EA004658B1

EA004658B1 - Белок b1, способный модулировать внутриклеточные каскады воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, кодирующая его молекула днк, вектор, содержащий указанную молекулу днк, штамм клеток, содержащий данный вектор, способы их использования и фармацевтическая композиция

Info

Publication number: EA004658B1
Application number: EA199901117A
Authority: EA
Inventors: Дэвид Воллах; Марк Болдин; Николай Малинин
Original assignee: Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко. Лтд
Priority date: 1997-06-05
Filing date: 1998-06-01
Publication date: 2004-06-24
Also published as: ES2244061T3; NO995959D0; WO1998055507A2; CA2289479A1; AU7546798A; EP0984983B1; CN1259165A; WO1998055507A3; JP2002502258A; AU754963B2; US20050288225A1; DK0984983T3; BR9809942A; US7374909B1; DE69831231T2; CN100451115C; IL121746A0; ATE302215T1; DE69831231D1; EP0984983A2

Abstract

Настоящее изобретение относится к белку В1, способному модулировать внутриклеточные каскады воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, кодирующей его молекуле ДНК, вектору, содержащему указанную молекулу ДНК, штамму клеток, содержащему данный вектор, и способам их использования и фармацевтической композиции.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области модуляторов путей клеточной гибели и клеточного выживания, опосредованных, среди прочих, рецепторами надсемейства рецепторов ΤΝΡ/Ν6Ρ и связанных с ними внутриклеточными адапторными белками, каспазным и киназным ферментам. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому белку, первоначально обозначенному СВК, а теперь обозначаемому В1, его изоформам, аналогам, фрагментам и производным, которые, видимо, способны взаимодействовать, непосредственно или опосредованно, с различными внутриклеточными белками и ферментами, которые имеют отношение к путям клеточной гибели, клеточного выживания и воспаления, и, следовательно, которые являются модуляторами этих путей.

Предпосылки изобретения

Надсемейство рецепторов фактора некроза опухоли/фактора роста нерва (ΤΝΡ/Ν6Ρ) определяется по структурной гомологии между внеклеточными доменами их членов (Вахап. 1993; Веи!1ег и уап Нийе1, 1994; 8тйй е! а1., 1994). За исключением двух рецепторов, рецептора р55 ΤΝΡ и Ра§/ЛРО1, различные члены этого семейства рецепторов не имеют явного подобия структуры внутриклеточных доменов. Тем не менее, между рецепторами существует большое подобие в действии, свидетельствующее о том, что они участвуют в общих сигнальных путях. Одним примером этого подобия является способность некоторых рецепторов семейства ΤΝΡ/ Ν6Ρ активировать фактор транскрипции ΝΡ-кВ. Эту общую способность относили к способности белка цитоплазмы, активирующего ΝΡ-кВ, ассоциированного с рецептором ΤΝΡ фактора-2 (ΤΚΑΡ2), связываться со структурно-диссимилированными внутриклеточными доменами некоторых рецепторов семейства ФНО/ФРН. Но не известно, каковы механизмы действия ΤΚΑΡ2 и как координируется его ответная реакция на различные рецепторы, с которыми он связывается.

ΤΚΑΡ2 является членом недавно описанного семейства белков, названных ΤΚΑΡ, которое включает несколько белков, идентифицированных как, например, ΤΚΑΡ1, ΤΚΑΡ2 (Ко!йе, М., ^опд, 8.С., Неп/ек XV.! и 6оеббе1, Ό (1994) Се11 78:681-692; опубликованная заявка РСТ νθ 95/33051), ΤΚΑΡ3 (Сйеид, 6. е! а1. (1995)) и ΤΚΑΡ6 (см. Сао е! а1., 1996а).

Всем белкам, принадлежащим семейству ΤΚΑΡ, в высокой степени присуща аминокислотная идентичность по их С-концевым доменам, тогда как их Ν-концевые домены могут быть не связаны. Как показано на схематической иллюстрации ΤΚΑΡ2 (фиг. 1), молекула содержит кольцевой палец и два ΤΡΙΙΙΑподобные цинковые пальцы в области их Сконцов. С-Концевая половина молекулы вклю чает область, известную как «домен ΤΚΑΡ», содержащий эффективную область лейцинового зиппера, расположенную между аминокислотами 264-358 (называемую Ν-ΤΚΑΡ), и другую часть по направлению к карбоксиконцу домена между аминокислотами 359-501 (называемую С-ΤΚΑΡ), которая ответственна за связывание ΤΚΑΡ с рецепторами и с другими молекулами ΤΚΑΡ с образованием гомо- или гетеродимеров.

Активация фактора транскрипции ΝΡ-кВ является одним из проявлений сигнального каскада, инициированного некоторыми рецепторами ФНО/ФРН и опосредованного ΤΚΑΡ2. ΝΡкВ включает члены семейства димеробразующих белков с гомологией к онкогену Ке1, которые в их димерной форме действуют как факторы транскрипции. Эти факторы повсеместно встречаются и участвуют в регуляции экспрессии сложных множественных генов. Хотя первоначально ΝΡ-кВ был идентифицирован как фактор, который структурно присутствует в Вклетках на стадии экспрессии 1дк легкой цепи, ΝΡ-кВ, в основном, известен по его действию в качестве индуцибельного активатора транскрипции. В большинстве известных случаев ΝΡкВ ведет себя как главный фактор, а именно, индукция его активности осуществляется с помощью активации уже имеющихся молекул, присутствующих в клетке в их неактивной форме, скорее, чем их синтез бе-ηονο, который, в свою очередь, опирается на индуцибельный фактор транскрипции, что включает ΝΡ-кВ ген. Действие ΝΡ-кВ высоко плейотропно. Большинство этих многочисленных эффектов обладает общими характеристиками по быстрому индуцированию ответа на внеклеточный раздражитель. Основная часть ΝΡ-кВактивирующих агентов является индукторами иммунной защиты, включая компоненты вирусов и бактерий, цитокинов, которые регулируют иммунный ответ, УФ-свет и другое. Соответственно, многие из генов, регулируемых ΝΡ-кВ, вносят вклад в иммунную защиту (см. В1апк е! а1., 1992; 6τί11ί е! а1., 1993; Ваеиег1е апб Непке1, 1994, в качестве ссылок).

Одним основным характерным признаком ΝΡ-кВ-регуляции является то, что этот фактор может существовать в цитоплазматической не связывающей ДНК форме, которая может быть индуцирована для переноса в ядра, связывания ДНК и активации транскрипции. Эта двойная форма ΝΡ-кВ белков регулируется с помощью Ι-кВ - семейства белков, которые содержат повторы домена, который первоначально был распознан в эритроцитном белке анкирине (Сбтоге апб Мотш, 1993). В невозбужденном состоянии, ΝΡ-кВ димер встречается в ассоциации с Ι-кВ молекулой, которая располагается на месте его цитоплазматической локализации и препятствует его взаимодействию с ΝΡ-кВ-связывающей ДНК последовательностью и активации транс3 крипции. Диссоциация Ι-кВ из ΝΕ-кВ димера включает определяющую стадию его активации с помощью многих его индуцирующих агентов (ΌίΩοηαΙο е! а1., 1995). Знание механизмов, которые вовлечены в эту регуляцию, все еще ограничены. Также только немного известно о пути, по которому определяется специфичность клеток в терминах реактивности по отношению к различным ΝΕ-кВ-индуцирующим агентам.

Одним из наиболее сильных индуцирующих агентов ΝΕ-кВ является цитокиновый фактор некроза опухоли (ФНО). Существуют два различных рецептора ФНО, р55 и р75 рецепторы (р55-К и р75-К). Их уровень экспрессии независимо варьирует в различных клетках (УапбспаЬсс1с е! а1., 1995). Рецептор р75 отвечает, предпочтительно, за клеточно-связанную форму ФНО (ФНО экспрессирован как в виде бетатрансмембранного белка, так и в виде растворимого белка), тогда как р55 рецептор отвечает только за эффективное растворение ФНО молекул (Оте11 е! а1., 1995). Внутриклеточные домены двух рецепторов структурно не близки и связывают различные цитоплазматические белки. Тем не менее, по меньшей мере часть эффектов ФНО, включая разрушающее клетки действие ФНО и индукцию ΝΕ-кВ, может быть индуцирована с помощью обоих рецепторов. Эти свойства являются клеточноспецифическими. Рецептор р55 способен индуцировать разрушающее клетки действие или активацию ΝΕ-кВ во всех клетках, которые проявляют такие эффекты в ответ на ФНО. р75-К может обладать такими эффектами только в некоторых клетках. Другие, хотя и экспрессирующие в высокой степени р75-К, демонстрируют индукцию таких эффектов только в ответ на стимуляцию р55-К (УапбепаЬее1е е! а1., 1995). Помимо рецепторов ФНО, различные другие рецепторы семейства рецепторов ФНО/ФРН: СИЗО (МсИопаИ е! а1., 1995), СИ40 (ВегЬепсй е! а1., 1994; Та1шапасй-61гатб е! а1., 1993), бета рецептор лимфотоксина и, в некоторых типах клеток, Еак/ЛРО1 (Кепкшд-ЕЫ е! а1., 1995), также способны индуцировать активацию ΝΕ-кВ. Рецептор ИЛ-1 I типа, также эффективно стимулирующий активацию ΝΕ-кВ, участвует в большинстве эффектов рецепторов ФНО, несмотря на то, что он не подобен им по структуре.

Активация ΝΕ-кВ при антигенной стимуляции примированной клетки этих различных рецепторов происходит из-за индуцированного фосфорилирования их ассоциированных Ι-кВ молекул. Это фосфорилирование метит Ι-кВ для деградации, которая наиболее вероятно протекает в протеосоме. Природа киназы, которая фосфорилирует Ι-кВ, и ее механизм активации рецепторной стимуляции примированной клетки все еще не известны. Однако за последние 2 года был достигнут некоторый прогресс в зна нии, как идентифицировать три ассоциированных с рецептором белка, которые, как кажется, принимают участие в инициировании фосфорилирования (см. иллюстрацию в виде диаграмм на фиг. 2а и 6). Белок, называемый ΤΚΑΕ2, сначала клонированный Ό. Соеббе1 и его коллегами (Ко1йе е! а1., 1994), как кажется, играет центральную роль в ΝΕ-кВ-активации с помощью различных рецепторов семейства ФНО/ФРН. Белок, который при экспрессии в высокой степени может сам стимулировать активацию ΝΕкВ, связывается с активированным р75 ФНО-К (Ко1йе е! а1., 1994), бета рецептором лимфотоксина (Мок1а1ок е! а1., 1995), СИ40 (Ко!йе е! а1., 1995а) и СИ-30 (неопубликованные данные) и опосредуют с их помощью индукцию ΝΕ-кВ. ΤΚΑΕ2 не присоединяется ни к рецептору р55 ФНО, ни к Рак/АРО1, однако, он может связываться с р55 рецептор-ассоциированным белком, называемым ΤΚΑΌΌ, и ΤΒΑΌΌ обладает способностью связываться с Рак/АРО 1ассоциированным белком, называемым МОКТТ (или ΕΑΌΌ -см. Во1бш е! а1. 1995Ь и 1996). Другой рецептор-взаимодействующий белок, называемый ΡΙΡ (см. §!апдет е! а1., 1995) тоже может взаимодействовать с ΤΚΑΕ2, а также с ΕΑ8/ΑΡ01, ΤΡΑΌΌ, рецептором р55 ФНО и МОКТ-Т Таким образом, несмотря на то, что К1Р ассоциирован с индукцией клеточной цитотоксичности (клеточная гибель), его способность взаимодействовать с ΤΚΑΕ2 также вовлекает его в активацию ΝΕ-кВ и он также может служить, кроме того, для усиления взаимодействия ΕΑ§/ΑΡО1, МОРГИ, рецептора р55 ФНО и ΤΒΑΌΌ с ΤΚΑΕ2 путем, приводящим к активации ΝΕ-кВ. Эти ассоциации, как кажется, позволяют рецептору р55 ФНО и Εак/ΑΡО1 стимулировать активацию ΝΕ-кВ (Нки е! а1., 1995; Во1бш е! а1., 1995, СЫппа1уап е! а1., 1995; Уаг£о1ошееу е! а1., 1996; Нки е! а1., 1996). Стимуляция активации ΝΕ-кВ с помощью рецептора ИЛ-1 протекает независимо от ΤΚΑΕ2 и может включать недавно клонированный ИЛ-1 рецептор-ассоциированный белок-киназу, называемый ΙΚΑΚ (СгоКоп е! а1., 1995).

По какому механизму действует ΤΚΑΕ2, не ясно. Некоторые цитоплазматические молекулы, которые связывают ΤΚΑΕ2, были идентифицированы (Ко!йе е! а1., 1994; Ко!йе е! а1., 1995Ь). Однако информация об этих молекулах не дает какого либо ключа относительно пути, с помощью которого ΤΚΑΕ2, который сам не обладает какой-либо ферментной активностью, вызывает фосфорилирование Ι-кВ. Также пока еще нет информации о механизмах, определяющих клеточно-специфический след активации ΤΚΑΕ2 с помощью различных рецепторов, таких как наблюдались для индукции ΝΕ-кВ с помощью двух ФНО рецепторов.

В дополнение к вышеуказанному, из различных ΤΚΑΕ белков, необходимо также отме5 тить, что ТКАЕ2 связывается с р55 (СБ 120а) и р75 (СБ120Б) ФНО рецепторами, а также с некоторыми другими рецепторами семейства рецепторов ФНО/ФРН, либо непосредственно, либо опосредованно через другие адаптерные белки, как указано выше, например, с отсылкой к ΡΑ8/ΑΡΟ1 рецептору, и адаптерные белки МОК.Т-1, ТРАББ и Κ1Ρ. Как таковой, ТКАР2 является определяющим для активации ΝΡ-кВ (см. также \Уа11ас11. 1996). Однако ТКАР3 действительно ингибирует активацию ΝΡ-кВ с помощью некоторых рецепторов семейства ФНО/ФРН (см. КоФе е! а1., 1995а), тогда как ТКАБ6 необходим для индукции ΝΡ-кВ с помощью ИЛ-1 (см. Сао е! а1, 1996а).

Соответственно, что касается ΝΡ-кВ активации и ее значения в поддержании жизнеспособности клетки, различные внутриклеточные пути, включенные в эту активацию, прежде не были ясно объяснены, например, как включены различные ТКАБ белки, непосредственно или опосредованно.

Более того, как известно сейчас в отношении различных членов семейства рецепторов ФНО/ФРН и их ассоциированных внутриклеточных сигнальных путей, включая различные адаптерные медиатор/модуляторные белки, (см. краткие обзоры и ссылки, например, в параллельных израильских патентных заявках тех же заявителей 114615, 114986, 115319, 116588), ФНО и ΡΑ8/ΑΡΟ1 лиганд, например, могут оказывать как полезное, так и пагубное действия на клетки. ФНО, например, вносит вклад в иммунную защиту организма против опухолей и инфекционных агентов и способствует выздоровлению от поражений путем индуцирования лизиса опухолевых клеток и клеток, инфицированных вирусом, усиливая антибактериальную активность гралуноцитов, и, таким образом, в этих случаях желателен ФНО-индуцированный лизиз клеток. Однако избыток ФНО может быть вредным и известно, что как таковой ФНО играет основную патогенную роль в ряде заболеваний, таких как септический шок, анорексия, ревматические заболевания, воспаление и реакции гость-против-хозяина. В таких случаях ФНО-индуцированный лизиз клеток не желателен. Лиганд ΡΑ8/ΑΡΟ1, например, также обладает желательными и вредными эффектами. Этот лиганд ΡΑ8/ΑΡΟ1 индуцирует посредством его рецептора лизинг аутореактивных Т клеток в процессе созревания Т клеток, например, лизис Т клеток, которые распознают аутоантигены в процессе их развития и поэтому предотвращают аутоиммунные заболевания. Далее, различные злокачественные клетки и ВИЧ инфицированные клетки несут рецептор ΡΑ8/ΑΡΟ1 на их поверхности и могут, поэтому, быть разрушены активацией этого рецептора его лигандом или специфичными к ним антителами, и вследствие этого активацией внутрикле точных путей клеточной гибели (апоптоз), опосредованных этим рецептором. Однако рецептор ΡΑ8/ΑΡΟ1 может опосредовать вредные эффекты, например, неконтролируемый лизис ткани, который наблюдается при некоторых заболеваниях, таких как острый гепатит, что сопровождается разрушением клеток печени.

С точки зрения вышеуказанного, а именно того, что рецепторы семейства ФНО/ФРН могут индуцировать пути клеточной гибели с одной стороны и могут индуцировать пути выживания клеток (посредством индукции ΝΡ-кВ) с другой стороны, как кажется, существует хорошее равновесие, внутриклеточно, между этими двумя противоположными путями. Например, когда желательно достигнуть максимальной деструкции раковых клеток или других инфицированных или больных клеток, было бы желательно иметь ФНО и/или ΡΑ8/ΑΡΟ1 лиганд, индуцирующий только путь клеточной гибели без индуцирования ΝΡ-кВ. Следовательно, когда желательно защитить клетки, такие как, например, при воспалении, реакциях «гость против хозяина», остром гепатите, было бы желательно блокировать индукцию клеточного лизиса ФНО и/или ΡΑ8/ΑΡΟ1 лиганда и повысить, вместо этого, их индукцию ΝΡ-кВ. Подобным образом, в некоторых патологических случаях было бы желательно блокировать внутриклеточные сигнальные пути, опосредованные с помощью рецептора р75 ФНО и рецептора ИЛ-1, тогда как в других случаях было бы желательно усилить эти внутриклеточные пути.

Недавно заявителями была выделена киназа, называемая ΝΙΚ (патентные заявки Израиля 117800, 119133 и ΑΟ 97/37016), которая способна к связыванию с 'ΓΚΑΡ2 и непосредственно вовлечена в реакции фосфорилирования, приводящие к индукции активации ΝΡ-кВ.

Кроме того, недавно был выделен ряд каспаз (каспазы) в большом числе исследований (включая настоящих заявителей (см. одновременно поданную израильскую патентную заявку тех же заявителей 1Ь 120759)), которые взаимодействуют с выше отмеченными адаптерными белками (например, ΜΟΚ'Γ-1/ΡΑΌΌ) или с комплексами между адаптерными белками и различными рецепторами семейства рецепторов ФНО/ФРН и которые осуществляют протеолитические реакции, приводящие к апоптозной клеточной гибели. Таким образом, прямая модуляция этих каспаз была бы желательной в ситуациях, отмеченных выше, когда желательно ингибировать или усилить клеточную гибель, например, когда желательно ингибировать клеточную гибель, было бы желательно ингибировать активность этих каспаз. Относительно этого было сообщено (см. обзор в НоГтапп е! а1., 1997), что существует область, называемая продоменом, у многих этих каспаз, которая также представлена в ряде адаптерных белков, таких

Ί как, например, ΚΑΙΌΌ (которые взаимодействуют с Я1Р, ΤΚΆΌΌ и, таким образом, с МОЯТ1/ΡΆΌΌ, р55-ФНО-Я и РА8/АРО1), адаптерный белок пути клеточной гибели; и с-ΙΑΡΙ, С-1АР2, два белка, которые, как кажется, являются ингибиторами апоптозы и которые сами взаимодействуют с ТЯАР2, и, таким образом, могут быть ингибиторами каспаз или, напротив, могут стимулировать включение ТЯАР2 в путь клеточного выживания, приводящий к индукции ΝΡ-кВ активации. Как таковой, этот продомен был также обозначен как САЯО капсазный рекрутинговый домен (см. НоРтапп с1 а1., 1997). Данный продомен (САЯО), следовательно, представляет другую цель для модуляции внутриклеточных сигнальных путей, ассоциированных с индукцией клеточной гибели.

Кроме того, недавно было описано (см. обзор Уапд и Когатсусг, 1996) другое семейство белков, названное семейством белков ВСЬ2, в котором белки ВСЬ2, их гомолог ВСЬ-Х, включая две его формы, являющиеся ВСЬ-Хь и альтернативно сплайсированные ВСЬ-Х₃, МСЬ1, А1, ВАК, ВАО, ВАО1, ВАХ, аденовирус Е1В19к и белок СаепогйаЬбШк с1сдап5 (С. с1сдап5) СЕО-9 - все являются членами. Среди этих белков наблюдалось, что ВСЬ2, ВСЬ-Хь, Е1В-19к и СЕО-9 действуют с целью ингибирования апоптоза, или для защиты против апоптоза, индуцированного с помощью различных внутриклеточных сигнальных путей (см. Уапд и Когатсусг, 1996). ВСЬ2 и ВСЬ-Хь являются также, очевидно, внутриклеточными мембранно-связанными белками, локализированными по отношению к митохондриям, а также к гладкой эндоплазматической сети, и перинуклеарной мембране, при этом С-концы этих белков, имеют сигнальную якорную последовательность, ответственную за их нацеливание и проникновение во внешнюю митохондриальную мембрану и другие указанные выше внутриклеточные мембраны. После того как заякоренные в различных внутриклеточных мембранах белки ВСЬ2 и ВСЬ-Хь доступны по отношению к цитозолю, они могут взаимодействовать с различными другими внутриклеточными белками.

Все еще не совсем понятно, как ВСЬ2, ВСЬ-Хь, Е1В-19к и СЕО-9 защищают клетки, но ясно, что их действие, очевидно выше эффекторов клеточной гибели, являющихся различными каспазами, указанными выше, такими как, например, 1СЕ и 1СЕ-подобные протеазы семейства 1СЕ/СЕО-3, включая СРР32/Уата, 1СЕ-БАР3 (Мей3), 1СН-1 и другие. В действительности, было обнаружено, что СЕО-9 является специфичным ингибитором С.с1сдаи8 протеазных эффекторов гибели СЕО-3 и СЕО-4, а ВСЬ2, очевидно, является ингибитором 1СН-1 (называемым также ΝΒΟΟ2), в частности, формы 1СН1ь, которая способствует клеточной гибели. Таким образом, пока точный механизм ингибирования апоптоза с помощью ВСЬ2, ВСЬ-Хь,

СЕО-9 и Е1В-19к не ясен, он, очевидно, выше 1СЕ-СЕО-3 протеаз, которые являются эффекторами гибели (см. обзор Уапд и Когатсусг, 1996, а также С1шша1уап с! а1., 1996).

