 또는 2A형 단백질 포스파타제 또는 그의 서브유닛중 하나에 결합하는 특성이 보전됨에도 불구하고 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 서열 번호 41과 구별되는 서열의 펩티드이다.
바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 하기 서열중 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) VEALIRILQQLLFIHFRI(서열 번호 1)
(b) RHSRIGIIQQRRTRNG(서열 번호 2)
(c) 2A형 단백질 포스파타제 또는 그의 서브유닛중 하나와 관련된 특성이 보존됨에도 불구하고 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열과 구별되는 서열.
본 발명의 특히 바람직한 펩티드는 서열 번호 2의 펩티드의 단편인데, 상기 단편은 후술하는 실시예 부분에서 기술하는 세포내 투과능과 세포 생존력에 대한 효과를 보유하는 FD9라 칭하는 서열 RHSRIG(서열 번호 36)의 펩티드로 구성되거나, 상기 펩티드를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 프레임워크를 갖는 화합물에 관한 것인데, 상기 화합물의 분자량은 10 내지 150 kDa이고, 2A형 단백질 포스파타제에 결합할 수 있는 능력을 보유한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드가 반복되는 구성을 특징으로 하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
상기 폴리펩티드의 특정 예는 펩티드 RHSRIG 중합체 및 구체적으로 이량체 (RHSRIG)2(서열 번호 37) 또는 삼량체(RHSRIG)3(서열 번호 38)(이들은 각각 FD10 및 FD11이라 칭하며, 후술하는 실시예에 기술되는 바와 같이 세포내 투과능과 세포생존력에 대한 효과를 보유함)이다.
아미노산의 치환 또는 결실에 의해 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 구별되는 서열을 보유하며, 본 발명의 범위내에 포함되는 펩티드는 구체적으로 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 변이체에서 상동 서열에 상응하는, HIV-1, HIV-2 및 SIV의 상이한 변이체의 Vpr 단백질에 대한 서열중 하나에 포함되는 서열의 펩티드를 예로 들 수 있다.
특히 예로 들수 있는 펩티드는 PP2A의 서브유닛 A에 결합하는 것으로 확인된 도데카펩티드에 상응하는 VEALIRILQQLL(서열 번호 6), ALIRILQQLLFI(서열 번호 7), IRILQQLLFIHF(서열 번호 8), ILQQLLFIHFR(서열 번호 9), RHSRIGIIQQRR(서열 번호 10), SRIGIIQQRRTR(서열 번호 11), IGIIQQRRTRNG(서열 번호 12)이다.
아미노산의 치환 또는 결실에 의해 서열 번호 2와 구별되는 본 발명의 특정 서열은 서열 RHSRIGVTRQRRARNG(서열 번호 40)이며, 후술하는 실시예에 기술되는 바와 같이 FD13으로도 칭한다.
본 발명의 바람직한 펩티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열로부터 선택된 펩티드인데, 이들은 투여시 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것을 특징으로 한다.
종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 펩티드의 선별 방법은 예를 들어 후술하는 실시예 부분에 기술된 MTT 생존력 테스트를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예는 CK2α 단백질의 단편으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 펩티드를 제공한다. 구체적으로, 천연 또는 합성 펩티드는 기생충인 테일레리아 파르바의 CK2α단백질의 단편으로부터 유도된 것을 특징으로 한다.
더 바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 하기 서열중 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(a) RKIGRGKFSEVFEG(서열 번호 3);
(b) TVTKDCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL(서열 번호 4);
(c) KILRLIDWGLAEFTHP(서열 번호 5);
(d) 피. 팔시파럼(P. falciparum) 또는 레이쉬마니아(leishmania)로부터 유래하는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 상동 서열; 또는
(e) 2A형 단백질 포스파타제 또는 그의 서브유닛중 하나와 관련된 특성이 보존됨에도 불구하고 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 상기 서열과 구별되는 서열 및 특히 서열 TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL(서열 번호 43).
서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5와 구별되는 펩티드 중에서, 특히 위치 1의 서열 RKIGRGKFSEVFEG(서열 번호 3), 및 특히 서열 RKIGRGKFSEVF의 펩티드 및 서열 IGRGKFSEVFEG의 펩티드 또는 위치 2의 서열 (TVTKDCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL)(서열 번호 4), 구체적으로 하기 펩티드를 예로 들 수 있다:
TVTKDKCVIKIL(서열 번호 13),
TKDKCVIKILKP(서열 번호 14),
DKCVIKILKPVK(서열 번호 15),
CVIKILKPVKKK(서열 번호 16),
IKILKPVKKKKI(서열 번호 17),
ILKPVKKKKIKR(서열 번호 18),
KPVKKKKIKREI(서열 번호 19),
VKKKKIKREIKI(서열 번호 20),
KKKIKREIKILQ(서열 번호 21),
KIKREIKILQNL(서열 번호 22),
및 최종적으로 위치 3의 서열 KILRLIDWGLAEFTHP(서열 번호 5), 또는 서열 KILRLIDWGLAE(서열 번호 23)의 펩티드, 서열 LRLIDWGLAEFY(서열 번호 24)의 펩티드 또는 서열 LIDWGLAEFYHP(서열 번호 25)의 펩티드.
예를 들어, 피. 팔시파럼에서 CK2α 단백질의 위치 3으로부터 티. 파르바의 상동 서열을 포함하는 본 발명의 펩티드의 한 예는 펩티드 RQKRLI(서열 번호 42)이다. 또한, 본 발명은 펩티드 RQKRLI의 중합체, 특히 후술하는 실시예에서 FD7이라 칭하는 삼량체 (RQKRLI)3(서열 번호 35)를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 기생충 테일레리아 파르바의 CK2α 단백질에서 유래하는 펩티드에 관한 것인데, 이는 투여시 기생충 발생을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 τ(tau) 단백질에서 유래하는 것을 특징으로 한다. 상기 타우 서열은 E4orf4 아데노바이러스 단백질을 위한 결합 위치에 상응하는 모티프를 보유한다. 알츠하이머병의 경우, 타우 단백질은 2A형 단백질 포스파타제에 의해 조절된다. 따라서, 상기한 바와 같은 펩티드는 알츠하이머병의 치료에 유용할 것이다.
