NL8302484A - Interferon-preparaat en werkwijze voor de bereiding daarvan. - Google Patents

Description

«

Interferon-preparaat en werkwijze voor de bereiding daarvan.

Deze uitvinding betreft een nieuw materiaal, dat hieria . e-interferon (of IFN-E) genoemd zal worden, dat onder meer in menselijke en andere celkweken nuttig is tegen virussen en/of woekeringen, en ook een werkwijze voor de be-5 reiding van dat materiaal, alsmede de toepassing daarvan ter bescherming van menselijke epitheel-cellen tegen virusinfecties.

Interferonen zijn stoffen met anti-virale eigenschappen. Ze worden door bepaalde typen cellen gemaakt indien die gestimuleerd worden door blootstaan aan een virus, 10 bepaalde nucleinezuren of antigeen/mitogeen-complexen. Interferonen zijn uiterst sterk werkende stoffen en zeer veel belovend als klinisch bruikbare geneesmiddelen tegen virussen en tumoren.

Er zijn thans drie types menselijk inter-15 feron bekend: ct-interferon (IFN-a), uitmenselijke leukocyten of lymfoblastoide cellen, β-interferon (IFN-S), uit fibroblasten en γ-interferon (IFN-γ) uit menselijke T-lymfocyten. Alle drie worden door de respectievelijke cellen afgescheiden nadat die cellen door een virus, bepaalde nucleinezuren of door anti-20 geen/mitogeen-complexen gestimuleerd zijn. Er zijn recent aanwijzingen dat deze interferonen mengsels van in structuur verwante eiwitten zijn, en niet een enkelvoudig eiwit. Menselijke interferonen kunnen onderling onderscheiden worden door de verschillende mate van werking op celkweken uit mens en rund. Een 25 bepaling van de interferon-werking kan uitgevoerd worden zoals beschreven is in "The Interferon System" van W.E. Stewart, (Springer Verlag, New York, 3978) en dat is een modificatie van de methode van Ho en Enders, beschreven in de Proceedings van de National Academy of Sciences, deel 45 (1959), blz. 385-389.

30 IEN-a heeft op rundemier-celkweken 1 tot 5 maal zoveel werking als op menselijke fibroblast-celkweken. IFN-β heeft op rundernier-celkweken een anti-virale werking van slechts 1 % 8302484 2 4 · \ % tot 2 % van die op menselijke fibroblast-celculturen. IFN-γ heeft op runde mi er-eetculturen een werking zwakker dan 1 % van zijn werking op menselijke fibroblast-celkweken.

Bij de meest produktieve bereidingswijze 5 voor IFN-a uit menselijke leükocyten krijgt men ongeveer één eenheid interferon per 50 cellen, IFN-γ wordt uit menselijke T-lymfocyten verkregen in een opbrengst van ongeveer één eenheid per 1000 cellen. De beste opbrengst aan IFN-β uit menselijke fibroblasten is ongeveer één eenheid per 15 cellen.

10 Bij interferon is een anti-virale eenheid die hoeveelheid die de helft van de cellen in een menselijke fibroblast-kweek onder standaardomstandigheden beschermt tegen aantasting door vesiculair Stomatitis-virus.

Anti-virale werking is gevonden in kweekfil-15 traten van andere cellen van menselijke of dierlijke herkomst.

Een ingreep in de vermenig\mldiging van influenza-virus werd het eerst waargenomen door Issacs en Lindemnann (1957) bij het kweken van cultures van het chorioallantoine-membraan uit kuikens. Een ander voorbeeld is de Hela-cellijn, dat zijn ge-20 transformeerde kankercellen van een epitheel (de cervix), zoals beschreven door G. Gey et al in Cancer Research, J_2 (1952) 264-265. Interferon-werking is gevonden in diverse getransformeerde of neoplastische cellijnen uit menselijk epitheelweefsel. Zie "Production of Interferon by Human Tumor Cell Lines" van 25 Jameson et al in Archives of Virology 62 (1979), 209-219. Eer der bekende menselijke interferon-preparaten blijken in menselijke celkweken anti-virale werking te vertonen.

Nu is een nu type anti-viraal materiaal gevonden en bereid, dat "ε-interferon" genoemd wordt. Dit nieuwe 30 materiaal dat, net als de andere interferonen, uit ten minste twee in werking en structuur verwante eiwitten schijnt te bestaan, kan bijvoorbeeld bereid worden door normale menselijke epitheelcellen bloot te stellen aan een techniek die de inter-feron-vorming induceert, en de cellen dan te incuberen onder 35 omstandigheden die de produktié van het nieuwe interferon be vorderen. ïFN-ε heeft, anders dan de eerder bekende α-, β- en 8302484 \ • », 3 γ-stoffen, op rundemier-celkweken een anti-virale werking van 1/4 tot 1/2 van zijn werking op menselijke celkweken. IFN-ε vertoont bij immuniteitsproeven geen significante reactie met antisera tegen IFN-a, IFN-0 of IFN-γ. Het is stabiel bij pH = 2.

5 Zijn vorming door epitheelcellen gaat teniet door het toevoegen van stoffen die de BNA-synthese of de eiri.t-syn these in die kweek remmen. De anti-virale werking van preparaten die IFN-ε bevatten wordt door proteases vernietigd.

ÏFN-e kan bereid worden uit alle typen pri-10 maire, diploide, menselijke epitheelcellen. Kweken van menselijke epidermis-, conjunctivus-, vagina- en esophagus-cellen zijn alle met succes gebruikt. Andere voorbeelden (geen uitputtende opsomming) van te gebruiken epitheel-weefsels zijn die van neus, Strottenhoofd, bronchiën, longen en darmen. Net 15 voordeel worden primaire epitheelcellen tot de vorming van ε-interferon geïnduceerd met dezelfde technieken die eerder toegepast werden bij de bereiding van andere typen interferon uit leukocyten, lymfoblasten en fibroblasten. Bij een bevoorkeurde inductietechniek, met Newcastle Disease Virus (de Bahkowski-20 stam) of Sendai Virus, gebruikt men 100-500 epitheelcellen voor de produktie van ëën eenheid IFN-e.

Zoals reeds aangegeven wordt IFN-ε gevormd door primaire, diploide epitheelcellen van menselijke herkomst. Hiermee worden cellen bedoeld die uit gezond menselijk weefsel 25 of uit kweken van zulke cellen verkregen zijn, bijvoorbeeld zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.0J6.036.

Deze types celkweek moet men onderscheiden van nxet-menselijke cellen en van menselijke cellen met andere herkomst dan het epitheel, en ook van getransformeerde of neoplastische epitheel-30 cellen. Het nieuwe interferon kan ook gevormd worden in op natuurlijke of kunstmatige wijze getransformeerde eukaryotische cellen die dat deel van menselijk epitheelcel-nucleinezuur bevatten dat voor de vorming van IFN-ε verantwoordelijk is en in cellen die door recombinant-DNA-techniek gemodificeerd zijn.

35 Ook werd gevonden dat een interferon uit een bepaald type menselijke cellen, bijv. epitheelcellen, een ster- 8302484 Λ · 4 kere anti-virale werking op net dat soort cellen dan op menselijke cellen van andere types heeft. Zo heeft ε-interferon een sterker, anti-viraal en anti-tumor-vermogen bij de behandeling van epitheelweefsel dat door een tumor of door een virusinfec-5 tie aangetast is dan bij mensélijke cellen van andere soorten.

