CN100482795C

CN100482795C - Iren蛋白,其制备和应用

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Publication number: CN100482795C
Application number: CNB008150133A
Authority: CN
Inventors: D·沃勒克; N·马利宁; I·辛哈; S·勒
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1999-09-02
Filing date: 2000-08-31
Publication date: 2009-04-29
Anticipated expiration: 2020-08-31
Also published as: CA2383606A1; AU784582B2; IL131719A0; ZA200201401B; HK1051876A1; BR0014167A; EP1208197A1; US20090075889A1; NO20020919L; IL148446A0; EE200200096A; WO2001016314A1; AU6723100A; NO20020919D0; KR20020059386A; CN1384878A; US7429648B1; EA005775B1; MXPA02002391A; JP2003508053A

Abstract

提供编码TRAF结合性蛋白质的DNA序列，其编码的蛋白质和它们在治疗或预防与NF-κB诱导相关的疾病，或与TRAF所介导的活性相关的疾病中的应用。

Description

IREN蛋白，其制备和应用

发明领域

本发明涉及编码TNF受体相关因子(TRAF)结合蛋白的DNA序列。更具体说，本发明涉及编码能结合TRAF2的本文命名为IREN的生物活性蛋白质及其同工型的cDNA序列。本发明还涉及上述DNA编码的蛋白质，所述蛋白质和DNA序列在治疗或预防与NF-κB诱导的或TRAF2介导的其他活性、或与所述蛋白结合的其他分子相关的疾病中的应用。

发明背景

肿瘤坏死因子/神经生长因子(TNF/NGF)受体超家族，代表了哺乳动物细胞中一个迄今已鉴定的成员超过20个的正在发展中的家族。虽然该超家族的受体胞外结构域一级序列互不相同，但TNF/NGF受体超家族成员均具有富含半胱氨酸的亚结构域，认为这些亚结构域继承了总体类似的三级折叠(Bazan1993；Beutler和van Huffel，1994；Smith等，1994)。除了P55TNF受体和Fas/APOl这两个受体外，该受体家族的各个成员可能具有不同的结构差异。然而各受体之间的功能非常相似表明，它们具有共同的信号传导通路。这种相似性的一个例子是TNF/NGF家族的几种受体能够激活转录因子NF-κB(见下)。

TRAF2是命名为TRAF(TNF受体相关因子)蛋白质家族最近描述的一个成员，该家族包括几种已鉴定的蛋白质，如TRAF1，TRAF2(Rothe，M等1994；PCT颁布的申请WO 95/33051)、TRAF3(Cheng，G等，1995)、TRAF4(CART1，富含C的与RING和TRAF结构域相关的基序，Regnier等，1995)、TRAF5(Ishida等，1996a；Nakano等，1996)和TRAF6(见Cao等，1996a；Ishida等，1996b)。属于TRAF家族的所有蛋白质其C未端结构域均有高度氨基酸相同性，而其N未端结构域不相关。如TRAF2的示意图(图1)所示。该分子在其N未端含有一个环指基序和二个TFIIIA样锌指基序。该分子的C未端一半包含一称为“TRAF结构域”的区域，它含有氨基酸264-358之间的一潜在性亮氨酸拉链区(称为N-TRAF)。另一朝向该分子羧基未端氨基酸359-501之间的结构域(称为C-TRAF)负责TRAF与受体和其它TRAF分子的结合形成同源-或异源二聚体。

TRAF衔接子蛋白质向受体分子胞质结构域的募集，可导致由不同TRAF衔接子分子和具有酶功能的效应蛋白质组成的较大信号传导复合体的装配。许多报道检验到在对TRAF依赖性信号转导的反应中，胞内激酶的激活。特别是已证明，有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的激酶，是含TRAF复合体触发的信号传导通路的关键性因素。这些通路看来以C-Jun(N)氨基未端激酶(JNK)的激活而告终(Reinhard等，1997；Song等，1997)。TRAF蛋白能具有是调节这些受体触发不同信号传递通路的能力，导致蛋白激酶的磷酸化和激活，然后导致Rel和AP-1家族转录因子的激活。

C-Jun转录因子在其氨基端被JNK(一种MAPK信号通路最下游成员)磷酸化(Hibi等，1993)。被JNK激活需要被MAPK激酶(MAPKK，SEK，MEK)所磷酸化。该激酶自身被MAPKKK(MEKK1)所磷酶化，MAPKKK可通过被GCKR(生发中心激酶相关)蛋白磷酸化而激活，GCKR是该通路中最上游激酶(Minden等人，1994；Liu等，1995；Shi和Kehrl，1997)。这些蛋白质之一的显性失活突变(缺乏激酶活性)将阻断TRAF-介导的由TNF/NGFR超家族成员诱导的JNK激活。因此，看来TRAF蛋白以非常邻近的步骤调节JNK活化通路(Liu等，1996；Lee等，1997；Reinhard等，1997)。TRAF2缺陷小鼠的细胞在对TNFα反应中不能激活JNK(Yeh等，1997)。已证明在T淋巴细胞激活过程中JNK介导了CD28的共刺激信号整合(Su等，1994)。综合起来这些结果提示，在TNFR相关分子连接后，CD28共刺激和TRAF介导的共刺激采用了相同的远端信号组分。

TRAF蛋白看来还在调节受体介导的NF-KB激活早期阶段起重要作用(Rothe等，1995b；Cao等1996；Nakano等，1996)。NF-κB包括与Rel癌基因同源的、一个形成二聚体的蛋白家族成员，以它们的二聚体形式起转录因子作用。这些因子普遍存在并参与多个基因表达的调节。虽然在B细胞表达Igκ轻链阶段已鉴定到B细胞中有NF-κB，但主要知道它的作用是一种可诱导的转录激活剂。最著名的是NF-κB起着基本(primary)因子作用，即其活性受到细胞中以它们的非活性形式预先存在分子的活化所诱导，而非其从头合成(这依赖于开启NF-κB基因的可诱导性转录因子)。NF-κB的作用是高度多效的。大多数这些作用具有共同特征，即对胞外刺激应答时被快速诱导。绝大多数NF-κB激活剂是免疫防卫的诱导剂，包括病毒和细菌的成分、调节免疫应答的细胞因子、UV光等。因此受NF-κB调节的许多基因对免疫防卫有贡献(见Blank等，1992；Grilli等，1993；Baeuerle和Henkel，1994，综述)。

NF-κB调节的一个主要特点是，该因子以胞质非DNA结合形成存在，可被诱导而转位至核中，结合DNA并激活转录。NF-κB蛋白质的这种双重(dual)形式受I-κB(含有多个最初在红细胞蛋白质ankyrin中鉴定到的一种结构域的蛋白质家族)的调节(Gilmore和Morin等，1993)。在未受到刺激形式中，NF-κB二聚体与一个I-κB分子(其占据它的胞质位置，防止它与NF-κB结合性DNA序列反应和激活转录)结合。受到其许多诱导剂的作用，I-κB与NF-κB二聚体分离构成了其关键性激活步骤(DiDonato等，1995)。对各种NF-κB诱导剂应答反应而言，迄今对各种NF-κB诱导性因子的应答反应中决定细胞特异性的方式了解很少。

TRAF蛋白质可影响NF-κB的受体介导的激活证据是，已证明显性失活形式的TRAF2可抑制对几种TNFR相关分子(包括TNFR11、CD40、CD30、41BB和0x40)的寡聚化反应中NF-κB的激活(Rothe等，1994，1995b；Duckett等，1997；Arch和Thompson，1998)。然而小鼠基因消除研究未能提示在这些受体之一激活NF-κB中需要特异性TRAF的作用(Lee等，1997；Yeh等1997)。这提示受体结合可能通过一条以上的通路激活NF-κB。

NF-κB最强的诱导剂之一是细胞因子，肿瘤坏死因子(TNF)。存在两种不同的TNF受体：P55和P75受体，二者的表达水平在不同细胞中各不相同(Vandenabeele等，1995)，P75受体优选与细胞结合形式的TNF起反应(TNF表达为II型跨膜蛋白和可溶性蛋白两种形式)而P55受体只对可溶性TNF分子起有效反应(Grell等，1995)。这两种受体的胞内结构域在结构上不相关，结合不同的胞质蛋白。然而，两种受体至少可诱导TNF的部分效应，包括TNF的杀细胞效应和NF-κB的诱导，其特征是细胞特异性的。P55受体能在所有对TNF反应显示这种效应的细胞中诱导杀细胞作用或激活NF-κB。P75-R只在某些细胞中具有此种作用。其他细胞尽管高水平表达P75-R，只在对P55-R刺激应答中显示诱导这种作用(Vandenabeele等，1995)。除TNF受体外，TNF/NGF受体家族的其他不同受体：CD30(McDonald等，1995)、CD40(Berberich等，1994；Lalmanach-Girard等，1993)、淋巴毒素β受体；在几种类型的细胞中Fas/APOl也能诱导NF-κB的激活(Rensing-Ehl等1995)。也能特异地触发NF-κB激活的IL-1I型受体尽管结构上与其不相似、但具有TNF受体的大多数效应。最近已克隆了IL-18受体复合物的新受体亚单位并显示能在对IL-18的反应中引起NF-κB转位和激活(Born等，1998)。IL-1Rrp以及一种IL-1受体家族的新蛋白质，命名为AcPL(Accessory Protein Like)，二者皆为IL-18信号传递所需要。

触发这些不同受体使NF-κB活化是由于诱导了其相关I-κB分子的磷酸化。最近已鉴定了在对促炎症性细胞因子TNF-α或IL-1β的反应中激活的特异性信号转导级联反应的几种成分，一种称为NIK的新的蛋白激酶(NF-κB诱导性激酶)是首次被鉴定(见待批的共同拥有的专利申请WO97/37016，Malinin等，1996)。发现NIK结合TRAF2并激活NF-κB，NIK序列与MAP3K激酶相似，参与对TNF/NGF家族受体和IL-1型受体共同的NF-κB诱导性信号级联反应。TNF-α和IL-1β启动信号级联反应，导致两种IκB激酶：IKK-1[IKK-α]和IKK-2[IKK-β]的激活，在特异性N-末端丝氨酸残基处磷酸化IκB(对IκBα为S32和S36，对IκBβ为S19和S23(见Mercurio F和Manning AM综述，1999)。这些激酶被鉴定为称为IKK信号体(Signalsome)的一种高分子量蛋白复合体的组成成分。

遍在蛋白能缀合酶级联反应的最末端成员，E3遍在蛋白连接酶可选择性地使磷酸化的IκB遍在蛋白化。此信号级联的最后一步，仍与胞浆中的NF-κB相结合的磷酸化和遍在蛋白化的IκB，被26S蛋白酶体选择性降解。此过程暴露出NLS，因而释放NF-κB与胞核输入机(nuclear import machinery)相互作用并转位到胞核中，结合其靶基因启动转录。

IKK信号体其他几种成分的鉴定为受体活化可能与IKK激活相连系的那一种可能机制提供了线索。其中之一是一种称为NEMO的NF-κB基本调节剂，发现这种鼠蛋白是在对所有测试的NF-κB刺激物无反应的HTLV-1Tax转化成纤维细胞的扁平细胞变体中激活NF-κB所必须。(Yamaoka等，1998)。显示NEMO为同源二聚化并直接与IKK2相互反应。Kovalenko等(见待批共同拥有的以色列专利申请123758和126024)独立克隆了同一蛋白质，作为RIP结合蛋白，命名为RAP-2。随后其他二个小组独立克隆了NEMO，作为IKK信号体的非激酶组分。命名为IKKAP-1(Mercurio F等，1996b，Rothwarf DM等1998)。该同一蛋白质还被克隆为E3反应性蛋白，它是一种腺病毒蛋白质，由早期转录区编码，功能是抑制TNF的溶细胞作用，显示能与RIP激酶反应(LiY等，1998)。这些研究提供的证据显示，NEMO介导了NF-κB信号转导通路的基本步骤。三种受体相关蛋白质看来参与了该磷酸化级联反应的启动(见图2说明)当TRAF2高水平表达时，可通过其自身引起NF-κB激活而结合于活化的P75TNF-R(Rothe等1994)、淋巴毒素β受体(Mosialos等1995)、CD40(Rothe等1995a)和CD30(未发表资料)并由它们介导NF-κB的诱生。TRAF2不结合P55TNF受体，也不结合Fas/APOl，然而能结合称为TRADD的P55受体相关蛋白质，而TRADD能结合称为MORT1(或FADD，见Boldin等1995b和1996)的Fas/APOL相关蛋白质。另一称为RIP的含死亡结构域(death domain)的丝氨酸/苏氨酸激酶受体反应性蛋白，也能与TRAF2以及FAS/APOl，TRADD，P55TNF受体和MORT-1反应。因此，虽然RIP最初是与细胞毒性的诱导(细胞死亡)相连系，但它与TRAF2反应的能力也意味着它参与NF-κB激活。

TRAF分子看来参与了导致NF-κ激活的通路。这些相关物看来使P55TNF受体和FAS/APOL触发了NF-κB的激活(Hsu等，1995；Boldin等，1995；Chinnaiyan等，1995；Varfolomeev等，1996；Hsu等，1996)。IL-1受体引起NF-κB激活不依赖于TRAF2，可能涉及TRAF2的同源物-TRAF6和最近克隆的称为IRAK的IL-1受体相关蛋白激酶(Croston等，1995)。已证明TRAF6和IRAK在IL-18诱导的信号传递和功能中起着重要作用(Kanarakaraj等，1999)。

TRAF分子或含死亡结构域的衔接子蛋白的受体募集启动的信号传递级联反应，受到能通过修饰多蛋白复合体组分和/或能阻断蛋白-蛋白相互反应和下游效应器功能而干扰特异性步骤的蛋白质的调节。已鉴定到几种能结合TRAF的胞质分子。其中有A20、c-IAP(凋亡的细胞抑制剂)、TRIP(TRAF反应性蛋白)和I-TRAF/TANK(TRAF反应性蛋白，TRAF家族成员相关的NF-κB激活剂)(Rothe等，1994；Rothe等1995b；Cheng和Baltimore 1996；Lee等1997；Roy等1997)以及其他二种蛋白：一种命名为克隆9，与本发明蛋白质有某些序列同源，另一种命名为克隆15(见待批共同拥有的专利申请WO97/37016)。已证明这些蛋白质各自能至少结合TRAF家族成员、某些还能与之反应。也证明这些反应的功能效应完全不同。这些蛋白质在TRAF依赖的信号转导调节细胞存活的能力中可能是重要的连接。事实上，尚不清楚TRAF如何引起I-κB的磷酸化。也没有关于说明TRAF被不同受体激活(如两种TNF受体诱生NF-κB)所见的细胞特异性方式机制的信息。最近已分辨了人TRAF的TRAF结构域的晶体结构(Park Y.C等1999)，该结构显示TRAF结构域为自身结合(self-association)的三聚体，这为TRAF的募集依赖于其三聚胞外配体对受体的寡聚化提供了基于亲合力的解释。

