KR20010086072A - 신생 세포 성장 억제를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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지앙 첸
오드리 고다드
오스틴 엘. 거니
케네쓰 힐란
매리 나피어
윌리암 아이. 우드
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 신생 세포 성장 억제를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항종양 조성물 및 종양 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 성장 억제제, 예를 들어 항종양 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 신규한 폴리펩티드 및 이들 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명에서는 이들 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 이종성 폴리펩티드 서열에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체 및 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

신생 세포 성장 억제를 위한 방법 및 조성물 {Methods and Compositions for Inhibiting Neoplastic Cell Growth}
악성 종양(암)은 미국에서 심장병 다음으로 두번째로 많은 사인(死因)이다 (문헌[Boring et al., CA Cancel J. Clin., 43:7 (1993)] 참조).
암은, 정상 조직으로부터 유래하며 증식하여 종양 덩어리를 형성하는 비정상 또는 신생 세포의 수의 증가, 이들 신생 종양 세포에 의한 인접 조직의 침입, 및 혈액 또는 림프구 체계를 통해 국소적 림프절 및 원거리 지역에까지 결국 퍼지는(전이) 악성 세포의 생성을 특징으로 한다. 암 상태의 세포는 정상 세포가 성장하지 않는 조건 하에서도 증식한다. 암은 상이한 정도의 침입성 및 공격성을 특징으로 하여 다양한 형태로 나타난다.
암 치료에 있어서의 최근의 발전에도 불구하고, 신생 세포 성장을 억제할 수 있는 새로운 치료제가 대단히 요구되고 있다. 따라서, 암 세포와 같은 신생 세포의 성장을 억제할 수 있는 화합물을 동정하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명은 신생 세포 성장을 억제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항종양 조성물 및 종양 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 성장 억제제, 예를 들어 항종양 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다.
도 1은 천연 서열 PRO655 cDNA의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:1)을 나타내고, 여기서 SEQ ID NO:1은 본 명세서에 "DNA50960-1224"로 명명된 클론이다.
도 2는 도 1에 나타난 SEQ ID NO:1의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 나타낸다.
도 3은 천연 서열 PRO364 cDNA의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:6)을 나타내고, 여기서 SEQ ID NO:6은 본 명세서에 "DNA47365-1206"으로 명명된 클론이다.
도 4는 도 3에 나타난 SEQ ID NO:6의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열(SEQ ID NO:7)을 나타낸다.
도 5는 천연 서열 PRO344 cDNA의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:16)을 나타내고, 여기서 SEQ ID NO:16은 본 명세서에 "DNA40592-1242"로 명명된 클론이다.
도 6은 도 5에 나타난 SEQ ID NO:16의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열(SEQ ID NO:17)을 나타낸다.
<본 발명의 요약>
A. 실시태양
본 발명은 신생 세포 성장을 억제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은, 포유류 환자, 바람직하게는 인간에 있어 유방암, 전립선암, 결장암, 폐암, 난소암, 신장암 및 CNS 암, 백혈병, 흑색종 등과 같은 암을 포함하는 종양 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
일 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트 유효량과 제약학적으로 허용되는 담체의 부가 혼합물을 포함하는 신생 세포 성장 억제를 위해 유용한 물질 조성물에 관한 것이다. 바라직한 실시태양에서, 물질 조성물은 성장 억제량의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트를 포함한다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 조성물은 세포 독성 양의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트를 포함한다. 임의적으로, 물질 조성물은 하나 이상의 부가적인 성장 억제제 및(또는) 세포독성제 및(또는) 기타 화학요법제를 함유할 수 있다.
추가적인 면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트의 치료적 유효량을 포함하는, 포유류의 종양 치료에 유용한 물질 조성물에 관한 것이다. 종양은 바람직하게는 암이다.
또다른 면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 PRO655, PRO364 또는 PRO344폴리펩티드 또는 그 아고니스트 유효량에 세포를 노출시키는 것을 포함하는, 종양 세포의 성장 억제를 위한 방법에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 아고니스트는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 아고니스트 항체이다. 또다른 실시태양에서, 아고니스트는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 소(小)분자이다. 이 방법은 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(in vitro)로 수행 가능하다.
또다른 추가적인 실시태양에서, 본 발명은
(a) 용기,
(b) 용기 중에 들어있는 유효 성분을 포함하는 조성물 (여기서, 조성물은 신생 세포 성장, 예를 들어 종양 세포 성장을 억제하기에 효과적이며, 조성물 중의 유효 성분은 본 명세서에 정의된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드, 또는 그 아고니스트임); 및
(c) 신생 세포 성장의 억제를 위한 상기 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트의 용도를 언급하는, 상기 용기에 부착된 표지 또는 상기 용기 중에 포함된 패키지 삽입물 (여기서, 아고니스트는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 결합하는 항체일 수 있음)
을 포함하는 제품에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 아고니스트는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 아고니스트 항체이다. 다른 실시태양에서, 아고니스트는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 소분자이다. 본 명세서에 정의된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트를 종양 치료에 치료학상 효과적인 양으로 포함하는 유사한 제품 또한 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 발명에 정의된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트, 및 추가로 성장 억제제, 세포 독성제 또는 화학요법제를 포함하는 제품 또한 본 발명의 범위에 속한다.
B.추가 실시태양
본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명은 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
일 면에서, 단리된 핵산 분자는, (a) 본 명세서에 개시된 전장 아미노산 서열을 가지는, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드, 본 명세서에 개시된 시그널 펩티드를 결여한 아미노산 서열, 본 명세서에 개시된, 시그널 서열이 존재 또는 부재하는 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본 명세서에 개시된 전장 아미노산 서열의 임의의 기타 구체적으로 정의된 단편을 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) (a)의 DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 상동성 및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 면에서, 단리된 핵산 분자는, (a) 본 명세서에 개시된 전장 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 cDNA의 코딩 서열, 본 명세서에 개시된 시그널 펩티드를 결여한 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 코딩 서열, 본 명세서에 개시된 시그녈 펩티드가 존재 또는 부재하는 막횡단 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 세포외 도메인의 코딩 서열, 또는 본 명세서에 개시된 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 기타 단편의 코딩 서열, 또는 (b) (a)의 DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 상동성 및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가적인 면에서, 본 발명은 (a) 본 명세서에 개시된 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 것과 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) (a)의 DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 상동성 및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 다른 면은, 막횡단 도메인에 제거되었거나 또는 막횡단 도메인이 불활성화된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그러한 코딩 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인이 고려된다.
또다른 실시태양은, 예를 들어 항-PRO655, PRO364 또는 PRO344 항체를 위한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 임의적으로 코딩할 수 있는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 단편을 코딩하기 위한 혼성화 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브로서 사용 가능한 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 코딩 서열의 단편 또는 그 상보체에 관한 것이다. 그러한 핵산 단편은 대개 약 20 뉴클레오티드 길이 이상, 바람직하게는 약 30 뉴클레오티드 길이 이상, 더욱 바람직하게는 약 40 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 50 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 60 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 70 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 80 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 90 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 100 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 110 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 120 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 130 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 140 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 150 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 160 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 170 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 180 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 190 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 200 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 250 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 300 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 350 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 400 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 450 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 500 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 600 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 700 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 800 뉴클레오티드 길이 이상, 더더욱 바람직하게는 약 900 뉴클레오티드 길이 이상 및 더더욱 바람직하게는 약 1000 뉴클레오티드 길이 이상이고, 여기서 "약"이라는 용어는 언급되는 뉴클레오티드 서열 길이 ± 언급되는 길이의 10%를 의미한다. PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 신규 단편은, 수 개의 주지된 서열 정렬 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열을 기타 공지된 뉴클레오티드 서열과 정렬시키고 어느 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 단편(들)이 신규한가를 결정함으로써, 통상적인 방법으로 결정될 수 있다는 것을 주목할 것이다. 그러한 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 모두는 본 발명에서 고려되었다. 또한, 이들 뉴클레오티드 분자 단편에 의해 코딩되는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 단편도 고려되었다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 확인된 임의의 단리 핵산 서열에 의해 코딩되는 단리된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 제공한다.
특정 면에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 전장 아미노산 서열을 가지는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드, 본 명세서에 개시된 시그널 펩티드를 결여한 아미노산 서열, 본 명세서에 개시된 시그널 펩티드가 존재 또는 부재하는 막횡단 단백질의 세포외 도메인 또는 본 명세서에 개시된 전장 아미노산 서열의 임의의 기타 구체적으로 정의된 단편과 약 80% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 상동성 및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 PRO655,PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가적인 면에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 약 80% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 상동성, 더더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 상동성 및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가적인 면에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 전장 아미노산 서열을 가지는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 아미노산 서열, 본 명세서에 개시된 시그널 펩티드를 결여한 아미노산 서열, 본 명세서에 개시된 시그널 펩티드가 존재 또는 부재하는 막횡단 단백질의 세포외 도메인 또는 본 명세서에 개시된 전장 아미노산 서열의 임의의 기타 구체적으로 정의된 단편과 비교시, 약 80% 이상의 양성, 바람직하게는 약 81% 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 93% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 양성, 더더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 양성 및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 양성을 기록하는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 관한 것이다.
구체적 면에서, 본 발명은 N-말단 시그널 서열 및(또는) 개시 메티오닌을 가지지 않고 전술한 바와 같은 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단리된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 제공한다. 동일물을 제조하는 방법 또한 본 명세서에 기재되며, 여기서 이 방법은 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 적합한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 면은 막횡단 도메인이 제거되었거나 또는 막횡단 도메인이 불활성화된 단리된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 제공한다. 동일물을 제조하는 방법 또한 본 명세서에 기재되며, 여기서 이 방법은 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 적합한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 천연 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 아고니스트에 관한 것이다. 특별 실시태양에서, 아고니스트는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 아고니스트 항체 또는 소분자이다.
추가적인 실시태양에서, 본 발명은, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키고 상기 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 모니터링하는 것을 포함하는, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 대한 아고니스트를 동정하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드는 천연 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드이다.
또다른 추가적인 실시태양에서, 본 발명은 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드, 또는 본 명세서에 기재된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 아고니스트 또는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 아고니스트 항체를 담체와 조합하여 포함하는 물질 조성물에 관한 것이다. 임의적으로, 담체는 제약학적으로 허용되는 담체이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드, 그 아고니스트 또는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 아고니스트 항체에 응답하는 증상의 치료에 있어 유용한 의약의 제조를 위한, 전술한 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트 또는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 아고니스트 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 본 발명은 임의의 전술한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 임의의 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 제공된다. 예로서, 숙주 세포는 CHO 세포, 대장균, 효모 또는 바쿨로바이러스-감염 곤충 세포일 수 있다. 전술한 임의의 폴리펩티드를 제조하는 방법이 추가로 제공되며 이는 요망되는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 세포 배양물로부터 요망 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 임의의 전술한 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 그러한 키메라 분자의 예로는 에피토프 태그 서열 또는 면역글로불린의 Fc 지역에 융합된 임의의 전술한 폴리펩티드를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 임의의 전술 또는 후술하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의적으로, 항체는 모노클론 항체, 인간화 항체, 항체 단편 또는 단쇄(single-chain) 항체이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 게놈성 또는 cDNA 뉴클레오티드 서열의 단리를 위해 또는 안티센스 프로브로서 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하며, 여기서 이들 프로브는 임의의 전술 또는 후술한 뉴클레오티드 서열로부터 유래할 수 있다.
<발명의 상세한 설명>
본 명세서에서 사용된 용어 "PRO655", "PRO364" 또는 "PRO344" 폴리펩티드 또는 단백질은 천연 서열 PRO655, PRO364 또는 PRO344 및 PRO655, PRO364 또는 PRO344 변이체(본 명세서에서 추가로 정의됨)를 포괄한다. PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드는 인간 조직 유형 또는 다른 원과 같은 다양한 원으로부터 단리되거나 또는 재조합 및(또는) 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
"천연 서열 PRO655", "천연 서열 PRO364" 또는 "천연 서열 PRO344"는 자연적으로 유래된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 천연 서열 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드는 자연으로부터 단리되거나 또는 재조합 및(또는) 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 용어 "천연 서열" PRO655, PRO364 또는 PRO344는 자연 발생 절단 또는 분비 형태 (예. 세포외 도메인 서열), 자연 발생 변이체 형태 (예. 선택 재조합(alternatively spliced) 형태) 및 PRO655, PRO364 및 PRO344 폴리펩티드의 자연 발생 대립 유전자 변이체를 구체적으로 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에서, 천연 서열 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드는 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 또는 도 6(SEQ ID NO:17) 각각에 나타난 것과 같은 성숙 또는 전장 천연 서열 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드이다. 또한, 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 또는 도 6(SEQ ID NO:17) 각각에 개시된 PRO655, PRO364또는 PRO344 폴리펩티드가 본 명세서에 아미노산 위치 1로 명명된 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 나타나는 반면, 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 또는 도 6(SEQ ID NO:17) 각각의 아미노산 위치 1의 상류 또는 하류에 위치한 또다른 메티오닌 잔기가 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 출발 아미노산 잔기로서 사용되는 것도 생각해 볼 수 있으며 또한 가능하다.
본 명세서에 개시된 폴리펩티드의 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 막횡단 및 세포질 도메인이 실질적으로 없는 형태의 폴리펩티드를 일컫는다. 보통, 폴리펩티드 ECD는 약 1% 미만의 그러한 막횡단 또는 세포질 도메인을 가질 것이며, 바람직하게는 약 0.5% 미만의 그러한 도메인을 가질 것이다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 확인된 임의의 막횡단 도메인은 그러한 유형의 소수성 도메인을 확인하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인된다는 것을 이해할 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계는 다양할 수 있으나, 초기에 확인되고 첨부 도면에 나타난 도메인의 어느 쪽 끝에서 약 5 아미노산 이하일 가능성이 크다. 따라서, 본 발명의 일 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드의 세포외 도메인은 성숙한 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 X를 포함하며, 여기서 X는 세포외 도메인/막횡단 도메인 경계의 어느 쪽 끝의 5 아미노산 이내의 임의의 아미노산이다.
본 명세서에 개시된 다양한 PRO 폴리펩티드의 "시그널 펩티드"의 대략적인 위치는 첨부 도면에 나타나 있다. 그러나, 시그널 펩티드의 C-말단 경계가 다양할 수 있으나 본 명세서에서 초기에 확인된 시그널 펩티드 C-말단 경계의 어느 쪽의 약 5 아미노산 이하일 가능성이 크며, 여기서 시그널 펩티드의 C-말단 경계는 그러한 유형의 아미노산 서열 요소를 확인하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인될 수 있다는 것을 주목할 것이다 (예. 문헌[Nielsen et al., Prot.Eng., 10:1-6 (1997)] 및 [Heinje et al., Nucl. Acids. Res., 14:4683-4690 (1986)] 참조). 또한, 특정 경우, 분비된 폴리펩티드로부터의 시그널 서열의 분할은 전체적으로 균일하지 않으며 그 결과 둘 이상의 분비된 종이 생성된다. 시그널 펩티드가 본 명세서에서 확인된 시그널 펩티드의 C-말단 경계의 어느쪽에서 약 5 아미노산 이하 내에서 분할된 이들 성숙한 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에서 고려되었다.
"PRO655 변이체 폴리펩티드"는, (a) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 PRO655 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 208, (b) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 PRO655 폴리펩티드의 X 내지 208 (여기서, X는 도 2(SEQ ID NO:2)의 17에서 26까지의 임의의 아미노산 잔기임), 또는 (c) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 이하 정의된 활성 PRO655 폴리펩티드(천연 서열 PRO655 폴리펩티드 이외의)를 의미한다.
"PRO364 변이체 폴리펩티드"는, (a) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 PRO364 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 26 내지 241, (b) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 PRO364 폴리펩티드의 X 내지 241 (여기서, X는 도 4(SEQ ID NO:7)의 21에서 30까지의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 4(SEQ ID NO:7)의 1 또는 약 26 내지 X (여기서, X는 도 4(SEQ ID NO:7)의 아미노산 158 내지 아미노산 167까지의 임의의 아미노산임),또는 (d) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 이하 정의된 활성 PRO364 폴리펩티드(천연 서열 PRO364 폴리펩티드 이외의)를 의미한다.
"PRO344 변이체 폴리펩티드"는, (a) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 PRO344 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 16 내지 243, (b) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 PRO344 폴리펩티드의 X 내지 243 (여기서, X는 도 6(SEQ ID NO:17)의 11에서 20까지의 임의의 아미노산 잔기임), 또는 (c) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 이하 정의된 활성 PRO344 폴리펩티드(천연 서열 PRO344 폴리펩티드 이외의)를 의미한다.
그러한 PRO655, PRO364 또는 PRO344 변이체는 예를 들어, 천연 서열의 하나 이상의 내부 도메인 내에서 뿐 아니라 N- 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 포함한다.
통상적으로, PRO655 변이체는 (a) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 PRO655 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 208, (b) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 PRO655 폴리펩티드의 X 내지 208 (여기서, X는 도 2(SEQ ID NO:2)의 17에서 26까지의 임의의 아미노산 잔기임), 또는 (c) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편과 약 80% 이상의 아미노산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 상동성 및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가질 것이다.
통상적으로, PRO364 변이체는, (a) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 PRO364 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 26 내지 241, (b) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 PRO364 폴리펩티드의 X 내지 241 (여기서, X는 도 4(SEQ ID NO:7)의 21에서 30까지의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 4(SEQ ID NO:7)의 1 또는 약 26 내지 X (여기서, X는 도 4(SEQ ID NO:7)의 아미노산 158 내지 아미노산 167까지의 임의의 아미노산임), 또는 (d) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편과 약 80% 이상의 아미노산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 상동성 및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가질 것이다.
통상적으로, PRO344 변이체는, (a) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 PRO344 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 16 내지 243, (b) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 PRO344 폴리펩티드의 X 내지 243 (여기서, X는 도 6(SEQ ID NO:17)의 11에서 20까지의 임의의 아미노산 잔기임), 또는 (c) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편과 약 80% 이상의 아미노산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 상동성, 더욱바람직하게는 약 93% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 상동성 및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가질 것이다.
통상적으로, PRO655, PRO364 및 PRO344 변이체 폴리펩티드는 약 10 아미노산 이상의 길이, 종종 약 20 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 30 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 40 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 50 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 60 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 70 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 80 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 90 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 100 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 150 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 200 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 250 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 300 아미노산 이상의 길이, 또는 그 이상의 길이이다.
이하 나타내는 바와 같이, 표 1은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 위한 완전한 소스 코드를 제공한다. 이 소스 코드는 UNIX 작업 시스템 상에서 사용하기 위해 통상적으로 컴파일하여 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 제공할 수 있다.
또한, 표 2A-2D는 후술하는 방법을 사용하여 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 사용하여 %아미노산 서열 상동성(표 2A-2B) 및 %핵산 서열 상동성(표 2C-2D)을 결정하는 가정적 예시를 나타낸다. 여기서, "PRO"는 관심있는 가상적PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "비교 단백질"은 관심있는 "PRO" 폴리펩티드를 비교하는 대상인 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "PRO-DNA"는 관심있는 가정적 PRO655, PRO364 또는 PRO344-코딩 핵산 서열을 나타내고, "비교 DNA"는 관심있는 "PRO-DNA" 핵산 분자를 비교하는 대상인 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, "X", "Y" 및 "Z"은 각각 상이한 가정적 아미노산 잔기를 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가정적 뉴클레오티드를 나타낸다.
본 명세서에서 확인된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 서열에 대한 "백분율(%) 아미노산 서열 상동성"은, 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 백분율 서열 상동성을 얻고 어떠한 보존적 치환도 서열 상동성의 일부로 고려하지 않은 후, PRO655, PRO364 또는 PRO344 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 백분율 아미노산 서열 상동성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 통상의 기술 범위 내의 다양한 방법으로 얻을 수 있으며, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메걸라인(Megalign; DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공용화된 컴퓨터 소프트웨어를 사용할 수 있다. 당업자라면 비교 대상인 서열의 전장에 걸친 최대 정렬을 얻기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위해 적합한 매개 변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본 명세서의 목적상, %아미노산 서열 상동성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용함으로써 후술하는 바와 같이 얻을 수 있으며, 여기서 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 소스 코드는 표 1에 주어져 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)사에 의해제작되었으며, 표 1에 나타난 소스 코드는 미국 20559 워싱턴 디.씨.에 소재한 미국 저작청에 사용자 문헌과 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 제TXU510087호로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코에 소재한 제넨테크, 인크.사를 통해 공용화되었으며 표 1에 제공된 소스 코드로부터 컴파일할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작업 시스템, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서 사용하도록 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 세팅되었으며 변화하지 않는다.
본 발명의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에의, 와의 또는 에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 %아미노산 서열 상동성(달리 말하면, 주어진 아미노산 서열 B에의, 와의 또는 에 대한 특정 %아미노산 서열 상동성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A)은 다음과 같이 계산된다.
100 곱하기 X/Y 비
상기 식에서 X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 프로그램의 A 및 B의 정렬에 있어 그 프로그램에 의해 서로 일치하는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B에 대한 %아미노산 서열 상동성은 B의 A에 대한 %아미노산 서열 상동성과 동일하지 않으리라는 것을 알 수 있다. %아미노산 서열 상동성 계산의 예로서, 표 2A-2B는 "비교 단백질"이라는 아미노산 서열의 "PRO"라는 아미노산 서열에 대한 %아미노산 서열 상동성을 어떻게 계산하는지를 보여준다.
달리 특정적으로 언급되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 %아미노산 서열 상동성 값은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 사용하여 전술한 바와 같이 얻는다. 그러나, %아미노산 서열 상동성은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 사용하여 측정할 수도 있다 (문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)] 참조). NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 http://www.ncbi.nim.nih.gov로부터 다운로드받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 몇 개의 검색 변수를 사용하며, 여기서 그러한 검색 변수는 전부, 예를 들어 언마스크(unmask)=yes, 스트랜드(strand)=모두(all), 예상 발생=10, 최소 저 복잡성 길이=15/5, 멀티-패스 값=0.01, 멀티 패스 상수=25, 최종 갭 정렬을 위한 감소=25 및 스코어링 매트릭스=BLOSUM62를 포함하는 값들을 디폴트하기 위해 세팅되었다.
NCBI-BLAST2를 아미노산 서열 비교를 위해 사용하는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에의, 와의 또는 에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 %아미노산 서열 상동성(달리 말하면, 주어진 아미노산 서열 B에의, 와의 또는 에 대한 특정 %아미노산 서열 상동성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A)은 다음과 같이 계산한다.
100 곱하기 X/Y 비
상기 식에서 X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 프로그램의 A 및 B의 정렬에 있어 그 프로그램에 의해 서로 일치하는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B에 대한 %아미노산 서열 상동성은 B의 A에대한 %아미노산 서열 상동성과 동일하지 않으리라는 것을 알 수 있다.
또한, %아미노산 서열 상동성은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수도 있다 (문헌 [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)] 참조). 대부분의 WU-BLAST-2 검색 변수는 디폴트 값으로 세팅한다. 디폴트 값으로 세팅하지 않은 것, 즉 조정 가능한 변수들은 다음 값으로 세팅한다: 중복 스팬=1, 중복 분획=0.125, 단어 스레숄드(T)=11, 및 스코어링 매트릭스=BLOSUM62. 본 발명의 목적상, %아미노산 서열 상동성 값은 (a) WU-BLAST-2에 의해 측정시, 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 가지는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 관심있는 비교 아미노산 서열(즉, 중요한 PRO 폴리펩티드를 비교하는 대상인 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음) 사이의 서로 일치하는 아미노산 잔기의 수를 (b) 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총 수로 나누어 결정한다. 예를 들어, "아미노산 서열 B에 80% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 구절에서, 아미노산 서열 A는 관심있는 비교 아미노산 서열이며 아미노산 서열 B는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
"PRO655 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO655 변이체 핵산 서열"이란, 하기 정의된 활성 PRO655 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 PRO655 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 208을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 PRO655 폴리펩티드의 아미노산 X 내지 208을 코딩하는 핵산 서열 (여기서, X는 도 2(SEQ ID NO:2)의 17에서 26까지의 임의의아미노산 잔기임), 또는 (c) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 가지는 것을 의미한다. 통상적으로, PRO655 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 PRO655 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 208을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 PRO655 폴리펩티드의 아미노산 X 내지 208을 코딩하는 핵산 서열 (여기서, X는 도 2(SEQ ID NO:2)의 17에서 26까지의 임의의 아미노산 잔기임), 또는 (c) 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 81% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 93% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 핵산 서열 상동성및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 핵산 서열 상동성을 가질 것이다. PRO655 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 PRO655 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
"PRO364 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO364 변이체 핵산 서열"이란, 하기 정의된 활성 PRO364 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 PRO364 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 26 내지 241을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 PRO364 폴리펩티드의 아미노산 X 내지 241을 코딩하는 핵산 서열 (여기서, X는 도 4(SEQ ID NO:7)의 21에서 30까지의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 4(SEQ ID NO:7)의 아미노산 1 또는 약 26 내지 X (여기서, X는 도 4(SEQ ID NO:7)의 아미노산 158 내지 아미노산 167까지의 임의의 아미노산임)를 코딩하는 핵산 서열, 또는 (d) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 가지는 것을 의미한다. 통상적으로, PRO364 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 PRO364 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 26 내지 241을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 PRO364 폴리펩티드의 아미노산 X 내지 241을 코딩하는 핵산 서열 (여기서, X는 도 4(SEQ ID NO:7)의 21에서 30까지의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 4(SEQ ID NO:7)의 아미노산 1 또는 약 26 내지 X (여기서, X는 도 4(SEQ ID NO:7)의 아미노산 158 내지 아미노산 167까지의 임의의 아미노산임)를 코딩하는 핵산 서열, 또는 (d) 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 81% 이상의 핵산 서열상동성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 93% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 핵산 서열 상동성 및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 핵산 서열 상동성을 가질 것이다. PRO364 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 PRO364 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
"PRO344 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO344 변이체 핵산 서열"이란, 하기 정의된 활성 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 PRO344 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 16 내지 243을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 PRO344 폴리펩티드의 X 내지 243 (여기서, X는 도 6(SEQ ID NO:17)의 11에서 20까지의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산 서열, 또는 (c) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 가지는 것을 의미한다. 통상적으로, PRO344는 (a) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 PRO344 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 16 내지 243을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 PRO344 폴리펩티드의 X 내지 243 (여기서, X는 도 6(SEQ ID NO:17)의 11에서 20까지의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산 서열, 또는 (c) 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유도된 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 81% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 82% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 83% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 84% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 86% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 87% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 88% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 89% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 91% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 92% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 93% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 94% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 96% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 핵산 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 핵산 서열 상동성 및 더더욱 바람직하게는 약 99% 이상의 핵산 서열 상동성을 가질 것이다. PRO344 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 PRO344 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
통상적으로, PRO655, PRO364 또는 PRO344 변이체 폴리뉴클레오티드는 약 30 뉴클레오티드 이상의 길이, 종종 약 60 뉴클레오티드 이상의 길이, 더욱 종종 약 90 뉴클레오티드 이상의 길이, 더욱 종종 약 120 뉴클레오티드 이상의 길이, 더욱 종종 약 150 뉴클레오티드 이상의 길이, 더욱 종종 약 180 뉴클레오티드 이상의 길이, 더욱 종종 약 210 뉴클레오티드 이상의 길이, 더욱 종종 약 240 뉴클레오티드 이상의 길이, 더욱 종종 약 270 뉴클레오티드 이상의 길이, 더욱 종종 약 300 뉴클레오티드 이상의 길이, 더욱 종종 약 450 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 600 아미노산 이상의 길이, 더욱 종종 약 900 뉴클레오티드 이상의 길이, 또는 그 이상의 길이이다.
