JP2010063461A - 細胞のＮＦ−κＢ活性化を調節するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ユビキチン経路を経由するＩκＢ分解のさらなる理解を提供すること。
【解決手段】核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化を調節する組成物および方法が提供される。この組成物は、リン酸化ＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節する１つ以上の因子を含む。このような組成物は、ＮＦ−κＢ活性化に関連する疾患を処置するために用いられ得る。調節因子は、Ｅ３ユビキチンリガーゼの認識ドメインを含むペプチドを含む。
【選択図】図４−３

Description

（技術分野）
本発明は、一般に、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化を調節する組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、リン酸化ＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節する因子、このような因子を同定する方法、およびＮＦ−κＢ活性化と関連する疾患を処置する方法に関する。本発明に含まれる調節因子は、Ｅ３ユビキチンリガーゼの認識ドメインを含むペプチドを含む。

（発明の背景）
ＮＦ−κＢは、インターロイキン１、インターロイキン８、腫瘍壊死因子および特定の細胞接着分子を含む、免疫、炎症性および急性相応答遺伝子で観察される高度に特異的なパターンの遺伝子発現で中心的役割を果たす転写因子である。転写アクチベーターのＲｅｌファミリーの他のメンバーのように、ＮＦ−κＢは、大部分の細胞型の細胞質中で不活性形態で隔離されている。マイトゲン、サイトカイン、抗原、ストレス誘導剤、ＵＶ光および生体タンパク質を含む種々の細胞外刺激は、最終的にはＮＦ−κＢ放出および活性化を導くシグナル伝達経路を開始する。

ＮＦ−κＢ活性化の重要なモジュレーターは、インビボでＮＦ−κＢと会合（そしてそれによってこれを不活性化する）インヒビタータンパク質ＩκＢαおよびＩκＢβ（本明細書でＩκＢと呼ぶ）である。ＮＦ−κＢの活性化および核移行は、シグナルで誘導されるＩκＢのリン酸化の後で起こり、これは、ユビキチン経路を経由するタンパク質分解に至る。ＩκＢαについていえば、刺激で誘導されたセリン３２および３６におけるリン酸化は、このインヒビターを、リジン２１および２２におけるユビキチン化の標的にし、その結果分解する。同様に、セリン１９および２３におけるＩκＢβのリン酸化は、このインヒビターを、リジン９におけるユビキチン化の標的にする。しかし、ユビキチン系により認識されるＩκＢの部位、およびＩκＢ認識を仲介するユビキチン系の成分のいずれも同定されていない。

ユビキチン経路を経由するタンパク質の分解は、以下の２つの別個の連続的な工程により進行する：（ａ）複数ユビキチン分子のタンパク質基質への共有結合、および（ｂ）２６Ｓプロテオソーム複合体の標的となるタンパク質の分解である。ユビキチン経路は、協調し、かつ階層的な様式で作用するいくつかの成分からなる（レビューのために、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照のこと）。１つのこのような成分、単一のＥ１酵素は、ユビキチンの活性化を実施する。Ｅ２酵素のいくつかの主要な種が、哺乳動物細胞、植物および酵母で特徴付けられている。Ｅ２酵素は、おそらく、リガーゼＥ３に結合し（非特許文献５；非特許文献６）、そして各Ｅ２酵素は、１つ以上のＥ３タンパク質とともに作用し得るようである（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。

ほんのわずかのＥ３酵素（ユビキチンリガーゼ）が記載されている。哺乳動物Ｅ３α（酵母におけるＵＢＲ１）およびＥ３βは、タンパク質基質の遊離のＮ末端アミノ酸残基を介してそれらを認識する（「Ｎ末端規則」；非特許文献１１；非特許文献１２）。Ｃｄｃ５３は、おそらく、リン酸化Ｇ１サイクリンを標的にする際に関与するＥ３である（非特許文献１３）。Ｅ６−ＡＰは、ｐ５３の認識に関与し（非特許文献１４）、そして一連の特有のＥ６−ＡＰ相同タンパク質が同定されている（非特許文献１５）：Ｎｅｄｄ４は、上皮Ｎａ^＋チャンネルの分解に関与し（非特許文献１６）、そしてＲＳＰ５（ＮＩＰ１）は、パーミアーゼＧａｐ１およびＦｕｒ１をタグ化することに関与し（非特許文献１７）、その一方、Ｐｕｂ１は、Ｃｄｃ２５を標的にする（非特許文献１８）。最近単離されたいくつかのその他のＥ３酵素は、筋肉タンパク質のサブセットであるｃ−Ｆｏｓの分解に、およびＮＦ−κＢの前駆体であるｐ１０５のプロセシングに関与するようである（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。従って、リガーゼ類は、大きな、大部分が解明されていない酵素のファミリーを示すようであり、「Ｎ末端規則」リガーゼ（Ｅ３αおよびＥ３β）の認識の様式を除いて、ユビキチン系のすべてのその他の既知の基質の認識モチーフは同定されていない。

従って、当該技術分野には、ユビキチン経路を経由するＩκＢ分解のさらなる理解に対する要求、およびＮＦ−κＢの活性化に関連する疾患を処置することにおける使用のためのこの分解プロセスのモジュレーターの同定に対する要求が存在する。本発明はこれらの要求を満たし、そしてその他の関連する利点をさらに提供する。

Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、Ｃｅｌｌ ７９：１３、１９９４ Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：２１５、１９９５ ＪｅｎｔｓｃｈおよびＳｃｈｌｅｎｋｅｒ、Ｃｅｌｌ ８２：８８１、１９９５ Ｄｅｓｈａｉｅｓ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：４２８、１９９５ ＲｅｉｓｓおよびＨｅｒｓｋｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３６８５、１９９０ Ｄｏｈｍｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７３５１、１９９１ Ｎｕｂｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７９５、１９９６ Ｏｒｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１７０７、１９９５ Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：７１０６、１９９５ Ｇｏｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３０２、１９９６ Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ、Ｃｅｌｌ ６９：７２５、１９９２ ＨｅｒｓｈｋｏおよびＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：７６１、１９９２ Ｗｉｌｌｅｍｓら、Ｃｅｌｌ ８６：４５３、１９９６ Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒら、Ｃｅｌｌ ７５：４９５、１９９３ Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：２５６３、１９９５ Ｓｔａｕｂら、Ｅｍｂｏ Ｊ．１５：２３７１、１９９６ Ｈｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：７７、１９９５ ＮｅｆｓｋｙおよびＢｅａｃｈ、ＥＭＢＯ Ｊ．１５：１３０１、１９９６

（発明の要旨）
簡単に述べれば、本発明は、リン酸化ＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節することにより核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化を調節する組成物および方法を提供する。１つの局面では、本発明は、インビボでユビキチン化を行うＩκＢポリペプチドの能力をアッセイする方法を提供し、この方法は、（ａ）ＩκＢポリペプチドを細胞抽出物とインキュベートする工程であって、ここで該インキュベートする工程は、ＩκＢポリペプチドのリン酸化およびリン酸化ＩκＢポリペプチドとＮＦ−κＢとを含む複合体の形成を可能にするに十分な条件下および時間の間実施され；（ｂ）次いで該複合体をインビトロユビキチン化に供する工程；および（ｃ）次いで該複合体のユビキチン化の程度を評価し、そしてそれによってＩκＢポリペプチドがインビボでユビキチン化を行う能力をアッセイする工程、を包含する。