因此关于NF-κB激活及其在维持细胞存活中的重要性，目前尚未能阐明涉及这种激活的各种胞内通路，例如，各种TRAF蛋白质是如何直接或间接参与。

因此，如目前所知关于TNF/NGF受体家族不同成员和它们的相关胞内信号传递通路，包括各种衔接子，介质/调节蛋白质(简述和参考文献见待批的共同所有的以色列专利申请114615，114986，115319，116588)而言，例如TNF和Fas/APOl配体可对细胞起有益和有害两种作用。例如TNF在器官抗肿瘤和感染因子的防卫时诱导对肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤，增强粒细胞的抗菌活性，对病理损伤康复有贡献，在这些情况下需要TNF诱导的细胞杀伤。然而过量TNF可能是有害的，如已知在许多疾病，如败血性休克、厌食、风湿病、炎症和移植物抗宿主反应中TNF起着主要致病作用，在此类情况下，不需要TNF诱导的细胞杀伤。例如，FAS/APOl配体也具有有益和有害作用。该FAS/APOl配体在T细胞成熟过程中通过其受体诱导了对自身反应性T细胞的杀伤，即在识别自身抗原的T细胞发育过程中将其杀死，从而避免了自身免疫疾病。

此外，各种恶性细胞和HIV感染细胞，其表面具有FAS/APOl受体，因此，可通过其配体或特异性抗体激活此受体，进而激活此受体介导的细胞死亡(凋亡)细胞内通路，而被摧毁。然而，FAS/APOl受体亦可介导有害作用，例如，在伴有肝细胞破坏的急性肝炎等某些疾病中见到的不能控制的组织杀伤。

以上综述，即TNF/NGF家族受体可一方面诱导细胞死亡通路，另一方面诱导细胞存活通路(通过诱导NF-κB)，细胞内这两个相反的通路之间显然存在着精细的平衡。例如，当需要获得对癌细胞或其他感染或患病细胞的最大破坏时，可能需要TNF和/或FAS/APOl配体只诱导细胞死亡通路而不诱导NF-κB。相反，当需要保护细胞时，例如在炎症，移植物抗宿主反应，急性肝炎时，可能需要阻断TNF和/或FAS/APOl配体诱导的细胞杀伤而代之以增强对NF-κB的诱生。同样，在某些病理情况下，可能需要阻断P75TNF受体和IL-1受体介导的胞内信号传递通路，而在其他情况下，可能需要增强这些胞内通路。

发明简述

本发明的一个目的是提供能结合肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)蛋白质的生物活性蛋白质，及其同工型，类似物，片段或衍生物。由于TRAF结合性蛋白质参与了转录因子NF-κB(其由某些TNF/NGF受体以及其他上述已提到的受体所引发)激活的调节或介导，本发明蛋白质通过结合TRAF蛋白可能调节或介导由结合其受体的各种配体所引发的胞内信号传递过程。这些配体，如TNF、CD40配体，FAS配体等和调节剂/介质，可以通过与TRAF蛋白直接或间接反应而激活NF-κB(如TRAF2和TRAF6诱导NF-κB激活，TRAF3抑制NF-κB激活)。

本发明的生物活性蛋白质，及同其工型，类似物，片段或衍生物，同样可能是其他能与TRAF蛋白直接或间接反应的各种其他蛋白质(如FAS/APOL受体，P55TNF受体，P75TNF受体，IL-1受体和其相关蛋白质，如MORT-1，TRADD，RIP)胞内生物活性的间接调节剂/介质。

本发明的另一目的是，提供对上述新颖TRAF结合性蛋白，及其同工型，类似物，片段或衍生物的拮抗剂(如抗体，肽，有机化合物或甚至其某些同工型)，当需要时可用于抑制信号传递过程，或更具体说抑制参与细胞存活过程的NF-κB及其相关物的激活。同样，本发明的TRAF结合性蛋白或它们结合的TRAF蛋白(如TRAF3)本身对NF-κB激活有抑制作用(间接或通过对它们结合的蛋白质的运输或稳定性调节)，本发明的目的是提供对TRAF结合性蛋白激活信号传递过程的拮抗剂，或更具体说，当需要时，提供对阻断NF-κB活化的抑制，因而能增强NF-κB激活的拮抗剂。

本发明另一目的是，采用上述新颖TRAF结合性蛋白质，其同工型，类似物，片段或衍生物来分离和特性鉴定其他可能参与TRAF蛋白活性调节和/或上述受体活性的蛋白质或因子，例如，可结合TRAF蛋白并影响其活性的其他蛋白质；和/或分离和鉴定该信号传递过程，上游或下游，这些新颖蛋白质，类似物，片段和衍生物所结合的、因而也涉及其功能的其他受体或其他细胞蛋白质。

本发明的另一目的还有一个提供能够导入细胞中与该新颖TRAF结合性蛋白及其可能的同工型结合或反应的抑制剂，该抑制剂可抑制例如NF-κB激活中的TRAF蛋白相关活性，因此当需要时，可抑制NF-κB的激活，或该抑制剂可抑制NF-κB激活中的抑制性TRAF相关活性(如TRAF3)，因此，当需要时可增强NF-κB激活。

而且，本发明的一个目的是采用上述TRAF结合性蛋白质，其同工型，类似物，片段或衍生物作为抗原来制备其多克隆和/或单克隆抗体。这些抗体进而可用于例如从不同来源，如细胞抽提物或转化的细胞系，纯化所述新型蛋白质。

更进一步，这些抗体还可用于诊断目的，例如，鉴定与TRAF蛋白直接介导的，或P55TNF受体、FAS/APOl受体或其它相关受体和它们结合的细胞蛋白质(如MORT-1、TRADD、RIP，它们通过与TRAF蛋白反应直接或间接调节/介导胞内过程)介导的细胞效应功能异常相关的疾病。

本发明还有一个目的是提供包含上述新颖IREN蛋白质，其同工型，类似物，片段或衍生物的药物组合物，以及包含上述新颖抗体或其他拮抗剂的药物组合物。

因此本发明提供了能至少结合TRAF2，并对TRAF2具有高度特异性结合能力的一种新颖IREN蛋白质，它是TRAF2胞内活性的调节剂或介质。TRAF2参与至少一个胞内信号传递通路的调节或介导，该通路是细胞存活或生存相关通路，TRAF2直接参与了在细胞存活中起中心作用的NF-κB的激活。

事实上，称为IREN(IκB的调节剂)的这种蛋白质能结合TRAF2，并显然在NF-κB信号传递通路NIK的下游NEMO和IKKI的上游起作用，并增强IκB的IKK1磷酸化。此外，TRAF2由于能直接或间接与上述P55TNF受体、P75TNF受体、FAS/APOl受体和它们的相关蛋白质MORT-1、TRADD和RIP反应，因此也是这些受体引起NF-κB诱生或激活活性的介质或调节剂。故TRAF2是这些受体和它们相关的蛋白质所介导的细胞存活途径的一种调节剂/介质(与细胞死亡途径相反)。这些受体和/或蛋白质与TRAF2之间反应的程度是这些受体活性(一旦被其配体激活)的结局，即细胞是死是活的重要因素。故本发明的蛋白质在TRAF2和其它能与其反应的蛋白质/受体之间的这种反应中起着关键作用，如IREN之类的蛋白质通过与TRAF2的特异性结合而调节其活性，和/或通过与TRAF2反应而调节其自身活性。

如本文所用，TRAF蛋白的活性，如TRAF2的活性包括其调节/介导细胞存活通路的活性，如NF-κB的诱导/激活。同样，如本文所用，TRAF结合性蛋白质，具体是TRAF2结合性蛋白质的活性，包括通过与TRAF(具体是TRAF2蛋白)的特异性结合，调节/介导了TRAF，具体说TRAF2的活性。这种调节/介导包括细胞存活通路的调节/介导，具体说这涉及TRAF蛋白，具体是TRAF2直接或间接参与的NF-κB的激活/诱导。因此可认为IREN是所有上述蛋白质和可能还有参与细胞存活的其他成员的间接调节剂/介质，例如NF-κB激活/诱导和TRAF2(或其他TRAF蛋白质)与NF-κB结合，或TRAF2(或其他TRAF蛋白质)以直接或间接方式与NF-κB反应。同样，TRAF2通过激活Jun激酶级联反应参与AP1转录因子的调节，故IREM在Jun激酶激活通路中或在控制其他基因激活通路(如P38激酶通路)中可能起作用。其在控制TNF所致炎症和其他非凋亡效应中以及在控制凋亡中可能具有重要作用。

更具体说，本发明提供了编码能结合TRAF的蛋白质的DNA序列，其选自：

a)包含图3所示核苷酸序列的本文命名为IREN的cDNA序列；

b)包含图4所示核苷酸序列的本文命名为IREN-10B同工型的cDNA序列；

c)包含图5所示核苷酸序列的本文命名为IREN-E同工型的cDNA序列；

d)编码能至少结合TRAF2氨基酸序列的225-501残基的生物活性蛋白质的(a)—(c)序列的片段

e)在中等严谨条件下能与(a)-(d)之一序列杂交，并编码能至少结合TRAF2氨基酸序列的225-501残基的生物活性蛋白质的DNA序列。

f)与(a)-(e)中限定的DNA序列具有基因密码子简并性(degenerate)并编码能至少结合TRAF2氨基酸序列的225-501残基的生物活性蛋白质的DNA序列。编码由IREN编码的蛋白质的本发明的上述DNA序列的具体例子包括：

(i)编码能结合TRAF2并能调节NF-κB和IREN同工型，其片段或类似物的活性IREN蛋白质、其生物活性同工型、片段或类似物的DNA序列。

(ii)上述(i)的DNA序列选自：

a)衍生自天然IREN蛋白编码区的cDNA序列；

b)在中等严谨条件下能与(a)序列杂交并编码生物活性IREN的DNA序列；和

c)与(a)和(b)中限定的序列具有基因密码子简并性并编码生物活性IREN蛋白的DNA序列。

(iii)如上述(i)或(ii)中的至少含有图3所示序列的一部分并至少编码一种活性IREN蛋白、其同工型、类似物或片段的DNA序列。

(iv)如上述(iii)中编码IREN蛋白、其同工型，类似物或片段的至少具有图3所示部分氨基酸序列的DNA序列。

另一方面，本发明提供上述DNA编码的蛋白质或多肽，它们能结合TRAF2，优选至少能结合TRAF2的225-501氨基酸序列；及这些蛋白质和多肽的同工型、类似物，片段和衍生物。本发明这些蛋白质/多肽的实施例包括：

a)本文命名为IREN的蛋白质；

b)其同工型、片段、类似物和衍生物；和

c)至少具有图6所示部分氨基酸序列的IREN蛋白质、其同工型、类似物、片段和衍生物

另一方面，本发明提供包含本发明上述DNA序列的、能在选自真核和原核细胞的宿主细中表达的载体，以及含有所述载体的转化的真核和原核细胞。

本发明还提供生产本发明上述DNA序列任一所编码的蛋白质、其同工型、类似物、片段或衍生物的方法，该方法包括在适合所述蛋白质、其同工型、类似物、片段或衍生物表达的条件下，培养上述转化的宿主细胞，若需要，可影响翻译后的修饰以获得所述蛋白质、其同工型、类似物、片段或衍生物，并分离所表达的蛋白质、其同工型、类似物、片段或衍生物。

还有一方面，本发明提供对以上TRAF结合性蛋白质、其类似物、同工型、片段或衍生物有特异性的，或对上述IREN蛋白质、其同工型、类似物、片段或衍生物有特异性的抗体或抗体的活性片段或衍生物。

另一不同方面，本发明提供以下筛选方法：

(i)筛选能结合本发明上述蛋白质，包括其同工型、类似物、片段或衍生物的配体的方法。该方法包括使一种其上结合有所述蛋白质其同工型，类似物，片段或衍生物的亲和层析基质与细胞提取物接触，在此配体与所述差异结合，洗脱，分离和分析所述配体。

(ii)筛选编码能结合本发明上述蛋白质、同工型、类似物、片段或衍生物的配体的DNA序列。该方法包括采用酵母双杂交程序，在此程序中一种杂交载体携带有编码所述蛋白质、其同工型、类似物、片段或衍生物的序列，第二杂交载体携带有cDNA或基因组DNA文库的序列，用所述二载体转化酵母宿主细胞，分离阳性转化细胞，抽提所述第二杂交载体以获得编码所述配体的序列。

相类似，本发明还提供分离和鉴定能直接结合TRAF2的本发明上述的蛋白质、其同工型、类似物和片段的方法，该方法采用酵母双杂交程序，此程序中一个杂交载体携带有编码TRAF2的序列，第二杂交载体携带有cDNA或基因组DNA文库的序列，用两载体转化酵母宿主细胞，分离阳性转化细胞，然后抽提所述第二杂交载体以获得编获能结合TRAF2的蛋白质的序列。

本发明还有一方面是提供一种调节或介导细胞内NF-κB活性，或受TRAF2或其他分子(本发明上述蛋白质、同工型、类似物、片段或衍生物)调节和介导的任何其他胞内信号传递活性的方法；所述方法包括通过以适合胞内导入的形式向所述细胞导入一种或多种所述蛋白质、其同工型、类似物、片段或衍生物，或以携带有所述序列的合适载体形式向所述细胞导入编码所述一种或多种蛋白质、其同工型、类似物、片段或衍生物的DNA序列来处理细胞，所述载体以所述序列能在所述细胞中表达所述序列的方式影响所述序列插入所述细胞。

上述调节/介导细胞内NF-κB活性或受TRAF2或其他分子调节或介导的任何其他胞内信号传递活性的方法，其实施例包括：

(i)上述方法中，所述的细胞处理，包括以携带有所述序列的合适载体形式，向所述细胞导入编码所述IREM蛋白质、其同工型、类似物、片段或衍生物的DNA序列，所述载体以所述序列能在所述细胞中表达的方式影响所述序列插入所述细胞。

(ii)上述方法中，所述的细胞处理是用重组动物病毒载体转染所述细胞，包括以下步骤。

a)构造一携带有编码病毒表面蛋白质(配体)的序列的重组动物病毒载体，和构造携带者编码本发明所述IREN蛋白质、同工型类似物、片段和衍生物的第二序列的重组动物病毒载体，该病毒表面蛋白(配体)能结合得处理的细胞表面的特异性细胞表面受体，然后在所述细胞中表达能调节/介导NF-κB活性或受TRAF2或其他所述分子调节/介导的任何其他胞内信号传递活性的分子；和

b)用(a)所述载体感染所述细胞

同样，本发明还提供调节TRAF2所调节/介导的细胞作用的方法，包括用本发明上述的抗体或其活性片段或衍生物处理所述细胞。所述处理是，给所述细胞使用含有所述抗体、其活性片段或衍生物的适当组合物，当所述细胞的IREN蛋白或其部分暴露于胞外表面时配制胞外用的所述组合物；当所述IREN蛋白是胞内所述成份时，配制胞内用的所述组合物。

