AT395017B - Verfahren zur herstellung eines neuen lymphokins (lk 2) sowie verwendung von lk 2 zur herstellung eines pharmazeutischen praeparates - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines neuen lymphokins (lk 2) sowie verwendung von lk 2 zur herstellung eines pharmazeutischen praeparates Download PDF

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AT395017B
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Description

AT 395 017 B
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Lymphokins (LK 2) mit folgenden physiochemischen Eigenschaften: (1) Molekulargewicht: 20 000 ± 2000 Dalton (2) Isoelektrischer Punkt: pl = 6,2 ± 0,3 (3) Elektrophoretische Mobilität: auf Disc-PAGE, Rf=0,29 ± 0,02 (4) UV-Absorptionsspektrum: ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm (5) Löslichkeit in Lösungsmitteln: löslich in Wasser, Salz- und Phosphatpuffem; kaum löslich oder unlöslich in Äthyläther, Äthylacetat oder Chloroform (6) Farbreaktion:
Protein-positiv bei der Lowry’s -Methode oder Mikrobürettenmethode; Saccharid-positiv bei der Phenol-Schwefelsäuremethode oder der Anthron-Schwefelsäuremethode (7) Biologische Aktivitäten: zytotoxisch bei L929-Zellen; zytostatisch bei KB-Zellen; im wesentlichen frei von Interferonaktivität (8) Stabilität in wässeriger Lösung: stabil bis 60 °C, wenn 30 Minuten bei pH 7,2 inkubiert; stabil im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0, wenn 16 Stunden bei 4 °C inkubiert, und (9) Stabilität bei Kryoaufbewahrung: stabil bei -4 °C über einen Zeitraum von einem Monat oder länger.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von LK 2 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates.
Lymphotoxin (LT) und der Tumornekrosefaktor (TNF) sind als Lymphokine bekannt, welche Tumorzellen schädigen. LT istbeispielsweise in Aoki, Ryuichi et aL beschrieben SHIN-MENEKIGAKU SOSHO. Band6, „Lymphokine“ Seiten 87-105(1979), veröffentlicht vonlgaku-Shoin. Tokyo, weiters inin Vitro Method in Cell-Mediatedlmmnnitv. herausgegeben von B. R. Bloom, und P. R. Glade, veröffentlicht durch Academic Press, Inc. (1971) und Cellular Immunologv. Band 38, Seiten 388-402 (1978); TNF ist in E.A. Carswell et aL, Proceedines of the National Academv of Sciences of the U.S.A.. Band 72, Nr. 9, Seiten 3.666 - 3.670 (1975) und Lvmphokines. Band 2, Seiten 235-272, „Tumor Necrosis Factor'1, herausgegeben von E. Pick, veröffentlicht durch Academic Press, Inc. (1981).
Vor kurzem offenbarte H. Ohnishi et al. ein antionkotisches lymphokines Glycoprotein im japanischen Patent KokaiNr. 146.293/83. C. Milstein besprach monoklonale Antikörper in Scientific American. Band 243, Nr. 4, Seiten 56-64 (1980).
InChemotherapeutika werden im allgemeinen ein odermehrereAnteilealkylierende Mittel,Stoffwechselhemmer, antionkotische Antibiotika und pflanzliche Alkaloide verwendet
Chemotherapeutika jedoch haben den Nachteil, daß ihre Verwendung eine übermäßige Nebenwirkung auf die Patienten haben kann, daß das Tumorspektrum der Chemotherapeutika relativ eng und ungenügend ist und daß die Chemotherapeutika für die Herbeiführung arzneiresistenter Tumore verantwortlich sind.
Die Erfinder haben unter Bezug auf das vorangehend Gesagte Lymphokin über die Dauer von Jahren studiert Als Ergebnis wurde ein neues Lymphokin mit physiochemischen Eigenschaften gefunden, die völlig unterschiedlich zu denen der bekannten Lymphokine und zur zytotoxischen Aktivität bei bösartigen Tumorzellen sind.
Das «findungsgemäße Verfahren besteht nun darin, daß eine zur LK 2 Herstellung geeignete menschliche Zelle, die ein Glied ausgewählt aus der Gruppe umfassend Namalwa-Zelle (ATCC CRL1432), BALL- 1-Zelle, TALL-1-Zelle, NALL-l-Zelle, M-7002-Zelle, B-7101-ZeUe, JBL-Zelle, EBV-Sa-Zelle, EBV-Wa-Zelle, EBV-HO-Zelle, MOLT-3-Zelle, (ATCC CRL 1552), CCRF-SB-ZeUe (ATCC CCL 120), CCRF-CEM-Zelle (ATCC CCL 119), BALM 2-Zelle, DND-41 -Zelle und Mono- 1-Zelle ist, einem LK 2 Induktor, der ein Glied ausgewählt aus der Gruppe umfassend a-Interieroninduktor.y-Interferoninduktor odereine Mischung davon ist, ausgesetzt und das angesammelte LK 2 gewonnen wird.
Die menschliche Zelle ist beispielsweise ein menschlicher Leukozyt, ein menschlicher Lymphozyt und bestehende Zellstämme davon. Ein menschlicher Leukozyt und Lymphozyt kann aus frischem menschlichen Blut -2-
AT 395 017 B isoliert werden. Der bestehende menschliche Zellstamm kann mit der herkömmlichen in vitro-Methode stark vermehrt werden. Für ein wirkungsvolleres Verfahren ist es wünschenswert, eine in vivo-Zellteilung zu verwenden. Nach einem Merkmal der Erfindung wird die menschliche Zelle erhalten durch Transplantieren der menschlichen Zelle in einen nichtmenschlichen Warmblüter; Füttern des Tieres, um der menschlichen Zelle die Nutzung der Nährkörperflüssigkeit des Tieres für ihre Vermehrung zu ermöglichen, und
Entfernung und Desaggregierung des im Tier gebildeten Tumors.
Unterschiedlich zur in vitro-Zellteilung benötigt das in vivo-Verfahren kein oder viel weniger teures Serum enthaltendes Nährmilieu und weniger Überwachung während der Zellteilung, und die vermehrten menschlichen Zellen haben eine bedeutend höhre LK 2-Aktivität.
Außerdem kann beim in vivo-Verfahren der menschliche Zellstamm einfach geteilt werden, indem die von einem nicht menschlichen Warmblüter zugeführte Nährkörperflüssigkeit verwendet wird.
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung wird die menschliche Zelle erhalten durch: Suspendieren der menschlichen Zelle in einer Diffusionskammer, in welcher die Nährkörperflüssigkeit eines nichtmenschlichen Warmblüters der menschlichen Zelle zugeführt wird;
Einbetten oder Anbringen der Diffusionskammer in oder auf dem nichtmenschlichen Warmblüter derart, daß die Nährkörperflüssigkeit des Tieres der menschlichen Zelle innerhalb der Kammer zugeführt wird; Füttern des Tieres, um der menschlichen Zelle die Nutzung der Nährkörperflüssigkeit für ihre Vermehrung zu ermöglichen, und
Einsammeln der vermehrten menschlichen Zellen aus der Kammer.
In jedem Fall werden die Tiere in herkömmlicher Art gefüttert
Darüberhinaus hat das in vivo-Verfahren zusätzlich den Vorteil, daß eine wesentlich stabilere und raschere Zellvermehrung, eine höhere Zellproduktion und eine extrem höhere LK 2 Produktion als mit dem invitro-Verfahren erzielt werden.
Die für die Erfindung verwendbaren menschlichen Zellstämme können solche sein, welche LK 2-produzierfähig, transplantierbar in einen nicht menschlichen Warmblüter, und im Tier rasch vermehrbar sind. Beispielsweise sind eine ganze Reihe menschlicher Zellen, welche in Protein. Nucleic Acid and Enzvme. Band 20, Nr. 6, Seiten 616-643 (1975) aufgelistet sind, für die Erfindung verwendbar. Speziell geeignet sind menschliche Lymphoblastenstämme, wie etwa Namalwa (ATCC CRL 1432, wie im Journal of Clinical Microbiologv. Band 1, Seiten 116-117 (1975) beschrieben; BALL-1, TALL-1 und NALL-1, wie von I. Miyoshi in Nature. Band 267, Seiten 843-844 (1977) beschrieben; M-7002und B-7101, wie in The Journal of Immunologv. Band 113, Seiten 1.334-1345 (1974) beschrieben; JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT-3 (ATCC CRL 1552) und EB V-HO, wie in The Tissue Culture. Band 6, Nr. 13, Seiten 527-546 (1980) beschrieben; CCRF-SB (ATCC CCL 120); CCRF-CEM (ATCC CCL 119); BALM2; DND-41; und andere bestehendeZellstämme, welche durch Transformation normaler menschlicher Monozyten oder Granulozyten mittels eines karzinogenen Virus, Mittels oder Bestrahlung erhalten werden. Die Teilungsrate und/ oder LK2Produktivitätpro Zelle dieses Zellstammes kann durchZellfusionstechnik,welchePolyäthylenglykol oder ein Sendai-Virus verwendet, oder durch Genwiedervereinigungstechnik, welche Nucleasen, Ligasen, DNA-Polymerasen etc. verwendet, verbessert werden.
Durch die Auflistung der verwendbaren menschlichen Zellstämme in der Beschreibung ist keine Begrenzung irgendwelcher Art des Anwendungsbereiches der Erfindung beabsichtigt
Ein oder mehrere Glieder dieser Zellstämme können in Kombination in den Stufen bis zur LK 2 Induktion verwendet werden, wie im folgenden beschrieben. Falls notwendig, können menschliche Leukozyten oder Lymphozyten, welche aus frischem, menschlichen Blut gewonnen werden können, in Verbindung mit irgendeinem der menschlichen Zellstämme verwendet werden.
Der für die Erfindung geeignete nicht menschliche Warmblüter soll einer von jenen sein, in welchem eine solche menschliche Zelle teilbar ist wobei erfindungsgemäß der nichtmenschliche Warmblüter ein Geflügel oder Säugetier ist Beispiele für Geflügel sind etwa Huhn und Taube, sowie für Säugetiere, Katze, Affe, Kaninchen, Ziege, Schwein, Pferd, Kuh, Guineaschwein, Ratte, Nacktratte, Hamster, Maus, Nacktmaus etc.