Binnen het kader van de uitvinding ligt dan ook dit nieuwe type anti-virale stof dat onder meer nuttig is voor het beschermen van menselijke cellen tegen aantasting door virussen. Daartoe behoort ook een werkwijze voor de produktie 10 van dat interferon van het type dat bij normaal, gezond menselijk epitheelweefsel behoort. Verder betreft deze uitvinding ook een werkwijze voor het behandelen van virusinfecties of tumorgroei op bepaalde soorten weefsels door dat weefsel bloot te stellen aan een interferon afgeleid uit weefsel van hetzelf-15 de type. Meer in het bijzonder gaat het hier om het verschaffen van een interferon dat op menselijke epitheel-cellen sterker werkt dan op andere menselijke cellen zoals fibroblasten. Dit zal alles uit de hierna komende beschrijving blijken.

Ruim gesproken kunnen voor de bereiding van 20 IFN-ε normale menselijke epitheelcellen in vitro gekweekt wor den, bijvoorbeeld zoals beschreven door Green et al, hetzij in monolagen, hetzij in microcapsules zoals voorgesteld in de Amerikaanse octrooiaanvrage 243.586 van 14 maart 1981, of op wat voor andere wijze dan ook. De cellen ondergaan dan een 25 IFN-inductie door ze Bloot te stellen aan bepaalde virussen of nucleinezuren. Bijvoorbeeld kan het kweekmedium vervangen worden door een medium dat een bekend viraal inductiemiddel of nucleinezuur bevat. Na een korte incubatie, zo van de orde van een uur, wordt het inductiemiddel verwijderd en worden de cellen 30 in vers, normaal groei- of onderhoudsmedium geplaatst en dan bijv. 24 uur geïncubeerd. Het blootstellen van de cellen aan het inductiemiddel leidt de expressie van de DNA-code van die cellen tot de vorming van ε-interferon in. Tijdens de daaropvolgende incubatie zullen de cellen IFN-ε synthetiseren en uitscheiden.

35 Dan wordt het medium geoogst, en als men er dan een bepaling in uitvoert (bijvoorbeeld met de eerder genoemde methode van Ho en 8302484 • fe Λ 5 %

Enders) zal men vinden dat het IFN-ε met werking tegen virussen bevat.

Het resultaat van deze bereiding vertoont geen significante reactie net antilichamen tegen IFN-ct, IFN-β 5 of IFN-γ. Het is stabiel bij pH « 2, en het heeft de aard van een eiwit. Bij immunoabsorptie-proeven blijkt dat antiserum tegen IFN-β met een deel van het door geïnduceerde epitheel-cellen gevormde interferon reageert. Het nieuwe interferon vertoont ook een activiteitsprofiel in zoogdiercellen dat anders 10 is dan dat van bekende soorten interferon. Uit deze kenmerken blijkt wel dat IFN-ε een unieke stof is.

Thans is IFN-e met succes geproduceerd uit normale epitheelcellen afkomstig van menselijke epidermis, conjunctiva, vagina en slokdarm, met de "normale inductie" van 15 Field et al (beschreven in de Proceedings of the National Academy of Sciences 58, (1967) 1004-1009) of met de "super-inductie" van Havell en Vilcek, beschreven in Antimicrobial Agents in Chemotherapy, (1972) 476-484) met nucleinezuur (het poly-(l.c)van de Miles Laboratories), met Newcastle Disease 20 Virus (zie Baron en Issacs in British Medical J. 56_ (1962) 18-20) en met Sendai-virus tegen parainfluenza-1 (zie Gresser in Proceedings of the Society of Experimental and Biological Medicine 108 (1961) 303-307.). De uitkomsten van bepalingen la- 1 ten zien dat met elk van deze induetietechnieken en met elk 25 soort inducerend materiaal er IFN-ε ontstaat. De geproduceerde hoeveelheid varieert met het type inductiemiddel en met de diverse modificaties van de inductie techniek. Heel goed gaat het met Newcastle Disease Virus. Andere bruikbare virussen staan in onderstaande tabel: 30 8302484 «> * 6

Tabel A

Virus Beschreven door

Influenza-A Gresser & Dull (1964);

Andrews (1961)

Parainfluenza-3 Chany (1960)

Mazelen Petralli, Merigan & Wilbur (1965a); DeMaeyer & Enders (1961)

Bof Cantell (1961); Waddell, Wilber &

Merigan (1968)

Rode hond Neva & Weller (1964)

Syncytiale luchtweg-virus Ray, Gravelle & Chin (1967);

Moehring & Forsyth (1971)

Rabies Wiktor et al (1972)

Vesiculaire stomatitis Marcus & Sekellick (1977); Vilcek,

Yamazaki en Havell (1977)

Chikungunya Zimmermam et al (1972)

Sindbis Gresser & Enders (1962)

Westelijke paarden- Luby, Sanders & Sulkin (1971) encephalitis

Gele koorts Wheelock & Sibley (1965);

Wheelock & Edelman (1969)

Poliovirus-Type 1 Gresser, Chany & Enders (1965)

Poliovirus-Type 2 Smorodintsev et al (1970);

Ho & Enders (1959a,b)

Encephalomyocarditis Stewart II, Gosser & Lockart (1971a)

Neus-virus-2 Smorodintsev et al (1971a);

Fiala (1972)

Neuslvirus-12 Gatmaitan, Stanley & Jackson (1973)

Reovirus-2 Oie, Loh en Ratnayake (1973)

Blauwe tong Jameson & Grossberg (1977)

Adenovirussen Lysov et al (1971)

Yaricella-zoster Vaczi, Horvath & Hadhazy (1965)

Menselijk cytomegalovirus Vaczi, Horvath & Hadhazy (1965);

Glasgow (1974)

Herpes simplex Rasmussen et al (1974)

Vaccinia Wheelock (1964); Epstein,

Stevens & Merigan (1972).

8302484 7 terferonen uit

Ook werd gevonden dat ia/een bepaald type menselijke cellen zoals epitheel-cellen, fibroblasten, vaat-cellen, levercellen, niercellen, enz,, bijzonder doeltreffend zijn als stoffen tegen virus of tumor als het om de behandeling 5 van menselijk weefsel van net dat type gaat. Dus is IFN-ε het meest doeltreffend bij de behandeling van epitheelcellen, en zal men daarvan een lagere werking vinden als men het op menselijke cellen van andere typen beproeft. Evenzo werkt IFN-β (uit menselijke fibroblasten) het meest doeltreffend bij de 10 behandeling van menselijke fibroblasten (cellen of compleet weefsel) en minder goed op tumoren en virussen die cellen van andere types aantasten.

De volgende procedure kan dan ook toegepast worden om cellen of een weefsel van een bepaald type tegen 15 een virusinfectie te beschermen of om de groei van een tumor in dat weefsel tegen té houden:

Eerst wordt een kweek van cellen van dat type met gebruikelijke technieken gekweekt (in het geval van epitheelcellen de hierboven genoemde techniek van Green). Dan 20 worden cellen van die kweek geïnduceerd zodat dat deel van hun DNA-code dat verantwoordelijk is voor de vorming van e-inter-feron tot expressie komt. Dat kan bijvoorbeeld gebeuren met de hierna te bespreken inductietechnieken. Daarna wordt het pro-dukt geoogst, in het algemeen na een zekere incubatie. Het produkt 25 kan gebruikt worden tegen de virussen of de tumor op de cellen of het weefsel in kwestie. In vitro worden cultures tegen aantasting door virussen beschermd door er per ml 2-5 eenheden ΙΙΊΤ-ε aan toe te voegen. Deze concentratie is doeltreffend voor het beschermen van epitheelcellen in een dichtheid tussen 0,5 5 2 30 en 2,5 x 10 cellen/cm .