본 발명의 방법에 따라 동정된 펩티드는 몇몇 종양의 치료, 몇몇 바이러스 감염 또는 기생충 감염의 치료에 특히 유용하다. 당업자들은 결합 경쟁 테스트를 이용하여 본 발명의 방법에 따라 동정된 서열로부터 유래하는 신규한 펩티드를 선택할 수 있는데, 상기 펩티드는 그것이 유래하는 천연 단백질과 홀로효소 PP2A 또는 그의 서브유닛중 하나의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 정의한 바와 같은 천연 또는 합성 펩티드에 관한 것인데, 이는 상기 펩티드가 유래하는 천연 단백질과 홀로효소 PP2A 또는 그의 서브유닛중 하나와 상호작용을 경쟁적으로 억제하는 것을 특징으로 한다.
생체 내에서 몇몇 종양 또는 몇몇 바이러스 감염 또는 기생충 감염의 치료에 효과적이기 위해서, 본 발명의 펩티드는 진핵 세포 내로 상기한 바와 같은 펩티드를 전달할 수 있는 벡터에 커플링될 수 있어야 한다. 그러나, 후에 논의되는 바와 같이 본 발명의 펩티드는 그 자체로 세포내로 투과될 수 있기 때문에 결과적으로 벡터를 첨가할 필요가 없을 수 있다.
자연적으로 본 발명은 본 발명의 펩티드를 합성할 수 있는 수단에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 폴리뉴클레오티드에 관한 것인데, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 본 발명의 펩티드를 암호화하는 서열로 구성되는 것을 특징으로 한다. 바람직한 폴리뉴클레오티드는 하기 서열중 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드이다:
서열 번호 26
(5'GTGGAAGCCTTAATAAGAATTCTGCAACAACTGCTGTTTATTCATTTCAGAATT)
서열 번호 27
(5'CGACATAGCAGAATAGGCATTATTCAACAGAGGAGAACAAGAAATGGA)
서열 번호 28
(5'AGGAAGATCGGAAGAGGGAAGTTCAGTGAAGTTTTTGAGGGA)
서열 번호 29
(5'ACAGTAACGAAGGATAAATGCGTAATAAAAATCCTAAAGCCTGTAAAGAAGAAGAAAATCAAGAGAGAGATTAAGATTCTACAGAACCTA)
서열 번호 30
(5'AAAATACTAAGGCTAATTGACTGGGGATTAGCTGAGTTTTACCACCCA)
상기 서열 번호 26 내지 서열 번호 30은 각각 서열 번호 1 내지 서열 번호 5의 펩티드를 암호화한다.
또한, 본 발명은 상기 서열 번호 26 내지 30중 한 서열과 상보적인 서열 및 공지된 엄격한 조건 하에서 상기 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화하는 서열에 관한 것이다.
본원에 사용한 용어 "엄격한 조건"은 예를 들어, 6 x SSC, 0.5% SDS, 5X 덴하르트 용액 또는 등가의 이온 세기를 갖는 임의의 기타 용액 및 65℃에서 세척후, 예를 들어 최대 0.2 x SSC 및 0.1% SDS 또는 등가의 이온 세기를 갖는 임의의 기타 용액 내에서 약 65℃에서 2개의 단일 스트랜드 DNA 서열의 특정 하이브리드화가 가능한 조건을 의미한다. 엄격성 조건을 정의하는 매개변수는 쌍을 이룬 스트랜드의 50%가 분리되는 온도(Tm)에 의존한다. 30개 이상의 염기를 포함하는 서열에 있어서, Tm은 다음과 같은 관계식으로 정해진다: Tm = 81.5 + 0.41(%G+C) + 16.6log(음 이온의 농도) - 0.63(%포름아미드) - (600/염기의 수). 30개 미만의 염기를 포함하는 서열에 있어서, Tm은 다음과 같은 관계식으로 정해진다: Tm = 4(G+C) + 2(A+T). 또한, 염격성 조건은 문헌(Sambrook 등, Molecular Cloning: A laboratory Manual 3판, Cold Spring Harbor, laboratory prss, Cold Spring Harbor, NY)에 기술된 프로토콜을 이용하여 정할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 동정된 펩티드 모티프를 반복하여 포함하는 폴리펩티드를 합성하는 것이 유익할 수 있다. 결론적으로, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 다량체로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 반복하여 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 세포 발현 벡터에 관한 것인데, 이는 상기 정의한 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 세포 내에서 본 발명의 펩티드의 발현을 가능하게 하는 조절 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따라 정의된 바와 같은 펩티드의 제조 방법에 관한 것인데, 이 방법은 상기 정의한 바와 같은 세포 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양시키는 단계; 및 배양 배지로부터 상기 펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 항혈청 또는 면역혈청, 또는 정제된 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체에 관한 것인데, 상기한 바와 같은 항체 또는 항혈청 또는 면역혈청이 본 발명에 따른 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법으로 동정된 펩티드에 대해 특이적으로 유도된 항체가 얻어지는데, 예를 들어 본 발명의 펩티드를 주입하여 동물을 면역화한 후, 생성된 항체를 회수하는 과정을 통해 항체를 얻을 수 있다. 모노클로날 항체는 Kohler 및 Milstein(1975)의 문헌에 기술된 방법과 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라 얻을 수 있다.
2A형 단백질 포스파타제의 표적에 대해 특이적으로 유도된 항체는 구체적으로, 면역요법에서 적용되는 것들이다. 이는, 예를 들어, 바이러스 또는 기생충의 발생을 차단하기 위해 2A형 단백질 포스파타제에 대해 유도된 바이러스 또는 기생충 단백질의 길항물질로 작용할 수 있다.
