NO832517L - Interferonpreparat, samt fremgangsmaate for dets fremstilling - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et nytt stoff (heretter kalt interferon epsilon eller IFN- E) som er nyttig f.eks. i humancellekulturer og andre cellekulturer som et antiviralt og/ eller antiformeringsmiddel, fremgangsmåter for fremstilling av stoffet og fremgangsmåter for å behandle humanepitel-celler for å få dem til å motstå virusinfeksjon.

Interferoner er stoffer som har antivirale egenskaper. De fremstilles av visse celletyper som er blitt stimulert ved eksponering mot et virus, visse nuclein-syrer eller antigen-/ mitogen-komplekser. Interferoner er svært sterke legemidler som er svært lovende som klinisk antivirale og anti-tumor-midler.

Det finnes for tiden tre kjente typer human-interferon: interferon alfa (IFN-<*<), fremstilt fra human leukocyter eller lymfoblastoid-celler, interferon beta (IFN-^ ), fremstilt fra fibroblaster og interferon gamma (IFN-tf ), fremstilt fra human T-lymfocyter. Alle tre utskilles av de respektive cellene etter at cellene er blitt stimulert av et virus, visse nuclein-syrer eller antigen-/mitogen-komplekser. Nyere bevismaterialer indikerer at disse interferonene kan omfatte en blanding av struktur-elt beslektede proteiner i motsetning til et enkelt protein. Human-interferoner kan adskilles fra hverandre ved hjelp av forskjellige aktivitetsnivåer i cellekulturer fra mennesker og kveg. En prøve for å måle aktiviteten kan utføres slik som beskrevet i The Interferon System, William E. Stewart, Springer Verlag Co., New York, 1978, som er en modifikasjon av fremgangsmåten til

Ho og Enders gjengitt i The Proceedings of the National Academy of Sciences, Volum 45, side 385-389, 1959. IFN- ©< har et antiviralt aktivitetsnivå på cellekulturer fra nyre hos kveg som er 1 til 5 ganger dets aktivitet på human-fibroblast-cellekulturer. IFN- 3 har et antiviralt aktivitetsnivå på cellekulturer fra

nyre hos okse som er 1/100 til 2/100 av dets aktivitet på human-fibroblast-cellekulturer. IFN- 3 har en aktivitet på cellekulturer fra okse som er mindre enn 1/100 av dets aktivitet på human-fibroblast-kulturer.

Ved den mest produktive fremgangsmåten for fremstilling av IFN-o< fra humanleukocyter, fremstilles omtrent en interferonenhet pr. 50 celler. IFN- -y fremstilles fra human T lymfocyter i et utbytte på ca. 1 enhet pr. 1000 celler. IFN- P fremstilt fra humanfibroblaster har et optimalt utbytte på ca. 1 enhet pr. 15 celler.

En antiviral interferonenhet er den konsentrasjonen som beskytter halvparten av cellene i en humanfibroblast-kultur mot påvirkning av Vesicular stomatitis virus ved en standardkonsen-trasjon (en pfu/celle).

Antiviral aktivitet er blitt påvist i medier fra andre celler med opprinnelse fra mennesker og fra dyr. Innvirkning på formeringen av influensavirus ble først påvist av Issacs og Lindenmann (1957) i kulturer av chorioallantiois-membran fra kylling. Et annet eksempel er Hela-celle-linjen som er en transformert kreftcelle av epitelopprinnelse (fra halsen) slik som rapportert av G. Gey et al i Cancer Research, Vol. 12, pp. 264-265, 1952. Interferon-aktivitet er blitt påvist i forskjellige transformerte eller neoplastiske cellelinjer som opprinnelig er avledet fra humanepitelvev. Se "Production of Interferon by Human Tumor Cell Lines", Jameson et al, Archives of Virology 62, 209-219 (1979). Det har vært påvist at tidligere kjente human interferon-preparater har antiviral aktivitet i human cellekulturer.

En ny type antiviralstoff betegnet interferon er nå oppdaget og fremstilt. Dette nye stoffet som, på samme måte som de øvrige interferonene, synes å være sammensatt av minst to virkningsmessig beslektede proteiner, kan fremstilles f.eks. ved å utsette normale human eptiel-celler for en interferoninduksjons-teknikk og deretter inkubere cellene under betingelser som fremmer fremstilling av det nye interferonet. IFN-£ har i motsetning til de tidligere kjente alfa-, beta- og gamma-stoffene et antiviralt aktivitetsnivå i cellekulturer fra nyre hos kveg som er 1/4 til ca. 1/2 part av dets aktivitet i human-kulturer. IFN-€ oppviser ingen betydelig kryss-reaktivitet med antisera fremstilt mot IFN-o< , IFN- P eller IFN-Jf i nøytraliseringsprøver. Det er stabilt ved pH 2. Dets produksjon ved hjelp av epitelceller oppheves ved innføringen av inhibitorer for RNA-syntese eller inhibitorer for proteinsynteser i kulturen. Den antivirale aktivitet til preparater som inneholder IFN-6 ødelegges av pro-teaser.

IFN-€ kan fremstilles fra alle typer primære, diploide epitelceller fra mennesker. Kulturer av epidermale, conjunctivale.

vaginale og esofageale celler fra mennesker har alle vært brukt med hell. Ikke begrensende eksempler på andre epitelvevtyper som kan brukes omfatter nasalt, pharyngealt, bronkialt, pleuralt, og intestinalt vev. Det er blitt oppdaget at primære epitel-celler fordelaktig kan bli indusert til å produsere interferon-

é ved å bruke de samme fremgangsmåtene som ble brukt i den tidligere kjente teknikk for fremstilling av andre typer interferon fra leukocyter, lymfoblaster og fibroblaster. Ved en fore-trukket induksjonsteknikk hvor man anvender Newcastle Disease virus (Bankowski -stamme)eller Sendai-virus, kreves det 100-500 eptelceller for å fremstille en enhet med IFN-6 .