Weil die Transplantation einer menschlichen Zelle auf ein Tier eine ungewünschte Immunreaktion hervorruft, istnach einem weiteren Merkmal das Verfahren erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daßder nichtmenschliche Warmblüter immunschwach ist oder eine unterdrückte Immunität aufweist Dabei ist die Verwendung eines nichtmenschlichen Warmblüters im jüngstmöglichen Stadium, beispielsweise Ei, Embryo oder Fötus, oder Neugeborenes oder Kleintier wünschenswert, um solche Immunreaktionen soweit als möglich herabzusetzen.
Vor der Transplantation kann das Tier mit Röntgen- oder γ-strahlen von etwa200-600rem bestrahlt werden oder mit einem Antiserum oder einem Immununterdrücker gespritzt werden, um die Immunreaktion auf den niedrigst möglichen Wert herabzusetzen. Wenn ein immundefizientes Tier, wie etwa eine Nacktmaus oder eine Nacktratte als -3-
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Wirt verwendet wird,kann jeder derzuvor erwähnten menschlichenZellstämme ohne solche Vorbehandlung in diese Tiere transplantiert werden und rasch mit geringerem Risiko, unerwünschte Immunreaktionen zu verursachen, vermehrt werden, weil diese Tiere sogar in ihrem erwachsenen Zustand wenig Immunreaktion zeigen.
Man kann die Zellteilung und/oder die vermehrte Produktion von LK 2 durch aufeinanderfolgende Transplantation , welche die gleichen oder unterschiedliche nicht menschliche Warmblüter verwendet, stabilisieren. Diese Zielekönnen erreicht werden, indem beispielsweisezuerst ein menschlicher Zellstamm in einen Hamstertransplantiert und in diesem vermehrt wird, und darauffolgend die geteilte menschliche Zelle einer Nacktmaus transplantiert wird. In diesem Fall kann die nachfolgende Transplantation mit einem nichtmenschlichen Warmblüter der gleichen Klasse oder Ordnung genausogut wie mit solchen der selben Art oder Gattung durchgeführt werden.
Die menschliche Zelle kann an jeder Stelle des Tieres so lange transplantiert werden, als sich die menschliche Zelle in ihrer beispielsweise in der Allantoishöhle befindlichen, intravenösen, intraperitonealen oder subcutanen Lage teilt
Alternativ dazu werden die menschlichen Zellen durch Anordnung in einer herkömmlichen Diffusionskammer unterschiedlicher Form und Größe geteilt welche mit einem geeigneten Hilfsmittel, das eine Kontamination der Kammer mit der Tierzelle verhindert, aber die menschliche Zelle mit der Nährkörperflüssigkeit versorgt ausgerüstet ist die Kammer beispielsweise intraperitoneal im Tier eingebettet sowie der menschlichen Zelle eine Teilung durch Erhalten der Nährköiperflüssigkeit aus dem Tier in der Kammer ermöglicht wird.
Erfindungsgemäß istdieDiffusionskammermiteinem odermehreren Membranfiltern,HohlfäsernoderUltrafiltem mit einer Nennporengröße von 10“^ -10'^ m ausgerüstet Daniberhinaus kann die Diffusionskamm»- so ausgebildet und angeordnet sein, beispielsweise auf dem Tier, daß die Nährflüssigkeit in der Kammer frei durch die Kammer zirkulieren kann. Die Kultur in der Kammer kann während der Zellteilung durch (ein) transparente(s), in die Seitenwand(wände)eingesetzte(s) Seitenfenster beobachtetwerden, und/oder die Kammer kann per sein Intervallen von einer frischen ersetzt werden, um die Zellteilung über den Zeitraum der Lebensdauer des Tieres ohne Verlust fortzusetzen und die Zellproduktion pro Tier wesentlich zu vermehren.
Da infolge Ermangelung direkten Kontaktes der menschlichen Zelle mit der tierischen Zelle solche Diffusionskammem eine viel weniger unerwünschte Immunreaktion auslösen, kann jeder nichtmenschliche Warmblüter bequem ohne Vorbehandlung, um solch eine Immunreaktion zu verringern, verwendet werden, und die geteilte, lebensfähige menschliche Zelle kann einfach aus der Diffusionskammer erhalten werden.
Die Fütterung der Tiere kann auf gewöhnliche Weise durchgeführt werden und keine spezielle Behandlung, auch nicht nach der Transplantation, ist notwendig.
Die notwendige Zeitdauer, um eine maximale Zellteilung zu erreichen, liegt im allgemeinen zwischen einer und zehn Wochen. Die Anzahl der so erhaltenen menschlichen Zellen liegt bei etwa 10^-10^ Zellen pro Tier und mehr.
Insbesondere nimmt die transplantierte menschliche Zelle erfindungsgemäß auf etwa das l(r - 10^-fache oder mehr zu, was etwa das 10-10^-fache oder höher von jenem ist, was durch Impfen und Teilen der menschlichen Zelle in einem in vitro Nährkulturmedium ist. Dies ist sehr vorteilhaft bei der Herstellung von LK 2.
Jede Methode ist für die Erfindung verwendbar, solange damit eine LK 2 Herstellung in der geteilten Zelle angeregt werden kann. Die geteilte Zelle wird im Tier, das als Wirt für die Zellteilung verwendet wird, einem LK 2 Induktor ausgesetzt. Beispielsweise wird eine menschlicheZelle, geteilt in Ascitelösung, oder eine Tumorzelle, beispielsweise subcutan ausgebildet, direkt in vivo einem LK 2 Induktor ausgesetzt, um LK 2 Herstellung auszulösen, und das angesammelte LK 2 wird aus dem Ascite, Serum und/oder Tumor entfernt, gefolgt von einer Vermehrung von LK 2.
Im anderen Fall wird die geteilte menschliche Zelle dem Tier entnommen und sodann in vitro einem LK2 Induktor ausgesetzt. Beispielsweise ist die geteilte menschliche Zelle, welche durch Entfernen aus der Ascitelösung oder Extrahieren und Zerteilen der beispielsweise subcutan gebildeten Tumormasse(n) erhalten wird, in einem Nährkulturmedium suspendiert, auf eine Temperatur von etwa 2040 °C vorgewärmt, um eine Zelldichte von etwa 10^-10° Zellen/ml zu geben, und einem LK 2 Induktor in vitro ausgesetzt, gefolgt von einer Rückgewinnung des angehäuften LK 2 aus der Kultur.
Wenn ein herkömmlicher Typ einer Diffusionskammer verwendet wird, erfolgt das Aussetzen der geteilten menschlichen Zelle einem LK 2 Induktor in der Kammer oder nach der Entnahme.
Die so erhaltene menschliche Zelle kann für weitere 14 Tage in vitro gezüchtet werden, um ihre Fortpflanzungszeit vor der LK 2-Induktion zu regulieren.
Die LK 2 Produktion pro Tier kann durch Verwenden einer oder mehrerer der folgenden Verfahren weiter vermehrt werden: (1) Ein Verfahren, bei welchem die geteilte menschliche Zelle einem LK 2 Induktor im Tier ausgesetzt wird, welches als Wirt für die Zellteilung verwendet wurde, und sodann von (einer) gewissen Stelle(n) des Tieres oder seines ganzen Körpers eingebracht wird, gefolgt von einem in vitro Aussetzen der menschlichen Zelle einem LK 2 Induktor, -4-
AT 395 017 B (2) ein Verfahren, bei welchem die menschliche Zelle wiederholt einem LK 2 Induktor ausgesetzt wird, und (3) ein Verfahren, bei welchem die im Tier eingebettete oder mit ihm verbundene Diffusionskammer in Intervallen durch frische ersetzt wird.
Die für die Erfindung verwendbaren LK 2 Induktoren sind herkömmliche a-Interferon Induktoren (IFN-a-Induktoren) wie etwa Virus, Nukleinsäure und Nukleotid; und herkömmliche γ-Interferon Induktoren (IFN-y-Induktoren) wie etwa Phytohaemagglutinin, Concanavalin A, Pokeweed Mitogen, Lipopolysaccharid, Endotoxin, Polysaccharid und Bakterien.
Antigene wirken auf sensibilisierte Zellen als LK 2 Induktor.
Die LK 2 Produktion kann durch eine kombinierte Verwendung von IFN-a- und IFN-y-Induktoren als LK 2 Induktoren vermehrt werden. Es hat sich bestätigt, daß solch eine Kombination eine gleichzeitige Produktion von humanspezifischem Interferon (HuIFN) einleitet. Dies ist sehr vorteilhaft, sowohl in einer gleichzeitigen und billigen Massenproduktion von zwei oder mehr biologisch aktiven Substanzen, beispielsweise unbezahlbarem LK 2 und HuIFN als auch in einer wesentlich effektiveren Verwertung menschlicher Stellen.
Das so erhaltene LK 2 kann durch eine oder mehrere Teilungen und/oder Separationsprozesse, z. B. Aussalzen, Dialyse,Filtration,Zentrifugieren,Konzentration und/oderLyophilisationriickgewonnen werden. Wenn hochreines LK 2 herzustellen gewünscht wird, kann die höchste Reinheit durch das (die) oben beschriebene^) Verfahren in Verbindung mit (einem) anderen, herkömmlichen Verfahren z. B. Adsorption und Desorption mit Ionenaustausch, Gelfiltration, Fraktion am isoelektrischen Punkt, Elektrophorese, Ionenaustauschchromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Säulenchromatographie und/oder Affinitätschromatographie erhalten werden.
Immobilsierte monoklonale Antikörper, welche durch Bindung eines monoklonalen Anti-LK 2 Antikörpers, welcher später beschrieben wird, an einem geeigenten wasserunlöslichen Träger z. B. BrCN-aktivierte Sepharose, ein Erzeugnis von Pharmacia Fine Chemical AB, Uppsala, Schweden, erhalten werden, können vorteilhafterweise dazu verwendet werden, um die Teilung von LK 2 zu beschleunigen und zu erleichtern.
