JP2632849B2

JP2632849B2 - γ―インターフェロンの製造方法

Info

Publication number: JP2632849B2
Application number: JP62125777A
Authority: JP
Inventors: 雅司栗本; 正和三橋
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1986-07-25
Filing date: 1987-05-25
Publication date: 1997-07-23
Anticipated expiration: 2012-07-23
Also published as: IN165716B; JPS63152993A; KR970002165B1; KR880001806A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、γ−インターフェロンの製造方法に関す
る。

（従来の技術）インターフェロンは、小林茂保著「インターフェロ
ン」1975年株式会社講談社発行、D.A.J.Tyrrell著「I
nterferon and Its Clinical Potential」1976年Willia
m Heinemann Medical Books Ltd.（London）発行、「蛋
白質核酸酵素Vol.21No.4」1976年などにも記載され
ているように、例えば、ウィルス、細菌、原虫、リケッ
チャ、核酸、エンドトキシン、多糖類などのインターフ
ェロン誘導剤を生細胞に作用させることによって、その
細胞内外に誘導生成される糖蛋白質であって、その細胞
内での各種ウィルスの増殖を非特異的に抑制する機能を
持つ物質に与えられた名称である。

インターフェロンの持つこのような機能から、インタ
ーフェロンは、その発見の当初よりウィルス性疾患の予
防剤、治療剤として期待されてきた。また、近年インタ
ーフェロンは、ウィルス性腫瘍のみならず、非ウィルス
性腫瘍に対しても抗腫瘍性が認められるようになって、
医薬品としてのインターフェロンが鶴首されるに至っ
た。

インターフェロンには、α−インターフェロン（別
名、白血球インターフェロン）、β−インターフェロン
（別名、繊維芽細胞インターフェロン）およびγ−イン
ターフェロン（別名、免疫インターフェロン、タイプII
インターフェロン）があり、この内α−インターフェロ
ンについては白血球などから、β−インターフェロンに
ついては繊維芽細胞などからの製造方法が確立され、最
近、これらを利用した医薬品が市販されるまでに至っ
た。一方、γ−インターフェロンについては、多数の製
造方法が提案されているもののいずれも未だ工業的に実
施されるに至っていない。

例えば、特開昭57−58891号公報、特表昭57−500961
号公報、特表昭58−502032号公報、特開昭59−82092号
公報、特開昭60−70099号公報、特開昭60−87300号公
報、特開昭60−139700号公報、特開昭60−149600号公報
などで提案されているヒト末梢血からの白血球またはＴ
−リンパ球を用いる方法は、原料の細胞を安定して大量
に供給することが困難であり、また細胞当りの産生量も
不充分である。

また、特開昭55−98118号公報で提案されている方法
は、培養株化されたヒト由来の細胞をヒト以外の温血動
物の体内に移植するか、またはヒト以外の温血動物の体
内もしくは体外に取り付けた拡散チャンバー内で、その
温血動物の体液の供給を受けながら増殖させ、得られる
ヒト由来の細胞を用いてγ−インターフェロンを製造す
る方法であり、原料のヒト由来の細胞を大量に安定して
供給できる点できわめて優れている。

しかしながら、この方法については、培養株化された
ヒト由来の細胞の違いによって、γ−インターフェロン
産生能に変動のあることが判明し、安定して高活性のγ
−インターフェロンを製造するにはなお改良の必要があ
り、未だ工業的に実施するに至っていない。

γ−インターフェロンは、細胞増殖抑制作用、抗腫瘍
作用がα−インターフェロン、β−インターフェロンよ
りも著しく強く、また、α−インターフェロン、β−イ
ンターフェロンなどと併用することにより、これらの抗
ウィルス作用、細胞増殖抑制作用、抗腫瘍作用などを増
強することが知られており、その工業的製造方法の確立
が強く望まれている。

（発明が解決しようとする問題点）本発明者等は、工業的規模で容易に実施しうるγ−イ
ンターフェロンの製造方法を確立することを目的に、培
養株化された各種ヒト由来の細胞、とりわけ、培養株化
された各種ヒト由来リンパ芽球様細胞のγ−インターフ
ェロン産生能について比較研究を続け、更に、そのγ−
インターフェロンがγ−インターフェロン感受性疾患の
予防剤および治療剤として有用であるか否かを鋭意研究
した。

その結果、意外にも、培養株化されたヒト由来の骨髄
単球系細胞が、他のリンパ芽球様細胞とは違って、高い
γ−インターフェロン産生能を有し、γ−インターフェ
ロン製造用細胞として好適であることを見いだし、更
に、その骨髄単球系細胞から得られたγ−インターフェ
ロンがγ−インターフェロン感受性疾患の予防剤、治療
剤として優れていることを確認して本発明を完成した。

本発明でいう培養株化されたヒト由来の骨髄単球系細
胞とは、岩波書店発行、岸本忠三、渡辺武編、「岩波講
座免疫科学３、免疫担当細胞」第181〜204頁（昭和61
年）およびMikio Shikita and Isao Yamane著「Mammali
an Cell Culture Technology」第141〜162頁1985年Soft
Science Publications,Tokyo,Japanなどに記載されて
いるように、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞に属さない細胞であっ
て、抗原抗体反応により骨髄単球系抗原（Myelomonocyt
e antigen）の存在を示すことで同定される細胞を云
う。

例えば、本発明者等が新たに樹立したHBL−38細胞、
前述の引用文献に記載されているHL−60、KG−１、ML−
１、ML−２、ML−３、THP−１、Ｕ−937、更には、Gann
Vol.75第660〜664頁1984年で報告されているCTV−１な
どが適宜利用できるが、とりわけ、HBL−38細胞のγ−
インターフェロン産生能は高く、本発明の実施に有利に
利用できる。

また、これら細胞のγ−インターフェロン産生能を持
つ遺伝子を、例えば、ポリエチレングリコールやセンダ
イウィルスなどを利用する細胞融合の手段やDNAリカー
ゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、DNAポリメラーゼなど
の酵素を利用する公知の遺伝子組換えの手段などによっ
て、より容易に継代培養しうる培養株化された細胞に導
入してその増殖速度を更に高めることも、また、そのγ
−インターフェロン産生能を更に高めることも有利に実
施できる。