本发明调节TRAF2所调节/介导的细胞作用的其他方法包括：

(i)用对于编码所述IREN蛋白质DNA序列至少一部分的反义序列的编码寡核苷酸序列，处理所述细胞，这种DNA序列是本发明上述序列之一，所述寡核苷酸序列能阻断所述IREN蛋白的表达。

(ii)如上述(i)的方法中，通过上述重组病毒，将所述寡核苷酸序列导入所述细胞，所述病毒的所述第二序列编码所述寡核苷酸序列

(iii)一种包括使用核酶程序的方法，在此方法中，将编码能与细胞mRNA序列(编码本发明上述IREN蛋白质、同工型、类似物、片段或衍生物)反应的核酶序列，以允许其在所述细胞中表达所述核酶的形式导入所述细胞。当所述细胞表达该核酶序列时，该核酶与所述细胞的mRNA序列反应并切割所述mRNA序列，导致抑制所述IREN蛋白在所述细胞中的表达。

本发明上述方法和实施例中还包括预防或治疗NF-κB诱导相关连的疾病、或受TRAF2或其他分子(本发明蛋白质、同工型、类似物、片段或衍生物能与之结合的)所介导的任何其他活性相关连的疾病的方法；所述方法包括给予需要的病人有效量的本发明蛋白质、同工型、类似物、片段或衍生物，或编码它们的DNA分子，或能破坏所述蛋白质、同工型、类似物、片段或衍生物与TRAF2的相互反应，或能破坏与所述蛋白质、同工型、类似物、片段或衍生物结合的其他分子的相互反应的分子。在本发明此方法中，给予需要的病人本发明的蛋白质可以是IREN编码的蛋白质，或编码其的DNA分子。目前认为IREN编码的蛋白质能调节IKK-1和NIK对NF-κB的诱导。本发明另一方面是提供一种药物组合物来调节TRAF2所调节/介导的细胞的效应，此组合物含有活性组分IREN、其生物活性片段、类似物、衍生物或它们的混合物。

本发明的其他药物组合物或其实施例包括：

(i)一种用于调节TRAF2所调节/介导的细胞效应的药物组合物，其包含本发明编码能结合细胞表面受体的蛋白质和IREN，其生物活性同工型、活性片段或类似物的重组动物病毒载体作为活性组分。

(ii)一种用于调节TRAF2所调节/介导的细胞效应的药物组合物，其包含编码本发明IRENmRNA序列的反义序列的寡核苷酸序列作为活性组分。

上述药物组合物的其他实施例具体是用于预防或治疗NF-κB诱导相关连的疾病或受TRAF2或其他分子(本发明蛋白质、同工型、类似物、片段或衍生物能与之结合的)所介导的任何其他活性相关连的疾病的药物组合物，所述组合物包含有效量的本发明的蛋白质、类似物、同工型、片段或衍生物，或编码它们的DNA分子或能破坏所述蛋白质、类似物、同工型、片段或衍生物与TRAF2的相互反应，或能破坏与所述蛋白质、类似物、同工型、片段或衍生物结合的任何其他分子的相互反应的分子。在另一具体实施例中，所述药物组合物含有有效量的IREN编码的蛋白质，IREN的同工型、类似物、片段或衍生物，或编码它们的DNA分子。

在另一具体的实施例中，本发明提供同于预防或治疗NF-κB诱导相关连的疾病或受TRAF2或受IREN蛋白所结合的任何其他分子所介导的其他活性相关连的疾病的药物组合物。所述的组合物含有能干扰IREN活性的分子。在该组合物中于扰性分子可能是有效量的活性位点残基已突变的IREN。这种突变的IREN作用是干扰天然IREN。

一种已知与NF-κB诱导相关连的状态(异常)是AIDS病，其他还有自身免疫病和肿瘤。

本发明的其他方面内容和实施例是：

(i)一种鉴定或产生能调节受本发明蛋白质、同工型、类似物、片段或衍生物所调节/介导的细胞活性的配体的方法，该方法包括：

a)筛选能结合含有图6所示IREN序列至少一部分的多肽的配体；

b)鉴定和特性分析上述筛选步骤发现的能实现所述结合的配体，除TRAF2或TNF/NGF受体家族某受体的一部分外；

c)以基本分离和纯化的形式产生所述配体。

(ii)一种鉴定或产生能调节受IREN所调节/介导的细胞活性的配体的方法，该方法包括：

a)筛选能结合含有图6所示IREN序列至少一部分的多肽的配体；

c)以基本分离和纯化的形式产生所述配体。

(iii)一种鉴定和产生能直接或间接调节受IREN所调节/介导的细胞活性的配体的方法，该方法包括：

a)筛选能调节受IREN所调节/介导的活性的分子；

b)鉴定和特性分析该分子；和

c)以基本分离和纯化形式产生所述分子。

(iv)一种鉴定和产生能直接或间接调节受本发明蛋白质、同工型、类似物、片段或衍生物所调节/介导细胞活性的分子的方法，该方法包括：

a)筛选能调节受本发明IREN蛋白质、同工型、类似物、片段或衍生物所调节/介导的活性的分子；

b)鉴定和特性分析该分子；和

c)以基本分离的和纯化的形式产生该分子。

本文也提供了本发明的其他方面内容和实施例，如本发明以下详细描述所提供的那样。

应明白，本文中，使用了以下术语“TRAF(或TRAF2)对细胞作用的调节/介导”和本文所述的其他这类“调节/介导”，可理解为包括体内和体外处理，此外还包括抑制或增强/促进。

附图说明

图1.TRAF2分子结构的示意图

图2.某些参与NF-κB激活的蛋白质的示意图

图3A.IREN的5’引物UTR的核苷酸序列(从该序列起始处直到Kozak序列的ATG)在所有3种IREN剪接同工型中是相同的(SEQ.ID NO：3)

图3B.显示IREN(SEQ.ID NO：4)的核苷酸序列

图4.显示IREN-10B(SEQ.ID NO：5)的核苷酸序列

图5.显示IREN-E(SEQ.ID NO：6)的核苷酸序列

图6.显示IREN的氨基酸序列(SEQ.ID NO：7)

图7.显示IREN-10B氨基酸序列(SEQ.ID NO：8)

图8.显示IREN-E氨基酸序列(SEQ.ID NO：9)

图9.显示IREN及其同工型IREN-10B和IREN-E序列之间的比较

图10.显示IKK-1，野生型IREN，NIK和NEMO及它们的突变体，诱导NF-κB激活结果的示意图。

图11.用pcFLAG CHUK(编码小鼠IKK1)和pc20.4(编码MEMO蛋白)，与PCHIS-IRENΔN(pcHIS-IREN_198-541，左泳道)，pcHIS-IREN(中间泳道)一起，或空载体PCDNA3(右泳道)作为对照，转染293细胞后获得的FLAG-IKK1，GST-IkappaB和NEMO的放射自显影图。如实施例3所述进行了免疫沉淀和激酶试验，测定了FLAG-IKK1、GST-IKappB和NEMO的分子量相应可见条带的大小。

图12.从转染细胞免疫沉淀的IREN10B和IREN的SDS-PAGE分析的放射自显影(左)和免疫染色(右)，再进行体外激酶试验。此图表明IREN10B在细胞内与一蛋白激酶结合。此激酶可磷酸化这种IREN剪接变体。

图13.基因数据库分析结果提示这些基因与存在于几个人染色体中的IREN密切相关。

发明详述

本发明涉及本文命名为IREN的cDNA序列(见图3)，它编码了能结合TRAF2的蛋白质，该DNA序列编码了此蛋白质。本发明还涉及IREN的同工型IREN-10B和IREN-E的以cDNA序列(分别见图4和5)。

上述DNA序列和推导的氨基酸序列在DNA或氨基酸序列的“GENEBANK”或“PROTEIN BANK”数据库中没出现。因此它们代表迄今未知的序列。

本发明的范围还包括上述DNA序列的片段和能在中等严谨条件下与这些DNA序列或其部分杂交的DNA序列，只要它们编码能与TRAF2的至少225-501氨基酸结合的生物活性蛋白质或多肽。

本发明也涉及作为上述DNA序列基因编码结果的简并DNA序列，它们能编码至少能结合TRAF2的225-501氨基酸序列的生物活性蛋白质或多肽。

关于TRAF2，应明白TNF/NGF受体家族的几个成员能通过与TRAF2直接或间接结合而激活转录因子NF-κB，因此TRAF2是这些受体的衡接子蛋白，也可以认为是这些TNF/NGF受体诱导NF-κB激活活性的一种调节剂/介质(见图2)。另一受体，IL-1受体可不依赖TRAF2激活NF-κB。本发明产生的IREN类似物或突变蛋白，当这些类似物和突变蛋白在细胞中表达时可调节NF-κB的激活。

故本发明涉及IREN蛋白及其生物活性同工型、类似物、片段和衍生物。和由该蛋白编码的同工型、类似物、片段和衍生物，可用标准方法(见SambrooK等，1998)制备这种类似物、片段和衍生物。标准方法中，在DNA编码序列中可删除，加入一个或多个密码子，或用另一个来替代，产生编码的对天然蛋白至少有一个氨基酸改变的类似物。可接受的类似物是那些至少保留了结合TRAF2能力的但不能或能介导任何其他结合活性或酶促活性的类似物，如能结合TRAF2但不传递信号，即不再结合下游蛋白或其他因子，或不催化信号依赖性反应的类似物。以这种方式可产生具有所谓显性失活效应的类似物，即在结合TRAF2上或在上述结合后的后续信号传递上有缺陷的类似物。例如可用这种类似物来抑制CD40，p55TNF和p75TNF(FAS/APOl)和其他有关的受体的作用。以及通过与天然IREN蛋白竞争，影响到上述各种受体相关蛋白(衔接子)所介导的作用。同样，也可产生所谓的显性阳性(dominant-positive)类似物，其作用是增强TRAF2作用。它们具有比天然TRAF2结合性蛋白质相同或更佳的TRAF2结合性能、和相同或更佳的信号传递性能。在类似物一类中，可如上所述以类似物制备形式制备本发明克隆的生物活性片段。本发明DNA序列的合适片段是编码保留了TRAF2结合能力的或能介导上述任何结合活性或酶促活性的蛋白质或多肽的那些DNA片段。因此就类似物而言，可以制备具有上述显性失活或显性阳性作用的本发明编码蛋白质的片段。同样，可通过标准方法修饰这些蛋白质、其类似物或片段的一个或多个氨基酸残基的侧链基团，或将这些蛋白质、其类似物或片段与另一分子，如抗体、酶、受体等偶联，来制备衍生物，这是本领域众所周知的。

本发明编码TRAF2结合性蛋白质IREN、其生物活性同工型、类似物、片段或衍生物的上述DNA序列，作为本发明的一个实施例，还包括能与天然TRAF结合性蛋白质编码区产生的cDNA序列杂交的DNA序列，这种杂交在中等严谨条件下进行，该可杂交的DNA序列编码生物活性的TRAF结合性蛋白。

这些可杂交的DNA序列包括，与天然IRENcDNA序列，和选择代表代表TRAF结合蛋白样序列相对高度同源的序列，它们可是，例如，编码各种IREN同工型的天然衍生序列，或天然存在的属检编码IREN的TRAF结合蛋白样序列的编码蛋白序列。进一步，这些序列也可例如包括非天然存在的，合成产生的序列，它们与天然的IRENcDNA序列类似，但包括一些所需的修饰。这样的合成序列包括编码都具有TRAF结合蛋白活性的IREN类似物，片段和衍生物的所有可能的序列。

如本文所用，严谨条件是杂交实验中所用温度、杂交溶液中单价阳离子摩尔浓度和甲酰胺百分浓度的函数(function)。为确定某给定系列条件所涉及的严谨程度，人们先采用了Meinkoth等(1984)的公式来确定100％同一性杂交的稳定性，表示为DNA-DNA杂交的解链温度Tm：：

Tm＝81.5℃+16.6(LogM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L

其中，M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中G和C核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分浓度，L是杂交物的碱基对长度。从100％同一性杂交计算，Tm每减少1℃，允许的错配序列数量增加约1％。因此，如果某给定杂交实验在特定的盐浓度和甲酰胺浓度时所用Tm低于按Meinkoth公式100％杂交计算的Tm值10℃，即使错配序列高达10％，杂交仍将发生。故“高严谨度条件”是，其Tm不低于发生与靶序列形成完全的二聚体时的Tm(或用以上公式计算或实际测定)10℃以上的那些条件。“中等严谨度条件”是，其Tm不低于发生与靶序列形成完全的二聚体时的Tm(或用以上公式计算或实际测定)20℃以上的那些条件。不受限制，高严谨度条件(低于计算或测定的杂交Tm 5-10℃)和中等严谨度条件(低于计算或测定的杂交Tm 15-20℃)的例子，在低于计算的杂交Tm的适当温度下采用2XSSC(标准柠檬酸盐水)和0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)洗涤液。最高严谨条件主要是洗涤条件。特别是如果所用的杂交条件使在形成稳定的杂交的同时也允许形成不大稳定的杂交。较高严谨度的洗涤条件去除了不大稳定的杂交。常用的杂交条件，采用上述高严谨至中等严谨度的洗涤条件，是在低于Tm约占20—25℃温度下在6xSSC(或6xSSPE，标准磷酸盐水-EDTA)，5xDenhardt试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性片段化的鲑精DNA溶液中杂交。如果采用混合的探针，宜采用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC(Ausubel，1987，1999)

为了获得上述各种天然IREN样序列，可采用各种组织的天然DNA或RNA样品，用天然IREN cDNA或其一部分作为探针，进行标准的筛选和分离方法(见Sambroo K等，1989建立标准方法)。

同样，为制备上述IREN的各种合成的编码类似物、片段或衍生物的TRAF结合性蛋白样序列的类似物、片段或衍生物，可采用一些标准方法，如本文以下制备这种类似物、片段和衍生物所详述的那样。

“基本上对应于”IREN的多肽或蛋白质，不仅包括IREN本身也包括IREN类似物的多肽或蛋白质。

基本上对应于IREN的类似物是其中IREN的氨基酸序列有一个或多个氨基酸被其他氨基酸所替代、缺失和/或插入的那些多肽，只要所产生的蛋白质显示与IREN有着基本上相同或更高的生物活性。

为了基本上对应于IREN，该蛋白质(如同工型)序列中的变化通常相当小。虽然变化的数量可能超过10个，优选不多于10个变化，更优选不多于5个，最优选不超过3个这些变化。虽然可采用任何技术来寻找基本上对应于IREN的潜在的生物活性蛋白，一种这样的技术是在编码该蛋白DNA上使用任何技术来寻找基本上对应于IREN的潜在的生物活性蛋白，一种技术是在编码该蛋白DNA上使用常规诱变技术来产生一些修饰。然后可筛选这些克隆所表达的蛋白质结合TRAF蛋白(如TRAF2)的能力，和在上述胞内通路的调节/介导中调节TRAF蛋白(如TRAF2)活性的能力。