본 발명에서 확인된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드-코딩 핵산 서열에 대한 "백분율(%) 핵산 서열 상동성"은, 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 백분율 서열 상동성을 얻은 후, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드-코딩 핵산 서열 중의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열 중의 뉴클레오티드의 백분율로서 정의된다. 백분율 핵산 서열 상동성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 통상의 기술 범위 내인 다양한 방법으로 얻을 수 있으며, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메걸라인(Megalign; DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공용화된 컴퓨터 소프트웨어를 사용할 수 있다. 당업자라면 비교 대상인 서열의 전장에 걸친 최대 정렬을 얻기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위해 적합한 매개 변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적상, %핵산 서열 상동성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용함으로써 후술하는 바와 같이 얻을 수 있으며, 여기서 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 소스 코드는 표 1에 주어져 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)사에 의해 제작되었으며, 표 1에 나타난 소스 코드는 미국 20559 워싱턴 디.씨.에 소재한 미국 카피라이트 오피스에 사용자 문헌과 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 제TXU510087호로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코에 소재한 제넨테크, 인크.사를 통해 공용화되었으며 표 1에 제공된 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작업 시스템, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서 사용하도록 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 세팅되었으며 변화하지 않는다.
본 발명의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에의, 와의 또는 에 대한 주어진 핵산 서열 C의 %핵산 서열 상동성(달리 말하면, 주어진 아미노산 서열 D에의, 와의 또는 에 대한 특정 %핵산 서열 상동성을 가지거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C)은 다음과 같이 계산된다.
100 곱하기 W/Z 비
상기 식에서 W는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 프로그램의 C 및 D의 정렬에 있어 그 프로그램에 의해 서로 일치하는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D 중의 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, C의 D에 대한 %핵산 서열 상동성은 D의 C에 대한 %핵산 서열 상동성과 동일하지 않으리라는 것을 알 수 있다. %핵산 서열 상동성 계산의 예로서, 표 2C-2D는 "비교 DNA"라는 핵산 서열의, "PRO-DNA"라는 핵산 서열에 대한 %핵산 서열 상동성을 계산하는 방법을 보여준다.
달리 특정적으로 언급되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 %핵산 서열 상동성 값은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 사용하여 전술한 바와 같이 얻는다. 그러나, %핵산 서열 상동성은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST-2를 사용하여 측정할 수도 있다 (문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)] 참조). NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 http://www.ncbi.nim.nih.gov로부터 다운로드받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 몇 개의 검색 변수를 사용하며, 여기서 그러한 검색 변수는 전부, 예를 들어 언마스크(unmask)=yes, 스트랜드(strand)=모두(all), 예상 발생=10, 최소 저 복잡성 길이=15/5, 멀티-패스 값=0.01, 멀티 패스용 상수=25, 최종 갭 정렬을 위한 감소=25 및 스코어링 매트릭스=BLOSUM62를 포함하는 값들을 디폴트하기 위해 세팅되었다.
NCBI-BLAST2를 사용하여 서열 비교를 하는 경우, 주어진 핵산 서열 D에의, 와의 또는 에 대한 주어진 핵산 서열 C의 %핵산 서열 상동성(달리 말하면, 주어진 핵산 서열 D에의, 와의 또는 에 대한 특정 %핵산 서열 상동성을 가지거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C)은 다음과 같이 계산한다.
100 곱하기 W/Z 비
상기 식에서 W는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 프로그램의 C 및 D의 정렬에 있어 그 프로그램에 의해 서로 일치하는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고,Z는 D 중의 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, C의 D에 대한 %핵산 서열 상동성은 D의 C에 대한 %핵산 서열 상동성과 동일하지 않으리라는 것을 알 수 있다.
또한, %핵산 서열 상동성 값은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수도 있다 (문헌 [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)] 참조). 대부분의 WU-BLAST-2 검색 변수는 디폴트 값으로 세팅한다. 디폴트 값으로 세팅하지 않은 것, 즉 조정 가능한 변수들은 다음 값으로 세팅한다: 중복 스팬=1, 중복 분획=0.125, 단어 스레숄드(T)=11, 및 스코어링 매트릭스=BLOSUM62. 본 발명의 목적상, %핵산 서열 상동성 값은 (a) WU-BLAST-2에 의해 측정시, 천연 서열 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산으로부터 유도된 서열을 가지는 관심있는 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 분자의 핵산 서열 및 관심있는 비교 핵산 분자(즉, 관심있는 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 분자를 비교하는 대상인 서열로서, 변이체 PRO 폴리뉴클레오티드일 수 있음) 사이의 서로 일치하는 뉴클레오티드의 수를 (b) 관심있는 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 분자의 뉴클레오티드의 총 수로 나누어 결정한다. 예를 들어, "핵산 서열 B에 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 가지는 핵산 서열 A를 포함하는 단리된 핵산 분자"라는 구절에서, 핵산 서열 A는 관심있는 비교 핵산 서열이며 핵산 서열 B는 관심있는 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 분자의 핵산 서열이다.
다른 실시태양에서, PRO655, PRO364 또는 PRO344 변이체 폴리뉴클레오티드는 각각 활성 PRO655, PRO364 또는 PRO344 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이며, 이는 도 2(SEQ ID NO:2)에 나타난 전장 PRO655 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에, 도 4(SEQ ID NO:7)에 나타난 전장 PRO364 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에, 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 전장 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 각각에, 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건 하에서, 혼성화할 수 있다. PRO655, PRO364 및 PRO344 변이체 폴리펩티드는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것들일 수 있다.
전술한 대로 수행된 아미노산 서열 상동성 비교 문맥에서 "양성"이라는 용어는, 비교된 서열 중에 동일한 것 뿐 아니라 유사한 특성을 지니는 아미노산 잔기를 포함한다. 관심있는 아미노산 잔기에 대해 양성 값을 기록하는 아미노산 잔기는 관심있는 아미노산 잔기와 동일하거나 또는 관심있는 아미노산 잔기의 바람직한 치환(이하 표 3에 정의된 바와 같이)인 것이다.
본 발명의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에의, 와의 또는 에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 %양성 값(달리 말하면, 주어진 아미노산 서열 B에의, 와의 또는 에 대한 특정 %양성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A)은 다음과 같이 계산된다.
100 곱하기 X/Y 비
상기 식에서 X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 프로그램의 A 및 B의 정렬에 있어 그 프로그램에 의해 상기 정의한 바와 같이 양성을 기록하는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B에 대한 %양성은 B의 A에 대한 %양성과 동일하지 않으리라는 것을 알 수 있다.
본 명세서에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용되는 "단리된"이라는 용어는 그 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리되고(되거나) 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드는 자연적으로 관련된 모든 성분들과 연관성이 없다. 그 자연 환경의 오염 성분들은 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도와 전형적으로 간섭하는 물질들이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할수 있다. 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠매씨 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비 환원성 또는 환원성 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 균질도로 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는, PRO655, PRO364 또는 PRO344 자연 환경의 하나 이상의 성분이 부재할 것이기 때문에 재조합 세포 내에서 제자리(in situ) 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자 또는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 항체를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자는, PRO655, PRO364 또는 PRO344-코딩 핵산 또는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344-코딩 핵산의 천연 원 중에서 상기 핵산과 통상적으로 연관되어 있는 하나 이상의 오염 핵산 물질로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 자연적으로 연관된 모든 성분들과 연관이 없다. 단리된 PRO655, PRO364또는 PRO344-코딩 핵산 분자 또는 단리된 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344-코딩 핵산 분자는 자연적으로 발견되는 형태 또는 세팅이 아니다. 단리된 핵산 분자는 따라서 자연 세포 중에 존재하는 PRO655, PRO364 또는 PRO344-코딩 핵산 분자 또는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344-코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자는, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 항체를 통상적으로 발현하는 세포 중에 함유된 PRO655, PRO364 또는 PRO344-핵산 분자 또는 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344-핵산 분자를 포함하며, 여기서 핵산 분자는, 예를 들어, 자연 세포와 상이한 크로모좀 위치에 존재한다.
"대조 서열"이라는 용어는, 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 대조 서열은 예를 들어 프로모터, 임의적으로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은, 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 예비서열(presequence) 또는 분비 리더를 위한 DNA는, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동 가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는, 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되며; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진시키도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"이라 함은, 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 또한 분비 리더의 경우 인접하고 판독 상(reading phase)에 있는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 반드시 인접할 필요 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 이루어진다. 만약 그러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 통상적인 관행에 따라 사용된다.
"항체"라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 예를 들어 단일 항-PRO655, 항-PRO364 및 항-PRO344 모노클론 항체(아고니스트 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 지닌 항-PRO655, 항-PRO364 및 항-PRO344항체 조성물, 단쇄 항-PRO655, 항-PRO364 및 항-PRO344 항체 및 항-PRO655, 항-PRO364 및 항-PRO344 항체의 단편을 구체적으로 포함한다(하기 참조). 본 명세서에서 사용된 "모노클론 항체"라는 용어는, 일 개체군의 실질적으로 균일한 항체로부터 얻은 항체, 즉 개체군을 이루는 개개 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 말한다.
혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 결정되며, 일반적으로, 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 의존하는 실험적 계산이다. 일반적으로, 더 긴 프로브는 적당한 어닐링을 위해 더 높은 온도를 요하는 반면, 더 짧은 프로브는 더 낮은 온도를 요한다. 혼성화는 일반적으로, 용융 온도 미만의 환경에서 상보적 가닥이 존재할 때 변성된 DNA의 재어닐링 능력에 의존한다. 프로브와 혼성화 서열 사이의 요망 상동성의 정도가 클수록, 사용 가능한 상대 온도가 더 높다. 그 결과, 더 높은 상대 온도가 반응 조건을 더욱 엄격하게 만드는 경향이 있고, 반면, 더 낮은 온도는 덜 엄격하게 하는 경향이 있게 된다. 혼성화 반응의 엄격성에 관한 추가적인 세부 사항 및 설명을 위해 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)]을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 정의된 "엄격한 조건" 또는 "고 엄격성 조건"은 (1) 낮은 이온 농도 및 높은 세척 온도, 예를 들어 50℃에서 0.015M 염화나트륨/0.0015M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 사용; (2) 혼성화 동안 포름아미드와 같은 변성 시약의 사용, 예를 들어 42℃에서 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨과 함께 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/pH 6.5의 50 mM 인산나트륨 완충액과 함께 50%(v/v) 포름아미드의 사용; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC(0.75M NaCl, 0.075M 시트르산 나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트(Denhardt) 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(50 ㎍/㎖), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 술페이트의 사용 및 42℃에서 0.2 x SSC(염화나트륨/시트르산나트륨) 및 55℃에서 50% 포름아미드 중의 세척 및 이어 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1 x SSC로 이루어진 고 엄격성 세척에 의해 확인할 수 있다.
"중간 정도로 엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에서 기술된 대로 확인 가능하며, 전술한 것보다 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건(예. 온도, 이온 농도 및 %SDS)의 사용을 포함한다. 중간 정도로 엄격한 조건의 예로는, 20% 포름아미드, 5 x SSC(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml 변성 전단(sheared) 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 일야 배양 후 필터를 약 37-50℃에서 1 x SSC 중에서 세척하는 것이다. 당업자라면 프로브 길이 등과 같은 요소들을 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 농도 등을 조정하는 방법을 알 것이다.
본 명세서에서 사용된 "에피토프 태그된"이라는 용어는, "태그 폴리펩티드"에 융합된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 일컫는다. 태그 폴리펩티드는 충분한 잔기를 가져 항체를 만들 에피토프를 제공할 수 있으나 또한 충분히 짧아 융합되는 폴리펩티드의 활성을 간섭하지 않는다. 태그 폴리펩티드는 바람직하게는 또한 적절하게 고유해서 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차 반응하지 않는다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기 및 통상적으로 약 8 내지 50 사이의 아미노산 잔기(바람직하게는, 약 10 및 20 사이의 아미노산 잔기)를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 "면역어드헤신"이라는 용어는, 이종성 단백질("어드헤신")의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합하는 항체-유사 분자를 가리킨다. 구조적으로, 면역어드헤신은, 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 요망 결합 특이성을 가진 아미노산 서열(즉, "이종성")과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합을 포함한다. 면역어드헤신 분자의 흡착 부분은 전형적으로, 최소한 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역어드헤신에서 면역글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 서브타입, IgA(IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 면역글로불린으로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 목적상 "활성인" 또는 "활성"은, 천연 또는 자연 발생 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 형태의 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 가리키며, 여기서 "생물학적" 활성이란 천연 또는 자연 발생 PRO655, PRO364 또는 PRO344이 가지는 항원성 에피토프에 대한 항체의 생성을 유도하는 능력 이외의 천연 또는 자연 발생 PRO655, PRO364 또는 PRO344에 의해 야기되는 생물학적 기능(억제성 또는 자극성)을 가리키며, "면역학적" 활성이란 천연 또는 자연 발생 PRO655, PRO364 또는 PRO344가 가지는 항원성 에피토프에 대한 항체의 생성을 유도하는 능력을 가리킨다.
본 명세서에 개시된 스크리닝 분석법에 의해 확인될 수 있는 항체 또는 기타 아고니스트 (예. 유기 또는 무기 소분자, 펩티드 등)의 문맥에서 "생물학적 활성"은 그러한 분자의 "치료학적으로 효과적인 양"의 정의와 관련하여 본 명세서에 열거된 하나 이상의 효과를 일으키는 능력을 가리키기 위해 사용된다. 구체적인 실시태양에서, "생물학적 활성"은 신생 세포 성장 또는 증식을 억제할 수 있는 능력이다. 바람직한 생물학적 활성은 표적 종양(예. 암) 세포의 성장을 지연시키거나 또는 완전히 중지시키는 것을 포함하는 억제이다. 다른 바람직한 생물학적 활성은 표적 종양(예. 암) 세포의 죽음을 야기시키는 세포독성 활성이다. 또다른 바람직한 생물학적 활성은 표적 종양(예. 암) 세포의 아폽토시스(apoptosis)의 유도이다.
"면역학적 활성"이라는 구절은, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 중하나 이상의 에피토프와의 면역학적 교차 반응성을 의미한다.
"면역학적 교차 반응성"은 본 명세서에서, 후보 폴리펩티드가 공지의 활성 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 대해 키운 폴리클로날 항혈청(antisera)과 이 활성을 가진 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 정성적 생물학적 활성을 경쟁적으로 억제할 수 있음을 의미한다. 그러한 항혈청은, 염소나 토끼에 예를 들어 피하 주사로 완전한 프로인트 보조액 중의 공지 활성 유사체를 주입한 후 완전한 프로인트 중의 복강내 또는 피하 보조(booster) 주사함으로써, 통상적인 방식으로 제조한다. 면역학적 교차 반응성은 바람직하게는 "특이적"이며, 이는 상응하는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 대한 확인된 면역학적으로 교차 반응성인 분자(예. 항체)의 결합 친화성이 기타 다른 공지 천연 폴리펩티드에 대한 이 분자의 결합 친화성보다 상당히 높음(바람직하게는 약 2배 이상, 더욱 바람직하게는 약 4배 이상, 더더욱 바람직하게는 약 6배 이상, 가장 바람직하게는 약 8배 이상 더 높음)을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 예비 암성 및 암성 세포 및 조직을 일컫는다.
"암" 및 "암성"이라는 용어는 비제어 세포 성장을 전형적으로 특징으로 하는 포유류 중의 생리학적 증상을 일컫거나 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 더욱 구체적인 예는 유방암, 전립선암, 결장암, 편평세포암, 소세포 폐암, 비 소세포 폐암, 난소암, 경부암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 간암, 방광암, 간암, 대장암,자궁내막 암종, 타액선 암종, 신장암, 외음부암, 감상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 뇌 및 목 암을 포함한다.
"치료"는 질병의 병변의 전개를 예방하거나 변경하려는 의도에서 수행되는 개입이다. 따라서, "치료"란 치료상의 처치 및 예방 또는 예방 대책을 의미한다. 치료를 요하는 사람이란 이미 질병에 걸린 사람 뿐만 아니라 질병을 예방해야 하는 사람을 포함한다. 종양(예. 암) 치료에 있어서, 치료제는 종양 세포의 병변을 직접적으로 감소시킬 수도 있고, 또는 종양 세포를 예를 들어 방사선 및(또는) 화학요법과 같은 기타 치료제에 의한 치료가 더욱 쉽도록 만들 수도 있다.
암의 "병변"은 환자의 복지를 위태롭게 하는 모든 현상을 포함한다. 이는, 제한 없이, 비정상 또는 제어 불가능한 세포 성장, 전이, 이웃 세포의 정상적인 기능에 대한 간섭, 사이토킨 또는 기타 분비 물질의 비정상적인 수준의 방출, 염증성 또는 면역학적 응답의 억압 또는 악화 등을 포함한다.
신생세포 성장의 억제와 관련하여, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 또는 그 아고니스트의 "유효량"은 어느 정도 표적 세포의 성장을 억제할 수 있는 양이다. 이 용어는 성장 억제, 세포증식억제 및(또는) 세포독성 효과 및(또는) 표적 세포의 아폽토시스를 일으킬 수 있는 양을 포함한다. 신생세포 성장 억제 목적을 위한 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트의 "유효량"은 실험적으로 그리고 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.
종양의 치료와 연관하여 "치료학상 유효량"은, 하기 효과들 중 하나 이상을 일으킬 수 있는 양을 의미한다: (1) 감속 또는 완전한 성장 정지를 포함하는 종양성장의 어느 정도의 억제; (2) 종양 세포 수의 감소; (3) 종양 크기의 감소; (4) 주위 기관으로의 종양 세포의 침투의 억제(즉, 감소, 감속 또는 완전한 정지); (5) 전이의 억제(즉, 감소, 감속 또는 완전한 정지); (6) 반드시 그러할 필요는 없으나 종양의 퇴행 또는 거부를 야기할 수 있는, 항-종양 면역 응답의 증진; 및(또는) (7) 질병과 관련된 하나 이상의 징후의 어느 정도의 경감. 종양 치료를 위한 목적의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트의 "치료학상 유효량"은 실험적으로 그리고 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.
PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트의 "성장 억제량"은, 생체 내 또는 생체 외적으로 세포, 특히 종양 (예. 암 세포)의 성장을 억제할 수 있는 양이다. 신생세포 성장 억제를 위한 목적의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트의 "성장 억제량"은 실험적으로 그리고 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.
PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트의 "세포독성량"은, 생체 내 또는 생체 외적으로 세포, 특히 종양 (예. 암 세포)의 파괴를 야기할 수 있는 양이다. 신생세포 성장 억제를 위한 목적의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트의 "세포독성량"은 실험적으로 그리고 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서의 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 예방하고(하거나) 세포의 파괴를 야기하는 물질을 일컫는다. 이 용어는 방사성 동위원소(예. I131,I125, Y90및 Re186), 화학요법제, 및 세균성, 진균성, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 톡신과 같은 톡신, 또는 그 단편을 포함하도록 의도되었다.
"화학요법제"는 종양(예. 암)의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 사이톡신, 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(Taxol), 미국 뉴저지주 프린스턴 소재 브리스톨-마이어스스큅온콜로지) 및 독세탁셀 (탁소테어(Taxotere), Rhone-PoulencRorer, Antony, Rnace), 톡소테어, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신스, 에스페라미신스(미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 기타 관련 질소 겨자(nitrogen mustards)를 포함한다. 이 정의에는 타목시펜 및 오나프리스톤과 같이 종양에 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 호르몬제 또한 포함된다.
본 명세서에서 사용된 "성장 억제제"는, 생체 내 또는 생체 외적으로 세포, 특히 종양 (예. 암 세포)의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 가리킨다. 따라서, 성장 억제제는 S 상의 표적 세포의 백분율을 상당히 감소시키는 것이다. 성장 억제제의 예로는, G1 정지 및 M -상 정지를 일으키는 시약과 같이, (S 상 이외의 곳에서) 세포 주기 진행을 차단하는 시약을 포함한다. 고전적인 M-상 차단제는 빈카스(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 시약들 또한 S-상 정지로 떨어뜨리며 예를 들어, 타목시펜, 프레드니손, 다카바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C와 같은 DNA 알킬화제이다. 추가적인 정보는 문헌[The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p.13]에서 찾을 수 있다.
"사이토킨"이라는 용어는, 다른 세포에 세포간 중재자로서 작용하는 일 개체군의 세포에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반 용어이다. 그러한 사이토킨의 예로는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토킨 중에 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 소르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 소포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체형성호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α및 -β; 뮐러관-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 맥관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판 성장 인자; TGF-α및 TGF-β와 같은 변환 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리스로포이에틴(EPO); 골유도성(osteoinductive) 인자; 인터페론-α,-β및 -γ와 같은 인터페론; 마크로파지-CSF (M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자 (CSF); 그래뉼로사이트-마크로파지-CSF(GM-CSF); 및 그래뉼로사이트-CSF(G-CSF); IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12와 같은 인터루킨(IL); TNF-α또는 TNF-β와 같은 종양괴사인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 기타 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 사이토킨이라는 용어는 천연 원으로부터의 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토킨의 생물학적으로 활성인 동등물을 포함한다.
본 출원에서의 "전구약"이라는 용어는, 모 약(parent drug)에 비해 종양 세포에 덜 세포독성이고, 효소적으로 활성화되거나 또는 더욱 활성인 모 형태로 전환될 수 있는, 제약학상 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 말한다. 예를 들어 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14. pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985)]을 참조할 수 있다. 본 발명의 전구약은 인산염-함유 전구약, 티오인산염-함유 전구약, 글리코실화된 전구약 또는 임의적으로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약, 5-플루오로시토신 및 기타 5-플루오로우리딘 전구약을 포함하나 이에 한정되지는 않으며, 본 발명에 사용하기 위한 전구약 형태로 유도될 수 있는 것들은 상기 화학요법제를 포함하나 이로 한정되지 않는다.
"아고니스트"라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 본 명세서에 개시된 천연 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 아고니스트 분자는 구체적으로, 아고니스트 항체 또는 항체 단편, 천연 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 소 기관 분자 등을 포함한다. PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 아고니스트를 확인하기 위한 방법은 종양 세포를 후보 아고니스트 분자와 접촉시키고 종양 세포 성장의 억제를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
"만성" 투여는 시약을 급성 모드에 반대되는 연속적인 모드로 투여하여 연장된 기간동안 초기의 치료 효과(활성)을 유지하도록 하는 것을 말한다. "간헐적" 투여는 중단 없이 연속적으로 행해지지 않고 실제로 성질상 주기적인 치료를 의미한다.
치료의 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함하여 포유류로 분류되는 임의의 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
하나 이상의 추가적인 치료제와 "조합하여" 하는 투여는 동시적(일시적) 투여 및 임의의 순서의 연속적 투여를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "담체"는, 사용되는 용량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유류에 독성이 없는 제약학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학상 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예로는, 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 미만)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온; 및(또는) 상표명 TWEEN, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 상표명 PLURONICS와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 대개, 두 개의 동일한 경(L)쇄 및 두 개의 동일한 중(H)쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 헤테로4량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유결합성 이황 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 반면, 이황 연결의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄간에 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄간 이황 다리를 가진다. 각 중쇄는 한쪽 말단에 한 개의 가변 도메인(VH)에 이어 수 개의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한쪽 말단에 한 개의 가변 도메인(VL) 및 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
"가변"이라는 용어는, 가변 도메인의 특정 부분이 항체들간에 서열이 광범위하게 상이하고 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 있어 상보성-결정 지역(CDR) 또는 과가변 지역이라 불리는 세 개의 세그먼트 중에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존되는 부분은 프레임워크 지역(FR)이라 불리운다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 대개 β-시트 구조를 채택하고, 루프 연결을 형성하는 세 개의 CDR에 의해 연결되고 특정 경우 β-시트 구조의 일부를 형성하는 4개의 FR 지역을 포함한다. 각 쇄 중의 CDR은 FR 지역에 의해 서로 근접하게 고정되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., NIH Publ. No.91-3242, Vol.1, pages 647-669 (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접적으로 관여되지는 않으나, 항체-의존성 세포 독성에의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 "과가변 지역"이라는 용어는, 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 과가변 지역은 "상보성 결정 지역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991)] 참조) 및(또는) "과가변 루프"로부터의 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); 문헌 [Clothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)] 참조)를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 정의된 과가변 지역잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 지역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2및 Fv 단편; 다이아바디(diabody); 선형 항체 (문헌 [Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)] 참조); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는, "Fab" 단편이라 불리우고 각각은 단일의 항원-결합 부위를 지니는 두 개의 동일한 항원-결합 단편, 및 용이 결정화 능력을 반영하는 지시물인 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리에 의해 F(ab')2단편이 생성되며, 이는 두 개의 두 개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원과 교차 결합할 수 있다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 지역은 촘촘하고 비 공유결합 관계인 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이 구조에서는 각 가변 도메인의 세 개의 CDR이 상호작용하여 VH--VL이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 여섯 개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단 하나의 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 단 세 개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)조차도, 비록 전체 결합 부위보다는 더 낮은 친화성일지라도, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.
