DE3752184T2

DE3752184T2 - Herstellung und Verwendungen von gamma-Interferon

Info

Publication number: DE3752184T2
Application number: DE3752184T
Authority: DE
Inventors: Masashi Kurimoio; Masakazu Mitsuhashi
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1986-07-25
Filing date: 1987-07-24
Publication date: 1998-10-29
Anticipated expiration: 2007-07-25
Also published as: NO173144C; AU605492B2; FR2615737A1; DE3752184D1; EP0254593A3; GB2194240B; NO873120D0; NO173144B; CA1340698C; NO873120L; EP0254593A2; AU7610587A; DK388787A; ES2115582T3; FR2615737B1; GB8717610D0; GB2194240A; FI873237A0; FI873237A; EP0254593B1

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendungen von gamma-Interferon.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von gamma-Interferon, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen etablierten menschlichen Myelomonocyt, der gamma-Interferon produzieren kann, gamma- Interferon produzieren läßt und die Ansammlung gewinnt; ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen anti-gamma- Interferon-Antikörpers unter Verwendung desselben; und ein Verfahren zur Reinigung von gamma-Interferon unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers und auch ein prophylaktisches und therapeutisches Mittel für gamma-Interferon ansprechende Erkrankungen, die als wirksamen Bestandteil gamma-Interferon enthalten.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Nach den Beschreibungen in Shigeyasu Kobayski, "Interferon", veröffentlicht von Kodansha Co., Ltd., Tokyo, Japan (1975), D.A.J. Tyrell, "Interferon and its Clinical Potential"; veröffentlicht von William Heinemann Midecal Books Ltd., London (1976), und Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Bd. 21, Nr. 4, Seiten 245-333 (1976) ist Interferon ein Name, um Glycoproteine zu bezeichnen, die extrazellulär in einer lebenden Zelle induzierbar sind, indem es der Wirkung eines Interferon- Induktionsmittels, zum Beispiel eines Virus, Bakteriums, Protozoons, Rickettsia, Nukleinsäure, Endoxins und Polysaccharids aussetzt, und welches eine Wirkung aufweist, Viruswachstum nicht spezifisch zu inhibieren.
Diese Aktivität hat Interferon zu einem prophylaktischen und therapeutischen Mittel für Viruserkrankungen gemacht. Jüngste Studien haben ergeben, daß Interferone eine antionkotische Wirkung auf Virustumore und auch auf Nichtvirustumore ausübt. Wegen dieser Wirkung werden große Erwartungen in die Entwicklung von Pharmazeutika mit Interferonen gesetzt.
Zu Interferonen zählen alpha-Interferon (oder Leukocyt- Interferon), beta-Interferon (oder Fibroplast-Interferon) und gamma-Interferon (oder Immuninterferon). Die Herstellung von alpha-Interferon und beta-Interferon wird unter Verwendung von Leukocyten und Fibroplastzellen durchgeführt. Erst kürzlich sind Pharmazeutika, die diese Interferone enthalten, auf den Markt gebracht worden.
Das jeweilige Interferon wird nachfolgend als "alpha-IFN", "beta-IFN" und "gamma-IFN" abgekürzt und gelegentlich mit der Vorsilbe "Hu" versehen, was den menschlichen Ursprung zeigen soll.
Obwohl verschiedene Methoden zur Herstellung von gamma-HuIFN vorgeschlagen worden sind, ist bisher noch keine Methode im industriellen Ausmaß in die Praxis umgesetzt worden.
Die Methode unter Verwendung von Leukocyten oder T-Lymphocyten aus dem menschlichen peripheren Blut, wie beispielsweise in den japanischen Patentoffenlegungsschriften 58,891/82, 82,092/84, 70,099/85, 87,300/85, 139,700/85 und 149,600/85, in den internationalen Patentveröffentlichungen in japanisch 500, 961/82 und 502,032/83 beschrieben, sind in der Praxis ungeeignet, weil eine ausreichende Bereitstellung der Materialzelle sehr schwierig ist und das HuIFN-Produktionsvermögen dieser Zellen unzureichend ist.
Die japanische Offenlegungsschrift 98,118/80 schlägt ein Verfahren vor, worin eine menschliche Zelle bei der Herstellung von gamma-HuIFN verwendet wird, welche erhalten wird, indem man eine etablierte menschliche Zelle in ein nicht menschliches Warmbluttier implantiert oder die Zelle in eine Diffusionskammer, die innerhalb oder außerhalb des Körpers eines nicht menschlichen Warmbluttiers vorgesehen ist, eingibt und die Zelle proliferieren läßt, während es der Zelle ermöglicht wird, die Nährstoffkörperflüssigkeit aus dem Tier zu erhalten. Diese Methode ist dadurch charakterisiert, daß für eine ausreichende Versorgung der menschlichen Materialzelle gesorgt wird.
Wir haben festgestellt, daß das gamma-HuIFN-Produktionsvermögen des Verfahrens je nach Typ der verwendeten menschlichen Zelle variiert. Demzufolge hat die Methode Raum für die Verbesserung bei der konsequenten Herstellung von gamma-HuIFN mit einem hohen Titer, um somit im industriellen Ausmaß praktikabel zu sein.
Es ist bekannt, daß gamma-HuIFN sehr viel stärkere cytostatische und antionkotische Wirkungen als alpha-HuIFN und beta- HuIFN aufweist. Es ist ebenfalls bekannt, daß die Kombination mit alpha-HuIFN und/oder beta-HuIFN die antiviralen, cytostatischen und antionkotischen Wirkungen des gamma-HuIFN verstärkt. Aus diesen Gründen besteht ein Bedarf hinsichtlich der Entwicklung der Herstellung von gamma-HuIFN in industriellem Ausmaß.

Zusammenfassung der Erfindung

Im Hinblick auf das vorstehend gesagte, haben wir verschiedene etablierte menschliche Zellen, insbesondere etablierte menschliche Lymphoplastoidzellen auf ihr gamma-HuIFN- Produktionsvermögen, welche die Herstellung von gamma-HuIFN in industriellem Ausmaß erleichtern kann, untersucht, wobei ebenfalls die Verwendbarkeit als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für gamma-HuIFN ansprechende Erkrankungen untersucht wurde. Im Ergebnis haben wir unerwarteterweise gefunden, daß etablierte menschliche Myelomonocyten ein größeres gamma-HuIFN-Produktionsvermögen als andere Lymphoplastoidzellen ausüben und für eine gamma-HuIFN-Produktionszelle geeignet sind und daß das erhaltene gamma-HuIFN in überlegener Weise wirksam ist, wenn es als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für gamma-HuIFN ansprechende Erkrankungen verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von gamma-Interferon zur Verfügung, bei dem man einen etablierten menschlichen Myelomonocyt, der gamma-Inteferon produzieren kann, gamma-Interferon produzieren läßt und die Ansammlung gewinnt.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein prophylaktisches und therapeutisches Mittel für auf gamma-Interferon ansprechende Erkrankungen zur Verfügung, wobei dieses Mittel als wirksamen Bestandteil 1 - 10.000.000 Einheiten gamma- Interferon pro Gramm Mittel enthält, welches gamma-Interferon nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 erhältlich ist, worin die gamma-Interferon-Aktivität durch die Plaquereduktionsmethode unter Verwendung von FL-Zellen aus dem menschlichen Ammion bestimmt wird und eine Einheit des gamma-Interferons als Menge definiert wird, die eine Plaquereduktionsrate (%) von etwa 50 % ergibt, wenn nach folgender Gleichung berechnet wird:
Plaquereduktionsrate (%) = A - B/A x 100
worin "A" die Plaquezahl ohne Zugabe von gamma- Interferon und "B" diejenige mit Zugabe des gamma- Interferons bedeuten.