“保守性”变化是预计不会改变蛋白质活性的那些变化，通常先筛选出预计不会实质性改变该蛋白质的大小、电荷或构象，因而预计不会改变其生物性能的那些变化。

IREN的保守性替代，包括多肽中至少一个氨基酸残基被一不同氨基酸保守性替代的类似物。这种替代宜按表1A提供的名单进行，通过常规实验可确定那种替代可提供结构功能性质改进的合成多肽分子，同时保留IREN的特征性生物活性。

表1A

原先的残基	代表性替代
原先的残基	代表性替代	丙氨酸	甘氨酸，丝氨酸
精氨酸	赖氨酸	丙氨酸	甘氨酸，丝氨酸
精氨酸	赖氨酸	天冬酰胺	谷氨酰胺，组氨酸
天冬	谷氨酸	天冬酰胺	谷氨酰胺，组氨酸
天冬	谷氨酸	半胱氨酸	丝氨酸
谷氨酰胺	天冬酰胺	半胱氨酸	丝氨酸
谷氨酰胺	天冬酰胺	谷氨酸	天冬氨酸
甘氨酸	丙氨酸，脯氨酸	谷氨酸	天冬氨酸
甘氨酸	丙氨酸，脯氨酸	组氨酸	天冬酰胺，谷氨酰胺
异亮氨酸	亮氨酸，缬氨酸	组氨酸	天冬酰胺，谷氨酰胺
异亮氨酸	亮氨酸，缬氨酸	亮氨酸	异亮氨酸，缬氨酸
赖氨酸	精氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸	亮氨酸	异亮氨酸，缬氨酸
赖氨酸	精氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸	甲硫氨酸	亮氨酸，酪氨酸，异亮氨酸
苯丙氨酸	甲硫氨酸，亮氨酸，酪氨酸	甲硫氨酸	亮氨酸，酪氨酸，异亮氨酸
苯丙氨酸	甲硫氨酸，亮氨酸，酪氨酸	丝氨酸	苏氨酸
苏氨酸	丝氨酸	丝氨酸	苏氨酸
苏氨酸	丝氨酸	色氨酸	酪氨酸
酪氨酸	色氨酸，苯丙氨酸	色氨酸	酪氨酸
酪氨酸	色氨酸，苯丙氨酸	缬氨酸	异亮氨酸，亮氨酸

另外，IREN的其他替代基团，是多肽中至少一个氨基酸残基被除去，在其位置上按照表1B插入了一个不同的残基的那些替代。多肽中可进行的替代类型可根据不同物种同源蛋白之间氨基酸变化频率的分析，如表1-2中Schulz等提供的那样(GE“蛋白结构原理”，Springer-Verlag，New York，NY，1978)和Creighton，T.E“蛋白质：结构和分子性能”(W.H.Freeman & Co，SanFrancisco，CA 1983)的图3-9。根据这种分析，其他的保守性替代本文定义为以下5组之一中的氨基酸互换：

表1B

1.脂肪族，无极性或低极性α残基：丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸(脯氨酸，甘氨酸)

2.极性带负电残基和其酰胺：天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺

3.极性带正电残基：组氨酸，精氨酸，赖氨酸

4.脂肪族无极性大残基：甲硫氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸(半胱氨酸)；和

5.芳香族大残基：苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸。

上表括号内的三个氨基酸残基在蛋白结构中具有特殊作用。甘氨酸是唯一缺乏任何侧链的残基，使其链有可屈曲性，这倾向促进二级结构而非α螺旋的形成。脯氨酸由于其异常的几何形状，紧紧约束了该链，一般倾向于产生β转角样结构，在某些情况下半胱氨酸可能参与二硫键的形成，这在蛋白折叠中是重要的。Schulz等(同上)将上述组1和组2合并。还有酪氨酸，由于其氢键潜能而具有与丝氨酸和苏氨酸等显著相近的性质(kinship)。

如上所述本发明的保守性氨基酸替代是本领域熟知的，预计氨基酸替代后仍保留了该多肽的生物和结构特性。本发明的大多数缺失和替代不会使蛋白质或多肽分子的特征产生实质性变化。“特征”性变化以非包容性方式定义为二级结构，如α螺旋或β片层两者变化和生物活性的变化。例如，结合TRAF蛋白质和/或介导TRAF蛋白对细胞死亡效应的变化。

产生本发明可用于获得IREN类似物的蛋白质的氨基酸替代例子，包括任何已知的方法步骤：美国专利RE33653，4959314，4588585和4737462(授与Mark等)；5116943(授与Koths等)；4965195(授与Namen等)；4879111(授与Chong等)；和5017691(授与Lee等)；赖氨酸取代的蛋白质见美国专利4904584(Shaw等)。

除了上述讨论过不会明显改变IREN活性的保守性替代外，能导致IREN类似物生物活性提高的保守性替代或较不保守和更加随机的变化也属于本发明的范围内。

当要验证替代或缺失的确切效果时，本领域技术人员懂得可通过常规结合试验和细胞死亡试验来评价替代，缺失等的效果。用这类标准试验进行筛检不需要过多实验。

通常在编码IREN的DNA中进行核苷酸定点诱变，在基因水平上制备这些类似物，由此产生编码该类似物的DNA，然后在重组细胞培养物中合成该DNA并表达多肽。这些类似物通常显示出与天然存在的蛋白质相同的或质量提高的生物活性，Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublications and Wiley Interscience，New York，NY，1987-1995；Sambrook等，分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor NY，1989。

可通过编码较早制备的类似物或天然形式IREN的DNA的位点特异性诱变，来制备编码本发明的IREN突变蛋白、或编码相同的多肽但由于已知的基因密码简并性所允许的变化而与天然序列不同的其他核苷酸序列。位点特导性诱变可通过使用编码所需突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列、以及足够数目的毗连核苷酸，以提供大小和序列复杂性足以在待跨越的缺失连接处两侧形成稳定的二聚体的引物序列，来产生类似物。通常优先引物长20~25个核苷酸，在待改变的序列各侧5-10个互补核苷酸。位点特异性诱变技术是本领域熟知的，一些出版物如Adelman等，DNA 2：183(1983)有举例说明，其公开的内容纳入本文作为参考。

大家知道位点特异性诱变技术通常采用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包括例如由Messing等Third ClevelandSymposium on Macromolecules and Recombinant DNA，A.Walton编著，Elsevier，Amsterdam(1981)所述的M13噬菌体载体，其公开内容纳入本文作参考。这些噬菌体易商购获得，其用途为本领域技术人员所熟知。另外，含有单链噬菌体复制起点的质粒载体(Veira等Meth Enzymol 153：3 1987)也可以用于获得单链DNA。

通常首先获得其序列中含有编码有关多肽的DNA序列的单链载体来进行本发明的定点诱变。用自动化DNA/寡核苷酸合成法合成制备带有所需突变序列的寡核苷酸引物。然后使该引物与含蛋白序列的单链载体退火和经受DNA聚合酶如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段的作用，完成突变链的合成，这样，突变序列和第二链带有所需突变。然后用此异源二聚体载体转化适当的细菌，如大肠杆菌JM101细胞，挑选出含有重组载体(带有突变序列排列)的克隆。

选出这种克隆后，可取出突变的IREN序列，将其置于适当的载体中，一般为可用来转染适当宿主类型的转运或表达载体。

因此采用已知的DNA或RNA扩增技术，如PCR和寡核苷酸化学合成，可在体外原位和/或体内检测、获得和/或修饰编码IREN蛋白的基因或核酸。PCR通过重复DNA聚合酶反应可扩增(数量增加)特异性DNA序列。可用该反应作为克隆反应的替代，所需要的就是要知道核酸序列。为了进行PCR，需设计与感兴趣序列互补的引物，用自动化DNA合成产生这些引物。因为可设计能与该基因任何部分杂交的引物，故可创造条件使互补碱基对错配能被耐受，这些错配区域的扩增可能导致诱变产物的合成，产生具有新性能的肽(即定点诱变)。参见Ausubel，同上第16章。也可用逆转录酶将互补DNA(cDNA)合成与PCR联合，可用RNA作为合成促乳素(prolactin)受体胞外域的起始材料而无须克隆。

PCR引物的涉及需包含新的限制性酶切位点或其他特征，诸如待扩增的基因区段的末端的末端密码子。这种在被扩增范围序列5′和3′端的限制性酶切位点的安置对于编码IREN蛋白或片段来说，是为连接载体中其他序列或克隆位点所定身设计的。

PCR和其他扩增RNA和/或DNA的方法是本领域熟知的，根据本文的说明和指导用于本发明而无须过多实验。已知的DNA或RNA扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)和有关的扩增方法(参见美国专利4683195，4683202，4800159，4965188(Mallis等)；4795699和4921794(Tabor等)；5142033(Innis)；5122464(Wilson等)；5091310(Innis)；5066584(Gyllensten等)；4889818(Gelfand等)；4994370(Silver等)；4766067(Biswas：4656134(Ringold)；和Innis等编著“PCR Protocols：A Guide to Method andApplications)和采用针对靶序列的反义RNA作为双链DNA合成的模板进行RNA介导的扩增(美国专利5130238，授与Malek等，商品名NASBA)；和将DNA扩增与抗体标记联合运用的免疫PCR(Ruzicka等，Science 260：487，1993)；Sano等，Science 258：120，1992：Sano等，Biotechniques 9：1378，1991)这些专利和参考文献的全部内容均纳入本文作参考。

就TRAF结合性蛋白质而言，可如上所述以类似物方式制备IREN的生物活性片段或其同工型。TRAF结合性蛋白质的合适片段，是保留了TRAF结合性蛋白的能力和能直接或间接介导TRAF蛋白或与TRAF蛋白相关的其他蛋白的生物活性的那些片段。因此，可制备具有上述类似物那样的显性失活或显性阳性效应的IREN片段。应明白这些片段代表了本发明的一种特异类型的类似物，即它们是全长IREN序列或其同工型衍生的IREN部分，每一这样的部分或片段均具有上述所需活性之一种，这种片段可能是一种肽。

同样可用标准方法修饰IREN、其类似物或片段的一个或多个氨基酸残基的侧链基团，或将IREN、其类似物或片段与另一分子，如抗体、酶、受体等偶联来制备衍生物，这是本领域熟知的，因此本文的“衍生物”包括可用本领域已知方法，从残基的侧链功能基团或N-或C-末端基团制备的衍生物，这包括在本发明中。衍生物可以具有化学基团如碳水化合物或磷酸根，只要这种组分具有与IREN蛋白相同或更高的生物活性。

例如，衍生物可包含羧基的脂族酯，羧基与氨、或与伯胺、仲胺反应产生的酰胺，氨基酸残基的游离氨基与酰基(如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物，或游离羟基(如丝氨酰或苏氨酰残基的羟基)与脂酰基形成的O-酰基衍生物。

术语“衍生物”只包括那些没有一个氨基酸改变为二十个常见天然存在氨基酸之另一个的衍生物。

IREN蛋白是一种由氨基酸残基序列组成的蛋白质或多肽。包含了本文定义的整个IREN蛋白序列的较长序列组成的多肽，包括在这种多肽范围内，只要加入的氨基酸不影响本发明蛋白质的基本和新的特性，即如果它们保留或提高了IREM的生物活性；或可将它们切断产生具有IREN生物活性的蛋白质或多肽。例如本发明包括含有IREN与其他氨基酸或肽融合的蛋白质。

如上所述，应理解本发明的IREN、同工型、片段、衍生物、突变蛋白等，是胞内结合和/或介导/调节任何TRAF蛋白活性的蛋白质。具体说，是能如上所述调节或介导TRAF2相关胞内信号传递活性，特别是在TRAF2和TNF/NGF受体家族各成员或它们的相关衔接子蛋白(如上和如下详述)之间相互反应后，涉及TRAF2调节NF-κB活性的那些蛋白质。本发明的IREN及其各种同工型、类似物、片段等(见实施例)看来能非常特异性地结合TRAF2，并对调节NF-κB活性起作用。以及IREN显性失活类似物/突变蛋白也能调节这种活性。

本发明范围中所提供的所有上述已提高的修饰保护了所编码的蛋白质、或多肽或它们的类似物和衍生物至少结合TRAF2的225-501氨基酸序列的能力。

本发明的所有蛋白质和多肽由于其结合TRAF2的能力被视为TRAF2信号传递的介质或调节剂。因此本发明所述分子在例如TRAF2配体结合CD30、CD40、淋巴毒素β(LT-β)受体、P55或P75TNF受体以及上述已提到的其他受体和衔接子蛋白的信号传递过程中具有作用，导致转录因子NF-κB的激活。特别令人感兴趣的是本发明的IREN蛋白及其同工型。

这种新颖的克隆、蛋白质、其类似物、片段和衍生物具有许多可能的用途，例如：

(i)在需要调节功能的情况下，例如抗肿瘤或免疫刺激应用等需要诱导TRAF2效应时，它们可用于调节NF-κB活性、及它们所结合的TRAF2和受体的功能。此时也可用已知的标准方法，将本发明蛋白质、其类似物、片段或衍生物导入细胞来调节TRAF2或受体的作用。例如，因为本发明DNA克隆编码的蛋白质是胞内蛋白，应将它们导入需要TRAF2作用的细胞中，故需要一种专用于将这些蛋白质导入细胞的系统。做此事的一种方法是构造一种重组动物病毒，例如，牛痘苗衍生的病毒。可将以下两种基因导入牛痘病毒的DNA中：编码能结合细胞所特异性表达的表面蛋白质，如AID(HIV)病毒的gp120蛋白质(它能特异性结合某些细胞：CD4淋巴细胞和有关白细胞)的配体的基因；或能特异性结合携带有受体(结合TRAF2)的细胞的其他配体的基因，这样该重组病毒载体将能结合这些细胞：和本发明基因编码的蛋白质。这样，病毒表面表达了细胞表面结合蛋白，将把该病毒特异性导向肿瘤细胞或其他带有受体的细胞，然后该蛋白的编码序列通过病毒导入细胞，一旦在细胞中表达将增强此受体或TRAF2的作用，在这些细胞中导致所需的免疫刺激作用。可通过标准方法(见Sambrook等，1989)构建这种重组动物病毒。另一种可能性是以寡核苷酸形式导入蛋白质编码序列，可被细胞吸收和表达。