Som angitt ovenfor, fremstilles IFN-6 ved hjelp av primære, diploide epitelceller av human opprinnelse. Uttrykket "primære, diploide humanepitel"-celler, eller cellekulturer, slik det her er brukt, henviser til celler som er tatt ut fra friskt menneskevev eller en kultur av slike celler fremstilt f.eks. i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet i U.S.-Patentskrift nr. 4.016.036, som her innlemmes ved henvisning. Disse typer cellekulturer må skjelnes fra ikke-humanceller, humanceller av annen enn epitel-opprinnelse og transformerte eller neoplastiske epitel-celler.

Det nye interferonet kan også fremstilles i naturlige eller kunstige transformerte eukaryot-celler som inneholder denne delen av human epitel-nukleinsyre som er ansvarlig for fremstillingen av IFN-€ og i celler som er modifisert ved hjelp av rekombinant- DNA- teknikker .

Det er også oppdaget at et interferon fremstilt fra en bestemt type human-celle, f.eks. epitel-celler, har større antiviral aktivitet på den bestemte celletypen enn på andre human-celletyper. Følgelig har interferon epsilon forøket antiviral og antitumor-styrke i behandlingen av epitelvev som er hjemsøkt av en tumor eller viral infeksjon, i sammenligning med dets virkning når det gjelder andre human-celletyper.

Det er følgelig et formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe en ny type antiviralt stoff som er nyttig f.eks. til å beskytte human-celler mot virusangrep. Et annet formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for å fremstille et interferon av den type som er medfødt i normalt, friskt human-epitelvev. Nok et annet formål er å tilveiebringe en fremgangsmåte for behandling av viralinfeksjon eller tumorvekst i en bestemt vevtype ved eksponering mot et interferon avledet fra den samme vevtype. Et annet formål er å tilveiebringe en interferon-type som er mer aktiv overfor human-epitelceller enn overfor andre typer human celler, f.eks. human-fibroblastcelier. Disse og andre formål og trekk ved oppfinnelsen vil komme tydelig frem i den etterfølgende beskrivelse og i kravene.

For å fremstille IFN-£ ', kan normale human epitelceller generelt sett dyrkes in vitro (f.eks. i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge U.S.-Patentskrift nr. 4.016.036) i mono-lag, innenfor mikrokapsler i overensstemmelse med fremgangsmåten som er beskrevet av Jarvis et al i U.S.-Patentsøknad nr. 243.586, inngitt. 14. mars 1981, eller ved hjelp av andre fremgangsmåter. Cellene udnerkastes deretter en teknikk for IFN-indusering ved å eksponere mot visse virus eller nukleinsyrer.F.eks. kan dyrkingsmediet erstattes med et medium som inneholder et kjent IFN-induksjonsmiddel av viral eller nuklein-syretype. Etter en kort inkubering, vanligvis i størrelses-orden 1 time, fjernes induksjonsmidlet og cellene plasseres i normalt, friskt dyrkings- eller oppbevaringsmedium og inkuberes, f.eks. i 24 timer. Eksponering av cellene mot induksjonsmidlet utløser ekspressjon av cellenes DNA-kode for fremstilling av epsilon interferon. Under den derpå følgende inkubering, vil cellene syntetisere og utskille IFN-c" . På dette tidspunkt høst-es mediet,og dersom det analyseres f.eks. ved fremgangsmåten til Ho og Enders (Proceedings of the National Acanlemy of Science, Volum 45, side 385-389, 1959), vil man finne at det inneholder IFN-6 antiviral aktivitet.

Produktet som oppnås ved denne fremgangsmåten oppviser ikke kryss-reaktivitet av betydning med antistoff mot IFN-«y , ifn- f , eller IFN-tf i nøytraliseringseksperimenter. Det er stabilt ved pH 2 og har protein-egenskaper. Immunologiske absorbsjonsforsøk indikerer at anti IFN- P antisera reagerer med en del av inter-feronproduktet fra induserte epitel-celler. Det nye interferonet oppviser også en aktivitetsprofil i pattedyrceller som er forskjellig fra kjente interferon-typer. Disse kjemiske kjenne-tegnene utpeker IFN-é som et entydig stoff.

Vanligvis har IFN- 6 vært fremstilt med hell fra normale epitel-celler avledet fra human-epidermis, -conjunctiva, -vagina og -esofagus, ved å anvende "normal induksjon" (Field et al., Proceedings of the National Academy of Science, Vol. 58, p. 1004-1009, 1967) og "superinduksjon" (Havell and Vilcek, Antimicrobial Agents in Chemotherapy, Vol. 2, pp. 476-484, 1972) med nukleinsyren poly I*C (Miles Laboratories), med Newcastle Disease virus, (Baron and Issacs, British Medical J., Vol. 56,

pp. 18-20, 1962) og med Sendai-virus (parainfluenza-1, Gresser, Proceedings of the Society of Experimental and Biological Medicine, Vol. 108, pp. 303-307, 1961. Resultatene av analyser indikerer

at hver av induksjonsteknikkene og hver av de forskjellige cellekulturtypene som ble prøvet, produserer IFN-€ . Produk-sjonsnivået varierer med typen induksjonsmiddel anvendt og med de forskjellige endringene i induksjonsteknikkene. Newcastle Disease virus virker bra. Andre virus som kan brukes, er gjengitt i den følgende tabell.