本発明で使用する培養株化されたヒト由来の骨髄単球
系細胞を増殖させる方法は、適宜に選択することができ
る。例えば、γ−インターフェロン産生能を有するヒト
由来の骨髄単球系細胞を栄養培地に接種して増殖させる
生体外で行なう組織培養法や、γ−インターフェロン産
生能を有するヒト由来の骨髄単球系細胞をヒト以外の温
血動物の体内に移植するか、または、ヒト以外の温血動
物の体内もしくは体外に取り付けた拡散チャンバー内に
移植して、その体液の供給を受けながら増殖させる生体
内で行なう方法などである。

まず、生体外で増殖させる場合について説明する。

この際使用する栄養培地は、ヒト由来の骨髄単球系細
胞を接種して増殖しうるものであればよく、例えば、RP
MI1640培地、イーグル最少基本培地などがあり、必要に
応じて、更に、ビタミン、ミネラル、炭水化物、アミノ
酸および哺乳類の血清などを補足して改良することもで
きる。

培養方法は、単層培養法または浮遊培養法が適宜選択
できる。

培養温度は、約20〜40℃、好ましくは約35〜38℃、接
種量は、接種後約１週間で最大細胞発育をみることがで
きるような培地ml当りの細胞数であって、好ましくは培
地ml当り約10⁴〜10⁷個である。

細胞を接種した培地を上記条件で約４〜10日間培養
し、この間培地を定期的に新鮮なものと取り替えて栄養
物を充分補給するとともに、培地中に放出された代謝産
物を洗浄または希釈して増殖させるのが望ましい。

次に、生体内で細胞を増殖させる方法について説明す
る。

この方法では、γ−インターフェロン産生能を有する
ヒト由来の骨髄単球系細胞をヒト以外の温血動物体内に
移植するか、または、その体液の供給を受けることので
きるチャンバー内に収容し、通常の飼育をすれば、温血
動物の体内から供給される栄養物を含有する体液を利用
してその細胞が容易に増殖しうることから、インビトロ
における組織培養のように高価な血清などを含む栄養培
地を使わずして、または大幅に節約しても大量のγ−イ
ンターフェロンを生成させることができる。

すなわち、ヒト以外の温血動物を利用する方法は、細
胞増殖中の維持管理が容易なことはもとより、インビト
ロで培養する場合と比較して細胞の増殖が安定している
こと、加うるに細胞当りのγ−インターフェロン産生量
が増大すること、とりわけ２〜10倍、またはそれ以上に
も高まるのできわめて有利である。

この方法に使用する温血動物は、ヒト由来の骨髄単球
系細胞が増殖し得るものであればよく、例えば、ニワト
リ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ブタ、
ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスタ
ー、普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳類などが使用
できる。

これら動物にヒト由来の骨髄単球系細胞を移植すると
好ましくない免疫反応を起すおそれがあるので、その反
応をできるだけおさえるために使用する動物は、できる
だけ幼若な状態、即ち卵、胚、胎児、または新生期、幼
少期のものの方が好ましい。

また、これら動物に、例えば、約200〜600レム程度の
エックス線若しくはガンマ線を照射するか、または、抗
血清若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処置を
ほどこして、免疫反応を弱めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウスの場合には、成長したも
のであっても免疫反応が弱いので、これらの前処置を必
要とすることなく、培養株化されたヒト由来の骨髄単球
系細胞が移植でき、急速に増殖できるので特に好都合で
ある。

また、培養株化されたヒト由来の骨髄単球系細胞を、
例えば、先ずハムスターに移植して増殖させた後、この
細胞を更にヌードマウスに移植するなどのように、ヒト
以外の温血動物間で移植して、ヒト由来の骨髄単球系細
胞の増殖をより安定化したり、更にそれらから誘導生成
されるγ−インターフェロン量を増加させることも自由
である。

この場合、同属間、同網間は勿論のこと、同鋼間、同
門間移植であってもよい。ヒト由来の骨髄単球系細胞を
移植する動物体内の部位は、移植した細胞が増殖し得る
部位であればよく、例えば、尿液腔、静脈、腹腔、皮下
などが自由に選ばれる。

また、直接動物体内にヒト由来の骨髄単球系細胞を移
植することなく、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の
濾過膜、例えば、孔径約10^-7〜10^-5mを有するメンブラ
ンフイルター、限外濾過膜またはホローフアイバーなど
を設けた公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動
物体内、例えば、腹腔内に埋設して、動物体からの栄養
物を含む体液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で前
述の培養株化されたヒト由来の骨髄単球系細胞を何れも
増殖させることができる。

また、必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含
む溶液を動物体内の体液と接続し灌流させるようにした
チャンバーを、例えば、動物体表に取付け、チャンバー
内のヒト由来の骨髄単球系細胞の増殖状態を透視できる
ようにすることも、また、このチャンバー部分のみを着
脱交換できるようにして、動物を屠殺せずに寿命一杯細
胞を増殖させ、動物個体当りの細胞生産量を更に高める
こともできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来
の骨髄単球系細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒ
ト由来の骨髄単球系細胞のみが容易に採取できるだけで
はなく、好ましくない免疫反応を起す心配も少ないの
で、免疫反応を抑制する前処置の必要もなく、各種温血
動物を自由に利用できる特徴を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育を
続ければよく、移植後と言えども特別の取扱いは何ら必
要としないので好都合である。