別の局面では、ＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節する因子を同定する方法が提供され、この方法は、（ａ）候補因子を、ＩκＢポリペプチドおよび細胞抽出物とインキュベートする工程であって、ここで該インキュベートする工程は、ＩκＢポリペプチドのリン酸化およびリン酸化ＩκＢポリペプチドとＮＦ−κＢとを含む複合体の形成を可能にするに十分な条件下および時間の間実施され；および（ｂ）次いで該複合体のユビキチン化を調節する候補因子の能力を測定し、そしてそれからＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節する因子を同定する工程を包含する。

本発明はまた、ＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節する因子を提供する。このような因子は、Ｅ３ユビキチンリガーゼの認識ドメインを含むペプチドを含み、例えば、配列番号５〜配列番号９に記載のペプチドを包含する。ペプチド因子をコードする、単離されたＤＮＡ分子および組換え発現ベクター、ならびにこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞もまた提供する。

別の局面では、本発明は、ＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節する１つ以上の因子を、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、薬学的組成物を提供する。

本発明はまた、さらなる局面で、患者におけるＮＦ−κＢ活性を調節する方法、およびＮＦ−κＢ活性化に関連する障害をもつ患者を処置する方法を提供し、
これらの方法は、患者に上記の薬学的組成物を投与する工程を包含する。ＮＦ−κＢ活性化に関連する障害には、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌およびウイルス感染が包含される。

本発明のこれらおよびその他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかになる。本明細書に開示されるすべての参考文献は、各々が個々に援用されるように、それらの全体が参考として本明細書に援用される。

本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） インビボでユビキチン化を行うＩκＢポリペプチドの能力をアッセイする方法であって：
（ａ）ＩκＢポリペプチドを細胞抽出物とインキュベートする工程であって、ここで該インキュベートする工程は、ＩκＢポリペプチドのリン酸化およびリン酸化ＩκＢポリペプチドとＮＦ−κＢとを含む複合体の形成を可能にするに十分な条件下および時間の間実施され；
（ｂ）次いで該複合体をインビトロでユビキチン化に供する工程；および
（ｃ）次いで該複合体のユビキチン化の程度を評価し、そしてそれによってＩκＢポリペプチドがインビボでユビキチン化を行う能力をアッセイする工程、
を包含する方法。
（項目２） ＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節する因子を同定する方法であって：
（ａ）候補因子を、ＩκＢポリペプチドおよび細胞抽出物とインキュベートする工程であって、ここで該インキュベートする工程は、ＩκＢポリペプチドのリン酸化およびリン酸化ＩκＢポリペプチドとＮＦ−κＢとを含む複合体の形成を可能にするに十分な条件下および時間の間実施され；および
（ｂ）次いで、該候補因子の、該複合体のユビキチン化を調節する能力を測定し、そしてそれからＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節する因子を同定する工程。
（項目３） 前記因子がペプチドである、項目２に記載の方法。
（項目４） 前記ペプチドが、Ｅ３ユビキチンリガーゼの認識ドメインを含む、項目３に記載の方法。
（項目５） ＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節する因子。
（項目６） 前記因子がペプチドである、項目５に記載の因子。
（項目７） 前記因子が、Ｅ３ユビキチンリガーゼの認識ドメインを含む、項目６に記載の因子。
（項目８） 前記因子が、配列番号５〜配列番号９の少なくとも１つに記載のアミノ酸配列を含む、項目７に記載の因子。
（項目９） 項目６〜８の少なくとも１つに記載の因子をコードする、単離されたＤＮＡ分子。
（項目１０） 項目９に記載のＤＮＡ分子を含む、組換え発現ベクター。
（項目１１） 項目１０に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
（項目１２） 前記宿主細胞が、細菌、酵母、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される、項目１１に記載の宿主細胞。
（項目１３） ＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節する因子を、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、薬学的組成物。
（項目１４） 患者におけるＮＦ−κＢ活性を調節する方法であって、項目１３に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１５） ＮＦ−κＢ活性化に関連する障害をもつ患者を処置する医薬の製造における使用のための、項目５〜８のいずれか１つに記載の因子。
（項目１６） 前記障害が、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌およびウイルス感染からなる群から選択される、項目１５に記載の因子。