Es wurde bestätigt, daß derart erhaltenes LK 2 die folgenden physiochemischen Eigenschaften aufweist. (1) Molekulargewicht; 20 000 ± 2 000 Dalton (2) Isoelektrischer Punkt, pl = 6,2 ± 0,3 (3) Elektrophoretische Mobilität auf Disc-PAGE, Rf=0,29 ± 0,02 (4) UV-Absorptionsspektrum ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm (5) Löslichkeit in Lösungsmitteln; löslich in Wasser, Salz- und Phospatpuffem kaum löslich oder unlöslich in Äthyläther, Äthylacetat oder Chloroform (6) Farbreaktion;
Protein-positiv bei der Lowry-Methode oder der Mikrobürettenmethode
Saccharid-positiv bei der Phenolschwefelsäuremethode oder der Anthronschwefelsäuremethode (7) Biologische Aktivitäten;
Zytotoxisch bei L 929-Zellen Zytostatisch bei KB-Zellen im wesentlichen keine Interferonaktivität (8) Stabilität in wässeriger Lösung;
Stabil bis 60 °C, wenn es bei einem ph-Wert von 7,2 für 30 Minuten inkubiert wurde.
Stabil im ρΉ-Bereich von 4,0-11,0 bei einer Inkubation bei 4 °C für 16 Stunden, und (9) Stabilität bei Kryo-Aufbewahrung;
Stabil bei -10 °C über den Zeitraum von einem Monat oder länger.
Ebenso wurde bestätigt, daß LK 2 keine irgendwie wesentliche Zytolyse bei normalen menschlichen Zellen hervorruft, jedoch eine bemerkenswerte Zytolyse bei einer Reihe von menschlichen Tumorzellen, ebenso wie beim Fibroblastoidstamm der Maus, L 929, hervornift, um diese Zellen zu töten.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von LK 2 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates, das einen pharmazeutisch zulässigen Träger und eine wirksame Menge LK 2 umfaßt.
Somit ist LK 2, z. B. in Form eines Präparates, geeignet als Prophylaktikum und/oder Therapeutikum für LK 2- -5-
AT 395 017 B sensitive Erkrankungen, z. B. bösartige Tumore, insbesondere verschiedene bösartige menschliche Tumore, sowie Behandlungen, welche für sehr schwierig gehalten wurden. Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung ist das Präparat antionkotisch.
Erfindungsgemäß enthält das Präparat mindestens 5 Einheiten LK 2/g; das Präparat wird erfindungsgemäß ferner als Injektion, Kollyrium, Salbe, Suppositorium oder Kollunarium hergestellt.
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung enthältdasPräparatzusätzlich ein Chemotherapeutikum. Die Dosis der Chemotherapeutika kann um etwa 1/2-1/1000 verringert werden, weil mit einem Verstärker, welcher LK 2 als den wirksamen Bestandteil beinhaltet, der antionkotische Effekt der Chemotherapeutika außerordentlich gesteigert werden kann. Außerdem verbreitert die Verwendung des Verstärkers sowohl das Tumorspektrum der Chemotherapeutika und macht auch die Behandlung von aizneiresistenten Tumoren möglich.
Die Erfindung ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Chemotherapeutikum ein Glied ausgewählt aus der Gruppe umfassend Alkylierungsmittel, metabolischen Antagonisten, antionkotisches Antibiotikum, Alkaloid und Mischungen davon ist.
Dabei sind beispielsweise geeignete Alkylierungsmittel etwa Melphalan, Cyclophosphamid, Ifosfamid, Estramustinnatriumphosphat, 1,4-Butandioldimethansulfonat, Imorposulfantosilat, N-Methyl-3,3'-dimesyloxydipropylamin biphenyl-4,4'-disulfonat, 2,5-Bis(l-aziridinyl)-3-(2-hydroxy-methoxyäthyl-6-methy-p-benzochinon carbanat), Thio-triäthylenthiophosphoramid, Carmustin, Nimustinhydrochlorid, Streptozocin, Dacarbazin und Pipobroman; metabolische Antagonisten etwa Methotrexat, Fluorouracil Tegaful, Carmoful, Cytarabin, Ancitabinhydrochlorid, Enocitabin, 6-Mercaptopurin und Thioinosin; antionkotische Antibiotika etwa Doxorubicin, Daunorubicin, Aclarubicin, Bleomycin, Peplomycin, Mitomycin C, Actinomycine D und C, Chromomycin A3, Mithramycin und Neocarzinostatin; und pflanzliche Alkaloide etwa Vincristinsulfat, Vinblastinsulfat, Vindestinsulfat und Podophyllotoxin.
Im Fall der Behandlung von Prostata- oder Brustkrebs können antionkotische Hormone wie etwa Predonisolon, Methyltestosteron und konjugiertes Östrogen gewünschtenfalls in Kombination verwendet werden. Bedingungen für die Verbindung dieser Chemotherapeutika und LK 2 sollten auf Wunsch gewählt werden und nicht beschränkt sein.
Das Verfahrenzur Herstellungeinesmonoklonalen Antikörpersumfaßtdie Immunisierung eines nichtmenschlichen Warmblüters, wobei LK 2 als Antigen verwendet wird; die Isolierung der den Antikörper produzierenden Zelle aus dem Tierkörper; die Vereinigung der Antikörper produzierenden Zelle mit einer Myelomazelle; die Selektion eines Klons aus der sich ergebenden Hybridzelle, welcher geeignet ist, einen zu LK 2 spezifischen Antikörper zu produzieren; die Teilung des Klons und die Möglichkeit für die geteilte Zelle, den für LK 2 spezifischen monoklonalen Antikörper zu produzieren.
Solch eine Immunisierung kann durch z. B. intravenöse, intraperitoneale oder subcutane Injektion einer wäßrigen Lösung, Emulsion oder Suspension von LK 2 als das Antigen in einen geeigneten nicht menschlichen Warmblüter z. B. Huhn, Taube, Hund, Katze, Affe, Ziege, Schwein, Kuh, Pferd, Kaninchen, Guineaschwein, Ratte, Hamster oder Maus, und Füttern der Tiere für 3 Tage oder länger, um die Antikörperproduktion anzuregen, erhalten werden.
Ein Konjugat von LK 2 und einem gemäß der Lehre der veröffentlichten japanischen Patentschrift Nr. 23.847/83 erhaltenen Saccharid ist ebenso als Antigen verwendbar.
Das Antigen kann in einer einfachen Dosis injiziert werden, oder, falls notwendig, in zwei oder mehreren Dosen in (einem) Intervall(en) von etwa 3-30 Tagen.
Die Milzzelle des immunisierten Tieres, worin die Antikörperproduktion angeregt wurde, wird mit einer Myelomazelle der gleichen oder einer unterschiedlichen Spezies mit einem geeigneten Verfahren verschmolzen, beispielsweise einer solchen, wie von G. Köhler et al in Nature. Band 256, Seiten 495 - 497 (1975) und Euronean Journal of Immunology. Band 6, Seiten 511519 (1976) beschrieben. Die so erhaltenen Hybridzellen werden sodann selektiert und geklont, wonach der (die) Klon(e) in vitro oder in vivo gezüchtet wird (werden), gefolgt von einer Rückgewinnung des gesammelten, hochspezifisch monoklonalen Antikörpers aus der sich ergebenden Kultur. Besonders istdas in vivo-Verfahren mehr bevorzugt als das invitro-Verfahren. weil das erstgenannte Verfahren eine viel höhere Teilung des Klons und eine viel höhere Produktion des monoklonalen Antikörpers bewirkt, ohne die Verwendung von teurem Serum.
Beim in vivo-Verfahren wird der Klon geteilt, wobei die Nährkörperflüssigkeit eines nicht menschlichen Warmblüters der gleichen oder einer unterschiedlichen Spezies eingesetzt wird, welche bei der Immunisierung mittels Transplantation des Klons auf einen solchen nicht menschlichen Warmblüter verwendet wird, oder durch Einimpfen des Klons in einen herkömmlichen Typ einer Diffusionskammer, welche so konstruiert ist, daß sie mit der Nährkörperflüssigkeit eines solchen Tieres versorgt wird, und der angesammelte monoklonale Antikörper wird aus den Körperflüssigkeiten, wie Ascite und Serum, wiedergewonnen. Alternativ dazu, nach derTeilunginvivo. kann der Klon auf einem serumfreien, künstlichen Nährmedium für weitere 1-5 Tage gezüchtet werden, gefolgt von einer Rückgewinnung des angesammelten monoklonalen Antikörpers aus der sich ergebenden Kultur. -6-
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Der so erhaltene monoklonale Antikörper kann einfach mit einer oder mehreren Separationen und/oder Reinigungsverfahren, z. B. Aussalzen, Dialyse, Filtration, Zentrifugieren, Konzentration und/oder Lyophilisation rückgewonnen werden. Wenn eine viel höhere Reinheit wünschenswert ist, kann die höchste Reinheit mittels des(r) oben erwähnten Verfahren(s) in Verbindung mit (einem) anderen herkömmlichen Verfahren z. B. Adsorption und S Desorption mit Ionenaustausch, Gelfiltration, Fraktionierung am isoelektrischen Punkt, Elektrophorese, Ionen-austauschchromatographie, Hochleistungsflössigkeitschromatographie, Säulenchromatographie und/oder Affinitätschromatographieerreicht werden. DieRückgewinnungsratedesmonoklonalen Antikörpers kann vorteilhaft verbessert werden durch die Verwendung eines immobilisierten LK 2 Gels, welches durch Bindung eines hochreinen LK 2 an einen geeigneten wasserunlöslichen Träger, z. B. BrCN-aktivierte Sepharose, erhalten wird. 10 DererhaltenemonoklonaleAntikörperistsowohlbevorzugtalsUgandfiirdiefiirdieLK2Produktionbestimmte
Affinitätschromatographie geeignet, als auch bei der Diagnose verschiedener menschlicher Erkrankungen weg» seiner Spezifität zu LK 2, welches bösartige Tumore schädigt
Die LK 2-Titer werden unter Verwendung von entweder einer KB-Zelle oder einer L 929-Zelle als Targetzelle untersucht: 15 Bei der Verwendung einer KB-Zelle wurde die zytostatische Aktivität auf die KB-Zelle gemäß der in Cancer
Chemotheranv Reports Part 3. Band 3, Nr. 2, September (1972) beschriebenen Methode bestimmt; bei der Verwendung von L 929-Zellen wurde die zytostatische Aktivität auf die L 929-Zellen in Anwesenheit von Actinomycin D mittels der in Lymphokines. Band 2, Seiten 245-249, „Tumor Necrosis Factor**, herausgegebenen von E. Pick, veröffentlicht von Academic Press, Inc. (1981) beschriebenen Methode bestimmt. Wenn nicht anders angegeben, 20 wurde in der Beschreibung die letztere Methode, welche L929-Zellen verwendet, angewendet. Die Titer von HuIFN wurden mittels der herkömmlichen Fleckreduktions-Methode, welcheFL-Zellen menschlicher Amnions verwendet, untersucht, ursprünglich beschrieben in Protein. Nucleic Acid and Enzvme. Band 20, Nr. 6, Seiten 616-643 (1975). Die Haemagglutinationstiter wurden nach der von S.E. Salk The Journal of Immunologv. Band 49, Seiten 87-98 (1944) dargestellten Methode untersucht. 25 Die folgenden Experimente geben eine weitere genaue Beschreibung der vorliegenden Erfindung.