Что касается других членов семейства ВСЬ2, указанных выше, то ВАХ является промотером клеточной гибели. ВАХ связывается сам с собой и в форме таких ВАХ гомодимеров он способствует апоптозу. ВАХ также связывается с ВСЬ2 и ВСЬ-Хь, и такие гетеродимеры связаны с защитным действием ВСЬ2 против апоптоза. Таким образом, равновесие между количествами гомодимеров ВАХ/ВАХ и гетеродимеров ВАХ/ВЬС2 определяет, будут ли клетки восприимчивы к апоптозу или же они будут защищены против апоптоза. ВАХ, очевидно, является также внутриклеточным мембранносвязанным белком, также локализованным в большой степени к внешней митохондриальной мембране (относительно вышеуказанного ВАХ см. также обзор Уапд и Когатсусг, 1996). Далее, указанные выше белки ВАК и ВАО также действуют как негативные регуляторы активности ВСЬ2 и ВСЬ-Хь, а именно, они подавляют способность ВСЬ2 и ВСЬ-Хь защищать клетки от апоптоза. Полагают, что и ВАК и ВАО связывают ВСЬ2 и ВСЬ-Хь и таким образом предохраняют ВАХ от связывания с ВСЬ2 и ВСЬ-Хь, что приводит к увеличению количеств гомодимеров ВАХ/ВАХ и, следовательно, увеличению клеточной гибели (см. обзор Уапд и Когатсусг, 1996). В этом отношении также понятно, что действию ВАК по блокированию подавляющей гибель активности ВСЬ2 и ВСЬ-Хь непосредственно в виде гетеродимеров ВАК/ВСЬ2 и ВАК/ВСЬ-Хь не свойственна способность защищать клетки от апоптоза. Кажется, что ВАО действует больше как конкурирующий ингибитор для связывания ВАХ с ВСЬ2 и ВСЬ-Хь, так как ВАО может заменить ВАХ из гетеродимеров ВАХ/ВСЬ2 и ВАХ/ВСЬ-Хь, таким образом обеспечивая увеличение количества гомодимеров ВАХ/ВАХ, способствующих гибели. Хотя, ВАК также, как кажется, является внутриклеточным мембранным связывающим белком, локализованным по отношению, кроме других, к митохондриальным внешним мембранам, ВАО, однако, очевидно лишен мембранной якорной последовательности и по существу не является белком, связывающим мембраны (см. обзор Уапд и Когатсусг, 1996).

Другим из вышеуказанных членов семейства ВСЬ2 является ВАС1 (см. Уапд и Когатсусг, 1996) который представляет собой позитивный модулятор активности ВСЬ2, приводящий к усилению защитной активности ВСЬ2 против апоптоза и даже обеспечивающий для ВСЬ2 защитную активность против апоптоза в клетках, индуцированных к воздействию апоптоза с помощью сигналов, обычно не подавляемых с помощью ВСЬ2.

Можно также отметить, что вышеуказанная альтернативно сплайсированная форма ВСЬ-Хь, а именно, белок ВСЬ-Хд, также является антагонистом активности ВСЬ-Хь и ВСЬ2 и блокирует их защитную активность против апоптоза (см. также обзор Уаид и Когзшсусг. 1996).

В свете вышеуказанного ясно, что семейство белков ВСЬ2 играет роль в регулировании путей клеточной гибели или клеточного выживания внутриклеточно, а смещение в равновесии от белков этого семейства, которые активно блокируют апоптоз, к тем, которые способствуют апоптозу или ингибируют противоапоптозную активность, может приводить к усилению клеточной гибели, и, подобным образом, смещение в равновесии другого пути может приводить к усилению клеточного выживания.

Следовательно, когда требуется усилить клеточную гибель путем усиления апоптоза в клетках в условиях, указанных выше, было бы желательно блокировать активность ВСЬ2, ВСЬ-Хь и других членов этого семейства, которые подавляют или ингибируют апоптоз, или усилить активность ВАХ, ВАК, ВАИ, ВС’Ь-Хз и других членов этого семейства, которые способствуют апоптозу или ингибируют антиапоптозную активность ВСЬ2 или ВСЬ-Хь. Аналогично, когда желательно увеличить клеточное выживание в клетках путем уменьшения апоптоза, было бы желательно увеличить активность ВСЬ2, ВСЬ-Хь и других членов этого семейства, которые подавляют или ингибируют апоптоз, или уменьшить активность апоптозных промотеров этого семейства, как указано выше.

Объектом настоящего изобретения являются новые белки, включая их изоформы, аналоги, фрагменты или производные, которые способны модулировать внутриклеточные сигнальные пути, ведущие к воспалению, клеточной гибели или клеточному выживанию, и эта модуляция возможна через продомен (САКЭ) различных каспаз или через киназные домены различных киназ, вовлеченных в ΝΡ-кВ активацию. Поэтому такие новые белки по данному изобретению могли бы, вероятно, быть прямыми модуляторами каспазной активности (путь клеточной гибели) и/или ΝΡ-кВ активации посредством киназной активности (путь клеточного выживания). Аналогично, новые белки по изобретению, вероятно, являются опосредованными модуляторами внутриклеточной биологической активности множества других белков, вовлеченных в воспаление, пути клеточной гибели или клеточного выживания (например, РА8/АРО1, р55 ФНО-К, р75 ФНО-К, ИЛ-1-К, МОКТ-1, ТКАИИ, К1Р, ТКАР2, ΝΙΚ и другие). Аналогично, эта модуляция, вероятно, может осуществляться путем прямого или опосредованного взаимодействия с членами семейства белков ВСЬ2, новые белки по изобретению мо гут модулировать активность ВСЬ2 или других белков этого семейства и, в этом смысле, новые белки по изобретению могут быть опосредованными модуляторами различных каспаз, которые, в свою очередь, модулированы членами семейства белков ВСЬ2.

Другим объектом изобретения являются антагонисты (например, антитела, пептиды, органические соединения или даже некоторые изоформы) по отношению к вышеуказанным новым белкам, включая их изоформы, аналоги, фрагменты и производные, которые могут быть использованы для ингибирования воспаления, клеточной гибели или сигнальных процессов выживания, когда желательно.

Следующим объектом изобретения является применение вышеуказанных новых белков, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных для выделения и характеристики дополнительных белков или факторов, которые могут быть вовлечены в регулирование воспаления, путей клеточной гибели или клеточного выживания и влияния на их активность, и/или для выделения и идентификации других рецепторов или других клеточных белков в сигнальных процессе(ах) ранее или позднее, с которыми эти новые белки, их аналоги, фрагменты и производные связаны, и, следовательно, в действие которых они также вовлечены.

Еще одним объектом изобретения являются ингибиторы, которые могут быть введены в клетки для связывания или взаимодействия с новыми белками и их возможными изоформами, которые могут действовать для подавления воспаления, процессов клеточной гибели или выживания, когда желательно.

Более того, объектом настоящего изобретения является использование вышеуказанных новых белков, их изоформ и аналогов, фрагментов и производных в качестве антигенов для получения поликлональных и/или моноклональных антител. Антитела, в свою очередь, могут быть использованы, например, для очистки новых белков из различных источников, таких как клеточные экстракты или трансформированные клеточные линии.

Далее, эти антитела могут быть использованы для диагностических целей, например, для идентификации возможных заболеваний, связанных с неправильным функционированием клеточных эффектов, опосредованных напрямую с помощью каспаз, киназ, белков, принадлежащих к семейству ВСЬ2, или белков ТКАР, или опосредованных с помощью рецептора ΤΝΡ р55, РА8/АР01 рецептора, или других родственных рецепторов и ассоциированных с ними клеточных белков (например, РАГОЙ, МОКТ-1, ТКАЛИ, К1Р), которые действуют прямо или опосредованно для модуляции/опосредования внутриклеточных процессов посредством взаимодействия с белками ТКАР, каспазами, киназами или членами семейства белков ВСЬ2.

Следующим объектом изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие вышеуказанные новые белки, их изоформы или аналоги, фрагменты или производные, а также фармацевтические композиции, содержащие вышеуказанные антитела или другие антагонисты.

Сущность изобретения

В соответствии с настоящим изобретением был выделен новый белок, обозначенный В1, (первоначально обозначенный СВК «С-1АРсвязывающая киназа», благодаря наличию некоторой гомологии с с-1АР. см. пример 1 ниже, но, здесь и далее называемый «В1»), который имеет область продомена САКЭ, киназный домен и промежуточную область между вышеуказанными доменами САКЭ и киназы, и, следовательно, возможно, вовлечен в модуляцию воспаления, путей клеточной гибели и клеточного выживания, как подробно описано далее. Как также объяснено здесь ниже, модуляция с помощью В1 путей клеточной гибели или выживания может быть позитивной (нарастающей/ усиливающей) или негативной (ингибиторной), в зависимости от типа внутриклеточных белков с которыми он взаимодействует.

Соответственно, настоящее изобретение относится к молекуле ДНК, кодирующей белок В1 с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 3А, способный модулировать внутриклеточные каскады воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, прямо или косвенно ассоциируясь с другими внутриклеточными модуляторами или медиаторами указанных каскадов, а также фрагменты и варианты указанной ДНК, полученные на основе вырожденности генетического кода.

Примеры вышеуказанной последовательности ДНК по изобретению включают (ί) последовательность ДНК, выбранную из группы, включающей (a) последовательность кДНК, производную кодирующей области нативного белка В1;

(b) фрагмент последовательности (а), который кодирует биологически активный белок, способный к модуляции воспаления, путей клеточной гибели или клеточного выживания, или того и другого;

(c) последовательность ДНК, способную гибридизироваться последовательность (а) или (Ь) в умеренно жестких условиях и которая кодирует биологически активный белок В1, аналог или фрагмент, способные к модуляции внутриклеточного воспаления, путей клеточной гибели или клеточного выживания, или того и другого;

(б) последовательность ДНК, которая является вырожденной в результате генетического кода на последовательности ДНК, определенную в (а)-(с), и которая кодирует биологически активный белок В1, аналог или фрагмент, способные к модуляции путей клеточного воспале ния, клеточной гибели или клеточного выживания, или того и другого;

(ίί) последовательность ДНК, как указано выше, содержащую по меньшей мере часть последовательности, изображенной на фиг. 3, и кодирующую по меньшей мере один активный белок В1, изоформу, аналог или фрагмент;

(ίίί) последовательность ДНК, как указано выше, кодирующую белок В1, изоформу, аналог или фрагмент, имеющую по меньшей мере часть аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 3.

В другом аспекте изобретение относится к вектору, содержащему описанную молекулу ДНК или ее фрагмент по изобретению, который может быть экспрессирован в клетках-хозяевах, выбранных из прокариотических и эукариотических клеток; и к штаммам трансформированных эукариотических и прокариотических клеток-хозяев, содержащих указанный вектор.

Следуя другому аспекту изобретения, предложен белок В1, его изоформы, фрагменты, функциональные аналоги и производные, кодированные последовательностью ДНК по изобретению, как указано выше, где указанные белок, его изоформы, фрагменты, аналоги и производные, возможно, способны модулировать внутриклеточное воспаление, пути клеточной гибели или клеточного выживания, или то и другое, непосредственно или опосредованно, путем ассоциации с другими внутриклеточными модуляторами или медиаторами этих путей.

Примером белка по изобретению является белок В1, способный модулировать внутриклеточные каскады воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, прямо или косвенно ассоциируясь с другими внутриклеточными модуляторами или медиаторами указанных каскадов, кодируемый молекулой ДНК по п.1 или 2, а также его фрагменты и варианты.

Изобретение также относится к способу получения белка В1 или его фрагментов или вариантов по п.8 или 9, предусматривающему культивирование штамма трансформированных клеток-хозяев по п.6 или 7 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного белка с возможной посттрансляционной модификацией и выделением указанного белка.

В следующем аспекте изобретение относится к антителам или их активным фрагментам или производным, специфичным по отношению к белку В1 или его фрагменту или варианту по изобретению.

В следующем аспекте изобретение относится к различным способам модуляции внутриклеточных сигнальных путей, например, к следующим:

способ модуляции в клетках активности механизмов воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания или любого иного сигнального механизма, активность которого модулируется или опосредуется белком В1 или его фрагментом или вариантом по настоящему изобретению или молекулами, с которыми связывается или иным образом взаимодействует указанный белок В1 или его фрагмент или вариант, причем указанный способ предусматривает введение в указанные клетки указанного белка В1 или его фрагмента или варианта в виде, приемлемом для их внутриклеточного введения, или экспрессирующего вектора, содержащего молекулу ДНК, кодирующую указанные белок В1 или его фрагмент;

способ, как описан выше, где указанная обработка указанных клеток осуществляется трансфекцией указанных клеток рекомбинантным вектором на основе вируса животного, содержащим также молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), способный связываться со специфичным рецептором на поверхности указанных клеток; способ модуляции в клетках механизмов воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, активность которых модулируется или опосредуется белком В1 по настоящему изобретению, а на поверхности указанных клеток экспрессирован белок В1 или его фрагмент или вариант, причем указанный способ предусматривает обработку указанных клеток фармацевтической композицией, содержащей антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, приготовленной в форме, пригодной для внеклеточного применения;

способ модуляции в клетках механизмов воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, активность которых модулируется или опосредуется белком В1 по настоящему изобретению, имеющим внутриклеточную локализацию, причем указанный способ предусматривает обработку указанных клеток фармацевтической композицией, содержащей антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, приготовленной в форме, пригодной для внутриклеточного применения; способ модуляции в клетках механизмов воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, активность которых модулируется или опосредуется белком В1 по настоящему изобретению, причем указанный способ предусматривает введение в указанные клетки рекомбинантного вируса на основе вируса животного, содержащего рибозимную последовательность, способную взаимодействовать в клетках с последовательностью мРНК, кодирующей белок В1 по настоящему изобретению, причем при экспрессии указанная рибозимная последовательность взаимодействует в указанных клетках с указанной мРНК и расщепляет ее, что приводит к ингибированию образования белка В1 в клетках.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение касается фармацевтической композиции для модуляции воспаления, клеточной гибели, клеточного выживания или других механизмов в клетках, которые модулируются непосредст венно или опосредованно белком В1 по настоящему изобретению, содержащая в качестве активного ингредиента белок В1 или его фрагмент или вариант по настоящему изобретению или их смеси.

Примером воплощения вышеуказанной фармацевтической композиции является композиция для модуляции воспаления, клеточной гибели, клеточного выживания или других механизмов в клетках, которые модулируются непосредственно или опосредованно белком В1 по настоящему изобретению, содержащая в качестве активного ингредиента вектор по настоящему изобретению, представляющий собой рекомбинантный вектор на основе вируса животного, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), способный к связыванию со специфичным рецептором на поверхности указанных клеток.

Следующим примером воплощения вышеуказанной фармацевтической композиции является композиция для профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с регуляцией апоптоза одной или несколькими молекулами, с которыми непосредственно или опосредованно связывается белок В1 по настоящему изобретению, причем указанная композиция содержит в качестве активного ингредиента белок В1 или его фрагмент или вариант по настоящему изобретению.

Еще одним примером воплощения вышеуказанной фармацевтической композиции является композиция для профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с регуляцией апоптоза одной или несколькими молекулами, с которыми непосредственно или опосредованно связывается белок В1 по настоящему изобретению, причем указанная композиция содержит в качестве активного ингредиента молекулу ДНК по настоящему изобретению или ее фрагмент или вариант.

Еще один аспект настоящего изобретения касается следующих методов скрининга и способов идентификации и получения различных лигандов:

способ скрининга лиганда, способного связываться с белком В1 по настоящему изобретению, предусматривающий взаимодействие носителя для афинной хроматографии, к которому присоединен указанный белок, с экстрактом анализируемых клеток в условиях, обеспечивающих связывание лиганда с указанным носителем, и элюцию, выделение и анализ указанного лиганда;

способ скрининга последовательности

ДНК, кодирующей лиганд, способный связываться с белком В1 по настоящему изобретению, предусматривающий использование дрожжевого двухгибридного метода, по которому последовательность, кодирующая указанный белок В1, переносится одним гибридным вектором, а последовательность из библиотеки кДНК или геномной ДНК переносится вторым гибридным вектором, трансформацию дрожжевых клеток-хозяев указанными векторами, выделение положительных трансформированных клеток и выделение указанного второго гибридного вектора с получением последовательности, кодирующей указанный лиганд;

способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую или опосредуемую белком В1 по настоящему изобретению, предусматривающий

a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, содержащим по меньшей мере часть белка В1, содержащую, по меньшей мере, некоторые аминокислотные остатки белка В1, приведенные на фиг. 3, которые включают в себя по существу весь продомен САКЭ (домен рекрутинга каспазы) белка В1;

b) идентификацию и характеристику лиганда, отличного от ВСЬ2, ТКАР2 или частей рецептора из семейства рецепторов ΤΝΒ/Ν6Ρ или других известных белков, содержащих продомен САКО, обладающих способностью к указанному связыванию по данным указанной стадии скрининга; и

c) получение указанного лиганда в существенно выделенной и очищенной форме;

a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, содержащим, по меньшей мере, карбоксиконцевую часть последовательности белка В1, приведенной на фиг. 3, включающую продомен САКЭ;

b) идентификацию и характеристику лиганда, отличного от ВСЬ2, ТКАР2 или частей рецептора из семейства рецепторов ΤΝΡ/Ν6Ρ или других известных белков, содержащих продомен САКЭ, обладающих способностью к указанному связыванию по данным указанной стадии скрининга; и

a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, содержащим, по меньшей мере, аминоконцевую часть последовательности белка В1, приведенной на фиг. 3, которая включает в себя по существу весь киназный домен белка В1;

b) идентификацию и характеристику лиганда, отличного от ВСЬ2, ТКАР2 или частей рецептора из семейства рецепторов ΤΝΡ/Ν6Ρ или других известных внутриклеточных модуляторных белков, обладающих способностью к указанному связыванию по данным указанной стадии скрининга; и

с) получение указанного лиганда в существенно выделенной и очищенной форме.

Другие аспекты изобретения станут понятными из следующего подробного описания изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показана диаграмма, иллюстрирующая структуру молекулы ТКАР2.

На фиг. 2 показана схематическая диаграмма, иллюстрирующая некоторые белки, вовлеченные в механизмы воспаления, клеточной гибели и клеточного выживания (ΝΡ-кВ активация).

На фиг. 3 (А, В) схематически показана установленная аминокислотная последовательность (А) белка В1 по настоящему изобретению и определенная кодирующая его нуклеотидная последовательность (В), где в аминокислотной последовательности показан киназный домен В1 (область в рамке на Ν-конце) и САКЭ домен В1 (подчеркнутая область на С-конце).

На фиг. 4 показан ΝογΙΙιογπ анализ экспрессии В1 в различных тканях человека, который показывает, что В1 экспрессирован в большинство типов тканей человека.

На фиг. 5 схематически показаны различные конструкции В1, исследованные на активность ΝΡ-кВ, потенциирование клеточной гибели и активацию ΡΝΚ.

На фиг. 6 показаны результаты измерения ΝΡ-кВ активации, осуществленные с различными конструкциями, представленными на фиг. 6 и в примере 3.

На фиг. 7 показаны результаты определения активации ΡΝΚ1, осуществленные с некоторыми из вышеуказанных конструкций.

На фиг. 8 показано, что В1 аутоассоциируется и связывает ТКАР1 ίη νίνο.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится в одном аспекте к новому белку В1, который имеет продомен или САКЭ домен (каспазный рекрутментный домен) и который содержит белковый киназный домен, подобный К1Р-киназному домену. Как таковой белок В1 по настоящему изобретению, вероятно, способен взаимодействовать с некоторыми внутриклеточными белками, вовлеченными в воспаление, пути клеточной гибели (апоптоз) и клеточного выживания (ΝΡкВ активация). Это взаимодействие может быть путем связывания различных белков или, с другой стороны, взаимодействием с ними через продомен (САКЭ), или оно может быть по пути активности киназного домена, или в одно и то же время может проходить взаимодействие обоих типов. Например, В1 может быть способен рекрутировать ряд белков, имеющих про домены (САКЭ) и затем фосфорилировать их через их киназный домен. Подобным образом, В1 может служить как «причаливающий» или рекрутментный белок посредством его продомена (САКО) для различных других продоменсодержащих белков, которые могут не быть субстратом для киназного домена В1, или В1 может взаимодействовать с различными белками только через его киназный домен, а не через его САКО домен.

Кроме того, как здесь подробно описано, результаты анализа связывания указывают, что новый белок В1 по изобретению вероятно способен связывать белок ВСЬ2. Это обнаружение увеличивает вероятность того, что белок В1 может быть регулятором активности ВСЬ2, особенно в отношении регуляции апоптоза. В первоначальных анализах биологической активности увеличивается также возможность того, что белок В1 может ингибировать защитный эффект ВСЬ2 в отношении апоптоза. Это по наблюдениям происходит из-за того, что белок В1 сам по себе не вызывает клеточную гибель, но действует для усиления клеточной гибели при добавлении к клеткам с другими индукторами клеточной гибели, такими как, например, РА8-К, р55 ФНО-К и К1Р (указанное добавление к клеткам путем сотрансформации с векторами, способными экспрессировать в клетки В1, РА8-К, р55 ФНО-К или К1Р, см. в примере 2 ниже). Следовательно, возрастает возможность того, что В1 может не действовать аналогичным путем на ВАХ или ВАК, которые со своей стороны, в виде гомодимеров могут вызывать клеточную гибель (см. раздел «Предпосылки изобретения» выше), но скорее, В1 вероятно может действовать аналогичным путем на ВАО, который служит для негативной регуляции ВСЬ2 путем связывания ВСЬ2 и предупреждения его связывания с ВАХ или ВАК, таким образом приводя к более свободной ВАХ и/или ВАК, которые, в свою очередь, вызывают снижение клеточной гибели (см. раздел «Предпосылки изобретения» выше).

Более того, что касается к вышеуказанной ΝΡ-кВ активации и клеточного выживания, В1 вероятно может также достигать наблюдаемой активности в увеличении клеточной гибели по пути, возможно, вызывающему уменьшение ΝΡкВ активации, может быть по пути киназной активности В1, которая, вероятно, может служить для модуляции различных белков (например, ΝΙΚ), необходимых для индукции активации ΝΡ-кВ, с тем результатом, что будет протекать уменьшенная ΝΡ-кВ активация, следовательно, будет уменьшено клеточное выживание. В этом отношении интересно отметить, что, когда В1 добавляют с индукторами клеточной гибели, такими как РА8-К, р55 ФНО-К или К1Р, он увеличивает их активность клеточного лизиса. Известно, что как р55 ФНО-К, так и РА8-К, и, возможно, также К1Р, помимо индуцирования путей клеточной гибели, при котором кульминационным моментом является повышение каспазной активности, также индуцируют ΝΡ-кВ активацию, которая, в некоторой области, сводит на нет индуцированную клеточную гибель. В некоторых клетках наблюдалось даже, что ФНО не убивает клетки, что присуще индукции активации ΝΡ-кВ с помощью рецепторов ФНО, а не счет нарушения этими рецепторами коиндуцированных путей клеточной гибели, таким образом, что в этих клетках ΝΡ-кВ опосредованные пути выживания клеток являются явно более активными, чем пути клеточной гибели. Таким образом, блокированием ΝΡ-кВ индукции можно было бы увеличить клеточный лизис, опосредованный, например, ΡΛ8-Κ р55 ФНО, К1Р, а белок В1 по изобретению, вероятно, может выполнять эту функцию и вызывать наблюдаемое увеличение клеточной гибели, при его добавлении к ΡА§-К, р55-ФНО-К или К1Р.