Belangrijke hoeveelheden van deze nieuwe stof tegen virussen kunnen ook bereid worden met twee kortgeleden ter beschikking gekomen celkweek-technieken. De eerste houdt het gebruik in van chemisch, met virussen of spontaan 35 getransformeerde eukaryotische cellen verwant aan die eerder gebruikt werden voor de produktie van IFN-α uit menselijke 8302484 • 4 8 lymfoblastoiden. De tweede past de recent ontwikkelde recombinant-DNA-techniek toe zoals reeds toegepast bij de bereiding van IFN-α en IFN-β.

Bij de eerstgenoemde methode kan men ge trans-* 5 formeerde cellen die IFN-ε kunnen maken op twee wijzen verkrij gen: in vivo of in vitro. Met de in vivo techniek isoleert men getransformeerde cellen direct uit vers weefsel, bij de in vitro techniek wordt een stam van normale menselijke diploide cellen langdurig gekweekt totdat een klein maar te onderscheiden aantal jO van de populatie een spontane transformatie ondergaan heeft of behandelt men die uitgangsstam eerst een korte tijd met een virus of een bekend mutageen zoals EMS, MMS of MNNG zodat de frequentie van transformaties hoger ligt. Sommige van deze in vitro getransformeerde cellen zullen zeker een deel van de 15 DNA-code van epitheelcellen bevatten die voor de vorming van IFN-ε verantwoordelijk is.

Aldus verkregen getransformeerde celkweken kunnen met standaardtechnieken geïnduceerd worden zodat ze nu IFN-ε gaan produceren.

20 Bij de tweede techniek wordt het in de epi theelcellen als respons op de IFN-inductie gesynthetiseerde mRNA uit de cellen geëxtraheerd, eventueel door ultracen-trifugeren of zo gezuiverd (om mENA met hogere specificiteit te krijgen) en wordt het extract gebruikt als matrijs bij de 25 synthese van complémentair DNA (cDNA). Het cDNA kan bereid wor den met behulp van het enzym transcriptase uit vogel-Myoblastose. Het uiteindelijke produkt van dat proces, het dubbele standaard-complementaire DNA (dscDNA) dat voor de synthese van IFN-ε codeert wordt dan samen met een bacteriële of een eukaryotische 30 vector behandeld met een restrictie-enzym dat het DNA openknipt en bindingsplaatsen schept waardoor het dscDNA en de vector aangehecht kunnen worden. De vector en het DNA worden dan bij elkaar gebracht en tot covalente koppeling gebracht met behulp van een ligase. Dan wordt met dit recombinant-vector-preparaat of 35 een bacteriële of een eukaryotische cel getransformeerd. De aldus getransformeerde cellen bevatten het DNA dat complementair 8302484 9 is met al het RNA. of met een deel van het RNA dat aanvankelijk in de epitheelcellen tijdens de vorming van het IFN-ε aanwezig was.

Deze recambinant-vectoren worden dan met 5 cellen van het geëigende type geïncubeerd zodat de vector aan het werk kan. Dat leidt tot een celpopulatie met afzonderlijke cellen die IFN-e kunnen synthetiseren en uitscheiden. De celpopulatie wordt dan afgezocht op een sub-populatie van cellen die IFN-ε produceren, en die subpopulatie wordt verder gekweekt 10 zodat men een cellijn krijgt die hetrekkelijk grote hoeveelheden IFN-ε vormt.

Verdere bijzonderheden van deze recombinant-DNA-techniek kan men in de volgende literatuur vinden: 1. Het Amerikaanse octrooischrift 4.237.224. 15 2. R, Scheller et al, "Clones of Individual

Repetitive Sequences from Sea Urchins DNA Constructed with Synthetic Eco Rj Sites", Science 196 (1977) 197-200; 3. F. Blattner et al, "Charon Phages:

Safer Derivatives of Bacterophage Lambda for DNA Cloning", 20 Science 196 (1977) 161-169; 4. J. R. Broach en J.B. Hicks, "Replication and Recombination Functions Associated with Yeast Plasmid, 2 Micron Circle", Cell, _21_ (1980), 501-508 en 5. D, Hamer "Synthesis Processing and 25 Secretion of Eukaryotic Proteins in the SV40 - Monkey Cell

System", Recombinant DNA Abstracts, 1_ (1981) biz. 4.

Voorbeeld I

Een kweek van epitheelcellen uit de mense- 30 lijke huid, verkregen van het laboratorium van H. Green in het

Massachusetts Institute of Technology, werd in een minimaal medium (het MEM van Gibco) dat 10 % door verhitting geïnactiveerd

kalverfoeten-serum (HIFCS, voor inactivering 30 minuten op 56°C

5 2 gehouden) tot een celdichtheid van 1-2 x 10 cellen per cm 35 gekweekt. Vier equivalente kweken in MEM met 2 % HIFCS werden 1 uur bij 37°C blootgesteld aan respectievelijk 0, 1, 10 en 100 8302484 *· 10 ^ig/ml poly(I*C)-(9S) (een hoogmoleculair nucleinezuur gekocht bij de PL Laboratories te Milwaukee, Wisconsin). De cultures werden tweemaal met MEM uitgewassen en 24 uur gekweekt in hetzelfde medium met 2 % HIFCS. Daarna werd in dat medium een 5 bepaling uitgevoerd volgens Stewart II, beschreven in blz. 17-18 van "The Interferon System". Werking tegen virussen was niet aantoonbaar in kweken die met 0 en 1 yug/ml poly(I*C) geïncu-beerd was. Ongeveer 10 eenheden/ml IFN-ε werden gevonden in monsters met 10 en 100^ig/ml poly(I.C).

10 Voorbeeld II

De procedure van voorbeeld I werd herhaald, behalve dat in een poging om de produktie van IFN-ε te verhogen een gemodificeerde "superinductie-techniek" toegepast werd (volgens Havell en Vilcek, zie hierboven). Samen met het poly-15 (I*C) werd ook 50 ^ig/ml cyclohexamide (een eiwitsyntheseremmer) opgenomen. Na 1 uur incubatie werden de cellen gewassen en nog 3 uur geïncubeerd in MEM met 2 Z HIFCS en 50 yug/ml cyclohexamide. Daarna werden de cellen opnieuw gewassen en nog eens 2 uur geïncubeerd in MEM dat 50 yug/ml cyclohexamide en 5,0 20 ^ïg/ml actinomycine D (een remmer van de KNA-synthese) bevatte. Na afloop van die incubatie werden de cellen tweemaal uitgewassen en 24 uur bij 37°C in een normaal medium geïncubeerd. Overeenkomstig voorbeeld I werden de media geoogst en geanalyseerd. In de kweken die bij het induceren 0 en 1 yig/ml poly-25 (ΙΌ) bevatten werd geen IFN-ε aangetoond. De met IQyug /ml poly(I*C) geïnduceerde kweek had per ml 100 eenheden IFN-ε.

De met 100 yug/ml poly(I*C) geïnduceerde kweek bevatte per ml 330 eenheden IFN-ε.