Kurze Erklärung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die im Phasenkontrast mikroskopische Ansicht der HBL-38-Zelle.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Karyotypie-Analyse der HBL-38-Zelle.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der Wortlaut "etablierter menschlicher Myelomonocyt" bedeutet solche, die nicht in die T- und B-Zellen gruppiert werden und identifizierbar sind, indem auf das Vorhandensein des myelomonocytischen Antigens durch Antigen-Antikörper-Reaktion untersucht wird. Solche sind beispielsweise in Iwanami Koza Men-eki Kagaku (The Iwanami Immunology Series), Bd. 3, "Immunity responsive cells", herausgegeben von Tadamitsu Kishimoto und Takeshi Watanabe, Seiten 181-204, veröffentlicht von Iwanamishoten Publisher, Tokyo, Japan (1986), und "Mammalian Cell Cluture Technology", geschrieben von Mikio Shikita und Isao .Yamane, Seiten 141-162, veröffentlicht von Soft Sciene Publications, Tokyo, Japan (1985) beschrieben.
Beispiele solcher Myelomonocyten umfassen die von uns etablierte HBL-38-Zelle; die in den obigen Referenzen beschriebenen HL-60-Zelle, KG-1-Zelle, ML-1-Zelle, ML-2-Zelle, ML-3- Zelle, THP-1-Zelle und U-937-Zelle; und die in Japanese Journal of Cancer Research (Gann) Bd. 75, Seiten 660-664 (1984) beschriebene CTV-1-Zelle. Insbesondere ist die HBL-38-Zelle am meisten geeignet zur Durchführung der vorliegenden Erfindung, da sie ein größeres HuIFN-gamma-Produktionsvermögen ausübt. Zur Vergrößerung der Proliferationsrate und des gamma-HuIFN-Produktionsvermögens kann das Gen, das für die gamma-HuIFN-Produktion kodiert, ohne weiteres in eine etablierte menschliche Zelle, die in Subkultur gehalten wird, durch Zellfusion eingeführt werden, wobei zum Beispiel Polyethylenglykol oder der Sendai-Virus verwendet werden oder durch rekombinante Technik unter Verwendung von DNA-Ligase, Restriktionsenzym (Nuklease) und DNA-Polymerase.
Die Proliferationsmethode für den menschlichen Myelomonocyt kann in geeigneter Weise gewählt werden. Beispiele für eine solche Methode umfassen die Gewebekultur, worin ein menschlicher Myelomonocyt auf ein Kulturmedium geimpft wird und in vitro gezüchtet wird; und ein Verfahren, worin der menschliche Myelomonocyt in ein nicht menschliches Warmbluttier oder eine Diffusionsklammer, die sich innerhalb oder außerhalb des Körpers eines nicht menschlichen Warmbluttiers befindet, implantiert wird, welcher dann proliferiert, während er die Nährkörperflüssigkeit vom Tier erhält.

Zunächst wird die in vitro-Proliferation erklärt.