마찬가지로, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 필요에 따라 생체 내에서 상응하는 펩티드의 발현을 가능하게 하는 적합한 벡터를 사용하여표적 세포의 핵으로 직접 전달될 수 있는데, 상기한 바와 같은 펩티드는 2A형 단백질 포스파타제와 펩티드가 유래하는 바이러스 단백질 또는 기생충 단백질의 특이적인 상호작용의 경쟁적 억제를 통해 쉽게 차단된다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명에 따른 항체로부터 선택된 성분을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드와 함께 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 바이러스 감염 또는 기생충 감염을 치료하는 약제의 제조에 사용하기 위한 상기한 바와 같은 본 발명의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 HIV의 감염을 억제하는 약제의 제조에 사용하기 위한, 서열이 상기한 바와 같은 Vpr 단백질의 단편에서 유래하는 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 펩티드는 세포성 단백질 프로테아제 2A의 활성화와 관련된 아폽토시스의 유도를 자극하기 위해 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 표적 세포의 아폽토시스, 구체적으로 종양 세포의 아폽토시스를 유도하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 상기한 바와 같은 본 발명의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 관점은 기생충 감염을 억제하기 위한 약제의 제조에서 서열이 CK2α 단백질의 단편에서 유래하는 펩티드의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 말라리아의 치료에 유용한 약제의 제조에 사용하기 위한 펩티드의 용도에 관한 것이다.
바이러스 감염 또는 기생충 감염은 본 발명의 펩티드의 서열을 포함하는 단백질을 특이적으로 발현시킨다. 본 발명의 펩티드를 암호화하는 서열은 환자의 생물학적 샘플로부터 추출한 RNA로부터 특이적인 방식으로 특이적인 바이러스 감염 또는 기생충 감염을 검출하기 위한 프로브로 사용할 수 있다.
마찬가지로, 본 발명에 따른 항체는 감염시 발현된 바이러스 단백질 또는 기생충 단백질에 함유된 펩티드 서열을 특이적으로 회수하기 위해 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 기생충 또는 바이러스 병리학의 시험관내 진단에 사용하기 위한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 세포내로 투과할 수 있으며, 2A형 단백질 포스파타제에 결 합하는 펩티드의 선별 및 용도에 관한 것이다.
상기 펩티드의 예로는 티. 파르바의 CK2α 단백질에서 유래하는 펩티드 FD6(서열 번호 20)을 들 수 있다. 실제로 확인된 바와 같이, 세포내에 본 발명의 펩티드의 존재는 배양된 세포의 생존력에 영향을 미치지 않았으며, 세포가 생존 상태로 유지되는 데에도 영향을 미치지 않았다.
후술하는 실시예 부분에서는 본 발명의 펩티드의 동정 방법의 적용을 예시하는데, HIV-1의 Vpr 단백질 및 기생충 테일레리아 파르바의 CK2α 단백질로부터 펩티드의 동정을 예시한다. 또한, 본 발명은 실질적으로 세포내로 투과할 수 있으며, 2A형 단백질 포스파타제에 결합하는 펩티드의 선별 및 용도에 관한 것인데, 상기한 바와 같은 펩티드는 표적이 2A형 단백질 포스파타제의 활성을 조절할 수 있는 분자가 내세포성 2A형 단백질 포스파타제 분자를 표적화하고 이와 접촉하는 것이 가능하도록 해준다.
본 발명의 펩티드는 크기가 30 아미노산 미만의 아미노산이며, 이들 펩티드는 2A형 단백질 포스파타제 홀로효소 또는 그의 서브유닛중 하나에 특이적으로 결합하는 특징을 가지므로, 바이러스 감염 또는 기생충 감염의 치료, 또는 종양의 치료에 유용한 효과가 있다.
[실시예]
A. 재료 및 방법
A.1. 정제된 PP2A 단백질
삼량체 PP2A1 단백질을 돼지 뇌로부터 균질하게 정제하였다,
PP2A의 재조합 구조 서브유닛을 이. 콜라이에서 발현시켜서 Cohen 등의 프로토콜(Cohen P, Alemany S, Hemmings B A, Resink T J, Stralfors P, Tung H Y. Protein phosphatase-1 and protein phosphatase 2A from rabbit skeletal muscle. Methods Enzymol 1988 159, 390-408), 또는 Bosch 등의 프로토콜(Bosch M, Cayla X, Van Hoof C, Hemmings B A, Ozon R, Merlevede W, Goris J. the PR55 and PR65 subunits of protein phosphatase 2A from Xenopus laevis. Molecular cloning and developmental regulation of expression. Eur J Biochem 1995, 230, 1037-45)을 이용하여 정제하였다.
A.2. PP2A와의 HIV Vpr 결합 부위 및 PP2A와의 타일레리아 파르바(티 파르 바) CK2α의 결합 부위를 확인하는 방법
CK2α단백질(티. 파르바 기생충에 의해 암호화됨) 또는 Vpr 단백질(HIV-1 바이러스에 의해 암호화됨) 유래 펩티드 중 PP2A와 결합하는 펩티드를 전술한 "스팟 펩티드" 기법(Frank and Overwing, 1996, Meth Mol Biol 66, 149-169)을 이용하여 확인하였다.
이 방법은 일련의 서열이 당해 단백질(Vpr 또는 CK2α)의 전체 서열을 포함하는 정해진 위치에서 셀룰로스 막 상에서 동일계로 도데카펩티드를 합성하는 단계를 포함하였다. 막 상의 두개의 연속 스팟의 펩티드는 두개의 아미노산에 의한 중첩과 일치한다.
HIV-1의 Vpr 단백질의 전체 서열을 포함하는 68개의 도데카펩티드 및 타일레리아의 CK2α단백질에 대한 서열을 포함하는 205개의 도데카펩티드를 합성하여 셀룰로스 막에 공유결합시켰다.
