UA71889C2

UA71889C2 - Модулятори зв'язаного з рецептором tnf фактора (traf), їх одержання та застосування

Info

Publication number: UA71889C2
Application number: UA98105743A
Authority: UA
Inventors: Девід Валлах; Ніколай Малінін; Марк Болдін; Андрєй Ковалєнко; Ігорь Метт
Original assignee: Йєда Рісерч Енд Дівелопмент Ко. Лтд.
Priority date: 1996-04-02
Filing date: 1997-01-04
Publication date: 2005-01-17
Also published as: US8236507B2; SK287889B6; SK287890B6; NO984551L; ATE380866T1; NO327054B1; EP0894130B1; AU2175597A; CA2250085C; CZ299682B6; SK287085B6; BR9708518A; CZ318398A3; JP2000507826A; DE69738370D1; CN1197966C; EA199800885A1; NO984551D0; CZ298866B6; US20090291888A1

Abstract

Послідовність ДНК, що кодує білок, здатний зв'язуватися з молекулою зв'язаного з рецептором фактора некрозу пухлини (TRAF), що TRAF-зв'язують білки, їхні ізоформи, аналоги, фрагменти і похідні, кодовані ДНК-послідовністю, способи одержання ДНК-послідовностей і білків і застосування ДНК-послідовностей і білків.

Description

Опис винаходу

Данное изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим белки, способнье связьваться с

ТКАР2, белкам, кодируемьм ими, и использованию зтих белков и последовательностей ДНК в лечений или предупреждениий патологического состояния, связанного с индукцией МЕ-КВ или с любой иной активностью, опосредованной ТКАРГ2 или другими молекулами, с которьіми связьівается зтот белок.

Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли/фактора роста нерва (ТМЕ/МОР) определяется структурной гомологией между внеклеточньми доменами его членов (Вагап, 1993; Вешіег апа мап Нийеї, 1994; 70 тій еї аї., 1994). Кроме двух рецепторов, ТМЕ-рецептора рб55 и Раз/АРО1, различнье членьї зтого семейства рецепторов не обнаруживают явного сходства структурь! в их внутриклеточньїх доменах. Тем не менее, имеется большое сходство в функции между зтими рецепторами, указьівающее, что они имеют общие пути передачи сигналов. Одним примером такого сходства является способность некоторьїх рецепторов семейства ТМЕ/МОЕ активировать фактор транскрипции МЕ-КВ. Зту общую способность приписьвали способности 12 цитоплазматического белка, которьій активирует МЕ-КВ, связанного с рецептором ТМЕ фактора 2 (ТКАБЕЗ2), связьшваться со структурно непохожими внутриклеточньми доменами некоторьх рецепторов семейства

ТМЕ/МОР. Посредством каких механизмов действует в действительности ТКАБ2 и как координируется его чувствительность к различньім рецепторам, с которьіми он связьвается, неизвестно.

ТКАРБЕ2 является членом описанного недавно семейства белков, назьіваемьх ТКАЕ, которое включаєт в себя несколько белков, идентифицированньїх, например, как ТКАР1, ТКАБ2 (Коїпе, М., УУопд, 8.с, Непгеї, МУ.). апа

Соедаеї, 0. (1994) СеїІ 78:681-692; РСТ рибіїзней арріїсайоп УМО 95/33051), ТКАЕЗ (Спепо, 0. еї аї. (1995)) и

ТКАБб (см. Сао еї аї., 1996ба). Все белки, принадлежащие к семейству ТКАЕ, имеют вьсокую степень идентичности аминокислот в их С-концевьіїх доменах, тогда как, их М-концевье домень! могут не бьть родственньми. Как показано в схематической иллюстрации ТКАРБ2 (Фиг.1), зта молекула содержит мотив с "піпо-Тпдег" ("кольцевой пальцевьй") и два ТЕПА-подобньїх мотива "цинковьїх пальцев" при их С-концевой зоне. (3

С-концевая половина молекульі включаєет район, известньй как "ТКАР-домен", содержащий потенциальньй район лейциновой молний, расположенньій между аминокислотами 264-358 (назьіваемьй М-ТКАР), и другую часть в направлений карбокси-конца домена между аминокислотами 359-501 (назьіваемую С-ТКАБРЕ), которая ответственна за связьівание ТКАЕ с рецепторами и с другими молекулами ТКАЕ с образованием гомо- или о гетеродимеров. с

Активация фактора транскрипции МЕ-КВ является одним из проявлений каскада передачи сигнала, инициируемого некоторьми из рецепторов ТМЕ/МОЕ и опосредованного: (медиируемого) ТКАБ2. МЕ-КВ со включает членьії семейства образующих димерь! белков с гомологией относительно КеіІ-онкогена, которье, в их спе димерной форме, действуют как факторь! транскрипции. Зти факторьї являются широко распространенньіми и участвуют в регуляции зкспрессиий многочисленньх генов. Хотя первоначально идентифицированньй как - фактор, которьій конститутивно присутствует в В-клетках на стадии зкспрессии легкой цепи Ідк, МЕ-КВ известен прежде всего из-за его действия в качество индуцируемого активатора транскрипции. В большинстве известньйх случаев МЕ-КВ ведет себя как первичньій фактор, а именно, индукция его активности является скорее « активацией предсуществующих молекул, присутствующих в клетке в их неактивной форме, чем синтезом его де З помо, которая, в свою очередь, основана на индуцируємьх факторах транскрипции, которне включают ген с МЕ-КВ. Зффектьі МТ-КВ являются в вьісокой степени плейотропньмми. Большинство зтих многочисленньх з» зффектов имеют общие чертьії, заключающиеся в том, что они бьістро индуцируются в ответ на внеклеточньй стимул. Большинство активирующих МЕ-кВ агентов являются индукторами иммунной защитьі, ввлючающими в себя компоненть! вирусов и бактерий, цитокиньі, регулирующие иммунньїй ответ, УФ-свет и другие. Позтому 49 Ммногие генні, регулируемье МЕ-кКкВ, способствуют иммунной защите (см. Віапк еї аї., 1992; Сгій еї аї., 1993; це. Ваецепе апа Непкеї, 1994, обзорьї). - Одной из главньїх особенностей МЕ-кВ-регуляции является то, что зтот фактор может существовать в цитоплазматической не связьівающей ДНК форме, которая может индуцироваться для перемещения в ядро, бо связьівания ДНК и активации транскрипции. Зта двойственная форма белков МЕ-кВ регулируется семейством о 20 белков І-КВ, которне содержат повторьі домена, которьій бьіл первоначально замечен в белке зритроцитов анкирине (Сіїтоге апа Могіп, 1993). В нестимулированной форме димер МЕ-КкВ существует в связи с молекулой с ІКВ, которая заставляеєт его находиться в цитоплазме и препятствует его взаймодействию с последовательностью ДНК, связьивающей МЕ-кВ, и активации транскрипции. Диссоциация 1-КВ от димера МЕ-кВ является решающей стадией его активации многими из индуцирующих его агентов (Оібопаїйо еї аї., 1995). 25 Знание механизмов, которье участвуют в зтой регуляции, все еще является ограниченньм. Также очень мало

ГФ) понятен путь, по которому определяется специфичность клеток в плане чувствительности к различньім индуцирующим МЕ-кВ агентам. о Одним из найболее сильнодействующих индуцирующих агентов МЕ-КВ является цитокин фактор некроза опухолей (ТМЕ). Существуют два различньхх ТМЕ-рецептора, рецепторьі роб и р7уб5. Уровни их зкспрессийи 60 варьируют независимо среди различньїх клеток (Мапдепа-рееіїе еї аїЇ, 1995). р7/б-рецептор отвечаєт преимущественно на связанную с клеткой форму ТМЕ (ТМЕ зкспрессируется как в виде бета-трансмембранного белка, так и в виде растворимого белка), тогда как ро5-рецептор отвечаєт так же зффективно на молекуль! растворимого ТМЕ (Огеї| еї аіІ., 1995). Внутриклеточнье домень зтих двух рецепторов структурно неродственнь и связьівают различнье цитоплазматические белки. Тем не менее, по меньшей мере часть зффектов ТМЕ, в том бо числе цитоцидное действие ТМЕ и индукция МЕ-КВ, могут индуцироваться обоими рецепторами. Зта особенность является клеткоспецифической. Рецептор ро5 способен индуцировать цитоцидньій зффект или активацию МЕ-КВ во всех клетках, которне обнаруживают такие зффекть! в ответ на ТМЕ. р/5-К может иметь такие зффектьї только в некоторьх клетках. Другие, хотя и зкспрессирующие вьісокие уровни р7бБ-К, обнаруживают индукцию зтих зффектов только в ответ на стимуляцию р55-К (Мападепабеегіе еї аї., 1995). Кроме

ТМЕ-рецепторов, различнье другие рецепторьі семейства ТМЕ/МОЕ: СОЗО (Мебопаїд еї аїІ., 1995), СО40 (Вегрегісп еї аї., 1994; І аїтапаси-Сігага еї аІ., 1993), бета-рецептор лимфотоксина и, в немногочисленньх типах клеток, Раз/АРОТ1 (Кепзвіпо-ЕНПІ еї аї., 1995), также способньії индуцировать активацию МЕ-КВ. Рецептор ІІ -1 типа І, также зффективно запускающий активацию МЕ-КВ, имеет также большинство зффектов ТМЕ-рецепторов, /о несмотря на тот факт, что он не имеет структурного сходства с ними.

Активация МЕ-КВ при запуске зтих различньїх рецепторов является результатом фосфорилирования связанньіїх с ним молекул І-КВ. Зто фосфорилирование действует на І-КВ до деградации, которая, найболее вероятно, происходит в протеасоме. Природа киназьі, которая фосфорилирует І-КВ, и ее механизм активации при запуске рецептором все еще неизвестньї. Однако, в последние два года бьіли полученьї некоторье знания в /5 отношений идентичности трех связанньїх с рецептором белков, которне, по-видимому, принимают участие в инициации фосфорилирования (см. иллюстрацию в виде диаграмм на Фиг.2а и 6). По-видимому, белок, названньій ТКАР2М, исходно клонированньй 0. СЗоедаеї и его коллегами (Коїпе еї а/!., 1994), играет центральную роль в активации МЕ-КВ различньми рецепторами семейства ТМЕ/МОР. Зтот белок, которьій при зкспрессийи при вьісоких уровнях сам может запускать активацию МЕ-КВ, связьівается с активированньм ТМЕ-рецептором 2о різ (КоїШе еї аї., 1994), бета-рецептором лимфотоксина (Мозіаіоз еї а!., 1995), СО40 (Коїйпе еї аї., 1995а) и

СО-30 (неопубликованнье даннье) и медиирует индукцию ими МЕ-КВ. ТКАРБ2 не связьвваєтся с ТМЕ-рецептором роб и с Рав/АРОТ, но он может связьваться со связанньмм с рецептором ро55 белком, названньм ТКАОО, а

ТКАБО обладает способностью связьваться со связанньім с Раз/АРО1 белок названньмм МОКТ-1 (или ГАСО - см. Воїаїп еї аі., 199565 и 1996). Другой взаимодействующий с рецептором белок, названньй КІР (см. Запдег еї с аІ.,, 1995), таюке способен взаимодействовать с ТКАБ2, а также с РГаз/"АРО1, ТКАБО, ТМЕ-рецептором роб и

МОКТ-1. Таким образом, хотя КІР связьшвали с индукцией клеточной цитотоксичности (смерти клеток), его і) способность взаймодействовать с ТКАЕ2 подразумеваєт также его участие в активации МЕ-КВ и он, кроме того, может также участвовать в увеличений взайимодействия между Раз/"АРО1, МОКТ-1, ТМЕ-рецептором роб и

ТКАБО с ТКАБР2 в пути, ведущем к активации МЕ-КВ. Зти связи, по-видимому, позволяют ТМЕ-рецептору роб и Ге! зо Базв/АРО1 запускать активацию МЕ-КВ (Нзи еї аї., 1995; Воїдіп еї аЇ., 1995; СПіппадуап еї аї., 1995;

Мапо|отеем еї а!., 1996; Нзи еї а!., 1996). Запуск активации МЕ-КВ рецептором 1-1 имеет место независимо от со

ТКАРЕ2 и может происходить с участием недавно клонированной связанной с рецептором 1-1 протеинкиназь, на со ванной ІКАК (Стгозіоп еї а!., 1995).

Неясно, по какому механизму действует ТКАБ2. Некоторье цитоплазматические молекуль, которье --

Зв СсвязьВваются с ТКАР2, бьіли идентифицировань! (Коїпе еї а/!., 1994; Коїпе еї аї., 19955). Однако, информация об ї- зтих молекулах не дает ключа к пути, по которому ТКАРБ2, которьій сам не обладает никакой ферментативной активностью, запускает фосфорилирование І-КВ. Пока нет также информации о механизмах, которье определяют клеткоспецифический характер активациий ТКАБ2 различньмми рецепторами, наблюдаемьй для индукции МЕ-КВ двумя ТМЕ-рецепторами. «

Кроме вьішеупомянутого, следует отметить, что из различньїх белкююов ТКАЕ, ТКАБ2 связьіваєтся с ро5 з с (СО120а) и р75 (СО01205) ТМЕ-рецепторами, а также с несколькими другими рецепторами семейства ТМЕ/МОБЕ, либо непосредственно, либо опосредованно через другие адапторнье белки, как отмечалось вьіше, например, ;» со ссьілкой на рецептор Раз/АРО1 и адапторнье белки МОКТ-1, ТКАОО) и КІР. В таком (связанном) виде ТКАЕ2 является решающим для активации МЕ-КВ (см. также УМаїЇїасі, 1996). Однако ТКАЕЗ фактически ингибирует активацию МЕ-КВ некоторьми рецепторами семейства ТМЕ/МОЕ (см. Коїпе еї а!., 1995а), в то время как ТКАЕб -І необходим для индукции МЕ-КВ 1І-1 (см. Сао еї а/!., 1996а).

Таким образом, что касается активации МЕ-КВ и ее значения в поддержаниий жизнеспособности клеток, - многочисленнье внутриклеточнье пути, участвующие в зтой активации, до сих пор полностью не вніяснень, о например, как непосредственно или опосредованно участвуют в них различнье белки ТКАР.

Кроме того, как теперь известно, в отношений различньїх членов семейства рецепторов ТМЕ/МОЕ и со связанньїх с ними внутриклеточньїх путей передачи сигнала, включающих различнье адапторньє,

Ге медиаторнье/модуляторнье белки (см. краткие обзорьі и ссьілки, например, в ожидающих одновременного рассмотрения и совместньїх заявках Ізгає! Райепі Арріїсайоп Мов. 114615, 114986, 115319, 116588), ТМЕ и лиганд Раз/АРО1, например, могут оказьівать благоприятньсе и неблагоприятнье действия на клетки. Например, дБ ТМЕ способствует защите организма против опухолей и инфекционньх агентов и способствует вьіздоровлению при повреждениий путем индуцирования гибели опухолевьх клеток и клеток, инфицированньїх вирусом, (Ф, увеличения антибактериальньїх активностей гранулоцитов, и, следовательно, в зтих случаях, индуцируемая ка ТМЕ гибель клеток является желательной. Однако, избьток ТМЕ может бьіть неблагоприятнь/м, и известно, что сам ТМЕ играет важную патогенетическую роль в ряде заболеваний, таких как септический шок, анорексия, бо ревматические заболевания, воспалительнье реакции и реакции "трансплантат против хозяина". В таких случаях ТМЕ-индуцируемая гибель клеток является нежелательной. Лиганд Раз/АРОТ1, например, также имеет нежелательнье и неблагоприятнье зффектьі. Зтот лиганд Раз/"АРО1 индуцирует через его рецептор гибель аутореактивньїх Т-клеток во время созревания Т-клеток, т.е. гибель Т-клеток, которье узнают аутоантигень, во время их развития, и тем самьм препятствуют аутоиммунньм заболеваниям. Кроме того, различнье 65 Злокачественнье клетки и ВиИЧ-инфицированньое клетки несут на их поверхности рецептор Равз/"АРО1 и, следовательно, могут бьіть разрушеньі активацией зтого рецептора его лигандом или специфическими к нему антителами, и, следовательно, активацией внутриклеточньїх путей гибели клеток (апоптоза), медиируемьх зтим рецептором. Однако, рецептор Разв/"АРОЇ1 может медиировать неблагоприятнье действия, например, нерегулируемую гибель ткани, которая наблюдается при определенньїхх заболеваниях, таких как острьй гепатит, бопровождающийся разрушением клеток печени.

В связи с вьішесказанньїм, а именно, с тем, что рецепторьї семейства ТМЕ/МОЕ могут индуцировать пути гибели клеток, с одной сторонь, и могут индуцировать пути вьіживания клеток (через индукцию МЕ-КВ), с другой стороньї, по-видимому, существует тонкое равновесие внутри клетки между зтими противоположньми путями.

Например, когда желательно достижение максимального разрушения раковьїх оклеток или других 70 инфицированньїх или патологических клеток, бьло бь желательно иметь ТМЕ и/или лиганд Раз/АРО1, индуцирующий только путь гибели клеток, без индукциий МЕ-КВ. Напротив, когда желательно защитить клетки, например, при воспалении, реакциях "трансплантат против хозяина", остром гепатите, бьіло бьї желательно ингибировать индукцию гибели клеток ТМЕ и/или лигандом Рав/АРОЇ1 и, вместо зтого, усилить их индукцию

МЕ-КВ. Подобньїм образом, при некоторьїх патологических обстоятельствах бьло бьї желательно ингибировать 7/5 Внутриклеточнье пути передачи сигнала, опосредованнье ТМЕ-рецептором р7/5 и рецептором 1-1, тогда как в других обстоятельствах бьло бьі желательно усиление зтих внутриклеточньх путей.

Целью данного изобретения является обеспечение новьїх белков, в том числе всех их изоформ, аналогов, фрагментов или производньїх, которье способньі связьіваться с белками, связанньми с фактором некроза опухолей (ТКАР). Поскольку белки ТКАЕ участвуют в модулирований или медиированиий активации фактора 2о транскрипции МЕ-КВ, которьій инициируется некоторьіми рецепторами ТМЕ/МОБЕ, а также другими, как отмечено вьше, нове белки данного изобретения путем связьшания с белками ТКА способньії, следовательно, к влиянию (модулированию или медиированию) на внутриклеточнье процессь! передачи сигнала, инициируемье различньіми лигандами (например, ТМЕ, лигандом РАЗ и другими), связьівающимися с их рецепторами, такому как, например, их модулирование/медиирование активации МЕ-КВ через прямое или опосредованное с взаймодействие с белками ТКАБЕ.

Таким образом, новье белки данного изобретения представляют собой прямье модуляторь/медиаторь і) внутриклеточной активности белков ТКАБ (например, индукции активациий МЕ-КВ ТКАБ2 и ТКАЕб и ингибирования активации МЕ-КВ ТКАЕЗ).

Новье белки данного изобретения являются также непрямьми модуляторами/медиаторами б зо Внутриклеточной биологической активности многочисленньїх других белков, которье способнь взаймодействовать с белками ТКАБ прямо или опосредованно (например, рецептора ЕГАБЗ/АРО1, со

ТМЕ-рецептора р55, ТМЕ-рецептора р75, І -1-рецептора и связанньїх с ними белков, таких как, например, со

МОТ-1, ТЕАОО, РІР).

Другой целью данного изобретения является обеспечение антагонистов (например, антител, пептидов, -- Органических соединений или даже некоторьх изоформ) по отношению к новьім ТКАР-связьвающим белкам,в (М том числе к их изоформам, аналогам, фрагментам и производньім, которье могут бьїть использовань! для ингибирования процесса передачи сигнала или, более конкретно, для ингибирования активации МЕ-КВ и его участия в процессах вьіживания клеток, когда зто желательно. Подобньім образом, когда ТКАР-связьівающие белки данного изобретения или белок ТКАРЕ, с которьім они связаньі! (например, ТКАЕЗ) сами являются « ингибирующими для активации МЕ-КВ, целью является обеспечение антагонистов к зтим ТКАБ-связьівающим з с белкам для активации процесса передачи сигнала или, более конкретно, для блокирования ингибирования активации МЕ-КВ и, следовательно, вьізьівания усиленной активации МЕ-КВ, когда зто желательно. ;» Следующей целью данного изобретения является использование вьішеупомянуть!х новьх

ТКАР-связьивающих белков, их изоформ, аналогов, фрагментов и производньїх, для вьіделения и характеристики дополнительньїх белков или факторов, которьіе могут участвовать в регуляции активности -І белка ТКА и/или вьшеупомянутой рецепторной активности, например, других белков, которье могут связьшваться с белками ТКА и влиять на их активность, и/или для вьіделения и идентификации других - рецепторов или других клеточньїх белков далее по ходу или ранее по ходу процесса (процессов) передачи о сигнала, с которьіми зти новьіе белки, аналоги, фрагменть! и производнье связьіваются и, следовательно, в функционирований которьх они также участвуют. со Еще одной целью данного изобретения является обеспечение ингибиторов, которне могут бьіть введень в

Ге клетки для связьивания или взаймодействия с новьіми ТКАР-связьвающими белками и их возможньми изоформами, причем зти ингибиторь! могут действовать путем ингибирования связанной с белком ТКА активности, например, в активации МЕ-КВ и, следовательно, если желательно, путем ингибирования активации дв о МЕ-КВ; или которье могут действовать путем ингибирования ингибирующей связанной с ТКАЕ активности (например, ТКАЕЗ) в активации МЕ-КВ и, следовательно, путем усиления активации МЕ-КВ. (Ф, Кроме того, целью данного изобретения является применение вьішеупомянутьїх новьїх ТКАР-связьиівающих ка белков, их изоформ и аналогов, фрагментов и производньїх в качестве антигенов для получения Кк ним поликлональньїх и/или моноклональньх антител. Антитела, в свою очередь, могут бьїть использовань,, бо например, для очистки новьїх белков из различньх источников, таких как клеточньюе зкстракть! или трансформированнье клеточнье линии.

Кроме того, зти антитела могут бьть использованьь для диагностических целей, например, для идентификации нарушений, связанньїх с аномальньмм функционированием клеточньїх зффектов, медиируемьсмх непосредственно белками ТКАЕ или опосредованньїх ТМЕ-рецептором ро5, рецептором РАБ/АРО1 или другими 65 родственньми рецепторами и их ассоциированньми клеточньми белками (например, МОКТ-1, ТКАБО, КІР), которье действуют прямо или опосредованно, модулируя/медиируя внутриклеточнье процессь! через взаймодействие с белками ТКАБЕ.

Следующей целью данного изобретения является обеспечение фармацевтических композиций, содержащих вьішеупомянутье новье белки ТКАЕ, их изоформь или аналоги, фрагментьіь или производнье, а также фармацевтических композиций, содержащих вьішеупомянутье антитела или другие антагонисть.

В соответствии с данньім изобретением бьл вьіделен ряд новьіїх ТКАБ-связьвающих белков, в частности,

ТКАР2-связьивающих белков. Зти ТКАБ2-связьвающие белки имеют вьісокую специфичность связьввания с

ТКАБ2 (см. Примерь! ниже) и, следовательно, являются модуляторами или медиаторами внутриклеточной активности ТКАБ2. ТКАБ2 участвует в модулирований или медиирований по меньшей мере одного 7/0 ВНутриклеточного пути передачи сигнала, являющегося путем, связанньм с вьїживаниєм клеток или с жизнеспособностью клеток, в котором ТКАРБ2 прямо участвует в активации МЕ-КВ, которьій играет центральную роль в вьїживаний клеток. Фактически, один из зтих новьїх белков, назьіваемьй МІК ("индуцирующая МЕ-КВ киназа"), связьівается с ТКАЕ2 и стимулирует активность МЕ-КВ. МІК является киназой, обладающей сходством последовательности с несколькими киназами МАРКК (см. ниже). Кроме того, ТКАБ2, будучи способньм взаймодействовать прямо или опосредованно с вьішеупомянутьми ТМЕ-рецептором р55, ТМЕ-рецептором р75, рецепторами РАБ/АРОТ и их ассоциированньми белками МОКТ-1, ТКАОО и КІР, является также медиатором или модулятором индукции или активации активности МЕ-кВ, связанной с зтими рецепторами. Следовательно,

ТКАРБЕ2 является модулятором/медиатором путей вьіживания клеток (в противоположность путям гибели клеток), медиируемьїх зтими рецепторами и их ассоциированньми белками, и степень взаимодействия между зтими 2о рецепторами и/или белками с ТКАБР2, как таковая, является важньмм фактором в результирующей активности зтих рецепторов (при активации их лигандами), а именно, в том, вьіживут или погибнут данньюе клетки. В соответствии с зтим, белки данного изобретения, например, МІК, играют ключевую роль во взаймодействий

ТКАР2 и других белков/рецепторов, с которьіми взаймодействует ТКАБ2, так как белки, такие как МІК, путем специфического связьншвания с ТКАБЕ2 будут модулировать его активность и/или будут иметь модулированную сч ов активность в результате взаиймодействия с ТКАБ2.

ТКАР-связьвающие белки, такие как, например, ТКАРБ2-связьвающие белки, в том числе МІК, бьіли (8) вьіделеньї и клонировань!ї с использованием двухгибридной системь!ї, частично или полностью секвенировань и охарактеризованьь и, как подробно описано ниже, являются, по-видимому, вьісокоспедифическими

ТКАР2-связьюающими белками и, следовательно, специфическими модуляторами/медиаторами ТКАБЕ2. Ге! зо В примененийи далее ко всему описанию, под активностью белка ТКАРЕ, например, под активностью ТКАБ2, подразумевают его активность в модулированиий/медиирований пути вьживания клеток, в частности, со относящуюся к индукции/активации МЕ-Кв. Подобньмм образом, в применениий ко всему описанию, под со активностью ТКАР-связьивающих белков, в частности, под активностью ТКАРБ2-связьивающего белка, имеют в виду модулированиє/медиированиє ими активности ТЕВАБ-, в частности, активности ТВАБ2, вследствие их 00/77 специфического связьшания ос о ТКАБ белками, в частности, с белком ТКАБ?2, опричем зто ї- модулирование/медиирование включает в себя модулирование/медиирование путей клеточного вьіживания, в частности, относящееся к активации/индукции МЕ-КВ, в которой белки ТКАБРЕ, в частности, ТКАРБ2, участвуют прямо или опосредованно, и ТКАБ- или ТКАЕ2-связьвающий белок как таковой может рассматриваться как опосредованньй модулятор/медиатор всех вьішеупомянутьхх белков и, возможно, других белков, которье « участвуют в клеточном вьіживании, в частности, в активации/индукции МЕ-КВ, и с которими ТКАР2 (или другие с белки) связьіваются или с которьіми ТКАЕ2 (или другие белки) взаимодействуют прямо или опосредованно.

Й Позтому, данное изобретение обеспечивает последовательность ДНК, кодирующую белок, способньй и?» связьіваться с молекулой связанного с рецептором фактора некроза опухолей (ТКАБЕ).

Один вариант последовательности ДНК данного изобретения представляет собой последовательность, Кодирующую белок, способньй связьваться с ТКАР2. -І Другой вариант последовательности ДНК данного изобретения представляет собой последовательность, кодирующую белок, способньй связьшваться по меньшей мере с аминокислотньми остатками 222-501 - аминокислотной последовательности ТЕАБЕ2. о Еще один вариант последовательности ДНК данного изобретения включаєет: (а) последовательность КДНК указанного здесь клона 9, содержащую нуклеотидную последовательность, со изображенную на Фиг.За;

Ге) (Б) последовательность КДНК указанного здесь клона 10, содержащую нуклеотидную последовательность, изображенную на Фиг.4; (с) последовательность КДНК указанного здесь клона 15, содержащую нуклеотидную последовательность, изображенную на Фиг.5а; (4) фрагмент последовательности (а)-(с), которьій кодируеєет биологически активньй белок, способньй (Ф) связьіваться по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501 ТКАБ2; ка (е) последовательность ДНК, способную гибридизоваться с последовательностью (а)-(4) при умеренно строгих условиях, кодирующую биологически активньй белок, способньй связьіваться по меньшей мере с во аминокислотной последовательностью 222-501 ТКАЕ2; и () последовательность ДНК, вьірожденную в результате вьірожденности генетического кода относительно последовательностей ДНК, определенньх в (а)-(е), которая кодирует биологически активньйй белок, способньй связьіваться по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501 ТКАБЕ2.

Другие варианть! вьішеупомянутой последовательности ДНК данного изобретения включают: 65 Последовательность ДНК, вьібранную из последовательностей, содержащихся в указанньїх здесь клонах

КДНК 9 и 15;

Последовательность ДНК, кодирующую белок, которьій также модулирует активность МЕ-КВ; и

Последовательность ДНК, вьібранную из последовательностей, содержащихся в указанном здесь клоне

КДНК 10.

Дополнительньмм предпочтительньм вариантом вьшеупомянутьх последовательностей ДНК данного изобретения является последовательность ДНК, содержащая последовательность, кодирующую белок МІК

Синдуцирующую МЕ-КВ киназу").

Вариантьії вьішеупомянутой последовательности ДНК данного изобретения, кодирующей белок МІК, включают: 70 () Последовательность ДНК, кодирующую белок МІК, его изоформь!і, фрагменть! или аналоги, причем МІК, его изоформь!ї, фрагменть! или аналоги способньі связьуваться с ТКАЕ2 и способньі модулировать активность

МЕ-КВ; (ї) Последовательность ДНК по п. (і) вніше, вьібранная из группьї, состоящей из: (а) последовательности КкДНК, полученной из кодирующего района нативного белка МІК; (Б) последовательностей ДНК, способньїх гибридизоваться с последовательностью (а) в умеренно строгих условиях и кодирующих биологически активньй МІК; (с) последовательностей ДНК, которніе являются виірожденньіми вследствие вьірожденности генетического кода относительно последовательностей, определенньмх в (а) и (Б) и которне кодируют биологически активньй белок МІК; (її) Последовательность ДНК по (ї) или (її, содержащую по меньшей мере часть последовательности, изображенной на Фиг.б, и кодирующую по меньшей мере один активньій белок МІК, изоформу, аналог или фрагмент МІК; (м) Последовательность ДНК по (ії), коюодирующую белок МІК, изоформу, аналог или фрагмент МІК, имеющий по меньшей мере часть аминокислотной последовательности, изображенной на Фиг.б. с

В другом аспекте, данное изобретение обеспечивает белки или полипептидь), кодируемье вьішеупомянутьми кодирующими последовательностями ДНК данного изобретения, изоформь, аналоги, і) фрагменть! и производнье зтих белков и полипептидов, при условийи, что они способнь! связьіваться с ТКАР2, предпочтительно по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501 ТКАР2. Варианть! зтих белков/полипептидов и их изоформ, аналогов, фрагментов и производньїх согласно данному изобретению (ду зо Включают: (а) белок, являющийся белком, кодируемь/м указанньїм здесь клоном 10; со (Б) белок, его изоформьї, фрагментьї, аналоги и производнье, являющиеся белком МІК, его изоформами, со аналогами, фрагментами и производньми, кодируемьми вьішеупомянутьми последовательностями ДНК, кодирующими зтот белок МІК, его изоформьї, аналоги, фрагменть! и производньеє; и -- (с) белок МІК, его изоформьї, аналоги, фрагментьї и производнье, являющиеся белком МІК, его изоформами, ї- аналогами, фрагментами и производньми, кодируемьми вьішеупомянутьми последовательностями ДНК, кодирующими зтот белок МІК, его изоформь), аналоги, фрагментьі и производнье, причем зтот белок, изоформьі, фрагментьї и производнье имеют по меньшей мере часть аминокислотной последовательности, изображенной на Фиг.б. «

Еще в одном аспекте, данное изобретение обеспечиваєт вектор, содержащий любую из вьішеупомянутьмх пт») с последовательностей ДНК данного изобретения, которьіе способнь! зкспрессироваться в клетках-хозяевах,

Й вьібранньїх из прокариотических и зукариотических клеток; и трансформированнье прокариотические и а зукариотические клетки, содержащие зтот вектор.

Данное изобретение обеспечиваєт также способ получения белка, изоформьі, аналога, фрагмента или производного, кодируемьх вьшеупомянутьми последовательностями ДНК в соответствий с данньм -І изобретением, которьій предусматриваєт виіращивание вьішеупомянутьїх трансформированньх клеток-хозяев в условиях, пригодньїх для зкспрессии зтого белка, изоформ, аналогов, фрагментов или производньмх, - вьіполнение пост-трансляционной модификации, если необходимо, с получением зтого белка, изоформ, о аналогов, фрагментов или производньїх и вьіделение зкспрессированного белка, изоформ, аналогов, Фрагментов или производньх. со В следующем аспекте, данное изобретение обеспечивает антитела или их активнье фрагменть! или

Ге) производнье, специфические для ТКАРЕ-связьвающих белков, аналогов, изоформ, фрагментов или производньїх или специфические для белка, изоформьї, аналога, фрагмента или производного МІК, упомянутьсмх вьіше. 5Б В другом аспекте, данное изобретение обеспечивает следующие способь! скрининга: (ЇЇ Способ скрининга лиганда, способного связьіваться с белком данного изобретения, описанньім вьіше, в (Ф, том очисле со его изоформами, аналогами, фрагментами или производньми, предусматривающий ка контактирование матрикса аффинной хроматографии, к которому присоединен зтот белок, изоформа, аналог, фрагмент или производное, с клеточньїм зкстрактом, в результате чего зтот лиганд связьівается с матриксом, и бр Ззлюцию, вьіделение и анализ зтого лиганда. (її) Способ скрининга последовательности ДНК, кодирующей лиганд, способньй связьшваться с белком, изоформой, аналогом, Фрагментом или производньм данного изобретения, упомянутьми вьіше, предусматривающий применение дрожжевого двухгибридного способа, в котором последовательность, кодирующая зтот белок, изоформу, аналог, производное или фрагмент, несет один гибридньій вектор, а б5 последовательности из библиотеки кКДНК или геномной ДНК несут второй гибридньїй вектор, трансформацию дрожжевьїх клеток-хозяев зтими векторами, вьіделение позитивно трансформированньїх клеток и зкстракцию второго гибридного вектора для получения последовательности, кодирующей зтот лиганд.

Также обеспечен способ вьделения и идентификации белков, изоформ, аналогов, фрагментов в соответствии с данньмм изобретением, упомянутьїх вьіше, способньїх связьіваться непосредственно с ТКАР2, предусматривающий применение дрожжевой двухгибридной процедурь, в которой последовательность, кодирующая ТКАР2, несет один гибридньій вектор, а последовательность из библиотеки кКДНК или геномной

ДНК несет второй гибридньій вектор, причем зти векторьї затем используют для трансформации дрожжевьмх клеток-хозяев и позитивно трансформированнье клетки вьіделяют с последующей зкстракцией второго гибридного вектора для получения последовательности, кодирующей белок, которьій связьнтваєтся с ТКАГ2. 70 Еще в одном варианте данного изобретения обеспечен способ модулирования или медиирования в клетках активности МЕ-КВ или любой другой внутриклеточной активности передачи сигнала, модулируемой или медиируемой ТКАРЕ2 или другими молекулами, с которьіми связьіваєется белок, изоформа, аналог, фрагмент или производное данного изобретения, причем зтот способ предусматривает обработку зтих клеток введением в клетки одного или нескольких белков, их изоформ, аналогов, фрагментов или производньїх в форме, пригодной 7/5 для внутриклеточного введения, или введением в зти клетки последовательности ДНК, кодирующей один или несколько белков, их изоформ, аналогов, фрагментов или производньїх, в форме пригодного вектора, несущего зту последовательность, причем зтот вектор способен осуществлять введение зтой последовательности в клетки таким образом, что зта последовательность зкспрессируется в зтих клетках.

Вариантьї! вьішеописанного способа модулирования/медиирования в клетках активности МЕ-КВ или любой 2о другой внутриклеточной активности передачи сигнала, модулируемой или медиируемой ТКАР2 или другими молекулами, включают: (ЇЇ Способ, аналогичньій описанному вьіше, в котором обработка клеток предусматриваєт введение в зти клетки последовательности ДНК, кодирующей белок, изоформу, фрагмент, аналог или производное, в форме подходящего вектора, несущего зту последовательность, причем зтот вектор способен осуществлять введение с о ЗТой последовательности в зти клетки таким образом, что зта последовательность зкспрессируется в зтих о клетках. (ї) Способ, аналогичньій описанному вьіше, в котором обработка указанньїх клеток представляет собой трансфекцию клеток рекомбинантньм вектором в виде вируса животного, предусматривающий следующие стадии: б зо (а) конструирование рекомбинантного вектора овируса животного, несущего последовательность, кодирующую вирусньй поверхностньій белок (лиганд), которьій способен связьіваться со специфическим со поверхностньім клеточньім рецептором на поверхности обрабатьваемьх клеток, и вторую последовательность, (у кодирующую белок, вьібранньй из белка, изоформ, аналогов, фрагментов и производньїх данного изобретения, которьій при зкспрессии в зтих клетках способен модулировать/медиировать активность МЕ-КВ или любую ("7 зв Ддругую внутриклеточную активность, модулируемую/медиируемую ТКАРЕ2 или другими молекулами; и ї- (Б) инфицирование клеток вектором (а).

Подобньм образом, данное изобретение обеспечиваєт также способ модулирования модулируемого/медиируемого ТКАБ2 действия на клетки, предусматривающий обработку зтих клеток антителами или их активньми фрагментами или производньіми, в соответствии с данньім изобретением, как « описано вьіше, причем зта обработка представляет собой применение подходящей композиции, содержащей в с зти антитела, их активнье фрагменть! или производнье, к зтим клеткам, причем, когда ТКАБ2-связьівающий белок или его части зтих клеток зкспонированьі на внеклеточной поверхности, зту композицию готовят для ;» внеклеточного применения, а когда ТКАБ2-связьівающие белки являются внутриклеточньіми, зту композицию готовят для внутриклеточного применения.

Другие способьї данного изобретения для модулирования модулируемого/медиируемого ТКАРБ2 действия на -І клетки включают: () Способ, предусматривающий обработку зтих клеток олигонуклеотидной последовательностью, - кодирующей антисмьсловую последовательность по меньшей мере для части последовательности ДНК,

Го! кодирующей ТКАРБ2-связьівающий белок, причем зта последовательность ДНК является любой из

Вьішеупомянутьх последовательностей данного изобретения, причем олигонуклеотидная последовательность со способна ингибировать зкспрессию ТКАЕ2-связьівающего белка.

Ге) (її Способ по (ї) вьіше, в котором указанную олигонуклеотидную последовательность вводят в клетки посредством вьішеупомянутого рекомбинантного вируса, причем вторая последовательность зтого вируса кодирует олигонуклеотидную последовательность. 5Б (її) Способ, предусматривающий применение рибозимной процедурь, в которой вектор, кодирующий последовательность рибозима, способного взаймодействовать с клеточной последовательностью мРНК,

Ф) кодирующей ТКАРГ2-связьвающий белок, изоформу, аналог, фрагмент или производное, упомянутье вьіше, ка вводят в клетки в форме, позволяющей зкспрессию последовательности рибозима в зтих клетках, и в которой при зкспрессии последовательности рибозима в клетках он взаймодействует с клеточной МРНК и расщепляет бо ЗТту МРНК, приводя к ингибированию зкспрессии ТКАГ2-связьівающего белка в зтих клетках.

Следует отметить, что для всех вьішеописанньїх способов данного изобретения белок данного изобретения, как указано, может бьть конкретно белком МІК или по меньшей мере может бьїть вьібран из его изоформ, аналогов, фрагментов или производньх.

В описанньсе вьіше способь и их варианть! данного изобретения включен также способ предупреждения или 65 лечения патологического состояния, связанного с индукцией МЕ-кВ или любой другой активности, медиируемой

ТКАРБ2 или другими молекулами, с которьїми связьіваєтся белок, изоформа, аналог, фрагмент или производное согласно данному изобретению, причем зтот способ предусматриваєт введение пациенту, нуждающемуся в лечении, зффективного количества белка, изоформь!, аналога, фрагмента или производного в соответствий с данньм изобретением, или молекульь ДНК, кодирующей его, или молекуль, способной нарушать взаймодействие зтого белка, изоформьі, аналога, фрагмента или производного, с ТКАБ2 или любой другой молекулой, с которой связьвваєтся зтот белок, изоформа, аналог, фрагмент или производное. В зтом способе изобретения белок, вводимьій пациенту, может бьть конкретно белком, кодируемьм клоном 10, МІК, изоформой, аналогом, производньм или фрагментом МІК, или молекулой ДНК, кодирующей их. Белок, кодируемьй клоном 10, ингибирует индукцию МЕ-КВ, так же как и другие фрагменть! МІК, тогда как МІК 7/0 индуцирует активацию МЕ-кВ.

В дополнительном аспекте данного изобретения обеспечена фармацевтическая композиция для модулирования модулируемого/медиируемого ТКАБ2 действия на клетки, содержащая в качестве активного ингредиента по меньшей мере один из ТКАРГ2-связьвающих белков данного изобретения, его биологически активнье фрагменть, аналоги, производньсе или их смеси.