Bei der in vitro-Proliferation kann jedes Nährkulturmedium verwendet werden, soweit der menschliche Myelomonocyt darin proliferiert, wie beispielsweise RPMI 1640-Medium und Eagle's minimal essential medium. Diese Kulturmedien können durch Anreicherung mit Vitamin, Mineral, Kohlenwasserstoff, Aminosäure und/oder Säugetierserum modifiziert werden.
Die Kultur kann eine Monoschicht- oder Suspensionskultur sein. Die Temperatur beträgt etwa 20 - 40ºC, wünschenswerter Weise etwa 35 - 38ºC, und die Impfkultur sollte eine Zellzahl pro ml Kulturmedium haben, die eine maximale Proliferation über einen Zeitraum von etwa einer Woche, vorzugsweise etwa - Zellen/ml Kulturmedium erreicht.
Das Kulturmedium, welches menschliche Myelomonocyten enthält, wird unter diesen Bedingungen für etwa 4 - 10 Tage gezüchtet und während der Züchtung kann das Kulturmedium nach und nach aufgefrischt werden, um ausreichende Mengen an Nährstoffen zu ergänzen und die Metaboliten, die im Kulturmedium freigesetzt worden sind, auszuwaschen und/oder zu verdünnen.
Die in vivo-Proliferation wird nun erklärt.
Menschliche Myelomonocyten können ohne weiteres durch in vivo-Proliferation proliferiert werden, indem man sie in ein nicht menschliches Warmbluttier implantiert oder in eine Diffusionskammer eingibt, in der die Zelle mit der Nährstoffkörperflüssigkeit des Tiers versorgt wird, wobei das Tier in üblicher Weise ernährt wird. Bei der in vivo-Proliferation wird eine größere gamma-HuIFN-Menge ohne oder viel weniger Nährkulturmedium, das teures Serum enthält, als bei der in vitro- Gewebekultur erreicht.
Die in vivo-Proliferation hat den zusätzlichen Vorteil, daß während der Zellproliferation weniger Sorgfalt geboten ist; daß sie die Zellproliferation stabilisiert und daß sie das gamma-HuIFN-Produktionsvermögen pro Zelle, insbesondere um das 2 - 10 fache oder mehr vergrößert.
Die nicht menschlichen Warmbluttiere für die in vivo- Proliferation sind solche, in denen menschliche Myelomonocyten proliferieren, beispielsweise Federvieh, wie Hühner und Tauben und Säugetiere, wie Hund, Katze, Ziege, Schwein, Kuh, Pferd, Kaninchen, Meerschwein, Ratte, Hamster, Maus und Nacktmaus.
Da die Implantation des menschlichen Myelomonocyts eine unerwünschte Immunreaktion im Tier auslösen kann, ist die Verwendung eines Tiers in möglichst jungem Stadium, z. B., Ei, Embryo oder Fötus, oder Neugeborenes oder Kindtier zu verwenden, um die Immunreaktion auf das möglichst niedrigste Niveau zu vermindern.
Für den gleichen Zweck kann das Tier vor der Implantation mit Röntgenstrahlen oder gamma-Strahlen, etwa 200 bis 600 rem bestrahlt werden oder mit einem Antiserum oder einem Immundämpfungsmittel gespritzt werden.
Wenn eine Nacktmaus verwendet wird, kann der menschliche Myelomonocyt ohne Vorbehandlung implantiert werden und ohne weiteres proliferieren, ohne daß befürchtet werden muß, daß eine ungewünschte Reaktion verursacht wird, da die Nacktmaus auch im Erwachsenenstadium weniger Immunreaktionen auslöst.
Man kann die Zellproliferation stabilisieren und/oder die gamma-HuIFN-Produktion vergrößern, indem nachfolgend unter Verwendung desgleichen oder eines anderen nicht menschlichen Warmbluttiers implantiert wird. Dieses kann beispielsweise erreicht werden, indem beispielsweise zunächst ein menschlicher Myelomonocyt in einen Hamster implantiert und proliferiert wird, wonach dann die proliferierte Zelle in der Nacktmaus implantiert wird. Diese Implantation kann mit nicht menschlichen Warmbluttieren gleichen Klasse oder Ordnung und auch mit denjenigen der gleichen Spezies oder Genus durchgeführt werden.
Die menschlichen Myelomonocyten können an jeder Stelle des Tiers implantiert werden, soweit die Zelle an der Stelle proliferiert: beispielsweise in den allantoischen Hohlraum, intravenös, intraperitoneal oder subkutan.
Alternativ kann der menschliche Myelomonocyt proliferiert werden, indem man ihn in eine herkömmliche Diffusionskammer verschiedener Formen und Größen eingibt, welche mit einer geeigneten Vorrichtung ausgerüstet ist, welche die tierische Zelle ausschließt, aber die HBL-38 mit der Nährstoffkörperflüssigkeit von einem nicht menschlichen Warmbluttier versorgt, z. B. ein Membranfilter oder eine Hohlfaser mit einer Porengröße von etwa 10&supmin;&sup7;-10&supmin;&sup5; m, wobei beispielsweise intraperitoneal die Kammer in einem nicht menschlichen Warmbluttier eingebettet ist oder nicht und man die Zelle in der Kammer proliferieren läßt, während es der Zelle ermöglicht wird, die Nährstoffkörperflüssigkeit vom Tier zu erhalten.
Die Diffusionskammer kann beispielsweise auf dem Tier in einer Weise angeordnet oder plaziert sein, daß die Nährstofflüssigkeit in der Diffusionskammer frei dadurch proliferieren kann. Die Diffusionskammer kann inder Weise angeordnet sein, daß die Kultur während der Zellproliferation durch die Kammerwand beobachtet werden kann und/oder daß eine Diffusionskammer in Abständen durch eine frische ersetzt werden kann, um die Zellproliferation über die Lebensspanne des Tiers ohne Tötung fortzuführen und auch um die Zellproduktion pro Tier wesentlich zu erhöhen.
Da bei der Methode mit der Diffusionskammer der menschliche Myelomonocyt niemals mit der Tierzelle in Kontakt kommt und sehr viel weniger unerwünschte Immunreaktionen ausgelöst werden, kann jedes nicht menschliche Warmbluttier ohne Beschränkung und ohne Vorbehandlung verwendet werden, um die Immunreaktion herabzusetzen, so daß die proliferierte Zelle ohne weiteres gewonnen werden kann.
Das Tier wird in üblicher Weise gefüttert und es ist keine besondere Sorgfalt auch nach der Implantation erforderlich. Die Dauer für die maximale Zellproliferation liegt in der Regel von 1 bis 10 Wochen. Die Zahl der erhaltenen Myelomonocyten beträgt etwa 10&sup7;-10¹² Zellen pro Tier oder mehr. Insbesondere erhöht sich erfindungsgemäß der implantierte Myelomonocyt um das etwa 10²-10&sup7; fache oder mehr, was etwa das 10- 10&sup6; fache oder mehr als dasjenige ist, das durch Impfen und Proliferieren von Myelomonocyten in einem in vitro Nährstoffkulturmedium erreicht wird. Dies ist bei der Herstellung von gamma-HuIFN sehr vorteilhaft.
Jede Impfmethode kann erfindungsgemäß verwendet werden, soweit es die gamma-HuIFN-Produktion in dem menschlichen Myelomonocyt, die auf dieser Weise erhalten wurde, induziert. Die menschlichen Myelomonocyten können der Wirkung eines gamma- IFN-Induktionsmittels in dem für die Proliferation verwendeten Tier ausgesetzt werden. Beispielsweise wird ein menschlicher Myelomonocyt, der im Ascites in Suspension proliferiert oder ein Tumor, der beispielsweise subkultan gebildet ist, direkt einem gamma-IFN-Induktionsmittel ausgesetzt, und das erhaltene gamma-HuIFN wird aus dem Ascites, Serum und/oder Tumor nach einer Reinigung gewonnen.
Der proliferierte menschliche Myelomonocyt kann aus dem Tier gewonnen werden und dann in vitro einem gamma-IFN-Induktionsmittel ausgesetzt werden. Beispielsweise wird ein menschlicher Myelomonocyt, der durch Gewinnung aus dem Ascites oder Extraktion und Disaggregation der Tumormasse, die beispielsweise subkultan gebildet ist, erhalten wird, in einem Nährmittelkulturmedium bei etwa 20-40ºC suspendiert, wobei eine Zelldichte von etwa 10&sup5;-10&sup8; Zellen/ml entsteht und einem gamma-IFN-Induktionsmittel ausgesetzt, wonach dann das erhaltene gamma-HuIFN gewonnen und gereinigt wird.
Wenn eine Diffusionskammer verwendet wird, kann der menschliche Myelomonocyt einem gamma-IFN-Induktionsmittel in der Diffusionskammer oder nach der Gewinnung aus dieser ausgesetzt werden.
Das Priming-Verfahren unter Verwendung von HuIFN und/oder die Superinduktionsmethode unter Verwendung eines Antimetaboliten können angewendet werden, um weiterhin die Verwendung von gamma-HuIFN zu vergrößern.
Die Produktion von gamma-HuIFN pro Tier kann weiterhin vergrößert werden, indem eine oder mehrere der folgenden Methoden angewendet werden:
(1) Eine Methode, worin der menschliche Myelomonocyt einem gamma-IFN-Induktionsmittel im Tier ausgesetzt wird, auf einer bestimmten Stelle des Tiers oder seinem ganzen Körper gewonnen wird und in vitro einem gamma-IFN- Induktionsmittel ausgesetzt wird;
(2) eine Methode, worin der menschliche Myelomonocyt wiederholt einem gamma-IFN-Induktionsmittel ausgesetzt wird und
(3) eine Methode, worin die Diffusionskammer, die in einem Tier eingebettet ist oder mit diesem verbunden ist, in Abständen durch eine frische Kammer ersetzt wird.
Die erfindungsgemäß verwendbaren gamma-IFN-Induktionsmittel sind in der Regel Mitogene, beispielsweise Phyotohämagglutinin, Concanavalin A, Kermesbeere-Mitogen, Lipopolysaccharid, Endoxin, Polypsaccharid und Bakterien.
Antigene wirken auf empfindlich gemachte Zellen als gamma- IFN-Induktionsmittel. Die gamma-IFN-Induktionsmittel werden in der Regel bei einer Konzentration von etwa 0,001 ug/ml bis 10 mg/ml verwendet. Die Kombination mit einem alpha-IFN- Induktionsmittel, beispielsweise ein Virus, eine Nukleinsäure und Polynukleotid, können zu einer vergrößerten Produktion von gamma-HuIFN und/oder Induktion einer gleichzeitigen Produktion von alpha-HuIFN führen.
Das erhaltene gamma-HuIFN kann durch eine oder mehrere herkömmliche Reinigungs- und Trennungsmethoden, beispielsweise Aussalzen, Dialyse, Filtration, Zentrifugation, Konzentration und Lyophilisation gewonnen werden. Wenn eine weitere Reinigung erforderlich ist, können eine oder mehrere andere herkömmliche Verfahren, beispielsweise die Absorption und Desorption mit einem Ionenaustauscher, die Gelfiltraktion, Fraktion am isoelektrischen Punkt, Elektrophorese, Ionenaustauscherchromotographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Säulenchromatographie und Affinitätschromatographie in Kombination verwendet werden. Die Chromatographie unter Verwendung monoklonaler Antikörper führt zu einem gamma-HuIFN mit höchster Reinheit.
Das in dieser Weise erhaltene gamma-HuIFN kann in vorteilhafter Weise zur Verhütung und Behandlung von gamma-HuIFN ansprechenden Erkrankungen verwendet werden.
Der Wortlaut "gamma-HuIFN ansprechende Erkrankungen" bedeutet solche, die mit gamma-HuIFN verhütet oder behandelt werden können, beispielsweise Viruserkrankungen, wie epidemische Konjunktivitis, herpetische Keratitis, Grippe, Rubella, Serum hepatitis und acquired immune deficiency syndrome (AIDS) und nicht virale Erkrankungen, einschließlich maligne Tumore, wie Coloncarcinoma, Lungenkarzinom, Leberkarzinom und Osteosarcoma und Immunpathien, einschließlich atopische Allergie, Myoasthenie, Collagenose, bösartige Anämie, Gelenkrheumatismus und systemischer Lupus erythematosus.
Das erfindungsgemäße Mittel kann je nach Endgebrauch in eine geeignete Form verarbeitet werden, beispielsweise in einen Nebel, ein Augenwasser, ein Mundwasser, eine flüssige Medizin, wie eine Injektion, eine Pastenmedizin, wie eine Salbe und in eine feste Medizin, wie Pulver, Granulae und Tabletten.
Der gamma-HuIFN-Gehalt liegt in der Regel im Bereich von 1 - 10.000.000 Einheiten/g. Die Wirksamkeit kann durch Kombination mit einem oder mehrerer Lymphokine, wie alpha-HuIFN, beta- HuIFN, Tumornekrosisfaktor (TNF), Lymphotoxin, Interleukin 2 und B-Zellendifferenzierungsfaktor oder natürliche oder synthetische chemotherapeutische Mittel verstärkt werden.
Das gamma-HuIFN kann in Kombination mit einem Adjuvans, Füllstoff und/oder Stabilisator verwendet werden. Das in dieser Weise erhaltene Mittel ist beispielsweise als Antivirusmittel, antionkotisches Mittel, Verstärker für antionkotische Chemotherapeutika, Hemmer für Tumormetastasen, Unterdrücker für Palindromie und Immunregulator geeignet.
Die HuIFN-Wirkung wurde mit der Plaquereduktionsmethode unter Verwendung von FL-Zellen aus dem menschlichen Amnion bestimmt, was in Protein, Nukleic Acid and Enzyme, Bd. 20, Nr. 6, Seiten 616-643 (1975) beschrieben ist.
Die Aktivität des gamma-HuIFN wurde nach Neutralisierung des alpha-HuIFN bzw. beta-HuIFN mit anti-alpha-HuIFN- und antigamma-HuIFN-Antikörpern bestimmt.
Der Hämagglutinationstiter wurde nach dem Verfahren von J.E. Salk, The Journal of Immunology, Bd. 49, Seiten 87-89 (1944) bestimmt.
Die von uns etablierte HBL-38-Zelle wird nun nachfolgend beschrieben.
Nach Züchten in einem in vitro-Nährmittelkulturmedium begann ein Leukocyt von einem Patienten mit akuter Myeloleukemie (55 Jahre alt) am 21. Tag zu proliferieren. Wir haben den Leukocyten wiederholt in Subkultur gehalten, wobei es dann gelang, eine der Subkulturen stabil zu proliferieren. Wir nannten die Subkultur "HBL-38".

(1) Proliferation

Die Verdopplungszeit auf RPMI 1640-Medium, das mit 10 Vol./Vol.-% fötalem Kalbsserum ergänzt war, betrug etwa 30 Stunden.