ヒト由来の骨髄単球系細胞を増殖させるための期間は
通常約１〜10週の期間で目的を達成することができる。

このようにして得られるヒト由来の骨髄単球系細胞数
は、動物個体当り約10⁷〜10¹²、またはそれ以上に達す
る。

換言すれば、ヒト以外の温血動物を利用する方法によ
り増殖させたヒト由来の骨髄単球系細胞数は、動物個体
当り移植した細胞数の約10²〜10⁷倍、またはそれ以上に
も達し、生体外の栄養培地に接種して増殖させる場合の
約10¹〜10⁶倍、またはそれ以上にも達して、γ−インタ
ーフェロンの製造のため極めて好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来の骨髄単球系生細
胞を用いてγ−インターフェロンを産生させる方法は自
由である。それが増殖した動物体内のままで、γ−イン
ターフェロン誘導剤を作用させることもできる。例え
ば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来の骨髄単
球系細胞に、または皮下に生じた腫瘍細胞に、γ−イン
ターフェロン誘導剤を直接作用させてγ−インターフェ
ロンを誘導生成させ、次いで、その腹水または腫瘍から
γ−インターフェロンを精製し採取すればよい。

また、ヒト由来の骨髄単球系細胞を動物体内から取り
出し、生体外でγ−インターフェロン誘導剤を作用させ
てγ−インターフェロンを誘導生成させることもでき
る。例えば、腹水中で増殖したヒト由来の骨髄単球系細
胞を分取し、または皮下に生じたヒト由来の骨髄単球系
細胞を含む腫瘍を摘出、分散し、得られる細胞を約20〜
40℃に保った栄養培地に細胞濃度が約10⁵〜10⁸/mlにな
るように浮遊させ、これにγ−インターフェロン誘導剤
を作用させることによってγ−インターフェロンを誘導
生成させ、これを精製し採取すればよい。

更に、ヒト由来の骨髄単球系細胞を拡散チャンバー内
で増殖させた場合には、増殖させた細胞をチャンバー内
のままで、またはチャンバーから取り出して、γ−イン
ターフェロンを誘導生成させることもできる。

また、γ−インターフェロンの誘導生成に際して、必
要ならば、例えば、ヒトに種特異性の高いインターフェ
ロンを用いてプライミング処理をしたり、代謝阻害剤を
使用するスーパーインダクション法などの公知の方法を
採用することによって、生成するγ−インターフェロン
量を更に高めることも自由である。

また、例えば、増殖させたヒト由来の骨髄単球系細胞
に、先ず動物体内のままでγ−インターフェロンを誘導
生成させた後、次いで同一動物個体の特定の部位または
全体から採取したヒト由来の骨髄単球系細胞に、動物体
外でγ−インターフェロンを誘導生成させる方法、ま
た、一度γ−インターフェロンの誘導生成に使用した細
胞を、更に２度以上γ−インターフェロンの誘導生成に
使用する方法、または、動物体内に埋設、若しくは接続
するチャンバーを交換して、得られる細胞数を増加させ
る方法などの方法によって、使用する動物個体当りのγ
−インターフェロン生成量を更に高めることも自由であ
る。

γ−インターフェロン誘導剤としては、通常、例えば
フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、ポークウィ
ードミトーゲン、リポポリサッカリド、リピドＡ、エン
ドトキシン、多糖類、細菌などのミトーゲンが好適であ
る。

また、感作化された細胞にとっては、抗原もγ−イン
ターフェロン誘導剤である。これらγ−インターフェロ
ン誘導剤を用いる場合には、通常約0.001μｇ〜10mg/ml
の濃度で使用される。必要ならば、例えば、ウィルス、
核酸、ポリヌクレオチドなどのα−インターフェロン誘
導剤を併用して、γ−インターフェロン量を更に増加さ
せることも、α−インターフェロンとγ−インターフェ
ロンとを同時に生成させることも自由である。

このようにして誘導生成させたγ−インターフェロン
は、公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠
心分離、濃縮、凍結乾燥などを行うことによって容易に
精製分離し、採取することができる。更に、高度の精製
を必要とする場合には、例えば、イオン交換体への吸着
・溶出、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、
等電点分画、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動な
どの公知の方法を更に組み合せればよく、とりわけ、モ
ノクローナル抗体を利用したクロマトグラフィーなどに
より、最高純度のγ−インターフェロンを採取すること
も可能である。

このようにして得られたγ−インターフェロンは、γ
−インターフェロン感受性疾患の予防剤、治療剤などと
して有利に利用できる。

γ−インターフェロン感受性疾患とは、γ−インター
フェロンによって予防され、若しくは治療される疾患で
あり、それがウィルス性疾患、例えば、流行性血膜炎、
ヘルペス性角膜炎、インフルエンザ、風疹、血清肝炎、
エイズなどであっても、また、非ウィルス性疾患、例え
ば、大腸癌、肺癌、肝癌、骨肉腫などの悪性腫瘍、更に
は、アトピー性アレルギー、重症筋無力症、膠原病、悪
性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマドーデスなどの
免疫疾患などであってもよい。

また、γ−インターフェロン感受性疾患予防剤、若し
くは治療剤は、その目的に応じてその形状を自由に選択
できる。その一例を上げれば、噴霧剤、点眼剤、うがい
剤、注射剤などの液剤、軟膏のようなペースト剤、粉
剤、顆粒剤、錠剤などの固剤などである。

これら予防剤、治療剤には、γ−インターフェロン
を、通常、グラム当り１〜10,000,000単位程度の活性を
含有せしめればよく、必要に応じてγ−インターフェロ
ンとともに他のリンホカイン、例えば、α−インターフ
ェロン、β−インターフェロン、ツモアネクロシス
ファクター、リンホトキシン、インターロイキン２、Ｂ
細胞分化因子などのγ−インターフェロン以外のリンホ
カイン、更には、他の天然または合成化学治療剤などの
１種または２種以上を有効成分として含有せしめ、その
予防、治療効果を更に高めることも有利に実施できる。

更に必要ならば、補助剤、増量剤、安定剤などの１種
または２種以上を併用することも随意である。このよう
にして製造される本発明のγ−インターフェロン感受性
疾患の予防剤、治療剤は、例えば、抗ウィルス剤、抗腫
瘍剤として、また、抗腫瘍性化学療法剤の抗腫瘍効果増
強剤、悪性腫瘍の転移抑制、再発防止剤、免疫調節剤、
免疫疾患治療剤などとして有利に利用できる。