Voorbeeld III

30 Een kweek van uit de huid afkomstige epi- theelcellen met 1-2 x 10J cellen (net als in voorbeeld I) werd gebruikt voor de produktie van IFN-ε met een inductie door Newcastle Disease Virus (NDV) zoals beschreven door Baron & Issacs. Het gebruikte virus was de Bankowski-stam van het NDV, 35 verkregen van de Poultry Health Laboratories te Davis,

Califomië. Er werden vier 1 ml-monsters MEM met 2 Z HIFCS aan- 8302484 *> * π gemaakt die genoeg NDV bevatten om in de uiteindelijke proefmonsters concentraties van respectievelijk 0, 100-200, 25-50 en 1-16 eenheden per cel te geven. Van deze 1 ml-preparaten werden porties van 0,2 ml aan de celkweken toegevoegd die 30 5 minuten bij 37°C géïncubeerd werden terwijl ze om de 5 minuten omgeschud werden. De overblijvende porties van 0,8 ml werden daarna aan die kweken toegevoegd, die vervolgens nog 30 minuten geïncubeerd werden. De celkweken werden nu tweemaal met normaal medium gewassen, 1 ml vers medium werd aan elke kweek 10 toegevoegd, en dat werd 24 uur geïncubeerd.

Het medium werd nu geoogst, met 0,1 N HC1 aangezuurd tot pH 2, en 5-6 dagen op 4°C bewaard om het NDV te inactiveren. Daarna werd het medium met 0,1 N NaOH geneutraliseerd en werd er het IFN-ε in bepaald. In de blanco, waaraan 15 geen NDV toegevoegd was, was anti-virale werking afwezig. De met 100-200 virus-deeltjes per cel geïnduceerde kweek bevatte per ml 500-1000 eenheden IFN-e, de met 25-50 virus-deeltjes per cel geïnduceerde kweek bevatte per ml 170-330 eenheden IFN-ε - en de met 1-16 virusdeeltjes per cel geïnduceerde kweek had 20 Per ml 50 tot 17Q eenheden ΕΕΝ-ε.

Zoals men uit deze proef kan zien kan een kweek met 1-2 x 10J cellen per ml wel 500-1000 eenheden/ml IFN-ε geven. De opbrengst is dus van de grootte-orde van ëên eenheid IFN-ε per 100-500 cellen in de kweek.

25 Voorbeeld IV

De werkwijze van voorbeeld III werd herhaald, behalve dat voor het induceren in plaats van NDV het parainfluenza- 1 -virus (of Sendai-virus) in diverse concentraties gebruikt werd. Het van de Flow Laboratories gekochte Sendai-virus 30 bevatte per ml 10.000-40.000 heamaglutinatie-eenheden.

In een kweek waarbij het virus-preparaat uit de handel 1:3 verdund was werden 1000 eenheden/ml IFN-ε gevormd.

Met een 1:10-verdunning kwam men op 200 eenheden/ml, en met een 1:33-verdunning op 100 eenheden/ml. Geen antivirale werking 35 vond men in een blanco culture waaraan geen virus toegevoegd was.

8302484 * s * * 12

De volgende tabel geeft een samenvatting van de proeven van voorbeelden I t/m IV met celkweken van men-selijke conjunctiva- en epidermis-cellen en diverse inductie-technieken.

5 Tabel B

Resultaten van interferon-proeven

Cel-type Inductie-metbode Eenh. IFN-ε ' Eenh. IFN-ε _ ___ per ml_ per cel

Menselijke poly(I«C) 33 3,3 x 10 3 10 Conjunctiva " poly(I.C)+ 330 3,3 x l(f4 " Geen (blanco) 0 0

Menselijke poly(I*C)* 0 0

Epidermis 15 " Sendaii ++ 330 3,3 x 10 4 " WW*31 1000 1,0 x 10-3 " Geen (blanco) 0 0 x Induetiemethode van voorbeeld I met 100 yug/ml poly(I*C) 20 + Inductiemethode van voorbeeld II met 100 jig/ml poly(I«C) xx Inductiemethode van voorbeeld III met een 1:3-verdunning van NDV (100-200 virus-deeltjes) ++ Inductiemethode van voorbeeld IV met een 1:3-verdunning van de voorraad-oplossing.

25 Voorbeeld V

Daar van interferonen altijd gezegd is dat het eiwitten zijn werd van monsters IFN-ε onderzocht of de daarin aanwezige antivirale werking aan een eiwit te wijten was.

De proeven werden uitgevoerd door monsters IFN-α (standaard van 30 het NIH), IFN-g (standaard van het NIH) en IFN-ε (geproduceerd door met NDV geïnduceerde epithee1-keratinocyten) in aanwezigheid van bekende protéolytische enzymen te incuberen en het aldus behandelde materiaal op resterende anti-virale werking te onderzoeken. Monsters IFN-a (16 eenheden/ml), IFN-ft (J6 eenhe-35 den/ml) en IFN-ε (32 eenheden/ml) in MEM werden een uur bij 37°C geïncubeerd, hetzij in aanwezigheid van trypsine (van de Sigma Chemical Co, te St. Louis, Missouri) hetzij van Pronase 8302484 . ; ^ 13 (ook van Sigma) in concentraties van 3,3-100 yug/ml. Na voltooide reactie werd de overblijvende proteolytische werking van de monsters geneutraliseerd door HIFCS tot een concentratie van 33 Z toe te voegen. Dan werden de monsters op restant IFN-werking 5 onderzocht door microtitratie met GM-2767-cellen. De uitkomsten hiervan waren:

Proteolytische gevoeligheid van IFN-ε

Proteolytisch Enzym- Restant IFN-werking enzym concentratie _ Qag/ml) 'IFN-ot IFN-g IFN-s 10 Trypsine 100 0 0 0 33 0 0 0 10 12 4 3.3 8 8 16 0 16 16 32 15 Pronase 10 000 3.3 0 0 0 0 16 16 32

Deze cijfers laten zien dat de anti-virale werking van monster IFN-ε te wijten is aan een of meer eiwitten, 20 want door behandeling met proteolytische enzymen ziet men de activiteit helemaal verdwijnen. Het eiwit-karakter van IFN-ε blijkt ook uit het feit dat remmers van RNA- en eiwit-synthese ook de vorming van IFN-ε tegenhouden.

Voorbeeld VI

25 Hieruit blijkt de stabiliteit van IFN-ε tegen zuur. IFN-ε werd bereid overeenkomstig voorbeeld III met inductie van menselijke epidermis cellen met NDV. Toen het medium geoogst werd werd het in drie delen verdeeld. In het eerste deel werd het virus overeenkomstig voorbeeld III geïnactiveerd door 30 met HC1 tot pH = 2 aan te zuren en daar 5 dagen op te bewaren.

Het tweede deel werd gefiltreerd door een Millipore PTMKQ1310-filter (grens aan het MG 100.000, van de Millipore Corp. te Bedford, MA). Het derde deel werd gefiltreerd door een Millipore PSVP 01310-filter (laat ook MG tot 100.000 door) dat eerst 35 4 uur met 1 % runderserumalbumine gedrenkt was.