Fab 단편 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은, 항체의 힌지(hinge) 지역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수 개의 잔기의 첨가에 의해 Fab' 단편과 차이가 난다. Fab'-SH는 여기서, 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 기를 함유하는 Fab'을 지칭한다. F(ab')2항체 단편은 원래, 그들 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링 또한 알려져 있다.
임의의 척추동물로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 카파 및 람다라 불리우는 두 개의 분명히 구분되는 유형 중의 하나로 분류된다.
그 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 다섯 가지 주요 클래스의 면역글로불린(IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)이 있으며, 이들 중 몇몇은 서브클래스(이소타입; 예. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2)로 추가로 나누어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "모노클론 항체"라는 용어는, 실질적으로 균일한 항체 개체군으로부터 얻은 항체, 즉 개체군을 구성하는 개개의 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일한 것을 의미한다. 모노클론 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 관여한다. 또한, 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제에 대조적으로, 각 모노클론 항체는 항원 상의 단일의 결정인자에 대한것이다. 특이성에 더하여, 모노클론 항체는 기타 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균일한 개체군의 항체로부터 얻어진 항체의 특성을 나타내며, 어떤 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 요하는 것을 의미하는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클론 항체는 먼저 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 기술된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있으며 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 만들 수도 있다. "모노클론 항체"는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
여기서 모노클론 항체는 구체적으로, 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래하거나 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 중의 해당 서열과 동일하거나 또는 일치하고, 쇄(들)의 나머지는 기타 종으로부터 유래하거나 기타 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 중의 해당 서열과 동일하거나 또는 일치하는 "키메라" 항체(면역글로불린), 및 요망 생물학적 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조).
"인간화된" 형태의 비인간(예. 쥐의) 항체는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 비 인간 면역글로불린으로부터 유도된 소량의 서열을 함유하는 그 단편(예. Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 기타 항원-결합 서열)이다. 대부분의경우, 인간화된 항체는 수용체의 CDR로부터의 잔기가 요망하는 특이성, 친화성 및 용량을 가지는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비 인간 종의 CDR(공여체 항체)로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 특정 경우, 인간 면역글로불린의 Fv FR 잔기는 해당 비 인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 이입된 CDR 또는 프레임워크 서열 중 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형에 의해 항체 성능이 더욱 정제되고 최대화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 지역이 비인간 면역글로불린의 CDR 지역에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 지역이 인간 면역글로불린 서열의 FR 지역인 최소한 하나, 그리고 전형적으로 두 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 인간화된 항체는 최상으로는, 일부분 이상의 면역글로불린 불변 지역(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 지역 또한 포함할 것이다. 추가적인 세부 사항을 위해, 문헌 [Jones et al.,Nature,321:522-525 (1986)], [Reichmann et al.,Nature,332: 323-329 (1988)] 및 [Presta,Curr. Op. Struct. Biol.,2:593-596 (1992)]을 참조할 수 있다. 인간화된 항체는 항체의 항원-결합 지역이 관심있는 항원을 가진 마카크 원숭이를 면역화시켜 생성된 항체로부터 유도된 것인 상표명 PRIMATIZED 항체를 포함한다.
"단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH및 VL도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 중에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 VH및 VL도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하여 sFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 한다. sFv의 검토를 위해 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)]을 참조할 수 있다.
"다이아바디(diabody)"라는 용어는, 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL) 중에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는, 두 개의 항원-결합 부위를 가지는 작은 항체 단편을 나타낸다. 동일한 쇄 상의 두 도메인 사이에 짝을 이룰 수 없을 만큼 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 쇄 상의 상보적 도메인과 짝을 이루고 두 개의 항원-결합 부위를 창조한다. 다이아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollonger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
"단리된" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 것이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도와 간섭할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 따라 측정시 95 중량% 항체 초과, 및 가장 바림작하게는 99 중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 잔기 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠매씨 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원성 또는비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 균일도로, 정제될 것이다. 항체의 자연 환경 성분 중 하나 이상이 존재하지 않을 것이므로 단리된 항체는 재조합 세포 내에서 제자리(in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 명세서에 사용된 "표지"라는 단어는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성할 수 있도록 하는 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로서(예. 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지) 검출 가능할 수 있으며, 또는 효소적 표지의 경우, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다. 표지는 톡신과 같이 검출 불가능한 물질일 수도 있다.
"고체 상"이란, 본 발명의 항체가 고착될 수 있는 비 수성 매트릭스를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 고체 상의 예는 유리(예. 제어 다공성 유리), 다당류(예. 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올 및 실리콘으로 부분적으로 또는 전체적으로 형성된 것들을 포함한다. 특정 실시태양에서, 문맥에 따라, 고체 상은 검정분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 곳에서는 정제 컬럼(예. 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 바와 같은 불연속 입자의 불연속 고체 상을 포함한다.
"리포좀"은 약물(PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 항체와 같은)을 포유류로 전달하는 데 유용한, 다양한 유형의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 구성된 작은 소포(vesicle)이다. 리포좀의 성분은 흔히, 생물학적 막의 지질 배열과 유사하게 이층 구조로 배열되어 있다.
"소 분자"는 본 명세서에서 약 500 달톤 미만의 분자량을 가지는 것으로 정의된다.
II.본 발명의 조성물 및 방법
A.전장 PRO655, PRO364 및 PRO344 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO655, PRO364 및 PRO344로서 언급되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, PRO655, PRO364 및 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 하기 실시예에 더욱 상세히 개시되는 바와 같이 확인 및 단리되었다.
하기 실시예에 개시되는 바와 같이, PRO655, PRO364 및 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 ATCC에 기탁하였다. 클론의 실제 뉴클레오티드 서열은 당업자라면 업계의 통상적인 방법을 사용하여 기탁된 클론을 서열화함으로써 쉽게 결정할 수 있다. 예상되는 아미노산 서열은 통상적인 기술을 사용하여 뉴클레오티드 서열로부터 결정할 수 있다. 본 명세서에 기술된 PRO655, PRO364 및 PRO344 폴리펩티드 및 코딩 핵산에 대하여, 본 출원인은 당 시대의 이용 가능한 서열 정보를 가지고 최상으로 확인 가능한 판독(reading) 프레임이라 여겨지는 것을 확인하였다.
B.PRO655, PRO364 및 PRO344 변이체
본 명세서에 기재된 전장 천연 서열 PRO655, PRO364 및 PRO344 폴리펩티드에 더하여, PRO655, PRO364 및 PRO344 변이체를 제조할 수 있다고 생각된다. PRO655,PRO364 및 PRO344 변이체는, 적합한 뉴클레오티드 변화의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 DNA로의 도입, 및(또는) 요망 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 합성에 의해 제조할 수 있다. 당업자는, 아미노산의 변화가 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화 또는 막 고정 특성의 변화와 같은, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 후-번역 공정을 변화시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
천연 전장 서열 PRO655, PRO364 또는 PRO344 또는 본 명세서에 기술된 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 다양한 도메인에 있어서의 변이는, 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 기재된 보존성 및 비보존성 돌연변이에 대한 임의의 기술 및 지침을 사용하여 일으킬 수 있다. 변이는, 천연 서열 PRO655, PRO364 또는 PRO344과 비교하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 아미노산 서열에 변화를 일으키는, PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 삭제 또는 삽입일 수 있다. 임의적으로 변이는 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 하나 이상의 도메인 중의 임의의 기타 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환에 의한 것이다. 어떤 아미노산 잔기가 요망하는 활성에 악영향을 끼치지 않고 삽입, 치환 또는 삭제될 수 있는가를 결정하는 지침은, PRO655, PRO364 또는 PRO344의 서열을 상동성 공지 단백질 분자의 서열과 비교하고, 상동성이 높은 지역에서 만들어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 찾을 수 있다. 아미노산 치환은 세린에 의한 류신의 치환과 같이 유사한 구조적 및(또는) 화학적 특성을 가지는 아미노산에 의한 다른 아미노산의 치환, 즉 보존성 아미노산 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 삭제는 임의적으로 약 1 내지 5 아미노산의 범위일 수 있다. 허용되는 변이는서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 삭제 또는 치환하고, 생성된 변이체를 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 활성에 대해 시험함으로써 결정할 수 있다.
PRO655, PRO364 및 PRO344 폴리펩티드 단편이 본 발명에서 제공된다. 그러한 단편은 N-말단 또는 C-말단에서 절단되거나, 또는 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교하여 내부 잔기를 결여할 수 있다. 특정 단편은, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 요망 생물학적 활성에 필수적인 아닌 아미노산 잔기를 결여한다.
PRO655, PRO364 및 PRO344 단편은 임의의 수 가지 통상적인 기술에 의해 제조할 수 있다. 요망되는 펩티드 단편을 화학적으로 합성할 수 있다. 대체적인 접근법은, 예를 들어 특정 아미노산 잔기에 의해 정의되는 부위에서 단백질을 분할하는 것으로 알려진 효소에 의한 단백질의 처리, 또는 적합한 제한 효소에 의한 DNA의 분해 및 요망 단편의 단리와 같은, 효소적 분해에 의한 PRO655, PRO364 및 PRO344 단편의 생성을 포함한다. 또다른 적합한 기술은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 요망 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편의 단리 및 증폭을 포함한다. DNA 단편의 요망 말단을 정의하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에서 사용된다. 바람직하게는, PRO655, PRO364 및 PRO344 폴리펩티드 단편은 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 및 도 6(SEQ ID NO:17) 각각에 나타난 천연 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드와 하나 이상의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.
특정 실시태양에서, 관심있는 보존성 치환을 바람직한 치환체라는 표제 하에 표 3에 나타내었다. 그러한 치환이 생물학적 활성에 변화를 일으킨다면, 표 3에 예시적 치환체로 나타내거나 아미노산 클래스와 관련하여 하기한 바와 같은 더욱 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝한다.
PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 정체성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 구조로서의 치환 지역의 폴리펩티드 주쇄의 구조, (b) 표적 위치에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄(side chain)의 부피를 유지하는 데 대한 영향에 있어서 상당한 차이를 가져오는 치환을선택함으로써 이루어진다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 하기와 같은 군으로 나누어진다.
(1) 소수성: 노류신(norleucine), met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5)쇄 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향성: trp, tyr, phe.
비 보존성 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성요소를 다른 클래스의 것으로 교환시킬 것이다. 그러한 치환된 잔기는 보존성 치환 부위로, 또는 더욱 바람직하게는 잔류 (비보존성) 부위로 또한 도입될 수 있다.
올리고뉴클레오티드-매개 (부위-배향성) 돌연변이, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이와 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 변이를 만들 수 있다. 부위 배향성 돌연변이(문헌 [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13:4331 (1986)] 및 [Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)] 참조), 카세트 돌연변이(문헌 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)] 참조), 제한 선택 돌연변이(문헌 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] 참조) 또는 기타 공지의 기술을 클로닝된 DNA 상에 작동시켜 PRO655, PRO364 또는 PRO344 변이체 DNA를 생성할 수 있다.
스캐닝 아미노산 분석법 또한 연속적인 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을확인하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산 중에는 비교적 작은 중성 아미노산이 있다. 그러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시트테인을 포함한다. 알라닌은 베타-탄소 너머의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 구조를 변경시킬 가능성이 적기 때문에, 알라닌은 전형적으로 이 군 중 바람직한 스캐닝 아미노산이다 (문헌 [Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)] 참조). 알라닌은 가장 흔한 아미노산이기 때문에 또한 전형적으로 바람직하다. 또한, 알라닌은 묻히고 노출된 위치 모두에서 종종 발견된다 (문헌 [Creighton, The Proteins, (W.H.Freeman & Co., N.Y.)] 및 [Chothia, J. Mol. Biol. 150:1 (1976)] 참조). 알라닌 치환에 의해 적당한 양의 변이체가 생성되지 않으면, 이소테릭(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
C.PRO655, PRO364 및 PRO344의 변형
PRO655, PRO364 및 PRO344의 공유결합적 변형은 본 발명의 범위 내에 속한다. 한 가지 유형의 공유결합 변형은 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를, PRO655, PRO364 또는 PRO344의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C- 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 제제에 의한 유도화는 예를 들어 PRO655, PRO364 또는 PRO344를, 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교결합시키는 경우 유용하다. 그 역도 성립한다. 흔히 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르,3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 호모이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 시약을 포함한다.
기타 변형으로는 글루타미닐 및 아스파라지닐 잔기에서 각각 해당 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 쓰레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(문헌 [T.E. Creighton, Proteins: Structural and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)] 참조), N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 다른 유형의 공유결합적 변형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변형을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변형"은 본 명세서에서 천연 서열 PRO655, PRO364 또는 PRO344에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 삭제(기초가 되는 글리코실화 부위의 삭제 또는 키메라 및(또는) 효소적 수단에 의한 글리코실화의 제거에 의해), 및(또는) 천연 서열 PRO655, PRO364 또는 PRO344에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 의미하도록 의도되었다. 또한, 이 어구는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 성질 및 비율의 변화를 포함하여 천연 단백질의 글리코실화에 있어서의 정성적 변화를 포함한다.
PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에의 글리코실화 부위의 첨가는 아미노산 서열 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 PRO655, PRO364 또는 PRO344 (O-결합 글리코실화 부위)에 하나 이상의 세린 또는 쓰레오닌 잔기를 첨가 또는 치환함으로써 이루어질 수 있다. PRO655, PRO364 또는 PRO344 아미노산 서열은 DNA 수준에서의 변화에 의해, 특히 미리선택된 염기에서 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시켜 요망 아미노산으로 번역될 코돈을 생성시킴으로써 임의적으로 변경될 수 있다.
PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 상에 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 또다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적 또는 효소적으로 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 국제공개공보 WO 87/05330 및 문헌[Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 상에 존재하는 탄화수소 잔기의 제거는, 화학적으로 또는 효소적으로, 또는 글리코실화를 위한 표적으로서의 역할을 하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이적 치환에 의해 이루어질 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 업계에 공지되었으며 예를 들어 문헌 [Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987)] 및 [Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄화수소 잔기의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성할 수 있다.
PRO655, PRO364 또는 PRO344의 다른 유형의 공유결합적 변형은 미국 특허제4,640,835호; 4,496,689호; 4,301,144호; 4,670,417호; 4,791,192호 또는 4,179,337호에 기재된 방법으로 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 다양한 비단백질성 중합체 중 하나(예. 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌)에 연결시키는 것을 포함한다.
본 발명의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드는 또다른 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수도 있다.
일 실시태양에서, 그러한 키메라 분자는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드와, 항-태그 항체가 선별적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드의 융합을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실 말단에 위치한다. 그러한 에피토프-태그된 형태의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출 가능하다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드로 하여금 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용하여 친화성 정제법에 의해 쉽게 정제될 수 있게 한다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 주지되어 있다. 예로는 폴리-히스티딘(poly-His) 또는 폴리-히스티딘-글리신(poly-His-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그 항체 12CA5(문헌 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)] 참조); c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(문헌 [Evans et al., Molecular and CellularBiology, 5: 3610-3616 (1985)] 참조); 및 헤르페스 심플렉스(Herpes Simplex) 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 그 항체 (문헌 [Pabrosky et al., Protein Eggineering, 3(6):547-553 (1990)] 참조)를 포함한다. 기타 태그 폴리펩티드는 플랙(Flag)-펩티드(문헌 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)] 참조); KT3 에피토프 펩티드(문헌 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)] 참조); α-튜뷸린 에피토프 펩티드 (문헌 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)] 참조); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그(문헌 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)] 참조)를 포함한다.
다른 실시태양에서, 키메라 분자는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 지역과의 융합을 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자("면역어드헤신"으로도 언급됨)의 경우, 그러한 융합은 IgG 분자의 Fc 지역에일 수 있다. Ig 융합은 바람직하게는 Ig 분자 내의 하나 이상의 가변 지역 대신에 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 가용성(삭제 또는 불활성화된 막횡단 도메인) 형태의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 면역글로불린 융합은 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 지역을 포함한다. 면역글로불린 융합의 생산의 경우 1995년 6월 27일에 특허된 미국 특허 제5,428,130호를 참조할 수 있다.
D.PRO655, PRO364 및 PRO344의 제조
하기 기재는 주로, PRO655, PRO364 또는 PRO344 핵산을 함유하는 벡터에 의해 형질전화 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 생산하는 것에 관한 것이다. 물론, 당업계에 주지된 대체 방법을 사용하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 제조하는 것도 생각할 수 있다. 예를 들어, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 서열 또는 그 일부는 고체-상 기술(문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H.Freeman Co., San Francisco, CA (1969)] 및 [Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)] 참조)을 사용하여 직접 펩티드 합성에 의해 생산할 수 있다. 생체 외 단백질 합성은 수작업 기술 또는 자동화를 사용하여 수행 가능하다. 자동화된 합성법은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템 펩티드 신써사이저(Applied Biosystems Peptide Synthesizer; Foster City, CA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행할 수 있다. PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 다양한 부분을 화학적으로 개별적으로 합성하여, 전장 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 생산하는 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합할 수 있다.
E.PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 DNA의 단리
PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 DNA는, PRO655, PRO364 또는 PRO344 mRNA를 가지며 이를 검출 가능한 수준으로 발현하는 것으로 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 따라서, 인간 PRO655, 인간 PRO364 또는 인간 PRO344 DNA는 실시예에 기재된 것과 같은 인간 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 얻을 수 있다. PRO655-, PRO364- 또는 PRO344-코딩 유전자 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지의 합성 과정(예. 자동화 핵산 합성)에 의해 얻을 수 있다.
라이브러리는 관심있는 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 디자인한 프로브(PRO655, PRO364 또는 PRO344에 대한 항체 또는 약 20-80 염기 이상의 뉴클레오티드)로 스크리닝할 수 있다. cDNA 또는 게놈 라이브러리는를 선택된 프로브로 스크리닝하는 것은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 것과 같은 표준 방법을 사용하여 수행 가능하다. PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 유전자를 단리하는 다른 방법은 PCR 방법론을 사용하는 것이다 [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 기재하고 있다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 길이가 충분하고 충분히 명백하여 거짓 양성을 최소화시켜야 한다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 표지화되어 스크리닝되는 라이브러리 중에서 DNA와 혼성화되었을 때 검출 가능하다. 표지 방법은 당업계에 주지되어 있으며,32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지의 사용, 비오티닐화 또는 효소 표지화를 포함한다. 중간 정도의 엄격성 및 고 엄격성을 포함하는 혼성화 조건은 상기 샘브룩 등(Sambrook et al.)의 문헌에 기재되어 있다.
이러한 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인되는 서열을, 기탁되고 진뱅크(GenBank)와 같은 공용 데이터베이스 또는 기타 사유 서열 데이터베이스에서 이용할 수 있는 기타 공지 서열과 비교 및 정렬할 수 있다. 분자의 일정한 지역내의 또는 전장 서열에 걸친 서열 상동성(아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 결정 가능하다.
단백질 코딩 서열을 가지는 핵산은 본 명세서에 최초로 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하여, 그리고 필요에 따라 상기 샘브룩 등의 문헌에 기재된 통상적인 프라이머 연장 절차를 사용하여, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 cDNA로 역전사되지 않았을 수 있는 mRNA의 전구체 및 처리 중간체를 검출함으로써 얻을 수 있다.
2.숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포를 PRO655, PRO364 또는 PRO344 생산에 대하여 본 명세서에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질감염 또는 형질전환시키고, 적절하게 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양하여 프로모터를 유도, 형질전화체를 선별 또는 요망 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시킨다. 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 부당한 실험 없이도 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양의 생산성의 최대화를 위한 원칙, 프로토콜 및 실용적 기법들은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 상기 샘브룩 등의 문헌에서 찾을 수 있다.
진핵생물 세포 형질감염 및 원핵생물 세포 형질전환 방법은 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포좀-매개 및 전기천공법과 같은 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 그러한 세포에 적합한 표준 기법을 사용하여 형질전환을 수행한다. 상기 샘브룩 등의 문헌에 기재된 염화칼슘을 사용하는 칼슘처리법 또는 전기천공법이 원핵생물에 대해 일반적으로 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 의한 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315 (1983)] 및 1989년 6월 29일에 공개된 WO 89/05859에 기재되어 있는 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 그러한 세포벽이 없는 포유류 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유류 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 면은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 중으로의 형질전환은 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 전형적으로 수행한다. 그러나, 핵 미세주입(nuclear microinjection), 전기천공법(electroporation), 박테리아 원형질세포와 온전한 세포와의 융합 또는 다양이온(polycation), (예. 폴리브렌, 폴리오르니틴)에 의한 것과 같은 DNA를 세포 내로 도입하는 기타 방법들도 사용 가능하다. 포유류 세포를 형질전환시키는 다양한 기술에 관해 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조할 수 있다.
여기서 벡터 중의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 적합한 원핵생물로는, 이로써 제한되는 것은 아니지만 그램-음성 또는 그램-양성 유기체와 같은 유박테리아(eubacteria)를 포함하며, 예를 들어 대장균과 같은 엔테로박테리아시이가 있다. E.coli K12균주 MM294(ATCC31,446); E.coli X1776(ATCC31,537); E.coli균주 W3110(ATCC27,325) 및 K5772(ATCC53,635)와 같은 다양한 대장균 균주가 공용화되어 있다. 다른 적합한 원핵 숙주세포는 에스케리치아 (Escherichia)(예를 들면, 대장균), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella)(예를 들면, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)), 세라티아(Serratia)(예를 들면, 세라티아 마르세산스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella)와 같은 엔테로박테리아시이(Enterobacteriaceae) 뿐만 아니라 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis)(예를 들면, 1989년 4월 12일 출원된 DD 266,710호에 개시된 비. 리케니포르미스(1989년 4월 12일에 발행된B. licheniformis) 41P)와 같은 바실리(Bacilli), 피. 애루기노사(P. aeruginosa)와 같은 슈도모나스 (Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 이들 예들은 제한적이기보다 예시적이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효에 대한 공통된 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해성 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110을 변형시켜 숙주에 내생적인 단백질을 코딩하는 유전자에 유전적 돌연변이를 일으킬 수 있으며, 그러한 숙주의 예로는, 완전한 유전자형 tonA를 가지는 대장균 W3110균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3를 가지는 대장균W3110균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kan'을 가지는 대장균 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan'을 가지는 대장균 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 삭제돌연변이를 가지는 균주 37D6인 대장균 W3110 균주 40B4; 및 1990년 8월 7일 발행된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 돌연변이 주변원형질 프로테아제를 가지는 대장균 균주를 포함한다. 별법으로는, 예를 들어 PCR 또는 기타 핵산 폴리머라제 반응과 같은 생체 외 클로닝 방법이 적합하다.
원핵생물 외에, 섬유성 진균 또는 효모와 같은 진핵성 미생물이 PRO655-, PRO364- 또는 PRO344-코딩 벡터에 대해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지에는 흔히 사용되는 저급 진핵 숙주 미생물이다. 다른 것들로는 스키조사카로마이세스 폼베([Beach and Nurse, Nature, 290: 140(1981)] 및 1985년 5월 2일 발행된 EP 139,383); 클루이베로마이세스 숙주(미국 특허 제4,943,529호; 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)]) (예. 케이. 락티스(MW98-8C, CBS683, CBS4574; [Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)]), 케이.프라질리스(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(ATCC 24,178), 케이. 왈티이(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(ATCC 36,906; [Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)]), 케이.써모톨레란스 및 케이.마르시아누스); 야로위아(EP 402,226); 피키아 파스토리스(EP 183,070; [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)]); 칸디다; 트리코더마 레시아(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사([Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)]); 슈와니오마이세스(예. 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(1990년 10월 31일에 발행된 EP 394,538)); 및 섬유성 진균류 (예. 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라디움(1991년 1월 10일 발행된 WO 91/00357)) 및 아스페르질루스 숙주(예. 에이. 니듈란스[Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474 (1984)] 및 에이. 니거[Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)])를 포함한다. 메틸로트로픽(methylotropic) 효모가 여기에 적합하며 제한적이지는 않으나 한세눌라, 칸디다, 클로에케라, 피키아, 사카로마이세스, 토룰롭시스 및 로도토룰라로 구성된 속(genera)으로부터 선택된 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함한다. 이 클래스의 효모의 예시가 되는 구체적 종의 목록을 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에서 찾을 수 있다.
글리코실화된 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유도된다. 무척추생물 세포의 예로는 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9과 같은 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예로는 중국 햄스터 난소(CHO) 및 COS 세포를 포함한다. 더욱 구체적인 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7. ATCC CRL 1651); 인간 태아 신장 세포주(현탁 배지에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, [Graham et al. J. Gen. Virol., 36:59 (1977)]); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)]); 인간 폐세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 적합한 숙주 세포의선택은 당업계의 기술 범위 내이다.
3.복제 가능한 벡터의 선택 및 사용
PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 핵산(예. cDNA 또는 게놈 DNA)을 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터 중에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터가 공용화되어 있다. 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열을 다양한 방법으로 벡터 중에 삽입할 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 시그널 서열, 복제 오리진(origin), 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 하나 이상의 이들 성분을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 당업자에게 공지된 표준 결찰 기법을 사용한다.
