DE2708780A1

DE2708780A1 - Neue blutserumpraeparationen, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel und medizinische hilfsstoffe

Info

Publication number: DE2708780A1
Application number: DE19772708780
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Dr Opitz
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1977-03-01
Filing date: 1977-03-01
Publication date: 1978-09-07
Also published as: FR2382237A1; GB1565793A; JPS53107410A; US4159320A

Description

Bayer Aktiengesellschaft 27O878o

Zentralbereich Patente, Marken und Lizenzen

5090 Leverkusen, Bayerwerk

Er/Di

Neue Blutserumpräparationen, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Arzneimittel und medizinische Hilfsstoffe

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Blutserumpräparationen, welche den mit Mercaptoverbindungen aktivierten immunregulatorischen Faktor MASF (mercaptoaktivierter Serumfaktor) enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung aus humanen- und/oder Säugetierblutserum sowie ihre Verwendung in der Medizin, z. B. als Arzneimittel, oder medizinische Hilfsstoffe wie Diagnostika und Reagenzien.

Es ist bereits bekannt geworden, daß 2-Mercaptoäthanol (Formel: CHgSH-CHgOH) das Wachstum von Lymphozyten in vitro günstig beeinflußt (Broome, J.D., and M.W. Jeng, J. Exp. Med. 138:574 (1973)und Click, R. E., L. Benck, and B. J. Alter. Cell Immunol. 3:156 (1972)). Eingehend wurde die Wirkung von 2-Mercaptoäthanol in einem in vitro-System untersucht, das in der Lage ist, Antikörper zu synthetisieren (Mishell, R., and R.W. Dutton, J. Exp. Med. 126:423 (1967)). Dieses System (Mishell-Dutton-System) besteht aus einer Suspension von Mäuse-Milzzellen. Sie können zusammen mit fötalem Kälberserum und Antigen innerhalb von 5 Tagen spezifische Antikörper gegen das verabreichte Antigen bilden. Die Antikörpersynthese in diesem System ist wesentlich von der Qualität des verwendeten fötalen Kälberserum abhängig. Es läßt sich nicht

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durch andere Seren ersetzen, selbst homologes Serum, d. h. Mausserum, erwies sich als unbrauchbar. Indes ermöglichen auch von den fötalen Kälberseren nur ausgewählte sogenannte "gute Seren" Milzzellsuspensionen eine Immunantwort. Zugabe von 2-Mercaptoäthanol in dieses System erhöht die Zahl der überlebenden Zellen und steigert entscheidend die Antikörpersynthese ·

Es ist nachgewiesen worden, daß die Antikörpersynthese von 3 Zelltypen abhängig ist, den T- und B-Lymphozyten und den Makrophagen (Miller, J. F. A. P. and Mitchell, G. F. 1969, Transplant Rev. 1:3). Entfernt man den Makrophagen aus dem Invitro-System, so ist es nicht mehr in der Lage, Antikörper zu bilden (Shortmaix, K., and J. Palmer, Cell. Immunol. 2:399t (1971)). Vor einiger Zeit wurde gezeigt, daß 2-Mercaptoäthanol den Makrophagen bei der Antikörpersynthese voll zu ersetzen vermag (Chen. Ch., and J. G. Hirsch, J. Exp. Med. 136 : 604 (1972)). Alle anderen Bestandteile des Systems sind weiterhin notwendig.

Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus von 2-Mercaptoäthanol zeigten, daß 2-Mercaptoäthanol zusammen mit fötalem Kälberserum die DNS-Synthese von T-Lymphozyten stark zu steigern vermag (Lemke, H., and H. G. Opitz, J. Immunol. 117:388 (1976)). Die Beobachtung, daß 2-Mercaptoäthanol ohne Zusatz von Serum gemischte Lymphozytenkulturen zur DNS-Synthese anregt (Katz-Heber, E., A.B.Peck, and R.E. Click, Eur. J. Immunol. 3:379 (1973)), führte zu der Annahme, daß 2-Mercaptoäthanol unmittelbar auf die Lymphozyten wirkt, und daß das in der Kultur befindliche Serum die Wirkung von 2-Mercaptoäthanol in unbekannter Weise zu verstärken vermag.

Es wurde von uns nun überraschenderweise festgestellt, daß bestimmte Mercaptoverbindungen (s. dazu nachfolgende Formel I) und vorzugsweise das 2-Mercaptoäthanol, auf die Antikörpersyn-

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these in vitro nicht über einen unmittelbaren Einfluß der Mercaptoverbindung auf Lymphozyten wirken. Inkubiert man fötales Kälberserum mit der Mercaptoverbindung und entfernt die freie Mercaptoverbindung später durch Lyophilisation, bevor das Serum zu den Milzzellkulturen gegeben wird, so findet man, daß das Serum durch die Vorinkubation mit der Mercaptoverbindung die Fähigkeit erworben hat, Makrophagen bei der Antikörpersynthese vollständig zu ersetzen. Ein so behandeltes Serum führt ebenso wie beispielsweise 2-Mercaptoäthanol zu einer Erhöhung der Überlebenszellzahl und zu einer Verstärkung der Antikörpersynthese· Diese Beobachtung beweist, daß 2-Mercaptoäthanol eine bis dahin inaktive Serumkomponente zu aktivieren vermag. Dies konnte durch teilweise Reinigung eines 2-Mercaptoäthanol-aktivierbaren Serumfaktors MASF bestätigt werden. Der durch 2-Mercaptoäthanol aktivierte Serumfaktor MASF besitzt ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 50 000. Der Faktor befindet sich in unterschiedlichen Konzentrationen in verschiedenen fötalen Kälberseren. Fötale Kälberseren mit einem hohen Anteil an diesem Faktor sind für die Antikörpersynthese in vitro am geeignetsten. "Ungeeignete fötale Kälbereeren besitzen deutlich weniger aktivierbaren Faktor als die sogenannten "guten Seren". Durch Konzentration des Faktors ist es aber möglich, auch aus "ungeeigneten" Seren ausreichend MASF zu isolieren. Bei anderen Seren als fötalen Kälberseren kann der Faktor MASF in allgemeinen nicht in den unbehandelten Vollseren nachgewiesen werden.