제조된 각 막을 먼저 5% 탈지유 및 3% BSA를 함유하는 TBS를 사용하여 상온에서 1 시간 동안 포화시킨 다음, 정제 단백질(PP2A의 서브유닛 A 또는 홀로효소 PP2A1) 4 ㎍/㎖ 존재 하에 동일 완충액 중에서 밤새 항온처리하였다. 구조 단백질 A(도 1A 및 2A)에 대해 유도된 항체 및 PP2A의 단백질 A, B 및 C를 인식하는 항체의 혼합물(도 1B 및 2B)과 막을 항온처리한 후, 웨스턴 블롯에서와 같이, 정제된 각 단백질(각각 구조 서브유닛 A 또는 삼량체 홀로효소 PP2A1)과 펩티드 서열간의 특이적 상호작용이 나타났다.
막을 항온처리에 사용되는 통상의 TBST 완충액(TBS + TWEEN)으로 15분간 5회 세척한 후, 2차 항체(퍼옥시다제에 결합된 것)와 상온에서 1 시간 더 항온처리하였다. 마지막으로 막을 TBST 완충액으로 15분간 5회 세척하자 반응이 나타났다.
A.3. 세포 투과 테스트
1-세포
본 발명자들은 인간 자궁경부암에서 유래된 Hela 세포주를 분석하였다.
2-내부화된 펩티드의 정량적 측정
용해 완충액
0.5% NP 40을 함유하는 0.1 M 트리스 완충액, pH 8
OPD 완충액
0.2 M 이염기 인산나트륨 25.7 ㎖ + 0.1 M 시트르산 24.3 ㎖ + 증류수 50 ㎖; pH 5.0으로 조정.
비오틴화 아비딘 펩티드 복합체
펩티드 4 몰을 아비딘-퍼옥시다제 1 몰과 상온에서 20분간 항온처리하였다.
- 다양한 펩티드의 Hela 세포로의 세포내 투과 분석
Hela 세포(100 ㎕ 중 104)를 2.5% 페니실린/암피실린 및 10% 소 태아 혈청 존재 하의 완전 DMEM 배지를 함유하는 96웰 플레이트(평평한 바닥)에 접종하였다. 37℃ CO2 오븐(5%)에서 밤새 항온처리한 후, 상이한 희석률의 복합체(비오틴화 아비딘 퍼옥시다제 펩티드)를 첨가하였다. 4 시간 동안 항온처리한 후 상청액을 흡출해 내고, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 트립신을 처리한 후 수거하여 PBS 중에서 세포의 수를 세었다. 세포수 측정 후 세포를 용해 완충액 300 ㎕에 첨가하였다.
- 퍼옥시다제 활성의 측정
용해 완충액 50 ㎕ 또는 세포 용해물 50 ㎕를 함유한 96웰 ELISA 플레이트에서 OPD 완충액 50 ㎕를 항온처리하였다(전체적으로 다양한 연속 희석을 실시하였다(1/2까지)). 반응을 드러내기 위해 OPD 용액 50 ㎕를 첨가하였다(암조건에서). 반응(약 10분)은 1 N HCl 100 ㎕를 첨가하여 중단시켰다.
- 결과 분석
퍼옥시다제 활성은 ELISA 판독기(620 nm의 기준 필터 사용)로 490 nm에서 판독하여 측정하고, 용해물 중의 퍼옥시다제의 양은 검량 곡선으로부터 계산한 다음 동일한 세포수(103 또는 104)에 대하여 외삽 추정하였다.
펩티드 분자 = (6 x 1023/펩티드의 분자량) x PO(ng) x 10-9
A.4. 세포 생존력 테스트
Hela 세포(100 ㎕ 중 104)를 2.5% 페니실린/암피실린 및 10% 소 태아 혈청 을 포함하는 완전 DMEM 배지를 함유하는 96웰 플레이트(평평한 바닥)에 접종하였다. 37℃ CO2 오븐(5%)에서 밤새 항온처리한 후, 세포를 상이한 농도의 펩티드 존재 하에 배양하였다. 72 시간 동안 항온처리한 후 펩티드를 함유하는 배지를 흡출해 내고, 0.5 mg/㎖의 MTT(DMEM으로만 희석시킴)를 웰당 100 ㎕의 양으로 첨가하였다. 37℃에서 암조건으로 30분간 항온처리를 수행한 후 MTT를 흡출해내고 DMSO 50 ㎕를 모든 웰에 첨가하였다. 세포를 완전히 용해시키기 위해서는 10분의 시간이 소요되었으며, 웰 내의 반응 생성물의 용해를 균질화하기 위해서는 용해물 웰을 진탕시킬 필요가 있었다. 그 후 690 nm 기준 필터를 사용하여 570 nm에서 플레이트를 판독하였다.
B. 결과 및 고찰
B.1. 2종의 병원성 물질(HIV-1 및 티 파르바)에 의해 암호화되는 단백질에 대한 PPA2(PP2A1 및 서브유닛 A)와의 결합 부위를 포함하는 펩티드 서열의 확인
HIV-1의 Vpr 및 티 파르바의 CK2α에 대한 서열을 포함하는 펩티드를 함유하는 막과 정제된 삼량체 PP2A 홀로효소를 항온처리한 후 얻은 결과에 의해, Vpr 및 CK2α 펩티드의 5가지 서열이 PP2A에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인하였으며, 그 결과는 하기 표에 나타내었다.
| 서브유닛 A | PP2A1 | ||
| HIV-1 Vpr | 위치 1 | RHSRIGIIQQRRTRNG | RHSRIGIIQQRRTRNG |
| 위치 2 | VEALIRILQQLLFIHFRI | ||
| T.parva Ck2α | 위치 1 | RKIGRGKFSEVFEG | |
| 위치 2 | TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL | ||
| 위치 3 | KILRLIDWGLAEFYHP | KILRLIDWGLAEFYHP | |
더 명확히 설명하면, 단백질 PP2A1(도 1B, "위치 1") 및 서브유닛 A(도 1A, "위치 1" 및 "위치 2")와의 HIV-1의 Vpr에 대한 결합 부위를 포함하는 두개의 펩티드 서열이 확인되었다. 단백질 PP2A1(도 2B, "위치 3") 및 구조 서브유닛 A와의 티 파르바의 CK2α에 대한 결합 부위를 포함하는 3개의 펩티드 서열 역시 확인되었다(도 2A, "위치 1", "위치 2" 및 "위치 3").