Alle drie de media werden daarna op IFN en op de aanwezigheid van resterend virus onderzocht. De uitkomsten hiervan waren: 8302484 14

Behandeling Virus-titer Virus-titer IFN-titer van het IFN in 't begin aan ’t eind (eenh./ml _ (pfu/ml) (pfu/ml) _ 5 5 dagen op pH = 2 1,1 x 10° 0 128

Filtreren door a PTHK 01310 1,1 x 100 0 128 JO Filtreren door « PSVP 01310 1,1x10 0 128

Geen van deze monsters vertoonde na afloop nog enige virus en allemaal hadden ze nog hetzelfde gehalte 15 aan IFN-ε. Daaruit blijkt dat IFN-e tegen zuur bestand is. Voorbeeld VII

De immunologische eigenschappen van IFN-ε (geproduceerd door menselijke epidermiscellen die overeenkomstig voorbeeld III met NDV geïnduceerd waren), IFN-a, IFN-β en 20 IFN-γ (verkregen van S. Baron van de University of Texas Medical School, te Galveston, Texas) werden vergeleken.

Elk interferon onderging een neutraliseringstitratie met sera tegen ÏFN-a (van het NIH), tegen IFN-β (van het NIH en Y.H.Tan van de Universiteit van Calgary te Calgary, Alberta, Canada), 25 tegen IFN-γ (van S. Baron) en met mengsels van deze antisera.

Van de geëigende antisera werden series van 1:2-verdunningen met MEM gemaakt, steeds met behulp van een microtiter-plaat met 96 putjes. Verdunningen van 32 eenheden per ml tot 2 eenheden per ml van elk IFN-preparaat werden in de putjes ge-30 bracht en de platen werden eerst een uur op 37°C en daarna een uur op 4°C geïncubeerd, zodat dé antilichaanrIFN-camplexen zich konden vormen. Toen werden menselijke fibroblasten (GM-2767 van het menselijke mutantcellen-depositorium) toegevoegd in een dosering van 2 x i04 cellen per putjes, en na 20-24 uur incu-35 batie bij 37°C werden deze aangevallen met een standaarddosis vesiculair stomatitis-virus (ëën eenheid per cel). Na 24-48 uur op 37°C werd elk putje microscopisch onderzocht op door interferon veroorzaakte remming van door virussen veroorzaakte schade.

8302484 15

De uitkomsten waren:

Hoeveelheid antiserum nodig om IFN te neutraliséren (eenheden per ml)_ IFN-monster ÏFN-conc. Anti-οί^ Anti-0 Anti-α en 5 _ eenh,/ml _______ _ Anti-β (a) IFN-ct 16 N.B. >3.000 N.B.

(NIH std) 8 N.B. >3.000 N.B.

4 62 >3.000 125 IFN-g 8 >3.000 375 750 10 (NIH std) 4 >3.000 188 750 2 >3.000 188 47 IFN-ε 8 >3.000 >3.000 188 AR-IV (b) 4 >3.000 375 188 2 >3.000 375 47 15 IFN-ε 16 >3.000 >3.000 375 AOB (c) 8 >3.000 >3.000 375 2 >3.000 1.500 94

Blanco schapenserum tegen fibroblast-IFN had geen neutrali-20 serend vermogen.

N.B. = niet bepaald.

(a) In schapen tegen de respectievelijke soorten IFN gekweekte antisera.

25 (b) Afgeleid van epidermis-keratinocyten, niet noodzakelijk vrij van fibroblasten (met NBV geïnduceerd) (c) Afgeleid van fibroblast-vrije epidermis-keratinocyten (met NDV geïnduceerd).

Uit de bovenstaande tabel kan men zien dat 30 a) IFN-α zowel door serum tegen α als door mengsels van sera tegen α en b geneutraliseerd wordt. Zoals te verwachten heeft men tweemaal zoveel gemengd serum nodig als van het enkelvoudige serum (alleen het serum tegen a werkt.

b) IFN-g wordt zowel door serum tegen g als door een mengsel 35 van sera tegen α en g geneutraliseerd. Ook nu heeft men yan het gemengde serum tweemaal zoveel nodig als van het enkelvoudige.

c) Er is van gemengd serum tegen α en g minder dan de helft van de hoeveelheid anti-g serum nodig om een zelfde hoeveelheid IFN-ε te neutraliseren. IFN-ε reageert niet met antisera tegen 40 IFN-γ.

8302484 % * w 16

Dit laat zien dat IFN-ε immunologisch te onderscheiden is van IFN-a, IFN-g en IFN-γ, en dus duidelijk een nieuwe stof.

Voorbeeld VIII

5 Dit bevat serologische gegevens die die van voorbeeld VII aanvullen.

IFN-s dat gedeeltelijk met antilichamen neergeslagen was werd in een neutraliseringsproef gebruikt.

Twee monsters van dat interferon werden gemengd met serum tegen 10 IFN-g (polyclonaal van het NIH of monoclonaal van Y.H. Tan).

Het mengsel werd een uur bij 37°C geïncubeerd en dan een uur bij 4°C zodat het antilichaam-IFN-complex kon vormen, en daarna werd dat complex samen met eventuele overmaat antilichaam verwijderd door het in een verhouding van 30:1,5 met eiwit-15 A Sepharose (van de firma Sigma) samen te brengen. Het achterblijvende, niet gebonden IFN onderging een tweede ronde imrmino-precipitatie, en die monsters werden met de CEP-remmingsproef op IFN-werking onderzocht, De resultaten waren als volgt: 20 IFN- Aanvanke- 3e precipi- IFN- 2e precipi- Uiteinde- monster lijke IFN- tatie met titer tatie met lijke titer daarna IFN-titer eenh./ml _ eerih. /ml_ eenh./ml A0B-IFN-ε 1024 Anti-g 256 Anti-g 256 25 polyclonaal polydonaal AOB-IFN-ε 1024 Anti-g 1024 Anti-g 1024 monoclonaal monoclonaal AOB-IFN-ε 1024 Anti-g 1024 Anti-g 1024 monoclonaal polyclonaal 30 AOB-IFN-ε 1024 Anti-g 256 Anti-g 256 polyclonaal monoclonaal

Toen bij de precies zoals in voorbeeld VII

uitgevoerde proef voorgeprecipiteerd AOB-IFN-ε gebruikt werd werden de volgende uitkomsten verkregen: 35 8302484 17

Hoeveelheid antisera nodig om IFN te neutraliseren _ IFN-monster IFN-conc. Anti-β Anti-ct en _ eenh./ml ' Anti-β 5 AOB IFN-ε 16 >3.000 1.500 voorbehandeld 8 >3.000 375 met anti-β 4 >3.000 94 antiserum AOB IFN-ε 16 >3.000 1.500 10 voorbehandeld 8 >3.000 188 met blanco 4 1.500 94 antiserum AOB-IFN-ε 8 >3.000 1.500 niet 4 375 94 15 voorbehandeld 1 12 24 NIH IFN-β 16 750 750 8 188 375 4 94 188

Blanco schapenserum tegen fiblasten-IFN had geen neutrali- 20 serend vermogen.

De gegevens uit de voorafgaande tabellen laten zien dat een deel van het IFN-e-preparaat niet met antiserum tegen β geneutraliseerd kan worden ook al worden twee verschillende antilichamen tegen β ingezet. Maar na een gron-25 dige voorprecipitatie met anti-serum tegen β kan een aanvullend deel van het IFN-e met gemengd antiserum tegen o en β neergeslagen worden. Deze gegevens vormen een aanvullend bewijs dat IFN-ε immunologisch en chemisch verschillend is van de andere bekende menselijke interferonen.