Es wurde nun gefunden, daß Blutserumpräparationen menschlichen oder tierischen Ursprungs, welche den durch Umsetzung mit einer Mercaptoverbindung der Formel

R H

HS-C-C-Y (I)

• I
H X

erhaltenen immunregulatorischen Faktor MASF enthalten,

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R für Wasserstoff oder Methyl
X für Hydroxyl oder Amino und

Y für Wasserstoff, Carboxyl oder niederes Alkyl steht, zur Initiierung und Steigerung der Antikörpersynthese verwendet und beispielsweise als Arzneimittel oder als medizinische Hilfsstoffe wie Diagnostika und Reagenzien eingesetzt werden können.

Weiterhin wurde gefunden, daß man die vorgenannten mercaptoaktivierten Blutserumpräparationen in einfacher Art und Weise durch Umsetzung von Blutserum oder Blutserumfraktionen mit Mercaptoverbindungen der Formel (I) und gegebenenfalls durchgeführter biochemischer Trennungsmethoden gewinnen kann.

Setzt man fötales Kälbervollserum als Ausgangsmaterial für die Herstellung der MASF-enthaltenden Blutserumpräparationen als Ausgangsmaterial ein, so ist im Prinzip, wie bereits oben erwähnt, kein biochemischer Trennungsschnitt (wie z. B. Chromatographie oder Präzipitation) notwendig, er ist aber zur Konzentration und Abtrennung von Begleitstoffen wünschenswert.

Bei anderen Seren als den fötalen Kälberserum sind präparative Trennungsschnitte zur Herstellung der MASF enthaltenden Blutserumpräparationen im allgemeinen notwendig.

unbedingt notwendig sind sie z. B. beim Mäuseserum, welches inhibitorische und cytotoxische Substanzen enthält. Weiterhin ist das Erreichen bzw. überschreiten einer bestimmten MASF-Faktor-Schwellenwertkonzentration notwendig, um den gewünschten immunologischen Effekt zu erreichen.

Die Bestimmung der Schwellenwertkonzentration ist mit Hilfe einer Dosis-Wirkungsrelationsbestimmung, beispielsweise mit der bereits eingangs erwähnten Mishell-Dutton-Methode möglich und muß bei jeder Blutserumpräparation experimentell erfolgen.

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Da im heterologen System (Seren anderer Species) alle hochmolekularen Substanzen als potentielle Antigene betrachtet werden müssen, sind Schlußfolgerungen bezüglich eines bestimmten Antigens nur mit Vorbehalt zu ziehen. Es ist deshalb eine unabdingbare Forderung derartige Untersuchungen in einem homologen System durchzuführen, d. h. immunkompotente Zellen und supplementäres Serum muß von der gleichen Spezies stammen. Dies war bisher nicht möglich wegen der oben erwähnten inhibitorischen und/oder cytotoxischen Aktivität solcher Seren.

Durch Abtrennung (z. B. Fällungs- und/oder chromatographische Verfahren) der Inhibitoren und/oder cytotoxischen Substanzen kommt man hier in überraschend einfacher Weise zu wirksamen autologen Präparationen.

Als in der Biochemie üblichen Trennmethoden zur Gewinnung von Blutserumfraktionen, welche den Faktor MASF enthalten, kommen vorzugsweise chromatographische und Präzipitationsmethoden in Frage.

Als chromatographische Trennmethoden seien beispielsweise genannt: Gelchromatographie, z. B. unter Verwendung von quervernetzten Dextranen geeigneter Porengröße (z. B. Sephadex -^ G 100), oder Agarose-Präparate (z. B. Sepharose^) bzw. PoIyacrylamidgele (z. B. Biogel, vorzugsweise Porengröße: P 60 oder P 120). Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung beispielsweise folgender Säulen: DEAE-Sephadex^ (= Diäthylaminoäthylgruppen enthaltendes quervernetztes Polydextran)

SE-Sephadex® («Sulfonyäthylgruppen enthaltendes quervernetztes Polydextran), Ionenaustauscher auf Polystyrolbasis z. B. Dowex^.

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Als Fällungsmittel für die Durchführung von Präzipitationsschritten kommen eine Reihe verschiedener chemischer Substanzen in Frage, beispielsweise anorganische Salze wie Ammoniumsulfat in wässrigen Lösungen verschiedener Konzentrationen, andere geeignete Fällungsmittel sind höhermolekulare Verbindungen, wie z. B. Polyäthylenglykole mit einen vorzugsweisen Molekulargewichtsbereich von 1000 bis 10 000, vorzugsweise von 3000 bis 5000. Weitere Fällungsmittel sind beispielsweise organische Lösungsmittel, wie niedere Alkohole (z. B. Äthanol) oder Ketone (z. B. Aceton). Außerdem ist die Molekularfiltratictn zwecks Ausschluß niedrigmolekularen Materials ein gegebenenfalls anwendbarer Arbeitsschnitt zur Gewinnung von Blutserumfraktionen, welche den Faktor MASF frei von Inhibitoren enthalten.