С точки зрения вышеуказанного, ясно, что В1, вероятно, может различным путем регулировать процессы воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, и может даже делать это одновременно. Например, В1, вероятно, может ингибировать ΝΡ-кВ активацию, или В1, вероятно, может даже действовать на другие внутриклеточные белки, вовлеченные в пути клеточной гибели или клеточного выживания, независимо от его возможного действия на ΝΡкВ или в дополнение к его возможному действию на ΝΡ-кВ.

Следовательно, оказывается, что В1 может обладать способностью модулировать широкую область внутриклеточных белков, в частности, таких, которые вовлечены в воспаление, пути клеточной гибели и клеточного выживания. Как подробно описано далее, ряд известных внутриклеточных белков имеют продомены (САКО), такие как, например, различные каспазные ферменты, вовлеченные в протеолитическую деструкцию клеток (путь клеточной гибели), включая 1СЕ, 1СН-1, Мейб и другие, а также различные адаптерные белки, также вовлеченные в пути клеточной гибели, включая КА1О0, с1АР1, С-1АР2 и другие. Таким образом В1, вероятно, может взаимодействовать непосредственно или опосредованно с различными каспазами через их общие САКО и поэтому, вероятно, модулировать их активность. Эта модуляция может быть позитивной, а именно, В1 может, вероятно, служить для концентрирования различных каспаз и поэтому повышает их протеолитическую активность, приводящую к увеличению клеточной гибели. Далее, В1 был выделен, используя последовательность с-1АР1, и В1 разделяет гомологию с с-1АР1, который сам по себе является ингибитором апоптоза. с-1АР1 имеет продомен (САКО) и может ингибировать апоптоз путем рекрутментных каспаз, преду преждая таким образом их активность. В1 может, вероятно, поэтому взаимодействовать непосредственно или опосредованно с с-ΙАР 1 и приводить к подавлению ингибирования им апоптоза, приводя таким образом к усилению клеточной гибели. Более того, В1, вероятно, может опосредованно или непосредственно взаимодействовать с различными каспазами через их САКЭ, может также моделировать их путем фосфорилирования через его киназный домен, и таким путем В1 может усиливать каспазную активность.

Более опосредованным образом, В1, вероятно, способен взаимодействовать опосредованно или непосредственно с адаптерными белками, такими как КА1ББ, с-1АР1, С-1АР2 и другими, имеющими САКЭ, поэтому, вероятно, может взаимодействовать с другими белками в более начальных стадиях воспаления, путей клеточной гибели и клеточного выживания. Например, РА1ББ взаимодействует с другими внутриклеточными белками, такими как К1Р и ТКАББ через общие гибельные домены, которые, в свою очередь, взаимодействуют с белками, такими как МОКТ-1, р55-ФНО-К и РА8-К. Таким путем, вероятно, взаимодействуя с КА1ББ, В1 таким образом, возможно, опосредованно присоединен к этим гибельэффекторным рецепторам и белкам. Подобным образом с-1АР1 и С-1АР2 взаимодействуют с белком ТК.АТ2, который, в свою очередь, взаимодействует с р75-ФНО-К и с МОКТ-1, р55ФНО-К и РА8-К через взаимодействие между ТКАР2 и К1Р, а также ТКАББ. Соответственно, В1, вероятно, может быть опосредованным модулятором процессов клеточной гибели, будучи опосредованно присоединенным к вышеуказанным адаптерным белкам, эффекторным белкам и рецепторам. Эта опосредованная модуляция может быть позитивной, например, она может приводить к усилению клеточной гибели.

Более того, благодаря тому, что В1, возможно, способен взаимодействовать, по меньшей мере, опосредованно (через с-1АР1) с ТКАР2, возрастает вероятность вовлечения В1 в путь клеточного выживания, который связан с индукцией ΝΤ-κΒ активации. В настоящее время известно, что ТКАР2 связывается непосредственно с ΝΙΚ (Майши с1 а1., 1997), который непосредственно вовлечен в индукцию ΝΤ-кВ активации и, таким образом, клеточное выживание. Соответственно, ввиду способности модулировать ТКАР2 опосредованно, В1 может быть также способен модулировать пути клеточного выживания. Далее, благодаря своему киназному домену В1, возможно, способен даже более непосредственно быть вовлеченным в МАР киназный путь (которому следует ΝΙΚ), приводящим к индукции ΝΤ-кВ активации и клеточного выживания. Однако, как указано выше, с точки зрения того факта, что В1 приво дит к усилению клеточной гибели, может быть, что В1 играет негативную роль в модуляции процесса клеточного выживания, а именно, В1, вероятно, может модулировать ТКАР2, или В1, вероятно, может быть непосредственно вовлечен в МАР киназный путь, но, таким образом, что приводит к уменьшению ΝΤ-кВ активации.

Также возможно, что В1 играет центральную роль в модуляции внутриклеточных сигнальных путей, в частности, воспаления, путей клеточной гибели и клеточного выживания, и как таковой В1 может служить для модуляции этого таким образом, что может сдвинуть равновесие от индукции клеточного выживания до индукции клеточной гибели в соответствии с наблюдаемым (см. пример 2) усиливающим действием В1 на индукцию клеточной гибели. Поэтому В1 может быть рассмотрен как «модулятор внутриклеточной сигнальной» активности непосредственно или опосредованно на различных компонентных белках, создающих эти пути.

Поэтому, рассматривая возможные различные терапевтические применения В1, важно понять, что во всех случаях В1 может играть разнообразные роли, а именно, он может усилить процессы клеточной гибели, и в то же время, вероятно, может активно ингибировать индукцию ΝΤ-кВ и, следовательно, ингибировать путь клеточного выживания, или, в зависимости от действительных белков/ферментов, с которыми связывается В1, и их относительных количеств в клетке, В1 может, вероятно, в некоторых клетках, действовать как ингибитор путей клеточного выживания и, в других, может, вероятно, действовать как усилитель путей клеточной гибели путем подавления ингибиторов клеточной гибели.

Следовательно, обычно, как будет ясно из следующего, когда желательно усилить клеточную гибель, например, в опухолях, ВИЧ инфицированных клетках и тому подобное, возможно, использование В1 для достижения этой цели. Например, В1 может быть введен в клетки непосредственно или для повышения экспрессии В1 в клетки может быть введена молекула ДНК, кодирующая В1.

Подобным образом, в ситуациях, когда желательно защитить клетки от клеточной гибели, индуцированной ФНО или РА8-лигандом, например, при различных воспалениях, аутоиммунных заболеваниях, реакциях «трансплантат против хозяина» и тому подобное, и вместо этого промотировать клеточное выживание, тогда для достижения этой цели, вероятно, могут быть использованы антагонисты В1. Например, могут быть введены антагонисты В1, такие как антиВ1 антитела, олигонуклеотиды, имеющие антисмысловые последовательности В1, рибозимы с В1 последовательностями, или различные пептиды или органические молекулы, предназна21 ченные специально для ингибирования активности В1.

Следовательно, когда здесь указываются применения В1, они могут быть в терминах модуляторного действия В1 на различные внутриклеточные процессы или заболевания, и следует учесть с точки зрения вышеуказанного, что эта модуляция может быть позитивной (усилитель), как в случае, когда рассматриваются пути клеточной гибели, или негативной (ингибитор), как в случае, когда рассматриваются пути выживания клеток.

Настоящее изобретение также относится к ДНК последовательностям, кодирующим биологически активные белки В1, а также к ДНК последовательностям, кодирующим их биологически активные аналоги, фрагменты и производные, и к белкам В1, аналогам, фрагментам и производным белков, кодированных последовательностями ДНК. Получение таких аналогов, фрагментов и производных осуществляют обычными способами (см., например, ЗатЬгоок с1 а1., 1989), по которым в ДНК кодирующих последовательностях один или несколько кодонов могут быть удалены, добавлены или замещены на другие, с получением кодированных аналогов, имеющих по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка по отношению к нативному белку. Приемлемыми аналогами являются такие, которые сохраняют, по меньшей мере, продомен (САКЭ) или киназный домен В1 или, по меньшей мере, активные части любого или обоих этих доменов, вместе или без опосредования любого другого связывания или ферментной активности, например, не связываются или иным образом не взаимодействуют, непосредственно или опосредованно, с последующим белком или другим фактором далее, или не катализируют сигнал-зависимую реакцию (например, киназную реакцию). Таким образом, могут быть получены аналоги, которые обладают так называемым доминант-негативным эффектом, а именно, аналог, который является дефективным либо при связывании, либо при взаимодействии иным образом с другими белками через продомен, или в последующем сигнале (вероятно, также киназная активность) сопровождающим такое связывание, как указанно выше. Такие аналоги могут быть использованы, например, для модуляции воспаления, путей клеточной гибели или выживания, как указано выше, путем конкурирования с природными белками В1. Подобным образом, могут быть получены так называемые доминантпозитивные аналоги, которые могли бы служить для усиления действия В1. Они могли бы иметь те же или улучшенные присущие В1 связывающие свойства по отношению к другим белкам и те же самые или улучшенные сигнальные свойства или киназную активность природных белков В1. Аналогичным образом биологически активные фрагменты клонов по изобретению могут быть получены, как указано выше, относительно получения аналогов. Подходящими фрагментами последовательностей ДНК по изобретению являются такие, которые кодируют белок или полипептид, сохраняя способность В1 связываться с другими белками, или которые могут опосредовать любое другое связывание или ферментную (киназную) активность, как указано выше. Соответственно, могут быть получены фрагменты кодированных белков по изобретению, которые обладают доминантнегативным или доминант-позитивным действием, как указано выше относительно аналогов. Подобным образом, производные могут быть получены обычными модификациями боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков белков, их аналогов или фрагментов, или конъюгацией белков, их аналогов или фрагментов с другой молекулой, например, антителом, ферментом, рецептором и т.д., как это хорошо известно в данной области.

Что касается вышеуказанных последовательностей ДНК по изобретению, которые кодируют белок В1, изоформу, аналог, фрагмент или производное, в качестве примера воплощения по изобретению включены также последовательности ДНК, способные к гибридизации с последовательностью кДНК, полученной из кодирующей области нативного белка В1, где такая гибридизация осуществляется в средне жестких условиях, и где гибридизуемые последовательности ДНК кодируют биологически активный белок В1. Эти гибридизуемые ДНК последовательности, следовательно, включают последовательности ДНК, которые обладают относительно высокой гомологией по отношению к нативной кДНК последовательности В1, и как таковые представляют В1-подобные последовательности, которые могут быть, например, производными природных последовательностей, кодирующими различные изоформы белка В1, или встречающимися в природе последовательностями, кодирующими белки, относящиеся к группе В1-подобных последовательностей, кодирующих белок, имеющий активность белков В1. Далее, эти последовательности могут также, например, включать не природные, полученные синтетическим путем последовательности, которые подобны кДНК последовательности нативного белка В1, но включают ряд желаемых модификаций. Такие синтетические последовательности, следовательно, включают все возможные последовательности, кодирующие аналоги, фрагменты и производные белков В1, все имеющие активность белка В1.

Для получения различных вышеуказанных природных белок В1-подобных последовательностей, могут быть использованы стандартные методы скрининга и выделения образцов природно-производных ДНК или РНК из различных тканей, используя кДНК природного белка

В1 или ее часть в качестве зонда (см., например, стандартные методы, представленные ЗатЬгоок е! а1., 1989).

Таким же образом для получения вышеуказанных различных синтетических белок В1подобных последовательностей, кодирующих аналоги, фрагменты или производные белка В1, может быть использован ряд стандартных методов, как это подробно описано далее в отношении получения таких аналогов, фрагментов и производных.

Полипептид или белок, по существу соответствующие белку В1, включают не только белок В1, но также полипептиды или белки, которые являются аналогами белка В1.

Аналогами, которые по существу соответствуют белку В1, являются такие полипептиды, в которых одна или несколько из аминокислот аминокислотной последовательности белка В1 заменена другой аминокислотой, удалена и/или включена, при условии, что полученный белок проявляет по существу такую же или большую биологическую активность в качестве белка В1, которому он соответствует.

С целью соответствия по существу белку В1, изменения в последовательности белков В1, такие как изоформы, являются обычно относительно незначительными. Хотя ряд изменений может быть больше, чем десять, предпочтительно имеется не более десяти изменений, более предпочтительно, не более пяти, и наиболее предпочтительно, не более трех таких изменений. Поскольку могут быть использованы любые методы для обнаружения потенциально биологически активных белков, которые по существу соответствуют белкам В1, одним таким методом является использование общеизвестных способов мутагенеза на ДНК, кодирующей белок, приводящим к небольшим модификациям. Белки, экспрессированные такими клонами, могут затем быть подвергнуты скринингу на их способность присоединяться к различным другим белкам, имеющим, например, продомены (САКЭ), связывающие киназу сайты, или к самому В1, и модулировать активность этих других белков или самих В1 при модуляции/опосредовании вышеуказанных внутриклеточных путей.

Консервативными изменениями являются такие изменения, от которых нельзя ожидать изменения активности белка, и обычно являются первыми для целей скрининга, так как они не предполагают по существу изменение размера, заряда или конфигурации белка, и поэтому не предполагают изменение их биологических свойств.

Консервативные заместители белков В1 включают аналог, где по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде консервативно заменен другой аминокислотой. Такие замещения предпочтительно осуществляют в соответствии со следующим списком, как представлено в табл. 1А, где заместители могут быть определены обычным экспериментом для обеспечения модифицированных структурных и функциональных свойств синтезированной полипептидной молекулы, при сохранении характеристик биологической активности белка В1.

Таблица1А

Первоначальный остаток	Пример замещения
А1а	О1у; Зег
Агд	Бук
Акп	О1п; Н1к
Акр	О1и
Сук	Зег
С1п	Акп
О1и	Акр
О1у	А1а; Рго
Н1к	Акп; О1п
11е	Беи; Уа1
Ьеи	11е; Уа1
Бук	Агд; О1п; О1и
Ме!	Беи; Туг; 11е
РЬе	Ме!; Беи; Туг
Зег	ТЬг
ТЬг	Зег
Тгр	Туг
Туг	Тгр; РЬе
Уа1	11е; Беи

Альтернативно, другая группа замещений в белке В1 представляет собой такую, в которой по крайней мере один аминокислотный остаток в полипептиде удаляли и на его место вставляли другой остаток в соответствии со следующей табл. 1В. Типы замещений, которые могут быть проделаны в полипептиде, могут быть основаны на анализе частоты аминокислотных замен в гомологичном белке различных видов, таких, которые представлены в табл. 1-2 ЗсНшх е! а1., О.Е., Рг1пс1р1ез οί Рго!ет З!гис!иге ЗрппдегУебад, Ыете Уогк, ΝΥ, 1798 и рис. 3-9 СгещЫоп. Т.Е., РгсИетк: З!гис!иге апб Мо1еси1аг Ргорегйек, XV.Н. Ргеетап & Со., Зап Егапаксо, СА 1983. Основываясь на таком анализе, альтернативные консервативные замещения определены здесь как замены внутри одной из следующих пяти групп:

Таблица 1В

1. Небольшие алифатические, неполярные или частично полярные остатки: А1а, Зег, ТЬг (Рго, О1у);

2. Полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды: Акр, Акп, О1и, О1п;

3. Полярные, положительно заряженные остатки: Н1к, Агд, Бук;

4. Большие алифатические неполярные остатки: Ме!, Ьеи, Н1к, Уа1 (Сук); и

5. Большие ароматические остатки: РЬе, Туг, Тгр.

Три аминокислотных остатка в круглых скобках, указанные выше, имеют специальные назначения в белковой архитектонике. С1у является единственным остатком, не имеющим никакой боковой цепи, и поэтому сообщает цепи гибкость. Он, однако, способствует образованию вторичной структуры, иной, чем α-спираль. Рго, из-за своей необычной геометрии, сильно сдерживает цепь и, обычно, способствует образованию структуры складчатого β-слоя, несмотря на то, что в некоторых случаях Сук может быть способен к участию в формировании дисульфидной связи, которая является важной в укладке белка. Отметим, что 8ο1ιι.ι1ζ с1 а1., кирга, объединил бы группы 1 и 2, указанные выше. Отметим также, что Туг, из-за его способности образовывать водородные связи, имеет значительное сродство к 8ег и Т11Г. и тому подобное.

Консервативные аминокислотные замещения, согласно настоящему изобретению, например, указанные выше, являются известными в своей области, и, как можно предположить, после аминокислотных замещений сохраняют биологические и структурные свойства полипептида. Большинство делеций и замещений, в соответствии с настоящим изобретением, являются такими, которые не производят радикальных замен в характеристиках белка или полипептидной молекулы. Термин характеристики служит для определения неспецифическим образом обоих изменений во вторичной структуре, например, α-спирали или β-слоя, а также изменений в биологической активности, например, связывания с другими белками с продоменами (САКЭ) или киназной активности и/или модуляции путей клеточной гибели или выживания, как указано ниже.

Примеры осуществления аминокислотных замещений в белках, которые могут быть использованы для получения аналогов белков В1 для использования по настоящему изобретению, включают любые известные стадии метода, такие как представлены в патентах США КЕ 33653, 4959314, 4588585 и 4737462, Магк е! а1., 5116943, Ко!йк е! а1., 4965195, Матеи е! а1.; 4879111, Сйоид е! а1.; и 5017691, Ьее е! а1.; и замещенные лизином белки представлены в патенте США № 4904584 (8йате е! а1.).

Помимо консервативных замещений, рассмотренных выше, которые не могли бы значительно изменить активность белка В1, к области данного изобретения относятся либо консервативные замещения, либо менее консервативные и более случайные изменения, которые ведут к увеличению биологической активности аналогов белков В1.

Когда должен быть определен точный эффект замещения или делеции, специалисту в данной области понятно, что действие замещения(ий), делеции(й) и тому подобное, будет оценено обычными анализами связывания и клеточной гибели. Скрининг, использующий такое стандартное исследование, не включает чрезмерное экспериментирование.

На генетическом уровне эти аналоги обычно получают путем сайт-направленного мутагенеза нуклеотидов ДНК, кодирующей В1 белок, вследствие чего получают ДНК, кодирующую аналог, и после чего синтезируют ДНК и экспрессируют полипептид в рекомбинантных клеточных культурах. Аналоги обычно проявляют ту же самую или повышенную качественную биологическую активность, что и природные белки, АикиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЬйеайопк апб \УПеу 1п!егке1епее, Ыете Уогк, ΝΥ, 1987-1995; 8атЬгоок е! а1., Мо1ееи1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ, 1989.

Получение В1 белка в соответствии со здесь указанным, или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей тот же полипептид, но отличающейся от природной последовательности благодаря изменениям, обусловленным известным вырождением генетического кода, может быть осуществлено с помощью сайт-специфичного мутагенеза ДНК, которая кодирует ранее полученный аналог или нативную версию белка В1. Сайт-специфичный мутагенез позволяет получать аналоги посредством использования специфичных олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК желаемой мутации, а также достаточное число смежных нуклеотидов, для обеспечения праймерной последовательности достаточного размера и вариабельности последовательностей для образования стабильного дуплекса на обоих сайтах соединения делеций, которые пересекают. Обычно, праймер, содержащий от около 20 до 25 нуклеотидов по длине, является предпочтительным, при этом он имеет от около 5 до 10 комплементирующих нуклеотидов на каждой изменяемой последовательности. Обычно методика сайт-специфичного мутагенеза хорошо известна в данной области, как показано на примерах в публикациях, таких как Абе1тап е! а1., ΌΝΑ 2:183 (1983), описание которой включено здесь в качестве ссылки.

Как будет понятно, в методе сайтспецифичного мутагенеза обычно используется вектор фага, который существует как в одноцепочечном и двухцепочечном виде. Типичные векторы, используемые в сайт-направленном мутагенезе, включают векторы, такие как фаг М13, например, как описано Мекктд е! а1., ТЫгб С1еуе1апб 8утрокшт оп Масгото1еси1ак апб КееотЬтапк ОМА, Ебйог А. Уа1!оп, Е1кеу1ег, Атк!егбат (1981), содержание включено здесь в качестве ссылки. Эти фаги коммерчески легко доступны и их использование обычно широко известно специалисту в данной области. Альтернативно, плазмидные векторы, которые содержат одноцепочечное фаговое начало репли кации (Уейа е! а1., Ме111. Επζνιηοΐ. 153:3, 1987), могут быть использованы для получения одноцепочечной ДНК.

Обычно сайт-направленный мутагенез в соответствии со здесь указанным осуществляют получением сначала одноцепочечного вектора, который включает в свою последовательность последовательность ДНК, которая кодирует релевантный полипептид. Олигонуклеотидный праймер, несущий желаемую мутированную последовательность, получают синтетически с помощью автоматизированного синтеза ДНК/олигонуклеотида. Этот праймер затем отжигают одноцепочечным вектором, содержащим белковую последовательность, и подвергают воздействию ДНК-полимеризующих ферментов, таких как фрагмент полимеразы I К1еηο\ν. Е. сой для завершения синтеза несущей мутацию цепи. Поэтому, мутированная последовательность и вторая цепь несут желаемую мутацию. Этот гетеродуплексный вектор используют затем для трансформации подходящих клеток, таких как клетки Е. сой 1М101, и выбирают клоны, которые включают рекомбинантные векторы, несущие мутированную структуру последовательности.

После выбора такого клона мутированная последовательность белка В1 может быть удалена и помещена в соответствующий вектор, обычно вектор переноса или экспрессии такого вида, который может быть использован для трансфекции соответствующего хозяина.

Соответственно, ген или нуклеиновая кислота, кодирующие белок В1, также могут быть установлены, получены и/или модифицированы ίη νίΐτο, ίη κίΐιι и/или ίη νίνο, при использовании известных методов амплификации ДНК или РНК, таких как РСК и олигонуклеотидный химический синтез. РСК подходит для амплификации (повышение числа) конкретных последовательностей ДНК с помощью повторных реакций полимеразных ДНК. Эта реакция может быть использована в качестве замещения при клонировании; все что требуется - это знание последовательности нуклеиновых кислот. С целью проведения РСК, конструируют праймеры, которые являются комплементарными по отношению к интересующей последовательности. Праймеры затем генерируют с помощью автоматизированного синтеза ДНК. Поскольку праймеры могут быть сконструированы для гибридизации в любой части гена, могут быть созданы такие условия, что несоответствия в комплементарном основном спаривании могут быть толерантными. Амплификация этих неподходящих областей может приводить к синтезу продуктов мутагенеза, что в результате ведет к созданию пептида с новыми свойствами (например, сайтнаправленный мутагенез). См. также, например, АикиЬе1, кирга, Сй. 16. Также, путем связывающего комплементарного синтеза ДНК (кДНК), используя обратную транскрипта зу, с РСК, в качестве исходного материала может быть использована РНК для синтеза внеклеточного домена пролактинового рецептора без клонирования.