30 Voorbeeld IX

IFN-ε dat bereid was door menselijke epi-dermis-cellen overeenkomstig voorbeeld III met NDV te induceren kan gezuiverd en geconcentreerd worden door affiniteitschroma-tografie over een aantal geïmmobiliseerde liganden. Daaronder 35 vallen (geen uitputtende opsomming) reactief roocHgarose, fenyl-sepharose (Sigma Chemical Co. te St. Louis, Mo.), procioon-rood-agarose, fenyl-agarose (BRL, Gaithersburg, Md.), Glycogel B, N-(3-carboxypropionyl)-aminodecaan-agarose en N-pyromelli-tylaminodecaan-agarose (Pierce Chemical Co. te Rockford, 111.).

40 Een oplossing van 900 eenheden IFN-ε in 8 ml 8302484 18 MEM werd gebracht op een kolom van 0,5 ml reactief rood-agarose. De kolom werd met 10 ml 20 mM fosfaat-buffer met pH = 7,4 gewassen en daarna werd het XEN geëlueerd met drie 2 ml-porties van ethaandiol/20 mM fosfaat-buffer die 1M NaCl bevatten. Om 5 het ethaandiol te verdunnen werd elke fractie in een gelijk volume 20 mM fosfaat-buffer opgevangen. Tenslotte werd de kolom uitgewassen met nog 5 ml 20 mM fosfaat-buffer. De eiwit-concen-tratie werd bepaald door de extinctie bij 280 nm te meten. Dat gaf deze uitkomsten: 10 8302484 19 Ρ α) <U 4J CM — _E* P UI O O Γ'' ¢) Λ Λ Λ * ÖN ο Ο Ο Ο I -d- Ο Ο dUZ ο m — > - *5 '1-1

S

ο C τ3 «5 0) «3 ,0 Η φ νΟνΟΟ Ο CS «d- Ο cd © σι m ν ~ — οί νο cd ι οο mo ο ÏÜ

Es Η II

Ο 03 Ό «Ί > 60 cd " _ •Η C cd Ο I I I Γ" <2 2 3·Η μ tsi μ οο| ^ _ ö c ο) cd 'd cd © <r jj in Γ1' «d* co 03 οο

τ-lc! V003V0 -d* 00 -d- O

cd cu «.·*« - “ “ ” I

cd © om-ct o cd o o P 1 CS —

O fl ES O

«3 § /-v H ^ ι-c g i^.r^m m -d- <· -d" co 0 'S’ > μ <1>

-U

•H

4J

1 ι-H CO 03 S CS 00 vO VO O

z g es es m —

fr. —. t— CS

H W

•ng m -- co — co ·“ •ri § LO cn ^ co CM CM CM * σν σ\ σ> o ~ o w

ο CO CS — ο ο ο ο ο S

Ο cs e ο

τ—I

ο

*—* rM

cd cd ο) Η -a 4J -Ρ -Ρ -Ρ Ρ

© μ ο υ ο ρ ο ο 2 ^ +J

Η ©ββιΰβΛ^^^-,^-ιδίϊί I 1 ρ Cö CÖ CÖ Ρ~ί τ—I ^ ρ Cd G Cd > 00 >4-1 OOMS 00 Ο 00 Ο 00 Ο <Η Λ g CcnfdmCOCOCiüöpffl Μ CO CU ·Ρ Ο ·Ρ Ο *Ρ *Η ·ι-1 Ρ Ο

1|_Ι 00 Ο (Η 4-1 CO 4S car-1 COt-1 CO rS -rl 4S

ι coca to cnootaootaooto g cdi-icd2cd2cd cd <d „ 52¾ o OOP si 5 s>s SN SN «Β r-i Ρ O 3 ο ή οωοαι οο οοοαι ο ® ο ¢4 top— ν es ν -mcsmcomHcs 6302484 20

De eerste twee glycol-fracties werden gecombineerd en hierin vond men al het ingezette IFN-ε, dat ten opzichte van het uitgangsmateriaal een zesvoudige zuivering ondergaan had.

5 In andere, overeenkomstige proeven werd tot 68 ml IFN-ε oplossing op de kolom gebracht en het IFN teruggewonnen in een eindvolume van 8 ml, wat een 8,5-voudige concentratie van het materiaal betekent.

Als het IFN-ε achtereenvolgens op twee of 10 meer van deze geïmmobiliseerde liganden gebracht wordt is een verdergaande zuivering mogelijk. Bijvoorbeeld werd een monster IFN-ε op een N-(3-carboxypropionyl)aminodecaan-kolom gebracht en op de hierboven beschreven wijze geëlueerd. De gecombineerde IFN bevattende fracties vertoonden een zuivering van onge-15 veer 9 maal en werden tegen 20 mM fosfaat-buffer gedialyseerd om het glycol te verwijderen. Daarna werd het monster op een N-pyromellitylaminodecaan-kolom gebracht, en die werd op dezelfde wijze geëlueerd. Het IFN-ε werd in een opbrengst van 70-100 % teruggewonnen en had nogeens een 5-voudige zuivering 20 ondergaan.

Uit dit voorbeeld blijkt dat IFN-ε door elke combinatie van geïmmobiliseerde liganden gezuiverd kan worden. Voorbeeld Σ

Ongefractioneerd IFN-ε werd eerst 20 minu-25 ten op 300 g gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd in een "Fisher Rotarack" bij 4°C gemengd met poreus glas met bekende poriën, 0,28 g glas per 30 ml vloeistof. Na 3 uur werd de bovenstaande vloeistof verwijderd en werden die poreuze glazen pareltjes tot een kolom van 2,5 x 3,1 cm gepakt. De 30 kolom werd eerst gewassen met 4 kolom-volumina PBS en daarna met 4 kolom-volumina 1,0 M NaCl in 20 mM fosfaat-buffer met pH = 7,4. Vervolgens werd het IFN-ε geëlueerd met 4 kolom-volumina mengsel van ethaandiol met 1,0 M NaCl in 20 mM fosfaat-buffer, de uitloop werd opgevangen in een zelfde volume 35 1,0 M NaCl in 20 mM fosfaat, zodat de glycol-concentratie daar na 25 % was. De IFN-ε bevattende fractie werd door ultrafiltra- 8302484 Γ 5 21 tie geconcentreerd tot 1,0-1,6 ml en toen op een 1,6 cm x 85 cm kolom van polyacrylamide-agarose (Ultragel AcA54) gebracht, die eerst tot evenwicht gebracht was met 25 % glycol in 1,0 M NaCl/20 mM fosfaat-buffer. Het IFN-ε werd daarna met die 5 evenwichtsvloeistof geëlueerd in een debiet van 6,0 ml/uur.

Er werden fracties van 2,0 ml opgevangen en die werden op gehalten aan IFN en eiwit onderzocht (Loury-bepaling). De uitkomsten waren als volgt: 10 8302484 < 22

4J <U O vO 00 I

<D +J cm ” O O CM 00 d ,jj ·* a a «ι | a a <d o — ο o — vo co pi n o ao I I— r-' d <d ”

t> 00¾ I

ti Pm

6»S ·Η Η I

in I

00

P5 _ I

•Η O

U — I O

0) 'd I I II Λ I

> d — I Γ" •d d

0 d I

M 00

<D 4J I

,±2 "rl

0) CD y-\ I

-r) +J-<f CO I'» m ·η o m cm I cm •rl r> ” *> I II ·> I ·> a *h f- oo I -* <u -u χ m

p.gv I

03 d i—f co I m bj cm in pq m d ·η oo * I II « I * * +j & g -ο- o s —

0 ^ — — I

H <0

Ο Ο O vO CM Ο O

do vo vo σν — ίο o cu cm cr\ r-~ co σν cm vo ι-Ί *β · · · * I · · d <D m cm —·> o on d a i'*· ” r>. I *-· σν +j a ö o co oo I—