Die für die Gewinnung der aktivierten Blutserumpräparationen wesentliche Umsetzung mit der Mercaptoverbindung der allgemeinen Formel (I) kann zu Beginn oder am Ende der Präparation, bzw. nach jedem Teilschritt des Herstellungsverfahrens durchgeführt werden.

Hierbei wird die Mercaptoverbindung in Konzentrationen von 0,01 bis 50 mM, vorzugsweise von 1 bis 20 mM hinzugefügt.

Bei einzelnen Mercaptoverbindungen (I) werden beispielsweise folgende Konzentrationen hinzugefügt:

Äthandiol 5 - 10 mM

1-Propanthiol 2 - 10 mM

2-Propanthiol 1 - 10 mM

Cysteamin 1 - 10 mM

Mercaptoäthanol 1 - 5 mM
3-Mercaptopropionsäure 1 - 10 mM

L-Cystein 4 - 20 mM

Thioglycerol 0,01- 10 mM

Dithiothreitol . 2 - 10 mM

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Vorzugsweise verwendet wurde bei allen Präparationen Mercaptoäthanol .

Die Aktivierung des Serumfaktors kann wie eingangs erwähnt, am Anfang oder am Ende bzw. nach jedem Trennungsschritt des Präparationsverfahrens erfolgen, sie erfolgt aber vorzugsweise

Beim humanen Blutserum hat sich folgende Sequenz der Schritte als vorteilhaft erwiesen:

1) Aktivierung des Humanserums mit Mercaptoverbindungen der Formel (I), vorzugsweise mit Mercaptoäthanol

Hierbei wird das Serum 0,5 - 5, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden bei 0 bis 35°, vorzugsweise bei Raumtemperatur (20 - 23°C) mit 1O~³ M Mercaptoäthanol inkubiert.

2) Molekularfiltration zwecks Ausschluß niedrig-und/oder hoch-molekularem Materials (Diaflo Ultrafiltration Membranes, PM3O, XM 100 A)

3) Ammoniumsulfatfraktionierung, der Faktor befindet sich unter den Proteinen, die zwischen 33 % und 55 % (NH^)2 SO^ Sättigung ausfallen.

4) Polyäthylenglykolfraktionierungi der Faktor wird mit einer zehnprozentigen Polyäthylenglykol-(PEG)-Lösung gefällt. Die PEG-Fällung kann an Stelle der Ammonsulfatfällung angewendet werden oder als weiterer Reinigungsschritt der (NH^JgSO^-Ausfällung angeschlossen werden.

5) Fraktionierung der den Faktor MASF enthaltenden Serumfraktion über Sephadex G 100. Die Gelchromatographie kann um eine bessere Reinigung zu erhalten, wiederholt werden.

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6) Trennung der Faktor enthaltenden Fraktion über Ionenaustauscher (z. B. Sephadex AD 50 DEAE).

Hierbei ist zu bemerken, daß zur Herstellung gebrauchsfertiger Blutserumpräparationen nicht unbedingt alle der vorgenannten Schritte zwingend durchgeführt werden (s. dazu auch die Beispiele A bis H).

Die Lyophilisation zum Zwecke der Einengung der Lösungen und zur Entfernung flüchtiger Mercaptane, wie z. B. Mercaptoäthanol kann im Prinzip nach jeden Teilschritt des Aufarbeitungsverfahrens erfolgen. Gegebenenfalls kann an Stelle der Lyophilisation ein anderes Konzentrierungsverfahren angewendet werden, z. B. Fällung mit Alkoholen oder Ketonen, ζ. B. Äthanol oder Aceton oder Konzentrierung durch Molekularsiebfiltration.

Bei allen Stufen des Reinigungsverfahrens aller erfindungsgemäß eingesetzten Blutseren (sowohl humane als auch tierische Seren), werden die verschiedenen gebildeten Fraktionen routinemäßig untersucht, vorzugsweise mit Hilfe der drei folgenden Testsysteme:

1. Bestimmung der Wirkung der MASF enthaltenden Präparation auf die DNS-Synthese von im Hinblick auf die MASF-Faktoraktivierung selektierten speziellen L^₂₁₀-Zellen (sog. L₁₂₁₀-FI0-30-Zellen)

2. Bestimmung der Wirkung der MASF-Faktor enthaltenden Präparationen auf die DNS-Synthese von T-Lymphozyten-Zellen (radioaktive Bestimmungsmethode) (3H-Thymidin-Einbau) und

3. Bestimmung der Wirkung der MASF-Faktor enthaltenden Präparation auf die Antikörpersynthese von Milzzellen. (Mishell-Dutton-System).

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Die beiden Testmethoden 1. und 2. seien im folgenden kurz beschrieben:

1) Wirkung von MASF auf das Wachstum von L₁₅^_n-FIO 30-Zellen (Methode) ¹²¹⁰

Die anmeldungsgemäß verwendete L₁₂₁₀-Zellinie benötigt für ihr Wachstum MASF. Diese Zelle wird als L₁₂₁₀-FIO 30-Zelle bezeichnet. Ihre Wachstumsrate, gemessen am Einbau von *H-Thymidin (TdR) in die DNS ist dosisabhängig von dem angebotenen MASF. Die Zellinie ist somit geeignet für den Nachweis und die Standardisierung von MASF. 2 χ 10 h_A _o„_n-Zellen werden 24 Stunden mit bzw. ohne MASF kultiviert. Die Zellen erhalten während der letzten 6 Stunden 0,5 /u Ci ³H-TdR. (mikro-Curie)