B.2. PP2A에 결합하는 HIV-1 Vpr 펩티드를 사용하는 것의 중요성
HIV-1의 Vpr의 프로바이럴 감염으로 인한 외인성 발현은 Hela 세포, T 림프계 세포주 및 1차 림프구에서 아폽토시스를 유도한다(Stewart 등, 1997 J Virol 71: 5579-9). Vpr 돌연변이체의 사용에 의해 먼저, 이러한 효과를 세포 주기의 G2단계에서의 세포의 휴지와 서로 연관시킬 수 있었다. 보다 최근에는 Vpr이 G2 단계에서의 휴지와는 별도로 아폽토시스를 유도할 수도 있음이 확인되었다(Nishizawa 등, 2000, Virology 27, 16-26).
E4orf4 아데노바이러스 단백질과의 상호작용 후의 PP2A의 활성화는 형질전환된 세포에서 아폽토시스를 유도한다는 것이 보고되었다(Shtrichman R 등, 2000, Oncogene 19, 3757-3765). 이와 유사하게, Vpr의 발현 역시 형질전환된 세포에서 아폽도시스를 유도한다(Stewart 등, 1999, PNAS, 96, 12039-12043).
또한, 당해 기술분야에 공지된 Vpr 돌연변이체의 분석 결과는, 본 발명의 방법에 의해 확인된 것으로 PP2A에 특이적으로 결합하는 펩티드가 Vpr의 아폽토시스 사전 효과에 필요한 요건과 서로 관련이 있는 서열을 포함한다는 것을 암시한다.
따라서, PP2A와 상호작용하며 본 발명의 방법에 의해 확인된 바이러스 단백질 Vpr 및 E4orf4의 단편은 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
확인된 펩티드는 본질적으로 HIV 또는 기타 관련 바이러스 및 레트로바이러스에 의한 감염을 억제하는 데에도 사용된다.
B.3. PP2A에 결합하는 티 파르바 CK2α서열을 사용하는 것의 중요성
오카다산 및 SV40의 소형 t 항원의 사용에 의해 PP2A가 PI3-키나제인 PKCξ(MAP-키나제-키나제-키나제 또는 MEKK로서 확인됨), MEK 단백질 및 2종의 MAP 키나제 ERK-1 및 ERK-2, 및 전사 인자 NF-κB 및 Sp1을 이용하는 신규 인산화 캐스캐이드를 통해 세포 증식을 억제한다는 것이 입증되었다(Sontag E, Sontag J M, Garcia A (1997), EMBO J, 16, 5662-5671; Ayllon V, Martinez A, C, Garcia A, Cayla X and Rebollo A (2000), EMBO J 19, 1-10, A Garcia, S Cereghini, E Sontag (2000), J Biol Chem 275, 9385-9389). 또한, MAP 키나제의 캐스캐이드를 조절하는 데 있어서의 PP2A의 역할은 Chambaz의 연구진에 의한 연구(Heriche 등, (1997), Science, 276, 952-955)에 의해 제시된 적도 있었는데, 이들의 연구는 세포 CK2α서브유닛의 과발현이 MEK 단백질을 탈인산화시키는 PP2A를 활성화시킨다는 것을 보여주었다.
Ole-Moi 등의 연구(Embo J, 1993, 12, 1621-1631)에서는 타일레리아에 의한 형질전환이 숙주 단백질의 과인산화를 유도한다는 것을 보여주었다. 이러한 효과는 기생충에 의해 암호화되며 형질전환된 세포의 사이토졸로 분비되는 CK2α유형 서브유닛의 작용에 의존하는 세포 CK2의 구성적 활성화에 부분적으로 기인한다.
아래에 나타낸 바와 같이, PP2A와의 3개의 결합 부위에 해당하는 본 발명의 방법에 의해 확인된 서열을 서로 비교해 보면 K-I-G/L-R/K 유형의 모티프가 존재하며, 이것은 위치 2에서 부분적으로 반복된다는 것이 확인된다.
CK2α의 ATP에 대한 결합 부위가 부분적으로 위치 1 및 위치 2를 포함한다는 것에 주목할 필요가 있으며, 이것은 CK2α와 서브유닛 A의 상호작용 후 키나제 활성이 억제된다는 것을 시사한다. 또한, 하기 표 2로부터 알 수 있듯이, PP2A와의 티 파르바의 CK2α에 대한 결합 부위를 포함하는 3개의 서열은 피. 팔시파럼(P. Falciparum) 및 레이쉬마니아(Leishimania) 기생충을 비롯한 다수의 종에서 보존되어 있다.
 |
상호작용의 면밀한 분석 결과는 이러한 상이한 종들에서 유래된 CK2α가 PP2A와 상호작용한다는 것을 시사한다. 한 예로서, 도 2에 도시되어 있으며 위치 3의 처음 4개 아미노산이 결실된 티 파르바 CK2α 유래의 펩티드 131은 PP2A에 결합할 수 있다. 이것은 처음 3개의 아미노산이 서로 다른 레이쉬마니아, 피. 팔시파럼의 CK2α가 PP2A에 결합한다는 것을 시사한다. 이는 KILRLI 모티프가 K/R-II/L-I/L의 중복을 포함하며, 이것은 기본적으로 PP2A에 대한 결합 부위가 될 수 있다는 사실과 일치한다.
따라서, 생체내 단백질의 PP2A 결합 부위에 해당하는 이들 펩티드가 세포 내부에 존재하게 되면 그러한 기생충들의 성장을 방해할 수 있다.
B.4. 본 발명의 펩티드 화합물이 세포에 미치는 생물학적 효과
표 3에 기재된 다양한 펩티드는 비오틴화 형태로 합성하여 HPLC(Neosystem)로 정제하였고, 이들이 세포내 투과 및 세포 생존력에 미치는 효과는 Hela 세포에서 분석하였다. 표 1에 기재된 일련의 펩티드의 사용한 실험에 의해 6개의 펩티드가 Hela 세포로 투과할 가능성이 있음을 확인하였다(도 3).