Другие фармацевтические композиции или их варианть! согласно данному изобретению включают: () Фармацевтическую композицию для модулирования модулируемого/медиируемого ТКАБ2 действия на клетки, содержащую активньй ингредиент, рекомбинантньй вектор-вирус животного, кодирующий белок, способньй связьваться с рецептором клеточной поверхности, и кодирующий по меньшей мере один

ТКАР2-связьвающий белок, изоформу, активнье фрагментьй или аналоги в соответствии с данньм 2о Мзобретением. (ї) Фармацевтическую композицию для модулирования модулируемого/умедиируемого ТКАБ2 действия на клетки, содержащую в качестве активного ингредиента олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмьсловую последовательность последовательности мРНК ТКАРЕ2-связьівающего белка в соответствий с данньім изобретением. с

Следующим вариантом вьішшеописанной фармацевтической композиции является конкретно фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения патологического состояния, связанного с і) индукцией МЕ-КВ или любой другой активности, медиируемой ТКАБ2 или другими молекулами, с которьіми связьвваєтся белок, изоформа, аналог, фрагмент или производное согласно данному изобретению, причем зта композиция содержит зффективное количество белка, аналога, фрагмента или производного, в соответствии с о (у зо данньмм изобретением, или молекуль! ДНК, кодирующей их, или молекуль, способной нарушать взаймодействие зтого белка, изоформьї, аналога, фрагмента или производного, с ТКАЕ2 или любой другой молекулой, с которой со связьвается зтот белок, изоформа, аналог, фрагмент или производноє. Еще в одном характерном варианте со указанная фармацевтическая композиция содержит зффективное количество белка, кодируемого клоном 10,

МІК, изоформьї, аналога, производного или фрагмента МІК, или молекульі ДНК, кодирующей их. --

Еще в одном характерном варианте данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для ча предупреждения или лечения патологического состояния, связанного с индукцией МЕ-КВ или любой другой активности, медиируемой ТКАБ2 или другими молекулами, с которьіми связьіваеєтся белок МІК, причем зта композиция содержит молекулу, способную противодействовать протеинкиназной активности МІК. В зтой композиции противодействующей молекулой может бьть зффективное количество МІК, мутированного в « остатках активного сайта, причем зтот мутированньй МІК противодействует нативному МІК, в частности, - с киназной активности МІК.

Одним известньім состоянием, связанньм с индукцией (аномальной) МЕ-КВ является СПИД, другими ;» являются аутоиммунньсе заболевания, а также опухоли.

Следующими аспектами и вариантами данного изобретения являются: () Способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, -І модулируемую/медиируемую ТКАБЕ2, предусматривающий: а) скрининг лиганда, способного связьіваться с полипептидом, содержащим по меньшей мере часть ТКАБ2, - имеющую аминокислотнье остатки 221-501 ТКАГ2;

Го! Б) идентификацию и характеристику лиганда, иного, чем ТКАЕ2 или части рецептора семейства рецепторов

ТМЕ/МОЕ, способного, согласно стадии скрининга, к упомянутому связьіванию; и со с) получение зтого лиганда по существу в вбіделенной и очищенной форме.

Ге) (її Способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую/медиируемую белком, изоформой, аналогом, фрагментом или производньм, в соответствии с данньім изобретением, предусматривающий: 5Б а) скрининг лиганда, способного связьшшаться с полипептидом, содержащим по меньшей мере часть последовательности МІК, изображенной на Фиг.б;

Ф) Б) идентификацию и характеристику лиганда, иного, чем ТКАЕ2 или части рецептора семейства рецепторов ка ТМЕ/МОЕ, способного, согласно стадии скрининга, к упомянутому связьіванию; и с) получение зтого лиганда по существу в вбіделенной и очищенной форме. во (її) Способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую/медиируемую МІК, предусматривающий: а) скрининг лиганда, способного связьшшаться с полипептидом, содержащим по меньшей мере часть последовательности МІК, изображенной на Фиг.б;

Б) идентификацию и характеристику лиганда, иного, чем ТКАЕ2 или части рецептора семейства рецепторов 65 ТМЕ/МОЕ, способного, согласно стадии скрининга, к упомянутому связьіванию; и с)получение зтого лиганда по существу в вьіделенной и очищенной форме.

(м) Способ идентификации и получения лиганда, способного прямо или опосредованно модулировать клеточную активность, модулируемую/медиируемую МІК, предусматривающий: а) скрининг молекуль, способной модулировать активности, модулируемье/медиируемьсе МІК;

Б) идентификацию и характеристику зтой молекуль!; и с) получение зтой молекуль! по существу в вбіделенной и очищенной форме. (М) Способ идентификации и получения молекульі, способной прямо или опосредованно модулировать клеточную активность, модулируемую/медиируемую белком, изоформой, аналогом, фрагментом или производньїм данного изобретения, предусматривающий: 70 а) сскрининг молекуль, способной модулировать активности, модулируемье/медиируемье белком, изоформой, аналогом, фрагментом или производньїм данного изобретения;

Б) идентификацию и характеристику зтой молекуль!; и с) получение зтой молекуль! по существу в вбіделенной и очищенной форме.

Также обеспечень! другие аспекть! и варианть! данного изобретения как возникающие на основе подробного /5 описания данного изобретения.

Следует отметить, что во всем описаний терминьї "модулирование/медиирование действия ТКА (или

ТКАБЕ2) на клетки" и любое другое подобное "модулирование/медиирование", упоминаемьсе в описаний, следует понимать как относящиеся к обработке іп міо, так и к лечению іп мімо и, кроме того, зти терминьї включают в себя ингибирование или усиление/увеличение.

Фиг.1 - изображение в виде диаграммь! структурьї молекуль! ТКАРГ2.

Фиг.2а-5 - схематические диаграммьї, иллюстрирующие некоторье белки, участвующие в активации МЕ-КВ, в том числе новьіе ТКАЕ-связьивающие белки данного изобретения (например, МІК), где (а) представляет собой частичную схему и (Б) представляет собой более полную схему.

Фиг.За-б - нуклеотидная последовательность 5-конца клона 9 (а) и расшифрованная аминокислотная сч об последовательность, кодируемая ею (Б);

Фиг.4 - нуклеотидная последовательность клона 10; (8)

Фиг.ба-р - нуклеотидная последовательность клона 15 (а) и расшифрованная аминокислотная последовательность, кодируемая ею (б);

Фиг.6 - нуклеотидная последовательность и расшифрованная аминокислотная последовательность МІК; и б зо Фиг.7 - сравнение первичной структурьї последовательности белка МІК с последовательностью мьІшиной протеинкиназьї тМЕКК (мьішиной киназьі МАРК или ЕКК киназь!) и ряда других киназ. Отмеченьї районь, со соответствующие консервативнь!м мотивам І-ХІ в протеинкиназах. со

Данное изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим белки, способнье связьваться с молекулой фактора, связанного с рецептором фактора некроза опухолей (ТКАБРЕ), и кодируемь/!м ими белкам. --

В предпочтительном варианте, данное изобретение относится к последовательностям КкДНК, названньім ча здесь клоном 9, клоном 10 и клоном 15 (изображенньім на Фиг.За, 4 и ба, соответственно), которне кодируют белки, способнье связьіваться с ТКАР2, и белкам, кодируемь!м зтими последовательностями ДНК.

В следующем предпочтительном варианте данное изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующей белок МІК, и к самому белку МІК. «

Последовательности ДНК и расшифрованнье аминокислотнье последовательности, упомянутье вьіше, в с представляют новьіе последовательности, они не встречаются в банках данньїх последовательностей ДНК или аминокислотньїх последовательностей "ЗОЕМЕВАМК" или ""КОТЕЇМ ВАМК". ;» В обьеме данного изобретения находятся также фрагменть! вьішеупомянутьїх последовательностей ДНК и последовательности ДНК, способнье гибридизоваться с зтими последовательностями или их частью при умеренно строгих условиях, при условии, что они кодируют биологически активньій белок или полипептид, -І способньїй связьіваться по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501 ТКАБ2.

Данное изобретение относится также к последовательности ДНК, которая является вьірожденной - вследствие вьірожденности генетического кода относительно вьішеупомянутьїх последовательностей ДНК и о которая кодирует биологически активньій белок или полипептид, способньій связьиваться по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501 ТКАБЕ2. со Что касается ТКАРБ2, следует отметить, что некоторне членьі семейства рецепторов ТМЕ/МОЕ активируют

Ге) фактор транскрипции МЕ-КВ прямьім или опосредованньм связьиванием с ТКАРЕ2, которьїй, следовательно, является адапторньм белком для зтих рецепторов и, таким образом, может рассматриваться также как модулятор/медиатор индукции активации активности МЕ-КВ зтими рецепторами ТМЕ/МОБЕ (см. схему на Фиг.2б).

Другой рецептор, І/-1-рецептор, активирует МЕ-КВ о независимо от ТКАБ2. Одним из вариантов предпочтительного ТКАЕ2-связьивающего белка согласно данному изобретению является, белок МІК, которьй

Ф) связьваєт ТКАБ2 очень специфическим образом и стимулирует активность МЕ-КВ. МІК представляет собой ка серин/треонин-киназу, имеющую сходство последовательности с несколькими киназами МАРКК (см. Примерь! ниже). Аналоги или мутеиньї МІК, получаемье в соответствии с данньім изобретением (см. Примерьї), которьіе бо лишень киназной активности МІК, не могут стимулировать активацию МЕ-КВ, когда зти аналоги/мутеинь зкспрессируются в клетках. Далее, такие аналоги/мутеиньі! МІК при зкспрессии в клетках ингибируют индукцию

МЕ-КВ ТМЕ, а также другими индуцирующими агентами, такими как бактериальньй зндотоксин ІРБ, миристат-ацетат форбола (активатор протеинкиназьі! С) и белок ТАХ НТІМ-1. ТМЕ-индукция активности МЕ-КкВ осуществляется Через любой из двух ТМЕ-рецепторов (ТМЕ-рецепторь! рб55 и р75) и, следовательно, можно 65 думать, что, по-видимому, мутеинь/аналоги МІК ингибируют индукцию активации МЕ-КВ через зти рецепторнь!.

Подобньім образом, ТМЕ и лиганд рецептора ГАБ/АРОЇ могут также индуцировать активность МЕ-КВ через соответствующий рецептор, рецептор ЕАБ/АРОТ1, индукция которого также ингибируется мутеинами/аналогами

МІК. Кроме того, вьнішеупомянутье рецепторьї имеют адапторнье белки ТКАБО, КІР и МОКТ-1, которье могут также индуцировать активность МЕ-КВ, но зта индукция также ингибируется мутеинами/аналогами МІК. Кроме того, такие мутеиньианалоги МІК иингибируют также индукцию МЕ-КВ 1Ї/-1 (функционирующим через

І/-1-рецептор). Таким образом, можно заключить, что МІК участвует в МЕ-кКВ-индуцирующем каскаде, которьй является обьічньм для рецепторов семейства ТМЕ/МОЕ и для ІІ-1-рецептора. По-видимому, МІК также действует прямь!м путем в индукции активации МЕ-КВ, возможно, путем прямого усиления фосфорилирования

ІКВ. Зто вьітекает из полученньїх наблюдений, что вьішеупомянутье аналоги/мутеинь! МІК, лишеннье киназной /о активности (также назьіваемне доминант-негативньми мутантами), при зкспрессии в клетках не влияют каким бьі то ни бьіло образом на ТМЕ-индуцируемую активацию дип киназьі, что свидетельствует о том, что МІК действует специфически, усиливая фосфорилирование І-КВ, без влияния на киназу МАР, участвующую в фосфорилированиий «шип.

Таким образом, данное изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим биологически /5 активнье ТКАР-связьівающего белки, например, ТКАЕ2-связьивающие белки, такие как, например, МІК, а также его аналоги, фрагментьї и производнье, и аналогам, фрагментам и производньм белков, кодируемьм ими.

Получение таких аналогов, фрагментов и производньїх представляет собой стандартнье процедурь! (см., например, ЗатрьгоокК еї аіЇ., 1989), в которьіх в кодирующих последовательностях ДНК один или несколько кодонов могут бьіть делетированьі, добавленьі или замененьі другими с получением аналогов, имеющих по 2о Мменьшей мере замену одного аминокислотного остатка относительно нативного белка. Приемлемьми являются аналоги, которне сохраняют по меньшей мере способность связьвания с ТКАБ2 с медиированием или без медиирования любой другой связьвающей или ферментативной активности, например, аналоги, которье связьвают ТКАРБ2, но не передают сигнал, т.е. не связьиваются с находящимся далее по ходу процесса передачи сигнала белком или иньіїм фактором, или не катализируют сигнал-зависимую реакцию. Таким образом с г /Могут бьіть получень! аналоги, которне имеют так назьіваемое доминант-негативное действие, а именно, аналог, которьїй является дефектнь!м либо в связьівании с ТКАР2, либо в последующей передаче сигнала после такого і) связьввания, как отмечалось вьіше. Такие аналоги можно использовать, например, для ингибирования зффектов сра4 0, роб ТМЕ и р/5 ТМЕ (РГАБ/АРО1 и других родственньїх рецепторов, а также зффектов, медиируемьсмх различньми связанньми с рецептором белками (адапторами), как отмечалось вьіше, путем конкурирования с б зо природньми ТКАР2-связьивающими белками. Подобньм образом, могут бьїть полученьі так назьіваемье доминант-позитивнье аналоги, которьіе могли бьї служить для усиления зффекта ТКАРЕ2. Они могли бьі иметь со те же самье или улучшеннье ТКАР2-связьівающие свойства и те же самье или улучшеннье свойства передачи оду сигнала природньїх ТКАБ2-связьвающих белков. Аналогичньм образом, могут бьіть получень! биологически активньіе фрагменть! клонов данного изобретения, как отмечалось вьіше в связи с получением зтих аналогов. -- з5 Пригодньми являются последовательности ДНК данного изобретения, которье кодируют белок или ча полипептид, сохраняющий ТКАРГ2-связьвающую способность или способньй медиировать любую другую связьвающую или ферментативную активность, как отмечалось вьіше. Таким образом, могут бьіть получень фрагментьі кодируемьх белков данного изобретения, которне имеют доминант-негативное или доминант-позитивное действие, как отмечалось вьіше, относительно зтих аналогов. Подобньім образом, могут « бьть полученьі производнье посредством стандартньїх модификаций боковьїх групп одного или нескольких 7-3) с аминокислотньїх остатков зтих белков, их аналогов или фрагментов, или посредством коньюгирования зтих белков, их аналогов или фрагментов с другой молекулой, например, с антителом, ферментом, рецептором и ;» т.д., как хорошо известно в данной области.

Из вьішеупомянутьїх последовательностей ДНК данного изобретения, которне кодируют ТКАР-связьівающий белок (например, ТКАРБ2-связьіваюший белок, такой как, например, МІК), изоформу, аналог, фрагмент или -І производное, в качестве варианта данного изобретения включень! также последовательности ДНК, способнье гибридизоваться с последовательностью кДНК, произведенной из кодирующего района нативного - ТКАР-связьивающего белка, причем такую гибридизацию вьіполняют при умеренно строгих условиях и

Го! гибридизуемье последовательности ДНК кодируют биологически активньій ТКАРБ-связьивающий белок. Таким образом, зти гибридизуемье последовательности ДНК включают в себя последовательности ДНК, которне со имеют относительно вьісокую гомологию с последовательностью КДНК природньїх ТКАРБ-связьвающих белков

Ге) (например, с последовательностью кКДНК ТКАг2-связьвающего белка, такой как, например, последовательность КДНК МІК) и как таковье представляют подобнье ТКАРБ-связьвающему белку последовательности, которье могут бьть, например, производньми природньїх последовательностей, вв Кодирующих различнье изоформь ТКАР-связьвающего белка; или производньми / природньїх последовательностей, кодирующих белки, принадлежащие к группе подобньїх ТКАРБ-связьвающему белку (Ф, последовательностей, кодирующими белок, имеющий активность ТКАРЕ-связьвающих белков (например, ка ТКАР2-связьівающих белков, таких как, например, МІК). Далее, зти последовательности могут также включать, например, не встречающиеся в природе, синтетически полученнье последовательности, которьіе подобнь бо последовательности КДНК нативного ТКАРБ-связьівающего белка, но содержат ряд желательньїх модификаций.

Такие синтетические последовательности включают, следовательно, все возможнье последовательности, кодирующие аналоги, фрагменть! и производнье ТКАР-связьівающих белков (например, ТКАЕ2- связьівающих белков, таких как, например, МІК), которне все обладают активностью ТКАР-связьівающих белков.

Для получения различньїх виішеупомянутьїх природновстречающихся подобньїх ТКАР-связьвающему белку 65 последовательностей могут бьіть использовань! стандартнье процедурь! скрининга и вьіделения природньх проб ДНК или РНК из различньїх тканей с использованием кКДНК природного ТКАР-связьівающего белка или ее части в качестве зонда (см., например, стандартнье процедурьі, описаннье в Затьгоок еї а!., 1989).

Подобньм образом, для получения вьішеупомянутьїх различньїх синтетических / подобньх

ТКАР-связьівающему белку последовательностей, кодирующих аналоги, фрагментьь или производнье

ТКАР-связьівающих белков (например, ТКАР2-связьвающих белков, таких как, например, МІК) может бьть использован ряд стандартньїх процедур, таких как описаннье подробно ниже, касающиеся таких аналогов, фрагментов и производньх.

Полипептид или белок, "в основном соответствующий" ТКАР-связьівающему белку, включаєт не только

ТКАР-связьівающий белок, но также полипептидь или белки, которне являются аналогами ТКАЕ-связьівающего 7/о белка.

Аналоги, которье в основном соответствуют ТКАРЕ-связьвающему белку, являются полипептидами, в которьїх одна или несколько аминокислот аминокислотной последовательности ТКАР-связьвающего белка бьіли замененьі другой аминокислотой, делетировань! и/или вставленьі), при условии, что полученньій белок проявляет в основном такую же или более вьісокую биологическую активность, что и ТКАЕ-связьівающий белок, 7/5 Которому он соответствует.

Для того чтобьі! в основном соответствовать ТКАР-связьівающему белку, изменения в последовательности

ТКАР-связьівающих белков, таких как изоформьі, как правило являются относительно мальми. Хотя число изменений может бьть более десяти, предпочтительно имеется не более десяти изменений, более предпочтительно не более пяти изменений и найболее предпочтительно не более трех изменений. Хотя можно Мспользовать любой способ для нахождения биологически активньїх белков, которне в основном соответствуют

ТКАР-связьівающим белкам, одним из таких способов является использование общепринятьїх способов мутагенеза ДНК, кодирующей зтот белок, приводящих к небольшим модификациям. Белки, зкспрессируемье такими клонами, могут бьїть затем подвергнутьї скринингу на их способность связьіваться с белками ТКАЕ (например, ТКАЕ2) и модулировать активность белка ТКАЕ (например, ТКАЕ2) в модулированиий/медиирований сч г Внутриклеточньх путей, описанньх вьіше. "Консервативньми" изменениями являются изменения, которье, как ожидается, не изменяют активность і) белка, и обьічно должнь! бьїіть подвергнуть! скринингу в первую очередь как изменения, которье, как ожидается, не должньі изменять размер, заряд или конфигурацию белка и, следовательно, не должнь! изменять его биологических свойств. б зо Консервативнье заменьі! ТКАР-связьвающих белков включают аналог, в котором по меньшей мере один аминокислотньй остаток в полипептиде бьл консервативно заменен отличающейся аминокислотой. Такие со заменьї предпочтительно получают в соответствии со следующим ниже перечнем, представленньм в Таблице ду

ІА, и зти замень! могут бьіть определеньї рутинньім зкспериментированием, с обеспеченигм модифицированньх структурньїх и функциональньх свойств молекульь синтезированного полипептида при осохранений (787 биологической активности, характерной для ТКАР-связьівающего белка. ча « з з с :» 1 - - ее со я. со 3») о іме)

Альтернативно, другой группой замен ТКАР-связьівающего белка являются замень, в которьїх по меньшей бо мере один аминокислотньій остаток в полипептиде бьіл удален и на его место бьл введен отличающийся остаток, в соответствии со следующей Таблицей ІВ. Типьї замен, которье могут бьїть произведень! в полипептиде, могут основьіваться на анализе частот аминокислотньїх замен между гомологичньми белками различньїх видов, таких, которье представлень в Таблице 1-2 Зспціл: еї аїЇ., О.Е., Ргіпсіріев ої Ргоїеіп

Зігисішге Зргіпдег-Мегад, Мем МЖогк, МУ, 1998 и Фиг.3-9 Стгеідпіоп, Т.Е., Ргоїеіпв: Бігисішге апа Моїіесшаг 65 Ргорепіез, МУ.Н. Ргеетап апа Со., Зап Егапсізсо, СА 1983. На основе такого анализа альтернативнье консервативнье замень определень здесь как обмень! в пределах одной из следующих пяти групп:

й

Три аминокислотньїх остатка в скобках вьіше играют особую роль в архитектуре белков. Сіу является то единственньім остатком, не имеющим боковой цепи, и, следовательно, он придаєет гибкость цепи. Однако, зто ведет к усилению образования вторичной структурьї, отличающейся от оо-спиральной. Рго, вследствие его необьічной геометрии, прочно сдерживает цепь и, как правило, приводит к усилению образования структур типа

Д-витка, хотя в некоторьїх случаях Суз может бьть способньім к участию в образованиий дисульфидньх связей, которое является важньм в укладке белка. Отметим, что 5спціг еї аі!., зирга, соединяют указаннье вьіше

Группьі 1 и 2. Заметим, что Туг, вследствие его потенциала в образовании водородньїх связей, имеет значительное родство с Зеги ТНг, и т.д.

Консервативнье заменьі аминокислот в соответствии с данньм изобретением, например, такие как представленньсе вьіше, известнь!ї в данной области, и можно бьло бьі ожидать, что они сохранят биологические

М структурньіе свойства полипептида после заменьі аминокислот. Большинство делеций и замен в соответствий с данньім изобретением представляют собой замень), которье не производят радикальньх изменений в характеристике молекульй белка или полипептида. "Характеристика" определяется для определения как изменений во вторичной структуре, например, о-спирали или Др-слоя, так и изменений биологической активности, например, связьшания с белками ТКАЕ и/или медиирования действия белков ТКАЕ на гибель с ов КЛлеток.

Примерьї получения аминокислотньхх замен в белках, которье могут использоваться для получения о аналогов ТКАБ-связьівающих белков для применения в данном изобретений, включают любье стадий известньїх способов, такие как представленнье в О.5. раїепі КЕ 33653, 4959314, 4588585 и 4737462 Магк еї аї.; 5116943 Коїйз еї аіЇ., 4965 95 Матеп еї а|.; 4879111 Спопд еї аїЇ.; и 5017691 І ее еї а); и лизин-замещеннье б зо белки, представленньсе в 0.5. раїепі Мо. 4904584 (ЗНаму е! аї.).

Кроме консервативньїх замен, рассмотренньїх вьіше, которне не должнь! значительно изменять активность со

ТКАР-связьивающего белка, любье консервативнье заменьй или менее консервативнье или более со произвольньсе замень, которне приводят к увеличению биологической активности аналогов ТКАБ-связьівающих белков, находятся в сфере действия данного изобретения. -

Специалисту в данной области будет понятно, что при подтверждении точного действия замень! или М делеции зто действие замень! (замен), делеции (делеций) и т.д. должно оцениваться при помощи рутинньх (общепринятьх) тестов связьівания и гибели клеток. Скрининг с использованием подобного стандартного теста не требует чрезмерного зкспериментирования.

На генетическом уровне, зти аналоги получают обьічно сайт-направленньім мутагенезом нуклеотидов в ДНК, « Кодирующей ТКАР-связьівающий белок, с получением ДНК, кодирующей зтот аналог, и последующим синтезом Ше) с зтой ДНК и зкспрессией полипептида в культуре рекомбинантньїх клеток. Как правило, зти аналоги проявляют такую же или увеличенную качественную биологическую активность, что и природно-встречающийся белок, з А!йзибреї! еї аїЇ.,, Ситепі РгоїосоЇв іп МоїІесцшіаг Віоіоду, Сгеепе Рибіїсайціпз апа МУМпйеу Іпіегесіепсе, Мем/ Могк,

МУ, 1987-1995; ЗатрьгоокК еї аї., МоІесшаг Сіопіпд: А ІГаброгаїгу Мапиа!Ї, Соїд 5ргіпд Нагброг І арогаюгу, Соїд

Зргіпд Нагброг, МУ, 1989. -І Получение ТКАРБ-связьвающего белка в соответствии с данньм изобретением или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей тот же полипептид, но отличающейся от природной - последовательности вследствие изменений, допускаемьх известной вьрожденностью генетического кода,

Го! может бьїть достигнуто сайт-специфическим мутагенезом ДНК, которая кодирует полученньїй ранее аналог или 5р Нативную версию ТКАР-связьвающего белка. Сайт-специфический мутагенез позволяет получать аналоги со путем использования специфических олигонуклеотидньїх последовательностей, которье кодируют

Ге) последовательность ДНК желательной мутации, а также достаточного количества смежньїх нуклеотидов, с получением праймерной последовательности достаточного размера и достаточной вариабельности для образования стабильного дуплекса, пересеченного на обеих сторонах сочленения делеции. Как правило, ов предпочтительньм является праймер длиной приблизительно 20-25 нуклеотидов, в котором 95-10 комплементарньїх нуклеотидов на каждой стороне изменень». В общих чертах, способ сайт-специфического (Ф, мутагенеза хорошо известен в данной области, в качестве примера приводится публикация Адеїтап еї аіІ., ОМА ка 2:183 (1983), описание которой включено здесь в качестве ссьІлки.

Как должно бьіть понятно, сайт-специфический мутагенез обьічно использует фаговьій вектор, которьй бо существует как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме. Типичнье векторь), применимье в сайт-направленном мутагенезе, включают такие векторьї, как фаг М13, например, описанньй Мезгзіпа еї аї!., Тніга

Сіемеіїапа бутровішт оп Масгото|Їесціез апа Кесотбріпапі ОМА, Едійог А. УУайоп, ЕїІвеміег, Атвіегдат (1981), описание которой включено здесь в качестве ссьілки. Зти фаги легко коммерчески доступнь! и их применение, как правило, хорошо известно специалистам в зтой области. Альтернативно, для получения одноцепочечной 65 ДНК могут использоваться плазмиднье векторь, которье содержат одноцепочечное фаговое начало репликации (Меїга еї аі., Ме(й. Епгутої. 153:3, 1987).

Как правило, сайт-направленньій мутагенез согласно данному изобретению проводят путем получения сначала одноцепочечного вектора, которьій содержит в своей последовательности последовательность ДНК, которая кодирует соответствующий полипептид. Олигонуклеотидньій праймер, несущий желательную Мутированную последовательность, получают синтетически при помощи автоматизированного синтеза

ДНК/олигонуклеотидов. Затем зтот праймер отжигают с одноцепочечньм содержащим последовательность для белка вектором и подвергают действию полимеризующих ДНК ферментов, таких как фрагмент Кленова

ДНК-полимеразь! Е.соїї, для завершения синтеза несущей мутацию цепи. Таким образом, мутированная последовательность и вторая цепь несут желательную мутацию. Зтот гетеродуплексньй вектор используют /о Затем для трансформации подходящих клеток, таких как Е.соїї УМ101, и отбирают клоньії, которне включают рекомбинантнье векторьі, несущие мутированную последовательность.

После отбора такого клона мутированная последовательность ТКАР-связьвающего белка может бьть удалена и помещена в подходящий вектор, обьічно трансдуцирующий или зкспрессирующий вектор такого типа, которьїй может бьіть использован для трансфекции подходящего хозяийна.

Таким образом, ген или нуклеиновая кислота, кодирующие ТКАР-связьивающий белок, могут бьіть также детектированьі, полученьї и/или модифицировань!, іп міо, іп 5йш и/или іп мімо, с использованием известньх способов амплификации ДНК или РНК, таких как ПЦР и химический синтез олигонуклеотидов. ПЦР позволяет амплифицировать (увеличить в числе) специфические последовательности ДНК при помощи повторяемьх

ДНК-полимеразньїх реакций. Зта реакция может бьть использована как замена клонирования; все, что 2о требуется, зто знание последовательности нуклеиновой кислотьі. Для проведения ПЦР конструируют праймерь, которне комплементарньі целевой последовательности. Затем зти праймерь! получают автоматизированньім синтезом ДНК. Поскольку могут бьіть сконструировань!і праймерь! для гибридизации с любой частью гена, могут бьть созданьії условия, при которьїх неправильнье спаривания оснований могут переноситься (не препятствовать достижению цели). Амплификация зтих неправильно спаренньїх районов может привести к с 2г5 синтезу мутагенизированного продукта, приводящего к образованию пептида с новьіми свойствами (т.е. сайтнаправленному мутагенезу). См. также, например, А!йзибеї, зирга, Сп.16. Также путем сочетания синтеза і) комплементарной ДНК (кДНК) с применением обратной транскриптазь! с ПЦР, РНК может бьїтть использована в качестве исходного материала для синтеза внеклеточного домена рецептора пролактина без клонирования.

Кроме того, могут бьіть сконструированьі праймерь! ПЦР для включения новьїх сайтов рестрикции или других ду зо признаков, таких как терминирующие кодоньії на концах амплифицируемого сегмента гена. Зто помещение сайтов рестрикции при 5- и 3-концах амплифицируемой генной последовательности позволяет генньім со сегментам, кодирующим ТКАР-связьівающий белок или его фрагмент, бьіть средством, сконструированньм для /- ду лигирования других последовательностей и/или клонирующих сайтов в векторах.

ПЦР и другие способьї амплификации РНК и/или ДНК хорошо известньі в данной области и могут бьть (787

Зз5 Мспользованьі в соответствии с данньм изобретением без чрезмерного зкспериментирования на основе ча разьяснений и руководства, представленньх здесь. Известнье способьї амплификации ДНК или РНК включают, но не ограничиваются ими, полимеразную цепную реакцию и родственнье способьї амплификации (см., например, О.5. раїепі Мов. 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, Миїйїз еї а; 4795699 и 4921794, Тарог еї а); 5142033, Іппів; 5122464, УУйвоп еї а, 5091310, Іппіз 5066584, СуПепвеіеп еї аїЇ.; 4889818, СейМапа еї « аі.,, 4994370, Зіїмег еї аї!., 4766067, Вівулаз; 4656134, Кіпдоід; и Іппів еї аїЇ.,, ейв. РСК Ргоїосоів: А Сціде - с о Меййодз апа Арріїсайопев) и опосредованную РНК амплификацию, которая использует антисмьісловую РНК в качестве последовательности-мишени для синтеза двухцепочечной ДНК (Ш.5. раїепі Мо. 5130238, Майек еї аї., с ;» товарньмм названием МАЗВА); и иммуно-ПЦР, которая сочетает использование амплификации ДНК с мечением антител (Кигіска еї аїЇ., Зсіепсе 260487 (1993); Запо сеї аїЇ., Зсіепсе 258:120 (1992); Бапо еї аї., Віоїесппідцев 9:1378 (1991)), полное содержание зтих патентов и ссьілок включено здесь в качестве ссьлки. -І Аналогичньмм образом, биологически активнье фрагментьї ТКАРЕ-связьвающих белков (например, фрагментов любьїх ТКАРБ2-связьівающих белков, таких как, например МІК) или их изоформь! могут бьть - получень), как описано вьіше в связи с аналогами ТКАР-связьівающих белков. Подходящими являются

Го! фрагменть! ТКАБ-связьівающих белков, которье сохраняют ТКАБ-связьівающую способность белка и которье 5р Могут медиировать биологическую активность белков ТКАЕ или других белков, связанньїх с белками ТКАЕ со прямо или опосредованно. Таким образом, могут бьіть полученьї фрагментьії ТКАР-связьівающих белков,

Ге которье обнаруживают доминант-негативное или доминант-позитивное действие, описанное вьіше в связи с аналогами. Следует отметить, что зти фрагменть! представляют особьй класс аналогов данного изобретения, а именно, они определяют части ТКАР-связьвающих белков, произведеннье из полной последовательности дв о ТКАР-связьівающего белка (например, последовательности любого из ТКАГ2-связьівающих белков, такого как, например, МІК или его изоформь), причем такая часть или фрагмент имеют любую из описанньїх вьіше (Ф, желательньїх активностей. Таким фрагментом может бьїіть, например, пептид. ка Подобньім образом, могут бьіть полученьї производнье при помощи стандартньїх модификаций боковьмх групп одного или нескольких аминокислотньїх остатков ТКАР-связьивающего белка, его аналогов или бо фрагментов, или коньюгированием ТКАР-связьівающего белка, его аналогов или фрагментов с другой молекулой, например, антителом, ферментом, рецептором и т.д., как хорошо известно в данной области. Таким образом, термин "производнье" в применений здесь охватьівает производньсе, которье могут бьіть получень из функциональньїх групп, которье находятся в виде боковьїх групп на остатках, или М- или С-концевьїх групп способами, известньмми в данной области, и зти производньіе включень! в данное изобретение. Производнье б5 Могут иметь химические части молекул, такие как остатки углеводов или фосфатов, при условийи, что такая фракция имеет ту же самую или более вьісокую биологическую активность, чем ТКАР-связьівающие белки.

Например, производнье могут включать алифатические зфирь! карбоксильньх групп, амидьі карбоксильньх групп, образованнье реакцией с аммиаком или с первичньмми или вторичньіми аминами, М-ацилпроизводньми или свободньіми аминогруппами аминокислотньїх остатков, образованньіми с ацильньіми группами (например, с алканоильной или карбоциклической ароильной группами), или О-ацил-производньіми свободной гидроксильной группь! (например, серильного или треонильного остатка), образованньіми с ацильньми группами .

Термин "производньсе" включает только такие производньсе, которне не изменяют один остаток на другой из двадцати обьічно встречающихся в природе аминокислот.

ТКАР-связьвающий белок представляет собой белок или полипептид, т.е. последовательность /о аминокислотньїх остатков. Полипептид, состоящий из более крупной последовательности, которая включает всю последовательность ТКАРБ-связьвающего белка, в соответствии с приведенньми здесь определениями, также включен в понятие такого полипептида, при условии, что добавления не влияют на основнье и новье характеристики данного изобретения, т.е., если они сохраняют или увеличивают биологическую активность

ТКАР-связьивающего белка, или могут бьть отщеплень, причем при отщеплений остается белок или 7/5 полипептид, имеющий биологическую активность ТКАР-связьвающего белка. Так, например, данное изобретение включает слитье (гибриднье) белки, образованнье ТКАРЕ-связьвающим белком с другими аминокислотами или пептидами.

Как упоминалось вьіше, должно бьіть понятно, что описаннье вьіше "ТКАР-связьвающие" белки данного изобретения представляют собой белки, которье связьшвают внутриклеточно любой белок ТКАЕ и 2о медиируют/модулируют активность любого о белка ТКАРБ. Конкретньми примерами являются

ТКАР2-связьвающие белки, которье могут модулировать или медиировать ассоциированную с ТКАБЕ2 внутриклеточную активность передачи сигнала, как упоминалось вьіше, в частности, относительно участия

ТКАРБ2 в индукции активности МЕ-КВ, в частности, после взаимодействия между ТКАРЕ2 и различньіми членами семейства рецепторов ТМЕ/МОЕ и/или их ассоциированньми адапторньми белками, как подробно описано сч ов Вьіше и ниже. Характерньім примером таких ТКАГ2-связьівающих белков является белок МІК и его различнье аналоги, фрагменть! и т.д. (см. Примерь!)), которье, по-видимому, связьвают ТКАБ2 очень специфически и і) оказьвают прямое действие в индукции активности МЕ-КВ, причем различнье доминант-негативнье аналоги/мутейинь!ї МІК ингибируют зту активность.

Все вьішеупомянутье модификации находятся в обьеме данного изобретения при условийи, что они б зо сохраняют способность кодируемьх белков или полипептидов или их аналогов и производньх связьваться по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501 ТКАБЕ2. со

Все белки и полипептидьій данного изобретения вследствие их способности связьшваться с ТКАБ2 со рассматриваются как медиаторь! или модуляторь! передачи сигнала ТКАР2. Как таковне, зти молекуль! данного изобретения играют роль, например, в процессе передачи сигнала, в котором связьівание лиганда ТКАБ2 с --

СО30, СО40, рецептором лимфотоксина бета (ІТ-р), ро5 или р75 ТМЕ-рецепторами, а также с другими ї- рецепторами и адапторньми белками, описанньми вьіше, приводит к активации фактора транскрипции МЕ-КВ.

Особенно интересньїм является белок МІК и частичньй белок МІК, кодируемьй клоном 10 данного изобретения; подробньій анализ последовательности МІК и кодируемого клоном 10 белка (первоначально названного ММРІ) обнаружил кодируемье аминокислотнье последовательности, соответствующие консервативнь!м мотивам І-ХІ, « характерньмм для Зег/ТНпг протеинкиназ, определяющие, таким образом, функцию зтого белка. 8 с Белки новьїх клонов, их аналоги, фрагменть! и производнье имеют ряд возможньїх применений, например: й () Они могут бьїть использованьь для имитации или усиления активности МЕ-КВ, функции ТКАБ2 и "» рецепторов, с которьіми они связьіваются, в ситуациях, когда желательна усиленная функция, например, в противоопухолевьїх или иммуностимуляторньїх приложениях, где желательньії индуцируемье ТКАБ2 зффектиь!.

В зтом случає белки данного изобретения, их аналоги, фрагментьї или производнье, которье усиливают -і зффекть! ТКАРБГ2 или рецепторов, могут бьіть введень! в клетки при помощи стандартньїх процедур, известньх а рег зе. Например, поскольку белки, кодируемье клонами ДНК данного изобретения, являются внутриклеточньіми и они должнь! вводиться только в клетки, в которьїх желателен зффект ТКАЕ2, необходима

Го) система специфического введения зтих белков в клетки. Одним способом для зтого является создание 5р рекомбинантного вируса животного, например, произведенного из вируса коровьей оспь, в ДНК которого вводят бо следующие два гена: ген, кодирующий лиганд, которьій связьівается с поверхностньми белками клетки,

Ге) специфически зкспрессируемьмм зтими клетками, например, такими как белок др120 вируса СПидДа (ВИЧ), которьій связьівается специфически с некоторьіми клетками (СО4-лимфоцитами и родственньмми лейкознь!ми клетками), или любой другой лиганд, которьій связьваеєется специфически с клетками, несущими рецептор, КОоторьй связьваєт ТКА, так что рекомбинантньй вирусньй вектор будет способен связьівать такие клетки; и ген, коюдирующий белки данного изобретения. Таким образом, зкспрессия связьвающегося с поверхностью іФ) клетки белка на поверхности зтого вируса будет нацеливать вирус специфически на опухолевую клетку или ко другую несущую рецептор клетку, после чего последовательности, кодирующие зти белки, будут введень! в клетки через зтот вирус и при зкспрессии в клетках приведут к усилению зффекта рецептора или ТКАБЕ2, что бо приведет к желательному иммуностимулирующему зффекту в зтих клетках. Конструирование такого рекомбинантного вируса животного вьіполняют согласно стандартньім процедурам (см., например, Затрьгоок еї аі., 1989). Другой возможностью является введение последовательностей кодируемьїх белков в форме олигонуклеотидов, которье могут адсорбироваться клетками и зкспрессироваться в них. (ї) Они могут бьіть использованьі! для ингибирования активности МЕ-КВ, зффектов ТКАРБ2 или рецептора, 65 Которьй связьваєт его, например, в таких случаях, как повреждение тканей, например, при СПИДе, септический шок или реакция трансплантат против хозяина (отторжение трансплантата), в которьїх желательно блокирование внутриклеточной передачи сигнала. В зтой ситуации можно, например, вводить в клетки, при помощи стандартньїх процедур, олигонуклеотидьі, имеющие антисмьсловую кодирующую последовательность для белков данного изобретения, которая могла бьії зффективно блокировать трансляцию мРНК, кодирующих

ЗИ белки и тем самьм ингибировать их зкспрессию и приводить к ингибированию нежелательного зффекта.

Альтернативно, могут бьіть использовань! другие олигонуклеотидьі!; олигонуклеотидь!, которье сохраняют их способность связьіваться с ТКАБГ2 таким образом, что зто препятствует связьиванию других молекул с зтим белком, но в то же время не медиируют какую-либо активацию или модулирование зтой молекульі. Обладая зтими характеристиками, зти молекуль! могут разрушать взаимодействие ТКАБГ2 с его природньім лигандом, 70 действуя, следовательно, в качестве ингибиторов, способньїх снимать зффекть, медиируемье ТКАБ2, например, такие как активация МЕ-КВ. Такие олигонуклеотидьі могут бьть введень в клетки при помощи описанного вьіше подхода с применением рекомбинантного вируса, причем второй последовательностью, которую несет зтот вирус, является олигонуклеотидная последовательность.

Другой возможностью является использование антител, специфических для белков данного изобретения, 7/5 для ингибирования внутриклеточной активности передачи сигнала.