2) T-Lymphozytenzellen ("T-Zellen")-Stimulation (Methode) T-Zellen werden nach der von Julius et al, Eur. J. Immunol. 3_, 645 (1973) beschriebenen Methode isoliert. 5 χ 10^ T-Zellen werden jeweils kultiviert mit bzw. ohne den Mercaptoäthanol aktivierten Faktor (MASF). Nach 48 h erhalten alle Kulturen 1 /u Ci ^H-Thymidin. Nach weiterhen 24 h wird der Einbau von ^H-Thymidin in die DNS der T-Zellen bestimmt. Zellen, die sich vermehren weisen eine deutlich gesteigerte DNS-Synthese auf. Da MASF spezifisch die Proliferation von T-Zellen bewirkt und dies durch einen gesteigerten Einbau von ³H-Thymidin gekennzeichnet ist, ist dieser Test geeignet, die Aktivität von MASF zu bestimmen.

Die erfindungsgemäßen MASF-haltigen Präparationen weisen eine ausgeprägte immunregulatorische, insbesondere immumstimulierende Wirkung auf. Sie eignen sich insbesondere zur Behandlung von Störungen der Makrophagenfunktion und der Lymphozyten-T-Zellenfunktion oder zur Behandlung von induzierten Immundefizienzen, welche z. B. nach der Gabe cytostatischer Medikamente auftreten.

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Weiterhin könnten die erfindungsgemäßen MASF-Präparativen zur Behandlung von anergischen Zuständen insbesondere bei Tumorerkrankungen eingesetzt werden.

Zur Behebung von anergischen Zuständen durch polyklonale Vermehrung von T-Lymphozyten können auf Grund der nachgewiesenen nitrogenen Wirkung die erfindungsgemäßen Präparationen für die Behandlung induzierter anergischer Zuständen, z. B. nach Therapie von Tumorerkrankungen und von chronischen Infektionskrankheiten mit cytotoxischen Substanzen eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen MASF-haltigen Blutserumpräparationen können sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen MASF-haltigen Blutserumpräparationen können in hochreiner Form oder in angereicherten Blutserumpräparationen therapeutisch verwendet werden. Ein Vorteil derartiger Präparationen ist, daß für jede in Betracht kommende Tierspezies und Mensch in einfacher Weise der homologe Faktor zubereitet werden kann.

Beim Einsatz der erfindungsgemäßen Präparation als medizinische Hilfstoffe kommt vor allem die Verwendung als Diagnostika und Reagenzien in Frage.

Man kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen MASF-Präparationen in einfacher Weise Mangelzustände des immunregulatorischen Profaktors diagnostizieren.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen MASF-Präparationen als Reagenzien zur Untersuchung von Lymphozyten eingesetzt werden. Da man,wie oben erwähnt,im homologen System arbeiten kann, eignen sich die erfindungsgemäßen Präparationen auch für die Untersuchung menschlicher Lymphozyten.

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Die neuen erfindungsgemäßen MASF-haltigen Blutserumpräparationen werden parenteral, beispielsweise intravenös, intraperitoneal, subcutan, intramuskulär angewendet, vorzugsweise werden sie intravenös angewendet.

Die Dosierung muß je nach beabsichtigter Anwendungsform und Zielrichtung individuell und mit Hilfe von Standardisierungstesten und Standardpräparaten bestimmt werden.

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Beispiele zur Herstellung von MASF-haltigen Blutserumpräparationen

Beispiel A

20 ml fötales Kälberserum wurden mit Mercaptoäthanol zum Erhalt einer 10"^ molaren Lösung versetzt. Man ließ zwei Stunden lang bei 20 C stehen. Anschließend erfolgte Ammoniumsulfatfällung (fraktionierte Fällung), man isolierte die Fraktion, die zwischen 33 und 55 % Ammoniumsulfatsättigung ausfiel.

Darauf folgte Lyophilisation und erschöpfende Dialyse gegen physiologische Kochsalzlösung.

Die MASF-haltige Fraktion wurde in den vorne beschriebenen biologischen Systemen (L₁₂<io~^{Zellen FI0}"30, DNS-Synthese von T-Lymphozyten und Mishell-Dutton-System getestet.

Beispiel B

20 ml fötales Kälberserum wurden mit Mercaptoäthanol zum Erhalt einer 10~*molaren Lösung versetzt. Man ließ 3 Stunden bei Raumtemperatur (22°C) stehen.

Anschließend erfolgte Ammoniumsulfat-Fraktionierung, wobei wiederum die zwischen 33 und 55 % Ammoniumsulfatsättigung ausfallende Fraktion isoliert wurde.

Die vorgenannte Ammoniumsulfatfraktion wurde über Sephadex'^R' G-IOO aufgetrennt. Als Trennungsmittel wird ein Tris-HCl-Puffer verwendet (0,05 M Tris-HCl / 0,1 M NaCl / pH 7.5).

(Statt Sephadex^ G-IOO kann Sephadex^ G-75, Sephadex^ G 150, Sephacryl' 'S-200 oder Biogel'^R' verwendet werden.)

Anschließend erfolgt Lyophilisation der MASF-haltigen Fraktion und darauffolgene extensive Dialyse gegen physiologische Kochsalzlösung·

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Anschließend Test der MASF-haltigen Fraktion wie bei Beispiel A erwähnt. In Analogie zum obigen für fötales Kälberserum beschriebenen Verfahren wurden noch folgende weitere Seren zu entsprechenden Präparationen verarbeitet: Humanserum, Mäuseserum, Rattenserum, Kaninchenserum und Rinderserum.