Det er også oppdaget at interferoner fremstilt fra

en utvalgt type human-celle slik som epitel-, fibroblast-,

kar-, lever-, nyrecelle etc, er det mest effektive som antivirale eller antitumor-midler for behandling av menneskevev som be-står av den utvalgte celletype. Følgelig er IFN-6 mest effektiv når den brukes til å behandle epitel-celler, og man vil finne at det har et lavere aktivitetsnivå når det brukes til å behandle andre typer humanceller. På samme måte er IFN-*<*>(av human fibroblast celle opprinnelse) mest effektiv til å behandle human

fibroblast-celler eller -vev, og har likeledes dårligere anti-tumor- og antiviral-egenskaper når det gjelder celdér<fra andre typer human vev.

Følgelig kan den følgende fremgangsmåte anvendes til å beskytte en bestemt celletype eller et bestemt vev mot virusinfeksjon, til å stanse formering av et virus som har infisert en bestemt celletype eller et bestemt vev, eller til å stanse vekst av en tumor i et bestemt vev.

En cellekultur av den angjeldende type dyrkes først ved hjelp av vanlige teknikker slik som (i tilfellet med epitelceller) teknikken til Green som det er henvist til ovenfor. Cellene fra kulturen behandles deretter for å starte opp eks-presjon av den delen av dets DNA-kode som er ansvarlig for produksjonen av interferon 6 . Dette kan f.eks. gjøres ved hjelp av induksjonsteknikkene for IFN som er omtalt nedenunder. Produktet høstes så, vanligvis fra mediet etter inkubasjonen. Produktet kan brukes som et effektivt antiviral eller antitumor-stoff til behandling av den angjeldende celle- eller vevtype.

In vitro beskyttes kulturen mot virusangrep ved tilsetningen av 2-5 enheter IFN- 6 pr. ml. Denne konsentrasjonen beskytter effektivt epitelceller med en tetthet på 0,5 x IO<5>til 2,5 x IO<5>

2

celler pr. cm .

Betydningsfulle mengder av dette nye antivirale stoffet kan også fremstilles ved hjelp av to ytterligere vanlig kjente cellulære teknikker. Den første omfatter bruken av kjemisk, viralt eller spontant transformerte eukariot celletyper lignende med de som tidligere ble anvendt ved fremstillingen av IFN- fra cellelinjer av human lymfoblastoid. Ved den andre anvendes vanlig kjente teknikker med rekombinant DNA som er lignende med de som vanligvis anvendes ved fremstillingen av IFN-«x og IFN- P .

Ved den første fremgangsmåten kan det erholdes transformerte celler som er istand til å produsere IFN-6 , ved å anvende en av to teknikker: in vivo eller in vitro. Den første teknikken (in vivo) omfatter den direkte isolering fra friskt vev av transformerte celletyper, den andre teknikken (in vitro) omfatter en seleksjonsfremgangsmåte hvor en stamme av normale human diploid celler enten dyrkes på lengre sikt inntil et lite men påvisbart antall av populasjonen gjennomgår spontan trans-formering, eller den opprinnelige stamme behandles i en kort tidsperiode med et virus eller et kjent mutagen slik som EMS, MMS eller MNNG for å øke transformasjons-frekvensen. Visse av cellene som er transformert ved en av de to beskrevne in vitro-måtene, vil inneholde en del av DNA-koden til epitel-celler som er avsvarlig for produksjonen av IFN-6 .

Således erholdte transformerte kulturer kan induseres til å produsere IFN- t ved å anvende standard induksjonsteknikker slik som beskrevet tidligere for normale, diploidé human-epitel-celler.

Ved den andre teknikken ekstraheres den mRNA som er synte-tisert i epitel-celler som svar på IFN-induksjonen, fra cellene, renses eventuelt ved ultrasentrifugering eller lignende hvorved man erholder en mRNA-fraksjon med økt spesifisitet, og ekstrakten brukes som en templet til syntesen av komplementær DNA (cDNA). cDNA kan fremstilles ved å bruke enzymet Avian Myoblastosis om-vendt transeriptase. Sluttproduktet fra denne fremgangsmåten, dobbel standard komplementær DNA (dscDNA), som omfatter sekvens-en som koder for syntesen av IFN- £ , og en bakteriell eller eukariotisk vektor behandles deretter med et restriksjonsenzym som spalter DNA-molekylet og tilveiebringer bindingspunkter hvor-til dscDNA-molekylet og vektoren kan festes. Vektor og DNA blandes deretter sammen, festes til hverandre og bindes kovalent ved anvendelse av et ligase-enzym. På dette punktet brukes det rekombinante vektbrpreparatet til å transformere enten en bakter-ie- eller eukariotcelle. De transformerte cellene inneholder således den DNA som er komplementær til all eller den del av den RNA som opprinnelig var inneholdt i epitel-cellene under deres IFN-é produksjonsfase.

Disse rekombinante vektorene inkuberes så med en passende celletype som lar vektoren virke. Dette resulterer i en celle-populasjon som omfatter individuelle celler som er istand til å syntetisere og utskille IFN-£ . Cellepopulasjonen undersøkes deretter med hensyn på'en underpopulasjon av celler som produserer IFN-6 , og denne underpopulasjonen dyrkes for å etabl-ere en cellelinje som er istand til å produsere forholdsvis store mengder av IFN-6

Ytterligere detaljer vedrørende denne rekombinante del av teknikken kan f.eks. finnes i de følgende litteraturhenvisninger, hvis beskrivelser innlemmes her ved henvisning. 1. U.S.-patentskrift nr. 4.237.224 med tittelen "Process For Producing Biologically Functional Mdlecular Chimeras"v 2. Scheller, :R. et al, 1977, Clones of Individual Repe-titive Sequences from Sea Urchins DNA Constructed with Synthetic Eco Rx Sites, Science, Vol. 196, pp. 197-200. 3. Blattner, F. et al, 1977, Charon'<;>Phages: Safer Deri-vatives of Bacteriophage Lambda for DNA Cloning, Science, Vol. 196, pp. 161-169. 4. Broach, J. R., and Hicks, J.B., 1980, Replication and Recombination Functions Associated with Yeast Plasmid, 2 Micron Circle, Cell, Vol. 21, pp. 501-508. 5. Hamer, D. 1981, Synthesis Processing and Secretion of Eukaryotic Proteins in the SV40 - Monkey Cell System, Recombi-nant DNA Abstracts, Vol. 1, p. 4.