Еще одним путем ингибирования нежелательного зффекта является недавно разработанньій рибозимньй подход. Рибозимь! представляют собой каталитические молекульі РНК, которне специфически расщепляют

РНК. Рибозимьї могут бьіть сконструированьії для расщепления вьібранньхх РНК-мишеней, например, мРНК, кодирующих белки данного изобретения. Такие рибозимь! должньі иметь последовательность, специфическую для МРНК зтих белков, и должнь! бьть способнь! взаймодействовать с ней (комплементарное связьвание) с последующим расщеплением зтой мРНК, приводя к уменьшению (или полной утрате) зкспрессии зтих белков, причем уровень сниженной зкспрессии зависит от уровня зкспрессии рибозима в клетке-мишени. Для введения рибозимов в вьібранньсе клетки (например, в клетки, несущие ТКАГ2-связьівающие белки) можно использовать любой подходящий вектор, например, плазмидньій вектор, вирусньій (ретровирусньй) вектор животного, с ов Которье обьчно используют для зтой цели (см. таюке (ї) вьіше, где зтот вирус имеет в качестве второй последовательности КДНК, кодирующую вьібранную рибозимную последовательность). (В отношений обзора, і) способов и т.д., касающихся рибозимов, см. Спеп еї аї!., 1992; 7Нао апа РіскК, 1993). (ії) Они могут бьіть использовань! для вьіделения, идентификации и клонирования других белков, которье способнь! связьваться с ними, например, других белков, участвующих в процессе внутриклеточной трансдукции ду зо бигнала, которье находятся далее по ходу процесса от ТКАР2. Например, последовательности ДНК, кодирующие белки данного изобретения, могут бьіть использованьь в дрожжевой двухгибридной системе, в со которой кодируемье белки будут использоваться как "приманка" для вьіделения, клонирования и со идентификации из библиотек кКДНК или геномной ДНК других последовательностей ("добьічи"), кодирующих белки, которье могут связьвваться с белками зтих клонов. Таким же образом можно таюке определить, могутли (87 белки данного изобретения связьіваться с другими клеточньми белками, например, другими рецепторами ча суперсемейства рецепторов ТМЕ/МОБ. (м) Кодируемье белки, их аналоги, фрагментьї или производньюе могут бьїть также использовань! для вьіделения, идентификации и клонирования других белков того же класса, т.е. белков, связьівающихся с ТКАБ2, или с функционально родственньіми белками, и участвующими в процессе внутриклеточной передачи сигнала. «

В зтом применений может бьіть использована вьішеупомянутая дрожжевая двухгибридная система или может в с бьіть использована недавно разработанная система, использующая гибридизацию при нестрогих условиях с . последующим ПЦР клонированием (У/ЇЇК5 еї аї!., 1989). а (М) Еще одним подходом для использования кодируемьх белков данного изобретения, их аналогов, фрагментов или производньїх является их использование в способах аффинной хроматографии для вьіделения

М идентификации других белков или факторов, с которьіми они способнь! связьваться, например, белков, -І родственньїх ТКАБ2 или другим белкам или факторам, участвующим в процессе внутриклеточной передачи сигнала. В зтом применений белки, их аналоги, фрагменть! или производнье данного изобретения могут бьіть - индивидуально присоединеньі к матриксам аффинной хроматографии и затем приведень в контакт с о клеточньми зкстрактами или вьіделенньіми белками или факторами, которье, как предполагается, участвуют в 5о процессе внутриклеточной передачи сигнала. После процедурьї аффинной хроматографии другие белки или со факторь, которьіе связьіваются с зтими белками, их аналогами, фрагментами или производньіми, могут бьіть

Ге злюировань, вьіделень и охарактеризовань. (мі) Как отмечалось вьіше, белки, их аналоги, фрагменть! или производнье данного изобретения могут бьіть также использованьі в качестве иммуногенов (антигенов) для получения специфических антител к ним. Зти боб антитела могут бьіть таюке использовань! для целей очистки белков данного изобретения либо из клеточньїх зкстрактов, либо из линий трансформированньх клеток, продуцирующих их, их аналоги или фрагменть!. Далее, (Ф, зти антитела могут бьіть использованьі в диагностических целях для идентификации нарушений, связанньмх с ка аномальньм функционированием рецепторной системь, в которой они функционируют, например, при сверхактивньїх или недостаточно активньїх индуцируемьх ТКАБ2 клеточньїх зффектах. Так, если такие бр нарушения связаньі с нарушением функционирования внутриклеточной системь! передачи сигнала, в которой участвуют белки данного изобретения, то такие антитела могли бь служить в качестве важного диагностического инструмента. Термин "антитела" включает поликлональнье антитела, моноклональнье антитела (тАбБ), химернье антитела, антиидиотипические (апіїі-І4) антитела к антителам, которье могут бьіть меченьїми, в растворимой или связанной форме, а также их фрагменти, такие как, например, фрагменть! Рар и 65 Каб)», лишеннье фрагмента Ес интактного антитела, которне способнь! связьівать антиген. (мі) Антитела, в том числе фрагментьь антител, применимье в данном изобретенийи, могут бьть использованьї для количественного или качественного детектирования клонов данного изобретения в пробе или для детектирования присутствия клеток, которье зкспрессируют клонь! данного изобретения. Зто может бьіть вьіполнено при помощи способов иммунофлуоресценции, использующих флуоресцентно меченье антитела, в бочетаний с микроскопическим (световой микроскоп), проточноцитометрическим или флуорометрическим детектированием.

Антитела (или их фрагментьї), применимьсе в данном изобретений, могут бьіть использовань! гистологически, например, в иммунофлуоресцентной или иммунозлектронной микроскопии, для обнаружения іп зйи клонов данного изобретения. Детектирование іп зі может бьіть вьіполнено путем взятия гистологического образца из /о пациента и предоставления меченого антитела данного изобретения такому образцу. Антитело (или фрагмент) предпочтительно предоставляется нанесением или наложением меченого антитела (или его фрагмента) на биологическую пробу. Посредством использования такой процедурьї можно определить не только присутствие клона, но также его распределение на испьітуемой ткани. Специалисть! с обьічной квалификацией в данной области легко поймут, что с использованием данного изобретения любье из большого разнообразия 7/5 Гистологических способов (такие как процедурь! окрашивания) могут бьіть модифицировань! для достижения детектирования іп зіш.

Такие тесть для клонов данного изобретения обьічно предусматривают инкубирование, биологической пробьї, такой как биологическая жидкость, зкстракт ткани, свежесобраннье клетки, такие как лимфоцить! или лейкоцить, или клетки, которье инкубировались в культуре ткани, в присутствий детектируемо меченого го антитела, способного идентифицировать кодируемье белки, и детектирование антитела любьм из ряда способов, хорошо известньїх в данной области. (мії) Кодируемье белки данного изобретения могут бьіть также использованьі в качестве непрямьх модуляторов ряда других белков, благодаря их способности связьіваться с другими внутриклеточньіми белками, причем другие внутриклеточнье белки непосредственно связьвают еще и другие внутриклеточнье белки или с г Внутриклеточньйй домен трансмембранного белка.

С целью омодулирования зтих других внутриклеточньх белков или внутриклеточньїх доменов і) трансмембранньїх белков белки данного изобретения могут вводиться в клетки рядом путей, упомянутьїх здесь вьіше.

Следует отметить, что вьіделение, идентификация и характеристика белков данного изобретения может б зо Ввіполняться с применением хорошо известньїх стандартньїх процедур скрининга. Например, одной из таких процедур является дрожжевая двухгибридная процедура, которую использовали для идентификации белков со данного изобретения. Могут бьіть также применень! другие процедурьі, такие как аффинная хроматография, со процедурь! гибридизации ДНК и т.д., такие, которье хорошо известньі в данной области, для вьіделения, идентификации и характеристики белков данного изобретения или для вьіделения, идентификации и -- з5 Характеристики дополнительньїх белков, факторов, рецепторов и т.д., которьіе способнь! связьіваться сбелками (М данного изобретения.

Кроме того, бьіло обнаружено, что белки, которніе связьіваются с белками данного изобретения, могут сами использоваться аналогично использованию белков данного изобретения, описанному вьіше и ниже, для вьіделения, идентификации и характеристики других белков, факторов и т.д., которне способнь! связьіваться с « 70 белками, связьвающими солки данного изобретения, и которье могут представлять собой факторні, в с участвующие далее по ходу процесса трансдукции сигнала или которьіе могут иметь собственнье активности

Й передачи сигнала и, следовательно, могли бьі представлять собой белки, участвующие в отличающемся а процессе передачи сигнала.

Последовательности ДНК и кодируемье белки данного изобретения могут бьть полученьй любой стандартной процедурой с применением рекомбинантньхх ДНК (см., например, Затьгоок еї аї!., 1989), в которой -І подходящие зукариотические или прокариотические клетки-хозяева трансформируют подходящими зукариотическими или прокариотическими векторами, содержащими последовательности, кодирующие зти - белки. Таким образом, данное изобретение относится также к таким зкспрессирующим векторам и о трансформированньїм хозяевам для получения белков данного изобретения. Как упоминалось вьіше, зти белки 5р Включают также их биологически активнье аналоги, фрагментьі и производнье и, следовательно, векторь, со кодирующие их, также включают векторьї,, кодирующие аналоги и фрагментьії озтих белков, и

Ге трансформированнье хозяева включают хозяев, продуцирующих такие аналоги и фрагментьі. Производнье зтих белков являются производньіми, получаемьми стандартной модификацией белков или их аналогов или фрагментов, продуцируемьїх трансформированньїми хозяевами. 5Б Данное изобретение относится также к фармацевтическим композициям для модулирования зффектов, опосредованньїх ТКАЕ2. Зти фармацевтические композиции содержат в качестве активного ингредиента любой (Ф, один или несколько компонентов из следующих: () одну или несколько последовательностей ДНК данного ка изобретения или их частей, субклонированньїх в подходящий зкспрессирующий вектор; (ії) белок данного изобретения, его биологически активнье фрагменть, аналоги, производньсе или их смеси; (ії) рекомбинантньй бо Вирусньй вектор (вирус животного), кодирующий белок данного изобретения, его биологически активнье фрагменть, аналоги или производньє.

Фармацевтические композиции вводят в соответствии с подлежащим лечению заболеванием и в количествах, благоприятньїх для пациента, в зависимости от веса тела и других факторов, определяемьх врачом. 65 Как отмечалось вьіше, одним из характерньїх вариантов ТКАР-связьівающих белков данного изобретения является ТКАГ2-связьівающий белок МІК. На основе открьітий данного изобретения, что МІК специфически связьівается с ТКАРБ2 и в связанном виде является медиатором/модулятором ТКАЕ2 и может, следовательно, медиировать/модулировать активность ТКАБ2 в активации МЕ-КВ и, следовательно, его возможную роль в путях вьіживания клеток, в которьїх ТКАБ2 функционирует независимо или в сочетаниий с другими белками (например, ТМЕ-рецепторами р55 и р75, рецептором ЕАБ/"АРО1, МОКТ-1, КІР и ТКАОО), важньім является создание лекарственньїх средств, которье могут усиливать или ингибировать по желанию взаймодействие

ТКАР2-МІК. Например, в случає, когда желательно увеличение клеточной цитотоксичности, индуцируемой ТМЕ, бьіло бьї желательно ингибировать индукцию МЕ-КВ путем ингибирования взаймодействия ТКАБ2-МІК или путем специфического ингибирования ТКАБ2 или МІК. Подобньм образом, например, в случає, когда /р0 жЖелательно ингибирование клеточной цитотоксичности, индуцируемой ТМЕ, бьло бь желательно усилить индукцию МЕ-КВ путем усиления взаймодействия ТКАБ-МІК или путем усиления ТКАБ2- и/или

МІК-специфической индукции МЕ-КВ. Имеется много болезней, в которьїх подобнье лекарственнье средства могут оказать большую помощь. Среди прочих, (см. также обсуждение вьіше) находятся острьій гепатит, в котором острое повреждение печени отражаєт, по-видимому, опосредованную рецептором РАБ/АРОЇ1 гибель /5 Кклеток печени после индукции лигандом РАЗ; аутоиммунную гибель клеток, такую как гибель р-клеток

Лангерганса поджелудочной железь, приводящую к диабету; гибель клеток при отторжении трансплантата (например почки, сердца и печени); гибель олигодендроцитов в мозгу при множественном склерозе и ингибируемьій СПИДоОмМ суицид Т-клеток, которьій вьізьівает пролиферацию вируса СПИДа и, следовательно, заболевание СПИД.

В таких случаях бьіло бьї желательно ингибирование медиируемого рецептором ЕАБ/АРО1 пути клеточной цитотоксичности (апопто-за) и усиление медиируемой рецептором ГАБ/АРО1 индукции МЕ-кВ через ТКАБ2 и взаймодействие ТКАРГ2-МІК. Одним путем для зтого бьіло бьї увеличение количества МІК в зтих клетках или увеличение количества ТКАБ2 и МІК таким образом, чтобьі МІК- или ТКАБ2-МІК-медиируемая индукция активации МЕ-КВ увеличилась, обеспечивая вьісокие уровни активации МЕ-КВ и, следовательно, вьїживания с

Кклеток; или таким образом, чтобьї прямое или опосредованное взайимодействие рецептора ГЕАБ/АРО1 и ТКАБЕ2 (или ТКАБ2-МІК) увеличилось, приводя к уменьшению взаймодействий рецептора ГАБ/АРО1 с медиаторами о клеточной цитотоксичности (например, с МАСН, см. схему на Фиг.25), для обеспечения увеличения индукции активации МЕ-КВ и вніживания клеток.

Напротив, в случає, например, опухолей и инфицированньх клеток (см. также обсуждение вьіше) бьіло бьі ду зо жЖелательно увеличение медиируемой рецептором РАБ/АРОТ1 клеточной цитотоксичности для индукции усиленной гибели зтих клеток. В зтом случає бьіло бьї желательно ингибирование взаймодействий рецептор со

ЕАБ/АРО1-ТКАБ2 (или -ТКАБ2-МІК) и/или прямое ингибирование МІК и тем самьм снижение индукции Ге) активности МЕ-КВ.

Возможно, что МІК или одна или несколько из его изоформ, один или несколько из его аналогов или (77 Фрагментов могут служить в качестве "природньїх" ингибиторов самого МІК или взаймодействия МІК-ТКАБ2ив Кк. таком качестве служить в качестве ингибиторов индукции активации МЕ-КВ. Такие ингибиторь! могут, следовательно, применяться в качестве описанньїх вьіше специфических ингибиторов, например, ингибиторов, которье можно использовать, когда зто желательно, для увеличения клеточно-цитотоксических зффектов ТМЕ или лиганда рецептора ГАБЗ/АРО!1 для увеличения гибели клеток. В самом деле, как описано в примерах ниже, « различнье аналоги и мутеинь! МІК бьли вьіделень в соответствии с данньім изобретением, которне являются 8 с киназа-недостаточньмми аналогами/мутеинами и которье способньі ингибировать индукцию активации МЕ-КВ, й опосредованную рецепторами ТМЕ, рецептором РГАБ/АРО1, их ассоциированньми белками ТКАБО, КІР и «» МОКТ-1; а также опосредованной рецептором 1І-1 (которьій активируется через МІК, но независимо от ТКАЕ2), а также опосредованную бактериальньм зндотоксином (ІГРБ5), миристатом-ацетатом форбола и белком ТАХ 45. НТІМ-1. Подобньім образом другие вещества, такие как пептидьі, органические соединения, антитела и т.д., -І также могут бьть подвергнутьї скринингу для получения специфических лекарственньїх средств, которье способньї ингибировать взаимодействие ТКАРГ2-МІК или активность МІК. - Подобньім образом, когда желательно увеличение активации МЕ-КВ в различньїх ситуациях, описанньх о вьше, можно, например, увеличить количество МІК и/или ТКАБ2 в клетках различньми стандартньми способами, указанньмми здесь вьіше (например, введением ДНК, кодирующей МІК и/или ТКАБ2, в клетки для бо индукции увеличенной зкспрессии или получением подходящих препаратов, содержащих МІК и/или ТКАРЕ2, для (Че) прямого введения в клетки, или любьїм другим путем, известньмм специалистам в данной области). Подобньім образом, другие вещества, такие как пептидьі, органические соединения, антитела и т.д., также могут бьть подвергнутьї скринингу для получения специфических лекарственньїх средств, которье способньі усиливать активность МІК или усиливать взаймодействие ТКАР2-МІК.

Неограничительньйй пример того, как могли бьї бьіть сконструировань! и подвергнуть! скринингу пептиднье (Ф, ингибиторьї взаимодействия МІК-ТКАРБ2, основан на предшествующих исследованиях пептидньїх ингибиторов ко ІСЕ или ІСЕ-подобньїх протеаз, субстратной специфичности ІСЕ и стратегий анализа зпитопов при помощи синтеза пептидов. Бьіло обнаружено, что минимальньм требованием для зффективного расщепления пептида бо СЕ является участие четьірех аминокислот слева от сайта расщепления с сильньм предпочтением в отношений аспарагиновой кислотьї в положениий Р. и с метиламином справа от положения Р. (5іеайй еї аї., 1990; Номага ей аїЇ., 1991; Трогпрегу еї аїЇ.,, 1992). Кроме того, флуорогенньій субстратньй пептид (тетрапептид), ацетил-Авзр-СІШ-МаІ-Авзр-а-(4-метилкумарил-7-амид), в аббревиатуре Ас-ОЕМО-АМС, соответствует последовательности в поли(АЮР-рибоза)-полимеразе (РАКР), которая, как бьло найдено, 65 расщепляется в клетках вскоре после стимуляции ГАЗ-К, а также других процессов апоптоза (Кашїтапп, 1989;

Кашцтапп еї аї., 1993; І агебрпік еї а!., 1994), и расщепляется зффективно СРРЗ32 (членом семейства протеаз

СЕОЗЛ/ЛСЕ) и протеазами МАСИ.

Поскольку Азр в положенийи Р. зтого субстрата, по-видимому, является важньім, тетрапептидьі, имеющие

Авзр в качестве четвертого аминокислотного остатка и различнье комбинации аминокислот в первьіїх трех положениях остатков, могут бьіть подвергнуть! бьістрому скринингу на связьівание с активньм сайтом протеаз с применением, например, способа, разработанного Сеузеп (Сеузеп, 1985; Сеузеп еї аї., 1987), где большое число пептидов на твердьїх подложках подвергали скринингу на специфические взаймодействия с антителами.

Связьвание протеаз МАСН со специфическими пептидами может бьїть детектировано многочисленньми хорошо известньми способами в пределах квалификации специалистов в данной области, такими как /о радисактивное мечение и т.д. Бьіло показано, что зтим способом Сеузеп можно тестировать по меньшей мере 4000 пептидов за каждьй рабочий день.

Подобньм образом может бьть вьіяснен точньій район связьшания или район гомологии, которьй определяет взаймодействие между ТКАЕ2 и МІК (или между любьім другим ТКАЕ-белком и ТКАБ-связьівающим белком), и затем могут бьіть подвергнуть! скринингу пептидь, которне могут участвовать в ингибирований зтого /5 Ввзаймодействия, например, синтезированнье пептидь, )йимеющие последовательность, сходную с последовательностью района связьівания или комплементарную ей, которье могут конкурировать с природньім

МІК (или ТКАРБ-связьівающим белком) за связьівание с ТКАРЕ2 (или ТКАБЕ).

Поскольку может бьїть вьігодньім конструирование пептидньїх ингибиторов, которье селективно ингибируют взаймодействия ТКАБ2-МІК (или взаймодействие ТКАБЕ-ТКАР-связьвающий белок) без вмешательства в 2о процессьі! физиологической смерти клеток, в которьїх участвуют другие члень! пути внутриклеточной передачи сигнала, например, МАСН протеазьі пути смерти клеток, которне являются членами семейства протеаз

СЕОЗ/ЛСЕ, пул пептидов, связьівающихся с ТКАБ2 (или ТКАРЕ) или МІК (ТКАР-связьвающие белки) в таких тестах, как описанньїйй вьіше тест, может бьіть синтезирован далее в виде флуорогенного субстратного пептида для тестирования избирательного связьівания с такими белками для отбора только белков, специфических для с дв ТКАГ2/МІК (или ТКАР/ТКАР-связьівающий белок). Пептидьі, которніе согласно зтому тестированию являются, например, специфическими для ТКАЕ2/МІК, могут бьіть затем модифицировань! для увеличения проницаемости і) в клетку и ингибирования активности ТКАБ2 и/или МІК обратимо или необратимо. Трогпреггу еї аї., (1994) сообщил, что тетрапептид (ацилокси)метилкетон-Ас-Туг-МаІ-АІа-Азр-СНьОС(О)-(2,6-(СЕ5)2|Р п бьіл сильнодействующим инактиватором ІСЕ. Подобньм образом, Міїййдап ейї аїЇ., (1995) сообщили, что Ге! зо Ттетрапептиднье ингибиторьі, имеющие хлорметилкетоновую (необратимо) или альдегидную (обратимо) группь, ингибировали ІСЕ. Кроме того, бьіло показано, что бензилоксикарбоксил-Азр-СНОС(О)-2,6-дихлорбензол (ОСВ) со ингибирует ІСЕ (Магпіта еї а/!., 1995). Таким образом, аналогичньїм путем, тетрапептидь, которне избирательно со связьшваются, например, с ТКАБ2 или МІК, могут бьїть модифицированьі, например, альдегидной группой, хлорметилкетоновой, (ацилокси)метилкетоновой или СНоОС(0О)-ОСВ-группой с ополучением опептидного (87 ингибитора активности ТКАЕ2/МІК. Кроме того, для улучшения проницаемости пептидь! могут бьіть, например, ї- химически модифицировань или дериватизовань! для повьішения их проницаемости через клеточную мембрану и облегчения транспорта таких пептидов Через мембрану и в цитоплазму. Мигапізпі еї аї. (1991) сообщили о получении производного тиротропин-вьісСвобождающего гормона путем присоединения лауриновой кислоть! с образованиегм липофильного лауроилпроизводного с хорошими характеристиками проницаемости через « Кклеточнье мембрань!. 7аснагіа еї а). (1991) также сообщил об окислений метионина до сульфоксида и замене ств) с пептидной связи ее кетометиленовьім изозфиром (СОСН 5) для облегчения транспорта пептидов через клеточную мембрану. Зто лишь некоторье из известньїх модификаций и производньїх, которье хорошо ;» известньі! специалистам в данной области.

Кроме того, лекарственнье средства или пептиднье ингибиторь), которье способнь ингибировать активность, например, МІК путем ингибирования взаймодействия МІК-ТКАБ2 и также взаймодействие между -І ТКАБ-белками и ТКАРБ-связьівающими обелками, могут бьть коньюгированььв или комплексировань! с молекулами, которніе облегчают вхождение в клетку. - В Ц.5. Раїепі 5149782 описано коньюгирование транспортируемой через клеточную мембрану молекуль! с о мембраноуплотняющим агентом, таким как образующие слитье белки (Тизодепіс) полипептидьі, образующие Моннье каналь! полипептидь!, другие мембраннье полипептидь! и жирньсе кислоть! с длинной цепью, например, со миристиновая кислота, пальмитиновая кислота. Зти мембраноуплотняющие агентьї вводят молекулярнье

Ге коньюгать! в липидньїй бислой клеточньїх мембран и облегчают их вхождение в цитоплазму.

Їом/ еї аіІ., 0.5. Раїепі 5108921 дает обзор доступньїх способов для трансмембранной доставки молекул, таких как (но не ограниченньїх ими) белки и нуклеиновье кислотьії, по механизму опосредованной рецепторами в ЗнДОЦИТОТИЧеской активности. Зти рецепторнье системь! включают системьі), узнающие галактозу, маннозу, маннозо-б-фосфат, трансферрин, асиалогликопротеин, транскобаламин (витамин В.42), о-2-макроглобулинь, іФ) инсулин и другие пептиднье факторь роста, такие как зпидермальньй фактор роста (ТОР). ом еї аї. ко утверждает, что рецепторь! питательньїх веществ, такие как рецепторь! биотина и фолата, могут бьїть с вьігодой использованьь для усиления транспорта Через клеточную мембрану вследствие расположения и бо Ммногочисленности рецепторов биотина и о фолата на поверхностях мембран большинства клеток и опосредованньїх ассоциированньм рецептором процессов трансмембранного транспорта. Таким образом, комплекс, образованньій между доставляемьм в цитоплазму соединением и лигандом, таким как биотин или фолат, контактирует с клеточной мембраной, несущей рецепторьі биотина или фолата, с инициацией опосредованного рецептором механизма трансмембранного транспорта и тем самьм позволяет вхождение 65 Желательного соединения в клетку.

Мзвестно, что ІСЕ обладает способностью вьіносить либеральнье замень в положении Ро и зта толерантность к либеральньм заменам бьла использована для создания сильной и вьісокоселективной аффинной метки, содержащей биотиновьій "ярльк" (Трогпрегту еї а!., 1994). Затем, положение Р 5, а также, возможно, М-конец тетрапептидного ингибитора могут бьіть модифицированьї или дериватизованьі, например, присоединением молекуль! биотина, для усиления проницаемости зтих пептидньх ингибиторов через клеточную мембрану.

Кроме того, в данной области известно, что слияние желательной пептидной последовательности с лидерной/сигнальной пептидной последовательностью с образованием "химерного пептида" позволит такому "химерному пептиду" транспортироваться через клеточную мембрану в цитоплазму. 70 Как должно бьть понятно специалистам в области пептидов, пептидньіе ингибиторьї взаймодействия

ТКАБ-ТКАРБ-связьівающий белок, например, взаймодействия ТКАР2-МІК, в соответствии с данньм изобретением, включают пептидомиметические лекарственнье средства или ингибиторьі, которье могут бьіть также подвергнуть! бьістрому скринингу на связьівание, например, с ТКАЕ2/МІК для создания по возможности более стабильньїх ингибиторов.

Также должно бьїть понятно, что те же самьне средства для облегчения или усиления транспорта пептидньх ингибиторов Через клеточнье мембрань, которье рассмотреньй вьше, применимь также к самим

ТКАР-связьівающим белкам, например, МІК, его аналогам, фрагментам или его изоформам, а также к другим пептидам и белкам, которне проявляют их действие (зффектьї) внутриклеточно.

Что касается упоминаемьх во всем описаний антител, термин "антитело" включает поликлональнье го антитела, моноклональнье антитела (тАбр), химернье антитела, антиидиотипические (апі-І4) антитела к антителам, которье могут бьіть меченьми, в растворимой или связанной форме, а также их фрагменть, обеспечиваемье любьм известньм способом, таким как (но не только) ферментативное расщепление, пептидньїй синтез или рекомбинантньсе способь.

Поликлональнье антитела являются гетерогенньмми популяциями молекул антител, полученньми из с г бьівороток животньх, иммунизированньх антигеном. Моноклональное антитело содержит в основном гомогенную популяцию антител, спедифическую в отношений антигенов, причем такая популяция содержит по і) существу одинаковье сайть! связьвания зпитопа. МАБ могут бьіть получень! согласно способам, известнь!м специалистам в данной области. См., например, Копіег апа Міївівїп, Маїцге, 256:495-497 (1975); 0.5. Раїепі

Мо. 4376110, А!йзивеї еї аї., едв., Нагіожм апа Гапе АМТІВООСІЕ5: А ГАВОКАТОКУ МАМОАГ, Соїа 5ргіпд Нагрог Ге! зо Гарогагу (1988) и Соїйїдап еї аї., ейв., Ситепі Ргоїосоїв іп Іттипоіюду, Сгеєепе Рибіїзпіпу Авзос. апа

УМіеу Іпіегзсіепсе М.У., (1992-1996), содержание которьїх включено здесь полностью в качестве ссьілки. Такие со антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, в том числе Ідс, ІМ, І9ЗЕ, ЗА, СІГО и к любому со их подклассу. Гибридому, продуцирующую тАБ данного изобретения, можно культивировать іп мігго, іп зйШ или іп мімо. Получение вьісоких титров тАБ іп мімо или іп зіш делаєт зтот способ предпочтительньм способом их /ї7 з5 получения. ча

Химернье антитела представляют собой молекуль!, различнье части которьїх происходят из различньх видов животньїх, такие антитела, как имеющие вариабельную область, произведенную из мьішиного тАБ, и константную область иммуноглобулина человека. Химернье антитела используют первично для снижения иммуногенности в применений и для увеличения вьїходов в получении, например, когда мьішинье тАб имеют « Ввісокие вьїходьІ из гибридом, но вьісокую иммуногенность в организме человека, применяют химернье в с человек/мьішь тАбБ. Химерньсе антитела и способьї их получения известнь! в данной области (СаріШу еї а!., Ргос.

Майн, Асад. Зсі. ОБА 81:3273-3277 (1984); Моїтівоп еї аіЇ., Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 81:6851-6855 (1984); ;» Вошіаппе еї аїЇ.,, МаїйшШге 312:643-646 (1984); Сарійу ей аЇ., Европейская патентная заявка 125023 (опубликована 14 ноября 1984); Мецйбрегдег еї аІЇ., Магиге 314:268-270 (1985); Тапідиспі еї аІ., Европейская патентная заявка 171496 (опубликована 19 февраля 1985); Могтізоп еї аі., Европейская патентная заявка 173494 -І (опубликована 5 марта 1986); Мешйибрегоег еї аі., РСТ заявка УУО 8601533, (опубликована 13 марта 1986); Кидо еї аі., Европейская патентная заявка 184187 (опубликована 11 июня 1986); Западап еї аї., 9. Іттипо). - 137:1066-1074 (1986); Кобіпзоп еї аІ., Муждународная заявка Мо. УМО 8702671 (опубликована 7 мая 1987); іш еї

Го! аі., Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 84:3439-3443 (1987); Зип еї аїЇ. Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 84:214-218 (1987); Вецег еї аЇ., Зсіепсе 240:1041-1043 (1988); и Нагпомж апа І апе. АМТІВООСІЕ5: А І АВОКАТОКУ МАМОАЇ, со зирга. Зти ссьілки включень! здесь полностью в качестве ссьІлки.

Ге) Антиидиотипическое (апіі-ІЯ) антитело представляеєт собой оантитело, которое узнает уникальнье детерминантьі, оббічно ассоциированнье с антигенсвязьиівающим сайтом антитела. Антитело |і может бьть получено иммунизацией животного того же самого вида и генетического типа (например, штамма мьіши), что и ов Мсточник тАБ, к которому получают апі-ід. Иммунизированное животное будет узнавать и отвечать на идиотипические детерминанть! иммунизирующего антитела путем образования антитела к зтим идиотипическим

Ф) детерминантам (антитело апії-І4). См., например, 0.5. Райепі Мо. 4699880, которьій включен здесь полностью в ка качестве ссьлки.

Апіі-Ід антитело может также использоваться в качестве "иммуногена" для индукции иммунного ответа в еще бо одном другом животном, продуцирующем так назьіваемое апії-апі-Ід антитело. Апії-апі-І4 антитело может бьіть зпитопно идентичньіїм исходному тАб, которое индуцировало апії-Ід. Таким образом, с использованием антител к идиотипическим детерминантам тАБ можно идентифицировать другие клоньі, зкспрессирующие антитела идентичной специфичности.

Таким образом, тАБ, образованнье против ТКАРБ-связьвающих белков, их аналогов, фрагментов или 65 производньх, (например, МІК, его изоформ, аналогов, фрагментов или производньїх) данного изобретения могут бьїть использованьі для индукции апіїі-І(ї антител в подходящих животньїх, таких как мьіши ВАЇ В/с. Клетки селезенки из таких иммунизированньїх мьішей используют для получения апіі-Ії гибридом, секретируюших апіі-ІА тАБ. Далее, апіі-Ії тАбБ могут бьіть связаньі! с носителем, таким как гемоцианин фиссурелль (КІ Н) и использованьії для иммунизации других мьішей ВАЇ В/с. Сьіворотки из зтих мьішей будут содержать апії-апіі-Іа антитела, которне имеют связьвающие свойства исходного тА, специфического для зпитопа вьішеупомянутого ТКАЕБ-связьивающего белка или его аналогов, фрагментов и производньх.

Таким образом, апіі-ії тАбБ имеют их собственнье идиотипические зпитопьі или "идиотопь!", структурно одинаковье с оцениваемьїм зпитопом, таким как протеин-а СКВ.

Термин "антитело" включает также как интактнье молекульї, так и их фрагменть, такие как, например, Раб и /0 (аб)2, которье способньі! связьивать антиген. Бар- и Е(абБ')2-фрагментьї лишень Ес-фрагмента интактного антитела, вьіводятся более бьістро из кровообращения и могут иметь меньшее неспецифическое связьівание, чем интактное антитело (УМапй!і еї аї., 9). Мисі. Мед. 24:316-325 (1983)).

Должно бьїть понятно, что Раб и К(аб)2 и другие фрагменть! антител, применимье в данном изобретений, могут бьіть использованьі для детектирования и количественного определения ТКАР-связьівающего белка в 7/5 Сбоответствий со способами, описанньми здесь для интактньїх молекул антител. Такие фрагменть! обьічно образуются при протеолитическом расщеплениий с использованием таких ферментов, как папаийн (для получения Рар-фрагментов) или пепсин (для получения К(аб')2-фрагментов).

Об антителе говорят, что оно "способно связьівать" молекулу, если оно способно специфически реагировать с зтой молекулой со связьванием зтой молекульі с антителом. Термин "зпитоп" относится к части любой 2о молекуль, способной связьіваться антителом, которая может таюке узнаваться зтим антителом. Зпитопь! или "антигеннье детерминанть" обьічно состоят из химически активньїх поверхностньїх групп молекул, таких как боковьіе цепи аминокислот или сахаров, и имеют специфические трехмернье структурнье характеристики, а также специфические характеристики заряда. "Антиген" представляет собой молекулу или часть молекульі, способную связьнваться антителом, которая с Ддополнительно способна индуцировать животное к образованию антитела, способного связьіваться с зпитопом зтого антигена. Антиген может иметь более одного зпитопа. Термин специфическая реакция, использованньй і) вьше, предназначен для указания на то, что данньій антиген будет реагировать вьісокоизбирательно с его соответствующим антителом, но не с множеством других антител, которье могут индуцироваться другими антигенами. б зо Антитела, в том числе фрагменть! антител, применимье в данном изобретении, могут бьіть использовань для количественного или качественного детектирования ТКАР-связьівающего белка (например, МІК) в пробе со или для детектирования присутствия клеток, которне зкспрессируют ТКАРБ-связьвающий белок данного со изобретения. Зто может бьіть вьіполнено иммунофлуоресцентньми способами, использующими флуоресцентно меченое антитело (см. ниже), в сочетаний с микроскопическим (световой микроскоп), проточно-цитометрическим (8-7 з5 Мли флуорометрическим детектированием. ча

Антитела (или их фрагментьї), применимьсе в данном изобретений, могут бьіть использовань! гистологически, например, в иммунофлуоресцентной или иммунозлектронной микроскопии, для обнаружения іп війїш

ТКАР-связьівающего белка данного изобретения. Детектирование іп зіш может бьіть вьіполнено путем взятия гистологического образца из пациента и предоставления меченого антитела данного изобретения такому « образцу. Антитело (или фрагмент) предпочтительно предоставляется нанесением или наложением меченого в с антитела (или его фрагмента) на биологическую пробу. Посредством использования такой процедурь! можно определить не только присутствие ТКАЕ-связьивающего белка, но также его распределение на испьітуемой ;» ткани. Специалисть! с оббічной квалификацией в данной области легко поймут, что с использованием данного изобретения любье из большого разнообразия гистологических способов (такие как процедурь! окрашивания) Могут бьіть модифицировань! для достижения детектирования іп зі. -І Такие тесть! для ТКАР-связьівающего белка данного изобретения обьічно предусматривают инкубирование биологической пробьії, такой как биологическая жидкость, зкстракт ткани, свежесобраннье клетки, такие как - лимфоцить или лейкоцить, или клетки, которье инкубировались в культуре ткани, в присутствии детектируемо о меченого антитела, способного идентифицировать ТКАР-связьивающий белок, и детектирование антитела любьм из ряда способов, хорошо известньїх в данной области. со Биологическая проба может бьіть обработана твердофазньм носителем или нанесена на твердофазную

Ге подложку, такую как нитроцеллюлоза, или обработана с применением другого твердого носителя или подложки, которье способньії иммобилизовать клетки, клеточнье частицьі или растворимье белки. Затем положка или носитель могут бьїть промьїтьї подходящими буферами с последующей обработкой детектируемо меченьм боб антителом данного изобретения, как упоминалось вьіше. Затем твердофазная подложка или носитель могут бьїіть промьїть! второй раз буфером для удаления несвязанного антитела. Затем количество связанной метки на (Ф, твердой подложке или носителе может бьіть детектировано общепринятьми средствами. ка Под "твердофазной подложкой", твердофазньм носителем", "твердой подложкой", "твердьім носителем", "подложкой" или "носителем" подразумевают любую подложку или носитель, способнье связьівать антиген или бор антитела. Хорошо известнье подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полизтилен, декстран, найлон-амилазьії, природнье и модифицированнье целлюлозьі, полиакриламидь, дарбгоз и магнетит.

Природа носителя может бьть либо до некоторой степени растворимой, либо нерастворимой для целей данного изобретения. Материал подложки может иметь практически любую возможную структурную конфигурацию до тех пор, пока связанная с ним молекула способна связьвваться с антигеном или антителом. 65 Так, конфигурация подложки или носителя может бьіть сферической, в виде гранульі, цилиндрической, в виде внутренней поверхности тест-пробирки или наружной поверхности стержня. Альтернативно, зта поверхность может бьть плоской, такой как пластинка, тест-полоска и т.д. Предпочтительнье подложки или носители включают гранульі из полистирола. Специалистам в данной области могут бьіть известньі другие подходящие носители для связьивания антитела или антигена или они смогут установить их при помощи рутинного Зкспериментирования.

Связьвающая активность приведенного разнообразия антител данного изобретения, описанного вьіше, может бьть определена при помощи хорошо известньїх способов. Специалистьі в данной области смогут определить рабочие и оптимальнье тест-условия для каждого определения при помощи рутинного зкспериментирования. 70 Другие стадии, такие как промьівание, встряхивание, фильтрование и т.п., могут бить присоединень к зтим тестам, как зто принято или необходимо для конкретной ситуации.

Одним из способов, при помощи которого антитела данного изобретения могут бьть детектируемо помечень, является способ соединения их с ферментом и использования в ферментном иммуно-анализе (ЕЇА).

Зтот фермент, в свою очередь, при зкспонирований позже с подходящим субстратом будет реагировать с 7/5 субстратом таким образом, чтобьї образовалась химическая частица, которая может бьть детектирована, например, спектрометрическим, флуорометрическим способами или визуально. Ферменть, которье могут бьіть использованьь для детектируемого мечения антитела, включают (но не оограничиваются ими) малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероидизомеразь, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, альфаглицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, го щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинзстеразу. Детектирование может бьіть вьіполнено колориметрическими способами, которне используют хромогенньй субстрат для фермента. Детектирование может бьіть также вьіполнено визуальньмм сравнением степени ферментативной реакции субстрата в сравнений с так же приготовленньіми стандартами. с

Детектирование может бьть вьіполнено при помощи любого из множества других иммуноанализов.

Например, посредством радисоактивного мечения антител или фрагментов антител можно детектировать і)

К-РТРазу при помощи радисиммуноанализа (КІА). Хорошее описание РИА может бьть найдено в І арогайгу

Тесппідцез апа Віоспетівігу іп Моіесцшіаг Віоіоду, МУогК, Т.5. еї аїЇ.,, Мой Ноїйапа Рибіїзпіпд Сотрапу, МУ (1978), конкретно в части, озаглавленной "Ап Іпігодисіоп йо Кадіоїттипе Авззау апа Кеїайей ТесНпідцев", Ге! зо Сага, Т., включенной здесь в качестве ссьлки. Радиоактивньй изотоп может бьть детектирован с использованием у-счетчика или сцинтилляционного счетчика или авторадиографии. со

Можно также метить антитело, в соответствии с данньім изобретением, флуоресцентньмм соєдинением. При о зкспонированим флуоресцентно меченого антитела на свету с правильно вьібранной длиной волньі его присутствие может бьіть затем определено по флуоресценции. Среди найболее общепринятьх соеєдинений для (77 флуоресцентного мечения находятся изотиоцианат флуоресцеина, родамин, фикозритрин, пикоцианин, че аллофикоцианин, о-фталевьй альдегид и флуорескамин.

Антитело может бьіть детектируемо помечено при помощи испускаюших флуоресценцию металлов, таких как 722Е или другие металль! ряда лантанидов. Зти металль! могут бьіть присоединень! к антителу при помощи « таких хелатирующих металл групп, как дизтилентриамин-пентауксусная кислота (ЕТРА).

Антитело может бьть детектируемо помечено соединениєм его с хемилюминесцентньм соединениєм. щей с Присутствие хемилюминесцентно меченого антитела определяют затем детектированием присутствия ц люминесценции, которая возникает в ходе химической реакции. Примерами особенно применимьх "» хемилюминесцентно метящих соединений являются люминол, изолюминол, тероматический сложньій зфир акридиния, имидазол, соль акридиния и оксалатньй зфир.