Beispiel C

Die Präparation erfolgt, wie bei Beispiel B beschrieben, mit dem Unterschied, daß die Aktivierung des Serumfaktors MASF nicht zu Beginn sondern am Ende des Präparationsweges, d. h. vor der Lyophilisation erfolgte.

Beispiel D

50 ml Humanserum werden mit Mercaptoäthanol zum Erhalt einer 10 molaren Lösung versetzt und 2,5 Stunden lang bei 20⁰C stehen gelassen.

Anschließend erfolgte Ammoniumsulfat-Fällung, man isoliert die bei 33 - 55 % AmmonsulfatSättigung ausfallende Fraktion. Daran schloß sich eine zweite Fällung mit 40-prozentigen Äthanol bei 4⁰C,an. Anschließend wurde über Sephadex^ ' G 100 mit dem Trennmittelι 0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl (pH 7,5) aufgetrennt.

Eine weitere Auftrennung erfolgte mit dem Ionenaustauscher DEAE-Sephadex^ A 50 (Trennmittel 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5). Anschließend erfolgte Lyophilisation und extensive Dialyse gegen physiologische Kochsalzlösung. Zum Abschluß wurden wiederum die bei Beispiel A erwähnten biologischen Tests durchgeführt.

Beispiel E

Präparation in Analogie zur Methode D mit dem Unterschied, daß der Aktivierungsprozeß mit Mercaptoäthanol erst nach dem Ionenaustauscherschritt (DEAE-Sephadex' ') durchgeführt wurde.

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Beispiel F

50 ml Mausserum (bzw. Kaninchenserum) wurden mit Mercaptoäthanol zum Erhalt einer 10 molaren Lösung versetzt (Temperatur 20⁰C, Aktivierungsdauer: zwei Stunden). Anschließend erfolgte Fällung der Serumproteine mit einer 10-prozentigen Polyäthylenglykol-Lösung (Molekulargewicht ca. 4000), 4 Stunden lang bei 20⁰C. Anschließend Molekularfiltration mit Amicon-Filter XM 100 A. Anschließend Trennung der Proteinfraktion über Sephadex^v ' G 100 sowie weitere Trennung über Ionenaustauscher DEAE-Sephadex A 50. Anschließend Lyophilisation und extensive Dialyse gegen physiologische Kochsalzlösung.
Am Schluß biologische Teste wie bei Methode A beschrieben.

Beispiel Q

Die Präparation erfolgte in Analogie zur Methode F mit dem Unterschied, daß der Aktivierungsprozeß erst nach der Fraktionierung über den DEAE-Sephadex-Ionenaustauscher durchgeführt wurde (10~³ M Mercaptoäthanol, 2 Stunden bei 20°C).

Beispiel H

50 ml Humanserum wurde mit Mercaptoäthanol zum Erhalt einer 10 molaren Lösung versetzt und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur (22,5°C) stehen gelassen. Anschließend erfolgte eine Molekularfiltration zum Ausschluß hochmolekularer Bestandteile mittels Amicon-Filter XM 100 A. Weiterhin Molekularfiltration zum Ausschluß niedermolekularer Bestandteile mittels Amicon-Filter PM 30.

Abschließend Durchführung biologischer Tests wie bei Beispiel A beschrieben.

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Beispiel 1

Wirkung des immunregulatorischen Faktors MASF auf die Antikörpersynthese in vitro

Die Wirkung des Faktors MASF auf die Antikörpersynthese läßt sich in einfacher Weise in vitro zeigen. Es wurden Mäuse-Milzzellkulturen die alle zur Antikörpersynthese notwendigen Zellarten enthalten (T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Makrophagen) bzw. solche, aus denen die Makrophagen entfernt worden waren, mit Blutserumpräparationen inkubiert, welche einmal den mit Mercaptoäthanol aktivierten zum anderen den nichtaktivierten Faktor MASF enthielten. Alle Kulturen erhielten Schaferythrozyten als Antigen. Die Antikörperbildung wurde nach fünftägiger Kultivierung gemessen, Ergebnisse s. Tabelle 1. Die angeführten Ergebnisse zeigen, daß der Faktor die Funktion des Makrophagen bei der Antikörpersynthese zu ersetzen vermag. Der Nachweis der Antikörperbildung erfolgte durch Messung der Synthese von "19 S-Antikörpern"· Angegeben wird in Tabelle 1 die Zahl der Antikörper bildenden Zellen pro Kultur (Plaque forming cells ("PFC") / Kultur). Bei den 19 S-Antikörpern handelt es sich um Antikörper des IGM-Typs. (Beschreibung der Testmethode tei Mishell u. Dutton, J. Exp. Med. 126 : 423 (1967).

Die Makrophagen wurden aus der Milzzellsuspension nach der Methode von Lundgreen et al, Clin. Exp. Immunol.

3, 817 (1968) entfernt.