Ο E CD I

Η H CD —

5-1 O CM CM vo vO I Ο O

1 CD 1—j M3 CO CO” r~ O O

g +J g LT) Γ-> I O Ό fxj ·Η ·~«. · · . » H -)-1 <U CM Γ" 1 CM m

T·*» (\J

I m I

+J ι-H -vf I

•rl g CO · · · ON · ΙΛ j3 o P Mffl olrt o ·,_{ fcQ λ · · · ·* · a iag o a a a ο i a o

vo O

0 I · · g Η O CO 1Π vO CM ” ” d 6 cm o mm — I co I—I n-' si- <· —

O I

> r-v u w a _ — da m a *·ι <d pm — — i-π d c —I d d cd d <t d ce d oo > cDdOdOl d > •rid 03 g g PM CD PM d dn-tOd i <d « d

CD ·Η dH 00 ooa TH a *J !c CD

iw wddoodCBOpl wcDdg

O d 4J d ·Η *rl ·Η -U d U O

•U gd -U CD 03 COO ΆΟΙ d Ml 03 ιΗ CO ICDtONcOfflCMdCM ddcno •h dOdP3c|3d~---d'--'.|r-i<Dd,i2

CD -rl CD CD & J3 r-l d r-l UP· I

o oo d > d o a oi -u d <1

H (Dd Ο O 0) CD d +J d *rl O d O

> P3v^pqo,”CMawai p u a <i 8302484 23

Voorbeeld XI

Preparaten van IFN-ε, IFN-α en IFN-β, waaronder het ruwe, gedeeltelijk volgens voorbeeld X gezuiverde preparaat (p-IFST-e) en p-IFN-e dat met antiserum uit muizen 5 tegen interferon voorbehandeld was ondergingen een molecuul- gewichtsbepaling volgens Lamelli door elektroforese over SDS-gel. De monsters werden I uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met 1,0 % SDS in 0,05 M tris-HCl (pH = 6,8) 10 Z glycerol en 0,001 % broomfenolblauw en dan op een 12,5 Z polyacryΙ-ΙΟ amidegel gebracht en dan 16 uur aan elektroforese onderworpen. Daarna werden de banden met molecuulgewicht-standaarden gekleurd. Dit IFM bevattende banden werden tot stroken van 3 mm gesplitst en 20 uur bij kamertenroeratuur onder schudden geëxtraheerd met 0,5 ml FBZ dat 0,5 %ffe.DS bevatte. Bepaling van 15 deze fracties gebeurde met GM-2767 cellen en het molecuulge- wicht van elke piek met activiteit werd berekend door vergelijking van zijn plaats op het gel met de molecuulgewicht-standaarden. De uitkomsten hiervan waren als volgt: 20 IPN Molecuulgewxchten der pieken met activiteit _ (Z der ingezette activiteit)_ et 18.000(27,6) 19.700 (44,8) 22.500 (27,6) β - (1,83) - - 22.000 (98,2) ruwe 17.500 (41,0) 20.000 ( 7,4) 22.000 (51,6) 25 p-IFN-e 17.500 (35,4) 20.000 (2,53) 22.000 (62,0) ongebonden p-IPN-e 17.500 ( 9,2) 20.000 0 22.000 (90,8) gebonden p-IPN-e 17.500 (68,0) 20,000 (15,3) 22.000 (16,8) 30

Alle drie uit IFN-e verkregen deelmonsters vertoonden anti-virale werking op GM-2767-cellen. De fracties met een MG van 22,000 vertoonden geen werking op rundemier-cellen, de twee andere fracties wel, maar met ongeveer een 35 kwart van hun werking op GM-2767-cellen.

Voorbeeld XII

Het anti-viraal vermogen van IFN-ε, dat over- 8302484 24 eenkomstig voorbeeld III gevormd was door menselijke epidermis-cellen die met NDV geïnduceerd waren, en die van IFN-α en IFN-β afkomstig van het NIH werden met elkaar vergeleken in kweken van normale menselijke epidermis-cellen versus normale menselijke 5 diploxde fibroblasten. Serieverdunningen van de drie IFN-pre- paraten werden in de putjes van een microtiterplaat gecombineerd met standaardkweken van normale menselijke epidermis-cellen of van normale menselijke fibroblasten. Na 18-24 uur incubatie op 37°C werden de cellen in alle putjes belast met 10 een standaarddosis vesiculair stomatitis-virus (één eenheid per cel). Na 36-96 uur (toen de blanco’s voor 100 % dood waren) bleken de cellen bij microscopisch onderzoek alle tegen het virus bestand te zijn. De uitkomsten zijn als volgt samengevat:

Tabel C

15 Interferon Ac-tiviteit van het IFN in eenheden op:

Fibroblasten (FS-4)a Epitheelcellen IFN-ε 32-64 512-2048 IFN-a 128-512 64 IFN-β 32-256 8-32 20 a - normale menselijke diploïde fibroblasten, verschaft door J. Vilcek (universiteit van New York).

Zoals men uit deze tabel ziet is het IFN-ε, waarvan de vorming beheerst werd door de DNA-code van epitheelcellen, als anti-viraal middel op epitheelcellen duide-25 lijk sterker (tot 16 x toe) dan op fibroblasten. Maar IFN-a, waarvan de vorming beheerst werd door de DNA-code van menselijke leukocyten en lymfoblastoïden, was op fibroblasten sterker (tot 8 x toe) dan op epitheel, en IFN-β, waarvan de vorming beheerst werd door de DNA-code van fibroblasten is ook 30 sterker op fibroblasten (4-8 x) dan op epitheelcellen.

Voorbeeld XIII

De werkwijze van voorbeeld XI werd gebruikt om het relatieve anti-virale vermogen van IFN-α, -β, -γ en -ε te bepalen op runderniercellen (MDBK-cellen ATCC CCL22) en 35 op menselijkejtrichrosome fibroblasten (drie kopieën van chromosoom 21 van de menselijke mutantcellen GM-2767, depot- 8302484 Λ 25 nummer 47, XX, t21). De uitkomsten van deze proef waren als volgt:

Activiteit van het IFN (eenh/ml) tegen IFN type MDBK GM-2767 5 α >512 512 β 0 128 γ 0 128 ε 8-36 32

Voor IFN-ct, -β en -γ zijn de uitkomsten in overeenstemming met 10 eerder vermelde gegevens. De uitkomsten voor het IFN-ε laten zien dat dit nieuwe interferon op 01-2767 twee tot viermaal zo sterk werkt als op runderniercellen.