PRO655, PRO364 또는 PRO344는 직접적으로뿐만 아니라 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서도 재조합적으로 생산될 수 있으며, 이는 시그널 서열 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특정 절단 부위를 가지는 기타 폴리펩티드일 수 있다. 일반적으로, 시그널 서열은 벡터의 성분일 수 있으며, 또는 벡터 내로 삽입되는 PRO655-, PRO364- 또는 PRO344-코딩 DNA의 일부일 수 있다. 시그널 서열은예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, ipp 또는 열-안정성 엔테로톡신 II 리더로 구성된 군으로부터 선택되는 원핵생물 시그널 서열일 수 있다. 효모 분비의 경우 시그널은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 알파 인자 리더(사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 알파-인자 리더 포함, 후자는 미국 특허 제5,010,182호에 기재되어 있음) 또는 산 포스파타제 리더, 씨이. 알비칸스 글루코아밀라제 리더(1990년 4월 4일에 발행된 EP 362,179호) 또는 1990년 11월 15일에 발행된 WO 90/13646에 기재된 시그널일 수 있다. 포유류 세포 발현에 있어, 포유류 시그널 서열을 사용하여, 동일 또는 관련 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 시그널 서열 및 바이러스 분비 리더와 같은 단백질의 분비를 유도할 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두 벡터로 하여금 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제 가능케 하는 핵산 서열을 함유한다. 그러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 주지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 오리진은 대부분의 그램-음성 박테리아에 대해 적합하며, 2μ플라스미드 오리진은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 오리진(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유류 세포 중의 클로닝 벡터에 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 선택 가능 마커라고도 불리우는 선택 유전자를 전형적으로 함유한다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 톡신(예. 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린)에 대한 내성을 부여, (b) 영양요구성(auxotrophic) 결함을 보완, 또는 (c) 복합 매질로부터 이용 불가능한 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩(예. 바실리(Bacilli)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)한다.
포유류 세포에 적합한 선택 가능 마커의 예는, DHFR 또는 티미딘 키나제와 같이 PRO655-, PRO364- 또는 PRO344-코딩 핵산을 흡수할 수 있는 세포를 확인할 수있는 것들이다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216 (1980)]에 기재된 대로 제조 및 증식된, DHFR 활성을 결여한 CHO 세포주이다. 효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)].trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력을 결여한 효모 돌연변이 균주에 대한 선택 마커를 제공하며, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]이다.
발현 및 클로닝 벡터는 PRO655-, PRO364- 또는 PRO344-코딩 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 통상적으로 함유하여 mRNA 합성을 유도한다. 다양한 잠재 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터가 주지되어 있다. 원핵 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템[Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템[Geoddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776] 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터[deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]를 포함한다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 DNA에 작동 가능하게 연결된 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno; S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트키나제[Hitzeman et al., J.Biol.Chem., 255:2073 (1980)] 또는 기타 당분해성 효소[Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149(1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어 엔올라제, 글리세랄데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-인산염 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어 가능한 전사라는 추가적인 장점을 가지는 유도 가능한 프로모터인 기타 효모 프로모터는, 알코올 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세랄데히드-3-인산염 디히드로게나제 및 말토스 및 갈락토스 사용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 지역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 설명된다.
포유류 숙주 세포 중의 벡터로부터의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 전사는, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두(fowlpox) 바이러스(1989년 7월 5일 발행된 UK2,211,504), 아데노바이러스(아데노바이러스 2 등), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종성 포유류 프로모터(예. 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터)로부터, 및 열-쇼크 프로모터로부터 얻어진 프로모터에 의해 (이러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 양립가능하다면) 제어된다.
고등 진핵생물에 의한 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 대개 약 10 내지 300 bp의 시스-작용 DNA 요소로서, 프로모터에 작용하여 전사를 증가시킨다. 많은 인핸서 서열이 포유류 유전자(글로민, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예로는 복제 오리진(bp 100-270)의 후측 상의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 오리진 후측 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 벡터의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에 접합될 수 있으나, 바람직하게는 프로모터로부터의 5' 부위에 위치한다.
진핵생물 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 기타 다세포 유기체로부터의 유핵(nucleated) 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 또한 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 경우에 따라 3' 비번역 지역으로부터 흔히 얻을 수 있다. 이들 지역은 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 mRNA의 비번역 지역 중 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 합성에 적용하기에 적합한 기타 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)]; EP 117,060 및EP 117,058에 기재되어 있다.
4.유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은, 예를 들어 통상적인 써든 블롯팅, mRNA의 전사를 정량화하는 노던 블롯팅[Thomas, Ptoc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블롯팅(DNA 분석), 또는 제자리(in situ) 혼성화에 의해, 제공된 서열에 기초하여 적절히 표지된 프로브를 사용하여, 직접적으로 샘플 상에서 측정할 수 있다. 별법으로는, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함하는 특정 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 항체는 표지할 수 있으며, 검정 분석은 듀플렉스가 표면에 결합되어 표면 상에 듀플렉스 형성시 듀플렉스에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있는 경우 수행 가능하다.
별법으로는, 세포 또는 조직 단면의 면역조직화학 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 분석에 의한 유전자 생성물의 발현의 직접적인 정량과 같은 면역학적 방법에 의해 유전자 발현을 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 샘플 유액의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있으며, 임의의 포유류 중에서 제조 가능하다. 편리하게는, 항체는 천연 서열 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 대해, 또는 제공된 DNA 서열에 기초한 합성 펩티드에 대해, 또는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대해, 제조 가능하다.
5.폴리펩티드의 정제
PRO655, PRO364 또는 PRO344의 형태는 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물(lysate)로부터 회복 가능하다. 막이 결합되어 있는 경우, 적합한 세제 용액(예. 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소 분해에 의해 막으로부터 유리시킬 수 있다. PRO655, PRO364 또는 PRO344의 발현에 사용된 세포는 냉동-해동 순환, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 정제하는 것이 요망될 수 있다. 하기 방법은 적합한 정제 방법의 예시이다: 이온-교환 컬럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 암모늄 술페이트 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과; IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼; 및 에피토프-태그된 형태의 PRO655, PRO364 또는 PRO344에 결합하는 금속 킬레이팅 컬럼. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있으며, 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있고 예를 들어 문헌 [Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990)]; [Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택된 정제 단계는 예를 들어 사용되는 생산 방법의 성질 및 생산되는 구체적 PRO655, PRO364 또는 PRO344에 의존할 것이다.
E.항체
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 특정 약 후보는 PRO655, PRO364또는 PRO344 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 항체 및 항체 단편이다.
1.폴리클론 항체
폴리클론 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클론 항체는 예를 들어 하나 이상의 면역화 제제 및 요망되는 경우 보조제의 주사에 의해 포유류 중에서 키울 수 있다. 전형적으로, 면역화 제제 및(또는) 보조제는 다중 피하 또는 복강내 주사로 포유류에 주사될 것이다. 면역화 제제는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화 제제를 면역화되는 포유류에서 면역원성이라고 알려진 단백질에 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 그러한 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 소이빈 트립신 억제제를 포함하나 이로 한정되지는 않는다. 사용 가능한 보조제의 예는 프로인트 완전 보조약 및 MPL-TDM 보조제(모노포스포릴 리피드 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 당업자에 의해 부당하게 과도한 실험 없이 선택될 수 있다.
2.모노클론 항체
대안으로, 항체는 모노클론 항체일 수 있다. 모노클론 항체는 문헌[콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein),Nature,256:495 (1975)]에 기재된 방법과 같은 하이브리도마(hybridoma) 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 만들거나 만들 수 있는 림프구를 유도하는 상기 면역화제로 마우스, 햄스터 또는 다른 적합한 숙주 동물을 면역화시킨다. 다른 방법으로, 림프구는 생체외에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 전형적으로 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함한다. 통상 인간에서 유래한 세포가 요구되면 말초 혈관 림프구("PBL")를 사용하고, 인간이 아닌 포유류가 요구되면 지라세포 또는 림프절을 사용한다. 이어서, 상기 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합화제를 사용하여 불사화 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다([고딩(Goding),Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]). 불사화 세포주는 통상 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간에서 유래한 골수종 세포이다. 통상 래트 또는 마우스의 골수종 세포를 사용한다. 하이브리도마 세포는 융합되지 않은 불사화 세포의 생장 또는 생존을 억제하는 물질을 바람직하게 1종 이상 함유하는 적합한 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모세포에 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)라는 효소가 부족하면, 하이브리도마 세포의 배지는 HGPRT가 부족한 세포의 생장을 방해하는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")을 전형적으로 포함할 것이다.
바람직한 불사화 세포주는 효과적으로 융합되고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 높은 수준의 항체를 안정하게 발현시키며, HAT 배지와 같은 배지에 감응성이 있는 것이다. 더욱 바람직한 불사화 세포주는 미국 캘리포니아주 새디에고 소재의 <Salk Institute Cell Distribution Center> 및 미국 버지니아주 마나싸스 소재의 <American Type Culture Collection>에서 수득할 수 있는 마우스의 골수종 세포주이다. 또한, 인간의 골수종 세포 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클론 항체 생성에 사용되었다 ([코즈보(Kozbor),J. Immunol.,133:3001 (1984)] 및 [브로드어(Brodeur) 등,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)]의 51-63 페이지 참조).
하이브리도마 세포를 배양하는 배지를 사용하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344에 대한 모노클론 항체의 존재 여부를 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에서 생성된 모노클론 항체의 결합 특이성은 면역 침강 또는 방사성면역분석(radioimmunoassay: RIA)이나 효소-결합 면역결합 분석(enzyme-linked immunoabsorbent assay: ELISA)와 같은 생체외 결합 분석으로 측정한다. 상기 기술 및 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클론 항체의 결합 친화도는 예를 들어 스케쳐드(Scatchard) 분석([먼슨(Munson) 및 폴라드(Pollard),Anal. Biochem. 107:220 (1980)] 참조)에 의해 측정할 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 찾아낸 후, 그 클론을 한계 희석 방법으로 서브클론(subclone)하여 표준 방법(고딩(Goding)의 상기 문헌)으로 배양한다. 상기 목적에 적합한 배지는 예를 들어 둘벨코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 다른 방법으로, 하이브리도마 세포는 포유동물의 복수(ascites)로서 생체내에서 배양할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클론 항체는 종래의 면역글로불린 정제 방법(예를 들면, 단백질 A-세파로오스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피)에 의해 배지 또는 복수로부터 단리 또는 정제할 수 있다.
모노클론 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법으로도 만들 수 있다. 본 발명의 모노클론 항체를 코딩하는 DNA는 종래의 방법(예. 쥐의 항체에 대한 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)을 사용하여 쉽게 단리할 수 있고, 서열 분석을 할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 출처로 사용된다. 일단 분리된 DNA를 발현 벡터로 클로닝하고 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포(평상시에는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않음)에 형질감염시킨 후, 재조합 숙주 세포에서 합성된 모노클론 항체를 수득할 수 있다. 예를 들어 쥐의 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인 서열을 이와 상동성 있는 인간의 사슬에 대한 코딩 서열로 치환(미국 특허 제4,816,567호 및 모리슨(Morrison) 등의 상기 문헌 참조)하거나, 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부분을 면역글로불린 코딩 서열과 공유결합으로 연결함으로써 DNA를 변형시킬 수도 있다. 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명 항체의 불변 도메인 대신 치환되거나, 또는 항원 결정부가 2개인 키메라 항체의 생성을 위해 본 발명 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인 대신 치환될 수 있다.
상기 항체는 항원 결정부가 1개일 수 있다. 상기 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 한 가지 방법은 면역글로불린의 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현과 관련되어 있다. 중쇄의 가교를 방해하기 위해 통상 Fc 부분의 임의의 지점에서 중쇄의 끝을 자른다. 다른 방법으로, 적절한 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하거나 제거하여 가교를 방해한다.
또한, 생체외 방법도 항원 결정부가 1개인 항체의 제조에 적합하다. 항체를 분해하여 그 단편, 특히 Fab 단편을 제조하는 것은 당업계에 공지된 통상의 기술을 이용하여 수행할 수 있다.
3.인간 및 인간화 항체
본 발명의 항체는 추가로 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 인간이외의 생물(예: 쥐과)에서 제조한 항체의 인간화 형태는 상기 생물의 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는, 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편(Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원-결합 하위 서열)이다. 인간화 항체는 수용체의 상보성 결정 영역(complementary determining region: CDR)의 잔기가, 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 인간이 아닌 종(공여 항체)의 CDR 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용체 항체)를 포함한다. 어떤 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 잔기가 상응하는 인간이 아닌 종의 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체 및 수용된 CDR 또는 골격 서열 어디에도 나타나지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 인간이 아닌 종의 면역글로불린과 일치하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열인, 하나 이상(통상, 두 개)의 가변 도메인을 실질적으로 포함한다. 또한, 최적의 인간화 항체는 면역글로불린 불변부(Fc), 전형적으로 인간의 면역글로불린 불변부(Fc)를 한 부분 이상 포함한다([존스(Jones) 등,Nature 321:522-525 (1986)], [리크만(Riechmann) 등,Nature,332:323-329 (1988)] 및 [프레스타(Presta),Curr. Op. Struct. Biol.,2:593-596 (1992)]).
인간이 아닌 생물에서 제조한 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 통상, 인간화 항체는 인간이 아닌 생물에서 제조한 항체에서 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가지고 있다. 상기 비인간 아미노산 잔기는 통상 "외래성" 잔기라 불리우며, "외래성" 가변 도메인에서 유래된 것이다. 인간화 과정은 윈터(Winter) 및 그 동료들의 방법([존스(Jones) 등,Nature,321: 522-525 (1986)], [리크만(Riechmann) 등,Nature,332:323-327 (1988)] 및 [버회엔(Verhoeyen) 등,Science 239:1534-1536 (1988)] 참조)에 따라 설치류의 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체에서 이에 상응하는 서열을 치환하여 실질적으로 수행될 수 있다. 따라서, "인간화" 항체는 인간 항체의 하나 미만의 온전한 가변 도메인이 인간이 아닌 종에서 유래한 상응하는 서열에 의해 실질적으로 치환된 키메라 항체(미국 특허 제4,816,567호)이다. 사실상, 인간화 항체는 전형적으로, 특정 CDR 잔기 및 어쩌면 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위에서 유래한 잔기로 치환된 인간 항체이다.
또한, 인간 항체는 파아지 디스플레이(phage display) 라이브러리([후겐붐 (Hoogenboom) 및 윈터(Winter),J. Mol. Biol.,227:381(1991)] 및 [막스(Marks) 등,J. Mol. Biol.,222:581(1991)])를 포함하는, 당업계에 공지된 여러 가지 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 콜(Cole) 등의 기술 및 뵈르너(Boerner) 등의 기술도 인간 모노클론 항체의 제조에 유용하다([콜(Cole) 등,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [뵈르너(Boerner) 등,J. Immunol.,147(1):86-95 (1991)]). 유사하게, 인간 항체는, 인간 면역글로불린 위치를 유전자이식 동물, 예를 들어 내재성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내로 도입함으로써 만들 수 있다. 도전 후, 유전자 재배열, 조립 및 항체 레파토리를 포함하는 모든 면에서 인간에서 나타나는 것과 매우 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 이 접근법은 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 5,545,806호; 5,569,825호; 5,625,126호; 5,633,425호; 5,661,016호 및 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)], [Lonberg et al., Nature, 368:856-859 (1994)], [Morrison, Nature, 368:812-13 (1994)], [Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-51 (1996)], [Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)] 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)]와 같은 과학 문헌에 기술되어 있다.
4.이중특이성 항체
이중특이성 항체는 상이한 두 가지 이상의 항원에 특이적으로 결합하는 모노클론 항체, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 상기의 경우, 결합 특이성 중 하나는 PRO655, PRO364 또는 PRO344에 관한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포-표면 단백질 또는 수용체나 수용체 서브유니트에 관한 것이다.
이중특이성 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합 제조 방법은 2개의 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 짝 (2개의 중쇄는 서로 상이한 특이성을 갖음)를 함께 발현하는 것에 기초를 두고 있다([밀스타인(Milstein) 및 쿠엘로(Cuello),Nature,305:537-539 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적 분류로 인하여, 하이브리도마(쿠아드로마: quadroma)는 10종의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하고, 이 중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 통상 친화 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 과정이 1993년 5월 13일 발행된 WO 93/08829호 및 트로네커(Traunecker) 등의 문헌[EMBO J.,10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체의 가변 도메인은 면역글로불린의 불변 도메인 서열과 융합될 수 있다. 바람직한 융합체는 힌지부, CH2 및 CH3 영역을 일부분 이상 포함하는 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인을 갖는 것이다. 하나 이상의 융합체에 나타나는 경쇄 결합에 필수적인 부위를 포함하는 첫 번째 중쇄 불변부(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체(및 필요한 경우, 면역글로불린 경쇄)를 코딩하는 DNA는 분리된 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 함께 형질감염시킨다. 이중특이성 항체 생성에 대해 더 상세한 사항은 문헌[수레시(Suresh) 등,Methods in Enzymology,121:210 (1986)]을 참조할 수 있다.
WO 96/27011에 기재된 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 처리하여 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 헤테로이량체의 백분율을 최대화시키도록 할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 지역의 일부분 이상을 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예. 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 큰 측쇄와 동일하거나 또는 유사한 크기의 보상적 "동공"은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것(예. 알라닌 또는 쓰레오닌)으로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 형성된다. 이는 헤테로이량체의 수율을 호모이량체와 같은 원하지 않는 기타 최종-생성물에 비해 증가시키는 기작을 제공한다.
이중 특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조 가능하다 (예. F(ab')2이중 특이적 항체). 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 선행 문헌에 기술되어 왔다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학 결합을 사용하여 제조 가능하다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]에는 온전한 항체를 단백질분해적으로 분해하여 F(ab')2단편을 생성하는 방법이 기재되어 있다. 이들 단편은 디티올 착화제 소듐 아르세니트의 존재 하에 환원되어 이웃 디티올을 안정화시키고 분자간 이황화물 형성을 방지한다. 생성된 Fab' 단편은 이어 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 변환된다. 하나의 Fab'-TNB 유도체가 이어 메르캅토에틸아민에 의한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 동등 몰량의 기타 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용할 수 있다.
Fab' 단편은 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 문헌[Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225(1992)]에는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2분자의 생성을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 대장균으로부터 개별적으로 분비되고 생체 외로 화학적 커플링되어 이중특이적 항체를 형성한다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있으며, 인간 유방암 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 분해 활성을 유발할 수 있다.
재조합 세포 배양으로부터 직접적으로 이중특이적 단편을 생산 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되어왔다. 예를 들어 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 제조해왔다 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 두 개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 호모이량체를 힌지 지역에서 환원시켜 단량체를 형성하고 이어 재산화시켜 항체 헤테로이량체를 형성하였다. 이 방법은 항체 호모이량체의 생산을 위해서도 또한 사용 가능하다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "다이아바디" 기술은 이중특이적 단편을 제조하는 다른 기작을 제공하였다. 단편은, 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 두 개의 도메인 사이를 짝지울 수 없는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH및 VL도메인은 다른 단편의 상보적 VL및 VH도메인과 짝을 짓고 이로써 두 개의 항원-결합 부위를 형성하도록 되어 있다. 단쇄 FV(sFV) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 만드는 다른 전략 또한 보고되었다. 문헌 [Gruberet al,. J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조할 수 있다.
2가를 넘는 항체도 생각할 수 있다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 [Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991)].
예시적인 이중특이적 항체는 여기에 주어진 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 상의 두 개의 상이한 에피토프에 결합될 수 있다. 별법으로는, 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 폴리펩티드 가지(arm)는 T-세포 수용체 분자(예. CD2, CD3, CD28 또는 B7) 또는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)과 같은 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR)과 같은 류코사이트 상의 유발 분자에 결합하는 가지와 조합으로, 특정 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 발현하는 세포에 세포 방어 기작을 집중할 수 있다. 또한 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성 제제를 특정 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 발현하는 세포에 국소화시킬 수 있다. 항체는 PRO655-, PRO364- 또는 PRO344-결합 가지 및 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA와 같은 방사성 핵종 킬레이터 또는 세포독성제와 결합하는 가지를 갖는다. 다른 관심있는 이중특이적 항체는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 결합하고 조직 인자 (TF)에 추가로 결합한다.
5.이종접합 항체
이종접합 항체 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이종접합 항체는 공유결합으로 연결된 두 개의 항체로 구성된다. 상기 항체는 예를 들면, 원하지 않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화(미국 특허 제4,676,980호) 및 HIV 감염의 치료(WO 91/00360호, WO 92/200373호 및 EP 03089호)용으로 제안되어 왔다. 상기 항체는가교제와 관련된 방법을 포함하는, 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 생체외에서 제조할 수 있다. 예를 들면, 면역독소는 이황 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 구성할 수 있다. 상기 목적에 적합한 제제의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티리미데이트를 포함하고, 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 제제를 포함한다.
6.이펙터 기능 공학
본 발명의 항체를 이펙터 기능 면에서 변형시켜 예를 들어 암 치료에 있어서의 항체의 효용성을 증진시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc 지역 내로 도입함으로써 이 지역의 쇄간(interchain) 이황화 결합 형성을 허용할 수 있다. 이렇게 생성된 호모이량체 항체는 개선된 내부화능 및(또는) 증가된 상보체-매개 세포 살해 및 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)]를 참조할 수 있다. 증진된 항-종양 활성을 가진 동종이량체 항체는 문헌 [Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종 이중작용성 가교결합제를 사용하여 제조할 수도 있다. 별법으로는, 이중 Fc 지역을 가지는 항체를 가공함으로써 증진된 상보체 분해 및 ADCC 능력을 가진 항체를 만들 수 있다. 문헌 [Stevenson et al,. Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)]을 참조할 수 있다.
7.면역접합체
본 발명은 또한, 화학요법제, 톡신(예. 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 톡신 또는 그 단편) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성접합체)와 같은 세포독성 제제에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
이러한 면역접합체 생성에 유용한 화학요법제가 상기 기술되었다. 사용 가능한, 효소적으로 활성인 톡신 및 그 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 톡신의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 쇄(슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruguinosa)로부터의), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알러리츠 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란시아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 리스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성핵종이 방사성접합 항체의 생성을 위해 이용 가능하다 예로는212Bi,131I,131In,90Y 및186Re를 포함한다.
항체 및 세포독성 제제의 접합체는, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이중작용성 유도체(디메틸아디프이미데이트HCL과 같은), 활성 에스테르(디숙신이미딜 수버레이트와 같은), 알데히드(글루타르알데히드와 같은), 비스-아지도 화합물(비스(p-아지도벤조일)헥산디아민과 같은), 비스-디아조늄 유도체(비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민과 같은), 디이소시아네이트(톨리엔 2,6-디이소시아네이트와 같은) 및 비스-활성 불소 화합물(1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은)과 같은 다양한 이중작용성 단백질-커플링 제제를 사용하여 만들어진다. 예를 들어, 문헌[Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 리신 면역톡신을 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)는 항체에 대한 방사성핵종의 접합에 대한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조할 수 있다.
다른 실시태양에서, 항체는 종양 프리타겟팅(pretargeting)에 사용하기 위해 "수용체"(스트렙트아비딘과 같은)에 접합될 수 있으며, 여기서 항체-수용체 접합체를 환자에 투여한 후 이어 세정제(clearing agent)를 사용하여 순환으로부터 비결합 접합체를 제거한 후, 세포독성 제제(예. 방사성핵종)에 접합된 "리간드"(예. 아비딘)를 투여한다.
8.면역리포좀
여기 개시된 항체는 면역리포좀으로서 제제화될 수도 있다 항체를 함유하는 리포좀은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 4,544,545호에 기재된 것과 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 증진된 순환 시간을 가지는 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 리피드 조성물로 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 한정된 공극 크기를 가지는 필터를 통해 압출되어 요망 직경을 가진 리포좀을 산출한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 이황화물-교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제(독소루비신과 같은)는 리포좀 내에 임의적으로 함유된다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989)]을 참조할 수 있다.
F.신생세포 성장 또는 증식을 억제할 수 있는 단백질의 확인
본 출원에 개시된 단백질은, 국립 암 연구소(National Cancer Institute; NCI)의 연구적, 질병-방향성인 생체 외 약물-발견 스크린에 현재 사용되는 60 종양 세포주 패널 상에서 분석되었다. 이 스크린의 목적은 상이한 유형의 종양에 대해 세포독성 및(또는) 세포증식억제 활성을 가지는 분자를 확인하는 것이다. NCI는 1년에 10,000 이상의 새로운 분자를 스크린한다 (문헌 [Monks et al.,J. Natl. Cancer Inst.,83:757-766 (1991)] 및 [Boyd,Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update,3(10):1-12 (1989)] 참조). 본 연구에 사용된 종양 세포주는 상기 몽크스(Monks) 등의 상기 문헌에 기재되었다. 본 발명의 단백질에 의해 성장이 상당히 억제된 세포주를 실시예에 특정하였다.
그 결과는, 시험된 단백질이 다양한 암 세포주에서 세포증식억제 및 특정 경우 및 농도에서 세포독성 활성을 보이며 따라서 종양 치료에 있어 유용한 후보임을 나타내었다.
기타 세포-기초 분석 및 종양(예. 암)에 대한 동물 모델 또한 사용하여 NCI 암 스크린의 발견을 입증하고 여기서 확인된 단백질 및 신생세포 성장의 발달 및발병학 사이의 관계를 더욱 잘 이해할 수 있다. 예를 들어, 비록 안정한 세포주가 바람직하지만, (후술하는 바와 같은) 유전자 이식 동물의 종양으로부터 유도된 1차 배양물을 본 명세서의 세포-기초 분석에 사용할 수 있다. 유전자이식 동물로부터 연속적인 세포주를 유도하기 위한 기술은 업계에 주지되어 있다 (예. 문헌 [Small et al.,Mol. Cell. Biol.,5:642-648 (1985)] 참조).