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Tabelle 1

Verwendetes
Zellsystem

Blutserumpräparation ! enthaltend Faktor MASF

Synthese von 19 S-Antikörpern (PFC / Kultur)

Mäusemilzzellen ί aktiviert

! (hergest. gemäß Bsp. A) , 5260

Mäusemilzzellen

nicht aktiviert j

(d. h. Bsp. A ohne Mer- i captoäthanolzusatz) ί 3970

Makrophagen- j aktiviert (hergest. gefreie Milzzellen: maß Bsp A)

4950

Makrophagen- ί nicht aktiviert freie Milzzellen (d. h. Bsp. A ohne Mer-

captoäthanol-Zusatz)

< 100

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Beispiel 2

Ersatz von Serum durch Faktor MASF

In den bisher bekannten, normalen in-vitro Antikörper synthetisierenden Systemen ist fötales Kälberserum absolut notwendig. Die in der Tabelle 2 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen die Wirkung von Blutserumpräparationen, welche den mit Mercaptoverbindungen aktivierten Faktor enthalten mit bzw. ohne Zusatz von fötalem Kälberserum auf die Antikörpersynthese von normalen Milzzellen (enthaltend u. a. T-Lymphozyten und B-Lymphozyten und Makrophagen) bzw. makrophagenfreien Milzzellen der Maus. Die Ergebnisse zeigen, daß MASF allein in der Lage ist, eine Antikörpersynthese zu ermöglichen und somit das gesamte übrige fötale Kälberserum zu ersetzen. Die Antikörpersynthese wird wiederum durch Bildung von 19 S-Antikörpern in Analogie zu der bei Tabelle 1 genannten Methodik gemessen.

Tabelle 2

Verwendetes Zellsystem

Fötales Kälberserum

Synthese von 19 S-Antikörpern (PFC/Kultur)

Gemisch aus fötalem Kälberserum
und Blutserumpräparation, welche
den mit Mercaptoäthanol aktiv. MASF- äthanol ak-Faktor enthält . tiv. MASF-(hergest. gemäß
Bsp. B)

Blutserumpräpara tion, welche den mit Mercapto-

Faktor enthält (hergest. gemäß Bsp. B;

Milzzellen ! (enthaltend 1 T- und B-Lympho-i zyten und Makro-! phagen) !

2890

6350

6960

Makrophagenfreie Milzzellen (enthaltend nur T-u. ß-Lymphocyten).

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100

5970

6330

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Beispiel 3

MASF-Faktor-Gehalt in verschiedenen fötalen Kälberseren

Drei verschiedene fötale Kälberseren, von denen nur eines in der Lage ist, Milzzellen eine Antikorpersynthese in vitro zu ermöglichen, werden hinsichtlich ihres Gehaltes an 2-Mercaptoäthanol-aktivierbarem Faktor untersucht. Milzzellkulturen erhalten unterschiedliche Dosen der Faktorpräparation, Die Antikorpersynthese wird am 5. Tag bestimmt. Die Ergebnisee (Tabelle 3) zeigen, daß das fötale Kälberserum, das normalen Milzzellen eine Antikorpersynthese ermöglicht, im Vergleich zu den beiden anderen Seren, die dies nicht vermögen, eine deutlich höhere Konzentration an aktivierbarem Faktor besitzt. Die unterschiedliche Wirkung von fötalen Kälberseren auf die Antikorpersynthese in vitro läßt sich somit auf den unterschiedlichen Gehalt an MASF-Faktor in den einzelnen Seren zurückführen.

In Tabelle 3 wird wiederum in Analogie zu den Tabellen 1 und 2 die Bildung von 19 S-Antikörpern als Maß für die Immunreaktion angegeben.

Tabelle 3 j

Zugabe verschiedener Dosen (angegeben in Prozent)
einer Blutserumpräparationj welche den mit Mercaptoäthanol aktivierten MASF-Faktor enthält ! (hergest. gemäß Bsp. B) !

19 S-Antikörpersynthese (PFC / Kultur)

Fötales
Kälberserum

Fötales Kälberserum II

Fötales Kälberserum III

5 %	'. 4350	■	-. 100	1740	<100
10 %	; 9050	- 18 -	4400	< 100
20 %	10070	809836/0073	9700	2030
30 %	10000	9400	4650
40 %	-	10100	8050
50 %	-	8620
0 (Kontrolle)	<100	<100
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Beispiel 4

Wirkung von MASF auf das Wachstum von Zellinien.

Permanente Zellinien lymphoiden Ursprungs benötigen in der Regel fötales Kälberserum für ihr Wachstum. Tabelle 4 zeigt, daß die oben genannten Zellinen ausschließlich 2-Mercaptoäthanol-aktivierten Faktor benötigen.

Es ist somit möglich, das sonst übliche fötale Kälberserum durch den MASF-Faktor zu ersetzen. Diese Tatsache hat in Bezug auf die Standardisierung des Wachstums von Zellinien große Vorteile.

Tabelle

Permanente Zellinien lymphoiden Urprungs erhalten

DNS-Synthese / 1O⁵L_121QFIO-3O-Zellen / 3H-Thymidineinbau (cpm)*

b) Fötales Kälberserum umgesetzt mit Mercaptoäthanol

c) Blutserumpräparation, welche den mit Mercaptoäthanol aktivierten Faktor MASF enthält (hergest. gemäß Bsp. A)

d) Blutserumpräparation, welche den nicht aktivierten Faktor enthält (analog Bsp. 1, aber ohne Aktivierung mit Mercaptoäthanol)

e) Blutserumpräparation aus Humanserum (hergest. gemäß Bsp. D)

f) Blutserumpräparation aus Humanserung / nicht aktivierter Faktor (analog Bsp. D, aber ohne Aktivierung mit Mercaptoäthanol)

g) Blutserumpräparationen aus Mausserum (hergest. gemäß Bsp. F)

270 12300

14600

320

9770

110

7650

Le A 17 716

- 19 809836/0073 * cpm = "counts per minute"