ヒトに種特異性の高いインターフェロンの活性は、
「蛋白質核酸酵素 Vol.20 No.6」第616〜643頁197
5年に報告されているヒト羊膜由来のFL細胞を使用し
て、公知のプラーク半減法で測定した。

なお、γ−インターフェロンの活性は、抗α−インタ
ーフェロン抗体及び抗β−インターフェロン抗体を共存
させて、α−インターフェロン及びβ−インターフェロ
ンを中和後、測定した。

赤血球凝集価は、J.E.Salk著「The Journal of Immun
ology Vol.49」第87頁 1944年の方法に準じて測定し
た。

以下、本発明で新たに樹立した骨髄単球系細胞HBL−3
8について説明する。

急性骨髄性白血病患者（男性55才）からの白血球細胞
をin vitroで栄養培地に培養した結果、21日後に細胞の
増殖が認められた。それを継代培養し、このうちの１種
類を安定して増殖させることに成功し、これをHBL−38
と命名した。

（１）増殖能牛胎児活性10v/v％を加えたRPMI 1640培地での増殖
能を測定したところ、倍加時間は約30時間であった。

（２）形態増殖時に、フラスコの底面に付着する性質を有してい
たが、付着性は弱く、すぐ遊離した。また、増殖時に細
胞集塊の形成もみられたが、強固なものではなく、軽く
触れると容易に単一細胞に分散された。この細胞を、位
相差顕微鏡で観察した結果を第１図に示した。細胞の形
態は、約15μｍの単一なほぼ円形をしていた。ギムザ染
色を行なった結果、核は円形のものの他に、不規則な切
込みや分葉傾向を示すものも認められた。

（３）染色体数染色体の分析には、対数増殖期の細胞を使用した。染
色体数の頻度分布を、第１表に示した。150個の細胞に
ついて観察した結果、染色体数は低２倍体域にあり、そ
の頻度分布は、45本が最も多く53個であった。また、44
本の細胞も42個認められた。

（４）細胞表面形質各種細胞表面抗体を用いてHBL−38細胞の同定を行な
った結果を、第２表に示した。ヒツジ赤血球（Ｅ）、抗
体感作ウシ赤血球（EA）、ヒト補体感作ウシ赤血球（EA
C）を用いた分析では、EAに10％のロゼット形成がみら
れたが、他のものは認められなかった。ヤギ抗ヒト抗体
を使用して、細胞表面免疫グロブリンの検出を行なった
結果、６種全て陰性であった。また、モノクローナル抗
体を用いた表面マーカーの検索の結果、3A1,MCS−2,B3/
25,MY−９は、高い陽性率を示し、NU−T2,Leu−5,Leu−
4,A−50,BA−2,OKT−1,NU−N1,B2,MO−1,MO−２は、全
て陰性であった。

（５） FBウィルス特異核抗原（EBNA）の検索 EBNAについては、細胞株樹立後、早期より数回にわた
って検索したが、常に陰性であった。

（６）軟寒天培地中でのコロニー形成コロニー形成因子（CSF）を含む0.3％寒天培地中での
コロニー形成を試験し、培養14日目で倒立顕微鏡により
観察した結果、ミエロイド様のコロニーを形成する細胞
が認められた。それらの頻度は、１〜２％であった。コ
ロニー形成因子を加えない場合は、全く造られなかっ
た。

以上の結果より、HBL−38細胞は、骨髄単球系細胞に
属することが判明した。

次に、γ−インターフェロンの産生に関する実験Ｉを
述べる。

実験Ｉ培養株化されたヒト由来の各種リンパ芽球様細
胞のγ−インターフェロン産生能の比較実験Ｉ−１生体外で増殖させた細胞によるインターフ
ェロンの産生牛胎児血清20v/v％を補足したRPMI1640培地（pH7.2）
に、培養株化されたヒト由来の各種細胞をそれぞれに接
種し、37℃で、常法に従って培養し、次いで、血清無添
加のRPMI1640培地（pH7.2）で洗浄し、同培地に濃度１
×10⁶/mlになるように懸濁した。

このようにして得たヒト由来の各種細胞懸濁液それぞ
れに、リポポリサッカリドをml当り約10μｇを添加し、
37℃で、２日間保ってインターフェロンを誘導させ、延
伸分離し、上清を用いてそのml当りのインターフェロン
活性及びγ−インターフェロン活性を測定した。

その結果を、第３表にまとめた。

第３表の結果から明らかなように、培養株化されたヒ
ト由来の各種リンパ芽球様細胞のγ−インターフェロン
産生能を比較したところ、従来、その産生が全く知られ
ていない骨髄単球系細胞からの産生を見いだし、しか
も、その産生量の多いことが判明した。とりわけ、HBL
−38細胞は、γ−インターフェロン産生能が著しく高
く、本発明に有利に利用できる。

実験Ｉ−２生体内で増殖させた細胞によるインターフ
ェロンの産生新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製
した抗血清を予め注射し、ハムスターの免疫を弱めた
後、その皮下に培養株化されたヒト由来の骨髄単球系細
胞をそれぞれ移植して、その後、通常の方法で３週間飼
育した。

皮下に生じた腫瘍を摘出して細切した後、トリプシン
含有の生理食塩水に懸濁して細胞を分散、分取した。

得られたそれぞれの細胞を、実験Ｉ−１と同様に懸濁
液とし、同様に活性を測定した。

その結果を、第４表にまとめた。

第３表および第４表の結果から明らかなように、培養
株化されたヒト由来の骨髄単球系細胞、とりわけ、HBL
−38細胞は、生体外で増殖させた細胞よりも、生体内で
増殖させた細胞の方が、顕著に高いγ−インターフェロ
ン産生量を示すことが判明した。

以下、γ−インターフェロンの製造例を、実施例Ａと
して示す。

実施例Ａ−１ HBL−38細胞を仔牛血清10v/v％を補足したRPMI 1640
培地（pH7.2）に細胞濃度５×10⁵/mlになるよう接種し
た。

その後、常法に従って、定期的に新鮮な培地と取り替
えながら、37℃で培養し、次いで、新鮮な同培地で洗浄
し、同培地に濃度２×10⁶/mlになるよう懸濁した。これ
にリポポリサッカリドをml当り約10μｇ添加し、37℃
で、２日間保ってインターフェロンを誘導させた。これ
を遠心分離し、その上清ml当り、約5,100単位のγ−イ
ンターフェロンを得た。