Oppfinnelsen vil bli ytterligere forstått ut fra de følg-ende, ikke begrensende eksemplene.

Eksempel 1

En epitel-cellekultur av human-epidermal opprinnelse erholdt fra laboratoriet til Howard Green ved Massachusetts Institute of Technology ble oppdyrket til en celletetthet på 1-2 x 10 5 celler pr. m 2i et minimalt essensielt medium (MEM, Gibco) som inneholdt 10% varme-inaktivert kalvefosterserurå

(inkubert ved 56°C i 30 minutter: HIFCS). Fire ekvivalent-kulturer inkubert i MEM og 2% HIFCS ble eksponert i en time ved 37°C mot henholdsvis en nukleinsyre med høy molekylvekt som er tilgjengelig i handelen fra PL Laboratories (Milwaukee, Wis-consin). (Field et al.'s induksjonsteknikk, supra). Kulturene ble deretter vasket to ganger med MEM og inkubert i det samme medium suplert med 2% HIFCS i 24 timer. Mediet ble så samlet opp og analysert ved hjelp av fremgangsmåten til Stewart II, The Interferon System, pp. 17-18. Det ble ikke observert noen påvisbar antiviral aktivitet i kulturene som var inkubert med 0 og 1 ug/ml poly (I-C). Omtrent 10 enheter/ml IFN-6 ble påvist i prøvene erholdt fra kulturene indusert med 10 og 100 ug poly (I-C).

Eksempel 2

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ble gjentatt med unntak av at en modifisert "superinduksjons"-teknikk ble anvendt (Havell og Vilcek, supra) i et forsøk på å øke IFN-6 produksjonen. 50ug/ml cykloheksamid (inhibitor for proteinsyntese) ble tatt med sammen med poly (I-C). Etter inkubering i én time ble cellene vasket og inkubert i ytterligere 3 timer i MEM som inneholdt 2% HIFCS og 50 ug/ml cykloheksamid. Cellene ble deretter på nytt vasket og inkubert med MEM som inneholdt 50 ug/ml cykloheksamid og 5.0 ug/ml actinomycin D (inhibitor for RNA-syntese) i ytterligere 2 timer. Ved avslutningen av denne inkubering ble cellene vasket to ganger og deretter inkubert i 24 timer ved 37°C i normalt medium. Innhøsting av mediet og analyse slik som angitt i eksempel I, resulterte ikke i produksjon av noe påvisbart IFN- 6 i kulturene indusert med 0 og 1 ug/ml poly (I<*>C). Kulturen indusert med 10 ug/ml poly (I-C) ga 100 enheter/ml IFN-£ . Kulturen indusert med 100 ug/ml poly (I*C) resulterte

i produksjon av mer enn 330 enheter/ml IFN-6 .

Eksempel 3

En epitel-cellekultur av epidermal opprinnelse som inneholdt 1-2 x 10 5 celler (eksempel 1) ble brukt til å fremstille IFN-6 under anvendelse av induksjonsmetoden med Newcastle Disease virus (NDV) (Baron og Issacs, supra.) Viruset som ble brukt var Bankowski-stammen av NDV som er tilgjengelig fra Poultry Health Laboratories, Davis, California. Fire 1 ml prøver av MEM som inneholdt 2% HIFCS og tilstrekkelig NDV til å gi en sluttkonsentrasjon på henholdsvis 0, 100-200, 25-50 og 1-16 virus pfu/celle i prøvene, ble fremstilt. 0,2 ml av hvert av de 1 ml store viruspreparatene (virusinduksjonsmiddel) ble så tilsatt til cellekulturene som ble ristet med 5 minutters mellomrom i 30 minutter ved 37°C. Den gjenværende 0,8 ml store delen av NDV-preparatene ble deretter tilsatt,og kulturene ble inkubert i ytterligere 30 minutter. Cellekulturene ble så vasket to ganger med normalt medium, 1 ml friskt medium ble tilsatt til hver kultur og kulturene ble inkubert i 24 timer.

Deretter ble mediet høstet, syregjort til pH 2 med 0,1 N HC1 og lagret ved 4°C i 5-6 dager for å inaktivere NDV. Deretter ble det høstede mediet nøytralisert med 0.1 N NaOH og analysert med hensyn på IFN- 6 . I prøven som ikke inneholdt noe NDV (kontroll), var det ingen antiviral aktivitet. Prøven indusert med 100-200 virus-partikler/celle av NDV inneholdt omtrent 500-1000 enheter IFN-6 /ml. Kulturen indusert med NDV-preparatet som inneholdt 25-50 virus-partikler/celle, inneholdt mellom 170 og 330 enheter IFN-6 /ml. Kulturen indusert medNDV-preparatet som inneholdt 1-16 virus-partikler/celle, inneholdt mellom 50 og 170 enheter IFN-6 /ml.

Som det vil sees av dette forsøket, kan en cellekultur som inneholder 1-2 x IO<5>celler/ml produsere ca. 500-1000 enheter IFN-6 /ml. Følgelig er utbyttet i størrelsesorden 1 enhet

IFN-6 produsert pr. 100-500 celler i kulturen.

Eksempel 4

Fremgangsmåten ifølge eksempel 3 ble gjentatt med unntak av at parainfluenza-1 (Sendai)virus i forskjellige konsentrasjoner ble brukt som et induksjonsmiddel i stedet for NDV (se Gresser, ovenfor). Slik det ble levert (Flow Laboratories), inneholdt Sendai-viruset 10.000-40.000 hemagglutinasjonsenheter, pr. ml.