図１Ａ〜１Ｄは、代表的な調節因子の存在下および非存在下で実施されたユビキチン化アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すオートラジオグラムである。他に示されていなければ、基質は、リン酸化され、そしてＮＦ−κＢが複合会合した、^３５Ｓ標識、ＨＡタグ化ＩκＢポリペプチドであった。図１Ａ中、レーン１は、３２位および３６位にアラニン残基を含むＩκＢαポリペプチド（Ｓ３２／３６Ａ；配列番号１３）のユビキチン化を示し、そしてレーン２は、非リン酸化野生型ＩκＢαポリペプチド（配列番号１２）のユビキチン化を示す。レーン３〜１４では、ユビキチン化の基質は、野生型ＩκＢα（配列番号１２）であった。レーン３では、ユビキチン化は、ＡＴＰの非存在下で実施され；そしてレーン４〜１４では、反応は、ＡＴＰγＳの存在下で、候補ペプチド調節因子とともに（レーン５〜１４）またはなしで（レーン４）実施された。示された候補因子は：４００μＭのｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン５）；４００μＭのセリン３２、３６をアラニンで置換したＩκＢαペプチド（ｐｐ２１Ｓ／Ａ（配列番号１１）、レーン６）；４０μＭの二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９、レーン７）；４００μＭの非リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐ２１（配列番号９、レーン８）；１００μＭの１つのリン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐＳ３２（配列番号９、レーン９；ｐｐＳ３６（配列番号９）、レーン１０）；および４０μＭの、より短い、二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ１９（配列番号８）、レーン１１）；ｐｐ１５（配列番号７）、レーン１２；ｐｐ１１（配列番号６）、レーン１３；ｐｐ７（配列番号５）、レーン１４）である。 図１Ａ〜１Ｄは、代表的な調節因子の存在下および非存在下で実施されたユビキチン化アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すオートラジオグラムである。他に示されていなければ、基質は、リン酸化され、そしてＮＦ−κＢが複合会合した、^３５Ｓ標識、ＨＡタグ化ＩκＢポリペプチドであった。図１Ｂでは、ユビキチン化基質は、遊離の野生型ＩκＢα（配列番号１２、レーン１〜３）または遊離のＳ３２／３６Ａ置換ＩκＢα（配列番号１３、レーン４〜６）であった。反応は、ＡＴＰγＳの非存在下（レーン１および４）または存在下（レーン２、３、５および６）で実施された。４０μＭの二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９）を、レーン３および６に示された試料中の結合反応混合物に添加した。 図１Ａ〜１Ｄは、代表的な調節因子の存在下および非存在下で実施されたユビキチン化アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すオートラジオグラムである。他に示されていなければ、基質は、リン酸化され、そしてＮＦ−κＢが複合会合した、^３５Ｓ標識、ＨＡタグ化ＩκＢポリペプチドであった。図１Ｃでは、ＨｅＬａ抽出物中のバルク細胞タンパク質のユビキチン化が示される。レーン１は、ＡＴＰ非存在下のユビキチン化を示し、そしてレーン５は、ＡＴＰ存在下のユビキチン化を示す。レーン３〜５では、以下の候補調節因子が添加された：４０μＭの二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９）、レーン２）；４００μＭのｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン３）；および４００μＭの非リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐ２１（配列番号９）、レーン４）。 図１Ａ〜１Ｄは、代表的な調節因子の存在下および非存在下で実施されたユビキチン化アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すオートラジオグラムである。他に示されていなければ、基質は、リン酸化され、そしてＮＦ−κＢが複合会合した、^３５Ｓ標識、ＨＡタグ化ＩκＢポリペプチドであった。図１Ｄでは、ユビキチン化基質は、リン酸化（レーン２〜７）または非リン酸化（レーン１）野生型ＩκＢβ（配列番号１４）であった。反応は、ＡＴＰγＳの非存在下（レーン２）または存在下（レーン１、３〜７）で、かつ候補ペプチド調節因子とともに（レーン４〜７）またはなしで（レーン１〜３）実施された。示された候補因子は：４００μＭの二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９）、レーン４）；４００μＭのｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン５）；４０μＭの二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ１９（配列番号８、レーン６）；および４００μＭの非リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐ２１（配列番号９、レーン７）である。 図２は、刺激されたＨｅＬａ細胞からの抽出物を用いて実施された、インビトロでのユビキチン依存性分解アッセイの結果を示すオートラジオグラムである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの各レーンにおいて、分解アッセイ後の、リン酸化（上のバンド）および非リン酸化（下のバンド）ＨＡタグ化ＩκＢαポリペプチド（配列番号１２）のレベルが示される。レーン１は、ＡＴＰなしで実施された分解アッセイ後のこれらのペプチドのレベルを示す。レーン２〜６では、ＡＴＰを反応混合物中に含めた。４０μＭの候補調節因子が、レーン３〜６に示される反応物に添加された：二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９）、レーン３）；二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ１９（配列番号８、レーン４）；ｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン５）；および非リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐ２１（配列番号９、レーン６）である。 図３Ａは、調節因子カラム上で分画されたＨｅＬａ細胞溶解物のフロースルー画分を用いて実施されたユビキチンアッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示すオートラジオグラムである。各場合において、基質は、リン酸化およびＮＦ−κＢ複合会合された、^３５Ｓ標識、ＨＡタグ化ＩκＢαポリペプチド（配列番号１２）であった。レーン１は、非分画抽出物を用いるユビキチン化のレベルを示す。レーン２〜９では、抽出物は、ペプチドＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム上で分画した。用いたペプチドは：ｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン２）；セリン３２、３６をアラニンで置換したＩκＢαペプチド（ｐｐ２１Ｓ／Ａ（配列番号１１）、レーン３）；二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９、レーン４〜６）；および二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ１９（配列番号８、レーン７〜９）である。さらに、網状赤血球画分ＩＩ（１６０μｇ）を、レーン５および８に示されるユビキチン化反応物に添加し、そして画分Ｉ（１６０μｇ）を、レーン６および９中の反応物に添加した。 図３Ｂは、ＨｅＬａ抽出物中のバルク細胞タンパク質のユビキチン化を示すオートラジオグラムである。レーン１は、ＡＴＰ非存在下のユビキチン化を示し、そしてレーン２は、ＡＴＰ存在下のユビキチン化を示し、しかし、候補調節因子なしである。レーン３〜６では、以下の候補調節因子が添加された：４０μＭの二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ１９（配列番号８）、レーン３）；４００μＭのｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン４）；４００μＭのセリン３２、３６をアラニンで置換したＩκＢαペプチド（ｐｐ２１Ｓ／Ａ（配列番号１１）、レーン５）；および４０μＭの二重リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９、レーン６）。 図４Ａ〜４Ｆは、核ＮＦ−κＢ移行に対する候補調節因子の影響を示す顕微鏡写真である。図４Ａ〜４Ｃでは、ｐｐ２１（図４Ａおよび４Ｂ）またはｐｐＦｏｓ（図４Ｃ）が、ＨｅＬａ細胞の細胞質にマイクロインジェクトされた。次いで細胞を、即座にＴＮＦαで活性化し、そして抗ｐ６５抗体で免疫染色した。図４Ｄ〜Ｆでは、ｐｐ２１（図４Ｄ）またはｐｐＦｏｓ（図４Ｆ）が、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞質に注入された。次いで細胞を、即座にＴＮＦαで活性化し、そして抗Ｅセレクチン抗体で免疫染色した。図４Ｅは、図４Ｄの位相差写真である。各顕微鏡写真において、注入された細胞は大きな矢印で記されている。図４Ｄおよび４Ｅでは、小矢印によって、注入されていないＥセレクチンネガティブ細胞が記されている。 図４Ａ〜４Ｆは、核ＮＦ−κＢ移行に対する候補調節因子の影響を示す顕微鏡写真である。図４Ａ〜４Ｃでは、ｐｐ２１（図４Ａおよび４Ｂ）またはｐｐＦｏｓ（図４Ｃ）が、ＨｅＬａ細胞の細胞質にマイクロインジェクトされた。次いで細胞を、即座にＴＮＦαで活性化し、そして抗ｐ６５抗体で免疫染色した。図４Ｄ〜Ｆでは、ｐｐ２１（図４Ｄ）またはｐｐＦｏｓ（図４Ｆ）が、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞質に注入された。次いで細胞を、即座にＴＮＦαで活性化し、そして抗Ｅセレクチン抗体で免疫染色した。図４Ｅは、図４Ｄの位相差写真である。各顕微鏡写真において、注入された細胞は大きな矢印で記されている。図４Ｄおよび４Ｅでは、小矢印によって、注入されていないＥセレクチンネガティブ細胞が記されている。 図４Ｇおよび４Ｈは、図４Ａ〜４Ｆに示されるマイクロインジェクション実験の要約を示すグラフである。図４Ｇには、核ｐ６５染色を示すＨｅＬａ細胞のパーセントが示される。９０および４２細胞は、それぞれｐｐ２１およびｐｐＦｏｓでマイクロインジェクトされた。図４Ｈは、Ｅセレクチン染色を示すＨＵＶＥＣのパーセントを示す。１６０および３６細胞は、それぞれ、ｐｐ２１およびｐｐＦｏｓでマイクロインジェクトされた。各グラフについて、カラム１は、候補調節因子およびＴＮＦα活性化の非存在下でのレベルを示す。カラム２〜４は、候補調節因子の非存在下（カラム２）、ｐｐ２１の存在下（カラム３）またはｐｐＦｏｓの存在下（カラム４）のＴＮＦα活性化後のレベルを示す。

（発明の詳細な説明）
上記の通り、本発明は一般的に、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化の調節およびこのような活性化に関連する疾患の処置に有用な組成物および方法に関する。特に、本発明は、リン酸化ＩκＢ（すなわち、ＩκＢαおよび／またはＩκＢβ）のユビキチン化を調節する因子、ならびにそのような因子の同定の方法に関する。

刺激に応答して、ＮＦ−κＢと会合したＩκＢは活性化され（すなわち、リン酸化され）、そしてＩκＢを分解の標的とし、それによってＮＦ−κＢを遊離および活性化する。本発明の状況において、リン酸化され、そしてＮＦ−κＢと会合したＩκＢは、特異的なユビキチンリガーゼＥ３により認識されることが見出されている。ＩκＢαおよびＩκＢβ間で機能的に保存されているＮ末端シグナル誘導リン酸化部位は、Ｅ３認識モチーフを構成し、そして近傍のユビキチン化部位と異なる。このモチーフに対応するペプチドおよびその改変体は、ＩκＢのユビキチン化およびそれに続く分解を阻害し、そしてそのようなペプチドは本発明の範囲中の調節因子である。