G.동물 모델
다양한 주지의 동물 모델을 사용하여 본 발명에서 확인된 분자의 종양 발달 및 발병학에 있어서의 역할을 더욱 잘 이해하고, 항체, 및 소분자 아고니스트를 포함하는 천연 폴리펩티드의 기타 아고니스트를 포함하는 후보 치료제의 효용성을 테스트할 수 있다. 그러한 모델의 생체내 성질에 의해 인간 환자에서의 반응을 특히 예견할 수 있게 된다. 종양 및 암(예. 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 등)의 동물 모델은 비 재조합 및 유전자이식 동물을 모두 포함한다. 비 재조합 동물 모델은 예를 들어 설치류(예. 쥐) 모델을 포함한다. 이러한 모델은 예를 들어 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신장 캡슐 하의 이식 또는 오르소핀 이식(예. 결장 조직에 이식된 결장 암 세포)과 같은 표준 기법을 사용하여 종양 세포를 유전적 동계의(syngeneic) 마우스에 도입함으로써 생성될 수 있다. (예를 들어 1997년 9월 18일에 발행된 PCT 공개 공보 WO 97/33551호 참조).
아마도 종양학적 연구에서 가장 흔히 사용되는 동물 종은 면역결핍 마우스 및 특히 누드 마우스이다. 형성부전증(hypo/aplasia)을 가진 누드 마우스가 인간 종양 이종이식편에 대한 숙주로서 성공적으로 작용할 수 있다는 사실의 관찰은 누드 마우스를 이 목적을 위해 널리 사용되게 만들었다. 상염색체의 열성nu유전자는, 예를 들어 ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, 1/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL를 포함하여 매우 많은 수의 독특한(distinct) 누드 마우스 컨지닉 계통(congenic strain) 내로 도입되었다. 또한, 누드 마우스 이외의 유전적인 면역학적 결함을 지닌 많은 기타 동물이 종양 이종이식편의 수용체로서 번식 및 사용되어 왔다. 추가적인 세부사항을 위해 예를 들어 문헌 [The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds., CRC Press Inc., 1991]을 참조할 수 있다.
이러한 동물 내로 도입된 세포는 임의의 상기 열거한 종양 세포주와 같은 공지의 종양/암 세포주 및 예를 들어, B104-1-1 세포주(neu프로토종양원에 의해 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주);ras-형질감염된 NIH-3T3 세포; Caco-2 (ATCC HTB-37); 중간 정도로 잘 분화된 II 등급 인간 결장 아데노카시노마 세포주 HT-29 (ATCC HTB-38)로부터, 또는 종양 및 암으로부터 유도될 수 있다. 종양 또는 암 세포의 샘플은 냉동 및 액체 질소에서의 저장을 포함하는 표준 방법을 사용하여 수술을 받는 환자로부터 얻을 수 있다 [Karmali et al.,Br. J. Cancer,48:689-696 (1983)].
종양 세포를 다양한 방법에 의해 누드 마우스와 같은 동물 중으로 도입할 수 있다. 마우스의 피하(s.c.) 공간은 종양 이식을 위해 매우 적합하다. 종양은 고체 블록으로서, 투관침의 사용에 의한 바늘 생체검사로서, 또는 세포 현탁액으로서 s.c. 이식될 수 있다. 고체 블록 또는 투관침 이식의 경우, 적합한 크기의 종양조직 단편을 s.c. 공간내로 도입한다. 세포 현탁액은 1차 종양 또는 안정한 종양 세포주로부터 신선하게 제조되어 피하 주사된다. 종양 세포는 또한 피부 하 이식물로서 주입될 수도 있다. 이 위치에서, 피부 연결 조직의 하부 및 s.c. 조직 사이에 접종원(inoculum)을 배치한다. 상기 보벤(Boven) 및 위노그라드(Winograd)의 1991년 문헌을 참조한다. 유방암의 동물 모델은 예를 들어, 문헌 [Drebin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 9129-9133 (1986)]에 기재된 바에 실질적으로 따라 래트 신경모세포종 세포(neu종양원을 초기에 단리한 세포) 또는neu-형질전환된 NIH-3T3 세포를 누드 마우스 내로 이식함으로써 생성될 수 있다.
유사하게, 결장암의 동물 모델은 예를 들어 누드 마우스와 같은 동물 중에 결장암 세포를 배양하고 이들 동물에 종양이 나타나게 함으로써 생성될 수 있다. 누드 마우스 중의 인간 결장암의 동소(orthotopic) 이식 모델이 예를 들어 문헌 [Wang et al.,Cancer Research; 54:4726-4728 (1994)] 및 [Too et al., Cancer Research, 55:681-684 (1995)]에 기재되어 있다. 이 모델은 안티캔서, 인크.(AntiCancer, Inc.; San Diego, California)사에 의해 판매되는 소위 "메타마우스(METAMOUSE)"에 기초한다.
동물에서 발생하는 종양을 제거하여 생체 외로 배양할 수 있다. 생체 외 배양으로부터의 세포를 이어 동물에 전달한다. 이러한 종양은 추가의 테스트 또는 약물 스크리닝을 위한 표적으로서의 역할을 할 수 있다. 별법으로는, 전달(passage)로부터 생성된 종양을 단리하고 전달 이전(pre-passage)의 세포 및 하나 이상의 전달 라운드 후에 단리된 세포로부터의 RNA를 중요한 유전자의 특질적인 발현에 대해 분석한다. 그러한 passage 기술은 임의의 공지된 종양 또는 암 세포주로 수행 가능하다.
예를 들어, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 BALB/c 암컷 마우스의 화학적으로 유도된 섬유육종이며 [DeLeo et al., J. Exp. Med., 146:720 (1977)], 이는 다양한 시약의 항-종양 활성 연구를 위한 고도로 제어되는 모델 시스템을 제공한다 [Palladino et al., J. Immunol., 138:4023-4032 (1987)]. 요컨대, 종양 세포는 생체 외 세포 배양으로 증식된다. 동물에 주사하기 전에, 세포주를 세척하고 완충액 중에 현탁하여 세포 밀도를 약 10 x 106내지 10 x 107세포/ml로 한다. 이어 동물을 세포 현탁액 10 내지 100 ㎕로 피하 감염시켜 1 내지 3 주간 종양이 나타나도록 한다.
또한, 가장 완전히 연구된 실험적 종양 중의 하나인 마우스의 루이스 폐(3LL) 암종을 연구적 종양 모델로서 사용할 수 있다. 이 종양 모델에서의 효용성은 폐의 소세포 암종(SCCL)을 가지는 것으로 진단된 인간 환자의 치료에 있어서의 유익한 효과와 연관되어 왔다. 병에 걸린 마우스로부터의 종양 단편 또는 배양물 중에 유지된 세포를 주입하여 이 종양을 정상 마우스에 도입할 수 있으며 [Zupi et al.,Br. J. Cancer,41. suppl. 4:309 (1980)], 증거는 종양은 단 하나의 세포의 주입으로부터도 시작될 수 있으며 감염된 종양 세포의 매우 많은 부분이 생존한다는 것을 나타낸다. 이 종양 모델에 대한 추가의 정보를 위해 문헌 [Zacharski,Haemostasis,16:300-320 (1986)]을 참조할 수 있다.
동물 모델에서 테스트 화합물의 이식된 종양에 대한 효용성을 평가하는 한가지 방법은 치료 전후의 종양 크기를 측정하는 것이다. 전통적으로, 이식된 종양의 크기는 슬라이드 캘리퍼로 2 또는 3차원으로 측정되어왔다. 2차원에 한정된 측정은 종양의 크기를 정확히 나타내지 않으므로 이는 수학식을 사용하여 대개 해당 부피로 환산된다. 그러나, 종양 크기의 측정은 매우 부정확하다. 약물 후보의 치료적 효과는 치료에 의해 유도된 성장 지연 및 구체적 성장 지연으로서 더욱 잘 표현된다. 종양 성장의 묘사에 있어 다른 중요한 변수는 종양 부피가 두배가 되는 시간이다. 종양 성장의 계산 및 기술을 위한 컴퓨터 프로그램 또한 이용 가능하며, 예를 들어 문헌 [Rygaard and Spang-ThomsenProc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds., Basel, 1989, 301]에 보고된 프로그램이 있다. 그러나, 치료에 뒤따르는 괴사 및 염증성 응답은 적어도 초기에는 종양 크기를 실제로 증가시킬 수 있다. 따라서, 이들 변화는 형태측정 방법 및 플로우 세포측정 분석과 조합하여 세심히 모니터할 필요가 있다.
유전자이식 동물 모델은, 유전자이식 동물을 생산하는 표준 기술을 사용하여 본 발명에서 확인된 유전자의 코딩 부분을 관심있는 동물의 게놈에 도입함으로써 처리될 수 있다. 유전자이식 조작을 위한 표적으로서의 역할을 할 수 있는 동물은 제한 없이 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 비인간 영장류(예. 비비, 침팬지 및 원숭이)를 포함한다. 이식유전자를 이러한 동물에 도입하기 위한 당업계에 공지된 기술은 전핵(pronucleic) 미세주입(Hoppe and Wanger, 미국 특허 제4,873,191호]); 레트로바이러스-매개 미생물 균주로의 유전자 이전(예. [Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6148-415 (1985)]); 배아 스템 세포에서의 유전자 타겟팅[Thompson et al.,Cell,56:313-321 (1989)]; 배아의 전기천공[Lo,Mol. Cell. Biol.,3:1803-1814 (1983)]; 정자-매개 유전자 전이[Lavitrano et al., Cell, 57:717-73 (1989)]를 포함한다. 검토를 위해 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호를 참조할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 유전자이식 동물은 세포 중 일부에만 이식유전자를 운반하는 것들("모자이크 동물")을 포함한다. 이식유전자는 단일 이식유전자로서, 또는 콘카타머(concatamer)(예. 머리-대-머리 또는 머리-대-꼬리 직렬)로서 통합될 수 있다. 이식유전자를 특정 세포 유형 내로 선택적으로 도입하는 것은 또한 예를 들어 문헌 [Lasko et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:6232-636 (1992)]의 기술에 따라 가능하다.
유전자이식 동물에서의 이식유전자의 발현은 표준 기술로 모니터할 수 있다. 예를 들어 써든 블롯 분석 또는 PCR 증폭을 사용하여 이식유전자의 통합을 확증할 수 있다. 이어 제자리(in situ) 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 사용하여 mRNA 발현 수준을 분석할 수 있다. 종양 또는 암 진전의 신호에 대해 동물을 추가로 검사한다.
본 발명에서 확인된 폴리펩티드 및 기타 약물 후보에 특이적으로 결합하는 항체의 효용성은 자연발생적 동물 종양의 치료에서도 시험할 수 있다. 이러한 연구를 위한 적합한 표적은 고양이과의 경구 편평세포암종(SCC)이다. 고양이과 경구 SCC는 매우 침략적인 악성 종양으로서 이 종에서 보고된 종양의 60% 이상을 차지하며 고양이의 가장 흔한 경구 암이다. 이는 원거리 지역으로 거의 전이되지 않으나, 전이의 이러한 낮은 발생빈도는 이 종양을 가진 고양이의 생존 시간이 얼마 남지 않았음을 나타낼 뿐이다. 이들 종양은 주로 고양이과 구강의 구조로 인해 대개 수술이 어렵다. 현재, 이 종양에 대한 효과적인 치료법이 없다. 본 연구에 착수하기 전에, 각각의 고양이는 완전한 임상검사, 생체검사를 받고 컴퓨터 단층촬영(CT)을 한다. 설하 경구 편평세포 종양이 있는 것으로 진단된 고양이를 본 연구에서 제외된다. 혀는 그러한 종양의 결과 마비될 수 있으며, 비록 치료가 종양을 죽인다 해도 동물은 스스로 먹을 수 없다. 각각의 고양이를 더 긴 시간 동안 반복하여 치료한다. 종양 사진을 치료 기간 동안 매일 및 각 후속적인 재체크시 촬영한다. 치료 후, 각 고양이를 다시 CT 스캔한다. CT 스캔 및 흉부 x선 사진을 그 후 매 8주마다 평가한다. 데이터를 대조군과 비교하여 생존, 반응 및 독성 차이에 대해 평가한다. 양성 반응은, 바람직하게는 삶의 질의 증진 및(또는) 수명의 연장과 함께, 종양 퇴행의 증거를 요할 수 있다.
또한, 개, 고양이 및 비비의 섬유육종, 선암종, 림프종, 연골종, 평활근육종과 같은 기타 자연발생 동물 종양도 테스트할 수 있다. 이들 중 개 및 고양이의 유방 선암종이 그 외관 및 반응이 인간의 경우와 매우 유사하기 때문에 바람직한 모델이다. 그러나, 이 모델의 사용은 동물에서 이 유형의 종양의 드문 발생빈도에 의해 제한된다.
H.약물 후보에 대한 스크리닝 분석
약물 후보에 대한 스크리닝 분석을 고안하여 본 발명에서 확인된 폴리펩티드의 수용체(들)과 경쟁적으로 결합 또는 착물을 형성하거나 또는 그렇지 않으면 그러한 수용체(들)을 통해 신호하는 화합물을 확인한다. 그러한 스크리닝 분석은 화학 라이브러리의 고 산출량 스크리닝이 가능한 분석을 포함하며 이들을 소분자 약물 후보를 확인하기에 특히 적합하게 만들 것이다. 고려된 소분자는, 펩티드, 바람직하게는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-면역글로불린 융합체, 및 특히 폴리- 및 모노클론 항체 및 항체 단편, 단쇄 항체, 항-이디오타입 항체 및 그러한 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화 버젼 및 인간 항체 및 항체 단편을 제한 없이 포함하는 항체를 포함하는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 분석은 업계에서 잘 특성화된, 단백질-단백질 결합 분석, 생화학 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포 기재 분석을 포함하여 다양한 형식으로 수행될 수 있다.
결합 분석에서, 상호작용은 결합이며 형성되는 복합체는 반응 혼합물 중에서 단리 또는 검출될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 수용체 또는 약물 후보를 공유 또는 비공유 부착에 의해 고체상(예. 미량역가 플레이트) 상에 고정시킨다. 비공유 부착은 일반적으로 고체 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시킴으로써 수행된다. 별법으로는, 고정화할 폴리펩티드에 특이적인 고정화된 항체(예. 모노클론 항체)를 사용하여 이를 고체 표면에 고정시킬 수 있다. 분석은, 검출 가능한 표지로 표지할 수 있는 비 고정화된 성분을 고정화된 성분(예. 고정된 성분을 함유하는 코팅된 표면)에 첨가함으로써 수행된다. 반응이 완료하면 반응하지 않은 성분들은 예를 들어 세척에 의해 제거하고 고체 표면 상에 고정된 착물을 검출한다. 처음에 고정화되지 않은 성분이 검출 가능한 표지를 운반하면, 표면 상에 고정화된 표지의 검출은 착화가발생했음을 가리킨다. 처음에 고정화되지 않은 성분이 표지를 운반하지 않으면, 예를 들어 고정화된 착물에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용함으로써 착화를 검출할 수 있다.
후보 화합물이 특정 수용체와 상호작용은 하나 결합하지 않으면, 그 폴리펩티드와의 상호작용을, 단백질-단백질 상효작용 검출을 위해 주지된 방법에 의해 분석할 수 있다. 그러한 분석은 가교결합, 공동-면역침전 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공동-정제와 같은 전통적인 접근법을 포함한다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Fields and Song,Nature (London),340:245-246 (1989)]; [Chien et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88:9578-9582 (1991)]; [Chevray and Nathans,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:5789-5793 (1991)]에 기재된 효모-기재 유전적 시스템을 사용하여 모니터할 수 있다. 효모 GAL4와 같은 많은 전사 활성화제는 두 개의 물리적으로 구분되는 모듈 도메인으로 구성되며, 하나는 DNA-결합 도메인으로 작용하고 반면 다른 하나는 전사 활성화 도메인으로서 기능한다. 상기 문헌에 기술된 효모 발현 시스템(일반적으로 "2-하이브리드 시스템"이라 언급됨)은 이 특성을 이용하고 두 개의 하이브리드 단백질을 사용하며, 그 중 하나의 단백질에서는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합되고 다른 하나에서는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 융합된다. GAL4-활성화 프로모터의 제어 하의 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 의존한다. 상호작용 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 베타-갈락토시다제에 대한 비색(chromogenic) 기질로 검출한다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 두 개의 특정 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완전한 키트(상표명 MATCHMAKER)는 클론테크(Clontech)사로부터 상업적으로 이용 가능하다. 이 시스템을 또한 확장하여 특정 단백질 상호작용에 관련된 단백질 도메인을 맵핑하고 이들 상호작용에 중요한 아미노산 잔기의 위치를 정확히 나타낼 수 있다.
I.제약 조성물
본 발명의 폴리펩티드, 본 발명에서 확인된 단백질에 특이적으로 결합하는 아고니스트 항체, 및 본 발명에 개시된 스크리닝 분석법에 의해 확인되는 기타 분자를 제약 조성물의 형태로 암을 포함하는 종양 치료를 위해 투여할 수 있다.
항체 단편을 사용하는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변성 지역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 그러한 펩티드를 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술에 의해 생성할 수 있다 (예를 들어 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)] 참조).
본 발명의 제형은 치료되는 특정 증상에 필요한 둘 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 악영향을 주지 않는 상보적 활성을 가진 것들을 또한 함유할 수 있다. 별법으로, 또는 추가적으로, 조성물은 예를 들어 세포독성제, 사이토킨, 화학요법제 또는 성장 억제제와 같은 그 기능을 증진시키는 약제를 포함할 수 있다. 그러한 분자는 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
본 발명에서 확인된 폴리펩티드 또는 그 아고니스트의 치료적 제제는, 원하는 정도의 순도를 가지는 유효 성분을 임의적인 제약학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)]와 함께 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로, 저장용으로 제조된다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용체에 비독성이며, 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예. 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 세클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만의) 폴리펩티드; 단백질(예. 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 (예. 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온; 금속 착물(예. Zn-단백질 착물); 및(또는) 비이온성 계면활성제 (예. 상표명 TWEEN, PLURONICS 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG))를 포함한다.
본 발명의 제제는 치료되는 특정 증상을 위해 필요에 따라 둘 이상의 유효 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적 활성을 가지는 것들을 함유할 수도 있다. 별법으로, 또는 추가적으로, 조성물은 세포독성제, 사이토킨 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 그러한 분자는 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
유효 성분은 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템(예. 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노-캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 만들어진 마이크로캡슐 (예. 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트)마이크로캡슐) 각각 내에 들어갈 수도 있다. 그러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여용으로 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과 막을 통해 여과함으로써 쉽게 달성된다.
본 발명의 치료 조성물은 멸균 접근(access) 포트, 예를 들어 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 가지는 정맥내 용액 백 또는 바이알을 가지는 용기 내에 일반적으로 배치된다.
서방형 제제를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품의 형태이다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 상표명 LUPRON DEPOT과 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상동안 분자가 방출되도록 하는 반면, 어떤 히드로겔은 더욱 짧은 기간동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 체내에 장시간동안 머무르면, 37℃에서 습기에의 노출에 의해 변성 또는 응집될 수 있으며, 그 결과 생물학적 확성이 상실되고 면역원성에 변화를 일으킬 수 있다. 관여된 기작에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 기작이 티오-이황화물 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성이라는 것이 밝혀지면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적합한 첨가제의 사용 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 이룰 수 있다.
J.치료 방법
본 발명의 폴리펩티드, 및 항체, 펩티드 및 소분자 아고니스트를 포함하는 그 아고니스트를 사용하여 다양한 종양(예. 암)을 치료하는 것이 고려되었다. 치료되는 예시적인 증상 또는 질병으로는 양성 또는 악성 종양(예. 신장(renal), 간, 신장(kidney), 방광, 유방, 위장, 난소, 대장, 전립선, 췌장, 폐, 외음, 갑상선, 간 암; 육종; 교모세포종; 및 다양한 뇌 및 목 암); 백혈병 및 림프구양 암; 뉴론, 신경교, 성상교, 시상하부 및 기타 선, 대식세포, 상피, 간질 및 포배강 질환과 같은 기타 질병; 및 염증성, 혈관형성성 및 면역성 질환을 포함한다. 본 발명의 항-종양제(본 명세서에 개시된 폴리펩티드 및 그 활성을 모방하는 아고니스트(예. 항체, 펩티드 및 유기 소분자))를 거환으로서 정맥내 투여와 같은 공지 방법에 따라, 또는 일정 기간에 걸친 연속적인 주입에 의해 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 안내, 동맥내, 병소내, 피하, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해, 동물, 바람직하게는 인간에 투여한다.
기타 치료적 섭생법을 본 발명의 항암제 투여와 병용할 수 있다. 예를 들어, 그러한 항암제로 치료되는 환자는 또한 방사능 치료를 받을 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 화학요법제를 환자에 투여할 수 있다. 그러한 화학요법제에 대한 제제 및 투여 스케줄은 제조자의 지시에 따라 또는 숙련된 실습자에 의해 경험칙상의 결정에 의해 사용될 수 있다. 그러한 화학요법제에 대한 제제 및 투여 스케줄은 문헌 [Chemotherapy Service, ed. M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에도 기재되어 있다. 화학요법제는 본 발명의 항종양제 투여보다 앞 또는 뒤에, 또는 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 항암제는 공지된 용량의 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤(EP 616812 참조)과 같은 항-프로게스테론제와 이러한 분자에 대해 공지된 용량으로 혼합될 수 있다.
종양 관련 항원에 대한 항체(예. ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 혈관 내피성 인자(VEGF)에 결합하는 항체)를 또한 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 동일물에 결합하는 둘 이상의 항체 또는 둘 이상의 상이한 암-연관 항원을 환자에 공동 투여할 수 있다. 때때로 하나 이상의 사이토킨을 환자에 또한 투여하는 것이 유익할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항암제를 성장 억제제와 공동투여한다. 예를 들어, 성장 억제제를 먼저 투여한 후 본 발명의 항암제를 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 항암제의 동시 투여 또는 먼저투여 또한 고려된다. 성장 억제제에 대한 적합한 용량은 현재 사용되는 것이며 성장 억제제 및 본 발명의 항체의 복합 작용(시너지)으로 인해 낮아질 수 있다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항종양제의 적합한 용량은 상기 정의한 바와 같은 치료 질병의 유형, 질병의 심각도 및 경과, 약제가 예방 목적으로 또는 치료적 목적으로 투여되는지에 따라, 이전의 치료, 환자의 임상 병력 및 약제에 대한 반응 및 돌보는 의사의 판단에 의존할 것이다. 약제는 한 번에 또는 일련의 치료를 통해 환자에게 적합하게 투여된다. 동물 실험은 인간 치료에 대한 효과적인 용량의 결정에 대한 믿을 만한 지침을 제공한다. 효과적인 용량의 종간 스케일링은 문헌[Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" inToxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., eds., Pergamon Press. New York 1989, pp. 42-96]에 기재된 원칙에 따라 수행될 수 있다.
예를 들어, 질병의 유형 및 심각도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예. 0.1-20 mg/kg)의 항종양제가 예를 들어 1회 이상의 별도 투여에 의해 또는 연속적 주입에 의해 환자에게 투여되는 초기 후보 용량이다. 전형적인 일일 용량은 상기 언급된 요소에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg의 범위 또는 그 이상일 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸치는 반복 투여의 경우, 증상에 따라, 질병 증후의 원하는 억압이 발생할 때까지 치료를 지속한다. 그런, 기타 용량 섭생이 유용할 수 있다. 이 치료의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터된다. 구체적 용량 및 전달 방법에 대한 지침은 예를 들어 미국 특허 제4,657,760호; 5,206,344호; 또는 5,225,212호에서 제공된다. 상이한 제제는 상이한 치료 화합물 및 상이한 질병에 대해 효과적일 것이며, 예를 들어 하나의 기관 또는 조직을 표적으로 삼는 투여는 다른 기관 또는 조직에 대한 경우와 상이한 방식의 전달을 요할 수 있다는 것이 예측된다.
K.제품
본 발명의 또다른 실시태양에서, 상기 질병의 진단 또는 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품을 제공한다. 제품은 용기 및 표지를 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 증상 진단 또는 치료에 효과적인 조성물을 담으며 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피부하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 가지는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 유효제는 본 발명의 항종양제이다. 용기 상의 또는 관련된 표지는 조성물이 선택된 증상의 진단 또는 치료를 위해 사용됨을 나타낸다. 제품은 제약학상 허용되는 완충액(예. 인산염-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액)을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 기타 완충액, 희석제, 충진제, 바늘, 주사기 및 사용법을 나타내는 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
하기 실시예는 예시의 목적만을 위하여 제공되며 본 발명의 범위를 어떠한 식으로든 제한하려는 의도는 없다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌은 본 명세서에 전제가 참고로서인용되었다.
다른 지시가 없는 한, 제조자의 지시에 따라 하기 실시예 중에 언급된 시판되는 시약을 사용하였다. ATCC 기탁 번호로 하기 실시예 및 본 명세서 중에 확인된 세포의 출처는 미국 버지니아주 마나싸스 소재 ATCC(American Type Culture Collection)이다.
실시예 1
PRO655, PRO364 및 PRO344를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
(A)PRO655
발현된 서열 태그(EST) DNA 데이터베이스(등록상표 LIFESEQ, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하고, 인터페론에 상동성(homology)을 나타내는 EST를 확인하였다. Incyte EST3728969(후에 DNA49668이라 개명됨) 및 포유류 알파 인터페론 간에 가능한 상동성을 찾아내었다. 조사(inspection)에 의해 상동성을 재확인하였다.