(ii)它们可用于调节NF-κB的活性、TRAF2或其结合的受体的作用，例如当AIDS中发生组织损伤、败血性休克、或移植物抗宿主排斥时，此时需要阻断已诱导的胞内信号传递。在此情况下，例如可能以标准方法向细胞导入具有本发明蛋白的反义编码序列的寡核苷酸，它将有效地阻断编码此蛋白的mRNA的翻译，从而阻断其表达导致对不良效应的抑制。另外，可使用其他寡核苷酸，即能以干扰其他分子与此蛋白结合的方式保持其结合TRAF2的能力，同时不介导该分子的任何激活或调节的寡核苷酸。因具有这些特性，所述分子能破坏TRAF2与其天然配体的相互作用，因此起着抑制剂作用，能消除TRAF2介导的效应，如NF-κB的激活。可用上述重组病毒(该重组病毒所携带的第二序列是寡核苷酸序列)方法将此种寡核苷酸导入细胞中。

另一种可能性是利用针对本发明蛋白质的特异性抗体来抑制这些蛋白质的胞内信号传递活性。抑制不良效应的另一种方法是采用最近开发的核酶方法。核酶是能特异性切割RNA的催化性RNA分子。可对核酶作基因工程改造来切割所选出的靶RNA，例如编码本发明蛋白质的mRNA。这种核酶具有针对该蛋白的mRNA的特异性序列，能与其反应(互补结合)然后切割此mRNA，导致该蛋白表达下降(或完全丧失)，表达水平的下降取决于靶细胞中核酶的表达水平。为了将核酶导入所选的细胞(如携带有IREN蛋白的细胞)可使用任何合适的载体，如质粒、动物病毒(逆转录病毒)载体，它们常用于此目的(也参见上述(i)，其中该病毒含有编码所选核酶序列的cDNA作为第二序列)(关于核酶的综述，方法等参见Chen等，1992；Zhao和Pick，1993)

(iii)它们可用于分离、鉴定和克隆能结合它们的其他蛋白质，如参与TRAF2下游胞内信号传递过程的其他蛋白质。例如，编码本发明蛋白质的DNA序列可用于酵母双杂交系统，此系统中将编码的蛋白质用作“诱饵”来分离、克隆和鉴定cDNA或基因组DNA文库中的能结合该克隆的蛋白质的其他序列(捕食的)的编码蛋白质。以相同方法也可确定本发明蛋白质能否结合其他细胞蛋白质，如TNF/NGF受体超家族的其他受体。

(iv)该编码的蛋白质、其类似物、片段或衍生物也可用于分离、鉴定和克隆同样类型的其他蛋白质，如那些能结合TRAF2或功能相关蛋白质并参与胞内信号传递的蛋白质。在此种应用中，可采用上述酵母双杂交系统或可用最近开发的使用非严谨性Southern杂交再进行PCR克隆的系统(Wilks等，1989)。

(v)运用本发明编码的蛋白质、其同工型、类似物、片段或衍生物的另一方法是在亲和层折方法中使用它们来分离和鉴定它们能结合的其他蛋白或因子，例如，与TRAF2相关的蛋白或参与细胞内信号传递的其他蛋白和因子。在此种应用中，本发明的蛋白质其同工型、类似物、片段或衍生物可分别连接于亲和层析基质上，然后与细胞抽提物或怀疑参与胞内信号传递的分离的蛋白质或因子接触，亲和层析后可洗脱、分离和特性分析结合本发明蛋白质、其类似物、片段或衍生物的其他蛋白质和因子。

(vi)如上述，本发明的蛋白质、其类似物、片段或衍生物还可用作免疫原(抗原)来产生其特异性抗体。也可用这些抗体，从细胞抽提物或产生它们的转化细胞系中，纯化本发明蛋白质、其类似物或片段。这些抗体还可用于诊断目的，以鉴定与该受体系统功能异常(如TRAF2诱导的细胞效应活性过高或低下)相关的疾病。这类疾病应与本发明蛋白质所涉及的胞内信号传递功能障碍相关，故这些抗体可作为重要诊断工具。术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合性抗体、抗独特型(anti-Id)抗体。可以可溶性或结合形式标记抗体及其片段，如缺乏完整抗体Fc段的Fab和F(ab′)₂片段，它们能结合抗原。

(vii)本发明有用的抗体及其片段可用于定性或定量检测样品中本发明的克隆，或检测表达本发明克隆的细胞是否存在。这可采用荧光标记抗体结合光学显微镜，流式细胞计数或荧光分光检测的免疫荧光技术来实施。

本发明有用的抗体及其片段可用于免疫荧光或免疫电镜进行组织学原位检测本发明的克隆。可采集病人的组织标本，在该标本中加入本发明的标记抗体进行这种原位检测。宜向生物样品施涂或覆盖的形式加入标记抗体(或片段)来提供抗体(或片段).通过应用此法，不仅可能测定该克隆的存在，还可了解其在所检查组织中的分布。可采用本发明普通技术人员不难懂得的改进的各种各样组织学方法(如染色法)，以实现这种原位检测。

本发明克隆的这种试验一般包括在能鉴定该编码蛋白质的标记抗休存在下培育生物样品，如生物液体、组织抽提物、新鲜收获的细胞(如淋巴细胞或白细胞)或已在组织培养中的细胞，并以本领域熟知的许多技术之一检测该抗体。

(viii)本发明编码的蛋白质凭借其结合其他胞内蛋白的能力也可用作许多其他蛋白的间接调节剂，该其他胞内蛋白直接结合的还有其他胞内蛋白或跨膜蛋白的胞内结构域。

为了调节这些其他胞内蛋白或跨膜蛋白的胞内结构域，可将本明蛋白质以(ii)中所述许多方法导入细胞中。还应明白可用一种熟知的标准筛选方法进行本发明蛋白质的分离鉴定和特征分析。例如，这些筛选方法之一，酵母双杂交方法可用于鉴定本发明的蛋白质。同样可采用其他方法，如亲和层析、DNA杂交等本领域熟知的方法来分离鉴定和特征分析本发明的蛋白质，或分离、鉴定和特征分析能结合本发明蛋白质的其他蛋白质、因子、受体等。

而且，可以上述和下述采用本发明蛋白质的类似方式来使用所发现的能结合本发明蛋白质的蛋白质，以分离、鉴定和特征分析能结合本发明结合性蛋白质的蛋白质的其他蛋白质、因子等，和可代表参与相关信号传递过程还要下游的因子，或可能具有它们的信号传递活性而因此代表参与不同信号传递过程的蛋白质。

可通过任何标准的重组DNA方法(见Sambrook等1989)产生本发明的DNA序列及编码蛋白质，在此法中用含有这些蛋白质的编码序列的适当的真核或原核载体转化适合的真核或原核宿主细胞。因此本发明还涉及到产生本发明蛋白质的这类表达载体和转化的宿主。如上所述，这些蛋白质也包括它们的生物活性类似物、片段和衍生物，编码它们的载体也包括编码这些蛋白质的类似物和片段的载体，转化的宿主包括产生这些类似物和片段的那些宿主。这些蛋白质的衍生物是通过对该蛋白质或其类似物或片段进行标准修饰，由转化的宿主产生的衍生物。

本发明还涉及调节TRAF2介导的效应的药物组合物，该药物组合物含有任一种或多种以下活性成分：

(i)亚克隆入一适当表达载体的本发明的一种或多种DNA序列及其部分；

(ii)本发明的蛋白质、其生物活性片段、类似物、衍生物或它们的混合物

(iii)编码本发明蛋白质、其生物活性片段、类似物或衍生物的重组动物病毒载体。

该药物组合物可用于治疗疾病，对病人的有效量取决于体重和其他因素，由医师决定。

如上所述，本发明TRAF结合蛋白的一个具体实施例是TRAF2-结合蛋白IREN。根据本发明的发现是：IREN能特异性地与TRAF2结合，并因而是TRAF2的介质/调节剂，因此IREN能够介导/调节TRAF2在NF-κB激活过程中的活性，所以它在细胞存活途径中可能通过TRAF2独立地或与其他蛋白质(如p55TNF和p75 TNF受体、FAS/APOl受体、MORT-1、RIP和TRADD)一起发挥功能而起作用。基于本发现，按需要设计出能够增强或抑制TRAF2-IREN相互作用的药物是至关重要的。例如，当需要调节TNF所诱导的细胞毒性时，就可以通过调节TRAF2-IREN的相互作用或通过特异性地调节TRAF2和/或IREN，从而调节NF-κB的诱导作用。同样，例如当需要调节TNF所诱导的细胞毒性时，就可以通过调节TRAF2-IREN的相互作用或通过调节TRAF2和/或IREN对NF-κB的特异性诱导，从而调节NF-κB的诱导作用。这类药物对许多疾病有很大帮助。这其中(请参见上面的论述)包括：急性肝炎，其中对肝脏的急性损伤似乎反映了在受FAS配体诱导之后FAS/APOl受体所介导的肝脏细胞死亡情况；自身免疫所诱导的细胞死亡，例如会导致糖尿病的胰腺βLangerhans细胞死亡；在移植物(如肾脏、心脏和肝脏)排斥中的细胞死亡；在多发性硬化症中的脑少突胶质细胞死亡；和艾滋病抑制的T细胞自杀，这造成了艾滋病病毒的增殖并导致艾滋病的产生。

IREN或其一种或多种可能的具有生物学活性的同工型、类似物或片段，可能作为IREN本身或IREN-TRAF2相互作用的“天然”抑制剂，并因此可以作为对NF-κB激活作用的抑制剂。因此，这些调节剂可用作如上所述的特异性调节剂，例如在需要增加TNF细胞毒效应时所使用的调节剂。事实上，正如下面例示的那样，根据本发明已经分离出了各种不同的IREN类似物和突变蛋白，它们能够调节NIK、NEMO和IKK-1及其片段所介导的对NF-κB激活的诱导作用。以及阻断细菌内毒素(LPS)、佛波醇豆蔻酸乙酸酯(phorbolmyristate acetate)、HTLV-1蛋白TAX所介导的诱导作用。同样，还可筛选其他物质如肽、有机化合物、抗体等，以获得能够抑制TRAF2-IREN相互作用或IREN活性的特异性药物。

按类似方式，在如上所述的各种需要调节NF-κB激活作用的情况下，可以通过例如本文上述的各种标准方法(例如将编码IREN和/或TRAF2的DNA引入细胞以调节表达，或者制备合适的含有IREN和/或TRAF2的制剂以便直接引入细胞，或者通过本领域技术人员所知的任何其他方法)，来调节IREN和/或TRAF2在细胞中的数量。同样，还可筛选其他物质如肽、有机化合物等，以获得能够增强IREN活性或增强TRAF2-IREN相互作用的特异性药物。

一种如何来设计和筛选IREN-TRAF2相互作用的肽调节剂的、不起限定作用的例子，是根据早先对ICE或ICE样蛋白酶的肽抑制剂、ICE的底物特异性的研究结果以及通过肽合成技术进行表位分析的策略。已发现，ICE有效切割某个肽的最低要求，涉及在切割位点左侧的4个氨基酸，并且在P1位置强烈优选天冬氨酸和在P1位的右侧有足够的甲胺(Sleath等人1990；Howard等人，1991；Thornberry等人，1992)。此外，一种缩写为Ac-DEVD-AMC的荧光团底物肽(四肽)乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-a(4-甲基-香豆酰-7-酰胺)，对应于一段聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的序列，此底物在FAS-R刺激和其他调亡过程(Kaufmann，1989；Kaufmann等人，1993；Lazebnik等人，1994)之后不久就发现其在细胞中被切割，而且该底物可被CPP32(CED3/ICE蛋白酶家族的一个成员)和MACH蛋白酶有效地切割。

因为在底物P1位的天冬氨酸显得很重要，所以第四个氨基酸残基为天冬氨酸并且在前3个残基位置上有各种不同组合的四肽，便可以被快速地筛选是否能结合于蛋白酶的活性位点，例如采用Geysen开发的技术(Geysen，1985；Geysen等人，1987)，在该技术中对位于固相载体上的大量肽进行筛选，确定它们是否与抗体有特异性的相互作用。MACH蛋白酶与特异性肽的结合，可用本领域技术人员技能范围之内各种熟知的检测方法(例如放射标记法)来进行检测。已表明，Geysen的这种方法能够在每个工作日至少测试4000种肽。

按类似的方式，能够阐明TRAF2与IREN之间(或任何其他TRAF蛋白与TRAF结合蛋白之间)相互作用的准确的结合区域或者同源区域，然后可以筛选能用于阻断该相互作用的肽，例如合成的、序列类似于结合区域或互补于结合区域的肽，从而使该肽能够与天然IREN(或TRAF2结合蛋白)竞争与TRAF2(或TRAF)的结合。

由于设计能够选择性地抑制TRAF2-IREN(或TRAF-TRAF结合蛋白)之间的相互作用，而不干扰胞内信号传导途径所涉及的其他成员(例如细胞死亡途径中的MACH蛋白酶，它是CED3/ICE蛋白酶家族的成员)的生理性细胞死亡过程的肽抑制剂是有利的，所以可进一步合成在分析(例如上述的某种分析)中能结合于TRAF2(或TRAF)或IREN(或IRAF-结合蛋白)的肽库，以便作为荧光底物肽来测试与这些其他蛋白质的选择性结合情况，从而选择出仅对TRAF2/IREN(或TRAF/TRAF-结合蛋白)特异结合的种类。例如，然后，经确定对TRAF2/IREN特异的肽可以被修饰以提高细胞通透性并可逆或不可逆地抑制TRAF2和/或IREN的活性。Thornberry等人(1994)报道了一种四肽(酰氧基)甲基酮Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH₂OC(O)-[2，6-(CF₃)]Ph，它是ICE的强失活剂。类似地，Milligan等人(1995)报道，具有氯甲基酮基团的四肽抑制剂(不可逆地)或具有醛基团的四肽抑制剂(可逆地)，会抑制ICE。此外，已表明苄氧基羧基-Asp-CH₂OC(O)-2，6-二氯苯(DCB)可抑制ICE(Mashima等人，1995)。因此，按类似方式，可以用例如醛基、氯甲基酮、(酰氧基)甲基酮或CH₂OC(O)-DCB基团，对选择性地结合于例如TRAF2或IREN的四肽进行修饰，以产生TRAF2/IREN活性的肽抑制剂。此外，为了提高通透性，例如可以对肽进行化学修饰或衍生处理，以提高它们通过细胞膜的通透性，并协助将这些肽运送通过细胞膜而进入细胞质。Muranishi等人(1991)报道了用月桂酸对促甲状腺素释放激素进行衍生处理，形成了一种亲脂的、具有良好的通过细胞膜性能的月桂酰衍生物。Zacharia等人(1991)还报道，将甲硫氨酸氧化成亚砜并用其酮亚甲基异酯(COCH2)(ketomethylene isoester)代替肽键，以帮助肽转运通过细胞膜。这些方法仅仅是本领域技术人员技能之内的、已知的修饰和衍生方法中的一部分而已。

此外，能够抑制例如IREN活性(通过抑制IREN-TRAF2相互作用、TRAF蛋白和TRAF-结合蛋白之间相互作用等)的药物或肽抑制剂，可以与协助进入细胞的分子进行偶连或复合，