１つの局面において、本発明は、インビボでのＩκＢαのユビキチン化を高い忠実度で再現するインビトロでのユビキチン化アッセイを提供する。インビボにおいて、ＩκＢはセリン３２およびセリン３６のリン酸化による分解の標識となり、その一方で、３２位と３６位にアラニン残基を含有するＩκＢαの改変形態は、ユビキチン結合に供されない。同様に、セリン１９およびセリン２３のリン酸化は、ＩκＢβのユビキチン化に必要とされる。しかし、遊離ＩκＢは、ユビキチン系により非差別的様式で認識される（すなわち、リン酸化は必要とされない）。本明細書中で提供されるユビキチン化アッセイは、インビボにおいて観察される調節に対応するＩκＢユビキチン化の調節を可能とする。

本明細書中に記載されるユビキチン化アッセイに使用されるＩκＢポリペプチドは、ネイティブヒトＩκＢα（配列番号１）あるいはネイティブヒトＩκＢβ（配列番号３）であり得、またはネイティブタンパク質の改変体であり得る。本明細書中で使用するように、改変体は、１つ以上の置換および／または改変を含有するポリペプチドである。改変体としては、短縮型ポリペプチドおよびポリペプチドの活性に最小の影響を有するさらなるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが挙げられる。特に、改変体は、さらなるアミノ酸配列をアミノ末端および／またはカルボキシル末端に含有し得る。このような配列は、例えば、ポリペプチドの精製または検出を容易にするために、使用され得る。ＩκＢのポリペプチド改変体は、本明細書中に記載するようなユビキチン化アッセイにおいてリン酸化およびユビキチン化される改変体の能力が、実質的に減少しないように、改変される。好ましくは、ＩκＢポリペプチドは標識される。例えば、標準的な技術を用い、^３５Ｓメチオニン存在下で、^３５Ｓは、ポリペプチドのインビトロ翻訳によってＩκＢポリペプチド中に取り込まれ得る。

ＩκＢポリペプチドは、一般的に、培養宿主細胞中のＤＮＡの発現により、またはコムギ胚抽出物のようなインビトロ系を用いた翻訳により、ポリペプチドをコードするＤＮＡから調製され得る。宿主細胞が用いられる場合、そのような細胞は、好ましくは、細菌、酵母、バキュロウイルス感染昆虫細胞または哺乳動物細胞である。組換えＤＮＡは、当業者にとって周知である技術を用い、宿主細胞中での使用に適切な任意の発現ベクター中にクローン化され得る。ポリペプチドのインビトロ翻訳は、一般的に製造者の指示に従い、実施され得る。

この様式で発現されるＤＮＡ配列は、ネイティブＩκＢαあるいはＩκＢβをコードし得るか、またはこのＤＮＡ配列は、ネイティブＩκＢの一部あるいは改変体をコードし得る。改変体をコードするＤＮＡ分子は、一般的に、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発のような、標準的な変異誘発技術を用い調製され得る。あるいは、ＤＮＡ配列のセクションはまた、短縮型ポリペプチドの調製を可能とするために除去され得、そして「タグ」のようなさらなる配列をコードするＤＮＡは、ＤＮＡ分子の５’または３’末端に付加され得る。例えば、ＩκＢポリペプチドをコードするＤＮＡはまた、組換えタンパク質がＮ末端またはＣ末端にエピトープを含むように、エピトープをコードし得る。グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼタンパク質（ＧＳＴ）、ＨＡ（赤血球凝集素）−タグ、ＦＬＡＧおよびヒスチジン−タグのようなエピトープは、当業者に周知の技術を用い、付加され得る。

発現されたＩκＢポリペプチドは、インビトロ翻訳に続く精製をせずに用いられ得る。あるいは、ポリペプチドは、実質的に純粋な形態で単離され得る。ＩκＢポリペプチドは少なくとも８０重量％の純度で単離され得、好ましくは、少なくとも９５重量％の純度、より好ましくは、少なくとも９９重量％の純度で単離され得る。一般的に、このような精製は、例えば、本明細書中に記載した代表的な精製方法または、硫安分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーの標準的な技術を用い達成され得る。

本明細書中に提供したユビキチン化アッセイにおいて、刺激し、または刺激しないＪｕｒｋａｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＨＰ−１細胞、または内皮細胞由来の細胞抽出物は、インビトロにおいて、ＡＴＰおよびホスファターゼインヒビターのオカダ酸の存在下でＩκＢポリペプチドとインキュベートされる。細胞抽出物は、一般的に、Ａｌｋａｌａｙら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０５９９，１９９５）の方法に従い調製され得る。インキュベーションは、ＩκＢポリペプチドのリン酸化（ＩκＢαおよびその改変体についてはセリン３２およびセリン３６）およびリン酸化ポリペプチド（ｐＩκＢ）と細胞由来ＮＦ−κＢ複合体との会合を生ずるのに十分な条件下で行われる。例えば、ＩκＢポリペプチドは、ＨｅＬａ細胞抽出物またはＪｕｒｋａｔ細胞抽出物、ＡＴＰならびにオカダ酸とインキュベートされ得る。９０分、３０℃でのインキュベーションは、一般的に、ＩκＢポリペプチドのリン酸化を可能とするのに十分である。このインキュベーションに続き、ｐＩκＢ／ＮＦ−κＢ複合体は、例えば、抗ｐ６５抗体により免疫精製され得、そして、Ａｌｋａｌａｙら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０５９９，１９９５）が記載したように、無細胞系でのインビトロユビキチン化に供され得る。次に、ユビキチン化のレベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くオートラジオグラフィーの周知の技術を用い、評価され得る。

これらの条件下において、ＡＴＰγＳの存在下で、野生型^３５Ｓ−ｐＩκＢαポリペプチドは、多重にユビキチン化された種を産生する（図１Ａ、レーン４を参照）。ＩκＢαの^３５Ｓ標識されたＳ３２／３６Ａ変異体（レーン１）も非リン酸化野生型^３５Ｓ−ＩκＢα（レーン２）もユビキチン化されない。しかし、遊離型変異体ＩκＢαあるいは遊離型野生型ＩκＢαのいずれも、容易に結合する（図１Ｂ）。同様に、ＩκＢαの遊離型（しかし、複合体に会合していない）リジン２１、２２変異体は、インビトロでユビキチン化され得る。従って、遊離型ＩκＢポリペプチドを用い行われるユビキチン化アッセイと異なり、本明細書中で提供されるユビキチン化アッセイは、複合体に会合し適切にリン酸化されたＩκＢポリペプチドのみを標的とする。