Experiment A-l
Bereitung von teilweise-gereinigtem LK 2
Neugeborenen Hamstern wurde herkömmliches Antiserum, welches aus Kaninchen hergestellt wurde, injiziert, 30 um ihre Immunreaktion zu schwächen, subcutan ein menschlicher Lymphoblastenstamm, BALL-1, transplantiert und die Hamster wurden drei Wochen auf herkömmliche Art gefüttert. Die Tumormasse, welche sich subcutan bildete, wurde extrahiert, zerkleinert und in Salzlösung desaggregiert Die so erhaltene Zellsuspension wurde dann mit RPMI 1640 medium (pH 7,2), ergänzt mit Serum, gewaschen und in einem frischen Präparat des gleichen künstlichen Nährmediums verteilt, um eine Zelldichte von etwa 2x10** Zellen/ml zu erreichen. Der Zellsuspension 35 wurde Sendai-Virus (etwa 400 Haemagglutinationstiter/ml) zugegeben und bei 37 °C für 24 Stunden inkubiert, um LK 2 Produktion anzuregen.
Die Kultur wurde bei etwa 1 OOOxg und etwa 4 °C zentrifugiert, und der so erhaltene Niederschlag wurde entfernt Der so erhaltene Überstand wurde gegen Salzlösung mit 0.01 M Phosphatpuffer (pH=7,2) für 20 Stunden dialysiert und mit einem Membranfilter behandelt Das Filtrat wurde dann durch eine Säule eines unbeweglichen Anti-HuIFN-40 Antikörpers geführt, und die nicht adsorbierte Fraktion wurde gesammelt Eine aktive Fraktion wurde aus dieser
Fraktion mittels Chromatofokussieren, Konzentrieren und Lyophilisieien gewonnen, um ein pulveriges Produkt mit LK 2 Aktivität zu erhalten.
Die spezifische Aktivität des Produktes betrug etwa 10** Einheiten/mg Protein. Die LK 2 Ausbeute war etwa 2,0 x 10' Einheiten pro Hamster. 45...
Experiment A-2
Bereitung von Anti-LK 2 Antikörpern
Ein LK 2 Präparat, welches mittels der Methode des Experimentes 1 erhalten wurde, wurde in Salzlösung gelöst, um eine Konzentration von etwa 0.05 Gew./Vol.% als Protein zu geben und weiters wurde die Lösung um das gleiche 50 Volumen Freund’schen Volladjuvans ergänzt. Mäuse wurden immunisiert, indem 0.2 ml Aliquoten der oben erhaltenen Mischung subcutan injiziert und sieben Tage nach dem ersten Injizieren verstärkt wurden.
Nach der Anregung der Anti-LK 2 Antikörper Produktion in den antikörperproduzierenden Zellen des Tieres wurden die Milzen derTiereentfemt, zerkleinert, desaggregiert undzusammen miteinem Maus-Myelomazellstamm, P^-X63-Ag8, gekauft bei Flow Laboratories Inc., Rockville, Maryland, USA, in serumfreiem Eagle’s Medium 55 (pH 7,2), welches 50 Gew./Vol.% Polyäthylenglykol 1000 enthält, suspendiert, auf 37 °C vorgewärmt, um eine entsprechende Dichte von 10^ Zellen/ml zu erhalten, gefolgt von einer 5 minütigen Standzeit der so erhaltenen -7- 5
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Mischung. Danach wurde die Mischung zwanzigmal in einem frischen Präparat des gleichen künstlichen Nährmediums verdünnt, und die Hybridomazellen, welche geeignet sind, auf Hypoxanthin, Aminopterin, thymidinhältigem Nährmedium zu wachsen, wurden gemäß der von R. L. Davidson und P. S. Gerald in Somatic Cell Genetics. Band 2, No. 2, Seiten 175-176 (1976) publizierten Methode zum Klonen der für die Produktion des Anti-LK 2 Antikörpers geeigneten Hybridomazelle gesammelt. Mäusen wurde intraperitoneal die geklonte Hybridomazelle in einer Dosis von etwalO^ Zellen pro Maus transplantiert, die Mäuse wurden zwei Wochen gefüttert und getötet. Die Körper-flüssigkeiten der Tiere, wie etwa Asciteflüssigkeit und Blut, wurden abgezogen, zentrifugiert und ausgesalzt mit Ammoniumsulfat, gefolgt von einem Aufsammeln der 30-50 % gesättigten, niedergeschlagenen Fraktionen. Diese Fraktionen wurden dialysiert und einer Affinitätschromatographie unterzogen, welche ein immobilisiertes Anti-LK 2-Antikörpergel verwendet, welches durch Reaktion einer mittels der Methode im Experiment 1 hergestellten LK 2 Probe mit BrCN-aktivierter Sepharose bei Umgebungstemperatur erhalten wurde, um eine Anti-LK 2 Antikörperfraktion zu erhalten, welche danach dialysiert, konzentriert und lyophilisiert wurde. Das sich ergebende pulverisierte Produkt wies eine immunospezifische Neutralisation der zytotoxischen Aktivität des LK 2 auf. Die Stabilität des monoklonalen Antikörpers in wässeriger Lösung wurde studiert mittels Prüfung der verbleibenden neutralisierenden Aktivitäten nach der Inkubation unter den vorher beschriebenen Bedingungen: Bei einer Inkubation bei pH=7,2 und unterschiedlichen Temperaturen für 30 Minuten, wurde 80 % oder mehr der Aktivität bei 60 °C zurückbehalten, hingegen bei 70 °C gingen 90 % oder mehr verloren. Nach der Inkubation bei 4 °C und unterschiedlichen pH-Werten für 16 Stunden waren die Aktivitäten im pH-Bereich von 4,0-11,0 stabil, verloren aber 90% und mehr bei pH = 2,0. Beim Studium der Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers wurde festgestellt, daß der Antikörper nicht resistent gegenüber 2-Mercaptoethanol ist und eine spezifische Antigen-Antikörperreaktion mit Antimaus-Immunglobulin M Antikörper hervorruft. Somit wird der vorliegende monoklonale Antikörper in die Klasse der Immunglobulin M Antikörper eingeordnet. Experiment A-3 Herstellung und phvsiochemische Eigenschaften von hochhereinigtem LK 2 Eine teilweise gereinigte LK 2 Probe, erhalten nach der Methode des Experiments A-l, wurde einer Affinitätschromatographie unterzogen, welche immobilisiertes monoklonales Antikörpergel, hergestellt nach der Methode im Experiment A-2, verwendet, um LK 2 Fraktionen zu sammeln, welche sodann dialysiert, konzentriert und lyophilisiert wurden. Das Ergebnis war ein hochgereinigtes LK 2 Präparat mit einer spezifischen Aktivität von etwa 10^ Einheiten/mg Protein. Die physiochemischen Eigenschaften von LK 2 wurden an diesem Präparat studiert. 35 (1) Molekulargewicht:
Das Molekulargewicht von LK 2 wurde mittels der elektrophoretischen Methoden bestimmt, welche SDS-Polyacrylamidgel verwenden, welches von K. Weber und M. Osbom in Journal of Biological Chemistry. Band 244, Seite 4.406 (1969) beschrieben ist Säulen von 10 %igem Acrylamidgel wurden mit etwa 10 pg Aliquoten des Präparates beladen, in Anwesenheit von 0.1 % SDS und mit 8 mA pro Säule für 4 Stunden 40 zur Elektrophorese beschickt. Nach der Entfernung und nachträglicher LK 2 Prüfung der aktiven Fraktion betrug das Molekulargewicht von LK 2 20.000 + 2.000 Dalton. (2) Isoelektrischer Punkt:
Nach 2-stündigem, 25 W-Elektrofokussieren des Präparats unter Verwendung von „AMPHOLINE PAGPLATE (pH 3,5-9,5)“, einem Gelproduktzum Elektrofokussieren, vertrieben von LKB Produkter AB, 45 Stockholm, Schweden, ergab sich ein isoelektrischer Punkt pl von 6,2 + 0,3. (3) Elektrophoretische Mobilität:
Gemäß der Methode, beschrieben von B. J. Davis. Annals of New York Academv of Sciences. Band 121, Seite 404 (1964) wurden etwa 10 pg Aliquoten des Präparats auf Säulen von 7,5 %igem Acrylamidgel aufgetragen, einer Elektrophorese bei pH = 8,3 und 3 m A pro Säule für 2 Stunden unterworfen, extrahiert 50 und auf LK 2 Aktivität überprüft, um eine elektrophoretische Mobilität Rf = 0,29 + 0,02 zu erhalten. (4) UV-Absorptionsspektrum:
Nach Analyse des UV-Spektrums des Präparates mit einem UV-250 Spektrometer, ein Produkt Shimadzu Seisakusho KK, Kyoto, Japan, wurde ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von ungefähr 280 nm gefunden. 55 (5) Löslichkeit im Lösungsmittel: Löslich in Wasser, Salz- und Phospatpufferlösung; schwer löslich oder unlöslich in Äthyläther, Äthylacetat und Chloroform. -8-
AT395 017 B (6) Farbreaktion:
Protein-positiv bei der Lowry-Methode und der Mikrobürettenmethode; Saccharid-positiv bei der Phenolschwefelsäuremethode und der Anthronschwefelsäuremethode. (7) Biologische Aktivität:
Eine zytotoxische Aktivität bei L 929 Zelle und eine zytostatische Aktivität bei KB-Zelle wurde festgestellt. Keine wesentliche HuIFN Aktivität wurde festgestellt. (8) Stabilität in wässeriger Lösung: i) Hitzestabilität: Etwa 1 x 10~* Einheiten/ml Aliquoten des Präparats wurden bei pH = 7,2 und unterschiedlichen Temperaturen für 30 Minuten inkubiert und die verbleibenden zytotoxischen Aktivitäten wurden übeiprüft. Als Ergebnis wurde eine Stabilität von LK 2 bis 60 °C festgestellt. ii) pH-Stabilität: 0,1 ml Aliquoten des Präparates (1x10° Einheiten/ml) wurden mit 1 ml Pufferlösung unterschiedlicher pH-Werte versetzt, beispielsweise Mcllvaine Puffer (ein Typ eines Natriumhydrogenphosphat-Zitronensäure-Puffers) bei pH=2-7; Phosphalpuffer, pH=7-8; Glycin-NaOH-Puffer, pH=8-11, und für 16 Stunden bei 4 °C inkubiert. Danach wurden 0,1 ml der inkubierten Mischung auf pH = 7,2 mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH = 7,2) eingestellt, und die verbleibende Aktivität wurde überprüft.