이어 cDNA 라이브러리의 구축을 위한 RNA를 인간 소장으로부터 단리하였다 (LIB99). 미국 캘리포니아주 산디에고 소재 인비트로겐(Invitrogen)사의 제품과 같은 상업적으로 이용 가능한 시약을 사용하여 표준 방법에 의해, 인간 PRO655를 코딩하는 cDNA 클론을 단리하는 데 사용되는 cDNA 라이브러리를 구축하였다. cDNA를 NotI 부위를 함유하는 올리고 dT로 프라이밍하고, SalI 헤미키나제화된(hemikinased) 어댑터에 블런트로 연결하고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기를 적절히 조절하고, 고유의 XhoI 및 NotI 중의 적합한 클로닝 벡터(pRKB 또는 pRKD 등.; pRK5B는 SfiI 부위를 함유하지 않는 pRK5D의 전구체이다.; 문헌 [Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)] 참조) 중으로 정의된 배향으로 크로닝하였다.
이어 상기 EST 서열을 기초로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하여, 1) 관심있는 서열을 함유한 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) 프로브로서 사용하여 PRO655의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하였다. 정방향 및 역방향PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30 뉴클레오티드 범위이며 종종 약 100-1000 bp 길이의 PCR 생성물을 생성하도록 고안된다. 프로브 서열은 전형적으로 40-55 bp 길이이다. 전장 클론의 몇몇 라이브러리를 스크린하기 위해, 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 상기 문헌[Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology]에 따라 PCR 증폭에 의해 스크린하였다. 이어 양성 라이브러리를 사용하여, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중의 하나를 사용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다.
사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 다음과 같다.
역방향 PCR 프라이머 1:
5'-TCTCTGCTTCCAGTCCCATGAGTGC-3' (SEQ ID NO:3)
역방향 PCR 프라이머 2:
5'-GCTTCCAGTCCCATGAGTGCTTCTAGG-3' (SEQ ID NO:4)
혼성화 프로브
5'-GGCCATTCTCCATGAGATGCTTCAGCAGATCTTCAGCCTCTTCAGGGCAA-3' (SEQ ID NO:5)
뉴클레오티드 위치 621-623에 겉보기 번역 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 1245-1247에 정지 시그널을 가지는 단일의 개방 판독 프레임을 함유하는 전장 클론을 동정하였다 (도 1, SEQ ID NO:1). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 208 아미노산 길이이고 약 24,414 달톤의 계산 분자량 값 및 약 8.92의 측정 pI를 갖는다. 도 2에 나타난 전장 PRO655 서열(SEQ ID NO:2)의 분석은 다양한 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 대해 주어진 위치는 대략 상기한 바와 같다. 전장 PRO655 서열(도 2: SEQ ID NO:2)의 분석은 다음의 존재를 입증한다: 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 21의 시그널 펩티드; 약 아미노산 95 내지 약 아미노산 99 및 약 아미노산 104부터 약 아미노산 108의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 181부터 약 아미노산 185의 카제인 키나제 II 인산화 부위; 약 아미노산 133부터 약 아미노산 139까지의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 147부터 약 아미노산 166까지의 인터페론 알파, 베타 및 델타 족(family) 시그니쳐. 클론 DNA50960-1224는 1997년 12월 3일에 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 제209509호를 부여받았다.
도 2에 나타나는 전장 서열(SEQ ID NO:2)의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 사용하는 데이호프(Dayhoff) 데이터베이스(버젼35.45 SwissProt35)의 분석은, PRO655 아미노산 서열 및 다양한 인간 IFN-α종 간의 약 35-40% 서열 상동성을 입증하였다. 상동성은 도 2에 나타난 서열(SEQ ID NO:2)의 22-189 아미노산 지역 내에서 가장 높다. 뉴클레오티드 수준에서, IFN-α의 코딩 서열과의 상동성은 약 60%이다.
(B)PRO364
발현된 서열 태그(EST) DNA 데이터베이스 및 사유 EST 데이터베이스(등록상표 LIFESEQ, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하고, 폴리펩티드의 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 족의 구성인자에 상동성을 나타내는 EST(Incyte EST 제3003460호)를 확인하였다.
블라스트(BLAST; [알츠컬(Altschul) 등,Methods in Enzymology 266: 460-480(1996)]) 및 "프랩(phrap)"(필 그린(Phil Green), 워싱턴주 시애틀 소재의 워싱턴대학교)의 반복 주기를 사용하여 Incyte EST 제3003460호 및 기타 EST 서열에 대한 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 이 컨센서스 서열을 여기서 DNA44825호라 나타낸다.
DNA44825 컨센서스 서열을 기준으로, 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하여: 1) 이를 사용하여 PCR에 의해 관심있는 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 확인하고, 2) PRO364에 대한 전장 코딩 서열 클론을 단리하는 프로브로 사용하였다. 통상 정방향 및 역방향 PCR 프라미어의 길이는 20 내지 30 뉴클레오티드이고, 종종 약 100 내지 1000bp 길이의 PCR 생성물을 제공하도록 설계된다. 대체로 프로브 서열의 길이는 40 내지 55bp이다. 전장 클론의 여러 가지 라이브러리를 스크리닝하기 위해, PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다 [오수벨(Ausubel) 등,Current Protocols in Molecular Biology]. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다.
사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 다음과 같다.
정방향 PCR 프라이머 1:
5'-CACAGCACGGGGCGATGGG-3' (SEQ ID NO:8)
정방향 PCR 프라이머 2:
5'-GCTCTGCGTTCTGCTCTG-3' (SEQ ID NO:9)
정방향 PCR 프라이머 3:
5'-GGCACAGCACGGGGCGATGGGCGCGTTT-3' (SEQ ID NO:10)
역방향 PCR 프라이머 1:
5'-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCAC-3' (SEQ ID NO:11)
역방향 PCR 프라이머 2:
5'-CGCTGACCCAGGCTGAG-3' (SEQ ID NO:12)
역방향 PCR 프라이머 3:
5'-GAAGGTCCCCGAGGCACAGTCGATACA-3' (SEQ ID NO:13)
혼성화 프로브 1:
5'-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGGGACTGCATGTGTGTCCAGC-3' (SEQ ID NO:14)
혼성화 프로브 2:
5'-AGCCTGGGTCAGCGCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-3' (SEQ ID NO:15)
이어 cDNA 라이브러리의 구축을 위한 RNA를 인간 소장 조직으로부터 단리하였다. 미국 캘리포니아주 산디에고 소재 인비트로겐(Invitrogen)사의 제품과 같은 상업적으로 이용 가능한 시약을 사용하여 표준 방법에 의해, 인간 PRO364를 코딩하는 cDNA 클론을 단리하는 데 사용되는 cDNA 라이브러리를 구축하였다. cDNA를 NotI 부위를 함유하는 올리고 dT로 프라이밍하고, SalI 헤미키나제화된(hemikinased) 어댑터에 블런트로 연결하고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기를 적절히 조절하고, 고유의 XhoI 및 NotI 중의 적합한 클로닝 벡터(pRKB 또는 pRKD 등.; pRK5B는 SfiI 부위를 함유하지 않는 pRK5D의 전구체이다.; 문헌 [Holmes et al.,Science,253:1278-1280 (1991)] 참조) 중으로 정의된배향으로 클로닝하였다.
뉴클레오티드 위치 121-123에 겉보기 번역 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 844-846에 정지 시그널을 가지는 단일의 개방 판독 프레임을 함유하는 DNA47365-1206에 대한 전장 클론을 동정하였다 (도 3, SEQ ID NO:6). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 241 아미노산 길이이고 약 26,000 달톤의 계산 분자량 값 및 약 6.34의 측정 pI를 갖는다.
도 4에 나타난 전장 PRO364 서열(SEQ ID NO:7)의 분석은 다양한 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 대해 주어진 위치는 대략 상기한 바와 같다. 전장 PRO364 서열의 분석은 다음의 존재를 입증한다: 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 25의 시그널 펩티드; 약 아미노산 163 내지 약 아미노산 183의 잠재 막횡단 도메인; 약 아미노산 146부터 약 아미노산 150의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 5부터 약 아미노산 11, 약 아미노산 8부터 약 아미노산 14, 약 아미노산 25부터 약 아미노산 31, 약 아미노산 30부터 약 아미노산 36, 약 아미노산 33부터 약 아미노산 39, 약 아미노산 118부터 약 아미노산 124, 약 아미노산 122부터 약 아미노산 128, 및 약 아미노산 156부터 약 아미노산 162의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 166부터 약 아미노산 177까지의 원핵생물 막 지질단백질 지질 부착 부위; 및 약 아미노산 171부터 약 아미노산 193까지의 류신 지퍼 패턴.
클론 DNA47365-1206는 1997년 11월 7일에 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 제209436호를 부여받았다.
도 4에 나타나는 전장 서열(SEQ ID NO:7)의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 사용하는 데이호프(Dayhoff) 데이터베이스(버젼35.45 SwissProt35)의 분석은, PRO364 아미노산 서열 및 종양 괴사 인자 수용체 족의 구성원 사이의 서열 상동성을 입증하였으며, 이로써 PRO364가 종양 괴사 인자 수용체 족의 신규한 구성원일 수 있음을 나타내었다.
전장 천연 PRO364 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상세한 검토는 문헌 [Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:6216-6221 (1997)]에 보고된 마우스 GITR 단백질과의 서열 상동성을 입증한다. 따라서, PRO364가 상기 노센티니(Nocentini) 등의 문헌에서 보고된 마우스 GITR 단백질에 해당하는 인간 상응부를 나타낼 가능성이 있다.
(C)PRO344
스위스-프로트(Swiss-Prot) 공개 데이타베이스 출처의 공지된 약 950가지 분비 단백질의 세포외 도메인(ECD) 서열(분비 시그널 서열이 존재하면 이를 포함함)을 이용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. 상기 EST 데이타베이스는 공개 EST 데이타베이스(예. GenBank) 및 비공개 EST 데이타베이스(예. LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함한다. 컴퓨터 프로그램 블라스트(BLAST) 또는 블라스트2(BLAST2)를 이용하여 ECD 단백질 서열을 상기 EST 서열에 대한 6개 프레임의의 번역과 비교하는 조사를 수행하였다([알츠컬(Altschul) 등,Methods in Enzymology 266: 460-480(1996)]). 공지된 단백질을 코딩하지 않을 경우 나타나는 블라스트 스코어 70(또는, 어떤 경우에는 90) 이상인 서열 단편을 모아서 "프랩(phrap)"이라는 프로그램을 이용하여 컨센서스(consensus) DNA 서열로 조립하였다(필 그린(Phil Green), 워싱턴주 시애틀 소재의 워싱턴대학교).
상기한 프랩을 사용하여 기타 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 이 컨센서스 서열을 여기서 DNA34398이라 지칭한다. 특정 경우, 상기 언급된 EST 서열 정보를 이용하여 가급적 멀리 중간체 컨센서스 서열을 확장시키기 위해 블라스트 및 프랩의 반복 주기를 이용하여 확장된 중간체 컨센서스 DNA 서열로부터 컨센서스 서열이 유도된다.
DNA34398 컨센서스 서열을 기준으로, 올리고뉴클레오티드를 합성하고: 1) 이를 사용하여 PCR에 의해 관심있는 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 확인하고, 2) PRO344에 대한 전장 코딩 서열 클론을 단리하는 프로브로 사용하였다. 통상 정방향 및 역방향 PCR 프라미어의 길이는 20 내지 30 뉴클레오티드이고, 종종 약 100 내지 1000bp 길이의 PCR 생성물을 제공하도록 설계된다. 대체로 프로브 서열의 길이는 40 내지 55bp이다. 어떤 경우에는, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5kbp 이상이면 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 전장 클론의 여러 가지 라이브러리를 스크리닝하기 위해, PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다 ([오수벨(Ausubel) 등,Current Protocols in Molecular Biology]. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다.
PCR 프라이머 (정방향 및 역방향)를 합성하였다:
정방향 PCR 프라이머 1:
5'-TACAGGCCCAGTCAGGACCAGGGG-3' (SEQ ID NO:18)
정방향 PCR 프라이머 2:
5'-AGCCAGCCTCGCTCTCGG-3' (SEQ ID NO:19)
정방향 PCR 프라이머 3:
5'-GTCTGCGATCAGGTCTGG-3' (SEQ ID NO:20)
역방향 PCR 프라이머 1:
5'-GAAAGAGGCAATGGATTCGC-3' (SEQ ID NO:21)
역방향 PCR 프라이머 2:
5'-GACTTACACTTGCCAGCACAGCAC-3' (SEQ ID NO:22)
또한, 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를, 하기 뉴클레오티드 서열을 가지는 컨센서스 DNA34398 서열로부터 구축하였다.
혼성화 프로브:
5'-GGAGCACCACCAACTGGAGGGTCCGGAGTAGCGAGCGCCCCGAAG-3' (SEQ ID NO:23)
cDNA 라이브러리 구축을 위한 RNA를 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용한 cDNA 라이브러리는, 인비트로겐(미국 캘리포니아주 산디에고 소재)사 등으로부터 구입 가능한 시약을 사용하여 표준 방법에 의해 구축하였다. NotⅠ 부위를 포함하는 올리고 dT를 사용하여 cDNA를 프라이밍(priming)하고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 블런트로 연결하고, NotⅠ으로 자르고, 겔 전기영동에 의해 적당한 크기로 분류하고, 적합한 클로닝 벡터 내의 유일한 XOhⅠ 및 NotⅠ부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다(예를 들면, pRKB 또는 pRKD로; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임, [홈스(Holmes) 등,Science,253:1278-1280 (1991)] 참조).
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열화에 의해 전장 PRO344 폴리펩티드에 대한 전장 DNA 서열(본 명세서에서 DNA40592-1242라 지칭됨; 도 5, SEQ ID NO:16 참조) 및 PRO344 폴리펩티드에 대한 유도된 단백질 서열을 생성하였다.
상기 확인된 전장 클론은 뉴클레오티드 위치 227-229에 겉보기 번역 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 956-958에 정지 시그널을 가지는 단일의 개방 판독 프레임을 함유하였다 (도 5, SEQ ID NO:16). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 243 아미노산 길이이고 약 25,297 달톤의 계산 분자량 값 및 약 6.44의 측정 pI를 갖는다. 도 6에 나타난 전장 PRO344 서열(SEQ ID NO:17)의 분석은 다양한 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 대해 주어진 위치는 대략 상기한 바와 같다. 전장 PRO344 서열의 분석은 다음의 존재를 입증하였다: 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 15의 시그널 펩티드; 약 아미노산 11부터 약 아미노산 17까지, 약 아미노산 68부터 약 아미노산 74까지 및 약 아미노산 216부터 약 아미노산 222까지의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 77부터 약 아미노산 80까지의 세포 부착 서열.
클론 DNA40592-1242는 1997년 11월 21에 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 제209492호를 부여받았다.
실시예 2
제자리( in situ ) 혼성화
제자리 혼성화는 세포 및 조직 표본 내의 핵산 서열을 탐지하고 위치를 파악하게 하는 강력한 다용도 기술이다. 예를 들면, 유전자 발현 부위 확인, 전사의 조직 분포 분석, 바이러스 감염 확인 및 위치 파악하는데 유용하므로 특정 mRNA 합성의 변화 및 염색체 지도 작성을 돕는데에도 유용할 수 있다.
PCR-생성33P-표지 리보프로브를 이용하여 문헌[루(Lu) 및 질레트(Gillett),Cell Vision 1:169-176 (1994)]의 최적 버전의 프로토콜로 제자리 혼성화를 수행하였다. 요컨대, 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 묻힌 인간 조직을 절단하고, 파라핀을 제거 후, 37℃에서 15분 동안 단백질 분해효소 K(20 g/ml)로 단백질을 분해하고, 루(Lu) 및 질레트(Gillett)(1994)의 상기 문헌에 개시된 원래 위치에서의 혼성화로 추가 처리하였다. PCR 생성물로부터 [33P]-UTP로 표지된 안티센스 리보프로브를 생성하고 55℃에서 밤새 혼성화하였다. 상기 슬라이드를 코닥(Kodak) NTB2 핵 트랙 에멀젼(nuclear track emulsion) 중에 담그고 4주 동안 노출시켰다.
33 P-리보프로브 합성
6.0㎕ (125mCi)의33P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000Ci/mmol)을 고속 진공 건조시켰다. 건조33P-UTP를 포함하는 각 튜브에, 하기 성분을 가하였다.
2.0㎕ 5x 전사 완충액
1.0㎕ DTT (100mM)
2.0㎕ NTP 혼합물 (2.5mM: 10mM GTP, CTP 및 ATP 각각 10μ+ 10㎕ H2O)
1.0㎕ UTP (50μM)
1.0㎕ RNAsin
1.0㎕ DNA 주형 (l㎍)
1.0㎕ H20
1.0㎕ RNA 중합효소 (PCR 생성물로는 통상 T3 = AS, T7 = S)
37℃에서 1시간 동안 상기 튜브를 인큐베이션하였다. 총 1.0㎕ RQ1 DNase를 첨가한 후에 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 총 90㎕의 TE(10mM Tris(pH 7.6)/lmM EDTA(pH 8.0))를 가하고 상기 혼합물을 DE81 페이퍼에 피펫으로 가하였다. 마이크로콘(Microcon)-50 초미세여과 유니트에 잔류 용액을 로딩하고 프로그램 10을 이용하여 6분 동안 가라앉게 하였다. 제2 튜브로 여과 유니트를 옮기고 프로그램 2를 이용하여 3분 동안 가라앉게 하였다. 최종 회수 가라앉힘 후에, 총 100㎕ TE를 가하였다. DE81 페이퍼 상에 최종 생성물 1㎕를 피펫으로 가하고 6ml의 바이오플루오르(Bioflour) Ⅱ로 계수하였다.
TBE/요소 겔 상에 프로브를 전개시켰다. 3㎕의 로딩 완충액에 총 1 내지 3㎕의 프로브 또는 5㎕의 RNA Mrk Ⅲ를 가하였다. 95℃ 가열 블록(heat block)에서 3분 동안 가열한 후에, 즉시 겔을 얼음에 놓았다. 겔의 웰을 세척 후, 샘플을 로딩하고 180 내지 250볼트에서 45분 동안 전기영동 하였다. 플라스틱 랩(상표명SARAN)으로 겔을 싸고, 이를 -70℃ 냉동고에서 1시간 내지 밤새의 시간 동안 신호 증강 스크린 상에서 XAR 필름에 노출시켰다.
33 P-혼성화
A. 동결 단편의 예비처리
냉동고로부터 슬라이드를 제거하고 알루미늄 트레이에 놓고 상온에서 5분 동안 해빙시켰다. 응축 감소를 위해, 트레이를 55℃ 배양기에 5분 동안 놓았다. 발연 후드(fume hood)에 얼음 상 4% 파라포름알데히드 중에 10분 동안 슬라이드를 고정시키고, 상온에서 0.5x SSC로 5분 동안 세척하였다(25ml 20x SSC + 975ml SQ H2O). 0.5㎍/ml의 단백질분해효소 K로 37℃에서 10분 동안 탈단백질화 후에(250ml의 예열된 RNAse가 없는 RNAse 완충액 중의 12.5㎕의 10mg/ml 원액), 상온에서 10분 동안 0.5x SSC로 단편을 세척하였다. 70%, 95%, 100% 에탄올로 각각 2분 동안 단편을 탈수화하였다.
B. 파라핀에 묻힌 절편의 예비처리
슬라이드를 탈파라핀화하고 SQ H2O 중에 놓고 상온에서 각각 5분 동안 2x SSC 로 2회 세척하였다. 인간 배(embryo) 조직의 경우 20㎕/ml 단백질분해효소 K(250ml RNase가 없는 RNase 완충액 중의 500㎕의 10mg/ml, 37℃, 15분), 또는 포르말린 조직의 경우 8x 단백질분해효소 K(250ml RNAse 완충액 중의 100㎕, 37℃, 30분) 중에서 절편을 탈단백질화하였다. 그 후에, 상기 기재된 바와 같이 0.5x SSC로 세척하고 탈수반응을 수행하였다.
C. 예비혼성화
박스(Box) 완충액(4x SSC, 50% 포름아미드)으로 포화된 여과지에 의해 구획이 나뉜 플라스틱 상자 중에 슬라이드를 놓았다. 50㎕ 혼성화 완충액(3.75g 덱스트란 설페이트 + 6ml SQ H2O)을 조직 시료에 넣고 볼텍싱 후, 뚜껑을 느슨하게 한 상태로 2분 동안 극초단파로 가열하였다. 얼음에서 냉각한 후에, 18.75ml 포름아미드, 3.75ml 20x SSC 및 9ml SQ H2O를 가하고 조직을 잘 볼텍싱한 후, 42℃에서 1내지 4시간 동안 배양하였다.
D. 혼성화
슬라이드마다 1.0 x 106cpm 프로브 및 1.0㎕ tRNA (50mg/ml 원액)를 95℃에서 3분 동안 가열하였다. 얼음에서 상기 슬라이드를 냉각하고 슬라이드마다 48㎕ 혼성화 완충액을 가하였다. 볼텍싱한 후에, 슬라이드 상의 50㎕ 예비혼성화 시료에 50㎕의33P 혼합물을 가하였다. 55℃에서 밤새 이 슬라이드를 배양하였다.
E. 세척
상온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 세척한 후에(400ml 20x SSC + 16ml 0.25M EDTA, 최종 부피=4L), 37℃에서 30분 동안 RNAse A로 처리하였다(250ml RNase 완충액 중의 10mg/ml 농도의 RNase 500㎕ = 20㎍/ml). 상온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 슬라이드를 세척하였다. 엄격성 세척 조건은 하기와 같다. 55℃, 0.1x SSC 및 EDTA에서 2시간(20ml 20x SSC + 16ml EDTA, 최종 부피 = 4L).
F. 올리고뉴클레오티드
본 명세서에 개시된 DNA 서열 중 하나에에 대한 제자리 분석을 수행하였다. 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다.
(1)DNA47365-1206 (PRO364)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAC CCG AGC ATG GCA CAG CAC-3' (SEQ ID NO:24)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCT CCC AGC CGC CCC TTC TC-3' (SEQID NO:25)
(G) 결과
본 명세서에 개시된 상기 DNA 서열 상에 제자리 분석을 수행하였다. 상기 분석의 결과는 하기와 같다.
(1)DNA47365-1206(PRO364)(신규 TNF-수용체 동족체)
태아의 척추골몸통의 앞표면 내의 근막에서 발현이 관찰되었다. 또한, 태아 망막 상에서 발현이 관찰되었다. 저수준의 발현이 태아 뉴런에서 관찰되었다. 기타 모든 조직은 음성이었다.
실시예 3
PRO655, PRO364 또는 PRO344의 혼성화 프로브로서의 용도
하기 방법에는 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로의 용도가 기재되어 있다.
전장 또는 성숙 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 코딩 서열(도 1, 3 및 5 각각, SEQ ID NO:1, 6 및 16 각각에 나타난 바와 같음) 또는 그 단편을 포함하는 DNA를 프로브로서 사용하여 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리 중의 상동 DNA(예를 들면, PRO655, PRO364 또는 PRO344의 자연 발생하는 변종을 코딩하는 DNA)를 스크린한다.
하기의 고도의 엄격성 조건 하에, 라이브러리 DNA를 함유하는 필터의 혼성화 및 세척을 수행한다. 42℃에서 20시간 동안 50% 포름아미드, 5xSSC, 0.1% SDS, 0.1% 피로인산나트륨, 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 2x 덴하르트(Denhart's) 용액 및 10% 덱스트란 술페이트의 용액 중에 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 유도된 방사능표지된 프로브를 필터에 혼성화시켰다. 42℃에서 0.1xSSC 및 0.1% SDS 수용액 중에 필터를 세척하였다.
그 후에, 당업계의 표준 기술을 이용하여 전체 길이의 천연 서열을 코딩하는 DNA와 원하는 서열 상동성이 있는 DNA를 확인할 수 있다.
실시예 4
대장균에서 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 발현
본 실시예는 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 글리코실화 되지 않은 형태를 대장균 재조합 발현에 의해 제조하는 방법에 관한 설명이다.
먼저, 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 DNA 서열을 증폭시킨다. 프라이머는 선택된 발현 벡터의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위를 함유해야 한다. 여러 가지 발현 벡터를 사용할 수 있다. 적합한 벡터의 예는, 앰피실린 및 테트라싸이클린 내성 유전자를 함유하는 pBR322(대장균에서 유래함, [볼리바(Bolivar) 등,Gene,2:95 (1977)] 참조)이다.벡터를 제한효소로 자르고 탈인산화하였다. 그 후에, PCR에 의해 증폭된 서열을 벡터에 결찰시켰다. 바람직하게는 벡터는, 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더(처음 6개의 STⅡ 코돈, 폴리히스 서열 및 엔테로키나제 절단 부위 포함), PRO655, PRO364 또는 PRO344 코딩 지역, 람다 전사 종결자 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함한다.
그 후에, 결찰 혼합물을 사용하고 샘부르크 등의 상기 문헌에 개시된 방법을 이용하여 선택된 대장균 균주를 형질전환시킨다. LB 플레이트 상의 그의 성장 능력에 의해 형질전환체를 확인한 후에, 항생제 내성 콜로니를 선택하였다. 제한 분석 및 DNA 서열 분석에 의해 플라스미드 DNA를 단리하고 확인한다.
선택된 콜로니를 액체 배양 배지, 예를 들면 항생제를 첨가한 LB 브로쓰에 밤새 배양할 수 있다. 그 후에, 밤새 배양한 것을 사용하여 더 큰 규모의 배양에 접종할 수 있다. 그 후에, 세포를 원하는 광밀도로 배양하였고, 이 기간 동안 발현 프로모터를 작동시킨다.
여러 시간 동안 세포를 더 배양한 후에, 원심분리하여 세포를 수획할 수 있다. 당업계에 공지된 여러 가지 제제를 사용하여 원심분리에 의해 수득된 세포 펠릿을 용해시킨 후에, 단백질을 단단히 결합시키는 조건 하에 금속 킬레이트 컬럼을 이용하여 용해된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 단백질을 정제할 수 있다.