Voorbeeld XIV

Het nieuwe interferon houdt ook wildgroei 15 tegen, zoals men kan zien aan de remming van de vermenigvuldiging van menselijke lymphoblastolden (Daudi-cellen). Ongeveer 10.000 menselijke lymphoblas tolden werden samen met 200 jj.1 medium in de putjes van een microti terp laat gebracht. Diverse verdunningen van IFN-α, -β en -ε werden in de putjes gebracht 20 en 1, 2 en 4 dagen later werden de aantallen levende cellen genoteerd. De uitkomsten waren als volgt:

Bepaling van Daudi-cellen ' _4

Aantal levende cellen per putje (xlO ) IEN-type en na 1 dag na 2 dagen na 4 dagen 25 concentratie _ _ _ α - 100 E 6,0 4,8 6,0 10 E 4,8 5,2 6,0 β - 100 E 7,2 9,6 6,4 10 E 5,2 9,6 18,4 3Q ε - 100 E 6,0 5,2 4,8 10 E 5,6 5,2 6,0

Blanco (geen IFN) 8,0 21,5 67

Hieruit ziet men dat 10 eenheden IFN-ε de groei van Daudi- cellen voor meer dan 90 % kan tegenhouden,

35 Yoorbeeld XV

Monsters IFN-α, -β en -ε werden bij 100°C

8302484 Λ 26 geïncubeerd in met fosfaat gebufferde zout-oplossing (PBZ), met natriumdodecylsulfaat (NaDS) en met een mengsel van NaDS, β-mercap toe than© 1 (BME) en ureum. Van het NaDS weet men dat het eiwitten denatureert doordat het hun conformatie ver-5 andert, en BME reduceert disulfide-bindingen. Gevonden werd dat IFN-a, -6 en -ε duidelijk verschillen in hun gevoeligheid voor deze reagentia. Met name was IFN-α stabiel in NaDS alleen maar werd het in hoofdzaak geïnactiveerd door een mengsel van NaDS, BME en ureum, wordt IFN-β in NaDS alleen grotendeels ge-10 inactiveerd maar is het stabiel in een mengsel van NaDS, BME en ureum, en is IFN-e betrekkelijk stabiel in NaDS en in een mengsel van NaDS, BME en ureum. In PBZ van 100°C blijft bij alle drie de interferonen minder dan 5 % van de activiteit behouden.

15 In daarop gelijkende proeven werd vastge steld dat IFN-α, dat eerst met een mengsel van NaDS en BME geïnactiveerd was gereactiveerd kon worden door het bij 100°C met een mengsel van NaDS ert PBZ te incuberen, dat eerder met alleen NaDS geïnactiveerd EFN-$ met een mengsel van NaDS, 20 BME, ureum en PBZ gereactiveerd kon worden, en dat eerder met PBZ geïnactiveerd IFN-e gereactiveerd kon worden door het bij J00°C met PBZ en NaDS te incuberen, met of zonder BME en/of ureum. Deze waarnemingen tonen opnieuw aan dat IFN-e iets geheel nieuws is.

25 Voorbeeld XVI

Dit betreft een vergelijking van de bindings- en elutie-eigenschappen van ΙΕΝ-ε en IFN-β aan een kolom blauwe sepharose (van Pharmacia). De Kolommen werden in overeenstemming met de gebruiksaanwijzingen van de fabrikant 30 klaargemaakt en bij kamer temperatuur met monster IFN-β of

IFN-ε in PBZ beladen. Elueren gebeurde met 1,0 M NaCl in PBZ

en met een 1:1 mengsel van êthaandiol en 20 mM fosfaat-buffer. Elk interferon-preparaat werd op twee kolommen met verschillende partijen blauwe sepharose beproefd, en dat gaf de vol- 35 gende uitkomsten: 8302484 ?! 27

Binding van IFN aan' Blauwe sepharose % activiteit teruggevonden in Fractie IFN-g IFN-ε

Uitspoeling van de kolom 5 met 20 mM fosfaat-buffer 44,0-44,2 2,5-10,2

Elutie met 1,0 M NaCl 2,7-4,3 19,3-30

Elutie met glycol/1,0 M NaCl in 20 mM fosfaat- buffer 1:1 51,9-52,3 60,0-78,2 10 Bit voorbeeld laat zien dat IFN-ε en IFN-β verschillende affiniteiten voor blauwe sepharose hebben en zich bij elutie verschillend gedragen. Blauw sepharose bindt 90-97 % van de IFN-e-werking, terwijl onder dezelfde omstandigheden maar 60 % van het IFN-β gebonden wordt. Bovendien wordt met 15 1,0 M NaCl 20-30 % van het IFN-teruggewonnen tegen slechts 3-4 1 van het IFN-β. Tenslotte wordt ongeveer 80 % van de IFN-e-werking geëlueerd met een 1:1 combinatie van glycol en 1,0 M NaCl terwijl onder dezelfde omstandigheden slechts 50 % van het IFN-β teruggevonden wordt.

20 8302484

Claims (14)

1. Interferon-preparaat met antivirale werking, bereid door bet kweken van levende cellen die althans 5 een deel bevatten van de DNA-code van menselijke epitheelcellen die de vorming van dat interferon bepaalt, en door het oogsten van een interferonrijke fractie uit die kweek, welk preparaat gekenmerkt wordt doordat i) het bij pH “ 2 stabiel is, 10 ii) zijn anti-virale werking door proteolytische enzymen vernietigd wordt, iii) hetgeen kruisreactiviteit met antilichamen tegen inter-feron-α of interferon-γ vertoont, en iv) zijn anti-virale werking op MDBK runderniercellen een 15 kwart tot een half van zijn werking op menselijke trichosome fibroblasten (GM-2767) is.

2. Interferon-preparaat volgens conclusie 1, bereid door het kweken van menselijke epitheelcellen.

3. Interferon-preparaat volgens conclusie 1, 20 gekweekt op getransformeerde eukaryotische cellen.

4. Interferon-preparaat volgens conclusie 1, verkregen uit een kweek van cellen waarvan het bedoelde deel der DNA-code door recombinant-DNA-techniek in die cellen gebracht was.

5. Interferon-preparaat volgens conclusie 1, gekenmerkt door een uniek profiel van kruisreactiviteit met een mengsel van sera tegen α-interferon en (3-interferon, zodanig dat tweemaal zoveel van dit interferon geneutraliseerd wordt door het mengsel als door het serum tegen g-interferon 30 alleen, betrokken op gelijke hoeveelheden neutraliserend vermogen.

6. Werkwijze voor het bereiden van een interferon-preparaat, waarbij men A) levende cellen dieeen deel van de DNA-code van menselijke 35 epitheelcellen bevatten, kweekt, B) die cellen in één medium incubeert onder omstandigheden die 8302484 s > -- —.......'f' de vorming van interferon begunstigen, en C) men een aan dat interferon rijke fractie uit die cellen oogst, met het kenmerk, dat dit interferon 5 i) bij pH 2 stabiel is, ii) anti-virale werking heeft die door proteolytische enzymen vernietigd wordt, iii) geen kruisxeactiviteit vertoont met antilichamen tegen α-interferon of γ-interferon, en JO iv) in MDBK-rundemiercellen antivirale werking vertoont die een | tot een \ van zijn werking in menselijke trichosoma fibroblasten (GM-2767) is.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men menselijke epitheelcellen kweekt en vooraf- 15 gaande aan stap B) een virus gebruikt om in die cellen de vorming van interferon te induceren,

8. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men getransformeerde eukaryotische cellen kweekt.

9. Werkwijze volgens conclusie 6, 7 of 8, 20 met het kenmerk, dat men cellen kweekt waarvan het bedoelde deel der DNA-code door recombinant-DNA-techniek in die cellen gebracht was.

10. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het voor induceren gebruikte virus het Newcastle

25 Disease virus of het Sendai-virus was.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het voor induceren gebruikte virus de Bankowski-stam van Newcastle Disease virus was.

12. Werkwijze volgens conclusie 7, met het 3Q kenmerk, dat men bij het kweken van menselijke epitheelcellen uitging van cellen uit dé epidermis, de conjunctiva, de vagina en/of de slokdarm.

13. Werkwijze in hoofdzaak volgens beschrijving en/of voorbeelden.

14. Preparaat in hoofdzaak volgens beschrij ving en/of voorbeelden, 3302484