美国专利No.5,149,782公开，可以将待运输通过细胞膜的分子与膜共混剂偶连在一起，这些膜共混剂有例如融合多肽、形成离子通道的多肽、其他膜多肽、和长链脂肪酸如肉豆蔻酸和棕榈酸。这些膜共混剂将分子偶连物插入细胞膜的脂类双分子层中，然后协助它们进入细胞质。

Low等人的美国专利5,108，921回顾了通过受体介导的胞吞机制来跨膜运送分子(例如，但并不仅限于，蛋白质、核酸)的已有方法。这些受体系统包括那些识别下列物质的系统：半乳糖、甘露糖、6-磷酸-甘露糖、运铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白、钴胺传递蛋白(维生素B12)、α-2巨球蛋白、胰岛素和其他的肽生长因子如表皮生长因于(EGF)。Low等人讲授，营养物的受体如生物素和叶酸的受体，可有利地被用于增强通过细胞膜的运输，因为在大多数细胞的膜表面上存在生物素和叶酸受体的信号及多种生物素和叶酸受体并且有相应受体介导的跨膜运输过程。因此，待输送入细胞质的化合物与配体如生物素或叶酸间所形成的复合物，与具有生物素或叶酸受体的细胞膜接触之后，就启动了受体所介导的跨膜运输机制，并从而允许所需的化合物进入细胞。

已知ICE能够容忍P2位置上自由替换，而且这种对自由替换的容忍性被加以利用，以开发强有力的和高选择性的、具有生物素标记的亲和标记物(Thornberry等人，1994)。因此，可以对P2位以及可能可以对四肽抑制剂的N-端进行修饰或衍生处理，例如添加生物素分子，从而提高这些肽抑制剂通过细胞膜的通透性。此外，在本领域中知晓，可以将所需的肽序列与引导肽/信号肽序列融合在一起以产生”嵌合肽”，这样就能够使“嵌合肽”被运输穿过细胞膜而进入细胞质。

正如肽领域的技术人员所知道的那样，根据本发明，TRAF-TRAF结合蛋白的相互作用(如TRAF2-IREN相互作用)的肽抑制剂，包括肽模拟型的药物和抑制剂，它们可以被快速地加以筛选，以确定是否与例如TRAF2/IREN相结合，从而设计出可能更稳定的抑制剂。

还应理解的是，上述的用于协助或增强肽抑制剂被运输穿过细胞膜的相同手段，也可被用于TRAF-结合蛋白，例如IREN，其类似物、其片段或其同种型，以及在胞内发挥它们功效的其他肽和蛋白质。

至于在此处全文中提及的抗体，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、嵌合抗体、针对能够以可溶或固定形式被标记的抗体的抗独特型(抗-Id)抗体、以及用各种已知技术产生的它们的片段，例如(但并不限于)：酶切、肽合成或重组技术。

多克隆抗体是异质的抗体分子群体，它们来自用抗原免疫的动物血清。单克隆抗体含有基本上均质的对抗原特异的抗体群体，该群体含有基本相似的表位结合位点，可用本领域技术人员已知的方法来获得单克隆抗体。参见例如Kohler和Milstein，Nature，256：495-497(1975)；美国专利No.4,376,110；Ausubel等人编，Harlow and Lane，ANTIBODIES：A LABORATORYMANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；和Colligan等人编，CurrentProtocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience N.Y.，(1992-1996)，这些文献的内容都全都在此引用作为参考。这些抗体可以是任何种类的免疫球蛋白，其中包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD和它们的任何亚类。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以在体外、原位或体内进行培养。在体内或原位下生产高效价单克隆抗体，是目前优选的生产方法。

嵌合抗体是这样的分子，该分子的不同部分来自不同的动物物种，例如具有鼠单克隆抗体的可变区以及人的免疫球蛋白恒定区的分子。嵌合抗体主要用于降低应用中的免疫原性以及增加产量。例如在杂交瘤产生的鼠单克隆抗体具有较高效率，但在人中也具有更高免疫原性的情况下，可以使用这种人/鼠嵌合单克隆抗体。嵌合抗体及其生产方法在本领城中是已知的(Cabilly等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3273-3277(1984)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984)；Boulianne等人，Nature，312：643-646(1984)；Cabilly等人，欧洲专利申请125023(1984年11月14日出版)；Neuberger等人，Nature，314：268-270(1985)；Taniguchi等人，欧洲专利申请171496(1985年2月19日出版)；Morrison等人，欧洲专利申请173494(1986年3月5日出版)；Neuberger等人，PCT申请WO 8601533(1986年3月13日出版)；Kudo等人，欧洲专利申请184187(1986年6月11日出版)；Sahagan等人，J.Immunol 137：1066-1074(1986)；Robinson等人，国际专利申请No。WO8702671(1987年5月7日出版)；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443(1987)；Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218(1987)；Better等人，Science 240：1041-1043(1988)；以及Harlow和Lane，ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL，同上)。这些文献全部在此引用作为参考。

抗独特型(抗-Id)抗体是这样的抗体，它识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇。Id抗体的制备，是通过免疫与单克隆抗体来源动物相同物种和基因型的动物(例如小鼠品种)，其中该单克隆抗体就是制备的抗-Id所要针对的。被免疫的动物会识别免疫抗体的独特型决定簇，并通过产生针对这些独特型决定簇的抗体(抗-Id抗体)而进行应答。参见例如美国专利NO.4,699,880，该专利全部在此引用作为参考。

抗-Id抗体还可用作“免疫原”，在另一动物中诱导免疫应答，以产生所谓的抗-抗-Id抗体。该抗-抗-Id抗体与最初诱导抗-Id的单克隆抗体在表位方面会相同。因此，通过使用针对mAb的独特型决定簇的抗体，可以鉴别出表达具有相同特性的抗体的克隆。

因此，本发明生产的针对IREN、其同工型，其类似物、其片段或衍生物的单克隆抗体，可用于在合适的动物如BALB/c小鼠中诱导产生抗-Id抗体。可使用来自该被免疫小鼠的脾细胞，来产生分泌抗-Id mAb的抗-Id杂交瘤。此外，抗-Id mAb还可被偶连于载体如匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)上，然后再用于免疫其他的BALB/c小鼠。来自这些小鼠的血清含有抗-抗-Id抗体，该抗体具有最初单克隆抗体的结合特性，并对上述的IREN蛋白、其类似物、其片段或其衍生物的表位是特异的。

这样，抗-Id mAb就具有它们自有的独特型表位：即结构上与被评价的表位相类似的独特位(idiotopes)，如GRB蛋白-a。

术语“抗体”还包括完整的分子及其片段两者，例如能够结合抗原的Fab和F(ab’)₂。Fab和F(ab’)₂片段缺少完整抗体的Fc片段，能够快速地从循环系统中被清除，并且与完整抗体相比具有更低的非特异性组织结合特性(Wahl等人，J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。

应理解，根据本发明公开的用于完整抗体分子的方法，本发明中有用的Fab和F(ab’)₂以及其他的抗体片段，可用于检测和定量分析IREN蛋白。这些片段通常可使用例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)₂片段)等酶的蛋白酶解切割而产生。

如果一种抗体能特异性地与某分子反应从而使该分子与该抗体结合，那么就称该抗体“能够结合”该分子。术语“表位”指任何分子中能够被抗体识别而且也能被抗体结合的部分。表位或“抗原决定族”通常是由分子表面的化学活性基团如氨基酸或糖的侧链所构成，而且具有特异的三维结构特征和特异的电荷特征。

“抗原”是能够被抗体结合的、并且还能诱导动物产生抗体(该抗体能够结合于该抗原的表位)的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或一个以上表位。上述的特异反应指抗原会以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不会与许多由其他抗原所产生的其他抗体反应，

本发明中所使用的抗体(包括抗体片段)可以定量或定性地检测样品中的IREN蛋白，或者检测是否存在表达本发明中IREN蛋白的细胞。这可以用免疫荧光技术，采用荧光标记的抗体(参见下面)并结合光学显微术、流式细胞计量术或荧光计量术检测来实现。

在组织学上，可使用本发明所用的抗体(或其片段)，如在免疫荧光或免疫电子显微镜中，来原位检测本发明的IREN蛋白。原位检测可这样进行：取一份病人的组织样品，然后将标记的本发明抗体提供给该样品；抗体(或其片段)的提供宜通过将标记的抗体(及其片段)施涂或覆盖在生物样品上。通过使用这一程序，不仅可以确定是否存在IREN蛋白，而且可以确定其在受检组织中的分布。使用本发明，一般技术人员会很容易地知道，各种不同的组织学方法(例如染色程序)都能被加以修改以实现这种原位检测。

这些分析本发明IREN蛋白的方法通常包括：将生物样品如生物液体、组织提取物、新收获的细胞(如淋巴细胞或白细胞)、或在组织培养中孵育过的细胞，与能够鉴别IREN蛋白的可检测标记抗体一起温育，然后用本领域熟知的众多方法中的任一种来检测抗体。

生物样品可以用固相支持物或载体如硝酸纤维素，或者用能够固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白的其他固相支持物或载体来进行处理，然后用合适的缓冲液洗涤该支持物或载体，再根据本发明如上所述的那样用可检测的标记抗体进行处理。再用缓冲液第二次洗涤该固相支持物或载体，以去除未结合的抗体，接着用常规方法检测所述固相载体或载体上所结合的标记的数量。

“固相支持物”、“固相载体”、“固体支持物”、“固体载体”、“支持物”、“载体”指任何能够结合抗原或抗体的支持物或载体。熟知的支持物或载体包括：玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙淀粉酶、天然的或改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁石。对于本发明目的，载体的性质可以是不溶的，或者有某种程度的可溶性。支持物材料几乎可以包括实际上任何可能的结构构型，只要所偶连的分于能够结合于抗原或抗体。因此，支持物或载体的结构可以是球形(如珠)、圆柱形(如试管的内表面或棒的外表面)。或者，表面可以是平坦的，如板、测试条带等，优选的支持物或载体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员会知道可用于结合抗体或抗原的其他合适载体，并且能够通过常规实验来确定这些载体。

如上所述的本发明的某批抗体的结合活性，可以用众所周知的方法进行测定。通过采用常规实验，本领域技术人员能够确定每次测定的操作条件和最佳试验条件。

其他的步骤，诸如洗涤、搅拌、振荡、过滤等，可以被增加到分析方法中，并且这些步骤都是常规的或是具体情况下所必需的。

本发明的抗体能够被标记的一种方法是将该抗体与酶相连，进行酶免疫分析(EIA)。然后，当该酶暴露于合适的底物时，酶会与底物反应，从而产生可被检测(例如通过分光光度分析、荧光分析、或肉眼观察)的化学组分子。能够用于可检测地标记抗体的酶包括(但并不限于)：苹果酸脱氢醇、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸酯脱氢酶、丙糖磷酸酯异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。采用酶的生色团底物，利用比色方法就可以完成检测。检测的实现，还可以通过将酶与底物反应的程度与类似方法制备的标准物进行肉眼比较。

检测还可用各种其他的免疫分析方法实现。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，就可以通过采用放射免疫分析法(RIA)来检测R-PTP酶。对于RIA的全面描述可在Laboratory Techniques and Biochemistry in MolecularBiology，Work，T.S.等人，North Holland Publishing Company，NY(1978)中找到，尤其参见Chard，T.所写的标题为“An Introduction to RadioimmuneAssay and Related Techniques(放射免疫分析和相关技术的介绍)”的章节，该文献在此引用作为参考。放射性同位素可用g计数器或闪烁计数器等设备，或通过放射性自显影而进行检测。

也可以用荧光化合物来标记本发明的抗体。当荧光标记的抗体被暴露于适当波长的光时，就能因荧光而检测出其存在与否。在最常用的荧光标记化合物中，有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、绿脓菌素、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。

抗体还可以用发出荧光的金属如¹⁵²E或其他镧系金属进行标记。可用这些金属的整合基团如二亚乙基三胺五乙酸(ETPA)使之附着于抗体。

还可以通过将抗体偶连于化学发光化合物，对抗体进行可检测标记。然后，带有化学发光标记的抗体的存在与否，可通过检阅在化学反应过程中产生发光的情况而进行检测。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺(luminol)、异鲁米诺(isoluminol)、热吖啶嗡酯(theromatic acridiniumester)、咪唑、吖啶嗡盐(acridinium salt)和草酸酯。

同样，还可以用生物发光化合物来标记本发明抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光，其中催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在，可通过检测发光而加以确定，用于标记用途的重要生物发光化合物是荧光素(1uciferin)、荧光素酶和水母蛋白。

本发明的抗体分子可用于免疫测量分析，也以“双位点”或“夹心分析”为人们所知。在典型的免疫测量分析中，将一定量的未标记抗体(或抗体片段)结合于固体支持物或载体上，然后加入一定量可检测的被标记可溶抗体，从而可以检测和/或定量分析在固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。

典型的(且优选的)免疫测量分析包括“正向”分析法，在该分析法中固定在固相上的抗体先与测试样品接触，从而通过形成二元的固相抗体-抗原复合物而将抗原从样品中取出。在温育合适时间之后，洗涤固相支持物或载体以去除残留的液体样品(包括未反应的抗原，如果有的话)，然后再与含有未知数量的标记抗体(功能为“报道分子)的溶液接触。在第二次温育以便让标记抗体，与通过未标记抗体而结合于固相支持物或载体上的抗原进行复合之后，第二次洗涤固相支持物或载体，以去除未反应的标记抗体。

在另一种“夹心”分析法(该方法可与本发明的抗原一起使用)中，使用所谓的“同时”和“反向”分析。同时分析包括一个简单的温育步骤，因为固定于固相支持物或载体的抗体和标记抗体两者被同时加入到测试样品中。在温育结束之后，洗涤固相支持物或载体以去除残余的液体样品或未复合的标记抗体，然后再像常规“正向”夹心分析那样，测定与固相支持物或载体相连的标记抗体的存在。

在“反向”分析中，按步骤先将标记抗体溶液加至液体样品中，然后在温育适当时间之后，再加入固定于固相支持物或载体的未标记抗体。在第二次温育之后，以常规方式洗涤固相载体，以洗去残余的测试样品和未反应的标记抗体溶液。再象“同时”或“正向”分析那样测定与固体支持物或载体相连的标记抗体。

如上所述，本发明还涉及含有重组动物病毒载体的药物组合物，该载体编码IREN蛋白，还编码能够结合于特定靶细胞(如癌症细胞)表面蛋白的病毒表面蛋白，从而能引导IREN蛋白序列插入到细胞中。本发明作为活性成份的的另一类药物组合物，其中包含：(a)具有编码IREN序列的反义序列的寡核苷酸序列；或(b)阻断IREN蛋白与TRAF相互作用的药物。

本发明的药物组合物含有足够数量的活性成分以达到其所需用途。此外，药物组合物还可含有合适的药学上可接受的载体，其中包括赋形剂和辅助剂，它们可协助将活性化合物加工成可作为药物使用的制剂，并且它们可使制剂给所需对象施用时更稳定。这些都是本领城技术人员所熟知的。