하기 방법을 이용하여 폴리-히스 표지 형태의 PRO655, PRO364 또는 PRO344을 대장균에서 발현시킬 수 있다. 먼저, 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 DNA를 증폭시킨다. 이 프라이머는 선택된 발현 벡터의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위, 및 효율적이고 정확한 번역 개시, 금속 킬레이트화 컬럼 상의 급속 정제 및 엔테로키나제에 의한 단백질 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열에 상응하는 제한 효소 부위를 함유할 것이다. 그 후에, 발현 벡터에 PCR에 의해 증폭된 폴리-히스 태그 서열을 결찰시키고, 이를 사용하여 균주 52 기재(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq))의 대장균 숙주를 형질전환시킨다. 먼저, 형질전환체를 진탕하면서 30℃에서 50mg/ml 카르베니실린을 포함하는 LB 배지에서 배양하여 OD600이 3 내지 5까지 이르게 한다. 그 후에, CRAP 배지(3.57g (NH4)2SO4, 0.71g 시트르산나트륨·2H20, 1.07g KCl, 5.36g Difco 효모 추출물, 물 500mL 중의 Sheffield hycase SF 5.36g, 및 110mM MPOS(pH 7.3), 0.55% (w/v) 글루코스 및 7mM MgSO4를 혼합하여 제조함)에 50 내지 100배로 배양물을 희석시키고 진탕하며 30℃에서 약 20-30 시간 동안 배양시킨다. 샘플을 채취하여 SDS-PAGE 분석에 의해 발현을 확인하고, 이 배양물을 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. 정제 및 재폴딩 실험시까지 세포 펠릿을 동결시킨다.
7M 구아니딘, 20mM Tris(pH 8) 완충액 10 볼륨(w/v)에 0.5 내지 1L 발효물(6 내지 10g 펠릿)의 대장균 페이스트를 재현탁시킨다. 고형 아황산나트륨 및 테트라티온산나트륨을 가하여 최종 농도가 각각 0.1M 및 0.02M 각각이 되도록 하고, 이 용액을 4℃에서 밤새 교반한다. 그 결과, 모든 시스테인 잔기가 술피톨화에 의해 차단된 변성된 단백질이 나타난다. 베크만 초원심분리기로 30분 동안 40,000rpm에서 상기 용액을 원심분리시킨다. 상층액을 3 내지 5 볼륨의 금속 킬레이트 컬럼완충액(6M 구아니딘, 20mM Tris(pH 7.4))으로 희석하고 0.22㎛ 필터를 통해 투명하게 여과시킨다. 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형을 이룬 퀴아젠(Qiagen) Ni2+-NTA 금속 킬레이트 컬럼 5ml에 투명한 추출물을 로딩한다. pH 7.4인 50mM 이미다졸(칼바이오켐, Utrol 등급)을 함유하는 추가 완충액으로 컬럼을 세척한다. 250mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 이 단백질을 용출시킨다. 원하는 단백질을 함유하는 분획을 모아 4℃에서 동결시킨다. 이 단백질의 아미노산 서열을 기초로 계산된 흡광 계수를 이용하여 280nm에서의 그의 흡광도에 의해 단백질 농도를 측정한다.
20mM Tris(pH 8.6), 0.3M NaCl, 2.5M 우레아, 5mM 시스테인, 20mM 글리신 및 1mM EDTA로 이루어진 새로 제조한 재폴딩 완충액에 샘플을 천천히 희석하여 상기 단백질을 재폴딩시킨다. 최종 단백질 농도가 50 내지 100㎍/ml이 되도록 재폴딩 부피를 선택한다. 4℃에서 12 내지 36시간 동안 재폴딩 용액을 천천히 교반한다. 최종 농도 0.4%(pH 약 3)의 TFA를 가하여 재폴딩 반응을 끝낸다. 상기 단백질의 추가 정제 전에, 상기 용액을 0.22㎛ 필터로 여과하고 아세토니트릴을 가하여 최종 농도가 2 내지 10%가 되게 한다. 0.1% TFA의 이동상 완충액을 사용하고 10 내지 80%의 아세토니트릴 농도 구배로 용출하는 포로스(Poros) R1/H 역상 컬럼을 통해 상기 재폴딩 단백질을 크로마토그래피한다. A280흡광도가 측정된 분획의 일부를 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하고, 재폴딩된 균질의 단백질을 함유하는 분획을 수집한다. 통상, 대부분 단백질의 적당히 재폴딩된 종이 역상 수지와의 상호작용으로부터 차단된 소수성 내부를 가지고 매우 밀집되어있기 때문에, 대부분 단백질의 적당히 재폴딩된 종이 가장 낮은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 더 높은 아세토니트릴 농도에서는 집합체를 이루는 종이 대개 용출된다. 잘못 폴딩된 단백질 형태를 원하는 형태에서 분리하는 것 외에도, 역상 단계에서는 시료로부터 내독소를 또한 제거한다.
원하는 폴딩 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 함유하는 분획을 수집하고 상기 용액에 질소의 완만한 흐름을 이용하여 아세토니트릴을 제거한다. 투석에 의해 또는 제제화 완충액 중에 평형을 이루고 멸균 여과된 G25 슈퍼파인(Superfine)(Pharmacia) 수지를 이용한 겔 여과에 의해 0.14M 염화나트륨 및 4% 만니톨을 갖는 pH 6.8의 20mM Hepes 중에 단백질을 제제화한다.
상기 과정에 의해 PRO655 및 PRO364를 폴리-히스 태그 형태로 대장균 중에 성공적으로 발현시켰다.
실시예 5
포유류 세포 중의 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 발현
본 실시예는 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 잠재적으로 글리코실화된 형태를 포유류 세포의 재조합 발현에 의해 제조하는 방법에 관한 설명이다.
발현 벡터로서 벡터 pRK5(1989년 3월 15일 발행된 유럽 특허 제307,247호 참조)를 사용한다. 임의로, 선택된 제한효소를 가지고 PRO655, PRO364 또는 PRO344 DNA를 pRK5에 결찰시켜, 샘부르크(Sambrook) 등의 상기 문헌에 개시된 것과 같은 결찰 방법을 이용하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344 DNA를 삽입한다. 이렇게 생성된 벡터를 pRK5-PRO655, pRK5-PRO364 또는 pRK5-PRO344라 칭한다.
한 실시태양에서, 선택된 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 예를 들면, 송아지 태아 혈청 및 임의적으로 영양 성분 및(또는) 항생제를 보충한 DMEM 배지의 조직 배양 플레이트에 인간 293 세포(ATCC CCL 1573호)를 플레이트 가득 배양하였다. 약 10㎍의 pRK5-PRO655, pRK5-PRO364 또는 pRK5-PRO344 DNA를, VA RNA 유전자([팀마파야(Thimmappaya) 등,Cell,31:543(1982)])를 코딩하는 약 1㎍의 DNA와 혼합하고 500㎕의 1mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, 0.227M CaCl2중에 용해시켰다. 상기 혼합물에 500㎕의 50mM HEPES (pH 7.35), 280mM NaCl, 1.5mM NaPO4를 적가하고 25℃에서 10분 동안 침전물을 형성시켰다. 이 침전물을 현탁시키고 293 세포에 가하여 37℃에서 약 4시간 동안 가라앉도록 하였다. 배양 배지를 흡입 제거하고 PBS 중의 20% 글리세롤 2ml을 30초 동안 가하였다. 그 후에, 무혈청 배지를 가지고 293 세포를 세척하고 새 배지를 첨가한 후에, 약 5일 동안 세포를 배양하였다.
형질감염 약 24시간 후에, 상기 배지를 제거하고 배양 배지(단독) 또는 200μCi/ml35S-시스테인 및 200μCi/ml35S-메티오닌을 포함하는 배양 배지를 넣어주었다. 12시간 배양 후, 조절된 배지를 수획하고 회전 필터로 농축하여 15% SDS 겔 상에 로딩하였다. 상기 겔을 건조시키고 일정 기간 동안 필름에 노출시켜 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드가 존재함을 알아냈다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양물을 (무혈청 배지에서) 추가로 배양하고 선택된 생물분석으로 배지를 시험하였다.
다른 기술로, 문헌[솜파리락(Somparyrac) 등,Proc. Natl. Acad. Sci 12:7575 (1981)])에 개시된 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 293 세포에 일시적으로 도입할 수 있다. 회전 플라스크 중에 최대 밀도로 293 세포를 배양하고 700㎍ pRK5-PRO655, pRK5-PRO364 또는 pRK5-PRO344 DNA를 가하였다. 먼저, 원심분리에 의해 이 세포를 회전 플라스크에서 농축하고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 세포 펠릿에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 세포를 90초 동안 20% 글리세롤로 처리하고 조직 배양용 배지로 세척 후, 조직 배양용 배지, 5㎍/ml의 소 인슐린 및 0.1㎍/ml 소 트랜스페린을 포함하는 회전 플라스크에 재도입하였다. 약 4일 후에, 조절된 배지를 원심분리 및 여과하여 세포 및 찌꺼기를 제거하였다. 그 후에, 발현된 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 포함하는 샘플을 농축하고 임의의 선택된 방법, 예를 들면 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
다른 실시양태에서, CHO 세포에서 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 발현시킬 수 있었다. CaPO4또는 DEAE-덱스트란과 같은 공지된 시약을 사용하여 CHO 세포를 pRK5-PRO655, pRK5-PRO364 또는 pRK5-PRO344로 형질감염시킬 수 있었다. 상기 기재된 바와 같이, 세포 배양물을 배양하고 배지를 배양용 배지(단독) 또는35S-메티오닌과 같은 방사능표지를 포함하는 배지로 대체하였다. PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 존재를 측정한 후에, 무혈청 배지로 배양용 배지를 대체할 수 있다. 바람직하게는, 약 6일 동안 배양물을 배양한 후에, 조절된 배지를 수획한다. 그 후에, 발현된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 포함하는 배지를 임의의 선택된 방법으로 농축하고 정제할 수 있다.
또한, 숙주 CHO 세포 중에 에피토프 태그된 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 발현시킬 수 있었다. pRK5 벡터에서 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 서브클로닝할 수 있다. PCR을 수행하여 바쿨로바이러스 발현 벡터에 폴리-히스 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 갖는 서브클론 삽입체를 동일한 프레임에 융합시켰다. 그 후에, 선택 마커, 예를 들면 안정한 클론을 선택하는 DHFR을 포함하는 SV40에서 유래한 벡터에 폴리-히스 태그 PRO655, PRO364 또는 PRO344 삽입체를 서브클로닝할 수 있다. 결국, SV40에서 유래한 벡터로 (상기한 바와 같이) CHO 세포를 형질감염시킬 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 표지를 이용하여 발현을 확인할 수 있다. 그 후에, 임의의 선택된 방법, 예를 들면 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피에 의해 발현된 폴리-히스 태그 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 포함하는 배양용 배지를 농축하고 정제할 수 있다.
일시적인 발현 방법에 의해 CHO 및(또는) COS 세포 중에, 또는 또다른 안정한 발현 방법에 의해 CHO 세포 중에, PRO655, PRO364 또는 PRO344를 또한 발현시킬 수 있다.
하기 방법을 이용하여 CHO 세포에서 안정하게 발현시켰다. IgG 구축물 (면역어드헤신; immunoadhesin)로서 단백질이 발현되었고, 여기서 각 단백질의 용해가능한 형태(세포외 도메인)의 코딩 서열은 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1의 불변부 서열에 융합되고(되거나) 폴리-히스 태그 형태이었다.
PCR 증폭 후에, 문헌[오수벨(Ausuble) 등,Current Protocols of Molecular Biology,Unit 3.16, John Wiley 및 Sons(1997)]에 개시된 바와 같은 표준 기술을 이용하여 CHO 발현 벡터 중에 각 DNA를 서브클로닝한다. cDNA의 편리한 셔틀링을 가능케 하는 관심있는 DNA의 5' 및 3'의 호환성 제한 부위를 갖는 CHO 발현 벡터를 만들었다. CHO 세포의 발현에 사용되는 벡터는 문헌[루카스(Lucas) 등,Nucl. Acids Res.24:9(1774-1779)(1996)]에 개시되어 있고 SV40 초기 프로모터 및 인핸서를 사용하여 관심있는 cDNA 및 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 발현시켰다. DHFR 발현으로, 형질감염 후 플라스미드를 안정하게 유지하는 세포의 선택이 가능하다.
시판되는 형질감염 시약, 예를 들면 슈퍼펙트(Superfect)(Quiagen), 도스퍼 (Dosper) 또는 퓨진(Fugene)(Boehringer Mannheim)을 사용하여 거의 천만개 CHO 세포에 원하는 플라스미드 DNA 12㎍을 도입하였다. 루카스(Lucas) 등의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 세포를 배양하였다. 하기 기재된 바와 같은 추가의 배양 및 생산을 위해 앰플 중에 약 3 x 10-7세포를 동결시켰다.
수조에 놓아 플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 해빙시키고 볼텍싱으로 혼합하였다. 배지 10mL을 포함하는 원심분리 튜브 중에 상기 혼합물을 넣고 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 10mL의 선별 배지(5% 0.2㎛ 통과하여 여과된 송아지 태아 혈청을 갖는 0.2㎛ 여과된 PS20)에 재현탁시켰다. 그 후에, 90mL 선별 배지를 포함하는 100mL 회전 플라스크 중에 세포를 나누어 넣었다. 1 내지 2일 후에, 150mL 선별 배지로 채워진 250mL 회전 플라스크에 세포를 옮기고37℃에서 배양하였다. 2 내지 3일 후에, 250mL, 500mL 및 2000mL 회전 플라스크에 3 x 105세포/ml을 접종하였다. 원심분리하여 상기 세포 배지를 새 배지로 교환하고 생산 배지 중에 재현탁하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 사용할 수도 있지만, 실제로는 1992년 6월 16일에 발행된 미국 특허 제5,122,469호에 개시된 생산 배지를 사용할 수 있다. 1.2 x 106세포/ml을 3L 생산 회전 플라스크에 접종하였다. 0일째, 세포의 수와 pH를 측정하였다. 1 일째, 회전 플라스크 1개를 선택하고 여과된 공기를 살포를 시작하였다. 2일째, 회전 플라스크를 선택하고 온도를 33℃로 전환하여 30mL의 500g/L 포도당 및 0.6mL의 10% 포말제거제(예를 들면, 35% 폴리디메틸실록산 에멀젼, 다우 코닝(Dow Corning) 365 메디칼 그레이드 에멀젼)를 넣었다. 폴리펩티드를 생산하는 동안 pH를 조절하여 7.2 부근으로 맞추었다. 10일 후에, 또는 생존력이 70% 미만으로 떨어질 때까지, 원심분리 및 0.22㎛ 필터로 여과하여 세포 배양물을 수획하였다. 여액을 4℃에 보관하거나 또는 바로 정제용 컬럼에 로딩하였다.
폴리-히스 태그된 단백질은 Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 정제한다. 정제하기 전에, 조절된 배지에 5mM의 농도가 되도록 이미다졸을 가하였다. 4℃에서 분당 4 내지 5ml의 유속으로, 0.3M NaCl 및 5mM 이미다졸을 포함하는 완충액인 pH 7.4의 20mM Hepes로 평형을 이룬 6ml Ni2+-NTA 컬럼에 조절된 배지를 넣어주었다. 로딩 후에, 부가의 평형 완충액으로 컬럼을 세척하고 0.25M 이미다졸을 함유하는평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 그 후에, 25ml G25 슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼을 가지고 10mM Hepes, 0.14M NaCl 및 4% 만니톨(pH 6.8)을 함유하는 저장 완충액으로 상기 고도로 정제된 단백질을 탈염하고 -80℃에 보관하였다.
하기와 같이 조절된 배지로부터 면역어드헤신(Fc 포함)을 정제하였다. 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8)과 평형을 이룬 5ml의 단백질 A 컬럼(Pharmacia)에 조절된 배지를 넣어주었다. 로딩 후에, 평형 완충액으로 컬럼 전체를 세척하고 100mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 275 ㎕의 1M Tris 완충액(pH 9)을 함유하는 튜브에 1ml 분획을 수집하여 용출 단백질을 즉시 중화시켰다. 그 후에, 상기 기재된 폴리-히스 태그된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액 중에 고도로 정제된 단백질을 탈염하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 에드만(Edman) 분해에 의한 N-말단 아미노산 서열 분석으로 균질성을 평가하였다.
상기 방법에 의해 PRO364를 CHO 세포 중에 안정하게 발현시켰다. 또한, 일시적인 발현 방법에 의해 PRO364를 CHO 세포 중에 발현시켰다.
실시예 6
효모에서 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 발현
하기에는 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 효모에서 재조합 발현시키는 방법이 기재되어 있다.
먼저, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 세포 내부 생산 또는 분비를 위해 효모 발현 벡터를 만들었다. 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 세포 내부 발현을 지시하도록PRO655, PRO364 또는 PRO344 및 프로모터를 코딩하는 DNA를 삽입하였다. 분비용으로는, 선택된 플라스미드 중에 ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO655, PRO364 또는 PRO344 시그널 펩티드 또는 기타 포유류 시그널 펩티드 (예. 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 시그널/리더 서열 및 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 발현을 위한 링커 서열(필요시)을 코딩하는 DNA와 함께 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 DNA를 클로닝할 수 있었다.
그 후에, 상기 기재된 발현 플라스미드를 가지고 효모 균주 AB110와 같은 효모 세포를 형질전환시키고 선택 발효 배지 중에 배양하였다. 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE에 의해 분리시킨 후에, 쿠마시 블루 염색으로 겔을 염색하여 형질전환된 효모의 상층액을 분석할 수 있었다.
그 후에, 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 분리하여 재조합 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 단리 및 정제한 후, 선택 카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시켰다. 또한, 선택 컬럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 함유하는 농축물을 추가로 정제할 수 있다.
실시예 7
바쿨로바이러스에 감염된 곤충 세포에서 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 발현
하기에는 바쿨로바이러스에 감염된 곤충 세포에서의 재조합 발현 방법이 기재되어 있다.
PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 서열이 바쿨로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합되어 있다. 상기 에피토프 태그는 폴리-히스태그 및 면역글로불린 태그(IgG의 Fc 영역과 유사)를 포함한다. 시판되는 플라스미드, 예를 들면, pVL1393(Novagen)으로부터 유래한 플라스미드를 포함한 여러 가지 플라스미드를 사용할 수 있다. 요컨데, PCR에 의해 5' 및 3' 지역에 상보적인 프라이머를 가지고 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 코딩하는 서열 또는 PRO655, PRO364 또는 PRO344의 코딩 서열의 원하는 부분(예를 들면, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열 또는 단백질이 세포외인 경우 성숙 단백질을 코딩하는 서열)을 증폭시킨다. 5' 프라이머는 합성되는(선택) 제한 효소 부위에 혼입될 수 있다. 그 후에, 상기 선택 제한 효소로 생성물을 자르고 발현 벡터 중에 서브클로닝하였다.
리포펙틴(GIBCO-BRL에서 시판함)을 이용하여Spodoptera frugiperda("Sf9")세포(ATCC CRL 1711호)에 상기 플라스미드 및 바쿨로골드(BaculoGold, 상표명) 바이러스 DNA(Pharmingen)를 동시 형질감염시켜 재조합 바쿨로바이러스를 생성하였다. 28℃에서 4 내지 5일 동안 배양 후에, 방출된 바이러스를 수획하여 추가로 증폭하는데 사용하였다. 오레일리(O'Reilley)등의 문헌[Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 기재된 바와 같이 바이러스 감염 및 단백질 발현을 수행하였다.
그 후에, 예를 들면 하기 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피에 의해, 발현된 폴리-히스 태그 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 정제할 수 있다. 문헌[루퍼트(Rupert) 등,Nature,362: 175-179 (1993)]에 개시된 바와 같이 재조합 바이러스에 감염된 Sf9 세포로부터 추출물을 제조한다. 요컨대, Sf9 세포를 세척하고, 초음파처리 완충액(25mL Hepes(pH 7.9), 12.5mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 10% 글리세롤, 0.1% NP40 및 0.4M KCl)에 재현탁시켜 얼음 상에서 20초 동안 2회 초음파처리한다. 원심분리에 의해 초음파처리한 것을 맑게 하고 상층액을 로딩 완충액(50mM 인산염, 300mM NaCl, 10% 글리세롤(pH 7.8)) 중에 50배로 희석시켜 0.45 mm 필터를 통해 여과시킨다. 수지만의 부피 5mL로 Ni2+-NTA 아가로오스 컬럼(Qiagen에서 시판함)을 제조하고 25 ml의 물로 세척하고 25mL의 로딩 완충액으로 평형을 이루게 하였다. 분당 0.5mL로, 여과된 세포 추출물을 컬럼에 로딩하였다. 로딩 완충액으로 기준선 A280까지 컬럼을 세척하고, 이 지점에서 분획 수집을 시작하였다. 다음에, 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시키는 두 번째 세척 완충액(50mM 인산염, 300mM NaCl, 10% 글리세롤(pH 6.0))으로 컬럼을 세척하였다. 다시 A280기준선에 도달한 후에, 두 번째 세척 완충액 중에 0 내지 500mM의 이미다졸 농도 구배로 컬럼을 전개시켰다. 1 ml 분획을 수확하여 SDS-PAGE 및 실버 염색(silver staining) 또는 웨스턴 블롯(western blot)에 의해 알칼라인 포스파타제에 결합된 Ni2+-NTA(Qiagen)를 가지고 분석하였다. 용출된 His10-태그 PRO655, PRO364 또는 PRO344 각각을 함유하는 분획을 수집하고 로딩 완충액에 대해 투석하였다.
별법으로, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공지된 크로마토그래피 기술을 사용하여 IgG 태그(또는 Fc 태그) PRO655, PRO364 또는PRO344의 정제를 수행할 수 있다.
PCR 증폭 후에, 바쿨로바이러스 발현 벡터(IgG 융합용 pb.PH.IgG 및 폴리-히스 태그된 단백질용 pb.PH.His.c)에 각 코딩 서열을 서브클로닝하고, 리포펙틴(Gibco BRL)을 사용하여 105Spodoptera frugiperda("Sf9") 세포(ATCC CRL 1711호)에 상기 벡터 및 바쿨로골드(등록상표) 바쿨로바이러스 DNA(Pharmingen)를 동시에 형질전환하였다. pb.PH.IgG 및 pb.PH.His는 시판되는 바쿨로바이러스 발현 벡터 pVL1393(Pharmingen)의 변이체로서, 변형된 폴리링커 지역은 His 또는 Fc 태그 서열을 포함하고 있다. 10% FBS(Hyclone)가 보충된 힝크(Hink's) TNM-FH 배지에서 세포를 배양하였다. 28℃에서 5일 동안 세포를 배양하였다. 상층액을 수획하고, 이어서 10% FBS가 보충된 힝크 TNM-FH 배지 중에 Sf9 세포를 감염 다중성(multiplicity of infection, MOI) 약 10으로 감염시켜 1차 바이러스 증폭에 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 수획하고 히스티딘 태그된 단백질은 Ni2+-NTA 비드(QIAGEN) 25mL로, IgG 태그된 단백질은 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드(Pharmacia) 25mL로 상층액 1ml을 뱃치 결합시켜 바쿨로바이러스 발현 벡터의 구성물의 발현을 측정한 후에, SDS-PAGE 분석에 이은 쿠마시 블루 염색에 의해 공지된 농도의 표준 단백질과 비교하였다.
1차로 바이러스 증폭된 상층액을 사용하여 약 0.1 MOI로 ESF-921 배지(발현 시스템 LLC)에서 배양한 Sf9 세포의 회전 플라스크 배양물(500ml)을 감염시켰다. 28℃에서 3일 동안 세포를 배양하였다. 상층액을 수획 및 여과하였다. 필요시에는 회전 플라스크 배양물의 발현이 확인될 때까지 뱃치 결합 및 SDS-PAGE 분석을반복하였다.
형질감염 세포(0.5 내지 3L)로부터 상기 조절된 배지를 원심분리에 의해 수획하여 세포를 제거하고 0.22㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-히스 태그된 구성물용으로, Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen)을 사용하여 상기 단백질 구성물을 정제하였다. 정제하기 전에, 조절된 배지에 5mM 농도로 이미다졸을 가하였다. 4℃에서 분당 4 내지 5ml의 유속으로, 0.3M NaCl 및 5mM 이미다졸을 함유하는 완충액인 pH 7.4의 20mM Hepes로 평형을 이룬 6ml Ni2+-NTA 컬럼에 조절된 배지를 넣어주었다. 로딩 후에, 부가의 평형 완충액으로 컬럼을 세척하고 0.25M 이미다졸을 함유하는 평형 완충액으로 단백질을 용출시켰다. 그 후에, 25ml G25 슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼으로 10mM Hepes, 0.14M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH 6.8)으로 고도로 정제된 단백질을 탈염하고 -80℃에서 보관하였다.
면역어드헤신(Fc 함유) 단백질 구성물을 하기와 같이 조절된 배지로부터 정제하였다. pH 6.8인 20mM 인산나트륨 완충액 중에 평형에 도달한 5mL 단백질 A 컬럼(Pharmacia)에 상기 조절된 배지를 넣어주었다. 로딩 후에, 평형 완충액으로 컬럼을 모두 세척하고 pH 3.5의 시트르산 100mM로 용출하였다. pH 9의 1M Tris 완충액 275mL를 함유하는 튜브에 분획 1ml을 수집하여 용출 단백질을 즉시 중화시켰다. 그 후에, 상기 기재된 폴리-히스 태그된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액 중으로 고도로 정제된 단백질을 탈염하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔(PEG) 전기영동에 의해 단백질의 균질성을 확인하고 에드만(Edman) 분해에 의해 N-말단 아미노산 서열 분석을 하였다.
바쿨로바이러스에 감염된 Sf9 곤충 세포에서 PRO344를 발현시켰다.