Далее, РСК праймеры могут быть предназначены для включения новых сайтов рестрикции или других признаков, таких как концевые кодоны на концах генного сегмента, подвергаемого амплификации. Это размещение сайтов рестрикции на концах 5' и 3' амплифицированной генной последовательности позволяет генным сегментам, кодирующим белок В1 или его фрагмент, быть специально сконструированным для лигирования других последовательностей и/или клонирующих сайтов в векторах.

РСК и другие способы амплификации РНК и/или ДНК хорошо известны в данной области и могут использоваться согласно настоящему изобретению без излишнего экспериментирования, основываясь на исследованиях и описании, представленным здесь. Известные способы амплификации ДНК или РНК включают, но не ограничиваются этим, полимеразно-цепную реакцию (РСК) и связанные процессы амплификации (см., например, патенты США №№ 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, МиШк е! а1.; 4795699 и 4921794, ΤаЬο^ е! а1.; 5142033, Ιηηίκ; 5122464 \νί1κοη е! а1.; 5091310, Ιηηίκ; 5066584, ОуИешйеп е! а1.; 4889818, ОеМапб е! а1.; 4994370, 81кег е! а1.; 4766067, Βικννικ; 4656134, Ρίη^οΐά; и Ιηηίκ е! а1., ебк., РСК Рю^ток: А Ошбе !ο Ме11юб, анб АррИстю^) и РНК опосредованную амплификацию, при которой используется антисмысловая РНК по отношению к целевой последовательности в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США N 5130238, Ма1ек е! а1., с торговой маркой ΝΛ8ΒΛ); и иммуно-РСК, которая объединяет использование амплификации ДНК с мечением антитела (К^юка е! а1., Саенсе 260:487 (1993); 8 а ηο е! а1., 8с1еисе 258:120 (1992); 8агю е! а1., Вю!есйтдие8 9:1378 (1991)), полное содержание этих патентов и ссылок включено здесь в качестве ссылок.

Аналогичным способом, биологически активные фрагменты В1 или его изоформы могут быть получены, как указано выше, в отношении аналогов белков В1. Подходящими фрагментами белков В1 являются такие, которые по крайней мере сохраняют относящуюся к продомену связывающую способность или киназную активность, и которые могут прямо или опосредованно опосредовать биологическую активность различных других белков или внутриклеточных путей, ассоциированных с В1 белками. Соответственно, могут быть получены фрагменты белка В1, которые имеют доминант-негативный или доминант-позитивный эффект, как указано выше, в отношении аналогов. Следует отметить, что эти фрагменты представляют особый класс аналогов по изобретению, а именно, они представляют собой части белков В1, полученные из полной последовательности белка В1, где каждая такая часть или фрагмент обладает какойлибо вышеуказанной активностью. Таким фрагментом, например, может быть пептид.

Аналогично, производные могут быть получены стандартными модификациями боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков белка В1, его аналогов или фрагментов, или конъюгацией белка В1, его аналогов или фрагментов, с другой молекулой, например, антителом, ферментом, рецептором и т.п., хорошо известными в этой области. Соответственно, термин «производные», как здесь используется, охватывает производные, которые могут быть получены из функциональных групп, которые представлены в виде боковых цепей на остатках или на Ν- или С-концевых группах с помощью средств, известных в этой области способом, включены в данное изобретение. Производные могут иметь химические группы, такие как углеводные или фосфатные остатки, при условии, что такая фракция имеет такую же или более высокую биологическую активность, чем у белка В1.

Например, производные могут включать алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп взаимодействием с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильными производными или свободными аминогруппами аминокислотных остатков, образованных с ацильными группами (например, алканоильные или карбоциклические ароильные группы) или Оацильными производными свободных гидроксильных групп (например, их серильные или треонильные остатки), образованные с ацильными группами.

Термин «производные» предназначен для включения только таких производных, которые не меняют одну аминокислоту на другую из двадцати обычно встречающихся основных аминокислот.

Белок В1 представляет собой белок или полипептид, т.е. последовательность аминокислотных остатков. Предполагается, что полипептид, состоящий из большей последовательности, которая включает полную последовательность белка В1 в соответствии с данным здесь определениями, считается таким полипептидом до тех пор, пока эти дополнения не влияют на основные или новые характеристики изобретения, т. е. если они либо сохраняют, либо повышают биологическую активность белка В1, или может быть расщеплен для удаления белка или полипептида, имеющего биологическую активность белка В1. Так, например, настоящее изобретение предполагает включение гибридных белков белка В1 с другими аминокислотами или пептидами.

Новые белки В1, их аналоги, фрагменты и производные обладают рядом возможных применений, как указано выше и далее, например (ί) Они могут быть использованы для модуляции путей клеточного выживания посредством прямой или опосредованной модуляции внутриклеточных белков, с которыми они связываются. В ситуации, где усиленная активность этих путей не желательна, т.е. желательно ингибировать их в сторону усиления путей клеточной гибели, например, так, как при противоопухолевом или иммуностимулирующем применении, тогда желательно, чтобы эта модуляция с помощью В1, его изоформ, аналогов, фрагментов или производных являлась ингибиторной. В этом случае, белки по изобретению, их аналоги, фрагменты или производные, когда они являются ингибиторами путей клеточного выживания, могут быть введены в клетки стандартными способами, известными рег §е. Например, так как белки, кодированные клонами ДНК по изобретению, являются внутриклеточными, и их следует вводить только в клетки, где это требуется, необходима система для специфичного введения этих белков в клетки. Одним путем осуществления этого является создание рекомбинантного вируса животного, например, вируса, производного вируса коровьей оспы, в ДНК которого будут введены следующие два гена: ген, кодирующий лиганд, который связывается с белками на поверхности клеток, которые специфически экспрессированы клетками, например такие, как белок др 120 вируса СПИД (ВИЧ), который специфически связывается с некоторыми клетками (СИ4 лимфоциты и связанные с ними лейкозы), или какой-либо иной лиганд, который специфически связывается с клетками, несущими известный рецептор, такой, чтобы рекомбинантный вирусный вектор мог связывать такие клетки; и ген, кодирующий белки по данному изобретению. Таким образом, экспрессия поверхностно-клеточносвязывающего белка на поверхности вируса будет целью вируса, специфичного по отношению к опухолевой клетке или другой клетке, несущей рецептор, после чего белки, кодирующие последовательности, будут введены в клетку посредством вируса, и после экспрессии в клетках, будут ингибировать пути клеточного выживания, приводящие к желательной клеточной гибели или иммуностимулирующему эффекту в этих клетках. Конструирование такого рекомбинантного вируса животного осуществляют обычными способами (смотри, например, 8атЬгоок е! а1., 1989). Другой возможностью является введение последовательностей кодированных белков в виде олигонуклеотидов, которые могут быть абсорбированы клетками и там экспрессированы.

Аналогично, когда белки В1, изоформы, аналоги, фрагменты или производные стимулируют или иначе усиливают процессы клеточной гибели, тогда они также могут быть введены в клетки, как указано выше, для усиления проти31 воопухолевого, иммуностимулирующего или другой активности клеточной гибели.

(ίί) Они могут быть использованы для усиления или прибавления путей клеточного выживания или, например, в случаях, таких как повреждение тканей при СПИДе, септическом шоке или реакции отторжения «трансплантат против хозяина», в которых желательно блокировать пути клеточной гибели или стимулировать пути клеточного выживания. В этой ситуации возможно в случае, когда белки В1 действительно ингибируют процессы клеточного выживания или стимулируют, или иначе увеличивают пути клеточной гибели, например, введение в клетки стандартными способами олигонуклеотидов, имеющих антисмысловую кодирующую последовательность для белков В1 по изобретению, которые могли бы эффективно блокировать трансляцию мРНК, которые кодируют белки и таким образом блокируют их экспрессию и ведут к ингибированию нежелательного эффекта (клеточная гибель). Такие олигонуклеотиды могут быть введены в клетки с использованием вышеуказанных рекомбинантных вирусных подходов, при этом вторая последовательность, которую несет вирус, является олигонуклеотидной последовательностью.

Вторая возможность представляет собой использование антител, специфичных для белков по изобретению, для ингибирования их внутриклеточной сигнальной активности.

Еще одним путем ингибирования нежелательного эффекта является недавно разработанный рибозимный подход. Рибозимы представляют собой каталитические РНК молекулы, которые специфически расщепляют РНК. Рибозимы могут быть спроектированы для расщепления мишеневой РНК по выбору, например мРНК, кодирующей белки В1 по изобретению. Такие рибозимы имели бы иметь последовательность, специфичную для мРНК белков и могли бы взаимодействовать с ними (комплементарное связывание) с последующим расщеплением мРНК, в результате получая уменьшение (или полную потерю) экспрессии белков, при этом уровень сниженной экспрессии зависит от уровня экспрессии рибозимов в клеткемишени. Для введения рибозимов в клетки по выбору (например, такие, которые несут последовательность белков В1), может быть использован любой подходящий вектор, например, плазмидный вектор, векторы вируса животного (ретровирус), которые обычно используются для этой цели (смотри также (ί) выше, где вирус содержит в качестве второй последовательности кДНК кодирующую рибозимную последовательность по выбору). (Обзоры, методы и т. д. в отношении рибозим, смотри СНсп е! а1., 1992; Ζΐιηο апк Р1ск, 1993).

(ΐϊϊ) Они могут быть использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков, которые способны к связыванию с ними, например, других белков, вовлеченных во внутриклеточное воспаление, пути клеточной гибели или клеточного выживания. Например, ДНК последовательности, кодирующие белки по изобретению, могут быть использованы в дрожжевой двухгибридной системе, в которой кодированные белки будут использоваться как «приманка» для выделения, клонирования и идентификации из библиотек кДНК или геномных ДНК других последовательностей («ргеуз») кодирующих белки, которые могут связываться с клонами белков. Таким же образом, может быть также определено, могут ли белки по изобретению связываться с другими клеточными белками, например, другими рецепторами ФНО/ФРН надсемейства рецепторов, или другими членами семейства ВСЬ2.

(ίν) Кодированные белки, их аналоги, фрагменты или производные также могут быть использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков того же класса, т.е. имеющих продомены (САКИ) или киназные домены, или для функционально родственных белков, и вовлеченных во внутриклеточные сигнальные процессы. В данной заявке может быть использована вышеуказанная дрожжевая двухгибридная система или может быть использована недавно разработанная система, использующая не точную 8ои!йегп гибридизацию с последующим клонированием РСК (\УИкз е! а1., 1989).

(ν) Еще одним подходом к использованию кодированных белков по изобретению, их аналогов, фрагментов или производных является использование их в методах аффинной хроматографии, для выделения и идентификации других белков или факторов, с которыми они могут связываться, например, белков, имеющих отношение к белкам В1, или других белков, или факторов, вовлеченных во внутриклеточный сигнальный процесс. В этой заявке белки, их аналоги, фрагменты или производные по изобретению могут быть индивидуально присоединены к матриксам аффинной хроматографии и затем приведены в контакт с клеточными экстрактами или выделенными белками или факторами, предположительно вовлеченными во внутриклеточный сигнальный процесс. В соответствии с методом аффинной хроматографии другие белки или факторы, которые связываются с белками, их аналогами, фрагментами или производными по изобретению, могут быть элюированы, выделены и охарактеризованы.

(νί) Как указано выше, белки, их аналоги, фрагменты или производные по изобретению могут быть также использованы как иммуногены (антигены) для получения специфичных к ним антител. Эти антитела могут быть также использованы для очищения белков по изобретению либо от клеточных экстрактов, либо от трансформированных клеточных линий, продуцирующих их, их аналоги или фрагменты. Далее эти антитела могут быть использованы для диагностических целей при идентификации заболеваний, связанных с патологическим функционированием рецепторных систем или воспалением, путей клеточной гибели или выживания, в которых они функционируют. Таким образом, такие заболевания должны быть связаны со сбоями в работе сигнальной системы, включающей белки по изобретению, такие антитела могли бы служить важным диагностическим инструментом. Термин «антитело» подразумевает включение поликлональных антител, моноклональных антител (ιηΑό). химерных антител, анти-идиотипных (анти И) антител в антитела, в которых может быть введена метка, в растворенном или связанном виде, а также их фрагментов, таких как, например, ЕаЬ и Е(аЬ')₂фрагменты, лишенные Ес фрагмента интактного антитела, которые способны к связыванию антигена.

(νίί) Антитела, включая фрагменты антител, использованные в изобретении, могут быть использованы для количественного или качественного определения клонов по изобретению в образце или для определения наличия клеток, которые экспрессируют клоны по изобретению. Это может быть осуществлено иммунофлуоресцентными методами, используя флуоресцентно меченое антитело, связанное с определением методами световой микроскопии, цитометрии потока или флуорометрического определения.

Антитела (или их фрагменты), использованные по изобретению, могут быть применены гистологически, как в иммунофлуоресцетной или иммуноэлектронной микроскопии для ίη δίΐιι определения клонов по изобретению. Ιη δίΐιι определение может быть выполнено путем отбора гистологического образца у пациента и введение таким образом меченого антитела по изобретению. Антитело (или фрагмент) предпочтительно вводят путем нанесения или перекрывания меченого антитела (или фрагмента) биологического образца. Посредством применения такого способа, возможно, определить не только присутствие клонов, но также их распределение на исследуемой ткани. При использовании настоящего изобретения специалист в данной области легко определит, что любой из большого разнообразия гистологических способов (такой, как способ окрашивания) может быть модифицирован для достижения такого ίη 81!и определения.

Такие анализы для клонов по изобретению обычно включают инкубацию биологического образца, такого как биологическая жидкость, экстракт ткани, свежехарвестированные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были инкубированы в культуре ткани, в присутствии определяемо меченого антитела, способного к идентификации кодированных белков, и обнаружение антитела любы ми методами, хорошо известными в этой области.

(νίίί) Кодированные белки по изобретению также могут быть использованы в качестве опосредованных модуляторов ряда других белков благодаря их способности связываться с остальными внутриклеточными белками, где другие внутриклеточные белки прямо связываются с еще другими внутриклеточными белками или еще другим внутриклеточным доменом трансмембранного белка.

В целях модуляции этих других внутриклеточных белков или внутриклеточных доменов трансмембранных белков, белки по изобретению могут быть введены в клетки различными путями, как указано здесь выше в (ί) и (ίί).

Следует также отметить, что выделение, идентификация и характеристика белков по изобретению могут быть выполнены любым, хорошо известным стандартным скрининговым методом. Например, один из этих скрининговых методов, дрожжевой двухгибридный метод, был использован для идентификации белков по изобретению. Аналогично, могут быть использованы другие методы, такие как аффинная хроматография, методы ДНК гибридизации, и т. п., а также хорошо известные в этой области, для выделения, идентификации и характеристики белков по изобретению, или для выделения, идентификации и характеристики дополнительных белков, факторов, рецепторов и т.п., которые способны связываться с белками по изобретению.

Более того, белки, связывающиеся с белками по изобретению, сами могут быть использованы аналогичным образом, путем, по которому использовали белки по изобретению, как указано выше и далее, для выделения, идентификации и характеристики других белков, факторов и тому подобное, которые способны к связыванию со связывающимися белками по данному изобретению и которые могут представлять факторы, вовлеченные далее в ассоциированные сигнальные процессы, или которые могут обладать их сигнальной активностью и, следовательно, могли бы представлять белки, вовлеченные в отдельные сигнальные процессы.

ДНК последовательности и кодированные белки по изобретению могут быть получены любым стандартным способом рекомбинантной ДНК (смотри, например, 8атЬгоок, е! а1., 1989), в котором подходящие эукариотические или прокариотические клетки-хозяева трансформированы соответствующими эукариотическими или прокариотическими векторами, содержащими кодирующие белки последовательности. Соответственно, настоящее изобретение также касается таких векторов экспрессии и трансформированных клеток-хозяев для получения белков по изобретению. Как указано выше, эти белки включают также их биологически активные аналоги, фрагменты и производные и, та35 ким образом, векторы, кодирующие их, включают также векторы, кодирующие аналоги и фрагменты этих белков, и трансформированные клетки-хозяева включают такие, которые продуцируют такие аналоги и фрагменты. Производные этих белков представляют собой производные, полученные стандартной модификацией белков или их аналогов, или фрагментов, продуцированные трансформированными клетками-хозяевами.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям для модуляции воздействий, опосредованных В1. Фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента любое одно или несколько из следующих: (ί) одну или несколько последовательностей ДНК по изобретению, или их части, субколонированные в соответствующий вектор экспрессии, (ίί) белок по изобретению, его биологически активные фрагменты, аналоги, производные или их смесь, (ш) рекомбинантный вектор вируса животного, кодирующий белок по изобретению, его биологически активные фрагменты, аналоги или производное.

Фармацевтические композиции применяют в соответствии с заболеванием, которое подвергают лечению, и в количестве наилучшем для пациента, в зависимости от веса тела и других параметров, которые определяет лечащий врач.

Как указано выше, В1 может быть, вероятно, опосредованным модулятором ТКАБ2, и как таковой, он, вероятно, может быть вовлечен в ΝΡ-кВ активацию через ТВΛΡ2-NIΚ взаимодействие. Таким образом, В1, вероятно, играет роль в путях клеточного выживания таким образом, что ТКАБ2 действует независимо или в сочетании с другими белками (например, р55 ФНО и р75 ФНО рецепторами, ΡА§/ΛРО1 рецептором, МОКТ-1, К1Р и ТКАОП). В этом отношении обнаружена важность создания лекарств, которые могут усиливать или ингибировать ТКАБ2ΝΙΚ взаимодействие, как желательно. Например, когда необходимо увеличить клеточную цитотоксичность, индуцированную ФНО, было бы желательно ингибировать ΝΡ-кВ индукцию путем ингибирования ТВАРТ-ИК взаимодействия или путем избирательного ингибирования ТВАРГ и/или ΝΙΚ. Аналогично, например, когда желательно ингибировать клеточную цитотоксичность, индуцированную ФНО, было бы желательно увеличить ΝΡ-кВ индукцию путем усиления ТВΛΡ2-NIΚ взаимодействия или путем усиления ТКАГ^- и/или ΝΙΚ-специфичной ΝΡ-кВ индукции. Существует много заболеваний, при которых такие лекарства могут быть очень полезны. Среди прочих, (смотри также обсуждение выше), острые гепатиты, при которых острое поражение печени, по-видимому, отражает ΡА§/ΛРО1 рецептор опосредованную гибель клеток печени с последующей индукцией Ραδ лигандом; аутоиммунно индуцированную клеточную гибель, такую как гибель β клеток Лангерганса поджелудочной железы в результате диабета; клеточную гибель при отторжении трансплантата (например, почки, сердце и легкие); гибель олигодендроцитов в мозге при рассеянном склерозе; и СПИД-ингибированное Тклеточное «самоубийство», которое является причиной пролиферации вируса СПИДа и, следовательно, заболевания СПИДом.

В таких случаях было бы желательно ингибировать опосредованный ΡА§/ΛРО1 рецептором путь клеточной цитотоксичности (апоптоз) и увеличить опосредованную ΡА§/ΛРО1 рецептором индукцию ΝΡ-кВ посредством ТКАΡ2 и ТВΛΡ2-NIΚ взаимодействия. Одним из путей осуществления этого могло бы быть повышение количества ΝΙΚ в клетках или повышение количества ТКА^Т и ΝΙΚ так, что ΝΙΚ- или ТВΛΡ2-NIΚ опосредованная индукция ΝΡ-кВ активации увеличила бы обеспечение более высоких уровней ΝΡ-кВ активации и, следовательно, клеточного выживания; или так, чтобы прямое или непрямое взаимодействие между ΡА§/ΛРО1 рецептором и ТВΛΡ2 (или ТКАΡ2-NIΚ) усилилось бы, приводя к уменьшению ΡА§/ΛРО1 рецепторного взаимодействия с медиаторами клеточной цитотоксичности (например, МАСН, см. схему на фиг. 2) для обеспечения повышения индукции ΝΡ-кВ активации и клеточного выживания.

Наоборот, в случае, например, опухолей и инфицированных клеток (смотри также обсуждение выше) было бы желательно повысить опосредованную ΡА§/ΛРО1 рецептором клеточную цитотоксичность для повышения клеточной гибели. В этом случае было бы желательно ингибировать взаимодействие рецептор-ТКАΡ2 (или -ТВΛΡ2-NIΚ) и/или прямо ингибировать ΝΙΚ, и, таким образом, снизить индукцию ΝΡ-кВ активности.

Так как В1 белок по изобретению, вероятно, может взаимодействовать с ТКА^Т, то можно усилить или блокировать это взаимодействие и, таким образом, усилить или ингибировать активность ТКА^Т, в частности, взаимодействие ТКАГ^ с ΝΙΚ и ассоциированную индукцию ΝΡ-кВ активации. Усиление или ингибирование взаимодействия между В1 и ТКАГ^, вероятно, может быть прямым или через другие белки (например, с4АР1, С4АР2), которые связываются с ТКА^Т и которые, возможно, взаимодействуют с В1 прямо или опосредованно. Таким образом, сосредоточив внимание на белке В1 и модулируя его возможное взаимодействие (прямое или опосредованное) с ТВΛΡ2, возможно также модулировать активность ТКА^Т и, таким образом, эффекты ΡА8/АРО1 (ΡА8-К), а также р55-ФНО-К, как указано выше.

Так же, как указано выше, В1 вероятно может действовать прямо на медиаторы клеточной гибели, а именно на различные каспазные ферменты, протеолитическая активность которых ведет к клеточной гибели. Соответственно, вышеуказанные эффекты ΡΆ8/ΆΡΘ1 (ΡΆδ-К) или р55 ФНО-К могут быть модулированы прямо или опосредованно В1 через В1 возможную модуляцию каспаз (например, МАСН и другие), которые ассоциированы с р55 ФНО-К, ЕА8-К или связывающим его белком МОКТ-1 и которые, очевидно, осуществляют апоптозные реакции, опосредованные таким образом. Так, если В1 взаимодействует с такими каспазами путем, который усиливает их активность, то такое взаимодействие следует увеличить, когда желательна клеточная гибель, как указано выше, или следует ингибировать, когда клеточная гибель нежелательна, как указано выше.