(2) Morphologie

Die HBL-38-Zelle neigte dazu, auf der Innenseite des Bodens der Flasche während der Proliferation anzuhaften, allerdings war die Anhaftung locker, und die Zellen wurden ohne weiteres entfernt. Obwohl sich während der Proliferation Zellklumpen bildeten, waren sie nicht fest und leicht auseinanderzubringen. Das Ergebnis der Beobachtung mit den Phasenkontrastmikroskop ist in Fig. 1 gezeigt. Die Zelle war regulär gerundet und hatte eine Dicke von etwa 15 um. Die Giemsa-Färbung ergab, daß die Nuklei gelegentlich mit einer unregelmäßigen Lappung oder einem Karyolobismus umrundet waren.

(3) Chromosomenzahl

Die Chromosomenanalyse wurde mit Zellen beim exponentiellen Wachstum durchgeführt. Die Verteilungshäufigkeit der Chromosomenzahl ist in Tabelle 1 gezeigt. Die Beobachtung von 150 Chromosomen hat ergeben, daß die Chromosomenzahlen in einem niedrig diploiden Bereich waren, und die häufigste Verteilung betrug 45 (53 Chromosomen). 42 Zellen hatten eine Chromosomenzahl von 44. Tabelle I Verteilungshäufigkeit der Chromosomenzahl

(4) Karyotypieanalyse

Die Ergebnisse der Karyotypieanalyse sind in Fig. 2 gezeigt. Das Geschlechtschromosom war XY, und dieses stimmte mit dem der Zellquelle überein. Ein Gegenstück von Chromosom 17 und das gesamte Chromosom 18 fehlten. Es wurde festgestellt, daß ein Chromosom in einen kurzen Arm (p) von Chromosom 5 und einen langen Arm (q) von Chromosom 12 eingesetzt war. Es wurden ein unidentifizierbares Markerchromosom und ein Chromatid beobachtet.

(5) Zelloberflächencharakter

Die Identifizierung der HBL-38-Zelle wurde mit verschiedenen Zelloberflächenantikörpern durchgeführt, und die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Die Analyse mit Ziegenerythrocyten (E), Erythrocytenambozeptor (EA) und Erythrocytenambozeptorkomplement (EAC) hat ergeben, daß der EA eine 10 %-Rosette bildete, während die anderen dies nicht taten. Der Nachweis von Oberflächenimmunglobulinen (Smig) mit sechs anti-humanen Ziegenantikörpern hat ergeben, daß die HBL-38-Zelle negativ gegenüber diesen Antikörpern war. Die Untersuchung der Oberflächenmarker mit monoklonalen Antikörpern hat ergeben, daß 3AL, MCS-2, B3/25 und MY-9 relativ stark positiv waren, während NU-T2, Leu-5, Leu-4, A-50, BA-2, OKI-1, NU-N1, B2, MO-1 und MO-2 negativ waren.

(6) Untersuchung auf EB-Virus bestimmtes Nuklearantigen (EBNA)

Die HBL-38-Zelle wurde mehrere Male an einem frühen Stadium der Etablierung auf EBNA untersucht. Die Ergebnisse haben ergeben, daß die HBL-38-Zelle EBNA-negativ war.

(7) Koloniebildung auf weichem Agarmedium

Die HBL-38-Zelle wurde auf Koloniebildung in einem 0,3 %igen Agarmedium, das Koloniestimulierungsfaktor (CSF) enthielt, getestet. Die Beobachtung mit dem Inversmikroskop am 14. Tag zeigte die Gegenwart einer Kolonie bildenden Myeloidzelle. Die Häufigkeit betrug 1 bis 2 %. Es bildete sich keine Kolonie, wenn kein CSF hinzugegeben wurde.
Auf der Grundlage dieser Daten wurde die HBL-38-Zelle in einen Myelomonocyt eingeordnet. Tabelle II Markerprofil
Bemerkung: Die Werte sind positiv (%).
Die folgenden Experimente 1 erläutern die Herstellung von gamma-HuIFN.

Experiment 1

Vergleich von etablierten menschlichen Lymphoblastoidzellen hinsichtlich gamma-HuIFN-Produktionsvermögen

Experiment 1-1

HuIFN-Produktion durch in vitro proliferierte Zellen

Eine etablierte menschliche Lymphoblastoidzelle wurde auf RPMI 1640-Medium (pH 7,2), das mit 20 % fötalem Kalbserum ergänzt war, geimpft, und die Mischung wurde bei 37ºC in üblicher Weise gezüchtet. Die erhaltene Kultur wurde mit serumfreien RPMI 1640-Medium (pH 7,2) gewaschen und dann mit einer frischen Präparation des gleichen Kulturmediums auf 1x10&sup6; Zellen/ml suspendiert.
Die erhaltene Zellsuspension wurde mit etwa 10 ug/ml Lipopolysaccharid versetzt, und die Mischung wurde bei 37ºC für 2 Tage gehalten, um die HuIFN-Produktion zu induzieren. Die Kultur wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde auf totale HuIFN- und gamma-HuIFN-Aktivitäten bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt.
Wie aus diesen Daten zu sehen ist, haben wir gefunden, daß menschliche Myelomonocyten gamma-HuIFN produzieren können und die Produktion größer war als diejenige, die mit den untersuchten etablierten menschlichen Lymphoblastoidzellen erreicht wurde. Die HBL-38-Zelle hatte ein extrem großes gamma- HuIFN-Produktionsvermögen. Tabelle III
Bemerkung: Die Werte zeigen HuIFN-Aktivität an, und diejenigen in Klammern, zeigen gamma-HuIFN-Aktivität.

Experiment 1-2

HuIFN-Produktion durch in vivo proliferierte Zellen

Neugeborene Hamster wurden mit einem vom Kaninchen hergestellten Anitserum in üblicher Weise injiziert, um mögliche Immunreaktion abzuschwächen, subkutan mit einem etablierten menschlichen Myelomonocyt implantiert und für 3 Wochen in üblicher Weise gefüttert. Die im Körper des Hamsters gebildeten Tumormassen wurden extrahiert und durch Suspendieren in Salzlösung, das Trypsin erhielt, disaggregiert.
Eine Suspension aus den erhaltenen Zellen wurde behandelt und hinsichtlich der Gesamt-HuIFN- und gamma-HuIFN-Aktivitäten in ähnlicher Weise wie in Experiment 1-1 bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt. Tabelle IV
Bemerkung: Die Werte zeigen HuIFN-Aktivität an, und diejenigen in Klammern gamma-HuIFN-Aktivität.
Die Daten in Tabelle III und IV bestätigten, daß die etablierten menschlichen Myelomonocyten, insbesondere die HBL- 38-Zellen, ein größeres gamma-HuIFN-Produktionsvermögen zeigten, wenn diese invivo und nicht in vito poliferiert wurden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von gamma- HuIFN.

Beispiel A-1

HBL-38-Zellen wurden auf RPMI 1640-Medium (pH 7,2), das mit 10 Vol./Vol.-% fötalem Kalbsserum ergänzt war, auf 5 x 10&sup5; Zellen/ml geimpft.
Die erhaltene Mischung wurde bei 37ºC gezüchtet, während das Kulturmedium in regelmäßigen Abständen erneuert wurde. Danach wurden unter Verwendung einer frischen Präparation des gleichen Kulturmediums die Zellen gewaschen und auf 2 x 10&sup6; Zellen/ml suspendiert. Die Zellsuspension wurde mit etwa 10 ug/ml Lipopoligosaccharid versetzt, und die Mischung wurde bei 37ºC für zwei Tage gehalten, um die HuIFN-Produktion zu induzieren. Die erhaltene Kultur wurde zentrifugiert unter Bildung eines Überstands, der etwa 5.100 Einheiten gamma- HuIFN pro ml enthielt.

Beispiel A-2

Neugeborene Hamster wurden mit einem vom Kaninchen hergestellten Antiserum in üblicher Weise zur Abschwächung möglicher Immunreaktionen injiziert, subkultan mit HBL-38-Zellen implantiert und für vier Wochen in üblicher Weise gefüttert. Die in den Tieren gebildeten Tumormassen, etwa 20 g jeweils, wurden extrahiert und durch Suspension in Salzlösung, die Collagenase enthielt, disaggregiert.
Nach Waschen mit Eagle's minimal essential medium, wurden die Zellen mit einer frischen Präparation des gleichen Kulturmediums auf etwa 2 x 10&sup6; Zellen/ml verdünnt und mit 200 ug/ml Phytohämagglutinin zusammen mit 5 g/ml Lipid A versetzt. Die Mischung wurde bei 37ºC für zwei Tage gehalten, um die HuIFN- Produktion zu induzieren. Die erhaltene Mischung wurde zentrifugiert und man erhielt einen Überstand, der etwa 93.000 Einheiten gamma-HuIFN enthielt. Demzufolge wurden etwa 183.000.000 Einheiten gamma-HuIFN pro Hamster erhalten.