I en kultur hvor det innkjøpte virus-preparatet ble for-tynnet 1-3, ble det fremstilt liffiOO enheter/ml IFN-£ . En 1-10 fortynning resulterte i 200 enheter/ml og en 1-33 fortynning resulterte i 100 enheter/ml. Ingen antiviral aktivitet kunne på-vises i kontrollkulturen hvor viruset ble holdt borte fra.

I tabellen gjengitt nedenunder oppsummeres resultatene fraforsøkene (eksemplene 1-4) ved bruk av kulturer av human-konjunk-tivale celler og human-epidermale celler, idet forskjellige induksjonsteknikker ble brukt.

Eksempel 5

Ettersom interferoner normalt, pr. definisjon, har vist

seg å være proteiner, ble prøver av IFN-6 undersøkt for å be-stemme hvorvidt den antivirale aktivitet som er tilstede i prøv-ene, skyltes en proteinbestanddel. Forsøkene ble utført ved å inkubere prøver av IFN-<»< (NIH standard), IFN-^ (NIH standard) og IFN-£ (avledet fra NDV-induserte epitel-keratinocyter) i nærvær av kjente proteolytiske enzymer og deretter analysere det be-handlede materialet med hensyn på gjenværende antiviral aktivitet. Prøver av IFN-<*(16 enheter/ml), IFN-^ (16 enheter/ml) og IFN-£ (32 enheter /ml) i MEM ble inkubert ved 37°C i 1 time i nærvær av enten trypsin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) eller Pronase (Sigma) i konsentrasjoner på 3,3-100 ug/ml. Etter fullførelse av omsetningen, ble gjenværende proteolytisk aktivitet i prøvene nøytralisert ved tilsetning av HIFCS inntil en sluttkonsentrasjon på 33% (v/v). Prøven ble deretter analysert med hensyn på gjenværende IFN-indusert antiviral aktivitet ved mikrotitrering på GM-2767 celler. Dataene er gjengitt nedenunder:

Proteolytisk sensitivitet hos IFN- 6

Dissé data viser at den antivirale aktivitet funnet i prøver av IFN-£ skyldes nærværet av en protein-bestanddel eller -bestanddeler, basert på fullstendig eliminering av aktivitet ved behandling med proteolytiske enzymer. Proteinegenskapene til IFN-6 er også åpenbare ut fra det faktum at inhibitorer for RNA- og proteinsyntese blokkerer produksjonen av IFN-£ .

Eksempel 6

Dette eksemplet viser stabiliteten til IFN-6 overfor sur

pH. IFN-6 ble fremstilt ved induksjon av human epidermal celler med NDV i henhold til eksempel 3. Da mediet ble høstet, ble det delt opp i tre deler. Viruset ble inaktivért i den første delen slik som beskrevet i eksempel 3 ved surgjøring til pH 2 med HC1. Den andre delen ble filtrert i 5 dager gjennom et "Millipore 01310"-filter (molekylvektgrense 100.000, Millipore Corp., Bed-ford, MA) for å fjerne viruset. Den tredje delen ble filtrert gjennom et "Millipore PTMK01310"-filter, molekylvektgrense 100.000, som på forhånd var blitt gjennomfuktet i 4 timer i en 1% oppløsning av BSA.

I hvert tilfelle ble det resulterende medium analysert for både IFN og for nærvær av rest-virus. Resultatene er gjengitt nedenunder:

Ingen av prøvene oppviste noen viral aktivitet og hver prøve inneholdt den samme mengde IFN-6 aktivitet. Dette viser at IFN-£ aktivitet er stabil ved sur pH.

Eksempel 7

De immunologiske egenskapene til IFN-6 (fremstilt ved NDV induksjon av epidermale celler fra mennesker i overensstemmelse med eksempel 3), IFN-o< , IFN-£ (NIH) og IFN-X (erholdt fra

S. Baron, University of Texas Medical School, Galveston, Texas) ble sammenlignet. Nøytraliserings-titreringen av hvert interferon ble utført ved å bruke anti-1FNo< (NIH), anti-IFN (NIH ogY.H. Tan, Calgary University, Calgary, Alberta, Canada), anti-IFN- (S. Baron) og blandinger av disse antisera. To gangers seriefortynninger av de passende antisera ble utført i MEM under anvendelse av en mikrotiterplate med 96 brønner. Fortynninger som varierte fra 32 IH/ml - 2 IU/ml for hvert IFN-preparat, ble tilsatt til brønnene og platene ble inkubert først ved 37°C i 1 time og deretter ved 4°C i 1 time for å la dannelsen av antistoff-IFN-kompleks skje. Human-fibroblastceller (GM -2767 - Human Mutant Cell Repository) ble deretter sao dd ut med 2 x 10<4>celler pr. brønn og etter 20-24 timers inkubering ved 37°C ble de tilført en standarddose av Vesicular stomatitis virus (1 pfu/ cell). Etter 24-48 timer ved 37°C ble hver brønn observert under mikroskopet med hensyn på interferon-formidlet inhibering av virusindusert cytopatisk virkning (CPE). Resultatene er opp-summert nedenunder:

Dette eksemplet demonstrerer at IFN-fe er immunologisk forskjellig fra IFN-** og IFN- £ , og fra IFN-tf og er derfor kjemisk forskjellig fra disse kjente human interferoner.