Таким образом, с точки зрения вышеуказанного, различные вещества, такие как пептиды, органические соединения, антитела и т. п. могут быть отобраны для получения конкретных лекарств, которые способны ингибировать возможное взаимодействие между В1 и различными другими белками, когда такое взаимодействие нежелательно. Такими лекарствами, вероятно, были бы такие, которые специфически распознают продомен (САКЭ) В1, например, пептиды, органические молекулы, антитела или фрагменты антител, которые специфически связываются с В1 САКЭ и препятствуют его взаимодействию с другими САКЭ-содержащими белками. Наоборот, когда такое взаимодействие между В1 и другими белками желательно, тогда оно может быть усилено увеличением количеств В1 в клетках стандартными методами, указанными в (ί) выше. Здесь также можно подобрать различные конкретные лекарства, которые могут усиливать активность В1 внутриклеточно, или усилить его взаимодействие с другими белками.

Кроме того, как указано выше, В1 также имеет киназный домен, который может быть вовлечен в его модуляторные эффекты воспаления, пути клеточной гибели или выживания. Соответственно, этот киназный домен может служить для связывания и фосфорилирования различных белков и в связи с этим повышать или снижать их активность, и таким образом повышать или снижать активность воспаления, пути клеточной гибели или клеточного выживания, в зависимости от ситуации. Соответственно, различные белки, органические соединения, антитела и т.п., могут быть подобраны для получения конкретных лекарств, которые могут ингибировать киназную активность В1, когда это желательно, либо для ингибирования, либо для усиления воспаления, путей клеточной гибели или выживания.

Не ограничивающие примеры того, как пептидные ингибиторы В1 взаимодействуют с другими белками через его продомен или киназный домен, как указано выше, разработаны и подобраны на основе предшествующих исследований по пептидным ингибиторам 1СЕ или 1СЕ-подобных протеаз, на субстратной специфичности 1СЕ и стратегиях для эпитопного анализа с использованием пептидного синтеза. Как обнаружено, минимальным требованием к эффективному расщеплению пептида с помощью 1СЕ, должно быть включение четырех аминокислот слева от сайта расщепления при сильном предпочтении аспарагиновой кислоты в Р₁ положении и с метиламином, расположенным справа относительно Р₁ положения (Ыеа111 е! а1., 1990; Но\\'агб е! а1., 1991; ТйогпЬепу е! а1., 1992). Кроме того, пептид - флуорогенный субстрат (тетрапептид) ацетил-Акр-61и-Уа1-Акр-а-(4метилкумарил-7-амид), сокращенно Ас-ЭЕУЭАМС, соответствует последовательности в поли (АДФ-рибоза) полимеразе (РАКР), как обнаружено, расщепляется в клетках сразу после ЕА8К стимуляции, а также других апоптозных процессов (КаиТтапп, 1989; КаиТтапп е! а1., 1993; Ьа/еЬюк е! а1., 1994), и эффективно расщепляется с помощью СРР32 (член СЕЭ3/1СЕ семейства протеаз) и МАСН протеаз.

Тогда как, появление Акр в положении Р1 субстрата является важным, тетрапептиды, имеющие Акр в качестве четвертого аминокислотного остатка, и различные комбинации аминокислотных остатков в первых трех положениях, могут быть быстро отобраны для связывания с активным сайтом протеаз, используя, например, метод, разработанный Гейсеном (Сеукеп, 1985; Сеукеп е! а1., 1987), где огромное количество пептидов на твердых основах были отобраны для специфического взаимодействия с антителами. Связывание МАСН протеаз со специфическими пептидами может быть определено различными методами, хорошо известными специалистам в данной области, такие, как радиоизотопное мечение, и т.п. Показано, что этим методом Гейсена можно исследовать, по крайней мере, 4000 пептидов каждый рабочий день.

Аналогичным путем точная связывающая область или область гомологии, которая определяет взаимодействие между В1 и другими белками, может быть объяснена и затем могут быть отобраны пептиды, которые могут служить для блокирования этого взаимодействия, например, синтезируемые пептиды, имеющие последовательность, сходную со связывающей областью или комплементарную ей, которая может соревноваться с природным В1 для связывания, или иного взаимодействовия с другими белками путей клеточной гибели или клеточного выживания через САКЭ или киназные домены, или, даже, интермедиаторный домен В1 между его САКЭ и киназными доменами.

Поскольку может быть удобно указать пептидные ингибиторы, которые селективно ингибируют В1 взаимодействия без вмешательства физиологических процессов клеточной гибели или выживания, в которые вовлечены дру39 гие члены внутриклеточных сигнальных путей, пул пептидов, связывающихся с В1 в исследовании, такой, как описан выше, может быть затем синтезирован в виде пептид-флуорогенного субстрата - для тестирования селективного связывания В1 с такими другими белками для выбора только тех, которые специфичны по отношению к В1. Пептиды, которые определены как специфичные для, например, САКЭ или киназного домена В1, затем могут быть модифицированы для усиления клеточной проницаемости и модуляции воспаления, процессов клеточной гибели или клеточного выживания обратимо или необратимо. ТЬоглЬеггу е! а1. (1994) сообщили, что тетрапептид (ацилокси)метилкетон Ас-Туг-Уа1-А1а-Акр-СН2ОС(О)-[2,6-(СЕз)2]РЬ является сильным инактиватором 1СЕ. Аналогично, М1Шдаи е! а1. (1995) сообщили, что тетрапептидные ингибиторы, имеющие хлорметилкетоновые (необратимо) или альдегидные (обратимо) группы, ингибировали 1СЕ. Кроме того, было показано, что бензилоксикарбоксилАкр-СН₂ОС(О)-2,6-дихлорбензол (ДХБ) ингибирует 1СЕ (МакЫта е! а1., 1995). Соответственно, аналогичным образом, тетрапептиды, которые селективно связываются, например, с САКО или киназным доменом В1, могут быть модифицированы, например, альдегидной группой, хлорметилкетоном, (ацилокси)метилкетоном или СН₂ОС(О)-ДХБ группой для создания пептида-модулятора В1 активности. Далее, для улучшения проницаемости, пептиды могут быть, например, химически модифицированы или преобразованы для усиления их проницаемости через клеточную мембрану и облегчения транспорта таких пептидов через мембрану и в цитоплазму. МигашкЫ е! а1. (1991) сообщили о преобразующем тиреотропин-рилизинг гормоне с лауриновой кислотой для образования липофильного лауроильного производного с хорошими характеристиками проницаемости через клеточные мембраны. Ζηοΐιηπη е! а1. (1991) также сообщили об окислении метионина до сульфоксида и замене пептидной связи его кетометиленовым изоэфиром (СОСН₂) для облегчения транспорта пептидов через клеточную мембрану. Это только несколько известных модификаций и производных, которые хорошо известны специалистам в этой области.

Далее, лекарственные или пептидные ингибиторы, которые способны к ингибирующему действию на, например, пути клеточной гибели или выживания, препятствуя возможному взаимодействию между В1 и любым из белков, с которыми он связывается через САКО, киназный или интермедиаторный домены, могут быть конъюгированы или образовать комплекс с молекулами, что облегчают вход в клетку.

В патенте США 5149782 описана конъюгация молекулы для перенесения через клеточную мембрану с помощью мембраносвязывающего агента, такого как слитые полипептиды, полипептиды, образующие ионные каналы, другие мембранные полипептиды и длинная цепь жирных кислот, например, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота. Эти мембраносвязывающие агенты встраиваются в молекулярные конъюгаты в липидный бислой клеточных мембран и облегчают их вход в цитоплазму.

Ьо\у е! а1., патент США 5108921, дали обзор доступных способов для трансмембранной доставки молекул, таких как, но не ограниченных этим, белки и нуклеиновые кислоты, с помощью механизма рецепторной передачи эндоцитотической активности. Эти рецепторные системы включают распознающие галактозу, маннозу, 6-фосфат маннозу, трансферрин, азиалогликопротеин, транскобаламин (витамин В12), α-2 макроглобулины, инсулин и другие пептидные факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (ЭФР). Ьо\у е! а1. показывают, что питательные рецепторы, такие как рецепторы для биотина и фолата могут быть успешно использованы для усиления транспорта через клеточную мембрану, благодаря положению и множеству биотиновых и фолатных рецепторов на поверхности мембран большинства клеток и ассоциированных с рецепторной передачей трансмембранных транспортных процессов. Таким образом, комплекс, образовавшийся между соединением, которое нужно доставить в цитоплазму, и лигандом, таким как биотин или фолат, входит в контакт с клеточными мембраносвязанными биотиновыми или фолатными рецепторами для инициации опосредованного рецептором механизма трансмембранного транспорта и, таким образом, дает возможность для входа желаемого соединения в клетку.

1СЕ, как известно, имеет способность допускать свободные замещения в положении Р2 и эта допустимость к свободным замещениям была использована для развития сильного и высоко селективного аффинного мечения, содержащего биотиновую метку (ТЬоглЬеггу е! а1., 1994). Следовательно, положение Р₂, а также, вероятно, Ν-конец тетрапептидного ингибитора могут быть модифицированы или преобразованы, например, добавлением молекулы биотина, для усиления проницаемости этих пептидов через клеточную мембрану.

Кроме того, в этой области известно, что соединение желательных пептидных последовательностей с ведущей/сигнальной пептидной последовательностью для создания «химерного пептида» допустит такой «химерный пептид» к перемещению через клеточную мембрану в цитоплазму.

Как ясно специалисту в области пептидов, пептидные ингибиторы взаимодействия В1 с другими белками, как указано выше, в соответствии с настоящим изобретением, подразумевают включение пептидомиметических лекарств или ингибиторов, которые могут также быть быстро подобраны для связывания с САКО, киназным или интермедиаторным доменом В1 для создания возможно более стабильных ингибиторов.

Также понятно, что одни и те же средства для облегчения или усиления транспорта пептидных ингибиторов через клеточные мембраны, как обсуждалось выше, также применимы к аналогам, фрагментам или изоформам В1, а также другим В1-специфичным пептидам и белкам (включая гибридные белки), которые действуют внутриклеточно.

В отношении антител, указанных здесь, термин «антитело» подразумевает включение поликлональных антител, моноклональных антител ^Α^, химерных антител, антиидиотипных (анти-И) антител к антителам, которые могут быть помечены в свободной или связанной форме, а также фрагментов, полученных любым известным способом, таким как, но не ограниченным, ферментативным расщеплением, пептидным синтезом, или рекомбинантными способами.

Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, полученных из сыворотки животных, иммунизированных антигеном. Моноклональные антитела содержат, по существу, гомогенную популяцию антител, специфичных к антигенам, популяции которых содержат, в основном, эпитоп связывающие сайты. МаЬ могут быть получены известными в этой области методами. Смотри, например Кой1ег и М11к!ет, Ыа!иге, 256:495-497 (1975); патент США № 4376110; Αιΐ5ΐ.^1 е! а1., ебк., Наг1оте и Ьапе ΑNΤIВО^IΕ8: Α ^ΑВОКΑΤОКΥ ΜΑΝυΑΕ, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу (1988); и СоШдаг е! а1., ебк., Сиггеп! Рго!осо1к ίη ^типоИду, Сгеепе РиЬПкЫпд Ακ^. и \МПеу НИгкаепсе Ν.Υ., (1992-1996), содержание этих ссылок включено здесь полностью в качестве ссылок. Такие антитела могут быть антителами любого класса иммуноглобулинов, включая ^С. ΙβΜ. Ι§Ε, Ι§Α, СИИ и любой их подкласс. Гибридома, продуцирующая тΑЬ по настоящему изобретению, может быть культивирована ш уйго, ш кйи или ш у1уо. Получение высоких титров тΑЬ ш у1уо или ш кйи, делает предпочтительным этот способ получения в настоящее время.

Химерные антитела подставляют собой молекулы, различные части которых получают у различных видов животных, такие, которые имеют вариабельную область, полученную из мышиного тΑЬ и с константной областью иммуноглобулина человека. Химерные антитела преимущественно используются для уменьшения иммуногенности при применении и для увеличения выхода при получении, например, когда мышиные тΑЬ имеют более высокий выход из гибридомы, но иммуногенность больше в человеческих, так, что используют человеческий/мышиный химерные тΑЬ. Химерные антитела и способы их получения известны в этой области (СаЬб1у е! а1., Ргос. Ыа!1. Αсаб. 8сй США 81:3273-3277 (1984); Моткоп е! а1., Ргос. Ыаб. Αсаб. 8οΐ. США 81:6851-6855 (1984); Воийаппе е! а1., Ыа!иге 312:643-646 (1984); СаЬ111у е! а1., европейская патентная заявка 125023 (опубликована 14 ноября, 1984); №иЬегдег е! а1., Νι!иге 314:268-270 (1985); 'ГатдисЫ е! а1., европейская патентная заявка 171496 (опубликована 19 февраля, 1985); Моткоп е! а1., европейская патентная заявка 173494 (опубликована 5 марта, 1986); №иЬегдег е! а1., заявка РСТ \УО 8601533, (опубликована 13 марта, 1986), Кибо е! а1., европейская патентная заявка 184187 (опубликована 11 июня, 1986); 8айадап е! а1., 1. Iттиηо1. 137:1066-1074 (1986); КоЬшкоп е! а1., международная патентная заявка № ХУО8702671 (опубликована 7 мая, 1987); Ьш е! а1., Ргос. Ыа!1. Αсаб. 8οΐ США 84:3439-3443 (1987); 8ип е! а1., Ргос. Ыаб. Αсаб. 8οΐ США 84:214-218 (1987); Вейег е! а1., 8с1епсе 240:1041-1043 (1988); и Наг1оте и Ьапе, ΑNΤIВО^IΕ8: Α ΓΑ^ΡΑΤΏ^ МΑNυΑΣ, кирга. Полный список рефератов приведен здесь в качестве ссылки.

Антиидиотипное (анти-И) антитело представляет собой антитело, которое распознает уникальные сайты связывания, обычно, ассоциированные с антиген-связывающим сайтом антитела. Ι6 антитело может быть получено иммунизацией животных одного и того же вида и генетического типа (например, мышиная линия), как источник тΑЬ, для которого готовят анти-И. Иммунизированные животные распознают и реагируют на идиотипные детерминанты иммунизирующих антител продуцированием антитела к этим идиотипным детерминантам (анти-И антитело). Смотри, например, патент США № 4699880, который полностью включен здесь в качестве ссылки.

Анти-И антитело также может быть использовано как «иммуноген» для индукции иммунного ответа у еще одного другого животного, продуцируя так называемым анти-анти-И антитело. Анти-анти-И может быть эпитопически идентично первоначальному тΑЬ, которое индуцирует анти-И. Поэтому, используя антитела к идиотипным детерминантам тΑЬ, возможно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности.

Соответственно, тΑЬ, выработанные против В1 белков, их аналогов, фрагментов или производных настоящего изобретения, могут быть использованы для индукции анти-И антител у подходящих животных, таких как ΕΑΡΕΑ мыши. Клетки селезенки мышей, иммунизированных таким образом, используют для получения анти-И гибридом, секретирующих анти-И тΑЬ. Далее, анти-И тΑЬ могут быть соединены с носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (КЬН), и использованы для дополнительной иммунизации мышей ВΑ^В/с. Сыворотка этих мышей будет содержать анти-анти-И антитела, которые имеют связывающие свойства исходного тАЬ, специфичные для эпитопа вышеуказанного В1 белка, или его аналогов, фрагментов и производных.

Таким образом, анти-Ιά тАЬ имеют свои собственные идиотипные эпитопы, или «идиотопы», структурно сходные с эпитопом, который оценивают, таким, как СЯВ белок-а.

Термин «антитело» также заключает в себе обе интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как, например, РаЬ и Р(аЬ')2, которые способны связывать антиген. РаЬ и Р(аЬ')2 фрагменты, лишенные фрагмента Рс интактного антитела, эвакуируются быстрее, чем циркулируют, и могут иметь меньше неспецифического тканевого связывания, чем интактное антитело (^аЬ1 с! а1., I. №с1. Мсб. 24:316-325 (1983)).

Следует учесть, что РаЬ и Р(аЬ')2 и другие фрагменты антител, использованных в настоящем изобретении, могут быть использованы для обнаружения и количественного определения белка В1, соответствующими методами, описанными здесь для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают протеолитическим расщеплением, используя ферменты, такие как папаин (для получения РаЬ фрагментов) или пепсин (для получения Р(аЬ')2 фрагментов).

Говорят, что антитело «способно к связыванию» молекулы, если способно к специфическому взаимодействию с молекулой, таким образом связывать молекулу с антителом. Термин «эпитоп» имеет отношение к той части любой молекулы, которая может быть связана антителом, которая также может распознаваться этим антителом. Эпитопы или «антигенные детерминанты» обычно состоят из химически активных сгруппированных на поверхности молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и имеют трехмерные структурные характеристики, а также конкретные характеристики заряда.

«Антиген» представляет собой молекулу или часть молекулы, способную связываться антителом, которое к тому же обладает способностью вызывать у животных выработку антител, способных к связыванию с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь один или более эпитопов. Специфические реакции, описанные выше, показывают, что антиген будет взаимодействовать высокоизбирательным образом с соответствующим антителом, а не со множеством других антител, которые могут быть вызваны другими антигенами.

Антитела, включая фрагменты, использованные в настоящем изобретении, могут применяться для количественного или качественного определения В1 белка в образце или выявления наличия клеток, которые экспрессируют В1 белок по настоящему изобретению. Это может быть выполнено методом иммунофлуоресценции с использованием флуоресцентно меченого антитела (см. далее), в сочетании со световым микроскопом, потоковой цитометрией или флуорометрическим определением.

Антитела (или их фрагменты), используемые в настоящем изобретении, могут быть применены гистологически, как в иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии, для ш 8Йи определения белка В1 по настоящему изобретению. 1п Ши определение может быть выполнено взятием у пациента гистологического образца, и снабжением его меченым антителом настоящего изобретения. Антитело (или фрагмент) лучше использовать наложением или перекрыванием меченого антитела (или фрагмента) с биологическим образцом. Использованием этого способа можно определить не только наличие В1 белка, но также его распространение в исследуемой ткани. Используя настоящее изобретение, среднему специалисту понятно, что любой из широкого разнообразия гистологических методов (таких, как методы окрашивания) может быть модифицирован для достижения такого выявления ш Й1и.

Такие исследования белка В1 по настоящему изобретению обычно включают инкубирование биологического образца, такого как биологическая жидкость, экстракт ткани, свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были инкубированы в культуре ткани, в присутствии детектируемо меченого антитела, способного идентифицировать В1 белок, и определение антитела любым из способов, хорошо известных в этой области.

Биологический образец может быть обработан на твердофазной подложке или носителе, таких как нитроцеллюлоза или другая твердая подложка или носитель, которые могут фиксировать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Подложка или носитель затем могут быть промыты подходящими буферами, после чего следует обработка детектируемо меченым антителом в соответствии с настоящим изобретением, как указано выше. Твердофазная основа или носитель после этого может быть промыта буфером второй раз для удаления несвязанных антител. Количество связанной метки на вышеуказанной основе или носителе затем может быть определено обычными способами.

«Твердофазная основа», «твердофазный носитель», «твердая основа», «твердый носитель», «основа» или «носитель» обозначают любую основу или носитель, способный связывать антиген или антитела. Хорошо известные основы или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, полиамидные амилазы, природную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, габброз и магнетит. Носитель по природе может быть или растворимым в некоторой степени, или нерастворимым для целей настоящего изо бретения. Материал основания может иметь любую возможную структурную конфигурацию так, чтобы связанная молекула была способна связывать антиген или антитело. Поэтому конфигурация основы или носителя может быть сферической, как у шарика, цилиндрической, как у внутренней поверхности пробирки, или наружной поверхности стержня. Альтернативно, поверхность может быть плоской, такой как пластинка, анализ на полосках (!ек! к!пр), и так далее. Предпочтительные основы или носители включают шарики полистирола. Специалистам в данной области могут быть известны другие подходящие носители для связывания антитела или антигена, или можно выяснить это обычным экспериментированием.

Связывающая активность большого количества данных антител по изобретению, как указано выше, может быть определена в соответствии с хорошо известными способами. Специалисты в данной области определят действующие оптимальные условия исследования для каждого определения обычным экспериментированием.

Другие стадии, такие как промывка, перемешивание, встряхивание, фильтрация и подобные могут быть добавлены к исследованиям как обычно или по необходимости в отдельных случаях.

Один из путей, в котором антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть определяемо помечено, представляет собой соединение с ферментом и использование в иммуноферментном анализе (ИФА). Этот фермент, в свою очередь, при обработке далее соответствующего субстрата, будет взаимодействовать с субстратом таким же образом, что получают химическую группу, которая может быть определена, например, спектрофотометрически, флуорометрически или визуальными способами. Ферменты, которые могут быть использованы для определяемо меченого антитела, включают, но неограничены этим, малатдегидрогеназу, нуклеазу стафилококка, дельта-5стероид изомеразу, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, альфа-глицерофосфат дегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу обыкновенного хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, оксидазу глюкозы, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6фосфат дегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолин эстеразу. Обнаружение может быть выполнено колориметрическими методами, в которых используют хромогенный субстрат для фермента. Обнаружение также можно произвести визуальным сравнением степени ферментативной реакции субстрата по сравнению со стандартом, приготовленным подобным образом.

Обнаружение может быть выполнено с использованием любого из разных других иммуноисследований. Например, радиоактивным мечением антител или фрагментов антител можно обнаружить К-РТРазу, используя радиоиммунный анализ (РИА). Подробное описание РИА можно найти в ЬаЬога!огу Тес11пк|иек апб В|ос11еппк1гу ш Мо1еси1аг В1о1оду, Ьу Vο^к. Т.З. е! а1., №г111 Но11апб РиЬНкЫпд Сотрапу, ΝΥ (1978) с обращением, в частности, к главе под названием «Ап 1п!гобис!1оп !о Кабюштипе Аккау апб Ке1а!еб ТесНп1₄иек», написанную СЬагб, Т., приведенную здесь в качестве ссылки. Радиоактивный изотоп может быть обнаружен использованием такого метода, как γ-счет или сцинтилляционный счет, или радиоавтографией.

Также можно метить антитело, в соответствии с настоящим изобретением, флуоресцентным соединением. Когда флуоресцентно меченое антитело подвергают действию света определенной длины волны, благодаря флуоресценции можно обнаружить его присутствие. Среди наиболее часто используемых соединений для флуоресцентного мечения имеются такие, как флуоресцин изотиоцианат, родамин, пикоэритрин, пикоцианин, аллофикоцианин, о-фталдегид и флуоресциамин.

Антитело может также быть определяемо помечено с использованием металлов, излучающих флуоресценцию, таких как ¹⁵²Е, или другие из ряда лантанидов. Эти металлы могут быть присоединены к антителу с использованием таких металл хелатирующих групп, как диэтилентриамин пентауксусная кислота (ЕТРА).