IREN蛋白及其同工型或同种型，被怀疑在不同组织中以明显不同的水平进行表达，而且与各种在胞内信号传导途径所涉及的其他蛋白质的表达相类似的方式，具有不同形式的同种型。这正如在上述共同拥有且都未审定的专利申请中所指出的那样。这些差别可能对FAS/APOl-配体和TNF应答的组织特异性特征有影响。正如其他CED3/ICE同源物(Wang等人，1994；Alnemri等人，1995)，本发明人在以前(在上述的专利申请中)已表明：含有不完整CED3/ICE区域的MACH同工型(如MACH α3)，被发现对共表达的MACH α1或MACH α2分子的活性有抑制作用；它们还被发现可阻断FAS/APOl和p55-R的死亡诱导过程。在细胞中表达这些抑制性的同工型可形成一个细胞自我保护机制，以对付FAS/APOl和TNF介导的细胞毒性。MACH同工型的广泛非均一性(这种非均一性大大超过了CED3/ICE家族中任何其他蛋白酶中所观察到的情况)，应能允许对活性MACH同工型的功能进行极其精细的调节。

根据本发明，已分离出了TRAF-结合蛋白IREN的类似物/突变蛋白。这些IREN类似物/突变蛋白(参见上面的论述和下面的实施例)，例如NF-κB活性调节的缺失的IREN突变体。因此，如上所述，按照它们与TRAF蛋白的相互作用以及它们对TRAF蛋白或TRAF所介导的胞内信号传导所造成的影响，IREN蛋白或有可能其同工型在不同的组织中有不同的效应。

还有可能某些可能的IREN同工型有一些其他功能。例如，IREN或某些IREN类似物或同工型还可作为某些分子的停靠位点起作用，而这些分子是在其他的，例如FAS/APOl和TNF受体通过与TRAF2的相互作用或甚至不依赖TRAF2而发挥非细胞毒效应中所涉及的分子。

因为FAS/APOl和TNF受体独特的能够造成细胞死亡的能力，以及TNF受体能够引发其他导致组织破坏的活性的能力，所以这些受体功能发生异常对生物体就特别有害。事实上，这些受体的功能过度或缺陷都会导致表现出各种病症病理表现(Vassalli，1992；Nagata和Golstein，1995)。鉴别出参与受体信号传导活动的分子并找出调控这些分子活性的方法，就能够指明新的治疗途径。考虑到了TRAF蛋白(如TRAF2)可能的重要作用及在NF-κB激活调节过程中TRAF-IREN的相互作用，设计能够调节TRAF2-IREN相互作用的药物是特别重要的，当需要杀灭细胞(通过抑制NF-κB激活)，与之相反，当需要保留细胞时，(增强NF-κB激活)。

本发明还涉及能够结合于本发明的IREN蛋白并从而能够调控/介导IREN蛋白活性的蛋白质或其他配体。这些蛋白质或配体可用上述的任何方法进行筛选、分离和产生。例如，可以分离出大量新的、能够结合于本发明IREN蛋白的配体(包括蛋白质)(这些新的蛋白质/配体不包括已知的TRAF2和TRAF1)。

正如上面详细论述，这些新的IREN蛋白-结合蛋白/配体如IREN-结合蛋白，可以作为例如IREN所介导的活性或例如TRAF2-IREN相互作用所介导的活性的抑制剂或增强剂，因此它们在上述的各种病理和其他情况中有着重要作用。这些IREN蛋白-结合蛋白/配体的另一功能是作为特异性的试剂用于纯化IREN蛋白，例如通过亲和色谱层析，其中将这些新的结合蛋白/配体附着在合适的层析基质上，形成固相或亲和支持物/基质，然后让含有了如IREN的溶液、提取物等通过，从而以这种方式协助纯化。目前，这些亲和色谱层析方法是本领域中众所周知的并且通常是标准化的工艺。

同样，本发明的所有上述IREN蛋白、其类似物、其片段、其同工型和衍生物，可用于通过亲和色谱层析来纯化各种与它们发生结合的TRAF蛋白。例如，IREN、其类似物、其片段和IREN的突变蛋白(参见下面的实施例)可用于亲和色谱层析纯化TRAF2。

现在结合下面不起限定作用的实施例和附图，更详细地描述本发明。

还应注意下列程序：

i)双杂交筛选和双杂交β-半乳糖苷酶表达测试；ii)蛋白质的诱导表达、代谢标记和免疫沉淀；iii)体外结合；iv)细胞毒性的测定；和v)Northern分析和序列分析，以及在下列实施例中所用的其他程序，在本发明人以前关于其他胞内信号传导蛋白和途径的出版物(参见例如Boldin等人，1995a、1995b和Boldin等人1996)中已有详细描述。这些程序在共同拥有和待批的以色列申请Nos.114615、114986、115319、116588、117932和120367，以及相应的PCT申请No.PCT/US96/10521中也有详细描述。因此，所有这些出版物和专利申请的全部公开内容在本申请中被完全引用而包括，至少只要涉及详细的实验程序时被引用而包括。

实施例

材料和方法

i)cDNA文库

a)B细胞cDNA文库

使用来自人B细胞并用寡聚dT为引物所构建的文库(Durfee等人，1993)，将文库的cDNA插入基于pACT的载体pSE1107的XboI位点中，与GAL4的激活结构域相融合。

b)λgt10睾丸cDNA文库

使用来自人睾丸的cDNA文库。该文库是以随机的六聚核苷酸为引物所建的文库，平均插入片段大小为200-400bp。

ii)酵母菌株

在转化和筛选中使用两种酵母菌株作宿主菌株：HF7c菌株被用于双杂交筛选，SFY526菌株被用于β-半乳糖苷酶分析。两种菌株都携带营养缺陷型标记trp1和leu2，就是说这些酵母菌株不能在缺少色氨酸和亮氨酸的极限合成培养基中生长，除非它们被含有这些基因(TRP1，LEU2)的野生型的质粒所转化。这两种酵母菌株在其GAL4和GAL80基因中带有缺失突变(分别为gal4-542和gal80-538突变)。

SFY526和HF7c菌株在它们的基因型中携带lacZ报道基因，在SFY526菌株中被融合于UAS和GALl启动子的TATA部分，在HF7c中3个拷贝的GAL 417聚体的共有序列和CYCl启动子的TATA部分被融合于lacZ。GAL1UAS和GAL 417聚体都会对GAL4转录激活物作出响应。此外，HF7c菌株携带融合于UAS和GAL1启动子的TATA部分的HIS3报道基因。

iii)人TRAF2的克隆

人TRAF2是从HL60cDNA文库中，通过PCR而克隆到的(对于TRAF2序列和其他细节，请参见Rothe等人，1994；Rothe等人1995a；Cheng等人，1996；Hsu等人1996；和Wallach，1996)。使用的引物是：a)30碱基的正向引物CAGGATCCTCATGGCTGCAGCTAGCGTGAC(SEQ ID No：1)，该引物对应于hTRAF2中从第一个甲硫氨酸(带下划线)的密码子开始的编码序列，并包含带BamHI位点的接头；b)32碱基的反向引物GGTCGACTTAGAGCCCTGTC AGGTCCACAATG(SEQ IDNo：2)，该引物含有hTRAF2基因的终止密码子(带下划线)，并且在接头中有SalI限制性酶切位点。PCR程序是最初变性步骤为94℃，2分钟，随后为30个循环，每个循环为94℃1分钟，64℃1分钟和72℃40秒。扩增出的人TRAF2然后被插入到pGBT9载体的BamHI-SalI位点中，与GAL4 DNA结合域相连。

iv)B细胞文库的双杂交筛选

双杂交筛选是一种用于鉴别与某一特定分子(该分于被用作“诱饵”)有关的因子的技术(参见上述出版物和专利申请中的细节)。在本发明中，被克隆入载体pGBT9的TRAF2被用作诱饵。TRAF2与筛选的B细胞cDNA文库在酵母菌株HF7c中共表达。PCR所克隆的TRAF2是与GAL4 DNA结合域重组的融合蛋白，而被筛选的cDNA文库被融合于pSE1107载体中的GAL4激活结构域。在HF7c中的报道基因是HIS3，它被融合于会对GAL4转录激活物作出响应的GAL1启动子上游的激活序列(UAS)。含有pGBT9和pSE1107两种质粒的转化子会因能在无色氨酸和亮氨酸的手板上生长而被选择出。在第二个步骤中，表达两种杂合蛋白(这两种蛋白会相互作用，从而激活GAL1-HIS3)的克隆，被从平板上挑出，其中该平板不含色氨酸、亮氨酸和组氨酸，并且含有50mM 3-氨基三唑(3AT)。

v)β-半乳糖苷酶分析

按照Clontech Laboratories’s手册(对于细节，可参见上述的出版物和专利申请)，对双杂交筛选中被挑出的阳性克隆，在SFY526酵母细胞中进行lacZ显色测试。简而言之，让转化子在30℃生长2-4天，直到直径达到约2毫米，然后将其转移至Whatman滤膜上，对滤膜进行冻/融处理以使细胞通透化，然后再浸泡在含有0.33毫克/毫升X-gal和0.35mM β-巯基乙醇的缓冲液(16.1毫克/毫升Na₂HPO₄.7H₂O；5.5毫克/毫升NaH₂PO₄.H₂O；0.75毫克/毫升KCl；0.75毫克/毫升MgSO₄.7H₂O，PH＝7)。监视克隆是否显现蓝色，出现蓝色就表示诱导了β-半乳糖苷酶。

vi)克隆cDNA的表达

构建两种表达载体；

a)基于pUHD10-3载体，它含有IREN的开放阅读框(ORF)，并且该ORF与血凝素(Hemeaglutinine，HA)表位相融合。

b)基于pUHD10-3的载体，在该载体中FLAG的八肽序列被正好插入克隆的TRAF2前面，因而被命名为FLAG/B6/TRAF2。

用标准的磷酸钙法(例如在Ausubel F.M.等人编的Current Protocols inMolecular Biology中所述的方法)，将含有IREN的ORF的构建物转染入Hela的HtTA1克隆(对于这些细胞，参见Gossen，M.和Bujard，M.(1992))，该转染或者单独进行，或者是与FLAG/B6/TRAF2进行共转染。

vii)荧光素酶分析

通常，通过用冷PBS洗涤3次，然后再悬浮于400微升抽提缓冲液(0.1MK₂HPO₄/KH₂PO₄，pH＝7.8；1mM DTT)中收获5×10⁵个转染细胞。通过在液氮中冰融3次而使细胞裂解，离心除去细胞碎片(10,000×g，5分钟)。对于荧光素酶分析，将200微升荧光素酶缓冲液(25mM甘氨酰甘氨酸，15mMK₂HPO₄/KH₂PO₄，pH＝7.8，15mM MgSO₄，4mM EDTA，2mM ATP，1mM DTT)加至50微升裂解液中。随后，将100微升0.2mM D-荧光素、25mM甘氨酰甘氨酸、1mMDTT加至反应体系。用Lumitron发光计装置，通过读取10秒内的累积光发射，测定荧光素酶活性(对于其他细节，可参见上述的出版物和专利申请)。

实施例1：IREN的克隆和双杂交试验

用材料和方法(iv)中所述的双杂交技术，从B细胞制备的cDNA文库中筛选与TRAF2相结合的蛋白，只有在既表达了TRAF2又表达了能与TRAF2相互作用的蛋白质的转化子，GAL4 DNA结构域和转录激活结构域才会结合在一起。结果是该报道基因被激活并表达，在该例子中HIS被融合入UAS和GAL1启动子的TATA部分。

筛选到了约2000个能够在Trp^-、Leu^-、His^- 3AT平扳上生长的克隆。从165个随机挑选的阳性克隆中所制备的DNA，被用于与克隆在pGBT9载体中的TRAF2一起瞬时共同转染SFY526酵母菌株，如材料和方法(v)中所述，对转化的SFY526酵母克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析。显现的蓝色表示酵母菌落中含有能编码与TRAF2结合的蛋白质或多肽的cDNA。

根据它们在3AT平板上的生长能力以及在显色测验中所测得的诱导lacZ的能力，鉴别到了能编码新型蛋白IREN的6种独立的克隆。在所检测的阳性克隆中，2个是编码已知蛋白的cDNA；TRAF2本身能够自我缔合并形成同源二聚体，以及淋巴毒素β-受体(已表明：其胞内结构域可结合TRAF2)。

对阳性克隆作进一步的结合特异性试验分析，即分析它们与无关诱饵的相互作用情况。如表2所示，IREN仅与TRAF2和TRAF1反应，而不结合于被分析检验的多种无关蛋白中的任何一种，如核纤层蛋白(lamin)和细胞周期蛋白D(Cyclin D)。IREN也不结合于p55和p75TNF受体的胞内结构域，以及MORT、NIK、NIK突变体_1-400、A20。

为了缩小与IREN相互反应的TRAF2分子的区城，制备了另两个构建物，一个构建物包括TRAF2分子的N端部分，即氨基酸1-224标记为RING_1-224，该部分包括了环指和锌指基序。第二个构建物仅含有TRAF2C末端部分，即氨基酸225-501，它覆盖了“TRAF结构域”和额外的42个氨基酸。在双杂交试验中将这两种构建物用作诱饵。结果清楚地显示，IREN不与含有TRAF2分子1-224位氨基酸的构建物发生作用，但是它们都与含有“TRAF结构域”的C末端的构建物结合，而且与它们结合于全长TRAF2分子有相同效率(表2)。缺失分析表明IREN及其同工型的TRAF2结合区域局限于第198-388位的氨基酸区域(表2)。

表2：IREN相互作用的酵母双杂交试验

诱饵	捕获	相互作用
诱饵	捕获	相互作用	TRAF2	IREN	+++
TRAF2<sub>225-501</sub>	IREN	+++	TRAF2	IREN	+++
TRAF2<sub>225-501</sub>	IREN	+++	RING<sub>1-224</sub>	IREN	-
TRAF2	IREN<sub>1-197</sub>	-	RING<sub>1-224</sub>	IREN	-
TRAF2	IREN<sub>1-197</sub>	-	Lamin	IREN<sub>1-197</sub>	-
TRAF2	IREN<sub>198-388</sub>	+++	Lamin	IREN<sub>1-197</sub>	-
TRAF2	IREN<sub>198-388</sub>	+++	Lamin	IREN<sub>198-388</sub>	-
TRAF2	IREN<sub>398-541</sub>	+/-	Lamin	IREN<sub>198-388</sub>	-
TRAF2	IREN<sub>398-541</sub>	+/-	Lamin	IREN<sub>398-541</sub>	+/-
TRAF2	IREN<sub>198-541</sub>	+++	Lamin	IREN<sub>398-541</sub>	+/-
TRAF2	IREN<sub>198-541</sub>	+++	Lamin	IREN<sub>198-541</sub>	-
TRAF2	IREN 10B	++	Lamin	IREN<sub>198-541</sub>	-
TRAF2	IREN 10B	++	IREN10B	IREN 10B	++
IREN10B	IREN	-	IREN10B	IREN 10B	++
IREN10B	IREN	-	Lamin	IREN 10B	-
Lamin	IREN	-	Lamin	IREN 10B	-
Lamin	IREN	-	CycD	IREN	-
P751C	IREN	-	CycD	IREN	-
P751C	IREN	-	P55IC	IREN	-
MORT	IREN	-	P55IC	IREN	-
MORT	IREN	-	TRAF3	IREN	-
NIK	IREN	-	TRAF3	IREN	-
NIK	IREN	-	NIK1-400	IREN	-
TRAF1	IREN	+++	NIK1-400	IREN	-
TRAF1	IREN	+++	A20	IREN	-
TRAF6	IREN	-	A20	IREN	-