ㆍFD6: PP2A의 A 서브유닛과 티.파르바 CK2α단백질의 상호작용을 위 한 부위에서 유래된 12 AA 펩티드;
ㆍFD7: 6 AA 헥사 모티프의 3개 반복체에 해당하는 18 AA 펩티드; 이 서열은 피.팔시파럼 CK2α에서 유래된 것으로 PP2A에 결합하는 티 파르바 서열과 상동성이다;
ㆍFD8: 프로타민 유래의 펩티드(공지된 PP2A 활성화제);
ㆍFD11: FD14에 대한 서열 유래의 6 AA 헥사 모티프의 3개 반복체에 해당하는 18 AA 펩티드;
ㆍFD14: FD14는 HIV-1 Vpr로부터 규명한 것으로 PP2A와의 결합 부위를 복제한다;
ㆍFD13: 이 펩티드는 FD14 펩티드 서열과 상동성인 HIV-1 Vpr 서열에 해 당한다. 이것은 또다른 HIV-1 Vpr과 PP2A의 결합 부위를 나타낸다.
또한, 상기 표 1에 기재된 일련의 펩티드에 대하여 수행한 생존력 실험에 의해 3가지 펩티드가 Hela 세포의 생존을 억제한다는 것이 확인되었다.
ㆍFD8: Hela 세포의 생존력에 영향을 미친다(도 4A);
ㆍFD14: Hela 세포의 생존력에 분명히 영향을 미친다(도 4B);
ㆍFD12: FD11 펩티드의 것에서 유래된 서열로서 18 AA 펩티드(R이 A로 변이됨). 이 펩티드는 클라미디아 뮤리다럼(Chlamydia muridarum)의 글루코사민 트랜스퍼라제 단백질과 상동성이며, Hela 세포의 생존력에 영향을 미친다(도 4C). 이러한 생물학적 효과는 플라즈마 막과의 상호작용에 의한 것일 수 있다.
| 펩티드 기원 | 펩티드 코드 | 펩티드 서열 | 서열 번호 |
| CD28 | FD2 | - PRRPGPTRKHY | 서열 번호 33 |
| FD3 | - (PRRPGPTRK)2 | 서열 번호 34 | |
| CK2α 티.파르바 | FD6 | - VKKKKIKREIKI | 서열 번호 20 |
| CK2α 피. 팔시파럼(티. 파르바의 유사체) | FD7 | - (RQKRLI)3 | 서열 번호 35 |
| Vpr(HIV-1) | FD9 | - RHSRIG | 서열 번호 36 |
| FD10 | - (RHSRIG)2 | 서열 번호 37 | |
| FD11 | - (RHSRIG)3 | 서열 번호 38 | |
| FD12* | - (AHSRIG)3 (FD11 돌연변이 R...A) | 서열 번호 39 | |
| FD13 | RHSRIGVTRQRRARNG (FD14 유사체) | 서열 번호 40 | |
| FD14 | RHSRIGIIQQRRTRNG | 서열 번호 2 | |
| 프로타민 | FD8 | RRRRRRRRSRGRRRRTY | 서열 번호 41 |
논의
PPA2와 상호작용하는 특정 단백질로부터 유래한 펩티드가 신규한 항종양제인가?
본 연구를 통해 PPA2와 상호작용하는 것으로 공지된 2개의 단백질, 즉 Vpr 및 프로타민으로부터 유래하는 2개의 투과성 펩티드를 동정하는 것이 가능하였다. 공통적으로 아르기닌 및 라이신이 풍부한 이들 펩티드는 일반적인 내재화 메카니즘을 이용하여 세포내로 투과될 수 있다. 아르기닌이 풍부한 서열을 보유하는 펩티드를 내재화시키는 이러한 메카니즘은 최근에 보고되었다(Tomoki Suzuki 등(2002), Possible Existence of Common Internalization Mechanism among Arginine-rich Peptides JBC 277: 2437-2443). 일반적으로, 아르기닌 또는 라이신이 풍부한 서열의 존재는 PP2A를 결합하는 단백질의 특징인데, 이는 다른 투과성 펩티드가 PP2A 패밀리에서 동정될 수 있음을 암시하는 것이다.
HIV-1 바이러스에 의해 암호화된 Vpr 단백질은 높은 바이러스 차지를 유지하고, HIV와 관련된 병인론을 확립하는데 연루되어 있다. 외인성 Vpr의 발현 또는 프로바이러스 HIV-1 감염에 기인한 Vpr의 발현은 Hela 세포, T 림프구 계통, 일차 림프구 및 형질전환된 세포에서 아폽토시스를 유도한다(Stewart 등, J. Virol 1997; 71: 5579-9; Stewart 등, 1999, PNAS, 96, 12039-12043). 또한, PP2A와 추가의 바이러스 단백질인 아데노바이러스 E4orf4와의 상호작용(Marcellus 등, J. Virol. 2000 74: 7869-7877)이 종양 세포에 아폽토시스를 유도할 수 있는 것으로 보고되었다. 전체적으로, 이들 결과는 특정 PP2A의 활성화가 종양의 아폽토시스를 유도하는 신규한 수단임을 암시하고 있다. 이러한 관점에서, 도 4B에 나타낸 본 발명자들의 결과로부터 HIV-1 Vpr로부터 유래하는 FD14 펩티드가 항종양 생펩티드임을 암시하는 것임을 확인할 수 있다. FD13 펩티드(FD14와 비교시 4 AA가 상이한 서열을 가짐-참조 표 2)의 생물학적 효과의 부재는 FD14의 구조가 Hela 세포 생존력을 조절하는 데 결정적인 역할을 수행하는 것을 암시한다. 결론적으로, FD14 펩티드의 구조를 모방하는 화학 분자의 생성은 신규한 항종양 물질의 생성을 가능하게 할 수 있다.