Антитело также может быть определяемо помечено соединением с хемилюминесцентным соединением. Присутствие хемилюминесцентно меченого антитела определяют с помощью обнаружения люминесценции, которая проявляется в ходе протекания химической реакции. Примерами особенно полезных химилюминесцентно меченнх соединений являются люминол, изолюминол, имидазол, соль и оксалат сложного эфира акридининия.

Также могут быть использованы биолюминесцентные соединения для мечения антитела по настоящему изобретению. Биолюминесценция представляет собой тип хемилюминесценции, найденный в биологических системах, в которых белок-катализатор увеличивает эффективность хемилюминесцентной реакции. Наличие биолюминесцентного белка определяют выявлением люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями для мечения являются люциферин, люцифераза и экворин.

Молекула антитела по настоящему изобретению может быть применена для использования в иммунометрическом анализе, известного также как «двухсторонний» или «сэндвич» анализ. В обычном иммунометрическом анализе множество немеченых антител (или фрагментов антител) связано с твердой основой или носителем и добавляют количество определяемо меченых растворенных антител для проведения определения и/или количественного определения тройного комплекса, образованного между твердофазным антителом, антигеном, и меченым антителом.

Обычный и предпочтительный иммунометрический анализ включает в себя «форвардные» исследования, в которых антитело, связанное с твердой фазой, сначала контактирует с тестируемым образцом, для извлечения антигена из образца путем образования бинарного твердофазного комплекса антиген-антитело. После соответствующего периода инкубации, твердую основу или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца, включая непрореагировавший антиген, если они есть, и затем введят в контакт с раствором, содержащим неизвестное количество меченого антитела (которое функционирует как «молекуларепортер»). После второго периода инкубации, для возможности образования комплекса меченого антитела с антигеном, связанным с твердой основой или носителем через немеченое антитело, твердую основу или носитель промывают второй раз для удаления непровзаимодействовавшего меченого антитела.

Другой тип «сэндвич» анализа, который также может быть использован с антигенами по настоящему изобретения, так называемые «81ти1!апеои8» (одновременные) и «ге\^гег8е» (обратные) исследования. Одновременный анализ включает одинарную стадию инкубации, так как антитело, связанное с твердой основой или носителем, и меченое антитело, оба одновременно добавляют к тестируемому образцу. После завершения инкубации твердую основу или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца и не образовавшего комплекс меченого антитела. Присутствие меченого антитела, ассоциированного с твердой основой или носителем, затем определяют как в обычном «форвардном» сэндвич анализе.

В «ге\^гег8е» анализе осуществляют постадийное добавление сначала раствора меченых антител к жидкому образцу, вслед за этим добавляют немеченые антитела, связанные с твердой основой или носителем после соответствующего периода инкубации. После второй инкубации, твердую фазу промывают обычным способом для освобождения от остатков тестируемого образца и раствора непровзаимодействовавших меченых антител. Определение меченых антител, ассоциированных с твердой основой или носителем, затем определяют как в «81ти1!апеои8», так и в «когоагб» исследованиях.

Как указано выше, настоящее изобретение также имеет отношение к фармацевтическим композициям, включающим рекомбинантные векторы вируса животного, кодирующие белки В1, при этом такой вектор также кодирует белки на поверхности вируса, способные к связыванию поверхностных белков специфических клеток-мишеней (например, раковых клеток) для прямого включения последовательности белка

В1 в клетки. Далее, фармацевтические композиции по изобретению включают в качестве активного ингредиента (а) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность последовательности белка В1, или (Ь) лекарства, которые блокируют взаимодействие В1 с другими белками.

Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат достаточное количество активного ингредиента для достижения поставленной цели. К тому же, фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включая наполнители и вспомогательные вещества, которые способствуют получению из активных соединений препаратов, которые могут быть использованы фармацевтически и которые могут стабилизировать такие препараты при введении субъекту, при необходимости в них, как хорошо известно специалистам в данной области.

Предполагают, что белок В1 и его изоформы или изотипы, возможно, экспрессируются в различных тканях на различимо разных уровнях и, по-видимому, также с различными структурами изотипов аналогичным образом для экспрессии различных других белков, вовлеченных во внутриклеточные пути передачи сигнала, как показано в вышеуказанных одновременно поданных и одновременно рассматриваемых патентных заявках. Эти различия, вероятно, могут способствовать тканеспецифическим особенностям ответа на Ρа8/ΑРО1-лиганд и ФНО. В случае других ί.Έ03/Ιί.Έ гомологов ^апд е! а1., 1994; Α1пет^^ е! а1., 1995), заявители ранее показали (в вышеуказанных патентных заявках), что МАСН изоформы, которые содержат неполные ί.Έ03/Ιί.Έ области (например, МАСНа3), как обнаружено, обладают ингибирующим действием на активность ко-экспрессированных МЛСНа 1 или МАСНа2 молекул; они так же, как обнаружено, блокируют гибель, индуцированную Ρа8/ΑРО1 и р55-К (р55-ФНО-К). Экспрессия таких ингибиторных изоформ в клетках может составлять механизм клеточной самозащиты против Ρа8/ΑРО1- и ФНОопосредованной цитотоксичности. Широкое разнообразие МАСН изоформ, которое значительно превышает наблюдаемое у любых других протеаз семейства ΟΈΟ^ι/ΚΈ, позволяет, в частности, хорошо регулировать функциональную активность МАСН изоформ. Известно также, что ВСЬ2, ВСЬ-Хь и другие члены семейства ВСЬ2 экспрессируются и активны в той или иной степени в различных типах клеток, вызывая изменение чувствительности различных клеток к индуцированному апоптозу, например, выживаемость некоторых клеток более вероятна, чем других (см. вышеуказанный обзор Уапд апб Ког8теуег, 1996).

Как указано выше, белки В1 или возможные изоформы, вероятно могут иметь разные эффекты в различных тканях. Например, такие разные эффекты, вероятно, касаются их взаимодействия с другими белками воспаления, путей клеточной гибели или клеточного выживания, и их влияния, следовательно, на активность этих путей, в частности на равновесие между ними и не будет ли это равновесие изменено тем или иным путем.

Также вероятно, что некоторые из возможных изоформ белка В1 выполняют другие функции. Например, В1, их аналоги или изоформы также могут действовать как докингсайты для молекул, которые вовлечены в другие внутриклеточные пути, не связанные с вышеуказанными путями клеточной гибели или выживания.

Благодаря уникальной способности Рак/АРО1 и ФНО рецепторов вызывать клеточную гибель, а также способности рецепторов ФНО запускать другие процессы поражения тканей, отклонения в функционировании этих рецепторов могли быть чрезвычайно вредны для организма. В самом деле, и чрезмерное, и недостаточное функционирование этих рецепторов, как было показано, способствуют патологическому проявлению различных заболеваний (УаккаШ, 1992; №1§а1а апб ΟοΙκΙοίη. 1995). Идентификация молекул, которые участвуют в сигнальной активности рецепторов, и нахождение путей модуляции активности этих молекул, могли бы направить новые терапевтические подходы. С точки зрения предполагаемой важной роли ТКАР белков, и, следовательно, белка В1, который, вероятно, может взаимодействовать с ними прямо или опосредованно, или предполагаемого взаимодействия между В1 и различными каспазами, что кажется чрезвычайно важным для разработки лекарств, которые могут влиять или модулировать взаимодействие между В1 и другими белками, с которыми он взаимодействует, и таким образом усиливать или ингибировать клеточную гибель или клеточное выживание, как требуется.

Настоящее изобретение также касается белков или других лигандов, которые могут связываться с белками В1 по изобретению и, таким образом, модулировать/опосредовать активность белков В1. Такие белки или лиганды могут быть отобраны, выделены и получены любым из вышеуказанных способов. Например, может быть выделено некоторое количество новых лигандов, включая белки, способные связываться с белками В1 по изобретению.

Как подробно описано выше, такие новые В1-связывающие белки/лиганды, могут служить, например, как ингибиторы или энхансеры В1-медиаторной активности, и поэтому играть важную роль в различных патологических и других состояниях, как подробно описано выше. Другой функцией таких В1-связывающих бел ков/лигандов может быть их использование в качестве специфических агентов для очищения белков В1, например, с помощью аффинной хроматографии новые связывающие белки/лиганды прикрепляются к подходящим хроматографическим матрицам для образования твердого или аффинного носитель/матрица раствора, через который пропускают экстракт, или подобное, содержащий белки В1, и, таким образом, облегчают их очищение. Такие методы аффинной хроматографии хорошо известны и, как правило, являются обычными стандартными методиками в этой области.

Более того, все вышеуказанные белки В1, аналоги, фрагменты, изоформы и производные по настоящему изобретению могут быть использованы для очищения с помощью аффинной хроматографии различных белков воспаления, путей клеточной гибели или выживания, с которыми они связываются. Например, белки В1 и аналоги, фрагменты и их мутеины могут быть использованы для очищения В1связывающих белков аффинной хроматографией. Такой способ для идентификации и получения этих В1-связывающих белков включает стадию скрининга, на которой белок В1, или, по крайней мере, его конкретная часть используется в качестве субстрата или «затравки» для получения белков или любых других лигандов, способных их связывать; затем следует стадия идентификации и характеристики таких белков/лигандов, полученных таким образом; и получение затем таких белков/лигандов по существу в выделенном и очищенном виде. Все эти стадии хорошо известны специалистам в этой области и подробно рассмотрены здесь выше и далее.

Изобретение далее будет описано более подробно в следующих не ограничивающих примерах и в сопровождении рисунков.

Следует также отметить, что методы

ί) двухгибридный скрининг и двухгибридный анализ экспрессии β галактозидазы; (ίί) индуцированная экспрессия, метаболическое нанесение метки и иммунопреципитация белков; (ш) ίη νίΐΓο связывание; (ίν) определение цитотоксичности; и (ν) анализы Нозерн и последовательности, а также другие методы, использованные в следующих примерах, были подробно рассмотрены в предыдущих публикациях настоящих заявителей в отношении других внутриклеточных сигнальных белков и путей (см., например, Βο16ίη е1 а1., 1995а, 1995Ь, и Βο16ίη е1 а1. 1996). Эти методы также представлены подробно в одновременно рассматриваемых израильских заявках тех же заявителей (№№ 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 и 120367, а также в соответствующей заявке РСТ № РСТ И8 96/10521). Соответственно, полное описание этих публикаций и патентных заявок включены здесь полностью, по крайней мере, что касается экспериментальных методик. В отношении ΝΙΚ белка и его роли в активации ΝΡ-кВ и, следовательно, клеточного выживания и роль ТКАР2 в этом пути клеточного выживания, например, взаимодействие между ТКАР2 и р55-К, РА8-К, К1Р и другими белками, было подробно рассмотрено заявителями в вышеуказанных одновременно рассматриваемых израильских заявках тех же заявителей и РСТ заявках и у МаНшп е! а1., 1997.

Пример 1. Выделение, секвинирование и частичная характеристика нового В1 белка.

С использованием различных методов, описанных в патентах тех же заявителей, указанных выше, была выделена, секвенирована и частично охарактеризована новая клонированная последовательность ДНК. Эта последовательность ДНК кодирует новый белок, первоначально обозначенный как С-1АР, связывающий киназу (СВК) на основании гомологии с С-1АР белками и присутствия киназного домена, но теперь обозначенный как В1.

Кратко, чтобы в дальнейшем объяснить внутриклеточную активность недавно обнаруженных гомологов С-1АР1 и С-1АР2 ингибитора клеточного апоптоза (1АР) (см. КоШе е! а1., 1995; Игеп е! а1., 1996; НоГтапп е! а1., 1997) и с которым внутриклеточные белки взаимодействуют, последовательности с-1АР использовались для скрининга других возможных гомологичных или иным образом связанных последовательностей в различных базах данных, включая те, которые имеют не характеризованный (и не полностью секвенированы) экспрессируемые метки последовательности (ез1з). Таким образом, была определена частичная последовательность нового клона, которая имела высокую гомологию с С-1АР1. С использованием этой частичной последовательности, предварительно не охарактеризованной, были получены РСК праймеры для РСК клонирования полноразмерной последовательности ДНК этого нового клона с помощью в качестве матрицы библиотек ДНК, кДНК, полученных коммерчески.

В результате, была получена новая полноразмерная ДНК, кодирующая прежде неизвестный белок, а именно, новый белок, обозначенный В1. Последовательность первоначально была определена для В1 (ДНК и аминокислота). Дальнейший анализ и определение начальной последовательности В1 показали некоторые различия в Ν-концевой части аминокислотной последовательности (5' конец нуклеотидной последовательности), которая затрагивает первые 19 выведенных аминокислотных остатков. Это дальнейшее определение последовательности и анализ дали выведенную В1 аминокислотную последовательность и ее кодирующую нуклеотидную последовательность, как показано на фис. 3А и В, соответственно.

Из анализа аминокислотной последовательности на фиг. 3 вытекает, что существует киназный мотив на Ν-конце белка, который ко дируется первыми приблизительно 1000 нуклеотидами открытой рамкой считывания (ОКР) нуклеотидной последовательности на фиг. 3. Далее, на С-конце аминокислотной последовательности находится структура продомена (САКИ), которая является общей в ряду внутриклеточных белков, вовлеченных в апоптический сигнальный путь, например, С-1АР1, КА1ИИ (см. Ииап апк Όίχί!, 1997) и другие каспазы, такие как 1СЕ и 1СН-1. В аминокислотной последовательности В1, описанной на фиг. 3, показан Νконец киназного домена (область в рамке) и Сконец САКИ (подчеркнутая область). Между эти двумя доменами находится промежуточный домен В1 белка.

Вышеуказанный киназный домен В1 имеет высокую гомологию (или подобие) с известными киназами КАР-типа и К1Р-киназным доменом.

Вышеуказанный продомен В1 был также недавно обозначен как САКИ для «каспазного рекрутментного домена» (см. НоГтапп е! а1., 1997) и предназначен, чтобы служить как область, через которую различные белки взаимодействуют в течение апоптозной сигнализации внутриклеточно. Например, р55 ФНО-К, который не имеет, продомен (или САКИ) взаимодействует с другим внутриклеточным белком ТКАИИ (адаптерный белок) через гибельную область домена, представленную на обоих эти белках. В свою очередь, ТКАИИ может взаимодействовать с К1Р и с КА1ИИ (такой дополнительный адаптерный белок, см. также НоГтапп и другие, 1997; Ииап и Όίχί!, 1997; ^а11асН, 1997), все из которых имеют гибельные домены, такие, что, через гибельную область домена р55-ФНО-К могут быть связаны в комплекс с КА1ИИ непосредственно или опосредованно. КА1ИИ имеет продомен (или САКИ), который может взаимодействовать или связываются с одним или несколькими каспазами, например 1СН-1 (каспаза-2), и, возможно, другими, и вследствие этого может связывать р55-ФНО-К с такими каспазами и вызывать апоптоз через действие каспаз.

Аналогично, р75-ФНО-К может взаимодействовать с ТКАР2 и ТКАР1 белками посредством общих мотивов, и ТКАР белки могут взаимодействовать с С-1АР1 и С-1АР2. Подобными методами (см. также МаНшп е! а1., 1997, XVО 97/37016), на основании способности РА8К (Раз/АРО1) взаимодействовать с МОКТ1 (ΡΛΌΌ), который, в свою очередь, взаимодействует с ТКАИИ (все через их общие гибельные домены), и способности ТКАЛИ взаимодействовать с ТКАР2, МОКТ1 может поэтому быть связан с С-1АР1, С-1АР2 (через ТКАР2) и вследствие этого к 1СЕ, Мс116 и другими каспазами, или быть связанным с 1СН-1, РИ1СЕ/МАСН или другими каспазами (через ТКАИИ-МР-КАкИИ взаимодействия, указанные выше). Необходимо также указать, что р55 ФНО-К может также быть связан с 1СЕ, МсЬб и другими такими каспазами через вышеуказанные отмеченные ТКАПП-ТКАР2-с1АР1, С-1АР2-1СЕ, МсЬб взаимодействия, также на основании способности р55 ФНО-К взаимодействовать с ТЕЛОЭ.

Кроме того, известно, что ТКАР2 также вовлечен во внутриклеточный путь (или больше чем один путь), что способствует клеточному выживанию посредством индукции ΝΕ-кВ активации. По этому(им) пути(ям) кажется, что ΝΙΚ непосредственно вовлечен в фосфорилирование Ι-кВ, что ведет к Ι-кВ диссоциации из ΝΕкВ и вследствие этого активации ΝΕ-кВ, тем самым ΝΕ-кВ может проникать в ядро и инициировать транскрипцию различных генов, экспрессия которых связана с клеточным выживанием (см. также раздел «Предпосылки изобретения» выше).

Таким образом, ТКАР2 вовлечен в оба пути клеточной гибели клетки и выживания, в зависимости от которых белки преимущественно взаимодействуют с ТКАР2 в любой данный период в ответ на различные внешние стимулы (например, лиганды связывают различные рецепторы), клетка может подвергаться индукции клеточной гибели или клеточного выживания. Ясно, что имеется хорошее равновесие между различными внутриклеточными сигнальными белками, которое может быть смещено либо в сторону клеточной гибели, либо к пути выживания клеток, и, как кажется, ТКАР2 является одним из ключевых белков, поддерживающих это равновесие, и является ответственным за любое смещение в равновесии одним путем или другим.

На фиг. 1 показана схематично структура белка ТКАР2 с его различными доменами, и на фиг. 2 схематично показаны некоторые возможные взаимодействия между различными клеточными рецепторами и внутриклеточными сигнальными белками и их участие в путях клеточной гибели или клеточного выживание (ΝΕкВ активация).

Соответственно, возникает возможность того, что новый белок В1 по настоящему изобретению может иметь важную модуляторную роль в воспалении, путях клеточной гибели и клеточного выживания. В1 имеет продомен (или САКЭ домен), который может, вероятно, взаимодействовать, даже опосредованно, с продоменом С-1АР1, С-1АР2, КАГОЦ и различными каспазами (1СЕ, 1СН-1 и т.д.) и вследствие этого может взаимодействовать даже опосредованно с ТКАР2 и различными белками, которые взаимодействуют непосредственно или опосредованно с ТКАР2, включая К1Р, ТКАОЦ, р75 ФНО-К, р55 ФНО-К, МОКТ-1 и ЕА8-К. В1 также имеет киназный домен и как таковой может, вероятно, быть вовлечен непосредственно или опосредованно в МАР-киназный путь, в котором, как кажется, ΝΙΚ является его членом, и вследствие этого может быть также вовлечен в путь ΝΕ-кВ активации.

Кроме того, В1 на основании гомологии к С-1АР1 может быть, вероятно, модулятором активности С-1АР1 (и С-1АР2), путем модуляции С-1АР1 биологической активности или путем модуляции связывания С-1АР1 с другими белками. В этом отношении (см. также пример 2 ниже), В1 может, вероятно, действовать по увеличению апоптоза, взаимодействуя даже опосредованно с белками С-1АР (С-1АР1, С-1АР2) и прерывая или иным образом уменьшая их способности к рекрутированию каспаз и ограничения их протеолитической активности, так что в итоге большее количество каспаз будет свободно действовать протеолитически.

Другая возможность - это то, что В1 через вышеуказанную возможную способность взаимодействовать с различными медиаторами клеточной гибели, непосредственно или опосредованно, включая ТКАР-1 и ТКАР2, КАТОО, К1Р, ТКАОЦ, р55-ФНО-К, Р75-ФНО-К, МОКТ-1 и ЕАЗ-К; и с различными каспазами, может, вероятно, служить для связывания этих белков с каспазами, и вследствие этого, вероятно, может служить в качестве промежуточного агента в пути(ях) клеточной гибели, которому(ым) эти белки принадлежат. Также, В1 может быть важный медиатором апоптоза.

Следующая возможность состоит в вероятном взаимодействии (даже опросредованно) В1 с вышеуказанными белками С-1АР, В1 может, вероятно, предотвращать С-1АР связывание или взаимодействие с ТКАР2, и вследствие этого может, вероятно, блокировать ТКАР2 активность относительно МАР-киназного пути, например, ТКАР2-С-1АР взаимодействия могут быть важными для ТКАР2 взаимодействий с ΝΙΚ, и, если это предотвращено путем В1 взаимодействия с С-1АР, тогда ТКАР2-опосредованная ΝΕ-кВ активация может быть блокирована, приводя к меньшему повышению клеточного выживания и, вероятно, увеличению клеточной гибели.

Еще одна дальнейшая возможность - то, что В1 может действовать более прямым способом при модуляции активности различных каспаз. Поэтому через взаимодействия, непосредственные или опосредованные, между продоменами (САКЭ домены) В1 и различными каспазами, В1 может, возможно, вести к увеличению активности этих ферментов и, вследствие этого увеличивать цитотоксичность этих ферментов. Таким образом, В1 может быть прямым манипулятором апоптоза путем рекрутирования или иным образом активируя каспазы (см. также пример 2 ниже).

Дополнительная возможность - это то, что

В1 может действовать, чтобы модулировать внутриклеточные сигнальные пути, опосредуя клеточную гибель или клеточное выживание путем связывания или взаимодействия с другими пока еще неизвестными белками.

Интересно отметить (см. выше), что В1 имеет киназный домен, подобный К1Р-киназе. К1Р - также центральный белок, вовлеченный в равновесие между путями клеточной гибели и клеточного выживания на основании его способности связать медиаторы клеточной гибели (например, р55 ФНО-К, ЕА8-К, МОКТ-1, ТКАОИ) и ТКАЕ-2, и посредством этого ΝΕ-кВ активацию и клеточное выживание (см. фиг. 2). К1Р-киназная активность может также быть фактором в этой точном равновесии, в зависимости от того, что является субстратом для этой киназы, например, какие белки фосфорилированы с помощью К1Р, и влияет ли это на их активность, направленную на увеличение апоптропной активности, уменьшенную апоптропную активность, увеличенную ΝΕ-кВ активацию или уменьшенную ΝΕ-кВ активацию. По аналогии, В1 может, вероятно, также играть такую центральную роль, в которой его киназная активность может быть важной, в зависимости от того, какие белки являются субстратами для такой киназной активности.

Пример 2. Анализ биологического активности В1 белка.

(ί) Анализ первоначального связывания для определения, какой известный белок может связываться с В1.

Используя способы из методов по XVО 97/37016 для получения и экспрессии ДНК конструкций и анализ дрожжевого двухгибридного связывания, была применена конструкция В1, из которого был удален киназный домен, например усеченный В1, имеющий только промежуточную область и С-концевую САКЭ область, для того, чтобы исследовать его способность связывать различные известные белки, вовлеченные во внутриклеточные сигнальные пути (пути клеточной гибели и выживания). Начальные, предварительные результаты (не показаны) кажется, указывают, что этот усеченный В1 связывается с ВСЬ2.

(ίί) Анализ цитотоксичности клеток для определения действия В1 на клеточную гибель или клеточное выживание.