Als Ergebnis wurde eine Stabilität von LK 2 in einem pH-Bereich von 4,0-11,0 festgestellt. iii) Stabilität gegenüber „DISPASE“
Zu etwa lxlO^Einheiten/ml des Präparates wurde „DISPASE“ beigemengt, eine Protease des Bazillus, vertrieben durch Godo Shusei Co., Ltd., Tokyo, Japan, um eine Enzymaktivität von 100 Einheiten/ml zu erhalten; und die Mischung wurde bei pH = 7,2 und 37 °C für 2 Stunden inkubiert. Während der Inkubation wurden kleine Mengen der Mischung periodisch gesammelt und mit Kalbs-Serumalbumin vermengt, um eine Konzentration von 1 Gew./Vol.% zu erhalten, um die Enzymreaktion zu unterbrechen. Beim Überprüfen der LK 2 Aktivitäten in den Proben war LK 2 instabil gegenüber DISPASE-Behandlung und verlor seine Aktivität, als die Enzymreaktion fortgeführt wurde. (9) Stabilität gegenüber Kryo-Aufbewahrung:
Das LK 2 Präparat wurde in flüssiger Lösung bei -10 °C und pH = 7/2 für einen Monat gelagert, aufgetaut und überprüft. Keine Abnahme der Aktivität wurde bemerkt
Hieraus geht klar hervor, daß LK 2 physiochemische Eigenschaften hat, die sich von denjenigen von bekannten Lymphokinen, wie LT, TNF oder IFN unterscheiden. Der vorliegende monoklonale Antikörper ist somit auch neu, weil er eine immunspezifische Neutralisation mit der zytotoxischen Wirksamkeit des neuen Lymphokins LK 2 aufweist.
Experiment B-l
Zytostatischer Effekt an bösartigen Tumorzellen
Die zytostatische Aktivität von LK 2 an verschiedenen menschlichen Zellen wurde mitLK 2 Präparaten, die durch die in den Experimenten A-l und A-3 dargestellten Methoden erhalten wurden, studiert
Menschliche Zellen (10^ Zellen), in Tabelle 1 angeführt, wurden in 1 ml herkömmlicher Nährsubstanz, ergänzt durch fötales Kalbsserum, suspendiert, für einen Tag gezüchtet, versetzt mit 0,1 ml Salzlösung, welche entweder 50 Einheiten oder 500 Einheiten eines LK 2 Präparates umfaßt hergestellt mittels der Methode im Experiment A-l oder A-3, und inkubiert bei 37 °C für zwei Tage. Nach Züchtung der Kultur wurden die lebensfähigen Zellen mit Neutral Rot einer Art eines Färbemittels gefärbt gemäß der in Applied Microbioloev. Band 22, No. 4, Seiten 671-677 (1971) beschriebenen Methode, und das Färbemittel wurde unter Verwendung einer angesäuerten Äthanollösung eluiert. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde durch Messung der Absorption des Eluates bei einer Wellenlänge von 540 nm bestimmt -9-
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Tabelle I
Name des Zellstammes Quelle des Zellstammes LK 2 aus dem Experiment A-l LK 2 aus dem Experiment A-3 50 Einheiten 500 Einheiten 50 Einheiten 500 Einheiten HEp#2* Larynx Epidermoidkarzinom 33 40 46 68 PC-8* Lungen karzinom 26 37 56 80 MKN 7* Magenkrebs 35 41 60 77 HLE* Leberkarzinom 32 38 55 71 HeLa* Cervix- Epitheloid- karzinom 24 35 46 68 L-132** Embryonale Lunge 3 -2 1 -3 Chang liver** Leber 2 -3 4 -1 Giradi heart** Herz -2 2 -1 -2
Anmerkung *) bezeichnet die menschlichen Zellstämme der bösartigen Tumorursprünge; Anmerkung **) solche gewöhnlichen Ursprunges
Als Kontrollmittel wurden 0,11 einer LK 2 freien Salzlösung verwendet Wachstumshemmung (%) wurde theoretisch mit der folgenden Gleichung berechnet 50
Absorption bei Verwendung von LK 2
Wachstumshemmung (%) = (1---) x 100
Absorption des Kontrollmittels 55 Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt.
Diese Ergebnisse bestätigen, daß LK 2 im wesentlichen normale Zellen nicht beeinträchtigt jedoch extrem das Wachstum verschiedener bösartiger Tumorzellen hemmt -10-
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Auch wurde bestätigt, daß die Wirkung von teilweise gereinigtem LK 2 gut mit der des hochgereinigten vergleichbar ist
Experiment B-2
Eine Gruppe von BALB/c-Mäusen wurde mit Meth A Zellen eines Maussarkomursprunges transplantiert Ab dem zehnten Tag nach der Transplantation wurden die Mäuse intravenös mit einer ein LK 2 Präparat (erhalten nach der Methode in Experiment A-3) enthaltenden Salzlösung gespritzt in einer Dosis von 100 oder 1000Einheiten/kg täglich 15 Tage lang. Danach wurden die Mäuse getötet und die Tumoizellen, welche sich in den Tieren gebildet hatten, wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt
Tabellen
Behandlung Dosis pro Tag Tumormasse (Einheiten/kg) (g) Kontrollmittel 0 5,7 ±0,7 LK2 100 3,3 ±0,4* 1000 2,8 ±0,4*
Anmerkung: *) bedeutet die statistisch bedeutungsvollen Werte gegenüber dem Kontrollmittel in einem Signifikanzbereich von 5 %.
Experiment B-3
Einer Gruppe von B ALB/c Nacktmäusen wurden subcutan in ihre Rücken-Bereiche kleine Fragmente menschlichen Brustkrebsgewebes transplantiert Nachdem die Tumorzellen auf etwa 200 mrn^ in den Körpern der Tiere angewachsen waren, wurde eine ein LK 2 Präparat - nach der Methode im Experiment A-l oder A-3 erhalten -enthaltende Salzlösung intravenös einmal pro Tag in einer Dosis von entweder 100 Einheiten/kg oder 1.000 Einheiten/kg 20 Tage lang injiziert. Danach wurden die Tiere getötet und die erhaltenen Tumormassen wurden gewogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt.
Tabelle III
Behandlung Dosis pro Tag Tumormassen (Einheiten/kg) (g) Kontrollmittel 0 10,8 ±1,0 LK2 100 73 ±0,7* beim Experiment A-l 1000 6,8 ±0,5* -11-
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Tabelle III (Fortsetzung)
Behandlung
Dosis pro Tag Tumormassen (Einheiten/kg) (g) LK2 100 6,4 ± 0,5* beim Experiment A-3 1000 5,6 ±0,7*
Anmerkung: *) bedeutet die statistisch bedeutungsvollen Werte gegenüber dem Kontrollmittel in einem Signifikanzbereich von 5 %.
Experiment B-4
EinerGruppevonBALB/cNacktmäusen wurden subcutan in ihreRücken-BereichekleineFragmentemenschlichen Brustkrebsgewebes, ähnlich dem in Experiment B-3 transplantiert Nachdem die Tumormassen auf etwa 200 mm^ in den Körpern der Tiere angewachsen waren, wurde eine Salzlösung, die ein LK 2 Präparat, welches nach der Methode in Experiment A-3 erhalten wurde, enthielt und/oder ein HuIFN- Präparat intravenös injiziert, einmal pro Tag über 20 Tage. Danach wurden die Tiere getötet und die erhaltenen Tumormassen wurden gewogen. Als Kontrollmittel wurde eine LK 2- und HuIFN-freie Salzlösung verwendet.
DieErgebnisse sind in Tabelle IV dargestellt. DieseErgebnisse zeigen deutlich, daß die gemeinsame Verwendung von LK 2 und HuIFN- den antionkotischen Effekt auf HuIFN- extrem steigert
Tabelle IV
Behandlung Dosis pro Tag Tumormassen (Einheiten/kg) (g) Kontrollmittel 0 10,8 + 1,0 LK2 100 6,4 ±0,5* HuIFN- 1000 6,7 ±0,5* LK2 100 5,3 ±0,4* plus HuIFN- 1000
Anmerkung: *) bedeutet die statistisch bedeutungsvollen Werte gegenüber dem Kontrollmittel in einem Signifikanzbereich von 5 %. -12-
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Experiment B-5
Ein Test auf akute Toxizität, in welchem einer Gruppe 20 Tage alter Mäuse ein LK 2 Präparat, welches mittels der Methode im Experiment A-3 erhalten wurde, verabreicht wurde, bestätigte, daß die Toxizität des Präparates extrem nieder war, z. B. LD^q, 10^ Einheiten oder mehr, nach intraperitonealer Injizierung.