Ii

Fortsetzung Tabelle 4

Permanente Zellinien lymphatischen Ursprungs erhalten

DNS-Synthese / 1O⁵L_121G-FIO-3O-ZeIlen / 3H-Thymidineinbau (cpm) *

h) Blutserumpräparation aus Mausserum / nicht aktivierter Faktor (Analog Bsp. F, aber ohne Aktivierung mit Mercaptoäthanol) '

80

* cpm = "Counts per minute"

Beispiel 5

Nachweis von MASF-Faktor in verschiedenen Seren

Fötales Kälberserum war bisher das einzige Serum, welches Milzzellen in vitro eine Antikörpersynthese ermöglicht. Da der 2-Mercaptoäthanol-aktivierte Faktor MASF in fötalem Kälberserum die für die Antikörpersynthese allein notwendige Substanz darstellt, wurden verschiedenste Seren daraufhin untersucht, ob sie diesen Faktor enthalten, und wenn, in welcher Konzentration. Wie Tabelle 5 zeigt, wurde in allen untersuchten Seren der MASF-Faktor gefunden.

Tabelle 5

Isolierung von Fraktionen, welche den mit Mercaptoäthanol aktivierten Faktor MASF enthalten (gemäß Bsp. B) aus dem Serum von

Synthese von 19 S-Antikörpern PFC / Kultur

Maus

Ratte

Kaninchen

Rind

Mensch

Le A 17 716

7360 5240 8310 4280 9420

- 20 -

809836/0073

270,780

Beispiel 6

Stimulation der DNS-Synthese von T-Zellen durch MASF

Die Zugabe von aktivierten MASF-Faktor zu Milzzellkulturen erhöht signifikant die DNS-Synthese dieser Kulturen.

Tabelle 6 zeigt, daß der aktivierte MASF-Faktor spezifisch die DNS-Synthese von T-Zellen stimuliert. Das Ausmaß der DNS-Synthese von T-Zellen ist abhängig von der Dosis des aktivierten MASF-Faktors.

Tabelle 6

Lymphozytenpopulation

DNS-Synthese /10 Zellen (^H-Thymidin-Einbau, cpm)

Verwendete Faktordosis (fötale Kälberserum- \ präparation gemäß Beispiel B)

1% j 2,5% ■■ 5%

Milzzellen
B-Lympho zyten
T-Lymphozyten

200
400
420

1700 1070 2640

5000

960

4210

10 %

20

7600 830

10130

6300

950

9460

Beispiel 7

In vivo-Wirksamkeit des Faktors MASF / Kaninchen-Versuch

Es sollte die Wirkung des aktivierten Faktors MASF auf die Antikörpersynthese in vivo untersucht werden, Kaninchen wurde Serum entnommen, eine Hälfte des Serums wurde mit Mercaptoäthanol aktiviert, während die andere Hälfte nicht aktiviert wurde. Der Faktor wurde gemäß Beispiel F präpariert. Ein Teil der Tiere bekam seinen eigenen Faktor in aktivierter Form appliziert, die andere Hälfte den nicht aktivierten Faktor. Gleichzeitig mit der Verabreichung des Faktors erhielten die Kaninchen Rinderserumalbumin (RSA) als Antigen. Nach vierzehn Tagen wurde der Antikörpertiter gegen Rinderserumalbumin in den einzelnen Seren bestimmt. Es zeigte sich, daß die mit ihrem eigenen aktivierten Faktor behandelten Kaninchen eine deutlich höhere Antikörpersynthese auf-

Le A 17 716

- 21 -

809836/0073

wiesen als die Kontrolltiere. (S. dazu die Zusammenstellung der Ergebnisse in Tabelle 7).

Die Antikörpertiter wurde immunelektrophoretisch ermittelt. Tabelle 7

verwendete Blutserumpräparation Anti-RSA-Antikörper welche den Faktor MASF enthält (Kaninchenpräparation, hergest. gemäß Beispiel F)

aktiviert mit Merkaptoäthanol + +

nicht aktiviert (analog Bsp. F, aber ohne Mercaptoäthanol-Umsetzung)

Kontrollen

Hierbei bedeutet: + + = Antikörper vom IgG-Typ

- = keine Antikörperbildung

Beispiel 8

In vivo-Wirksamkeit des Faktors MASF / Mäuseversuch

Untersucht wurde die Wirkung von aktiviertem menschlichen Faktor MASF auf die Antikörpersynthese von Mäusen. Mäuse erhielten als Antigen Schaferythrozyten. Gleichzeitig erhielten die Tiere mit Mercaptoäthanol aktivierten Faktor bzw. nicht aktivierten Faktor. Wie die Ergebnisse zeigen, ist die Antikörpersynthese gegen Schaferythrozyten bei den Tieren, die aktivierten Faktor erhielten, deutlich erhöht.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 8 zusammengestellt. Angegeben wird die Zahl Antikörper bildender Zellen (19-S-Antikörper) / 10° Milzzellen.

Le A 17 716 - 22 -

809836/0073

Tabelle 8	19 S-Antikörpersynthese PPC / 10⁶ Milzzellen
Testsubstanz	44
Kochsalz

Blutserumfraktion, welche den mit Mercaptoäthanol aktivierten Faktor MASF enthält (Human-serumpräparation gemäß Bsp. E)

754

Blutserumfraktion, welche den nicht aktivierten Faktor MASF enthält •(In Analogie zu Bsp. E, aber ohne Mercaptoäthanolaktivierung)

244

Beispiel 9

Wirkung des durch 2-Mercaptoäthanol aktivierten Faktors MASF auf die zelluläre Immunität

Der Faktor MASF wirkt auf T-Lymphozyten. Diese Zellen sind vor allem Träger der zellulären Immunität. Die zelluläre Immunität wird üblicherweise in gemischten Lymphozytenkulturen gemessen, d. h.: Lymphozyten eines Spenders werden mit Lymphozyten eines anderen Spenders gemischt. Eine der beiden Lymphozytenpopulationen wird zuvor bestrahlt, um Reaktionen dieser Zellen auszuschließen. Diese Zellen dienen als Stimulatus. Die unbehandelte Lymphozytenpopulatxon erkennt die bestrahlten allogenen Lymphozyten als fremd und reagiert mit gesteigerter DNS-Synthese. Die DNS-Synthese wird über den Einbau von ³H-Thymidin bestimmt. Wie Tabelle zeigt, weisen gemischte Lymphozytenkultüren eine deutlich gesteigerte DNS-Synthese auf, d. h. die zelluläre Immunität wird durch MASF gesteigert.