本発明の別の局面において、上記のユビキチン化アッセイは、ＩκＢのユビキチン化を調節する因子を同定するために使用され得る。調節因子としては、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、ペプチド、およびＩκＢαおよび／またはＩκＢβポリペプチドのユビキチン化を刺激または、好ましくは、阻害する他の薬物が挙げられ得る。一般的に、このような因子は、その他の点で上記のとおり実施され得るユビキチン化反応において調節因子候補を含ませること、および因子のユビキチン化レベルへの影響を評価することにより、同定され得る。候補因子のそのようなアッセイにおける使用での適切な濃度は、一般的に、約０．１μＭ〜約１ｍＭの範囲である。ペプチド候補因子について、ベスタチンのようなペプチダーゼインヒビター（４０μｇ／ｍＬ）もまた、加えられ得る。そして、ペプチドの量は、好ましくは、約１０μＭ〜約１ｍＭの範囲である。ユビキチン化のレベルに統計学的に有意な効果を生じる候補因子は、本発明により包含される調節因子である。

上記のとおり、本発明の状況において、複合体に会合したＩκＢは、特異的ユビキチンリガーゼＥ３によって認識されることが見出された。従って、本発明の範囲内の調節因子として、Ｅ３ユビキチンリガーゼの認識ドメインを含有するペプチドが挙げられるが、これに限定されない。このようなペプチドは、Ｎ末端シグナルドメイン（ネイティブＩκＢαまたはＩκＢβの残基１〜５４）より由来し得、そして、最低限、シグナルリン酸化部位（ネイティブＩκＢαの残基３２〜３６またはネイティブＩκＢβの残基１９〜２３）を含有すべきである。ペプチド調節因子は、一般的に、標準的な自動合成技術を用い、または所望のペプチドをコードする組換えＤＮＡの発現により調製され得る。このような因子は、上記のように、１つ以上の置換および／または改変のために、ネイティブＩκＢαおよびＩκＢβと配列が異なり得る。ただし、ペプチド改変体は、ＩκＢポリペプチドのユビキチン化を阻害する。

最大限の阻害のために、ペプチド調節因子はリン酸化されるべきである；好ましくは、ネイティブなリン酸化部位の両方（例えば、ＩκＢαのセリン３２およびセリン３６）がリン酸化されるか、一方がリン酸化されたペプチドも用いられ得る。リン酸化ペプチドは周知の技術により調製され得る。例えば、ホスホセリン残基は、合成中にペプチドに取り込まれ得る。あるいは、ペプチドは、合成後に標準的な技術を用いリン酸化され得る。

一般的に、ペプチド調節因子は、アミノ酸および／またはアミノ酸アナログを取り込む標準的な技術を用い調製され得る。合成中に、アミノ酸および／またはアミノ酸アナログの活性基は、必要な場合、例えば、ｔ−ブチルジカルボネート（ｔ−ＢＯＣ）基またはフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基を用い保護され得る。アミノ酸およびアミノ酸アナログは、市販品を購入し得る（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．； Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃ）か、または当該分野において公知の方法を用いて合成され得る。ペプチドは固相法を用い合成され得る。固相法では、ペプチドは、４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）、４−（オキシメチル）−フェニルアセトアミドメチル−および４−（ヒドロキシメチル）フェノキシメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）（Ｗａｎｇ樹脂）（全て市販されている）、またはＤｅ ＧｒａｄｏおよびＫａｉｓｅｒ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：３２５８，１９８２）によって記述されたように合成され得るｐ−ニトロベンゾフェノンオキシムポリマー（オキシム樹脂）のような樹脂に付着される。当業者は、アミノ酸および／またはアミノ酸アナログの選択が、所望の特定の物理学的、化学的または生物学的な特徴に部分的に依存することを理解する。このような特徴は、投与方法および患者における標的位置により、部分的に決定される。

ペプチド中の反応性基の選択的改変はまた、所望の特徴を与え得る。ペプチドは、アセチル化ペプチドのようにＮ末端改変した化合物を得るために、まだ樹脂に付着している間に、操作され得る。または、ペプチドは、フッ化水素または同等の切断因子を用い樹脂から取り出され、そして改変され得る。合成されたＣ末端カルボキシル基を含む化合物（Ｗａｎｇ樹脂）は、樹脂からの切断後、またはいくつかの場合には溶液相合成に先立って、改変され得る。ペプチドのＮ末端またはＣ末端を改変する方法は、当該分野において周知である。この方法としては、例えば、Ｎ末端のアセチル化またはＣ末端のアミド化が挙げられる。同様に、アミノ酸側鎖またはアミノ酸アナログ側鎖を改変する方法は、ペプチド合成における当業者にとって周知である。ペプチド上に存在する反応性基に対してなされる改変の選択は、所望の特徴によって決められる。

調節因子はまた、環状ペプチドであり得る。環状ペプチドは、例えば、ペプチドのＮ末端のアミノ基とＣ末端のカルボキシル基との間の共有結合の形成を誘導することにより得られ得る。あるいは、環状ペプチドは、末端の反応性基と反応性アミノ酸側鎖との間、または２つの反応性側鎖間での共有結合の形成により得られ得る。所望の特徴に基づき環状ペプチドが選択されることは、当業者にとって明らかである。例えば、環状ペプチドは、増加した安定性、増加した可溶性、減少した免疫原性または減少したインビボクリアランスを提供し得る。

新たに合成されたペプチドは、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）またはサイズもしくは電荷に基づき分離する他の方法のような方法を用い、精製され得る。さらに、精製ペプチドは、これらの方法およびアミノ酸分析および質量分析のような他の周知の方法を用いることにより、特徴づけられ得る。

ペプチド調節因子のいくつかの代表的な例は表Ｉに提供される。

（表Ｉ）
代表的なペプチド調節因子

^＊は、リン酸化残基を示す。

調節因子のさらなる特徴づけは、ユビチン依存性インビトロ分解アッセイを用いることにより、達成され得る。そのようなアッセイは、一般的には、Ａｌｋａｌａｙら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：１０５９９，１９９５）が記載したように実施され得る。このアッセイにおいて、刺激された細胞由来のｐＩκＢαは、インビトロでユビキチン依存性様式で分解され、他方、同一の細胞抽出物由来の非リン酸化ＩκＢαは、分解を受けない。ＩκＢαのユビキチン化を阻害する調節因子はまた、このようなインビトロ分解アッセイでｐＩκＢαの安定化を生ずるべきである。

本明細書中で記する調節因子は、一般的に、細胞のＮＦ−κＢ機能を特異的に阻害するために用いられ得る。このような阻害は、一般的に、因子（例えば、約５ｍｇ／ｍＬのペプチド因子）の適切な細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、または初代ヒト血管内皮細胞）へのマイクロインジェクションにより示され得る。マイクロインジェクションに続き、細胞は、ＮＦ−κＢの活性化を可能にするように刺激され（例えば、ＴＮＦαを用い）そしてインキュベートされる。ＨｅＬａ細胞において、ＴＮＦαは、ＮＦ−κＢの核中への迅速な核移行を誘導し、この核移行はｐ６５特異的抗体での染色により検出され得る。調節因子は、ＮＦ−κＢ移行の統計学的に有意な減少を誘導し、そしてこのような移行を検出不可能なレベルまで減少させ得る。

初代ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ＮＦ−κＢにより調節される接着タンパク質（例えば、ＩＣＡＭ−１、Ｖ−ＣＡＭ−１およびＥセレクチン（Ｒｅａｄら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：４９３，１９９５； Ｃｈｅｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５：３５３８，１９９５））の表面発現により、ＴＮＦα刺激に応答する。Ｅセレクチンの発現は特にＮＦ−κＢ依存性であり、そしてＥセレクチンは、最初の好中球付着および活性化内皮上のローリングに主要な誘導性内皮接着分子である。刺激された細胞は、１つ以上のＮＦ−κＢに調節される接着タンパク質の発現を検出するために、固定され、そして染色され得る。調節因子のマイクロインジェクションは、そのような発現の統計学的に有意な阻害を生じるが、ＩＣＡＭ２のようなＮＦ−κＢ非依存性接着タンパク質の発現には影響しない。