Wie aus den obigen Experimenten offensichtlich ist, zeigt LK 2 einen starken zytostatischen Effekt auf bösartige Tumore in vitro als auch in vivo. Darüberhinaus ist die Verabreichung von LK 2 sehr sicher in der Hinsicht, daß eine hohe Dosis keinen tatsächlichen Einfluß auf normale Zellen hat, während eine niedrige Dosis Tumorzellen beachtenswert beeinträchtigt.
Die wirksame Dosis von LK 2 fallt im allgemeinen in den Bereich von 5-500 000 000 Einheiten/Tag für einen Erwachsenen: insbesondere für lokale Verabreichung z. B. in Form von lokalen Injektionen oder Kollyrium, 5-10 000 000 Einheiten /Tag; für percutane oder permucosale Verabreichung, z. B. in Form von Salbe oder Suppositorium, 10-50 OOOOOOEinheiten/Tag; für systemische Verabreichung, z. B. intravenöse oder intramuskuläre Injektion, 50-100 000 000 Einheiten/Tag; und orale Verabreichung, 500-500 000 000 Einheiten/Tag, die Dosis ist aber frei wählbar, abhängig von den Anweisungen und den Symptomen des Patienten. Obwohl LK 2 für die Medizin auf gewöhnlichem Weg nach Beimengen zu einem geeigneten herkömmlichen Träger, einer Basis und/oder einem Auflösungsmittel hergestellt werden kann, sollte der LK 2-Gehalt davon wenigstens 5 Einheiten/g in Hinblick auf seine Toxizität, wirksame Dosis und Gefahrlosigkeit sein. Die Gestalt und Form von prophylaktischen und/oder therapeutischen Mitteln für LK 2-empfmdliche Erkrankungen kann frei gewählt werden: zum Beispiel zur oralen Verabreichung kann es zu Präparaten für die enterische Verwendung geformt sein,beispielweise als Kapsel, Tablette oder Pulver; zur rektalen Verabreichung als Suppositorium; zum Injizieren kann es beispielsweise als lyophilisierte Injektion zubereitet sein, welche vor der Anwendung in einer Injektionslösung mit destilliertem Wasser aufgelöst wird; genausogut in Form eines Kollunariums, Kolly riums oder einer Salbe. Z. B.bei der Behandlung einesPatienten mit bösartigem Tumor kann ein Tumorgewebestück, welches dem Patienten entnommen wurde, mitLK 2 in vitro behandelt werden, um die Immunogenität des Gewebestückes zu erhöhen und sodann dem Patienten zu verabreichen, um eine wesentlich wirkungsvollere Behandlung des bösartigen Tumors zu erreichen.
Die kombinierte Verwendung von LK 2 mit einem Antionkoticum (bzw. mit Antionkotica), beispielsweise Lymphokinen wie etwa HuIFN, TNF, LT und T-Zellenwachstumsfaktor (TCGF); antionkotische Polysaccharide wie etwa ß-l,3-Glucan, Arabinomannan, Lipopolysaccharid, OK-432 (Picibanil), PSK (Krestin) und Lentinan; metabolische Antagonisten, wie etwa Methotrexat und Fluorouracil; und antionkotische Antibiotika wie etwa Doxorubicin und Mitomycin C sind sehr vorteilhaft, weil solche kombinierten Verwendungen den antioiikotischen Effekt von LK 2 extrem erhöhen.
Insbesondere zeigt sich deutlich, daß LK 2 den antionkotischen Effekt von Chemotherapeutika erhöht. Das Verhalten zur Erhöhung des antionkotischen Effektes von LK 2 wird nachfolgend erläutert.
Experimente-!
Steigerung des antionkotischen Effektes von Chemotherapeutika durch LK 2
Die Steigerung des antionkotischen Effektes von Chemotherapeutika durch LK 2 wurde an bösartigen Tumorzellen studiert. Menschliche bösartige Tumorzellen (IO** Zellen) wurden in 1 ml eines herkömmlichen Typs eines Nährmediums welches mit fötalem Kalbsserum versetzt wurde, eingeimpft, und dann einen Tag lang gezüchtet. Danach wurde der Kultur 0,1 ml Salzlösung zugesetzt, welche 100 Einheiten einer LK 2 Probe enthielt, die mittels der Methode in Experiment A-3 hergestellt wurde, und/oder ein Chemotherapeutikum zugesetzt und zusätzliche 2 Tage bei 37 °C gezüchtet.
Als Kontrollmittel wurde eine LK 2- und chemotherapeutikumfreie Salzlösung verwendet.
Nach Fertigstellung der Kultur wurde die Anzahl der lebensfähigen Zellen unter Bezugnahme der Methode in Experiment B-l gezählt, und sodann die Wachstumshemmung (%) bestimmt. -13-
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Tatolis-Y
Kein ACNU 5-Fu ADM MMC VCR HEp#2 (Kehlkopf Epidermoid- karzinom) 52 4 67 8 80 13 70 10 72 5 66 PC-8 (Lungenkarzinom) 62 2 71 10 85 6 71 5 68 8 72 MKN 7 (Magenkrebs) 62 4 73 6 77 5 69 3 73 6 70 HLE (Leberkamzinom) 57 5 75 8 81 7 73 12 74 10 69 HeLa (Cervix Epitheloidkarzinom) 51 5 71 12 69 7 62 7 61 10 63
Anmerkung: +) mit Chemotherapeutikum; -) ohne Chemotherapeutikum; und Werte, Wachstumshemmung (%) der Tumorzelle.
Die Konzentrationen der getesteten Chemotherapeutika waren wie folgt: Nimustinhydrochlorid (ACNU), 1,0 x 10*^ g/ml Kultur, Fluorouracil (5-FU), 1,5 x 10‘° g/ml Kultur; Doxorubicin (ADM), 1,0 x 10_1® g/ml Kultur; Mitomycin C (MMC), 2,5 x 10"^ g/ml Kultur, und Vincristinsulfat (VCR) 1,5 x 10’*® g/ml Kultur.
Die Ergebnisse sind in Tabelle V dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß LK 2 den antionkotischen Effekt von Chemotherapeutika extrem steigen.
Experiment C-2
Einer Gruppe von B ALB/c Nacktmäusen wurden subcutan in ihre Rücken-Bereiche kleine Fragmente menschlichen Brustkrebsgewebes transplantiert. Nachdem die Tumormassen auf etwa 200 mm^ in den Körpern der Tiere angewachsen waren, wurde eine Salzlösung, welche ein LK 2 Präparat enthielt, das nach der im Experiment A-3 beschriebenen Methode erhalten wurde, intravenös injiziert, 1 mal pro Tag über 20 Tage. Danach wurden die Tiere getötet, und die erhaltenen Tumormassen wurden gewogen. Als Kontrollmittel wurde eine LK 2- und chemotherapeutikafreie Salzlösung verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI dargestellt. -14-
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Tabelle VI
Behandlung Dosis pro Tag Tumormasse (g) Kontrollmittel 0 10,8 ±1,0 LK2 100 Einheiten/kg 6,4 ±0,5* MMC 1mg/kg 5,1 ±0,4* LK2 100 Einheiten/kg 4,8 ±0,4* plus MMC 0,1 mg/kg
Anmerkung: *) bedeutet die statistisch bedeutungsvollen Werte gegenüber dem Kontrollmittel, in einem Signifikanzbereich von 5 %.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß LK 2 den antionkotischen Effekt auf Chemotherapeutika sogar in vivo erheblich steigert. Die zuvor erwähnten Ergebnisse bestätigen, daß eine Kombination eines Chemotherapeutikums mit LK 2 einen hohen antionkotischen Effekt zeigt, wobei bei Verwendung des Chemotherapeutikums in geringer Konzentration allein ein unzureichender antionkotischer Effekt erzielt wird.
Die Verwendung von LK 2 als Verstärker für Chemotherapeutika vermindert die praktische chemotherapeutische Konzentration extrem, verhindert das Auftreten von Nebenwirkungen und vergrößert die Tumorspektren der Chemotherapeutika extrem.
Der erfindundungsgemäße, LK 2 enthaltende Verstärker zeigt die Steigerung der Aktivität des antionkotischen Effektes, wenn er zusammen mit Chemotherapeutika verwendet wird.
Der Verstärker ist mit einem Chemotherapeutikum vorgemischt, und das erhaltene Produkt wird auf einmal verabreicht Alternativ dazu wird entweder der Verstärker oder ein Chemotherapeutikum zuerst verabreicht und sodann wird der Rest auf gleichem oder einem anderen Weg verabreicht
Die folgenden Beispiele A, B, C verdeutlichen die Herstellung von LK 2, LK 2 enthaltende pharmazeutische Massen oder den zu LK 2 spezifischen, monoklonalen Antikörper.