별법으로는, 개량된 바쿨로바이러스 방법을 사용하여 하이-5 세포를 도입할 수 있다. 이 방법에서, 원하는 서열을 코딩하는 DNA를, 적합한 시스템(예를 들면, Pfu(Stratagene) 또는 바쿨로바이러스 발현 벡터에 융합된 함유 에피토프 태그의 5'-상류)으로 증폭시킨다. 상기 에피토프 태그는 폴리-히스 태그 및 면역글로불린 태그(IgG의 Fc 영역과 유사함)를 포함한다. pIE1-1(Novagen)과 같은 시판되는 플라스미드로부터 유래한 플라스미드를 포함하는 여러 가지 플라스미드를 사용할 수 있다. pIE1-1 및 pIE1-2 벡터는 안정하게 형질전환된 곤충세포(1) 중에 바쿨로바이러스 ie1 프로모터로부터 재조합 단백질의 구조적 발현(constitutive expression)을 위해 고안된다. 플라스미드는 다중 클로닝 부위의 배향 면에서만 상이하며 hr5 인핸서 성분 뿐 아니라 감염되지 않은 곤충 세포에서 ie1-매개 유전자 발현에 중요하다고 알려진 모든 프로모터 서열을 함유한다. pIE1-1 및 pIE1-2는 번역 개시 부위를 포함하며 융합 단백질 생성에 사용될 수 있다. 요컨대, PCR에 의해 5' 및 3' 지역에 상보적인 프라이머를 가지고 원하는 서열 또는 서열의 원하는 부분(예를 들면, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열)을 증폭시킨다. 5' 프라이머는 합성되는(선택) 제한 효소 부위에 혼입될 수 있다. 그 후에, 상기 선택 제한 효소로 생성물을 자르고 발현 벡터 중에 서브클로닝하였다. 예를 들면, pIE1-1의 유도체는 인간 IgG의 Fc 지역(pb.PH.IgG) 또는 원하는 서열 3' 하류의 8 히스티딘(pb.PH.His) 태그를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 서열 확인을 위해 벡터 구성물을 서열 분석하였다.
27℃의 온도, CO2가 없고, NO 펜/스트렙(pen/strep) 조건 하에서 플레이트의 50%까지 하이-5 세포를 배양하였다. 각 150mm 플레이트에 1ml Ex-Cell 배지(배지: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences #14401-78P(주의: 상기 배지는 빛에 민감함))에 서열을 함유하는 pIE 기초의 벡터 30 ㎍을 혼합하였고, 별도의 튜브에 1ml의 엑스-셀(Ex-Cell) 배지에 셀펙틴(CellFECTIN, GibcoBRL #10362-010)(볼텍스로 혼합)) 100㎕를 혼합하였다. 상기 두 용액을 혼합하여 상온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. DNA 및 CellFECTIN 혼합물 2ml에 엑스-셀 배지 8ml을 가하고, 엑스-셀 배지로 1회 세척한 하이-5 세포에 상기 혼합물을 올려놓았다. 그 후에, 상기 플레이트를 상온에서 1시간 동안 어두운 상태로 배양하였다. 그 후에, DNA/셀펙틴(CellFECTIN) 혼합물을 제거하고 Ex-Cell로 1회 세포를 세척하여 과량의 셀펙틴을 제거하였다. 새로운 엑스-셀 배지 30ml을 가하고 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 수획하고, 히스티딘 태그된 단백질은 Ni2+-NTA 비드(QIAGEN) 25mL로, IgG 태그된 단백질은 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드(Pharmacia) 25mL로 상층액 1ml을 뱃치 결합시켜 바쿨로바이러스 발현 벡터의 서열의 발현을 측정한 후에, SDS-PAGE 분석에 이은 쿠마시 블루 염색에 의해 공지된 농도의 표준 단백질과 비교하였다.
형질감염 세포(0.5 내지 3L)로부터 상기 조절된 배지를 원심분리에 의해 수획하여 세포를 제거하고 0.22㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-히스 태그된 구성물용으로, Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen)을 사용하여 상기 서열을 포함하는 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에, 조절된 배지에 5mM 농도로 이미다졸을 가하였다. 48℃에서 분당 4 내지 5ml의 유속으로, 0.3M NaCl 및 5mM 이미다졸을 함유하는 완충액인 pH 7.4의 20mM Hepes와 평형을 이루는 6ml Ni2+-NTA 컬럼에 조절된 배지를 넣어주었다. 로딩 후에, 부가의 평형 완충액으로 컬럼을 세척하고 0.25M 이미다졸을 함유하는 평형 완충액으로 단백질을 용출시켰다. 그 후에, 25ml G25 슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼으로 10mM Hepes, 0.14M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH 6.8)으로 고도로 정제된 단백질을 탈염하고 -80℃에서 보관하였다.
면역어드헤신(Fc 포함) 단백질 구성물을 하기와 같이 조절된 배지로부터 정제하였다. pH 6.8인 20mM 인산나트륨 완충액 중에 평형에 도달한 5mL 단백질 A 컬럼(Pharmacia)에 조절된 배지를 넣어주었다. 로딩 후에, 평형 완충액으로 컬럼을 모두 세척하고 pH 3.5의 시트르산 100mM로 용출하였다. pH 9의 1M Tris 완충액 275mL를 함유하는 튜브에 분획 1ml을 수집하여 용출 단백질을 즉시 중화시켰다. 그 후에, 상기 기재된 폴리-히스 태그된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액으로 고도로 정제된 단백질을 탈염하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔에 의해 그리고 에드만(Edman) 분해에 의한 N-말단 아미노산 서열 분석 및 기타 필요한 분석 방법에 의해 서열의 균질성을 확인하였다.
하이-5 세포를 사용하는 상기 바쿨로바이러스 방법을 사용하여 PRO364 및 PRO344를 발현시켰다.
실시예 8
PRO655, PRO364 또는 PRO344에 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 PRO655, PRO364 또는 PRO344에 특이적으로 결합하는 모노클론 항체의 제조에 관한 설명이다.
모노클론 항체 제조 기술은 당업계에 공지되고 예를 들어 고딩(Goding)의 상기 문헌에 개시되어 있다. 사용될 수 있는 면역원은 정제된 PRO655, PRO364 또는 PRO344, PRO655, PRO364 또는 PRO344를 함유하는 융합 단백질, 및 세포 표면 상에 재조합 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 발현시키는 세포를 포함한다. 당업계 숙련자는 별다른 과도한 실험없이 면역원을 선택할 수 있었다.
완전한 프로인트의 면역보강제 중에 유화된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 면역원을 1 내지 100㎍ 양으로 피하적으로 또는 복강내로 주사하여 Balb/c와 같은 마우스를 면역화시킨다. 또는, 동물 뒷발 패드 내로 MPL-TDM 면역보강제(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) 중에 유화된 면역원을 주사한다. 10 내지 12일 후에, 선택 면역보강제 중에 유화된 부가의 면역원으로 상기 면역화된 마우스의 면역을 증강시켰다. 이후, 몇주 동안, 추가 면역제 주사로 마우스의 면역을 증강시킬 수 있다. 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 항체를 검출하는 ELISA 분석법으로 시험하기 위해 레트로-오비탈 블리딩(retro-orbital bleeding)에 의해 마우스로부터 혈청 샘플을 주기적으로 얻을 수 있다.
적합한 항체 적정 농도의 검출 후에, 항체가 "양성"인 동물에는 최종 정맥 주사로 PRO655, PRO364 또는 PRO344를 주사하였다. 3 내지 4일 후에, 마우스를 도살하여 비장 세포를 수획하였다. 그 후에, 선택된 쥐과 골수 세포주(예를 들면, ATCC CRL 1597호로부터 입수가능한 P3X63AgU.1)에 비장 세포를 융합시켰다(35% 폴리에틸렌 글리콜을 사용함). 상기 융합으로 생성된 하이브리도마 세포를, HAT배지(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘)를 들어있는 96 웰 조직 배양 플레이트에 접종하여 미융합 세포, 골수 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드의 증식을 억제할 수 있다.
PRO655, PRO364 또는 PRO344에 대한 하이브리도마 세포의 반응성은 ELISA로 스크린하였다. PRO655, PRO364 또는 PRO344에 대한 원하는 모노클론 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포의 결정은 당업계 기술 범위 내에 있다.
유전적으로 동계의 Balb/c 마우스의 복강내로 양성 하이브리도마 세포를 주사하여 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 모노클론 항체를 함유하는 복수를 생성할 수 있다. 다른 방법으로, 조직 배양 플라스크 또는 롤러 보틀(roller bottle)에서 하이브리도마 세포를 배양할 수 있다. 황산암모늄 침전법 및 이어 겔 배제 크로마토그래피를 사용하여, 복수에서 생산된 모노클론 항체를 정제할 수 있다. 또는, 단백질 A 또는 단백질 G에 항체를 결합시키는 친화 크로마토그래피를 사용할 수도 있다.
실시예 9
특이적 항체를 이용하는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 정제
단백질 정제 분야의 여러 가지 표준 기술로 천연 또는 재조합 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 정제할 수 있었다. 예를 들면, 관심있는PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 특이적인 항체를 사용하는 면역친화 크로마토그래피에 의해 pro-PRO655, pro-PRO364 또는 pro-PRO344PRO 폴리펩티드, 성숙 PRO655, 성숙 PRO364 또는 성숙 PRO344 폴리펩티드, 또는 pre-PRO655, pre-PRO364 또는 pre-PRO344 폴리펩티드를 정제한다. 일반적으로, 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 폴리펩티드 항체를 활성 크로마토그래피 수지에 공유 결합시켜 면역친화성 컬럼을 만들었다.
황산암모늄으로 침전시키거나 또는 고정 단백질 A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)상에 정제하여 면역 혈청으로부터 다중클론 면역글로불린을 제조한다. 유사하게, 황산암모늄 침전 또는 고정 단백질 A 상에 크로마토그래피하여 마우스 골수종으로부터 모노클론 항체를 제조한다. 크로마토그래피 수지, 예를 들면, CnBr-활성화 세파로오스(등록상표)(SEPHAROSETM)(Pharmacia LKB Biotechnology)에 부분 정제된 면역글로불린을 공유적으로 부착시킨다. 제조자의 지시에 따라, 이 항체를 수지에 결합시키고 수지를 차단하여 유도체 수지를 세척하였다.
가용성 형태의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 함유하는 세포로부터 분획을 제조하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 정제하는 데 상기 면역친화성 컬럼을 이용하였다. 계면활성제 첨가에 의한 분별 원심분리 또는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 전체 세포 또는 아세포 분획을 용해하여 상기 제법을 유도하였다. 다른 방법으로, 세포를 배양하는 배지에 시그널 서열을 함유하는 가용성 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 유용한 양으로 분비할 수 있다.
면역친화성 컬럼에 가용성 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 함유하는 제제를 통과시키고 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 바람직한 흡광 조건에서 컬럼을 세척하였다(예를 들면, 계면활성제 존재 하에 높은 이온 농도 완충액). 그 후에, 항체/PRO655, 항체/PRO364 또는 항체/PRO344 폴리펩티드 결합을 파괴하는 조건(약 pH 2 내지 3과 같은 낮은 pH 완충액, 또는 요소 또는 티오시아네이트 이온과 같은 카오트롭 고농도)하에서 컬럼을 용출시키고 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 수집하였다.
실시예 10
약물 스크리닝
본 발명은 여러 가지 약물 스크리닝 기술 중 임의의 것으로 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 이용하거나 또는 그의 단편을 결합하여 화합물을 스크리닝하는데 특히 유용하다. 상기 시험에 사용된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 단편은 용액 중 유리되거나 고체 지지체에 고정시키거나 세포 표면에 포함시키거나 세포 내부에 위치시킬 수 있다. 약물 스크리닝의 한 방법은 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 단편을 발현시키는 재조합 핵산으로 안정하게 형질전환시킨 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용한다. 경쟁 결합 분석으로 형질전환 세포에 대해 약물을 스크리닝한다. 활동성 또는 고정 형태로 표준 결합 분석에 상기 세포를 이용할 수 있다. 예를 들면, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 단편 및 시험 제제 사이의 복합체 형성을 측정할 수 있다. 다른 방법으로, 시험 제제로 인해 야기되는, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 및 그의 표적세포 또는 표적 수용체 사이의 복합체 형성의 감소를 검사할 수 있다.
따라서, 본 발명은 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 관련 질병 또는 질환에 영향을 주는 약물 또는 임의의 다른 제제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 제제를 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시키고, (ⅰ) 제제 및 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 단편 사이 복합체의 존재 또는 (ⅱ) PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 단편 및 세포 사이 복합체의 존재를 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 분석하는 것을 포함한다. 상기 경쟁 결합 분석에 있어서, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 단편은 통상 표지된다. 적합한 배양 후에, 유리 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 단편을 결합된 형태로 존재하는 것으로부터 분리하고, 유리 또는 비복합체 표지의 양은 특별한 제제가 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 결합하거나 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드와 세포의 복합체를 저해하는 능력의 척도가 된다.
약물을 스크리닝하는 또다른 방법은 폴리펩티드에 적합한 결합 친화성을 갖는 화합물에 대한 고도의 산출량의 스크리닝을 제공하며 1984년 9월 13일에 공개된 WO 84/03564호에 상세히 개시되어 있다. 요컨대, 고형 기재, 예를 들면 플라스틱 핀 또는 몇가지 다른 표면 상에 많은 수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 합성한다. PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드에 적용한 바와 같이, 상기 펩티드 시험 화합물을 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 결합된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 검출한다. 또한, 상기 언급된 약물 스크리닝 기술에 사용하기 위해 정제 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 직접 플레이트 상에 코팅할 수 있다. 또한, 비-중화 항체를 사용하여 상기 펩티드를 포획하고 고체 지지체 상에 고정시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드와 결합할 수 있는 중화 항체가 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그의 단편에의 결합에 대해 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁 약물 스크리닝 분석의 용도에 관한 것이다. 상기 방식으로, 상기 항체를 사용하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드와 1개 이상의 항원 결정자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출할 수 있다.
실시예 11
합리적인 약물 설계
합리적인 약물 설계의 목표는 관심있는 생물학적 활성인 폴리펩티드(즉, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드) 또는 그가 상호작용하는 작은 분자, 예를 들면 아고니스트, 길항제 또는 억제제의 구조적 유사체를 생성하는 것이다. 상기 임의의 실시예를 이용하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 보다 더 활성이 있거나 또는 안정한 형태의 약물 또는 생체 내 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 기능을 강화하거나 또는 저해하는 약물을 만들 수 있다([허지슨(Hodgson)Bio/Technology,9: 19-21(1991)] 참조).
한 연구에서는, x-선 크리스탈로그래피, 컴퓨터 모델링 또는 통상 두 조사법을 조합하여 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드-억제제 복합체의 3차원 구조를 결정하였다. PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 형태 및 전하를 확인하여 그 구조를 설명하고 상기 분자의 활성 부위를 결정하였다. 자주는 아니지만, 상동성 단백질의 구조를 기초로 모델링에 의해 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 구조에 대한 유용한 정보를 얻을 수 있다. 두 경우 모두, 관련된 구조 정보를 이용하여 유사한 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 유사 분자를 설계하거나 또는 효율적인 억제제를 확인하였다. 합리적인 약물 설계에 대한 유용한 실시예는 문헌 [브랙스톤(Braxton) 및 웰스(Wells),Biochemistry, 31:7796-7801 (1992)]에 나타난 바와 같이 개선된 활성 또는 안정성을 가지거나 또는 문헌 [아타우다(Athauda) 등,J. Biochem.,113:742-746 (1993)]에 나타난 바와 같이 천연 펩티드의 억제제, 아고니스트 또는 길항제로서 작용하는 분자를 포함할 수 있다.
또한 상기 기재된 바와 같이, 기능 분석에 의해 선택된 표적-특이적 항체를 단리하여 그의 결정 구조를 해석하는 것도 가능하다. 원칙상, 본 연구는 일련의 약물 설계의 기초가 될 수 있는 제약코어를 산출하였다. 항-이디오타입 항체(anti-ids)를 기능성 제약 활성 항체로 생성시켜 단백질 크리스탈로그래피를 우회하는 것이 가능하다. 거울상의 거울상으로서, 항-이디오타입 항체의 결합 부위는 원래 수용체와 유사한 것으로 생각되었다. 그 후에, 항-이디오타입 항체를 사용하여 화학적 또는 생물학적으로 생성된 펩티드의 뱅크로부터 펩티드를 동정 및 단리할 수 있다. 그 후에, 이 단리된 펩티드는 제약코어로 작용하였다.
본 발명에 의해, 충분한 양의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드를 제조하여 x-선 크리스탈로그래피와 같은 분석 연구를 수행할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 제공된 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 아미노산 서열에 대한 지식은 x-선 크리스탈로그래피를 대신하거나 또는 부가하여 컴퓨터 모델링 기술을 이용하는 지침을 제공할 것이다.
실시예 12
생체 외 항종양 분석
실질적으로 문헌 [Skehan et al.,J. Natl. Cancer Inst.,82:1107-1112 (1990)]에 기재된 술포로다민 B(SRB) 염료 결합 분석법을 사용하여, 국립 암 연구기관(National Cancer Institute; NCI)의 조사적, 질병-관련 생체외 항암 약물 발견 분석법으로, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 항증식 활성을 측정하였다. 본 연구에 사용된 60 종양 세포주("NCI 패널"), 및 그 유지를 위한 조건 및 생체외 배양은 문헌[Monks et al.,J. Natl. Cancer Inst.,83:757-766 (1991)]에 기재되어 있다. 이 스크린의 목적은, 상이한 유형의 종양에 대한 테스트 화합물의 세포독성 및(또는) 세포증식억제 활성을 초기에 평가하는 것이다 (상기 Monks 등의 문헌 및 [Boyd,Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update,3(10):1-12 (1989)] 참조).
약 60 개의 인간 종양 세포주로부터의 세포를 트립신/EDTA(Gibco)로 수확, 1회 세척 및 IMEM 중에 재현탁하고 생존능력을 측정하였다. 피펫(100㎕ 부피)으로 세포 현탁액을 분리된 96-웰 미량역가 플레이트에 첨가하였다. 6일간의 배양 동안의 세포 밀도를 2일 배양의 경우보다 작게 하여 과성장을 막았다. 안정화를 위해37℃에서 24시간 동안 접종물을 예비배양시켰다. 의도하는 시험 농도보다 두배로 희석한 것을 시간 0에 100㎕ 분액으로 미량역가 플레이트 웰에 첨가하였다 (1:2 희석). 테스트 화합물을 5개의 반-로그(half-log) 희석(1000 내지 100,000 배)에서 평가하였다. 5% CO2대기 및 100% 습도에서 2일간 및 6일간 배양하였다.
배양 후, 배지를 제거하고 40℃에서 세포를 0.1 ml의 10% 트리클로로아세트산 중에 고정시켰다. 플레이트를 탈이온수로 5회 헹구고, 건조시키고, 1% 아세트산 중에 용해된 0.1 ml의 0.4% 술포로다민 B 염료(Sigma)로 30분간 염색하고, 1% 아세트산으로 4회 헹구어 비결합 염료를 제거하였으며, 염색을 0.1 ml의 10 mM 트리스 염기(트리스(히드록시메틸)아미노메탄), pH 10.5로 5분간 추출하였다. 492 nm에서의 술포로다민B의 흡광도(OD)를, 컴퓨터-접속, 96-웰 미량역가 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
테스트 샘플은 하나 이상의 농도에서 40% 이상의 성장 억제 효과를 나타내는 경우 양성으로 생각한다. 결과를 하기 표 4에 나타내었으며, 여기서 종양 세포 유형 약자는 다음과 같다:
NSCL = 비 소세포 폐 암종; CNS = 중추신경계
화합물 농도 일수 종양 세포 유형 칭호
PRO655PRO655PRO655PRO655PRO655PRO364PRO364PRO364PRO364PRO364PRO364PRO364PRO364PRO364PRO364PRO364PRO344PRO344PRO344PRO344PRO344PRO344PRO344PRO344PRO344PRO344PRO344 22.2 nM22.2 nM22.2 nM18.0 nM18.0 nM27.23 nM27.23 nM27.23 nM27.23 nM27.23 nM135.00 nM135.00 nM135.00 nM135.00 nM135.00 nM135.00 nM1.2 nM1.2 nM14.9 nM14.9 nM14.9 nM14.9 nM14.9 nM14.9 nM14.9 nM14.9 nM14.9 nM 266666666626666626222226666 난소결장흑색종흑색종결장NSCL결장CNS흑색종신장결장NSCL흑색종결장난소유방백혈병신장결장CNS난소신장유방백혈병결장CNSNSCL OVCAR-4HCT-15UACC-257LOX IMVIKM-12HOP62KM-12SF295LOX IMVIUO-31KM-12HOP62LOX IMVIHT-29IGROVIMDA-MB 435HL-60(TB)UO-31 및 CAKI-1KM-12SF-268OVCAR-4CAKI-1MDA-MB-435HL-60 (TB)KM-12SF-295HOP62
물질 기탁
하기 물질을 미국 20110-2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 불레바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁하였다.
물질 ATCC 기탁 번호 기탁일
DNA50960-1224 209509호 1997년 12월 3일
DNA47365-1206 209436호 1997년 11월 7일
DNA40592-1242 209492호 1997년 11월 21일
기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙(부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크.(Genentech Inc.)와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시(이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙(37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정된 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 통지시 그 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임에 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
앞서 기술한 명세서는 당업계 숙련자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 실시양태는 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 본 발명의 범위는 기탁된 구성물에 의해 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서도 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업계 숙련자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위에 속할 것이다.

Claims (40)

  1. 유효량의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트 및 제약학상 허용되는 담체의 부가 혼합물을 포함하는, 신생 세포 성장 억제를 위해 유용한 물질 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 성장 억제량의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트를 포함하는 물질 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 세포독성 양의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트를 포함하는 물질 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 추가의 성장 억제제, 세포독성제 또는 화학요법제를 추가로 포함하는 물질 조성물.
  5. 치료학상 유효량의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트를 포함하는, 포유류의 종양 치료를 위해 유용한 물질 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 종양이 암인 물질 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암이 유방암, 난소암, 신장암, 대장암, 자궁암, 전립선암, 폐암, 방광암, 중추신경계암, 흑색종 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 물질 조성물.
  8. 종양 세포를 유효량의 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트에 노출시키는 단계를 포함하는, 종양 세포의 성장 억제 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아고니스트가 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 아고니스트 항체인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 아고니스트가 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 소분자인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 노출 단계가 생체 외(in vitro)로 일어나는 것인 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 노출 단계가 생체 내(in vivo)로 일어나는 것인 방법.
  13. 용기; 및
    상기 용기 내에 포함된 유효제를 포함하는 조성물 (여기서, 조성물 중의 상기 유효제는 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드 또는 그 아고니스트임)
    을 포함하는 제품.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조성물의 신생 세포 성장 억제에 있어서의 용도를 언급하는 상기 용기에 부착된 표지 또는 상기 용기 내에 포함된 패키지 삽입물을 추가로 포함하는 제품.
  15. 제13항에 있어서, 상기 아고니스트가 항-PRO655, 항-PRO364 또는 항-PRO344 아고니스트 항체인 제품.
  16. 제13항에 있어서, 상기 아고니스트가 PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 소분자인 제품.
  17. 제13항에 있어서, 상기 유효제가 포유류의 종양 치료에 효과적인 양으로 존재하는 것인 제품.
  18. 제31항에 있어서, 상기 조성물이 추가의 성장 억제제, 세포독성제 또는 화학요법제를 추가로 포함하는 제품.
  19. 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 및 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 가지는 단리된 핵산.
  20. 도 1(SEQ ID NO:1), 도 3(SEQ ID NO:6) 및 도 5(SEQ ID NO:16)에 나타난 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 가지는 단리된 핵산.
  21. 도 1(SEQ ID NO:1), 도 3(SEQ ID NO:6) 및 도 5(SEQ ID NO:16)에 나타난 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 가지는 단리된 핵산.
  22. ATCC 기탁 번호 제209509, 209436 또는 209492호로 기탁된 DNA의 전장 코딩 서열과 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 가지는 단리된 핵산.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 벡터.
  25. 제23항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포인 숙주 세포.
  27. 제25항에 있어서, 상기 세포가 대장균인 숙주 세포.
  28. 제25항에 있어서, 상기 세포가 효모 세포인 숙주 세포.
  29. 제25항에 있어서, 상기 세포가 바쿨로바이러스-감염된 곤충 세포인 숙주 세포.
  30. PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 제25항의 숙주 세포를 배양하고 세포 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, PRO655, PRO364 또는 PRO344 폴리펩티드의 생산 방법.
  31. 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 및 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 단리된 폴리펩티드.
  32. 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 및 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 비교하여 80% 이상의양성을 기록하는 단리된 폴리펩티드.
  33. ATCC 기탁 번호 제209509, 209436 또는 209492호로 기탁된 DNA의 전장 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 단리된 폴리펩티드.
  34. 이종성 아미노산 서열에 융합된 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자.
  35. 제34항에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 에피토프 태그 서열인 키메라 분자.
  36. 제34항에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 면역글로불린의 Fc 지역인 키메라 분자.
  37. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
  38. 제37항에 있어서, 상기 항체가 모노클론 항체, 인간화 항체 또는 단쇄 항체인 항체.
  39. (a) 연관된 시그널 펩티드를 결여한, 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 또는 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    (b) 연관된 시그널 펩티드를 가진, 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 또는 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
    (c) 연관된 시그널 펩티드를 결여한, 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 또는 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
    과 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 가지는 단리된 핵산.
  40. (a) 연관된 시그널 펩티드를 결여한, 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 또는 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 폴리펩티드;
    (b) 연관된 시그널 펩티드를 가진, 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 또는 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 폴리펩티드의 세포외 도메인; 또는
    (c) 연관된 시그널 펩티드를 결여한, 도 2(SEQ ID NO:2), 도 4(SEQ ID NO:7) 또는 도 6(SEQ ID NO:17)에 나타난 폴리펩티드의 세포외 도메인
    과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 단리된 폴리펩티드.
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