Подобньм образом для мечения оантитела данного изобретения может бьть использовано -І биолюминесцентное соединение. Биолюминесценция является типом хемилюминесценции, обнаруженньм в -з биологических системах, в котором каталитический белок увеличивает зффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют детектированием присутствия люминесценции. (ее) Важньми биолюминесцентньми соединениями для целей мечения являются люциферин, люцифераза и зкворин. бо Молекула антитела данного изобретения может бьть оадаптирована для использования в (Че) иммунометрическом оанализе, известном таюже как "двухслойньй" или "сзндвич"-анализ. В типичном иммунометрическом анализе некоторое количество немеченого антитела (или фрагмента антитела) связьувают с твердой подложкой или носителем и некоторое количество детектируемо меченого растворимого антитела добавляют для создания возможности детектирования и/или количественного определения тройного комплекса, образованного между твердофазньїм антителом, антигеном и меченьїм антителом. о Типичнье или предпочтительнье иммунометрические анализьї включают "прямье" анализь!, в которьх іме) антитело, связанное с твердой фазой сначала контактируют с испьітуемой пробой для зкстракции антигена из пробьї посредством образования двойного комплекса твердофазное антитело-антиген. После подходящего бо периода инкубирования твердую подложку или носитель промьівают для удаления остатка жидкой пробь, включающей непрореагировавший антиген, если он имеется, и затем контактируют с раствором, содержащим неизвестное количество меченого антитела (которьій действует в качестве "репортерной молекуль!"). После второго инкубационного периода для образования комплекса меченого антитела с антигеном, связанньм на твердой подложке или твердом носителе через немеченое антитело, твердую подложку или носитель 65 промьівают второй раз для удаления непрореагировавшего меченого антитела.

В другом типе "сзндвич"-анализа, которьій может также применяться с антигенами данного изобретения,

используют так назьіваемье "одновременнье" или "обратнье" анализь Одновременньій анализ включаєет в себя единственную стадию инкубирования, так как антитело, связанное с твердой подложкой или носителем, и меченое антитело добавляют к тестируемой пробе в одно и то же время. После завершения инкубирования твердую подложку или носитель промьівают для удаления остатка жидкой пробьї и не образовавшего комплекс меченого антитела. Присутствие меченого антитела, связанного с твердой подложкой или твердьм носителем, определяют затем, как и в обьічном "прямом" сзндвич-анализе.

В "обратном" анализе используют ступенчатое добавление сначала раствора меченого антитела к жидкой пробе с последующим добавлением немеченого антитела, связанного с твердой подложкой или твердьм 7/0 носителем, после подходящего периода инкубирования. После второго инкубирования твердую фазу промьшвают общепринятьім способом для освобождения ее от остатка тестируемой пробь и раствора непрореагировавшего меченого антитела. Определение меченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, определяют, как в "одновременном" и "прямом" анализах.

Как упоминалось вьіше, данное изобретение относится также к фармацевтическим композициям, 7/5 содержащим рекомбинантнье вируснье векторь! (вирус животного), кодирующие ТКАР-связьвающие белки, причем зтот вектор кодирует также поверхностньій белок вируса, способньій связьувать поверхностнье белки специфической клетки-мишени (например, раковьїх клеток), для нацеливания инсерции последовательностей

ТКАР-связьивающего белка в зти клетки. Кроме того, фармацевтические композиции данного изобретения содержат в качестве активного ингредиента (а) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую 2о антисмьсловую последовательность последовательности ТКАР-связьивающего белка, или (Б) лекарственнье средства, которье ингибируют взаимодействие ТКАЕБЕ-связьивающий белок-ТКАЕ.

Фармацевтические композиции в соответствии с данньім изобретением включают достаточное количество активного ингредиента для достижения намеченной цели. Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемье носители, включающие зксципиенть! и вспомогательнье с г Ввещества, которне облегчают обработку активньїх соединений в препарать, которне могут использоваться фармацевтически, и которье могут стабилизировать такие препаратьї, предназначеннье для введения і) субьекту, нуждающемуся в таком введений, как хорошо известно специалистам в данной области.

Предполагается, что ТКАР-связьівающий белок и его изоформь! или изотипьї зкспрессируются в различньх тканях при заметно отличающихся уровнях и, по-видимому, также с различньми распределениями изотипов б зо аналогично зкспрессии различньїх других белков, участвующих в путях внутриклеточной передачи сигнала, как показано в перечисленньїх вьіше совместньїх и ожхидающих одновременного рассмотрения патентньїх заявках. со

Зти различия могут, возможно, способствовать тканеспецифическим особенностям ответной реакции на лиганд оз

ЕАБ/АРО1 и ТМЕ. Как и в случае других СЕЮОЗ/ЛСЕ-гомологов (УУапад еї аї., 1994; АІпеттгі еї аї., 1995), авторь данного изобретения показали ранее (в вьішеупомянутьїх патентньїх заявках), что изоформь! МАСН, которье -- з5 бодержат неполнье районь СЕОЗЛСЕ (например, МАСНоЗ), обладают, как бьіло найдено, ингибирующим ча действием на активность козкспрессируемьїх молекул МАСНОо1 или МАСНО2; бьіло обнаружено также, что они ингибируют индукцию гибели клеток ЕАБ/АРОТЇ и р55-К. Зкспрессия таких ингибиторньїх изоформ может составлять механизм клеточной самозащить! против опосредованной РАБ/АРОТ и ТМЕ цитотоксичности. «

Большая гетерогенность изоформ МАСН, которая сильно превьішает гетерогенность, наблюдаемую для любой из других протеаз семейства СЕЮОЗЛСЕ, должна сделать возможной особенно тонкую настройку функции /-д с активньїх изоформ МАСН. ц В соответствии с о данньм изобретением бьли также вьіделеньь аналоги/мутеийинь! одного из "» ТКАР-связьівающих белков, а именно ТКАБ2-связьивающего белка МІК. Зти аналоги/мутейинь! МІК (см. вьіше и см. Примерьї ниже) являются ингибирующими для опосредованной МІК активации МЕ-кВ, а также

Мнгибирующими для индукции активации МЕ-КВ, опосредованной ТМЕ-рецепторами, рецептором РГАБ/АРОЇ1, -І затем родственньми белками, рецептором ІЇ/-1 и другими агентами. Таким образом, как отмечалось вьіше, -3з ТКАР-связьівающие белки или возможнье изоформь! могут иметь различающиеся зффекть! в различньїх тканях в отношений их взаймодействия с ТКЕАБЕ-белками и их влияния тем самьмм на активность ТКАЕБЕ-белков или (оо) внутриклеточной передачи сигнала, опосредованного ТКАЕ-белками.

Возможно также, что возможнье изоформь! ТКАЕ-связьвающего белка обслуживают другие функции. со Например, МІК или некоторье аналоги МІК или изоформь! могут также действовать в качестве сайтов стьіковки (Че) для молекул, которье участвуют в других, нетоксических зффектах, например, рецепторов ГАБ/АРОЇ1 и

ТМЕ-рецепторов, через взаимодействие с ТКАЕ2 или даже независимо от ТКАБ2.

Вследствие уникальной способности рецепторов РАБ/АРОЇ и ТМЕ вьізьшать смерть клеток, а также способности рецепторов ТМЕ запускать другие повреждающие клетки активности, отклонения в функции зтих рецепторов могло бь бьть особенно пагубньми для организма. В самом деле, бьіло показано, что как і) избьточное, так и недостаточное функционирование зтих рецепторов способствует патологическим ко проявлениям различньїх болезней (Магзаїр, 1992; Мадайа апа Соівіеїп, 1995). Идентификация молекул, которьіе участвуют в активности передачи сигнала зтих рецепторов, и отьіскание путей модулирования активности зтих бо молекул могло бь указать путь к новьім терапевтическим подходам. Ввиду предполагаемой важной роли белков

ТКАР, например, ТКАБ2, и, следовательно, взайимодействия ТКАБ-ТКАРБ-связьвающего белка, например,

ТКАР2-МІК, в опосредованной РАБ/АРОЇ и ТМЕ активации МЕ-КВ представляеєется особенно важньм конструирование лекарственньх средств, которье могут ингибировать взаймодействие

ТКАБ-ТКАР-связьівающий белок, например, взаймодействие ТКАРБ2-МІК, когда зто желательно для убивания 65 клеток (путем ингибирования активации МЕ-КВ), и, наооборот, когда желательно сохранить клетки, зто взаймодействие должно бьїть усилено (для усиления активации МЕ-КВ).

Данное изобретение относится также к белкам или другим лигандам, которье могут связьнваться с

ТКАР-связьівающими белками данного изобретения и тем самьм модулировать/медиировать активность

ТКАР-связьівающих белков. Такие белки или лигандь! могут бьіть подвергнуть! скринингу, вьіделеньї и получень любьм из вьішеупомянутьх способов. Например, может бьть вьіделен ряд лигандов, в том числе белков, способньїх связьіваться с белками МІК данного изобретения (в такие нове белки/лигандь! не входит известньй

ТЕКАРЕ?2 и, возможно, І-КВ, если МІК действительно связьіваєт І-КВ)..

Как подробно описано вьше, такие новье белки/лигандьі, связьівающие ТКАРБ-связьвающий белок, например, МІК-связьвающие белки, могут служить, например, в качестве ингибиторов или усилителей 70 опосредованной МІК активности или активности, опосредованной, например, взаимодействием ТКАБ2-МІК, и в качестве таковьїх будут играть важную роль в разнообразньїх патологических и других ситуациях, описанньх подробно вьіше. Другой функцией таких белков/лигандов, связьівающих ТКАР-связьваюший белок, могло бь бьть их функционирование в качестве специфических агентов для очистки ТКАРБ-связьвающих белков, например, аффинной хроматографией, причем зти новье связьвающие белки/лигандьії присоединяют к 7/5 подходящим хроматографическим матриксам для образования твердого или аффинного носителя/матрикса, через которьій будет проходить раствор, зкстракт или т.п., содержащий ТКАР-связьівающие белки, например,

МІК, и для облегчения таким образом их очистки. Такие способьї аффинной хроматографии в настоящее время хорошо известнь! и являются стандартньіми процедурами в данной области.

Подобньмм образом все вьішшеупомянутье ТКАР-связьвающие белки, аналоги, фрагментьї, изоформь! и 2о производнье данного изобретения могут бьть использованьь для очистки аффинной хроматографией различньїх ТКАРБ-белков, с которьіми они связьіваются. Например, ТКАЕ2-связьивающие белки, подобньсе МІК, и аналоги, фрагменть и мутейнь! МІК (см. примерь! ниже) могут бьіть использованьі для очистки ТКАБ2 аффинной хроматографией. Позтому тем же самьм способом, что и белок МІК, бьли вьіделеньй и получень аналоги/мутеиньї данного изобретения (см. Примерь ниже), и при помощи зтих способов и любьх других с г равноценньїх способов, вполне очевидньїх для специалистов в данной области (как подробно описано вьіше), могут бьть идентифицированьй и полученьй любье другие ТЯАГ2-связьвающие белки. Такой способ і) идентификации и получения зтих ТКАБ-связьівающих белков, например, ТКАЕ2-связьивающих белков, будет включать в себя стадию скрининга, в которой белок ТКАЕ (например, ТКАБ2) или по меньшей мере его специфическую часть (например, часть ТКАГ2 между аминокислотами 222-501) используют в качестве (ду зо субстрата или "приманки" для получения белков или любого другого лиганда, способного связьіваться с ними; с последующими стадиями идентификации и характеристики полученньїх таким образом белков/лигандов; и со затем получение таких белков/лигандов в по существу изолированньх и очищенньхх формах. Все зти стадий оз хорошо известнь! специалистам в данной области и подробно описань! здесь вьіше и ниже.

Теперь данное изобретение будет описано подробно в деталях в следующих далее неограничивающих -- з5 примерах и сопутствующих рисунках. ча

Следует отметить, что процедурь!: () двухгибридного скрининга и двухгибридного теста зкспрессии Д-галактозидазь; (її) индуцированной зкспрессии, метаболического мечения и иммунопреципитации белков; (ії) связьмшания іп міго; (ім) оценки цитотоксичности; и (М) Нозерн-анализ и секвенирование, а также другие процедурь!, использованнье в « спедующих Примерах, бьіли детально описаньі в более ранних публикациях авторов данного изобретения в 8 с отношений других белков и путей внутриклеточной трансдукции сигналов (см., например, Воіїаіп еї а!., 1995а, й 19956, и Воїаіп еї аі., 1996). Зти процедурьі описань!ї также в деталях в совместньїх окидающих одновременного и? рассмотрения |ізгаеІ! Арріїсайоп Мов. 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 и 120367, а также в соответствующей РОСТ заявке Мо. РСТ/О596/10521). Позтому полнье описания всех зтих публикаций и патентньїхх заявок включень! здесь во всей их полноте и по меньшей мере настолько, насколько зто касаєтся -І подробньїх зкспериментальньїх процедур.

Примерь! - Материаль и методь!

Го) Ї) Библиотеки кКДНК а) Библиотека кДНК В-клеток бо Использовали олиго 4аТ-праймированную библиотеку, сконструированную из В-клеток человека Оипее еї аї.,

Ге) 1993). КДНК зтой библиотеки вводили в сайт Хпо! вектора рЗЕ1107 на основе рАСТ в слитом виде с доменом активации САЇ 4.

Б) Библиотека кДНК яичка х910

Использовали библиотеку кДНК яичка человека. Зта библиотека является праймированной произвольньм гексануклеотидом библиотекой со средним размером вставки 200-400п.н. о ї) Штаммьї дрожжей іме) Для трансформации и скрининга использовали два штамма дрожжей в качестве штаммов-хозяев: штамм

НЕ7с, которьій использовали в двухгибридном скрининге, и штамм 5ЕМ526, которьй использовали бо в рД-галактозидазньїх тестах. Оба штамма несут ауксотрофньсе маркерь! Ігрі и Іец2, то есть зти штаммь! дрожжей не могут расти в минимальной синтетической среде без триптофана и лейцина, если они не трансформировань плазмидой, несущей вариантьі дикого типа зтих генов (ТКРІ, ГЕО2). Зти два штамма дрожжей несут делеционнье мутации в их генах САЇ 4 и СА 80 (мутации да14-542 и да180-538, соответственно).

Штаммь 5ЕМ52 6 и НЕ7с несут репортер Іас7 в их генотипах; в штамме ЗЕУ526 слитьій с ШАЗ и ТАТА-частью б5 промотора СБАЇ1, и в НЕ7с три копиий 17-мерной консенсусной последовательности СА/4 и ТАТА-часть промотора СУС1 слить с Іас/. Как САЇ 1 ЦАБ, так и 17-мерьі СА 4 чувствительнь! к активатору транскрипции

СА 4. Кроме того, штамм НЕ?7с несет репортер НІБЗЗ, слитьій с ШАЗ и ТАТА-частью промотора ОА 1. ії) Клонирование ТКАРБ2 человека

ТКАРЕ2 человека клонировали при помощи ПЦР из библиотеки кДНК НІ 60 (в отношений последовательности

ТКАР2 и других деталей см. Коїпе еї аї!., 1994; Коїпе еї аІ., 199582; Спепд еї аї., 1996; Нзги еї аї., 1996; и

Умаїасн, 1996). Используемьми праймерами биьіли: а) ЗО-мерньій прямой праймер САССАТССТСАТООСТОСАССТАССОТОАС, соответствующий кодирующей последовательности НТКАРБ2, начинающейся от кодона для первого метионина (подчеркнутого) и включающей линкер с сайтом Ватні. 70 в) 32-мерньй обратньій праймер

СОТСОАСТТАСАОСССТОТСАООТССАСААТО, которьїй включаєет стопкодон гена НТКАБ2 (подчеркнутьй) и сайт рестрикции зЗаї в его линкере. Программа ПЦР включала исходную стадию денатурации 2мин. при 947 с последующими 30 циклами Тмин. при 94"С, мин. при 64"С и 40сек. при 72"С. Затем амплифицированньй ген

ТКАР2 человека вводили в сайть! Ватні - ЗаїЇ вектора рОоВтТо9 в соединениий с доменом, связьівающим ДНК 75 ЗАА. їм) Двухгибридньй скрининг библиотеки В-клеток

Двухгибридньій скрининг является способом (см. детали в вьішеупомянутьїх публикациях и патентньх заявках), применяемьм для идентификации факторов, которье связань! с определенной молекулой, которая служит в качестве "приманки". В данном изобретений ТКАБ2, клонированньій в вектор рОВТ9, служил в качестве приманки. ТКАР2 козкспрессировали вместе со скринированной библиотекой кКДНК В-клеток в штамме дрожжей НЕ7с. Клонированньй ПЦР ТКАБЕ2 бьіл рекомбинантньім слитьім белком с СА 4 ДНК-связьівающим доменом, а скринированную библиотеку кДНК сливали с доменом активации САЇ4 в векторе рзеП07.

Репортерньй ген в НЕ7с бьіл НІ5ЗЗ слит с активирующей последовательностью против хода транскрипции (АБ) от промотора САЇ1, которая чувствительна к активатору транскрипции СА14. Трансформанть, которье сч содержали как плазмиду роотТе, так и плазмиду рЗЕПО7, отбирали для вниіращивания на чашках без триптофана и лейцина. Во второй стадии позитивнье клоньі, которье зкспрессировали два гибридньїх белка, которье і) взаймодействовали друг с другом, и, следовательно, активировали (А 1-НІЗЗ, вьіскребали из чашек, не содержащих триптофана, лейцина и гистидина и содержащих 50мММ З-аминотриазол (ЗАТ). (у) д-галактозньй тест Ге!

Позитивнье клонь), полученньюе вьіскребанием в двухгибридном скрининге, подвергали Іас/-тесту с развитием окраски в дрожжевьх клетках ЗЕУ526 согласно Сіопіесй І арогаїогіез тапица! (в отношений деталей со см. вьішеупомянутье публикации и патентнье заявки). Вкратце, трансформантам давали расти при З3З0"С в Ге) течение 2-4 дней до достижения 2мм в диаметре, затем их переносили на фильтрь! У/пайтап. Фильтрь проходили через обработку замораживания/оттаивания для обеспечения проницаемости клеток, затем их --

Зз5 замачивали в буфере (16,1мг/мл Ма»НРО,.Н»О; 5,5мг/мл МанНоРО,.НО; 0,75мг/мл КСІ; 0,75мг/мл Ма5О,.7Н2О, ї- рнН-7), содержащем 0,ЗЗмг/мл Х-даІ и 0,35мМ р-меркаптозтанол. Колоний наблюдали в отношений развития голубой окраски, которая является указанием на индукцию р-галактозь. мі) Зкспрессия клонированньїх КДНК «

Конструировали два типа зкспрессирующих векторов: а) Векторьі на основе РОНО10-3, содержащие открьттую рамку считьівания (ОКР) либо клона 9, 10, либо 15, - с слитую с зпитопом гемаглютинина (НА). и Б) Вектор на основе рИиНОл10-3, в которьй бьла введена последовательность октапептида РІАс "» непосредственно перед клонированньім ТКАР2, названньй РІ АС/В6/ТКАБ2.

Конструкции, содержащие ОКЕ клона 9, 10 или 15, трансфицировали в клетки Неї а-Вціага (в отношений зтих клеток см. бозвеп, М. апа Виіага, М. (1992)) либо отдельно, либо котрансфицировали с РІ АС/В6/ТКАБ2 при -і помощи стандартного кальций-фосфатного метода (Метод, например, в Сигтепі Ргоїосоів іп МоіІесціаг Віоіоду, - едз. А!йзибеї, Е.М. еї а1.). мії) Люциферазньй тест бо Обьчно 5х107 трансфицированньх клеток собирали промьшанием три раза холодньм РВ5З и со 20 ресуспендированием в 400мкл буфера для зкстракции (0,01М КоНРОД/КНоРО, рнН-7,8; 1мММ ДТТ). Лизис зтих клеток получали трехкратньм замораживанием в жидком азоте и оттайванием. Остатки клеток удаляли

Ме; центрифугированием (бмин. при 10000 х 9). Для люциферазного теста к 5О0мкл лизата добавляли 200мкл люциферазного буфера (25мММ глицилглицин, 15мММ КоНРО,/КНоРО,, рнН-7,8; 15мМ МозоО,, 4мММ ЗГТА, 2ММ

АТФ, 1мМ ДТТ). Затем к реакционной смеси добавляли 100мкл 0,2мММ О-люциферина, 25мММ глицилглицина, 1мМ ДдтТтТ. Люциферазную активность определяли регистрацией змиссии света при помощи І тйгоп о Ісгпіпотегсег, установленного на 10-секундную интеграцию (см. вьішеупомянутье публикации и патентнье заявки в отношений дополнительньх деталей). о Пример 1: Клонирование новьїх клонов 9, 10 и 15

Библиотеку кДНК, приготовленную из В-клеток, подвергали скринингу на белки, которье связьшваются с 60 ТРЕАР2, с использованием двухгибридного способа, описанного в разделе Материаль! и методь (ім). Только в трансформантах, которье зкспрессировали как ТКАР2, так и белок, способньій взаймодействовать с ним, СА! 4

ДНК-связьівающий домен и домен активации транскрипции бьли соединеньй вместе. Результатом бьла активация и зкспрессия репортерного гена, в зтом случає НІЗЗ, слитого с АБ и ТАТА-частью промотора СА! 1.

Скрининг дал приблизительно 2000 клонов, которьіе бьіли способньі расти на чашках Ттгр-, І ец-, Ніз- ЗАТ. 65 ДНК, полученная из 165 произвольно вьібранньїх позитивньїх клонов, служила для временной котрансфекции штамма дрожжей ЗЕМ526 вместе с ТКАБ2, клонированньм в вектор рОВТ9У. Тест на р-галактозидазную активность вьіполняли на колониях трансформированньїх дрожжей ЗЕУ526, как описано в разделе Материаль и методь (М) . Голубая окраска, которая развивалась, бьіила указанием на колонии, которье содержат кДНК, кодирующую белок или полипептид, которьїй связьівается с ТКАБ2.

Результать! двухгибридного скрининга, способность вьібранньїх (вбіскребанием) клонов расти на чашках с

ЗАТ и индуцировать І ас7, измеренньсе в цветном тесте, суммировань в Таблице І. Из проверенньїх позитивньсх клонов два представляли кДНК, кодирующую известнье белки; сам ТКАБ2, которьій способен самоассоциироваться и образовьівать гомодимерьі, и бета-рецептор лимфотоксина, внутриклеточнье домень которого, как бьіло показано, связьивают ТКАРБ2. Три из зтих клонированньїх кКДНК (клонь 9, 10 и 15) бьіли 7/0 НОВвЬІМИ.

Позитивнье клоньі проверяли далее в тесте специфичности связьівания, а именно проверяли на их взаймодействие с не относящимися к делу приманками. Как показано в Таблице ІІ, клоньї 9 и 10 взаймодействовали только с ТКАРЕ2 и не связьівались ни с одним из ряда испьітанньїх посторонних белков. С другой сторонь,, клон 15, не связьивался с МОКТ-1 и с межклеточньіми доменами рецепторов ТМЕ р5і5 и р75, но слабо связьівался с Ламином и с Циклином 0.

Для сужения района на молекуле ТКАР2, которьій взаймодействует с клонами 9, 10 и 15, бьіли изготовлень две дополнительнье конструкции. Одна конструкция содержала М-концевую часть молекуль ТКАБ2, аминокислоть 1-221, которая включала мотивь! Кіпд-пальца и цинкового пальца. Вторая конструкция включала только С-концевую часть молекульі, аминокислоть! 222-501, охватьвающие "ТКАР-домен" и дополнительньсе 42 го аминокислоть. Зти две конструкциий служили в качестве приманок в двухгибридньхх тестах. Результать! ясно показьівают, что тогда как клонь 9, 10 и 15 не взайимодействовали с конструкцией, содержащей аминокислоть 1-221 молекульь ТКАБ2, все они действительно связьшались с С-концевой конструкцией, содержащей "ТКАР-домен", с той же зффективностью, с которой они связьівались с полноразмерной молекулой ТКАРГ2. с в о нн и ни и т ня по п М зо со со «- з т

ПОП ННЯ ПОН ПОЛО ПОЛОН « й но 1 З нини: ни ПО ПОН - яю 00110000 ї» мя 11105200 - - Путем применения нескольких стадий ПуР к клону ТОКДНК бьіла клонирована полноразмерная кДНК из библиотек кДНК, полученньїх из РНК тканей человека. Зтот белок бьіл назван МІК (индуцирующая МЕ-КкВ -й киназа), поскольку он содержит район протеинкиназь! (см. ниже). Следует заметить, что при первоначальном бо анализе последовательности клона 10 (перед получением МІК при помощи ПЦР) бьіло обнаружено, что она кодирует белок, первоначально названньій ММРІ (см. совместную, охидающую рассмотрения заявку І 117800). (ее) 50 Бьло ообнаружено, что зтот ММРІ или кодируемьй клоном 10 белок имеет последовательности, с соответствующие консервативнь!м мотивам І-ХіІ, которне характеризуют Зег/ППг-протеинкиназь.

Пример 2: Секвенирование новьїх клонов

Три из новьїх клонов КкДНК (клонь 9, 10 и 15) бьіли очищеньії, амплифицировань! в Е.соїї и их ДНК бьіла подвергнута анализу последовательности (секвенированию). Біло обнаружено, что все три клона являются частичньіми клонами кДНК.

ГФ) Общие длинь клонов 9, 10 и 15 бьіли приблизительно 2000, 2700 и 1300п.н., соответственно. 7 Фиг.З и 5 показьівают секвенированную часть клонов 9 и 15 и Фиг.4 показьівает полную последовательность клона 10.

Фиг.бБа-6 показьвают полную нуклеотидную последовательность клона 15, секвенированную от обоих 5- и 60 3З-концов (а) и расшифрованнье кодируемье ею аминокислоть! (Б). Біло обнаружено, что клон 15, которьй является частичньім клоном КкДНК, кодирует белок с длиной 172 аминокислоть.

Клонь 9 и 15 являются частичньмми клонами, которье лишень! их найболее дальнего 5-конца кодирующих последовательностей ДНК. Расшифрованнье аминокислотнье последовательности, показаннье на Фиг.За, 45 и 5р, все начинаются от первого нуклеотида соответствующего клона. бо Последовательность клона 10 (частичньій клон кКДНК), которая бьіла найболее основательно анализирована,

кодирует белок, названньй ММРІ, как отмечалось вьше, содержащий мотив Зег/ТПг-протеинкиназь.

Полноразмерньй клон кКДНК, полученньій ПЦР с использованием клона 10, как отмечалось вьіше, ввіявил новую

ТКАР2-связьівающую киназу МІК, как упоминалось вьіше.

Полная нуклеотидная последовательность и ее расшифрованная аминокислотная последовательность МІК показань на Фиг.б, в которой инициирующий кодон АТО при нуклеотиде Мо232 подчеркнут и в которой стоп-кодон при нуклеотиде Мо3073 указан звездочкой. Полноразмерньй клон МІК Фиг.б имеет в длину 4596 нуклеотидов, внутри которьіїх содержится кодирующая последовательность МІК, кодирующая белок МІК, состоящий из 947 аминокислотньх остатков. 70 Поиск в банках данньх вьіявил, что новая аминокислотная последовательность МІК обнаруживает особенно вьісокую гомологию с группой киназ, о некоторьїх из которьїх известно, что они функционируют в качестве киназьї киназьї киназь! МАР.

Фиг.7 показьівает сравнение первичной молекулярной структурь: мьішиной МЕККК (51), вУка2 (52),

Трі-2 (53), онкогена саркомьі! Ем'іпа (54), 5БЗ (55), (ЗТЕЇ|) (56), (МРКІ) (57), (ВСКІ) (58) и (МІК) (59).

Некоторье из зтих киназ бьіли идентифицировань! благодаря онкогенной активности, которой они обладают в мутированном виде. с

Пример 3: Зкспрессия клонированньїх КкКДНК и их коиммунопреципитация с ТКАБ2

Клетки Неї а-Вцагі трансфицировали ТКАБ2, меченьм РБГАС, в зкспрессирующем векторе на основе і) риОнНОт0-3 и конструкциями, содержащими ОКЕ любого из клонов 9, 10 или 15, слитьіми с зпитопом НА, как описано в разделе Материальй и методь (ім) Затем клетки вьращивали в течение 24 часов в модифицированной по способу Дульбекко среде Мгла (ЗМЕМ) плюс 1095 телячья сьворотка с Ге») зо добавленньми З55-метионином и 255-цистеином. В конце зтого периода инкубации клетки лизировали в буфере для радисиммунопреципитации (10мМ Трис-НСЇІ рН 7,5, 150мМ Масі, 195 Мопідепі Р-40, 190 деоксихолат, 0,190 со

ДСН и ї1мММ ЗДТА; їмл/б5х10? клеток) и лизат предварительно осветляли инкубированиєм с посторонней (ее) кроличьей антисьмвороткой и гранулами ОС-Зерпагозе протеином (РІіагтасіа, Зу"едеп). Иммунопреципитацию проводили инкубированием в течение 1 часа при 4"С аликвот лизата с моноклональньмми антителами против --

РГАС (купленньіми в Еазітап Кодас Со.) или против НА (клон 12СА5 (Ріеїйй, . еї аІ. (1988)). Зкспрессируемье їЇч-ч белки анализировали при помощи злектрофореза на геле ПААГ-ДСН с последующей авторадиографией.

Результать! таких зкспериментов показали, что частичнье клоньі кДНК 9, 10 и 15 кодировали белки с мол. массой приблизительно 50-65, 45 и 26кДа, соответственно. «

Не смогли определить взаймодействия клона 15 с ТКАРБ2, но белки, кодируемье клонами 9 и 10 (МІК), а также полноразмерньй МІК ко-иммунопреципитировались с белком ТКАБ2. Пробь клеток, которье - с котрансфицировали ТКАРБ2 и любьїм из зтих двух клонов, и иммунопреципитировали либо антителами против а ЕГАС, либо антителами против НА с последующим анализом при помощи злектрофореза в ПААГ-ДСН, как ,» описано вьіше, показали три полосьі в каждой дорожке: одну полосу, соответствующую белкам, кодируемьм клоном 9 или клоном 10, и две другие полосьії, представляющие собой дублет 42 и 44кДа, соответствующий белку ТКАРГ2. -і Пример 4: Функциональнье тесть - Бьіло обнаружено злектрофоретическом анализом на замедление подвижности в геле, что МІК вьізьівает индукцию МЕ-КВ. В типичном случае 0,5-1х109 клеток 293 ЕВМА трансфицировали 1Омкг клона 10 в рсоОМАЗ со (Фиг.7, дорожка 1), Змкг рсОМАЗ, содержащей кДНК для рецептора ТМЕ р75 (Фиг.7, дорожка 3) или клоном 10 о 50 (10мкг) и рецептором ТМЕ р75 (Змкг) (Фиг.7, дорожка 2). В каждой из зтих трансфекций общее количество трансфицированной ДНК доводили до 15мкг "пустьім" вектором рсОМАЗ. В качестве контроля служили клетки

Ме) 293 ЕВМА, трансфицированньсе 15мкг только вектора рсрОМАЗ (Фиг.7, дорожка 4). Клетки виіращивали в течение 24 часов в среде ОМЕМ їж 1095 телячья сьіворотка, затем собирали и обрабатьвали согласно Зспгеїбег еї а). (Зспгеїрег, Е. еї а. (1989)). Пробьї подвергали злектрофорезу на 595 полиакриламидном геле. МЕ-КВ наблюдали 59 с использованием набора З"Р-радиоактивно меченьїх олигонуклеотидов, соответствующих сайту связьівания

ГФ) МЕ-КВ в качестве зондов. (Зти зондьі бьіІли сСАТОССАТТОСОСАТТТОСТСТТІ И /САСТАЛАСАССААЛТОСССААТОО) . о Как показано в Таблице ІМ МІК индуцировал МЕ-КВ даже более зффективно, чем ТКАР2. С другой сторонь, клон 10 вообще не имел зтого зффекта. 60 Анализ с репортерньім геном вьіполняли следующим образом:

Клетки 293 ЕВМА котрансфицировали вектором рсОМАЗ, содержащим НІМ ІТК, соединенньй с люциферазньм репортерньїм геном, вместе с плазмидой рсОМАЗ, содержащей кДНК только для ТМЕ-рецептора р75, плазмидой рсОМАЗ, содержащей только кКДНК клона 10, или плазмидой рсОМАЗ, содержащей кДНК для

ТМЕ-рецептора р75, и плазмидой рсОМАЗ, перечисленньїми в Таблицах ІІ и ІМ. бо Результать, приведенньсе в Таблице ІМ, показьівают:

а) что трансфекция клоном 10 не активирует индукцию МЕ-кВ, тогда как МІК сильно активирует,

Б) что клон 10, а также МІК, в котором лизин активного сайта -заменен аланином (МІК"), сильно ингибировали индукцию МЕ-кВ кКДНК, перечисленньїми в первом столбце Таблицьі ІП.

Делеция 3-ТК МІК (МІК-З'ЮТК) сильно увеличивала его зкспрессию, и вследствие зтого его способность ингибировать индукцию МЕ-КВ при зкспрессии в виде мутированной формні. радиоактивного распада, детектируемье пластинкой "рпозрпоітадег" й тв

ТМЕНК-ІІ, ТМЕВК-І/гАв-химерой, КІР и активацию МЕ-КВ под влиянием МІК. Люциферазньй тест. й 225-БО1 паю 00001366 60000106

Ммовтивюю 00030000 00000018 о те 17ю00000ю1вю1юю186010000

Бквхимера 0010003ю00000012ю00000001005601 00000010 я 1вю1вю1111111111в1во 11111111 77101511 юю Фо зво 07717716 110 сатин

МО - не определяли «-

Пример 5: Дополнительнье характеристики МІК ч-

Кроме тестов на специфичность Примера 2 вьіше, дальнейшее двухгибридное тестирование связьівающих свойств МІК вьіявило (результатьі не приведеньї), что первоначально вьіделенньій частичньй клон МІК (МІК 624-947) связьівается специфически с С-концевьім районом ТКАБ2 (С-ТКАБЕ-доменом), тогда как, в « противоположность зтому, полноразмерньій МІК связьівался как с С-ТКАР-доменом, так и с районом против 470 хода транскрипции от него (М-ТКАЕ-доменом). МІК также не связьввается с ТКАЕЗ. Далее, химерная молекула, - с содержащая С-ТКАРБ-домен ТКАРГ2 и М-концевую часть ТКАЕЗ, могла связьівать частичную молекулу МІК (МІК ц 624-947), но не полноразмерньій МІК, что указьівало на то, что связьвание полноразмерного МІК с ТКАБ2 "» требует как С-ТКАР, так и М-ТКАР'-доменьі ТКАБ2.

Кроме того, МІК не самоассоциируется и не связьівается с внутриклеточньім доменами: ТМЕ-рецепторов ро5

М р75; рецептора СО40 (члена семейства рецепторов ТМЕ/МОРЕ); и ГАБ/АРО1 (СО9б-рецептора). МІК также не -І связьмваєтся с внутриклеточньми белками, ассоциированньми с зтими рецепторами, такими как, например, -3з ТКАО, МОКТ-1 и КІР. Зти результатьіь коррелируют с результатами, показанньми в Таблице І вьіше, касающимися специфичностей связьівания белков, кодируемьїх клонами 9, 10 и 15. Различнье взаймодействия (о между различньіми рецепторами и белками изображень! схематически на Фиг.2а и 2, причем на Фиг.25 являются более полньіми.

Ме Нозерн-блот-анализ вьіявил, что имеется единственньій транскрипт МІК, зкспрессируемьй в различньх (Че) тканях при разньїх уровнях, которіій имеет размер приблизительно 5000 нуклеотидов, которьій по существу такой же, что и у клонированной кДНК МІК (как отмечалось вьіше, см. Фиг.б).

Кроме того, как отмечалось вьіше в отношений белка, кодируемого клоном 10 (первоначально названного

ММРІ), полноразмерньй белок МІК имеет также серин/треонин-протеинкиназньй мотив, сходньій с несколькими киназами киназьі киназьї МАР (МАРККК), как зто видно также из сравнений последовательностей, показанньх і) на Фиг.7. ко Тестирование іп міго киназной активности МІК вьіявило, что МІК может бьіть автофосфорилированньм, но не в случає, когда лизин активного сайта и соседний лизин замененьїй аланином (аналог или мутеин МІК, бо обозначенньй МІК КК429-430АА, что указьівает на заменьі лизинов в положениях 429 и 430 аланинами). Зто также коррелирует с результатами, представленньми вьіше в Примере 4 и показанньми в Таблице М, в отношений МІК"-мутеина.

Как упоминалось вьіше, сверхзкспрессия МІК в клетках 293 ЕВМА индуцировала МЕ-КВ даже до более вьісокой степени, чем сверхокспрессия ТКАР2, но сверхзкспрессия частичного МІК (МІК 624-947) не вьізьівала 65 активации МЕ-КВ. Кроме того, вьішеуказанньй аналог/мутеин МІК МІК КК429-430АА также не вьїзьвал активации МЕ-кВ при сверхзакспрессии в зтих клетках. Таким образом, индукция МЕ-КВ МІК зависит от интактной киназной функции МІК. В противоположность зтому, КІР (см. Фиг.2а, 5), которьій также имеет киназньїй домен, все еще может индуцировать активацию МЕ-КВ, когда его киназная активность устраняется мутацией.

Активация МЕ-КВ при сверхзокспрессии МІК бьіла неотличима от активации, производимой обработкой зтих клеток ТМЕ, и, как в случае сверхокспрессии ТМЕ или ТКАР2, главньми компонентами МіК-активированного

МЕ-КВ бьіли рбо и рб5. Сверхзкспрессия МІК вьізвала деградацию І-КВо и ингибирование зтой деградации

М-ацетил-ї еш- ен-норлейцинолом (АГ М), приводившей (как в случае с ТМЕ) к накоплению молекул І-КВ, имеющих более медленную подвижность при злектрофорезе в ПААГ-ДСН, указьвающую на присутствие фосфорилированного І-кВо.

Другие тесть! вніявили, что МЕ-КВ может активироваться в клетках 293 ЕВМА ТМЕ, а также сверхзкспрессией рецепторов роб и р/б5 или сверхзкспрессией ТМЕ-рецептора роб, в котором внутриклеточньй домен

ТМЕ-рецептора роб заменен доменом рецептора РАБ/АРО1. МЕ-КВ может бьть также активирован сверхзкспрессией ТКАБЕ2, ТКАБО, КІР или МОКТ-1, но не делеционного мутанта МОКТ-1, лишенного района против хода транскрипции от "домена смерти" МОКТ-1. Как отмечалось вьіше, полноразмерньій МІК, но не 75 Ммутеин МІК КК429-430АА и не частичньй МІК (МІК 624-947), индуцирует активацию МЕ-КВ. Кроме того, зкспрессия мутеина МІК КК429-430АА или МІК (МІК 624-947) в клетках 293-ЕВМА вместе с любьм из указанньх вьше агентов, те. рецепторами или ассоциированньми белками, приводила к ингибированию индукции активации МЕ-КВ всеми зтими агентами, что свидетельствовало о том, что активность МІК непосредственно участвует в зтой индукции МЕ-КВ. Подобньім образом, наблюдаемое вьше ингибирование неактивньми молекулами МІК коррелирует с меньшим снижением 1-кВ.

МЕ-КВ активируется также 1І-1 (см. схему на Фиг.25). Зтот зффект, по-видимому, не зависит от ТКАЕ2 (ІІ -1 не связьівает ТКАРГ2 и действие 1-1 не ингибируется зкспрессией доминант-негативного ТКАЕ2). Однако, зто действие І/-1 ингибируется зкспрессией мутантов МІК. Кроме того, на активность МЕ-КВ, наблюдаемую при сверхаокспрессии Кеї гомолога рб5 в клетках 293-ЕВМА, не влияла козкспрессия киназанедостаточньїх мутантов Га

МІК, что указьвало на то, что МІК не влияет на функцию Кеі!-белков непосредственно, но участвует в их индуцируемой рецептором активации. о

Цитотоксическая активность ТМЕ (очевидно, опосредованная МОКТ-1-ассоциированной протеазой МАСН - см. Фиг.25) является обьектом негативной регуляции некоторьми МЕ-кВ-индуцируемьми генами.

Антагонистические последствия опосредованной МЕ-КВ индукции генов и активаций МАСН могут обьяснить, Ге») почему сам ТМЕ, а также ІЇ-1 могут индуцировать клеточную резистентность к цитотокснчности ТМЕ. В соответствии со озтим, бьло также ообнаружено, согласно данному изобретению, что зкспрессия со доминант-негативньїх мутантов МІК в клетках 293-ЕВМА значимо увеличивала их чувствительность кубиванию

ТМЕ и что сверхзкспрессия нативного (полноразмерного, дикого типа) МІК ингибировала убивание клеток ТМЕ или сверхзкспрессией ТМЕ-рецептора р5о5 (зтот рецептор имеет внутриклеточньїй домен, состоящий из "домена - 3з5 смерти", которьій при зкспрессии в клетках, в отсутствие какого-либо ТМЕ, может индуцировать его собственную /-(Узрча цитотоксичность - см. цитируемье вьше публикации данного изобретения и совместнье, ожидающие одновременного рассмотрения заявки).