実施例Ａ−２新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製
した抗血清を予め注射し、ハムスターの免疫反応を弱め
た後、その皮下にHBL−38細胞を移植し、その後、通常
の方法で、４週間飼育した。皮下に生じた約20gの腫瘍
を摘出した後、コラゲナーゼ含有生理食塩水に懸濁し
て、細胞を分散、分取した。

この細胞を、イーグルの最少基本培地で洗浄した後、
37℃に保った同じ組成の培地に、細胞濃度が約２×10⁶/
mlになるように希釈し、これにml当りフィトヘマグルチ
ニン200μｇおよびリピドA5μｇを加え、37℃で、２日
間保ってインターフェロンを誘導させた。これを遠心分
離し、上清ml当り約93,000単位のγ−インターフェロン
を得た。ハムスター１匹当り、約183,000,000単位のγ
−インターフェロンが得られた。

実施例Ａ−３新生児のラットの静脈内へ、KG−１細胞を移植した
後、通常の方法で、４週間飼育した。

皮下に生じた約20gの腫瘍を摘出した後、実施例Ａ−
２と同様にして分散し、細胞懸濁液を得た。これに、ml
当りセンダイウィルス約100赤血球凝集価およびリポポ
リサッカリド約５μｇを加え、37℃で、２日間保ってイ
ンターフェロンを誘導させた。これを遠心分離し、上清
ml当り、約49,000単位のγ−インターフェロンを得た。
ラット１匹当り、約97,000,000単位のγ−インターフェ
ロンが得られた。

実施例Ａ−４孔径約0.5ミクロンのメンブランフィルターを設けた
内容量約10mlのプラスチック製円筒型チャンバー内に、
CTV−１細胞を生理食塩水で浮遊させ、これを成長した
ラットの腹腔内に埋設した。

このラットを、通常の方法で、４週間飼育した後、こ
のチャンバーを取り出した。

この細胞を、実施例Ａ−１と同様に処理してインター
フェロンを誘導させた。これを遠心分離し、上清ml当
り、約41,000単位のγ−インターフェロンを得た。ラッ
ト１匹当り、約78,000,000単位のγ−インターフェロン
が得られた。

実施例Ａ−５ 37℃で、５日間保ったニワトリの受精卵に、HBL−38
細胞を移植した後、37℃で、１週間保った。この卵を割
卵した後、増殖細胞を採取し、その細胞を実施例Ａ−２
と同様に処理してインターフェロンを誘導させた。これ
を遠心分離し、上清ml当り、約36,000単位のγ−インタ
ーフェロンを得た。受精卵10個当り、約60,000,000単位
のγ−インターフェロンが得られた。

次に、抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体の
製造方法と、それを利用した高純度γ−インターフェロ
ンの製造例を、実施例Ｂとして示す。

実施例Ｂ−１（１）部分精製したγ−インターフェロンの調製実施例Ａ−２の方法で調製したγ−インターフェロン
含有溶液を、pH8.5、0.01Mトリス塩酸塩緩衝液で、20時
間透析し、更に精密過して得た液を、抗α−インタ
ーフェロン抗体および抗β−インターフェロン抗体を固
定化している抗体カラムに流し、その非吸着画分を採取
し、更に、これをクロマトフォーカッシング法により抗
ウィルス活性画分を採取し、濃縮、凍結乾燥して、γ−
インターフェロンを含有する粉末を、活性収率約30％で
得た。本品の比活性は、約10⁶単位/mg蛋白質であった。

（２）抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体の
調製（１）の方法で得た部品精製γ−インターフェロン
を、生理食塩水に蛋白質濃度として約0.05w/v％になる
ように溶解し、これとフロイント完全アジュバンド乳化
液とを、等量混合して、この混合液0.2mlをマウスの皮
下に注射し、７日後、再び同様に注射してマウスを免疫
した。その抗体産生能を有する細胞に抗γ−インターフ
ェロン抗体を誘導生成せしめ、このマウスからひ臓を摘
出し、細切分散して得られるひ臓細胞とマウス骨髄腫細
胞P₃−X₆₃−Ag8（Flow Laboratories社製）とを、血清
無含有イーグル最少基本培地で調製した50w/v％ポリエ
チレングリコール−1000溶液（pH7.2、温度37℃）に、
それぞれ10⁴/mlになるように浮遊させて５分間保った
後、前記基本培地で20倍に希釈し、次いでダビソン（Da
vison）などが、ソマティックセルゼネティックス
（Somatic Cell Genetics）,Vol.2,175〜176頁（1976
年）に報告している方法に準じて、ヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン培養液で増殖しうる融合細胞を
採取し、この融合細胞から抗γ−インターフェロン抗体
産生能を有する融合細胞を選択した。得られた融合細胞
を、マウス腹腔内に１匹当り約10⁶個移植して、２週間
飼育した後、これを屠殺して腹水、血液などの体液を集
め、遠心分離し、この上清を硫安塩析して、飽和度30〜
50％の沈澱画分を集め、次いで透析し、更に、この液
を、（１）の方法で得たγ−インターフェロンをプロム
シアン活性化セファロースと室温下で反応させて得られ
る固定化γ−インターフェロンゲルを用いてアフィニテ
ィクロマトグラフィーを行ない、抗γ−インターフェロ
ン抗体画分を得、透析した後、濃縮し、凍結乾燥してγ
−インターフェロンのモノクローナル抗体の粉末を採取
した。

本品は、骨髄単球系細胞由来のヒトγ−インターフェ
ロン活性に対して免疫学的に特異的な中和活性を示し
た。

このモノクローナル抗体の水溶液での安定性を、中和
活性の測定により調べた結果、pH7.2で30分間保持する
条件では、60℃で80％以上の活性が残存し、70℃で90％
以上の活性が失なわれた。また、４℃で16時間保持する
条件で、pH4.0〜11.0の範囲で安定であり、pH2.0では90
％以上の活性が失なわれた。