도 1: PP2A(A) 및 홀로효소 PP2A1(B)의 구조적 서브유닛 A를 이용하는 HIV-1의 Vpr의 서열을 커버하는 펩티드를 함유하는 막의 스크리닝
4개의 펩티드 54-57 서열의 커버는 위치 2 VEALIRILQQLLFIHFRI(서열 번호 1)의 서열을 한정한다.
펩티드 54: VEALIRILQQLL (서열 번호 6)
펩티드 55: ALIRILQQLLFI (서열 번호 7)
펩티드 56: IRILQQLLFIHF (서열 번호 8)
펩티드 57: ILQQLLFIHFRI (서열 번호 9)
3개의 펩티드 64-66 서열의 커버는 위치 1 RHSRIGIIQQRRTRNG(서열 번호 2)의 서열을 한정한다.
펩티드 64: RHSRIGIIQQRR (서열 번호 10)
펩티드 65: SRIGIIQQRRTR (서열 번호 11)
펩티드 66: IGIIQQRRTRNG (서열 번호 12)
도 2: PP2A(A) 및 홀로효소 PP2A1(B)의 구조적 서브유닛 A를 이용하는 테일레리아의 CK2α의 서열을 커버하는 펩티드를 함유하는 막의 스크리닝
2개의 펩티드 서열의 커버는 위치 1 RKIGRGKFSEVFEG(서열 번호 3)의 서열을 한정한다.
펩티드 66: RKIGRGKFSEVF (서열 번호 31)
펩티드 67: IGRGKFSEVFEG (서열 번호 32)
10개의 펩티드 74-83 서열의 커버는 위치 2 TVTKDCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL(서열 번호 4)의 서열을 한정한다.
펩티드 74: TVTKDKCVIKIL (서열 번호 13)
펩티드 75: TKDKCVIKILKP (서열 번호 14)
펩티드 76: DKCVIKILKPVK (서열 번호 15)
펩티드 77: CVIKILKPVKKK (서열 번호 16)
펩티드 78: IKILKPVKKKKI (서열 번호 17)
펩티드 79: ILKPVKKKKIKR (서열 번호 18)
펩티드 80: KPVKKKKIKREI (서열 번호 19)
펩티드 81: VKKKKIKREIKI (서열 번호 20)
펩티드 82: KKKIKREIKILQ (서열 번호 21)
펩티드 83: KIKREIKILQNL (서열 번호 22)
3개 펩티드 서열의 커버는 위치 3 KILRLIDWGLAEFTHP(서열 번호 5)의 서열을 한정한다.
펩티드 129: KILRLIDWGLAE (서열 번호 23)
펩티드 130: LRLIDWGLAEFY (서열 번호 24)
펩티드 131: LIDWGLAEFYHP (서열 번호 25)
도 3: 표 3에 나타낸 펩티드에 대한 세포 투과 테스트를 이용하여 얻은 세포내 투과값을 나타내는 막대그래프.
도 4: MTT 생존력 테스트를 이용하여 평가된 Hela 세포의 생존력에 대한 상 이한 펩티드의 효과를 나타내는 도면.
Hela 세포의 생존력(초기 군집에 대한 백분율로 나타냄)은 펩티드 FD8(4A), FD13/FD14(4B) 및 FD11/FD12(4C)의 농도를 증가시키면서 테스트하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> INSTITUT PASTEUR
INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
<120> PEPTIDES SYNTHETIQUES OU NATURELS LIANT LA PROTEINE
PHOSPHATASE 2A, METHODE D'IDENTIFICATION ET UTILISATIONS
<130> B4894A PCT
<140> PCT/FR 02/02705
<141> 2002-07-26
<150> FR 0110139
<151> 2001-07-27
<160> 44
<170> PatentIn version 3.1
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<211> 18
<212> PRT
<213> virus HIV
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1 5 10 15
Leu Ile
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> Theileria parva
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1 5
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<212> PRT
<213> Theileria parva
<400> 37
Arg His Ser Arg Ile Gly Arg His Ser Arg Ile Gly
1 5 10
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<211> 18
<212> PRT
<213> Theileria parva
<400> 38
Arg His Ser Arg Ile Gly Arg His Ser Arg Ile Gly Arg His Ser Arg
1 5 10 15
Ile Gly
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<211> 18
<212> PRT
<213> Theileria parva
<400> 39
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1 5 10 15
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Leu Phe Ile His Phe Arg Ile Gly Cys Gln His Ser Arg Ile Gly Ile
1 5 10 15
Thr Arg Arg Arg Arg Val Arg Asp Gly Ser Ser Arg Pro
20 25
Claims (40)
- 시험관 내에서 2A형 단백질 포스파타제 홀로효소(holoenzyme) 또는 이의 서브유닛중 하나와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 크기가 30개 미만, 바람직하게는 20개 미만의 아미노산인 펩티드.
- 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 시험관 내에서 2A형 단백질 포스파타제에 결합하는 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 세포성 단백질의 단편 또는 2A형 단백질 포스파타제 또는 그의 서브유닛중 하나에 결합하는 특성이 보존됨에도 불구하고 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 상기 단백질 단편과 구별되는 서열인 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제2항에 있어서, 상기 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 세포성 단백질이 하기 단백질중 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드: SV40 또는 폴리오마의 t 항원, 폴리오마의 중간 t 항원, PP2A의 B형(B, B', B'') 서브유닛, CXCR2(케모카인 수용체), CK2α, CaMIV, p70S6-키나제, Pak1/Pak3, Tap42/알파 4, PTPA, Set/I1/I2-PP2A, E4orf4, tau, CD28 또는 Vpr.
- 제3항에 있어서, 상기 펩티드가 하기 펩티드 서열중 하나로부터 선택되는 CD28 단백질의 단편인 것을 특징으로 하는 펩티드:(a) PRRPGPTRKHY(서열 번호 33) 또는(b) 2A형 단백질 포스파타제 또는 그의 서브유닛 중 하나에 결합하는 특성이 보존됨에도 불구하고 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 상기 (a)의 서열과 구별되는 서열.