Пример 6: Дополнительнье функциональньсе тесть! на биологическую активность МІК «

В соответствии с данньм изобретением, бьіло также обнаружено, что зкспрессия доминант-негативньх мутантов МІК могла ингибировать индукцию активации МЕ-КВ в 293-ЕВМА клетках другими индуцирующими с агентами, включающими: (ї) хорошо известньій бактериальньй зндотоксин, липополисахарид (І Р); (ії) хорошо ц известньій миристат-ацетат форбола, которьій является известньім активатором протейинкиназь С; и (ії) белок "» ТАХ НТІМ-1.

Кроме того, бьіло обнаружено, что зкспрессия доминантнегативньїх мутантов МІК в клетках 293-ЕВМА по существу не оказьвваєет действия на ТМЕ-индуцируемую активацию киназь п, что свидетельствует о том, что -І МІК действует специфическим и, возможно, прямьм образом, усиливая фосфорилирование І-кВ, без -3з воздействия на МАР-киназьі, участвующие в фосфорилирований дип.

Ввиду всего вьішеупомянутого можно заключить, что киназная активность МІК является частью каскада (ее) передачи сигнала, которая ответственна за активацию МЕ-КВ, и зтот каскад является общим для двух рецепторов ТМЕ, рецептора РГАБ/АРО1 и рецептора 1-1. МІК, по-видимому, играет специфическую (особую) бо роль в зтом каскаде. Связьшание МІК с ТКАБ2 может служить для того, чтобьі на МІК влияли как (Че) ТМЕ-рецепторьї, так и рецептор ЕАБЗ/АРО1. По аналогии с каскадами МАР-киназь, МІК может служит в качестве субстрата для киназьї (МАРКККК) при "рекрутировании" белком ТКАРЕ2 к стимулированньїм рецепторам, так что, когда МІК является фосфорилированньм, он фосфорилирует и активируеєет другие киназьії (или может индуцировать непосредственно активацию МЕ-КВ прямьм фосфорилированием І-кВ). І/-1-индуцируемая активация МЕ-КВ является независимой от ТКАЕ2 и, следовательно, активация МІК 1І-1-рецептором может бьїть о опосредована другим белком ІКАК, серин/треонин-киназой, которая рекрутируется к рецептору 1І/-1 после ко стимуляции (Сао еї аї!., 19965), и также белком ТКАЕб, которьйй связьваеєт ІКАК (см. Сао еї аї., 1996а, а также схему на Фиг.25). Как отмечалось вьіше, мишенью МІК, или каскада киназ, активируемьх им, является, бо по-видимому, І-КВ. МІК может также фосфорилировать белки ТКАБ или регуляторнье белки, которье связьіваются с ними, например, ТАМК-И/ТКАЕ (см. Спепа апа ВаїсКтоге, 1996; Коїне еї а/!., 1996), создавая сайть! стьковки для других белков.

Ссьілки 1. АдеІтапега!., (1983) ОМА 2, 183. 65 2. АІпетгі, Е.5. еї а. (1995) 9. Віої. Спет. 270, 4312-4317.

З. А!зибеї, Е.М. еї аї. едв., Сигтепі Ргоїосоїв іп МоіІесціаг Віоіоду.

4. Ваецепгіе, Р.А., апа Непкеї!, Т. (1994) Аппи Кем Іттипо!). 5. Вагап, 9.Р. (1993). Ситепі Віоіоду З, 603-606. 6. Вегрегіси, І., Зпи. О.І.., апа Сіагк, Е.А. (1994). 3. Іттипої 153, 4357-66. 7. Вешег, В., апа мап Нийеї!. С. (1994). Зсіепсе 264, 667-8. 8. Віапк, М., КошгіїзКу, Р., апа Ізгае!, А. (1992). Ттепаз Віоспет. Зсі 17, 135-400. 9. Воїайп, М.Р. еї аї. (1995а) 9. Вісі. Снет. 270, 337-341. 10. Водії, М. Р., МапоІотеем, Е.Е., Рапсег, 7., Мей І.Ї., Сатопів. 9У.Н., апа МУУаМйаси, 0. (19955) 3.

Віо! Снет. 270, 7795-7798. 70 11. Воїадіп. М.Р. еї аї. (1996) Сеї! 85, 803-815. 12. Сао. 7. еї а. (1996а) Майшге 383, 443-446. 13. Сао, 7. ейа). (19965) Зсіепсе 271, 1128-1131. 14. Спеп, С... еї аі. (1992) Апп. М.У. Асад. Зсі. 660:271-273. 15. Спепо, 0... СіІеагу, А.М., Ме, 2-8., Нопо, 0.І., едегтап, 5. апа Вакітоге, 0. (1995) Зсіепсе 267:1494-1498). 16. Спепо, о. апа Вакітоге, О. (1996) Сепез Оеу. 10, 963-973. 17. Спіппа)уап, А.М., О'Коигке, К., Темагі, М., апа Оіхії, М. М. (1995) Сеїї 81, 505-512. 18. Стеідпіюоп, Т.Е., Ргоїеіпев: Бігисішге апа Моіесціаг Ргорегііев, МУ.Н. Ргеетап 5 Со., Зап Егапсізсо, Са. 1983. 19. Стовіоп, О.Е., Сао, 7., апа Соедаеї, О.М. (1995). У Віої Спет 270, 16514-7. 20. Бібопайф, У.А, Мегсигіс, Р., апа Кагіп, М. (1995). Мої Сеї Віої! 15, 1302-11. 21. Оипее, Т. еї аі. (1993) Сепез ЮОеу. 7:555-569. 22. Рівід, 9. еї а). (1988) Мо!. Сеї| Вісі. 8:2159-2165. 23. Сеувзеп, Н.М. (1985) ІттипоЇї. Тодау 6, 364-369. 24. Сеузеп, Н.М. еї аії. (1987) 9. Іттипої. Мей. 102, 259-274. 25. Сіітоге, Т.О., апа Могіп, Р.). (1993). Ттепаз Сепеї 9, 427-33. сч 26. боззеп, М. апа Вціага, М. (1992) РМАЗ 89:5547-5551. 27. СгеіЇ, М. ЮОоишпі. Е., ММа|дапі. Н., Гопдеп, М., Сацез, М., Вахеїпег, В, Сеогдороціов5, 5., І езвіацег. (8)

МУ., КоїПав, О., Ріїгептаїег, К., апа Зспеийгісн, Р. (1995). СеїІ 83, 793-802. 28 Оггі. М., Спін, 9.У, апа І епагао, М..). (1993). іпЕ КеуСуо). 29. Напкв, 5.К., Оціпп, А.М., апа Нипіег, Т. (1988). Зсіепсе 241, 42-52. Ге! зо 30. Номага. А.О. еї аї. (1991) У). Іттипої. 147, 2964-2969. 31. Неи, Н., Зпи. Н.-В., Рап, М.-0., апа Соедаеї, О.М. (1996). Сеї! 84, 299-308. со 32. Нзи, Н., Хіопо, у., апа соеадеї, О.М. (1995). СеїІ 81, 495-504. со 33. Кашптапп, 5.Н. (1989) Сапсег Кез. 49, 5870-5878. 34. Кашптапп, 5.Н. (1993) Сапсег Кев. 53, 3976-3985. --

З5. І аїтапасі-Сігага, А.С, Спііев, Т.С, Рагкег, О.С, апа КоїВвзіеїп, Т.І. (1993). У Ехр Меа 177, 1215-1219. ї- 36. І агерпік, У.А. еї аї. (1994) Маїшге 371, 346-347. 37. Мазпіта, Т. еї аї. (1995) Віоспет. Віорпуз. Кез. Соттип. 209, 907-915. 38. МебопаїЇд, Р.Р., Саззай(ейа, М.А., Ваїд, А., Маодді, Е., Котадпапі, 5., Огив85. Н.І, ап4а Ріггоіїо, 0. (1995). Єшиг У Іттипої 25, 2870-6. « 39. Мезвзіпу еї аїЇ., Трігі Сіемеїапа Зутровішт оп Масготоіесцієв апа Кесотбріпапі ОМА, Ед. А. УМапйоп, ств) с ЕІвеміег, Атвіегдат (1981).

Й 40. Міїїдап, С.Е. еї аі. (1995) Мешйгоп 15, 385-393. и? 41. Мозіаіов, б., Вігкепрасі, М., Хаіатапснії, К., МапАгзааїе, Т., УМаге, С, апа Кіеїйї, Е. (1995). СеїІ 80. 389-399. 42. Мигапізпі, 5. еї аї. (1991) Ріагт. Кезеагсі 8, 649. 43. Мадаїйа, 5. апа Соівіеїп, Р. (1995) Зсіепсе 267, 1449-1456. -І 44. Кепвіпд-ЕНІ, А., Невгв, 5., Ледіег-Нейргоск, Н. МУ. Ї., Кіе(птийег, б., апа Епдеїтапп, Н. (1995). 3.

ІпІатт. 45, 161-174, - 45. КоїШе, М., Рап, М.-О , Непгеї, МУ.)., Аугез, Т.М., апа Соедаеї, О.М. (19956). Сеї! 83, 1243-1252.

Го! 46. Коїйе. М, Загта, М., ріхії, М.М., апа Соедае!, О.М. (1995а). Зсіепсе 269, 1424-1427. 47. КоїШе, М., Мопа, 5.С., Непзгеї, МУ.., апа Соедае!, О.М. (1994). СеїІ 78, 681-692. со 48. Коїпе, М. еї а. (1996) Ргос. Маї)!. Асад. Зсі. О.5.А. 93, 8241-8246.

Ге) 49. Ки?ліскКа еї аї., (1993) Зсіепсе 260, 487. 50. ЗатбргооК еї а). (1989) МоїІесшаг сіопіпд: а Іарогаїогу тапица). Соїй Зргіпд. Нагрог І арогаїогу Ргезв,

Соа 5ргіпд Нагброг, М.У. 51. Запо еї аї!., (1992) Зсіепсе 258, 120. 52. Запо еї аї!., (1991) Віосїесппіднез 9, 1378. (Ф) 53. 5сПгеїбег. Е., Майпіаз, Р., Миїег, М.М. апа Зспайнег, МУ. (1989), Мис. Асіаз Кев. 17:6419. ка 54. ЗсНпціз еї аї|., О.Е., Ргіпсіріез ої Ргоївіп Зігисіиге, Зргіпдег-Мегіад, Мем МогК, М.М. 1798. 55. ЗіІвакй, Р.К. еї а. (1990) 9. Вісі. Снет. 265, 14526-14528. 60 56. Зтійй, С.А., Ратай, Т., апа Соодм/п, К.О. (1994). Сеї!І 76, 959-962. 57. Запдег. В.7. еї а. (1995) СеїІ 81, 513-523. 58. ТПпогпрегту, М.А. еї аї. (1992) Майте 356, 768-774. 59. Тпогпрегту, М.А. еї аї. (1994) Віоспетівігу 33, 3934-3940. 60. Мапаепабееіе, Р., Оесіегсд, МУ., Веуаегі, К., апа Ріегв, МУ. (1995). Тгепаз Сеї| Віої. 5, 392-400. 65 61 МапоІотеему. Е.Е., Воїдіп, М.Р., Сопснпагом, Т.М., апа УУаїІаси, 0. (1996). 9. Ехр. Меа. іп ргезв. 62. Маззаїїй, Р. (1992) Апп. Кему. Іттипої. 10, 411-452.

63. Меїга еї аї., (1987) Мей. Епгутої. 153, 3. 64 УМаїІасй, 0. (1996) ЕЄшиг. СуїокКіпе Меї. 7, 713-724. 65. УУапо, Г.. еї аї. (1994) Сеї! 78, 739-750. 66. УЛїКв, А.Р. еї а. (1989) Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 86:1603-1607. 67. 7/асснагіа, 5. еї аї. (1991) Єиг. У. Рпагтасої. 203, 353-357. 68. 2пао, 9.9. апа Ріск, Г.. (1993) Майшге 365: 448-451.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

(1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ: 70 (І) ЗАЯВИТЕЛЬ: (А) ИМЯ: Уеда Кезеагсп апа ОемеІортепі Со. Це. (В) УЛИЦА: УУеігтап Іпзійше ої Зсіепсе (С) ГОРОД: Р.0О.В. 95 (0) ШТАТ: Кепомої (Е) СТРАНА: Івгаеї! (Р) ПОЧТОВНЬІИ КОД (2ІР): 76100 (б) ТЕЛЕФОН: 972-8-9344093 (Н) ТЕЛЕФАКС: 972-8-9470739 (А) ИМЯ: Оаміа У/аІМаси (В) УЛИЦА: 24 Вогоспом 5ігееї (С) ГОРОД: Кепомої (Е) СТРАНА: Івгае! (Р) ПОЧТОВЬЙ КОД (21ІР): 76406 (А) ИМЯ: Місоїаі Маїїпіп сч (В) УЛИЦА: Веї Сіоге, М/еі2тап Іпвійше ої Зсіепсе (С) ГОРОД: Кейомої і) (Е) СТРАНА: Івгае! (Р) ПОЧТОВЬЙ КОД (21ІР): 76100 (А) ИМЯ: Магк Воїаїп Ге! зо (В) УЛИЦА: Веї Сіоге, М/еі2тап Іпвійше ої Зсіепсе (С) ГОРОД: Кейомої со (Е) СТРАНА: Івгаеї! со (Р) ПОЧТОВНЬІИ КОД (2ІР): 76100 (А) ИМЯ: Апагеї Комаїепко -- (В) УЛИЦА: Веї Сіоге, М/еі2тап Іпвійше ої Зсіепсе ї- (С) ГОРОД: Кепомої (Е) СТРАНА: Івгае! (Р) ПОЧТОВЬЙ КОД (21ІР): 76100 (А) ИМЯ: Ідог Мей « (В) УЛИЦА: 60 І еміп Ерзіевїп Бігееї з с (С) ГОРОД: Кепомої . (Е) СТРАНА: Івгаеї! и? (Р) ПОЧТОВНЬІИ КОД (2ІР): 76100 (її) НАЗВАНИЕЄ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Модуляторь! связанного с рецептором ТМЕ фактора (ТКАРЕ), их получение и применение Й -І (її) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 11 (м) ФОРМА СЧИТЬІВАНИЯ КОМПЬЮТЕРОМ: - (А)УТИП НОСИТЕЛЯ: Гибкий диск

Го! (В) КОМПЬЮТЕР: ІВМ РС совместимьй (С) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РО-ВОС/М5-Б05 со (Б) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Раїепііп Кеїеазе

Ге 1.0, Мегвіоп 21.30 (ЕРО) (М) ДАННЬЕ ТЕКУЩЕЙ ЗАЯВКИ:

НОМЕР ЗАЯВКИ: РСТЛІ 97/00117 5Б (мі) ДАННЬЕ ПРЕДЬІДУЩЕЙ ЗАЯВКИ: (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: І. 117800 (Ф, (В) ДАТА РЕГИСТРАЦИИ: 02-АПР-1996 ка (мі) ДАННЬЕ ПРЕДЬІДУЩЕЙ ЗАЯВКИ: (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: ІЇ. 119133 60 (В) ДАТА РЕГИСТРАЦИИ: 26-АВГ-199 6 (2) Информация для 5ЕО ІЮ Мо1: () Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: 1906п.н. (В) ТИП: нуклеиновая кислота 65 (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная

(ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ: кдНнК (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО І Мо1:

САТТОбСТСА ССОбоТооСо ОСОСТСТАСА АТАСТОСАТС ССОСОСОСТО САбОААТТСО во

АТТССАСОСС АСОААОСССС бСбОСОСОбС ОСАМОСАССО ОСССОбОбАМ АСОСМССАТО 120 95 АССОСАТСМС МОААСМАТСА СААААСАСАА ТТТСТОСТОС АСССАСТОСТ ОбАТОСАСТО 180

АААСАСТОСС АСАТССОСТТ ТМСАбОССАБА ААССАСАТТО ССТОССАТТС СОАСАбСАСС 240

СТСАССТСТС ТбТоТЬСССА ТТТОААССС СТОСТОСАбС АТОССТЕБАА САБСАСТОСА 309 бБАТТОССАС ТСАСАбСОбС АбССАТСААС САбОСАбБСбО ОСТТТбССАб САЛААСССАА 350 70 АСАСАССССВ ТОТТІТООТА СТАСОТСАЛО ОАБСТОСТСА АСААССАССА ОСТОСАССОС 429

ТТСТАСТСПС ТОСОССАСАТ СОССТСАСАС СтТобоссоос стоососств остосостот «во

ОПТСТСАЛЄЗ ААСЛЛССОТ ЗОАССІСТАЄ СТОСАСАТОС тТостТооОССА ССбСТоСАСС 540

СТОАОСАСТО ТТТАТОАЗСА СТСОТСТІТТ СТСАТООАТО ААСАААССТО САСТАТОСТТ 600

ССТАССАТОС САССАбСТСТ СААСТОСАТА СТСТТТОСОА ТТААСАТОСА СААСААССАТ 660

ТЕбБААСООСО АСАСТААСТТ ТОСТОССАСЄ СТТТСАБАСС ТСТТАААСОА ОТОСААСбСАб 120

АМССТОАССТ ССТТОСТОАЛ ОСАСТОСЛСб САЛОСЛСТСА ССАСССТСТТ САСОСАСАТС 30

АСАбССТОСТ СТОСССТСТС САТОСТСАТС АААССТОААС АССАСАСССА СССТТООСТо 540

ТСбТЄтессАо СААДТОТСАСТ ОСТСАТОССА ААТОСАДААА ССАСОСОЛАЄ ААСАААААСА 900

ААСТОАЛСПАА САСАЛТСТОА ТТТОАТСАТО АбСААбАТСА ССАСААСТОТ СбОбАСОоТОоТ 360

ТГААЛААСАЇ АС ЛОБЬСОА ОБОСАБАОСТ САБАССАСАА СТСССАЄСОЄ ТОСТСТОТСА 01020

АЛРІАТСАТОІ ШИДОТТТОВА АОС ОБССТААСТО СААТОСЛАТС АБАБСАССАл. 1089

СТСАТОСААА АТТСАТТОСС ТОТСТІТОАА СОБОБАСТТТ СОСТАССАСА АОСТТСАТСТ 1140

ОААААОСАТС ОАІОАІВААО АГОГОзАТОвВ ВААСОААСАТ бАСОТОТАТО САААСТСАТС 1200

АСБААССААС САСАСССССС АСТСОСАСТС БССОСАСААЄ ССАСТОСААС СЗААСАССТЬ 1260 с 29 ССТСТСОСАС АТССАСАССТ ОСОСТОСССТ СААССТОСТО САСААТОЗАСТ СССАСАТОСТ 1320 Ге)

СТТСССТСТС АСТОбССТоб ССТОСТАСАЄ СОСАССАСАТ бССССОСТСб СААСССТОСА 1380

СААССССАСА ССАССАСАСС АССАССТТСТ СССОСАТОСТ бСАСТТСОСТ АСАСТСТОСА 1440

АОССАССТСТ ССАССССАСС СААСТОСТСТ САССАбССТЄ ТТАСТТСТОС СТСАСТОССА 1500 Фо

ЗАСТОСАТСА СААТТАСГОА АСТОСЬССАВ ЗОСАСТОТОС ССАЖОАТОАА САССАДССАТ 1560 30

САССТОСАСС АССАСААСАС АТСАСТОССА ААССТОСТСС АСССТСАСАТ ССАССАСТСА 162 (ее)

ЗССбСОСТОС СОСААСАССТ СОАСАССТТО ААААОСААСС ТООСТОААСА СОСАССАССоС 1689 со

САБООСАТСА АССТССАбОС ОСТООССАСС ТАТСТТТОСТ АТТТТСТСАС САСАТТСТАА 1740

ССССАССТСА СААССАТОГО СТОСАСАААТ ССАСОСАСАС АСАААТССАА САСТТССТСА 1800 ьо

ТАСТСТСАТТ ТСАССТОСТО САТССАСТСТ ТТОСТОААСС ТСТСТТТОСТ СТОСАСТТТТ 1860 їм- 35 САТСТАТСТО АСССААТААА ТТОСТТТСАТ ТОСТТСАДАА АААДАА 1906 (2) Информация для 5ЕО ІЮ Мо2: () Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: 604 аминокислоть « 40 (В) ТИП: аминокислота Й з с (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная з (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ: белок (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО І Мо2:

Хаа Тпк о біу Рго біу Хаа б1у Хаа Мес 5ег Сіу Бех Хаа Азп Хаа Азр - 45 1 5 10 15 - їув Ага біп Рпе Пер Пе бій Агу Гей Бей Авр Аза Маї Був Сіп Суб 20 25 Зо шкі 50 біп ї11сє Лгд Рпе Хаа Сб1у Акад Пуз Сі) І1їе Аїа бег Авзр бех Азр Зекг (Фе) 35 40 45 і3е) Ага УМаї ТБг оСув рец Сув Аїа біп Ре біш А1їа Уа! це біп Нніз біу 50 55 со іФ) іме) 60 бо

Беп Буг Агд бек Агуд біу Мец Аза рей Тпг Аа Аза Аїа І1е Бу5 біп 65 70 15 80

А1а Аїа б1іу Ре А1їа бек Був Та обі Тпс обі Рго Маї Рпе Тгр Туг 85 90 95

Тут УМаі Буз Сі Уаї це Авп пуз Ніз біц Пец біп Асо Рпе Туг 5ег 100 105 110 76 пцез Агу Ні 11е Аза бег Авр Маї біу Акз б1іу Ага А1їа Тгр Пец АгдФ 115 120 125

Суз Аа цецп Ап бі Ніз бек Пец бі Агу Тут їеп Ніз Мех Пец Гей 130 135 140

Аїа Азр Акд Суз Агд Пе бег Тпг Рпе Туг біц Азр Ттр бек Те Уаї 145 150 155 160

Мес Азр сій бій Агу бек бек Мес Пец Рго Тпг Меє А1а А1а С1у Те 165 170 175

Азп бех І1е Те» Рпе А1їа І1е Авп І1е Авр Авп Ббуз Авр Гец Авп сіу 180 185 190 біп Зек Був Рнпе А1а Рко ТНК Маї1ї бек Авзр Геч цец цуз С1іц бек ТЬг 195 200 205 сі 7 о біп Авп Ма! Тис обехг Гем теп Гуз бій бек Так Сіп біу Маї бек бех 710 215 220 їец Рпе Агу бі І1е Трг Аїа бек бег Аїа Уаї бег І1е Пе І1е уз 225. 230 238 240 (2)

Зо со

РКО бі біп біз Та о Аб5роРго Сув Те бег Сув Рго біу Мес 5ег МУа1 245 250 255 Ге) їм Ме Рго Азп Аза Гуз Агу Зег біу Ака Акч Буз Агд Гуз Хаа Рго чи 260 265 270 в.

ТЕ Хаа бес Ніз Тео Мес Мес Акуд цуз Мес бек Агу Тах Гец біу Тах 275 286 285

Сув пцеш пув Агу Ніз Тед б1у Сіп б1у Агд Аїа Сіп Агд Тв Тс Рго с 290 295 300 - с ТипгоАїа Ркго Ге 5Бег І1е Бек Сув Рго Рго їец Був Аїа Рго 5ег б1у ч » 305 3 315 320 п

Теч Тпг Рго Мес біш бег Сіц біп біп цейп Меє біц Азп Хаа Ре Рго 325 330 335

Уа1 Ре 51и Ага Сіу Уа! Ткр Уа1і Рго Сі А1а Хаа Сув бій Був Ніз - 340 345 350

Акад Хаа Хаа Аго Суз Сіу Хаа уз Агд Акуд Хаа Ага Маї Тер Буз Пей бо о 355 зво з65 (Че) 116 Агд йувз біч Аїа біп Сіу Рго бешп біу Уаї Ага Акд бій Аїа Тс 370 375 380 б1іу Ага бі) Ніз Пей Рго Бе Рго Азр Аза біп реп біу бБег Аза бі» 385 390 395 400 б1у Аї1а Аії3 біп Хаз Пе Аго Нів Рго Тем Рго Суз Сіп Тгр Агд С1іу ю | 405 410 415 60 б5

Бей орви біп Рго 5ег Агд сСув Рго Рго Агу Був Рго б1іу 011 Аг Авр 420 425 430

Ага Так оАгс о біу Рго Агуд бек Рго Сіу бег Тгр Тс бек Уа! Сіп Суз 435 440 445 сіу Бек біп Шен бЗег Аго Рго Аго Буз 5Зег Бех 510 б1п Рго Уаї Тпг 450 459 460 бег А1а бек Уа! Рго біш бек Меї Тіпг Іїе бег бій Те Акад Сбіп Аїіа 465 470 475 480

Так Маї А1їа Мег Мес Аб5п Аго Був Азвр осі Без бі) бі) бі Азп Агд 485 490 495 бек їец Акуд Азп Гец Тєю Авр біу бій Меї біц Нів Бек А1а Аза Геч 00 505 510

Аго біо бій Уа! Азр Тс оБец Пуз Агуд Ббуз Маї Аїа б1й біп бід б1ч 515 320 525 ;

Акд біп Сіу Мес уз Уаї б1п0 А1а їеш Аїа бек Туг Пе) Суб Туг Рів 530 535 540 ма1і Акд Аго Рпе Хаа Рко Ніз Ма! Асд Тпг Мес Тср Тгр Агд Азп б1у 545 550 555 56 сеІ о

Сіу Агд Січ Суз бек Азп Зег бег Хаа Хаа бек Нів Ге бек бек Тгр 5655 570 575

І1е біл бег Ре Ге пуз Те Суз Рае Пец Тгр ТіК Ре Ніз Уаї Суз

І зво 585 590 Ф біс обо т11є АзпоСуз збе Ніз бек Ге» Пув Був Був г) 59 со (ее) (2) Информация для 5ЕО ІЮ Мо3: () Характеристики последовательности: -- (А) ДЛИНА: 26311п.н. м (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: кКДНнК « (хі) ОПИСАНИЄ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ІЮ Мо3: шщ

ССССТСТСАС АБСССАОССС АТССААСАСС СССТСАССАА АСАССССАТС САССОССТОТ 6о с СТССАбСССА ССТОССАССС ААССТОААСС СОбСАСТАСА ССААСТСССА ССТСТСААСА 120 ; - ССОСТТОСАС СОСАСААТАТ АААСААССАА САСАТССАСС ОССАВАТСАА СССААТТАСС 180

АССАСАСССТ ССАТОСССАС СОСАСАСАСС ТТТОбССААС ССССССАбОС ССССОбССАС 240

СТБАССАСАС ААСАСССАСА бССССТААСС ТОСАСССТОС ТСТОССАССА САбСССССАС 300 -і АСССАВАСАА СТСТОСТССС ТТСАСТТІТСА ССЛАССАССА СТСТОССАТС ТОССААСССТ з6о

ТАССТСТСТС СТОССТОбАб ССАСССССТО ССАСААЛАССС САССТСАССА САССОСАВАЄ 429 - САВСОСТССС ССАССАССАА СТОСАССАСС ТОСАААТАСА АТТАТТОСТС ААСАСССТСТ 480

Ге | СССАСССАТТ ТТСТСТОСАб САССАССАСС АВАТТСТСТС СТСССТСАЄС АТССАСАбСС з4й

ТСТСССТОТС бСАТСАСАСТ САСААСААСС САТСАААСОС СТСТСАААОС ТОбСббСАСА 600 со СССТСАССТС АССССТАСАС ТОСТОСАССА СССАСССССА СОСТССААСС ТОСАССТОСА. 660 (Че) АСАТОСТОСТ ббСССобооб СОССССАССС АСАССССААС СТАТТТСААТ ССТОТОАДАС 129

ТССАААТАСА СТСТСТТААТ ССТОААСАСС ТОСАСАТОССО ССАСТТОСАС СООСТСВДАС тво

ТООСАСАСАТ ССССАСТОСС АТСАССАбСС АСАТСССАСС ТОСАСССТТС АбСТТОСТСА 840

ССАААСАССС бСАСССТСТТ СОСТАССАСА ТОбАбСТОСС АСАСТОСбОС АТССАССТОС 900

АСТОСАСАСТ ОсЄСССТбАТ ОССАССТТСО ССТОСАССТО бАбОСТСААС САТОбССАОС 960

ІФ) ТОБАСААСАС ССССТЛАССС ТОСССТОСАС СОССббСТСС АСАСТОССОС АААССАСССТ 1020 іме) ТОСТОСТОбО ТОСАСОАТОС ТОСССТОААА АСАСАбОСТС АСССОТТССС АССОСАТУТС 1080

МОСАСССССС СОССТСАВСА СМТСССААСС АСОСССТОбМ САССМАССМА АССТМОССсс 1140 бо СААССМАСАА ТОССТОССАЄ САТІТСАСАМ ССТСАБСССМ ТОССССАМСС СТОСТСААРА 1200

АААСАТТЮИСС СССАССТСАА САСАСАСААС САССАТОСМС АбСАСТТММА ССТУСОСОЛА 1260 б5

АСАДААСАСС САТСТТТМТТ СТОСОССТоС ТОСАСТМОбА СТТОбССТОМ АСССоСТТоо 1320

АМТСАСТОАС САТТТОТТОб САСАМСАбОС БАСАБСАССТ ТОСАбССТОС СТСАСААСоС 1380

СтТообСбАСС ССТТОбоССС СТСАСССТМС САбоСТОСТО ТОМАСАСТСТ СААСТОТОТА 1440

АСССМСССАА АМСТСАСОМТ ТСАСТОСАБА АССАССТМСА ССАССТАТОС ССОСССОМТА 1520

ССТТААММОС бооОССТОТМ АААССССТТС ССТМСОССТМ САССТМОССС АбСТСАМССС 1560

СТТІТТОбСТо ТАССбСАААА СААТОССТСА СССТОССААС ССТИСОСТОб ТАСААТАСАС 1620

САСАСТТТТО АССТТСТТОС ААСАСАССТО СТСАСТТОАС СТСТОСТТСА СССААССАСС 1680

АААСААОСТОо ТОТААСТСАА СТОСТТСТСА СТМССССАБА САТоТОоСССС ТтТОоСстТостТо 1740 70 ССТАССАСТС ТТОСССАСАС САБСАСОССС ССАСССССТТ САБССССАСС АСТОССССАС 1800

АСТСОСТобС АСТСАСТТОС СТСАТСТСТА ААОСТОААСо СТСАТССАбо АТАТОССТбА 1860

САССААСАСТ СТОТОСАТОС АСАТСАТСАС ТОСТМААСОМ АААССАССАС АСАСАСАССУ 1920

ТССОбСБССС САСМССССАС ТМАТСАСТОТ МССАСССТОС ТМОСТІМССС САСМАССАСА, 1980

ОСТМСАСМСА ТСАМСАСТСА САСТНСАССС ТМОСССТОСС ССТМОСССАМ САСОСТАСТОо 2040

СССМАСОССА СТТТОСАСМТ СТОАТОМАСС ТСАААССАСТ ТТСАТСОСТМ ССССТСТММо 2100

БСАСОСМСАС ССМСАбОСМС АСТОАСАМСТ СТАССМАССА ТАМОСААМОС САССАБАТОС 2160

ССТОМААбСо АКСЛСАСТСТ ТСАССТОТОС АМСАТОСАТС ТОАСТМССТО АААССТСТТМ 2220

МССАСМАТТТ СТСТАДСААТ ВОСАМНССССС ТТМССССАТТ СССССАОСТТ АоССТСТтТсТт 2280

СССАббОСАб СТАМСТСАбО АСТСАССТАС САТТАААТСА ОСТОТОМААТ СоТсАСОоСоС 2340 2 0 ТОТСТОСТАС ССТСААССТС СТоббОСАСо ССАСОСССАС АСТОССТОоСо АСААССТСАТ 2400

ТСССАСАТСТ ТОССААСАСА СССТТТМСТС САССТСТОСА САТТСАСТСА САСТОСТоСС 2460

ССОСАСАСАС ССССООСССС САССАСАТАА АСААСТОСАб ССТТОСТАСТ ССАБАСТСТО 2520

ССТТСТАСАб ААСТСТТТСТ ААССААТААА СсТТТобостТс АТСАСАААТО ТТААААДААС 2580

СССТТОСТбо ССТСОААТСА АОСТТАТОСА ТАСССТОбАС СтТосАСбоСо б 2631 с (2) Информация для 5ЕО ІЮ Мо4: і) () Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: 1253п.н. (В) ТИП: нуклеиновая кислота Ге! зо (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная со (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: кКДдНнК со (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО І Мо4:

САТТОБАСТС АСССосТобо БОСОСТСТАС ААТАСТОСАТ ССССоСОСТо САМОСААТТС у ьо

САТТССАССС САССААСоСС ССТТСТТСТо ТОосТСоСобС АССТТТАСАС ССОСААССАС 120 -

ССАССОССАС СТОААССАСС СТТТТСАСАС ССТОСТбССС САСОТОСАСо СбОСССбСАА 180

СБОСАТССОС СССбСТСАСС ТОСАССОСТА ТОТОССССАА САСбАСССАТ оСТОСТОоСТо 240

ССТОТОоСТОоС СОСТОТбАСС ТОССОСААСА ССТСАСССАТ СБАААССТОА СОСТОСТОТА 300

СссобоосСТо СТОСАССАТС ТОБССАСССС АСАбСАСААС АААССААССА АСАЛАТТСТо. зо « 406 СТСССАСААС АААССТСАСо ТОСАСАТСАА АСАСААСТТТ СТОСТСАСТС СССАССАТТА. 420 шщ с ТОСОСбАТТС АЛОЛААТОССА ТОСТСАЛАбСС ТТТОСАТТСС ТАТОААСААЛА АбСАСбАТАА аво ч АОТІОАТСААС САСАТОССАС СТСАСАТОСОо ТОАСОТООАС САСАСССОАС АбоАооТосТ з40 п » ТСбОТСТоТС ТТАСАОССТО АбССАСТОСО АСАСССАСАА САСООСТСТТ САБСАССТАЄ 6оо

ААССТОбААА СССАТОААСА СССААСТАСС ТТССАССТТА САССАССССТ САААТТТОбА во

ССТОССАССА ОСТОСАСАСС ТТСАСТОСАТ ССАСАСАССА ССАТСТСТОА САТТСАТТОС 720 -І ССАТСАССАТ АТАССАССАС ТТОСТААСАТ ССАСТСАССТ СССАСАССТО ССТОСАТОАТ 780

ССАДБАТСАА СААТАСАТТО СТОбСААССА АСАААТАССА ССАТССТАТО ААСААТТТСТ 840 - ТАААСААВАС САААААСАСА АСТТСААААА АСТОСССССА САСССАСТТО БСОССААСТІ 900 (Фе) ТСАТСАСАСС ТОСАССАССА СТоСАСоСтТо ССТоСОСТСТ ТТТОбОоССоС СТСТОБААТА. 960

АТОБАССССС СТОССАСТСС АСАСАТСААС ТССААААСТС ААССТОСАСС ААТСААСААС 1020 со САСТСАСАТА САСАДАЛАдС СТААТСАТОС ТСТСТАССАА СТАССАТОАб ОСТАЛАЛОоСС 1080 (Че) АААСТСААСС АААССССТАТ ТАТАССТТСС АСССАААТТС ТТТАТСАТТО ТСТТТСТТАС 1140

САААСАБАСА ТАСТСАТТСА ТТТОАТТТАА ТАААСТТТТА ТТТтІТСбосСс тТостТобсстТ 1200

ССААТСААбС ТТАТОБАТАС СОТСбАССТО ЗАббОобОСОС СОТАСССАСТ ТЕТ 1253 59 (2) Информация для 5ЕО ІО Моб:

ГФ) () Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: 417 аминокислот де (В) ТИП: аминокислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна 6о (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ: белок (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО І Моб:

І1е біу Ма! Тис Ас Тер Агу Агу бег Агуд І1е Ма! Авр Рго Акд А1а 1 о 10 15 б5

Аїа Хаа Азп Бег 112 Агд Аїа нНіз біц біу Ркго Рпе Рре Суз біу Асд 20 25 за біу Тих Рре Тис А1їа А1їа бек Тпг біп Агд біп Те Буз бій Аза Рпе 35 40 45 б1Ш Агуд Гей Геї Рго бСіп Уа1ї бій Аїа Аїа Агуд Гуз А1іа І1е Агуд Аа зо 55 во

Аза біп Уа! біш Ага Туг Ма1ї Рго біш Нів біш Ага Суз Суз Тер Суз 65 70 75 80

Ге Суз Суз бі1у Сув бі уа1 Агуд Сі Нів Те бек Нів біу Азп Ге! 85 з0 95

Твг Ма! Те» Туг Сіу біу їеш бец бі Ніз Те Аїа бек Рго Сій Нів 100 105 110 цуз цуз Аіа ТВг о Азп о Пуз Ре Тер Тгр біш Азп Буз Аза бі) Уаї біп 115 120 125 мес пув бі Пув Рре їез уаї Таг Рго біп Авр Туг Аїа Агд Ре Гуг 130 135 140 цув бес Мес Ма! був біу си Авр бег Тук Сім бій Буз бій Авр буз 115 150 155 160 се з о

Ууаї І1е буз біу Мес Аїа діа біп І1е Агд бі Уаї бі біп бек Ага 165 170 175

Сіп біо Уаї Ма! Агуд бек Уа! Гей Сі Рго біп Аїа Уаї Рго Азр Рго

І 150 185 190 іа

Зо со січ б1у сіу бес Бек А1а Ргро Акад бЗег Тгр був с1у Ме Азп бек с1п 195 200 205 Ге)

Ууаї Аїа бек бек Ге біп біп Рго бек Азп Пец Азр Те Рго Рго А1а ч- 210 215 220 в.