Используя способы из методов по XVО 97/37016 для получения ДНК конструкций и трансфекции/трансформирования клеток и определения действия на клеточную гибель или клеточное выживание экспрессированных продуктов этих конструкций, ДНК конструкция, кодирующая полноразмерный белок В1, была использована для трансфекции клетки в культуру. Далее, в другой серии экспериментов, В1кодирующая конструкция была использована для ко-трансфекции клеток с другими конструкциями, кодирующими среди прочих ЕА8-К, р55 ФНО-К и К1Р.

Результаты, полученные из этих трансфекции (не показанны), указывают, что экспрессированный белок В1 сам по себе не вызывает клеточную гибель. Однако, когда В1 экспрессирован вместе с ЕА8-К, р55 ФНО-К или К1Р, он расширяет уровень клеточной гибели, индуцированной этими известными возбудителями клеточной гибели.

Эти результаты, принимаемые с учетом того, что, как указано выше, (ί) В1 может связываться с ВСЬ2, повышают возможность того, что В1 может служить как ингибитор ВСЬ2 активности, например, что В1 может предотвращать ВСЬ2 активность к защите клеток против апоптоза (см. раздел «предпосылки изобретения» выше), и также В1, очевидно, способен к расширению пути клеточной гибели, индуцированных ЕА8-К, р55 ФНО-К и К1Р и, возможно, другими возбудителями клеточной гибели (как также вышеуказанные в разделе «предпосылки изобретения»). В этом отношении, В1 может, вероятно, действовать аналогичным способом на ВАЭ белок, член ВСЬ2 семейства, который связывается с ВСЬ2 и ВСЬ-Х_Ъ и, вследствие этого, приводит к повышенным уровням ВАХ и ВАК, которые, как известно, будут непосредственно вовлечены в вызывание клеточной гибели. Другая возможность - это то, что В1, благодаря его киназному домену, может фосфорилировать ВСЬ2 на участках фосфорилирования, присутствующих на ВСЬ2, и, таким образом, может влиять на активность ВСЬ2 к защите клеток против апоптоза, и, в конечном результате, как это наблюдалось, В1 оказывает усиливающее действие на индукцию клеточной гибели.

Кроме того, также возможно, что В1 может, в дополнение к или, независимо от его возможного взаимодействия с ВСЬ2, производить индукцию активации ΝΕ-кВ, что осуществляется через киназную активность В1, действующую по пути, ведущему к активация ΝΕ-кВ, например, В1 может возможно взаимодействовать с ΝΙΚ или другими киназами на пути, частью которого является ΝΙΚ, или он может воздействовать на другие адаптерные белки, участвующие в этом процессе, например, ТКАЕ2, способом, приводящим к уменьшению активация ΝΕ-кВ, и, в конечном счете, к пониженному клеточному выживанию и повышенной клеточной гибели.

Следовательно, вкратце, оказывается, что В1 играет роль в модуляции внутриклеточных сигнальных путей, независимо от того, ведут ли они к воспалению, клеточной гибели или клеточному выживанию. В1 может поэтому рассматриваться как «модулятор внутриклеточной сигнализации», поскольку он определенно обладает способностью влиять на воспаление, пути клеточной гибели и клеточного выживания различными способами, например, прямо (рекрутмент различных белков и их активация или ингибирование, или через киназную активность) или опосредованно (через взаимодействие с различными другими промежуточными звеньями, например, ВСЬ2, и, возможно, также С-ΙΑΡ, и, вследствие этого, с 'ΓΚΑΡ2, и т.д.; или ΒΑΙΌΌ и вследствие этого, с ΚΙΡ, ΓΚΑΟΟ, и т.д.).

Пример 3. Дополнительный анализ биологической активности В1.

ΝΡ-кВ активность, анализ клеточной гибели, Нозерн анализ и анализ ΊΝΚ активности были проведены с использованием следующих В1 и В1 мутантных конструкций (см. фиг. 6).

В1 (см. пример 1)

В1 тик мутант В1, в котором лизин в положении 47 был заменен на аланин

ΔΟΆΚΩ, В1 без ΟΆΚΩ домена, полученный в результате ГСК и клонирования в векторы экспрессии

ΔХЬа, В1 без С-АКБ домена, но более короткий на его 3' конце по сравнению οΟΆΚΟ, созданный с использованием сайта рестрикции и клонирования в векторы экспрессии

ΔВат, подобный пХЬа, и созданный тем же самым способом, используя фермент рестрикции Ват

ΔNάе, содержащий часть киназного домена и ί.ΆΚΩ домен, созданный Ρ0Κ и клонированием в векторы экспрессии

ΔΗ, созданный Ρ0Κ с использованием следующих праймеров

1. 5'-СΑΟΑΑТТССΑΟΑΟТΟТТТСΑΑΟТΟССΑТТС;

2. 5'-ΑΑСТСΟΑΟΑСТТΑСΑТΟСТТТТΑТТТТΟΑΑ.

Фрагмент Ρί,’Κ был клонирован в векторы экспрессии и верифицирован при помощи секвенирования.

Оценку ΝΡ-кВ активации осуществляли репортерным генным анализом, как описано в \νΟ 97/37016. Кратко, клетки были котрансфектированы с генной плазмидой ВИЧ ЬТК-люциферазы (1 мкг) и векторами экспрессии В1 и мутанта В1 (3 мкг). Количество трансфектированной ДНК поддерживали постоянным путем добавления пустого вектора. Через 24 ч после трансфекции клетки промывали ΡΕ8 и лизировали. Осуществляли анализ с использованием люциферазы, как описано в Сиггеп! Ριό!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Αι.ΐ8ΐ.^1 е! а1. Результаты также представлены на фиг. 6.

Анализ клеточной гибели был проведен путем выращивания клеток 293-Т в модифицированной Дульбеко минимальной основной среде Игла, дополненной 10% фетальной сывороткой теленка, несущественными аминокислотами, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. 293-Т клетки (5х10⁵ клеток в 6 см чашках) были мгновенно трансфектированы методом осаждения фосфата кальция с использованием различных конструкций кДНК вместе с вектором экспрессии β-галактозидазы. В экспериментах, результаты которых представлены на фиг. 6, каждую чашку трансфицировали 1 мкг р55 ФНО-К, ΚΙΡ или Т^ББ конструкта, 1 мкг соответствующего В1 или В1 мутантного конструкта (или пустого вектора, взятого в качестве контроля), и 1 мкг р8У-в-да1 (Гготеда). Уровень клеточной гибели в конце периода инкубации оценивали путем определения экспрессии и β-галактозидазы, как описано Во1бт е! а1.,

1996.

Нозерн анализ осуществляли обычными методами (см., например, Во1бт е! а1., 1995), и этот анализ показал, что В1 присутствует во многих тканях человека (фиг. 4).

ΡΝΚ активацию осуществляли путем быстрого трансфицирования 293-Т клеток (5х10⁵клеток в 6 см чашках) с использованием метода осаждения фосфата кальция с 1,5 мкг Ρ8Κ-ΗΑΡΝΚ1 конструкта (меченый НА эпитопом вектор экспрессии ΡΝΚ-1) и 4 мкг вектора экспрессии каждого В1 и В1 мутантного конструкта. Спустя 24 ч клетки лизировали в лизисном буфере (20 мМ Нерек рН 7,6, 10 мМ ΕΟΓΑ, 40 мМ βглицерофосфата, 2,0 мМ МдС1₂, 1 мМ БТТ и 1% ΝΡ-40) и белок Ηη-ίΝΚ1 иммунопреципитировали с анти-НА антителами (см., например, Ко111е е! а1., 1995Ь) (клон 12 СА5). Киназный анализ осуществляли в 30 мкл киназного буфера (20 мМ Нерек, рН 7,6», 40 мМ βглицерофосфата, 2,0 мМ МдС1₂, 2 мМ БТТ ТТ, 3 нмоль АТР и 3 мкКи у-Р³²-АТР) при 30°С в течение 20 мин. Бактерицидно продуцированный белок СБТ-ίυη (около 10 мкг) использовали в качестве субстрата. Реакцию останавливали добавлением 2 х БББ-нагруженного буфера, кипятили в течение 3 мин и анализировали 8Б8ΡΑΟΕ гелевым методом. Результаты представлены на фиг. 7.

Результаты, представленные на фиг. 6, показывают, что В1 может непосредственно индуцировать МТ-ГСВ активацию. Однако учитывая то, что В1 должен также индуцировать ΝΡ-кВ, эта активация, как оказалось, является независимой от его киназного домена, и полагают, что она может быть связана с САК Б доменом, при этом промежуточный домен В1 может вносить или не вносить свой вклад, частично или полностью.

Дальнейший анализ клеточной цитотоксичности показывает, что не только В1 (см. пример 2 (ίί)), но также В1 мутант, будучи экспрессированными вместе с р55-ФΗΟ-Κ. ΚΙΡ или ^Αββ усиливают уровень клеточной гибели. ΔСΑΚ^. ΔNάе и ΔК делают это в меньшей степени, тогда как другие конструкты не делают этого. По-видимому, это указывает на то, что, по меньшей мере, С-АКБ домен вовлечен в усиление клеточной гибели, возможно, вместе с промежуточным доменом.

Результаты ΡΝΚ активации также, видимо, указывают, что, по меньшей мере, С-АКБ домен вовлечен в эту активацию, также, возможно, вместе с промежуточным доменом.

В дополнение к вышеуказанному, проведенные исследования показали, что В1 самопроизвольно фосфорилирует. Это доказательство того, что В1 - действительно киназа.

Далее было подтверждено, что В1 имеет гомологию с К1Р. Компьютерный анализ указывает 37%-ное тождество двух белков на аминокислотном уровне и 47%-ную гомологию. В настоящее время К1Р, в основном, рассматривается как ΝΕ-кВ модулятор, и вышеуказанные результаты указывают, что В1 действует аналогично.

Пример 4. Характеристики связывания.

Характеристики связывания В1 и его мутантов представлены в следующей таблице.

Таблица

ДНК-связывающий гибрид	Гибрид активации	Ε;κΖ
В1	В1	+++
В1	ДК	+++
ДК	В1	+++
ДК	ДК
В1	ТКАЕ2
В1	ТКАЕ3
В1	ТКАЕ6
ТКАЕ2	В1
ТКАЕ6	В1
ТКАЕ1	В1	+
В1	ТАNΚ
В1	ΝΙΚ
ΝΙΚ	В1
В1	САЗН
САЗН	В1
В1	К1Р
В1	КАГОО
В1	1СЕ
В1	1СН-1
В1	МАСНа1 (С360З)
В1	МОКТ-1
В1	С1АР-1
С1АР-1	В1	+
К1Р	В1
КАГОО	В1
1СЕ	В1
1СН-1	В1
МАСНа1 (С360З)	В1

Из результатов, показанных в вышеуказанной таблице, ясно, что, когда В1 функционирует, чтобы стимулировать ΝΕ-кВ активацию, он может делать это независимо от связывания с другими белками, известными как вовлеченные в ΝΕ-кВ активацию, такими как, например, 1КАК, ТКАЕ2, ΝΙΚ, ТКАЕ6 и К1Р. Поэтому В1 может индуцировать ΝΕ-кВ активацию непосредственно или опосредованно через взаимодействие с некоторыми другими белками, формирующими часть этого пути активации.

Что касается наблюдаемой активности В1 в усилении клеточной гибели, из вышеуказан ной таблицы следует, что В1 может быть центральным белком, участвующим в точном равновесии между внутриклеточными путями, ведущими к клеточной гибели или к клеточному выживанию. В этой связи В1, в зависимости от того, с каким белком он взаимодействует, способен к сдвигу равновесия между клеточной гибелью и клеточным выживанием.

293 клетки почки человеческого эмбриона (5х10⁶; 2,5х10⁶/на 10 см чашку) были одновременно трансфектированы в соответствии с процедурой, использующей фосфат кальция, 10 мкг плазмиды, кодирующей НА-меченый белок В1 (НА-В1) и 10 мкг любой плазмиды, кодирующей Е1ад-меченый белок В1 (ЕЬ-В1), либо плазмиды, кодирующей Е1ад-меченый С-1АР-1 белок (ЕБ-1АР1), либо плазмиды, кодирующей Е1адмеченый ТКАЕ1 (ЕБ-ТКАЕ1), или плазмиды, кодирующей Е1ад-меченый ТКАЕ2 (ЕБ-ТКАЕ2) или с 10 мкг комбинации (в отношении 1:1) Е1ад-меченого ТКАЕ1 и не-меченого ТКАЕ2 (ЕЬ-ТК1 + ТК2), или с 10 мкг комбинации (1:1:1) Е1ад-меченого ТКАЕ1, не-меченого ТКАЕ2 и С-1АР-1 (ЕБ-ТК1 + ТК2 + 1АР1). Через 7 ч после трансфекции клетки промывали и через 18 ч клетки лизировали в буфере, содержащем 50 мМ НЕРЕЗ, рН 7,5, 250 мМ №С1, 0,2% ΝΡ-40, 5 мМ ЕЭТА. 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 2,0 мкг/мл апротинина и 20 мкг/мл леупептина (лизисный буфер). Иммунопреципитацию осуществляли инкубацией (2 ч, 4°С) 1 мл аликвот лизата с анти-Е1ад эпитопным антителом (5 мкг/аликвота) и с шариками белка Сагарозы (30 мкг/аликвота). Иммунопреципитаты промывали 3 раза лизисным буфером и 1 раз РВЗ, разделяли на фракции ЗИЗ-рАсЕ (10%) и помещали на нитроцеллюлозную мембрану (ЗсЫе1сЬег & ЗсНиеП, Оакке1, Германия). Вестерн блот анализ выполняли с анти-НА эпитопными моноклональными антителами при разбавлении 1:1000, и с использованием набора ЕСЬ (АтегкЬат, Бакингемшир, Англия).

Из фиг. 8 видно, что В1 является способным к самоассоциированию, а также к взаимодействию с ТКАЕ1. Уровень взаимодействия оказался примерно таким же самым, что и самоассоциации. Никакое прямое взаимодействие с ТКАЕ-2 или 1 АР1 не наблюдается.

Пример 5. В1 связывается с Е субъединицей У-АТРазы.

Два гибридных фильтра с САКО-доменом В1 в качестве приманки получали в процессе клонирования Е субъединицы У-АТРазы (обзор №1коп е! а1., Е.хрепепйа 52 (1996 рр. 1101-1110).

Е субъединицу У-АТРазы флуоресцентно метят и инкубируют с образцом САКО-домена В1 в присутствии различных образцов библиотеки органических молекул или пептидов. После инкубации, В1-САКО подвергают иммунопреципитации определенными антителами и измеряют количество флуоресценции, ассоциированное с преципитатом. Молекулы, мешаю щие осаждению флуоресцентно меченого Ебелка, затем исследуют на возможность использования соединения в качестве лекарственного средства, влияющего на рост и/или воспаление клеток посредством действия Е-субъединицы АТРазы.

При наличии полного описания данного изобретения, специалистам будет понятно, что заявленное предложение может быть осуществлено в широком диапазоне эквивалентных параметров, концентраций и условий, не отступая от сущности и объема изобретения и без излишнего экспериментирования.

Хотя данное изобретение описано в виде его конкретных осуществлений, понятно, что возможны и его дальнейшие модификации. Данная заявка охватывает любые модификации, использования или приложения изобретения, которые в целом следуют основным принципам изобретения, включая такие отступления от настоящего описания, которые находятся в пределах известной или общепринятой практики в данной области, к которой относится изобретение, и в соответствии с признаками, сформулированными далее в объеме предложенной формулы изобретения.

Все ссылки, цитируемые здесь, включая изданные журнальные статьи или резюме, или соответствующие заявки США или иностранные заявки, поданные в США, или иностранные патенты, или любые другие ссылки, полностью включены в данное описание, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, представленный в цитируемых ссылках. Дополнительно включены также полные содержания ссылок, цитируемых в тех ссылках, которые представлены в описании.

В ссылках на известные стадии способов, обычные стадии способов, известные способы или обычные способы ни в коем случае не раскрыт какой-либо аспект описания или вариант воплощения настоящего изобретения, представленного здесь, и нет никакого указания или предположения о такой возможности такого раскрытия.

Предшествующее описание каждого конкретного воплощения полностью иллюстрирует сущность изобретения, поэтому любой специалист в данной области может, используя навыки в данной области (а также принимая во внимание содержание ссылок, цитируемых здесь), легко модифицировать и/или приспосабливать для различных использований такое конкретное воплощение без излишнего экспериментирования, не отклоняясь от общей концепции существующего изобретения. Поэтому такие применения и модификации должны быть в пределах параметров и диапазона эквивалентов описанных воплощений, основанных на указаниях и руководстве, представленных в данной заявке. Должно быть понятно, что используемая здесь фразеология или терминология служат только для целей описания, а не ограничения, и являются таковыми, чтобы терминология или фразеология существующей спецификации могла интерпретироваться квалифицированным специалистом на основании исследований и рекомендаций, представленных здесь, в сочетании с обычными знаниями в данной области.

Ссылки

1. Абе1тап е! а1., (1983) 1)\А 2, 183.

2. А1петп, Е.З. е! а1., (1995) 1. Вю1. СЬет. 270, 4312-4317.

3. АикиЬе1, ЕМ. е! а1., (1994) ебк., Сиггеп! Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду.

4. Ваеиег1е, Р.А., апб Непке1, Т. (1994) Апп. Кеу. 1ттипо1.

5. Вахап, ЕЕ (1993). Сиггеп! Вю1оду 3, 603606.

6. ВегЬепсЬ, I., ЗЬи, 6.Б., апб К1агк, Е.А. (1994) 1. 1ттипо1. 153, 4357-66.

7. Веи!1ег, В., апб уап Нийе1, С. (1994). Зс1епсе, 264, 667-8.

8. В1апк, У., КошИкку, Р., апб 1кгае1, А. (1992). Тгепбк ВюсЬет. ЗсЕ, 17, 135-40.

9. Во1бш, М.Р. е! а1., (1995а) ί. Вю1. СЬет. 270, 337-341.

10. Во1бт, М.Р., УагГо1отееу, Е.Е., Рапсег, Ζ., Ме!!, ЕЬ., Сатошк, ЕН., апб Vа11асЬ, Ό. (1995Ь). ί. Вю1. СЬет., 270, 7795-7798.

11. Во1бш, М.Р. е! а1., (1996) Се11, 85, 803815.

12. Сао, Ζ. е! а1., (1996а) №!иге, 383, 443446.

13. Сао, Ζ. е! а1., (1996Ь) Зыепсе, 271, 11281131.

14. СЬеп, С.Е е! а1., (1992) Апп. Ν.Υ. Асаб. Зск, 660:271-273.

15. СЬепд, 6., С1еагу, А.М., Υе, Ζ-к., Нопд, Ό.Ι., Ьебегтап, З. апб ВаШтоге, Ό. (1995) Зс1епсе, 267:1494-1498.

16. СЬепд, 6. апб ВаШтоге, Ό. (1996) 6епек Эеу. 10, 963-973.

17. СЫппа1уап, А.М., О'Коигке, К., Те\уагг М., апб Όίχί!, У.М. (1995) Се11, 81, 505-512.

18. СЫппа1уап, А.М. е! а1. (1996) 1. Вю1. СЬет. 271, 4573-4576.

19. Сге1дЬ!оп, Т.Е., Рго!ешк: З!гис!иге апб

Мо1еси1аг РгорегБек, Ргеетап & Со., Зап

Ргапаксо, Са. 1983.

20. Сгок!оп, 6.Е., Сао, Ζ., апб 6оеббе1, ϋ.ν., (1995). 1. Вю1. СЬет., 270, 16514-7.

21. П1Попа!о, ЕА. , Мегсипо, Р. апб Капп, М. (1995). Мо1. Се11. Вю1., 15, 1302-11.

22. Эиап, Н. апб Όίχί!, У.М., (1997) №!иге, 385, 86-89.

23. БигГее, Т. е! а1., (1993) 6епек. Оеу., 7:555-569.

24. Р1е1б, ί. е! а1., (1988) Мо1. Се11 Вю1., 8:2159-2165.

25. беукеп, Н.М., (1985) 1ттипо1. Тобау, 6, 364-369.

26. беукеп, Н.М. е! а1., (1987) 1. 1ттипо1. МеШ, 102, 259-274.

27. СПтоге, Τ.Ό, апд Могт, Р.к (1993). Тгепдз Сепе!., 9, 427-33.

28. Соззеп, М. апд Вщагд, М. (1992) ΡΝΆ8 89:5547-5551.

29. Сге11, М., Поит, Е., \Уа)ап1. Н., Ьокдеп, М., С1аизз, М., Вахетег, В., Сеогдорои1оз, 8., Ьезз1аиег, V., КоШаз, С., РГщепта1ег, К., апд Зскеипск, Р. (1995). Се11 83, 793-802.

30. СгШ1, М., СЫи, И, апд Ьепагдо, М.1. (1993). 1п! ВеуСу!оЬ.

31. Напкз, 8.К., Оикт, А.М., апд Нип!ег, Т. (1988). 8с1епсе, 241, 42-52.

32. НоГтапп К. е! а1., (1997) Т1В8 Мау 22, 1997, р. 155-156.

33. Но^агд, Α.Ό. е! а1., (1991) 1. 1ттипо1., 147, 2964-2969.

34. Нзи, Н., 8ки, Н.-В., Рап. М.-С., апд Соеаде1. Ό.ν. (1996). Се11 84, 299-308.

35. Неи, Н., Хюпд, 1. , апд Соедде1, Ό.ν. (1995). Се11 81, 495-504.

36. КаиГтапп, 8.Н. (1989) Сапсег Вее. 49, 5870-5878.

37. КаиГтапп, 8.Н. (1993) Сапсег Вее. 53, 3976-3985.

38. Ьа1тапаск-С1гагд, А.С., Скйез, Т.С., Рагкег, О.С., апд Во!кз!ет, Т.Ь. (1993). 1. Ехр. Мед. 177, 1215-1219.

39. Ьа7еЬп1к, Υ.Α. е! а1. (1994) №!иге, 371, 346-347.

40. МаПшп, Ν.Ό. е! а1., (1997) №!иге, 385, 540-544.

41. Мазк1та, Т. е! а1. (1995) Вюскет. Вюркуз. Вез. Соттип., 209, 907-915.

42. МсЭопаИ. Р.Р., Сазза!е11а. М.А., Ва1д,

А., Мадд1, Е., Вотадпаш, 8., Сгизз, Н.1., апд Р1/ζθ1θ, С. (1995). Еиг. 1. 1ттипо1. 25, 2870-6.

43. Меззтд е! а1., Тк1гд С1еуе1апд 8утрозшт оп Масгото1еси1аз апд ВесотЫпап! ΌΝΑ, ЕД. А. ^а1!оп, Е1зеу1ег. Атз!егдат (1981)

44. М1Шдап. С.Е. е! а1., (1995) №игоп, 15, 385-393.