Beispiel A-l
Ein menschlicher Lymphoblastenstamm, BALL-1 wurde in Eagle’s Medium (pH = 7,4) eingeimpft mit 20 % fötalem Kalbsserum versetzt und in vitro in Lösung bei 37 °C auf herkömmlichem Weg gezüchtet Die geteilte menschliche Zelle wurde dann mit Eagle’s Medium (pH=7,4) gewaschen und wiederum in einem frischen Präparat des gleichen Nährmediums gelöst, um eine Zelldichte von etwa 1 x 10^Zellen/ml zu produzieren. Der Zellsuspension wurde Sendaivirus in einer Dosis von etwa 1000 Haemagglutinationstiter/ml beigegeben, und sie wurde bei 38 °C einen Tag inkubiert, um LK 2 Produktion hervorzurufen. Nach dem Zentrifugieren der erhaltenen Kulturbei etwa lOOOxg und etwa 4 °C wurde der Überstand gegen eine Salzlösung, welche 0,01M Phosphatpuffer (pH=7,2) enthielt für 15 Stunden dialysiert und mit einem Membranfilter behandelt. Das Filtrat wurde sodann durch eine Säule aus Anti-LK 2 Antikörpern, ähnlich denen in Experiment A-l, geführt und die nicht adsorbierte Fraktion wurde ähnlich wie im Experiment A-3 mit Hilfe der Affinitätschromatographie gereinigt, unter Verwendung einer Säule aus Anti LK 2-Antikörper-gebundenem Gel, und konzentriert, um ein Konzentrat mit einer spezifischen LK 2-Aktivität von etwa 10^ Einheiten/mg Protein zu erhalten. Die Ausbeute lag bei etwa 1,5 x 10^/Titer der angeregten Zellsuspension. -15-
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Beispiel A-2
Neugeborenen Hamstern wurde herkömmliches Antiserum injiziert, welches aus Kaninchen gewonnen wurde, um ihre Immunreaktion zu schwächen, subcutan ein menschlicher Lymphoblastenstamm BALL-1 transplantiert, und sie wurden drei Wochen auf herkömmliche Weise gefüttert. Die Tumormassen, jede etwa 15 g, subcutan in den Tieren gebildet, wurden entfernt, zerkleinert und in Salzlösung desaggregiert. Nach dem Waschen mit serumfreiem RPMI1640 (pH = 7,2) wurde die geteilte Zelle in einem frischen Präparat des gleichen Nährmediums wiederum suspendiert, um eine Zelldichte von etwa 5x10^ Zellen/ml zu erhalten. Die Zellsuspension wurde mit Sendaivirus und E. coli -Endotoxin versetzt in einer entsprechenden Dosis von etwa 1000 Haemagglutinationstiter/ml und ca. 10 pg/ml, und bei 37 °C einen Tag inkubiert, um LK 2 Produktion anzuregen. Nach dem Zentrifugieren der Kultur bei etwa lOOOxg und 4 °C zur Entfernung des Sediments wurde der Überstand gegen eine Salzlösung mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH=7,2) für 21 Stunden dialysiert, und mit einem Membranfilter behandelt. Das Filtrat wurde mit ein»' Säule aus Antikörpern, ähnlich denen in Beispiel A-l, gereinigt, und die Eluatlösung.wurde konzentriert und lyophilisiert, um ein pulverförmigesProduktmiteinerspezifischenLK2AktivitätvonetwalOy/mgProteinzuerhalten.
Die Ausbeute betrug etwa 3,2 x 10^ Einheiten.
Beispiel A-3
Erwachsenen Nacktmäusen wurde intraperitoneal ein menschlicherLymphoblastenstamm,TALL-l, transplantiert, sie wurden5 Wochen aufherkömmliche Weise gefüttert, intraperitoneal wurde ihnenNewcastle Disease Virus (etwa 3 000 Haemagglutinationstiter pro Nacktmaus) injiziert, welches im wesentlichen vorher mittels UV-Strahlung inaktiviert wurde, und sie wurden 24 Stunden nach dem Injizieren getötet, worauf ihnen ihre Asciteflüssigkeiten entnommen wurden. Die Asciteflüssigkeiten wurden gereinigt, konzentriert und ähnlich wie in Beispiel A-2 lyophilisiert, um ein pulverförmiges Produkt mit LK 2-Aktivität zu erhalten.
Die Ausbeute betrug etwa 3,5 x 10^ Einheiten pro Nacktmaus.
Beispiel A-4
Erwachsene Mäuse wurden mit einer Röntgenstrahlung von etwa 400 rem bestrahlt, um ihre Immunreaktion zu schwächen, es wurde ihnen subcutan ein menschlicher Lymphoblastenstamm Mono-1 transplantiert, und sie wurden auf herkömmliche Art drei Wochen gefüttert. Die Tumormassen, jede etwa 10 g, subcutan in den Tieren gebildet, wurden entfernt und ähnlich wie in Beispiel A-2 desaggregiert. Die derart erhaltene Zelle wurde ähnlich wie in Beispiel A-2 suspendiert, wonach die erhaltene Zellsuspension mit Sendaivirus und Concanavalin A in entsprechender Dosis von etwa 500 Haemagglulinationstiter/ml und 0,8 pg/ml versetzt und bei 37 °C für einen Tag inkubiert wurde, um LK 2 Produktion anzuregen. Danach wurde die Kultur gereinigt, konzentriert und ähnlich wie in Beispiel A-2 lyophilisiert, um ein pulverförmiges Produkt mit LK 2 Aktivität zu erhalten. Die Ausbeute betrug 2,0 x 10^ Einheiten pro Maus.
Beispiel A-5
Neugeborenen Hamstern wurde ein menschlicher Lymphoblastenstamm, Namalwa (ATCC CRL 1432), transplantiert, ähnlich wie in Beispiel A-2, und sie wurden über 4 Wochen auf herkömmliche Art gefüttert. Die Tumormassen, jede etwa 20 g, subcutan in den Tieren gebildet, wurden entfernt und desaggregiert, um eine Zellsuspension zu erhalten, welche eine Zelldichte von etwa 3 x 10^ Zellen/ml hat. Die Zellsuspension wurde mit Sendaivirus in einer Dosis von etwa 1000 Haemagglutinationstiter/ml versetzt und 2 Tage bei 36 °C inkubiert, um LK 2 Produktion anzuregen. Die Kultur wurde gereinigt und konzentriert, ähnlich wie in Beispiel A-l, um ein Konzentrat mit LK 2 Aktivität zu erhalten. Die Ausbeute betrug etwa 2,2 x 10^ Einheiten pro Hamster.
Beispiel A-6
Ein menschlicher Lymphoblastenstamm, NALL-1, wurde in Salzlösung suspendiert und in einer etwa 10 ml großen,zylindrischen Kunststoffdiffusionskammerangeordnetwelche miteinem Membranfilter mit einerParengröße von etwa 0.5 pm ausgerüstet war. Die Kammer wurde intraperitoneal in eine erwachsene Ratte implantiert, und das Tier wurde vier Wochen in gewöhnlicher Weise gefüttert Nach dem Entfernen der Kamm» wurde festgestellt daß die Zelldichte in der Kammer etwa 5 x 10^ Zellen/ml betrug, was etwa das 10^-fache oder mehr im Vergleich zu jenem Fall war, in welchem die Teilung in vitro in einem CO2 Inkubator unter Verwendung eines Nährmediums erfolgte. Die menschliche Zelle wurde in einem Nährmedium suspendiert, ähnlich wie in Beispiel A-2, mitNewcasde Disease Virus (etwa 500 Haemagglutinationstiter/ml), welches vorher mit UV-Strahlung inaktiviert wurde, und Phytohaemagglutinin (etwa 50 pg/ml) versetzt und einen Tag bei 37 °C inkubiert, um LK 2 Produktion anzuregen. Danach wurde die Kultur gereinigt konzentriert und ähnlich wie in Beispiel A-2 lyophilisiert, um ein pulverförmiges Produkt mit LK 2 Aktivität zu erhalten. Die Ausbeute betrug etwa 8 x 10^ Einheiten pro Ratte. -16-
AT 395 017 B
Beispiel A-7
Ein menschlicher Lymphoblastenstamm, CCRF-CEM (ATCC CCL 119), wurde in die Allantoishöhlen embryonaler Eier eingeimpft, welche 5 Tage bei 37 °C inkubiert wurden, und die Eier wurden dann weiter eine zusätzliche Woche bei dieser Temperatur inkubiert. Die geteilte menschliche Zelle wurde aus den Eiern entfernt und ähnlich wie in Beispiel A-l suspendiert, um eine Zelldichte von 5 x 10^ Zellen/ml zu erhalten. Die Zellsuspension wurde dann mit Sendaivirus (etwa 500 Haemagglutinationstiter/ml) versetzt und bei 37 °C für einen Tag inkubiert, um LK 2 Produktion anzuregen. Die erhaltene Kultur wurde gereinigt und ähnlich wie in Beispiel A-2 konzentriert, um ein pulverförmiges Produkt mit LK 2 Aktivität zu erhalten. Die Ausbeute betrug etwa 7,0 x 10^ Einheiten pro zehn embryonalen Eiern.
Beispiel B-l Injektion Fünfhunderttausend Einheiten einer LK 2-Probe, hergestellt mit der Methode in Beispiel A-2, wurden in 200 ml Salzlösung gelöst und unter sterilen Bedingungen unter Verwendung eines Membranfilters gefiltert. 2 ml Aliquote des Filtrats wurden in sterile Glasphiolen aufgeteilt, lyophilisiert und versiegelt, um eine pulverförmige Injektion zu erhalten. Die Injektion ist vorteilhaft zur alleinigen Verwendung geeignet oder als ein Verstärker in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie etwa Melphalan, Methotrexat oder Doxorubicin, zur Behandlung von Brustkrebs, Lungenkarzinom, Leberkarzinom und Leukämie.
Beispiel B-2
Injektion
Eine pulverförmige Injektion wurde ähnlich der Methode in Beispiel B-l hergestellt, mit Ausnahme daß 3 x 10° Einheiten von HuIFN-, welches von menschlichen Lymphoblastenzellen abgeleitet wurde, in 200 ml Salzlösung zusammen mit 5 x 10-* Einheiten von LX 2 aufgelöst wurden.
Die Injektion ist vorteilhaft zur alleinigen Verwendung geeignet oder als Verstärker in Verbindung mit einem Chemotherapeutikum, wie etwa Tegafur, Mitomycin C oder Vincristinsulfat, zur Behandlung von Brustkrebs, Lungenkarzinom, Leberkarzinom und Leukämie, und ihre therapeutische Wirksamkeit ist der Injektion nach Beispiel B-l überlegen.