更に、このモノクローナル抗体の性質を調べた結果、
２−メルカプトエタノールに不安定であり、抗マウスイ
ムノグロブリンＭ抗体と特異的抗原抗体反応を示すこと
が判明した。

従って、このモノクローナル抗体は、イムノグロブリ
ンＭクラスに分類される抗体である。

（３）高純度に精製したγ−インターフェロンの調製（１）の方法で調製した部分調製γ−インターフェロ
ンを、（２）の方法で調製したモノクローナル抗体を固
定化したゲルを用いてカラムクロマトグラフィーを行な
いγ−インターフェロンの活性画分を採取し、透析し、
濃縮して凍結乾燥し、活性収率約80％でγ−インターフ
ェロン固体を得た。本品は、高純度に精製されたγ−イ
ンターフェロンであって、その比活性は約1.5×10⁷単位
/mg蛋白質であった。

実施例Ｂ−２（１）部分精製したγ−インターフェロンの調製実施例Ａ−３の方法で調製したγ−インターフェロン
含有溶液を、実施例Ｂ−１（１）の方法に準じて部分精
製し、比活性約10⁶単位/mg蛋白質のγ−インターフェロ
ンを収率約20％で得た。

（２）抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体の
調製（１）の方法で得た部分精製γ−インターフェロンを
抗原に用いた以外は、実施例Ｂ−１（２）と同様にマウ
スを免疫し、ひ臓細胞を得た。

このひ臓細胞とマウス骨髄腫細胞P3−NS−1/1−Ag4−
１（大日本製薬株式会社製）とを、140mM NaCl,54mM KC
l,1mM NaH₂PO₄,2mM CaCl₂を含有する塩類溶液に、それ
ぞれ10⁴/mlになるように浮遊させ、これに、予じめ紫外
線で不活化したセンダイウィルスを含有する前記塩類溶
液を氷冷下で混合し、この混合液を、５分後に37℃のRP
MI培地で約20倍に希釈し、次いで、実施例Ｂ−１（２）
と同様にして抗γ−インターフェロン抗体産生能を有す
る融合細胞を選択した。

得られた融合細胞を、公知の方法で免疫反応を弱めた
生後７日のハムスターの腹腔内に、１匹当り約10⁷個移
植し、実施例Ｂ−１（２）と同様にしてモノクローナル
抗体を採取した。

本品は、実施例Ｂ−１（２）で調製したモノクローナ
ル抗体と同様に、γ−インターフェロン活性に対し免疫
学的に特異的中和活性を示した。

このモノクローナル抗体の水溶液での安定性を、その
中和活性の測定により調べた結果、pH7.2で30分間保持
する条件では、60℃で80％以上の活性が残存し、70℃で
90％以上の活性が失なわれた。また、４℃で16時間保持
する条件では、pH2.0〜11.0の範囲で安定であった。更
に、このモノクローナル抗体の性質を調べた結果、２−
メルカプトエタノールに安定であり、抗マウスイムノグ
ロブリンＧ抗体と特異的抗原抗体反応を示すことが判明
した。従って、このモノクローナル抗体は、イムノグロ
ブリンＧクラスに分類される抗体である。

（３）高純度に精製したγ−インターフェロンの調製（１）の方法で調製した部分精製γ−インターフェロ
ンを、（２）の方法で調製したモノクローナル抗体を固
定化したゲルを用いてカラムクロマトグラフィーを行な
いγ−インターフェロンの活性画分を採取し、透析、濃
縮して活性収率約85％でγ−インターフェロン溶液を得
た。本品は、高純度に精製されたγ−インターフェロン
であって、その比活性は、約1.5×10⁷単位/mg蛋白質で
あった。

実施例Ｂ−３実施例Ａ−１の方法で得られたγ−インターフェロン
を含有する上清を、pH7.2、0.01Mリン酸塩緩衝液を含有
する生理食塩水で15時間透析し、更に精密過して得ら
れる液を、実施例Ｂ−１（３）の方法に準じて抗体カ
ラムを用いて精製し、濃縮、凍結乾燥して活性収率約75
％でγ−インターフェロン固体を得た。本品は、高純度
に精製されたγ−インターフェロンであって、その比活
性は、約1.5×10⁷単位/mg蛋白質であった。

実施例Ｂ−４実施例Ａ−４の方法で得られたγ−インターフェロン
を含有する上清を、実施例Ｂ−３の方法に準じて透析、
精密過し、得られる液を実施例Ｂ−２（３）の方法
に準じて抗体カラムを用いて精製し、濃縮して、活性収
率約70％でγ−インターフェロン溶液を得た。本品は、
高純度に精製されたγ−インターフェロンであって、そ
の比活性は約1.5×10⁷単位/mg蛋白質であった。

実施例Ｂ−５実施例Ａ−５の方法で得られたγ−インターフェロン
を含有する上清を、実施例Ｂ−３の方法に準じて透析、
精密過し、得られる液を実施例Ｂ−１（３）の方法
に準じて抗体カラムを用いて精製し、濃縮、凍結乾燥し
て、活性収率約70％でγ−インターフェロン固体を得
た。本品は、高純度に精製されたγ−インターフェロン
であって、その比活性は、約1.5×10⁷単位/mg蛋白質で
あった。

次に、γ−インターフェロンによるγ−インターフェ
ロン感受性疾患の予防、治療に関する実験IIを述べる。

実験II γ−インターフェロンによるγ−インターフェ
ロン感受性疾患の予防、治療試験実験II−１ in vitroでのウィルス増殖抑制作用直径6cmのシャーレで単層培養したヒト胎児肺の初代
培養細胞に、実施例Ｂ−１（３）の方法で調製したγ−
インターフェロンを0.1、1.0または10.0単位を添加し、
37℃で、５％炭酸ガスインキュベーター中に20時間保っ
た後、これに、γ−インターフェロン無添加の場合に約
100個のプラーク形成能を有する量のバリセラーゾスタ
ーウィルス（水痘帯状疱疹ウィルス）、またはヒトサイ
トメガロウィルス（死産、早産原因ウィルス）を添加す
ることにより生成するプラーク数を計数した。