45. Моз1а1оз, С., ВйкепЬаск, М., Υа1атапск1И, В., VаηΑ^зда1е, Т., ^аге, С., апд К1еГГ, Е. (1995). Се11, 80, 389-399.

46. МигашзЫ, 8. е! а1., (1991) Ркагт. Везеагск, 8, 649.

47. Ν ада 1а, 8. апд Со1з!еш, Р. (1995) 8с1епсе, 267, 1449-1456.

48. Вепзтд-ЕЫ, А., Незз, 8., 21ед1егНейЬгоск, Н. V. Ь., В1е!кти11ег, С., апд Епде1тапп, Н. (1995). 1. 1п1атт. 45, 161-174.

49. Во!ке М., Рап, М.-С., Не^е1, V.!, Аугез, Т.М., апд Соедде1, Ό.ν. (1995Ь). Се11 83, 1243-1252.

50. Во!ке, М., 8агта, V., Όίχί!, ν^., апд Соедде1, Ό.ν. (1995а). 8с1епсе 269, 1424-1427.

51. Во!ке, М., \Уопд. 8.С., Нете1, XV.!. апд Соедде1, Ό.ν. (1994). Се11 78, 681-692.

52. Во!ке, М. е! а1., (1996) Ргос. №11. Асад. 8с1. И.8.А. 93, 8241-8246.

53. ЩЩска е! а1., (1993) 8аепсе, 260, 487.

54. 8атЬгоок е! а1., (1989) Мо1еси1аг с1оп1пд: а 1аЬога!огу тапиа1. Со1д 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, Со1д 8рппд НагЬог, Ν.Υ.

55. 8апо е! а1., (1992) 8с1епсе, 258, 120.

56. 8апо е! а1., (1991) В1о!ескп1диез, 9, 1378.

57. 8скге1Ьег, Е., МайЫаз, Р., Ми11ег, М.М. апд 8скаГГпег, V. (1989), Кис. Ас1дз Вез. 17:6419.

58. 8скик е! а1., С.Е., Ргтс1р1ез оГ Рго!еш 8!гис!иге, 8ргшдег^ег1ад, Ν©\ν Υо^к, Ν.Υ. 1798.

59. 81еа!к, Р.В. е! а1., (1990) 1. Вю1. Скет. 265, 14526-14528.

60. 8ткк, С.А., Еаггак, Т., апд Соод\ут.

В.С. (1994). Се11 76, 959-962.

61. 8!апдег, В.2. е! а1., (1995) Се11 81, 513523.

62. ТкогпЬеггу, КА. е! а1., (1992) №!иге, 356, 768-774.

63. ТкогпЬеггу, КА. е! а1., (1994) Вюскет1з!гу, 33, 3934-3940.

64. Игеп, А.С. е! а1. (1996) Ргос. №!1. Асад. 8ск И8А 93, 4974-4978.

65. VапдепаЬее1е, Р., Оес1егс₄, V. , Веуаей. В. , апд Иегз, V. (1995). Тгепдз Се11 Вю1. 5, 392400.

66. Vа^Го1отееν. Е.Е., Во1дт, М.Р., Сопскагоу, Т.М., апд Vа11аск, Ό. (1996). 1. Ехр. Мед. ίη ргезз.

67. VаззаШ, Р. (1992) Апп. Веу. 1ттипо1. 10, 411-452.

68. ν©ίηι е! а1., (1987) Ме!к. Еηζуто1. 153,

3.

69. Vа11аск, Ό. (1996) Еиг. Су!окше №!. 7, 713-724.

70. Vа11аск. Ό. (1997) Тгепдз Вюскет. 8ск 22, 107-109.

71. Vаηд, Ь. е! а1., (1994) Се11 78, 739-750.

72. νΐ1Η А.Е. е! а1., (1989) Ргос. №!1. Асад. 8с1. И8А, 86:1603-1607.

73. Υаηд, Е. апд Когзтеуег, 1. (1996) В1оод 88(2), 386-401.

74. 2асскапа, 8. е! а1., (1991) Еиг. 1. Ркагтасо1. 203, 353-357.

75. 2као, 1.1. апд Иск, Ь. (1993) Книге 365: 448-451.

Список последовательностей (1) СБШДЯ ИНФОРМАЦИЯ:

ίί) ЭАЯЗИТЕЛЬ:

(А) АДРЕСАТ: ΥΕϋΑ КЕ5ЕАВСН ΑΝΟ ЬЕУЕБОЗУЕМТ СО. БТЭ.

(3) УЛИЦА: ΝΕΙΖΜΑΝΝ ΙΝΒΤΙΤυΤΕ ОГ 5С1ЕМСЕ, Р.О.В. 35 ΊΟ ГОРОД: КЕНОУОТ (Ξί ГОСУДАРСТВО: 15КАЕД (Г) ИНДЕКС (21?): 76100 (О) ТЕЛЕФОН: 972-8-9344093 (Н) ТЕЛЕФАКС: 972-8-9470739 (A) ИМЯ: ИДББАСН, САУЮ (B) УЛИЦА: 24 ЭОКОСНОУ ЗТКЕЕТ (С; ГОРОД: КЕНОУОТ (Е) ГОСУДАРСТВО: 15ВАЕБ (?) ИНДЕКС (21Р) : 76406 (A) ИМЯ: ЗОБНИ, МАКК (B) УЛИЦА: ΒΕΙΤ СБОКЕ, ΗΕΙΖΜΑΝΝ ΙΝΕΙ'ΪΤυΤΕ ОТ ΕΟΖΕΝΤΕ (C) ГОРОД: КЕНОУОТ (Е1 ГОСУДАРСТВО: 13ВАЕЛ (Г) ИНДЕКС (21?): 76100 (А! ИМЯ: ΜΑΗΝΪΝ, И1КОЛА1 (3) УЛИЦА: ΒΕΙΤ СЛОВЕ, ΗΕΙΖΜΑΝΝ ΙΝΟΤΙΤΟΈ БГ ЗСГЕЛСЕ (С) ГОРОД: КЕНОУОТ (Е; ГОСУДАРСТВО: 15КАЕЛ (Д ИНДЕКС (21?): 76100 (1·-) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: МОДУЛЯТОРЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ВОСЕАГЕНИЧ, ПУТЕЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ И КЛЕТОЧНОГО ВЫЖИВАНИЯ (ίίί: КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 2

А·.’) ЭЛЕКТРОННАЯ ФОРМА:

(А) ТИП НОСИТЕЛЯ: ЕБорру сНзк (3) КОМПЬЮТЕР: Ι3Μ РС сотрасБЫе (С) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РС-005/МЗ-203 (О) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: РаБегЛ Iη ЯеБоазе #1.С, УегзБоп (ν:.) ДАННЫЕ ПО ПРИОРИТЕТНОЙ ЗАЯВКЕ:

(А) НОМЕР ЗАЯВКИ: 1Б 121011 (3) ДАТА ПОДАЧИ: 05 ИЮНЯ 1997 ГОДА (νί) ДАННЫЕ ПО ПРИОРИТЕТНОЙ ЗАЯЗКЕ:

(A) НОМЕР ЗАЯВКИ: 1Л 121199 (3) ДАТА ПОДАЧИ: 30 ИЮНЯ 1997 ГОДА (νί) ДАННЫЕ ПО ПРИОРИТЕТНОЙ ЗАЯВКЕ:

;А) НОМЕР ЗАЯВКИ: 1Л 121746 (B) ДАТА ПОДАЧИ: 11 СЕНТЯБРЯ 199? ГОДА (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 3Ε0 ΙΟ ΝΟ: 1:

ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(А) ДЛИНА: 540 аминокислот (3) ТИП: аминокислотная (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Б) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Εζ) БД ΝΟ: 1

Мес ί

Азп

СБу

СБи

АБа 5

Не

Суз Зег

АБа Беи 10

Рго

Тпг

_1е Рго

15

Н13

ЦуЕ

Беи

АБа

Α3ϋ

Беи

Агд

Туг

Беи

Зег

Агд

СБу

АБа

Зег

СБу

Г.пг

V а Б

20

25

30

Зег

АБа

Агд

НБз

АБа

Азр

Тгр

Агд

УаБ

С1г.

УаБ

АБа

УаБ

Буз

НБз

35

40

Б 5

Бес

Н15

Не

НБз

ТЬг

Рго

Беи

Азр

Зег

СБи

Агд

Буз

Азр

'.'аБ

Беи

50

55

60

Агд

(Ли

АБа

СБи

Не

Беи

НБз

Буз

А1а

Агд

РЬе

Зег

Т у г

Σ. е

Рпе

Рго

65

70

75

80

Т 1 е

Беи

С-Бу

Не

Суз

Азп

СБи

Рго

СБи

РЬе

Беи

С

Не

У а (

Тпг

СБи

35

90

95

Тут

Мес

Рго

Азп

СБу

Зег

Беи

Азп

СБи

Беи

Б.еи

Н ; !5

А г о

Буз

Т.П г

СБи

100

105

110

Туг

Рго

Азр

УаБ

АБа

Тгр

Рго

Беи

Агд

РЬе

Агл

Не

Беи

Н15

СБи

1 Бе

115

1 20

125

АБа

Беи

С-Бу

УаБ

Азп

Туг

Беи

НБз

Азп

МеС

Нпг

Но

Р г о

Беи

НБз

130

135

140

Н13

Азо

Беи

Буз

ТЬг

СБп

Азп

Пе

Беи

д_зс

А з г.

СБи

РЬе

НБз

УаБ

14 5

150

15 5

160

ЬуЕ

Т1 е

АБа

Азр

РЬе

СБу

Беи

Зег

Буз

Тгр

Агд

Мес

Ме:

Зег

Беи

Зег

165

170

175

31 П

Зег

Аг с

Зег

Буз

Зег

АБа

Рго

СБи

СБу

Тог

Г Бе

1 1 _е

Туг

160

185

ΐ 90

Мег

Рго

СБи

Азп

Туг

СБи

Рго

СБу

СБп

Буз

Агд

АБа

Зег

И е

195

200

205

Ьуз

Η1Ξ

Азр

Не

Туг

5ег

Туг

АБа

УаБ

I Бе

ТЬг

Тгр

СИ

Та 1

Г.еи

Зег

21С

215

220

Аге

Буз

С-1г.

Рго

РЬе

СБи

Азр

УаБ

ТЬг

Азп

Рго

Беи

С .г.

Не

М е с.

Туг

225

230

235

240

Зег

'3 а 1

Зег

С1п

СБу

НБз

Ага

Рго

УаБ

Не

Азп

СБи

Зег

Беи

Рго

245

250

255

Туг

Азо

Пе

Рго

НБз

Агд

АБа

Агд

МеС

Не

Зег

Беа

I ±е

СБи

Зег

31 у

260

265

2 70

Тгр

АБа

С1п

Азп

Рго

Азр

СБи

Агд

Рго

Зег

РЬе·

Беи

Буз

Суз

Беи

Б Бе

6Ί

275

280

285

СДс

Ьеи

С-1и

Рго

УаД

Деи

Агд

ТЬг

РЬе

СДи

Не

ТЬг

РЬе

Дел

СДи

290

295

300

АДа

УаД

Не

СДп

Деи

Дуз

ТЬЬ

Ьуз

Деи

СДп

Зег

УаД

Зег

АДа

30 5

310

315

32С

Не

НДз

Деи

Суз

Азр

Дуз

Мед

СДи

Ьеи

Зег

Ьеи

Азп

1Де

Рго

325

330

335

Та 1

Азп

НДз

С1у

Рго

СДп

СДи

Зег

Суз

СДу

Зег

ЗДп

Деи

НДз

340

345

3 5 С

О1с

Аз η

Зег

С1у

Зег

Рго

СДи

ТЬг

Зег

Агд

Зег

Деи

Рго

АД а

Рго

СДп

355

360

365

Азе

Азп

Азр

РЬе

Деи

Зег

Агд

Дуз

АДа

СДп

Азр

Ту=

Т у г

Зле-

Мес

Дуз

370

375

3 8 0

Дес

НДз

Суз

Рго

СДу

Азп

НДз

Зег

Тгр

Азр

Зег

Тлг

Не

Зег

СДу

335

390

395

400

Зег

СДп

Агд

АДа

РЬе

Суз

Азр

НДз

Ьуз

ТЬг

Рго

Суз

Зег

405

4Д0

415

АДа

Не

11е

Азп

Рго

Деи

Зег

Тлг

АДа

С1у

А- п

Зег

С1с

Агд

Деи

С 1 п

420

425

4 3 0

Рго

СДу

Не

АДа

СДп

Тгр

Не

СДп

Зег

Дуз

Агд

31 с

Азр

Не

7аД

435

4-10

4 4 5

Азп

ОС г.

Мес

Тог

СДи

АДа

Суз

Деи

Азп

СДг.

Зег

Дес

Азо

.3 а

Деи

4 5 0

455

4 60'

Зег

Агд

Азр

Ьеи

Не

МеД

Дуз

СДи

Азр

туг

СДи

Деи

7а Д

Зег

ТЬг

Дуз

465

470

475

4 И

Рго

ТЬг

Агд

ТЬг

Зег

Дуз

УаД

Агд

СДп

Дес

Деи

Азр

ТЬг

Тлг

Азо

Не

435

4 90

4 Н

С1п

С-У

С-Га

СДи

РЬе

АДа

Дуз

УаД

Не

УаД

СДп

Дуз

Деи

Дуз

Азр

Азп

500

505

5 ίθ

Ьуз

СДп

Мес

СДу

Деи

СДп

Рго

Туг

Рго

СДи

7 Де

1.еи

У г. 1

V- 1

Зег

Агд

515

520

Зег

Рго

Зег

Ьеи

Азп

Деи

СДп

Азп

Ьуз

Зег

Мес

530 535 540 ίίι! ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А! ДЛИНА: 2098 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С; КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (о; ТОПОЛОГИЯ: линейная

аатссзтотт сассОттасс сссааатаОт тстсстттст айатсаос.-т стттаааттт1960

АСТТСААААТ ААААССАТСТ ААСТСАСТСТ ТТТТСААСАА САА.АТЛ7СТТ 7САТАА_ААСС'.920

АТАТТТА7А7 СТС7С-ТТССТ 7ТСАСТТТТТ Т7А7АТАААА 7С\7СТОА'77А 7 Г ААА С С 77'л1937

ΑΙ·;·.’ίπΑΑΡ.0-Κ7 С7Т72ККТАА АТАТТАСТСТ СССТССАТСА САСТиСАЗТЛ 7Τ7ΤΤ777ΑΛ СС4С

ТТААТАСААЗ ТАААААСТТС ААТТТСАААА АААААААААА ΆΡΛαΑΑΑΑΑΑ А.к-_-'.чАА.А 2 С ?Б

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Молекула ДНК, кодирующая белок В1 с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 3А, способный модулировать внутриклеточные каскады воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, прямо или косвенно ассоциируясь с другими внутриклеточными модуляторами или медиаторами указанных каскадов, а также фрагменты и варианты указанной ДНК, полученные на основе вырожденности генетического кода.
2. Молекула ДНК по п.1, имеющая нуклеотидную последовательность, приведенную на фиг. 3В.
3. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу ДНК по п.1 или 2 или ее фрагмент.
4. Вектор по п.3, способный экспрессироваться в эукариотической клетке-хозяине.
5. Вектор по п.3, способный экспрессироваться в прокариотической клетке-хозяине.
6. Штамм трансформированных эукариотических клеток-хозяев, содержащих вектор по любому из пп.3-5.
7. Штамм трансформированных прокариотических клеток-хозяев, содержащих вектор по любому из пп. 3-5.
8. Белок В1, способный модулировать внутриклеточные каскады воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, прямо или косвенно ассоциируясь с другими внутриклеточными модуляторами или медиаторами указанных каскадов, кодируемый молекулой ДНК по п.1 или 2, а также его фрагменты и варианты, полученные, как указано в описании.
9. Белок В1 по п.8, кодируемый молекулой ДНК по п.2.
10. Способ получения белка В1 или его фрагментов или вариантов по п.8 или 9, предусматривающий культивирование штамма трансформированных клеток-хозяев по п.6 или 7 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного белка с возможной посттрансляционной модификацией и выделением указанного белка.
11. Антитело, специфичное по отношению к белку В1 или его фрагменту или варианту по п.8 или 9.
12. Фрагмент антитела, охарактеризованного в п.11.
13. Способ модуляции в клетках активности механизмов воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания или любого иного сигнального механизма, активность которого модулируется или опосредуется белком В1, или его фрагментом, или вариантом по п.8 или 9 или молекулами, с которыми связывается или иным образом взаимодействует указанный белок В1, или его фрагмент, или вариант, причем указанный способ предусматривает введение в указанные клетки указанного белка В1, или его фрагмента, или варианта в виде, приемлемом для их внутриклеточного введения.
14. Способ модуляции в клетках активности механизмов воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания или любого иного сигнального механизма, активность которого модулируется или опосредуется белком В1, или его фрагментом, или вариантом по п.8 или 9 или молекулами, с которыми связывается или иным образом взаимодействует указанный белок В1, или его фрагмент, или вариант, причем указанный способ предусматривает введение в указанные клетки вектора по любому из пп.3-5.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой рекомбинантный вектор на основе вируса животного, содержащий также молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), способный связываться со специфичным рецептором на поверхности указанных клеток.
16. Способ модуляции в клетках механизмов воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, активность которых модулируется или опосредуется белком В1 по п.8 или 9, а на поверхности указанных клеток экспрессирован белок В1, или его фрагмент, или вариант, причем указанный способ предусматривает обработку указанных клеток фармацевтической композицией, содержащей антитело или его фрагмент по п.11 или 12, приготовленной в форме, пригодной для внеклеточного применения.
17. Способ модуляции в клетках механизмов воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, активность которых модулируется или опосредуется белком В1 по п.8 или 9, имеющим внутриклеточную локализацию, причем указанный способ предусматривает обработку указанных клеток фармацевтической композицией, содержащей антитело или его фрагмент по п.11 или 12, приготовленной в форме, пригодной для внутриклеточного применения.
18. Способ модуляции в клетках механизмов воспаления, клеточной гибели или клеточного выживания, активность которых модулируется или опосредуется белком В1 по п.8 или 9, причем указанный способ предусматривает введение в указанные клетки рекомбинантного вируса на основе вируса животного, содержащего рибозимную последовательность, способную взаимодействовать в клетках с последовательностью мРНК, кодирующей белок В1 по п.8 или 9, причем при экспрессии указанная рибозимная последовательность взаимодействует в указанных клетках с указанной мРНК и расщепляет ее, что приводит к ингибированию образования белка В1 в клетках.
19. Фармацевтическая композиция для модуляции воспаления, клеточной гибели, клеточного выживания или других механизмов в клетках, которые модулируются непосредственно или опосредованно белком В1 по п.8 или 9, содержащая в качестве активного ингредиента белок В1, или его фрагмент, или вариант по п.8 или 9 или их смеси.
20. Фармацевтическая композиция для модуляции воспаления, клеточной гибели, клеточного выживания или других механизмов в клетках, которые модулируются непосредственно или опосредованно белком В1 по п.8 или 9, содержащая в качестве активного ингредиента вектор по п.3 или 4, представляющий собой рекомбинантный вектор на основе вируса животного, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), способный к связыванию со специфичным рецептором на поверхности указанных клеток.
21. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с регуляцией апоптоза одной или несколькими молекулами, с которыми непосредственно или опосредованно связывается белок В1 по п.8 или 9, причем указанная композиция содержит в качестве активного ингредиента белок В1, или его фрагмент, или вариант по п.8 или 9.
22. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения патологического состояния, ассоциированного с регуляцией апоптоза одной или несколькими молекулами, с которыми непосредственно или опосредованно связывается белок В1 по п.8 или 9, причем указанная композиция содержит в качестве активного ингредиента молекулу ДНК по п.1 или 2, или ее фрагмент, или вариант.
23. Способ скрининга лиганда, способного связываться с белком В1 по п.8 или 9, предусматривающий взаимодействие носителя для афинной хроматографии, к которому присоединен указанный белок, с экстрактом анализируемых клеток в условиях, обеспечивающих связывание лиганда с указанным носителем, и элюцию, выделение и анализ указанного лиганда.
24. Способ скрининга последовательности ДНК, кодирующей лиганд, способный связываться с белком В1 по п.8 или 9, предусматривающий использование дрожжевого двухгибридного метода, согласно которому последовательность, кодирующая указанный белок В1, переносится одним гибридным вектором, а последовательность из библиотеки кДНК или геномной ДНК переносится вторым гибридным вектором, трансформацию дрожжевых клетокхозяев указанными векторами, выделение положительных трансформированных клеток и выделение указанного второго гибридного вектора с получением последовательности, кодирующей указанный лиганд.
25. Способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую или опосредуемую белком В1 по п.8 или 9, предусматривающий

a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, содержащим, по меньшей мере, часть белка В1, содержащую, по меньшей мере, некоторые аминокислотные остатки белка В1, приведенные на фиг. 3, которые включают в себя по существу весь продомен ΟΆΚΩ (домен рекрутинга каспазы) белка В1;

b) идентификацию и характеристику лиганда, отличного от ВСЬ2, ΤΚΑΡ2 или частей рецептора из семейства рецепторов ΤΝΡ/Ν6Ρ или других известных белков, содержащих продомен САКЭ, обладающих способностью к указанному связыванию по данным указанной стадии скрининга; и

С) получение указанного лиганда в существенно выделенной и очищенной форме.
26. Способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую или опосредуемую белком В1 по п.8 или 9, предусматривающий

а) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, содержащим, по меньшей мере, карбоксиконцевую часть последовательности белка В1, приведенной на фиг. 3, включающую продомен САКЭ;

2.

область, которая не взаимодействует с клоном 10(ΝΜΡ1), 9 и 15 в 2-гибридном тесте

Ь) идентификацию и характеристику лиганда, отличного от ВСЬ2, ΤΚΑΡ2 или частей рецептора из семейства рецепторов ΤΝΡ/Ν6Ρ или других известных белков, содержащих продомен СΑΚ^, обладающих способностью к указанному связыванию по данным указанной стадии скрининга; и

С) получение указанного лиганда в существенно выделенной и очищенной форме.
27. Способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую или опосредуемую белком В1 по п.8 или 9, предусматривающий

a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, содержащим, по меньшей мере, аминоконцевую часть последовательности белка В1, приведенной на фиг. 3, которая включает в себя по существу весь киназный домен белка В1;

b) идентификацию и характеристику лиганда, отличного от ВСЬ2, ΤΚΑΡ2 или частей рецептора из семейства рецепторов ΤΝΡ/Ν6Ρ или других известных внутриклеточных модуляторных белков, обладающих способностью к указанному связыванию по данным указанной стадии скрининга; и

С) получение указанного лиганда в существенно выделенной и очищенной форме.