調節因子はまた、患者におけるＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節するのに用いられ得、それによりインビボでＮＦ−κＢ細胞機能を調節する。本明細書中で使用するように、「患者」は、ヒトを含む任意の哺乳動物であり得、そしてＮＦ−κＢの活性化に関連する疾患に苦しんでいてもよく、または検出可能な疾患に罹患していなくてもよい。従って、処置は現存の疾患について、または予防的なものであり得る。ＮＦ−κＢ活性化に関連する疾患として、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンおよびウイルス感染が挙げられる。

処置とは、本明細書中に記載の調節因子の投与をいう。患者への投与について、１つ以上のこのような化合物は、一般的に、薬学的組成物として処方される。薬学的組成物は、生理学的に受容可能なキャリア（すなわち、活性成分の活性を妨害しない非毒性物質）をさらに含有する、滅菌の水性もしくは非水性溶液、懸濁液あるいはエマルジョンであり得る。当業者にとって公知である任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物に用いられ得る。代表的なキャリアとして、生理食塩水溶液、ゼラチン、水、アルコール、天然あるいは合成油、糖類溶液、グリコール、オレイン酸エチルのような注射用有機エステル、またはこのような物質の組み合わせが挙げられる。必要に応じて、薬学的組成物は、さらに、保存剤および／または他の添加物（例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および／または不活性ガス）、および／または他の活性成分を含有し得る。

あるいは、薬学的組成物は、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、調節因子をコードするポリヌクレオチドを含有し得る（その結果、調節因子がインサイチュで産生される）。そのような薬学的組成物において、ポリヌクレオチドは、当業者に公知である任意の種々の送達系内に存在し得る。送達系としては、核酸、細菌およびウイルス発現系、ならびにリポソームを含むコロイド分散系が挙げられる。適切な核酸発現系は、患者内での発現に必要なポリヌクレオチド配列（例えば、適切なプロモーターおよびターミネーターシグナル）を含有する。ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９，１９９３）が記載したように、「裸」であり得る。

標的化された患者の細胞へ核酸配列を導入するために使用され得る種々のウイルスベクターとして、ワクシニアもしくは他のポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡをこのようなベクターへ組み込む技術は、当業者にとって周知である。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスまたはトリレトロウイルスの誘導体である。レトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳ガンウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターは、選択マーカー遺伝子（形質導入細胞の同定または選択を助けるため）および／あるいは特定の標的細胞上のレセプターについてのリガンドをコードする遺伝子（ベクターを標的特異的にするため）をさらに導入または取り込み得る。例えば、レトロウイルスベクターは、糖、糖脂質またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入することにより、標的特異的とされ得る。標的化はまた、当業者に公知の方法により、抗体を用いて達成され得る。

ウイルスベクターは、代表的には、非病原性（欠損性）の、複製能力のあるウイルスであり、これは感染性のベクター粒子の産生のために補助を必要とする。この補助は、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下にレトロウイルスの全ての構造遺伝子をコードするプラスミドを含有するが、パッケージング機構がカプセル化のためのＲＮＡ転写物を認識することを可能にするヌクレオチド配列を欠くヘルパー細胞株を用いることにより、提供され得る。このようなヘルパー細胞株としては、ψ２、ＰＡ３１７、およびＰＡ１２が挙げられるが、これらに限定されない。このような細胞に導入されたレトロウイルスベクターは、パッケージされ得、そしてベクタービリオンを産生し得る。次に、この方法により産生されたベクタービリオンは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のような組織細胞株への感染に用いられ、大量のキメラレトロウイルスビリオンを産生し得る。

ポリヌクレオチドのための別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル（ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅ）、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられる。インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして用いるのに好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。０．２〜４．０μｍのサイズ範囲の大きな単層小胞（ＬＵＶ）は、大きな高分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合をカプセル化し得ることが示されている。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンは、水性内部にカプセル化され、そして細胞へ生物学的に活性な形態で送達され得る（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．６：７７，１９８１）。哺乳動物細胞に加え、リポソームは、ポリヌクレオチドの植物細胞、酵母細胞および細菌細胞への送達にも使用されてきた。リポソームが効率的な遺伝子導入ビヒクルであるために、以下の特徴が存在すべきである：（１）目的遺伝子を高効率でカプセル化するが、生物学活性を損なわない；（２）非標的細胞と比べ標的細胞への優先的および実質的な結合；（３）小胞の水性内容物の標的細胞細胞質への高効率送達；および（４）遺伝情報の正確で効果的な発現（Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：８８２，１９８８）。

リポソームの標的化は、解剖学上の因子および機械論的な因子に基づき、分類され得る。解剖学上の分類は、選択性のレベルに基づき、そして例えば、器官特異的、細胞特異的、および／またはオルガネラ特異的であり得る。機械論的な標的化は、受動的であるかまたは能動的であるかに基づき区別され得る。受動的な標的化は、リポソームが、洞様毛細血管を含む器官における細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布する天然の傾向を利用する。一方、能動的な標的化としては、天然に生じる局在部位以外の器官および細胞型への標的化を達成するための、リポソームと特異的なリガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質）の結合による、またはリポソームの組成もしくはサイズの変更によるリポソームの改変が挙げられる。

投与の経路および頻度、ならびに用量は、患者により異なる。一般的に、薬学的組成物は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、腔内にまたは経皮的に投与され得る。１〜６の間の用量が、毎日投与され得る。適切な用量は、ＮＦ−κＢ活性化と関連した疾患に苦しむ患者の症状の改善を示すのに十分な量である。このような改善は、炎症応答（例えば、浮腫、移植片拒絶、過敏症）をモニターすることにより、または疾患と関連した臨床症状の改善を通して検出され得る。一般的に、用量中に存在する調節因子の量、または用量中に存在するＤＮＡによりインサイチュで産生される調節因子の量は、宿主１ｋｇあたり約１μｇ〜約１００ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者のサイズにより異なるが、代表的には、１０〜６０ｋｇの動物について約１０ｍＬ〜約５００ｍＬの範囲である。

以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、そして限定することを意図しない。

実施例１
ユビキチン化アッセイを使用する調節因子の同定
この実施例は、代表的なユビキチン化アッセイ、および候補調節因子を評価するためのこのようなアッセイの使用を例示する。

Ａ．インビトロでのユビキチン化アッセイ
ＨＡタグ化ＩκＢαまたはＨＡタグ化ＩκＢβ ｃＤＮＡ（Ｈａｓｋｉｌｌら、Ｃｅｌｌ ６５：１２８１−１２８９，１９９１）を、コムギ胚芽抽出物においてインビトロで^３５Ｓメチオニンの存在下で、製造業者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従って翻訳した。ＩκＢαまたはＩκＢβをリン酸化するために、標識したタンパク質を含有する１μｌの抽出物を、９０分間３０℃で、最終容量３０μｌを有する反応混合物（１００μｇ ＨｅＬａ細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞抽出物（Ａｌｋａｌａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０５９９，１９９５に記載されるように調製した）、２ｍＭ ＡＴＰ、および１μＭ オカダ酸）中でインキュベートした。このインキュベーションの間、標識したＩκＢポリぺプチドを、セリン３２および３６においてリン酸化し、そして内因性のＮＦ−κＢ複合体に会合させた（データ示さず）。