Le A 17716

- 23 -

809836/0073

Tabelle 9

Zusammensetzung
der Lymphozytenkulturen

Die Lymphozytenkulturen enthalten

Blutserumfraktion, welche den Faktor MASF enthält (hergest. nach Bsp. D)

H-Thymidin-Einbau icpm (counts per minute)

324

I Medium

(RPMI- 1640-Medium) 80

Blutserumfraktion, welche den Faktor MASF enthält (hergest. nach Bsp H) 7212

Medium

(RPMI-1640-Medium) 1565

bzw. B = Lymphozyten dieses Spenders werden bestrahlt

RPMI-Medium ist wie folgt zusammengestellt;

RPMI 1640 Mediumzusammensetzung (Mengen in mg/L)

(Literatur: MOORE, G. E. et. al., J. Am. Med. Assoc. 199, 519 (1067))

Na₂HP0₄7H₂0

MgS0₄7H₂0

Ca(NO,)₂4H₂(

D-Glucose

Phenolrot

Le A 17 716

6000 400

1512 100 100

2000 5

- 24 -

809836/0073

Fortsetzung Tabelle;

NaHCO,

2000

L-Arginin	200	- 2
L-Asparagin	50
L-Asparaginsäure	20
L-Cystin	50
L-Glutamin	300
L-Glutaminsäure	20
Glycin	10
L-Histidin	15
L-Hydroxyprolin	20
L-Isoleucin	50
L-Leucin	50
L-Lysin HCl	40
L-Methionin	15
L-Phenylalanin	15
L-Prolin	20
L-Serin	30
L-Threonin	20
L-Tryptophan	5
L-Tyrosin	20
L-Valin	20
Glutathion	1
Biotin	0,2
Vitamin B₁₂	0,005
D-Ca-Pantothenat	0,25
Cholinchlorid	3
Folsäure	1
i-Inosit	35
Nicotinamid	1
p-Aminobenzoesäure	1
Pyridoxin HCl	1
Riboflavin	0,2
Thiamin HCl	1
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809836/0073

Claims

Patentansprüche

1) Blutserumpräparationen welche den durch Mercaptoverbindungen der Formel

R H

Il

HS-C-C-Y (I) t t

H X

aktivierten Faktor MASF enthalten, wobei R für Wasserstoff>oder Methyl X für Hydroxyl oder Amino und

Y für Wasserstoff, Carboxyl oder gegebenenfalls durch Hydroxyl und/oder Mercapto substituiertes Alkyl (C^-Cg) steht.

2) Blutserumpräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich hierbei um aktiviertes fötales Kälbervollserum handelt.

3) Blutserumpräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um aktivierte Blutserumfraktionen handelt.

4) Blutserumpräparationen nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Mercaptoäthanol als Verbindung der Formel (I) als Aktivierungsmittel eingesetzt wird.

5) Verfahren zur Herstellung von Blutserumpräparationen,

welche den durch Mercaptoverbindungen der Formel R H

I I

HS-C-C-Y (I) t I

H X

aktivierten Faktor NASF enthalten, wobei R für Wasserstoff oder Methyl X für Hydroxyl oder Amino und

Y für Wasserstoff, Carboxyl oder Alkyl (C₁-Cg) steht, dadurch gekennzeichnet, daß man

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ORIGINAL INSPECTED

a) zum Erhalt von Präparationen, welche aktiviertes fötales Kälbervollserum enthalten, fatales Kälbervollserum mit einer Mercaptoverbindung der Formel (I), in welcher die Substituenten R, X und Y die oben angegebene Bedeutung besitzen, umsetzt,

oder

b) zum Erhalt von Präparationen, welche aktivierte Humanblutserumfraktionen oder Blutserumfraktionen anderer Säugerspezies enthalten, Vollseren mit Hilfe einer oder mehrerer chromatographischer und/oder Präzipitationsschritte fraktioniert und mit einer Mercaptoverbindung der Formel (I), in welcher die Substituenten R, X und Y die oben angegebene Bedeutung besitzen, umsetzt, wobei der Aktivierungsschritt mit der Mercaptoverbindung (I) zu Beginn oder nach jedem Teilschritt des Verfahrens erfolgen kann.

6) Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Blutserumpräparation gemäß Anspruch 1.

7) Medizinische Hilfsstoffe gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Blutserumpräparation gemäß Anspruch 1.

Θ) Medizinischer Hilfsstoff nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Diagnostikum handelt.

9) Medizinischer Hilfsstoff nach Anspruch 7_f dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Reagens handelt.

10) Verfahren zur Immunregulation, dadurch gekennzeichnet, daß man Blutserumpräparationen gemäß Anspruch 1) Menschen oder Tieren appliziert, die an immunregulatorischen Störungen erkrankt sind.

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