ウィルス増殖抑制作用は、γ−インターフェロンによ
るプラーク数減少率の大きさで判定した。

A:γ−インターフェロン無添加でのプラーク数 B:γ−インターフェロン添加でのプラーク数その計数した結果を、第５表に示す。

第５表の結果から明らかなように、本発明で使用する
γ−インターフェロンは、ウィルス性疾患を引き起すウ
ィルスの増殖をよく抑制していることがわかる。

実験II−２ γ−インターフェロンによる悪性腫瘍の治
療（１） in vitroでのγ−インターフェロンによる悪性
腫瘍細胞増殖抑制作用牛胎児血清15v/v％を含有するRPMI1640培地に、実施
例Ｂ−１（３）の方法で調製したγ−インターフェロン
を最終濃度を５、50、500単位/mlになるように添加し
て、さらに、これにヒト由来の悪性腫瘍細胞を５×10⁵/
mlの濃度になるように接種し、37℃に保った５％炭酸ガ
スインキュベーター中で３日間培養した。対照として
は、100℃に30分間保って熱失活させたγ−インターフ
ェロンを、それぞれ等量になるように添加して、同様に
培養した。培養終了後、「アプライドマイクロバイオ
ロジー（Applied Microbiology）」第22巻、第４号、67
1〜677頁（1971年）に記載されている方法に準じて、染
色剤ニュートラルレッドで生細胞を染色し、続いて、こ
の染色剤をアシドエタノールで溶出し、溶出液の540nm
における吸光度から生細胞量を測定した。

細胞増殖抑制率（％）は、次式から算出した。

A:試験区の生細胞量 B:対照区の生細胞量測定結果を、第６表に示す。

第６表の結果から明らかなように、本発明で使用する
γ−インターフェロンは、KB細胞、HEp−２細胞、KATO
−III細胞、Ｐ−4788細胞などの悪性腫瘍細胞の増殖を
著しく抑制しており、その活性濃度も５〜500単位/mlで
有効であることがわかる。

（２） in vitroでのγ−インターフェロンによる他の
リンホカインの悪性腫瘍増殖抑制作用の増強効果使用したリンホカインとしては、γ−インターフェロ
ンを５単位/ml、α−インターフェロンを50単位/ml、お
よびツモアネクロシスファクターを10単位/ml使用
した。これらのリンホカインは、いずれもリンパ芽球様
細胞由来の天然型のものを使用した。

実験方法は、（１）の方法に準じて行ない、細胞増殖
抑制率（％）を求めた。結果は、第７表に示す。

第７表の結果から明らかなように、γ−インターフェ
ロンは、他のリンホカインの持つ悪性腫瘍増殖抑制作用
を著しく増強し、その作用は、γ−インターフェロンの
持つその抑制作用と相乗効果を示す。

（３） in vitroでのγ−インターフェロンによる化
学療法剤の悪性腫瘍増殖抑制作用の増強効果（１）の方法に準じて調製した栄養培地1mlにヒト由
来の悪性腫瘍細胞を10⁶個ずつとり、１日培養した後、
これに実施例Ｂ−１（３）の方法で調製したγ−インタ
ーフェロンを最終濃度50単位及び／または化学療法剤を
含有する生理食塩水0.1mlを加え、37℃で、２日間培養
した。対照としては、γ−インターフェロン及び化学療
法剤を含まない生理食塩水を用いた。培養終了後、
（１）の方法に従って、細胞増殖抑制率（％）を求め
た。なお、化学療法剤の濃度は、培養液ml当り、塩酸ニ
ムスチン（ACNU）1.0×10^-6g、フルオロウラシル（５−
FU）1.5×10^-8g、ドキソルビシ（ADM）1.0×10^-10g、マ
イトマイシンＣ（MMC）2.5×10^-9gおよび硫酸ビンクリ
スチン（VCR）1.5×10^-10gとした。

結果を、第８表に示す。

第８表の結果から明らかなように、γ−インターフェ
ロンは、各種化学療法剤の持つ悪性腫瘍増殖抑制作用を
著しく増強し、その作用は、γ−インターフェロンの持
つその抑制作用と相加効果乃至相乗効果を示す。

（４） in vivoでの悪性腫瘍増殖抑制作用 BALB/C由来のヌードマウスにヒト乳癌組織片を背部皮
下に移植し、その腫瘍体積が約200mm³になった時期か
ら、実施例Ｂ−１（３）の方法で調製したγ−インター
フェロンを単独で、またはこのγ−インターフェロンと
リンパ芽球様細胞由来の他のリンホカインおよび化学療
法剤とを併用して、生理食塩水に溶解した状態で、毎日
１回、20日間静脈注射を行った。

その後、ヌードマウスを屠殺して腫瘍の重量を測定し
た。

なお、対照としては、生理食塩水を使用した。結果
を、第９表に示す。

第９表の結果から明らかなように、生体内（in viv
o）の試験においても、γ−インターフェロンは、悪性
腫瘍の増殖を著しく抑制する。また、その増殖抑制作用
は、他のリンホカインや化学療法剤との併用により著し
く増強され、高い抗腫瘍効果を発揮する。

（５）急性毒性試験生後20日のマウスを使用して、実施例Ｂ−１（３）の
方法で得られたγ−インターフェロンの急性毒性試験を
した。

その毒性は極めて低く、腹腔内に注射した時のLD
₅₀は、10⁹単位以上であることが判明した。

以下、本発明のγ−インターフェロンを有効成分とし
て含有せしめた薬剤の製造例を、実施例Ｃとして示す。

実施例Ｃ−１液剤生理食塩水に、実施例Ｂ−１（３）の方法で調製した
γ−インターフェロンをml当り500単位の割合で含有せ
しめて液剤を製造した。

本品は、流行性結膜炎やインフルエンザなどのウィル
ス性疾患の予防剤、治療剤として、噴霧用、点眼用、点
鼻用、うがい用に好適である。

実施例Ｃ−２注射剤生理食塩水に、実施例Ｂ−２（３）の方法で調製した
γ−インターフェロンをml当り100,000単位の割合で含
有せしめ、これを無菌的に過し、得られる液を滅菌
したガラス容器に2mlずつ採り、凍結乾燥して密栓し、
乾燥注射剤を得た。本品は、実施例Ｃ−１の場合と同様
にウィルス性疾患の予防剤、治療剤として有利に利用で
きる。