Рко бій пе Авр Тер Меє 010 Тв б1у Рго бек Пец Типг Рпе І1е 61у 225 230 235 240

Ніз біл А5р ї11іє Рго біу Маї Сіу Азп І1е Ні 5ег біу Аіїа Тік Рго с 2415 250 255 - с Ркго Тгр Мес Пе біп А5р бі бій Тус т1в А1їа біу АБа біп біц І1е . з» 260 265 270 п б1у Рго бек Тук біш бій Ріє йеш руз біш Гуз біц Буз біп уз їей 275 280 285

Туз Буз Пец Рко Рго Азр Ага Маї Сіу А1а Азп Рне Азр Нівз бек бесг тд 290 295 300

Со Агд Так обег Аза сіу Тгр Мец Рго Бек Рпе біу Рго Агд Пец бій Ха о 50 305 310 315 320 (Че) Тер Тс оРко бе Аїа Маї біп Тнс бер Тс оРго уз Бец Буз еп біп 175 330 335 біп Хаа Агд бек Бек Ніз 11іеє біп уз уз Аі1а Азп Ніз Аіїа їеи Туг 340 345 350 бій Бей Рго Хаа біу Хаз Гуз Рко ПЦуз бе: Тпг ПЦуз Ркго Гец Пец Тугс де зБь зво з65 60 б5

Тем Рго Рго Буз Рпе Рпе Іч11є І1е Уа1ї Рпе йец Ак4д Був біп Тс Тук 379 315 380

Зег Рпе І1е Хаа Рпе Азп Гуз Ма! Ге Рпе Рпе біу Бей Агд С1іу їец 385 3950 395 400 бі бег бек Пец бег І1е Рго бег ТПг бЗег Агу Сіу біу Ага Тпг Нів 405 410 415

Рпе (2) Информация для 5ЕО ІЮ Моб: () Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: 4596п.н. (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: кКДНнК (хі) ОПИСАНИЄ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ІЮ Моб:

АбСбОБСОбА СТОТОСССТо ТОбААСОТОЇ АССТОТТСАА ССТОСАСТСТ СТТАССАТТО 50

АССАТСТІТТО САССАТСАСТ АТСТСТОССА САСОСАСАСА ТАААСАбОСА БАБАСССТТТ 120 бССССТоССТ ТТСТоССССА АСССАдДСССТ САССТоТСТТ СТОССАбСТС ТСССАТТСТА 180

ВАОТбАССТОС ТСТОТоТТТо СТСТСТСТСА ССАТОАССАС ВАСССТОСОА САТООСАСТО 240

АТОСАААТОС ССТОСССАСо ТОССССТОСС ТСАССАСТОС СОСАССАСАА ССААСТОССС 300

ААСССАААСС АСААСАСОСС СССАСТООСО ААСАААСАСА ССТОССТСТА СААССТТОАб 360

ОССОТОБАБА АБАССССТОТ СТТСТОСбСА ААСТОбСАСА ТОСТСААТОА ССТОАТТАСС 420 с

ААСОССАСАС ССААССААСС СТОССАСОСА СОбССАБСТС ССАТСТСТАТ САТОбСССАС 180 Го)

ОСТОАОТОТо АОААТАСССА ДОЛОТТСАОС СОСАССТТТТ САСААСОСАТ ТТТСАТСОСТ 40

СОБТССАААС АСТАСАСССА СТСССАСАСТ СТТОАТСАСА ТССССААСАА ТСТОбСССАТ 6о0

ОСТАСАСАСО ССААЛАТОСС СОСТСТОТОтТ ТОСАЛОССАЛ АБССТОССАб САЛАССССоо вво Ге»)

ААСАЛАСОСА АСААСААСАС СТСАААСТСС СТООСТСАТО САССАСТООС СТТОСССААА. 720

ССССТССССА ООАССССТОА ОСАБСАСАСС ТОСАССАТСС САЄТОСАССА ББАТОАСТСТ 780 (ее)

ССАСТССЬбСо СОССАТАТОТ ТАСАЛАСАСС ССССАСТТСА ССААбССТСТ СААССААССА 840 со бОССТТОбОС ААСТСТОТІТ ТААССАбСТТ бОСоАббоСС ТАСобСССоС ТСТоССТобА з00

ТСАБААСТОСС АСАААСТОАТ САССССОТУО СВАТОТСТОА АССАССТОТО САЛААСТОСАС зео «-

САСССССАОС АСОСАССССС ССТОССССТо СССАСОСАСС ССТТССССТА ТАССАСАСТО 1020 че

ССТСАТСССТ ТОССАТТССА СССТСТОСАС СССТОбАААС СТСАСССТСТ бСАсТестТТ 1080

СТОСОСАААС ТобоСтТоТоТ АСАСАСССАС АААСССТТОС СТОАСОСАСА ССТОАССВАА 1140

СТоСоСтТсТо ТАСАСАСТОС АААбССССТо ССТОСССАС АССТоСАССС САостТоссТо 1200

ТСТостТосТо СССАТбАСАА СТТТТСТОТС САССААТАСС ТАСТОСАТОС ТСТОСАдСоС 1260 «

АЗССТСАССТ СААбССАСОС ССАСАСОССТВ АССАБССТОС ССААСАССТО БбСАССАСОС 1320 шщ с СССТССАСАТ ССССОСАССС САСССОСААА АСТСАБСАСА АССАбССТОТ ССТОСТСАСТ 1380 ч бБАСАДАСТСА АСССАСТОСА ТТАТОАСТАС СбАСААСААС ТОСАСТОСОС САСОСАССАЄ 1440 п » СТОСбССТоо ОСАСАСОСТО СТТСССАСАС СТОСАСАССА ТОбАССАСАА ССАСАСТОСС 1500

ТТССАСТОСо СТОТСАЛААА СОТОСОССТо СААСТАТТТС ОСОСАСАССА ОСТОАТСОСА 1560

ТСТОСАССАТ ТСАССТСАСС САбААТТСоТО ССТТТОТАТО БАССТОТОАС АСААСОбССТ 1620 -І ТОБОТСААСА ТСТТСАТОВА ОСТОСТОСАА бстТОоСстТоСС ТОСОССАССТ ССТСААССАб 1680

САббОСТОТС ТСССАСЛЬСА ССобОСССТо ТАСТАССТОоб бССАбОСССТ обАСОСТСТо 1740 - СААТАССТОС АСТСАССААС САТІСТОСАТ СБОБАССТСА ААССТСАСАА ССТОСТОСТо 1800 (Фе) ТССАСССАТО СбАбССАССС АССССТСТОТ САСТІТСОСС АТОСТоТСТо ТСТТСАдССТ 1850

САТООССТОб САААСТОСТІ ОСТСАСАбОо бАСТАСАТОС СТООСАСАСА САСССАСАТо 1920 со ССТоСбоАбС ТоотТосСтТобо САбСАССТОС БАСбССАДОС ТОСАТСТСТО САССАССТоС 1980 (Че) ТОТАТСАТОС ТОСАСАТОСТ СААСООСТОС САССССТОБА СТОАСТТСТТ СссоАоСоСоб 2040

СТСТОССТСА АСАТТОССАС СОАбССТОСо ССТОТОАСоС АСАТСССАСС СТоСТоСоСС 2100

ССТСТСАСАС СССАССССАТ ССААСАСОСО СТОАСОЛАЛС АССССАТОСА ССоССТОТСТ 2159

ССАССССАСС ТСОСАСССАА ССТСААССОС ССАСТАСАСС ААСТОбСАСО ТОТОААСАСС 2229

ССТТОСАСоб САСААТАТАА АСААССААСА САТОСАСССС САААТСААСС СААТТАССАС 2280 іФ) САСАСОСТОС АТОСССАССС САЗАСАССТІ ТСОССВАОбОо СОССАбоСоС сссассСАССТ 2349 ко САБСАСАСАА САСССАСАВС СОСТААССТО СВОССТОСТО ТОССАССАбБА ССССССАСАЄ 2400

ССАЛАСАЛОТ СТССТСССТТ бАСТТТОАОС ААОСАССАСТ СТООбАТОТО СОАДСССТТА 2460 во ССТСТОТССТ СССТОбАБОСС АСССССТОСС АСАААССССА бСТСАССАбА ССОСАААССА 252

Ассстоссоо АССАССААСТ ССАССАССТО САААТАСААТ ТАТТССТСАА САбССТоТОС 2580

САбБССАТТТТ СТСТОСАССА бСАССАССАА АТТСТСТОСТ бССТСАССАТ СбАСАОССТе 2640

ТОССТоТСоб АТСАСАСТОА СААСААСССА ТСАДАСОССТ СТСАДАССТС бСббСАСАСС 2700 б5

СТОАССТСАС ЗСОТАСАСТС СТОСАССАбС САбССССАбО СТОСААБСТО САССТОВААС 2160

АТОСТбСТОб ССОСОбООСо ССССАСОбАС АСОССААССТ АТТТСААТОС ТСТСАДАСТС 2820

САААТАСАСТ СТСТТААТОС ГСААСАССТО САСАТССОВО АСТТССВССО ЗСТСАвАСТЄ 2800

СОАСАСАТСВ ССАСТОССАТ САОСАСССАС АТОССАЄСТО САОССТТСАЄ СТТОСТСАСС 2940

АВАСАСОООС АСССТоТТоо СТАСОАСАТО САССТОССАЄ АСТСбООСАТ ССАССТОСАЄ 3000

ТОСАСАСТОС ССОСТОАТОЇ СЛОСТТОССС ТОСАССТОСА СОСТСААССА ТООССАОСТо 3060

САСААСАСОС ССТААСССТо СССТССАССС СССОСТОСАС АСТОССОСАА АбСАбССТТОС 3120

СТОСТОбСТО САССАТОСТО СССТОАААЛЄ АСЛОБСТСАС СССТТСССАЄС СОбАТТОССА 3180 70 СССССССОСС ТСАСАСТОСО ААССАбОСОС ТСОСАбСАСС ААССТОСоСС СААССАСААТ 3240

ОССТСССАСБ АТТТСАСАСС ТЗАССССТОС СССАСССТОС ТОАААЛААСА ТССбССАССТ 3300

СААСАСАСАС ААССАССАТО ССАССАСТТА ССТОСССАЛА САЛАЛСАСОС АТСТТТТТСТ з3з60 бССОСТОСТСо САСТОСАСТТ ССССТСАССС ОСТТОСАТСА СТСАССАТТТ СТТОССАСАС 34120

АСССОСАСАСС АССТТССАСС СТООСТСАСА АССОСТОСОС САбСССТТСо СССССТСАСС з4180

СтТОСАбОСТО СТОТОВОАСТ СТСААСТОТО ТААСОбСССА ААСТСАЄСТТ САСТОСАСАА 3540

ССАССТСАСС АССТАГОССС бСССОТАССТ ТААССбОССС СТСТАААССС СТтосСТобС 3600

СТСАССТОбС САбСТСАССС СТТТТОбОТО ТАбССОАААА СЛАТСССТСА СССТОСбААО збо

ССТСОСТОСТ АСААТАСАСС АСАСТТТТСА ССТТСТТОСА АСАСАССТОС ТСАСТТСАСС 3120

ТСТОСТТСАС ССАДССАССА ААСААССТОТ СТААСТСААС ТОСТТСТСАС ТССССАСАСА 3780

ТсТбССССтТтТ ТоСТбстТоосС ТАССАСТСТТ ССССАСАССА ССАСбССССб АбССССТТСА зва

СОСССАБСАС ТОССОСАСАС ТООСТОбСАС ТСАСТТСССТ САТСТОТААА ССТСААСССТ 3900

САТССАССАТ АТОССТСАСА ССААСАСТСТ СТССАТССАС АТСАТСАСТо СТААССАДАС 3960

САССАСАСАС АБАССТОСОС ССОСССАССС ССАСТАТСАЄ ТОТОСАСССТ ССТоСТТСсС 4020

САСАССАСАС СТСАССАТСА САСТСАСАСТ САСССТООСС ТОССССТОбС САСАСССТАС 4080

ТОССбАСООС АСТТТОСАСТ СТОАТОАССТ САААССАСТТ ТСАТООСТОС ССТСТОбСАЄ 4140 сч 29 СОСАССОСАС СОСАСТОАСА СТОТАССАСС АТАССААССС АССАСАТОСО СТОААСОСАС 4200 о

АСАСТСТТОА ОСТОТОЗАСА ТОСАТОТОАЄ ТССТСАААСС ТСТТОСАСАТ ТТСТСТААБА 4250

АТАБСАСССС СТТСОССАТТ СССССАССТІ АбССТСТІСТ СССЛСОССЛВ СТАСТСАССА 4320

СТСАСОТАЄЄ АТТАДАЇЄАО СТСТСААЛЄ ТСАбОбСССТО ТСТОСТАССС ТСААССТОСТ л3ви Ф бСобСЛОСОС АСбСССАЬАС ТОСбТСОСАС ЛАОСТСАТТС ССАСАТСТТо ССААСАСАСС 444

СТТОТССАС СТОТССАСАТ ТОАОТСАСАС ТОСТОССОбо САСАСАСССС СбОСССССАС 4500 (ее)

САСАТАЛЛАСА АСТОСАСЄСТ ТОСТАСТОСЛ бАСТСТбОСТ ТСТАСАСЛАС ТСТТТСТААС 4550 со

СААТАААСТТ ТОбСОТОАТО АСАААТОТТА ААЛАЛА ч596 ч- (2) Информация для 5ЕО ІЮ Мо7:

Зо () Характеристики последовательности: ї- (А) ДЛИНА: 947 аминокислот (В) ТИП: аминокислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна « (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная 40 (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ: белок в с (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО І Мо: ч Мек Аа Уаї Ме бій мес Ага Сув Рго біу АІіа Рго біу бек Аїа Уаї п » 1 З 10 15 біу біп біп Пуз бі Пез Рос Ббуз Рго Пуз Сі Буз Тс о Рсо Рго Бец 45 -І 20 25 30 ша б1у уз Був Сіг бБесг бЗег Маї Туг ГЦуз Пе Сі Аза Маї сі був бег (о)

Ркго Уа! Рпе Сув сіу уз Тгтр бі Тіе Тен А5п Азр Уаї І1є Ти Був со 50 55 60 « 2 біУ Тиг о Аїа Буз бьц о біу Зег б.и Аїа б1у Рго Аїа Аа Іїе бег ї12г 65 70 15 во оо Ііе Аіа біп А1з Сі Суз Січ Азп бек біп бій Рре Зег Рго Тпг Ре

ГФ! 85 90 95 ке б5ег бі Ага 113 Рпе І1е Аіа С1у Бек Гує біп Туг бек біп бек б1ц 100 105 110 60

Зегобом АБробіл 112 Рго Азп о Лзп Уаї А1ї2 Ні Аїа Тис Сі біу бух 115 120 125 бо

Мес діа Агу Уаї Субз Тгр Був біу Був Агд Агд бег Гуз Аїа Агд Гув 130 135 140

Буз Аг Був Гуз Гуз бек бег Був Зег Гей Аїа Ніз А1їа біу Уа! Аза 1415 150 155 150

Те Аїа цу Ро Гей Рко Ака Тс оРго бі) б1п 010 бек Суз Так І1е 165 170 175

Рго Ма! Сіп б! Азр обі бек Рго рей б1у Аїа Рго Туг Ма! Агуд Азп 157 185 190

Тис оРго біп Рпе ТпК цу Рго Беш був бі Рго біу Бецп біу Сіп Бе! 195 299 205

Сув Рпе Пуз біп це біу бі біу Пец Акд Ркго А1а Пец Рго Аг9д бек 210 215 220 бі Пе Ніз Пуз Пєш І1є бек Рго Пец Сіп Суз Пец Азп Ніз Ма1ї Тгр 225 2:30 235 240 пув Пеп Нів Ніз Рго біп Азр біу б1у Рго Гео Рго їеи Рго ТАг нів 245 250 255

Ркго Рпе Рго Туг бег Акд цей Рко Ніз Рго Рре Рко Рпе Нів Рго Гей 260 265 219

Сіп Рго Тгр Гуз Рго Ніз Рго Те б1іш Зек Рпе Те біу Буз йем А1а Ге) 275 280 285

Суз ма! Авр бег біп буз Рко Те Рго Азр Рго Нів Бец Бех Пу5 Гец 290 295 300 Ге!

А1їа Суб Уаі Авр Бек Рго руб Рго бе Рго біу Рго Ніз Бе бій Рго 305 по 315 320 (ее) бек Суз це бБег Агуд біу Діа Ніз бі уз Рпе бек Ма1і біс бій Туг 375 330 335 че

З5 Теч МУаї НіБ Аїа пем біп біу бег Уаї Бег Бег Бех біп А1а Нів бег че 340 345 350

Беп Твг обЗег Ге А1а Гуз Тс Тгр Аа А1а Акад Сіу бес Агуд Зег Аг4д 355 360 365 « бій Рго бег Рго Дув Тпг бій Авр Абзп бі СсСіу Уаії Тез Гей Тих Сі с 370 315 зво ;»

ГІ Пуз Беч Гуз Ро Ма) Азр Тук о біцш Тук Агуд біз бін Уаї Ніз Ткгр Аіа 385 4390 395 400

І

І Тапг Нів Сіп пес Агд Ге Сіу Агд б1у Зек Рбе б5іу Сіц Ма! Нів Агд 405 410 415 -й

Мекє біш Азр Пуз Сіп Того Сіу Рпе біп Суз Азїа Маї уз Ппуз Ма1ї Аго (ее) 420 425 130 бе 70

Тем бій Маї Рбе Агуд А1їа бі бі) Тец Мес діа Суз діа Сіу Іеєц Так (Че) 435 440 445

Зег Рго Аго І12е Уа! Рго Пе Туг б1у Аї1а Уа! Агд бін сіу Рго Тгор 450 ї5У 460 25

Ф! Уа1ї Авп І1е Рре Ме біп Тїєуш це біз б1у Сіу бег Пси біу Сбіп Гей 4657 475 475 авс 60 бо маї Гуз бі сб1іп б1у Суз Тео Ркго б1й Азр Агу Аіа пе Тух Туг їеу 485 490 495 сіу біп Аза без бій б1у па бі) Тух пед Ніз бег Акд Агу 116 їв ог 505 510

Ніз С1у Авр Маї Пуз Лід Авро дви Маї Бе Бец Зег бег Азр біу бек 515 520 525 ніз Аїа Аіа лек Суз Азр Рпе біу Ніз Аіа Уаї Суз цей біп Регс Азр 530 535. 540 б1іу печ біу Буз бег 12 Тец тпк о б1у Азр Тук 118 Ркго 01у Тйг 610 545 350 555 950

Тр нів Меб Аза Рго Січ Уа1ї Уаї безч біу Агуд бех Суз Азр А1їа Гуз 565 570 515 чаї Азр Ма! Тср бег бег Суз Суз Меє Мес цец НЦіз Меб Пец Азп б51у зу 585 550

Суз Ніз Гко Тгр Тк біп Рбе оре Агд біу Рко пен Суз Геш Буз І1е 595 600 605

А1їа Бек бій Рго Рос Рго Ма1 Ага бій Ізе Рго Ркго бек Суз Аїа Рго рити 615 620

Тео Тпг о Аїа біп Аїа 116 Сіп Сі б1у Тец Агд Гуз Сі Рго 1120 Нів 75 30 635 вас

Ага Уа! Бест А) АЇа бі цеа біу біу був Маї Ахп Ага Ліа еу Сіп

Й 645 650 655 о біп ма! біу біу Пец Буз бег Рго Тгр Агу біу сім Туг Був бі Ро 6ео 565 670 зо Агу Ніз Рго Рго Рго Азп біп А1а Авп Туг Ні біп Тбг о їеи Ніз Аза 615 680 685 (ее) біп Рго Агд бій Пец бек Рго Агу А1Іа Рго біу Рго Агуд Рго Аза Сі со 590 695 700 ч- біс Тпг о Тас обіу Агд діа Рго уз Те біп Рго Рго їв Рго Рго біц у 7оь /л16 715 120

Рко Рко бій Рго Леп бує бек Рго Рго Пе Тпг Те бег цЦуз Сі бій 728 130 135 «

Бек біу Меє Тгр бій Рко Гей Рго Бей бег Зег еп біц Рго Аза ро - с 1493 145 150 ч а Аїа Ага Азп о Рго Зегобег о гго бі Агд Гуз Аїа Тк оМаї Рго бі) біп 155 760 165 бій пе біп біт без біш Т16 бі Пеп Рпе Пец АБип бег Беп 5ег біп 1 70 715 780 -й

Рго Рпе бек цей би бій біп біш біп 11е їеєц бег Суз це Бех І1е (ее) 785 139 195 во

Ге Ж

Азр бБекг Пе бег Бей бек Азр Азр бек бі Пуз Азп Рго бег Цуз діа

Ге 805 810 815 бек біп Зег бег Ага Азр їБгоцес 5ег бек Сіу Уа1ї Ні бес Тгр бек 342 825 830 25 60 бо бек біг Аїа бій А1а Агу Бек бег Бек Тгр Авп Меє Ма)! Геш Ала Акад 835 840 845 біу Аг9 Рго ТВІ Азр ТргоРго бег Тук Рпе Ап біу Уаії Пу5 Маї с5іп 2 350 855 860

І16 біп бек Теи Азп Сіу бій Ні Пец Нів І1е Агд Сі Ре Нів Ага 865 37 875 880 уаї ув Маї біу Аво І1е Аїа Тик Сіу Іїе бек бек біп І1е Рго діа 70 335 890 395

А1їа А1іа Рпе бег Пец Ма! Тих Пуз Авр Сіу Сіп Рго Ма)! Ахд Тук Авгр 900 905 910

Меї біш Маї Рго Азр бег біу їіе Азр Гео біп Суз ТрІ Тем А1а Ркго 915 920 925

АБр Сіу бек Рпе Аза Тгр бек Ткр Агуд Уа! Пуз Ніз сіу Сіп Ге біи 9:50 935 940

Авп Ак Рго 945 (2) Информация цля 5ЕО ІЮ Мов: () Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: ЗОп.н. с (В) ТИП: нуклеиновая кислота о (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙИ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /дезс - "олигонуклеотидньій ПЦР-праймер" (о) (хі) ОПИСАНИЄ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ІЮ Мов: со (2) Информация для 5ЕО ІЮ Ме9: со () Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: З2п.н. -- (В) ТИП: нуклеиновая кислота ї- (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙИ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /дезс - "олигонуклеотидньій ПЦР-праймер" « ска Хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ІЮ Мео: з с 7"Т2) Информация для ЗЕО 10 Мо10: "» () Характеристики последовательности: " (А) ДЛИНА: 24п.н. (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна ш- (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная - (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /дезс - "олигонуклеотидньй зонд" со (хі) ОПИСАНИЄ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО Мо10: со 20 (2) Информация для ЗЕО О Мо11:

Ге) () Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: 24п.н. (В) ГЛП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная

Ф) (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеиновая кислота ка (А) ОПИСАНИЕ: /дезс - "олигонуклеотидньй зонд" (хі) ОПИСАНИЄ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІЮ Мо11: во пня пн пн нн нн ння б5 -д42-

оре ї | ЇЇ «є Вебтійненовбнюй мотив синковова НаХЕНЕ

А як г Б - ТВА ш в Й ян

ВИ, х я а ян.

В ш см | вне о

Ї а ще ш шо ше » 858 8 З в ще 5 ві о | ї 7 с І : ї з» | і й | 7 -3з со и бо 70 ббобіийнеонини: ТВ (Че) (Ф) ко 60 б5 ви й Ї єна: - фе хрону ОБОВ В СБісов й ЄВ я Ша Яни 1МЕ евро фтетнь йенелеорі Пе

Е Ї | і г: Ше КУ І ще ще ще вро Чий МАРЕК) я п ще з ! г 70 о н- и Х її ! ї / ія ее е Б я у Її : Ж ії 5 я х Пе. ! Так, таке;

К У І тта-мікан- ф би І а й (МАРОК

ПП савадниу Ши: щ І імкенівмсв ре І и г ЩІ «ї | 1 ТЯ в й 1 " . й

Й ї

ТИВИ АКВИВАЦИХ: колегою Меекві їепоїп: 1906 бшціу 7. 1996 12:35 Туре: М СБеск: 7122... 1 сСАТТОбОТОХ СОСОСТОоСо ССОСТСТАСА АТАСТОбАТС ссссососто 51 САбБААТТОЗ АТТСБАСОСС АСбААСОССС бос соС ссапссАССо (о) 101 бСсСбосодп АСОСЛССАТО АССССАТСВС ВСААСОАТСА СААААСАСАА со 151 ТТТСТОоСтТбо АСОСАСТОСТ ССАТОСАСТО АААСАСТОСС АСАТоСосТтт 201 ТПбАСОЗАСА АЛСОАСАТТО ССТОСОСАТТС СЗАСАССАСО СРСАССТСТо 255 ТСТСТОСОСА СТТТОААСОС СТОСТОСАСС АТООСТТОАЛА САСсАСТОСА із 301 СОАТТООСАС ТСАСАССОВС АСОСАТСААС САСОСАСССО ССТТТСССАЄ ї- 351 СААААСООАА АСАСАССОСО ТОТТСТОСТА СТАССТСААС САССТОСТСА 401 АСААССАСОА ССТОСАССОС ТТСТАСТОСС ТОСОССАСАТ СОССТСАСАЄ 451 дтобосссос СТооСссстТо ОСТОСОСТСТ ОСССТОААСО ААСАСТоССТ « 502 шпдеСостТАС СТосАСАТоС ТосСтТоСосСсА ССостосАСо столосастт З 551 ТТТАТСААСА СТОСТОТТТТ СТСАТОСато ААСААЛАССТС САСТАТОСТУ с 601 ССТАССАТСО САССАССТСТ СААСТОСУТА СТСТТТОССА ТТААСАТССА :з» 651 СААСЛАССАТ ТТОААСОООС АСАСТААСТТ ТССТСССАСС СТТТСАСАСС 701 ТсттТАХАСОА СТОААСССАС ААССТСАССТ ССТТОСТСАА ССАСТОСАСО 751 СВАСОАСІСА ССАСОСТОТТ САСОСАСАТО АСАСССТоСТ стоссстесто -І 801 сСАТСетТСАТО АААССТОААС АССАСАСССА СОСТТСССТо ТОСТоТССАС з 851 СААТОТСАСТ ССТОАТОССА ААТОСААЛААА ССАССОСААС ААСАААААСА ге» ШИ

Ге; ФИГ. ЗА 60 65 -АА-

901 ААСТОАССАА САТААТСТСА ТТТСАТСАТО АССААСАТСА ССАСААСТСТ 951 боооАСсСТоОТ ТТАААААСАС АССТОСОССА СБОБАСАССТ САСАСОСАСАА 1001 СтТІСОАСОоС ТОСТОТОТСА АТАТСАТОТС СОССТТТОАА АоссосттТоо 2 1051 СОІІТААСТІ СЛАТООААТС АСАбСАССАА СТСАТОСАЛА АТТСАТТССС 1101 тТоТсттТоАА СОООСАСТТТ СОСТАССАСА АССТТСАТСТ СЛАЛАССАТе 1151 сСАКСАЕСААС АТСТОСАТСА АДАССААСАТ САСОТОТАТО САААСТСАТо 1201 АСОХАССААС САСАСОСОСС АСТОССАСТС СССССАСАДС ССАСТОСААС 170 1251 ОБбААСАСсСтТУ СОТСТОССАб АТОСАСАССТ бо9СЕССоСТ СААботоСТо 1301 СаслатоАсСтТ СОБАСАТОоСТ СТТоССТоТо АСТооСоТоо УСТоСтТАСАС 1351 СССАССАСАТ оССССССТСС СААССОТОСА СААСОООАСА ССдССАсАСо 1401 АССАССТТСТ СССОСАТОСТ СЗАСТІСССТ АСАСТОТОСА АСоСАССТСТ

Фиг. ЗВ с ї135Ь боноплІЗоОп седотоІстсї СваоспАОССТС ТІАсітотос Стас Ге) їі овматІтлтйл СААТТІвВОТоОв АСтОСЄбОСА сспАСТоТоа ССЗТОАТОАХ, т951 сАбавнаполт бАпстооги АасазАлСла АТПАасТеСоХ васстотись їа01 засаптоАоАТ спаоСАСТоА срессостес послдсдост шпасіесято (є) 931 АдААПаРла поЗІТовАСА паАссАшсаЗ плас АтТоА АЗСТІОМУЗЕ с 2191 бстапосьоо ТАТОТТТОоТ АТТТТСТОчБ ОАЗАТТІХАА ССелатЗтТпА

МБ о пбавшуАтТиОї пТОдАЗАЛАТ сала МОАВАТОСАА САбТТОТТоА (2,0) 1801 тал. ТБАШСІЕТО пАТЕбАПТСТ "тера тататттосТ ч- 1651 жтштАптттї САТВТАТоТй АОССААТАВА ТТОСТТІСАТ ТоСТтплАлА

Зо 1501 вАвахА ї-

Фиг.3с тВАМБІАТЕ ай: 9-7 пласкі. 71722 Етот: Її со; 10є авто твІ утопії 1 їб: 1:15, «

Енпп.вет орепсетій: 524 лежать 23. 1996 15:03 Тупе: Р Слеск: «55 шщ ї Жізвахлекил саККХВКаск СБЕВЗІОАМИХ СПІЖЕХСЯИ РІАЯВЕОЗЕУ с ІІ отрітаптетаУ пПанаОКАБАИ САштТАААТЕО ААСТЬБИТЕТ КРУТА лЯ ч з 10- УінннхжООдК У5ОсЕКАБОУ ОдодАнЬвсЯ ІМЕЧУШРЖЖІ. НУТ. ОБІДІ, " 111 ЕЕ ЖЕСЧЕРКІ НОЕЕБЕБИ Ов ТМвАаЦНВЕ. БАГХІШЧНИ: Молсекдлти

Іі ВОСЬЕКЕТОХ ЧІТ бИЗЕЬІЕЕТТ АаХАМаїслк ЗЕЗЕТІТСТ 5 - 75 ІІ свочел тм МкзЕплинан вт Е МЯЗЕтТЬсІо. ХЗЕилам 1. ОВлІБІвОВЕЇ БВАОКАваС ТЕМІ НЕЯТЕРТЕКЕК путрвІАтиВ - ФБ1 опчат'врс'бї ЖБ'ЖЮІНЕТтВ ЖТАСЛЕТстА ЗЕАСпвеЧ,В опал зАх о «421 бАдозБавнІ, ЕОПИлеш а ЕАСТРЕКЗУе ЗритУбЕвси ФемтТиниЗ

ЗЕ1 опОБкзЕУанЕ ОРІ ЗАЗУВІ ЗКТІБІОБОА тТУйЕЧМАВпя ПЕЖЕМАЗсвЯ со ЗЕ о хдобЕМлкЗА доптючтТУх ВАУААЧЕШИО СМЕМЦЛІЬНУ БУТ вЕвт о (Че) 5 онтятчЧнии: сПЕККЯ8- ВЕЬТУНІВНІ ТАТИ Ттн УусІВАжти таз І ЛЕК (Ф, ко 60 дис. 30 б5 шіста 19 опепатло 253: бич 42. 2986 11:18 отТурех КО Ббєск: 51рт у, 2 ССС тиМ Ас сАдст йтВгААДАСО СестлалотаА ліжАЖсІХ

ЗІ ЖАДоштитОІ стТашАЧТОтТА Оса ДАтЕВаАЕХ дтошАсТАлу

Зі збААОТшов пГІТОСКАВА ССОСІтОалІ ЕЕ АлАПОАЛЕдА 131 пАТАТЕТМЄІ ПТТАЛАТОАА ПСТаАЄТАИЄ АстАСАЄССТ СЕАТОВсВА т сі ожапАСАШУІ: ТІБСОССХАБ ПО тВСІ) пстастоссаю СТОврВасдт

БРі о хАБпадеємх бстлетТвАєт ТОСЗСетТт: ТеТЕШФйССА пАдплетсмі

Зх вапладажеь П7ЕТІШТИтт ЗІВА шА зеАЮНАЮСА ФЕТА о 155 тлшжлАЕЮХ Є тотІЕтиїли сісти зп тТО Селалавито 401 пАБшТІМА ВАдІОПАААТ ШМАСТІТОСТ ЖОАВІМІІАК СТР ВРШАВЕ 35. ЗЕЛАААТАЮА АУТАТТЕІТІ вішАВІСТВТ ШТТАСЧАТІ То стовви ас бАВпАЛОвЛС АААЛТОТоТе пт АОС АТОМА єтя ТЕГотс:сто вії боса ласьст сАСнАСЛАОС САтокадп СТОТОААвВИ Зв АА пі СтттпАбсСто впшотійсАє ТежПошалтеА Постшадсасся СОсТОпААвЕ

БУ: тІтАостозА АпАТиТТй:тТ ОПЕОтода соб Атт АСМстсАЬо пі тА Ат спІбТсАвАй ТеСЗАктТаСА пТОТОТЕАДР Ж аЛАШАТИО тЕІ товара тесо штабттотас сбоптоАнаю ЗОпрпапаилт СпплАлТІ

Жб1 бле ВбгАавсо ВПАТОСсЛ ТОМИ СТТІ МИЛІССТСА ССАлАпАєтЕ вжх1 би стТатт СшствгплеА ТІМ тост ваАлЛТтСси БІлАЄШТІХ вах люТтТашАЄЛШТ бИПТІСТШТ СПОВОсТТСп СоОТтОПАбОТІ блпизІшАну аб сАТОпОгАШІ тТопголаслш СОССТАВОСо ТОТтПТТСтАЖ СОСТОбетЕ: 100. о лтаєтогИ ЖАЛОЛАСТТ ТІТІСТТсСт васАсшАтТО: ТотштсаКА і1ПЕ- овезІвоютІ АОСІЗТІЦОЄ вежаТутЬ оппатнсСсІт спбетІівісй тьпї о поспбаллаво лоастЕтв. СТВО. В пот бова Алла, ліальй 1181 ост вттпцшАЙ ЗУТТТІАШХ, СЛТФАбОвл. ТОЕШтЬ.СЯ ФІбсттваІА с 1201 зАвРаут. тих шланапквий сала л ниє лава Дтся і деващель я. 29 11 ситуа жСалаасьсю сутетті-Б сійшттттося ТОСлдт тій о тяг. ад

Я: бстзотттв. АтттвтІні А. ТСАФЕСАЄ САТТІсЕТОС пас гАплт б» 1351 батлосадит тосмилетос ФтсСАйМАєТи бІсбейдсо сселецио. Ге 1401 ошттиАстттІ - сАппОТОТІС Е.А титТ САМЖИЗЕТА ВІЛТ.ШИСАК 1451 Адошттиьсо. т ТгАпТИСАЛА АСТАНЧТ. СА стЛАЕСТАТО: ис ей.ТА со 7531 бот тТАН. сш СоПстетет. ААЛЕШИСТТСС сотополот. Слатто пот ч-: цЕРІ оаасттА СТГ 2тІТТОЗата ТАСПОТААКА БААТОШСТОХ сопла м. 1851 Фитетастож ТАлвАТлЛОАО САСАСТТТІС Міпт::с;ттоас вас

Р581 сТеАЦІТОАТ СтттатіГтА ПИСЛАШОАСС АВАПАДСТТО ТОТААСТЧАХ

М1Фі1 птшлІтТІТтХ тТт.пІШсАтА салЯІтесосе ТІТОгТОостІ; ПСТасІЛєтТо 1151 тТІсСССсЬоАФ САПІХВАСВ СяАЮССССТІ СМспоСоАаС АетастІТ « тії АетЕжстТоштТ астелшттТСя СТСАТШТЯТА АНОСібдАСТЬ СТІНА - с " » 1857. АтАТОСІЬоА СлюиювАсСлші Іі алься встала ше. АЛідо, " 1722 АААпОТАПСЬСЯ АСасАсАсу ТессОЧОРОт св.спиюАє 7, АТТАВТУТ 85 00 БІАтслуши З.п. сто ба вОПАСА СЕТ СА. Са тсьосстая 1007 лади ..СЬсит т.СІСрІШО СОТОбоасша. САФОпЕвКО СО нших і 20х3 стада с СтІОАТО АТІ ТІААМІСАВТ ТІЗАТОдетТ. ЗеЛетої. с - зі сІлобо,шАш спп-Чллтш.іС АдлОлеКостТ ста КАСІ Тводтав ших о І1ЗЕї1 шАБСАПВЛОП шоїУ. ВА: А-САСМИТЕТ теАшШЕТОТТе АС гМіІТАТО

І1ЩІ осадЕТОСІТО ААВсСсІСТь -ШТАШ.АТІТ ШПТАВААТ ваша птІСт бо І351 ТІ. ССПІАТТ сІПОСАІТІ АДоСТСТІСТ СегАЮПаСАЄ СТВ.СТОЛЯЙ (Че) 10: лет АссатАЯ САТІЗААТТА Ш-Тетч АКА Суто ТПІСІСстТАЦ

ІЗ51 слТгАВЕСТтІ СТОПО0Сабу ФРАСТОСЯАШ АСтТІпЯ Тих МІвАНЕТОАТ 01 лтрптаєнтит ЛЕГСАЛеАПА УТ сто САДІТИТІМ САТІОАЕТТА 145: ФАСТОСТІСо борта ССТбІшсеє СаФСАСАТАМ ХОлАСТОТАЄ

ГФ) 1501 стттОстТАСТ ЗСАБАСТСТЯ ста тАшАВ ААСТЕТІТУЮ ВАПОЛАТАЛЬ 2531 БтТтОоШьоьо дтпАсСАвлАТЬ ЗТАКВААКВААО сосСтТтоотТУх ОТП ПАКТеА де іб01 зпиутатопаА ТАССсТоШМ. Іа лойо б

Фаг4в 60 б5 -4В-

реватп: 39753 сиху 310, 1996 сіопе15 1 САТІОСАСТО АСоСсСОсСТООс сОСОСТСТАС ААТАОТОСАТ сессооосте 81 СА. ОЗААТТО БАТТССАСЕс САССААсОССС ССТІТСТТСТо Тостосгосо. 1901 АСОЗІТУТАСВО СОБОЛАЗСАС ССАССОЗСвАо СТОААССАЬСЯ СТТТТОдоАо

М5У бстІЄтТУСОО САостослос СоОСССбоАА ОбоСАтТосСеУс бсосстозос 203 ТтОобАССО.ТА ТИТОССІБАА САСбАбБСОАТ оСтТоСтосто сстстостосс 251 бостОотТОЗАСо ТССОБОАЬСА ССТОАСССАТ ОСААВССТОА СОСТОСТОТА 301 собососСдсто СТОБАССАТС ТОБССКОССС АСАПСКСЗАС АААСІЗАССМ 351 АСАААТТСТОо стОооАСААС АЛАБСТОАСО ТОСАПАТСАА АСАБАЛСТТТ «01 стос тсАСТС СІПЛОСАТТА ТОСОССАТТС ААСАААТОСА ТОссСТОАААСо езі тТттОЗАТТСО ТАТСААСААЛА АОСАСОЗАТАА АСТІСАБСЗАб бАабатодсАЄ ват стсасАтсс5 ТтТосассотосау САБАЯССЗАС АссАсУутось Топбосстоте т 58. ТТАСАБСОСТО АБОСАСТОСС АБАСССЬОАА САСОССТСТТ САОСАССТАЄ 601 ААСІТОСАЛА ОЗЗАТСААСА СССААСТАСе ТТССАССТТА САбсАСсССТ 851 САААТТТОЗА ШОТОСОАССА ОСТОСАСАОО ТІСАСТОСАТ ССАСАСАССА

То СсутотостоМ СРЛТСАТТОС ССАТСКСЗАТ АТАССТАСслЛО УТОЗТААСАТ ті оссстолост оссМоМсто ССТОСАТСХТ ССААОУТОЛА СДАТАСАТТО 801 стоп ОАЛССА АБАЛАТАСОА ССАТОСТАТО АЛСААТТТСТ ТАААСААВАС 851 бААЛААСАЬСА АСТІСААААА АСТЕСССССА сАССспАСТТО бОБССААСТТ 901 тТсАтСАСАСС ТоСЗсоАССА сТоСАСссТо сстосестот тттоссссос с 351 СТОТОЗААТА АТОСАСОСССО СТОССЬОТОСС ЛОАСАТСААС ТОСААЛАСТО о

УШО1 ААСОІТОСАСС ААТОЛАСААО САСТСАСАТА САСААВАЛАС СТААТСАТОС 1051 ТСТСТАССАА СТАССАТСАС БСТААААССС АААСТСААСС ЗААССССТАТ 1101 ТАТАСОТТСС АСОСАЛАТІС ТІТАТСАТТо ТСТТІСТТАС СЛАДСАСАСА Фу зо 1153 ТАСТОАТТСА ТТТСАТІТАА ТААЛСТТТТА тІТТТСббСс тІсстобостТ 1201 сСЗАВТСААСС ТТАТОбАТАС СБІСБАССТС бдосоовосо ССТАСССАСТ со 1251 їттт с

ФИГ. 5А --

ТВАМЗБАТЕ ої: 15сс спесх: 9389 2пот; 2 їо: 1253 епетасей 5Ууптзої5 1 по: 417. у і5сп.ретз о репстй: 417 Аисиз: 23, 1996 14:3У Туре: 85 Сдпеск: 7921 1 ІБХТЕМЕВЗК ІМОРВААХМУ ІВАКЕСТЕКІ ОВОТЕТААБТ ОЖОСКЕАЕЕА 51 1ОРОМЕААВК АІВАВОМЕВУ УРЕНЕВССЯС БССОСЕУВЕН БНО « 101 оЗОШЕНЬАБР ЕНЕКАТМКЕЙ ЧЕМКАЕМОМХ ЕХЕБУТРОВУ АВЕККБМУКО 151 ОПОЕУЕЖКЖОК УІКТНМАОІХ ЕМЕОБАОЕУУ НЕМОЕРОВМР ОРЕБОЗБАРК в) с 201 БиКсСИМЗОМА 55БО0РБМЮ СРРАРЕПОЯМ ЕТОРБОТЕІС НООІРОУСКІ т 25Р БЕСАТІТЕНИЇ ОРБЕТІВОМО ЖІОРБЖЕЕТІ, КЕКЕКОКИКХ ПРРОБУСАНЕ щі » 301 ОНЗ5ЕТБАСЯ БРЗЕО?ВЦЕ ЯТРЬАУОТОТ РЕЦКЦОО"КО ЗНІОККАМКА 351 ІХОПР'ОТКР? КЗІКРІШТЬР РЕЕБІІУТЬА КОТІЗРІТЕМ КУОЕТОШАСЬ 401 ЖЕ ББІБІР5Т5 ВОСЕТЯК -І -й (ог) о 50

Фиг. 5В 3е) (Ф, ко 60 б5

Бей Із - ш и (І у о а в е ето « 5 к Б х во о о Ов би дв бо бк йх «о е я 5) е зн. ; о о - Ок е в о е |в) оо « о Оа ба шн Ом дноба док о Го (а ть о е б Біх РШ із: е ві бе лм б» чно бш б» 5 о з е о о о З У є в є о г р « як е о о Ей З моя за «нн «кн ях 5 Б 85 8 5,8 5. 5,8. 8 х я я е бо Б» За Би Ок 32

З І о о З о ке 0 7 о а Б о о дк о в в о - - о о о на Ол ян бщ Оуа

Е « - в хв о «

З ФЕ о 8 8.8 е о о е «о «і - 9 во «Фа Ге б на «м «У е ІН КУ з е ев о 7 - с 24 т о « о е а в о - о ох Осо зт й -ш сла 70 водоовоо як : в я в ш І) С 0-х 1 о 2 о 3 6 з о й Зк ам БЕ Ов яв бо

Б о -о -е -єе -о но -О -Вв

ОО нНк мк, тато па 5 мо 4 оте па паб оно во сет мово

Б б 5 5 8, 8,5, б, 8, Б

Е гої 5 еЕ вро ов МД ба «ча «п в о Геї о еб о В З о о ве « во б. 5 жа Бе Я ко б х о бш Ов ово Ов ве бш -« Е: О е У «о о о 9 о 5 о о о р о - о « р іш о Є Ок Ом вв Би б шоп нок « гл ІК вв «а о

Гі - ко о ОО (5 т о « « е в г в бо б о» о бо 00 9 «ку водо Б а 5 в) о 5 о 9.09 о З о о - У о Осокові па пш «п «тд 8 5 ВР 5 8,8. 8,35, 5. 8

З о ІІ е що їж кл хх ях м вок е у КУ ГК. во о с - ее о « а Св) я Г-я «о В о СО« б ам «а ба бо в ЕЕ У о» в 9 «кв З