Beispiel A-3

Neugeborenen Ratten wurden mit KG-1-Zellen intravenös implantiert und für vier Wochen in üblicher Weise gefüttert.
Die in den Tieren gebildeten Tumormassen, jeweils 20 g, wurden ähnlich wie in Beispiel A-2 zur Bildung einer Zellsuspension extrahiert und disaggregiert. Die Zellsuspension wurde mit etwa 100 Hämagglutinationstiter/ml Sendaivirus und etwa 5 ug/ml Lipopolysaccharid versetzt, unddie Mischung wurde bei 37ºC für 2 Tage zur Induzierung der HuIFN-Produktion inkubiert. Die erhaltene Mischung wurde zentrifugiert und man erhielt einen Überstand, der etwa 49.000 Einheiten gamma-HuIFN pro ml enthielt. Die gamma-HuIFN-Ausbeute betrug etwa 97.000.000 Einheiten pro Ratte.

Beispiel A-4

CTV-1-Zellen wurden mit Salzlösung in zylindrischen Kunststoffdiffusionskammern von etwa 10 ml mit einem Membranfilter, Porengröße etwa 0,5 Micron, suspendiert, und die Diffusionskammern wurden intraperitoneal in erwachsenen Ratten eingebettet.
Die Ratten wurden für vier Wochen in üblicher Weise gefüttert, und die Kammern wurden entfernt.
Die proliferierten Zellen wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel A-1 behandelt, um die HuIFN-Produktion zu induzieren. Die erhaltene Kultur wurde zentrifugiert und man erhielt einen Überstand, der etwa 41.000 Einheiten gamma-HuIFN pro ml enthielt. Die Ausbeute betrug etwa 78.000.000 Einheiten pro Ratte.

Beispiel A-5

Embryonierte Eier, die bei 37ºC während einer Woche vorgewärmt worden waren, wurden mit HBL-38-Zellen implantiert und dann für eine weitere Woche bei dieser Temperatur inkubiert. Die proliferierten Zellen wurden durch Brechen der Eier gewonnen und in ähnlicher Weise wie in Beispiel A-2 behandelt, um die HuIFN-Produktion zu induzieren. Die erhaltene Kultur wurde zentrifugiert und man erhielt einen Überstand, der etwa 36.000 Einheiten gamma-HuIFN pro ml enthielt. Die Ausbeute betrug etwa 60.000.000 Einheiten pro 10 Eier.
Die folgenden Beispiele B erläutern die Herstellung von monoklonalem anti-gamma-HuIFN-Antikörper und die Reinigung von gamma-HuIFN unter Verwendung desselben.

Beispiel B-1 (1)

Herstellung von teilweise gereinigtem gamma-HuIFN

Eine Flüssigkeit, die nach der Methode in Beispiel A-2 hergestelltes gamma-HuIFN enthielt, wurde gegen 0,01 M Trisphosphatpuffer (pH 8,5) für 20 Stunden dialysiert und dann membranfiltriert. Das Filtrat wurde auf eine Antikörpersäule, die anti-alpha-HuIFN- und anti-beta-HuIFN-Antikörper bindet, aufgetragen und die nicht absorbierte Fraktion wurde gewonnen. Die Fraktion wurde unter Bildung einer Fraktion mit Antivirusaktivität chromatofocusiert, die dann eingeengt und lyophilisiert wurde, um ein gamma-HuIFN enthaltenes Pulver in eine Aktivitätsausbeute von etwa 30 % zu erhalten. Die spezifische Aktivität des Pulvers betrug etwa 10&sup6; Einheiten/ml Protein.

Beispiel B-1 (2)

Herstellung von monoklonalem anti-gamma-HuIFN-Antikörper

Ein nach der Methode in Beispiel B-1 (1) erhaltenes teilweise gereinigtes gamma-HuIFN wurde in Salzlösung auf etwa 0,05 Gew./Gew.-% gelöst, und die erhaltene Lösung wurde mit einem Äquivalenzvolumen Freund's Adjuvans versetzt. Es wurden Mäuse intravenös mit einem 0,2 ml Aliquot der Mischung injiziert und am 7. Tag nach der ersten Injektion ähnlich wie oben zur Bewirkung der Immunisierung reimmunisiert. Die Milzorgane, worin die anti-gamma-HuIFN-Produktion in der Antikörper produzierenden Zelle induziert worden war, wurden aus den Mäusen entnommen, zerkleinert und disaggregiert, wonach die Milzzellen zusammen mit P3-X63-Ag8-Zellen, eine Mausmyelomzelle, verkauft von Flow Laboratories Inc., Maryland, USA, in 37ºC serumfreien Eagle's minimum essential medium (pH 7,2), welches 50 Gew./Vol.-% Polyethylenglykol 1000 enthielt, suspendiert wurden, bis sich eine Zelldichte von 10&sup4; Zellen/ml bildete. Beim Stehenlassen während 5 Minuten wurde die Zellsuspension 20-Mal in einer frischen Präparation des gleichen Kulturmediums verdünnt, und die Hybridzellen, die auf dem Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthielt, wachsen konnten, wurden gewonnen und nach dem Verfahren von R. L. Davidson und P. S. Gerald, Somatic Cell Genetics. Bd. 2, Nr. 2, Seiten 175 - 176 (1976) unter Bildung einer Hybridzelle kloniert, die anti-gamma-HuIFN-Antikörper produzieren konnte. Die Hybridzelle wurde dann intraperitoneal in Mäuse in einer Dosis von etwa 10&sup6; Zellen pro Maus implantiert, welche zwei Wochen gefüttert und dann getötet wurden. Die Körperflüssigkeiten aus den Mäusen, wie Ascites und Blut, wurden zentrifugiert unter Bildung eines Überstands, der dann mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 30 bis 50 % versetzt wurde. Das erhaltene Sediment wurde dialysiert und mit immobilisierten gamma-HuIFN-Gel affinitätschromatographiert, welches erhalten wurde, indem ein gamma-HuIFN bei Raumtemperatur umgesetzt wurde, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1 (1) mit BRCN-aktivierter Sepharose erhalten worden ist. Die erhaltene anti-gamma-HuIFN-Antikörperfraktion wurde dialysiert, eingeengt und in ein Pulver lyophilisiert.
Das Produkt neutralisierte immunologisch ein gamma-HuIFN aus einem menschlichen Myelomonocyt.
Die Stabilität des monoklonalen Antikörpers in wäßriger Lösung wurde bestimmt, indem die Restneutralisationsaktivität bei einer 30-minütigen Inkubation bei einem pH von 7,2 gemessen wurde. Im Ergebnis erhielt der monoklonale Antikörper eine Aktivität von über 80 % bei der Inkubation bei 60ºC, aber er verlor über 90 % Aktivität bei der Inkubation bei 70ºC. Bei einer 16-Stundeninkubation bei 4ºC wurde festgestellt, daß der monoklonale Antikörper bei einem pH im Bereich von 4,0 bis 11,0 stabil war, er verlor allerdings 90 % Aktivität bei einem pH von 2,0.
Die weitere Untersuchung hat gezeigt, daß der monoklonale Antikörper in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol instabil war und eine Antigen-Antikörper-Reaktion spezifisch mit einem anti- Maus-Immunglobulin-M-Antikörper verursachte.
Dieses bestätigte, daß der monoklonale Antikörper zur Klasse Immunglobulin-M-Antikörper gehörte.

Beispiel B-1 (3)

Herstellung von hochgereinigtem gamma-HuIFN

Ein nach der Methode in Beispiel B-1 (1) hergestelltes teilweise gereinigtes gamma-HuIFN wurde auf einer Säule aus einem immobilisierten, nach dem Verfahren in Beispiel B-1 (2) hergestellten monoklonalen Antikörpergel chromatographiert, und die Fraktion mit gamma-HuIFN-Aktivität wurde gewonnen, dialysiert, eingeengt und lyophilisiert, und es wurde ein Feststoff erhalten, der gamma-HuIFN in einer Ausbeute von etwa 80 % enthielt. Das Produkt war hochgereinigtes gamma-HuIFN, und die spezifische Aktivität betrug etwa 1,5 x 10&sup7; Einheiten/mg Protein.

Beispiel B-2

Beispiel B-2 (1)

Herstellung von teilweise gereinigtem gamma-HuIFN

Eine Lösung, die ein nach der Methode in Beispiel A-3 hergestelltes gamma-HuIFN enthielt, wurde nach der Methode in Beispiel B-1 (1) teilweise gereinigt, und man erhielt eine gamma-HuIFN-Präparation mit einer spezifischen Aktivität von et-10&sup6; Einheiten/mg Protein in einer Ausbeute von etwa 20 %.