Eksempel 8

I tillegg til serologisk bevismateriale gjengitt i eksempel 7, ble IFN-1-som var blitt delvis immunologisk utfelt, brukt i et nøytraliseringsforsøk. Til prøver av dette interferonet ble det tilsatt anti- £IFN (polyklonalt erholdt fra NIH eller mono-klonalt erholdt fra Y.H. Tan). Blandingen ble inkubert i 1 time ved 37°C etterfulgt av 1 time ved 4°C for å gi anledning til antistoff-IFN kompleksdannelse, og deretter ble komplekset sammen med eventuelt overskudd av antistoff fjernet ved inkubering av kompleksbundne og ikke-kompleksbundne antisera i nærvær av protein A Sefarose (Sigma) i et forhold på 30 ul til 1,5 ul re-aksjonsblanding. Gjenværende ikke-kompleksbundet IFN ble utsatt for en annen runde med immunologisk utfelling og prøvene ble analysert for IFN aktivitet slik som beskrevet ved å bruke CPE inhi-beringsanalysen. Resultatene er gjengitt nedenunder:

Når det på forhånd utfelte AOB IFN-6 ble brukt i nøytrali-ser ingsprøven, utført nøyaktig som i eksempel 7, ble de følg-ende resultater oppnådd:

Kontrollserum fra sau for fibroblast IFN hadde ingen nøytrali-serende virkning.

Dataene i tabellene ovenfor viser at en del av IFN-6 preparatet ikke kan nøytraliseres med anti-Æ antiserum selv når to forskjellige anti-£ antistoffer anvendes. Selv etter grundig utfelling med anti-£ antisera, kan imidlertid en ytterligere del av IFN-fc utfelles med blandet anti-V //» antiserum. Disse data utgjør ytterligere bevismateriale for at IFN-6 er immunologisk og kjemisk forskjellig fra andre kjente human-interferoner.

Eksempel 9

IFN-6 fremstilt ved induksjonen av epidermalceller fra menneske med NDV i henhold til eksempel 3 kan renses og oppkon-sentreres ved hjelp av affinitetskromatografi på en rekke immobiliserte Ugandere. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, reaktiv rød agarose, fenylsefarose, (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, Mo.), procion-rød agarose, fenol-agarose (BRL, Gaith-ersburg, Md.), Glycogel B, N-(3-karboksypropionyl)-aminodekan (CPAD) agarose og N-pyromellitylaminodekan (PMAD) agarose (Pierce Chemical Co., Rockford. 111.). 8 ml IFN-6 i MEM som inneholder 900 enheter IFN-6 ble til-ført en kolonne med 0,5 ml reaktiv rød agarose. Kolonnen ble utvasket med 10 ml 20 mM fosfatbuffer (pH 7,4). Deretter ble IFN eluert med 3 2ml store alikvoter av 50% etylenglykol i 20 mM fosfatbuffer som inneholder IM natriumklorid. Hver av disse frak-" sjonene ble samlet opp i et like stort volum 20 mM fosfatbuffer for å fortynne etylenglykolet. Kolonnen ble til slutt utvasket med ytterligere 5 ml 20 mM fosfatbuffer. Konsentrasjonene av protein ble målt som absorbansen ved 280 nm (OD-280). Resultatene er vist i den følgende tabell:

Rensing av IFN- 6 ved anvendelse av reaktiv rød agarose

De første to etylenglykol-fraksjonene ble slått sammen og den resulterende fraksjon inneholdt alt IFN-6 som var tilført kolonnen, og viste en 6 ganger rensing i forhold til utgangsmateri-alet.

I andre lignende forsøk ble opp til 68 ml IFN-6 tilført kolonnen og IFN-et ble gjenvunnet i et sluttvolum på 8 ml. Dette utgjør en 8,5 ganger oppkonsentrering av materialet.

Dersom IFN-£ tilføres to eller flere av disse immobiliserte Ugandere i rekkefølge, kan det fås en større grad av rensing. F.eks. ble en IFN-6 prøve tilført en CPAD-kolonne og eluert slik som beskrevet i fremgangsmåten ovenfor. De sammenslåtte IFN-holdige fraksjonene oppviste omtrent en 9 ganger rensing og ble dialysert mot 20 mM fosfatbuffer for å fjerne etylenglykolet. Prøven ble så tilført en PMAD agarose-kolonne som ble fremkalt på samme måte. IFN-6 ble utvunnet i 70 - 100% utbytte med en ytterligere 5 ganger rensing når det gjelder alt protein.

Dette eksemplet viser at IFN-€ kan renses ved en hvilken

som helst eller en kombinasjon av immobiliserte Ugandere.

Eksempel 10

Ikke-fraksjonert IFN-6 sentrifugeres først ved 300 ganger g

i 20 minutter. Supernatanten blandes på en Fischer Rotarack med kontrollert poreglass (C.P.G) (Electronucleénics, Inc.,) ved 4°C. Det brukes 0,28 gram kontrollert poreglass pr. 30 ml kultursuper-natant. Etter 3 timer fjernes supernatanten og de kontrollerte poreglasskulene pakkes i en kolonne (2,5 x 3,1 cm). Kolonnen vaskes først ved 4 kolonnevolumer PBS etterfulgt av 4 kolonnevolumer 1.0 NaCl-20mM fosfatbuffer. ph 7.4. IFN-€elueres med

, 4 kolonnevolumer 50% v/v etylenblykol - 1.0 M NaCl-20mM fosfat-

buffer, ph 7.4 og samles opp i et like stort volum 1.0 M NaCl-20 mM fosfatbuffer hvorved man får en sluttkonsentrasjon av etylenglykol på 25%. Den IFN-fe holdige fraksjon oppkonsen-treres ved ultrafiltrering til 1.0 til 1.6 ml og tilføres en polyakrylamid-agarose (Ultragel AcA54) kolonne (1.6x85 cm.)

som er ekvilibrert med 25% etylenglykol (V/V) -1.0 M NaCl-20mM fosfatbuffer 7.4. IFN-6 ble deretter eluert med ekvilibrerings-buffer ved en strømningshastighet på 6.0 ml pr. time. 2.0 ml store fraksjoner ble samlet opp og analysert for IFN- og pro-teininnhold (Loury-analyse). Resultatene er vist nedenunder:

Eksempel 11

Preparater av IFN-6 , IFN-*< og IFN- P inkludert rått, delvis renset i overiensstemmelse med eksempel 10, (p-IFN-é), og anti-mus interferon-absorbert p-IFN-€ , underkastet molekylvekt-analyse ved å anvende SDS gel-elektroforese i henhold til fremgangsmåten til Lamelli. Prøvene ble inkubert ved værelsestemperatur i 1 time i nærvær av 1.0% SDS, 0.05 M tris-HCl (pH 6.8) buffer, 10% (v/v) glycerol og 0.001% bromfenol-blått, plassert på 12.5% polyakrylamid-geler og kjørt 16 timer. Etter elektro-foresen ble feltene som inneholdt molekylvektstandardene, farget. Felter som inneholdt IFN ble skåret ut i 3 mm lange stykker og ekstrahert ved rysting med 0.5 ml PBS som inneholdt 0.5% SDS i 20 timer ved værelsestemperatur. Analyse avadiisse fraksjoner ble gjennomført i GM-2767 celler og molekylvekten for hver akti-vitetstopp ble beregnet ved sammenligning mellom dens posisjon på gelen og molekylvektstandardenes posisjon. Resultatene er gjengitt nedenunder:

Molekylvekt for IFN- er

Alle de tre fraksjonene erholdt med IFN-6 prøver oppviser antiviral aktivitet på GM-2767 celler. Fraksjonen med molekylvekt 22.0 x 10"^ erholdt fra IFN-fc oppviser ingen aktivitet på oksenyreceller (MDBK). De to andre IFN-fe fraksjonene (17.5K, 20.OK) var omtrent 25% mer aktive på MDBK celler som på GM-2767 celler.

Eksempel 12

Den antivirale styrken til IFN-6 (fremstilt fra human epidermal-celler med NDV induksjon i henhold til eksempel 3), IFN-«<

(erholdt fra National Institute of Health, NIH), og IFN-£

(NIH) ble sammenlignet i kulturer av normale epidermal-celler fra menneske mot normale diploide fibroblast-celler fra menneske. Seriefortynninger av de tre IFN-preparatene ble tilført brønnene

i en mikrotiter-plate sammen med standardkulturer av normale epidermalceller fra menneske og normale fibroblast-celler fra menneske. Etter en 18-24 timers inkubering ved 37°C, ble cellene i hver av brønnene tilført en standard-dose Vesirkulær stomatitis-virus (1 pfu/celle). Etter 36 - 96 timer (når kontroller viste 100% celledød), ble hver brønn observert under mikroskopet for undersøkelse av resistens overfor viruset. Resultatene er opp-summert nedenunder:

I IFN-6 fremstilt ved hjelp av DNA-koden til epitelceller er, som det tydelig fremgår av tabellen ovenfor, betydelig sterkere (opp til ca. 16 ganger) som et antiviralt middel når det gjelder epitel-celler enn når det gjelder fibroblaster. IFN-o< fremstilt fra DNA-koden avledet fra human leukocyter og lymfoblastoid-celler er sterkere (opp til 8 ganger) når det gjelder fibroblaster enn når det gjelder epitel-celler, og IFN-^ fremstilt fra DNA-koden avledet fra fibroblaster er sterkere (opp til 32 ganger) når det gjelder fibroblast-celler enn når det gjelder epitel-celler.

Eksempel 13

Fremgangsmåten ifølge eksempel 11 ble brukt til å måle den relative antivirale aktiviteten til IFN-o^,^ , tø , og é på oksenyreceller (MDBK-celler ATCC CCL22) i forhold til trisomiske fibroblaster fra menneske (3 kopier av kromosom 21 - GM-2767 Human mutant cell repository 47, XX, t21). Resultatene av mål-;

ingen er gjengitt nedenunder:

Resultatene for IFN-oc , P og y er i overensstemmelse med tidligere rapporterte data. Resultatene for IFN-6 indikerer at dette nye interferonet er mellom ca. 2 og 4 ganger så aktivt på GM-2767 som på oksenyreceller.

Eksempel 14

Det nye interferonet oppviser også anti-formeringsaktivitet bedømt ved inhiberingen av formeringen av human lymfoblastoid-celler (Daudi-celler). Omtrent 10.000 human lymfoblastoid-celler ble utplatet sammen med 200 ul medium i hver brønn i en mikrotiterplate. Forskjellige fortynninger av IFN-°<, P og 6 ble deretter tilsatt hver brønn og antallet levedyktige celler ble telt etter 1, 2 og 4 dager. Resultatene er gjengitt i den følgende tabell:

Daudi celleprøve

Antall levedyktige celler/brønn (x 10 -4)

Disse resultatene viser at 10 enheter IFN-6 kan undertrykke Daudi-cellevekst ved mer enn 90%.

Eksempel 15

Prøver av IFN-c<, p og ble hver ekvilibrert med fosfat-bufferet saltvannsoppløsning (PBS), natriumdodecyl-sulfat (SDS), en blanding av SDS, merkaptoetanol (BME) og urea ved 100°C. Detergenten SDS er kjent for å denaturere proteiner ved å endre deres konformasjon, BME reduserer disulfid-bindinger. Det ble oppdaget at IFN-»*', P og £ adskiller seg markert fra hverandre med hensyn til sin sensitivitet overfor disse reagensene. Nær-mere bestemt var IFN-o< stabilt i SDS alene, men ble vesentlig inaktivert i nærvær av en SDS-, urea-, BME-blanding, IFN- P ble i stor grad inaktivert i SDS alene, men var stabil og i SDS-, BME-,urea-blanding. I PBS ved 100°C var mindre enn 5% av aktiviteten tilbake hos alle tre interferonene.