ІБ о в е «о о в о о Я хм оби Хв бо Зм шо е о 5 в 9 з о о « о І БІ І-ч и во о 5 бБщ бю р» Фо ба вт 8 ов я 5 58.85.8035. - ва з о т нЕ ЗЕ З Ля даму оо

ФИГ. бА о - к «9 в о

Ге 2 9 г ге в З в в. 8 бе м оте бо ощшо о бш Ом в м ба Фо и о о «ото « о о 5 З « є о га З о о В 2 б б« б« О0ь дю ОО ОА ящ бо «ма Бо Ох о « о - У о 9 З е ві 1. 8, 5. ж. 8. 5. 8. и В. 8, В, 5 вм на бо «ков м кап 0ш 0 «п ба ба (є) о о о о 08 ва 9 У Гз е ві о г -. 5 З- КЕ а « о об, В да Фа бив 0 ба би Ем ОА Ощ Ом За На 9 з ов в в « - 8 е ря о о є о а о « ре о (со)

Ош 0» Осо ба Се о» Ой Ов Ом Ом Ож єв - к Іо) о Гя о 9 о У о с о

Е я б ря « « бе бо б» Ях Сш бло Ваш о Ош бо Од Б» З (ее. з. 5.5. 8. Б. З. 8, Б. б. би ба В

За ба б Хе ба хх Ом Ов Ов Ош ба бе « ГЯ У в о о" о а чи 5 х 2 -щЗ во, є 2 Е о я В бо Ош «з шь бо а ож ж я Ом вм ош й нн Б о а - І о о 3 о о жк 0, о о о 8 я, В м ба дно обо вм во дв вх 00 бо Ов я» у я няття - -о -О 8 но п: -О по ні -воото ти - тео о що т то о - - и зе чи освжЖоОанеОФОтмеОгВТасцото втоми Ат Фея ин ши и Я ВЕ

Бо ва Яє Че оба Ка ба бо бо ба б» бо о 9 «4 у з в в у х - ЕЕ х ях 5 ;

Б» Ям бе Ха бо Ов ба бо Яю Во. Бо и а - т я о и СЯ І о І в о о о к- сх ке 13 - о ко 2 вн я ре В сет -ом я-ста ОО Ше ра м ш оох в. 8.3, 5. Б. 8 8а З. Б. 8. Я 8 з

За Же би бо» Ба Ян б» бш б» ба ям Ок о з - нов в у о в в чо а Зи 8 оо - во о о ди ок «додаю Ов ов»м во а бо в во и бш 00 з У З. т В ов о

Яи 9 о, ее 3 (У о « «8 "» ж -- ще йо Фо Оу Ок пра шо «п 24 о о У «3 о о о ве «4 о и З 8.5... в З бо Зм Як ба бо Ош Ба Би. ба Б» Вя Би (У в о чу в вро о ее в 8 « о о т о во. «к о о ш Ощ ГБж ро оо па пе Ом - ви зво ка « о вв о чо ово 5. 3. В.В. Б. З. Ва Ж. Во 8. 5. 8 нн о йм ба ба ба ба Ом бОш оо « Ош о» ет води -І воно но нано нку св ов тр овн оу вази хо ана оо юс ман но рю с ох ва сь су КІ ро ня Об 3 и и в нап виг, ЄВ ху в: в в бу б я БЕ. Б. б 8.5 о « Го; РІ ОБ Зш Ол Ол Ов яд бу

Е п во з з е с 5 о Яй ї е еЕ к о

В р Б Ва Зе Ях Зо ба бо би Зо

Оу Ух «ЕЕ з 4 о з в К о 5

В. 8 я 5 За б» Зм б» ба За Зв

Он яв бо ій ій з з З 5 з В

Е 5 В в'я Я« ба ба їх во За вх

Оу бок «о з з о и в - ь

НІ « о к 9 о 5 я Ч9Я « б» ой бд« За о» «кв о» роб пе о 6 мно вБово о в 9. 2 б. 9. . я ЕЕ. 5 - О« бо Ос ба За Во ба р ш хх с -т їй о о е М о

Е В в е о а о ї « о е

За б Є пе бо ба оо м о Ойшж ба о 7 я в е в о 5 роз

З 5 в

Ба б Зш ЕЕ, б» Ба ба б» бо Кн ях в 5 8 5 в. 8,5. 5, 8, В їх г -, к, Кк « ба бо йм ба Баш пніувж

За бл б ве доплати я й ї а В поту св то то по пвопк се й йо об се КО юя дя ЩЕ пдв о зОовадочимавоводновява яЕннОохАсвя Ко ; й ій с о о 9 5 9 х 2 т д з во. о

Е: а ї о о» бйш 0оа 0Ош во бо ви пн: в вв ноо в В г 07 а 2 - о З

Ов Би Бо р ба бек а ба Же Хе т « с о в о о з в о ЕЕ В 5 в. в. 00, в. З во ко но б« 04 ж «и йно йш де ОА От я й ба є ; м роз о 9 о їз - із о (4 е о

Ов ба би я Ов ба бо Як ба Шо бо ; о ї 9 В Р шо В В ях 5. Б. Ви ба би Пе

Ом 0» бо вп ол оот о пиши пиши и ИН ИН ТИ) о «і « Бе о о а о ЕЯ 5 хХн Бе Ов бо о ях бБь

ОО ов «о о « а

В. 8. 80 5 Б. Б. Бо Я бо бо Є, йо Ям бо а чно 9 й ій о - о « о о ШЕ ЩІ е. я вок,

І е с - КІ б кщ Б. ба в бо Яд пи Ою бо 5 5 5 ци, о 9 5 12 В до б є. « З о, о а о ди бо ов ав ях Ок, о охо» о ня подо 7 мно ек - с

Удав ЗБ холоне Ви об яаочношиба вовче ' сиг. 5 '

І Й бо» 5. 8. Б. 8. 5. 5. З. Б. б. В. В, 8 в о бе Як бо да блобак бю Ба ба вия да яв Як бе

З ІвІ о вок в в в в 9 я в ї о б. 8 ши ще с -

Во Бо Оз Зх м Ов От ба м а «па ба ех Як 2 8 8 5 ЕЕ 8 8 5 8 9 9 5 ьо ш З о о з Ж іс о в

Оє ба Ок 06 Зак Ош ОО. бе Ох ЖХи бо Оп и б» 5. 8. х. Б, 8. 8. 8. В. Я. 8. 8. 8 В Б ФО бе бе Ош бо За Оє бш Би би и йн йо бю бо о « р - І -« Г к в о о г е в З. БК. б з, 9, 8

Пе ба Ян бо Зо Зо Ов Як 0» ба Я» Чо За За с

ЗУ в 8 в 5 й ЕВ я в в я я 5 : м п т и : ИН АН НЯ 5 бо Ха ба б» Зп Ом ба Во пи в ов в ож Баш - о 2. «о щ о О І 9 я Со -н к Іі ! я Я У о е о а е о о ІВ, -к я о бш би бо ба бк« Са би Хи ба йо Йе ба б с є ш вв я 5 вв в в вв в 8. 8. 2. 50 ба 8. Б. Ви В. Я. З. 8. За 8, з вв

Рош пи ин З и І І ПИ є ь бе б» жа бе Ов Ом Ов бю Мих Кн ба ем ок Ов йо кь опо йя й По Ко йо ко й пе ко по йо й - пе

ЯбавОнлоая «ек анода ей ик кни ано ок - чОжеотеасмвоче ше ося «ву в в в 9 є Б в 8 8 в ч У ом и и ДИ З й

Бо Ба бо Оє Як ба ба Хо Мя ба бо Ок Хи ба чу нов вові уяв шов но шооо в в в а х я 0 « ДЕ ще бо Ов. Ош жт Ов бю Ям Ба Ов бо бю йщ й ве в а о ч в 2 в 3 2 кВ З в « 5 Го 9 2 Г- що

За бю бо б» бОш Як Ов ян Бк бо о Ям кх бе в со оо роб З в ев я в во В

Е п. В 5. В бо ки де Зм Ям Ов б« Ба ба 02 бю би бю Ок

Е Е о о о 54 г о - Іс с о о рі В Б 8 г вояк, В, ок . 3

ЖиЕ Ва Ма бе ЕМ бо Яке Ов бш би бю Я би бо

Іо. о «о Бе 24 - і-й ко З о ІІ - Ге це р Е Е о о І р ее - "к с Оп Ха бо бо бе бля би ба Ша бо Ом бе бь бе в о о з ТВ, о « в « е Го Ф - к. 5 : 5. к. 9,5 ка о й Ба 3. З. бо Во 8. З. В. Ж. бе Б. За В. 5. і: в в 5 5 В 8 й В В В ВЕ В я в ня Ях ба Зе бе Як бо Же ях Ба ба Па Бе Ни ба че роя вв

Е в е ІЙ о 5 х Я в е у Гн о а як бо обоє Ва бх Же бн йх ба Б» бе 0 т б»

Ше по бьоше цьо в цошо ху бо ово ян олжо б ошяк зн ошоОо зо За вол ХУ бр зе - о ет то ти Ок авовбахВанУ«лНалвокоихОакВайЯ ей оон еко ж -І Фиг80

Е з ш т р. , бв же бе це : й 5 Б Ба в я т ж з « З І Ге ч ж їн пе ба бе б Е - в е у г ї . ою ЕН 5. р шк у п» Ез па ве Е В 5 З у Е В - е . - Г2І в жи Е, -ї В І а ря й Е я 5. Кк. є, 8 я ій

Ше єн си Ще Е в г 5 т че

І2) й се та що - ш (3) а їх бак о йе оз Я Е 5 З ї ш 5 й т Е

Я. Як ї- Її. й Е а Е є - ж а я о я їх з. На й- В шов « з ов тк йош Пе Я в ни нн ни и В ШЕ сянобн й» ,хи В Я ЕЕ 8 В 8 8 тч шосе де в по а а а мине йшов й пк дв де пе же а

Е е ГУ - ля яв йо яв ня й г є ш

З Со апоте В р В в Е н Е - Ям й Є г оч ВЕ 19 - - ч ш- НВ із - я 5 к ГЯ ба ши ЕЕ ш е ш Ге тя З и жи -ти -лл я вв он ЕЕ Я я ЕЕ це о ш- бан бе 8 п "ве Е вх ЕЕ Б В БВ В ке

І пе бло За 4 В Е ї х 5 ов 5 к З

Б, Же БА Ма г ї - ЕН Е е в -ь з и Ва Г2) ж Е Оп ГІ -и пе ля й - Е ря ї Е т

Зо Б. БУ Б. бе в в є т в

Р я Б А 5 Я я - ша ї- « їх джен оба ба Я в 8 Б Ак пЕОЕПІЕЕ.ВЕ, м пе щу б во до з я алі з г жов и те хй пе 85 МУ т т- - пе -ш кла ят с

Фиго БЕ

Ф ш- І ч- я - - т є 5 5 58:15 о п - я - п ве Са я У в 9 є ЕЕ 8 8 з 5 ЕЕ Б В 5 З "т У Е Ки т - м - ї

ЕТО Я Б Я ь в я 5

Е |: Е т Е в - м ш

КЕ Б й 5 4 Я 5 ЕВ В о - І М ш - І-Я г (є) зо Я 8 Б Б Б 8 Б 5 5 В

Б ЖЕ Я Б ЕЕ 5 5 Б 8 8 со - - що т ш - - - ші е « са ' 3 5 5 5 ЕЕ 88 ЕЕ ЕЕ со ш- и « «а - - се т 8 5 5 8 Я ЕЕ 5

В и Бі ї: е а н0 ж Ге - і нак я ЕН АНЯ Га ше лм я

Зв ЕВ ВЕБ ЕХ Е5 ПЕ я ЕР СЕ БНО 85 95 ї- в опо од о во Б чо ой вок

Б б оз я ЕЕ Б я В В У В

Г- х я - ї ш Ех НЯ

З 5 8 28 ЕЕ 585 з: Я ВЕ « 2 о а НІ Е НІ п ся с їх и: НИ По п З ЕН з 8 5 5168: не т - Е І її вк 5 5 ци е с в 5 5 я Б В ВЕ че я в кн ово оовои ч» БЕ 8 5 5 У ЕЕ БЕ Ж Б п - м н ІН й Ні - - а ж я й ЕЕ ВЕ я 5 8 8 сини ни ни ши и и з м ЕП НУ

ВДВ шк ве де ЦО ЦЕ б ж зр дя Бу в ве ше би фе щі пу Шу

І ТБ дрон у БЕ БР ЕК Кл ле 23 ЕВ

Фиг ве шк ге» ШИ 60 о « к І-ий о 9 в жк г 5 о о « шок з о « о я о « « - 9 о е

З - і БІ -« о - о 5 З В « е ч в ев о « РІ

Б Б а 85 8 о о а і 5 в Б 8 5 8 В 5

Фо « о е о я о (У ГУ З -

Є о « о В 5 - о о - - як - о о о 9 « 9 З ря Г- « З к о е о е я о в 13 ОО и о що. « 9 х В о е о 5 в 5 о е о о о е в. о о т Гя (У ШК с « е о а 6 З п « « і-й о « и пап « «о о о о У Б

ГЙ о е 2 В о р о С о о о Гі В - - -я Я - -квО то лак Ов -е чи пе пе па 28 55 2 та ож ото тот ото 5 5 Б 8 8 55

І б о е в 5 о е

Е е З в 5 Б ЕЕ я В 5 5 В « е о о е е ЕЕ - к о е о (5 Із

Го о о о о « Іг Р - с І-І -О о о о ОО

У ЕЕ В 8 5 Б Б я о І2 вок « « о е « « «о З о чок б в о а к - Го о е о пк о о «в о о 9 9 х Б 8 8 г Іа 8 о о вен о В з в 8 5 858 ЕВ В з ях 9 5 6 в а ж о о з є З е о е о « 8 5 4 9 о е о Гм Іс. о Г-я : я о в ІУч Кк

З е 9 о ІЗ) о е З з О о «4 і - « е - - я ялоа я то За ва ау з 5 29 22 яшочОо чол о їІ5 5 2 по от ож то жу то

Фиг. бо о 8 ш озв:івзооо поввовроев апарата аю ах рати бажав адфштаї вазах пи и и и ВЕ ИН раю кала банди. ван ть». а то. апа яд рана ПИ п о ИН м юю іні с а бла» ана ва вати: ПИ А С я НН «-- пи п си аа діа -- барви пи ни нн и НЯ ба пр п п я у п вда ваша - варіант. пи ни п и о Я аа аа я я ваша ад аю пиРЧНИ ЧИ НН НН ВН ' вада аа ток « аа пи и НН на ван капа адліа др тв ТІ о

ПРИ ПРЕ НИ капа с раною пики не и и и бала ва пики ни и и У Я и аж кад ;» капати ва жьвна ин нн п п о м п ни ши и и и кава раю вда пн що. ваті ---4-4--4-4-- -----е-. -І " -їь се ово) г ре сор - Ш9 сект --й (ее) Ме ялоїй це окз пай с Я шроту ЧЕ яр

Фиг. тд оПвПовоПоПоовотоОоО ввовоПовОоюФшоОоо рат ті рр чі се пише ши ни пи о и я ВИН пиши ше ше ши Но Но с РИ М ши ши ни п п а ГИ Шк и НИ НИ Ж вх МИ НИ п ни ши и М и пиши ше м и МИ а: НО с ран я щі І шк ШИ Я М с я М яні п ни и п п о В вва зва вті ді ра чі пише н п и п мн ЗИ г нище м Но М В о М п ши ше Ми М Ки» Я ВЧ п ни и и п о пише ни ше НЕ З НН Шо 70 п пише и и НИ т я ЧИ НН пише ни ни В Я А о ЗЕ Ша Я пк шк и и п и М У п ши ши мн и шк о ШК вра шт ві п ши ше пн п я НЕ рр ап дії г ши ши Ми М М я НИ Ж ва врата ва кі п шк ше и и М НИ м п ше ни и п о я ВИН пише шк ши НИ з ША п ши ни и и и - МИТИ п ше ни ши и Я є ШУ ше ж ши и В с: НИ М п я и п п и ль ши ШК оо Я пи ни ни о о ралі асо пиши ши ни и п и х ИН пише шк ни и В чн НО ОВ пиши шк ни и п п у ЯК пише шк ни ШИ М в НИ ШЕ як прраа очі пи ше ж ни и У НИ Я раба щі р аа пт пише ни и пи В и МИ НН раса вні пише и Ши НИ М о: ВИ НТ пи жи ше НИ НИ НИ На ра і вана г шк ни и и и ях НИ ИН п ние ши В о НН І см пише ши ни по о и с г ше ши и о М г п по п по я ши М шк шк ши Ми о ся МИ о г шк и и о я В г ши м им Ж с; и НЄ рова що іл І шк ни и М хх МК пиши и ни М НК о ВИТ г шк ни и М п ши ни пи п я» МИ Гпише шк ни и и В сх НИ Ге) рад ла г шк ни Не и и сх НИ п ши пи и п в МНН пиши шк ик и п и У В со г) -а-Я ення НА - Ян А - чо ч- о спот мМ юс ня спот сю с А 5 о й шию о я о оз в Ж М) Ше)

Фиг. 7В « - ч ит - -й (ог) 20 (ог) іе) 25 ко 60 бо тп г зЗеозозиУзй овтовосоге капа шо В. юю вна - ба дов рвав баса вище д; вав вищ м п п п п о ни нн п п о п ши пи п о п о з у бана

І п п п п сь НУ пи ни п и п п я апала в тиаш спа папашед аа ад васала лань вала ам п п п о о ве ЛИН 70 ан апа ат а єю а« п п п п пе в аа щнь- ба пи вав аа вана Нам вка ддрежм ката а дк щу аа нія вас стка пи п п и ноя баба що ф пи нн п нн о о

Кал бо ЕЕ м пи п ло о он по

Кано в п п з з о о

Ка оо пи и п о о п п п о о о В ня каалал шов

ПИ ПЕ ПО сь НИ аа а щш мн па по по пов п жо дк п п ль М аа а (а

Кано т аа а с» аа ую аа а дра п п п п сь НЯ аа жвава пи п по ев баба" ттшкнд апа т панни мам бала ль м ап ю ва ма панна х аа ць З ли п по о о пи и и и ТОН і) ни п о о п п п п а в в п є ваз ант пото яні - й о с плотви

З в (о) г) г) пт

Фа ой я ой бо лю юю ч-

З5 М

ФИГ. 7

З ч и?» - -й (ог) 20 (ог) і3е) 25 іме) 60 бо

- 1 « Гео осоосвооотос овавоовошватш різав а сечвка рора ами баса я, пише ше и пи и В: НИ м п ни и и п НИ о п шк ни и М их МИ Ж п ше ши ни о хо ШЕ г ши и и НИ с: НН Ну п ши ши ни о НН Но пише ши ши ни НИ НО мя ШИ Я

ПИ ШИ М НИ ИН КУ М Ши пише шк ни Ша МИ В сх М Я пише ни шик м МИ МИ ВК Мч) пише шк ни о ся В Є Й раза са а г ши шк Ме НИ М є Я пиши пиши ши и М ть ШК НК) пиши ше ж ни о о о НЕ ка проба ноя о пиши шк ши М М М НИ с паші и М І я и пи шк ши и НИ с» МИ хм п нин ни нн и о НИ о Я раса нин пи ж ши ПИ З п а Пиши Шк НИ М НИ и со НИ а пише шк и и п и с НИ 0) поши ши и М НИ в з НИ Я роараск ою юто, васала сів ж п ши нин п о Я пиши ник о п НИ сх ШИ врата м А пиши шк ни ни и т г нн п о о ж НИ я я пиши шпон п п с Ше пише ши ши и о и раю яд раза бр г ши шк и НИ НИ Кс раї мі т шк ши Ми НИ НИ мн НО я ром д п ши ни а М НИ ШИ ся галас яна пиши ше и Но М ж є» Шк рат ща пи ше нище ни НИ В І с п ни Ши НИ НИ о З а пише шк и и чи М У ШИ НЯ г) п ни п І А т о ВИ я) п ши ши и НИ М с ШЕ а Я ши ни о п о п в РИ ж г ши ши з НИ п сх НО НК КО

І ни В М я КИ ШЕ шк ши ши ши В и ху ше п ни ни и нн и п ше ши Я НИ су НИ Те (є) пи ни ни и о я МИ ть Я п ше ни ни НИ сх НИ НИ я г пиши и п З М ся НК ПИ ши М М М НИ в У НИ як со пишно М и я гра й тп ее) рака вит п ши ни ни НИ с У НН к Я пиши шк и пи ПИ МА Я ши ши шк о С Я чи че - --41- 8-4 - тн пе кл а НИ же Не В У НИ Мо

Гв)у вп са с - ГІ т сф ен см 0 А 16 с оФо с м ю Ф А- «

ФОФ ол о ФО й ФО Ф Фо й ФО ФІ ло ФМ - с Фиг. 70 . ит - -й (ее) (ее) іе) ко 60 б5

- - пн нн п п о о НВ ВІ гаю а Що щу аа є іа д нн и п о ть аа з (пФ а ою пи п Хо я МИ ЛИН пи п п п с оо аа «до бара, ра аз ка м аю ноквтп п и п Хе а Шся пн п п п па и аа вн су п ш-иад в а 5 пав, м, т 170 вола (а ка, пи нн п он ИН аа м аа кою аа вна ді а» пн п п о м ВИ НТ а нь о кора пи 2» юнак банки в 75 ІБ аю в в а у . ї- а да мн п о т асо І бать п п и и '

КЕ я 11111028 ва ка ШІ з цу пад ва нзвкоб ра , нин п ль а нн аа в: т аа тд а - пиши и м о Я ВО

КА» а иа аю о а о нн нн п п о я нин п о п о о НИ я є аіда м Ге м п по о по ав ги ШО Що ги стіш що нах пи п о по и о ба є нин но п о и ИН тю х п оз хх п ни п п М Б що - ою пплплв'В зо ЕВ: (2,0) (2,0) ель - ово ха о а а о ба иешю й

З5 й

ФИГ. 7 ч 40 7 с

Г. и?» 45 - -їь (о) (о) і3е) іме) 60 бо

ГІ - чо о оовоовопло оюовпмп ососососвоовототТа г и ни М М М со НИ Ше Гм ши я прокаті с пиши чн ни и НЕ о» МИ пише ши шк ик и Мп Я ши ниши Ми НИ МК си НЯ ши шиш ни з Ми М є з МИ ШО ши шк ни п о с и ШИЯ вал ж пиши ши я и НИ З НЕ нн враз па ор т щов пише шк ши М ТИ чн В Я

ГИ ро ща п ни и и и М из НИ НАУ кора ті Ен НИ НИ ПИ я рат ма г ше ши М М о о НИ я ге ши ни Ми Но В ТИ чи | раба Об раса я лнна п ше ни о с РИ Я п ни ни о п и» М Ша: п ши ни и о и В м

Пише ни м М НИ М а Р ШИ пише ши ни ни ПО я п Ше рр ам вн раса ваміитщ ши ши ши нн п и з ШИ си пише ше ши ни и и о НИ ШИ з рі п шк б щ п ши и п п ат ШИ пише ши ни и и о я м | г ши ше М и М ни М п ши ни и и НН ШЕ п ше ни и Я сх НИ ШО пише шк ни п НО Пк РИ М я пиши ше ни НО ПО з ва НИ ШИ Як врасва вла жід ши ше ши и о и ж п ши нш нн п ко НИ Я 1 вра ій вою ай п зи шк и ни и Я

Кока а нн ротор авт та ра тома м п ни ше ни М о НИ Ге! г ши но п о и я НИ Я ши ниши и Но в РИ Я ши ши жи и НО чн» НИ М Я г и и Я В чн НО СТ о пиши ши и и о о а) б ка тім пише шк ни о и ху М п ше и о о Я пише шк ши о о и о ги шк ни нн п я НИ Мч п ши ни о п с Ь Й г ше ши ши и Вч: В Я Ме пише ши ни Ши НО хх НИ Я пише шк ни о ПО У» НИ а Й (оо) п ши ншш ш но и М г шк ни м М м ПИ С п ни и по п и НИ г ши ни п З М со НО (ге) і ' ' ' 1 ла дщ ві І 1 ' "іл ктТт ч- 3 ло ШИ жк МК ли мо ЩА жк МК жо М пи На НЕ Се ШК ли Щ лк ЛК ло ШК жк М ло В он и Нв о в. щі. с чо Гр а с Це! с "ся з см о 0 А 6 еле: шко о Дис В а ИН

Фо ФФУ дю й ково ши ово шко шко шко « 70 Фиг. 7Е 8 . ит - -й (ог) 20 (ог) іе) 25 ко 60 бо к т с ч-- звзозотвочїов звовозотою

І п о І Пи ав нин п п т Я аа аа ща га іди, коала з ура п ідасх ваз ааажаш ва вада ал но(ооїх«О аю да ва нмад вана мм ва др т пиши пн и к- з- валах «дра бий

ПИШИ ба па аю кала 70 аа ноя аа ліві пи п п о я бай аш, й ваші каф -- ва адьд бю кода ж орав аалтьскоя аа літня М вав аа Кат ш бала амет аа амньм

Кок ду т аа ща вт ни п п п» - НИ ШИН ню пааннає вана ва ака т щ вана атиад ши и п а В я то аа дя щу. іт ш сальдо ва асєшиав аа ав пи п п о п п ві ба ши п ОК вата ашщет 0118 тм ана баоХої

ТІВ вах м аа му

Кок п ОО ос витків й пи вам ба м

НИ ка ща ба аа ащ» о пл п о о Р с пана мо (в попа пи пана и п

Геї с З В Ге) со с т- ваш ОО ут їй п ч-

З5 й

ФИГ. 7с й -

Г. и?» - -їь (о) 20 (о) і3е) 25 іме) 60 бо п А цен, - ооовоовоо ото - обвовоосчоОо

Еш ши шк о о с п Не жо г ши ши пи о Но го и ШЕ ро ар анна Гл шк ши Ми и Мн В КУ Я пиши ши я ни НО Мо НИ с как ж т літі 2 ря ті ді га ши ши их НО он З ШИЯ пиши ши ша и М ан НО рок ща в пише м ни ПИ НН з ШИ Я п ни и и М жо ЗИ ра ва щі г шк ни НИ НИ А ях НО пиши ши и М НО НИ Ше І ши и М Я М НИ с 706 га и и М М С Шен г шк ШИ НИ ПО М мо НИ Я ва рр а вав пише ши Ше НИ НИ т я Р ШИЯ п ни и п НИ Я п ше ши ни я МИ пов'я кт А г ж ши и Но о М З пи не и и Но НГ Я п ше ше ни и о ОВ ря ти щ раса вддрів 15 и ни пи п п о и ши и но о Не РИ а пиши пиши и и М и а РИ ЛИС г ши ши я п я М ЯК ши ни м и М с у На М І ши и З ШИ М МИ М ши ним ни по п ох НИ ЯК Я І ши Ши НИ НИ М з МИ ДН ката я А пиши шк ж и о 20 ши ж шк Но НИ о Р Ша Я г шк ни п п и я Р ги ши и и НИ М ся МИ о п ши ни п ПИ с НИ я пиши ни п о п а Р ШТ Ь Й п ше и з и М: НИ чн пиши ни ни п п и м п ше ни и и НИ я, НИ а я роза а вщі гаях щі с 25 п ж ик и НИ о: ЗИ п ши и и Я НИ У МИ ги ши пи ни А сь и пиши шк и п п є» НИ в Й о пише ни и Но п п: п раннім гм и ши и о А я НИ г ши ни и Но СИ Я р 11451 І ни и п Но а и пиши шк ни ни о о-ви М ше ни ше и М с МИ Я (2) 30 п ни и о о РИ ПИ НИ НИ НН ль МГ со ги нщ ши пи мн ПО НН п я ши Ши НИ ся НИ Я пише ше ни ни о и ях МЕ Гн шк ши пи НЕ и я НИ НИ як (ее) пише ниш и п З п и ги ши ни М и М ся ВИ ч- 35 ер А нен м есе ноя ею тю - чо ш п -е- м с - га сах г см ча о -4 ож оФфтн сю о опо й п Я 4 мо Фо й Фо ю Ф п «

Фиг. 7ТН а . ит - -й (ог) (ог) іе) ко 60 б5 в о З: Фев Кк зо вВо т вості т воала,н- о о. - г» «(ОТ воара ніна пи ши ни шк ж «МИ ШО баса щи неМм баб бщо у

ПИ п НИ т ов рам баба з шаошаи, ака і-Ц ЩО ОЇ аа -дМ а. пн нн и п о м Я гаю а ма вокал Ше бла Ммн( (т шх аа а «Фа і ваша - вала АТО пи ни п о МЕ МЕ

ПИ п НН ПИ п св І С п п п т о о и ВИ. вапнапнев М Кава а - аю они БК -(ва пн нн и п п о о а с ап дья аа ЕОМ 0 щ вапном т аю є ад вала Шу ван дала боб ЖЕ сао щ кора - вас а шш у аа а ЕЕ каз з «сла за ка що ва тата ал авав ворала ав з цу ' в - пн п и п я НИ як клапана Шо ТВ ПИ НН НИ НИ с о» Я ОЬьЯ ва ціа ов а та дв апа що В база да»ц, ва та і-ї капа та на аа Мо аа рн а капааа ти ж вапбошмаА ах

Ка ідо Ж каб щшщеазо вар .д вала ко се вна Мам п ши и и п п вана афбат вва, вмамаМм Ге) п п п п НН а ні вва з(дднноья бара аа жах ши ши ши шо ИН ен НН яна ан шо т пів її (22) с г) с сто см ос с3 - с)ст з - см а с - спра пою б м й шоп дл юю о чи че

ФИГ. 7І 20 - . ит - -й (ог) (ог) іе) ко 60 б5 то с Ф вПоводосьОо'юг овеаоОошютпчо т г жи ни М Ко и мо) ГІ ГИ Шк М НС ке ЖИ» В МТУ п пспдаава, хх п ши ни ни о НН Ша М п ни ни и и ко ШИ п шк НИ НИ НИ к з Ше ТИ Ша 1) р відно аранж

ПИ Ше МИ в ШИ НИ Шо ПИ я Ши МЕ а а РИ Я ра ана і У п ни ни Ж с ШК у п ни ши о Ше Но НИ Шк ГЕш МИ НН ШИ «ЯК я ШК в ШИ НО Я п ни пи м ИН Я п ни и и» ьо МИ Я рака а м ни ши еко г: ШИ пора тА ПИ НИ НИ З я ЩО Р ЧО рова яд ПИ ши МИ М а Щ вя МВВ ЗЯИ Шо пиши ни и ик НО В ПК я пра оїКо, щ пише ние ши и п о МО СЯ ПИ ши М М ШК я ль МИ Ж оо раса єнііоїї з га шк ши и НИ чн ра днат м вар нім

Гоше ши и о В Ге не ни о НН У НИ Шо о вада п ши ни и ни я, НИ ра їз Ан п ше ши и и и пп апттна ка г ши ни и А Кк о М в'я раї, Ада дм кап пвннтТтна рам г ше ни и и и я НИ

ГИш ПИ Я Мч М а я ША ги шк ие ни Но Я м

ПИ ПИ Па очи ШИ РЕ п ши шк ши п м ШИ Я зп щтвно м аа літі пише ши ПИ а» Шо ШЕ З ралі рі; ння о г ни ни п п с, ШИ са Ге робо до щі мії Й пиши ни и НН НИ Я о пиши ни о ие» НН сп кам іа гати в ашшщнінН раса ніїнан п ни и М о а: Ше РИ Я раса 1тоОо кА рвана (о)

ПИш М ж Ми Чи ВГ ва. (мА т ра ія А г ше и М ше ЩО З НН ее п нин шк о и НИ Я ра вкл тоді г) --,н - А ге ж АК - ее ню чи: с-г го с- ше г

Шл й чо щі о то ото сю о А са «ної г см м сг А кол ши Ов о що Я ОЇ шо Фо 4 ФУ Ф Ф

Фиг. 70 « - . ит - -й (ог) (ог) іе) ко 60 б5

- - см ща ст - ооо ововМиМв пиши ни и НО Ще до. ЗИ ШИН ЕН ШЕ НИ р о Шк о Яр 1 1 ' кон-дяДддро- в ' " мтІвмнигг б са воза х пи шк їх -8.5-сл 1 во ДІ фі и нн и п и СК ВШЕ воза міц. БО он- ' вад ше т пиши ши о «шоп ваша т пи ни п а ми а ЩЕ

Кант ії І ас ьноддвннтза 76 пн и п п о о НИ Льв ПИ ПИ о о за о ЯК ой вала Ша вка см оь-яя ваз дни м п п п ИН в» ть ба ті 6 БВ ва ін-хВ., вала ІДД" ПИ І со еп о Я ' к а перше шк а) за ' " вооьх вага Ж у апа «чіда» вола ні а т аа хто ' ' І ' бі ш вата зов в) вала а нмаш вас зсвоОааН« воді вроаа о (ть ' ' П ' ї-1Ж8 (0 . ' е с штшшат ваз сю(ддж»о ваз ав ох

І ' ' ко (лЛІЛ п ші ' ' ' боті 008 - вана тм Ж в «ад» бака міра м пап нптмрврах воя аа ша ш вас нНМ- а п и п» ШЕ во абадь«4 ваз ток и и и и а Ши» Ко» НИ! б Ед 0 жОд о х сч асо вашши ва (сова о вада т вала ті а ші пок яї я ьо «і рога я- Па баса тираш Кк ян ян М ката а ха - ва ІН ду а» (є) зо тлпБЕЗТЗ ттптпткяВте со (2,0) ч- зош с СМ с т цу те - з» Ваша 5 ща

ФиИг. Кк « - с ч и?» - -й (о) 20 (о) і3е) 25 іме) 60 бо

«во ся чо есе Ге)!

Золотій ооотпточиоюєсю ран ню ГІ М а НИ НЕ жк М я: ШИ по пот га ванянФОМ 11 0 1 б ва в Й пише ни и и: М МИ А М Я ваті вШИнве

ПИ НЕ НИ ач Нв о спінювання рат нт п фквнщсщн пщ ши пи А: Мо Ж башт онощо я п ни и и о В є па тни кока тям А І ко Да пиши ни и ку ШИ ет во жо в я ва с вч рова ля «що сл щ є ва ся й сі пад осчида 1 ЖжЖітірщшм ра п штат ірІкпрШШН пп наАщЩна і ек п ЕІ ва бовтеиУ є а пд діЕгчтТть

ПИ ши и Мо Шик 7 є» Шо раса канКЕГНАа рас патнТИТНННИА поря їду дув

ПИШИ НИ М ШИ кт а М Я я я пиши и и ЗИ со ШИН рат ді т п не ни НИ М з РН ся совок, дм, пиши шк ж ни М Не МРС аа сни пише ши и о НО и о Я ра їз я ще пров А А раса тек, п ши ни и и о є ван шк ши ни НИ А м» НИ но м рання що ква, шщЕшфВВВОО с пише ши Ши ПИ ня М ШИ Я Шо покої цк ва т А Ге) и ни п п м І КО КО вата и ни ни и Ше: ОО вл пнИ Та ді вол вм кап сонне п ши ни з со а ТЕ: НИ ва ск анавни (о) вра вважа прп» со враз ще права бок ав8 А «а покої дощ А у» (5 (ее) п ни и о ин Я п ше и и са оо КУ вапдовтав»о іпапдзвавпаня -- в. - ен А Ср юю М т яяяаАачжтоОою ошттнНоа с ев -- сг ч - А - чо оо с юю я ст с ср ою й «

Фото Ф п п Фо Дю п то - с Фиг. 71, . и? - шо (ее) (ее) 3е) іме) 60 б5

"фі сон Га Ше В Шо йно ці

З веж от 8 шк шрот т

Фото оясн Фо гзч о см нн сш ФВ т ба мл дж бета Вт яті» в" «ад прРхЕам щока вн сш "вп п: «М Меса я Ж с ба - бо бош- наштек ба м оз взоішо баб п-ва бохо щі вч, шш- 1 вот - І ОТ сш зи лдщшац((в ба Вк б" вт ашмотлм балон с," б'шОТтов.-1ї сапабб'Ввшашаи свошееч«шекик вомо Осо шава емо же жо» ам а «авіа божа шт тІШшШ 53 (б мо - бно п. б сл шо Ав сбсб'шШштшолш ваш ма зі -ши вад шов башто(вд-8о» ба - ШМмІлТпХх б - шов вам 'а ам а «а бато мжт(т беш шо шо» союв'шоОомух вамошфшоа» бот кноОм-нУ ва а тс с - и Фо дпа ш бом о адш о фі анавна вс ка«аА-та хх ваш ап з «гу б с) шенцда бо п -А «1. саше мг 1 - бом з Анмт б збш об па-595 б -тшасх "з" бб'вддшкем сво ссвва с" бШ'зв-нНнОоОТм спиш Февши, сч спаси пОбнНнОо пс псМ'пшОонНАа ге) ода, М КА й М І асо злзвявнНнІа сад шОбашо ба м жі с вп'мвммщшх бо що в'п«ооо

ТТЕСЕВБАВ 75 ВЕС їй со (со, іч - з5отоавне ЗВУ - че

ФиИгГ. 7М 20 - с . и? - -й (о, (о, іт, о 60 б5 с ро щі яччлнто во;со о ночі оочочпОоОоовоОо росу со ГУ піт єчсеаФСсТ врата том пише ие НИ о о ро до що и ни НИ з» щі зи прп ссінЕфання с щі тс і бло т ні м с на атінд роя (я кі п ши и и Я вас щен д іл пп" шОВвАД пвищ;фінИйнІА вові Фі що ст віп х пвіщшинияше пк они шиє: ШЕ ШИ Ше пи ВК Що и а с 5 Ж с «що п тики ока ва ва й ОХ вн етвнсе еф ва м'я прощ в щ АН ре ПИШИ с Я ЩЕ в Зо Я ато що у щ га Оз нова ра ща страт биті вижиИ прощ С, м кад» дн пиши шк с» Шк НИ НИ НИ со г я Я паж сд'ссх ех раба їз лінією вра жи ща вав ад ,дФпад п и МИ НИ и На с в вшпта її сЙпйжи роб п, пі ті кв віщі, , миша п і ее ШЕ НИ А са М г ПИ ще - ШІ ШИ ШИ Є Ше я щої нощ вріак«ачаа то п шк о Зк НИ НИ а М На ПИШИ шен М ШИ ШИ А ях ШК Га

І ня ШИ ШИ НИ ШЕ ко и» ШИ пишався щі 6) раз ти 1 ФтТД Кр 1 її і щопь щ СХ

ПИ Як сх НИ НИ МИ щи ЩЕ С воа її 1 6 од, НО а її тіт зо її щощ о А «б ща кн а п В В В ВИ ВМ роя ей ої 1 СЯ в, Я ранок талан (є) вра сіє пт в ге шк о Б Ше ше но о чн со прое ін ки ОО ПИ ШИ ль ШЕ НИ НИ НИ ПИ квтнтої 1 ід, д, д, пише ши: НИ А ОН А А Я (ее) рана дрмгм щі п ше 2» Ши и М В я М ч яяовче вт яатаянога - ів) осо свт - срох ню срср о т - сосе 0 А г сто ох с юс А чт нє юю ел ов ш шкх т ШК с си В а ВК І УНК ря Фо фл Я МФ «

Фиг. 7М З . и? - -й (ее) (ее) 3е) ко 60 б5 т- ст рай чт сх зелен сетпомМмопсв башт чс»ОцгкоОо ба шо «-вВах з а"шташоах воша вшроях вад-/тимОх 38 б ' Ффалтвовм варни с ---- 5 ва - сп - А вадам баба ос сшв»иу вада ЩЛ- б" б' ша виш дн о -ів в ашаи ба бо дж зб ' с" ав ваша ше ба ап «ев то башти вс" ша п с" аж кни 1 т гама аз «(В бо - и - вм б -п ол що б ещшо Шов ваша а -Н-нОш бок (3-х ма -со з (вас бат бат сви вом вШвнММм шо о щоОо- ве «од-лищ с" б' "ШО бод т що- салат а ша т вача бшьшМ бно що -я тоди жо нин ба (д о шу ба що, шодо бно бач по бат ша « бо шо -(тТтш вам пн в «Чо тиша ш з" а' попа ваш шаи ва я «о дни в" зФвп'ОГвШшШМе У 35:10 лпвВдо

ПИШИ о ШИ М Б о о Шен ба - о (3 (З (п - 4 в," ФО моо само см рад нашОфФф с Фо -с»шщии о вам ш-МА-О ваше ша шо

Бо -д вад « міо бом пла пРх б шах ваша, ше мі б шавАшЕхн- б) зо "С лЕЧЕБВКЕВ ТЕ ВЕ со (со, «-- сзсшжосн сс со - Ус ж он со о

Фо юю юю Фо мМ фл ся ФО в.