Beispiel B-2 (2)

Herstellung von monoklonalem anti-gamma-HuIFN-Antikörper

Milzzellen wurden erhalten, indem Mäuse ähnlich wie in Beispiel B-1 (2) immunisiert wurden, mit der Ausnahme, daß als Antigen das in Beispiel B-2 (1) teilweise gereinigte gamma- HuIFN verwendet wurde.
Die Milzzellen wurden zusammen mit P3-NS-1/1-Ag4-1-Zellen, eine Mausmyelomzelle, verkauft von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan, in einer Salzlösung, die 140 mM NaCl, 54 mM KCl, 1 mM NaH&sub2;PO&sub4; und 2 mM CaCl&sub2; enthielt, bis zu einer Zelldichte von Zellen/ml suspendiert. Zu der Zellsuspension wurden unter eisgekühlten Bedingungen eine frische Präparation der gleichen Salzlösung, die zusätzlich einen durch UV-Strahlung inaktivierten Sendaivirus enthielt, gegeben, und die Mischung wurde etwa 20-Mal nach Ablauf von 5 Minuten in 37ºC RPMI 1640-Medium verdünnt. Eine Hybridzelle, die anti-gamma-HuIFN-Antikörper produzieren konnte, wurde kloniert, indem die verdünnte Mischung ähnlich wie in Beispiel B-1 (2) behandelt wurde.
Die erhaltene Hybridzelle wurde intraperitoneal in 7 Tage alte Hamster implantiert, deren Immunreaktionen in üblicher Weise in einer Dosis von etwa Zellen pro Hamster abgeschwächt worden war, und die Hamster wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel B-1 (2) zur Bildung eines monoklonalen Antikörpers behandelt.
Das Produkt neutralisierte immunologisch ein gamma-HuIFN, das in ähnlicher Weise von dem in Beispiel B-1 (2) hergestellten stammte.
Die Stabilität des monoklonalen Antikörpers in wäßriger Lösung wurde bestimmt, indem die Restneutralisationsaktivität bei einer 30-minütigen Inkubation bei einem pH von 7,2 gemessen wurde. Im Ergebnis erhielt der monoklonale Antikörper über 80 % Aktivität bei einer Inkubation bei 60ºC, er verlor allerdings über 90 % Aktivität bei der Inkubation bei 70ºC. Bei einer 16-stündigen Inkubation bei 4ºC wurde festgestellt, daß der monoklonale Antikörper bei einem pH im Bereich von 2,0 - 11,0 stabil war.
Eine weitere Untersuchung hat ergeben, daß der monoklonale Antikörper in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol stabil war und eine Antigen-Antikörper-Reaktion spezifisch mit anti-Maus- Immunglobulin-G-Antikörper verursachte.
Dieses hat bestätigt, daß der monoklonale Antikörper zur Klasse Immunglobulin-G-Antikörper gehörte.

Beispiel B-2 (3)

Herstellung von hochgereinigtem gamma-HuIFN

Ein nach der Methode in Beispiel B-2 (1) hergestelltes teilweise gereinigtes gamma-HuIFN wurde auf einer Säule aus einem immobilisierten, nach der Methode in Beispiel B-2 (2) hergestellten monoklonalen Antikörper chromatographiert und die gamma-HuIFN enthaltene Fraktion wurde gewonnen, dialysiert und konzentriert und man erhielt eine Flüssigkeit, die gamma- HuIFN enthielt, in einer Aktivitätsausbeute von etwa 85 %. Das Produkt war hochgereinigtes gamma-HuIFN, und die spezifische Aktivität betrug etwa 1,5 x 10&sup7; Einheiten/mg Protein.

Beispiel B-3

Ein durch Dialysieren eines gamma-HuIFN enthaltenen Überstands erhaltenes Filtrat, das nach der Methode in Beispiel A-1 erhalten wurde, wurde gegen eine Salzlösung, die 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) enthielt, für 15 Stunden dialysiert, und der membrangefilterte erhaltene Überstand wurde auf einer Antikörpersäule gemäß der Methode in Beispiel B-1 (3) gereinigt, eingeengt und lyophilisiert, wobei ein Feststoff erhalten wurde, der gamma-HuIFN in einer Aktivitätsausbeute von etwa 75 % enthielt. Das Produkt war hochgereinigtes gamma- HuIFN, und die spezifische Aktivität betrug etwa 1,5 x Einheiten/mg Protein.

Beispiel B-4

Ein gamma-HuIFN enthaltender Überstand, der nach der Methode in Beispiel A-4 erhalten wurde, wurde gemäß der Methode in Beispiel B-3 dialysiert und membranfiltriert. Das erhaltene Filtrat wurde auf einer Antikörpersäule gereinigt und in ähnlicher Weise wie in Beispiel B-2 (3) eingeengt, und man erhielt eine Lösung, die gamma-HuIFN in einer Aktivitätsausbeute von etwa 70 % enthielt. Das Produkt war hochgereinigtes gamma-HuIFN, und die spezifische Aktivität betrug etwa 1,5 x 10&sup7; Einheiten/mg Protein.

Beispiel B-5

Ein gamma-HuIFN enthaltener Überstand, der nach der Methode in Beispiel A-5 erhalten war, wurde gemäß der Methode in Beispiel B-3 dialysiert und membranfiltriert. Das erhaltene Filtrat wurde auf einer Antikörpersäule gereinigt, eingeengt und ähnlicher Weise wie in Beispiel B-1 (3) lyophilisiert, und man erhielt einen Feststoff, der gamma-HuIFN in einer Aktivitätsausbeute von etwa 70 % enthielt. Das Produkt war hochgereinigtes gamma-HuIFN, und die spezifische Aktivität betrug etwa 1,5 x 10&sup7; Einheiten/mg Protein.
Die folgenden Experimente 2 erläutern die Verhütung und Behandlung von auf gamma-HuIFN ansprechenden Erkrankungen unter Verwendung von gamma-HuIFN.

Experiment 2

Prophylaktische und therapeutische Wirkungen von gamma-HuIFN auf gamma-HuIFN ansprechenden Erkrankungen

Experiment 2-1

In vitro Virusinhibitionsaktivität

Eine primäre Monolayer-Kultur einer menschlichen fötalen Lunge in einer 6 cm Petrischale wurde mit einem nach der Methode in Beispiel B-1 (3) hergestellten gamma-HuIFN mit einem Inoculum von 0,1, 1,0 oder 10,0 Einheiten versetzt und in einem 5 % CO&sub2;-Incubator bei 37ºC für 20 Stunden inkubiert. Die erhaltene Kultur wurde entweder mit Varicella zoster Virus oder menschlichem Cytomegalovirus in einer Dosis versetzt, bei der 100 Plaques in Abwesenheit von gamma-HuIFN gebildet werden konnten.
Die Virusinhibitionsaktivität wurde mit der abnehmenden Rate der Plaquezahl bestimmt.
Plaquereduktionsrate (%) = A-B/A x 100
worin A die Plaquezahl ohne Zugabe von gamma-HuIFN bedeutet, während B diejenige mit Zugabe von gamma-HuIFN bedeutet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Tabelle V
Diese Ergebnisse bestätigten, daß das erfindungsgemäß verwendete gamma-HuIFN außerordentlich stark das Wachstum von pathogenen Viren hemmt.

Experiment 2-2

Behandlung von malignen Tumoren mit gamma-HuIFN

Experiment 2-2 (1)

Cytostatische Aktivität von gamma-HuIFN auf maligne Tumore in vitro

Ein Aliquot mit RPMI 1640-Medium, das mit 15 Vol./Vol.-% fötalem Kalbsserum ergänzt war, wurde mit einem nach der Methode in Beispiel B-1 (3) hergestellten gamma-HuIFN bis zu einer Endkonzentration von 5, 50 oder 500 Einheiten/ml versetzt, und die Mischung wurde mit malignen menschlichen Tumorzellen bis auf 5 x 10&sup5; Zellen/ml geimpft. Das Erhaltene wurde in einem 5 % CO&sub2; Inkubator bei 37ºC während 3 Tagen inkubiert. Als Kontrolle wurde die gleiche Menge eines gamma- HuIFN, das durch eine 30 minütige Inkubation bei 100ºC vorinaktiviert wurde, zu einer frischen Präparation des gleichen Kulturmediums gegeben, und die Mischung wurde in ähnlicher Weise wie oben behandelt. Nach der Züchtung wurden die lebenden Zellen mit Neutralrot gemäß der Methode in Applied Microbiology Bd. 22, Nr. 4, Seiten 671 - 677 (1971) gefärbt. Danach wurde das Neutralrot mit angesäuertem Ethanol eluiert und die Zahl der lebenden Zellen wurde anhand der Absorption des Eluats bei 540 nm bestimmt.
Die cytostatische Rate (%) wurde mit folgender Gleichung bestimmt:
Cytostatische Rate (%) = (1 - )/B x 100
worin A die Zahl der lebenden Zellen im Testsystem und B diejenigen in der Kontrolle bedeuten.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt. Tabelle VI
Bemerkung: Die KB-Zelle stammt von einem oralen Epidermoidcarcinom vom Menschen; die HEP-2-Zelle stammt von einem Larynxepidermoidcarcinom vom Menschen; die KATO-II-Zelle stammt von einem Magencarcinom vom Menschen und die P-4788 stammt von einem menschlichen Coloncarcinom.
Diese Ergebnisse bestätigten, daß das erfindungsgemäß verwendete gamma-HuIFN in außerordentlicher Weise bei einer Konzentration von 5-500 Einheiten/ml das Wachstum von malignen Tumorzellen, wie die KB-Zelle, HEp-2-Zelle, KATO-II-Zelle und P-4788-Zelle, inhibierte.