また、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの悪性腫瘍の予
防剤、治療剤として、また、アトピー性アレルギー、悪
性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなどの
免疫疾患の予防剤、治療剤としても好適である。

更に、メルファラン、メソトレキサート、ドキソルビ
シンなどの化学療法剤の抗腫瘍効果増強剤として利用す
ることも好都合である。

実施例Ｃ−３注射剤生理食塩水に、実施例Ｂ−３の方法で調製したγ−イ
ンターフェロン、リンパ芽球様細胞由来の天然型α−イ
ンターフェロンおよびリンパ芽球様細胞由来の天然型ツ
モアネクロシスファクターを、ml当りそれぞれ、1
0,000単位、100,000単位および100,000単位の割合で含
有せしめ、これを無菌的に過し、実施例Ｃ−２と同様
に凍結乾燥して乾燥注射剤を得た。

本品は、各種ウィルス性疾患の予防剤、治療剤として
好適である。

また、乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、白血病などの各種悪
性腫瘍の予防剤、治療剤として、また、アトピー性アレ
ルギー、膠原病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデ
スなどの免疫疾患の予防剤、治療剤としても好適であ
る。

更に、テガフール、マイトマイシンＣ、硫酸ビンクリ
スチンなどの化学療法剤の抗腫瘍効果増強剤として利用
することも好都合である。

実施例Ｃ−４軟膏剤実施例Ｂ−１（３）の方法で調製したγ−インターフ
ェロンおよびリンパ芽球様細胞由来の天然型α−インタ
ーフェロンを、常法に従い少量の流動パラフィンに研和
した後、製品グラム当りγ−インターフェロンおよびα
−インターフェロンがそれぞれ50,000単位および500,00
0単位になるようワセリンを加えて混合し、軟膏剤を得
た。

本品は、ヘルペス、皮膚癌、アトピー性皮膚炎などの
各種皮膚疾患の予防剤、治療剤として好適である。

実施例Ｃ−５腸溶性錠剤常法に従って、澱粉とマルトースとを基材として錠剤
を製造するに際し、実施例Ｂ−５の方法で調製したγ−
インターフェロンおよびリンパ芽球様細胞由来の天然型
ツモアネクロシスファクターを、１錠（200mg）当
り10,000単位ずつ含有せしめて錠剤を製造し、これにメ
チルセルロースフタレートをコーティングして腸溶性
錠剤を得た。

本品は、小腸、大腸などのウィルス性疾患の予防剤、
治療剤として有利に利用できる。

また、大腸癌、結腸癌、肝癌などの予防剤、治療剤と
して、また、アトピー性アレルギー、重症筋無力症、関
節リウマチ、全身性エリテマトーデスなどの免疫疾患の
治療剤、予防剤としても有利に利用できる。

更に、ドキソルビシン、フルオロウラシル、マイトマ
イシンＣなどの化学療法剤の抗腫瘍効果増強剤として利
用することも好都合である。

（発明の効果）本文で詳記したように、従来、γ−インターフェロン
は、その産生量が不充分で、工業的に製造することはき
わめて困難であった。これに対し、本発明は、培養株化
されたヒト由来の骨髄単球系細胞が、γ−インターフェ
ロン産生能の著しく大きいことを見いだし、該細胞を用
いるγ−インターフェロンとその大量製造方法を確立す
るものである。

また、このγ−インターフェロンを抗原としたモノク
ローナル抗体の製造方法と、その抗体による精製方法を
確立し、得られたγ−インターフェロンを有効成分とし
て含有せしめγ−インターフェロン感受性疾患の予防
剤、治療剤を完成するものである。この予防剤、治療剤
は、従来治療が困難とされているウィルス病、悪性腫
瘍、免疫疾患などの予防剤、治療剤として著効を示す。

本発明の産業的意義はきわめて大きい。

【図面の簡単な説明】

図において、第１図は、HBL−38細胞の位相差顕微鏡写
真を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】γ−インターフェロン産生能を有する培養
株化されたヒト由来の骨髄単球系細胞を用いてγ−イン
ターフェロンを産生せしめ、産生されたγ−インターフ
ェロンを採取することを特徴とするγ−インターフェロ
ンの製造方法。
【請求項２】骨髄単球系細胞が、ヒト以外の温血動物体
内に移植させるか、またはヒト以外の温血動物体内もし
くは体外に取り付けた拡散チャンバー内に移植されて、
その温血動物の体液を受けながら増殖して得られる細胞
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のγ
−インターフェロンの製造方法。
【請求項３】γ−インターフェロンの産生に際し、γ−
ンターフェロン産生能を有する培養株化されたヒト由来
の骨髄単球系細胞に誘導剤を接触させることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項または第２項記載のγ−インタ
ーフェロンの製造方法。
【請求項４】骨髄単球系細胞が、HBL−38、HL−60、KG
−１、ML−１、ML−２、ML−３、THP−１、Ｕ−937およ
びCTV−１から選ばれる細胞であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項、第２項または第３項記載のγ−イ
ンターフェロンの製造方法。
【請求項５】γ−インターフェロンを採取するに際し、
γ−インターフェロンに特異性を示すモノクローナル抗
体を用いてγ−インターフェロンを採取することを特徴
とする特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第
４項記載のγ−インターフェロンの製造方法。
【請求項６】モノクローナル抗体が、イムノグロブリン
ＧクラスまたはイムノグロブリンＭクラスであることを
特徴とする特許請求の範囲第５項記載のγ−インターフ
ェロンの製造方法。