インキュベーション後、１μｌの抗ｐ６５血清を添加し、そしてＮＦ−κＢ免疫複合体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）に固定化し、そしてＡｌｋａｌａｙらによって記載されるように、ＨｅＬａ細胞抽出物においてインビトロでのユビキチン化に供した。ユビキチン化したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。

図１Ａに示すように、野生型^３５Ｓ−ｐＩκＢαのみが多様に（ｍｕｌｔｉｐｌｙ）ユビキチン化した種を生成した（レーン４）。ＩκＢαの^３５Ｓ標識したＳ３２／３６Ａ変異体（レーン１）も、非リン酸化野生型^３５Ｓ−ＩκＢα（レーン２）もいずれも、ユビキチン化されず、そしてｐＩκＢαのユビキチン化は、ＡＴＰの非存在下で観察されなかった（レーン３）。

このアッセイの生理学的な関連性を、遊離の^３５Ｓ−ＩκＢのインビトロでのユビキチン化の、複合体に会合したリン酸化基質のユビキチン化との比較によってさらに記録した。複合体に会合したＳ３２／３６Ａ変異体が、そのインビボでの運命に従ってユビキチン結合に供されなかったのに対し、変異体または野生型ＩκＢαの遊離の形態は、容易に結合した（図１Ｂ）。同様に、遊離のＩκＢαのみがインビトロでユビキチン化され得たが、複合体に会合したリジン２１、２２変異体のＩκＢαは、インビトロでユビキチン化され得た（データは示さず）。従って、遊離のＩκＢαが、無差別的に、ユビキチン系によって認識されるのに対し、複合体に会合したインヒビターは、適切にリン酸化されていない限り、マスクされる。

Ｂ．ペプチド調節因子の同定
ＩκＢαユビキチンリガーゼ認識モチーフを同定するために、種々のペプチドを、種々の濃度で、ペプチダーゼインヒビターＢｅｓｔａｔｉｎ（４０μｇ／ｍｌ）の存在下で、反応混合物に添加した。ペプチドは、タンパク質のＮ末端シグナリングドメインにわたり、そして１つまたは両方のセリン残基（３２および３６）でリン酸化されるか、または改変されないかもしくはセリン置換された。これらのペプチドを、種々の濃度でユビキチン反応に含ませ、そしてｐＩκＢα特異的ユビキチン化のインヒビターについて試験した。遊離のＩκＢαの結合をモニターした場合、翻訳されたタンパク質を、結合反応混合物に直接添加した。

両方のセリン３２および３６でリン酸化されたペプチド（ｐＩκＢαペプチド）のみが、ｐＩκＢαユビキチン化を効果的に阻害した（図１Ａ、レーン７、１１〜１４）。ｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ、レーン５）、セリン３２、３６をアラニンで置換したＩκＢαペプチド（ｐ２１Ｓ／Ａ、レーン６）、および非リン酸化ペプチド（ｐ２１、レーン８）は、４００μＭの濃度で、ｐＩκＢのユビキチン化に対して検出可能な効果を有さなかった。リン酸化ＩκＢαペプチドのＩＣ_５０を計算した。そして代表的な阻害濃度を図１Ａに示す。二重にリン酸化されたＩκＢαペプチドは、ｐＩκＢ結合反応を、５μＭのＩＣ_５０で阻害した（レーン７、１１〜１４）。これらのペプチドの配列を上記表Ｉ、および配列番号５〜９に提供する。対照的に、一重リン酸化ペプチド（レーン９、１０）は、４００μＭのＩＣ_５０でｐＩκＢα結合を阻害した。試験した最小サイズのペプチド（シグナリングリン酸化部位に広がるのみである）（ｐｐ７、レーン１４）は、いくらか高いＩＣ_５０（１０μＭ）であったが、ユビキチン化を効果的に阻害するのに十分であった。従って、配列番号１の残基２１〜４１を含むペプチドは、Ｅ３ユビキチンリガーゼについての認識ドメインを含む。興味深いことに、リジン残基２１および２２は、阻害について必須ではなく、ユビキチン系認識部位は、実際の認識部位とは異なることを示唆する。

ペプチド調節因子の特異性を、２つの他のユビキチン結合反応において試験した：遊離の野生型の結合（図１Ｂ、レーン１〜３）またはＳ３２／３６Ａ変異体ＩκＢα（図１Ｂ、レーン４〜６）、およびＨｅＬａ抽出物中の細胞性タンパク質のバルクへのユビキチン結合（Ａｌｋａｌａｙらに従って^１２５Ｉ標識化ユビキチンによって検出される、図１Ｃ ）。いずれの反応も、ペプチド調節因子またはコントロールペプチドの添加によって影響を受けなかった。

ペプチド調節因子は、ｐＩκＢαに関連する基質ｐＩκＢβのユビキチン化を消滅させることを見出した（図１Ｄ）。ｐＩκＢαの結合と同様に、ＩκＢβの特異的結合もまた、会合したＮＦ−κＢ複合体（示さず）およびＩκＢα相同性残基Ｓｅｒ１９および２３で予めリン酸化することを必要とした。ホスファターゼインヒビターの非存在下で調製されたＩκＢβ基質は、ユビキチン化に供されなかった（図１Ｄ、レーン１）。ペプチド調節因子は、ｐＩκＢαについて観察されたものと類似のＩＣ_５０でｐＩκＢβユビキチン化に影響を与えた（図１Ｄ、レーン４〜７）。従って、同一の酵素が、ユビキチン依存性分解について両方のＩκＢを標的化するようである。

阻害性ｐＩκＢαペプチドを、相補的ユビキチン依存性インビボ分解アッセイにおいて試験した（Ｏｒｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１７０７，１９９５；Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：７１０６，１９９５）。このアッセイを使用して、刺激された細胞由来のｐＩκＢαのみが、ユビキチン依存的にインビトロで分解するのに対し、同一の細胞抽出物由来の非リン酸化ＩκＢαは、分解に供されない。結合阻害ホスホペプチド調節因子の分解アッセイへの組み込みは、ｐＩκＢα基質の安定化を生じた（図２、レーン３、４）のに対し、非リン酸化ペプチド因子またはコントロールホスホＦｏｓペプチドは、特異的ｐＩκＢα分解に対して効果を有さなかった（レーン５、６）。ペプチドをＬｙｓ２１／２２でトリムすることは、分解阻害効果を減退させなかった（レーン４）。これは、ペプチドが結合可能な基質としてのユビキチンプロテアーゼ系を消耗させることによってｐＩκＢα分解を消滅させないことを示す。