Beispiel 2-2 (2)

Wirkungsvermögen der cytostatischen Aktivität von anderen Lymphokinen durch gamma-HuIFN in vitro

Die in diesem Experiment verwendeten Lymphokine waren gamma- HuIFN (5 Einheiten/ml), alpha-HuIFN (50 Einheiten/ml) und TNF (10 Einheiten/ml). Diese Lymphokine waren natürliche Produkte von Lymphoblastoidzellen.
Diese Lymphokine wurden auf ihre cytostatische Rate (%) gemäß der Methode in Experiment 2-2 (1) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII gezeigt. Tabelle VII
Diese Ergebnisse haben klar bestätigt, daß die Kombination mit gamma-HuIFN die cytostatische Wirkung anderer Lymphokine auf maligne Tumore extrem verstärkt und die Verstärkung synergistisch war.

Experiment 2-2 (3)

Wirkungsvermögen der cytostatischen Aktivität von Chemotherapeutika auf malgine Tumore durch gamma-HuIFN in vitro

1 ml Aliquots eines Nährstoffkulturmediums, das gemäß der Methode in Experiment 2-2 (1) hergestellt war, wurde mit 10&sup6; Zellen von menschlichen malignen Tumorzellen geimpft, und die Mischung wurde für einen Tag angezüchtet. Die erhaltene Kultur wurde mit 50 Einheiten eines gamma-HuIFN, das nach der Methode in Beispiel B-1 (3) hergestellt war und/oder 0,1 ml einer Salzlösung, die ein Chemotherapeutikum enthielt, versetzt und bei 37ºC während 2 Tagen gezüchtet. Als Kontrolle wurde eine Salzlösung, die kein gamma-HuIFN und Chemotherapeutikum enthielt, verwendet. Nach der Kultur wurde die cytostatische Rate (%) gemäß der Methode in Experiment 2-2 (1) bestimmt. Die Konzentration der Chemotherapeutika war folgendermaßen: Nimustinhydrochlorid (ACNU), 1,0 x 10&supmin;&sup6; g/ml; Fluoruracil (5-FU), 1,5 x 10&supmin;&sup8; g/ml; Doxodrubicin (ADM), 1,0 x 10&supmin;¹&sup0; g/ml; Mitomycin C (MMC), 2,5 x 10&supmin;&sup9; g/ml, und Vincristinsulfat (VCR), 1,5 x 10&supmin;¹&sup0; g/ml.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII gezeigt. Tabelle VIII
Bemerkung: (-) bedeutet keine Zugabe und (+) bedeutet mit Zugabe. Die HEP-2-Zelle stammt von einem menschlichen Larynxepidermoidcarcinom; PC-9 stammt von einem menschlichen Lungencarcinom; HLE stammt von einem menschlichen Lebercarcinom und HeLa stammt von einem menschlichen Cervixepitheloidcarcinom.
Diese Ergebnisse haben klar gezeigt, daß gamma-HuIFN die cytostatische Aktivität von Chemotherapeutika auf maligne Tumore extrem erhöht und die Erhöhung arithmetisch oder synergistisch war.

Experiment 2-2 (4)

Cytostatische Aktivität auf maligne Tumore in vivo

BALB/c-Nacktmäuse wurden auf ihren Rückenbereichen mit einem Seument aus menschlichem Brustkrebsgewebe implantiert. Von dem Zeitpunkt an, als die Tumore bis zu etwa 200 mm³ wuchsen, wurden die Nacktmäuse einmal am Tag mit einem oder mehr gamma-HuIFN, das nach der Methode in Beispiel B-1 (3) hergestellt war, einem Lymphokin aus einer menschlichen Lymphoblastoidzelle und/oder einem Chemotherapeutikum in Salzlösung über einen Zeitraum von 20 Tagen injiziert.
Danach wurden die Nacktmäuse getötet und die Tumore wurden gewogen.
Als Kontrolle wurde Salzlösung in ähnlicher Weise wie oben injiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX gezeigt.
Diese Ergebnisse haben klar bestätigt, daß gamma-HuIFN das Wachstum von malignen Tumoren in vivo außerordentlich inhibiert. Die cytostatische Aktivität war extrem verstärkt und übte eine starke antionkotische Wirkung durch Kombination mit einem oder mehreren Lymphokin(en) oder Chemotherapeutikum(a) aus. Tabelle IX
Bemerkung: Die Werte waren stoachastisch signifikant gegenüber der Kontrolle bei einem Signifikanzwert von 5 %.

Experiment 2-2 (5)

Akute Toxizität

Die akute Toxizität einer gamma-HuIFN-Präparation, die nach dem Verfahren in Beispiel B-1 (3) erhalten wurde, wurde unter Verwendung von 20 Tage alten Mäusen untersucht.
Das Ergebnis bestätigte, daß die Toxitität des gamma-HuIFN extrem niedrig, d. h. 10&sup9; oder mehr, ausgedrückt als LD&sub5;&sub0;, bei der intraperitonealen Injektion war.
Die folgenden Beispiele C erläutern die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die als wirksamen Bestandteil das gamma-HuIFN enthalten, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde.

Beispiel C-1

Flüssige Medizin

Eine flüssige Medizin wurde hergestellt, indem in einer Salzlösung ein gamma-HuIFN, das nach der Methode in Beispiel B-1 (3) hergestellt war, bis auf 500 Einheiten/ml gelöst wurde.
In das Produkt in Form eines Nebels, Augenwassers, Gurgelwassers oder Mundwassers ist als prophylaktisches und therapeutisches Mittel bei Viruserkrankungen wie die epidemische Conjunctivitis und Influenza, geeignet.

Beispiel C-2

Injektion

Eine feste Injektion wurde erhalten, indem in einer Salzlösung 100.000 Einheiten/ml eines gamma-HuIFN, das nach der Methode in Beispiel B-2 (3) hergestellt worden war, gelöst wurde, steril filtriert wurde und als 2 ml Aliquots des Filtrats in Ampullen verteilt und lyophilisiert wurde, wonach dann die Ampullen versiegelt wurden.
Das Produkt ist vorteilthafterweise als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für Viruserkrankungen in ähnlicher Weise wie das Produkt in Beispiel C-1 geeignet.
Das Produkt ist als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für maligne Tumore, wie Brustkrebs, Lungencarcinom, Lebercarcinom und Leukämie und Immunerkrankungen, wie atopische Allergie, gefährliche Anämie, Gelenkrheumatismus und systemischer Lupus Erythematosus geeignet.
Das Produkt ist als Verstärker für Chemotherapeutika, wie Melphalan, Methotrexat und ADM geeignet.

Beispiel C-3

Injektion

Zu einer Salzlösung wurden 10.000 Einheiten/ml eines gamma- HuIFN, das nach der Methode in Beispiel B-3 hergestellt war, 100.000 Einheiten/ml natürliches Lymphoblastoid-alpha-HuIFN und 100.000 Einheiten/ml natürliches Lymphoblastoid-TNF gegeben, und die Mischung wurde sterilfiltriert und ähnlich wie in Beispiel C-2 zur Bildung einer festen Injektion lyphilisiert.
Das Produkt ist als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für Viurserkrankungen geeignet.
Das Produkt ist ebenfalls als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für maligne Tumore, wie Brustkrebs, Lungencarcinom, Lebercarcinum, Magenkrebs und Leukämie und Immunerkrankungen, wie atopische Allergie, Collagenase, Gelenkrheumatismus und systemischer Lupus Erythematosus geeignet.
Das Produkt kann in vorteilhafter Weise verwendet werden, um die cytostatische Wirkung von Chemotherapeutika, wie Tegafur, MMC und VCR, zu verstärken.