IREN cDNA的开放阅读框编码一个541个氨基酸的蛋白，同时其cDNA也包含有一个与聚腺苷酸一样的短3’端UTR(图3A和图3B)。

IREN开放阅读框的5’端结构域被发现含有一段与另一已知蛋白(ID：U73941，从Rap2结合蛋白的双杂交筛选过程中克隆到的(Janoueix-Lerosey Iet al 1998))以及另外一些数据库中找到的未知蛋白(如两个人类基因KIAA0871、KIAA0842和一个C.Elegans基因ID CAA21666)有同源性的区域。

在IREN的序列中发现有一段存在于51个氨基酸结构域中的肽序列(IDSLSL326-331)，此肽正好也穿越NIK的769-820位氨基酸，它对双杂交试验中IKK-1与NIK的结合及NIK过量表达所引起的NF-κB激活都是必不可少的(数据未显示)。

实施例2：IREN的进一步的研究和功能特性

通过使用一个基于pcDNA3且包含融合有HA表位的IREN开放阅读框的载体，使融合有HA表位的IREN cDNA表达在人肾细胞系293中，然后IREN与抗HA的抗体进行免疫沉淀。

使用标准的磷酸钙方法(方法参照Current protocols in MolecularBiology，eds.Ausubel，F.M，等)，用IREN-HA蛋白转染细胞。然后细胞在含有10％小牛血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培养液中培养24小时。培养时间的末端，细胞溶解于放射免疫沉淀缓冲液中(10mMTris-HCl PH7.5，150mM NaCl，1％Nonident P-40，1％deoxycholate，0.1％SDS，1mM EDTA；1ml/5×10⁵细胞)，用无关的兔抗血清和蛋白G-Sephorose珠(Pharmacia，Sweden)共孵育裂解物，进行预处理。在4℃，用裂解物的上清和抗HA的单克隆抗体(clone12CA5)Field，J等，1988)共孵育一个小时进行免疫沉淀。表达的蛋白进行SDS-PAGE凝胶分析，接着用抗HA的抗体做WesternBlot免疫印迹，该IREN编码的蛋白显示出一条大约60KD的条带。

用报道基因试验研究IREN对NF-κB激活作用。用含有连于荧光素酶报道基因的HIV LTR的pcDNA3载体，与仅含有IREN cDNA的pcDNA3质粒，或与含有编码下列蛋白(IKK-1、全长NEMO、C端缺失的NEMO、NIK、NIK激酶缺陷型突变体(NIK mut)、C端缺失的IREN突变体(IREN_1-197)、或者N端缺失的IREN突变体(IREN_198-541)的任何一种pcDNA3质粒一起共转染293 EBNA细胞。

转染采用上文材料和方法(vii)中所述的标准磷酸钙方法(方法参照Current protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel，F.M，等)。在与鼠IKK-1(即一种NIK酶活性的已知底物(Regnier CH，等1997))一起共转染时，通过荧光素酶试验分析发现人IREN能有效地诱导293细胞的NF-κB活性(见图10)。

在与C端缺失的NEMO突变体(CΔNEMO氨基酸1-309)共转染时，(根据报导，NEMO能阻断JKKs酶促活性(Rothwarf DM等，1988))，发现此共同转染能抑制IREN和IKK1共转染时所诱导的NF-κB活性(见图10)。

IREN和IKK1共转染所诱导的NF-κB活性与全长NEMO和IKK1共表达所诱导的活性相当，NEMO并没有能够进一步加强IREN和IKK1所诱导的NF-κB活性(图10)

与CΔNEMO不同的是：NIK激酶缺陷型突变体(NIK mut，氨基酸参见共同拥有和待批的专利申请WO 97/37016，Malinin等，1996)共转染后，它并不能阻断IREN和IKK1共转染所诱导的NF-κB活性(图10)。

IREN与NIK DNA以2:1倍的比例共表达时，能有效地加强NF-κB的诱导作用。全长NEMO与NIK共表达时，会阻断NIK诱导的NF-κB活性，这种抑制可通过IREN的表达来逆转(图10)。正如早期所述，参见(共同拥有和待批的专利申请WO 97/37016，Malinin et al，1996)，NIK mut能有效地阻断CD120a过量表达所诱导的NF-κB活性，这种作用无法通过IREN的共表达来改变(图10)。

综合上述的实验数据，得出结论：IREN在NF-κB的信号传导途径中发挥作用，在NIK的信号下游和NEMO、IKK1的信号上游发挥着作用，同时也是NIK与IKK-1之间相互作用的一种调节剂。

因此，可以假设：某些缺失型IREN突变体可能会干扰从NIK激酶到NEMO-IKK复合物的信号流。C端缺失突变体IREN_1-197对NIK诱导的NF-κB活性确没有任何影响(数据没列出)。然而N端缺失IREN突变体(IREN△N；IREN_198-541)严重抑制了NIK诱导的NF-κB活性，其抑制程度与NEMO相当。

实施例3：激酶试验

单独用编码鼠IKK1的pcFLAG CHUK转染293-T细胞(2×10⁶)或联合pcNIK或pc20.4(编码NEMO蛋白)或pcHIS-IREN(编码带His标记的IREN)或pcHIS-IREN△N(即pcHIS-IREN_198-541，编码带His标记且N端缺失的IREN突变体：作为显性失活的结构域起作用)转染293-T细胞。培养24小时后收集转染细胞，用裂解缓冲液裂解(缓冲液配方：1％NP-40，50mM Hepes PH7.5，100mM NaCl，10％甘油，1mM EDTA，20mM β-甘油磷酸，20mM PNPP，1mM Na₃VaO₄，1mM NaF，1mM偏亚硫酸氢钠，1mM Bezami dine，1mM DTT，蛋白酶完全抑制剂(Boehringer)。

离心，去除细胞碎片，补加氯化钠到250mM的浓度，蛋白与抗FLAG的单克隆抗体发生免疫沉淀，用含0.1％NP-40和250mM NaCl的裂解缓冲液的洗涤缓冲液充分洗涤，用30μl含有1mg/ml FLAG肽的缓冲液洗脱下来。洗脱液的上清用于体外做激酶反应试验，以大肠杆菌(E.coli)生产的GST-IκB为底物，激酶反应缓冲液中含有50mMβ-甘油磷酸、2mM DTT、20mM MgCl₂、1mMNa₃VaO₄、1mM EDTA/EGTA，同时含有³²P-γATP。通过SDS-PAGE分离该反应物，蛋白的磷酸化可通过曝光于X-射线底片来检测。作为对照，可通过用抗FLAG抗体做Western Blot免疫印迹来检测裂解物中的蛋白量。

N端缺失的IREN突变体被发现是一个显性失活分子，在IREN、IKK1与NEMO共表达时所做的激酶活性试验中，它能阻断IKK1的活性。

IKK1和NEMO都过量表达，而不仅仅是IKK1过量表达，这样能诱导出很强的IKK1激酶活性，这可通过其自身磷酸化和大肠杆菌产生的GST-IκB融合蛋白的磷酸化来检测)。IREN_198-541与IKK1和NEMO共表达，导致了活性的显著降低(图11)，但这并没有影响IKK1和NEMO的表达水平，全长IREN没有这种影响(图11，中列)。

实施例4：IREN-10B和IREN-E的克隆及测序

为了鉴别出IREN的拼接变异体，用IREN的前端600bp作为探针对上文提到的源于MCF7细胞系的噬菌体cDNA文库进行筛选，从两个独立的克隆中鉴别到了似乎是两种不同的IREN变异体。这两种克隆的头5’端1595bp与IREN是一致的，但它们的3’引物端还有一个额外的编码序列。这个区含有一个PX结构域，它是功能未知的一个保守区域(有可能是一个蛋白与蛋白之间相互作用的结构域)，这种结构域在某些信号分子(包括PI3激酶)中也有出现。在克隆10B和克隆E中，该PX结构域的侧面有两段短的同源区。在这两种克隆中，这些区域的下游区域是不同的。两种IREN拼接变异体的比较见图9。

5’端引物UTR的暂时序列(用Kozak序列，从序列的开始到第一个ATG)表明：在IREN和IREN 10B、IREN-E同工型中，这些序列是相同的。

TRAF2的结合区域是位于IREN_198-388处，在所有这三种拼接同工型中都是一致的(见图9所示)。因此，IREN 10B在双杂交试验中也能与TRAF2相互作用。尽管没有观察到IREN的自身连接，但是IREN 10B在双杂交试验中却发生自身连接现象，然而它却不会与IREN相互作用(表II)。

一种IREN 10B的缺失突变体，它缺失了PX结构域，但是却含有一个IREN所没有的卷曲螺旋结构域，所以它也能自身连接，这也暗示了这个卷曲螺旋结构域在IREN 10B自身的相互作用中起到了作用。

实施例5：与IREN 10B和IREN相互作用的蛋白

采用上文所述的酵母双杂交系统，用IREN 10B筛选B细胞文库，目的是为了确定能与IREN 10B相互作用的其他蛋白，结果确定了能与IREN10B强且异性相互作用的三种蛋白。

1)网格蛋白(clathrin)装配蛋白2的mul亚基(AP50，CLAPM1；GENE BANK序列号U36188)，它能与IREN 10B强相互作用，但与IREN仅有微弱的相互作用。

2)FB1或Amida基因，它跟IREN 10B、IREN都能发生特异性的强相互作用。这个基因早先被认为是一个融合在儿童时期前B白血病细胞中的E2A基因上的一段序列(Brambillasca等，Leukemia 13(3)，369-375，1999)。最近发现，它在过量表达时能诱导细胞调亡。它是位于细胞核上的，且参与了神经细胞特异的立即早期基因(Arc基因)的模运输(Irie等，J.Biol.Chem275，(2000)2647-2653)。

3)TRAX基因，它能与IREN 10B发生强相互作用，但与IREN仅有非常微弱的相互作用。这个基因与DNA结合蛋白Translin有高度的同源性，可能参与了Translin的核内定位。(Aoki等，FEBS Lett 401，109-112，1997)。

综合了解了IREN 10B与上述蛋白的特异性的强相互作用后，因而IREN很可能在信号蛋白的控制流中发挥了积极的作用。

实施例6：IREN 10B与一种未知的能磷酸化IREN 10B的激酶发生强相互作用

N端融合有6-HIS标记的IREN 10B和IREN，通过瞬时转染方法转入293T细胞且在其中表达。转染24小时后，用免疫沉淀的方法纯化蛋白。免疫沉淀物进行PAGE分析及用抗HIS的抗体作免疫染色，结果显示两种蛋白的表达水平一样。对两种免疫沉淀物做激酶反应试验，IREN 10B蛋白被强磷酸化，显示了它是结合了一种未知的能以IREN 10B为底物的酶。IREN自身仅仅被微弱的磷酸化，这可能是由于非特异性结合激酶引起的，这暗示了上述的激酶是与IREN 10B的C端序列相互作用，很可能就是其PX结构域，(图2)。

实施例7：IREN可能是一种基因家族的一个成员。

通过在最新的genebank(包含有绝大多数的近乎完整的人类基因组序列)上作BLAST比对分析，结果显示：至少有部分IREN基因拷贝与1个非常紧密相关的同工型，在核苷酸水平上有97-98％的同源性，且定位于5号染色体的几个位置上，它具有保守的外显子结构。在两种同工型中，每一种的外显子4-7都编码氨基酸113-406(与图3B、4、5中的核苷酸序列559-759位相对应，[SEQID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，一一对应])。因此TRAF2结合结构域在4种不同的染色体上都是保守的，而别的外显子只在这些染色体中的一条或两条染色体上存在。这些数据可能显示了：以不同的N端或C端延伸的以多种大小表达的IREN变异体，是作为一类能调节TRAF1或TRAF2依赖的信号传导途径的分子(图13A)。

通过对EST数据库作BLAST比对分析，显示了至少有部分高度保守型的IREN表达在老鼠和牛中。与两种IREN基因同工型(一种是本专利所描述的，另一种是上述所提到的在别的染色体位置上找到的)相对应的ESTs，它们在EST库中都能找得到，这显示了这两种紧密相关的同工型都是活性基因(图13B)。

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序列表

<110>耶达研究发展有限公司(Yeda Research and Development Co.Ltd)

D.沃勒克(Wallach，David)

N.马利宁(Malinin，Nikolay)

I.辛哈(Sinha，Indranil)

S.勒(Leu，Stefan)

<120>IREN蛋白，其制备和应用

<130>399

<150>131719

<151>1999-09-02

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA序列

<400>1

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>143

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

<210>4

<211>1782

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

<210>5

<211>3139

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

<210>6

<211>2873

<212>DNA

<213>homo sapiens

<400>6

<210>7

<211>541

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

<210>8

<211>813

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

<210>9

<211>784

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>9

Claims

1.一种选自以下的蛋白质：

a)图6所示的IREN蛋白；

b)图7所示的IREN-10B蛋白；和

c)图8所示的IREN-E蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA序列。

3.如权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列由图3B所示的核苷酸序列、图4所示的核苷酸序列或者图5所示的核苷酸序列构成。

4.一种含有权利要求2所述DNA序列的载体。

5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体能被真核宿主细胞表达。

6.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体能被原核宿主细胞表达。

7.包含权利要求5所述载体的转化的真核宿主细胞。

8.包含权利要求6所述载体的转化的原核宿主细胞。

9.一种分离和鉴定权利要求1所述的能直接结合TRAF2的蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括采用酵母双杂交程序，在该程序中，一个杂交载体携带有编码所述TRAF2的序列，第二个杂交载体携带有来自cDNA或基因组DNA文库的序列，用此二载体转化酵母宿主细胞并分离转化阳性的细胞，然后提取所述第二杂交载体以获得编码能结合所述TRAF2的蛋白质的序列。

10.一种产生权利要求1所述的蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括在适合所述蛋白质表达的条件下，培养权利要求7-8中任一项所述的转化宿主细胞，如需要，影响其翻译后修饰，以获得所述蛋白质，分离所述被表达的蛋白质。