- 제3항에 있어서, 상기 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 세포성 단백질이 HIV 바이러스의 Vpr 단백질인 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제5항에 있어서, 상기 Vpr 단백질이 HIV-1 또는 HIV-2 바이러스로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제6항에 있어서, 상기 펩티드가 하기 펩티드 서열중 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드:(a) RRRRRRRSRGRRRRTY(서열 번호 41) 또는(b) 2A형 단백질 포스파타제 또는 그의 서브유닛중 하나에 결합하는 특성이 보존됨에도 불구하고 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 상기 (a)의 서열과 구별되는 서열.
- 제6항에 있어서, 상기 펩티드가 하기 서열중 하나에 포함되는 것을 특징으로 하는 펩티드:(a) VEALIRILQQLLFIHFRI(서열 번호 1),(b) RHSRIGIIQQRRTRNG(서열 번호 2) 또는2A형 단백질 포스파타제 또는 그의 서브유닛중 하나에 결합하는 특성이 보존됨에도 불구하고 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열과 구별되는 서열.
- 제8항에 있어서, 상기 펩티드가 서열 RHSRIGVTRQRRARNG(서열 번호 40)인 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제8항에 있어서, 상기 펩티드가 서열 RHSRIG(서열 번호 36)로 구성되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 투여시 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제3항에 있어서, 상기 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 세포성 단백질이 CK2α단백질인 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제12항에 있어서, 상기 CK2α단백질이 기생충인 테일레리아 파르바 (Theileria parva)로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 투여시 기생충의 발생을 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제12항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 하기 서열중 하나에 포함되는 것을 특징으로 하는 펩티드:(a) RKIGRGKFSEVFEG(서열 번호 3)(b) TVTKDCVIKILKFPVKKKKIKREIKILQNL(서열 번호 4)(c) KILRLIDWGLAEFYHP(서열 번호 5) 또는(d) 피. 팔시파럼(P. falciparum) 또는 레이쉬마니아(leishmania)로부터 유래하는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 상동 서열; 또는2A형 단백질 포스파타제 또는 그의 서브유닛중 하나에 결합하는 특성이 보존됨에도 불구하고 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 상기 서열과 구별되는 서열, 특히 서열 TVTKDKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNL(서열 번호 43).
- 제15항에 있어서, 상기 펩티드가 펩티드 RQKRLI(서열 번호 42)인 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제1항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 상기 펩티드가 유래하는 천연 단백질과 PP2A 홀로효소 또는 그의 서브유닛 중 하나와의 상호작용을 경쟁적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제1항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 상기 펩티드를 진핵 세포 내로 전달할 수 있는 벡터와 커플링된 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제1항 내지 제13항중 어느 한 항의 펩티드의 반복으로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제19항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 하기 서열중 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:(a) (RHSRIG)2(서열 번호 37)(b) (RHSRIG)3(서열 번호 38) 또는(C) (RQKRLI)3(서열 번호 35).
- 제1항 내지 제20항중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 서열이 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29 또는 서열 번호 30중 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제21항 또는 제22항의 폴리뉴클레오티드의 다량체로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제21항 내지 제23항중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및 숙주 세포에서 제1항 내지 제20항중 어느 한 항의 펩티드의 발현을 가능하게 하는 조절 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 발현 벡터.
- 제1항 내지 제20항중 어느 한 항의 임의의 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 정제된 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체.
- 제1항 내지 제20항중 어느 한 항의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제21항 내지 제23항중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제24항의 발현 벡터 또는 제25항의 항체로 구성되는 군으로부터 선택된 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 하기 서열중 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드:서열 번호 38,서열 번호 40 및서열 번호 41.
- 서열 번호 20을 보유하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 바이러스 감염 또는 기생충 감염을 치료하는 약제의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제20항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드의 용도.
- HIV에 의한 감염을 억제할 수 있는 약제의 제조에 사용하기 위한, 제5항 내지 제10항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드의 용도.
- 표적 세포, 구체적으로 종양 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있는 약제의 제조에 사용하기 위한, 제5항 내지 제20항 또는 제28항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 펩티드의 용도.
- 기생충 감염을 억제시킬 수 있는 약제의 제조에 사용하기 위한, 제12항 내지 제16항중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 펩티드의 용도.
- 말라리아를 치료하는 약제의 제조에 사용하기 위한, 제12항 내지 제16항중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드의 용도.
- 기생충 또는 바이러스성 질환의 시험관내 진단에서, 제21항 내지 제23항중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제25항의 항체의 용도.
- 2A형 단백질 포스파타제 홀로효소 또는 그의 서브유닛중 하나에 특이적으로 결합하며, 서열이 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 세포성 단백질에서 유래하는 펩티드의 동정 방법으로서, 이 방법은(a) 지지체 상에 서열이 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 세포성 단백질에서 유래하는 펩티드를 스팟의 형태로 부착시키는 단계로서, 각각의 스팟이 정해진 서열의 펩티드 부착물에 상응하는 것인 단계;(b) 지지체 상에 존재하는 펩티드가 상기 홀로효소 또는 그의 서브유닛중 하나에 결합할 수 있는 조건 하에서 2A형 단백질 포스파타제 홀로효소 또는 그의 서브유닛중 하나를 함유하는 용액과 상기 고형 지지체를 접촉시키는 단계; 및(c) 고형 지지체 상에서 2A형 단백질 포스파타제 또는 그의 서브유닛중 하나가 결합하는 펩티드를 동정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 스팟의 형태로 부착된 펩티드의 크기가 20개 미만의 아미노산, 바람직하게는 15개 미만의 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항 또는 제39항에 있어서, 상기 펩티드는 셀룰로즈 막 상에 부착시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항 내지 제40항중 어느 한 항에 있어서, 부착된 일련의 펩티드 서열은 이들 서열이 유래하는 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 세포성 단백질의 완전 서열을 커버하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제20항, 제28항 또는 제29항중 어느 한 항에 기재되어 있는 바와 같은 펩티드의 제조 방법으로서, 이 방법은 제24항의 세포 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 배양 배지로부터 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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