Beispiel C-4

Salbe

Ein gamma-HuIFN, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1 (3) hergestellt war, und ein natürliches Lymphoblastoid-alpha- HuIFN wurden zusammen mit einer kleinen Menge flüssiges Paraffin in üblicher Weise verknetet und die Mischung wurde mit weißer Vaseline versetzt und ergab gamma-HuIFN- und alpha- HuIFN-Konzentrationen von 50.000 Einheiten/g bzw. 500.000 Einheiten/g.
Das Produkt ist als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für Hauterkrankungen, wie Herpes, Hautcarcinom und atopische Dermatitis geeignet.

Beispiel C-5

Darmlösliche beschichtete Tablette

Bei der Herstellung von herkömmlichen Tabletten unter Verwendung von Stärke und Maltose als Träger wurde ein gamma-HuIFN, das nach der Methode in Beispiel B-5 hergestellt war und ein natürliches Lymphoblastoid-TNF in die Tablette in den jeweiligen Mengen von 10.000 Einheiten pro Tablette (200 mg) eingegeben. Die erhaltenen Tabletten wurden dann mit Methylcellulosephthalat beschichtet.
Das Produkt ist vorteilhafterweise als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für Viruserkrankungen, wie solche im Dünn- und Dickdarm und auch für maligne Tumore, wie Coloncarcinom und Lebercarcinom und Immunerkrankungen, wie die atopische Allergie, gefährliche Anämie, Gelenkrheumatismus und systemischer Lupus Erythematosus geeignet.
Das Produkt kann in vorteilhafter Weise verwendet werden, um die antionkotische Wirkung von Chemotherapeutika, wie ADM, 5- FU und MMC, zu verstärken.
Wie vorstehend im einzelnen beschrieben wurde, bieten herkömmliche Verfahren nur ein unzureichendes gamma-HuIFN- Produktionsvermögen, und dieses macht die Produktion von gamma-HuIFN in industriellem Ausmaß sehr schwierig. Auf der Grundlage der Feststellung, daß etablierte menschliche Myelomonocyten ein außerordentlich hohes gamma-HuIFN-Produktionsvermögen zeigen, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von gamma-HuIFN zur Verfügung, das in hervorragender Weise im industriellen Maßstab ausgeführt werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers unter Verwendung des in dieser Weise hergestellten gamma-HuIFN zur Verfügung und auch ein Reinigungsverfahren, bei dem der Antikörper verwendet wird und ein prophylaktisches und therapeutisches Mittel für gamma-HuIFN zugängliche Erkrankungen. Das Mittel ist sehr wirksam bei Viruserkrankungen, malignen Tumoren und Immunerkrankungen, deren Behandlung bisher sehr schwierig war.
Die vorliegende Erfindung ist eine bedeutsame Erfindung im Stand der Technik.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von gamma-Interferon, bei dem man einen etablierten menschlichen Myelomonocyt, der gamma-Interferon produzieren kann, gamma-Interferon produzieren läßt und die Ansammlung gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der etablierte menschliche Nyelomonocyt erhalten wird, indem man einen etablierten menschlichen Myelomonocyt in ein nicht menschliches Warmbluttier implantiert oder den etablierten menschlichen Myelomonocyt in eine Diffusionskammer, die innerhalb oder außerhalb des Körpers eines nicht menschlichen Warmbluttiers angeordnet ist, impft und den etablierten menschlichen Myelomonocyt proliferieren läßt, während diesem ermöglicht wird, die Körperflüssigkeit von dem nicht menschlichen Warmbluttier zu erhalten

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Stufe, bei der man den etablierten Myelomonocyt gamma-Interferon produzieren läßt, eine Stufe umfaßt, bei der der etablierte menschliche Myelomonocyt der Wirkung eines Induktionsmittels ausgesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der nachweislich etablierte Myelomonocyt ein Mitglied aus der Gruppe aus HL-60-Zelle, KG-1-Zelle, ML-1-Zelle, ML-2-Zelle, ML-3-Zelle, THP-1-Zelle, U-937-Zelle und CTV-1-Zelle gewählt ist

5. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen anti-gamma- Interferon-Antikörpers, wobei man

einen etablierten menschlichen Myelomonocyt, der gamma- Interferon produzieren kann, gamma-Interferon produzieren läßt;

die Ansammlung gewinnt;

ein nicht menschliches Warmbluttier immunisiert, wobei als Antigen das erhaltene gamma-Interferon verwendet wird;

die Antikörper-produzierende Zelle aus dem Tier gewinnt;

die Antikörper-produzierende Zelle mit einer Myelomzelle verschmilzt;

eine Hybridzelle, die anti-gamma-Interferon-Antikörper produzieren kann, auswählt und

die Hybridzelle züchtet, um einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch gegenüber gamma-Interferon ist, zu produzieren.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der etablierte menschliche Myelomonocyt erhalten wird, indem man

einen etablierten menschlichen Myelomonocyt in ein nicht menschliches Warmbluttier implantiert oder den etablierten menschlichen Myelomonocyt in eine Diffusionskammer, die sich innerhalb oder außerhalb des Körpers eines nicht menschlichen Warmbluttiers befindet, impft und den etablierten menschlichen Myelomonocyt proliferieren läßt, während es ihm ermöglicht wird, die Körperflüssigkeit von dem nicht menschlichen Warmbluttier zu erhalten.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, worin der monoklonale Antikörper aus der Klasse Immunglobulin G oder M stammt.

8. Verfahren zum Reinigen von gamma-Interferon, bei dem man einen etablierten menschlichen Myelomonocyt, der gamma- Interferon produzieren kann, gamma-Interferon produzieren läßt, und

die Ansammlung mittels Säulenchromatographie unter Verwendung eines anti-gamma-Interferon-Antikörpers gewinnt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin der etablierte menschliche Myelomonocyt erhalten wird, indem man einen etablierten menschlichen Myelomonocyt in ein nicht menschliches Warmbluttier implantiert oder den etablierten menschlichen Myelomonocyt in eine Diffusionskammer, die sich im innerhalb oder außerhalb des Körpers eines nicht menschlichen Warmbluttiers befindet, impft und den etablierten menschlichen Myelomonocyt proliferieren läßt, während es ihm ermöglicht wird, die Körperflüssigkeit von dem nicht menschlichen Warmbluttier zu erhalten.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, worin der anti-gamma-Interferon-Antikörper erhalten wird, indem man einen etablierten menschlichen Myelomonocyt, der gamma- Interferon produzieren kann, gamma-Interferon produzieren

die Ansammlung gewinnt;

ein nicht menschliches Warmbluttier unter Verwendung des erhaltenen gamma-Interferons als Antigen immunisiert;

die Antikörper-produzierende Zelle aus dem Tier gewinnt;

die Antikörper-produzierende Zelle mit einer Myelomzelle verschmilzt;

11. Prophylaktisches und therapeutisches Mittel für auf gamma-Interferon sprechende Erkrankungen, wobei das Mittel als wirksamen Bestandteil 1-10.000.000 Einheiten gamma-Interferon pro Gramm des Mittels enthält, welches gamma-Interferon nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 erhältlich ist, worin die gamma-Interferon-Aktivität nach der Plaquereduktionsmethode unter Verwendung von FL-Zellen aus dem menschlichen Amnion bestimmt wird, und eine Einheit des gamma-Interferons als Menge definiert wird, die eine Plaquereduktionsrate (%) von etwa 50 % ergibt, wenn nach folgender Gleichung berechnet wird:

Plaquereduktionsrate (%) = A - B/A x 100

worin "A" die Plaquezahl ohne Zugabe von gamma-Interferon und "B" diejenige mit Zugabe des gamma-Interferons bedeuten.

12. Mittel nach Anspruch 11, worin das gamma-Interferon über die Säulenchromatographie unter Verwendung eines antigamma-Interferon-Antikörpers gereinigt worden ist, wobei eine spezifische Wirkung von etwa 1,5x10&sup7; Einheiten/mg Protein erhalten wird.

13. Mittel nach Anspruch 11 oder 12, worin das Mittel ein zusätzliches Lymphokin enthält.

14. Mittel nach Anspruch 13, worin das Lymphokin ein Mitglied aus der Gruppe aus alpha-Interferon, beta-Interferon, Tumornekrosisfaktor, Lymphotoxin, Interleukin-2, B- Zellen-differenzierungsfaktor und Mischungen daraus gewählt ist.

15. Mittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin das Mittel als Antivirusmittel, als antionkotisches Mittel, als Verstärker für ein antionkotisches Mittel oder als therapeutisches Mittel für Immunerkrankungen wirkt.