実施例２
基質認識に関与するユビキチン系成分の同定
この実施例は、ｐＩκＢポリぺプチドの認識を担う特定のＥ３の同定を例示する。

ｐＩκＢαユビキチン結合および分解は、ユビキチン系酵素：Ｅ１、ユビキチン系画分Ｉに由来する特定のＥ２、Ｅ２Ｆ１（Ａｌｋａｌａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０５９９，１９９５；Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ ８４： ８５３，１９９６）、および画分ＩＩの成分Ｅ３の全ての成分を必要とする。基質認識に関与するユビキチン系成分を同定するために、ＨｅＬａ溶解物を、ＩκＢαホスホペプチド調節因子カラムにかけて分画し、そしてフロースルー画分をｐＩκＢα結合についてアッセイした。ペプチドを、製造業者の指示に従って、２ｍｇ／ｍｌの濃度でＮＨＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^(R)（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させた。１００μｇのＨｅＬａ抽出物を、２．５μｌの結合化樹脂とともに、０．１％ＮＰ４０および３％オボアルブミンの存在下で１時間、４℃でインキュベートした。樹脂を捨て、そして未結合の物質を上記のユビキチン化アッセイで試験した。

コントロールホスホペプチドカラムおよびＳ３２／３６Ａペプチドカラムからのフロースルー画分は、全ＩκＢα結合能力を維持した（図３Ａ、レーン２、３）が、２つの異なるｐＩκＢαペプチド由来のフロースルー画分は、そのＩκＢα特異的結合能力を失った（レーン４、７）。欠失した結合活性は、Ｅ３酵素の全ての公知の種を含む網状赤血球画分ＩＩ（レーン５、８）によって補足され得た（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ， Ｃｅｌｌ ７９：１３， １９９４）。相補化は、画分Ｉまたは画分ＩおよびＥ１の添加によって得られず（それぞれ、レーン６および９）、このことはペプチドカラムがＥ２またはＥ１よりむしろＥ３を涸渇させたことを示している。再び、ＩκＢαリジン残基２１および２２は、Ｅ３を維持するために不必要であり（図３Ａ、レーン７〜レーン４を比較のこと）、基質認識と結合部位との間の区別を強調した。ペプチドカラム涸渇は、ＩκＢ Ｅ３に特異的であることを見出した。なぜなら、全てのフロースルー画分が、ランダムＨｅＬａタンパク質結合において全活性を維持したからである（^１２５Ｉユビキチンの結合を測定することによって検出した。図３Ｂ）。これは、特定のＥ３が、同定されたモチーフにおいてｐＩκＢの認識を担うことを示す。

実施例３
胞性ＮＦ−κＢ活性化に対する代表的なペプチド調節因子の効果
この実施例は、細胞性ＮＦ−κＢ活性化の、ペプチド調節因子の微量注入による阻害を例示する。

ＨｅＬａ細胞を、微量注入の１８時間前にグリッドのカバースリップ（Ｃｅｌｌｏｃａｔｅ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上に置いた。微量注入を、２２アミノ酸ｐＩκＢαペプチド（ｐｐ２１；表Ｉおよび配列番号９）またはコントロールホスホＦｏｓペプチド（配列番号１０）を用いて、半自動化装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して行った。ペプチドを細胞の細胞質中に、５ｍｇ／ｍｌの濃度で、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ （ｐＨ ７．２）で注入し、そしてＴＮＦα（２００ユニット／ｍＬ）で２０分間（ＮＦ−κＢ移行）または３時間（Ｅセレクチン発現）のいずれかで、迅速に活性化した。活性化の後、細胞を固定し、そしてｐ６５特異的抗体（Ｍｅｒｃｕｒｉｏら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．７：７０５，１９９３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはモノクローナル抗Ｅセレクチン抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で染色した。

ペプチド調節因子の非存在下で、ＴＮＦαは、９０％の細胞のｐ６５核染色によって示されるように、ＮＦ−κＢの核内への迅速な核移行を誘導する（図４Ｇ、カラム２を参照のこと）。ｐｐ２１ペプチドは、いくつかの実験において微量注入した細胞の５０〜７０％において、ＴＮＦα刺激によるＮＦ−κＢ活性化を消滅させた（図４Ａおよび４Ｂにおける代表的な視野；および図４Ｇ、カラム３を参照のこと）。対照的に、コントロールｐｐ−Ｆｏｓペプチドは、微量注入されていない細胞と比較して、ＮＦ−κＢ誘導性核移行の割合に対して効果を有さなかった（図４Ｃおよび４Ｇ、カラム４）。

ＮＦ−κＢ阻害の機能的コンセンサスをさらに評価するために、ＩκＢ−Ｅ３阻害ペプチドを、原発性ヒト血管内皮細胞中に微量注入した（ＨＵＶＥＣ；Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５：３５３８，１９９５）。これらの細胞は、Ｅセレクチンのような、ＮＦ−κＢ調節接着タンパク質の表面発現によってＴＮＦα刺激に応答する。ＨＵＶＥＣ細胞を上記のようにプレートし、微量注入し、そして刺激した。刺激の３時間後、細胞を固定し、そしてＮＦ−κＢ依存性Ｅセレクチンの発現について染色した。ＨＵＶＥＣ細胞の７５％〜８５％を、いくつかの実験において、ＴＮＦα刺激後にＥセレクチンについて強度に染色した。ｐｐ２１ペプチドの微量注入は、微量注入した細胞の７０〜８０％のＥセレクチン発現を阻害した（図４Ｄ；および図４Ｈ、カラム３）。対照的に、コントロールｐｐ−Ｆｏｓペプチドは、微量注入していない細胞と比較して、Ｅセレクチン発現に対して効果を有さなかった（図４Ｆおよび４Ｈ、カラム４）。コントロールの、Ｓ３２／３６Ａ置換されたＩκＢαペプチドの微量注入は、Ｅセレクチン発現の割合に対して効果を有さなかった（データ示さず）。

これらの結果は、シグナル誘導リン酸化ＩκＢαおよびＩκＢβのサブユニット特異的分解が、特定のＥ３によって媒介されることを示す。Ｅ３ユビキチンリガーゼの認識ドメインは、短い配列であり、両方のＩκＢにて保存されている２つのシグナル獲得ホスホセリンを中心を置き、第１の生物学的に関連性のあるＥ３認識モチーフを表す。ＩκＢ認識における特異性は、リン酸化基質の状況によって支持される：会合した細胞性複合体は、非特異的Ｅ３から基質をマスクする。この特徴は、ＮＦ−κＢインヒビター分解を刺激後相に制限し、ここで部位特異的リン酸化事象を介して特定のリガーゼに曝露される。ＮＦ−κＢ活性化およびその得られる機能が、本明細書中で提供される調節因子を使用して、ＩκＢリガーゼのインビボ阻害によって特異的に消滅させられ得る。

上記から、本発明の特定の実施態様が例示の目的で記載されているが、種々の改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲による以外は限定されない。

配列表の要旨
配列番号１は、ＩκＢαのアミノ酸配列である。
配列番号２は、ＩκＢαのＤＮＡ配列である。
配列番号３は、ＩκＢβのアミノ酸配列である。
配列番号４は、ＩκＢβのＤＮＡ配列である。
配列番号５は、ｐｐ７のアミノ酸配列である。
配列番号６は、ｐｐ１１のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ｐｐ１５のアミノ酸配列である。
配列番号８は、ｐｐ１９のアミノ酸配列である。
配列番号９は、ｐｐ２１のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ホスホＦｏｓペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ｐｐ２１ Ｓ／Ａのアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ＨＡタグ化ＩκＢαのアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ＨＡタグ化Ｓ３２，３６ＩκＢαのアミノ酸配列である。
配列番号１４は、ＨＡタグ化ＩκＢβのアミノ酸配列である。

（配列表）

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。