Ved lignende forsøk ble det bestemt at IFN-c< som tidligere var blitt inaktivert med en SDS-BME-blanding, kunne reaktiveres ved ekvilibrering ved 100°C med en SDS-PBS-blanding, at IFN- P som tidligere var blitt inaktivert i SDS alene, kunne reaktiveres i en blanding av SDS,BME, urea og PBS, og at IFN-£ som tidligere var blitt inaktivert i PBS, kunne reaktiveres ved ekvilibrering ved 100°C i nærvær av PBS/SDS med eller uten BME/urea. Disse observasjonene er ytterligere beviset for hvor enestående IFN-6 preparatet ifølge oppfinnelsen er.

Eksempel 16

Dette forsøk sammenlignet bindings- og elueringsegenskapene til IFN- t og IFN-^på en "Blue Sepharose"-kolonne (Pharmcia). Kolonnene ble preparert i overensstemmelse med produsentenes instruksjoner og tilført enten IFN-P eller IFN-6 prøver i PBS

ved værelsestemperatur. Elueringer ble utført ved å bruke 1.OM NaCl i PBS og 50% (v/v) etylenglykol i 20 mM natriumfosfat-buffer. Hvert interferon-preparat ble kjørt på 2 kolonner som inneholdt forskjellige mengder Blue Sepharose, og man fikk de følgende data:

Binding av IFN- er til " Blue Separose"

Dette eksemplet viser at IFN-6 og IFN- P har forskjellige

affiniteter til "Blue Sepharose" og forskjellig adferd ved elu-ering. "Blue Sepharose" binder omtrent 90-97% av IFN-6 aktiviteten, mens bare ca. 60% av IFN-^ bindes under de samme beting-elsene. Mens 20-30% av IFN-6 utvinnes ved å bruke 1.0M NaCl,

utvinnes dertil bare 3-4% av IFN-f aktiviteten under lignende betingelser. Til slutt elueres opp til omtrent 80% av IFN-6 aktiviteten med en kombinasjon av 50% etylenglykol/1.OM NaCl, mens bare ca. 50% av IFN-P aktiviteten utvinnes under lignende betingelser.

Andre utførelsesformer finnes blant de følgende kravene.

Claims (16)

1. Interferonpreparat med antiviral aktivitet som er fremstilt ved å dyrke levende celler som inneholder minst en del av DNA-koden som får en human-epitel-celle til å syntetisere interferonet, og innhøsting av en fraksjon som er rik på interferonet fra kulturen, karakterisert ved at i) det er stabilt ved pH2, ii) dets antivirale aktivitet ødelegges med protolytiske enzymer, iii) det oppviser ingen kryssreaktivitet med antistoff til interferon-c<*eller interferon-^ , og iv) dets antivirale aktivitet på MDBK oksenyreceller er 1/4- til 1/2-part av dets aktivitet på trisomiske fibroblaster fra menneske (GM-2767).

2. Interferonpreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at kulturen er en epitel-cellekultur fra menneske.

3. Interferonpreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at kulturen omfatter transformerte eukariotiske celler.

4. Interferonpreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at kulturen omfatter celler hvor delen av DNA-koden er innført i cellene ved hjelp av rekombinant-DNA-teknikker.

5. Interferonpreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at det har en særpreget kryssreaktivitetsprofil overfor en blanding av anti-o<og anti- P antisera, slik at to ganger mere av interferonet nøytraliseres av blandingen enn det som nøytrali-seres av anti- P antisera alene basert på like enheter for nøytra-liser ingsaktivitet.

6. Fremgangsmåte for å fremstille et interferon-preparat, karakterisert ved følgende trinn: A. å fremstille en kultur av levende celler som inneholder en del av DNA-koden til epitel-celler fra menneske, B. å inkubere cellene i et medium under betingelser som fremmer syntese av interferon, og C. høste en fraksjon som er rik på interferonet fra cellene, idet interferonet er karakterisert ved at i) det er stabilt ved pH 2, ii) dets antivirale aktivitet ødelegges av protolytiske enzymer, iii) det oppviser ingen kryss-reaktivitet med antistoff mot interferon eller interferon , og iv) dets antivirale aktivitet i MDBK oksenyreceller er 1/4-til 1/2-part av dets aktivitet på trisomiske fibroblaster fra menneske (GM-2767).

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det som kultur av levende celler anvendes en epitel-cellekultur fra menneske, og at det,før trinn B., anvendes et virus for å indusere cellene til å produsere interferonet.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det i trinn A. anvendes en kultur som omfatter transformerte eukariotiske celler.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det anvendes en kultur i trinn A. som omfatter celler hvor delen av DNA-koden er innført i cellene ved hjelp av rekombinant- DNA-teknikker.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at viruset er valgt ut fra gruppen bestående av Newcastle Disease-virus og Sendai-virus.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det som virus anvendes Bankowski-stammen av Newcastle Disease virus.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at cellekulturen oppdyrkes fra celler fra et human-epitelvev valgt ut fra gruppen bestående av epidermis, konjunktivar vagina og esofagus.

13.F remgangsmåte ved behandling av levende celler for å hindre virusinfeksjon, karakterisert ved å bringe cellene som skal behandles i kontakt med en virksom mengde av interferon-preparatet ifølge kravene 1, 2, 3, 4 eller 5 for å hindre virus-infeksjoner .

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved å behandle epitel-celler fra menneske.

15. Fremgangsmåte ved behandling av neoplastiske levende celler for å hindre formering av cellene, karakterisert ved å bringe cellene som skal behandles i kontakt med" en virksom mengde av interferon-preparatet ifølge kravene 1, 2, 3,

4 éller 5 for å hindre formeringen.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved å behandle epitel-celler fra menneske.