Фиг. 70 « - с . а - шк (ее, (ее, іЧе) о 60 65 м « тов с ше ФФтшп оочояЮюЮЮОрХм чячанОопВФоомМа вача тт --с ана т башт пе і щоб м ОО си щЩес тт Яд що Рош семи пні:іЕД шок о ща вимо фо тво 00 Же: що що м пиши НИ а МН ДЖЕК СЯ а жо ПЕВ вав ті тд Ед; КВ аа д юд п пдшіма ми ЖАВ зош СА ЗА: бейсвідния Бкшя ві му панда ніїА т ММК тТн о: оз па ФК пал мічтМ Що вовни вапаослаіини МВ а доб Вж ж кіл ЩА Ні 0 1 вищі МнНіМмМа гад ля що Фо іще ід 0 ши шк М Ж г» а ПД ва біл ії щодо Ф рапнчніаазаанжх п ие ШИ ШК о ШИ ШИ: НИ я б вч 1 ЩО ра щі ких рай ав и ШИ Мк: НИ а ШИ з ра ті мм вини вВфБІОВХх апр п ет ШЕ о М НИ си и М ща паж рі щі т с щ бла щоі Ж А и не ШИ ШЕ г» ШИ ШИ є» Шо ав бощо 1 ном т сн щфкКоОо, ак сі

ПИШЕ ние РЕ ШИ я и НК ПИ ще х НИ я В Я ШНМ понад ща м окт н шт А (о) і па пднада га щ іт ок но ро щ АЛ Юм тати що вра тиатштмирм сн А в' йти Фу бами; ль ді б ба її б іч ді ва ва щфнав Ота що т (со) ра"; дме жи ІН о Ще МИ Ще ЩО со Я ск зрапдпапвнатРто І як ШИ НИ те НН м Шок со попади дна псів, Тптас - з ск, шо те пів і - что во» чав нопйчтаатй - їгз ШИЯ ЩЕ ов знє) Б: М то ов вот з се пс з апп пжлтвюв супетюоювчи ло о Ф ФО) ФО ФО 0) Ф 8 с Фиг. 7р . а - шк (ее) (ее) іЧе) іме) бо б5 і-аь) В юю в тео - --ооото-н От ж о и в са ль м хе З ЩЕ МИ с Пн кН іде пе ШК ЗА Ж хе В Є ПИ Р Дан я ШЕ шив жтв ше. 1 НЛХОЦВДЯ шо а ше 90 --щ БВЕЕТОЯНО боб БЕеетшШОКВШНЕ тн "во нн бен ЕЕ б бу і

НИ да НИК С ЗРАД нн пити шо Слон юн сс шшШ аб ш шви - шт - шипа Бен ба шшевол. дар шо сте Но ж слони нилієцЯ швччлНо бо у 70 сич ЦІНОЮ ДУШ о бд ш шко бддо-ялиш о полю б б со шила «о топ (ба пос -

Шия бо -Б 8 БШЕМЕЖ б. шт боші боб Шо б УлюрИте б бшелЕш 9 лен бос ПНшЕея Ж б шк

БТ СЕ бобЕ тт НЛюДюЄОЮ, 8 "Це шити сб шо баню шідана об бм т о6 Шоу об бору чить с чо БД -е б б д4ФО штхОщіссцшо БЕ ЕОО бліх год о ко до ве ш- шо б сБЕШОо БІО Фшв-«

Ше бо шоб рлфш сш т - щоб ос свл'яо ЦІ ооо

НЛО бо св шоб вл ше пох --ЦіНО б б Ло» даному ши

ШЕ боб шо ошо ПЕСБОНи а ШЕКОнК с жа б Фобаншам о Піно я що ен А І з ас о лан. б» о шо - БНЕА шо поташ» шШишщообО об сщжашШ о дохлмтено шо

ЄМО СМ о -- т- - "Ч"Б'ЕВБВБЕ УББ Ф

Зо со со 25 Емо -

М

ФИГ. 70 пд - . ит - -й (ее) (ее) (че; їмо) бо 65 т й п сет А т пд

Запвоаптато Затавчача ваша тва 7 р оласих ЦИ ее ва пвмаваю ББЖ, мод,

Ко вс: как м Деевнетя пи ж МНН ШИ) шт ШК мо

ТО риніти Жде то

Шев аю

Меащешкношжеа БК б жкимохшвка «реє 00 а о жо 15 ЖЕН ра НК СУ КИЕВ ВИШ а аа ащо

Яд о ЩО ЕН Од Есе Я а ЩЕ НИ НЕ -ЗНЦ

Модем астмі о

ЕКЕЄЯТЕТУфееткзсж 0 ВК божа

ВЕ «овощчонов все ВИ. З

Ше м пдв модем 00 ЖОВ що 20 ПЕ КД В В М ШЕ мМ а ашма і

Па ух с: бом п ни и ши и и» НИ НУ

ПЕ а іч пишне ни мк М и и М

Пиши ни Мак с» НН М и НИ п ше шк и шк о В Ге! 25 Коля МИ ВИ СИ г шк шк шк ши с

ЖК ниви а БІВ оо жо я і)

Швщоо б он шва б мот 30 Емо а мою 0 ФВ мом со ве ж ж сущим ім,

Ер моя щіщева жо со о и НИ офав'ммоадх «-

Зо рало но С в: м: олова ШИ мл З» Ша ШЕ ТЯ в і о тела Ши Шк че Ши з) Ше воопаїТпято та аптяешВВ - Те: ШИ ло Ша як -ї - - са сж тс сю во А Гоа: Не М пк о Ше Ше п ШИ о ШЕ ЕВ п шоп топ Фо Ф т Од ФО п «

Фиг. 7КЕ З с з -І -х (ее) оо 50 (Че) (Ф. ко бо б5

- о їт- Фе хеаНазкО8 вовк спец: оо іа ПИ МИ МИ ВИМИ 5 МЕ

ЕЕ - 0 ОЗ --- или и и і в В

КЛИН ша, о ОО В с аша. ето опе у НИВИ е ДИ

БО НО сша

І ТЕ тат, ше шия им а дл ш дов -Щ - ши ни и и і я в и

НЯ В Я аа ші ШИН ВН ОЇ а

Сл сте ад перш || с шишшОвчоб о аава., оцононока т 1 о) ам аа шила о аль ати я широта

Кеполоноо | ан ше поло капа ня я пло ооо запала дотла сер балада аа с св А ВН о ІН ша во НОЮ на нБде здо т, щи Ж Ом оааатьхя з ши ЩЕ ІЗ У баба ат жо ВЕ ЕН ам М- шив бл бБбИК ваа ок -шШш-х

Ехо Ж шеетеь в сч

ЕНН б бо обо ст М Ш (зпУ ОШ 7ооце о бохо ел Яореютя о пані ИНА Кон п щоб б шобна фен ясчня (ян

ЕВЕР БІВ8В ВЕН Ф то со с 25539599 З5855955 - 35 о

ФИГ. 78 40 - с . и» 45 -і - (ее) 20 (ее)

І3е) іме) 60 бо

- о - іє --і1:64сч0с0т г і: Ше: Ше ШИ ГА ШИ во ЩЕ ле МИ Те ДИ се Я ло

Фо чтлтавс вто - А гос «не

Їли ЩО ле М: ШК жо Б Є У ШО и В В Га: Ше: ЩЕ ДК ля МЕС ВИТ ОВ же ШК: ШК як

А КОН ЕЯ УКВ ДИКИМ КК о МИС

ЖЕНИХ ж ожояоломвно 0 ФО Е ВК о ВЕ св ев ж ОВК ВВ пе ко ку бозвовомоювь 00 ЗОВ Одессе о пащщещше пі м КК Я спа блддно 0 ШВОВИМм моя

Юа аащалваяаня о шЕЕшЖУЄМ ОХ бат єтатшо 00 ВЕДЕ ВВ рпдовзайв»в»щ ІЕС кі ЗОН бе шиаввон о ЖНВЮн Я сезямханмо полян

І5оаа сяє мно мо 00 БКБОВОМЮУкноя м впадини Ж ЖИВЕ т ЖЕК що ше врата ткв Кен ков с єтфднтщте В ра рН Мо баба ощоідобіво 0 ВОШЕЙ зд я д КХИК го Шкжто сста ЗВ жи о мкг

ІК і а ЖАХ СВК В Пи

ЖЕ срср Я о ОСНО я о ОХ

Шжжеамнни МиносваНя

ШКО ВООопі мір ов Не ом ЗК

ШЕ шям Мо мово с 2 Бббовюрютитюте 00 ЖЖ Ве аневх о

Ж о у КЕ екв кн и ну рваватині за п дош не пи и и» о ИН ЖД пе пе До й: рані і ее «рН ред свруси Ме.

Здав ада воло шо я я випили ники зни Шона щ ака; со апа ни ті ШИК я таж що со ра; а і пс вви ва Сова 0 г рай ва щшебопламинжя - - вечерю фетою яяеЖннрмчФжтФвочоОо -- Ж А щі с ча - - - - оф й я Шо б б о ч - с Фиг. 7Т з -І шк (ее) бо 0 (Че) (Ф) ко 6о 65

(12) - ї- їз (12) - ї-о тс Мо моно нт ст В хв ВІ БОБІВ пил ПВ ВМО сит реоізезщикщовй сення ссОхмлмті

Ееуеноися ХЕЕе шшнм міш шишщіх Х и хо плотву сени шилосглиі» «о СИВУ о діжі яю олококоя о олоко сисивноцю| то! ниж р бо Ше (ж НО аю Ін ІА тю Екадатшонітншяї дер сю, со и Ну Кн яй ш- 0555-03 проме м мЕЕМтя вано ах одиниця "тин т МО

Гео ж беж

Пт РН нот САН б о. 5 Ейр йо б о В 951 сс сшошжиО сосвЕхоОобне

ЕН ж мож мІлач оф дод ох ОК. шити ШЛЕ пив п ЕТО З швацію і - ДЕ МЛМ Суіт дж я -шЛ вд шо ІІ Ух пишачоапнлішатфе о-- 2-5 -шшШ

ЖЕ вштвиШ ЕЕ нт

ЕПЕ АТОМ МИКОВЕК. ПЛІ Суто Су- Ш шого схо ше со солалеотдуО

Ток ноке оон оби июею. ст Р Мои с ов дос ШО жу м о В сюдрсьєу -|вланв шшо-ії шосе ота і) ініийеератйжитьн (Енн сет к-т 1 пт І шШн- х з Біт ето я ---8и лука шо - 500 (22)

ШРОТ ІВ о що о и т 30007 - Г» є) ща З 8-9 мМ м-н ії чани ЕЕ со «- їм зво о 55 ветО

Фиг. 70 5 я. як с . и? -І -й (ее) (ее) (че) їмо) бо 65 чо їі - Фф

Чи тс чи о м: ес ел ТИ Шон ес

Фа вшюстася чесеп;Птошто с о Ше Шик е ни я: ШИК АШИ То ди ШИЯ ШЕ треш юю м ті

ШЕТМНИИИ ОК: 0 СБЕЕДКМ МошомОомопі

ЗЕМ яко 0 ЄЮ о ус;

ЕН ЕЕ ЗЕНИК о ЕСЕ ИН

ВОВКИ щоронов Кн кон вет

АКНЕ со ЗЕКОІКСНКЖ 00 ЕЕИЖТИА Ж НИ

Мноафошнв і жести ші? м сен ж АСЕОНЕСЕЄТЕВ ва Кер:

М жнкжтвоойбною 0 НН ВеюВвє

Жан солод ОСБЕО0ОСБОЕСЕ НК АКА раба вті 000 ЖКАНОКЕДР ОБ баня ВЕСТВООНЕ бета па опа м ВИК нношю баса 00 ВВІВ вк ЖВЕЯЕ ан нв ЯНВ жна» др пт ьо ВОК Меню є ва ва ланд ЖЕК п т М щу

ЖОВ М мою КО» 00 ЖКНЕЖЮДЕ Є бот м

ЯСЕН: б Ж ОСЯЕ пз ащаням с

ВЖК 0 Ж Хоми я апп жвнв» о

ЦВНОЮ ДЕК ОПН м пппп нас

ОВС о воно яодржев ов М ог шви вові во ЗОВКО 1 ОБЕсОУВ: фббсюююют мяжт ЗІХКесЕрмМ г м Ф зо БОБ Е люде мжк о МІВ» м за саме, ФЕМОФНК» ра рунЕ со сзата,сю В внатия пов иіан ЗДАВ «ЦК - і - мо (чо 0 лою «и По ЛА Ко жк НК ЖИ ча чин зе стос сгоші во сало Оу том ма с см сот сміло юю лі - секс ші с 3 о га ле - - - т- "тової се ммоль важ сю с АЙ « пп оо ля ал т око шо жо Ши о ШЕ о ВО - с Фиг. 7У . а -І шк (ее) (ее) іЧе) ко 60 65

"- т- о - веввадвЗви вової ез с) бос дн тс нов пошта сш» бВоша ня сс ши 1

ЖЄЕВЕННаЦЕО нев 0 опо шов саке

НАЕЕН ЩІ ОУ ссмшшо ж ваша сшнно шо бо бООоштшожма

БЕН анна ві боби

Шівнаеє.-- - ше --ИДе (Ікони жечпрсанох ЗЖоНе о вер яти ВНЕО алко У шо 0 нЧищоцлшл о о тю пбашушев о божобп (Несе

БЕ с сФ 0 - ШЕшоФнанах сит оє мо 0 мо що ЛІ» ПІВ ДОНКУ сера ріс Таня вельаввзітв ві Гейтса ПО)

ЖЕ не жцшя мов шжтвр- І шах

Беретет роутер сло »- ШОЕ 5 ЕШЕЕ, ЕОМ. |ВЕОЛЕВЕЮ ОСНО)

БЕ бждОІЕИМ ОМ що пошле ці с-ще

Кок сш ше шНшм м -в- с

ШЕЖВЕ с о-0- М - ше ШИШОК

Еш тЕня ЕЕ ЦеОЕУНЕ

Ек Орест) Геофщощо БЕТОООВеЬ, ппиливноь ВСЕМ ЕН м мкс шко ОБР» шШ циш ОО ШшШету » (3

Нестатащі вне вя ДУ днів ПЕНЮ,

КИ 0 акти ВАШ ори тт Конт бЕДЕ ЩПУЕОМЛТ НЮХУ б 00 пише ЕЕ ЕО ею шир ожщи ж ти шшШшОюмун ши

ВМ сс сс людб с Ж -- шин че бобові шо ШОВ бо УКВ, с и ж ТОХОгВ, б поцовоов

Шк ЄЬШЦО боб 0 Ло плас? єКо І СТНСтеЄ (о) ка НЕ тт в-во нусошя чі т (22) рою яю ню сно оо -- ножі зо тс швомвв ов ФЕВ що (ее) (ее) ге сн с 3 с-м с 3-0 -- шою шолом ї-

ФИг. тя шли та - с . и?» - -їь со со (3е) о бо 65

-е-ж вро шал нс ть се ос би ох с г с бо Філ я я са А - я не че во юс ЮА і: М: ЩО за: М о ДИ по и НВ В пЕЯеЕЕН ПИ я в М ШО Кох ос а ТИ НИ ВИ ШИ ШТ во й пав дДЕМЕ св ра ЕЕ рі ПИШИ мах мч» НИ НИ ВИН ПИ

ШЕ ної пиши о ШИ НИ НИ

Кобея пи и: п и хи и М М

ШК я Га: ШІ НИ ек М ПИ шк о Я: ШИ ШИ ШИ М 70 Ко водя р зщ ШЕ ШИ З ГИ Ма: МГ ат НИ НИ НИ ШТ

ЕК с доп цка п и: Ши и НИ

КК шт ПИ ато ж ШІ ЗИ МИ

Бек етрие я В пп Аві калі

ЕК а. ГНН че НИГНННО ПАЙ і ор ві що ета п шк о т оди ши и МГ 19 Ето а ДВ пили хв: ВЕ НИ НИ МИ

ЗВТИсву ра ра і п ши шо и ши ни

ЗВСВУ АК: Пиши не се аа їі

Іква ом ши их: ЩО; ВИ В НИ ИН

ЕТ м ваної Пиши нн: ж НИ НИ А

ЖЕН пк авт

ІЕЕ а ша мо! пиши: Кк о В НН НИ А

КО Ге В НИ Ж зе М ПИ нє т е- Ж НИ НИ НИ

ЯН дю й А кі ПИШИ ОЩ а ШИ НИ НИ НТ г сх ЩЕ МИ М з НИ Що Й ге РК ШК ШЕ НИ с та лі йА 1 і МНН ей г: В В НИ М п ше» щі сл ВИ Є; В НН З т то ши шк шк МИ М о я ние ни З ІНН

ФЕМ а а о Кос о В В вада тьй Бе с НИ

Пиши яко с НИ НИ Я к УНН НМ ЕК В ЯК вал (2) вав ОВ о ШИ со с біт 3 -щ ж в ОД х пи са бтіниявх шаора мо (ге) спааашевнЕа ато що зпо«на«тио ЗЕ що т ї- такт охо пз счпоотоо ою 7 ло сеї хною осот е- тром ть г Ю «ою го я - - т спож от см юю Ай сво с сю юю тв «

Фо лю й дп Ф Фо лу МО шщ с Фиг. 7Х . и? - -й (ее) (ее) 3е) іме) 60 б5 -7А-

жа БУ й Бе ЕК бе БЕН ке ож ЕХ СЕ ОВК ве еВ ве

ВОНА» ЕЕЕВИЕЕВН тпЕдеЕНЄ жо а ж ДОВИХ ях ев ж жа з и Мед ви З й ях а й акта ьсер и ДОМИ аж важ и и я а ном р еесяк й еятвстя | Б.В, з шо ж ж ож ЕНН я я жарени т: НЕ Я вия ля аж ее вл ВЕН сс во ВИН ШЕ

Ме Коб ож ожоя о сфе вн я Во овою

Ба ною» ФЕШО НЕ к я ж жов

КЕ, я ож ож ож ВВ Я возі 70 ший. є бохо в НЕК ож жо п жов мож пенні Її акояожо о

НЕ» ся ков й ож КВН я оо» шов жим ї з. ШИ НН вх ек ЕЕ

НН Е Ж в є к я з сук ШК ШИ ер лнзя а ЖИ яз Аді ож отож ок ки і хижий з щоеняье іш кох ок я хз з ж кож во в

ПЕН са ЩО ЕЕ з ож БКвкатя їж о ок т; т: в НН НН ИН

Ед ко» ШИ ШИ ШИ сао ВИ ВИС

Боев ев ке не ЕЕ з НЕ НЕ: з ж Ж в кн б в є

Мала я я їх з ек в я її

ЕЕ хх ях я аж ки шЕ ж кій б кох» сем ре хо ИЙ пава не аа ж ВИНЕН я вузи й аа еко кла В ШЕ ШЕ ШЕ ШЕ ПИ их: ЩЕ ШЕ

НА Я я я її ож жд ха я

М ли пет ра М са: Кеті: МеВ ШЕ ТИ ЗИ се Во В ШЕ ШЕ

ПО вн як й хво ФУ ее 5 Ще є в шо ше з у жу ж ее же а и В'є В ше не ж Ба ЗБЕ жу що зе ба

З МЕ пива со (ее) -

ЖК НЕ Ве ВО ен й не НВ ее У ЩО жінк йву; з ТЕТ Вже М «виг ТЕ « « - . а -і - (ее) (ее) іЧе) ко бо б5 оо ки і Ь: й -е-кговтоясмчи вн т с іт дите ше ж ни оо ШИ ЕР ШИ жк ШИ чан Я м ІЛ ДУ А сн і: ке ШИ ЩЕ во ле ШК" ШЕ і мс еВ Ще ШИ по те се ДИ зв пиши шо кс» НИ и ИН Ге" ка М ШИ М МИ М Я 2 Пиши ши у» в ще М и іш шк АН ШИ ще НИ пи ник НИ В В ВН пиши щк я: Шиаг В ВО А ЯН У ши ши «мкс ше Ши МИ ПИШЕ ШРІ ВИ З НИ ра ща і Пе ши щі те М ШИ А ра щі г т: ко Я В В ВИ ВАН

ПИШЕ НИ тк НІ ВИ ВО ВО НТ РИ Ши: В І З ВИ НН

Пиши ШО є 7 ШИ ВИ ВИ НТ пиши не І Ш ши НИ ще п ни и ши Ши НИ

ПИ Шк с» и ВО ЗИ ВОНИ В ВНТ г ники: М НИ В ВО НТ

ПИШИ Я же Щі яь М НИ ВИН ВН ВАН ПИ Ши ху ЩО я В НИ В НЕ ВО 715 Каті юю і г шк є» Ме В В ВИ В

ПИ є; ма ще НИ и В м й Шк 111 щ г: с І ПИ ЗИ МИ ТТ г щи «ШИ Ж ШИ М

ПИ «Шк; ЩІ НИ ВИ ПИ НТ б щщ а тлі

ПИШИ ни» Мо» з ШИ ЧИ ШК ІНШ Я «з ЩЕ як НИ ШИ М МИ ВИН

ГИ Шк и» М ль В НИ А ВО АН ПИ З «ние НИК ШИ ВИ ВИ ВН

ПИШИ ши ь ще М В ПИ ГИ Шк «о Що в "В НИ З МИ В

ПИ як М Щ НИ НИ ВИН п шк с» ЩЕ нш Н

ПИ кс» ов В ПО А ТТ ПИШИ Шк с» Що « Щ ШИ НИК ВИ ВН г ях ЩО хх НИ НИ ПОН НН ТТ ГИ М жа В НИ НК МИ ВИН п шк о щі ст и ПИ шк с» М: «ще Я Шк с

Пп шо» Ше ШИ Шк НИ МИ ИН ГИ ния вк з» Я З ВИ М Ге)

АН: гор г мне: ст ШЕ ШИ В ВИ

Пк чі зх НИ НИ ПО НН АН г як а щі т НЕ НИ НИ А НТ г шк є шт Ши и и ЗИ г ши хх як НИ НИ НИ ВИН ВН р ДС 1111 г ше» ЩО кз В В ВИ ВИ НУ (о) мк ун зскн М я ШИ НИМ УНК НИ пада і т Ні со ее нео пиши НИ М пед вка

ЛИСА га і НИК Ше НИ Ада ал (ее)

КЕ раки ПИШЕ ШИ з «ЩІ с: М В НИ НИ МН

ПИПОНТИШИИ че

ЖЕК пиши г ПИШИ ке» ЩЕ: м В Не НИ НТ

ВОД а рак шин и: : не Ше НИ МИ у свсвчопчЧчовсоосвоОо оопвтчосвсповоо ло о о -В8 з ото Фо « с тн сю й спот се сю с г - с жо шин шко ВН У КОКО Бо ши шко ше ку В ЕВ) . «» Фиг. 75 - -й (ее) (ее) іе) ко 60 б5 шов ода обо - тн шо СМ Мт -Фож о М с от - ЗО 0 ня

Шк Фо Я с» и ПИ ВК ВИН и яв ж ШИ ГИ ШИ

Пи ло ср. «щи ШИ Пи ИН НИ М з до НИ ПИ НИ Й

ПИШЕ ра в ВИ ВИ ПИ ВИ НИ Пк не» М о» В ЛИ ПИ ИН

М ШИ Ше З а КИ НИ ПОГ НН Ша

ПИШИ ЩО з а М ПИ ПИ ЧИН ПИ о Де и НИ ШИНИ

ШИ При поса ВИ ВАШ ВИ І ли ль Пра В ПИ НИ Я ни еще НИ М ПИ ШИ ран(ІД аа ши 5 Ше ав ПИ ПИ ВИ та

ПИ и зо о ШЕ НИ НИ ИН ше ше ВИ НГ ИН ШИ ШИ и ке НИ пи НИ п ке є дь» ЗИ М М НЯ

М даси»: І НИ ПИ ИН сов кава ' п Па НИ ИН пи т сб ' 1 пк п пили В З В В о п и ль з ЗИ ВИ ПИ ННЯ

Кеш аа п ак - пи и и шк ва Пр НИ НИ ВИНИ ШИ он Фо ВИ ВИ ИН ПР

СИ и до МЕ ПИ А ИН пи а п НН пише ше ші и ши Ши Я в м де п п РН ши и т» м оз ВЕ НИ ПИ М шк нор шви Шк пи зи НЯ

С ж ев» НИ І ЛИН па шют аа бля ана Ак, бід аа дна ставі п он в ШИ ПИ ПО ННЯ . б ши и и ль я НИ НИ МИ Я кадри і ва са

ІД ява ПИ п щі опи ИН ПН НН ши и о і» НИ ИН НИ ИН ИН МИ Б Ді пай ПИ НИ ННЯ 1 раю: ШИ ШИ ШИ ШИ ши т» М є» В І Я п п ооо НИ ИН ВИ и м» а п ПО с п в а и и ПИ Я нн і, Ге)

СД аа М Фо ші коп и

ПИ лк оду и НИ НИ НН ШИ по НИ НИ ННЯ ная, п пра п НИ башта, яні аа бно аль, МН мь і в ШЕ НИК НННЯ о подо ево пови осво со (2,0) ч- с сто нн со сю чого - юю те

Фо г с сю дю й йо фо

Фиг. 7АА « - с ч и?» - -й (о) 20 (о) і3е) 25 іме) 60 бо сет ся трест жави ЖЖ яю пише Ши є» НИ НО НН ЗЕ пише ше м: и Ше Ши НИ

ГЕ ШИ с» ШИ НИ Мих В г ши т в ШИ ШИ НИ НН п ни пи І и НИ г ши м «п М ШИ В

ГП Шк ан я НЕ ВИ ВИН Гоше ше мк «з НИ М В З рат Гашек Шк Шах ВОК ВИ ВО В НК

Пиши ни є В ПЕ НИ ВИ НН п ше и ш и НИ 70 ПИШЕ Я са ЩО з п НИ ИН ИН НТ Го ни же: ж Я ШИ НИ пише Що ЗЕ НИ ЗИ НТ пиши ши М нщ ни и а пш Шк с; а В НТ пише ни шк о шк ши зи ни г шик а і НИ В ИН НТ І ЖИ Шк « ШИ ШИ ШИ ЗИ В

ТИ ще они М ТИ ШИ ВИНИ ТТ ба ж 111

ПИ щи: В ВИ НИ В НТ ши ши ж Шк ни и МИ рада г МИ М в: НО НИ ВИНИ А ТТ

Пк а: НИ НИ ВИ ВИ ГІ Шк М « ВИ ВО НЄ ВНТ

ПИ ск «в ШИ ВИ ИН НТ п шк м ни и и щі м ни и м Мк В НИ ВН г нн Ши ни и г ши ж ж и и о Я ре ща її іч гм ши м І Я ВО ЗИ ВНТ

І и хх з «ШИ ШИ гл І ШИ с ШИ ШИ ' ра

ГИ ше» Шк а т В НИ МИ НН ЕМ ШИ ЩО зх НИ ИН НИ ИН ВИНУ

ГИ Шк са ех НІ ВИ НИ ВН МТ ГИ шк Шк ль ШИ ШІ ЖИМ ШИ МН

ГИ нг ам М в В ИН В НИ ВН ра А 1 г ние т з м НИ НИ МИ У ГИ М М з НИ НИ ПОМ НН НТ с

ГИ сш сз ЩЕ ШИ ШК МИ ВН ГИ М Я з « М ШИ НИ ВИН ВН Ге) го ше ЩЕ о ЩІ В Ше ИН гашене ши щи Ши Ми Ви

ТИН зх ЩО як НН НИ НО ПО ВО г ни мис М М МИ ши шк в и з ш и и В г ж м з В ВЕ ВИ З ВНТ ши шк Я с НЕ НИ В ВО НТ ГИ ШИ Ма НИ ВИ ИН КТ (о)

ПИШИ ши І о ВИ НИ А ИН ПИ шо ЗИ НИ НИ НГ НЯ

Ге Ше ше и ЧИ Я МИ г ши М є « НИ НИ НИ со

ГИ М ех Мч ШО ВИН З ВН ТТ ги ниш М є: НИ НИ ВОНИ ВН НТ (ее) ши шк о ши м В о о В г шиши шк ся о о о В пиши шик ок м Вк НИ З ПИ п ши ше є " З М ВИ УТ - і - овПпвато осв осооввоооФвао - п бю чо зІ2590959 Зх050йи89 їх - с Фиг. 788 . "» 1. «БрОСІ » Полипептид, которьій связьівается с ТКАЕ2 и модулирует активность МЕ-КВ, причем указанньй полипептид включает: а) аминокислотную последовательность ЗЕО ІЮ МО: 7 (МІК, "индуцирующая МЕ-кВ киназа"); -і б) аминокислотную последовательность фрагмента а), причем указанньій фрагмент связьівается с ТКАЕ2 и - модулирует активность МЕ-кВ; в) аминокислотную последовательность аналога а) или б), имеющую не более десяти изменений в (ее) аминокислотной последовательности а) или б), причем каждое указанное изменение представляет собой бо 50 замену, делецию или вставку аминокислотьї, причем указанньй аналог связьшвается с ТКАБ2 и модулирует активность МЕ-кВ; или іЧе) г) производное а), б) или в), которое связьівается с ТКАЕ2 и модулирует активность МЕ-КВ. 2. Полипептид по п. 1, где указанньй полипептид представляет собой последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью ЗЕО ІЮ МО:З (клон 10).

З. Полипептид по п. 1, где указанньій полипептид представляет собой МІК (5ЕО ІЮО МО: 7). 4. Полипептид МІК по п. З, где указанньій полипептид содержит, по крайней мере, часть аминокислотной

ІФ) последовательности ЗЕО ІЮО МО: 7. іме) 5. Последовательность ДНК, кодирующая полипептид, которьій связьівается с ТКАБ2 и модулирует активность МЕ-КВ, вьібранная из группь, состоящей из: 60 1. последовательности КДНК, содержащей нуклеотидную последовательность ЗЕО ІЮО МО: 3; 2. фрагмента последовательности (1), кодирующего полипептид, которьй связьваєтся с ТКАБ2 и модулирует активность МЕ-кВ; и 3. последовательности ДНК, способной гибридизоваться с последовательностью (1)-(2) в умеренно жестких условиях и которая кодирует полипептид, которьйй связьіваєтся с ТКАЕ2 и модулирует активность МЕ-КВ. 65 6. Последовательность ДНК по п. 5, включающая нуклеотидную последовательность ЗЕО ІЮ МО: З. 7. Последовательность ДНК по п. 5, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок МІК с аминокислотной последовательностью 5ЕО ІЮ МО: 7. 8. Последовательность ДНК, способная гибридизоваться в умеренно жестких условиях с последовательностью, которая кодирует полипептид по п. 1. 9. Вектор, содержащий последовательность ДНК по п. 5. 10. Вектор по п. 9, способньій зкспрессироваться в зукариотической клетке-хозяине. 11. Вектор по п. 9, способньій зкспрессироваться в прокариотической клетке-хозяине. 12. Штамм трансформированньїх зукариотических или прокариотических клеток-хозяев, содержащих вектор по п. 9. 70 13. Способ получения ТКАР-связьівающего белка, его изоформьії, фрагмента, аналога или производного, которьій предусматриваеєт культивирование штамма клетки-хозяина по п. 12, в условиях, пригодньїх для зкспрессии указанного белка, его изоформь, фрагмента, аналога или производного, осуществление посттрансляционной модификации, если необходимо, для получения указанного белка, его изоформьї, фрагмента, аналога или производного, вьіделение указанного зкспрессируемого белка, изоформьі, фрагмента, /5 аналога или производного. 14. Антитело или его активньій фрагмент, или производное, специфичнье по отношению к полипептиду по п. 1. 15. Способ модулирования или опосредования в клетках активности МЕ-кВ или другой активности внутриклеточной передачи сигнала, модулируемой или опосредуемой ТКАБ2, причем указанньій способ 2о предусматриваєт обработку указанньх клеток введением в указаннье клетки одного или нескольких полипептидов по п. 1 в форме, пригодной для их внутриклеточного введения, или введением в указаннье клетки последовательности ДНК по п. 5 в форме вектора по п. 9, несущего указанную последовательность, причем указанньійй вектор способен трансформировать клетки таким образом, что указанная последовательность ДНК зкспрессируется в указанньх клетках. с 16. Способ по п. 15, где указанная обработка указанньїх клеток представляет собой трансфекцию указанньх клеток рекомбинантньїм вектором на основе вируса животного, предусматривающий следующие стадии: і) (а) конструирование рекомбинантного вектора на основе вируса животного, несущего последовательность, кодирующую вирусньій поверхностньй белок (лиганд), которьій способен связьіваться со специфичньм клеточньім поверхностньім рецептором на поверхности обрабатьваемьх клеток, и вторую последовательность, (33 зо Кодирующую белок, вьібранньй из указанного белка, его изоформ, аналогов, фрагментов и производньх, которьй при зкспрессии в указанньїх клетках способен модулировать/опосредовать активность МЕ-КВ или любой со другой активности внутриклеточной передачи сигнала, модулируемой/опосредуемой ТКАБ2 или другими со указанньіми молекулами; и (б) инфицирование указанньх клеток вектором (а). -- 17. Способ модулирования модулируемого/опосредуемого ТКАРГ2 действия на клетки, предусматривающий ї- применение рибозимной методики, в которой вектор, коюодирующий последовательность рибозима, способньй взаймодействовать с клеточной последовательностью МРНК, кодирующей полипептид по п. 1, вводят в клетки в форме, которая делает возможной зкспрессию указанной рибозимной последовательности в указанньїх клетках, причем, при зкспрессии указанной рибозимной последовательности в указанньїх клетках она взаимодействует с « Ууказанной клеточной последовательностью МРНК, расщепляя ее и приводя таким образом к ингибированию в с зкспрессии ТКАЕ2-связьівающего белка в указанньх клетках. 18. Способ вьіделения и идентификации полипептида по п. 1, способного связьвваться непосредственно с ;» ТКАРБ2, предусматривающий применение дрожжевой двухгибридной процедурь), в которой один гибридньй вектор несет последовательность, кодирующую ТКАР2, а другой гибридньій вектор несет последовательность

МЗ библиотеки кКДНК или геномной ДНК, причем указаннье векторьї используют затем для трансформации -І дрожжевьїх клеток-хозяев и позитивнье трансформированньюе клетки вьіделяют с последующей зкстракцией указанного второго гибридного вектора для получения последовательности, кодирующей белок, которьй - связьіваєется с указанньім ТКАЕ2. о 19. Способ по п. 15, где указанньій белок представляет собой МІК или по меньшей мере один из изоформ, 5о аналогов, фрагментов и производньх МІК. со 20. Фармацевтическая композиция для модулирования модулируемого/опосредуемого белком ТКАБ2

Ге действия на клетки, содержащая в качестве активного ингредиента по меньшей мере один полипептид по п. 1. 21. Фармацевтическая композиция для модулирования модулируемого/опосредуемого белком ТКАБ2 действия на клетки, содержащая в качестве активного ингредиента рекомбинантньй вектор на основе вируса ов Животного, кодирующий белок, способньй связьвать клеточньій поверхностньій рецептор, и кодирующий по меньшей мере один полипептид по п. 2. (Ф, 22. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, связанного с ка индукцией МЕ-КВ или с любой другой активностью, опосредованной ТКАБ2 или другими молекулами, с которьїми связьівается полипептид по п. 1, причем указанная композиция содержит зффективное количество бо белка, кодируемого клоном 10 (ЗЕО ІО МО: 3). 23. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, связанного с индукцией МЕ-КВ или с любой другой активностью, опосредованной ТКАБ2 или другими молекулами, с которьїми связьівается полипептид по п. 1, причем указанная композиция содержит зффективное количество молекуль! ДНК, кодирующей белок, кодируемого клоном 10 (ЗЕО ІЮ МО: 3). 65 24. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, связанного с индукцией МЕ-КВ или с любой другой активностью, опосредованной ТКАБ2 или другими молекулами, с которьїми связьівается полипептид по п. 1, причем указанная композиция содержит зффективное количество белка МІК, его изоформьї, фрагмента, аналога или производного. 25. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, связанного с индукцией МЕ-КВ или с любой другой активностью, опосредованной ТКАБ2 или другими молекулами, с которьїми связьівается полипептид по п. 1, причем указанная композиция содержит зффективное количество молекуль! ДНК, кодирующей белок МІК, его изоформу, фрагмент, аналог или производное. 26. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, связанного с индукцией МЕ-КВ или с любой другой активностью, опосредованной ТКАБ2 или другими молекулами, с 7/0 Которьми связьвается белок МІК, его изоформа, фрагмент, аналог или производное по п. 3, причем указанная композиция содержит зффективное количество белка МІК, его изоформь), фрагмента, аналога или производного. 27. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, связанного с индукцией МЕ-КВ или с любой другой активностью, опосредованной ТКАБ2 или другими молекулами, с 7/5 Которьми связьвается белок МІК, его изоформа, фрагмент, аналог или производное по п. 3, причем указанная композиция содержит зффективное количество молекульь ДНК, кодирующей белок МІК, его изоформу, фрагмент, аналог или производное. 28. Способ профилактики или лечения патологического состояния, связанного с индукцией МЕ-кВ или с любой другой активностью, опосредованной ТКАБ2 или другими молекулами, с которьіми связьівается полипептид по п. 1, причем указанньй способ предусматривает введение пациенту, нуждающемуся в лечении, зффективного количества полипептида по п. 1. 29. Способ по п. 28, где указанньій белок кодируется клоном 10. 30. Способ по п. 28, где указанньій белок представляет собой МІК. 31. Способ профилактики или лечения патологического состояния, связанного с индукцией МЕ-кКВ или с сч ов пюбой другой активностью, опосредованной ТКАГ2 или другими молекулами, с которьми связьвается полипептид по п. 1, причем указанньійй способ предусматривает введение пациенту, нуждающемуся в лечении, і) зффективного количества молекуль! ДНК по п. 1. 32. Способ по п. 31, где указанньїй белок кодируется клоном 10. 33. Способ по п. 31, где указанньій белок представляет собой МІК. б зо 34. Способ скрининга лиганда, способного связьшшваться с полипептидом по п. 1, предусматривающий контактирование матрикса аффинной хроматографии, к которому присоединен указанньй полипептид, с со клеточньмм зкстрактом, в результате чего указанньій лиганд связьшвается с указанньмм матриксом, злюцию, со вьіделение и анализ указанного лиганда. 35. Способ скрининга последовательности ДНК, кодирующей лиганд, способньій связьшваться с --

З5 полипептидом по п. 1, предусматривающий использование дрожжевой двухгибридной методики, в которой один ча гибридньій вектор несет последовательность, кодирующую указанньій полипептид, а второй гибридньїй вектор несет последовательности из библиотеки кКДНК или геномной ДНК, трансформацию дрожжевьїх клеток-хозяев указанньми векторами, вьіделение позитивно трансформированньїх клеток и зкстракцию указанного второго гибридного вектора для получения последовательности, кодирующей указанньй лиганд. « 36. Способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, в с модулируемую/опосредуемую ТКАРБ2, предусматривающий: а) скрининг лиганда, способного связьіваться с полипептидом, содержащим по меньшей мере часть ТКАБ2, ;» содержащую аминокислотнье остатки 222-501 ТКАБЕ2; б) идентификацию и характеристику лиганда, отличного от ТКАБЕ2, или частей рецептора семейства рецепторов ТМР/МОБ, способного, как обнаружено с помощью указанного скрининга, к указанному связьіванию; -І и в) получение указанного лиганда по существу в вбіделенной и очищенной форме. - 37. Способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, о модулируемую или опосредуемую полипептидом по п. 1, предусматривающий: а) скрининг лиганда, способного 5р бвязьваться с полипептидом, содержащим по меньшей мере часть последовательности МІК ЗЕО ІЮ МО: 7; со б) идентификацию и характеристику лиганда, отличного от ТКАБЕ2, или части рецептора семейства

Ге) рецепторов ТМЕ/МОРЕ, способного, как обнаружено с помощью скрининга, к указанному связьіванию; и в) получение указанного лиганда по существу в вбіделенной и очищенной форме. 38. Способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, в Модулируемую/опосредуемую МІК, предусматривающий: а) скрининг лиганда, способного связьиваться по меньшей мере с частью последовательности МІК 5ЕО ІЮ іФ) МО: 7; ка б) идентификацию и характеристику лиганда, отличного от ТКАБ2 или части рецептора семейства рецепторов ТМЕ/МОЕ, способного, как обнаружено с помощью скрининга, к указанному связьіванию; 60 в) получение указанного лиганда по существу в вбіделенной и очищенной форме. 39. Способ идентификации и получения молекульі, способной прямо или опосредованно модулировать клеточную активность, модулируемую/опосредуемую МІК, предусматривающий: а) скрининг молекуль, способной модулировать активности, модулируемье/опосредуемьсе МІК; б) идентификацию и характеристику указанной молекульї!; и 65 в) получение указанной молекуль! по существу в вбіделенной и очищенной форме. 40. Способ идентификации и получения молекульі, способной прямо или опосредованно модулировать клеточную активность, модулируемую/опосредуемую полипептидом по п. 1, предусматривающий: а) скрининг молекульі, способной модулировать активности, модулируемье/опосредуемье полипептидом по п. 1; б) идентификацию и характеристику указанной молекульї!; и в) получение указанной молекуль! по существу в вбіделенной и очищенной форме. 41. Антитело или его активньіе фрагмент или производное, специфичнье по отношению к полипептиду по п. 3. 70 Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2005, М 1, 15.01.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України.

с щі 6) (о)

(ее) (ее) «- і - - с . и?

-І - (ее)

(ее) 3е)

іме) 60 б5