Beispiel B-3
Salbe
Eine nach der Methode in Beispiel A-3 hergestellte LK 2 Probe wurde mit einer minimalen Menge flüssigen Paraffins bis zur Homogenität geknetet. Die Mischung wurde sodann mit weißer Vaseline auf heikömmlichem Weg versetzt, um eine Salbe mit einem LK 2-Gehalt von 20 000 Einheiten/g zu erhalten. Die Salbe ist vorteilhaft zur alleinigen Verwendung geeignet oder als Verstärker in Verbindung mit einem Chemotherapeutikum, wie etwa Cyclophosphamid, Fluorouracil oder Vincristinsulfat, zur Behandlung von Hautkarzinom, Brustkrebs undLymphom.
Beispiel B-4
Kollvrium
Eine Mischung aus 800 ml destilliertem Wasser, 5 ml ß-Phenyläthylalkohol und 20 000 000 Einheiten einer LK 2-Prohe, hergestellt nach der Methode in Beispiel A-4, wurde mit Natriumchlorid in einer zusätzlichen Menge von destilliertem Wasser vermischt, um 1000 ml einer isotonen Lösung zu erhalten.
Die Lösung ist vorteilhaft zur alleinigen Verwendung oder als Verstärker in Verbindung mit einem Chemotherapeutikum, wie etwa Cytarabin oder Vincristinsulfat, zur Behandlung von Retinoblastomen geeignet
Beispiel B-5 Überzogene Enteraltablette Überzogene Enteraltabletten mit einem LK 2 Gehalt von 200 000 Einheiten pro Tablette (100 mg) wurden auf herkömmliche Art hergesiellt, indem eine Mischung aus Stärke, Maltose und einer nach der Methode im Beispiel A-7 hergestellten LK 2 Probe tablettiert wurde, gefolgt von einem Überziehen der Tabletten mit Methylzellulose-Phthalsäure.
Die Tabletten sind vorteilhaft zur alleinigen Verwendung oder als Verstärker in Verbindung mit einem Chemotherapeutikum, wie etwa Doxorubicin, Fluorouracil oder Mitomycin C, zur Behandlung von Dickdarmkarzinom oder Leberkarzinom geeignet. -17-

Claims (13)

  1. AT 395 017 B Beispiel C-l Mäuse wurden ähnlich wie in Experiment A-2 immunisiert, außer daß ein hochreines, nach der in Experiment A-3 beschriebenen Methode erhaltenes LK 2 als Antigen verwendet wurde. Danach wurden die Milzzellen der Tiere zusammen mit einem Mausmyelomstamm, P3 -NS-1/1 - Ag4-1, ein Produkt von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Osaka, Japan, in einer Salzlösung, welche 114 mmol NaCl, 54 mmol KCl, 1 mmol NaH^PO^ und 2 mmol CaC^ enthielt, suspendiert, um eine entsprechende Zelldichte von 10^ Zellen/ml zu erhalten. DieZellsuspension wurde mit ein» frischen Salzlösung der gleichen Zusammensetzung, welche aber zusätzlich noch ein Sendaivirus, welches mit UV-Strahlung inaktiviert wurde, enthielt, unter eisgekühlte Bedingungen versetzt, und die Mischung wurde 5 Minuten stehengelassen. Danach wurde die Mischung etwa 20 fach in RPMI1640 Medium von 37 °C verdünnt, und die Hybridomzellen, welche zur Herstellung von Anti-LK 2 Antikörper geeignet sind, wurden ähnlich wie im Experiment A-2 geklont Die geklonten Hybridomzellen wurden intraperitoneal in 7-TagealteHamster transplantiert (etwa 101 2 3 4 5 6 7 Zellen pro Hamster), deren Immunreaktion mit einer herkömmlichen Methode geschwächt wurde, und der monoklonale Antikörper wurde aus den Körpern der Tiere auf ähnliche Art wie in Experiment A-2 zurückgewonnen. Ähnlich dem in Experiment A-2 hergestellten monoklonalen Antikörper zeigt das Produkt eine immunitätsspezifische Neutralisation mit der zytotoxischen Aktivität von LK 2. Die Stabilität des monoklonalen Antikörpers in wässeriger Lösung wurde mittels Untersuchung der verbleibenden neutralisierenden Aktivitäten nach dem Inkubieren unter nachfolgend beschriebenen Bedingungen studiert: Bei einer Inkubation bei pH = 7,2 und unterschiedlichen Temperaturen während 30 Minuten, wurden 80 % der Aktivität oder mehr bei 60 °C erhalten, hingegen gingen 90 % oder mehr bei 70 °C verloren. Nach der Inkubation bei 4 °C und unterschiedlichen pH-Werten für die Dauer von 16 Stunden war die Aktivität im pH-Bereich von 2,0-11,0 stabil. Beim Studium verschiedener Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers wurde gefunden, daß der vorliegende monoklonale Antikörper gegenüber2-Mercaptoethanol resistent war undeine spezifische Antigen-Antikörperreaktion mit einem Anti-Mausimmunglobulin G auslöste. Daher wird der vorliegende monoklonale Antikörper in die Klasse der Immunglobuline G eingeordnet. Beispiel C-2 Ein monoklonaler Anti-LK 2-Antikörper wurde ähnlich wie der in Beispiel C-1 hergestellt, außer daß ein Mausmyelomstamm, SP2/0-Agl4, im Handel durch Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan erhältlich, das P3-NS-l/l-Ag4-l ersetzte. Beim Studium der immunitäts-spezifischen Neutralisation durch den monoklonalen Antikörper mit der zytotoxischen Aktivität von LK 2 wurde ein ähnlicher wie in Beispiel C-l erhaltener erhalten. Daher wird der monoklonale Antikörper ebenfalls in die Klasse der Immunglobuline G eingeordnet. PATENTANSPRÜCHE -18- 1 Verfahren zur Herstellung eines neuen Lymphokins (LK 2) mit folgenden physiochemischen Eigenschaften: 2 (1) Molekulargewicht: 20 000 ± 2000 Dalton 3 (2) Isoelektrischer Punkt: pl = 6,2 ± 0,3 4 (3) Elektrophoretische Mobilität: auf Disc-PAGE, Rf = 0,29 ± 0,02 5 (4) UV-Absorptionsspektrum: ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm 6 (5) Löslichkeit in Lösungsmitteln: löslich in Wasser, Salz- und Phosphatpuffem; 7 kaum löslich oder unlöslich in Äthyläther, Äthylacetat oder Chloroform AT 395 017 B (6) Farbreaktion: Protein-positiv bei der Lowry’s-Methode oder Mikrobürettenmethode; Saccharid-positiv bei der Phenol-Schwefelsäuiemethode (7) Biologische Aktivitäten: zytotoxisch bei L929-Zellen; zytostatisch bei KB-Zellen; im wesentlichen frei von Interferonaktivität (8) Stabilität in wässeriger Lösung: stabil bis 60 °C, wenn 30 Minuten bei pH 7,2 inkubiert; stabil im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0, wenn 16 Stunden bei 4 °C inkubiert, und (9) Stabilität bei Kryoaufbewahrung: stabil bei -4 °C über einen Zeitraum von einem Monat oder länger, dadurch gekennzeichnet, daß eine zur LK 2 Herstellung geeignetemenschliche Zelle, die ein Glied ausgewählt aus derGruppeumfassendNamalwa-Zelle(ATCCCRL1432),BALL-l-Zelle,TALL-l-Zelle,NALL-l-Zelle,M-7002-Zelle, B-7101-Zelle, JBL-Zelle, EBV-Sa-Zelle, EBV-Wa-Zelle, EBV-HO-Zelle, MOLT-3-Zelle, (ATCC CRL 1552), CCRF-SB-ZeUe (ATCC CCL 120), CCRF-CEM-Zelle (ATCC CCL 119), BALM 2 - Zelle, DND-41-Zelle und Mono-l-Zelle ist, einem LK 2 Induktor, der ein Glied ausgewählt aus der Gruppe umfassend a-Interferoninduktor, γ-Interferoninduktor oder eine Mischung davon ist, ausgesetzt und das angesammelte LK 2 gewonnen wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die menschliche Zelle erhalten wird durch: Transplantieren der menschlichen Zelle in einen nichtmenschlichen Warmblüter; Füttern des Tieres, um der menschlichen Zelle dieNutzungder Nährkörperflüssigkeitdes Tieres für ihreVermehrung zu ermöglichen, und Entfernung und Desaggregierung des im Tier gebildeten Tumors.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die menschliche Zelle erhalten wird durch: Suspendieren der menschlichen Zelle in ein«' Diffusionskamm«, in welcher die Nährkörperflüssigkeit eines nichtmenschlichen Warmblüters der menschlichen Zelle zugeführt wird; Einbetten oder Anbringen der Diffusionskammer in oder auf dem nichtmenschlichen Warmblüter d«art, daß die Nährkörperflüssigkeit des Tieres der menschlichen Zelle innerhalb der Kammer zugeführt wird; Füttern des Tieres, um der menschlichen Zelle die Nutzung der Nährkörperflüssigkeit für ihreVermehrung zu ermöglichen, und Einsammeln der vermehrten menschlichen Zellen aus der Kammer.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der nichtmenschliche Warmblüter ein Geflügel oder Säugetier ist.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der nichtmenschliche Warmblüter ein Geflügel oder Säugetier ist.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der nichtmenschliche Warmblüter immunschwach ist oder eine unterdrückte Immunität aufweist.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Diffusionskammer mit einem oder mehreren Membranfiltem, Hohlfasem oder Ultrafiltem mit einer Nennporengröße von 10'^ bis 10'^ m ausgerüstet ist.
  8. 8. Verwendung von LK 2 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates, das einen pharmazeutisch zulässigen Träger und eine wirksame Menge LK 2 umfaßt.
  9. 9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat antionkotisch ist.
  10. 10. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat mindestens 5 Einheiten LK 2/g enthält -19- AT 395 017 B
  11. 11. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat als Injektion, Kollyrium, Salbe, Suppositorium oder Kollunarium hergestellt wird.
  12. 12. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat zusätzlich ein Chemotherapeutikum enthält
  13. 13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Chemotherapeutikum ein Glied ausgewählt ausderGruppe umfassend Alkylierungsmittel,metabolischen Antagonisten,antionkotisches Antibiotikum, Alkaloid und Mischungen davon ist. -20-
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